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▶ ヨハン ウォルフガング ゲーテ−ウニベルジテート フランクフルト アム マインの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-04-16
(45)【発行日】2024-04-24
(54)【発明の名称】固定ガイドＲＮＡペアを用いた遺伝子編集ベクターの作製方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/63 20060101AFI20240417BHJP
C40B 40/06 20060101ALI20240417BHJP
C12Q 1/6876 20180101ALN20240417BHJP
C12Q 1/68 20180101ALN20240417BHJP
【ＦＩ】
C12N15/63 Z ZNA
C40B40/06
C12Q1/6876 Z
C12Q1/68
【請求項の数】
12
(21)【出願番号】P 2020568291
(86)(22)【出願日】2019-06-11
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2021-09-27
(86)【国際出願番号】 EP2019065167
(87)【国際公開番号】W WO2019234258
(87)【国際公開日】2019-12-12
【審査請求日】2022-05-24
(31)【優先権主張番号】18176677.5
(32)【優先日】2018-06-08
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(73)【特許権者】
【識別番号】507038825
【氏名又は名称】ヨハン ウォルフガング ゲーテ－ウニベルジテート フランクフルト アム マイン
【氏名又は名称原語表記】Ｊｏｈａｎｎ Ｗｏｌｆｇａｎｇ Ｇｏｅｔｈｅ－Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｅｔ Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ ａｍ Ｍａｉｎ
【住所又は居所原語表記】Ｔｈｅｏｄｏｒ－Ｗ．－Ａｄｏｒｎｏ－Ｐｌａｔｚ １， ６０３２３ Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ ａｍ Ｍａｉｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ
(74)【代理人】
【識別番号】100088904
【弁理士】
【氏名又は名称】庄司 隆
(74)【代理人】
【識別番号】100124453
【弁理士】
【氏名又は名称】資延 由利子
(74)【代理人】
【識別番号】100135208
【弁理士】
【氏名又は名称】大杉 卓也
(74)【代理人】
【識別番号】100163544
【弁理士】
【氏名又は名称】平田 緑
(74)【代理人】
【識別番号】100183656
【弁理士】
【氏名又は名称】庄司 晃
(72)【発明者】
【氏名】カウリヒ，マヌエル
(72)【発明者】
【氏名】ディキック，イヴァン
(72)【発明者】
【氏名】ウェグナー，マルティン
(72)【発明者】
【氏名】マテス，イヴ
(72)【発明者】
【氏名】フスンジャク，コラルカ
【審査官】鳥居 敬司
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１７／００５８０７（ＷＯ，Ａ１）
【文献】Cell Systems, 2015, Vol.1, pp.88-96
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０
Ｃ４０Ｂ ４０／００－４０／１８
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
gRNAの固定ペアを発現させるための共有結合閉環状（ccc）DNAベクターを生成する方法であって、(a)
(x) 2つの逆方向の（発現方向が互いに向き合う）gRNA発現カセットであって、各gRNA発現カセットは (i) RNAプロモーター、(ii) gRNA配列によって置換される、gRNAプレースホルダー配列、および(iii) crRNA配列の順序で含むものである、または、(ii) gRNA配列によって置換される、gRNAプレースホルダー配列、および(iii) crRNA配列の順序で含むものである、gRNA発現カセット、および
(y) crRNA配列を欠き、tracrRNAの発現に適したプロモーターに作動可能に連結されているtracrRNAコード配列を含む、tracrRNA発現カセット、
を含む、一本鎖（ss）ファージミドベクターとしてのレシピエントベクターを提供する工程、
(b) Kunkelの変異誘発法で使用するための変異原性DNAプライマーを提供する工程であって、
前記変異原性DNAプライマーは、
目的の2つのgRNAコード配列と、
前記変異原性DNAプライマーと、前記レシピエントベクターに含まれる2つの逆方向のgRNA発現カセットとの相同性結合を仲介できる相同性領域
を含むものである、工程、および
(c) 前記レシピエントベクターと前記変異原性DNAプライマーを使用してcccDNAベクターを生成する工程であって、
ここで、工程(c)において、cccDNAベクターは、次の手順で生成される：
(a') 前記ssファージミドベクターとしての前記レシピエントベクターを提供する工程、
(b') 変異原性DNAプライマーを前記ssファージミドベクターにアニーリングする工程、
(c') (b')から共有結合閉環状（ccc）-ヘテロ二本鎖dsDNAを増幅する工程、および
(d') 残存野生型ファージミドベクターDNAを除去する工程、
を含む、方法。
【請求項2】
それぞれのgRNAコード配列は、少なくとも10ヌクレオチド長～200ヌクレオチド長、10ヌクレオチド長～50ヌクレオチド長、10ヌクレオチド長～30ヌクレオチド長、15ヌクレオチド長～30ヌクレオチド長、15ヌクレオチド長～25ヌクレオチド長、17ヌクレオチド長～23ヌクレオチド長、または20ヌクレオチド長から選択されるものである、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
該方法は、共有結合閉環状（ccc）DNAを利用してgRNA発現ベクターまたはベクターライブラリーを生成するために使用されるものであって、それぞれのベクターは、少なくとも2つの異なるgRNAの組み合わせを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項4】
請求項１に記載の方法に使用するための、固定ペア遺伝子編集のためのレシピエントベクターであって、次の要素を直接かつ中断のない連続した順序で含む：(i)第１のRNAプロモーター、
(ii)第１のgRNAプレースホルダー（gRNA配列によって置換されるもの）であって、(i)および (ii)は操作可能な鎖中にあり、
(iii)第１のcrRNA (反復) 配列、
(iv)リンカー、
(v)第２のcrRNA配列、
(vi)第２のgRNAプレースホルダー（gRNA配列によって置換されるもの）、
(vii)第２のRNAプロモーターであって、(vii) および (vi)は操作可能な鎖中にあり、
(v)から(vii)は、それぞれ(i)から(iii)と比較して逆方向（発現方向が互いに向き合う）であり、
レシピエントベクターはtracrRNA発現カセットをさらに含む、レシピエントベクター。
【請求項5】
gRNAの固定ペアを発現するための共有結合閉環状（ccc）DNAベクターを生成する方法であって、(a)
(x)２つの外向性（互いに発現方向が外向き）の第１および第２のgRNA発現カセットであって、各gRNA発現カセットは、(ii) gRNA配列によって置換される、gRNAプレースホルダー配列、および(iii) crRNA配列の順序で含むものである、第１および第２のgRNA発現カセット、および
(y) crRNA配列を欠き、tracrRNAの発現に適したプロモーターに作動可能に連結されているtracrRNAコード配列を含む、tracrRNA発現カセット、
を含む、一本鎖（ss）ファージミドベクターとしてのレシピエントベクターを提供する工程、
(b)
i. 第１のgRNA発現カセットに結合することができる第１の相同領域、
ii. 発現される第１のgRNA配列、
iii. リンカー配列、
iv. 発現される第２のgRNA配列、
v. 第２のgRNA発現カセットに結合することができる第２の相同領域、
をこの順序で含む、Kunkelの変異誘発法で使用するための変異原性DNAプライマーを提供する工程、
(c) 前記レシピエントベクターと前記変異原性DNAプライマーを使用してcccDNAベクターを生成する工程であって、
ここで、工程(c)において、cccDNAベクターは、次の手順で生成される：
(a') 前記ssファージミドベクターとしての前記レシピエントベクターを提供する工程、
(b') 変異原性DNAプライマーを前記ssファージミドベクターにアニーリングする工程、
(c') (b')から共有結合閉環状（ccc）-ヘテロ二本鎖dsDNAを増幅する工程、および
(d') 残存野生型ファージミドベクターDNAを除去する工程、
(d)cccDNAベクターのリンカー配列に互いに外向きの２つのRNAプロモーター配列を含むプロモーター断片を導入して、gRNAの固定ペアを発現するためのcccDNAベクターを取得する工程、
を含む、方法。
【請求項6】
工程(a)において、2つのgRNAプレースホルダー配列（gRNA配列によって置換されるもの）はリンカーによって分離されており、該リンカー配列は変異原性DNAプライマーのリンカー配列と同一である、請求項５に記載の方法。
【請求項7】
リンカー配列は、制限酵素認識部位を含む、または、リンカー配列は、平滑末端ライゲーションのための制限酵素認識部位もしくは粘着末端ライゲーションのための制限酵素認識部位を含む、
請求項５または６に記載の方法。
【請求項8】
工程(d)において、プロモーター断片は、制限酵素もしくはヌクレアーゼを使用して、リンカー配列に二本鎖切断を誘導し、そのように誘導された二本鎖切断部位に前記プロモーター断片を連結することによってリンカー配列に導入される、請求項５～６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項9】
少なくとも2つのgRNA発現カセットのうちの一方のtracrRNA配列は、少なくとも2つのgRNA発現カセットのうちの他方のtracrRNA配列と同一ではない、請求項５～８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項10】
一方および他方のgRNA発現カセットのtracrRNA配列は、それらの配列相同性が50から95％であることを特徴とし、および／または該tracrRNA配列は、同じもしくは異なるRNA/DNAに結合する能力を有するまたはゲノム編集ヌクレアーゼに結合する能力を有する、請求項９に記載の方法。
【請求項11】
コード配列を有するそれぞれのgRNAは、少なくとも10から200ヌクレオチド長、10から50、10から30、15から30、15から25、17から23、または20ヌクレオチド長である、請求項５～１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項12】
該方法は共有結合閉環状（ccc）DNAを利用してgRNA発現ベクターまたはベクターライブラリーを生成するために使用されるものであって、それぞれのベクターは、少なくとも2つの異なるgRNAの組み合わせを含む、請求項５～１１のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は所定の発現可能なガイドRNA（gRNA）配列の固定ペアを含む、遺伝子編集適用に適したベクターコンストラクトを生成するための新規方法に関する。本発明の方法は、そのようなベクターの容易な構築を可能にし、さらに、gRNAの固定ペアの発現のためのベクターライブラリーを提供する。本発明のベクターは、より大きなゲノムＤＮＡ配列を切り出すために有利に使用してもよく、あるいは、損失またはより大きなゲノム配列なしにゲノムに突然変異を同時に導入するために有利に使用してもよい。したがって、本発明のシステムは、ゲノム改変のための多くの分子遺伝学的手法を提供する。
【背景技術】
【0002】
クラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート（CRISPR）/Casシステムは、外来遺伝物質（例えば、プラスミドおよびバクテリオファージ）に対する防御機構として細菌および古細菌種で最初に発見された。自然に発生するCRISPR/Casシステムは3つのコンポーネントの発現に依存する：１）標的配列に相補的なガイドRNA配列、２）第３のコンポーネントであるエンドヌクレアーゼをその部位に動員するのを助けるスキャフォールドRNA。多くの細菌や古細菌の種では、CRISPR/Casシステムが外来遺伝物質の分解に使用されているが、このシステムは、さまざまな原核生物および真核生物での使用に適合しており、遺伝子ノックアウト、突然変異誘発、および発現の活性化または抑制などを含む多くの方法で使用されている（非特許文献１）。遺伝子操作されたCRISPR/Casシステムでは、3つの独立したコンポーネントの要件は、標的配列を結合するためのCRISPRガイドRNA配列と、個々のガイドRNA配列とスキャフォールド配列によって形成される構造を一緒に模倣するスキャフォールドRNAの両方を含み、かつ、エンドヌクレアーゼを適切な標的部位に動員するのに十分である、低分子ガイドRNA(sgRNA、または単純にガイドRNA (gRNA))の発現によって回避することができる （非特許文献２）。 Cas-gRNA複合体のDNA標的化を成功させるためのさらなる前提条件は、標的DNAにプロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）DNA配列が存在することであり、正確な配列は細菌のCas酵素に依存する。最も広く使用されている化膿レンサ球菌（Streptococcus pyogenes） Cas9（SpCas9）の場合、この配列はNGGの形式であり、Nは任意のヌクレオチドである。最も注目すべきは、Cas酵素はヒト細胞で発現することができ、ヒトDNAに向けられたgRNAを提供することにより、修復できない非常に特異的なDNA二本鎖切断を誘発し、挿入および欠失（InDels）変異を引き起こす。InDels変異の表現型は、フレーム内の欠失から完全な遺伝子ノックアウトまで多岐にわたる。近年、CRISPR/Casシステムは、患者由来の幹細胞と前駆細胞を使用して、鎌状赤血球症の原因となる変異を効率的に修正することが実証されている。したがって、CRISPR/Casシステムは、標準的な細胞生物学から治療への応用に至るまで、大きな可能性を秘めたプログラム可能な遺伝子編集ツールである。
【0003】
単一の遺伝的変化を使用して、十分に制御されたモデルシステムを生成できるが、これらは偏りのないスクリーニングを可能にしない。遺伝子スクリーニングを実行するために、多数のgRNA配列を組み合わせてライブラリーを生成し、ヒトおよび他のゲノムの特定の領域を標的化することができる。これらの遺伝子スクリーニングの主な利点は、偏りのない適用と使いやすさである。現時点で、ゲノムワイドなCRISPR/Casノックアウトスクリーニングは2、3しか公開されていないが、これらの実験が実行され、それぞれの結果が報告されるペースは大幅に加速している。ノックアウトスクリーニングに加えて、少数の研究所がゲノムワイドなCRISPR/Cas転写活性化および抑制スクリーニングの利点を実証している。これらのスクリーニングの対象となる領域には、薬剤耐性、細胞増殖、劣性遺伝子および必須遺伝子、長鎖ノンコーディングRNA（lncRNA）、ならびにNF-κB活性化／抑制遺伝子、または転移誘発遺伝子が含まれる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0004】
【文献】Hsu, et al. Cell (2014) 157(6):1262- 1278
【文献】Jinek, et al. Science (2012)337(6096):816-821
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
従来のプールされたgRNAクローニングは、過酷な労働でエラーが発生しやすく、試薬に深刻な配列バイアスとクローニングアーチファクトが生じる1。これらの技術的欠点に加え、応用CRISPR/Casスクリーニングの分野は、各gRNAがすべてのgRNAとランダムに組み合わされた複雑なライブラリーの生成が可能になる単一および多重gRNAライブラリーの生成に向けて大きな一歩を踏み出した（図１ａ）2。このような試薬の複雑さ（c）は、第１のgRNA発現カセットを標的とするn個のオリゴヌクレオチドと第２のgRNA発現カセットを標的とするm個のオリゴヌクレオチドの産物である。したがって、gRNAの数が増えると、そのようなgRNAライブラリーの複雑さは、経済的に実行可能なスクリーニング実験にはすぐに大きくなりすぎる2。さらに、多重gRNAライブラリーで可能なすべてのgRNAの組み合わせが生物学的に関連しているわけではない。したがって、単一のプラスミド（「固定ペア」）上の２つのgRNAの正確な組み合わせを定義することがしばしば望まれる（図１ａ）。今日までプールされた定義された固定ペア遺伝子摂動試薬を生成するための技術的解決策はない。
【課題を解決するための手段】
【0006】
単一のプラスミド上の２つ以上のgRNAの組み合わせを事前に決定することは、科学的に非常に重要であり、複数のアプリケーションがこのような科学技術から大きな恩恵を受けることができる。
【0007】
DNA切除：２つのRNAは、2次元または3次元に近接して配置された２つの同時発生した（synchronized）DNA二本鎖切断を同時に誘発する可能性がある。近接すると、２つのgRNA標的配列間にあるDNA断片が切除される可能性がある（図１ｂ）。したがって、コーディングおよび非コーディングの遺伝要素は、それらの生物学的機能およびそれぞれのDNA配列の欠失の結果を調査するために正確に切除され得る。
【0008】
２つ（またはそれ以上）の gRNA－１つの標的：信頼性を向上させて標的の関連性を分析するために、固定ペア3Cs試薬を使用すると、２つ（またはそれ以上）のgRNAを同じ標的に向けることができ、編集イベント（切断、改変など）の効率が向上する（図１ｃ）。
【0009】
２つ（またはそれ以上）の gRNA－２つ（またはそれ以上）の標的：固定ペアgRNAを使用すると、標的ペア（または標的グループ）の正確な事前決定を分析でき、それにより理論的に可能なすべての相互作用を分析する必要なく、標的間の相互作用の直接分析を可能にする（図１ｃ、ｄ、ｅ）。
【0010】
CRISPR活性化および阻害：標的転写を誘導またはブロックするには、効率的な変化のために多重gRNAが必要であり、したがって、同じプラスミド上の複数の定義された（defined）gRNAは、複雑さの低いgRNA試薬を維持しながら、活性化率または阻害率を改善する。
【0011】
薬効と耐性のスクリーニング： 固定ペア3Cs試薬を使用すると、２つ（またはそれ以上）のgRNAを使用して、実際に薬剤を適用することなく、FDA承認または新規薬剤の作用または耐性の根底にある分子メカニズムの有効性を監視または分析できる。
【0012】
以下のとおり、本発明の要素が記載される。これらの要素は、特定の実施態様とともにリストされているが、それらは、追加の実施態様を作り出すために、任意の方法および任意の数で組み合わせることができることを理解されたい。様々に記載された実施例および好ましい実施態様は、本発明を明示的に記載された実施態様のみに限定すると解釈されるべきではない。本明細書は、明示的に記述された実施態様のうちの２つ以上を組み合わせる、または明示的に記述された実施態様のうちの１つ以上を任意の数の開示および／または好ましい要素と組み合わせる実施態様をサポートおよび包含すると理解されるべきである。さらに、本出願に記載されているすべての要素の順列および組み合わせは、文脈で別段の指示がない限り、本出願の記載によって開示されていると見なされるべきである。
【0013】
I. 共有結合閉環状（ccc）DNAを使用したgRNAベクターおよびベクターライブラリーの生成
【0014】
最近、本発明者らは、cccDNAベースの低分子RNAまたは発現ベクターライブラリーを生成することにより、より高次のgRNAライブラリーを生成するための新しいシステムを開発した。この方法には、基本的に次の手順が含まれている
(a) (i) RNA/DNAプロモーターおよび空の標的低分子RNA/DNA配列導入部位または低分子RNA/DNAコード配列および／またはDNA/RNAヌクレアーゼ標的配列、またはそれらの部分配列を含む少なくとも1つの低分子RNA/DNA発現カセット、 (ii) ファージORI、特にf1複製起点などの一本鎖DNAの少なくとも1つの複製起点（ORI）、を含む一本鎖（ss）ファージミドベクターを提供する工程、および
(b) 少なくとも1種の変異原性RNAまたはDNAプライマーを提供する工程であって、変異原性RNAまたはDNAプライマーは、3’から5’方向に次の構造：第１の相同性領域、発現される低分子RNA/DNAをコードする標的配列領域、および第２の相同性領域を有し、第１の相同領域は、5’側で空の標的低分子RNA/DNA配列導入部位または低分子RNA/DNAコード配列またはそれらの部分配列に隣接するssファージミドベクターコンストラクトの配列に相補的であるか、またはアニーリングすることができるものであり、第２の相同性領域は、3’側で空の標的低分子RNA/DNA配列導入部位または低分子RNA/DNAコード配列またはそれらの部分配列に隣接するssファージミドベクターコンストラクトの配列に相補的であるか、またはアニーリングすることができる、工程、
(c) 少なくとも1種の変異原性RNAまたはDNAプライマーをssファージミドベクターコンストラクトにアニーリングし、そこから共有結合閉環状（ccc）ヘテロ二本鎖dsDNAを増幅する工程、
(d) 残存野生型ファージミドベクターDNAを除去する工程。
(a) (i) RNA/DNAプロモーターおよび空の標的低分子RNA/DNA配列導入部位または低分子RNA/DNAコード配列および／またはDNA/RNAヌクレアーゼ標的配列、またはそれらの部分配列を含む少なくとも1つの低分子RNA/DNA発現カセット、 (ii) ファージORI、特にf1複製起点などの一本鎖DNAの少なくとも1つの複製起点（ORI）、を含む一本鎖（ss）ファージミドベクターを提供する工程、および
(b) 少なくとも1種の変異原性RNAまたはDNAプライマーを提供する工程であって、変異原性RNAまたはDNAプライマーは、3’から5’方向に次の構造：第１の相同性領域、発現される低分子RNA/DNAをコードする標的配列領域、および第２の相同性領域を有し、第１の相同領域は、5’側で空の標的低分子RNA/DNA配列導入部位または低分子RNA/DNAコード配列またはそれらの部分配列に隣接するssファージミドベクターコンストラクトの配列に相補的であるか、またはアニーリングすることができるものであり、第２の相同性領域は、3’側で空の標的低分子RNA/DNA配列導入部位または低分子RNA/DNAコード配列またはそれらの部分配列に隣接するssファージミドベクターコンストラクトの配列に相補的であるか、またはアニーリングすることができる、工程、
(c) 少なくとも1種の変異原性RNAまたはDNAプライマーをssファージミドベクターコンストラクトにアニーリングし、そこから共有結合閉環状（ccc）ヘテロ二本鎖dsDNAを増幅する工程、
(d) 残存野生型ファージミドベクターDNAを除去する工程。
【0015】
本方法は国際特許出願番号PCT/EP2017/084625に完全に記載されており、参照によりその全体が本明細書に含まれるものとする。本方法は、比較例１でさらに記載される。上記方法は、高次のライブラリーの生成だけでなく、単一または複数の（ただし高次ではない）ベクターの作成にも使用できる。したがって、本発明は、いくつかの実施態様では、以下において、本発明に関連するものとして繰り返されるPCT/EP2017/084625の記載として、方法または材料のステップを具体的に参照することができる。
【0016】
本明細書に開示された発明に関連して残存野生型ファージミドベクターDNAを除去するためにエンドヌクレアーゼ消化を適用することができる。例えば、エンドヌクレアーゼ標的部位を、一本鎖（ss）ファージミドベクターコンストラクトにおいて、その少なくとも1つの低分子RNA/DNA発現カセット内に設ける。好ましくはエンドヌクレアーゼ標的部位は、一本鎖（ss）ファージミドベクターコンストラクトにおいて、変異原性DNAプライマーの第１の相同性領域に相補的な領域と、変異原性プライマーの第２の相同性領域に相補的な領域との間に位置する。このため、エンドヌクレアーゼ標的部位は、3Cs合成において複製されない位置にあり、したがって野生型ssファージミドベクターコンストラクトにおいてのみ存在する。したがって、ここでの方法は、工程（d）において、3Cs DNAを標的部位に特異的なエンドヌクレアーゼで酵素的に消化することを含む。例えば、エンドヌクレアーゼとして、いくつかの実施態様では制限酵素およびそれらの標的部位を用いる。例示的な制限酵素およびそれらの標的部位はI-PpoI、SmaI、HpaI、I-SceIまたはI-CeuIである。鋳型ssDNAにも変異原性プライマー中の導入配列にも生じない任意の制限認識部位を用いることができる。制限エンドヌクレアーゼの使用に加えて、以下の酵素のいずれか1つを、残存野生型プラスミドを除去するために用いることもできる： I-CeuI、I-PpoI、I-SceI、好ましくは全てのホーミングエンドヌクレアーゼ、全ての非ホーミングエンドヌクレアーゼ、例えばTALEN、ZFN、CRISPR/Casおよび同様の酵素の遺伝子摂動標的配列の使用、残存野生型プラスミドの配列の増幅を抑制することを目的とした、原核生物および／または真核生物の毒性ヌクレオチド配列の使用、および相同性および／または組換えに基づくクローニング配列の使用。
【0017】
野生型DNAベクターを除去する別の可能性は、Kunkel法を用いることである。したがって、上記の問題は、本発明により、Kunkelの変異誘発法（Kunkel法）を用いた低分子RNA/DNA発現（またはコードする）ベクターを生成する方法または低分子RNA/DNAコード配列をベクターに導入する方法によって解決される。したがって、好ましい態様では、Kunkel法またはKunkel変異誘発を用いて低分子RNA/DNA配列をベクターに導入する方法に関する。本発明におけるKunkel法またはKunkel変異誘発は、以下の手順を指す：変異させるDNA断片をファージミド（M13mp18/19などの任意のf1 ori含有ベクター）に挿入した後、dUTPアーゼ（dut）およびウラシルデグリコシダーゼ（ung）の２つの酵素が欠損したE. coli株に形質転換する。どちらの酵素も細菌染色体をdCTPからdUTPへの自然脱アミノ化による突然変異から保護するDNA修復経路の一部である。 dUTPアーゼ欠損は、dUTPの分解を妨げ、細胞における高レベルのdUTPをもたらす。ウラシルデグリコシダーゼ欠損は、新たに合成されたDNAからのウラシルの除去を妨げる。したがって、二重変異体E. coliがファージDNAを複製する際に、その酵素機構がdUTPをdTTPの代わりに誤って取り込み、幾つかのウラシルを含有する一本鎖DNA（ssUDNA）が生じる可能性がある。ssUDNAを培地中に放出されるバクテリオファージから抽出した後、変異誘発の鋳型として用いる。ヌクレオチド配列中に所望の変異または変化を有するオリゴヌクレオチドがプライマー伸長に用いられる。形成されるヘテロ二本鎖DNAは、dUTPを含有する１つの親非変異鎖と、dTTPを含有する１つの変異鎖からなる。次いで、このDNAを、野生型dutおよびung遺伝子を保有するE. coli株に形質転換する。ここで、ウラシルを含有する親DNA鎖が分解されるため、生じるDNAのほぼ全てが変異鎖からなる。本発明の方法は、標的ゲノム編集のためにガイドRNA配列をゲノム編集ベクターに導入するのに特に好適である。
【0018】
本発明における「Kunkel法」は、一本鎖ウラシル化DNA、好ましくは環状一本鎖ウラシル化DNAを鋳型として用いた変異プライマーによる増幅を含む方法である。「ウラシル化」は、ヌクレオチド中に１以上のウラシル塩基を含有する任意のDNA分子を指すものとする。
【0019】
本発明の前の発明では、共有結合閉環状（ccc）DNAベースの低分子RNA/DNA発現ベクターまたはベクターライブラリーを生成する方法が開示されており、該方法は次の工程を含む：
(a) 少なくとも1つのウラシル塩基および／またはDNA/RNAヌクレアーゼ標的配列を含む一本鎖（ss）ファージミドベクターコンストラクトを提供する工程であって、ssファージミドベクターコンストラクトが、(i) RNA/DNAプロモーターおよび空の標的低分子RNA/DNA配列導入部位または低分子RNA/DNAコード配列またはそれらの部分配列を含む少なくとも1つの低分子RNA/DNA発現カセット、 (ii) ファージORI、特にf1複製起点などの一本鎖DNAの少なくとも1つの複製起点（ORI）、を含む、工程、および
(b) 少なくとも1種の変異原性DNAプライマーを提供する工程であって、変異原性DNAプライマーは、3’から5’方向に次の構造：第１の相同性領域、発現される低分子RNA/DNAをコードする標的配列領域、および第２の相同性領域を有し、第１の相同領域は、5’側で空の標的低分子RNA/DNA配列導入部位または低分子RNA/DNAコード配列またはそれらの部分配列に隣接するssファージミドベクターコンストラクトの配列に相補的であるか、またはアニーリングすることができるものであり、第２の相同性領域は、3’側で空の標的低分子RNA/DNA配列導入部位または低分子RNA/DNAコード配列またはそれらの部分配列に隣接するssファージミドベクターコンストラクトの配列に相補的であるか、またはアニーリングすることができる、工程、
(c) 少なくとも1種の変異原性DNAプライマーをssファージミドベクターコンストラクトにアニーリングし、共有結合閉環状（ccc）ヘテロ二本鎖dsDNAを増幅する工程、
(d) cccヘテロ二本鎖dsDNA中のウラシル含有鎖を非ウラシル含有相補的DNA鎖で置き換え、cccDNAベースの低分子RNA/DNA発現ベクターまたはベクターライブラリーを得る工程。
(a) 少なくとも1つのウラシル塩基および／またはDNA/RNAヌクレアーゼ標的配列を含む一本鎖（ss）ファージミドベクターコンストラクトを提供する工程であって、ssファージミドベクターコンストラクトが、(i) RNA/DNAプロモーターおよび空の標的低分子RNA/DNA配列導入部位または低分子RNA/DNAコード配列またはそれらの部分配列を含む少なくとも1つの低分子RNA/DNA発現カセット、 (ii) ファージORI、特にf1複製起点などの一本鎖DNAの少なくとも1つの複製起点（ORI）、を含む、工程、および
(b) 少なくとも1種の変異原性DNAプライマーを提供する工程であって、変異原性DNAプライマーは、3’から5’方向に次の構造：第１の相同性領域、発現される低分子RNA/DNAをコードする標的配列領域、および第２の相同性領域を有し、第１の相同領域は、5’側で空の標的低分子RNA/DNA配列導入部位または低分子RNA/DNAコード配列またはそれらの部分配列に隣接するssファージミドベクターコンストラクトの配列に相補的であるか、またはアニーリングすることができるものであり、第２の相同性領域は、3’側で空の標的低分子RNA/DNA配列導入部位または低分子RNA/DNAコード配列またはそれらの部分配列に隣接するssファージミドベクターコンストラクトの配列に相補的であるか、またはアニーリングすることができる、工程、
(c) 少なくとも1種の変異原性DNAプライマーをssファージミドベクターコンストラクトにアニーリングし、共有結合閉環状（ccc）ヘテロ二本鎖dsDNAを増幅する工程、
(d) cccヘテロ二本鎖dsDNA中のウラシル含有鎖を非ウラシル含有相補的DNA鎖で置き換え、cccDNAベースの低分子RNA/DNA発現ベクターまたはベクターライブラリーを得る工程。
【0020】
本明細書において用語「ファージミド」は、プラスミドに変換されたファージゲノムを指す。
【0021】
本発明および本開示のいくつかの好ましい実施形態では、一本鎖（ss）ファージミドベクターコンストラクトは、その少なくとも1つの低分子RNA/DNA発現カセット内に制限酵素認識部位（制限部位）を付加的に含む。好ましくは、制限部位は、一本鎖（ss）ファージミドベクターコンストラクトにおいて、変異原性DNAプライマーの第１の相同性領域に相補的な領域と、変異原性プライマーの第２の相同性領域に相補的な領域との間に位置する。このため、制限部位は、3Cs合成において複製されない位置にあり、したがってウラシル含有ssファージミドベクターコンストラクトにおいてのみ存在する。この実施態様では、残存ウラシル化野生型DNAの付加的な消化が可能である。したがって、この方法は、一実施態様において工程（c）と工程（d）との間に、制限部位での二本鎖切断の選択的導入が可能な制限酵素で3Cs DNAを酵素的に消化することを含む（c'）の工程を含む。この実施態様において、ゲノム中に殆ど見られない認識部位を有する制限部位およびそれらの対応酵素が用いられる。例示的な制限酵素およびそれらの標的部位はI-PpoI、SmaI、HpaI、I-SceIまたはI-CeuIである。鋳型ウラシル化ss DNAに生じない任意の制限認識部位を用いることができる。制限エンドヌクレアーゼの使用に加えて、以下の酵素のいずれか１つを、残存野生型プラスミドを除去するために用いることもできる： I-CeuI、I-PpoI、I-SceI、好ましくは全てのホーミングエンドヌクレアーゼ、全ての非ホーミングエンドヌクレアーゼ、例えばTALEN、ZFN、CRISPR/Casおよび同様の酵素の遺伝子摂動標的配列の使用、残存野生型プラスミドの配列の増幅を抑制することを目的とした、原核生物および／または真核生物の毒性ヌクレオチド配列の使用、および相同性および／または組換えに基づくクローニング配列の使用。
【0022】
好ましい一実施の態様では、本発明は、少なくとも2つの低分子RNA/DNA発現カセット、より好ましくは少なくとも3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30およびそれ以上の本明細書で先に記載された低分子RNA/DNA発現カセットを含む、先に記載された一本鎖（ss）ファージミドベクターコンストラクトを提供する。この実施態様において、「多重」と呼ばれる、ベクター分子は、同時に発現される多数の低分子RNA/DNAを生成することが可能である。
【0023】
さらなる一実施態様において、少なくとも1つの低分子RNA/DNA発現カセットは、少なくとも2つ以上の低分子RNA/DNA発現カセットである（gRNAまたは他の低分子RNA/DNAの多重発現）。他の好ましい実施態様では、2つ以上の低分子RNA/DNA発現カセット内に用いられる制限部位は同一、同様であるかまたは異なる。
【0024】
本明細書で使用される用語「共有結合閉環状DNA」または「cccDNA」は、ニックを含むか、または遊離3'末端若しくは5'末端を含むものであり、真核生物染色体DNAまたは細菌染色体DNAなどの直鎖状DNA分子とは対照的に環状形態をとるDNA分子を指す。さらに、上記のDNA分子の環状構造は、共有結合で閉じている。cccDNAは当該技術分野で周知であり、例えば、KG. Hardy (ed)"Plasmids, a practical approach", IRL Press Oxford U.K., WashingtonD.C., U.S.A., 1987に更に記載されている。
【0025】
本明細書で使用される、用語「ベクターライブラリー」は、RNA/DNA発現カセットに挿入される、発現される複数の固有低分子RNA/DNA配列（例えばsiRNA、shRNA、gRNAまたは同様の配列）を含む複数のベクター（またはプラスミド）を指す。好ましい実施態様では、ベクターライブラリーは、少なくとも101個または102個、より好ましくは少なくとも103個、さらにより好ましくは少なくとも104個、またさらにより好ましくは少なくとも105個、106個、107個、108個または109個の固有ベクター配列（各々のベクターまたはプラスミドに含有されるRNA/DNA配列を意味する）を含む。
【0026】
本発明において、低分子RNAはsiRNA、shRNA、抗miR、ガイドRNA（gRNA）またはガイドDNA（gDNA）を含むことが理解されるものとする。最も好ましくは、低分子RNAがgRNAであり、ssファージミドベクターコンストラクトが、限定されるものではないが、任意にプロモーターに操作可能に連結したゲノム編集ヌクレアーゼ発現配列の存在をさらに含む。固定ペアgRNAベクターの提供に関する本発明では、低分子RNAはgRNAまたはsgRNAであることが理解されるものとする。
【0027】
本開示は、いくつかの態様において、低分子RNA/DNA発現ベクターのより高次のライブラリーを生成する新たな方法を提供する。本発明に関して、用語「より高次の」は、ライブラリーがベクターによって／介して発現される低分子RNA/DNAの配列が異なる複数種のベクターを含むことを意味するものとする。本方法では、かかる配列を選択ベクターに導入するために変異原性DNAプライマーを用いる。したがって、いくつかの実施態様において、上記少なくとも1種の変異原性DNAプライマーは少なくとも2種の変異原性DNAプライマー、好ましくは少なくとも3種、より好ましくは少なくとも4種、5種、6種、10種、50種、100種、1000種、104種、105種、106種、107種、108種、109種、1010種、1011種または1012種の変異原性DNAプライマーであり、cccDNAの各種が選択低分子RNA/DNAコード配列内に異なる配列を有する。
【0028】
本発明のいくつかの態様において、多数の変異原性DNAプライマー配列種が、（本発明の変異原性DNAプライマーに含有される）選択される低分子RNA/DNAコード配列に少なくとも1つ以上のIUPACコード化塩基（例えば、縮重塩基）を導入することによって提供される。「縮重塩基」または「縮重位置」は、配列の名称中では「n」と呼ばれる。本発明に関して、縮重塩基はヌクレオチド塩基のタイプではなく、本質的に同じ配列を有する核酸の調製物において、該配列中の位置「n」が、この位置での複数種類の塩基の可能性を与える可能性を表す。したがって、少なくとも1つの「n」位置を含有する配列を有する核酸の調製物は、アデニン、グアニン、チミンまたはシトシンのいずれかを（等確率で）位置nに有する核酸の混合物を表す。例えば、オリゴヌクレオチドを合成する場合、1つ以上の位置での反応は、ドナーヌクレオチドとして同量のアデニン、グアニン、チミンおよびシトシンを含有するヌクレオチドを用いて行うことができる。かかる反応では、これらのヌクレオチドは各々、成長オリゴヌクレオチド鎖に付加される等しい機会を有し、したがって位置「n」に異なる塩基を有する分子の混合物が生じることが可能になる。1つの位置に2つまたは3つの異なる塩基のみが導入されることが意図される場合、同じ原理を用いることができる。本開示では、以下の名称が用いられる：R=G、A（プリン）、Y=T、C（ピリミジン）、K=G、T（ケト）、M=A、C（アミノ）、B=G、T、C（A以外の全て）、D=G、A、T（C以外の全て）、H=A、C、T（G以外の全て）、V=G、C、A（T以外の全て）およびN=A、G、C、T（任意）。
【0029】
本発明の他の実施態様では、低分子RNA/DNAコード配列は、少なくとも10ヌクレオチド長～200ヌクレオチド長、より好ましくは10ヌクレオチド長～100ヌクレオチド長、より好ましくは10ヌクレオチド長～50ヌクレオチド長、より好ましくは10ヌクレオチド長～30ヌクレオチド長、より好ましくは15ヌクレオチド長～30ヌクレオチド長、より好ましくは15ヌクレオチド長～25ヌクレオチド長、最も好ましくは17ヌクレオチド長～23ヌクレオチド長、最も好ましくは約20ヌクレオチド長である。配列の長さは、発現される低分子RNA/DNAのタイプに応じて当業者が調整することができる。ガイドRNAおよびshRNAまたはsiRNAの好ましい長さは異なるが、当業者に周知である。
【0030】
本開示の変異原性DNAプライマーは、プライマーと本発明の反応に用いられるss環状ウラシル化ベクター分子とをアニールするのに用いられる隣接相同性領域を含む。したがって、隣接領域は、プライマー伸長に好適な条件での鋳型への変異原性DNAプライマーのアニーリングを可能にする長さであるのが好ましい。3'または5'相同性領域の長さは、同一であってもまたは異なっていてもよい。いくつかの態様において、相同性領域は各々、少なくとも5ヌクレオチド、好ましくは少なくとも10ヌクレオチド、より好ましくは5ヌクレオチド～40ヌクレオチド、最も好ましくは10ヌクレオチド～30ヌクレオチド、または10ヌクレオチド～20ヌクレオチド、最も好ましくは13ヌクレオチド～18ヌクレオチド、さらにより好ましくは約15ヌクレオチドの長さを有する。5ヌクレオチド～40ヌクレオチドが最も好ましい。
【0031】
本発明の方法のいくつかの態様において、一本鎖（ss）ファージミドベクターコンストラクトを、以下の付加的な方法の工程により提供される：
(aa) 同じ配列のdsDNAファージミドベクターを、dUTPアーゼおよび／またはウラシルグリコシラーゼ、および／またはそれらのホモログ、パラログ若しくはオルソログが欠損した細菌株、好ましくはCJ236株において増幅し、ウラシル含有ヘテロ二本鎖dsDNAファージミドベクターを得ること、および
(bb) ウラシル含有ssDNAを含むファージ粒子を生成すること、および
(cc) 前記ファージ粒子から、前記ウラシル含有ssDNAを精製して、少なくとも1つのウラシル塩基を含むssファージミドベクターコンストラクトを得ること。
(aa) 同じ配列のdsDNAファージミドベクターを、dUTPアーゼおよび／またはウラシルグリコシラーゼ、および／またはそれらのホモログ、パラログ若しくはオルソログが欠損した細菌株、好ましくはCJ236株において増幅し、ウラシル含有ヘテロ二本鎖dsDNAファージミドベクターを得ること、および
(bb) ウラシル含有ssDNAを含むファージ粒子を生成すること、および
(cc) 前記ファージ粒子から、前記ウラシル含有ssDNAを精製して、少なくとも1つのウラシル塩基を含むssファージミドベクターコンストラクトを得ること。
【0032】
本発明の様々な態様による好ましい別の実施態様では、dUTPアーゼおよび／またはウラシルグリコシラーゼ、および／またはそれらのホモログ、パラログ若しくはオルソログが欠損した細菌株、好ましくは、CJ236株はヘルパーファージミドを含むものであるか、または工程（bb）において、dUTPアーゼおよび／またはウラシルグリコシラーゼ、および／またはそれらのホモログ、パラログ若しくはオルソログが欠損した細菌株、好ましくはCJ236株にヘルパーファージを感染されるものであり、ヘルパーファージミドまたはヘルパーファージが好ましくはM13KO7である。
【0033】
いくつかの実施態様では、Iによりライブラリーベクターを生成する方法の工程（d）が、前記cccヘテロ二本鎖dsDNAを、XL1またはSS320などの機能的dUTPアーゼおよび／またはウラシルグリコシラーゼ活性を有する細菌において形質転換および増幅することによって行い、前記cccDNAを得ることが好ましい。
【0034】
本発明のいくつかの実施態様において、工程（c）における共有結合閉環状（ccc）ヘテロ二本鎖dsDNAの増幅は、DNAポリメラーゼ活性を有する酵素、例えばT7 DNAポリメラーゼを、任意でT4 DNAリガーゼなどのDNAリガーゼまたは当業者に既知のその代替物と共に用いることによって行われる。
【0035】
別の態様では、本発明の目的は、本明細書に開示される本発明の方法によって生成されるベクターまたはベクターライブラリーを提供することによって解決される。本発明によって作製されるベクターライブラリーは少なくとも106個、より好ましくは107個、108個、最も好ましくは109個の本明細書に記載の異なる種のベクター配列を含むことを特徴とするのが好ましい。
【0036】
さらに、本発明の方法によって作製されるベクターライブラリーの使用を含む、細胞表現型のゲノムワイドスクリーニングの方法が提供される。
【0037】
本発明のスクリーニング方法は、本発明のベクターライブラリー、特にゲノムワイドライブラリーを標的細胞の集団に導入する工程と、任意の対象のアッセイを用いて形質導入細胞の表現型を決定する工程とを含み得る。対象の表現型を有する任意の細胞を、次の工程において形質導入gRNAまたはRNAiの同一性について分析し、表現型の生成に関与する遺伝子またはゲノム領域を特定することができる。例えば、細胞を細胞死誘導剤と接触させてもよく、生存細胞を形質導入3Csベクターについて分析し、細胞死誘導剤に対する耐性に関与する遺伝的摂動を特定する。
【0038】
本発明の別の態様では、本明細書で上述された方法を行うためのキットが提供され、
該キットは、
(a)
(i) gRNA/gDNAプロモーター、空のgRNA/gDNA標的化配列導入部位またはgRNA/gDNA標的化配列を含む少なくとも1つのガイドRNA（gRNA）／ガイドDNA（gDNA）発現カセット、
(ii) 少なくとも1つのファージ複製起点、および
(iii) プロモーター配列の制御下のゲノム編集ヌクレアーゼをコードする配列を含む少なくとも1つの発現カセット、
を含むファージミドベクターコンストラクト、
(b) DNAポリメラーゼ、任意でDNAリガーゼ
(c) 機能的dUTPアーゼおよび／またはウラシルグリコシラーゼ活性を有する細菌細胞の調製物、
(d) 任意で本発明のキットの使用説明書
を含む。
該キットは、
(a)
(i) gRNA/gDNAプロモーター、空のgRNA/gDNA標的化配列導入部位またはgRNA/gDNA標的化配列を含む少なくとも1つのガイドRNA（gRNA）／ガイドDNA（gDNA）発現カセット、
(ii) 少なくとも1つのファージ複製起点、および
(iii) プロモーター配列の制御下のゲノム編集ヌクレアーゼをコードする配列を含む少なくとも1つの発現カセット、
を含むファージミドベクターコンストラクト、
(b) DNAポリメラーゼ、任意でDNAリガーゼ
(c) 機能的dUTPアーゼおよび／またはウラシルグリコシラーゼ活性を有する細菌細胞の調製物、
(d) 任意で本発明のキットの使用説明書
を含む。
【0039】
いくつかの態様では、DNAポリメラーゼはT7 DNAポリメラーゼであり、および／またはDNAリガーゼはT4 DNAリガーゼであり、またはこれらの任意の一般に知られる代替物である。
【0040】
本発明の他の実施態様では、本発明のファージミドベクターコンストラクトは、少なくとも1つのウラシル塩基を含む一本鎖（ss）ファージミドベクターコンストラクトである。
【0041】
さらなる実施態様では、ファージミドベクターはdsDNAベクターである。
【0042】
本発明のキットは、いくつかの実施態様では、dUTPアーゼおよび／またはウラシルグリコシラーゼ、および／またはそれらのホモログ、パラログ若しくはオルソログが欠損した細菌細胞、好ましくはCJ236株の調製物、サンプルまたは培養物を含み得る。かかる株は、関連技術において一般に知られている。
【0043】
本発明のキットに関する他の実施態様では、細菌細胞はヘルパーファージミド、好ましくはM13KO7をさらに含む／含有する。
【0044】
本発明の他の実施態様では、本発明によるキットは、ヘルパーファージミドまたはヘルパーファージの調製物をさらに含み、ここでヘルパーファージミドまたはヘルパーファージは、M13KO7粒子であるのが好ましい。
【0045】
II. cccDNAを使用した固定ペアgRNAベクターおよびベクターライブラリーの生成
【0046】
本発明に関して、2以上の発現可能なgRNA配列（「固定ペア」）を含むgRNAベクターを簡単かつ迅速に生成できるようにすることが特別な目的だった。この問題を解決するために、本発明者らは、上記のcccDNAとKunkelベースの方法を応用し変更した。上記の開示、特に任意の定義は、もちろん技術的に合理的である場合、本発明の特定の態様および実施態様の以下の説明に等しく適用される。
【0047】
本発明に関し、用語「固定ペア」は、2以上の別個の異なる低分子RNA配列、特にゲノムの標的化編集（CRISPRベースのゲノム編集）に適したgRNA配列を指すものとする。本発明による固定ペアは好ましくは、2、3、4、5、6、7、8またはそれ以上の低分子RNA配列などの多数のそのような配列に関係する。いくつかの好ましい態様および実施態様において、この用語はそのような2つの配列に関係する。
【0048】
上記本発明の目的は、第１の態様において核酸によって解決され、該核酸はtracrRNAのそれぞれの野生型配列と比較して50％から95％の間の配列同一性を有する改変tracrRNA配列を含むものであり、該改変tracrRNA配列は、野生型tracrRNA配列と比較して、少なくとも1つ、好ましくは少なくとも2つまたは3つの配列変異を含む。本発明者らは、外向性（exverted）または逆方向反復にクローン化されたときに、立体的に不利な3次元構造に折りたたまれる能力の低下などの改善された特性を示す複数の非野生型tracrRNA配列を開発した。
【0049】
本明細書において、用語「tracrRNA」は、部分的な相補性の領域を介してcrRNA配列と結合し、Cas9ヌクレアーゼまたはCAS9関連ヌクレアーゼまたはタンパク質をプロトスペーサーモチーフに動員する働きをするトランス活性化RNAを指す。一実施態様において、tracrRNAは少なくとも50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、 73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、またはそれ以上の長さのヌクレオチドである。一実施態様において、tracrRNAは約85 ヌクレオチド長である。
【0050】
時々、crRNAおよびtracrRNAは、本明細書で「単一ガイドRNA」または「sgRNA」と呼ばれる1つのポリヌクレオチド配列に設計される。sgRNAのcrRNA相当部分は、Cas9ヌクレアーゼをガイドして任意の所望のプロトスペーサーモチーフを標的化にするように設計される。一実施態様において、sgRNA のtracrRNA相当部分は少なくとも50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、 73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、またはそれ以上の長さのヌクレオチドになるよう設計される。
【0051】
プロトスペーサーモチーフは、Cas9/RNA複合体の動員に役割を果たす短いプロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）に隣接する。Cas9ポリペプチドは、Cas9ポリペプチドに特異的なPAMモチーフを認識する。すなわち、CRISPR/Cas9システムを使用して、特定のCas9ポリペプチドに特異的な特定の3’PAM配列に隣接する二本鎖ポリヌクレオチド配列の一方または両方の鎖を標的にして切断することができる。PAMは、バイオインフォマティクスまたは実験的手法を使用して識別できる。Esvelt etal., 2013, Nature Methods. 10(11):1116-1121は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【0052】
いくつかの実施態様において、態様IおよびIIによる本発明の方法は、ゲノム編集に好適なベクターの生成に向いている。かかるゲノム編集ベクターは通常、ゲノム編集複合体をゲノム中の標的部位へとガイドする選択gRNA配列の導入のための部位を含むガイドRNA発現カセットの存在を特徴とする。そのため、gRNA発現カセットは、標的化のためのgRNA部分と、ゲノム編集ヌクレアーゼ（Cas）への結合のためのgRNAセグメントとの両方を含む。gRNA発現カセットは通常、ヒトもしくはマウスU6プロモーター、またはヒト7SKプロモーター、またはマウスH1プロモーターなどのRNAプロモーターと操作可能に連結（転写調節）している。しかしながら、他のRNAプロモーターが当業者に既知である。ゲノム編集ベクターは通常、Cas9などの発現可能なゲノム編集ヌクレアーゼをさらに含む。態様IIによる発明に関し、さらなる開示が以下に提供される。
【0053】
本明細書で使用される用語「ガイドRNA」は概して、Casタンパク質に結合可能であり、標的ポリヌクレオチド（例えば、DNAまたはRNA）内の特定の位置へのCasタンパク質の標的化を助けることができるRNA配列またｈは分子（または集合的にRNA分子の群）を指す。ガイドRNAは、crRNAセグメントおよびtracrRNAセグメントを含み得る。本明細書では、用語「crRNA」または「crRNAセグメント」は、ポリヌクレオチド標的化ガイド配列、ステム配列および任意で5’オーバーハング配列を含むRNA分子またはその一部分を指す。本明細書で使用される用語「tracrRNA」または「tracrRNAセグメント」は、タンパク質結合セグメント（例えば、タンパク質結合セグメントは、Cas9などのCRISPR関連タンパク質と相互作用することが可能である）を含むRNA分子またはその一部分を指す。用語「ガイドRNA」は、crRNAセグメントおよびtracrRNAセグメントが同じRNA分子中に位置する単一ガイドRNA（sgRNA）を包含する。用語「ガイドRNA」は集合的に、crRNAセグメントおよびtracrRNAセグメントが別個のRNA分子中に位置する2つ以上のRNA分子の群も包含する。ガイドＲＮＡのさらに好ましい構造および実施態様は、本明細書で以下に記載される。
【0054】
用語「スキャフォールド」は、天然の生物学的種間で実質的に同一であるかまたは高度に保存された配列を含むガイドRNA分子の一部分を指す。スキャフォールドは、天然のcrRNAおよびtracrRNAにおいて保存されていない配列を含む任意の非天然部分を除く、tracrRNAセグメントおよびcrRNAセグメントの5’末端または5’末端近傍のポリヌクレオチド標的化ガイド配列以外のcrRNAセグメントの一部分を含む。
【0055】
本発明の様々な実施態様および態様のゲノム編集ベクターはf1バクテリオファージ複製起点、RNAポリメラーゼプロモーター、CRISPR/CasシステムのガイドRNAスキャフォールド、RNAガイドヌクレアーゼ、またはその任意の他の好適な代替物をコードし得る。好ましいコンストラクトは、レンチウイルスベースのコンストラクトである。本発明において使用することができるか、または他のゲノム編集ベクターの開発のための青写真となり得る当該技術分野で既知の標準CRISPR/CasベクターはpLentiCRISPR、pLentiCRISPRv2またはpLentiGuideとして知られるベクターである。
【0056】
いくつかの実施態様において、改変tracrRNA配列と野生型tracrRNA配列は、互いに50％以下、より好ましくは20％以下、より好ましくは10％以下、5％以下、3％以下、最も好ましくは1％以下しか異ならないRNA/DNAまたはゲノム編集ヌクレアーゼに対する結合親和性を有する。
【0057】
本明細書で使用される用語「CRISPRヌクレアーゼ」は、ヌクレアーゼまたはニッカーゼ活性を有し、本発明のgRNAと共に機能して、目的の標的、例えば、DYS遺伝子にDSB（または1つまたは2つのSSB）を導入する、天然に存在するCasヌクレアーゼに由来する組換えタンパク質を指す。実施態様において、CRISPRヌクレアーゼはSpCas9である。実施態様において、CRISPRヌクレアーゼはCpf1である。他の実施態様において、CRISPRヌクレアーゼは SaCas9である。CRISPRヌクレアーゼは TALEN酵素でもあり得る。別の実施態様において、CRISPRヌクレアーゼはニッカーゼ活性を有するCas9タンパク質である。本明細書で使用される用語「Cas9ニッカーゼ」は天然に存在するCas9に由来し、2つのヌクレアーゼドメインの1つが不活性化されておりDNAに一本鎖切断（SSB）を導入する組換えタンパク質を指す。それはRuvCまたはHNHドメインのいずれかであってよい。さらなる一実施態様において、Casタンパク質は、二量体化依存性FoKIヌクレアーゼドメインと融合したdCas9タンパク質である。本発明に従って使用することができる例示的なCRISPRヌクレアーゼは、以下の表１に提供される。Cas9の変異体は、タンパク質工学またはランダム突然変異誘発によって得られる（つまり、天然に存在しない）Cas9ヌクレアーゼであってよい。このようなCas9変異体は機能を維持し、S. pyogenesなどの天然に存在するCas9のアミノ酸配列の変異（欠失、挿入、および／または置換）によって得られる可能性がある。
【0058】
Cas9/ヌクレアーゼなどのCRISPRヌクレアーゼは、PAM配列の3～4bp上流で切断する。一方、Cpf1などのCRISPRヌクレアーゼは、5’オーバーハングを生成する。切断は、標的（＋）鎖のPAMの19 bp後、反対側の鎖(62)の23bpで生じる。野生型Cas9を使用するいくつかのオフターゲットDSBが存在する可能性がある。オフターゲット効果の程度は、オフターゲット部位がオンターゲット部位と比較してどの程度相同であるか、特定部位配列、ならびにヌクレアーゼおよびガイドRNA（gRNA）の濃度を含むいくつかの要因に依存する。これらの考慮事項は、PAM配列がほぼ相同な標的部位に直接隣接している場合にのみ重要である。追加のPAM配列が存在するだけでは、オフターゲットDSBを生成するのに十分ではない。 PAMの後にまたは先行するプロトスペーサーの広範な相同性が必要である。
【0059】
表１：さまざまな種のCRISPRヌクレアーゼシステムの非網羅的なリスト。また、代替PAM配列を認識する操作された変異体も含まれる(Kleinstiver, BP. etal. (2015). Broadening the targeting range of Staphylococcus aureus CRISPR-Cas9by modifying PAM recognition. Nat Biotechnol 33(12): 1293-1298.参照).
【表1】
【0060】
いくつかの好ましい実施態様において、本発明の改変tracrRNA配列は配列番号8～10のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列を含む。
【0061】
本発明に関して、少なくとも１つの配列変異は、少なくとも１つの核酸残基の欠失、置換、挿入、反転（inversion）、付加または化学修飾である。
【0062】
本発明の別の態様において、改変tracrRNA配列を生成する方法を提供し、該方法は以下の工程を含む：
a) 野生型tracrRNAと複合体を形成したRNA/DNAまたはゲノム編集ヌクレアーゼの構造を分析する工程、
b) 野生型tracrRNA配列において、RNA/DNAまたはゲノム編集ヌクレアーゼと接触していない少なくとも1つの残基、好ましくは少なくとも2つ、より好ましくは少なくとも3つのRNA/DNAまたはゲノム編集ヌクレアーゼと接触していない残基を同定する工程、および
c) RNA/DNAまたはゲノム編集ヌクレアーゼと接触していない、前記少なくとも1つの残基、好ましくは少なくとも2つ、より好ましくは少なくとも3つの残基を変異させること、および、これにより、野生型tracrRNA配列と50～95％の配列同一性を含む改変tracrRNA配列が得られ、該改変tracrRNA配列は、野生型tracrRNA配列の結合親和性と比較して、RNA/DNAまたはゲノム編集ヌクレアーゼへの結合親和性を少なくとも50％、より好ましくは80％、より好ましくは90％、95％、97％、および最も好ましくは99％維持する。
a) 野生型tracrRNAと複合体を形成したRNA/DNAまたはゲノム編集ヌクレアーゼの構造を分析する工程、
b) 野生型tracrRNA配列において、RNA/DNAまたはゲノム編集ヌクレアーゼと接触していない少なくとも1つの残基、好ましくは少なくとも2つ、より好ましくは少なくとも3つのRNA/DNAまたはゲノム編集ヌクレアーゼと接触していない残基を同定する工程、および
c) RNA/DNAまたはゲノム編集ヌクレアーゼと接触していない、前記少なくとも1つの残基、好ましくは少なくとも2つ、より好ましくは少なくとも3つの残基を変異させること、および、これにより、野生型tracrRNA配列と50～95％の配列同一性を含む改変tracrRNA配列が得られ、該改変tracrRNA配列は、野生型tracrRNA配列の結合親和性と比較して、RNA/DNAまたはゲノム編集ヌクレアーゼへの結合親和性を少なくとも50％、より好ましくは80％、より好ましくは90％、95％、97％、および最も好ましくは99％維持する。
【0063】
例えば、tracrRNA配列は、それぞれのCRISPRヌクレアーゼと複合体を形成し、次に、たとえばX線結晶学、NMR分光法、および二面偏波式干渉によって構造的に分析されて、そのtracrRNAに結合したヌクレアーゼの構造が決定される。
【0064】
好ましくは、そのように生成された変異tracrRNA配列は、それぞれの野生型tracrRNA配列と比較して、50%（好ましくは60%、70%、80%、85%、または90%）～95%の配列同一性を有する。
【0065】
さらに別の態様では、本発明の目的はガイドRNAの固定ペアを発現させるための共有結合閉環状（ccc）DNAベクターを生成する方法によって解決され、該方法は以下の工程を含む：
(a) ２つの外向性（互いに発現方向が外向き）gRNA発現カセットを含むレシピエントベクターを提供する工程であって、各gRNA 発現カセットはgRNAプレースホルダー配列およびtracrRNA（sgRNA）配列を含むものである、
(b)
i. 第１のgRNA発現カセットに結合することができる第１の相同領域、
ii. 発現される第１の事前決定gRNA配列、
iii. リンカー配列、
iv. 発現される第２の事前決定gRNA配列、
v. 第２のgRNA発現カセットに結合することができる第２の相同領域、
をこの順序で含む変異原性DNAプライマーを提供する工程、
(c) レシピエントベクターと変異原性DNAプライマーを使用してcccDNAベクターを生成する工程、
(d) cccDNAベクターのリンカー配列に２つの外向性RNAプロモーター配列を含むプロモーター断片を導入して、ガイドRNAの固定ペアを発現するためのcccDNAベクターを取得する工程。
(a) ２つの外向性（互いに発現方向が外向き）gRNA発現カセットを含むレシピエントベクターを提供する工程であって、各gRNA 発現カセットはgRNAプレースホルダー配列およびtracrRNA（sgRNA）配列を含むものである、
(b)
i. 第１のgRNA発現カセットに結合することができる第１の相同領域、
ii. 発現される第１の事前決定gRNA配列、
iii. リンカー配列、
iv. 発現される第２の事前決定gRNA配列、
v. 第２のgRNA発現カセットに結合することができる第２の相同領域、
をこの順序で含む変異原性DNAプライマーを提供する工程、
(c) レシピエントベクターと変異原性DNAプライマーを使用してcccDNAベクターを生成する工程、
(d) cccDNAベクターのリンカー配列に２つの外向性RNAプロモーター配列を含むプロモーター断片を導入して、ガイドRNAの固定ペアを発現するためのcccDNAベクターを取得する工程。
【0066】
gRNAプレースホルダーまたはgRNAプレースホルダー配列は、上記の方法を実施する過程で、本発明の固定ペアで発現される第１または第２のgRNA配列によって置き換えられることを意図するランダムに選択されたgRNA配列のいずれかとして理解されるべきである。ランダムgRNA配列にかえて、任意の他のランダム配列を使用してもよい。配列の長さは、効率的なハイブリダイゼーションとプライマー合成を可能にするために、変異原性DNAプライマーの全長に対応するように選択される。
【0067】
好ましい実施態様において、一方または両方のgRNA発現カセットのtracrRNA配列は、本明細書で上記に記載されているように、改変または変異されたtracrRNA配列である。好ましくは tracrRNA配列は配列番号７～１０のいずれか１つに示される配列である。最も好ましくはtracrRNA配列の１つは、配列番号１０に示される配列であるか、または、その配列と少なくとも80、85、90、または95％同一配列である。
【0068】
いくつかの実施態様では、工程(a)において、2つのgRNAプレースホルダー配列はリンカーによって分離されており、該リンカー配列は変異原性DNAプライマーのリンカー配列と同一である。好ましくは、リンカー配列は、例えば、平滑末端ライゲーションのための制限酵素認識部位、または粘着末端ライゲーションのための制限酵素認識部位などの制限酵素認識部位を含む。平滑末端または粘着末端制限酵素の切断点へのライゲーションでは、挿入配列の方向性クローニングはできない。しかしながら、2つの制限酵素認識部位の2つの異なる粘着末端配列は互換性がなく、挿入配列を一方向のみの切断点にライゲーションすることができることから、2つの異なる制限ヌクレアーゼ認識部位を互いに十分な間隔で使用することにより、方向性クローニングが可能になる。したがって、いくつかの実施態様において、リンカー配列は、2つの制限酵素認識部位、好ましくは、方向性RNAプロモーターライゲーションのための2つの異なる制限酵素認識部位を含む。
【0069】
いくつかの好ましい実施態様において、レシピエントベクターは、以下のいずれか、またはすべて、または任意の組み合わせを含む：
- f1 ORIなどのファージ複製起点（ORI）、
- 遺伝子編集ヌクレアーゼ用の発現カセット、
- １以上の選択マーカー
- f1 ORIなどのファージ複製起点（ORI）、
- 遺伝子編集ヌクレアーゼ用の発現カセット、
- １以上の選択マーカー
【0070】
いくつかの実施態様において、本発明の方法は好ましくは(c)の工程において、cccDNAベクターは、次の手順で生成される：
(a') 一本鎖（ss）ファージミドベクターとしてのレシピエントベクターを提供する工程、
(b') 変異原性DNAプライマーを前記ssファージミドベクターにアニーリングする工程、
(c') そこから共有結合閉環状（ccc）-ヘテロ二本鎖dsDNAを増幅する工程、および
(d') 残存野生型ファージミドベクターDNAを除去する工程。
(a') 一本鎖（ss）ファージミドベクターとしてのレシピエントベクターを提供する工程、
(b') 変異原性DNAプライマーを前記ssファージミドベクターにアニーリングする工程、
(c') そこから共有結合閉環状（ccc）-ヘテロ二本鎖dsDNAを増幅する工程、および
(d') 残存野生型ファージミドベクターDNAを除去する工程。
【0071】
好ましい実施態様では、本発明の工程(d)において、プロモーター断片は、例えば、制限酵素を使用して、リンカー配列に二本鎖切断を誘導することによってリンカー配列に導入され、前記プロモーター要素をそのように誘導された二本鎖切断に連結する。用語「制限酵素配列」は特定のヌクレオチド配列またはその近傍で二本鎖DNAを切断する細菌の酵素によって認識および切断される特定の二本鎖DNA配列を指す。
【0072】
本明細書で使用される用語「粘着末端」または「オーバーハング」は、一般に、関連技術の当業者の理解と一致するものとして解釈され、一本鎖分子の末端に１以上のペアになっていないヌクレオチド種を有する線状二本鎖核酸分子を含み、該ペアになっていないヌクレオチド種は、いずれかの鎖に存在してよく、単一の塩基位置または複数の塩基位置（「付着末端」と呼ばれることもある）を含んでよい。本明細書で使用される用語「平滑末端」または「平滑末端の」は、一般に、１つのペアの相補的ヌクレオチド塩基種で終結する末端を有する線状二本鎖核酸分子を指すものであり、平滑末端のペアは、常に相互のライゲーションに対応する。好ましい制限酵素部位は本明細書の実施例のセクションで使用されている。しかしながら、代替のエンドヌクレアーゼ部位は当業者によく知られている。本発明に関して好ましくは、使用された制限酵素は、粘着末端の二本鎖切断または平滑末端の二本鎖切断のいずれかを誘発する。いくつかの態様において、リンカーは、前記プロモーター要素の方向性のある導入を可能にするために使用される、互いに近接した２つの異なる制限酵素認識部位を含むことが好ましい場合がある。いくつかの実施態様において、近接は、両方の認識部位が互いに50以下、好ましくは20、10または5つ核酸離れている。
【0073】
本発明の別の実施態様において、本発明は共有結合閉環状（ccc）DNAベースのガイドRNA発現ベクターまたはベクターライブラリーを生成する方法に関するものであり、該方法は次の工程を含む：
(a) (i)少なくとも２つのガイドRNA発現カセットのそれぞれは、tracrRNA（sgRNA）配列および空の標的ガイドRNA配列導入部位またはガイドRNAプレースホルダー配列、またはそれらの部分配列を含む、少なくとも２つのガイドRNA発現カセット、(ii)ファージORI、特にf1複製起点などの少なくとも1つの一本鎖DNAの複製起点（ORI）、を含む一本鎖（ss）ファージミドベクターを提供する工程、
(b) 少なくとも1種の変異原性DNAプライマーを提供する工程であって、変異原性DNAプライマーは、3’から5’方向に次の構造：第１の相同性領域、発現される第１のガイドRNAをコードする第１の標的配列領域、第２の相同性領域、発現される第２のガイドRNAをコードする第２の標的配列領域、および第３の相同性領域有し、第１の相同性領域は5’側で空の第１の標的ガイドRNA配列導入部位または第１のガイドRNAコード配列またはそれらの部分配列に隣接するssファージミドベクターコンストラクトの配列に相補的であるか、またはアニーリングすることができるものであり、第２の相同性領域は、3’側で空の第１の標的ガイドRNA配列導入部位または第１のガイドRNAコード配列またはそれらの部分配列に隣接するssファージミドベクターコンストラクトの配列に相補的であるか、またはアニーリングすることができるものであり、第３の相同性領域は、3’側で空の第２の標的ガイドRNA配列導入部位または第２のガイドRNAコード配列またはそれらの部分配列に隣接するssファージミドベクターコンストラクトの配列に相補的であるか、またはアニーリングすることができる、工程、
(c) 少なくとも1種の変異原性DNAプライマーをssファージミドベクターコンストラクトにアニーリングし、そこから共有結合閉環状（ccc）ヘテロ二本鎖dsDNAを増幅する工程、
(d) 残存野生型ファージミドベクターDNAを除去する工程、および
(e) 第１のガイドRNAおよび第２のガイドRNAを発現可能なRNAプロモーターを提供する工程。
(a) (i)少なくとも２つのガイドRNA発現カセットのそれぞれは、tracrRNA（sgRNA）配列および空の標的ガイドRNA配列導入部位またはガイドRNAプレースホルダー配列、またはそれらの部分配列を含む、少なくとも２つのガイドRNA発現カセット、(ii)ファージORI、特にf1複製起点などの少なくとも1つの一本鎖DNAの複製起点（ORI）、を含む一本鎖（ss）ファージミドベクターを提供する工程、
(b) 少なくとも1種の変異原性DNAプライマーを提供する工程であって、変異原性DNAプライマーは、3’から5’方向に次の構造：第１の相同性領域、発現される第１のガイドRNAをコードする第１の標的配列領域、第２の相同性領域、発現される第２のガイドRNAをコードする第２の標的配列領域、および第３の相同性領域有し、第１の相同性領域は5’側で空の第１の標的ガイドRNA配列導入部位または第１のガイドRNAコード配列またはそれらの部分配列に隣接するssファージミドベクターコンストラクトの配列に相補的であるか、またはアニーリングすることができるものであり、第２の相同性領域は、3’側で空の第１の標的ガイドRNA配列導入部位または第１のガイドRNAコード配列またはそれらの部分配列に隣接するssファージミドベクターコンストラクトの配列に相補的であるか、またはアニーリングすることができるものであり、第３の相同性領域は、3’側で空の第２の標的ガイドRNA配列導入部位または第２のガイドRNAコード配列またはそれらの部分配列に隣接するssファージミドベクターコンストラクトの配列に相補的であるか、またはアニーリングすることができる、工程、
(c) 少なくとも1種の変異原性DNAプライマーをssファージミドベクターコンストラクトにアニーリングし、そこから共有結合閉環状（ccc）ヘテロ二本鎖dsDNAを増幅する工程、
(d) 残存野生型ファージミドベクターDNAを除去する工程、および
(e) 第１のガイドRNAおよび第２のガイドRNAを発現可能なRNAプロモーターを提供する工程。
【0074】
前述のように、本発明の方法にとって好ましくは、少なくとも２つのガイドRNA発現カセットのうちの一方のtracrRNA配列は、少なくとも２つのガイドRNA発現カセットのうちの他方のtracrRNA配列と同一ではない。これは、tracrRNA配列の外向性（exverted）反復配向によるコンストラクト内の3次元構造の形成を回避するためである。そのような三次元構造は、固定ペアベクターを生成するためのさらなる方法工程を損なう可能性がある。一方および他方のガイドRNA発現カセットのtracrRNA配列は、それらの配列相同性が50から95％の間であるという特徴を有する、および／またはtracrRNA配列は、同じまたは異なるRNA/DNAまたはゲノム編集ヌクレアーゼに結合する能力を有することが好ましい。
【0075】
２つのgRNA発現カセットは、好ましくは外向性（extraverted）の配向であり、好ましくは、第１のガイドRNAは3’から5’方向に配向され、第２のガイドRNAは5’から3’方向に配向される。
【0076】
前述のとおり、第１のガイドRNA配列と第２のガイドRNA配列との間の配列は、制限エンドヌクレアーゼによって認識される少なくとも１つの制限エンドヌクレアーゼ認識配列を含む。そのようなヌクレアーゼおよびそれらの認識部位は、本明細書上に記載されている。
【0077】
好ましくは、本発明に関して、工程(e)は以下を含む：
(i) cccヘテロ二本鎖dsDNAを少なくとも1つの制限エンドヌクレアーゼと接触させる工程であって、少なくとも１つの制限エンドヌクレアーゼは、第１のガイドRNA配列と第２のガイドRNA配列との間に位置する少なくとも１つの制限エンドヌクレアーゼ認識配列を切断することができるものであり、その条件は、第１の制限エンドヌクレアーゼ認識配列ハーフサイトおよび第２の制限エンドヌクレアーゼ認識配列ハーフサイトを含む切断産物を生成するのに十分である、工程、
(ii) 第１の制限エンドヌクレアーゼ認識配列ハーフサイト、第１のRNAプロモーター、第２のRNAプロモーターおよび第２の制限エンドヌクレアーゼ認識配列ハーフサイトを含む双方向DNA/RNA 断片を提供する工程であって、第１の認識配列のハーフサイトは、工程（ｉ）由来の切断産物の第１の認識配列のハーフサイトと互換性があり、第２の認識配列ハーフサイトは、工程（ｉ）由来の切断産物の第２の認識配列ハーフサイトと互換性があり、第１のRNAプロモーターは3’から5’方向に配向され、第２のRNAプロモーターは5’から3’方向に配向される、工程、および
(iii) ライゲーション産物組成物を生成するのに十分なライゲーション条件下で、工程(i)由来の切断産物と工程(ii)由来の双方向DNA/RNA 断片を組み合わせる工程であって、第１のガイドRNAの5’末端は、第１のRNAプロモーターの3’末端に作動可能に連結され、第２のガイドRNAの5’末端は、第２のRNAプロモーターの3’末端に作動可能に連結される、工程。
(i) cccヘテロ二本鎖dsDNAを少なくとも1つの制限エンドヌクレアーゼと接触させる工程であって、少なくとも１つの制限エンドヌクレアーゼは、第１のガイドRNA配列と第２のガイドRNA配列との間に位置する少なくとも１つの制限エンドヌクレアーゼ認識配列を切断することができるものであり、その条件は、第１の制限エンドヌクレアーゼ認識配列ハーフサイトおよび第２の制限エンドヌクレアーゼ認識配列ハーフサイトを含む切断産物を生成するのに十分である、工程、
(ii) 第１の制限エンドヌクレアーゼ認識配列ハーフサイト、第１のRNAプロモーター、第２のRNAプロモーターおよび第２の制限エンドヌクレアーゼ認識配列ハーフサイトを含む双方向DNA/RNA 断片を提供する工程であって、第１の認識配列のハーフサイトは、工程（ｉ）由来の切断産物の第１の認識配列のハーフサイトと互換性があり、第２の認識配列ハーフサイトは、工程（ｉ）由来の切断産物の第２の認識配列ハーフサイトと互換性があり、第１のRNAプロモーターは3’から5’方向に配向され、第２のRNAプロモーターは5’から3’方向に配向される、工程、および
(iii) ライゲーション産物組成物を生成するのに十分なライゲーション条件下で、工程(i)由来の切断産物と工程(ii)由来の双方向DNA/RNA 断片を組み合わせる工程であって、第１のガイドRNAの5’末端は、第１のRNAプロモーターの3’末端に作動可能に連結され、第２のガイドRNAの5’末端は、第２のRNAプロモーターの3’末端に作動可能に連結される、工程。
【0078】
本発明のガイドRNA配列は最終的にRNAプロモーターの制御下で発現される。好ましくは、第１のRNAプロモーターと第２のRNAプロモーターは同一であるか、または、好ましくは同一ではない。用語「プロモーター」は、RNAポリメラーゼを結合／動員することが可能であり、プロモーターから下流または3’方向に配列の転写を開始することができる調節配列／要素または制御配列／要素を意味すると理解される。例えば、プロモーターは、構成的に活性であるか、または常にオンであるか、または誘導性であってよく、誘導性の場合、プロモーターは、外部刺激の存在下で活性または不活性である。RNAプロモーターの例としては、h7SK、T7プロモーターまたはU6 プロモーターが含まれる。
【0079】
いくつかの実施態様において本発明で使用するベクターは、任意でプロモーター（安定または誘導性）に作動可能に連結されており、該プロモーターは好ましくはmRNAの発現に好適である、野生型または操作された形態のRNA/DNAまたはゲノム編集ヌクレアーゼ（CRISPRヌクレアーゼ）発現配列をさらに含む。
【0080】
ガイドRNA（gRNA）は、少なくとも10から200ヌクレオチド長、より好ましくは10から50、より好ましくは10から30、より好ましくは15から30、より好ましくは15から25、最も好ましくは17から23、さらにより好ましくは約20ヌクレオチド長である。
【0081】
本明細書に記載の方法において、相同領域は少なくとも5ヌクレオチド、好ましくは少なくとも10ヌクレオチド、より好ましくは5から40ヌクレオチド、最も好ましくは10から30、または10から20、最も好ましくは13から18、さらにより好ましくは約15ヌクレオチドの長さを有する。本発明の他の代替のまたは付加的な実施態様において、相同領域は、約40～60℃、好ましくは約45～55℃、最も好ましくは50℃+/- 3のTmを有する配列からなる。
【0082】
いくつかの態様における本発明の方法は、共有結合閉環状（ccc）DNAベースのガイドRNA発現ベクターまたはベクターライブラリーを生成するために使用されるものであって、各ベクターは、少なくとも2つの異なるgRNA（固定ペア）の定義された組み合わせを含む。
【0083】
本発明の非限定的な例として、免疫原性DNAプライマーは配列番号１～５のいずれかに記載の配列を有してよい。
【0084】
さらに好ましい実施態様では、上記の「固定ペア」gRN発現ベクターを生成するための技術は、図１１に示されるさらなる態様に従って使用される。簡単に言えば、本明細書に記載の固定ペア法は、本明細書のセクションＩに開示されるようなgRNA発現ベクターを生成する方法と直接組み合わせて使用される。この実施態様は、鋳型ベクターの他のtracrRNA配列と同一ではない、追加のgRNA発現カセットの追加で使用されるtracrRNA配列も含んでよい。１つの追加のまたは代替の実施態様は同じベクターで2回同時に使用される固定ペア技術の方法に関する（図１１ｃ参照）。
【0085】
また、本発明の一部は本明細書に記載の方法によって得られるベクターライブラリーを形成する。
【0086】
本発明の別の実施態様では、２つの異なるガイドRNA配列を導入および発現するための核酸ベクターを提供し、該ベクターは、外向性配向［互いに外向きの発現方向］で、以下を含む：
(i) 第１のtracrRNA（sgRNA）配列と第１のgRNAプレースホルダー配列を含む、第１のgRNA発現カセット、および
(ii) 第２のtracrRNA（sgRNA）配列と第２のgRNAプレースホルダー配列を含む、第２のgRNA発現カセット。好ましくは第１および第２のtracrRNA配列は同一ではない。いくつかの実施態様において、外向性反復配向（extraverted repeat orientation）での第１および第２のtracrRNA配列からなる核酸配列は、約100～-100 kcal/mol以上の最小自由エネルギーを有する。
(i) 第１のtracrRNA（sgRNA）配列と第１のgRNAプレースホルダー配列を含む、第１のgRNA発現カセット、および
(ii) 第２のtracrRNA（sgRNA）配列と第２のgRNAプレースホルダー配列を含む、第２のgRNA発現カセット。好ましくは第１および第２のtracrRNA配列は同一ではない。いくつかの実施態様において、外向性反復配向（extraverted repeat orientation）での第１および第２のtracrRNA配列からなる核酸配列は、約100～-100 kcal/mol以上の最小自由エネルギーを有する。
【0087】
いくつかの好ましい実施態様において、ベクターは、第１および第２のgRNA発現カセット間のリンカーを含むものであり、該リンカーはgRNAプレースホルダー配列に隣接している。好ましくは、該リンカーは、制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含み、好ましくは平滑末端または粘着末端の二本鎖切断を導入するのに適している（上記を参照）。
【0088】
固定ペアgRNAベクターを生成する方法で使用するのに適した鋳型ベクターについての上記の実施態様は、等しく適用される。
【0089】
本発明のさらに別の態様は、本明細書に記載の発明の任意の化合物を含む部品のキットに関し、任意で、細菌の形質転換、および／またはDNA/RNA単離、および／または制限酵素消化、および／またはライゲーションのいずれかに適したバッファーまたは試薬を含む。
【0090】
III. 拡張された固定ペア3Cs遺伝子編集
【0091】
さらに別の態様において本発明の目的はガイドRNAの固定ペアを発現するための共有結合閉環状（ccc）DNAベクターを生成するための拡張された方法によって解決される。上記のセクションIIで開示された上記の方法は、依然として残りの古典的なクローニング工程を必要とするので、さらなる戦略であって固定ペアの原理に基づいて開発される戦略が開示される。
【0092】
CRISPR法には、必要な構造要素と、標的DNAへの相補的結合のためのガイド配列を含む機能的RNA複合体の生成のための2つの可能性が含まれる場合がある。しばしば使用されるのは、標的相補領域（「プロトスペーサー」と呼ばれることもある）を含む単一分子としてのガイドRNAであり、tracrRNAに相補的であるcrRNA「反復」配列に融合され、crRNA反復配列とtracrRNA配列の二本鎖の形成をもたらす。しかしながら、標的ガイド配列がcrRNA配列に融合され、tracrRNAが別個の分子として発現される可能性もあるが、crRNA配列とtracrRNAの相補的塩基ペア形成を介して複合体を形成する可能性もある。本発明者らは本発明の第３の態様として後者の戦略を用いた。
【0093】
したがって、本発明の拡張された3Cs固定ペア法は以下の工程を含む：
(a) (x) 2つの逆方向の[発現方向が互いに向き合う]拡張されたgRNA発現カセット（第１および第２の拡張されたgRNA発現カセット）であって、各拡張されたgRNA発現カセットは (i)任意でRNAプロモーター、(ii)RNAプレースホルダー配列、および(iii) crRNA（トレーサー配列を欠くsgRNA配列）配列の順序で含むものである、拡張されたgRNA発現カセット、および(y) tracrRNA発現カセットを含む拡張されたレシピエントベクターを提供する工程、
(b) 目的の2つのgRNA配列と、変異原性DNAプライマーの2つの逆方向の拡張されたgRNA発現カセットへの結合を仲介できる相同性領域を含む拡張された変異原性DNAプライマーを提供する工程、および
(c) レシピエントベクターと変異原性DNAプライマーを使用してcccDNAベクターを生成する工程。
(a) (x) 2つの逆方向の[発現方向が互いに向き合う]拡張されたgRNA発現カセット（第１および第２の拡張されたgRNA発現カセット）であって、各拡張されたgRNA発現カセットは (i)任意でRNAプロモーター、(ii)RNAプレースホルダー配列、および(iii) crRNA（トレーサー配列を欠くsgRNA配列）配列の順序で含むものである、拡張されたgRNA発現カセット、および(y) tracrRNA発現カセットを含む拡張されたレシピエントベクターを提供する工程、
(b) 目的の2つのgRNA配列と、変異原性DNAプライマーの2つの逆方向の拡張されたgRNA発現カセットへの結合を仲介できる相同性領域を含む拡張された変異原性DNAプライマーを提供する工程、および
(c) レシピエントベクターと変異原性DNAプライマーを使用してcccDNAベクターを生成する工程。
【0094】
好ましい実施態様において、本発明の方法は他の場所で本明細書に記載される生成力のある（generative）cccDNAの工程、好ましくは、拡張された変異原性DNAプライマーの配列を拡張されたレシピエントベクターに導入するためのいわゆるKunkelの変異誘発法を使用することによる生成力のあるcccDNAの工程を含む。好ましい実施態様におけるそのような方法は、方法工程(c)において以下のサブ工程を含み得る： (a')一本鎖（ss）ファージミドベクターとしてレシピエントベクターを提供する工程、(b')変異原性DNAプライマーを前記ssファージミドベクターにアニーリングする工程、(c')そこから共有結合閉環状（ccc）ヘテロ二本鎖dsDNAを増幅する工程、および (d')残存野生型ファージミドベクターDNAを除去する工程。
【0095】
本発明の拡張された3Cs固定ペア法はgRNA発現用のRNAプロモーター領域を含むリンカー断片を導入する工程を必要としないため、一般的なクローニングの問題やエラーが発生しにくくなる。
【0096】
本発明のいくつかの好ましい実施態様において、tracrRNA発現カセットは、拡張されたレシピエントベクターの逆方向の拡張されたgRNA発現カセットの間に位置していない。
【0097】
本発明のいくつかの好ましい実施態様において、tracrRNA発現カセットは、crRNA配列を欠き、tracrRNAの発現に適したプロモーターに作動可能に連結されているtracrRNAコード配列を含む。
【0098】
本発明のいくつかの好ましい実施態様において、レシピエントベクターによって発現される場合crRNA配列を欠くtracrRNA配列、およびcrRNA配列は互いに相互作用して機能的なcrRNA－tracrRNA複合体を形成するRNA分子を生成する。
【0099】
本発明の本態様の目的のため、crRNA配列は、crRNA配列を欠くtracrRNA配列の一部に相補的である。したがって、crRNAの発現時に（好ましくはgRNA配列に融合した場合）、crRNAはtracrRNAに結合し、Cas9依存性遺伝子編集を仲介するための機能的RNA複合体を形成する。
【0100】
本発明のいくつかの他の好ましい実施態様において、 crRNA配列はcrRNA配列の既知の「反復」配列、例えば、化膿レンサ球菌（Streptococcuspyogenes）のcrRNA配列 (Kooning, EV et al Curr. Opin. Microbiol. 37, 67-78 2017、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる) を含む。本発明の好ましいcrRNA配列は例えば図１２ｄに開示される。
【0101】
いくつかの実施態様において、拡張されたgRNA発現カセットのそれぞれの中で、RNAプロモーター配列およびgRNAプレースホルダー配列が作動可能に連結されていることが好ましく、本発明に従ってgRNA配列がプレースホルダーに導入される場合、gRNA配列は、RNAプロモーター配列の制御下で発現されることが理解されるべきである。
【0102】
本発明の好ましい実施態様において、拡張されたレシピエントベクターは、次の要素を直接かつ中断のない連続した順序で含む：(i) 第１のRNA プロモーター、(ii)第１のgRNAプレースホルダーまたはgRNA配列であって、(i)および (ii)は操作可能な鎖（operable linkage）中にあり、(iii)第１のcrRNA (反復) 配列、(iv)任意でリンカーとそれに続く次の要素であって、それぞれ（i）から（iii）と比較して逆方向になっている：(v) 第２のcrRNA配列、(vi)第２のgRNAプレースホルダーまたはgRNA配列、(vii) 第２のRNAプロモーターであって、(vii) および (vi)は操作可能な鎖（operable linkage）中にある。
【0103】
いくつかの好ましい実施態様において、拡張された変異原性DNAプライマーはこの順序で含まれる：
i. 第１の拡張されたgRNA発現カセットに結合することができる第１の相同領域、
ii. 発現される第１の所定のgRNA配列、
iii. 逆方向のcrRNA配列に結合できる第２の相同領域、および、任意でリンカー、
iv. 発現される第２の所定のgRNA配列、
v. 第２の拡張されたgRNA発現カセットに結合できる第３の相同領域。
i. 第１の拡張されたgRNA発現カセットに結合することができる第１の相同領域、
ii. 発現される第１の所定のgRNA配列、
iii. 逆方向のcrRNA配列に結合できる第２の相同領域、および、任意でリンカー、
iv. 発現される第２の所定のgRNA配列、
v. 第２の拡張されたgRNA発現カセットに結合できる第３の相同領域。
【0104】
いくつかの実施態様において、上記方法は工程(a)と(c)との間の方法がクローニング、好ましくは、ヌクレアーゼベースの二本鎖切断の導入とそれに続くライゲーション（例えば、ベクターの一部の導入または切除後）の工程を指すクローニングの工程、を含まないことが好ましい。
【0105】
したがって、本発明の課題は、次の要素を直接かつ中断のない連続した順序で含む拡張されたレシピエントベクターによってさらに解決される：(i)第１のRNAプロモーター、 (ii) 第１のgRNAプレースホルダーまたはgRNA配列であって、 (i) および (ii)は作動可能な鎖中あり、(iii) 第１のcrRNA（反復）配列、 (iv) 任意でリンカーとそれに続く次の要素であって、それぞれ(i)から(iii)と比較して逆方向になっている： (v) 第２のcrRNA配列、(vi)第２の gRNAプレースホルダーまたはgRNA配列、(vii)第２のRNAプロモーターであって、 (vii)および (vi) は操作可能な鎖中にあり、tracrRNA発現カセットをさらに含む拡張されたレシピエントベクター。
【0106】
3Cs反応を成功させるために必要な上記の他の態様で言及されたすべての要素および実施態様は、該当する場合または必要な場合、参照により組み込まれるものとする。
【0107】
本発明の他の方法および組成物について記載されたすべての用途および使用もまた、この態様の好ましい実施形態として等しく適用される。
【0108】
本明細書で使用される場合、「含む（comprising）」という用語は、「含む（including）」および「からなる（consisting of）」の両方を包含すると解釈されるべきであり、両方の意味は、具体的に意図され、したがって、本発明による個別に開示される実施態様である。本明細書で使用される場合、「および／または」は、２つの特定の特徴または構成要素のそれぞれの特定の開示として、他方の有無にかかわらず解釈されるべきである。例えば、「Aおよび／またはB」は、（i）A、（ii）B、および（iii）AおよびBのそれぞれの特定の開示として、それぞれが本明細書に個別に記載されていると解釈されるべきである。本発明に関し、用語「約」および「およそ」は当業者が問題の特徴の技術的効果を依然として確実にするために理解するであろう正確さの間隔を示す。この用語は通常、示された数値から±20％、±15％、±10％、たとえば±5％の偏差を示す。当業者によって理解されるように、所与の技術的効果の数値に対する特定のそのような偏差は、技術的効果の性質に依存するであろう。例えば、自然または生物学的技術的効果は、一般に、人工的または工学的技術的効果の場合よりも大きな偏差を有する可能性がある。当業者によって理解されるように、所与の技術的効果の数値に対する特定のそのような偏差は、技術的効果の性質に依存するであろう。例えば、自然または生物学的技術的効果は、一般に、人工的または工学的技術的効果の場合よりも大きな偏差を有する可能性がある。単数名詞を参照する場合に不定冠詞または定冠詞、例えば、「a」、「an」、または「the」が使用される場合、特に明記されていない限り、これらにはその名詞の複数形が含まれる。
【0109】
特定の問題または環境への本発明の教示の適用、および本発明の変形またはそれに対する追加の特徴（さらなる態様および実施態様など）の包含は、本明細書に含まれる教示に照らして、当業者の能力の範囲内にあるであろうと理解されるべきである。
【0110】
文脈が別段の指示をしない限り、上記の特徴の説明および定義は、本発明の特定の態様または実施態様に限定されず、説明されるすべての態様および実施態様に等しく適用される。
【0111】
本明細書で引用されたすべての参考文献、特許、および刊行物は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【0112】
本発明は、以下の実施例において、添付された図面および配列表を参照してさらに説明されるが、それに限定されることはない。
【図面の簡単な説明】
【0113】
【図1-1】a) gRNA多重化または定義された固定ペアgRNA試薬を生成するための2つのgRNA発現カセットの組み合わせ。従来の3Cs gRNA多重化は、いずれかのgRNA発現カセットを標的とするgRNAのすべての可能な組み合わせを含む試薬をもたらす（複雑さ(complexity)＝カセットのgRNAの数n * カセットのgRNAの数m、c = n * m）。対照的に、3Cs固定ペアgRNA合成によってgRNAの組み合わせを事前に決定すると、個々に定義されたgRNAの組み合わせの数が複雑な試薬となる(c = n = m)。b) 単一の固定ペアのgRNAの2つのgRNAは、近接したDNAを標的とするように定義でき、2つのgRNA標的配列間に存在するDNAが失われる。そのため、固定ペアのgRNA試薬を利用してDNA配列を正確に切り出すことができる。c) 単一の固定ペアのgRNAの2つのgRNAは、同じ遺伝子標的（遺伝子、要素、非コード配列など）に対して定義でき、これにより、所望の編集または変更イベントの効率が大幅に向上する。あるいは、単一の固定ペアのgRNAの2つのgRNAは、2つの異なる遺伝子標的（遺伝子、要素、非コード配列など）に対して定義できる。これにより、同じ細胞内の2つの定義された配列要素を正確に編集または変更できる。d) 固定ペアgRNA試薬は、（i）ヌクレアーゼ活性野生型Cas酵素または（ii）単一活性部位不活化Cas酵素であるニッカーゼとともに使用できる。e) 固定ペアgRNAの使用は、活性Cas酵素に限定されず、遺伝的要素の（i）不活性化、（ii）活性化、（iii）エピジェネティック修飾、または（iv）視覚化のために酵素的に死んだCas酵素に拡張できる。
【図1-2】同上
【図1-3】同上
【図1-4】同上
【図2-1】a) 定義された3Cs固定ペアgRNA試薬を生成するための概念的なワークフロー。2つの外向性tracrRNAおよびgRNAをコードするプレースホルダー（I-SceI部位）は、ランダムにデオキシウラシルを組み込むためにCJ236細菌で増幅された鋳型dsDNAプラスミドに組み込まれている。CJ236細菌のM13K07重複感染は、鋳型プラスミドのssDNAコピーを含むバクテリオファージ粒子をもたらす。5’および3’相同性と2つの定義されたgRNA配列をコードするDNAオリゴヌクレオチドは、ssDNAにアニーリングされ、T7DNAポリメラーゼおよびT4リガーゼの活性によってそれぞれ伸長およびライゲーションされる。鋳型および新しく合成された3Cs DNAからなる得られたヘテロ二本鎖dsDNAは、非CJ236細菌に形質転換され、新しいDNA鎖を増幅し、dU含有鋳型DNAを分解する。定義されたgRNAの組み合わせの得られたdsDNAは、その後2つの新しいgRNA配列間の酵素消化によって開かれ、双方向RNAプロモーター配列とライゲーションされ、最終的に定義された3Cs固定ペアgRNA試薬が得られる。b) オリゴヌクレオチドアニーリング部位の詳細かつ例示された配列図。野生型暗示プラスミドDNAを除去するその後の精製工程を可能にする2つの制限酵素認識部位の存在に留意されたい。c) 定義された3Cs固定ペアgRNAの組み合わせは、単一のCasヌクレアーゼの使用に限定されない。2つの異なるtracrRNA配列を使用できるため、標的配列の範囲が広がり、野生型と酵素的に死んだまたは修飾されたCasヌクレアーゼの組み合わせを使用できる（図１ｄ、ｅ）。d) 所望のDNA配列で定義された固定ペアgRNAの組み合わせの最大数は、tracr#1の標的配列の数にtracr#2の標的配列の数を掛けた結果である。SpCas9標的配列をそれ自体と組み合わせる場合、定義された固定ペアgRNAの平均的な組み合わせは150 * 150になる（図２ｃ）。異なるCas酵素を組み合わせると、Cas酵素のPAM選択性が高まるため、数が減少する。
【図2-2】同上
【図2-3】同上
【図3-1】a) SpCas9 tracrRNA配列（#1-3）内の選択された配列要素は、3Cs鋳型DNAに2つの非常に類似した配列が存在するのを防ぐように適合させることができる。配列スキームはKonermann et al., 201514を適応させた。配列は配列番号７で提供される。b) 合理的に操作されたSpCas9tracrRNA配列v2（配列番号９）およびv3（配列番号１０）と野生型SpCas9 tracrRNA配列（配列番号８）との比較。青と赤の文字は、合理的な配列の変更を示す。 V2は以前Chen et al., 201316によって報告された。
【図3-2】同上
【図4-1】a) pLKO.1に基づいて、本発明者らは、以下のCasヌクレアーゼの組み合わせを可能にするtracrRNA配列を含む5つの3Cs鋳型dsDNAプラスミドを生成した：SpCas9:SpCas9 (v1.v2、およびv2.v3)、SpCas9:SaCas9 (v2.Sa)、SpCas9:NmCas9(v2.Nm)およびSpCas9:AsCpf1 (v2.As)。すべてのプラスミドは、制限酵素消化分析を行い、ゲル電気泳動によって分析されたときに予想されるバンドパターンをもたらしており、正しいクローニングおよび3Cs鋳型の生成を確認した。b) すべての3Cs鋳型dsDNAプラスミドはdU含有ssDNAに変換され、ゲル電気泳動によって分離され、高純度のssDNAが明らかになった。c) 5つすべての3Cs鋳型ssDNAを運ぶバクテリオファージを使用して、XL1細菌に感染させ、ssDNAをdsDNAに変換し直し、3Cs鋳型ssDNAの品質を間接的に分析した。驚くべきことに、SpCas9 tracrRNAの組み合わせv1およびv2に対応するssDNAは、重度の組換えを受ける。対照的に、試験された他のすべてのtracrRNAの組み合わせに対応するssDNAは組換えイベントがないため、固定ペア3Cs反応の鋳型として適している。
【図4-2】同上
【図4-3】同上
【図5】固定ペア3Cs鋳型設計のための異なるtracrRNAの組み合わせの2次元フォールディングと構造予測。一本鎖DNAフォールディング予測はLorenz et al., 201113に基づく。重要なことに、tracrRNAの組み合わせSpCas9：SpCas9（SpV1.SpV2）の構造予測は、他のすべてのtracrRNAの組み合わせの予測された構造にはない、64ヌクレオチド長の完全な相同性とssDNAアニーリングを示す。配列は、配列番号８～１０、およびそれらのそれぞれのウラシル含有RNAで提供される。
【図6-1】図４ｃに由来する単一細菌クローンのtracrRNAの組み合わせとSANGER配列決定のスキーム。図４ｃから予測されたとおり、単一クローンのSANGER配列決定により、組換えイベントが確認され、SpV1.SpV2固定ペア鋳型DNA上の外向性tracrRNAおよび2つのgRNA配列に対応する配列が完全に欠如していることが明らかになった。他のすべての3Cs固定ペア鋳型設計は、エラーのない配列を示した。
【図6-2】同上
【図6-3】同上
【図7】a) ヒト網膜芽細胞腫タンパク質１（RB1）遺伝子のゲノム遺伝子座について、エクソン7からエクソン9までズームインし、固定ペア#1および#2に使用されるgRNAの位置を赤で強調表示している。DNA切除が成功した後、固定ペア#1または#2でそれぞれ219bpまたは207bpの断片が失われる。gRNAは、コーディングInDelsを最小限に抑えるために、非コーディングイントロンDNAを標的にするように設計されていることに留意。b) 固定ペアgRNA #1または#2で形質導入した後、RPE1細胞にパルボシクリブ（PD、iCdk4）耐性を誘導した。対照細胞（空、空のレンチウイルス骨格）と比較した場合、固定ペア#1または#2で形質導入された細胞は、選択的Cdk4阻害剤パルボシクリブの存在下で増殖し始める。
【図8】試験された5つのtracrRNAの組み合わせの一本鎖DNAを、一晩の3Cs反応において3Cs固定ペアDNAオリゴヌクレオチドと個別に組み合わせた。3Cs産物をゲル電気泳動で分析し、対応するtracrRNA組み合わせ鋳型のdsDNAおよびssDNAと比較した。驚くべきことに、すべての3Cs反応は、発明者が以前に組換えDNAを含むことを示したSpCas9 v1.v2鋳型で実行された3Cs反応を含む、ヘテロ二本鎖3Cs DNA形成の成功を示しており、この設定におけるssDNA結合に対する非特異的DNAオリゴヌクレオチドを示唆している。
【図9-1】図８の3Cs DNAは、ポリクローナルDNA増幅のために非CJ236細菌に形質転換された。一晩培養物のプラスミドDNAを精製し、制限酵素消化分析を行った。個々の3Cs DNA調製物を、図４ａの対応する野生型プラスミドDNA対照と比較した。3Cs反応が成功すると、3Cs鋳型DNAのI-SceI制限酵素部位が定義されたgRNA配列に変化する。したがって、I-SceIによる酵素切断では、野生型3Cs DNAのみを線形化する。予想されたとおり、v1.v2 3Cs鋳型DNAの3Cs DNAで形質転換された細菌はうまく成長せず、得られたDNAは野生型DNAとして移動しなかった。このことは、3Cs鋳型DNAおよび3Csオリゴヌクレオチドのミスアニーリングが形質転換不可能なDNA種をもたらすことを示唆している。対照的に、他のすべてのtracrRNAの組み合わせの3Cs DNAは、非切断性DNAをもたらし、3Cs固定ペア反応の成功を示唆している。驚くべきことに、予想外のサイズで移動するDNA種がない場合、得られたDNAの全体的な品質は非常に高かった。
【図9-2】同上
【図10-1】図９と同様に、図８の3Cs DNAは、非CJ236細菌で形質転換されたが、LB寒天プレート上に縞模様があり、そこから単一の細菌コロニーが増幅され、それらのDNAがSANGER配列決定によって分析された。それぞれの野生型(WT) SANGER配列決定結果と比較した場合、本発明者らは、試験されたすべてのtracrRNAの組み合わせについて、正しいRB1固定ペアgRNA配列を同定することができた。これは、本発明者らは、前述の3Cs技術に基づいて、定義された固定ペアgRNA試薬の生成を可能にする新しい技術を成功裏に生み出したことを実証している。
【図10-2】同上
【図10-3】同上
【図11-1】上記説明されたとおり、3Cs固定ペア技術は、単一またはプールされた方法で2つの配列の事前決定を可能にし、そのため、この種の技術的解決策としては初めてのものである。しかしながら、3Cs固定ペア技術のいくつかの適応は論理的帰結である。そのため、例えば 同じプラスミド上において単一の固定ペアカセットと単一のgRNA発現カセットの組み合わせが可能なはずである（a）。また、単一の固定ペアカセットを2つの別々のgRNA発現カセットと組み合わせることができ、固定ペアgRNAとgRNA多重化の組み合わせが可能となる（b）。さらに、2つの固定ペアgRNAカセットを組み合わせて固定ペア多重化を可能にする3Cs鋳型を設計することは技術的に実現可能である。
【図11-2】同上
【図11-3】同上
【図12-1】拡張された3Cs固定ペアgRNA。 a) 固定ペアgRNAの組み合わせの生成の過程でcrispr（cr）RNAをtracrRNAから分離する論理を示すスキーム。簡単に説明すると、2つの事前に定義されたgRNAの組み合わせをコードするオリゴヌクレオチドが合成され、鋳型DNAのssDNAとともにプールされて、3Cs合成反応が実行される。得られたdsDNA産物は、2つの別々のcrRNA配列の発現をもたらし、tra-crRNA（同じプラスミドから共発現）にアニーリングして、SpCas9とともに機能的なリボヌクレオチド複合体を形成する。 b) 3Cs固定ペア反応の一般的なワークフローとssDNAの鋳型設計ルール。c) 固定ペア鋳型DNA設計。 強調表示されているのは、RNAプロモーター、gRNA、およびcrRNA配列である。d) 3Cs固定ペアgRNAオリゴヌクレオチドの設計とアニーリングの原理。
【図12-2】同上
【図12-3】同上
【図13-1】a) 2つのCJ236クローンを、拡張された固定ペア鋳型DNAのssDNA生成の対象とした。ssDNAはdsDNAよりも速く移動する。b) 個々のプライマーペアを使用した固定ペア3Cs合成後の3Cs産物のアガロースゲル電気泳動により、3Cs反応産物が特定される。c-d) PacIおよびI-SceI制限酵素消化によって分析された増幅されたdsDNA 3Cs固定ペア産物の品質管理工程（P1）。切断がない場合は、新しい配列の組み込みが成功したことを示す。P1の消化産物は再増幅され（P2）、制限酵素消化によって再度分析され、野生型の残存がないことを明らかにする。 e) (c)に由来する3CsDNAのP1およびP2のSANGER配列決定。8ヌクレオチドが変更されていることが確認されている（矢印で強調表示）。重要なことに、すでにP1のレベルでは、これらの8ヌクレオチド位置で十分なランダム化が識別されるが、P2のレベルでは完全なランダム化が生じている。
【図13-2】同上
【図13-3】同上
【図14】3Cs合成産物の増幅されたdsDNAのアガロースゲル電気泳動。ssDNAとオリゴヌクレオチドの様々な比率および総DNA量が、P1の品質に影響を与えるか試験される。単一の比率または量に対する明らかなバイアスは確認されず（すべての試験条件が機能した）、3Cs固定ペア反応の高性能さが明らかになった。
【図15-1】3Cs固定ペアgRNA試薬の細胞機能。 a) 図１３ｂに由来する固定ペアコンストラクトは、レンチウイルス粒子の生成に供され、GFP陽性RPE1細胞の形質導入に使用された。GFPの枯渇はFACSによって分析された。以前報告されたとおり、単一のgRNAはGFP陽性細胞を確実に減少させるが、GFPを標的とするgRNAの固定ペアの組み合わせは、GFP陽性細胞の集団を完全に消失させる。b) (a)に由来する細胞の免疫ブロット分析、FACSによるGFP蛍光の喪失の確認は、GFPタンパク質の喪失によるものである。c) GFPの固定ペア標的化と同様に、Cdk2を標的化する3Cs固定ペアコンストラクトは単一または組み合わせて使用され、2つの機能的gRNAが固定ペアの組み合わせとして使用されるとCdk2の枯渇が改善されることが明らかになった。これは、3Cs固定ペアgRNAの形の2つのgRNAが、これらのgRNAのいずれかと個別に比較した場合、オンターゲット（on-target）活性が改善されていることを示す。
【図15-2】同上
【発明を実施するための形態】
【0114】
表２：本発明の配列
【表2】
【実施例】
【0115】
比較例：共有結合閉環状合成変異CRISPR/Cas9プラスミド
【0116】
従来の部位特異的変異誘発は、大きなレトロウイルス要素を含むプラスミドでは効率的に機能しないが、T7DNAポリメラーゼおよびT4DNAリガーゼを介したssDNAに基づく5’オリゴヌクレオチド伸長は、高品質で偏りのないgRNAライブラリーを生成するための効率的な手法であると予想された（図１２Ａ）。この目的のため、dut- / ung-、F因子含有K12 大腸菌であるCJ236細菌に、最も広く使用されている、f1複製起点（f1-ori）含有CRISPR/Cas9プラスミドpLentiGuide およびpLentiCRISPRv2を形質転換した。従来のK12大腸菌株とは対照的に、CJ236細菌は、酵素dUTPase（dut-）およびウラシルグリコシラーゼ（ung-）がないため、ゲノムおよびプラスミドDNAにデオキシウリジンが存在することを許容する。その後のM13K07バクテリオファージによるCJ236形質転換の重複感染により、pLentiGuideおよびpLentiCRISPRv2のデオキシウリジン含有ssDNA（dU-ssDNA）鋳型をパッケージ化するバクテリオファージ粒子の生成が可能になる。次の工程では、dU-ssDNAは沈殿したバクテリオファージ粒子から精製される（図１２Ｂ）。一般に、この手法は、f1-oriをコードする任意のプラスミドに適用できる。
【0117】
dU-ssDNA鋳型由来のヘテロ二重化された共有閉環状合成dsDNA（3Cs-dsDNA）を成功裏に生成するため、2時間のインビトロ3Cs反応における5’および3’相同性の10、13、15、および18ヌクレオチド（nts）を比較することによる最適なプライマー／相同性の長さを試験した（図１３Ａ）。dU-CCC-dsDNA反応産物はゲル電気泳動によって分離され、ヘテロ二本鎖dsDNA反応（33、34）の典型的な3つのバンドパターンが特定された。正しく伸長され、ニックが入れられ、鎖が置換された3Cs産物間の最適な比率は、15ntのプライマー相同性で達成された（図１３Ａ）、したがって、発明者らはこの後のすべての反応にこの長さを用いた。
【0118】
次に、本発明者らは、拡張された緑色蛍光タンパク質（eGFP）遺伝子を標的とする細胞内活性gRNAの生成についてこのプロトコルを試験した。ルール設定2（RS2）アルゴリズムを使用して6つのgRNA配列を設計し、3Cs反応を使用して、U6プロモーターの制御下にある非ヒト標的化（NHT）制御配列とそれに続くCas9への結合に関与するgRNAスキャフォールドDNA配列を含むpLentiGuideおよびpLentiCRISPRv2にクローニングした（図２Ｂ）（32）。得られたヘテロ二本鎖dU-CCC-dsDNAを使用して、XL1細菌を形質転換し、野生型（NHT）含有配列と正しく変異した配列の比率を決定した。発明者らは20個のクローンを個別に配列決定し、pLentiGuideの81％とplentiCRISPRv2の82％がGFPを標的とするgRNAで変更されていることを確認した（図１３Ｃ、Ｄ）。M13K07培地へのウリジンの添加では、野生型の割合が約12％に大幅に減少したが、これはdU-ssDNA鋳型へのdUの取り込みが不十分なため未変更プラスミドが発生した可能性が高いことを示す（図１３Ｅ）。重要なことに、発明者らは、20個の個々のクローンのみを配列決定したにもかかわらず、発明者らは、6つすべてのeGFPを標的とするgRNA配列のいくつかのコピーを特定することができた（図１３Ｄ）、これは非常に効率的なプロトコルがライブラリー構築に適していることを示唆している。
【0119】
eGFPを標的とするgRNAコンストラクトの細胞機能をテストするため、感染性レンチウイルス粒子が生成され、eGFP陽性のヒトテロメラーゼ不死化された網膜色素上皮（RPE1）細胞が形質導入するために使用された。選択圧をかけずに7日後、eGFP陽性細胞と陰性細胞の存在をフローサイトメトリーで分析した。レンチウイルス3Cs gRNAコンストラクトを使用した緑色蛍光の減少は非常に強力だったが、対照プラスミドはeGFP蛍光に影響を与えなかった（図１４）。興味深いことに、発明者らは、用量依存的な蛍光の減少を観察し、RPE1細胞のレンチウイルス形質導入が従来の方法で生成されたレンチウイルスCRISPR/Cas粒子と同等に効率的であることを示す（図１４）。したがって、共有結合閉環状合成CRISPR/Cas gRNAは、新しく確立された3C手法を使用して迅速に生成でき、細胞内で完全に機能する。
【0120】
実施例１：固定ペアCRISPR/Cas gRNAsに対する3Cs戦略
gRNAの組み合わせまたはgRNAの固定ペアを生成するため、発明者らは、以前に発明された3Cs技術に基づく3Cs戦略を立案した（図２ａ）。それを実行するため、本発明者らは、shRNA発現カセット（RNAプロモーターおよびshRNAクローニング部位）が、CasヌクレアーゼへのRNA結合に必須である逆方向の2つのtracrRNAによって置き換えられたpLKO.1に基づく鋳型プラスミドをインシリコで設計した。外向性tracrRNAは、2つの制限部位をコードするgRNAプレースホルダーによって分離されている（図２ａ、ｂ）。本発明者らは、このプラスミドをCJ236細菌でクローン化および増幅し、バクテリオファージM13K07粒子の増幅および精製を介して、それを一本鎖環状dU-DNA（dU-ssDNA）に変換した。次に、得られた環状dU-ssDNAを、外向性tracrRNA配列（tracr#1およびtracr#2）に対して5’および3’の十分な相同性を特徴とし、2つの定義された双方向gRNA配列を含むDNAオリゴヌクレオチドでアニーリングする（図２ａ、ｂ）。次に、アニーリングされたDNAオリゴヌクレオチドは、T7ポリメラーゼとT4リガーゼの活性によってそれぞれ伸長され、それ自体の尾部にライゲーションされ、鋳型と新しく合成されたDNA鎖からなるヘテロ二本鎖DNA（3Cs-DNA）を生成する。次に、dU含有DNAを選択的に分解するため3Cs-DNAを非CJ236細菌に形質転換して、新しく合成されたプラスミドDNAを増幅する。精製された非dU含有プラスミドDNAは精製され、野生型暗示プラスミドを除去するための精製工程（制限酵素消化）にかけられる。gRNA 発現を可能にするため、制限酵素切断部位（平滑または粘着クローニング）を利用することにより、2つの定義されたgRNA配列間に双方向RNAプロモーター（2つの非相同配列、例えば、hU6、h7SK、H1などで構成される）がクローン化され、定義された（「固定ペア」）gRNAの組み合わせの最終的なCRISPR/Cas gRNAライブラリーが得られる（図２ａ）。
gRNAの組み合わせまたはgRNAの固定ペアを生成するため、発明者らは、以前に発明された3Cs技術に基づく3Cs戦略を立案した（図２ａ）。それを実行するため、本発明者らは、shRNA発現カセット（RNAプロモーターおよびshRNAクローニング部位）が、CasヌクレアーゼへのRNA結合に必須である逆方向の2つのtracrRNAによって置き換えられたpLKO.1に基づく鋳型プラスミドをインシリコで設計した。外向性tracrRNAは、2つの制限部位をコードするgRNAプレースホルダーによって分離されている（図２ａ、ｂ）。本発明者らは、このプラスミドをCJ236細菌でクローン化および増幅し、バクテリオファージM13K07粒子の増幅および精製を介して、それを一本鎖環状dU-DNA（dU-ssDNA）に変換した。次に、得られた環状dU-ssDNAを、外向性tracrRNA配列（tracr#1およびtracr#2）に対して5’および3’の十分な相同性を特徴とし、2つの定義された双方向gRNA配列を含むDNAオリゴヌクレオチドでアニーリングする（図２ａ、ｂ）。次に、アニーリングされたDNAオリゴヌクレオチドは、T7ポリメラーゼとT4リガーゼの活性によってそれぞれ伸長され、それ自体の尾部にライゲーションされ、鋳型と新しく合成されたDNA鎖からなるヘテロ二本鎖DNA（3Cs-DNA）を生成する。次に、dU含有DNAを選択的に分解するため3Cs-DNAを非CJ236細菌に形質転換して、新しく合成されたプラスミドDNAを増幅する。精製された非dU含有プラスミドDNAは精製され、野生型暗示プラスミドを除去するための精製工程（制限酵素消化）にかけられる。gRNA 発現を可能にするため、制限酵素切断部位（平滑または粘着クローニング）を利用することにより、2つの定義されたgRNA配列間に双方向RNAプロモーター（2つの非相同配列、例えば、hU6、h7SK、H1などで構成される）がクローン化され、定義された（「固定ペア」）gRNAの組み合わせの最終的なCRISPR/Cas gRNAライブラリーが得られる（図２ａ）。
【0121】
最初のCRSIPR/Casシステムの説明および最も広く使用されているCas酵素SpCas93,4の特性評価以来、多くの追加のCasヌクレアーゼが説明され機能的に特性評価されてきた。本発明者らは、いくつかの一般的に使用されるCas酵素（SpCas9、SaCas9、NmCas9、およびAsCpf1）を選択し、個々のPAM配列選択性に基づいて、1000ランダムヌクレオチド（GC含量50％）での平均標的部位発生を推定した（図２ｃ）3-7。以前報告されたとおり、 SpCas9は、キロベースDNAあたり約150の標的部位で最も高い標的部位発生率を示し、次にSaCas9がキロベースあたり125、NmCas9がキロベースあたり10、そしてAsCpf1がキロベースあたり約100の標的部位と続く（図２ｃ）。理論上、固定ペアgRNAの組み合わせは、同じtracrRNA（同じCas酵素を利用）に基づいて生成できるだけでなく、異なるtracrRNA分子（異なるCas酵素に依存）と組み合わせて生成することもでき、標的の範囲とその特異性を拡大する。そのため、SpCas9とSaCas9またはAsCpf1の組み合わせは、標的の範囲が最も広く、平均固定ペア標的数がキロベースあたり約20000gRNAの組み合わせである（図２ｄ）。
【0122】
実施例２：固定ペア3Cs gRNA用に合理的に操作されたSpCas9 tracrRNA
高度に相同または同一のヌクレオチド配列を含むプラスミドは、ウイルスのパッケージング中に組換えが起こり、配列情報が失われ、不活性なウイルス粒子を生じることが実証されている8-11。バクテリオファージ粒子のパッケージング中のこの問題を回避するために、本発明者らは、固定ペア鋳型プラスミドDNA (v1.v2)の生成のために、野生型SpCas9 tracrRNA (v1)配列を、最近操作され改良されたSpCas9 tracrRNA version 2 (v2)と組み合わせた（図２ａ）12。 さらに、本発明者らは、SpCas-SaCas9（v2.Sa）、SpCas9-NmCas9（v2.Nm）およびSpCas9-AsCpf1（v2.As）の外向性tracrRNAの組み合わせの固定ペア鋳型プラスミドDNAを生成し、これらすべてが制限酵素消化分析において予想されるDNA断片を生成した（図４ａ）。また、本発明者らは、従来のバイオインフォマティクスツールによって外向性tracrRNAおよびgRNA配列の折り畳みを予測し、ほとんどのtracrRNAの組み合わせは強い折り畳みをもたらさなかった13。本発明者らは、SpCas9 tracrRNA分子のv1およびv2の強い相同性に基づく折り畳みを同定した（図５）。v1およびv2の組換えを防ぐために、本発明者らは、tracrRNAおよびgRNA分子と複合体を形成した以前に報告されたSpCas9の結晶構造14に基づいて、新たなSpCas9 tracrRNA配列を合理的に設計した。本発明者らは、SpCas9と直接接触しておらず、したがって配列相同性を破壊する操作可能性を含み得る3つの配列領域を同定した（図３ａ）。本発明者らは、3つの配列をssDNAのリフォールディングを最も効果的に破壊するヌクレオチドに合理的に変更し、新しいtracrRNA分子バージョン３（v3）と名付けた（図３ｂ、図５）。他のすべての鋳型プラスミドと同様に、v2をv3と組み合わせたもの(v2.v3)は、酵素制限分析後に正しい消化パターンが得られた（図４ａ）。次に、本発明者らは、環状ssDNAの生成のために固定ペア鋳型プラスミドのポートフォリオを試験した。SpCas9tracrRNAの組み合わせのv1.v2を含む、複数のクローンからのすべての固定ペア鋳型プラスミドからの一本鎖DNAは、ゲル電気泳動によって分析されたときに単一のバンドとして移動した高品質の環状ssDNAをもたらした（図４ｂ）。しかしながら、相同性の高い配列情報の喪失は、ssDNAのゲル電気泳動では見えない場合がある。よって、本発明者らは、固定ペア鋳型DNAを含む精製バクテリオファージ粒子を使用して、ファージ感染を介してそれらに送達されたssDNAに基づくdsDNAの生成のためにXL1細菌に再形質転換した。得られたプラスミドdsDNAを制限酵素消化分析に供して、固定ペア鋳型dsDNAの正しさを確認した。予想どおり、v1.v2 tracrRNA ssDNAから生じるdsDNAは、より速い移動バンド、正しい消化パターンの欠如、および正しいSANGER配列決定情報の欠如によって示される、深刻な組換えイベントの影響を受けた（図４ｃ、図６）。しかしながら、新しく操作されたv3 SpCas9 tracrRNAを含む他のすべてのtracrRNAの組み合わせは、DNA組換えがなく、SANGER配列決定によって決定された正しいヌクレオチド配列を含んでいた（図４ｃ、図６）。これは、それぞれの固定ペア鋳型由来の環状ssDNAが高品質であり、3Cs DNA生成を可能にする正しい相同性配列を含んでいることを示す。
高度に相同または同一のヌクレオチド配列を含むプラスミドは、ウイルスのパッケージング中に組換えが起こり、配列情報が失われ、不活性なウイルス粒子を生じることが実証されている8-11。バクテリオファージ粒子のパッケージング中のこの問題を回避するために、本発明者らは、固定ペア鋳型プラスミドDNA (v1.v2)の生成のために、野生型SpCas9 tracrRNA (v1)配列を、最近操作され改良されたSpCas9 tracrRNA version 2 (v2)と組み合わせた（図２ａ）12。 さらに、本発明者らは、SpCas-SaCas9（v2.Sa）、SpCas9-NmCas9（v2.Nm）およびSpCas9-AsCpf1（v2.As）の外向性tracrRNAの組み合わせの固定ペア鋳型プラスミドDNAを生成し、これらすべてが制限酵素消化分析において予想されるDNA断片を生成した（図４ａ）。また、本発明者らは、従来のバイオインフォマティクスツールによって外向性tracrRNAおよびgRNA配列の折り畳みを予測し、ほとんどのtracrRNAの組み合わせは強い折り畳みをもたらさなかった13。本発明者らは、SpCas9 tracrRNA分子のv1およびv2の強い相同性に基づく折り畳みを同定した（図５）。v1およびv2の組換えを防ぐために、本発明者らは、tracrRNAおよびgRNA分子と複合体を形成した以前に報告されたSpCas9の結晶構造14に基づいて、新たなSpCas9 tracrRNA配列を合理的に設計した。本発明者らは、SpCas9と直接接触しておらず、したがって配列相同性を破壊する操作可能性を含み得る3つの配列領域を同定した（図３ａ）。本発明者らは、3つの配列をssDNAのリフォールディングを最も効果的に破壊するヌクレオチドに合理的に変更し、新しいtracrRNA分子バージョン３（v3）と名付けた（図３ｂ、図５）。他のすべての鋳型プラスミドと同様に、v2をv3と組み合わせたもの(v2.v3)は、酵素制限分析後に正しい消化パターンが得られた（図４ａ）。次に、本発明者らは、環状ssDNAの生成のために固定ペア鋳型プラスミドのポートフォリオを試験した。SpCas9tracrRNAの組み合わせのv1.v2を含む、複数のクローンからのすべての固定ペア鋳型プラスミドからの一本鎖DNAは、ゲル電気泳動によって分析されたときに単一のバンドとして移動した高品質の環状ssDNAをもたらした（図４ｂ）。しかしながら、相同性の高い配列情報の喪失は、ssDNAのゲル電気泳動では見えない場合がある。よって、本発明者らは、固定ペア鋳型DNAを含む精製バクテリオファージ粒子を使用して、ファージ感染を介してそれらに送達されたssDNAに基づくdsDNAの生成のためにXL1細菌に再形質転換した。得られたプラスミドdsDNAを制限酵素消化分析に供して、固定ペア鋳型dsDNAの正しさを確認した。予想どおり、v1.v2 tracrRNA ssDNAから生じるdsDNAは、より速い移動バンド、正しい消化パターンの欠如、および正しいSANGER配列決定情報の欠如によって示される、深刻な組換えイベントの影響を受けた（図４ｃ、図６）。しかしながら、新しく操作されたv3 SpCas9 tracrRNAを含む他のすべてのtracrRNAの組み合わせは、DNA組換えがなく、SANGER配列決定によって決定された正しいヌクレオチド配列を含んでいた（図４ｃ、図６）。これは、それぞれの固定ペア鋳型由来の環状ssDNAが高品質であり、3Cs DNA生成を可能にする正しい相同性配列を含んでいることを示す。
【0123】
TracrRNA設計
灰色のハイライト: wtからの変更
下線: MS2 ステムループ
灰色のハイライト: wtからの変更
下線: MS2 ステムループ
【0124】
実施例３：原理実証：順次クローン化された固定ペアgRNAの機能
3Cs固定ペアgRNAの性能を試験するため、本発明者らは、2つのgRNA標的部位での個々の挿入または欠失（InDels）の発生にわたって完全なDNA切除イベントを選択的に定量化することを可能にする実験設定の設計に着手した。これを実施するため、本発明者らは、それぞれがヒト網膜芽細胞腫遺伝子RB1遺伝子のイントロン領域を標的とする2対のgRNAを設計し、その枯渇または不活性化は、選択的Cdk4/6阻害剤パルボシクリブに対する耐性をもたらす。両方のペアは、個々のgRNAがRB1の最も近いコーディングエクソンの5’または3’末端から少なくとも50ヌクレオチド離れているように設計された。ペア1はRB1のエクソン7を含むように設計され、ペア2はRB1のエクソン9を含むように設計された（図７ａ）。注目すべきことに、gRNAは、コーディングInDelsを最小限に抑えるために非コーディングイントロンDNAを標的化するように設計されている。ペアになったgRNAの2つのセットは、前述のレンチウイルスプラスミドpKLV2.215に、従来のクローニングによって個別に順次クローニングされた。両方のプラスミドは、感染性レンチウイルス粒子の生成に供され、その後、SpCas9を発現するRPE1細胞を形質導入するために使用された。レンチウイルス形質導入の1日後、細胞を1μMの選択的Cdk4阻害剤であるパルボシクリブ（PD）に曝露し、その増殖を毎日のAlamarBlueアッセイで合計11日間定量した。空のpKLV2.2を運ぶレンチウイルス粒子で形質導入された細胞とは際立って対照的に、RB1を標的とするgRNAペアのペア1またはペア2で形質導入された細胞は、パルボシクリブ曝露の4～7日後に増殖の急激な増加を示した（図７ｂ）。
3Cs固定ペアgRNAの性能を試験するため、本発明者らは、2つのgRNA標的部位での個々の挿入または欠失（InDels）の発生にわたって完全なDNA切除イベントを選択的に定量化することを可能にする実験設定の設計に着手した。これを実施するため、本発明者らは、それぞれがヒト網膜芽細胞腫遺伝子RB1遺伝子のイントロン領域を標的とする2対のgRNAを設計し、その枯渇または不活性化は、選択的Cdk4/6阻害剤パルボシクリブに対する耐性をもたらす。両方のペアは、個々のgRNAがRB1の最も近いコーディングエクソンの5’または3’末端から少なくとも50ヌクレオチド離れているように設計された。ペア1はRB1のエクソン7を含むように設計され、ペア2はRB1のエクソン9を含むように設計された（図７ａ）。注目すべきことに、gRNAは、コーディングInDelsを最小限に抑えるために非コーディングイントロンDNAを標的化するように設計されている。ペアになったgRNAの2つのセットは、前述のレンチウイルスプラスミドpKLV2.215に、従来のクローニングによって個別に順次クローニングされた。両方のプラスミドは、感染性レンチウイルス粒子の生成に供され、その後、SpCas9を発現するRPE1細胞を形質導入するために使用された。レンチウイルス形質導入の1日後、細胞を1μMの選択的Cdk4阻害剤であるパルボシクリブ（PD）に曝露し、その増殖を毎日のAlamarBlueアッセイで合計11日間定量した。空のpKLV2.2を運ぶレンチウイルス粒子で形質導入された細胞とは際立って対照的に、RB1を標的とするgRNAペアのペア1またはペア2で形質導入された細胞は、パルボシクリブ曝露の4～7日後に増殖の急激な増加を示した（図７ｂ）。
【0125】
これは、定義されたgRNAのペアが活性であり、個々の部位での小さなInDelsではなくgRNAが隣接するエクソンを含む完全なDNA切除イベントを引き起こすことを示す。したがって、固定ペアgRNAは、大規模な細胞機能スクリーニングに適している可能性がある。
【0126】
実施例４：プールされた固定ペア3Cs技術における定義されたgRNAの組み合わせ
上記の固定ペア環状ssDNA鋳型の3Cs性能を実証するために、本発明者らは、それらを、1)外向性tracrRNAの組み合わせに対する5’および3’の相同性および2) RB1遺伝子のエクソン7に隣接する2つのイントロン領域を標的とする双方向gRNA配列から構成されるDNAオリゴヌクレオチドと組み合わせた（ペア１、図７ａ、ｂ）。ゲル電気泳動によって3Cs DNAを分析すると、本発明者らが以前にtracrRNA配列の組換えおよび欠如を示したv1.v2鋳型DNAに対して行われた3Cs反応よりも遅い移動DNA種を観察することに本発明者らは驚いた（図８）。DNAの移動が遅いのは、オリゴヌクレオチドと鋳型の相同性が完全に欠如しているためであり、オリゴヌクレオチドの非特異的結合を引き起こして部分的な3Cs DNA産物をもたらす可能性があると本発明者らは仮定する。しかしながら、使用したtracrRNAとtracrRNAの組み合わせに関係なく、他のすべての3Cs反応でもDNA種の移動が遅くなっており、すべての試験条件において3Cs DNAが生成されたことを示す（図８）。
上記の固定ペア環状ssDNA鋳型の3Cs性能を実証するために、本発明者らは、それらを、1)外向性tracrRNAの組み合わせに対する5’および3’の相同性および2) RB1遺伝子のエクソン7に隣接する2つのイントロン領域を標的とする双方向gRNA配列から構成されるDNAオリゴヌクレオチドと組み合わせた（ペア１、図７ａ、ｂ）。ゲル電気泳動によって3Cs DNAを分析すると、本発明者らが以前にtracrRNA配列の組換えおよび欠如を示したv1.v2鋳型DNAに対して行われた3Cs反応よりも遅い移動DNA種を観察することに本発明者らは驚いた（図８）。DNAの移動が遅いのは、オリゴヌクレオチドと鋳型の相同性が完全に欠如しているためであり、オリゴヌクレオチドの非特異的結合を引き起こして部分的な3Cs DNA産物をもたらす可能性があると本発明者らは仮定する。しかしながら、使用したtracrRNAとtracrRNAの組み合わせに関係なく、他のすべての3Cs反応でもDNA種の移動が遅くなっており、すべての試験条件において3Cs DNAが生成されたことを示す（図８）。
【0127】
プールされた制限酵素消化および単一細菌クローンの直接的なSANGER配列決定によって固定ペア3Cs反応効率を正確に定量化するために、本発明者らは、得られた3Cs DNAをXL1細菌に形質転換した。以前の観察と一致して、v1.v2鋳型ssDNAの使用により生じた3Cs産物で形質転換された細菌は増殖せず、プラスミドDNAを抽出または分析できなかった。これにより、鋳型DNAへの非特異的オリゴヌクレオチド結合は形質転換可能な3Cs DNAをもたらさないという仮説が確認された。対照的に、他のすべてのtracrRNAの組み合わせに由来する細菌は正常に増殖し、それらの増幅されたDNAが抽出された。重要なことに、3Cs反応が成功すると、3Cs鋳型DNAのI-SceI制限酵素部位が定義されたgRNA配列に変更され、それにより正しく生成された3Cs DNAでI-SceIが不活性になる。続いて、ポリクローナル一晩細菌培養物の精製されたDNAを制限酵素消化分析に供し、それぞれの野生型プラスミドと比較した。最も重要なことに、すべての固定ペアtracrRNAの組み合わせは、I-SceI消化に供されたときに、切断されないプラスミドDNA種であることが明らかにされ、I-SceI制限部位が変更されたプラスミドDNAの存在を示す（図９）。I-SceI配列の変更を確認するために、本発明者らは、SANGER配列決定によって単一の細菌クローンを分析し、図７のペア１切除に対応する2つのRB1 gRNA配列を同定した（図１０ａ～ｃ）。
【0128】
要約すると、本発明者らは、プールされた固定ペアgRNAライブラリーを生成するために、CRISPR/Cas gRNAの定義された組み合わせを生成するための新規な方法を開発した。この革新的な技術は、遺伝子ノックアウト、活性化または阻害、またはエフェクターを介した編集、ならびに遺伝子情報の正確な切除(CRISPRex) の生成のためのオンターゲット効率の改善を含むがこれらに限定されない、幅広い応用の可能性を有している。固定ペアgRNA試薬は、CRISPRaおよびCRISPRiの分野で特に重要であり、両者は効率的な活性化(a)または不活性化(i)が多重gRNAに大きく依存することが実証されている。本発明者らは、この技術が、健康および疾患におけるコーディングおよび非コーディングの遺伝情報の調査に幅広い影響を与えると考える。
【0129】
実施例５： 3C固定ペアgRNAツールボックスの使用
3Cs固定ペア技術は、以下の適応によって示されるように、使用されるgRNAの組み合わせにおけるさらなる技術開発を可能にする（図１１）。
1) 3Cs固定ペアgRNAを1つの単一gRNA発現カセットと組み合わせて、1つの単一gRNAと固定ペアgRNAの多重化を可能にする（図１１ａ）。
2) 3Cs固定ペアgRNAを2つの単一gRNA発現カセットと組み合わせて、2つの単一gRNAと固定ペアgRNAの多重化を可能にする（図１１ｂ）。
3) 単一の3Cs固定ペアgRNA発現カセットを2つめの3Cs固定ペアgRNA発現カセットと多重化することができ、3Cs固定ペアgRNA多重化を可能にする（図１１ｃ）。
3Cs固定ペア技術は、以下の適応によって示されるように、使用されるgRNAの組み合わせにおけるさらなる技術開発を可能にする（図１１）。
1) 3Cs固定ペアgRNAを1つの単一gRNA発現カセットと組み合わせて、1つの単一gRNAと固定ペアgRNAの多重化を可能にする（図１１ａ）。
2) 3Cs固定ペアgRNAを2つの単一gRNA発現カセットと組み合わせて、2つの単一gRNAと固定ペアgRNAの多重化を可能にする（図１１ｂ）。
3) 単一の3Cs固定ペアgRNA発現カセットを2つめの3Cs固定ペアgRNA発現カセットと多重化することができ、3Cs固定ペアgRNA多重化を可能にする（図１１ｃ）。
【0130】
実施例６： 3Csライブラリー増幅の防止
3Cs試薬が第三者によって増幅され得ないことを確実にするために、細菌での増殖／増幅を妨げるプラスミド／ライブラリーの重要な部分を除去するために最終的な3Cs試薬を制限酵素消化によって線形化することができる。ただし、線形化されたプラスミド／ライブラリーの形質導入は、実験目的でレンチウイルス粒子を生成することにおいて機能する。
3Cs試薬が第三者によって増幅され得ないことを確実にするために、細菌での増殖／増幅を妨げるプラスミド／ライブラリーの重要な部分を除去するために最終的な3Cs試薬を制限酵素消化によって線形化することができる。ただし、線形化されたプラスミド／ライブラリーの形質導入は、実験目的でレンチウイルス粒子を生成することにおいて機能する。
【0131】
細菌プラスミドの増幅には、所望のプラスミド／ライブラリーを保持する細菌の選択的増殖を確実にするための抗生物質の選択圧が必要である。そのため、例えば、1)抗生物質プロモーターを切除することができ、2)抗生物質耐性遺伝子の全部または一部を除去することができ、または3)複製起点（ORI）配列を切除することができる。
【0132】
実施例７：クローニングフリーの拡張された3Cs固定ペアgRNA生成
3Cs試薬は、PCR増幅および従来のクローニング工程がないという利点がある。しかしながら、双方向プロモーターを組み込んで3Cs固定ペア試薬の製造を完了すると、3Cs固定ペア試薬の全体的な品質（多様性と分布）が妨げられる可能性がある。したがって、本発明者らは、従来のクローニング工程の必要性を完全に回避する、拡張された3Cs固定ペアプロトコルを設計した。そうするために、本発明者らは、化膿レンサ球菌（Streptococcuspyogenes）の非操作型ＩＩ CRISPRシステムが、機能的なRNA誘導型DNAヌクレアーゼ複合体であるCas9とともに細胞内で形成される2つの別個のRNA分子（crRNAおよびtracrRNA）を使用するという事実を利用した（図１２ａ）。
3Cs試薬は、PCR増幅および従来のクローニング工程がないという利点がある。しかしながら、双方向プロモーターを組み込んで3Cs固定ペア試薬の製造を完了すると、3Cs固定ペア試薬の全体的な品質（多様性と分布）が妨げられる可能性がある。したがって、本発明者らは、従来のクローニング工程の必要性を完全に回避する、拡張された3Cs固定ペアプロトコルを設計した。そうするために、本発明者らは、化膿レンサ球菌（Streptococcuspyogenes）の非操作型ＩＩ CRISPRシステムが、機能的なRNA誘導型DNAヌクレアーゼ複合体であるCas9とともに細胞内で形成される2つの別個のRNA分子（crRNAおよびtracrRNA）を使用するという事実を利用した（図１２ａ）。
【0133】
3Cs固定ペア鋳型プラスミドを変更することにより、2つのプレースホルダーgRNA配列によって分離された2つの双方向に配置された（別向きの）ヒトRNAプロモーター（7SKおよびU6）配列を含むようにする。前記2つのプレースホルダーgRNA配列はtracrRNAにアニーリングする双方向crRNA配列によってさらに分離されるものであり、3Cs固定ペア反応は、同じプラスミド（拡張されたプラスミド#3.1）からcrRNAの固定ペア組成を生成するのに十分である（図１２ｂ、ｃ）。同じプラスミド上の別個のSpCas9 tracrRNA発現カセットは、同じ細胞内の両方のRNA分子の発現を保証する。以前の設計とは対照的に、拡張されたプラスミド#3.1のための3Cs固定ペアオリゴヌクレオチドは3つの相同領域（3Cs固定ペア相同性）を含み、オリゴヌクレオチドアニーリングを改善し、それによって3Cs反応の性能を向上させる可能性がある（図１２ｄ）。
【0134】
実施例８：拡張された3Cs固定ペア試薬の製造
拡張された3Cs固定ペア鋳型の性能と堅牢性を実証するため、本発明者らは、プラスミド#3.1をCJ236細菌に形質転換し、ssDNA生成のために2つのクローンを選択した。アガロースゲル電気泳動により、CJ236クローンのssDNAの単一バンドが特定され、プラスミド#3.1の堅牢なssDNA生成が実証された（図１３ａ）。
拡張された3Cs固定ペア鋳型の性能と堅牢性を実証するため、本発明者らは、プラスミド#3.1をCJ236細菌に形質転換し、ssDNA生成のために2つのクローンを選択した。アガロースゲル電気泳動により、CJ236クローンのssDNAの単一バンドが特定され、プラスミド#3.1の堅牢なssDNA生成が実証された（図１３ａ）。
【0135】
プラスミド#3.1での3Cs反応の堅牢性と品質を特定するために、本発明者らは、対照（非ヒト標的、NHT）、mCherry、GFP標的化gRNAの組み合わせをコードする5つのオリゴヌクレオチドを設計し、個々の3Cs固定ペア反応を行った。設計されたすべてのオリゴヌクレオチドは、3Cs固定ペア反応において良好に機能することが、アガロースゲル電気泳動によって視覚化された予想されるバンドパターンによって明らかになった（図１３ｂ）。単一オリゴヌクレオチド3Cs固定ペア合成がうまく行われたので、本発明者らは、プールされたプライマー反応がこのプロトコルで可能であるかどうかを追求した。これを特定するために、本発明者らは、計算された多様性が65,536である、8つのランダム化ヌクレオチド位置（8Nプライマー）を含む単一オリゴヌクレオチドを設計し、インビトロ3Cs反応を実施した。反応産物を精製し、細菌にエレクトロポレーションして増幅した後、第１の品質管理工程（P1）で、酵素PacIおよびI-SceIを適用して野生型の残存を除去した。P1の非切断産物を再度エレクトロポレーションし、第２の品質管理工程（P2）を適用して、アガロースゲル電気泳動による最終的な8Nライブラリー調製における野生型の残存の程度を特定した（図１３ｃ、ｄ）。予想通り、両方の品質管理手順により、野生型の残存が検出限界未満まで除去された。ランダム化されたヌクレオチドを視覚化し、3Csプライマー相同領域に並置された不要な変異を潜在的に特定するために、本発明者らは、プールされた8Nプラスミド上のP1およびP2のレベルでSANGER配列決定を行った。驚くべきことに、すでにP1のレベルで、8つのランダム化されたヌクレオチドすべてがSANGER配列決定によって識別でき、品質工程P1はヌクレオチドのランダム化の全体的な度合いにほとんど影響を与えなかった（図１３ｅ）。これは、8N 3Cs固定ペア反応が非常に効率的であったことを示唆し、これはオリゴヌクレオチド内の3Csの相同性が長いためと考えられ、3Cs固定ペアプラスミド#3.1が、事前に定義された組み合わせを持つgRNAのプールされたライブラリーの生成に非常に適していることを示す。
【0136】
本発明者らは、ssDNAと3Csオリゴヌクレオチドの比率が、堅牢な3Cs性能にとって重要であることを以前に実証した。したがって、本発明者らは、どの比率が3Cs固定ペア反応に最も効率的であるかを試験した。そうするために、本発明者らは、600/20(1:33)、600/15 (1:25)、および400/20 (1:50)（ngのssDNA対μｇのオリゴヌクレオチド）の比率で3つの反応を設定し、ssDNAの総量が10または5μgになるように調整された1:33の比率で2つの反応を設定した。すべての反応産物は、前述のようにエレクトロポレーションおよび増幅され、品質管理工程P1によって処理された。 s興味深いことに、本発明者らは、すべての試験条件において3Cs性能の顕著な違いを観察することができなかった（図１４ａ）。単一または多重化3Cs反応におけるssDNAとオリゴヌクレオチドの正確な比率は重要であるが、固定ペアプライマーの追加の内部3Cs相同性は、この必要性を回避し、ssDNAとオリゴヌクレオチドの実行比率を広げる可能性がある。
【0137】
実施例９：拡張された3Cs固定ペア試薬の細胞機能
拡張された3Cs固定ペアプラスミドおよび試薬の機能性を実証するために、本発明者らは、上記で生成されたNHTおよびGFP標的化コンストラクトを利用し、それらの感染性レンチウイルス粒子を作製した。GFPを発現するhTERT-RPE1細胞に48時間これらを形質導入した後、選択圧（ピューロマイシン）をさらに4日間加えた後、細胞をFACSならびに野生型（wt）およびGFP陽性細胞（GFP）がコントロールとして機能する免疫ブロットで分析した。重要なことに、2つのNHT-gRNA配列の固定ペアの組み合わせは、GFP陽性細胞の割合に影響を与えなかった、一方で、FACSによってNHT-GFP2とGFP2-NHTの両方が、GFP陽性細胞の強力な減少を誘導した。しかしながら、GFP2-GFP1（2つの異なるGFP標的化gRNA）の組み合わせにより、GFP陽性細胞集団が検出限界未満に減少した（図１５ａ、ｂ）。さらに、GFPの欠失効率は、GFPの免疫ブロットによって確認され、FACSの結果が確認された（図１５ｂ）。ヒト細胞で発現される蛍光タンパク質は人工的な状況を反映しているため、本発明者らは、RPE1細胞で内因的に発現される遺伝子が同様に2つのgRNAによってより効率的に枯渇するかどうかを追求した。この疑問に対処するために、RPE1細胞に、NHT/NHT、NHT/Cdk2、Cdk2/NHT、またはCdk2/Cdk2をコードする固定ペアgRNAコンストラクトを形質導入した。予想通り、内因性Cdk2は、どちらかの単一gRNAよりも2つの固定ペアgRNAによってより効率的に枯渇した（図１５ｃ）。これは、3Cs固定ペア試薬が細胞内で機能し、同じ遺伝子を標的とする3Cs固定ペアgRNAの組み合わせが、単一のgRNAよりもオンターゲット活性を高めていることを示す。
拡張された3Cs固定ペアプラスミドおよび試薬の機能性を実証するために、本発明者らは、上記で生成されたNHTおよびGFP標的化コンストラクトを利用し、それらの感染性レンチウイルス粒子を作製した。GFPを発現するhTERT-RPE1細胞に48時間これらを形質導入した後、選択圧（ピューロマイシン）をさらに4日間加えた後、細胞をFACSならびに野生型（wt）およびGFP陽性細胞（GFP）がコントロールとして機能する免疫ブロットで分析した。重要なことに、2つのNHT-gRNA配列の固定ペアの組み合わせは、GFP陽性細胞の割合に影響を与えなかった、一方で、FACSによってNHT-GFP2とGFP2-NHTの両方が、GFP陽性細胞の強力な減少を誘導した。しかしながら、GFP2-GFP1（2つの異なるGFP標的化gRNA）の組み合わせにより、GFP陽性細胞集団が検出限界未満に減少した（図１５ａ、ｂ）。さらに、GFPの欠失効率は、GFPの免疫ブロットによって確認され、FACSの結果が確認された（図１５ｂ）。ヒト細胞で発現される蛍光タンパク質は人工的な状況を反映しているため、本発明者らは、RPE1細胞で内因的に発現される遺伝子が同様に2つのgRNAによってより効率的に枯渇するかどうかを追求した。この疑問に対処するために、RPE1細胞に、NHT/NHT、NHT/Cdk2、Cdk2/NHT、またはCdk2/Cdk2をコードする固定ペアgRNAコンストラクトを形質導入した。予想通り、内因性Cdk2は、どちらかの単一gRNAよりも2つの固定ペアgRNAによってより効率的に枯渇した（図１５ｃ）。これは、3Cs固定ペア試薬が細胞内で機能し、同じ遺伝子を標的とする3Cs固定ペアgRNAの組み合わせが、単一のgRNAよりもオンターゲット活性を高めていることを示す。
【0138】
材料と方法
【0139】
dU-DNA鋳型の増幅と精製
KCMコンピテントおよびdut-/ung-大腸菌細胞(大腸菌株 K12 CJ236、NEB)は以下のプロトコルに従って、50ngのCRISPR/Cas鋳型プラスミドで形質転換された： DNAを10μLに設定した2μLの5xKCM溶液（1M KCl、1M CaCl2、1M MgCl2）と混合し、氷上で10分間冷却した。等量のCJ236細菌をDNA/KCM混合物に加え、穏やかに混合し、氷上で15分間インキュベートした。次に、細菌/DNA混合物を室温で10分間インキュベートし、続いて200μLのSOC培地に播種した。細菌を37℃、200 rpmで1時間インキュベートした。1時間後、LB寒天プレート上でアンピシリンを用いて細菌を選択し、37℃で一晩インキュベートした。
KCMコンピテントおよびdut-/ung-大腸菌細胞(大腸菌株 K12 CJ236、NEB)は以下のプロトコルに従って、50ngのCRISPR/Cas鋳型プラスミドで形質転換された： DNAを10μLに設定した2μLの5xKCM溶液（1M KCl、1M CaCl2、1M MgCl2）と混合し、氷上で10分間冷却した。等量のCJ236細菌をDNA/KCM混合物に加え、穏やかに混合し、氷上で15分間インキュベートした。次に、細菌/DNA混合物を室温で10分間インキュベートし、続いて200μLのSOC培地に播種した。細菌を37℃、200 rpmで1時間インキュベートした。1時間後、LB寒天プレート上でアンピシリンを用いて細菌を選択し、37℃で一晩インキュベートした。
【0140】
翌朝、形質転換されたCJ236の単一コロニーを、M13KO7ヘルパーファージを最終濃度1x108 pfuで、任意で6.25 μg/mlのウリジン、クロラムフェニコール（最終濃度35μg/mL）およびアンピシリン（最終濃度100 μg/mL）を添加した1mLの2YT培地に採取し宿主F’エピソームとファージミドのそれぞれを維持した。200 rpm、37℃で2時間振とうした後、カナマイシン（最終濃度25 μg/mL）を添加し、M13KO7に感染した細菌を選択した。アンピシリン（最終濃度100 μg/mL）とカナマイシン（最終濃度25 μg/mL）を添加した2YT培地30mLに培養を移す前に、細菌を200 rpm、37℃でさらに6時間維持した。200 rpmかつ37℃で20時間振とうした後、細菌培養物をBeckman JA-12固定角度ローターで10,000 rpmかつ4℃で10分間遠心分離した。ファージ粒子を沈殿させるために、上清を6 mL（培養液量の1/5）PEG/NaCl（20％ポリエチレングリコール8000、2.5 M NaCl）に移し、RTで1時間インキュベートした後、Beckman JA-12固定角度ローターで10,000 rpmかつ4℃で10分間遠心分離した。ファージペレットを1mLのPBSに再懸濁した。
【0141】
環状ssDNAは、メーカーのプロトコルに従ってE.Z.N.A. M13 DNA Mini Kit (Omega)を使用して再懸濁されたファージから精製された。
【0142】
3Cs DNA生成
3Cs反応に使用されたオリゴヌクレオチドは別々にリストされている。3Cs反応ごとに、2μLの10x TMバッファー（0.1 M MgCl2、0.5 M Tris-HCl、pH 7.5）、2 μLの10 mM ATP、1 μLの100 mM DTT、20ユニットのT4ポリヌクレオチドキナーゼとH20を混合して総量20μL とした600ngのオリゴヌクレオチドをリン酸化した。混合物を37℃で1時間インキュベートした。
3Cs反応に使用されたオリゴヌクレオチドは別々にリストされている。3Cs反応ごとに、2μLの10x TMバッファー（0.1 M MgCl2、0.5 M Tris-HCl、pH 7.5）、2 μLの10 mM ATP、1 μLの100 mM DTT、20ユニットのT4ポリヌクレオチドキナーゼとH20を混合して総量20μL とした600ngのオリゴヌクレオチドをリン酸化した。混合物を37℃で1時間インキュベートした。
【0143】
リン酸化オリゴヌクレオチドと環状dU-ssDNA鋳型のアニーリングは、20μLのリン酸化産物を25μLの10x TMバッファー、20μgのdU-ssDNA鋳型、およびH2Oに加えて総量を250μLにすることで行った。混合物を90℃で3分間、50℃で5分間、および室温で5分間インキュベートした。
【0144】
3Cs DNAは、アニーリングされたオリゴヌクレオチド/ssDNA混合物に10μLの10 mM ATP、10μLの100 mM dNTPミックス、15μLの100 mM DTT、2000ライゲーションユニット（または30ワイスユニット）のT4DNAリガーゼおよび30ユニットのT7DNAポリメラーゼを添加することによって生成された。3Cs合成混合物を室温で12時間（一晩）インキュベートし、アフィニティー精製し、ゲル抽出カラム(ThermoFisher Scientific)で脱塩した。3Cs反応産物は、0.8% TAE /アガロースゲル上でssDNA鋳型と一緒にゲル電気泳動によって分析された（100 V、30分）。
【0145】
細胞培養
標準どおり、HEK293T（ATCC CRL-3216）はダルベッコ変法イーグル培地(DMEM、Thermo Fisher Scientific) で、hTERT-RPE1（CRL-4000）はDMEM: Nutrient Mixture F-12（DMEM/F12、Thermo Fisher Scientific）で、10%ウシ胎仔血清（FBS）および1%ペニシリン－ストレプトマイシン（Sigma）を添加して、37℃、5% CO2で維持された。
標準どおり、HEK293T（ATCC CRL-3216）はダルベッコ変法イーグル培地(DMEM、Thermo Fisher Scientific) で、hTERT-RPE1（CRL-4000）はDMEM: Nutrient Mixture F-12（DMEM/F12、Thermo Fisher Scientific）で、10%ウシ胎仔血清（FBS）および1%ペニシリン－ストレプトマイシン（Sigma）を添加して、37℃、5% CO2で維持された。
【0146】
レンチウイルス形質導入
RPE1細胞は、各実験に適切な密度、10% FBSおよび1%ペニシリン－ストレプトマイシン（Sigma）を添加されたDMEM/F12 (Thermo Fisher Scientific)で最大コンフルエンシーの60～70％で播種された。形質導入の日に、ポリブレンを最終濃度が8 μg/mLになるように培地に添加し、以前に決定したウイルス力価に従ってウイルス上清を添加した。翌朝、培地を新鮮な培地と交換し、細胞を抗生物質の選択または実験分析に供した。
RPE1細胞は、各実験に適切な密度、10% FBSおよび1%ペニシリン－ストレプトマイシン（Sigma）を添加されたDMEM/F12 (Thermo Fisher Scientific)で最大コンフルエンシーの60～70％で播種された。形質導入の日に、ポリブレンを最終濃度が8 μg/mLになるように培地に添加し、以前に決定したウイルス力価に従ってウイルス上清を添加した。翌朝、培地を新鮮な培地と交換し、細胞を抗生物質の選択または実験分析に供した。
【0147】
レンチウイルス粒子の生成と定量化
形質導入の前日、HEK293T細胞を5x105 cells/mLで播種した。 HEK293T細胞を形質導入するため、Optimem (Thermo Fisher Scientific)培養液量の1/10を含む形質導入培地、105 μl/ml リポフェクタミン 2000 (Invitrogen)、1.65 μg トランスファーベクター 1.35 μg pPAX2 (addgene プラスミド #12260) および 0.5 μg pMD2.G (addgene プラスミド # 12259)。混合物を室温で30分間インキュベートした後、培地に滴下した。翌朝、形質導入培地を新鮮な培地と交換して、形質導入試薬を含まないレンチウイルス上清を生成した。レンチウイルスの上清を24時間および48時間で回収し、-80℃でプールし保存した。
形質導入の前日、HEK293T細胞を5x105 cells/mLで播種した。 HEK293T細胞を形質導入するため、Optimem (Thermo Fisher Scientific)培養液量の1/10を含む形質導入培地、105 μl/ml リポフェクタミン 2000 (Invitrogen)、1.65 μg トランスファーベクター 1.35 μg pPAX2 (addgene プラスミド #12260) および 0.5 μg pMD2.G (addgene プラスミド # 12259)。混合物を室温で30分間インキュベートした後、培地に滴下した。翌朝、形質導入培地を新鮮な培地と交換して、形質導入試薬を含まないレンチウイルス上清を生成した。レンチウイルスの上清を24時間および48時間で回収し、-80℃でプールし保存した。
【0148】
レンチウイルス力価を決定するため、RPE1細胞をウェルあたり20,000細胞で24ウェルプレートに播種した。翌日、8μg/ mlのポリブレンと一連の0.5、1、5、および10μLのウイルス上清を使用して細胞に形質導入した。37℃で3日間インキュベートした後、フローサイトメトリーで蛍光陽性細胞の割合を測定した。次の式を使用してウイルス力価を計算した：
【数1】
【0149】
フローサイトメトリー
すべてのサンプルはFACSCantoIIフローサイトメーター(BD Biosciences)で分析され、データはFlowJoソフトウェア(FlowJo, LLC)によって処理された。ゲーティング（Gating）は、それらの散乱形態に基づいて同定された生存可能な単一細胞に基づいて実施された。
すべてのサンプルはFACSCantoIIフローサイトメーター(BD Biosciences)で分析され、データはFlowJoソフトウェア(FlowJo, LLC)によって処理された。ゲーティング（Gating）は、それらの散乱形態に基づいて同定された生存可能な単一細胞に基づいて実施された。
【0150】
免疫ブロット
溶解物の調製および免疫ブロット分析は、20mM NaF、20mMβ-グリセロホスフェート、0.3 mMバナジン酸ナトリウム、20μg/ml RNase A、20μg/ml DNase、および1/300プロテアーゼ阻害剤カクテル(Sigma-Aldrich, P8340)およびホスファターゼ阻害剤カクテル#2(Sigma-Aldrich, P5726)含有トリス溶解バッファー(50 mMTris-HCl (pH 7.8)、150 mM NaCl、1% IGEPAL CA-630）を使用して前述のとおり実施された。本研究で使用された抗体は、以下の供給元から購入された：マウス抗GFP（GFP（B-2）：sc-9996、1：2,000、Santa Cruz Biotechnology、Inc。）、マウス抗チューブリン（クローン12G10、1：1,000、Developmental Studies Hybridoma Bank、University of Iowa） 、マウス抗Cdk2（クローンM2（sc-163）、1：1,000、Santa Cruz Biotechnology、Inc.）。ウエスタンブロット分析に使用された二次抗体はヤギ抗マウス（Thermo Scientific、31430）およびヤギ抗ウサギ(Thermo Scientific、31460)だった。マウス抗チューブリンハイブリドーマ細胞株（クローン#12G10）は、NICHDの後援の下でJ. FrankelとE.M. Nelsonによって開発され、Developmental Studies HybridomaBankによって維持された。タンパク質レベルは、BioRad ChemiDocMPイメージングシステムのPierceECLウエスタンブロッティング基質で視覚化し、Bio-Rad Image Labソフトウェア（バージョン4.1ビルド16）で分析した。
溶解物の調製および免疫ブロット分析は、20mM NaF、20mMβ-グリセロホスフェート、0.3 mMバナジン酸ナトリウム、20μg/ml RNase A、20μg/ml DNase、および1/300プロテアーゼ阻害剤カクテル(Sigma-Aldrich, P8340)およびホスファターゼ阻害剤カクテル#2(Sigma-Aldrich, P5726)含有トリス溶解バッファー(50 mMTris-HCl (pH 7.8)、150 mM NaCl、1% IGEPAL CA-630）を使用して前述のとおり実施された。本研究で使用された抗体は、以下の供給元から購入された：マウス抗GFP（GFP（B-2）：sc-9996、1：2,000、Santa Cruz Biotechnology、Inc。）、マウス抗チューブリン（クローン12G10、1：1,000、Developmental Studies Hybridoma Bank、University of Iowa） 、マウス抗Cdk2（クローンM2（sc-163）、1：1,000、Santa Cruz Biotechnology、Inc.）。ウエスタンブロット分析に使用された二次抗体はヤギ抗マウス（Thermo Scientific、31430）およびヤギ抗ウサギ(Thermo Scientific、31460)だった。マウス抗チューブリンハイブリドーマ細胞株（クローン#12G10）は、NICHDの後援の下でJ. FrankelとE.M. Nelsonによって開発され、Developmental Studies HybridomaBankによって維持された。タンパク質レベルは、BioRad ChemiDocMPイメージングシステムのPierceECLウエスタンブロッティング基質で視覚化し、Bio-Rad Image Labソフトウェア（バージョン4.1ビルド16）で分析した。
【0151】
使用DNAオリゴヌクレオチド
【0152】
SpV1-SpV2-R: (3Cs合成オリゴヌクレオチド)－ 配列番号1
SpV2-SpV3-R: (3Cs 合成オリゴヌクレオチド)－ 配列番号2
SpV2-SaV1-R: (3Cs合成オリゴヌクレオチド) － 配列番号3
SpV2-NmV1-R: (3Cs合成オリゴヌクレオチド) － 配列番号4
SpV2-As-R: (3Cs合成オリゴヌクレオチド) － 配列番号5
pLKO-1-Seq-F: (SANGER合成オリゴヌクレオチド) － 配列番号6
【0153】
【0154】
参考文献
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2. Han, K. et al.Synergistic drug combinations for cancer identified in a CRISPR screen forpairwise genetic interactions. Nat. Biotechnol. 35, 463-474 (2017).
3. Mali, P. et al.RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science (80-. ). 339, 823-826(2013).
4. Cong, L. et al.Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science (80-. ). 339,819-823 (2013).
5. Ran, F. A. et al. Invivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9. Nature 520, 186-191(2015).
6. Kleinstiver, B. P.et al. Genome-wide specificities of CRISPR-Cas Cpf1 nucleases in human cells.Nat Biotechnol (2016). doi:10.1038/nbt.3620
7. Hou, Z. et al. Efficientgenome engineering in human pluripotent stem cells using Cas9 from Neisseriameningitidis. Proc. Natl. Acad. Sci. 110, 15644-15649 (2013).
8. Kuate, S., Marino,M. P. & Reiser, J. Analysis of Partial Recombinants in Lentiviral VectorPreparations. Hum. Gene Ther. Methods 25, 126-135 (2014).
9. Sack, L. M., Davoli,T., Xu, Q., Li, M. Z. & Elledge, S. J. Sources of Error in MammalianGenetic Screens. G3: Genes|Genomes|Genetics 6, 2781-2790 (2016).
10. Miller, A. D. &Buttimore, C. Redesign of retrovirus packaging cell lines to avoidrecombination leading to helper virus production. Mol. Cell. Biol. 6, 2895-902(1986).
11. Barlett, M. M.,Erickson, M. J. & Meyer, R. J. Recombination between directly repeatedorigins of conjugative transfer cloned in M13 bacteriophage DNA models ligationof the transferred plasmid strand. Nucleic Acids Res. 18, 3579-86 (1990).
12. Chen, B. et al.Dynamic Imaging of Genomic Loci in Living Human Cells by an OptimizedCRISPR/Cas System. Cell 155, 1479-1491 (2013).
13. Lorenz, R. et al.ViennaRNA Package 2.0. Algorithms Mol. Biol. 6, 26 (2011).
14. Konermann, S. et al.Genome-scale transcriptional activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex.Nature 517, 583-588 (2015).
15. Tzelepis, K. et al.A CRISPR Dropout Screen Identifies Genetic Vulnerabilities and TherapeuticTargets in Acute Myeloid Leukemia. Cell Rep 17, 1193-1205 (2016).
16. Chen, B. et al.Dynamic imaging of genomic loci in living human cells by an optimizedCRISPR/Cas system. Cell 155, 1479-1491 (2013).
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3. Mali, P. et al.RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science (80-. ). 339, 823-826(2013).
4. Cong, L. et al.Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science (80-. ). 339,819-823 (2013).
5. Ran, F. A. et al. Invivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9. Nature 520, 186-191(2015).
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7. Hou, Z. et al. Efficientgenome engineering in human pluripotent stem cells using Cas9 from Neisseriameningitidis. Proc. Natl. Acad. Sci. 110, 15644-15649 (2013).
8. Kuate, S., Marino,M. P. & Reiser, J. Analysis of Partial Recombinants in Lentiviral VectorPreparations. Hum. Gene Ther. Methods 25, 126-135 (2014).
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10. Miller, A. D. &Buttimore, C. Redesign of retrovirus packaging cell lines to avoidrecombination leading to helper virus production. Mol. Cell. Biol. 6, 2895-902(1986).
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13. Lorenz, R. et al.ViennaRNA Package 2.0. Algorithms Mol. Biol. 6, 26 (2011).
14. Konermann, S. et al.Genome-scale transcriptional activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex.Nature 517, 583-588 (2015).
15. Tzelepis, K. et al.A CRISPR Dropout Screen Identifies Genetic Vulnerabilities and TherapeuticTargets in Acute Myeloid Leukemia. Cell Rep 17, 1193-1205 (2016).
16. Chen, B. et al.Dynamic imaging of genomic loci in living human cells by an optimizedCRISPR/Cas system. Cell 155, 1479-1491 (2013).
【0155】
図面の用語
two gRNA casettes 2つのgRNAカセット
n and m, 3 gRNAs each nとm、それぞれ3つのgRNA
Conventinoal Multiplexing 従来の多重化
all possible combinations すべての可能な組み合わせ
complexity 複雑さ
Fixed-Pair 固定ペア
predefined combinations 事前に定義された組み合わせ
excised fragment 切り出された断片
original 本来の
end product 最終産物
two gRNAs / one target 2つのgRNA／1つの標的
two gRNAs / two targets 2つのgRNA／2つの標的
wild type 野生型
cut 切断
target 標的
single active center 単一活性中心
nickase ニッカーゼ
interference 干渉
activation 活性化
or without effector domain (bacteria) または効果ドメインなし（細菌）
Epigenetic modifications エピジェネティック修飾
visualisation 視覚化
Fluoreszenzprotein 蛍光タンパク質
Technology 技術
template 鋳型
plasmid プラスミド
generation 生成
synthesis 合成
product 産物
Digest 消化
Ligation ライゲーション
Bidirectional 双方向
promoter プロモーター
final 最終
library ライブラリー
primeer プライマー
Species 種
Nuclease ヌクレアーゼ
sequence 配列
Frequency 頻度
Streptococcus pyogenes 化膿レンサ球菌
Staphylococcus aureus 黄色ブドウ球菌
Neisseria meningitidis 髄膜炎菌
Acidaminococcus sp. アシダミノコッカス
Average 平均
Max 最大
combinations 組み合わせ
fixed gRNA 固定gRNA
1st 第１の
2nd 第２の
adjusted regions 調整領域
guide ガイド
Tetraloop テトラループ
stem-loop ステムループ
XL1 to M13K07 XL1～M13K07
XL1 to M13K07 to XL1 XL1～M13K07～XL1
locus 遺伝子座
Proliferation in PD PDでの増殖
empty 空
exon エクソン
Single clone after 3Cs 3Cs後の単一クローン
Update 最新の
Sequential 連続
pair ペア
single oligos on FP3.1 FP3.1上の単一オリゴ
8N on FP3.1 FP3.1上の8N
randomized 8N P1 Sanger sequencing ランダム化8N P1 Sanger配列決定
randomized 8N P2 Sanger sequencing ランダム化8N P2 Sanger 配列決定
GFP level GFPレベル
two gRNA casettes 2つのgRNAカセット
n and m, 3 gRNAs each nとm、それぞれ3つのgRNA
Conventinoal Multiplexing 従来の多重化
all possible combinations すべての可能な組み合わせ
complexity 複雑さ
Fixed-Pair 固定ペア
predefined combinations 事前に定義された組み合わせ
excised fragment 切り出された断片
original 本来の
end product 最終産物
two gRNAs / one target 2つのgRNA／1つの標的
two gRNAs / two targets 2つのgRNA／2つの標的
wild type 野生型
cut 切断
target 標的
single active center 単一活性中心
nickase ニッカーゼ
interference 干渉
activation 活性化
or without effector domain (bacteria) または効果ドメインなし（細菌）
Epigenetic modifications エピジェネティック修飾
visualisation 視覚化
Fluoreszenzprotein 蛍光タンパク質
Technology 技術
template 鋳型
plasmid プラスミド
generation 生成
synthesis 合成
product 産物
Digest 消化
Ligation ライゲーション
Bidirectional 双方向
promoter プロモーター
final 最終
library ライブラリー
primeer プライマー
Species 種
Nuclease ヌクレアーゼ
sequence 配列
Frequency 頻度
Streptococcus pyogenes 化膿レンサ球菌
Staphylococcus aureus 黄色ブドウ球菌
Neisseria meningitidis 髄膜炎菌
Acidaminococcus sp. アシダミノコッカス
Average 平均
Max 最大
combinations 組み合わせ
fixed gRNA 固定gRNA
1st 第１の
2nd 第２の
adjusted regions 調整領域
guide ガイド
Tetraloop テトラループ
stem-loop ステムループ
XL1 to M13K07 XL1～M13K07
XL1 to M13K07 to XL1 XL1～M13K07～XL1
locus 遺伝子座
Proliferation in PD PDでの増殖
empty 空
exon エクソン
Single clone after 3Cs 3Cs後の単一クローン
Update 最新の
Sequential 連続
pair ペア
single oligos on FP3.1 FP3.1上の単一オリゴ
8N on FP3.1 FP3.1上の8N
randomized 8N P1 Sanger sequencing ランダム化8N P1 Sanger配列決定
randomized 8N P2 Sanger sequencing ランダム化8N P2 Sanger 配列決定
GFP level GFPレベル
【図1-1】
【図1-2】
【図1-3】
【図1-4】
【図2-1】
【図2-2】
【図2-3】
【図3-1】
【図3-2】
【図4-1】
【図4-2】
【図4-3】
【図5】
【図6-1】
【図6-2】
【図6-3】
【図7】
【図8】
【図9-1】
【図9-2】
【図10-1】
【図10-2】
【図10-3】
【図11-1】
【図11-2】
【図11-3】
【図12-1】
【図12-2】
【図12-3】
【図13-1】
【図13-2】
【図13-3】
【図14】
【図15-1】
【図15-2】
【配列表】