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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-04-15
(45)【発行日】2024-04-23
(54)【発明の名称】評価方法及び製造方法
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/686 20180101AFI20240416BHJP
G01N 33/50 20060101ALI20240416BHJP
G01N 33/15 20060101ALI20240416BHJP
A61Q 5/00 20060101ALI20240416BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/686 Z
G01N33/50 Z ZNA
G01N33/15 Z
A61Q5/00
【請求項の数】
4
(21)【出願番号】P 2019226454
(22)【出願日】2019-12-16
(65)【公開番号】P2021013372
(43)【公開日】2021-02-12
【審査請求日】2022-12-14
(31)【優先権主張番号】P 2019128825
(32)【優先日】2019-07-10
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(73)【特許権者】
【識別番号】592255176
【氏名又は名称】株式会社ミルボン
(74)【代理人】
【識別番号】100111187
【弁理士】
【氏名又は名称】加藤 秀忠
(74)【代理人】
【識別番号】100142882
【弁理士】
【氏名又は名称】合路 裕介
(72)【発明者】
【氏名】永見 恵子
(72)【発明者】
【氏名】櫻井 勇希
【審査官】牧野 晃久
(56)【参考文献】
【文献】特開２０１９－０３１４８２（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１２／０６０３２３（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特開２０１３－０１０６９３（ＪＰ，Ａ）
【文献】HIDA T. et al.，Rab7 is a critical mediator in vesicular transport of tyrosinase-related protein 1 in melanocytes，Journal of Dematology，2011年，Vol.38，p.432-441
【文献】Nguyen Dinh Thang et al.，Polygonum multiflorum root extract as a potential candidate for treatment of early graying hair，Journal of Advanced Pharmaceutical Technology & Research，2017年，Vol.8, Issue 1，p.8-13
【文献】Adila Tuerxuntayi et al.，Kaliziri extract upregulates tyrosinase, TRP-1, TRP-2 and MITF expression in murine B16 melanoma cells，BMC Complementary and Alternative Medicine，2014年，Vol.14，p.1-9
【文献】Tomohiro ITOH et al.，Hot-Water Extracts from Adzuki Beans (Vigna angularis) Stimulate Not Only Melanogenesis in Cultured Mouse B16 Melanoma Cells but Also Pigmentation of Hair Color in C3H Mice，Biosci. Biotechnol. Biochem.，2005年，Vol.69, No.5，p.873-882
【文献】Susumu TAKEKOSHI et al.，Flavonoids Enhance Melanogenesis in Human Melanoma Cells，Tokai J Exp Clin Med，2014年，Vol.39, No.3，p.116-121
【文献】田口暢彦、畑俊宏，白髪改善・白髪防止剤の開発，FRAGRANCE JOURNAL，2017年，p.38-45
【文献】武田俊祐、出田立郎，白髪化のメカニズムとその制御成分の開発，FRAGRANCE JOURNAL，2004年，p.40-45
【文献】YAMAGUCHI Y. et al，Physiological factors that regulate skin pigmentation，Biofactors. Author manuscript，2010年03月01日，Vol.35, No.2，p.193-199
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｑ １／００－ ３／００
Ｇ０１Ｎ ３３／００－ ３３／４６
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
毛髪用組成物、又は毛髪及び頭皮用組成物に配合される評価対象の成分の評価方法であって、評価対象の成分を添加した細胞におけるメラニン合成遺伝子及び／又はメラニン輸送遺伝子の発現量（Ａ）、並びに、比較対象の成分を添加した細胞におけるメラニン合成遺伝子及び／又はメラニン輸送遺伝子の発現量（Ｂ）を測定し、
前記メラニン合成遺伝子が、ｐｒｅｐｒｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ１遺伝子であり、
前記メラニン輸送遺伝子が、ＭＬＰＨ遺伝子であり、
前記発現量（Ａ）と前記発現量（Ｂ）とを比較し、
前記発現量（Ａ）が前記発現量（Ｂ）に比べて増加していた場合には、評価対象の成分は比較対象の成分よりも、ｐｒｅｐｒｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ１遺伝子及び／又はＭＬＰＨ遺伝子の発現を促進する作用を有すると評価することを特徴とする、
毛髪用組成物、又は毛髪及び頭皮用組成物に配合される評価対象の成分の評価方法。
【請求項2】
毛髪用組成物、又は毛髪及び頭皮用組成物に配合される評価対象の成分の評価方法であって、
評価対象の成分を添加した細胞におけるメラニン合成遺伝子及び／又はメラニン輸送遺伝子の発現量（Ａ）、並びに、比較対象の成分を添加しない細胞におけるメラニン合成遺伝子及び／又はメラニン輸送遺伝子の発現量（Ｂ）を測定し、
前記メラニン合成遺伝子が、ｐｒｅｐｒｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ１遺伝子であり、
前記メラニン輸送遺伝子が、ＭＬＰＨ遺伝子であり、
前記発現量（Ａ）と前記発現量（Ｂ）とを比較し、
前記発現量（Ａ）が前記発現量（Ｂ）に比べて増加していた場合には、評価対象の成分は、ｐｒｅｐｒｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ１遺伝子及び／又はＭＬＰＨ遺伝子の発現を促進する作用を有すると評価することを特徴とする、
毛髪用組成物、又は毛髪及び頭皮用組成物に配合される評価対象の成分の評価方法。
【請求項3】
前記評価方法が、毛髪の色調変化を抑制する成分を判別するための評価方法である請求項１又は２に記載の評価方法。
【請求項4】
請求項１～３のいずれか１項に記載の評価方法により評価対象の成分を評価する工程と、
前記工程により評価された評価対象の成分を配合し、毛髪用組成物、又は毛髪及び頭皮用組成物を製造する工程とを備える、
毛髪用組成物、又は毛髪及び頭皮用組成物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、毛髪用及び／又は頭皮用組成物に配合される成分の評価方法、及び当該評価方法で評価された成分を配合する毛髪用及び／又は頭皮用組成物の製造方法に関するものである。
【背景技術】
【0002】
毛髪用及び／又は頭皮用組成物には、様々な効能を有するものが提供されている。毛髪用及び／又は頭皮用組成物に配合される成分について、新規の成分や公知の成分であるかを問わず、いかなる効能が得られるかの関心の度合いは高い。
毛髪用及び／又は頭皮用組成物に配合される成分の効能は、官能的に評価されるのが通常であるが、官能評価を用いた効能の評価が困難な場合があるため、官能評価によらない成分の評価方法が必要となる。
毛髪用及び／又は頭皮用組成物に配合される成分の効能は、官能的に評価されるのが通常であるが、官能評価を用いた効能の評価が困難な場合があるため、官能評価によらない成分の評価方法が必要となる。
【0003】
官能評価によらない成分の評価方法としては、例えば、ケラチン毛のカルボニル化度を評価する方法を用いて、毛髪のカルボニル化度を低下させる成分のスクリーニング方法が提案されている（特許文献１：特許請求の範囲等）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0004】
【文献】特開２０１５－２２２２４８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
上記の通り、毛髪用及び／又は頭皮用組成物に配合される成分について、官能評価によらずに効能を評価する方法が要望されている。
【0006】
本発明の課題は、上記事情に鑑み、官能評価によらずに毛髪用及び／又は頭皮用組成物に配合される成分の評価方法を提供することである。また、本発明の別の課題は、上記評価方法により評価された成分が配合された毛髪用及び／又は頭皮用組成物の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明者らは、毛髪用及び／又は頭皮用組成物に求められる効能の一つである「毛髪の色調変化の抑制」について研究を進め、上記課題に基づき、毛髪の色調変化に関係するメラニン合成遺伝子及び／又はメラニン輸送遺伝子に着目した評価方法を鋭意検討した。上記検討の結果、評価対象の成分を添加した細胞、及び、比較対象の成分を添加した細胞又は成分を添加しない細胞から、それぞれメラニン合成遺伝子及び／又はメラニン輸送遺伝子の発現量を測定し、各々の細胞における各遺伝子の発現量を比較すれば、毛髪用及び／又は頭皮用組成物に配合される成分の評価が可能であることを見出した。
【0008】
すなわち、本発明の評価方法は、
毛髪用及び／又は頭皮用組成物に配合される成分の評価方法であって、
評価対象の成分を添加した細胞におけるメラニン合成遺伝子及び／又はメラニン輸送遺伝子の発現量（Ａ）、並びに、比較対象の成分を添加した細胞又は成分を添加しない細胞におけるメラニン合成遺伝子及び／又はメラニン輸送遺伝子の発現量（Ｂ）を測定し、
前記発現量（Ａ）と前記発現量（Ｂ）とを比較することを特徴とする、
毛髪用及び／又は頭皮用組成物に配合される成分の評価方法である。
毛髪用及び／又は頭皮用組成物に配合される成分の評価方法であって、
評価対象の成分を添加した細胞におけるメラニン合成遺伝子及び／又はメラニン輸送遺伝子の発現量（Ａ）、並びに、比較対象の成分を添加した細胞又は成分を添加しない細胞におけるメラニン合成遺伝子及び／又はメラニン輸送遺伝子の発現量（Ｂ）を測定し、
前記発現量（Ａ）と前記発現量（Ｂ）とを比較することを特徴とする、
毛髪用及び／又は頭皮用組成物に配合される成分の評価方法である。
【0009】
本発明の評価方法は、例えば、毛髪の色調変化を抑制する成分を判別するための評価方法である。
【0010】
本発明の評価方法は、例えば、メラニン合成遺伝子が、ＴＹＲ遺伝子、ＤＣＴ遺伝子、ＴＹＲＰ１遺伝子、ＭＩＴＦ遺伝子、Ｐｍｅｌ１７遺伝子、及びｐｒｅｐｒｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ１遺伝子の群から選ばれる１種又は２種以上である。
【0011】
本発明の評価方法は、例えば、メラニン輸送遺伝子が、Ｒａｂ２７Ａ遺伝子、ＭＹＯ５Ａ遺伝子、ＭＬＰＨ遺伝子、及びＳｌｐ２－ａ遺伝子の群から選ばれる１種又は２種以上である。
【0012】
本発明の毛髪用及び／又は頭皮用組成物の製造方法は、上記の評価方法により評価された成分が配合された毛髪用及び／又は頭皮用組成物を製造する方法である。
【発明の効果】
【0013】
本発明によれば、官能評価によらずに毛髪用及び／又は頭皮用組成物に配合される成分の評価方法が提供できる。また、本発明によれば、前記評価方法により評価された成分を配合した毛髪用及び／又は頭皮用組成物の製造方法が提供できる。
【図面の簡単な説明】
【0014】
【図1】色調が濃い群の毛髪と色調が薄い群の毛髪との毛根部におけるＭＩＴＦ遺伝子、ｐｒｅｐｒｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ１遺伝子、ＭＬＰＨ遺伝子の発現量の比較。
【発明を実施するための形態】
【0015】
本発明の実施形態に基づき、本発明を以下に説明する。
【0016】
本発明者らは、毛髪の色調変化に関する研究において、目視観察で白髪に見える毛髪を詳細に観察すると、色調が薄い毛髪と色調が濃い毛髪とが存在することを発見した。また、色調が薄い毛髪と色調が濃い毛髪との違いを明らかにするため、それぞれの毛髪における毛根部の細胞におけるメラニン合成遺伝子及びメラニン輸送遺伝子の発現量を調べたところ、色調が薄い毛髪と色調が濃い毛髪とでは上記遺伝子の発現量が異なるとの知見を得た（図１）。
【0017】
さらに、本発明者らは、上記知見に基づいて毛髪の色調変化の抑制について研究を進め、毛髪の色調変化に関係するメラニン合成遺伝子及び／又はメラニン輸送遺伝子に着目した評価方法を鋭意検討したところ、評価対象の成分を添加した細胞、及び、比較対象の成分を添加した細胞又は成分を添加しない細胞から、それぞれメラニン合成遺伝子及び／又はメラニン輸送遺伝子の発現量を測定し、各々の細胞における各遺伝子の発現量を比較すれば、毛髪用及び／又は頭皮用組成物に配合される成分の評価が可能であることを見出し、本実施形態に係る評価方法を着想した。また、本実施形態に係る評価方法により評価された成分を配合した毛髪用及び／又は頭皮用組成物の製造方法を着想した。
以下の記載において、本実施形態の評価方法及び製造方法を示す。
以下の記載において、本実施形態の評価方法及び製造方法を示す。
【0018】
（評価方法）
本実施形態に係る評価方法は、
毛髪用及び／又は頭皮用組成物に配合される成分の評価方法であって、
評価対象の成分を添加した細胞におけるメラニン合成遺伝子及び／又はメラニン輸送遺伝子の発現量（Ａ）、並びに、比較対象の成分を添加した細胞又は成分を添加しない細胞におけるメラニン合成遺伝子及び／又はメラニン輸送遺伝子の発現量（Ｂ）を測定し、
前記発現量（Ａ）と前記発現量（Ｂ）とを比較することを特徴とするものである。
なお、用語「及び／又は」は、両方又はいずれか一方を指す（以下の記載においても同様）。
本実施形態に係る評価方法は、
毛髪用及び／又は頭皮用組成物に配合される成分の評価方法であって、
評価対象の成分を添加した細胞におけるメラニン合成遺伝子及び／又はメラニン輸送遺伝子の発現量（Ａ）、並びに、比較対象の成分を添加した細胞又は成分を添加しない細胞におけるメラニン合成遺伝子及び／又はメラニン輸送遺伝子の発現量（Ｂ）を測定し、
前記発現量（Ａ）と前記発現量（Ｂ）とを比較することを特徴とするものである。
なお、用語「及び／又は」は、両方又はいずれか一方を指す（以下の記載においても同様）。
【0019】
本実施形態に係る評価方法は、例えば、毛髪の色調変化を抑制する成分を判別するための評価方法である。また、本実施形態に係る評価方法の別の一例としては、加齢に伴い生じる白髪に対する毛髪の色調変化を抑制する成分を判別するための評価方法である。
【0020】
（成分）
本実施形態の評価方法に係る毛髪用及び／又は頭皮用組成物に配合される成分は、毛髪用及び／又は頭皮用組成物に配合可能な成分であれば、特に限定されない。そのため、上記成分として、例えば、毛髪用及び／又は頭皮用の化粧品、医薬部外品に配合可能な成分を用いることができる。
本実施形態の評価方法に係る毛髪用及び／又は頭皮用組成物に配合される成分は、毛髪用及び／又は頭皮用組成物に配合可能な成分であれば、特に限定されない。そのため、上記成分として、例えば、毛髪用及び／又は頭皮用の化粧品、医薬部外品に配合可能な成分を用いることができる。
【0021】
（評価対象の成分、比較対象の成分）
本実施形態の評価方法では、「評価対象の成分」を必須に用いるが、「比較対象の成分」は用いても良く、用いなくても良い。
「評価対象の成分」は、毛髪用及び／又は頭皮用組成物に配合可能な成分から適宜選定すればよい。「比較対象の成分」を用いる場合には、同様に毛髪用及び／又は頭皮用組成物に配合可能な成分から「比較対象の成分」を適宜選定すればよい。「評価対象の成分」又は「比較対象の成分」としては、単一の成分でもよく、２種以上の成分を含む混合物を用いても良い。
なお、後述する細胞への成分の添加を容易とする観点から、評価対象の成分及び／又は比較対象の成分を溶媒（例えば、水、有機溶媒、又はこれらの混合物等）に溶解して希釈して用いても良い。
本実施形態の評価方法では、「評価対象の成分」を必須に用いるが、「比較対象の成分」は用いても良く、用いなくても良い。
「評価対象の成分」は、毛髪用及び／又は頭皮用組成物に配合可能な成分から適宜選定すればよい。「比較対象の成分」を用いる場合には、同様に毛髪用及び／又は頭皮用組成物に配合可能な成分から「比較対象の成分」を適宜選定すればよい。「評価対象の成分」又は「比較対象の成分」としては、単一の成分でもよく、２種以上の成分を含む混合物を用いても良い。
なお、後述する細胞への成分の添加を容易とする観点から、評価対象の成分及び／又は比較対象の成分を溶媒（例えば、水、有機溶媒、又はこれらの混合物等）に溶解して希釈して用いても良い。
【0022】
（細胞におけるメラニン合成遺伝子及び／又はメラニン輸送遺伝子の発現量の測定）
本実施形態の評価方法では、評価対象の成分を添加した細胞におけるメラニン合成遺伝子及び／又はメラニン輸送遺伝子の発現量（Ａ）、並びに、比較対象の成分を添加した細胞又は成分を添加しない細胞におけるメラニン合成遺伝子及び／又はメラニン輸送遺伝子の発現量（Ｂ）を測定する。
本実施形態の評価方法では、評価対象の成分を添加した細胞におけるメラニン合成遺伝子及び／又はメラニン輸送遺伝子の発現量（Ａ）、並びに、比較対象の成分を添加した細胞又は成分を添加しない細胞におけるメラニン合成遺伝子及び／又はメラニン輸送遺伝子の発現量（Ｂ）を測定する。
【0023】
（細胞）
本実施形態の評価方法に係る細胞は、細胞培養が可能なメラニン合成遺伝子及び／又はメラニン輸送遺伝子を発現する細胞であれば特に限定されない。
本実施形態の評価方法に係る細胞としては、例えば、メラノサイト（色素細胞）が挙げられる。メラノサイトは、ヒト由来やその他の動物由来のものを用いることができ、入手が容易な市販のメラノサイト細胞（例えば、正常ヒト表皮メラノサイト細胞、マウスＢ１６メラノーマ細胞等）を用いることができる。
本実施形態の評価方法に係る細胞は、細胞培養が可能なメラニン合成遺伝子及び／又はメラニン輸送遺伝子を発現する細胞であれば特に限定されない。
本実施形態の評価方法に係る細胞としては、例えば、メラノサイト（色素細胞）が挙げられる。メラノサイトは、ヒト由来やその他の動物由来のものを用いることができ、入手が容易な市販のメラノサイト細胞（例えば、正常ヒト表皮メラノサイト細胞、マウスＢ１６メラノーマ細胞等）を用いることができる。
【0024】
本実施形態の評価方法に係る「評価対象の成分を添加した細胞」とは、選定した評価対象の成分を添加した細胞を意味する。添加方法は、適宜設定すればよく、培養細胞の培養液に評価対象の成分を所定濃度となるように添加してから数時間（例えば、３～４８時間）経過させたものとしても良い。
本実施形態の評価方法に係る「比較対象の成分を添加した細胞」とは、選定した比較対象の成分を添加した細胞を意味する。添加方法は、適宜設定すればよく、培養細胞の培養液に比較対象の成分を所定濃度となるように添加してから数時間（例えば、３～４８時間）経過させたものとしても良い。
本実施形態の評価方法に係る「成分を添加しない細胞」とは、成分（評価対象の成分及び比較対象の成分を含む）を添加しない細胞を意味する。
本実施形態の評価方法に係る「比較対象の成分を添加した細胞」とは、選定した比較対象の成分を添加した細胞を意味する。添加方法は、適宜設定すればよく、培養細胞の培養液に比較対象の成分を所定濃度となるように添加してから数時間（例えば、３～４８時間）経過させたものとしても良い。
本実施形態の評価方法に係る「成分を添加しない細胞」とは、成分（評価対象の成分及び比較対象の成分を含む）を添加しない細胞を意味する。
【0025】
（メラニン合成遺伝子及び／又はメラニン輸送遺伝子の発現量の測定）
本実施形態の評価方法に係る細胞におけるメラニン合成遺伝子及び／又はメラニン輸送遺伝子の発現量は、細胞におけるメラニン合成遺伝子及び／又はメラニン輸送遺伝子の発現量が測定可能な公知の方法により、適宜測定すればよい。
細胞におけるメラニン合成遺伝子及び／又はメラニン輸送遺伝子の発現量を測定する方法の具体例としては、例えば、評価対象の成分を添加した細胞、及び比較対象の成分を添加した細胞又は成分を添加しない細胞を、それぞれ、５％ＣＯ２下の３７℃で約３～４８時間培養する。その後、各細胞からｍＲＮＡを抽出し、メラニン合成遺伝子及び／又はメラニン輸送遺伝子、及び内部標準とするハウスキーピング遺伝子（例えば、β－Ａｃｔｉｎ遺伝子、ＮＡＤＰＨ遺伝子等）の発現量を、各遺伝子を特異的に検出するプライマーを用いたｑ－ＰＣＲにより、定量的に測定を行う。なお、メラニン合成遺伝子及び／又はメラニン輸送遺伝子の発現量としては、ＰＣＲ産物間での各遺伝子発現量を標準化する観点から、ハウスキーピング遺伝子の発現量に対するメラニン合成遺伝子及び／又はメラニン輸送遺伝子の発現量の比を算出した値（ハウスキーピング遺伝子の比（例えば、β－Ａｃｔｉｎ比等））を採用すると良い。
当該測定の結果から、評価対象の成分を添加した細胞におけるメラニン合成遺伝子及び／又はメラニン輸送遺伝子の発現量（Ａ）と、比較対象の成分を添加した細胞又は成分を添加しない細胞におけるメラニン合成遺伝子及び／又はメラニン輸送遺伝子の発現量（Ｂ）を得ることができる。
なお、「評価対象の成分を添加した細胞」と、「比較対象の成分を添加した細胞」又は「成分を添加しない細胞」との、後述するメラニン合成遺伝子及び／又はメラニン輸送遺伝子の発現量の比較をより適切なものとする観点から、添加条件（例えば、添加方法及び添加後の細胞培養時間等）は、同様の条件で行うことが好ましい。
本実施形態の評価方法に係る細胞におけるメラニン合成遺伝子及び／又はメラニン輸送遺伝子の発現量は、細胞におけるメラニン合成遺伝子及び／又はメラニン輸送遺伝子の発現量が測定可能な公知の方法により、適宜測定すればよい。
細胞におけるメラニン合成遺伝子及び／又はメラニン輸送遺伝子の発現量を測定する方法の具体例としては、例えば、評価対象の成分を添加した細胞、及び比較対象の成分を添加した細胞又は成分を添加しない細胞を、それぞれ、５％ＣＯ２下の３７℃で約３～４８時間培養する。その後、各細胞からｍＲＮＡを抽出し、メラニン合成遺伝子及び／又はメラニン輸送遺伝子、及び内部標準とするハウスキーピング遺伝子（例えば、β－Ａｃｔｉｎ遺伝子、ＮＡＤＰＨ遺伝子等）の発現量を、各遺伝子を特異的に検出するプライマーを用いたｑ－ＰＣＲにより、定量的に測定を行う。なお、メラニン合成遺伝子及び／又はメラニン輸送遺伝子の発現量としては、ＰＣＲ産物間での各遺伝子発現量を標準化する観点から、ハウスキーピング遺伝子の発現量に対するメラニン合成遺伝子及び／又はメラニン輸送遺伝子の発現量の比を算出した値（ハウスキーピング遺伝子の比（例えば、β－Ａｃｔｉｎ比等））を採用すると良い。
当該測定の結果から、評価対象の成分を添加した細胞におけるメラニン合成遺伝子及び／又はメラニン輸送遺伝子の発現量（Ａ）と、比較対象の成分を添加した細胞又は成分を添加しない細胞におけるメラニン合成遺伝子及び／又はメラニン輸送遺伝子の発現量（Ｂ）を得ることができる。
なお、「評価対象の成分を添加した細胞」と、「比較対象の成分を添加した細胞」又は「成分を添加しない細胞」との、後述するメラニン合成遺伝子及び／又はメラニン輸送遺伝子の発現量の比較をより適切なものとする観点から、添加条件（例えば、添加方法及び添加後の細胞培養時間等）は、同様の条件で行うことが好ましい。
【0026】
（メラニン合成遺伝子）
本実施形態の評価方法に係るメラニン合成遺伝子は、細胞においてメラニンの合成に関与する遺伝子を意味する。メラニン合成遺伝子としては、例えば、ＴＹＲ遺伝子、ＤＣＴ遺伝子、ＴＹＲＰ１遺伝子、ＭＩＴＦ遺伝子、Ｐｍｅｌ１７遺伝子、及びｐｒｅｐｒｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ１遺伝子等が挙げられる。
本実施形態の評価方法におけるメラニン合成遺伝子は、ＴＹＲ遺伝子、ＤＣＴ遺伝子、ＴＹＲＰ１遺伝子、ＭＩＴＦ遺伝子、Ｐｍｅｌ１７遺伝子、及びｐｒｅｐｒｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ１遺伝子から選ばれる１種又は２種以上とすることができる。
本実施形態の評価方法に係るメラニン合成遺伝子は、細胞においてメラニンの合成に関与する遺伝子を意味する。メラニン合成遺伝子としては、例えば、ＴＹＲ遺伝子、ＤＣＴ遺伝子、ＴＹＲＰ１遺伝子、ＭＩＴＦ遺伝子、Ｐｍｅｌ１７遺伝子、及びｐｒｅｐｒｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ１遺伝子等が挙げられる。
本実施形態の評価方法におけるメラニン合成遺伝子は、ＴＹＲ遺伝子、ＤＣＴ遺伝子、ＴＹＲＰ１遺伝子、ＭＩＴＦ遺伝子、Ｐｍｅｌ１７遺伝子、及びｐｒｅｐｒｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ１遺伝子から選ばれる１種又は２種以上とすることができる。
【0027】
ＴＹＲ遺伝子は、チロシナーゼ（ＴＹＲＯＳＩＮＡＳＥ）をコードする遺伝子である。チロシナーゼは、メラニン色素産生に関わる酵素である。
ＤＣＴ遺伝子は、ドーパクロムトートメラーゼ（ｄｏｐａｃｈｒｏｍｅ ｔａｕｔｏｍｅｒａｓｅ）をコードする遺伝子である。ドーパクロムトートメラーゼは、メラニン色素産生に関わる酵素である。
ＴＹＲＰ１遺伝子は、チロシナーゼの活性をサポートする役割があるチロシナーゼ関連タンパク質１（ＴＹＲＯＳＩＮＡＳＥ ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ １）をコードする遺伝子である。チロシナーゼ関連タンパク質１は、チロシナーゼの活性をサポートする役割があり、メラニン色素産生に関わるものである。
毛根部に存在するメラノサイトにおいて、ＴＹＲ遺伝子、ＤＣＴ遺伝子、又はＴＹＲＰ１遺伝子の発現量が増加すれば、細胞内のメラニン色素産生を促進するチロシナーゼ、ドーパクロムトートメラーゼ、又はチロシナーゼ関連タンパク質１が増加することで、メラノサイトにおけるメラニン色素の産生が促進されて、毛幹に供給されるメラニン量が増加するため、毛髪の明度低下に寄与すると考えられる。
ＤＣＴ遺伝子は、ドーパクロムトートメラーゼ（ｄｏｐａｃｈｒｏｍｅ ｔａｕｔｏｍｅｒａｓｅ）をコードする遺伝子である。ドーパクロムトートメラーゼは、メラニン色素産生に関わる酵素である。
ＴＹＲＰ１遺伝子は、チロシナーゼの活性をサポートする役割があるチロシナーゼ関連タンパク質１（ＴＹＲＯＳＩＮＡＳＥ ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ １）をコードする遺伝子である。チロシナーゼ関連タンパク質１は、チロシナーゼの活性をサポートする役割があり、メラニン色素産生に関わるものである。
毛根部に存在するメラノサイトにおいて、ＴＹＲ遺伝子、ＤＣＴ遺伝子、又はＴＹＲＰ１遺伝子の発現量が増加すれば、細胞内のメラニン色素産生を促進するチロシナーゼ、ドーパクロムトートメラーゼ、又はチロシナーゼ関連タンパク質１が増加することで、メラノサイトにおけるメラニン色素の産生が促進されて、毛幹に供給されるメラニン量が増加するため、毛髪の明度低下に寄与すると考えられる。
【0028】
ＭＩＴＦ遺伝子は、ＭＩＴＦ（Ｍｉｃｒｏｐｈｔｈａｌｍｉａ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ：小眼球症関連転写因子）をコードする遺伝子である。ＭＩＴＦは、ＴＹＲ遺伝子、ＤＣＴ遺伝子、ＴＹＲＰ１遺伝子の各遺伝子の発現を制御する役割を持つ転写因子である。
毛根部に存在するメラノサイトにおいて、ＭＩＴＦ遺伝子の発現量が増加すれば、ＴＹＲ遺伝子、ＤＣＴ遺伝子、ＴＹＲＰ１遺伝子の発現量が増加する結果、メラノサイトにおけるメラニン色素の産生が促進されて、毛幹に供給されるメラニン量が増加するため、毛髪の明度低下に寄与すると考えられる。
毛根部に存在するメラノサイトにおいて、ＭＩＴＦ遺伝子の発現量が増加すれば、ＴＹＲ遺伝子、ＤＣＴ遺伝子、ＴＹＲＰ１遺伝子の発現量が増加する結果、メラノサイトにおけるメラニン色素の産生が促進されて、毛幹に供給されるメラニン量が増加するため、毛髪の明度低下に寄与すると考えられる。
【0029】
Ｐｍｅｌ１７遺伝子は、Ｐｍｅｌ１７をコードする遺伝子である。Ｐｍｅｌ１７は、メラノソームにおいて、メラニン色素が沈着する線維を構成する糖タンパク質であり、メラノソームの成熟に関わる。
毛根部に存在するメラノサイトにおいて、Ｐｍｅｌ１７遺伝子の発現量が増加すれば、Ｐｍｅｌ１７の発現が増加する結果、メラノソームの成熟が促進されてメラノソームにおけるメラニン色素の貯蔵量が増加することで、毛幹に供給されるメラニン量が増加し、毛髪の明度低下に寄与すると考えられる。
毛根部に存在するメラノサイトにおいて、Ｐｍｅｌ１７遺伝子の発現量が増加すれば、Ｐｍｅｌ１７の発現が増加する結果、メラノソームの成熟が促進されてメラノソームにおけるメラニン色素の貯蔵量が増加することで、毛幹に供給されるメラニン量が増加し、毛髪の明度低下に寄与すると考えられる。
【0030】
ｐｒｅｐｒｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ１遺伝子は、プレプロエンドセリン１（ｐｒｅｐｒｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ１）をコードする遺伝子である。プレプロエンドセリン１は、エンドセリン－１の前駆体となるタンパク質であり、細胞内の酵素の働きにより、プレプロエンドセリン１からビックエンドセリンに変換された後、エンドセリン－１となる。エンドセリン－１は、メラノサイトを増殖させる働きがあることが知られている。
毛根部に存在するケラチノサイトにおいて、ｐｒｅｐｒｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ１遺伝子の発現量が増加すれば、プレプロエンドセリン１の発現が増加する結果、メラノサイトの増殖が促進され、毛幹に供給されるメラニン量が増加するため、毛髪の明度低下に寄与すると考えられる。
毛根部に存在するケラチノサイトにおいて、ｐｒｅｐｒｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ１遺伝子の発現量が増加すれば、プレプロエンドセリン１の発現が増加する結果、メラノサイトの増殖が促進され、毛幹に供給されるメラニン量が増加するため、毛髪の明度低下に寄与すると考えられる。
【0031】
（メラニン輸送遺伝子）
本実施形態の評価方法におけるメラニン輸送遺伝子は、細胞においてメラニンの輸送に関与する遺伝子を意味する。メラニン輸送遺伝子としては、例えば、Ｒａｂ２７Ａ遺伝子、ＭＹＯ５Ａ遺伝子、ＭＬＰＨ遺伝子、及びＳｌｐ２－ａ遺伝子等が挙げられる。
本実施形態の評価方法におけるメラニン輸送遺伝子は、Ｒａｂ２７Ａ遺伝子、ＭＹＯ５Ａ遺伝子、ＭＬＰＨ遺伝子、及びＳｌｐ２－ａ遺伝子から選ばれる１種又は２種以上とすることができる。
本実施形態の評価方法におけるメラニン輸送遺伝子は、細胞においてメラニンの輸送に関与する遺伝子を意味する。メラニン輸送遺伝子としては、例えば、Ｒａｂ２７Ａ遺伝子、ＭＹＯ５Ａ遺伝子、ＭＬＰＨ遺伝子、及びＳｌｐ２－ａ遺伝子等が挙げられる。
本実施形態の評価方法におけるメラニン輸送遺伝子は、Ｒａｂ２７Ａ遺伝子、ＭＹＯ５Ａ遺伝子、ＭＬＰＨ遺伝子、及びＳｌｐ２－ａ遺伝子から選ばれる１種又は２種以上とすることができる。
【0032】
Ｒａｂ２７Ａ遺伝子は、Ｒａｂ２７Ａをコードする遺伝子である。Ｒａｂ２７Ａは、低分子量Ｇタンパク質の一種であり、メラノサイトにおいてメラノソームを輸送する役割がある。
ＭＹＯ５Ａ遺伝子は、ミオシンＶａ（ｍｙｏｓｉｎ ＶＡ）をコードする遺伝子である。ミオシンＶａは、アクチン依存性のモータータンパク質である。
ＭＬＰＨ遺伝子は、メラノフィリン（Ｍｅｌａｎｏｐｈｉｌｉｎ）をコードする遺伝子である。メラノフィリンは、Ｒａｂタンパク質のエフェクタータンパク質であり、メラノフィリン、Ｒａｂ２７Ａ、及びミオシンＶａと三者複合体を形成することで、メラノソームの輸送を促進する。
毛根部に存在するメラノサイトにおいて、Ｒａｂ２７Ａ遺伝子、ＭＹＯ５Ａ遺伝子、又はＭＬＰＨ遺伝子の発現量が増加すれば、Ｒａｂ２７Ａ、ミオシンＶａ、又はメラノフィリンの発現が増加するため、メラノサイトにおけるメラソームの輸送が促進されることで、毛幹に供給されるメラニン量が増加し、毛髪の明度低下に寄与すると考えられる。
ＭＹＯ５Ａ遺伝子は、ミオシンＶａ（ｍｙｏｓｉｎ ＶＡ）をコードする遺伝子である。ミオシンＶａは、アクチン依存性のモータータンパク質である。
ＭＬＰＨ遺伝子は、メラノフィリン（Ｍｅｌａｎｏｐｈｉｌｉｎ）をコードする遺伝子である。メラノフィリンは、Ｒａｂタンパク質のエフェクタータンパク質であり、メラノフィリン、Ｒａｂ２７Ａ、及びミオシンＶａと三者複合体を形成することで、メラノソームの輸送を促進する。
毛根部に存在するメラノサイトにおいて、Ｒａｂ２７Ａ遺伝子、ＭＹＯ５Ａ遺伝子、又はＭＬＰＨ遺伝子の発現量が増加すれば、Ｒａｂ２７Ａ、ミオシンＶａ、又はメラノフィリンの発現が増加するため、メラノサイトにおけるメラソームの輸送が促進されることで、毛幹に供給されるメラニン量が増加し、毛髪の明度低下に寄与すると考えられる。
【0033】
Ｓｌｐ２－ａ遺伝子は、Ｓｌｐ２－ａをコードする遺伝子である。Ｓｌｐ２－ａは、シナプトタグミン様タンパク質（ｓｙｎａｐｔｏｔａｇｍｉｎ－ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）の一種であり、Ｒａｂ２７Ａのエフェクター分子としてメラノサイトの細胞膜にメラノソームを結合し、メラノサイトのメラノソームをケラチノサイトや毛母細胞に受け渡す役割がある。
人の毛根部に存在するメラノサイトにおいてＳｌｐ２－ａ遺伝子の発現量が増加すれば、ケラチノサイトや毛母細胞へのメラノソームの受け渡しが促進されて、毛幹に供給されるメラニン量が増加するため、毛髪の明度低下に寄与すると考えられる。
人の毛根部に存在するメラノサイトにおいてＳｌｐ２－ａ遺伝子の発現量が増加すれば、ケラチノサイトや毛母細胞へのメラノソームの受け渡しが促進されて、毛幹に供給されるメラニン量が増加するため、毛髪の明度低下に寄与すると考えられる。
【0034】
（発現量（Ａ）と発現量（Ｂ）の比較）
「前記発現量（Ａ）と前記発現量（Ｂ）とを比較する」とは、比較対象の成分を添加した細胞又は成分を添加しない細胞におけるメラニン合成遺伝子及び／又はメラニン輸送遺伝子の発現量（Ｂ）を基準として、評価対象の成分を添加した細胞におけるメラニン合成遺伝子及び／又はメラニン輸送遺伝子の発現量（Ａ）を比較することを意味する。
「前記発現量（Ａ）と前記発現量（Ｂ）とを比較する」とは、比較対象の成分を添加した細胞又は成分を添加しない細胞におけるメラニン合成遺伝子及び／又はメラニン輸送遺伝子の発現量（Ｂ）を基準として、評価対象の成分を添加した細胞におけるメラニン合成遺伝子及び／又はメラニン輸送遺伝子の発現量（Ａ）を比較することを意味する。
【0035】
上記発現量（Ａ）と発現量（Ｂ）の比較の一例としては、例えば、メラニン合成遺伝子としてＭＩＴＦ遺伝子を用いる場合、比較対象の成分を添加した細胞又は成分を添加しない細胞におけるＭＩＴＦ遺伝子の発現量（Ｂ）を基準として、評価対象の成分を添加した細胞におけるＭＩＴＦ遺伝子の発現量（Ａ）を比較することが挙げられる。また、別の一例としては、例えば、メラニン輸送遺伝子としてＭＬＰＨ遺伝子を用いる場合、比較対象の成分を添加した細胞又は成分を添加しない細胞におけるＭＬＰＨ遺伝子の発現量（Ｂ）を基準として、評価対象の成分を添加した細胞におけるＭＬＰＨ遺伝子の発現量（Ａ）を比較することが挙げられる。
【0036】
発現量（Ａ）と発現量（Ｂ）の比較としては、例えば、発現量（Ｂ）を１００％としたときの発現量（Ａ）の割合（％）を算出すること等が挙げられる。
また、上記比較において、発現量（Ａ）が発現量（Ｂ）に比べて増加していた場合には、評価対象の成分は、メラニン合成遺伝子及び／又はメラニン輸送遺伝子の発現を促進する作用を有すると評価可能である。なお、発現量（Ａ）が、比較対象の成分を添加した細胞の発現量（Ｂ）に比べて増加していた場合には、評価対象の成分は比較成分よりも、メラニン合成遺伝子及び／又はメラニン輸送遺伝子の発現を促進する作用を有すると評価可能である。
上記比較において、例えば、発現量（Ｂ）に対する発現量（Ａ）の割合（％）が１０５％以上（より好ましくは１１０％以上）であれば、評価対象の成分は、メラニン合成遺伝子及び／又はメラニン輸送遺伝子の発現を促進する作用を有すると評価できる。なお、発現量（Ａ）が、比較対象の成分を添加した細胞の発現量（Ｂ）に比べて増加していた場合には、評価対象の成分は比較成分よりも、メラニン合成遺伝子及び／又はメラニン輸送遺伝子の発現を促進する作用を有すると評価可能である。
また、上記比較において、発現量（Ａ）が発現量（Ｂ）に比べて増加していた場合には、評価対象の成分は、メラニン合成遺伝子及び／又はメラニン輸送遺伝子の発現を促進する作用を有すると評価可能である。なお、発現量（Ａ）が、比較対象の成分を添加した細胞の発現量（Ｂ）に比べて増加していた場合には、評価対象の成分は比較成分よりも、メラニン合成遺伝子及び／又はメラニン輸送遺伝子の発現を促進する作用を有すると評価可能である。
上記比較において、例えば、発現量（Ｂ）に対する発現量（Ａ）の割合（％）が１０５％以上（より好ましくは１１０％以上）であれば、評価対象の成分は、メラニン合成遺伝子及び／又はメラニン輸送遺伝子の発現を促進する作用を有すると評価できる。なお、発現量（Ａ）が、比較対象の成分を添加した細胞の発現量（Ｂ）に比べて増加していた場合には、評価対象の成分は比較成分よりも、メラニン合成遺伝子及び／又はメラニン輸送遺伝子の発現を促進する作用を有すると評価可能である。
【0037】
上記の発現量（Ａ）と発現量（Ｂ）の比較においてメラニン合成遺伝子の発現量及びメラニン輸送遺伝子の発現量が両方増加していると評価された場合、評価対象の成分は、比較成分に比べてメラニン合成遺伝子及びメラニン輸送遺伝子の両方の発現を促進すると評価できるから、メラノサイトにおけるメラニン色素の産生とメラソームの輸送が促進されて毛幹に供給されるメラニン量が増加する作用に優れると考えられる。
【0038】
（毛髪用及び／又は頭皮用組成物の製造方法）
本実施形態の製造方法は、本実施形態の評価方法によって評価された成分を配合する毛髪用及び／又は頭皮用組成物の製造方法である。
本実施形態の製造方法は、本実施形態の評価方法によって評価された成分を配合する毛髪用及び／又は頭皮用組成物の製造方法である。
【0039】
（毛髪用及び／又は頭皮用組成物）
本実施形態の製造方法に係る毛髪用及び／又は頭皮用組成物は、毛髪用組成物、頭皮用組成物、又は、毛髪及び頭皮に用いる組成物を意味する。毛髪用組成物とは、毛髪に用いられる組成物を意味する。頭皮用組成物とは、頭皮に用いられる組成物を意味する。
本実施形態の製造方法に係る毛髪用及び／又は頭皮用組成物の具体例としては、例えば、毛髪用及び頭皮用として使用可能なヘアトニック、ヘアクリーム、シャンプー、リンス、コンディショナー、ヘアトリートメント、整髪料等が挙げられる。
本実施形態の製造方法に係る毛髪用及び／又は頭皮用組成物は、毛髪用組成物、頭皮用組成物、又は、毛髪及び頭皮に用いる組成物を意味する。毛髪用組成物とは、毛髪に用いられる組成物を意味する。頭皮用組成物とは、頭皮に用いられる組成物を意味する。
本実施形態の製造方法に係る毛髪用及び／又は頭皮用組成物の具体例としては、例えば、毛髪用及び頭皮用として使用可能なヘアトニック、ヘアクリーム、シャンプー、リンス、コンディショナー、ヘアトリートメント、整髪料等が挙げられる。
【0040】
（剤型）
本実施形態の製造方法に係る毛髪用及び／又は頭皮用組成物の剤型は、特に限定されず、例えば、液状、乳液状、ローション状、クリーム状、ワックス状、ゲル状、固形状、フォーム状（泡状）、霧状、粉末状等が挙げられる。
本実施形態の製造方法に係る毛髪用及び／又は頭皮用組成物の剤型は、特に限定されず、例えば、液状、乳液状、ローション状、クリーム状、ワックス状、ゲル状、固形状、フォーム状（泡状）、霧状、粉末状等が挙げられる。
【0041】
（毛髪用及び／又は頭皮用組成物の製造方法）
本実施形態の製造方法に係る毛髪用及び／又は頭皮用組成物は、例えば、次の＜１＞、＜２＞工程により製造できる。
＜１＞本実施形態の評価方法を用いて、成分の評価を行う工程。
＜２＞上記＜１＞によって評価された成分及び必要に応じてその他の任意成分を配合して、毛髪用及び／又は頭皮用組成物における公知の製造方法を適宜採用して、毛髪用及び／又は頭皮用組成物を製造する工程。
本実施形態の製造方法に係る毛髪用及び／又は頭皮用組成物は、例えば、次の＜１＞、＜２＞工程により製造できる。
＜１＞本実施形態の評価方法を用いて、成分の評価を行う工程。
＜２＞上記＜１＞によって評価された成分及び必要に応じてその他の任意成分を配合して、毛髪用及び／又は頭皮用組成物における公知の製造方法を適宜採用して、毛髪用及び／又は頭皮用組成物を製造する工程。
【0042】
なお、上記その他の任意成分とは、化粧品又は医薬部外品に配合可能な公知の成分を指す。その他の任意成分としては、毛髪用及び／又は頭皮用組成物のその用途、目的、剤型等に応じて適宜選択すればよく、例えば、アニオン界面活性剤、カチオン界面活性剤、両性界面活性剤、アルコール、多価アルコール、糖類、エステル油、油脂、脂肪酸、炭化水素、ロウ、シリコーン、高分子化合物、アミノ酸、動植物抽出物、微生物由来物、無機化合物、香料、防腐剤、金属イオン封鎖剤、紫外線吸収剤、水等が挙げられる。
【0043】
（使用方法）
本実施形態に係る製造方法で製造された毛髪用及び／又は頭皮用組成物は、公知の毛髪用及び／又は頭皮用組成物の使用方法で使用することができる。
本実施形態に係る製造方法で製造された毛髪用及び／又は頭皮用組成物は、公知の毛髪用及び／又は頭皮用組成物の使用方法で使用することができる。
【実施例】
【0044】
以下、実施例に基づき本発明を詳述するが、この実施例の記載に基づいて本発明が限定的に解釈されるものではない。
【0045】
（毛根部の遺伝子発現）
ヘルシンキ宣言に則り、倫理委員会の承認を得た同意書に同意した２５～６４歳の日本人女性の２９名（２０歳代：１名、３０歳代：５名、４０歳代：１３名、５０歳代：９名、６０代歳：１名、２９名の平均年齢４５．１歳）から、５本ずつ白髪の毛髪を抜去した。抜去した毛髪の根元から約０．２～０．４ｍｍまでの長さの毛根部を、光学顕微鏡を用いて４００倍に拡大して観察した後、拡大した毛根部の観察像を写真撮影し、毛根部の画像データを得た。続いて、画像解析ソフトウェア（ＷｉｎＲＯＯＦ２０１５）を用いて、上記画像データから、根元から約０．２～０．４ｍｍまでの長さの毛根部の平均明度を画像解析した。そして、抜去した毛髪のうち、毛根部の平均明度が７５以上１００未満のものを「色調が濃い群」、毛根部の平均明度が１００以上のものを「色調が薄い群」として選別した。
ヘルシンキ宣言に則り、倫理委員会の承認を得た同意書に同意した２５～６４歳の日本人女性の２９名（２０歳代：１名、３０歳代：５名、４０歳代：１３名、５０歳代：９名、６０代歳：１名、２９名の平均年齢４５．１歳）から、５本ずつ白髪の毛髪を抜去した。抜去した毛髪の根元から約０．２～０．４ｍｍまでの長さの毛根部を、光学顕微鏡を用いて４００倍に拡大して観察した後、拡大した毛根部の観察像を写真撮影し、毛根部の画像データを得た。続いて、画像解析ソフトウェア（ＷｉｎＲＯＯＦ２０１５）を用いて、上記画像データから、根元から約０．２～０．４ｍｍまでの長さの毛根部の平均明度を画像解析した。そして、抜去した毛髪のうち、毛根部の平均明度が７５以上１００未満のものを「色調が濃い群」、毛根部の平均明度が１００以上のものを「色調が薄い群」として選別した。
【0046】
次に、色調が濃い群の毛髪と色調が薄い群の毛髪から、それぞれ毛根部（根元から約５～８ｍｍ）を切除した。切除された各毛根部から、Ｍａｘｗｅｌｌ ＲＳＣ ｓｉｍｐｌｙＲＮＡ Ｃｅｌｌｓ Ｋｉｔ(プロメガ社製)を用いて、Ｔｏｔａｌ ＲＮＡの抽出を行った。続いて、抽出したＴｏｔａｌ ＲＮＡを、ＧｏＳｃｒｉｐｔ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ(プロメガ社製)を用いて、ｃＤＮＡに逆転写した。得られた各ｃＤＮＡを用いてリアルタイムＰＣＲ（Ｒｏｃｈｅ社製のＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ９６）により、ＭＩＴＦ遺伝子、ｐｒｅｐｒｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ１遺伝子、及びＭＬＰＨ遺伝子、並びにハウスキーピング遺伝子のβ－Ａｃｔｉｎ遺伝子の各ｍＲＮＡの発現量を測定した。
なお、ＭＩＴＦ遺伝子、ｐｒｅｐｒｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ１遺伝子、及びＭＬＰＨ遺伝子の各発現量は、次の計算式に従い、β－Ａｃｔｉｎ遺伝子の発現量を１とした場合の各遺伝子の発現量の比によって求めた。
各遺伝子の発現量（β－Ａｃｔｉｎ比）＝（各遺伝子の発現量）／（β－Ａｃｔｉｎ遺伝子の発現量）
なお、ＭＩＴＦ遺伝子、ｐｒｅｐｒｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ１遺伝子、及びＭＬＰＨ遺伝子の各発現量は、次の計算式に従い、β－Ａｃｔｉｎ遺伝子の発現量を１とした場合の各遺伝子の発現量の比によって求めた。
各遺伝子の発現量（β－Ａｃｔｉｎ比）＝（各遺伝子の発現量）／（β－Ａｃｔｉｎ遺伝子の発現量）
【0047】
ＰＣＲによる各遺伝子の発現量の測定に用いたプライマーは下記の通りである。
・ＭＩＴＦ遺伝子の発現量測定に用いたプライマー
フォワード：5'-CAGGTGCCGATGGAAGTC-3' （配列番号１)
リバース ：5'-TGCTAAAGTGGTAGAAAGGTACTGC-3' （配列番号２)
・ｐｒｅｐｒｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ１遺伝子の発現量測定に用いたプライマー
フォワード：5'-TCTCTGCTGTTTGTGGCTTG-3' （配列番号３)
リバース ：5'-GAGCTCAGCGCCTAAGACTG-3' （配列番号４)
・ＭＬＰＨ遺伝子の発現量測定に用いたプライマー
フォワード：5'-GATGGAGAACCTGGCTCAGA-3' （配列番号５)
リバース ：5'-GGAGAGGAGGCGCTTTTT-3' （配列番号６)
・β－Ａｃｔｉｎ遺伝子の発現量測定に用いたプライマー
フォワード：5'-TGGCACCCAGCACAATGAA-3' （配列番号７)
リバース ：5'-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3' （配列番号８)
・ＭＩＴＦ遺伝子の発現量測定に用いたプライマー
フォワード：5'-CAGGTGCCGATGGAAGTC-3' （配列番号１)
リバース ：5'-TGCTAAAGTGGTAGAAAGGTACTGC-3' （配列番号２)
・ｐｒｅｐｒｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ１遺伝子の発現量測定に用いたプライマー
フォワード：5'-TCTCTGCTGTTTGTGGCTTG-3' （配列番号３)
リバース ：5'-GAGCTCAGCGCCTAAGACTG-3' （配列番号４)
・ＭＬＰＨ遺伝子の発現量測定に用いたプライマー
フォワード：5'-GATGGAGAACCTGGCTCAGA-3' （配列番号５)
リバース ：5'-GGAGAGGAGGCGCTTTTT-3' （配列番号６)
・β－Ａｃｔｉｎ遺伝子の発現量測定に用いたプライマー
フォワード：5'-TGGCACCCAGCACAATGAA-3' （配列番号７)
リバース ：5'-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3' （配列番号８)
【0048】
色調が濃い群の毛髪と色調が薄い群の毛髪における各遺伝子発現の結果を表１及び図１に示す。
なお、表１中の色調が濃い群と色調が薄い群の１段目の数字は各遺伝子の発現量（β－ａｃｔｉｎ比）の平均値を表し、２段目のＮの数字は測定数を表す。
図１中における、＊＊はｐ＜０．０１、＊はｐ＜０．０５であることを表す（ｔ検定）。
なお、表１中の色調が濃い群と色調が薄い群の１段目の数字は各遺伝子の発現量（β－ａｃｔｉｎ比）の平均値を表し、２段目のＮの数字は測定数を表す。
図１中における、＊＊はｐ＜０．０１、＊はｐ＜０．０５であることを表す（ｔ検定）。
【0049】
【表1】
【0050】
表１及び図１に示す結果から、色調が濃い群の毛髪は色調が薄い群の毛髪に比べて、メラニン合成に関与する遺伝子のＭＩＴＦ遺伝子、ｐｒｅｐｒｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ１遺伝子、及びメラニン輸送に関与する遺伝子のＭＬＰＨ遺伝子の発現量が有意に多かった。
このことから、色調が濃い群の毛髪と色調が薄い群の毛髪とは、メラニン合成又はメラニン輸送に関与する遺伝子の発現に違いがあり、色調が濃い群の毛髪は色調が薄い群の毛髪に比べて、メラニン合成又はメラニン輸送に関与する遺伝子（ＭＩＴＦ遺伝子、ｐｒｅｐｒｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ１遺伝子、ＭＬＰＨ遺伝子）の発現が高くなっていることが理解できる。
このことから、色調が濃い群の毛髪と色調が薄い群の毛髪とは、メラニン合成又はメラニン輸送に関与する遺伝子の発現に違いがあり、色調が濃い群の毛髪は色調が薄い群の毛髪に比べて、メラニン合成又はメラニン輸送に関与する遺伝子（ＭＩＴＦ遺伝子、ｐｒｅｐｒｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ１遺伝子、ＭＬＰＨ遺伝子）の発現が高くなっていることが理解できる。
【0051】
（成分を用いた遺伝子発現の評価）
次に、表１及び図１の結果から、色調が濃い群の毛髪と色調が薄い群の毛髪で違いがあったメラニン合成遺伝子又はメラニン輸送遺伝子の発現について、メラノサイトを用いた評価方法を行った。当該評価方法は、次に示す［１］～［４］の手順により行った。
次に、表１及び図１の結果から、色調が濃い群の毛髪と色調が薄い群の毛髪で違いがあったメラニン合成遺伝子又はメラニン輸送遺伝子の発現について、メラノサイトを用いた評価方法を行った。当該評価方法は、次に示す［１］～［４］の手順により行った。
【0052】
[１]正常ヒト表皮メラノサイト細胞を正常ヒト表皮メラニン細胞増殖用低血清液体培地(クラボウ社製)に５．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように調整し、２４ウェルプレートに１ウェル当たり各１ｍＬずつ播種した後、３７℃、５％ＣＯ２下で２４時間培養した。
[２]培養開始から２４時間経過後、試験品１としてクマザサエキス（クマザサ葉エキス１質量％、エタノール４９．５質量％、水４９．５質量％）を５０ｐｐｍ、試験品２としてキナエキス（キナノキ樹皮エキス１．６質量％、ＢＧ４８．５質量％、水４８．５質量％）を５０ｐｐｍ、試験品３としてタイムエキス（ワイルドタイムエキス０．５質量％、ＢＧ４９．７５質量％、水４９．７５質量％）を２５ｐｐｍ、試験品４としてヨクイニンエキス（ハトムギ種子エキス０．３質量％、ＢＧ４９．８５質量％、水４９．８５質量％）を５０ｐｐｍ、又は試験品５としてユリエキス（マドンナリリー根エキス１．３６質量％、ＢＧ４９．３２質量％、水４９．３２質量％）を１００ｐｐｍの濃度（各培養液におけるｐｐｍ濃度）となるように、各試験品を各ウェルの培地中に添加した。また、各試験品１～５のコントロールとして、エタノール２５％、ＢＧ２５％、水５０％の水溶液を２５ｐｐｍ（比較品１）、５０ｐｐｍ（比較品２）、又は１００ｐｐｍ（比較品３）の濃度となるように別々のウェルの培地中に添加した。各試料の添加後、３７℃、５％ＣＯ２下で２４時間培養した。なお、試験品１、２、４のコントロールは比較品２、試験品３のコントロールは比較品１、試験品５のコントロールは比較品３をそれぞれ用いた。
[３]試料添加から２４時間経過後、Ｄ－ＰＢＳ（－）を用いて各ウェルを洗浄し、トリプシン／ＥＤＴＡ水溶液（トリプシン ０．０２５質量％、ＥＤＴＡ ０．０１質量％の水溶液）で各々の試料で処理した細胞を回収した。回収した細胞から、Ｍａｘｗｅｌｌ ＲＳＣ ｓｉｍｐｌｙＲＮＡ Ｃｅｌｌｓ Ｋｉｔ(プロメガ社製)を用いて、各細胞のＴｏｔａｌ ＲＮＡの抽出を行った。
[４]抽出したＴｏｔａｌ ＲＮＡを、ＧｏＳｃｒｉｐｔ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ(プロメガ社製)を用いて、ｃＤＮＡに逆転写した。得られた各ｃＤＮＡを用いてリアルタイムＰＣＲ（Ｒｏｃｈｅ社製のＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ９６）により、ＭＩＴＦ、ｐｒｅｐｒｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ１、及びＭＬＰＨの各遺伝子、並びにハウスキーピング遺伝子のβ-Ａｃｔｉｎ遺伝子を内部標準として、各ｍＲＮＡの発現量を測定した。測定に用いたプライマーは、上記の「毛根部の遺伝子発現」の解析と同じものを用いた（発現量測定に用いたプライマー：ＭＩＴＦ遺伝子（配列番号１、２）、ｐｒｅｐｒｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ１遺伝子（配列番号３、４）、ＭＬＰＨ遺伝子（配列番号５、６）、β-Ａｃｔｉｎ遺伝子（配列番号７、８））。
なお、試験品１～５、比較品１～３におけるＭＩＴＦ遺伝子、ｐｒｅｐｒｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ１遺伝子、及びＭＬＰＨ遺伝子の各発現量は、β－Ａｃｔｉｎ遺伝子の発現量を１とした場合の各遺伝子の発現量の比を求めた後、下記計算式によって算出した。
発現量（％）＝（発現量（Ａ）：試験品１～５のいずれかを添加したものの各遺伝子の発現量（β－Ａｃｔｉｎ比））／（発現量（Ｂ）：コントロールの比較品１～３のいずれかを添加した場合の各遺伝子の発現量（β－Ａｃｔｉｎ比））×１００
[２]培養開始から２４時間経過後、試験品１としてクマザサエキス（クマザサ葉エキス１質量％、エタノール４９．５質量％、水４９．５質量％）を５０ｐｐｍ、試験品２としてキナエキス（キナノキ樹皮エキス１．６質量％、ＢＧ４８．５質量％、水４８．５質量％）を５０ｐｐｍ、試験品３としてタイムエキス（ワイルドタイムエキス０．５質量％、ＢＧ４９．７５質量％、水４９．７５質量％）を２５ｐｐｍ、試験品４としてヨクイニンエキス（ハトムギ種子エキス０．３質量％、ＢＧ４９．８５質量％、水４９．８５質量％）を５０ｐｐｍ、又は試験品５としてユリエキス（マドンナリリー根エキス１．３６質量％、ＢＧ４９．３２質量％、水４９．３２質量％）を１００ｐｐｍの濃度（各培養液におけるｐｐｍ濃度）となるように、各試験品を各ウェルの培地中に添加した。また、各試験品１～５のコントロールとして、エタノール２５％、ＢＧ２５％、水５０％の水溶液を２５ｐｐｍ（比較品１）、５０ｐｐｍ（比較品２）、又は１００ｐｐｍ（比較品３）の濃度となるように別々のウェルの培地中に添加した。各試料の添加後、３７℃、５％ＣＯ２下で２４時間培養した。なお、試験品１、２、４のコントロールは比較品２、試験品３のコントロールは比較品１、試験品５のコントロールは比較品３をそれぞれ用いた。
[３]試料添加から２４時間経過後、Ｄ－ＰＢＳ（－）を用いて各ウェルを洗浄し、トリプシン／ＥＤＴＡ水溶液（トリプシン ０．０２５質量％、ＥＤＴＡ ０．０１質量％の水溶液）で各々の試料で処理した細胞を回収した。回収した細胞から、Ｍａｘｗｅｌｌ ＲＳＣ ｓｉｍｐｌｙＲＮＡ Ｃｅｌｌｓ Ｋｉｔ(プロメガ社製)を用いて、各細胞のＴｏｔａｌ ＲＮＡの抽出を行った。
[４]抽出したＴｏｔａｌ ＲＮＡを、ＧｏＳｃｒｉｐｔ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ(プロメガ社製)を用いて、ｃＤＮＡに逆転写した。得られた各ｃＤＮＡを用いてリアルタイムＰＣＲ（Ｒｏｃｈｅ社製のＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ９６）により、ＭＩＴＦ、ｐｒｅｐｒｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ１、及びＭＬＰＨの各遺伝子、並びにハウスキーピング遺伝子のβ-Ａｃｔｉｎ遺伝子を内部標準として、各ｍＲＮＡの発現量を測定した。測定に用いたプライマーは、上記の「毛根部の遺伝子発現」の解析と同じものを用いた（発現量測定に用いたプライマー：ＭＩＴＦ遺伝子（配列番号１、２）、ｐｒｅｐｒｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ１遺伝子（配列番号３、４）、ＭＬＰＨ遺伝子（配列番号５、６）、β-Ａｃｔｉｎ遺伝子（配列番号７、８））。
なお、試験品１～５、比較品１～３におけるＭＩＴＦ遺伝子、ｐｒｅｐｒｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ１遺伝子、及びＭＬＰＨ遺伝子の各発現量は、β－Ａｃｔｉｎ遺伝子の発現量を１とした場合の各遺伝子の発現量の比を求めた後、下記計算式によって算出した。
発現量（％）＝（発現量（Ａ）：試験品１～５のいずれかを添加したものの各遺伝子の発現量（β－Ａｃｔｉｎ比））／（発現量（Ｂ）：コントロールの比較品１～３のいずれかを添加した場合の各遺伝子の発現量（β－Ａｃｔｉｎ比））×１００
【0053】
（評価結果）
成分の評価結果を表２に示す。
成分の評価結果を表２に示す。
【0054】
【表2】
【0055】
表２に示す結果から、試験品１（クマザサエキス）、試験品２（キナエキス）をそれぞれ細胞に添加したものは、比較品２を添加したものに比べて、メラニン合成遺伝子のＭＩＴＦ遺伝子、ｐｒｅｐｒｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ１遺伝子、及びメラニン輸送遺伝子のＭＬＰＨ遺伝子の発現量が増加した。同様に、試験品３（タイムエキス）を細胞に添加したものは、比較品１を添加したものに比べて、ＭＩＴＦ遺伝子、ｐｒｅｐｒｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ１遺伝子、及びＭＬＰＨ遺伝子の発現量が増加した。
また、試験品４（ヨクイニンエキス）を細胞に添加したものは、比較品２を添加したものに比べて、ＭＩＴＦ遺伝子の発現量は減少するものの、ｐｒｅｐｒｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ１遺伝子、及びＭＬＰＨ遺伝子の発現量が増加した。試験品５（ユリエキス）は、比較品３を添加したものに比べて、ＭＩＴＦ遺伝子、ｐｒｅｐｒｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ１遺伝子、及びＭＬＰＨ遺伝子の発現量が減少した。
これらの結果から、メラニン合成遺伝子及び／又はメラニン輸送遺伝子の発現量を用いて、成分の評価が可能であることがわかる。
また、試験品４（ヨクイニンエキス）を細胞に添加したものは、比較品２を添加したものに比べて、ＭＩＴＦ遺伝子の発現量は減少するものの、ｐｒｅｐｒｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ１遺伝子、及びＭＬＰＨ遺伝子の発現量が増加した。試験品５（ユリエキス）は、比較品３を添加したものに比べて、ＭＩＴＦ遺伝子、ｐｒｅｐｒｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ１遺伝子、及びＭＬＰＨ遺伝子の発現量が減少した。
これらの結果から、メラニン合成遺伝子及び／又はメラニン輸送遺伝子の発現量を用いて、成分の評価が可能であることがわかる。
【図1】
【配列表】