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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-04-16
(45)【発行日】2024-04-24
(54)【発明の名称】サンプル中の光化学的活性化学種の検出方法及び装置
(51)【国際特許分類】
G01N 21/64 20060101AFI20240417BHJP
【ＦＩ】
G01N21/64 B
【請求項の数】
15
(21)【出願番号】P 2022517406
(86)(22)【出願日】2020-07-31
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-11-24
(86)【国際出願番号】 EP2020071687
(87)【国際公開番号】W WO2021052668
(87)【国際公開日】2021-03-25
【審査請求日】2023-05-15
(31)【優先権主張番号】19306120.7
(32)【優先日】2019-09-18
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(73)【特許権者】
【識別番号】311016455
【氏名又は名称】サントル ナシオナル ドゥ ラ ルシェルシェ シアンティフィク
【氏名又は名称原語表記】ＣＥＮＴＲＥ ＮＡＴＩＯＮＡＬ ＤＥ ＬＡ ＲＥＣＨＥＲＣＨＥ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＱＵＥ
(73)【特許権者】
【識別番号】516149907
【氏名又は名称】エコール・ノルマル・シュペリウール・ドゥ・パリ
(73)【特許権者】
【識別番号】518170446
【氏名又は名称】ソルボンヌ ウニベルシテ
(74)【代理人】
【識別番号】110001173
【氏名又は名称】弁理士法人川口國際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】ジュリアン，リュドビック
(72)【発明者】
【氏名】シュケ，ラジャ
(72)【発明者】
【氏名】エスパーニュ，アガット
(72)【発明者】
【氏名】ルマルシャン，アニー
(72)【発明者】
【氏名】ル・ソー，トマ
(72)【発明者】
【氏名】ペリシエ－タノン，アニエス
【審査官】横尾 雅一
(56)【参考文献】
【文献】特表２００８－５４２７４８（ＪＰ，Ａ）
【文献】米国特許出願公開第２００９／００４０５１８（ＵＳ，Ａ１）
【文献】特表２０１９－５１７００６（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１８－５２９９８０（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１７－５３５７６４（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１８－５１３３５２（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１１－５２１２５０（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第９９／０１２０１８（ＷＯ，Ａ１）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｇ０１Ｎ ２１／６２ － Ｇ０１Ｎ ２１／７４
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
サンプル中の少なくとも１つの光化学的活性化学種を検出する方法であって、ａ）照明シーケンスに従って、前記少なくとも１つの光化学的活性化学種により吸収されて、前記少なくとも１つの光化学的活性化学種の少なくとも１つの光学特性に影響を与え、少なくとも１つの光化学的に誘起されるステップ（ＰＡＳ１）及び１つの熱的に誘起されるステップ（ＴＡＳ１）を含む第一の反応（Ｒ１）をトリガするのに適した少なくとも第一の波長（λ１）の光（ＬＢ１）で前記サンプル（Ｓ）を照明するステップであって、前記照明シーケンスは：
・前記照明シーケンスの少なくとも第一の時間ウィンドウ（ＴＷ１、ＴＷ１’）中に、第一の反応の速度は光化学的に誘起されるステップによって限定され、
・前記照明シーケンスの少なくとも第二の時間ウィンドウ（ＴＷ３、ＴＷ２’）中に、前記第一の反応の前記速度は熱的に誘起されるステップによって限定される
というものであるステップと、
ｂ）前記第一及び前記第二の時間ウィンドウ中の前記少なくとも１つの光化学的活性化学種の光特性の変化を測定するステップと、
ｃ）前記測定から、少なくとも、それぞれ前記第一及び前記第二の時間ウィンドウ中の前記第一の反応の速度定数を表す第一及び第二の時間定数を特定するステップと、
ｄ）前記特定された時間定数を前記少なくとも１つの光化学的活性化学種の検出のために使用するステップと、
を含む方法。
【請求項2】
－ステップａ）はまた、前記照明シーケンスに従って、少なくとも第二の波長（λ２）の光（ＬＢ２）で前記サンプルを照明するステップも含み、前記第二の波長の光は、前記少なくとも１つの光化学的活性化学種によって、又は前記第一の反応の生成物によって吸収されて、前記少なくとも１つの光化学的活性化学種の少なとく１つの光学特性に影響を与え、少なくとも１つの光化学的に誘起されるステップ（ＰＡＳ２）及び１つの熱的に誘起されるステップ（ＴＡＳ２）を含む第二の反応（Ｒ２）をトリガするのに適しており、前記照明シーケンスは：・前記照明シーケンスの少なくとも第三の時間ウィンドウ（ＴＷ２）中に、前記第二の反応の速度は前記光化学的に誘起されるステップによって限定され、
・前記照明シーケンスの少なくとも第四の時間ウィンドウ（ＴＷ４）中に、前記第二の反応の前記速度は前記熱的に誘起されるステップによって限定される、
とうものであり、
－ステップｂ）はまた、前記第三及び前記第四の時間ウィンドウ中の前記少なくとも１つの光化学的活性化学種の前記光学特性の前記変化を測定するステップも含み、
－ステップｃ）はまた、前記測定から、少なくとも、それぞれ第三及び第四の時間ウィンドウ中の前記第二の反応の速度定数を表す第三及び第四の時間定数を特定するステップ含み、
－少なくとも前記第三及び第四の時間定数は、ステップｄ）において、前記第一及び第二の時間定数とともに前記少なくとも１つの光化学的活性化学種の検出に使用される、
請求項１に記載の方法。
【請求項3】
ステップｂ）は蛍光発光を測定するステップを含む、請求項１～２の何れか１項に記載の方法。
【請求項4】
前記少なくとも１つの光化学的活性化学種は、蛍光タンパク質と可逆的光スイッチ型蛍光体から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項5】
－前記少なくとも１つの光化学的活性化学種は可逆的スイッチ型蛍光タンパク質であり、－前記照明シーケンスの少なくとも第一の時間ウィンドウ（ＴＷ１）中に、前記第一の波長の光強度レベル（Ｉ１）は、前記第一の反応の前記速度が前記光化学的に誘起されるステップにより限定されるのに十分に低く保持され、
－前記照明シーケンスの少なくとも第二の時間ウィンドウ（ＴＷ３）中に、前記第一の波長の前記光強度レベルは、前記第一の反応の前記速度が前記熱的に誘起されるステップにより限定されるのに十分に高く保持される
請求項４に記載の方法。
【請求項6】
－前記照明シーケンスの少なくとも第三の時間ウィンドウ（ＴＷ２）中に、前記第二の波長の光強度レベル（Ｉ２）は、前記第二の反応の前記速度が前記光化学的に誘起されるステップにより限定されるのに十分に低く保持され、－前記照明シーケンスの少なくとも第四の時間ウィンドウ（ＴＷ４）中に、前記第二の波長の前記光強度レベルは、前記第二の反応の前記速度が前記熱的に誘起されるステップにより限定されるのに十分に高く保持される
請求項２に従属するときの請求項５に記載の方法。
【請求項7】
－前記少なくとも１つの光化学的活性化学種は蛍光タンパク質であり、－前記照明シーケンスの少なくとも１つの第一の時間ウィンドウ（ＴＷ１’）中に、前記第一の波長の光強度レベル（Ｉ１）は、前記少なくとも１つの光化学的活性化学種を非蛍光形態に光化学的に変換して、蛍光強度を漸減させるのに十分に高く保持され、
－前記照明シーケンスの、前記第一の時間ウィンドウの後の少なくとも１つの第二の時間ウィンドウ（ＴＷ２’）中に、前記第一の波長の前記光強度レベル（Ｉ１）は、前記蛍光強度の熱による回復が可能となるのに十分に低く保持される、
請求項４に記載の方法。
【請求項8】
－前記少なくとも１つの光化学的活性化学種は可逆的光スイッチ型蛍光タンパク質であり、－前記照明シーケンスの少なくとも１つの第一の時間ウィンドウ（ＴＷ１）中に、前記サンプルは前記第一の波長の光パルスの第一の連続（ＬＰ１１－ＬＰ１５）により照明され、各パルスは、前記少なくとも１つの光化学的活性化学種のうちの化学種の第一の部分のみが前記第一の反応の前記光化学的に誘起されるステップを通じて変換されるのに十分に低いフルエンスを有し、連続する２つのパルス間の間隔（ｔｄ）は、化学種の前記第一の部分が、前記第一の反応の前記光化学的に誘起されるステップに続く前記熱的に誘起されるステップを通じて完全に変換されるのに十分に長く、
－前記照明シーケンスの少なくとも１つの第二の時間ウィンドウ（ＴＷ３）中に、前記サンプルは前記第一の波長の光パルスの第二の連続（ＬＰ３１－ＬＰ３５）により照明され、前記連続の少なくとも第一のパルスは、前記少なくとも１つの光化学的活性化学種を前記第一の反応の前記光化学的に誘起されるステップを通じて完全に変換するのに十分に高いフルエンスを有し、連続する２つのパルス間の間隔（ｔｄ）は、前記第一の反応の前記熱的に誘起されるステップを通じた前記少なくとも１つの光化学的活性化学種の後続のさらなる変換をサンプリングするのに十分に短い、
請求項４に記載の方法。
【請求項9】
－前記照明シーケンスの少なくとも前記第三の時間ウィンドウ（ＴＷ２）中に、前記サンプルは前記第二の波長の光パルスの第三の連続（ＬＰ２１－ＬＰ２５）により照明され、各パルスは、前記少なくとも１つの光化学的活性化学種のうちの化学種の第二の部分のみが前記第二の反応の前記光化学的に誘起されるステップを通じて変換されるのに十分に低いフルエンスを有し、連続する２つのパルス間の間隔は、化学種の前記第二の部分が、前記第二の反応の前記光化学的に誘起されるステップに続く前記熱的に誘起されるステップを通じて完全に変換されるのに十分に長く、－前記照明シーケンスの少なくとも第四の時間ウィンドウ（ＴＷ４）中に、前記サンプルは前記第二の波長の光パルスの第四の連続（ＬＰ４１－ＬＰ４５）により照明され、前記連続の少なくとも第一のパルスは、前記少なくとも１つの光化学的活性化学種を前記第二の反応の前記光化学的に誘起されるステップを通じて完全に変換するのに十分に高いフルエンスを有し、連続する２つのパルス間の間隔は、前記第二の反応の前記熱的に誘起されるステップを通じた前記少なくとも１つの光化学的活性化学種の後続のさらなる変換をサンプリングするのに十分に短い、
請求項２に従属するときの請求項８に記載の方法。
【請求項10】
－前記少なくとも１つの光化学的活性化学種は蛍光タンパク質であり、－複数の第一の時間ウィンドウ（ＴＷ１ａ－ＴＷ１ｅ）中に、前記サンプルは、前記第一の反応の前記光化学的に誘起されるステップを通じて前記少なくとも１つの光化学的活性化学種を完全に変換するのに十分に高いフルエンスにより前記第一の波長で照明され、
－前記第一の時間ウィンドウと交互の複数の第二の時間ウィンドウ（ＴＷ２ａ－ＴＷ２ｅ）中に、前記サンプルは前記第一の波長で照明されず、前記第二の時間ウィンドウは、前記第一の反応の前記熱的に誘起されるステップを通じた前記少なくとも１つの光化学的活性化学種の後続のさらなる変換をサンプリングするのに適した変化する持続時間を有する、
請求項４に記載の方法。
【請求項11】
ステップａ）及びｂ）は光走査型顕微鏡により行われる、請求項８～１０の何れか１項に記載の方法。
【請求項12】
－前記サンプルは、空間的に不均一な光強度で照明され、－ステップｄ）は、光化学的に誘起されるステップにより限定される反応速度定数を表す前記特定された時間定数を、前記サンプル内で前記少なくとも１つの光化学的活性化学種の局在を検出するために使用するステップを含む、
請求項１～１１の何れか１項に記載の方法。
【請求項13】
ステップｄ）は：－ステップｃ）で特定された前記時間定数により形成されるベクトルと複数の所定の時間定数のベクトルの各々との間の複数の多次元対数距離を計算するステップであって、前記複数の所定の時間定数のベクトルの各々は前記少なくとも１つの光化学的活性化学種のうちのそれぞれの光化学的活性化学種を表すようなステップと、
－前記対応する多次元対数距離が測定の不確実性を表す閾値より低い場合に、前記少なくとも１つの光化学的活性化学種の１つを検出するステップと、
を含む、請求項１～１２の何れか１項に記載の方法。
【請求項14】
ステップｂ）は、前記サンプル中の複数の場所にある前記少なくとも１つの光化学的活性化学種の前記又は各前記光学特性の前記変化を別々に測定するステップを含み、ステップｃ）は、前記場所の各々に関する前記時間定数を特定するステップを含み、ステップｄ）は、前記少なくとも１つの光化学的活性化学種が前記場所の各々に存在するか否かを特定するステップを含む、請求項１～１３の何れか１項に記載の方法。
【請求項15】
請求項１～１４の何れか１項に記載の方法を実行する装置であって、－前記サンプルを、異なる照明条件に対応する少なくとも２つの時間ウィンドウを含む所定の照明シーケンスに従って少なくとも第一の波長（λ１）の光（ＬＢ１）で照明するように構成された少なくとも１つの制御された光源（ＬＳ１）と、
－前記時間ウィンドウ中に前記サンプルの光学特性の変化を測定するように構成された光検出器（ＬＤ）と、
－前記測定から、前記時間ウィンドウ中に前記変化を表す複数の時間定数を特定し、前記特定された時間定数に応じて前記サンプル内の少なくとも１つの光化学的活性化学種を検出するように構成されたデータ処理装置（ＤＰＤ）と、
を含む装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、サンプル中の光化学的活性化学種、例えば蛍光タンパク質（ＦＰ：ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）又は可逆的光スイッチ型蛍光タンパク質（ＲＳＦＰ：ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｙ ｐｈｏｔｏｓｗｉｔｃｈａｂｌｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）を検出するため、より詳しくはサンプル中に存在する、又は存在するのに適した複数の光化学的活性化学種を区別することによってそれを同定するための方法に関する。本発明はまた、適当な不均一照明が使用されることを条件として観察領域内の光化学的活性化学種の局在を検出することや、検出された光化学的活性化学種の特定の化学的及び物理的環境を特定すること等、他の様々な用途にも適している。
【0002】
このような方法は特に、蛍光顕微鏡法及び生物学的／生化学的解析の分野に適用される。
【0003】
本発明はまた、このような方法を実行するための装置にも関する。
【背景技術】
【0004】
「化学種」という用語は、分子、分子イオン、又は化合物を意味すると理解されたい。本発明の枠組み内では、化学種はその特性、特に光化学的特性により定義される。したがって、異なる環境中でこれらの特性に影響を与える同じ分子、分子イオン、又は化合物は異なる種と考え得る。
【0005】
「光化学的活性」な種とは、光の影響下で電子的構成及び／又は化学的構造に変化をきたす化学種である。
【0006】
「可逆的光スイッチ型」という表現は、異なる特性（例えば、蛍光特性）を持つ少なくとも２つの異なる状態を有し、光の影響下で１つの状態から他の状態へと可逆的に移行し得る化学種（典型的にタンパク質）を意味すると理解されたい。可逆的光スイッチ型の種の例は、「Ｄｒｏｎｐａ（ドロンパ）」及び化合物の「Ｓｐｉｎａｃｈ－ＤＦＨＢＩ」（「Ｓｐｉｎａｃｈ」はＲＮＡアプタマであり、「ＤＦＨＰＩ」は発蛍光プローブである）である。これらの種は特に標識又はマーカとして使用され得る。
【0007】
蛍光イメージング及び特に蛍光顕微鏡法は、蛍光標識の高い感度と汎用性から、生物学にとってきわめて重要となっている。蛍光標識を同定し、識別するための一般的な方法は、スペクトルドメインで蛍光信号を読み出すことである。しかしながら、スペクトル識別には高度な多項目観察について限界が見られる。光源、色収差が補正された光学系、ダイクロイックミラー、光フィルタ等の豊富なハードウェアがあっても、重なった吸収及び発光バンドのスペクトル解析では４つの標識しか識別できないのが普通である。最新技術のスペクトル特性分離（ｓｐｅｃｔｒａｌ ｕｎｍｉｘｉｎｇ）を用いれば、この数は６に増え、そのうちの５つは遺伝的にコード化されている（［Ｖａｌｍ ２０１７］）が、ｐｈｏｔｏｎ ｂｕｄｇｅｔと計算時間の点でコストが高い。これは新規な遺伝子工学戦略の識別力を大きく制限している。
【0008】
蛍光体の最適化（光吸収のための断面積、発光の量子収差、吸収／発光バンドの半値幅）は基本的にその物理的限界まで行われており、蛍光は引き続き生体細胞の画像形成のために非常に有利な観察可能物であるはずであるため、蛍光体をさらに識別するために、スペクトル次元を１つ又は複数の追加の次元で補うことがきわめて望ましい。そして実際に、蛍光体を、その吸収－蛍光発光の光サイクルを特徴付ける動力学的な、すなわち時間的な情報を使って識別するための幾つかの技術が開発されている。
【0009】
例えば、蛍光寿命顕微鏡法（ＦＬＩＭ：Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｌｉｆｅｔｉｍｅ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）では、励起状態の寿命を利用して蛍光が識別される（［Ｌａｋｏｗｉｃｚ １９９２］）。しかしながら、高度な器具と高速の電子機器が必要となること以上に、この方法は、現在蛍光イメージングで使用されている明るい蛍光体の寿命のばらつきの範囲が狭い（１桁未満）ことにより限定される。したがって、多重蛍光寿命イメージングには、デコンボリューション（時間がかかる）又は減算方式（ロバスト性を欠き、信号対ノイズ比が下がる）の適用が必要である。
【0010】
可逆的光スイッチ型蛍光体（ＲＳＦであり、ＲＳＦＰはその一部）にはこのような欠点がない。これらの標識は、吸収－蛍光発光の光サイクルをはるかに超える豊富な光化学反応から利益を受ける。ＲＳＦでは、照明が光化学的及び熱工程を含む幾つかの光サイクルを駆動し、これらは広い範囲の緩和時間（μ秒～秒）にわたって干渉し、生物学的現象のリアルタイムでの観察と両立する時間スケールでの識別が容易となる。したがって、ＯＬＩＤ、ＳＡＦＩＲｅ、及びＯＰＩＯＭ等の幾つかのプロトコルでは、デコンボリューションにも減算方式にも依存せずに、分光的に類似したＲＳＦ（「ダイナミックコントラスト」）の画像を形成するために光の変化に対する蛍光の時間応答を利用している。
【0011】
ＯＬＩＤは、“Ｏｐｔｉｃａｌ Ｌｏｃｋ－Ｉｎ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ”の略であり、［Ｍａｒｒｉｏｔｔ ２００８］に記載されている。この技術の１つの欠点は、ＲＳＦの濃度に関する数量的情報が提供されていないことである。また、少なくとも１つの参照ピクセルも必要となる。
【0012】
ＳＦＩＲｅは、“Ｓｙｎｃｈｒｏｎｏｕｓｌｙ Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｉｍａｇｅ Ｒｅｃｏｖｅｒｙ”の略であり、［Ｒｉｃｈａｒｄｓ ２０１０］に記載されている。ダイナミックコントラストの最適化には、経験的に行われるという欠点があり、それによって実施する上での複雑さが増す。
【0013】
ＴＲＡＳＴは、ＴＲＡｎｓｉｅｎｔ ＳＴａｔｅ顕微鏡法の略である。これは［Ｗｉｎｄｅｎｇｒｅｎ ２０１０］に記載されている。
【0014】
ＯＰＩＯＭは、“Ｏｕｔ－ｏｆ－Ｐｈａｓｅ Ｉｍａｇｉｎｇ ａｆｔｅｒ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ”の略である。この方法は、［Ｑｕｅｒａｒｄ ２０１５］及び国際出願第２０１５０７５２０９号パンフレットに記載されている。この方法では、ＲＳＦを含むサンプルが周期的に変調される光波で照明される。その後、励起波に関して同相／直交位相で、蛍光体により同じ角周波数で発せられた強度の成分が検出される。Ｓｐｅｅｄ ＯＰＩＯＭ（［Ｑｕｅｒａｒｄ ２０１７］及び国際出願第２０１８／０４１５８８号パンフレット）はＯＰＩＯＭの変形であり、これは２波長照明の利用によって、より短い取得時間を実現する。
【0015】
それでも、これらのプロトコルは何れも、ある組織内の細胞又は細胞近傍の数十個の化学種を同時に画像化するという定量的生物学の需要の高まりに依然として応えていない。例えば、Ｓｐｅｅｄ ＯＰＩＯＭでは、１Ｈｚのオーダの取得頻度で、分光的に類似する３種のＲＳＦＰを独立して画像化できる。その他の方法で実証されている識別力はずっと低い。
【0016】
米国特許第２００９／００４０５１８号明細書には、異なる照明条件に対応する一連の時間積分蛍光測定から運動学的速度を特定する方法が記載されている。この方法には、モデルに依存するという欠点がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0017】
【文献】国際出願第２０１５０７５２０９号
【文献】国際出願第２０１８／０４１５８８号
【文献】米国特許出願公開第２００９／００４０５１８号明細書
【非特許文献】
【0018】
【文献】Ｖａｌｍ ２０１７
【文献】Ｌａｋｏｗｉｃｚ １９９２
【文献】Ｍａｒｒｉｏｔｔ ２００８
【文献】Ｒｉｃｈａｒｄｓ ２０１０
【文献】Ｗｉｄｅｎｇｒｅｎ ２０１０
【文献】Ｑｕｅｒａｒｄ ２０１５
【文献】Ｑｕｅｒａｒｄ ２０１７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0019】
本発明は、先行技術の上記の限界の全部又は一部を克服することを目指す。より詳しくは、ダイナミックコントラストを利用する他の技術と比較して、蛍光イメージングにおける（及びより広くは、化学種の光検出における）多重化能力を改善することを目指す。さらにより詳しくは、デコンボリューションや減算処理に頼らずにこれを行うことを目指す。
【課題を解決するための手段】
【0020】
本発明の基礎となるアイディアは、照明の適当な変化を適用したときに異なる可逆的蛍光変化をきたす標識を使用することであり、それによってダイナミックコントラストに関する複数の緩和時間の利用が可能となる。
【0021】
実際に、先行技術によれば、ダイナミックコントラストに基づく減算もデコンボリューションも用いずに、信頼性の高いそれらの識別を可能にするために、典型的に、２つの蛍光標識は１０倍の差のあるその信号の緩和時間を示さなければならない。この制約は、Ｎ個の標識を区別するには、それらのダイナミスクを１０Ｎ×τｍｉｎの幅の時間ウィンドウに広がるべきであることを意味し、τｍｉｎは光の変化に最も速く応答するＲＳＦの緩和時間を示す。その結果、１０Ｎ×τｍｉｎによって画像取得時間Τが固定される。したがって、Ｎが十分に大きく（例えば、１０）なるとすぐに、Τは長くなりすぎ、画像取得頻度は生きている生物学的サンプルの観察とは両立しなくなる（言うまでもなく、このような広い範囲の緩和時間を有する標識のライブラリを見つけることはきわめて困難である）。１０種の区別可能なＲＳＦＰのライブラリを例にとると、τｍｉｎは１ｍｓの範囲で、Τ＝１０７ｓ（すなわち、１１０日を超える）となり、長すぎる。
【0022】
ダイナミックコントラストによる識別のためにｎ＞１（典型的に、後述のように、ｎ＝２又はｎ＝４）の緩和時間と、したがってｎの識別次元を利用することによって、本発明では取得時間を大幅に短縮でき、適当な標識を見つけやすくなる。実際に、２つの標識間の識別には依然として、それらの信号の緩和時間が１０倍の差を有することが必要となるが、ｎの識別次元の中の（少なくとも）１つにおいてである。したがって、Ｎの標識を画像化するために必要な全体的な識別ウィンドウはｎの次元で共有でき、それによって各識別次元に沿った取得ウィンドウの幅はおそらく１０Ｎ／ｎ×τｍｉｎまで縮小される。すると、全体的な取得時間は
となり、式中、τｍｉｎ．ｋは次元ｋに沿った光の変化に最も早く応答するＲＳＦの緩和時間を示す。τｍｉｎ．ｋが識別次元に依存しないと仮定することにより、識別のためにｎの次元を使用すると、画像取得頻度を１０Ｎ（１－１／ｎ）／ｎの係数で増やすことができる。再び１０種の区別可能なＲＳＦを例にとり、ｎ＝４次元、τｍｉｎ．ｋ＝１ｍｓとすると、Τ≒１．３ｓとなり、画像取得頻度は８・１０６という驚きの係数で高くなる。
【数1】
【0023】
さらに、ダイナミックコントラストに依存する他の検出／識別方式の幾つかと異なり、本発明による方法はＲＳＦＰに限定されず、非光スイッチ型蛍光タンパク質（ＦＰ）等のより単純な蛍光体でも使用できるが、ただしその場合、使用可能な緩和時間の数はＲＳＦＰより少ないことが多い。
【0024】
本発明の重要な特徴は、広視野イメージング及び光走査型顕微鏡法のどちらにも適用可能であることである。
【0025】
すると、本発明の対象物はサンプル中の光化学的活性化学種を検出又は同定する方法であり、これは：
ａ）照明シーケンスに従って、少なくとも、化学種により吸収されて化学種の少なくとも１つの光学特性に影響を与え、少なくとも１つの光化学的に誘起されるステップと１つの熱的に誘起されるステップを含む第一の反応をトリガするのに適した第一の波長の光でサンプルを照明するステップであって、照明シーケンスは：
・照明シーケンスの少なくとも第一の時間ウィンドウの中で、第一の反応速度は光化学的に誘起されるステップによって限定され、
・照明シーケンスの少なくとも第二の時間ウィンドウの中で、第一の反応速度は熱的に誘起されるステップによって限定される
というものであるステップと、
ｂ）第一及び第二の時間ウィンドウ中に化学種の光特性の変化を測定するステップと、
ｃ）前記測定から、少なくとも、それぞれ第一及び第二の時間ウィンドウ内の第一の反応の速度定数を表す第一及び第二の時間定数を特定するステップと、
ｄ）特定された時間定数を化学種の検出又は同定のために使用するステップと、
を含む。
ａ）照明シーケンスに従って、少なくとも、化学種により吸収されて化学種の少なくとも１つの光学特性に影響を与え、少なくとも１つの光化学的に誘起されるステップと１つの熱的に誘起されるステップを含む第一の反応をトリガするのに適した第一の波長の光でサンプルを照明するステップであって、照明シーケンスは：
・照明シーケンスの少なくとも第一の時間ウィンドウの中で、第一の反応速度は光化学的に誘起されるステップによって限定され、
・照明シーケンスの少なくとも第二の時間ウィンドウの中で、第一の反応速度は熱的に誘起されるステップによって限定される
というものであるステップと、
ｂ）第一及び第二の時間ウィンドウ中に化学種の光特性の変化を測定するステップと、
ｃ）前記測定から、少なくとも、それぞれ第一及び第二の時間ウィンドウ内の第一の反応の速度定数を表す第一及び第二の時間定数を特定するステップと、
ｄ）特定された時間定数を化学種の検出又は同定のために使用するステップと、
を含む。
【0026】
この方法の特定の実施形態は、特許請求の範囲の従属項の主旨を構成する。
【0027】
本発明の他の対象物は、このような方法を実行するための装置であり、これは：
－サンプルを、異なる照明条件に対応する少なくとも２つの時間ウィンドウを含む所定の照明シーケンスに従って少なくとも第一の波長の光で照明するように構成された少なくとも１つの制御された光源と、
－前記時間ウィンドウ中にサンプルの光学特性の変化を測定するように構成された光検出器と、
－前記測定から、前記時間ウィンドウ中の前記変化を表す複数の時間定数を特定し、特定された時間定数に応じてサンプル内の光化学的活性化学種を検出又は同定するように構成されたデータ処理装置と、
を含む。
－サンプルを、異なる照明条件に対応する少なくとも２つの時間ウィンドウを含む所定の照明シーケンスに従って少なくとも第一の波長の光で照明するように構成された少なくとも１つの制御された光源と、
－前記時間ウィンドウ中にサンプルの光学特性の変化を測定するように構成された光検出器と、
－前記測定から、前記時間ウィンドウ中の前記変化を表す複数の時間定数を特定し、特定された時間定数に応じてサンプル内の光化学的活性化学種を検出又は同定するように構成されたデータ処理装置と、
を含む。
【0028】
本発明のその他の特徴と利点は、以下の説明文を下記のような添付の図面とともに読めば明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【0029】
【図1A】本発明の基礎となる概念を概略的に示す。
【図1B】本発明の基礎となる概念を概略的に示す。
【図1C】本発明の基礎となる概念を概略的に示す。
【図1D】本発明の基礎となる概念を概略的に示す。
【図2A】本発明のある実施形態による、ＲＳＦを識別するための複数の緩和時間の使用を示す。
【図2B】本発明のある実施形態による、ＲＳＦを識別するための複数の緩和時間の使用を示す。
【図3A】本発明の幾つかの実施形態において使用するのに適した仮定上のＲＳＦのエネルギ準位と、これらのエネルギ準位間の遷移を概略的に示す。
【図3B】疑似定常状態近似を通じて得られた低減エネルギ準位スキームである。
【図4A】本発明の第一の実施形態で使用される照明シーケンスを示す。
【図4B】本発明の第一の実施形態で使用される照明シーケンスを示す。
【図4C】本発明の第一の実施形態で使用される照明シーケンスを示す。
【図4D】本発明の第一の実施形態で使用される照明シーケンスを示す。
【図5A】本発明の第二の実施形態で使用される照明シーケンスを示す。
【図5B】本発明の第二の実施形態で使用される照明シーケンスを示す。
【図5C】本発明の第二の実施形態で使用される照明シーケンスを示す。
【図5D】本発明の第二の実施形態で使用される照明シーケンスを示す。
【図6】本発明の幾つかの実施形態において使用するのに適した仮定上のＦＰのエネルギ準位と、これらのエネルギ準位間の遷移を概略的に示す。
【図7A】本発明の第三の実施形態で使用される照明シーケンスを示す。
【図7B】本発明の第三の実施形態で使用される照明シーケンスを示す。
【図8A】本発明の第四の実施形態で使用される照明シーケンスを示す。
【図8B】本発明の第四の実施形態で使用される照明シーケンスを示す。
【図9A】本発明の実施形態による、サンプルの光学的セクショニングを提供するための緩和時間測定の使用を示す。
【図9B】本発明の実施形態による、サンプルの光学的セクショニングを提供するための緩和時間測定の使用を示す。
【図10】本発明の実施形態による装置のブロック図である。
【図11A】ドロンパで標識した大腸菌のイメージングへの本発明の実施形態による方法の応用を示す。
【図11B】ドロンパで標識した大腸菌のイメージングへの本発明の実施形態による方法の応用を示す。
【図11C】ドロンパで標識した大腸菌のイメージングへの本発明の実施形態による方法の応用を示す。
【発明を実施するための形態】
【0030】
本発明の方法によれば、ＲＳＦの光サイクルは、一次の光化学的及び熱的に駆動される反応に係わるｎｓの状態、Ｃ１．．．Ｃｎｓのネットワークに同化させることができる。ｎλの波長が、少なくとも１つの状態の可逆的光化学反応につながる値に設定される。ＲＳＦの照明の変化により、ＲＳＦ状態の、ひいては蛍光信号の濃度の変化が誘導され、ｎｓの状態のうちの少なくとも幾つかは異なる輝度を示すと仮定される。この変化は、ｎｓ－１の指数の項の一次結合として表現でき、その振幅と緩和時間はＲＳＦの光サイクルの反応の速度定数に依存する。光サイクルの光化学ステップの速度定数は光の強度により設定され（例えば、これらは１光子励起での光強度に比例する）、他方で熱的ステップのそれらは設定されない。ＲＳＦ蛍光信号の変化は、最も低い速度定数、すなわち最長緩和時間に関連付けられる最も低速なステップにより限定される。その結果、照明条件の変化に対するＲＳＦ蛍光の時間応答は光の強度に依存する。１つではなく複数の連続的な照明条件（例えば、光強度値）を適用することにより、異なる速度限定ステップに関連するＲＳＦ蛍光変化の動力学を調べ、したがって非冗長的な情報を得ることができる。異なる照明条件の各々に関連付けられる緩和時間は、ＲＳＦ識別のための同数の次元を構成し、その結果先行技術による方法より選択性が高くなり、したがって区別可能な分光的に類似のＲＳＦの数が増える。
【0031】
論理的な観点から（この理論に関するより詳しい説明は、［Ｓｕｍｍｅｒｓ １９９８］を参照のこと）、反応が一次であるため、ｎｓの状態の濃度ｃ１、ｃ２、．．．、ｃｎｓは次式で表される：
式中、ｃは濃度値を含む列ベクトルであり、Ｋはｎｓ×ｎｓの行列である。Ｋの各非対角成分、ｋｉｊ ｉ≠ｊは反応Ｃｉ→Ｃｊの速度定数であり、Ｋの各対角成分、ｋｉｉは光サイクルの他の何れかの状態における速度定数変化状態Ｃｉの全部の合計である：
【数2】
【数3】
【0032】
行列Ｋはｎｓの固有値を有することを証明でき、そのうちの１つはゼロである。妥当な実験条件下で、ｎｓ－１の重要な固有値は実数で負であり、したがって－１／τｉで示すことができる。定常的な照明条件の場合の状態Ｃｉの濃度の時間変化はすると、次式で表される：
ただし、頻度因子ｒｉｊと定数ｓｉは速度定数と初期条件に依存する。
【数4】
【0033】
同様に、蛍光強度ＩＦは以下のように変化する：
式中、
且つ
であり、Ｑｉは状態Ｃｉの輝度である。
【数5】
【数6】
【数7】
【0034】
したがって、蛍光信号は、前述のように、光強度とともに変化する多次指数関数的時間依存性を示す。
【0035】
図１Ａ～１Ｄは、本発明による基本的な原理を、ｎｓ＝３、ｎλ＝１のごく単純なケースで図解する。仮定上のＲＳＦはｎｓ＝３の状態、すなわち、蛍光性の輝度がＱ１の基底状態Ｃ１、蛍光性の輝度が例えばＱ１より低いＱ２の状態Ｃ２、及び蛍光性を持たない（「暗い」）状態Ｃ３である。反応ＰＡＳは、Ｃ１をＣ２に変換するもので、光化学的反応であり、速度定数ｋ１２＝Κ１２Ｉλであり、Ｉλは特定波長λでの光強度であり、反応ＴＡＳはＣ２をＣ３に変換するもので、熱的反応であり、その速度定数はｋ２３で、光強度とは無関係である。図１Ａ及び１Ｂは、Ｉλがｋ１２＜＜ｋ２３となるのに十分に低い状態に関している（この理由のために、図１Ａでは、Ｃ１→Ｃ２の遷移を表す波線の矢印は細い黒線で、それがＣ１をＣ３に変換するメカニズムの速度限定ステップであることを示している）。その結果、Ｃ１からＣ３への変換の動力学は光化学的ステップによって支配され、時間による蛍光強度ＩＦの減少（図１Ｂ）は主としてｋ１２を表す。図１Ｃ及び１Ｄは、Ｉλがｋ１２＞＞ｋ２３となるのに十分に高い状態に関している（この理由のために、図１Ｃでは、Ｃ１→Ｃ２の遷移を表す波線の矢印は太く、黒ではなくグレーになっている）。その結果、Ｃ１からＣ３への変換の動力学は熱的ステップによって支配され、時間による蛍光強度ＩＦの減少（図１Ｂ）は主としてｋ２３を表す。異なる光強度に対応する２つの測定された緩和時間は、ＲＳＦを同定する２つの「標識」を構成する。
【0036】
【0037】
上で説明したように、ＲＳＦは異なる照明条件下で測定される緩和時間τｉのセットにより同定できる。図１Ａ～１Ｄの例では、同じ波長での異なる光強度に対応する２つの緩和時間だけが測定されているが、多波長照明の使用によって、より多くの緩和時間を取得できる。
【0038】
これらの緩和時間、又はその適当な関数は、ＲＳＦを同定するための識別次元として使用できる。同じＲＳＦに関する緩和時間が数桁の範囲にわたり得ることを考えると、その対数、すなわちｌｉ＝ｌｏｇ（τｉ）の使用が有利であることが多い。理想的には、ＲＳＦはすると、その次元が緩和時間の対数ｌｉによりパラメータ化される多次元空間（「識別空間」）内の点で表すことができる。しかしながら、測定ノイズにより緩和時間の標準偏差の適当な関数である半径又は軸を有する超球又は超楕円体としてそれを表す方がより正確である。
【0039】
すると、指数ｉ及びｊで特定されるＲＳＦのペア間の距離ｄｉｊを識別空間内で定義できる。例えばこれは、緩和時間の対数ｌｉによりパラメータ化されたその空間内のユークリッド距離とすることができ、すなわち緩和時間により直接パラメータ化される空間内の対数距離：
であり、式中ｌｋｉ＝ｌｏｇ（τｋｉ）で、τｋｉはＲＳＦ「ｉ」のｋ番目の緩和時間である。
【数8】
【0040】
本発明による方法の識別力を最適化するために、Ｎの利用可能なＲＳＦのセットｓ（Ｎ）の中から、その相対距離が最大となるＲＳＦのサブセットを選択する必要がある。すると次に、それによってそのペア間の距離に応じてＮのＲＳＦをランク付けする必要がある。
【0041】
本発明の第一の実施形態によれば、ｍのＲＳＦの最適化されたサブセットｓ’（ｍ）がｍ＝２；．．．；Ｎについて特定される。ペア間の最小距離ｄｍｉｎが、ｓ（Ｎ）に含まれるｍのＲＳＦの全サブセットについて計算される。ｄｍｉｎの値が最大のサブセットｓ’（ｍ）が選択される。
【0042】
この方法の欠点は、ｓ’（ｍ）⊂ｓ’（ｍ＋１）となることが保証されないことである。例えば、ｍ＝３のＲＳＦの最適サブセットは必ずしも、ｍ＝２のＲＳＦの最適なサブセットともう１つのＲＳＦにより構成されるとは限らない。これは、ＲＳＦの同じセットを使って異なる数のそのメンバーを識別したいエンドユーザにとって欠点であり得る。
【0043】
本発明の第二の実施形態によるランク付け方法では、確実にｓ’（ｍ）⊂ｓ’（ｍ＋１）となる。
【0044】
ＲＳＦ間の三体相互作用を考慮したこの方法は、距離を延ばし、他の２つのＲＳＦに最も近いＲＳＦを逐次的に排除することによってペアを分類することから始まる。具体的には、ＮのＲＳＦのセットｓ（Ｎ）の中の最も短い距離に関連するペアが（ｉ；ｊ）で示される。ｊとは異なるｉに最も近いＲＳＦはｋで示され、ｉとは異なるｊに最も近いＲＳＦがｌで示される。距離ｄｉｋがｄｊｌより短い場合、ＲＳＦ ｉは２つのＲＳＦに最も近いＲＳＦである。順序リストの中でこのＲＳＦ ｉに割り当てられるランクは、セットｓ（Ｎ）のＲＳＦの数Ｎと等しい。すると、ＲＳＦ ｉはセットｓ（Ｎ）から除外され、その結果、Ｎ－１のＲＳＦのセットｓ（Ｎ＝１）となる。セットｓ（２）が特定されるまで繰り返される。ランク１及び２は、残りのペアｓ（２）の２つのＲＳＦに割り当てられる。
【0045】
２つのＲＳＦの識別は、それらの距離が、緩和時間の対数ｌｋｉ上の不確実性Δｌｋｉにより誘導される距離ｄｊｉに実験的精度Δｄｊｉにより与えられるカットオフ距離ｄｃより大きければ可能である：
【数9】
【0046】
統計分析は、カットオフ距離の最適な選択が
であることを示しており、
式中、
Ｍ＝ｍａｘｋ，ｊ（Δｌｋｉ） （６Ｃ）
であり、ｎは識別次元の数である。
【数10】
式中、
Ｍ＝ｍａｘｋ，ｊ（Δｌｋｉ） （６Ｃ）
であり、ｎは識別次元の数である。
【0047】
図２Ａは、対数ｌｉによりパラメータ化された４次元識別空間内の、分光的に類似する７つのＲＳＦＰの位置を表す。４次元空間の領域は紙面上に直接書くことができないため、ｌ２でパラメータ化される第二の次元はグレーのシェードで表されている。
【0048】
ＲＳＦＰは、参照番号１～７で指定される：
１：ドロンパ
２：ドロンパ－２
３：ドロンパ－３
４：コヒノール
５：パドロン
６：ｒｓＥＧＦＰ２
７：ｒｓＦａｓｔＬｉｍｅ
１：ドロンパ
２：ドロンパ－２
３：ドロンパ－３
４：コヒノール
５：パドロン
６：ｒｓＥＧＦＰ２
７：ｒｓＦａｓｔＬｉｍｅ
【0049】
２種類の照明が、何れも２つの異なる強度で使用された：
・タイプＩ：λ１＝４８８ｎｍで照明：
・Ｉｌｏｗ：光化学的ステップにより支配される動力学のために十分に低い強度（例えば、２ｍｏｌ・ｓ－１・ｍ－２の光子束に対応する）
・Ｉｈｉｇｈ：熱的ステップにより支配される動力学のために十分に高い強度（例えば、２００ｍｏｌ・ｓ－１・ｍ－２の光子束に対応する）
・タイプＩＩ：λ１＝４８８ｎｍとλ２＝４０５ｎｍの２色照明（λ２での照明は光化学反応を誘導するために使用され、λ１での照明は蛍光発光を励起することによる反応ダイナミクスを調べるためにのみ使用される）
・ＩＩｌｏｗ：光化学的ステップにより支配される動力学のために十分に低いλ２での強度（例えば、０．１ｍｏｌ・ｓ－１・ｍ－２の光子束に対応する）と２ｍｏｌ・ｓ－１・ｍ－２の光子束に対応するλ１での強度
・ＩＩｈｉｇｈ：熱的ステップにより支配される動力学のために十分に高いλ２での強度（例えば、９０ｍｏｌ・ｓ－１・ｍ－２の光子束に対応する）と、２００ｍｏｌ・ｓ－１・ｍ－２の光子束に対応するλ２での強度
・タイプＩ：λ１＝４８８ｎｍで照明：
・Ｉｌｏｗ：光化学的ステップにより支配される動力学のために十分に低い強度（例えば、２ｍｏｌ・ｓ－１・ｍ－２の光子束に対応する）
・Ｉｈｉｇｈ：熱的ステップにより支配される動力学のために十分に高い強度（例えば、２００ｍｏｌ・ｓ－１・ｍ－２の光子束に対応する）
・タイプＩＩ：λ１＝４８８ｎｍとλ２＝４０５ｎｍの２色照明（λ２での照明は光化学反応を誘導するために使用され、λ１での照明は蛍光発光を励起することによる反応ダイナミクスを調べるためにのみ使用される）
・ＩＩｌｏｗ：光化学的ステップにより支配される動力学のために十分に低いλ２での強度（例えば、０．１ｍｏｌ・ｓ－１・ｍ－２の光子束に対応する）と２ｍｏｌ・ｓ－１・ｍ－２の光子束に対応するλ１での強度
・ＩＩｈｉｇｈ：熱的ステップにより支配される動力学のために十分に高いλ２での強度（例えば、９０ｍｏｌ・ｓ－１・ｍ－２の光子束に対応する）と、２００ｍｏｌ・ｓ－１・ｍ－２の光子束に対応するλ２での強度
【0050】
蛍光は５２５ｎｍで測定される。
【0051】
パラメータｌ１は、Ｉｌｏｗ照明に対応する緩和時間の対数であり、ｌ２はＩｈｉｇｈ照明に対応する緩和時間の対数であり、ｌ３はＩＩｌｏｗ照明に対応する緩和時間の対数であり、ｌ４はＩＩｈｉｇｈ照明に対応する緩和時間の対数である。
【0052】
図２Ａでは、７つのＲＳＦＰを表す（超）球が十分に離れていることがわかり、これは、ＲＳＦＰを識別できることを意味する（ＲＳＦＰ ４及び５の超球は部分的に重なっているように見えるが、これは３次元サブ空間への投射によるアーチファクトであり、グレーのシェードの違いが、実際にこれらがｌ２によりパラメータ化される次元に沿って十分に離れていることを示している）。
【0053】
図２Ｂは、検討対象のＲＳＦＰの数に応じたＲＳＦＰのペア間の最小距離ｄｍｉｎのプロットである。７つ全てのＲＳＦＰを考慮した場合でも、最小距離は閾値レベルｄｃを超え（式６Ａ～６Ｃ参照）、確実に超球は交差せず、したがって、ＲＳＦＰを明確に同定できる。これにより、図２Ａにおいてすでに見える結果が確認される。
【0054】
分光的に類似する７つのＲＳＦＰを区別できるため、減算にもデコンボリューションにも頼らないことはすでに、先行技術からの大きな進歩である。しかしながら、本発明の方法には、はるかにより大きな識別力がある。本発明者らが得た最近の結果では、分光的に類似する少なくとも２０のＲＳＦＰを識別できることが明らかとなった。
【0055】
後で図６～８Ｂに関して詳しく述べるように、本発明の方法はＲＳＦに限定されず、蛍光タンパク質（ＦＰ）等のより単純な蛍光化学種にも、このような蛍光体のより単純なダイナミクスでは識別次元は幾分少なくなるものの、適用される。例えば、本発明者らは、分光的に類似する１０のＦＰを識別できた。
【0056】
以上、本発明の論理上の原理を、図１Ａ及び１Ｃに示された非常に単純な光サイクルを有する仮定上のＲＳＦに関して説明した。図３Ａ及び３Ｂは、より複雑な光サイクルを示しており、前述のＲＳＦＰ １～７等の実際のＲＳＦの挙動をモデル化したものである。この光サイクルの説明により、本発明の方法の２つのそれぞれの実施形態で使用される２つのセットの照明シーケンスを導入できる。
【0057】
図３Ａの仮定上のＲＳＦは、Ａ、Ａ’、Ｂ、及びＢ’により指定される４種類の構成をとることができ、その各々が基底状態又は励起状態Ａ＊、Ａ’＊、Ｂ＊、Ｂ’＊の何れかで存在する。状態Ａ＊及びＡ’＊は蛍光であり、単純にするために、これらは同じ輝度と同じ吸収及び蛍光スペクトルを有すると考える。状態Ｂ＊及びＢ’＊は蛍光性がないか、Ａ＊及びＡ’＊よりはるかに低い輝度を有する。
【0058】
波長λ１での光子の吸収により、状態ＡからＡ＊に、及び状態Ａ’からＡ’＊に、波長λ１での光強度Ｉ１に比例する速度定数ｋＡ（Ｉ１）で励起される。放射崩壊は非常に速く、光強度に依存しない速度定数ｋ－１で発生する。さらに、状態Ａ’には、熱（すなわち、光強度に依存しない）速度定数ｋＡ’で状態Ａ’への非放射崩壊が生じる可能性あり、Ａ’には比較的小さい熱速度ｋＡ’で状態Ｂへの非放射崩壊が生じる可能性がある。光化学ステップ（Ａ→Ａ＊）及び２つの熱的ステップ（Ａ＊→Ａ’＊はかなり速く、Ａ’→Ｂは遅い）を通じた状態ＡからＢへの分子の変換の結果、蛍光強度が漸減する。
【0059】
波長λ２での光子の吸収により、状態ＢからＢ＊に、及び状態Ｂ’からＢ’＊に、波長λ２での強度Ｉ２に比例する速度定数ｋＢ（Ｉ２）で励起される。非放射崩壊は非常に速く、光強度に依存しない定数ｋ－２で発生する。さらに、状態Ｂ’には、熱（すなわち、光強度に依存しない）速度ｋＢ’で状態Ｂ’へのより低速な非放射崩壊が生じる可能性あり、Ｂ’には状態Ａへの非放射崩壊が生じる可能性がある。光化学ステップ（Ｂ→Ａ＊）及び２つの熱的ステップ（Ｂ＊→Ｂ’＊、Ｂ’→Ａ）を通じた状態ＢからＡへの分子の変換の結果、蛍光強度が徐々に回復する。
【0060】
現実的な光強度の場合、状態Ａ＊は破壊速度定数（ｋ－１＋ｋＡ’）よりはるかに低い速度定数（ｋＡ）で作られ、したがって準安定状態が素早く達成される。同じことが、状態Ａ’＊、Ｂ＊、及びＢ’＊に当てはまる。これによって、状態Ａ、Ａ’、Ｂ、及びＢ’のみを含む図３Ｂの簡略化された光サイクルが得られ、これはｎｓ＝４、ｎλ＝２のネットワークである。蛍光発光は、ＡとＡ’の濃度の合計（これらの状態の輝度が異なる場合は加重和）に比例する。
【0061】
明るい状態Ａは暗い状態Ｂへと第一の反応Ｒ１を通じて変換され、これは、ｋＡ、ｋ－１、及びｋＡ＊の関数であり、ｋＡを通じてＩ１に依存する速度定数ｋ１での光化学的ステップＰＡＳ１ Ａ→Ａ’と、強度に依存しない速度定数ｋＡ’での熱的ステップＴＡＳ１ Ａ’→Ｂを含む（単純化するための、ＡとＡ’が同じ輝度であるとの仮定の下では、第一のステップだけでは蛍光信号に影響を与えない点に留意されたい）。暗い状態Ｂは明るい状態Ａに第二の反応２を通じて再び変換され、これは、ｋＢ、ｋ－２、及びｋＢ＊の関数であり、ｋＢ通じてＩ２に依存する速度定数ｋ２での光化学的ステップＰＡＳ２ Ｂ→Ｂ’と、強度に依存しない速度定数ｋＢ’での熱的ステップＴＡＳ２ Ｂ’→Ａを含む（ＢとＢ’はどちらも暗いため、第一のステップだけでは蛍光信号に影響を与えない点に留意されたい）。
【0062】
ＲＳＦを波長λ１で照明することにより（照明タイプＩ）、時間伴う蛍光信号の減少が誘導される。「低い」Ｉ１の値（すなわち、λ１での光強度）では、蛍光信号の破壊速度は基本的に光化学的ステップＰＡＳ１により決まり、他方で、「高い」Ｉ１の値では、これは基本的に熱的ステップＴＡＳ１により決まる。したがって、波長λ１の異なる光強度（Ｉｌｏｗ及びＩｈｉｇｈの条件）での測定により、ＲＳＦダイナミクスに関する非冗長的な情報が提供される。
【0063】
蛍光信号が消失するか、又は少なくとも平坦域に到達すると、波長λ２及びλ１の両方でＲＳＦを照明することにより（照明タイプＩＩ）、蛍光信号の回復が誘導される。回復はλ２での光子により誘導される光化学反応によるが、λ１での光子は、ＡとＡ’を励起させ、消滅しない蛍光発光を生じさせるために必要であることに留意されたい。「低い」Ｉ２の値（すなわち、λ２での光強度）では、蛍光信号の回復速度は基本的に光化学的ステップＰＡＳ２により決まり、他方で、「高い」Ｉ２の値では、これは基本的に熱的ステップＴＡＳ２により決まる。したがって、波長λ２の異なる光強度（Ｉｌｏｗ及びＩｈｉｇｈの条件）での測定により、ＲＳＦダイナミクスに関する追加の非冗長的な情報が提供される。全体として、ＲＳＦは、異なる照明条件で行われる４つの測定から得られた４つの緩和時間により識別でき、それによって前述のように４次元空間内の識別が可能となる。
【0064】
これら４つの緩和時間を測定するための第一の、かなり単純な実験的プロトコルについて、ここで図４Ａ～４Ｄを利用して説明する。このプロトコルは、例えばＲＳＦを含むサンプルを照明し、その蛍光を画像化するための広視野顕微鏡を使って実装されるようになされる。
【0065】
当初、全てのＲＳＦ分子がその状態Ａにある。当初時間ウィンドウＴＷ１では、照明Ｉｌｏｗが一定に保持されて、発せられた蛍光光子が後続の幅ｔｃの時間ウィンドウにわたりカメラを使って収集され、サンプルの広視野画像が形成される。すると、ｔｃ中に作成された画像は、図中では無視されている時間ｔｄ＜＜ｔｃで伝送される。カメラの各ピクセルの蛍光信号（ｔｃの平均）の時系列により、低い光強度の状態でのサンプル中のピクセルに対応する領域（このような領域は同じ種のＲＳＦだけを含むと仮定する）内に存在するＲＳＦの光活性化ステップの動力学を遡ることができる。データ処理（これについては後述する）によって、第一の時間ウィンドウ中の動力学を特徴付ける１つの緩和時間を抽出できる。
【0066】
すると、同様の測定と分析が、照明ＩＩｌｏｗでの後続の時間ウィンドウＴＷ２で（その間に蛍光信号が回復する）、その後、照明Ｉｈｉｇｈでのまた別の時間ウィンドウＴＷ３で（光化学的ステップＰＡＳ１がもはやＡ→Ｂへの変換を低速化させる「ボトルネック」とはならなくなるため、緩和時間は強度がより低い場合より短くなることに留意されたい）、そして照明ＩＩｈｉｇｈでの最後の時間ウィンドウＴＷ４で（光化学的ステップＰＡＳ２がもはやＢ→Ａへの変換を低速化させる「ボトルネック」とはならなくなるため、回復がより速い）行われる。
【0067】
ＴＷ－１－ＴＷ２－ＴＷ３－ＴＷ４のシーケンスは、必要に応じて複数回繰り返されてよい。
【0068】
ここで、これら４つの緩和時間を測定するための第二の実験的なプロトコルを、図５Ａ～５Ｄを利用して説明する。この第二のプロトコルは、走査型顕微鏡を使って実装できる。
【0069】
走査型顕微鏡が使用される場合、サンプルの各点が一連の光パルスにより照明され、これは典型的に、広視野顕微鏡で使用される取得時間よりはるかに短いが、はるかに高い瞬間的強度を有する。したがって、サンプルのある点を照明する光の瞬間的強度は、ゼロか、又は非常に高く、光化学的ステップが反応動力学にとっての制約要因とならない。したがって、「低強度」状態を直接利用できない。しかしながら、各パルスのフルエンス（すなわち、パルスが矩形波であることを前提とした、その強度と持続時間の積）を確実に十分に低くすることにより、「シミュレート」できる。
【0070】
図５Ａに示されるように、当初時間ウィンドウＴＷ１で、波長λ１、持続時間ｔｃの一連の光パルスＬＰ１１、ＬＰ１２、ＬＰ１３、ＬＰ１４、ＬＰ１５．．．が時間間隔ｔｄで分離されてサンプルの各小領域に向けられる（典型的に、これはレーザビームをサンプル上で移動させることによって得られる）。サンプルのその領域に含まれるＲＳＦは当初、その状態Ａにある。強度Ｉ１、持続時間ｔｃ（したがって、フルエンスＩ１ｔｃ）の第一のパルスＬＰ１１を印加した後、ＲＳＦ分子の一部
がＡ’の状態に変換されている。フルエンスＩ１ｔｃは、
、すなわちＲＳＦ分子のかなりの部分がＡの状態のままとなるように選択される。時間間隔ｔｄは、状態Ａ’の全ての分子が確実に熱によりＢに変換される（これは、図５Ａで暗いグレーの破線で示される）のに十分に長い。したがって、時間ｔｃ＋ｔｄで、分子の一部
はＡの状態のままであり、蛍光であり得、残りの電子は不活性される。第二のパルスが印加されると、検出された蛍光信号はしたがって、最初のパルス中に収集された信号と比較して
の係数で減少する。さらに、第二のパルスはさらに、Ａのままであった分子の一部
をＡ’に移行させ、これらの分子はその後、第二の間隔ｔｄ中に状態Ｂに熱により変換され、等々である。それに続くパルス中に取得した蛍光信号の減少を測定することにより（図５Ａの、目のためのガイドとなる明るいグレーの破線を参照のこと）、図４Ａの広視野低強度測定のように、ｋ１の値を特定できる。
【数11】
【数12】
【数13】
【数14】
【数15】
【0071】
時間ウィンドウＴＷ１の終了時に適用される後続の時間ウィンドウＴＷ２で、波長λ２、持続時間ｔｃの別の一連の光パルスＬＰ２１、ＬＰ２２、ＬＰ２３、ＬＰ２４、ＬＰ２５．．．が時間間隔ｔｄで分離されてサンプルの各小領域に向けられる（典型的に、これはレーザビームをサンプル上で移動させることによって得られる）。この時間ウィンドウ中に、λ１の照明も、光化学反応を誘導するためではなく、単に蛍光発光を誘導することによってそれを調べるために使用される。サンプルのその領域に含まれるＲＳＦは当初、その状態Ｂにある。強度Ｉ２、持続時間ｔｃ（したがって、フルエンスＩ２ｔｃ）の第一のパルスＬＰ２１を印加した後、ＲＳＦ分子の一部
がＢ’の状態に変換されている。フルエンスＩ２ｔｃは、
、すなわちＲＳＦ分子のかなりの部分がＢの状態のままとなるように選択される。時間間隔ｔｄは、状態Ｂ’の全ての分子が確実に熱によりＡに変換され（これは、図５Ｂで暗いグレーの破線で示される）、蛍光となるのに十分に長い。したがって、時間ｔｃ＋ｔｄで、分子の一部
はＢの状態のままである。第二のパルスが印加されると、検出された蛍光信号はしたがって、最初のパルス中に収集された信号と比較して
の係数で増加する。さらに、第二のパルスはさらに、Ｂのままであった分子の一部
をＢ’に移行させ、これらの分子はその後、第二の間隔ｔｄ中に状態Ａに熱により変換され、等々である。それに続くパルス中に取得した蛍光信号の増大を測定することにより（図５Ｂの、目のためのガイドとなる明るいグレーの破線を参照のこと）、図４Ｂの広視野低強度測定のように、ｋ２の値を特定できる。
【数16】
【数17】
【数18】
【数19】
【数20】
【0072】
図５Ｃに示されるように、後続の時間ウィンドウＴＷ３で、波長λ１、持続時間ｔｃのまた別の一連の光パルスＬＰ３１、ＬＰ３２、ＬＰ３３、ＬＰ３４、ＬＰ３５．．．が時間間隔ｔｄで分離されてサンプルの各小領域に向けられる。再び、サンプルのこの領域に含まれるＲＳＦは当初、その状態Ａにある。しかしながら、このとき、第一のパルスＬＰ３１のフルエンスは十分に高く、ＲＳＦ分子はＡ’状態に変換される。Ａ’状態から、分子は速度定数ｋＡ’で暗い状態Ｂに変換される。それに続くパルスＬＰ３２、ＬＰ３３、ＬＰ３４、ＬＰ３５．．．は蛍光信号の変化をサンプリングするためだけに使用され、これはＡ’状態の濃度に比例し、
として減衰する。これによって、図４Ｃの広視野高強度測定のようにｋＡ’を特定できる。間隔ｔｄは、この変化をサンプリングできるのに十分に短いべきであり、典型的にこれらは第一のウィンドウにおけるよりはるかに短くなることに留意されたい。
【数21】
【0073】
図５Ｄに示されるように、第三の時間ウィンドウＴＷ３の終了時に適用される最終時間ウィンドウＴＷ４で、波長λ２、持続時間ｔｃのまた別の一連の光パルスＬＰ４１、ＬＰ４２、ＬＰ４３、ＬＰ４４、ＬＰ４５．．．が時間間隔ｔｄで分離されてサンプルの各小領域に向けられる。この時間ウィンドウ中に、λ１の照明も、光化学反応を誘導するためではなく、単に蛍光発光を誘導することによってそれを調べるために使用される。サンプルのその領域に含まれるＲＳＦは当初、その状態Ｂにある。しかしながら、この場合、第一のパルスＬＰ４１のフルエンスは、ＲＳＦ分子をＢ’状態に変換するのに十分に高い。Ｂ’状態から、分子は速度定数ｋＢ’で明るい状態Ａに変換される。それに続くパルスＬＰ４２、ＬＰ４３、ＬＰ４４、ＬＰ４５．．．は蛍光信号の変化をサンプリングするためだけに使用され、これはＡ状態の濃度に比例し、
として増大する。これによって、図４Ｄの広視野高強度測定のようにｋＢ’を特定できる。間隔ｔｄは、この変化をサンプリングできるのに十分に短いべきであり、典型的にこれらは第一のウィンドウにおけるよりはるかに短くなることに留意されたい。
【数22】
【0074】
ＴＷ－１－ＴＷ２－ＴＷ３－ＴＷ４のシーケンスは、必要に応じて複数回繰り返されてよい。
【0075】
蛍光タンパク質（ＦＰ）は長い間、光スイッチ型ではないと考えられていた。しかしながら、そのうちの幾つかは最近、暗い、より低い三重項状態を形成し、可視－近ＩＲ範囲にわたる広い吸収率を示すことが実証された（［Ｂｙｒｄｉｎ ２０１８］参照）。図６は、このような分子のエネルギ準位と遷移を示す。波長λ１での光子の吸収は、基底状態ＡをＡ＊に、光強度Ｉ１に比例する速度定数ｋＡ（Ｉ１）で励起させる。放射破壊は、光強度に依存しない速度定数ｋ－１できわめて早く起こる。さらに、状態Ａ＊にはまた、はるかに遅い熱（すなわち、光強度に依存しない）速度定数ｋＡ＊で暗い三重項状態Τへの非放射破壊が生じる。すると、三重項状態Τは熱速度定数ｋΤで基底状態Ａに戻る。
【0076】
【0077】
図７Ａに示されるように、当初時間ウィンドウＴＷ１’で、ＦＰは波長λ１と十分に高い強度（Ｉｈｉｇｈ条件）で照明される。照明によって、蛍光発光だけでなく、光化学的ステップＡ→Ａ＊及び熱的ステップＡ＊→Τを通じたＡ及びＡ＊状態のデポピュレーション及び暗いΤ状態のポピュレーションが誘導される。したがって、蛍光強度が低下する。低下がサンプリングされ、限定的（最も遅い）ステップの速度を特定するために使用される。ＦＰの場合、かなり高い強度でも限定的ステップは光化学的ステップであり、したがってＴＷ１’中に行われる測定により、ｋＡ、ｋ－１、及びｋＡ＊の関数であり、ｋＡを通じてＩ１に依存するｋ１を特定できる。
【0078】
その後の時間ウィンドウＴＷ２’で、光強度レベルははるかに低いレベルに保持され（照明条件ＩＩＩ）、これは非常に低く、その光化学的効果は無視できる。第二の時間ウィンドウ中に、レベルＡは熱反応ステップΤ→Ａによりポピュレートされる。Ａの濃度の上昇は、残留照明により刺激された蛍光発光を測定することによって追跡できる。これは、図７Ｂに示されている。
【0079】
ＴＷ１’－ＴＷ２’のシーケンスは、必要に応じて複数回繰り返されてよい。
【0080】
興味深いことに、図４Ａ～４Ｄに関して説明したＲＳＦの場合と異なり、ＦＰに適用可能なこのプロトコルによると、光化学的速度定数は高い光強度で測定され、熱的なそれは（非常に）低い強度で測定される。
【0081】
図８Ａ及び８Ｂは、走査型顕微鏡を用いて実装するのに適したＦＰのための別のプロトコルを示している。照明条件Ｉｈｉｇｈが、同じ持続時間ｐ×ｔｃ（ｐは典型的に５）の複数の時間ウィンドウＴＷ１ａ、ＴＷ１ｂ、ＴＷ１ｃ、ＴＷ１ｄ．．．にわたって適用され、これらは増大する持続時間ｔｄ．１＜ｔｄ．２＜ｔｄ．３＜ｔｄ．４＜ｔｄ．５の時間ウィンドウで分離され、その間は照明が適用されない。時間ウィンドウＴＷ１ａ、ＴＷ１ｂ、ＴＷ１ｃ、ＴＷ１ｄの持続時間と強度の積は十分に高く、ＦＰのＡ状態は持続時間ｐ×ｔｃにわたってほぼ完全にデポピュレートされる。第一の（又は複数の第一の）時間ウィンドウ中に蛍光信号の減少をサンプリングすることにより、前述のようにｋＡを特定できる。無照明の時間ウィンドウＴＷ２ａ、ＴＷ２ｂ、ＴＷ２ｃ、ＴＷ２ｄ．．．により、状態Ａの部分的なリポピュレーションが可能となる。持続時間ｔｄ．１のウィンドウＴＷ２ｊの終了時に、Ａの濃度は
に比例する。この濃度により、次の照明されるウィンドウＴＷ１ｊ＋１の開始時の蛍光強度が決まる。時間間隔ｔｄ．ｊはより長い（又は、より一般的には、変化する）持続時間を有するため、照明されるウィンドウの開始時の蛍光強度の測定により、ｋΤの特定が可能となる。これは図８Ｂに示されている。
【数23】
【0082】
何れの測定プロトコルであっても、ＲＳＦの同定に使用される緩和時間を抽出するために蛍光信号の時間変化の測定値を処理するための幾つかの方法がある。処理は、変化の幾つかが純粋な単一指数によるものではなく、２つ又はそれより多い指数の一次結合により表現されることから、複雑である。したがって、各ＲＳＦ及び各照明条件について１つの特徴的時間を抽出するための適当な処理方法が必要である。有利な態様として、本発明の方法の識別力が最大になるようにするために、抽出される特徴的時間はできるだけ分散しているべきである。
【0083】
第一の実現例では、蛍光信号の持続時間全体か、指数関数形減衰又は増大からの偏差が強すぎる場合は信号の単調部分に単一指数フィッティングが適用され、これはキネティックフィルタとして作用する時間ウィンドウに限定される。各照明条件に関する時間ウィンドウと蛍光信号のサンプリング点の数は、有利な態様として、τｍａｘ／τｍｉｎが最大になるように選択され、τｍａｘ（又はτｍｉｎ）は、識別対象のＲＳＦのそれぞれの中で抽出された最長（又は最短）緩和時間である。信号対ノイズ比を改善するために、単一指数フィッティングに進む前に、連続する実験的な点にわたる移動平均を計算することが有利であり得る。
【0084】
第二の実現例では、「スペクトル」Ｓ（ｌ）が生成される。これは、
として定義され、式中、ｌは緩和時間の常用対数であり、ＩＦ（ｔ）は蛍光信号であり、〈〉は０～β１０ｌの時間平均を表し、ｆｌ（ｔ）は選択される関数であり、βは選択されるパラメータである。より正確には、βは、単一指数ＩＦ（ｔ）のスペクトルＳ（ｌ）がこの単一指数の緩和時間の常用対数に対応する単独の極値を有するような方法で選択される。
【数24】
【0085】
緩和時間のスペクトルは、関数ｆｌ（ｔ）の様々な選択肢について計算できる。蛍光変化ＩＦ（ｔ）は一般に指数関数の一次結合であり、ｆｌ（ｔ）＝ｅｘｐ（－ｔ／１０ｌ）が直感的に選択される。指数との相関関係は広いピークを有するスペクトルを生成することが知られており、これはすなわち、時間分解能は幾分低いが、蛍光信号の信号対ノイズ比の影響をほとんど受けない。ＩＦ（ｔ）がｎｓ－１の指数関数の一次結合である、より一般的なケースでは、スペクトルは最大ｎｓ－１の極値を有する。
【0086】
ＲＳＦの同定に使用される緩和時間は、スペクトルの単独の極値に、又はスペクトルの最大絶対値に関連する極値に対応するものである。
【0087】
その他の考え得る方法は、［Ｉｓｔｒａｔｏｖ １９９９］に記載されている。
【0088】
本発明の方法の興味深い特徴は、空間的に不均一な照明の使用（例えば、ガウシアンレーザビームを使用する）によってＲＳＦの位置を特定できることである。実際に、速度限定ステップが光化学的ステップである場合、ＲＳＦの動力学的識別特性は光強度に依存する。光強度が不均一であると、式（５）で定義される距離の空間依存性が焦点面におけるＲＳＦの局在検出に使用でき、蛍光光スイッチの動力学の空間的ばらつきは、焦点面に近いＲＳＦの検出を制限するために使用できる。したがって、その非常に高い識別力に加えて、本発明の方法は蛍光顕微鏡法の空間分解能を高めることができる。
【0089】
同じレイリ長ｚＲ＝２６．６μｍの２つの同軸ガウシアンビームを用いて、タイプＩ及びタイプＩＩによるλ１及びλ２で照明された均質なＲＳＦ溶液を考える。
【0090】
動力学は、緩和時間τＩ（タイプＩの照明）とτＩＩ（タイプＩＩの照明）で指数法則に従って変化する濃度を有する２状態モデルにより説明される光化学的ステップにより限定されると仮定される。これらの緩和時間は光の強度、したがって、特に軸座標ｚ上の位置に依存する。
【0091】
厚さ“ｅ”の溶液のスライスについて積分された蛍光信号は
で表され、式中、Ｑはλ１での輝度（λ２での輝度は無視できると考えられる）であり、ｉ＝Ｉ，ＩＩ、及びＣｉはタイプＩの照明での軸上の位置ｚと時間ｔの関数で表される明るい状態の濃度である。
【数25】
【0092】
図９Ａは、タイプＩの照明下で、
（破線）と
（点線）
が両方とも、厚さｅとともに増大するが、これらの差
（実線）はｅ≒ＺＲで飽和することを示している。これは、焦点面の片側の１未満のレイリ長にある分子だけが差分信号に寄与するとを意味している。
【数26】
【数27】
が両方とも、厚さｅとともに増大するが、これらの差
【数28】
【0093】
【0094】
図１０は、本発明を実行するための装置のごく簡略化した図を示す。装置は、制御された２つの光源ＬＳ１、ＬＳ２（例えば、半導体レーザ）を含み、これらはそれぞれ、所定の波長で可変強度Ｉ１、Ｉ２の光ビームＬＢ１、ＬＢ２を発出する。光学システムＯＳは光ビームＬＢ１、ＬＢ２をサンプルＳ上へと向かわせ、光検出器ＬＤ（例えば、光電子増倍管又はカメラ等の画像検出装置）上へと向けられるサンプルの蛍光発光を収集する。光学システムＯＳは、広視野顕微鏡、走査型顕微鏡、コリメート又は結像レンズの単純なセット等であるか、又はこれを含み得る。幾つかのケースで、これはなくてもよく、光ビームＬＢ１、ＬＢ２はサンプルに直接衝突し、光検出器ＬＤが単純にサンプル付近に配置される。
【0095】
データ処理装置ＤＰＤは、典型的にはコンピュータ又は、ネットワーク上で相互接続されているか接続されていない複数のコンピュータからなる系であるが、それが光源を制御して、複数の照明条件を作り、前述のように光検出器により生成された蛍光信号を処理する。
【0096】
１つの光源でも（例えば、ＦＰが使用される場合）、若しくは、反対にそれぞれの波長の３つ以上の光源でも、又はさらには１つの多色若しくは調整可能光源でも使用され得ると理解すべきである。
【0097】
図１１Ａは、図１０による画像形成装置を用いて得られた、ドロンパで標識した大腸菌の蛍光画像を示す。図１１Ｂは、λ１＝４８８ｎｍで強度Ｉ１＝２ ｅｉｎ．ｍ－２．ｓ－１の連続照明及びλ２＝４０５ｎｍで強度Ｉ２＝０．２ ｅｉｎ．ｍ－２．ｓ－１の方形波照明でのこれらの細菌の蛍光強度の時間変化のプロットであり、蛍光減衰に一次指数フィッティングを適用して、「低強度」減衰時間定数τ１
ｌｏｗを抽出した。同様の取得が、λ１＝４８８ｎｍで強度Ｉ１＝５０ ｅｉｎ．ｍ－２．ｓ－１の連続照明及びλ２＝４０５ｎｍで強度Ｉ２＝２０ｅｉｎ．ｍ－２．ｓ－１の方形波照明で実行され、一次指数フィッティングによって「高強度」減衰時間定数τ１
ｌｏｗを得た。図１１Ｃは、ドロンパで標識した大腸菌の２Ｄ空間での表現である（Ｉ１＝ｌｏｇ１０τ１
ｌｏｗ、Ｉ３＝ｌｏｇ１０τ１
ｈｉｇｈ）。
【0098】
本発明は、限定的な数の実施形態に関して説明したが、そのほかも可能である。
【0099】
例えば、ＲＳＦはタンパク質でなく、他の何れの光化学的活性化学種でもあり得る。
【0100】
識別対象のＲＳＦの光サイクルの特徴に応じて、異なる波長、照明条件、及び照明シーケンスが使用され得る。
【0101】
求められる性能によっては、利用可能な識別次元の全部を使用しなければならないわけではない。例えば、図３Ａ／３ＢのＲＳＦＰの場合、識別のために４つではなく２つの緩和時間だけを測定し、使用することができる。２つの測定は、例えば図４Ａ及び４Ｃの時間ウィンドウＴＷ１及びＴＷ３のそれらに対応し得る。しかしながら、各測定の前にＲＳＦＰが予想される初期状態（この例では状態Ａ）にあることを確認することが重要である。必要に応じて、これはλ２での照明を通じて実現できる。代替的に、時間ウィンドウＴＷ１、次にＴＷ４の測定を使用することができ、これはウィンドウＴＷ１の最終状態はウィンドウＴＷ４の必要な初期状態に対応することによる。４つの時間ウィンドウＴＷ１、ＴＷ２、ＴＷ３、及びＴＷ４が使用される場合、各測定の前にＲＳＦＰが予想される初期状態であることが確認されるかぎり、これらはその順序でなくてもよい。代替的な順序は例えば、ＴＷ３－ＴＷ２－ＴＷ１－ＴＷ４である。
【0102】
逆に、ＲＳＦの光化学的ダイナミクスが十分に複雑であれば、５つ以上の時間ウィンドウ、そしてそれぞれの照明条件が使用され得る。
【0103】
本発明を用いて検出される光化学的に活性な種は必ずしも蛍光性である必要はなく、その変化が測定される調査対象の光学特性は必ずしも蛍光発光でなくてもよい。例えば、それは吸光度やラマン散乱でもあり得る。
【0104】
図２Ａ及び２Ｂは、蛍光体を識別するための「幾何学的な」アプローチを示しているが、その他の方法、例えばニューラルネットワーク等の分類器も使用され得る。距離が使用される場合、それは必ずしも式５のように定義されなくてはならないわけではない。閾値距離が識別に使用される場合、それは必ずしも式６Ａ～６Ｃのように定義されなければならないわけではない。
【0105】
参考文献
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［Ｓｕｍｍｅｒｓ １９８８］Ｄ．Ｓｕｍｍｅｒｓ ａｎｄ Ｊ．Ｍ．Ｗ．Ｓｃｏｔｔ Ｓｙｓｔｅｍｓ ｏｆ ｆｉｒｓｔ－ｏｒｄｅｒ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，Ｍａｔｈｌ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ｍｏｄｅｌｌｉｎｇ，１０：９０１－９０９，１９８８．
［Ｉｓｔｒａｔｏｖ １９９９］Ａ．Ａ．Ｉｓｔｒａｔｏｖ ａｎｄ Ｏ．Ｆ．Ｖｙｖｅｎｋｏ．Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ ｐｈｙｓｉｃａｌ ｐｈｅｎｏｍｅｎａ．Ｒｅｖ．Ｓｃｉ．Ｉｎｓｔｒｕｍ．，７０：１２３３－１２５７，１９９９．
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［Ｂｙｒｄｉｎ ２０１８］Ｍａｒｔｉｎ Ｂｙｒｄｉｎ，Ｃｈｅｎｘｉ Ｄｕａｎ，Ｄｏｍｉｎｉｑｕｅ Ｂｏｕｒｇｅｏｉｓ，ａｎｄ Ｋｌａｕｓ Ｂｒｅｔｔｅｌ．Ａ ｌｏｎｇ－ｌｉｖｅｄ ｔｒｉｐｌｅｔ ｓｔａｔｅ ｉｓ ｔｈｅｅｎｔｒａｎｃｅ ｇａｔｅｗａｙ ｔｏ ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｉｎ ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ，１４０（８）：２８９７－２９０５，２０１８．
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【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図1D】
【図2A】
【図2B】
【図3A】
【図3B】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図4D】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図5D】
【図6】
【図7A】
【図7B】
【図8A】
【図8B】
【図9A】
【図9B】
【図10】
【図11A】
【図11B】
【図11C】