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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-04-18
(45)【発行日】2024-04-26
(54)【発明の名称】慢性炎症およびウイルス感染の診断と治療
(51)【国際特許分類】
A61K 45/00 20060101AFI20240419BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20240419BHJP
C12N 15/113 20100101ALI20240419BHJP
C07K 16/18 20060101ALI20240419BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240419BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20240419BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20240419BHJP
A61P 25/28 20060101ALI20240419BHJP
A61K 31/713 20060101ALI20240419BHJP
A61K 31/7105 20060101ALI20240419BHJP
G01N 33/53 20060101ALI20240419BHJP
G01N 33/68 20060101ALI20240419BHJP
【ＦＩ】
A61K45/00
C12N15/13 ZNA
C12N15/113 Z
C07K16/18
A61P43/00 111
A61K39/395 N
A61P25/00
A61P25/28
A61K31/713
A61K31/7105
G01N33/53 D
G01N33/68
【請求項の数】
11
(21)【出願番号】P 2021560209
(86)(22)【出願日】2020-03-31
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-07-12
(86)【国際出願番号】 CN2020082296
(87)【国際公開番号】W WO2020200186
(87)【国際公開日】2020-10-08
【審査請求日】2022-06-22
(31)【優先権主張番号】201910256220.3
(32)【優先日】2019-04-01
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(31)【優先権主張番号】202010122554.4
(32)【優先日】2020-02-27
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(73)【特許権者】
【識別番号】522391497
【氏名又は名称】広州恩邁生物科技有限公司
【氏名又は名称原語表記】Ｇｕａｎｚｈｏｕ Ｅｎｍａｉ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．， Ｌｔｄ
【住所又は居所原語表記】Ｒｏｏｍ ２０１ （ｓｉｔｅ ２０７）， Ｂｕｉｌｄｉｎｇ Ｂ， ２ Ｒｕｉｔａｉ Ｒｏａｄ， Ｈｕａｎｇｐｕ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ， Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ， Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ， ＣＨＩＮＡ
(74)【代理人】
【識別番号】100108453
【弁理士】
【氏名又は名称】村山 靖彦
(74)【代理人】
【識別番号】100110364
【弁理士】
【氏名又は名称】実広 信哉
(74)【代理人】
【識別番号】100133400
【弁理士】
【氏名又は名称】阿部 達彦
(72)【発明者】
【氏名】梁 ▲歡▼▲歡▼
(72)【発明者】
【氏名】▲劉▼ 迎芳
(72)【発明者】
【氏名】于 ▲楊▼
【審査官】長部 喜幸
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第９９／０２８４６０（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特表２０１７－５２８１２９（ＪＰ，Ａ）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ ４５／００
Ａ６１Ｋ ３９／００－３９／４４
Ｃ１２Ｎ １５／１３
Ｃ１２Ｎ １５／１１３
Ｃ０７Ｋ １６／１８
Ａ６１Ｋ ３１／７１３
Ａ６１Ｋ ３１／７１０５
Ｇ０１Ｎ ３３／５３
Ｇ０１Ｎ ３３／６８
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
多発性硬化症を治療または緩和するための組成物であって、ＩＦＰ３５および／またはＮＭＩに特異的に結合し、かつＩＦＰ３５および／またはＮＭＩを阻害する抗体またはその抗原結合フラグメントを含む、組成物。
【請求項2】
前記抗体は、軽鎖可変領域および重鎖可変領域を有し、ｉ）前記重鎖可変領域に含まれるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３、１４、１５であり、前記軽鎖可変領域に含まれるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６、１７、１８である、または
ｉｉ）前記抗体の前記重鎖可変領域におけるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９、１４、１５であり、前記軽鎖可変領域におけるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６、１７、１８である、または
ｉｉｉ）前記重鎖可変領域に含まれるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３、１４、１５であり、前記軽鎖可変領域に含まれるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６、１７、２０である、または
ｉｖ）前記重鎖可変領域に含まれるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３、１４、１５であり、前記軽鎖可変領域に含まれるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６、１７、２１である、または
ｖ）前記重鎖可変領域に含まれるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３、１４、１５であり、前記軽鎖可変領域に含まれるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６、１７、２２である、または
ｖｉ）前記重鎖可変領域に含まれるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３、１４、１５であり、前記軽鎖可変領域に含まれるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６、１７、２３であることを特徴とする、
請求項１に記載の組成物。
【請求項3】
前記抗体の重鎖可変領域の配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９であり、前記抗体の軽鎖可変領域の配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０であることを特徴とする、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項4】
ｉ）前記抗体の重鎖定常領域の配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５であり、前記抗体の軽鎖定常領域の配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４である、またはｉｉ）前記抗体の重鎖定常領域の配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１であり、前記抗体の軽鎖定常領域の配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３である、または
ｉｉｉ）前記抗体の重鎖定常領域の配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５であり、前記抗体の軽鎖定常領域の配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７である、または
ｉｖ）前記抗体の重鎖定常領域の配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１であり、前記抗体の軽鎖定常領域の配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２であることを特徴とする、
請求項１～３のいずれかに記載の組成物。
【請求項5】
多発性硬化症（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ：ＭＳ）は、分泌されたＩＦＰ３５／ＮＭＩ炎症因子の異常量によって作用が発揮されることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項6】
多発性硬化症を診断するためのキットであって、個体から得られた生体試料中のインターフェロン誘導タンパク質３５ｋＤ（ＩＦＰ３５）および／またはＮ－Ｍｙｃ相互作用タンパク質（ＮＭＩ）の量を測定するための試薬を含むことを特徴とする、キット。
【請求項7】
多発性硬化症を診断することが、前記個体から得られた生体試料中のインターフェロン誘導タンパク質３５ｋＤ（ＩＦＰ３５）および／またはＮ－Ｍｙｃ相互作用タンパク質（ＮＭＩ）の量を測定するステップを含む、請求項６に記載のキット。
【請求項8】
前記診断は、早期診断、病態診断および予後判定であることを特徴とする、請求項６または７に記載のキット。
【請求項9】
生体試料中のＩＦＰ３５および／またはＮＭＩの量を測定することは、生体試料中のＩＦＰ３５および／またはＮＭＩのタンパク質含有量を測定することであるか、または生体試料中のＩＦＰ３５および／またはＮＭＩの核酸の発現レベル、例えばｍＲＮＡ含有量を測定することであり、ならびに／あるいは前記生体試料は、血液、血漿、血清、脳脊髄液または肺胞洗浄液であることを特徴とする、
請求項７または８に記載のキット。
【請求項10】
ＩＦＰ３５および／またはＮＭＩに特異的に結合し、かつＩＦＰ３５および／またはＮＭＩを阻害する抗体またはその抗原結合フラグメントであって、前記抗体は、軽鎖可変領域および重鎖可変領域を有し、
ｉ）前記抗体の前記重鎖可変領域におけるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９、１４、１５であり、前記軽鎖可変領域におけるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６、１７、１８である、または
ｉｉ）前記重鎖可変領域に含まれるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３、１４、１５であり、前記軽鎖可変領域に含まれるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６、１７、２０である、または
ｉｉｉ）前記重鎖可変領域に含まれるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３、１４、１５であり、前記軽鎖可変領域に含まれるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６、１７、２１である、または
ｉｖ）前記重鎖可変領域に含まれるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３、１４、１５であり、前記軽鎖可変領域に含まれるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６、１７、２２である、または
ｖ）前記重鎖可変領域に含まれるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３、１４、１５であり、前記軽鎖可変領域に含まれるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６、１７、２３であることを特徴とする、
抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項11】
ｉ）前記抗体の重鎖定常領域の配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５であり、前記抗体の軽鎖定常領域の配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４である、またはｉｉ）前記抗体の重鎖定常領域の配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１であり、前記抗体の軽鎖定常領域の配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３である、または
ｉｉｉ）前記抗体の重鎖定常領域の配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５であり、前記抗体の軽鎖定常領域の配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７である、または
ｉｖ）前記抗体の重鎖定常領域の配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１であり、前記抗体の軽鎖定常領域の配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２であることを特徴とする、
請求項１０に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、２０１９年４月１日に出願された中国特許出願第２０１９１０２５６２２０．３号および２０２０年２月２７日に出願された中国特許出願第２０２０１０１２２５５４．４号の優先権を主張し、この二つの特許出願の内容は、参照により、本明細書に組み込まれる。
【0002】
本発明は、生物医学の分野に関し、具体的には、慢性炎症およびウイルスの診断と治療のための方法と製品に関する。
【背景技術】
【0003】
生体が微生物に感染された後または組織の損傷などを受けた場合、ＴＮＦ、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－１２、ＩＦＮ－γおよびＭＣＰ－１等の様々なサイトカインは、体液中に急速かつ大量に生成され、サイトカインストームおよび急性呼吸窮迫症候群、多臓器不全等の様々な深刻な臨床疾患を引き起こすことさえある。炎症因子（ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ：炎症性因子ともいう）は、様々な急性および慢性の炎症性疾患に密接に関連している。これまでに、これらの疾患の臨床的に有効な治療方法はない。
【0004】
生存ストレスがある細胞は、内因性サイトカインを放出し、免疫応答反応を開始し、損傷または感染された細胞を効果的に排除する役割を果たす。組織が感染または損傷される場合、損傷関連分子パターン（ＤＡＭＰｓ）と呼ばれる種類のサイトカインが放出され、かつ隣接する食細胞を活性化し、最終的には、正常な機能を失った細胞を排除する。ＤＡＭＰは、自然な免疫応答を開始し、かつ炎症反応を悪化させ、それによって感染および細胞損傷と戦うことができる。従って、ＤＡＭＰの鑑定およびその機能の開示は、非常に重要である。過去に、本発明の発明者は、ＤＡＭＰｓとして作用することができる二つのタンパク質、即ち、Ｎ－ｍｙｃおよびＳＴＡＴ相互作用タンパク質（ＮＭＩ）およびインターフェロン誘導タンパク質３５（ＩＦＰ３５）を発見した。研究によると、ＩＦＰ３５およびＮＭＩは、ＬＰＳまたはインターフェロンによって活性化されてから１時間内に、単球およびマクロファージによって細胞外に分泌されることができ、リポ多糖誘導性敗血症モデルまたはアセトアミノフェン誘導性肝障害モデルにおいて、活性化されたマクロファージは、放出される。細胞外ＮＭＩおよびＩＦＰ３５は、Ｔｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）を介してＮＦ－κＢを活性化することにより、マクロファージを活性化し、かつ炎症性サイトカインを放出する。さらに、重度の炎症で死亡した患者の血清において、ＮＭＩのレベルは、有意に上昇する。ＮＭＩの喪失は、炎症反応を軽減し、かつ敗血症モデルおよび肝障害モデルでマウスの死亡率を低下させることができる。ＩＦＰ３５に対する抗体は、炎症因子の発現レベルを低下させることにより、敗血症マウスの生存率を効果的に向上させることができる。
【0005】
多発性硬化症（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ：ＭＳ）を例として取り上げる。多発性硬化症は、慢性炎症性疾患の一つである。ＭＳは、患者に感覚、精神、運動、身体活動および認知機能障害を引き起こすことができ、若年および中年の人々の障害の主な原因の一つである。
【0006】
ＩＦＰ３５タンパク質ファミリーは、Ｎ－ｍｙｃとＳＴＡＴとの相互作用タンパク質（ＮＭＩ）およびインターフェロン誘導タンパク質３５（ＩＦＰ３５）の二つの相同タンパク質を含み、すべてインターフェロン誘導遺伝子（ＩＳＧｓ）であり、ヒトの体および免疫細胞がインターフェロンによって誘導された後、細胞内の発現量は、増加する。さらに、それらは、損傷関連分子パターン（ＤＡＭＰ）でもあり、感染または臓器損傷において、ＮＭＩおよびＩＦＰ３５は、活性化されたマクロファージによって放出され、ＴＬＲ４受容体信号伝達経路を介してＮＦ－κＢを活性化し、マクロファージからの炎症性サイトカインの放出を促進し、ＮＭＩおよびＩＦＰ３５のノックアウトは、細菌またはウイルス感染によって引き起こされた敗血症および肝障害モデルのマウスの死亡率を低下させることができる。ＬＰＳ、サルモネラ菌等の病菌、ウイルス等によって誘導されるマウス敗血症マウスモデル、および毒性物質（アセトアミノフェンＡＰＡＰ等）がインビボに侵入するマウス動物モデルにおいて、ＮＭＩおよびＩＦＰ３５は、細胞内から血清等の体液にすばやく放出される。ＩＦＰ３５保護性抗体の注射は、ＬＰＳ、サルモネラ菌、およびＡＰＡＰによって引き起こされる損傷からマウスを保護することができる。
【0007】
長い間、ウイルス感染性疾患は、中国および人間社会全体に大きな脅威をもたらしてきた。効果的な特異的抗ウイルス薬を開発することが難しい状況下で、ウイルス感染患者インビボの過剰な炎症反応を阻害することは、生体の炎症性損傷を減少させ、死亡率を減少させるために特に重要である。炎症因子のストームを引き起こす主要なサイトカインを見つけ、突然のウイルス性疾患に対処するための新型診断薬および治療薬を開発する十分な必要がある。
【0008】
ＳＡＲＳウイルス、インフルエンザウイルスおよび他の呼吸器ウイルスと同様に、ＣＯＶＩＤ－１９ウイルス感染の標的臓器は、肺であり、感染された患者に肺不全を引き起こし、かつ急性呼吸窮迫症候群を引き起こすことができる。ウイルスが宿主に感染された後、しばしば患者の体に強いまたは無秩序な炎症反応を引き起こす。無秩序な炎症および過度の炎症は、ＳＡＲＳ等のウイルスによる重要な死因と考えられ、これもＣＯＶＩＤ－１９ウイルス感染による重要な死因であると推測される。従って、ウイルス感染疾患は、一つは、直接的な抗ウイルス薬の治療であり、もう一つは、生体の免疫反応のバランスを取り、過剰な免疫を阻害する二つの側面から治療する必要がある。標的となる抗ウイルス薬がない場合、生体の炎症反応を調節することは、疾患の損傷程度を減少させ、死亡率を減少させるために特に重要であり、臨床上でも炎症反応を正確に調節する薬物を緊急に開発する必要性がある。
【0009】
炎症反応は、様々な免疫細胞および大量の炎症関連サイトカインの関与に伴い、正確に調節されたプロセスである。炎症反応は、諸刃の剣である。一方で、それは、生体の免疫防御が感染を排除するための重要な経路である。もう一方で、無秩序な炎症は、敗血症、慢性炎症性疾患および自己免疫性疾患等の多くの疾患の重要な原因である。病原体感染の場合、宿主の免疫系は、内因性の損傷関連分子パターン（Ｄａｍａｇｅ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐａｔｔｅｒｎ、ＤＡＭＰ）を生成する。現在、ＨＭＧＢ１、ＩＬ１ｂ、ＩＬ３３、Ｓ１００Ａなどを含む、いくつかのＤＡＭＰ炎症因子が生体で発見された。炎症因子としてのＤＡＭＰは、細胞パターン識別受容体（例えば、ＴＬＲ４等）によってさらに識別され、天然免疫細胞の下流信号伝達経路（ＪＡＫ－ＳＴＡＴ経路などを含む）を活性化し、ＮＦ－κＢおよびＩＲＦ３／７等の細胞の炎症に関連する転写因子を活性化し、大量の炎症関連遺伝子の転写および発現を誘導し、免疫反応を活性化する。従って、ＤＡＭＰ炎症因子は、免疫系における非常に重要なタイプの炎症反応分子である。これらのＤＡＭＰ炎症因子は、臨床検出および抗体、小分子化学薬等の医薬品開発の標的として広く使用される。
【0010】
現在、ＣＯＶＩＤ－１９ウイルス感染の発生対して、臨床的に決定された効果的なワクチンおよび抗ウイルス薬は、まだ不足している。報告によると、ロピナビル、レムデシビル（Ｒｅｍｄｅｓｉｖｉｒ）等のいくつかの抗ＨＩＶおよびＳＡＲＳ／ＭＥＲＳ薬は、ＣＯＶＩＤ－１９ウイルス感染の場合に治療效果がある可能性がある。臨床的には、ＳＡＲＳおよび現在のＣＯＶＩＤ－１９ウイルス感染症の重篤な患者の治療で使用される措置は、過剰な炎症を阻害するための高用量ホルモン薬の使用を含む。しかし、大量のホルモンの使用は、しばしば深刻な副作用をもたらし、過度の免疫阻害は、生体がウイルスを排除するのに役立たない。従って、炎症反応を調節する重要なサイトカインを見つけ、宿主の過剰な炎症反応を効果的に阻害できるサイトカイン薬をスクリーニングすることは、新規、突然の感染症の効果的な治療法であり、臨床および予後の正確な介入治療に使用されることができる。これは、現在のＣＯＶＩＤ－１９ウイルスの予防および治療にとって非常に重要であるだけでなく、将来的に標的薬が不足している様々な突然の感染症に対応するための普遍的な意味も有する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0011】
【文献】中国特許出願第２０１９１０２５６２２０．３号
【文献】中国特許出願第２０２０１０１２２５５４．４号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0012】
本発明で解決されるべき課題の一つは、慢性炎症性疾患の予防および／または治療方法と製品および関連抗体、ならびに慢性炎症性疾患を診断するための方法と製品および関連抗体を提供することである。
【0013】
本発明は、慢性炎症性疾患の予防および／または治療のための製品の製造における試薬の使用のための技術案を提供する。
【課題を解決するための手段】
【0014】
当該技術案は、次のとおりである。
慢性炎症性疾患の予防および／または治療のための薬物の製造における試薬の使用であって、
前記試薬は、
（１）炎症因子として細胞外に分泌される異常量（異常な含有量）のＩＦＰ３５および／またはＮＭＩの活性を阻害する物質、
（２）炎症因子として細胞外に分泌されるＩＦＰ３５および／またはＮＭＩの量および／または活性を阻害する物質、
（３）ＩＦＰ３５および／またはＮＭＩの炎症因子としての細胞外への分泌を阻害する物質、
（４）ＩＦＰ３５および／またはＮＭＩの量および／または活性の異常な増加を阻害する物質、
（５）ＩＦＰ３５および／またはＮＭＩの細胞外への分泌を阻害する物質、
（６）炎症因子として慢性炎症性疾患を引き起こすＩＦＰ３５および／またはＮＭＩを阻害する物質、あるいはＤＡＭＰｓとして慢性炎症性疾患を引き起こすＩＦＰ３５および／またはＮＭＩを阻害する物質、
（７）ＩＦＰ３５および／またはＮＭＩがインターフェロン、ＴＮＦ、ＩＬ１および／またはＩＬ６である一部の炎症因子の発現および分泌を上方制御することを阻害する物質、
（８）ＩＦＰ３５および／またはＮＭＩがＴＬＲ４と相互作用し、ＴＬＲ４／ＭＤ２を介してＮＦ－κＢを活性化することを阻害する物質のうちの少なくとも一つである。
慢性炎症性疾患の予防および／または治療のための薬物の製造における試薬の使用であって、
前記試薬は、
（１）炎症因子として細胞外に分泌される異常量（異常な含有量）のＩＦＰ３５および／またはＮＭＩの活性を阻害する物質、
（２）炎症因子として細胞外に分泌されるＩＦＰ３５および／またはＮＭＩの量および／または活性を阻害する物質、
（３）ＩＦＰ３５および／またはＮＭＩの炎症因子としての細胞外への分泌を阻害する物質、
（４）ＩＦＰ３５および／またはＮＭＩの量および／または活性の異常な増加を阻害する物質、
（５）ＩＦＰ３５および／またはＮＭＩの細胞外への分泌を阻害する物質、
（６）炎症因子として慢性炎症性疾患を引き起こすＩＦＰ３５および／またはＮＭＩを阻害する物質、あるいはＤＡＭＰｓとして慢性炎症性疾患を引き起こすＩＦＰ３５および／またはＮＭＩを阻害する物質、
（７）ＩＦＰ３５および／またはＮＭＩがインターフェロン、ＴＮＦ、ＩＬ１および／またはＩＬ６である一部の炎症因子の発現および分泌を上方制御することを阻害する物質、
（８）ＩＦＰ３５および／またはＮＭＩがＴＬＲ４と相互作用し、ＴＬＲ４／ＭＤ２を介してＮＦ－κＢを活性化することを阻害する物質のうちの少なくとも一つである。
【0015】
本発明は、慢性炎症性疾患の予防および／または治療方法を提供する。
【0016】
本発明に係る慢性炎症性疾患の予防および／または治療の方法は、慢性炎症性疾患の予防および／または治療の目的を達成するために、有効量の以下の試薬を生体に投与するステップを含み、
前記試薬は、
（１）炎症因子として細胞外に分泌される異常量のＩＦＰ３５および／またはＮＭＩの活性を阻害する物質、
（２）炎症因子として細胞外に分泌されるＩＦＰ３５および／またはＮＭＩの量および／または活性を阻害する物質、
（３）ＩＦＰ３５および／またはＮＭＩの炎症因子としての細胞外への分泌を阻害する物質、
（４）ＩＦＰ３５および／またはＮＭＩの量および／または活性の異常な増加を阻害する物質、
（５）ＩＦＰ３５および／またはＮＭＩの細胞外への分泌を阻害する物質、
（６）炎症因子として慢性炎症性疾患を引き起こすＩＦＰ３５および／またはＮＭＩを阻害する物質、あるいはＤＡＭＰｓとして慢性炎症性疾患を引き起こすＩＦＰ３５および／またはＮＭＩを阻害する物質、
（７）ＩＦＰ３５および／またはＮＭＩがインターフェロン、ＴＮＦ、ＩＬ１および／またはＩＬ６である一部の炎症因子の発現および分泌を上方制御することを阻害する物質、および
（８）ＩＦＰ３５および／またはＮＭＩがＴＬＲ４と相互作用し、ＴＬＲ４／ＭＤ２を介してＮＦ－κＢを活性化することを阻害する物質からなる群より選ばれる少なくとも一つである。
前記試薬は、
（１）炎症因子として細胞外に分泌される異常量のＩＦＰ３５および／またはＮＭＩの活性を阻害する物質、
（２）炎症因子として細胞外に分泌されるＩＦＰ３５および／またはＮＭＩの量および／または活性を阻害する物質、
（３）ＩＦＰ３５および／またはＮＭＩの炎症因子としての細胞外への分泌を阻害する物質、
（４）ＩＦＰ３５および／またはＮＭＩの量および／または活性の異常な増加を阻害する物質、
（５）ＩＦＰ３５および／またはＮＭＩの細胞外への分泌を阻害する物質、
（６）炎症因子として慢性炎症性疾患を引き起こすＩＦＰ３５および／またはＮＭＩを阻害する物質、あるいはＤＡＭＰｓとして慢性炎症性疾患を引き起こすＩＦＰ３５および／またはＮＭＩを阻害する物質、
（７）ＩＦＰ３５および／またはＮＭＩがインターフェロン、ＴＮＦ、ＩＬ１および／またはＩＬ６である一部の炎症因子の発現および分泌を上方制御することを阻害する物質、および
（８）ＩＦＰ３５および／またはＮＭＩがＴＬＲ４と相互作用し、ＴＬＲ４／ＭＤ２を介してＮＦ－κＢを活性化することを阻害する物質からなる群より選ばれる少なくとも一つである。
【0017】
慢性炎症性疾患の予防および／または治療のための製品の製造において、上記の物質（１）～（８）のいずれか１項に記載の機能を達成できる先行技術における任意の試薬の使用は、本発明の保護範囲内に属する。
【0018】
上記（１）～（５）に記載の阻害は、例えば、ＩＦＰ３５および／またはＮＭＩの量および／または活性の異常な増加を直接阻害するか、または炎症因子の異常量として細胞外に分泌されるＩＦＰ３５および／またはＮＭＩの活性を直接的に阻害し、例えば、ＩＦＰ３５および／またはＮＭＩの炎症因子としての細胞外への分泌を直接的に阻害し、例えば、炎症因子として細胞外に分泌されるＩＦＰ３５および／またはＮＭＩの量および／または活性を阻害する等の、直接的に阻害することもでき、インターフェロンの発現および／または活性を阻害することにより、ＩＦＰ３５および／またはＮＭＩを間接的に阻害することもできる。
【0019】
上記治療方法および治療使用において、前記試薬は、
ＩＦＰ３５および／またはＮＭＩに特異的に結合し、上記の物質（１）～（８）のうちの少なくとも一つの機能を有する、抗体またはポリペプチドまたは抗原結合フラグメント、
上記の物質の（１）～（８）のうちの少なくとも一つの機能を有する、小分子化合物、および
上記の物質の（１）～（８）のうちの少なくとも一つの機能を有する、核酸試薬からなる群より選ばれる少なくとも一つである。
ＩＦＰ３５および／またはＮＭＩに特異的に結合し、上記の物質（１）～（８）のうちの少なくとも一つの機能を有する、抗体またはポリペプチドまたは抗原結合フラグメント、
上記の物質の（１）～（８）のうちの少なくとも一つの機能を有する、小分子化合物、および
上記の物質の（１）～（８）のうちの少なくとも一つの機能を有する、核酸試薬からなる群より選ばれる少なくとも一つである。
【0020】
核酸分子は、ＩＦＰ３５および／またはＮＭＩをコードする遺伝子を標的とすることができるｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡであってもよい。
【0021】
小分子化合物は、ＩＦＰ３５および／またはＮＭＩの分泌、発現および／または活性を阻害する小分子化合物であってもよい。
【0022】
前記抗体またはポリペプチドまたは抗原結合フラグメントは、（１）配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の８１位～１７０位、１７７位～２６８位、または１３６位～２１６位のアミノ酸内に位置するエピトープ、（２）配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４の８１位～１６８位、１７５位～２６６位、または１３４位～２１４位のアミノ酸内に位置するエピトープ、（３）配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６の１０４～１９３、２０２－２９３位、または１５１位～２５０位のアミノ酸内に位置するエピトープ、（４）配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８の１０３位～１９２位、２０１位～２９２位、または１５１位～２４０位のアミノ酸に位置するエピトープから選ばれる抗原エピトープに特異的に結合する抗体であってもよい。
【0023】
上記治療方法および治療使用において、前記抗体は、以下のＡまたはＢまたはＣまたはＤの抗体であってもよく、
Ａ．ＩＦＰ３５／ＮＭＩの抗原エピトープに特異的に結合する抗体、ポリペプチドまたは抗原結合フラグメントであって、前記抗原エピトープは、以下の（１）または（２）であり、（１）前記抗原エピトープは、ＩＦＰ３５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）のＡｒｇ１６３、Ａｓｎ１６４、Ａｒｇ１９１、Ｇｌｎ１９４、Ｉｌｅ１９５、Ｇｌｎ１９７、Ｐｈｅ１９８、Ｔｈｒ１９９、Ｐｒｏ２０１、Ｇｌｎ２０６、Ｐｒｏ２０８、Ａｒｇ２１０のアミノ酸部位を含み、（２）前記抗原エピトープは、ＮＭＩ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）のＡｒｇ１８５、Ａｓｎ１８６、Ｌｙｓ２１５、Ｌｙｓ２１８、Ｌｙｓ２１９、Ｇｌｕ２２１、Ｔｙｒ２２２、Ｐｒｏ２２３、Ｔｙｒ２２５、Ｃｙｓ２３０、Ａｒｇ２３２、Ｔｈｒ２３４のアミノ酸部位を含む、抗体、ポリペプチドまたは抗原結合フラグメント、
Ｂ．任意の上記（１）の抗原エピトープの少なくとも一つのアミノ酸残基に結合し、かつＩＦＰ３５の活性を阻害することができる、抗体または小分子またはポリペプチド物質、
Ｃ、任意の上記（２）の抗原エピトープの少なくとも一つのアミノ酸残基に結合し、かつＮＭＩの活性を阻害することができる、抗体または小分子またはポリペプチド物質、
Ｄ、軽鎖可変領域および重鎖可変領域を有する３５ＮＩＤｍＡｂ抗体であって、重鎖可変領域は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、ＣＤＲ１の配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９（ＧＹＴＦＴＮＹＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３））の２５位～３２位のアミノ酸であり、ＣＤＲ２の配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９（ＩＮＴＹＴＧＥＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４））の５０位～５７位のアミノ酸であり、ＣＤＲ３の配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９（ＹＧＹＳＷＡＭＤＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５））の９８位～１０６位のアミノ酸であり、軽鎖可変領域は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、ＣＤＲ１の配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０（ＳＳＳＶＳＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６））の２６位～３１位のアミノ酸であり、ＣＤＲ２の配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０（ＤＴＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７））の４９位～５１位のアミノ酸であり、ＣＤＲ３の配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０（ＷＳＳＮＰＰＩ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８））の９０位～９６位のアミノ酸である、抗体。
Ａ．ＩＦＰ３５／ＮＭＩの抗原エピトープに特異的に結合する抗体、ポリペプチドまたは抗原結合フラグメントであって、前記抗原エピトープは、以下の（１）または（２）であり、（１）前記抗原エピトープは、ＩＦＰ３５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）のＡｒｇ１６３、Ａｓｎ１６４、Ａｒｇ１９１、Ｇｌｎ１９４、Ｉｌｅ１９５、Ｇｌｎ１９７、Ｐｈｅ１９８、Ｔｈｒ１９９、Ｐｒｏ２０１、Ｇｌｎ２０６、Ｐｒｏ２０８、Ａｒｇ２１０のアミノ酸部位を含み、（２）前記抗原エピトープは、ＮＭＩ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）のＡｒｇ１８５、Ａｓｎ１８６、Ｌｙｓ２１５、Ｌｙｓ２１８、Ｌｙｓ２１９、Ｇｌｕ２２１、Ｔｙｒ２２２、Ｐｒｏ２２３、Ｔｙｒ２２５、Ｃｙｓ２３０、Ａｒｇ２３２、Ｔｈｒ２３４のアミノ酸部位を含む、抗体、ポリペプチドまたは抗原結合フラグメント、
Ｂ．任意の上記（１）の抗原エピトープの少なくとも一つのアミノ酸残基に結合し、かつＩＦＰ３５の活性を阻害することができる、抗体または小分子またはポリペプチド物質、
Ｃ、任意の上記（２）の抗原エピトープの少なくとも一つのアミノ酸残基に結合し、かつＮＭＩの活性を阻害することができる、抗体または小分子またはポリペプチド物質、
Ｄ、軽鎖可変領域および重鎖可変領域を有する３５ＮＩＤｍＡｂ抗体であって、重鎖可変領域は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、ＣＤＲ１の配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９（ＧＹＴＦＴＮＹＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３））の２５位～３２位のアミノ酸であり、ＣＤＲ２の配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９（ＩＮＴＹＴＧＥＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４））の５０位～５７位のアミノ酸であり、ＣＤＲ３の配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９（ＹＧＹＳＷＡＭＤＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５））の９８位～１０６位のアミノ酸であり、軽鎖可変領域は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、ＣＤＲ１の配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０（ＳＳＳＶＳＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６））の２６位～３１位のアミノ酸であり、ＣＤＲ２の配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０（ＤＴＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７））の４９位～５１位のアミノ酸であり、ＣＤＲ３の配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０（ＷＳＳＮＰＰＩ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８））の９０位～９６位のアミノ酸である、抗体。
【0024】
上記抗体、ポリペプチドまたは抗原結合フラグメントにおいて、かかる抗体は、ＣＤＲを除く３５ＮＩＤｍＡｂの残りの位置のアミノ酸を突然変異させて得られる抗体であり、あるいは、かかる抗体は、３５ＮＩＤｍＡｂをヒト化して得られる抗体である。
【0025】
当業者は、当技術分野の一般的な知識及び一般的な方法に従って、ＣＤＲ配列を除いて、上記のいずれか一つの抗体の他のアミノ酸を修飾および突然変異させて得られた抗体も、本発明の保護範囲に属する。
【0026】
前記ヒト化抗体は、ＡＥ００１－Ｈ１＋Ｌ１、ＡＥ００１－Ｈ２＋Ｌ２またはＡＥ００１－Ｈ３＋Ｌ３の少なくとも一つである。これらの三つの抗体は、すべて軽鎖可変領域および重鎖可変領域を有し、重鎖可変領域は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、ＣＤＲ１の配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９（ＧＹＴＦＴＮＹＧ）の２５位～３２位のアミノ酸であり、ＣＤＲ２の配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９（ＩＮＴＹＴＧＥＰ）の５０位～５７位のアミノ酸であり、ＣＤＲ３の配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９（ＹＧＹＳＷＡＭＤＹ）の９８位～１０６位のアミノ酸であり、軽鎖可変領域は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、ＣＤＲ１の配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０（ＳＳＳＶＳＹ）の２６位～３１位のアミノ酸であり、ＣＤＲ２の配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０（ＤＴＳ）の４９位～５１位のアミノ酸であり、ＣＤＲ３の配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０（ＷＳＳＮＰＰＩ）の９０位～９６位のアミノ酸である。
【0027】
ＡＥ００１－Ｈ１＋Ｌ１の重鎖定常領域の配列は、ＡＥ００１Ｈ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）であり、軽鎖定常領域の配列は、ＡＥ００１Ｌ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）である。
【0028】
ＡＥ００１－Ｈ２＋Ｌ２の重鎖定常領域の配列は、ＡＥ００１Ｈ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）であり、軽鎖定常領域の配列は、ＡＥ００１Ｌ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）である。
【0029】
ＡＥ００１－Ｈ３＋Ｌ３の重鎖定常領域の配列は、ＡＥ００１Ｈ３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）であり、軽鎖定常領域の配列は、ＡＥ００１Ｌ３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）である。
【0030】
上記の抗体、ポリペプチドまたは抗原結合フラグメントにおいて、前記抗体は、３５ＮＩＤｍＡｂまたはそのヒト化抗体における少なくとも一つのＣＤＲのアミノ酸残基を突然変異させることによって得られる抗体である。
【0031】
上記の抗体、ポリペプチドまたは抗原結合フラグメントにおいて、前記３５ＮＩＤｍＡｂまたはそのヒト化抗体における少なくとも一つのＣＤＲの突然変異は、
３５ＮＩＤｍＡｂの重鎖可変領域のＣＤＲ１の２５、２６、２７、２８、２９および／または３２位のアミノ酸残基での突然変異、即ち、（２５ ＧＹＴＦＴＮＹＧ ３２）において、ＮＹ以外のアミノ酸位置での突然変異、
３５ＮＩＤｍＡｂの重鎖可変領域のＣＤＲ２の５０、５２、５５、５６および／または５７位のアミノ酸残基での突然変異、即ち、（５０ ＩＮＴＹＴＧＥＰ ５７）において、下線付きアミノ酸以外のアミノ酸位置での突然変異、
３５ＮＩＤｍＡｂの重鎖可変領域のＣＤＲ３の９８、９９、１０１、１０３、１０４、１０５および／または１０６位のアミノ酸残基での突然変異、即ち、（９８ ＹＧＹＳＷＡＭＤＹ １０６）において、下線付きアミノ酸以外のアミノ酸位置での突然変異、
３５ＮＩＤｍＡｂの軽鎖可変領域のＣＤＲ１の２６、２７、２８および／または２９位のアミノ酸残基での突然変異、即ち、（２６ ＳＳＳＶＳＹ ３１）において、下線付きアミノ酸以外のアミノ酸位置での突然変異、
３５ＮＩＤｍＡｂの軽鎖可変領域のＣＤＲ３の９０、９１、９４、９５および／または９６位のアミノ酸残基での突然変異、即ち、（９０ ＷＳＳＮＰＰＩ ９６）において、下線付きアミノ酸以外のアミノ酸位置での突然変異のうちの少なくとも一つの突然変異を行うことを含む。
３５ＮＩＤｍＡｂの重鎖可変領域のＣＤＲ１の２５、２６、２７、２８、２９および／または３２位のアミノ酸残基での突然変異、即ち、（２５ ＧＹＴＦＴＮＹＧ ３２）において、ＮＹ以外のアミノ酸位置での突然変異、
３５ＮＩＤｍＡｂの重鎖可変領域のＣＤＲ２の５０、５２、５５、５６および／または５７位のアミノ酸残基での突然変異、即ち、（５０ ＩＮＴＹＴＧＥＰ ５７）において、下線付きアミノ酸以外のアミノ酸位置での突然変異、
３５ＮＩＤｍＡｂの重鎖可変領域のＣＤＲ３の９８、９９、１０１、１０３、１０４、１０５および／または１０６位のアミノ酸残基での突然変異、即ち、（９８ ＹＧＹＳＷＡＭＤＹ １０６）において、下線付きアミノ酸以外のアミノ酸位置での突然変異、
３５ＮＩＤｍＡｂの軽鎖可変領域のＣＤＲ１の２６、２７、２８および／または２９位のアミノ酸残基での突然変異、即ち、（２６ ＳＳＳＶＳＹ ３１）において、下線付きアミノ酸以外のアミノ酸位置での突然変異、
３５ＮＩＤｍＡｂの軽鎖可変領域のＣＤＲ３の９０、９１、９４、９５および／または９６位のアミノ酸残基での突然変異、即ち、（９０ ＷＳＳＮＰＰＩ ９６）において、下線付きアミノ酸以外のアミノ酸位置での突然変異のうちの少なくとも一つの突然変異を行うことを含む。
【0032】
３５ＮＩＤｍＡｂの抗体重鎖可変領域のＣＤＲ１配列（２５ ＧＹＴＦＴＮＹＧ ３２）において、抗原に結合する二つのアミノ酸は、主にＡｓｎ３０およびＴｙｒ３１であり、抗体の重鎖可変領域のＣＤＲ２配列（５０ ＩＮＴＹＴＧＥＰ ５７）において、抗原に結合する三つのアミノ酸は、主にＡｓｎ５１、Ｔｙｒ５３およびＴｈｒ５４であり、抗体の重鎖可変領域のＣＤＲ３配列（９８ ＹＧＹＳＷＡＭＤＹ １０６）において、抗原に結合する二つのアミノ酸は、主にＴｙｒ１００およびＴｒｐ１０２である。上記の残基は、抗体の重鎖と抗原との間の相互作用残基と呼ぶことができる。他のＣＤＲ残基は、抗原ＩＦＰ３５に結合しないか、またはほとんど結合しないため、抗体活性に大きな影響を与えない抗体を取得するために変更を加える方が簡単である。従って、抗原と相互作用しない上記の前記ＣＤＲの残基のいずれかを変更しても、ＩＦＰ３５またはＮＭＩの抗原－抗体複合体構造の対応するエピトープアミノ酸との結合を維持することができ、本発明の保護範囲内に属するべきである。
【0033】
抗体の軽鎖可変領域のＣＤＲ１配列（２６ ＳＳＳＶＳＹ ３１）において、抗原に結合する主なアミノ酸は、Ｓｅｒ３０およびＴｙｒ３１であり、抗体の軽鎖可変領域のＣＤＲ２配列（４９ ＤＴＳ ５１）において、抗原に結合する主なアミノ酸は、Ａｓｐ４９であり、抗体の軽鎖可変領域のＣＤＲ３配列（９０ ＷＳＳＮＰＰＩ ９６）において、抗原に結合する主なアミノ酸は、Ｓｅｒ９２およびＡｓｎ９３である。上記の残基は、抗体の重鎖と抗原との間の相互作用残基と呼ぶことができる。他のＣＤＲ残基は、抗原ＩＦＰ３５に結合しないか、またはほとんど結合しないため、抗体活性に大きな影響を与えない抗体を取得するために変更を加える方が簡単である。従って、抗原と相互作用しない上記の前記ＣＤＲの残基のいずれかを変更しても、ＩＦＰ３５またはＮＭＩの抗原－抗体複合体構造の対応するエピトープアミノ酸との結合を維持することができ、本発明の保護範囲内に属するべきである。
【0034】
上記抗体、ポリペプチドまたは抗原結合フラグメントにおいて、前記３５ＮＩＤｍＡｂまたはそのヒト化抗体における少なくとも一つのＣＤＲの突然変異は、
３５ＮＩＤｍＡｂの重鎖可変領域のＣＤＲ１の３０および／または３１位のアミノ酸残基での突然変異、
３５ＮＩＤｍＡｂの重鎖可変領域のＣＤＲ２の５１、５３および／または５４位のアミノ酸残基での突然変異、
３５ＮＩＤｍＡｂの重鎖可変領域のＣＤＲ３の１００および／または１０２位のアミノ酸残基での突然変異、
３５ＮＩＤｍＡｂの軽鎖可変領域のＣＤＲ１の３０および／または３１位のアミノ酸残基での突然変異、
３５ＮＩＤｍＡｂの軽鎖可変領域のＣＤＲ３の９２および／または９３位のアミノ酸残基での突然変異のうちの少なくとも一つの突然変異を行うことを含む。
３５ＮＩＤｍＡｂの重鎖可変領域のＣＤＲ１の３０および／または３１位のアミノ酸残基での突然変異、
３５ＮＩＤｍＡｂの重鎖可変領域のＣＤＲ２の５１、５３および／または５４位のアミノ酸残基での突然変異、
３５ＮＩＤｍＡｂの重鎖可変領域のＣＤＲ３の１００および／または１０２位のアミノ酸残基での突然変異、
３５ＮＩＤｍＡｂの軽鎖可変領域のＣＤＲ１の３０および／または３１位のアミノ酸残基での突然変異、
３５ＮＩＤｍＡｂの軽鎖可変領域のＣＤＲ３の９２および／または９３位のアミノ酸残基での突然変異のうちの少なくとも一つの突然変異を行うことを含む。
【0035】
前記抗体または抗原結合フラグメントは、抗原ＩＦＰ３５およびＮＭＩの識別に関与する、３５ＮＩＤｍＡｂまたはそのヒト化抗体における重鎖のＡｓｎ３０、Ｔｙｒ３１、Ａｓｎ５１、Ｔｙｒ５３、Ｔｈｒ５４、Ｔｙｒ１００およびＴｒｐ１０２位のアミノ酸残基のうちの２つ以上のアミノ酸残基を識別することができる抗体または抗原結合フラグメントである。
【0036】
前記抗体または抗原結合フラグメントは、抗原ＩＦＰ３５およびＮＭＩの識別に関与する、３５ＮＩＤｍＡｂまたはそのヒト化抗体における軽鎖のＳｅｒ３０、Ｔｙｒ３１、Ａｓｐ４９、Ｓｅｒ９２およびＡｓｎ９３位のアミノ酸残基のうちの２つ以上のアミノ酸残基を識別することができる抗体または抗原結合フラグメントである。
【0037】
抗体の重鎖可変領域のＣＤＲ１配列（２５ ＧＹＴＦＴＮＹＧ ３２）において、抗原に結合する二つのアミノ酸は、主にＡｓｎ３０およびＴｙｒ３１であり、抗体の重鎖可変領域のＣＤＲ２配列（５０ ＩＮＴＹＴＧＥＰ ５７）において、抗原に結合する三つのアミノ酸は、主にＡｓｎ５１、Ｔｙｒ５３およびＴｈｒ５４であり、抗体の重鎖可変領域のＣＤＲ３配列（９８ ＹＧＹＳＷＡＭＤＹ １０６）において、抗原に結合する二つのアミノ酸は、主にＴｙｒ１００およびＴｒｐ１０２である。従って、いくつかのアミノ酸を変更することは、抗原―抗体の結合能に有益である可能性がある。上記の残基は、抗体の重鎖と抗原との間の相互作用残基と呼ぶことができる。抗原と相互作用するこれらの残基のいずれか一つまたは二つまたは三つを変更しても、ＩＦＰ３５またはＮＭＩの抗原－抗体複合体構造の対応するエピトープアミノ酸との結合を維持し、本発明の保護範囲内に属するべきである。
【0038】
抗体の軽鎖可変領域のＣＤＲ１配列（２６ ＳＳＳＶＳＹ ３１）において、抗原に結合する主なアミノ酸は、Ｓｅｒ３０およびＴｙｒ３１であり、抗体の軽鎖可変領域のＣＤＲ２配列（４９ ＤＴＳ ５１）において、抗原に結合する主なアミノ酸は、Ａｓｐ４９であり、抗体の軽鎖可変領域のＣＤＲ３配列（９０ ＷＳＳＮＰＰＩ ９６）において、抗原に結合する主なアミノ酸は、Ｓｅｒ９２およびＡｓｎ９３である。従って、これらのアミノ酸の変化のいくつかは、抗原―抗体の結合能に有益である可能性がある。上記の残基は、抗体の軽鎖と抗原との間の相互作用残基と呼ぶことができる。抗原と相互作用するこれらの残基のいずれか一つまたは二つまたは三つを変更しても、ＩＦＰ３５またはＮＭＩの抗原－抗体複合体構造の対応するエピトープアミノ酸との結合を維持し、本発明の保護範囲内に属するべきである。
【0039】
上記抗体、ポリペプチドまたは抗原結合フラグメントにおいて、前記３５ＮＩＤｍＡｂまたはそのヒト化抗体における少なくとも一つのＣＤＲを突然変異させて得られる抗体は、ＡＥ００１－５、ＡＥ００１－６、ＡＥ００１－７、ＡＥ００１－８、ＡＥ００１－９のうちの少なくとも一つである。
【0040】
ＡＥ００１－５、ＡＥ００１－６、ＡＥ００１－７、ＡＥ００１－８、ＡＥ００１－９の重鎖可変領域のＣＤＲおよび軽鎖可変領域のＣＤＲは、以下の表に示される。
【0041】
重鎖可変領域ＣＤＲ：
【表1】
【0042】
軽鎖可変領域ＣＤＲ：
【表2】
【0043】
ＡＥ００１－５、ＡＥ００１－６、ＡＥ００１－７、ＡＥ００１－８、ＡＥ００１－９の重鎖可変領域および軽鎖可変領域のＣＤＲを除く配列は、当業者がその所望に応じて改変（遺伝子操作）することができる。具体的な例として、ＡＥ００１－５、ＡＥ００１－６、ＡＥ００１－７、ＡＥ００１－８、ＡＥ００１－９の重鎖可変領域および軽鎖可変領域のＣＤＲを除く配列はまた３５ＮＩＤｍＡｂ抗体の対応する配列と同じであってもよい。
【0044】
ＡＥ００１－５、ＡＥ００１－６、ＡＥ００１－７、ＡＥ００１－８、ＡＥ００１－９の定常領域の配列は、当業者がその所望に応じて改変することができる。具体的な例として、ＡＥ００１－５、ＡＥ００１－６、ＡＥ００１－７、ＡＥ００１－８、ＡＥ００１－９の定常領域の配列は、上記ＡＥ００１－Ｈ１＋Ｌ１、ＡＥ００１－Ｈ２＋Ｌ２またはＡＥ００１－Ｈ３＋Ｌ３の定常領域の配列と同じであってもよい。
【0045】
上記治療方法および治療使用において、前記慢性炎症性疾患は、多発性硬化症、関節炎、関節リウマチ、乾癬（鱗屑癬）、各種腸炎（ＩＢＤなど）、喘息、慢性閉塞性肺および全身性紅斑性狼瘡、慢性肝炎、慢性腎炎、慢性膵炎、脳炎、悪性腫瘍、白血病、アルツハイマー病、パーキンソン症候群などからなる群より選ばれる。
【0046】
上記治療方法および治療使用において、関節リウマチ（Ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ：ＲＡ）、変形性関節症（ＯＳＴＥＯＡＲＴＨＲＩＴＩＳ：ＯＡ）、多発性硬化症（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ：ＭＳ）、アテローム性動脈硬化症（ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、心筋梗塞（Ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ Ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ）、慢性閉塞性肺（ＣＯＰＤ）、慢性腎炎、慢性肝炎、慢性膵炎、２型糖尿病（ｔｙｐｅ ２ ｄｉａｂｅｔｅｓ）、全身性紅斑性狼瘡（Ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｌｕｐｕｓ ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ：ＳＬＥ）、アルツハイマー病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、パーキンソン病（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ：ＰＤ）悪性腫瘍、喘息（ａｓｔｈｍａ）、アレルギー性疾患（Ａｌｌｅｒｇｉｃ ｄｉｓｅａｓｅｓ）、心血管疾患（Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ ｄｉｓｅａｓｅｓ）、筋骨格疾患（Ｍｕｓｃｕｌｏｓｋｅｌｅｔａｌ ｄｉｓｅａｓｅｓ）、炎症性腸炎（ＩＢＤ）、肥満と糖尿病（Ｏｂｅｓｉｔｙ ａｎｄ ｄｉａｂｅｔｅｓ）、網膜炎症性疾患（ＡＭＤ）、歯周炎（Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｉｔｉｓ）、ブドウ膜炎（Ｕｖｅｉｔｉｓ）などを含む前記慢性炎症性疾患は、分泌されたＩＦＰ３５／ＮＭＩ炎症因子の異常量によって作用が発揮される。
【0047】
慢性炎症性疾患の病理学的過程には、多くの炎症因子が関与している。免疫細胞等によって細胞外マトリックス（血液、体液等）に分泌されて炎症反応作用を促進する炎症因子として、ＩＦＰ３５および／またはＮＭＩは、細胞によって細胞外マトリックス（血液、体液等）に分泌され、炎症反応を活性化作用を発揮することもできる。本発明で例示される多発性硬化症は、慢性炎症性疾患の典型的な代表例である。多発性硬化症の発生は、ミクログリアと密接に関連している。ミクログリアは、神経系の免疫細胞（マクロファージ）の一部の役割を果たし、炎症因子を放出し、炎症反応の発生を促進することができる。この現象は、インビボの他の組織および臓器が炎症反応を起こしている際にマクロファージ等の免疫細胞によって引き起こされる炎症反応に相当する。本発明の発明者らは、ＬＰＳ等の誘導状況下で、ミクログリアが細胞培地にＩＦＰ３５／ＮＭＩを分泌し、多発性硬化症を罹患した動物の血清中のＩＦＰ３５／ＮＭＩ含有量も増加することを見出した。ＩＦＰ３５／ＮＭＩが多発性硬化症に関連していることを示す。全体的には、マクロファージ、ミクログリア等の免疫細胞は、炎症因子を放出して炎症反応を引き起こし、ＩＦＰ３５／ＮＭＩがそのうちの炎症因子として、様々な慢性炎症性疾患を引き起こすことができる。本発明は、以下の技術案Ａ、Ｂ、ＣまたはＤに記載のような慢性炎症性疾患を診断ための方法および使用を提供しており、
【0048】
技術案Ａは、ＩＦＰ３５および／またはＮＭＩを検出する物質の、慢性炎症性疾患を診断するための製品の製造における使用であり、
前記ＩＦＰ３５および／またはＮＭＩを検出する物質は、
（１）生体脊髄組織におけるＩＦＰ３５／ＮＭＩの発現量が有意に上昇しているかどうかを検出する物質、
（２）ＩＦＰ３５／ＮＭＩが生体の血液または体液（例えば、脳脊髄液）に分泌されているかどうかを検出する物質、
（３）生体の血液または体液（例えば、脳脊髄液）にＩＦＰ３５／ＮＭＩが含まれているかどうかを検出し、ならびに／あるいは生体の血液または体液（例えば、脳脊髄液）中のＩＦＰ３５／ＮＭＩの量を検出する物質、
（４）臨床上の炎症性疾患の医学的診断を補助するために、生体の血液または体液（例えば、脳脊髄液）に分泌されるＩＦＰ３５／ＮＭＩの量を検出する物質、および
（５）分泌されたＩＦＰ３５／ＮＭＩと生体の他の炎症因子（例えば、ＴＮＦ、ＩＬ１、ＩＬ６）およびバイオマーカー（プロカルシトニン（ＰＣＴ）、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ））の発現増加と血液中への分泌量増加（分泌される含有量の増加）との間の差異および相関関係を検出する物質からなる群より選ばれる少なくとも一つである。
前記ＩＦＰ３５および／またはＮＭＩを検出する物質は、
（１）生体脊髄組織におけるＩＦＰ３５／ＮＭＩの発現量が有意に上昇しているかどうかを検出する物質、
（２）ＩＦＰ３５／ＮＭＩが生体の血液または体液（例えば、脳脊髄液）に分泌されているかどうかを検出する物質、
（３）生体の血液または体液（例えば、脳脊髄液）にＩＦＰ３５／ＮＭＩが含まれているかどうかを検出し、ならびに／あるいは生体の血液または体液（例えば、脳脊髄液）中のＩＦＰ３５／ＮＭＩの量を検出する物質、
（４）臨床上の炎症性疾患の医学的診断を補助するために、生体の血液または体液（例えば、脳脊髄液）に分泌されるＩＦＰ３５／ＮＭＩの量を検出する物質、および
（５）分泌されたＩＦＰ３５／ＮＭＩと生体の他の炎症因子（例えば、ＴＮＦ、ＩＬ１、ＩＬ６）およびバイオマーカー（プロカルシトニン（ＰＣＴ）、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ））の発現増加と血液中への分泌量増加（分泌される含有量の増加）との間の差異および相関関係を検出する物質からなる群より選ばれる少なくとも一つである。
【0049】
技術案Ｂは、疾患（病態）診断使用の臨床検出製品が血清および体液に分泌されるＩＦＰ３５および／またはＮＭＩを検出することであり、
前記血清および体液に分泌されるＩＦＰ３５および／またはＮＭＩを検出するための臨床使用製品は、蛍光発光臨床検出試薬（キット）、化学発光臨床検出試薬（キット）、Ｅｌｉｓａ検出試薬（キット）、ＰＣＲ臨床検出試薬（キット）のうちの少なくとも一つを含む。
分泌されたＩＦＰ３５／ＮＭＩと、生体の他の炎症因子（例えば、ＴＮＦ、ＩＬ１、ＩＬ６）およびバイオマーカー（プロカルシトニン（ＰＣＴ）、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ））の発現増加および血液中への分泌量増加との間の差異および相関関係を検出する。
前記血清および体液に分泌されるＩＦＰ３５および／またはＮＭＩを検出するための臨床使用製品は、蛍光発光臨床検出試薬（キット）、化学発光臨床検出試薬（キット）、Ｅｌｉｓａ検出試薬（キット）、ＰＣＲ臨床検出試薬（キット）のうちの少なくとも一つを含む。
分泌されたＩＦＰ３５／ＮＭＩと、生体の他の炎症因子（例えば、ＴＮＦ、ＩＬ１、ＩＬ６）およびバイオマーカー（プロカルシトニン（ＰＣＴ）、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ））の発現増加および血液中への分泌量増加との間の差異および相関関係を検出する。
【0050】
技術案Ｃは、慢性炎症性疾患の診断使用のための臨床検出製品が血清および体液に分泌されるＩＦＰ３５および／またはＮＭＩを検出することであり、
前記血清および体液に分泌されるＩＦＰ３５および／またはＮＭＩを検出するための臨床使用製品は、蛍光発光臨床検出試薬（キット）、化学発光臨床検出試薬（キット）、Ｅｌｉｓａ検出試薬（キット）、ＰＣＲ臨床検出試薬（キット）のうちの少なくとも一つを含む。
分泌されたＩＦＰ３５／ＮＭＩと、生体の他の炎症因子（例えば、ＴＮＦ、ＩＬ１、ＩＬ６）およびバイオマーカー（プロカルシトニン（ＰＣＴ）、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ））の発現増加および血液中への分泌量増加との間の差異および相関関係を検出する。
前記血清および体液に分泌されるＩＦＰ３５および／またはＮＭＩを検出するための臨床使用製品は、蛍光発光臨床検出試薬（キット）、化学発光臨床検出試薬（キット）、Ｅｌｉｓａ検出試薬（キット）、ＰＣＲ臨床検出試薬（キット）のうちの少なくとも一つを含む。
分泌されたＩＦＰ３５／ＮＭＩと、生体の他の炎症因子（例えば、ＴＮＦ、ＩＬ１、ＩＬ６）およびバイオマーカー（プロカルシトニン（ＰＣＴ）、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ））の発現増加および血液中への分泌量増加との間の差異および相関関係を検出する。
【0051】
技術案Ｄは、被験生体が慢性炎症性疾患を罹患しているかどうかを診断する方法であり、
（１）生体組織（例えば脊髄組織など）におけるＩＦＰ３５／ＮＭＩの発現量が有意に上昇しているかどうかを検出するステップ、
（２）ＩＦＰ３５／ＮＭＩが生体の血液または体液（例えば、脳脊髄液）に分泌されているかどうかを検出するステップ、
（３）生体の血液または体液（例えば、脳脊髄液）にＩＦＰ３５／ＮＭＩが含まれているかどうかを検出し、ならびに／あるいは生体の血液または体液（例えば、脳脊髄液）中のＩＦＰ３５／ＮＭＩの量を検出するステップ、
（４）臨床上の炎症性疾患の医学的診断を補助するために、生体の血液または体液（例えば、脳脊髄液）に分泌されるＩＦＰ３５／ＮＭＩの量を検出するステップ、および
（５）分泌されたＩＦＰ３５／ＮＭＩと、生体の他の炎症因子（例えば、ＴＮＦ、ＩＬ１、ＩＬ６）およびバイオマーカー（プロカルシトニン（ＰＣＴ）、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ））の発現増加および血液中への分泌量増加との間の差異および相関関係を検出するステップからなる群より選ばれる少なくとも一つのステップを含む。
（１）生体組織（例えば脊髄組織など）におけるＩＦＰ３５／ＮＭＩの発現量が有意に上昇しているかどうかを検出するステップ、
（２）ＩＦＰ３５／ＮＭＩが生体の血液または体液（例えば、脳脊髄液）に分泌されているかどうかを検出するステップ、
（３）生体の血液または体液（例えば、脳脊髄液）にＩＦＰ３５／ＮＭＩが含まれているかどうかを検出し、ならびに／あるいは生体の血液または体液（例えば、脳脊髄液）中のＩＦＰ３５／ＮＭＩの量を検出するステップ、
（４）臨床上の炎症性疾患の医学的診断を補助するために、生体の血液または体液（例えば、脳脊髄液）に分泌されるＩＦＰ３５／ＮＭＩの量を検出するステップ、および
（５）分泌されたＩＦＰ３５／ＮＭＩと、生体の他の炎症因子（例えば、ＴＮＦ、ＩＬ１、ＩＬ６）およびバイオマーカー（プロカルシトニン（ＰＣＴ）、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ））の発現増加および血液中への分泌量増加との間の差異および相関関係を検出するステップからなる群より選ばれる少なくとも一つのステップを含む。
【0052】
上記の診断方法および使用において、被験生体が慢性炎症性疾患を罹患しているかどうかという診断は、
（１）被験生体組織（例えば脊髄組織など）におけるＩＦＰ３５／ＮＭＩの発現量が有意に上昇していると、被験生体が慢性炎症性疾患を罹患していると判断し、
（２）ＩＦＰ３５／ＮＭＩが生体の血液または体液（例えば、脳脊髄液）に分泌されていることが検出されると、被験生体が慢性炎症性疾患を罹患していると判断し、
（３）生体の血液または体液（例えば、脳脊髄液）にＩＦＰ３５／ＮＭＩが含有されることが検出されると、被験生体が慢性炎症性疾患を罹患していると判断し、
（４）ＩＦＰ３５／ＮＭＩ発現の増加が、生体の他の炎症因子（インターフェロン、ＴＮＦ、ＩＬ１、ＩＬ６等）の発現および血液または体液への分泌と一致するか、または臨床的に特性の特徴があると、被験生体が慢性炎症性疾患を罹患していると判断する判断標準の少なくとも一つに従って診断することができる。
（１）被験生体組織（例えば脊髄組織など）におけるＩＦＰ３５／ＮＭＩの発現量が有意に上昇していると、被験生体が慢性炎症性疾患を罹患していると判断し、
（２）ＩＦＰ３５／ＮＭＩが生体の血液または体液（例えば、脳脊髄液）に分泌されていることが検出されると、被験生体が慢性炎症性疾患を罹患していると判断し、
（３）生体の血液または体液（例えば、脳脊髄液）にＩＦＰ３５／ＮＭＩが含有されることが検出されると、被験生体が慢性炎症性疾患を罹患していると判断し、
（４）ＩＦＰ３５／ＮＭＩ発現の増加が、生体の他の炎症因子（インターフェロン、ＴＮＦ、ＩＬ１、ＩＬ６等）の発現および血液または体液への分泌と一致するか、または臨床的に特性の特徴があると、被験生体が慢性炎症性疾患を罹患していると判断する判断標準の少なくとも一つに従って診断することができる。
【0053】
上記の診断方法および使用において、前記血清および体液に分泌されるＩＦＰ３５および／またはＮＭＩを検出するための臨床使用製品は、蛍光発光臨床検出試薬（キット）、化学発光臨床検出試薬（キット）、Ｅｌｉｓａ検出試薬（キット）、ＰＣＲ臨床検出試薬（キット）のうちの少なくとも一つを含む。
【0054】
上記の診断方法および使用において、ＩＦＰ３５および／またはＮＭＩの量および／または活性の検出は、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質レベルから検出することができる。
【0055】
上記の診断方法および使用において、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡレベルの検出は、特異的核酸プローブを使用することができ、ＰＣＲプライマーまたはチップなどを使用することもできる。
【0056】
上記の診断方法および使用において、タンパク質レベルの検出は抗体を使用する。
【0057】
上記の診断方法および使用において、現在、臨床上に一般的に使用される炎症性疾患の検出指標は、プロカルシトニン（ＰＣＴ）、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、ＴＮＦおよびＩＬ６などを含む。しかし、これらの検出指標には制限がある。例えば、ＰＣＴを使用してウイルスによる感染を示すことはできない。さらに、様々な疾患について、多種類の炎症因子は、様々な患者での表現が異なる。従って、一方で、他の適切な検出指標を開発必要があり、もう一方で、既知の炎症因子を一般的にテストする必要がある。慢性炎症性疾患の場合、ＩＦＰ３５およびＮＭＩを臨床的に検出して、他の指標と比較することができる。
【0058】
上記の診断方法および使用において、マウスの脊髄組織におけるＩＦＰ３５／ＮＭＩの発現量が有意に上昇しているかどうかを検出するか、またはＩＦＰ３５／ＮＭＩがマウスの血液または体液（例えば、脳脊髄液）に分泌されているかどうかを検出するか、またはＩＦＰ３５／ＮＭＩとマウスにおける他の炎症因子（例えば、ＴＮＦ、ＩＬ１、ＩＬ６）の発現増加および血液への分泌含有量の増加との間の相関関係を検出することにより、マウスにＭＳが罹患しているかどうかを診断するのに役立てることができる。マウス組織におけるＩＦＰ３５／ＮＭＩの発現量異常に増加し、ＩＦＰ３５／ＮＭＩがマウスの血液または体液（例えば、脳脊髄液）に異常に分泌されるか、またはＩＦＰ３５／ＮＭＩの発現増加が、マウスの他の炎症因子（インターフェロン、ＴＮＦ、ＩＬ１、ＩＬ６等）の発現および血液に分泌されるのと一致して、マウスの歩行の変化、手足の麻痺等の明らかな外的症状を引き起こすと、基本的にマウスがＭＳを罹患していると診断することができる。
【0059】
上記の診断方法および使用において、前記検出物質は、以下のＡ、Ｂ、ＣまたはＤに示す抗体、ポリペプチドまたは抗原結合フラグメントである。
【0060】
Ａ．ＩＦＰ３５／ＮＭＩの抗原エピトープに特異的に結合する抗体、ポリペプチドまたは抗原結合フラグメントであって、前記抗原エピトープは、以下の（１）または（２）であり、（１）前記抗原エピトープは、ＩＦＰ３５のＡｒｇ１６３、Ａｓｎ１６４、Ａｒｇ１９１、Ｇｌｎ１９４、Ｉｌｅ１９５、Ｇｌｎ１９７、Ｐｈｅ１９８、Ｔｈｒ１９９、Ｐｒｏ２０１、Ｇｌｎ２０６、Ｐｒｏ２０８、Ａｒｇ２１０のアミノ酸部位を含み、（２）前記抗原エピトープは、ＮＭＩのＡｒｇ１８５、Ａｓｎ１８６、Ｌｙｓ２１５、Ｌｙｓ２１８、Ｌｙｓ２１９、Ｇｌｕ２２１、Ｔｙｒ２２２、Ｐｒｏ２２３、Ｔｙｒ２２５、Ｃｙｓ２３０、Ａｒｇ２３２、Ｔｈｒ２３４等のアミノ酸部位を含む、抗体、ポリペプチドまたは抗原結合フラグメント。
【0061】
Ｂ．任意の上記（１）の抗原エピトープの少なくとも一つのアミノ酸残基に結合し、かつＩＦＰ３５の活性を阻害することができる、抗体または小分子またはポリペプチド物質。
【0062】
Ｃ．任意の上記（２）の抗原エピトープの少なくとも一つのアミノ酸残基に結合し、かつＮＭＩの活性を阻害することができる、抗体または小分子またはポリペプチド物質。
【0063】
Ｄ．以下の３５ＮＩＤｍＡｂ抗体であって、軽鎖可変領域および重鎖可変領域を有し、重鎖可変領域は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、ＣＤＲ１の配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９（ＧＹＴＦＴＮＹＧ）の２５位～３２位のアミノ酸であり、ＣＤＲ２の配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９（ＩＮＴＹＴＧＥＰ）の５０位～５７位のアミノ酸であり、ＣＤＲ３の配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９（ＹＧＹＳＷＡＭＤＹ）の９８位～１０６位のアミノ酸であり、軽鎖可変領域は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、ＣＤＲ１の配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０（ＳＳＳＶＳＹ）の２６位～３１位のアミノ酸であり、ＣＤＲ２の配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０（ＤＴＳ）の４９位～５１位のアミノ酸であり、ＣＤＲ３の配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０（ＷＳＳＮＰＰＩ）の９０位～９６位のアミノ酸である、抗体。
【0064】
上記の診断における抗体、ポリペプチドまたは抗原結合フラグメントは、ＣＤＲを除く３５ＮＩＤｍＡｂの残りの位置のアミノ酸を突然変異させることによって得られる抗体であるか、あるいは、前記抗体は、３５ＮＩＤｍＡｂをヒト化することによって得られる抗体である。
【0065】
当業者は、当技術の一般的な知識及び一般的な方法に従って、上記抗体のいずれか一つのＣＤＲ配列を除く他のアミノ酸を修飾および突然変異させて得られた抗体も、本発明の保護範囲に属する。
【0066】
前記ヒト化抗体は、ＡＥ００１－Ｈ１＋Ｌ１、ＡＥ００１－Ｈ２＋Ｌ２またはＡＥ００１－Ｈ３＋Ｌ３の少なくとも一つである。これらの三つの抗体は、すべて軽鎖可変領域および重鎖可変領域を有し、重鎖可変領域は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、ＣＤＲ１の配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９（ＧＹＴＦＴＮＹＧ）の２５位～３２位のアミノ酸であり、ＣＤＲ２の配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９（ＩＮＴＹＴＧＥＰ）の５０位～５７位のアミノ酸であり、ＣＤＲ３の配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９（ＹＧＹＳＷＡＭＤＹ）の９８位～１０６位のアミノ酸であり、軽鎖可変領域は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、ＣＤＲ１の配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０（ＳＳＳＶＳＹ）の２６位～３１位のアミノ酸であり、ＣＤＲ２の配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０（ＤＴＳ）の４９位～５１位のアミノ酸であり、ＣＤＲ３の配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０（ＷＳＳＮＰＰＩ）の９０位～９６位のアミノ酸である。
【0067】
ＡＥ００１－Ｈ１＋Ｌ１の重鎖定常領域の配列は、ＡＥ００１Ｈ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）であり、軽鎖定常領域の配列は、ＡＥ００１Ｌ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）である。
【0068】
ＡＥ００１－Ｈ２＋Ｌ２の重鎖定常領域の配列は、ＡＥ００１Ｈ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）であり、軽鎖定常領域の配列は、ＡＥ００１Ｌ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）である。
【0069】
ＡＥ００１－Ｈ３＋Ｌ３の重鎖定常領域の配列は、ＡＥ００１Ｈ３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）であり、軽鎖定常領域の配列は、ＡＥ００１Ｌ３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）である。
【0070】
上記の診断における抗体、ポリペプチドまたは抗原結合フラグメントにおいて、前記抗体は、３５ＮＩＤｍＡｂまたはそのヒト化抗体における少なくとも一つのＣＤＲのアミノ酸残基を突然変異させることによって得られる抗体である。
【0071】
上記の診断における抗体、ポリペプチドまたは抗原結合フラグメントにおいて、前記３５ＮＩＤｍＡｂまたはそのヒト化抗体における少なくとも一つのＣＤＲの突然変異は、
３５ＮＩＤｍＡｂの重鎖可変領域のＣＤＲ１の２５、２６、２７、２８、２９および／または３２位のアミノ酸残基での突然変異、即ち、（２５ ＧＹＴＦＴＮＹＧ ３２）において、ＮＹ以外のアミノ酸位置での突然変異、
３５ＮＩＤｍＡｂの重鎖可変領域のＣＤＲ２の５０、５２、５５、５６および／または５７位のアミノ酸残基での突然変異、即ち、（５０ ＩＮＴＹＴＧＥＰ ５７において）、下線付きアミノ酸以外のアミノ酸位置での突然変異、
３５ＮＩＤｍＡｂの重鎖可変領域のＣＤＲ３の９８、９９、１０１、１０３、１０４、１０５および／または１０６位のアミノ酸残基での突然変異、即ち、（９８ ＹＧＹＳＷＡＭＤＹ １０６）において、下線付きアミノ酸以外のアミノ酸位置での突然変異、
３５ＮＩＤｍＡｂの軽鎖可変領域のＣＤＲ１の２６、２７、２８および／または２９位のアミノ酸残基での突然変異、即ち、（２６ ＳＳＳＶＳＹ ３１）において、下線付きアミノ酸以外のアミノ酸位置での突然変異、
３５ＮＩＤｍＡｂの軽鎖可変領域のＣＤＲ３の９０、９１、９４、９５および／または９６位のアミノ酸残基での突然変異、即ち、（９０ ＷＳＳＮＰＰＩ ９６）において下線付きアミノ酸以外のアミノ酸位置での突然変異のうちの少なくとも一つの突然変異を行うことを含む。
３５ＮＩＤｍＡｂの重鎖可変領域のＣＤＲ１の２５、２６、２７、２８、２９および／または３２位のアミノ酸残基での突然変異、即ち、（２５ ＧＹＴＦＴＮＹＧ ３２）において、ＮＹ以外のアミノ酸位置での突然変異、
３５ＮＩＤｍＡｂの重鎖可変領域のＣＤＲ２の５０、５２、５５、５６および／または５７位のアミノ酸残基での突然変異、即ち、（５０ ＩＮＴＹＴＧＥＰ ５７において）、下線付きアミノ酸以外のアミノ酸位置での突然変異、
３５ＮＩＤｍＡｂの重鎖可変領域のＣＤＲ３の９８、９９、１０１、１０３、１０４、１０５および／または１０６位のアミノ酸残基での突然変異、即ち、（９８ ＹＧＹＳＷＡＭＤＹ １０６）において、下線付きアミノ酸以外のアミノ酸位置での突然変異、
３５ＮＩＤｍＡｂの軽鎖可変領域のＣＤＲ１の２６、２７、２８および／または２９位のアミノ酸残基での突然変異、即ち、（２６ ＳＳＳＶＳＹ ３１）において、下線付きアミノ酸以外のアミノ酸位置での突然変異、
３５ＮＩＤｍＡｂの軽鎖可変領域のＣＤＲ３の９０、９１、９４、９５および／または９６位のアミノ酸残基での突然変異、即ち、（９０ ＷＳＳＮＰＰＩ ９６）において下線付きアミノ酸以外のアミノ酸位置での突然変異のうちの少なくとも一つの突然変異を行うことを含む。
【0072】
３５ＮＩＤｍＡｂの抗体重鎖可変領域のＣＤＲ１配列（２５ ＧＹＴＦＴＮＹＧ ３２）において、抗原に結合する二つのアミノ酸は、主にＡｓｎ３０およびＴｙｒ３１であり、抗体の重鎖可変領域のＣＤＲ２配列（５０ ＩＮＴＹＴＧＥＰ ５７）において、抗原に結合する三つのアミノ酸は、主にＡｓｎ５１、Ｔｙｒ５３およびＴｈｒ５４であり、抗体の重鎖可変領域のＣＤＲ３配列（９８ ＹＧＹＳＷＡＭＤＹ １０６）において、抗原に結合する二つのアミノ酸は、主にＴｙｒ１００およびＴｒｐ１０２である。上記の残基は、抗体の重鎖と抗原との間の相互作用残基と呼ぶことができる。他のＣＤＲ残基は、抗原ＩＦＰ３５に結合しないか、またはほとんど結合しないため、抗体活性に大きな影響を与えない抗体を取得するために変更を加える方が簡単である。従って、抗原と相互作用しない上記の前記ＣＤＲの残基のいずれかを変更しても、ＩＦＰ３５またはＮＭＩの抗原－抗体複合体構造の対応するエピトープアミノ酸との結合を維持することができ、本発明の保護範囲内に属するべきである。
【0073】
抗体の軽鎖可変領域のＣＤＲ１配列（２６ ＳＳＳＶＳＹ ３１）において、抗原に結合する主なアミノ酸は、Ｓｅｒ３０およびＴｙｒ３１であり、抗体の軽鎖可変領域のＣＤＲ２配列（４９ ＤＴＳ ５１）において、抗原に結合する主なアミノ酸は、Ａｓｐ４９であり、抗体の軽鎖可変領域のＣＤＲ３配列（９０ ＷＳＳＮＰＰＩ ９６）において、抗原に結合する主なアミノ酸は、Ｓｅｒ９２およびＡｓｎ９３である。上記の残基は、抗体の重鎖と抗原との間の相互作用残基と呼ぶことができる。他のＣＤＲ残基は、抗原ＩＦＰ３５に結合しないか、またはほとんど結合しないため、抗体活性に大きな影響を与えない抗体を取得するために変更を加える方が簡単である。従って、抗原と相互作用しない上記の前記ＣＤＲの残基のいずれかを変更しても、ＩＦＰ３５またはＮＭＩの抗原－抗体複合体構造の対応するエピトープアミノ酸との結合を維持することができ、本発明の保護範囲内に属するべきである。
【0074】
上記の診断における抗体、ポリペプチドまたは抗原結合フラグメントにおいて、前記３５ＮＩＤｍＡｂまたはそのヒト化抗体における少なくとも一つのＣＤＲの突然変異は、
３５ＮＩＤｍＡｂの重鎖可変領域のＣＤＲ１の３０および／または３１位のアミノ酸残基での突然変異、
３５ＮＩＤｍＡｂの重鎖可変領域のＣＤＲ２の５１、５３および／または５４位のアミノ酸残基での突然変異、
３５ＮＩＤｍＡｂの重鎖可変領域のＣＤＲ３の１００および／または１０２位のアミノ酸残基での突然変異、
３５ＮＩＤｍＡｂの軽鎖可変領域のＣＤＲ１の３０および／または３１位のアミノ酸残基での突然変異、
３５ＮＩＤｍＡｂの軽鎖可変領域のＣＤＲ３の９２および／または９３位のアミノ酸残基での突然変異のうちの少なくとも一つの突然変異を行うことを含む。
３５ＮＩＤｍＡｂの重鎖可変領域のＣＤＲ１の３０および／または３１位のアミノ酸残基での突然変異、
３５ＮＩＤｍＡｂの重鎖可変領域のＣＤＲ２の５１、５３および／または５４位のアミノ酸残基での突然変異、
３５ＮＩＤｍＡｂの重鎖可変領域のＣＤＲ３の１００および／または１０２位のアミノ酸残基での突然変異、
３５ＮＩＤｍＡｂの軽鎖可変領域のＣＤＲ１の３０および／または３１位のアミノ酸残基での突然変異、
３５ＮＩＤｍＡｂの軽鎖可変領域のＣＤＲ３の９２および／または９３位のアミノ酸残基での突然変異のうちの少なくとも一つの突然変異を行うことを含む。
【0075】
上記の診断における抗体、ポリペプチドまたは抗原結合フラグメントにおいて、前記抗体または抗原結合フラグメントは、抗原ＩＦＰ３５およびＮＭＩの識別に関与する、３５ＮＩＤｍＡｂまたはそのヒト化抗体における重鎖のＡｓｎ３０、Ｔｙｒ３１、Ａｓｎ５１、Ｔｙｒ５３、Ｔｈｒ５４、Ｔｙｒ１００およびＴｒｐ１０２の位置のアミノ酸残基のうちの２つ以上のアミノ酸残基を識別することができる抗体または抗原結合フラグメントである。
【0076】
上記の診断における抗体、ポリペプチドまたは抗原結合フラグメント，抗体または抗原結合フラグメントは、抗原ＩＦＰ３５およびＮＭＩの識別に関与する、３５ＮＩＤｍＡｂまたはそのヒト化抗体における軽鎖のＳｅｒ３０、Ｔｙｒ３１、Ａｓｐ４９、Ｓｅｒ９２およびＡｓｎ９３位のアミノ酸残基のうちの２つ以上のアミノ酸残基を識別することができる抗体または抗原結合フラグメントである。
【0077】
抗体の重鎖可変領域のＣＤＲ１配列（２５ ＧＹＴＦＴＮＹＧ ３２）において、抗原に結合する二つのアミノ酸は、主にＡｓｎ３０およびＴｙｒ３１であり、抗体の重鎖可変領域のＣＤＲ２配列（５０ ＩＮＴＹＴＧＥＰ ５７）において、抗原に結合する三つのアミノ酸は、主にＡｓｎ５１、Ｔｙｒ５３およびＴｈｒ５４であり、抗体の重鎖可変領域のＣＤＲ３配列（９８ ＹＧＹＳＷＡＭＤＹ １０６）において、抗原に結合する二つのアミノ酸は、主にＴｙｒ１００およびＴｒｐ１０２である。従って、いくつかのアミノ酸を変更することは、抗原―抗体の結合能に有益である可能性がある。上記の残基は、抗体の重鎖と抗原との間の相互作用残基と呼ぶことができる。抗原と相互作用するこれらの残基のいずれか一つまたは二つまたは三つを変更しても、ＩＦＰ３５またはＮＭＩの抗原－抗体複合体構造の対応するエピトープアミノ酸との結合を維持し、本発明の保護範囲内に属するべきである。
【0078】
抗体の軽鎖可変領域のＣＤＲ１配列（２６ ＳＳＳＶＳＹ ３１）において、抗原に結合する主なアミノ酸は、Ｓｅｒ３０およびＴｙｒ３１であり、抗体の軽鎖可変領域のＣＤＲ２配列（４９ ＤＴＳ ５１）において、抗原に結合する主なアミノ酸は、Ａｓｐ４９であり、抗体の軽鎖可変領域のＣＤＲ３配列（９０ ＷＳＳＮＰＰＩ ９６）において、抗原に結合する主なアミノ酸は、Ｓｅｒ９２およびＡｓｎ９３である。従って、これらのアミノ酸の変化のいくつかは、抗原―抗体の結合能に有益である可能性がある。上記の残基は、抗体の軽鎖と抗原との間の相互作用残基と呼ぶことができる。抗原と相互作用するこれらの残基のいずれか一つまたは二つまたは三つを変更しても、ＩＦＰ３５またはＮＭＩの抗原－抗体複合体構造の対応するエピトープアミノ酸との結合を維持し、本発明の保護範囲内に属するべきである。
【0079】
上記の診断における抗体、ポリペプチドまたは抗原結合フラグメントにおいて、前記３５ＮＩＤｍＡｂまたはそのヒト化抗体における少なくとも一つのＣＤＲを突然変異させて得られる抗体は、ＡＥ００１－５、ＡＥ００１－６、ＡＥ００１－７、ＡＥ００１－８、ＡＥ００１－９のうちの少なくとも一つである。
【0080】
ＡＥ００１－５、ＡＥ００１－６、ＡＥ００１－７、ＡＥ００１－８、ＡＥ００１－９の重鎖可変領域のＣＤＲおよび軽鎖可変領域のＣＤＲは、以下の表に示される。
【0081】
重鎖可変領域ＣＤＲ：
【表3】
【0082】
軽鎖可変領域ＣＤＲ：
【表4】
【0083】
ＡＥ００１－５、ＡＥ００１－６、ＡＥ００１－７、ＡＥ００１－８、ＡＥ００１－９の重鎖可変領域および軽鎖可変領域のＣＤＲを除く配列は、当業者がその所望に応じて改変することができる。具体的な例として、ＡＥ００１－５、ＡＥ００１－６、ＡＥ００１－７、ＡＥ００１－８、ＡＥ００１－９の重鎖可変領域および軽鎖可変領域のＣＤＲを除く配列はまた３５ＮＩＤｍＡｂ抗体の対応する配列と同じであってもよい。
【0084】
ＡＥ００１－５、ＡＥ００１－６、ＡＥ００１－７、ＡＥ００１－８、ＡＥ００１－９の定常領域の配列は、当業者がその所望に応じて改変することができる。具体的な例として、ＡＥ００１－５、ＡＥ００１－６、ＡＥ００１－７、ＡＥ００１－８、ＡＥ００１－９の定常領域の配列は、上記ＡＥ００１－Ｈ１＋Ｌ１、ＡＥ００１－Ｈ２＋Ｌ２またはＡＥ００１－Ｈ３＋Ｌ３の定常領域の配列と同じであってもよい。
【0085】
上記の診断方法および使用において、前記慢性炎症性疾患は、ＩＦＰ３５／ＮＭＩの血液または体液への異常分泌によって引き起こされる炎症反応の増加に関連しているものであり、かつ、関節炎、関節リウマチ、乾癬（鱗屑癬）、各種腸炎（ＩＢＤなど）、多発性硬化症、喘息、慢性閉塞性肺、全身性紅斑性狼瘡、慢性肝炎、慢性腎炎、慢性膵炎、脳炎、悪性腫瘍、白血病、アルツハイマー病、パーキンソン症候群、アレルギー性疾患、心血管疾患、筋骨格疾患、炎症性腸炎、肥満と糖尿病、網膜炎症性疾患、歯周炎、ブドウ膜炎などを含む。
【0086】
上記の診断方法および使用において、前記慢性炎症性疾患は、ＩＦＰ３５／ＮＭＩの血液または体液への異常分泌によって引き起こされる炎症反応の増加に関連しているものであり、かつ、関節炎、関節リウマチ、乾癬（鱗屑癬）、各種腸炎（ＩＢＤなど）、多発性硬化症、喘息、慢性閉塞性肺、全身性紅斑性狼瘡、慢性肝炎、慢性腎炎、慢性膵炎、脳炎、悪性腫瘍、白血病、アルツハイマー病、パーキンソン症候群、アレルギー性疾患、炎症性腸炎などを含む。前記慢性炎症は、多種類の炎症因子に関連していることがすでに繰り返して証明された。
【0087】
上記の診断方法および使用において、前記診断は、早期診断、病態診断および予後判定である。
【0088】
本発明は、ＩＦＰ３５の抗原エピトープをさらに提供する。ＩＦＰ３５の抗原エピトープは、ＩＦＰ３５のＡｒｇ１６３、Ａｓｎ１６４、Ａｒｇ１９１、Ｇｌｎ１９４、Ｉｌｅ１９５、Ｇｌｎ１９７、Ｐｈｅ１９８、Ｔｈｒ１９９、Ｐｒｏ２０１、Ｇｌｎ２０６、Ｐｒｏ２０８、Ａｒｇ２１０のうちの少なくとも一つのアミノ酸残基である。
【0089】
本発明は、ＮＭＩの抗原エピトープをさらに提供する。ＮＭＩの抗原エピトープは、ＮＭＩのＡｒｇ１８５、Ａｓｎ１８６、Ｌｙｓ２１５、Ｌｙｓ２１８、Ｌｙｓ２１９、Ｇｌｕ２２１、Ｔｙｒ２２２、Ｐｒｏ２２３、Ｔｙｒ２２５、Ｃｙｓ２３０、Ａｒｇ２３２、Ｔｈｒ２３４のうちの少なくとも一つのアミノ酸残基である。
【0090】
本発明は、上記エピトープに基づいて抗体を製造するための方法をさらに提供する。
【0091】
本発明でさらに提供されるＩＦＰ３５またはＮＭＩの抗体を製造するための方法は、特許請求の範囲に記載の抗原エピトープ情報のいずれかを使用することによって、ＩＦＰ３５またはＮＭＩの抗体を製造することである。
【0092】
上記ＩＦＰ３５またはＮＭＩの抗体を製造するための方法は、以下の３５ＮＩＤｍＡｂ抗体－ＩＦＰ３５／ＮＭＩ抗原複合体の構造情報および配列情報に基づいて、抗体配列を改変して、製造して改変されたＩＦＰ３５またはＮＭＩの抗体を得ることである。
【0093】
前記３５ＮＩＤｍＡｂ抗体－ＩＦＰ３５／ＮＭＩ抗原複合体の構造情報は、次のとおりである。
【0094】
抗体３５ＮＩＤｍＡｂの重鎖可変領域のＣＤＲ１配列（２５ ＧＹＴＦＴＮＹＧ ３２）において、抗原に結合する二つのアミノ酸は、主にＡｓｎ３０およびＴｙｒ３１であり、抗体の重鎖可変領域のＣＤＲ２配列（５０ ＩＮＴＹＴＧＥＰ ５７）において、抗原に結合する三つのアミノ酸は、主にＡｓｎ５１、Ｔｙｒ５３およびＴｈｒ５４であり、抗体の重鎖可変領域のＣＤＲ３配列（９８ ＹＧＹＳＷＡＭＤＹ １０６）において、抗原に結合する二つのアミノ酸は、主にＴｙｒ１００およびＴｒｐ１０２である。
【0095】
抗体３５ＮＩＤｍＡｂの軽鎖可変領域のＣＤＲ１配列（２６ ＳＳＳＶＳＹ ３１）において、抗原に結合する主なアミノ酸は、Ｓｅｒ３０およびＴｙｒ３１であり、抗体の軽鎖可変領域のＣＤＲ２配列（４９ ＤＴＳ ５１）において、抗原に結合する主なアミノ酸は、Ａｓｐ４９であり、抗体の軽鎖可変領域のＣＤＲ３配列（９０ ＷＳＳＮＰＰＩ ９６）において、抗原に結合する主なアミノ酸は、Ｓｅｒ９２およびＡｓｎ９３である。
【0096】
当業者は、特定の抗原エピトープ構造に従って、既存の元の抗体を設計および改変するのと助けることができることを一般的に知っている。元の抗体は、一般的に様々なスクリーニング技術によって得られる。エピトープ（抗原决定基）を知ることは、このフラグメントを直接使用して抗体をスクリーニングすることもできる。
【0097】
上記の抗体－抗原複合体の構造情報および配列比較情報において、（１）抗原の表面にあるアミノ酸残基を直感的にみることができ、ほとんどの抗原决定基が抗原の表面に分布しているため、これらの表面残基は、抗原决定基を見つけるのに役立ち、（２）抗原と抗体との相互作用の残基を確認できるため、抗原と抗体アミノ酸残基との間の相互作用の特徴を分析し、特徴的なアミノ酸残基を改変、設計し、抗体を最適化するのに役たち、（３）抗体の改変を導くことにより、他の相同タンパク質抗原に対する新しい抗体を得ることができる。
【0098】
抗体の遺伝子改変法（遺伝子組換法）は、一般的な遺伝子指向性突然変異技術に関し、改変された抗体遺伝子または抗体遺伝子フラグメント（抗体可変領域等）は、真核細胞（哺乳類細胞等）または原核細胞によって発現、精製されて、改変された精製モノクローナル抗体を得ることができる。
【0099】
上記の方法のいずれかによって製造された抗体も、本発明の保護範囲に属する。
【0100】
本明細書に記載の３５ＮＩＤｍＡｂ抗体は、軽鎖可変領域および重鎖可変領域を有し、重鎖可変領域は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、ＣＤＲ１の配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９（ＧＹＴＦＴＮＹＧ）の２５位～３２位のアミノ酸であり、ＣＤＲ２の配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９（ＩＮＴＹＴＧＥＰ）の５０位～５７位のアミノ酸であり、ＣＤＲ３の配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９（ＹＧＹＳＷＡＭＤＹ）の９８位～１０６位のアミノ酸であり、軽鎖可変領域は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、ＣＤＲ１の配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０（ＳＳＳＶＳＹ）の２６位～３１位のアミノ酸であり、ＣＤＲ２の配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０（ＤＴＳ）の４９位～５１位のアミノ酸であり、ＣＤＲ３の配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０（ＷＳＳＮＰＰＩ）の９０位～９６位のアミノ酸である。
【0101】
本明細書に記載の３５ＮＩＤｍＡｂ抗体において、軽鎖可変領域の配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０であり、重鎖可変領域の配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９である。
【0102】
ヒトＩＦＰ３５のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２である。
マウスＩＦＰ３５のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４である。
マウスＮＭＩのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６である。
ヒトＮＭＩのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８である。
マウスＩＦＰ３５のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４である。
マウスＮＭＩのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６である。
ヒトＮＭＩのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８である。
【0103】
本発明において、本発明の発明者らは、炎症性疾患のいくつかのマウスモデルを構築し、かつこれらの炎症性疾患動物の血清中のＩＦＰ３５およびＮＭＩの量を検出して、ＩＦＰ３５／ＮＭＩに関連する炎症性疾患を見つける。本発明の発明者らによって発見されたＩＦＰ３５およびＮＭＩは、多発性硬化症等のいくつかの慢性炎症性疾患と密接に関連しており、その高い血清含有量は、多発性硬化症の発症と密接に関連しており、ＩＦＰ３５／ＮＭＩ遺伝子ノックアウトまたはＩＦＰ３５／ＮＭＩに対する中和抗体の使用は、多発性硬化症の症状を軽減することができる。従って、本発明の発明者らは、ＩＦＰ３５またはＮＭＩの活性を阻害することが、多発性硬化症等の慢性疾患を治療するために使用されると考えられる。血清または体液（例えば、脳脊髄液）中のＩＦＰ３５およびＮＭＩの量の検出は、慢性炎症性疾患の診断に使用されることができる。
【0104】
これに基づいて、本発明の発明者らは、ＩＦＰ３５を阻害することができる中和抗体を開発し、抗体の阻害メカニズムをより明確に開示するために、本発明の発明者らは、当該中和抗体と抗原ＩＦＰ３５の一つのＮＩＤドメインとの複合体の三次元結晶構造をさらに分析した。この複合体の構造を通じて、本発明の発明者らは、抗体の構造、抗原構造および抗体識別エピトープ、抗原－抗体結合モードおよび重要な相互作用残基などを開示することができ、この構造を使用して、抗体の最適化改変を導いて、結合能および増強識別の特異性を向上させ、抗体の中和性活性を向上させることができる。さらに、ＩＦＰ３５およびＮＭＩ配列での高度な相同性により、これに基づいて、ＮＭＩタンパク質を識別する能力を向上させる抗体を設計および改変することにより、ＮＭＩに対する特異的抗体および同時にＩＦＰ３５とＮＭＩとに対する二重特異的抗体を開発することができる。
【0105】
慢性炎症部分：本発明の発明者らは、いくつかの炎症性疾患においてＩＦＰ３５またはＮＭＩの発現が増加するどうかを検出した。本発明の発明者らは、多発性硬化症（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ：ＭＳ）疾患のマウスモデルにおいて、血清中のＮＭＩの量が有意に上昇したことを発見した。ＩＦＰ３５およびＮＭＩを遺伝子ノックアウトした後、多発性硬化症（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）疾患のマウスの症状は、大幅に軽減された。ＩＦＰ３５に対する中和抗体の使用は、ＭＳの症状を緩和し、疾患の治療または改善の目的を達成することができる。
【0106】
本発明の別の部分の内容において、本発明の発明者らは、インフルエンザウイルスおよび宿主免疫メカニズムを研究している間に、人体において新しいタイプのＤＡＭＰ様炎症因子ＩＦＰ３５ファミリータンパク質（ＩＦＰ３５およびＮＭＩを含む）を発見した。このようなタイプの因子は、正常なヒトおよびマウスの血清では非常に低いか、または検出可能なレベル（検出線より下のレベル）より低く、病原感染の場合、免疫細胞（マクロファージ）から血液に急速に放出されることができ、免疫細胞を迅速に促進して、ＴＮＦ、ＩＬ６等の炎症因子を分泌し、生体の炎症反応を活性化することができ、血清中の含有量が炎症反応の程度と正の相関があり、敗血症の患者からのサンプル（試料）を検出する場合、血液中のＩＦＰ３５およびＮＭＩの量がより高いレベルに達した場合（例えば、ＩＦＰが数百ｐｇ／ｍＬに達した場合）、患者の死亡率がより高いことが分かった。
【0107】
本発明の発明者らは、インフルエンザウイルスをモデルとして使用して、そのような炎症因子とウイルス感染との間の関係を研究し、野生型マウスと比較して、ＩＦＰ３５および／またはＮＭＩファミリータンパク質遺伝子ノックアウトマウスの体重減少の状況は、大幅に緩和され、臨床症状は、有意に軽減され、インフルエンザウイルス感染による肺損傷は、有意に軽減され、生存率は、有意に向上される。ＩＦＰ３５および／またはＮＭＩを使用した中和抗体の治療は、遺伝子ノックアウトと同等の効果を達成し、罹患したマウスの症状を大幅に軽減し、インフルエンザウイルス感染による死亡率を大幅に低下させることができる。
【0108】
上記の研究結果に基づいて、中国および世界が新しい新型コロナウイルス肺炎（ＣＯＶＩＤ－１９）との戦いを探索している一般的な状況下で、本発明の発明者らは、この炎症因子がＣＯＶＩＤ－１９感染の血液検出マーカーとして使用され、医療スタッフが患者の疾患の重症度と予後を判断するのに役立つことを探索し、過剰な炎症反応を阻害するための標的として、ウイルスによって引き起こされる過剰な炎症反応（または敗血症と呼ぶ）の治療に使用されることができ、かつこれにより本発明の一つまたは複数の発明を構築した。
【0109】
研究結果によると、新型コロナウイルスＣＯＶＩＤ－１９に感染された重症／重篤の患者の血清中のＩＦＰ３５およびＮＭＩのレベルが有意に上昇していることを示し、ＩＦＰ３５およびＮＭＩが重症／重篤の患者の診断または診断補助指標として使用されて、医療スタッフを支援するための警告を提供することができる。さらに、ＩＦＰ３５およびＮＭＩを標的とするインフルエンザウイルス研究結果に組み合わせて、ＩＦＰ３５およびＮＭＩの阻害剤薬物（例えば、抗体薬物）は、ＣＯＶＩＤ－１９によって引き起こされる過剰な炎症反応疾患の治療に使用されることが期待される。インフルエンザウイルスであろうと新型コロナウイルスＣＯＶＩＤ－１９であろうと、人体に感染された後、ＩＦＰ３５およびＮＭＩが血液および体液に分泌される。この二つの炎症因子ＩＦＰ３５およびＮＭＩのいずれかの遺伝子がノックアウトされるか、または中和抗体によって遺伝子の一つが阻害された後、感染された体の炎症反応が軽減され、死亡率が低下し、これらの結果は、分泌されたＩＦＰ３５およびＮＭＩがウイルス（インフルエンザウイルスおよび新型コロナウイルスＣＯＶＩＤ－１９を例として）感染の重症度に牽連しており、これらのウイルスによって引き起こされる体の炎症反応の指標として、抗体薬物、ポリペプチド薬物または化学薬物等の阻害剤の治療標的となることができる。
【0110】
定義
別に定義しない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書で引用されるすべての特許、特許出願（公開または未公開）および他の刊行物は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。この部分に説明される定義が本明細書の特許、出願、公開された出願および他の刊行物に組み込まれる定義と反対または一致しない場合、この部分に説明される定義を基準とする。
別に定義しない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書で引用されるすべての特許、特許出願（公開または未公開）および他の刊行物は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。この部分に説明される定義が本明細書の特許、出願、公開された出願および他の刊行物に組み込まれる定義と反対または一致しない場合、この部分に説明される定義を基準とする。
【0111】
本明細書でのウイルスは、感染された体の炎症反応、特に、過度／重度の炎症反応（炎症因子ストーム）を引き起こすことができるウイルスを含み、コロナウイルス科（例えば、ＣＯＶＩＤ－１９、ＳＡＲＳ、ＭＥＲＳウイルスを含むコロナウイルス等）、オルトミクソウイルス科（例えば、Ａ型インフルエンザウイルス等のインフルエンザウイルス）、マイナス鎖ＲＮＡウイルスオーダーの他のウイルス（エボラウイルス、ラッサウイルス、マールブルグウイルス、クリミアコンゴ出血熱ウイルス等）、レトロウイルス科（例えば、ＨＩＶ－１（ＨＴＬＶ－ＩＩＩ、ＬＡＶまたはＨＴＬＶ－ＩＩＩ／ＬＡＶまたはＨＩＶ－ＩＩＩとも呼ばれる）ヒト免疫不全ウイルス等）、ならびに例えば、ＨＩＶ－ＬＰ、ピコルナウイルス科（ポリオウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、エンテロウイルス、ヒトコクサッキーウイルス、ライノウイルス、エコーウイルス等）、カリシウイルス科（Ｃａｌｃｉｖｉｒｉｄａｅ）（胃腸炎を引き起こす細菌株等）、トガウイルス科（ウマ脳炎ウイルス、風疹ウイルス等）、フラビウイルス科ウイルス（ジカウイルス、ウエストナイルウイルス、デング熱ウイルス、ハンタウイルス等）、ラブドウイルス科（水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス等）、フィロウイルス科（エボラウイルス等）、パラミクソウイルス科（パラインフルエンザウイルス、おたふく風邪ウイルス、はしかウイルス、呼吸器合胞体ウイルス）、二本鎖ＲＮＡウイルス科（ブンガ（ｂｕｎｇａ）ウイルス、静脈炎ウイルスおよびナイロ（Ｎａｉｒｏ）ウイルス等）、腎炎ウイルス科（出血熱ウイルス等）、レオウイルス科ロタウイルス）、二重抗体ウイルス科肝炎ウイルス科（Ｂ型肝炎ウイルス等）、パルボウイルス科（パルボウイルス等）、パピローマウイルス科（パピローマウイルス、ポリオーマウイルス等）、アデノウイルス科（ほとんどのアデノウイルス）、ヘルペスウイルス科（単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）１および２、水痘帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヘルペスウイルス等）、ポックスウイルス（天然痘ウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス等）および虹色ウイルス（アフリカのブタ熱ウイルス等）、Ｃ型肝炎ウイルスおよび未分類のウイルス（例えば、δ型肝炎（Ｂ型肝炎ウイルスの欠陥衛星と見なされる）、ノーウォークと関連ウイルス、およびアストロウイルス等）等の他の分離株を含むが、これらに限定されない。
【0112】
本明細書における「生体試料」とは、血液、血漿、血清、脳脊髄液、肺胞洗浄液、尿、汗、糞便などを含むがこれらに限定されない、ウイルスに感染された個体から得られた細胞分泌物を含むサンプルを指す。
【0113】
本明細書における「個体」は、特定の種またはサンプルタイプに限定されない。例えば、「個体」という用語は、患者、通常は人間の患者を指すことができる。しかしながら、当該用語は、ヒトに限定されないため、ヒト以外の様々な動物または哺乳類種を含む。「哺乳類」とは、哺乳類（哺乳動物）種の任意の種を指す。通常，本明細書で使用される「哺乳類」という用語は、ヒト、ヒト被験者またはヒト患者を指す。「哺乳類」とは、実験的、伴侶的または経済的な非ヒト哺乳類等の非ヒト哺乳類種の任意の種を指す。例示的な非ヒト哺乳類は、マウス、ラット、ウサギ、ネコ、イヌ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、サル、ゴリラおよびチンパンジーを含む。
【0114】
本明細書における「治療有効量」または「有効量」とは、細胞、組織または被験者に単独で、または他の治療薬と組み合わせて投与して、被験者の異常に高いレベルのＩＦＰ３５および／またはＮＭＩに関連する疾患または不快感を予防または改善する場合に有効な治療薬の量を指す。治療有効用量とは、関連する医学的不快感の治療、治癒、予防または緩和、またはこのような病況の治療、治癒、予防または緩和の速度の増加などの症状の改善を引き起こすのに十分な治療薬の量を指す。単独で投与される単一の有効成分に適用される場合、治療有効量とは、当該成分のみを指す。組み合わせに適用される場合、治療有効量とは、組み合わせて、連続して、または同時に投与されるかどうかにかかわらず、治療効果をもたらす有効成分の組み合わせ量を指す。いくつかの実施形態において、「特定の疾患を治療するための化合物の有効量」は、疾患に関連する症状を軽減するか、または何らかの方法で軽減するのに十分な量である。そのような量は、単回投与として投与することができるか、または効果的であるようなスケジュールに従って投与することができる。前記量は、疾患を治癒することができるが、通常は、疾患の症状を改善するために投与される。望ましい症状の緩和を達成するために、反復投与が必要になる場合がある。
【0115】
本明細書における「薬学的に許容される担体」という用語は、薬物投与と適合性のあるすべての溶媒、分散媒体、コーティング、等張剤および吸収遅延剤を含むことを指す。薬物活性物質のためのこれらの媒体および試薬の使用は、当技術分野でよく知られている。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎら、Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２０版、（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ、Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ２００３）を参照する。従来の媒体または試薬が活性化合物と適合しない場合を除くと、組成物におけるそのような使用を考慮する。
【0116】
本明細書で使用される「阻害剤」という用語は、例えば、ＩＦＰ３５および／またはＮＭＩと別の分子（例えば、その基質）との相互作用を妨害するか、またはＩＦＰ３５および／またはＮＭＩをコードする遺伝子の発現を低下させる等のＩＦＰ３５および／またはＮＭＩのタンパク質レベルを低下させることにより、ＩＦＰ３５および／またはＮＭＩの生物学効果に悪影響を及ぼすことができる任意の分子を指す。阻害剤は、ＩＦＰ３５および／またはＮＭＩまたはＩＦＰ３５および／またはＮＭＩをコードする核酸と相互作用する「直接的阻害剤」であってもよいか、またはＩＦＰ３５および／またはＮＭＩまたはＩＦＰ３５および／またはＮＭＩをコードする核酸と相互作用しないが、調節経路においてＩＦＰ３５および／またはＮＭＩの上流または下流と相互作用する「間接的阻害剤」であってもよい。阻害剤は、特異的阻害剤であってもよい。当業者は、特異的阻害剤の使用が理想的であるが、具体的な状況に応じて、多機能または普遍的なタンパク質阻害剤の使用も選択可能であるということを理解することができる。上記のように、阻害剤は、発現阻害剤、機能阻害剤、または発現と機能とを同時に阻害することができる阻害剤であってもよい。いくつかの実施形態において、阻害剤は、ＩＦＰ３５および／またはＮＭＩの転写および／または翻訳レベルに作用して、生成される機能的ＩＦＰ３５および／またはＮＭＩの量を減少させることができる阻害剤である。いくつかの関連する実施形態において、阻害剤は、ｄｓＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡまたはリボザイムを含むが、これらに限定されない。標的タンパク質の発現レベルを低下させるためのＲＮＡ干渉／サイレンシング技術、アンチセンス核酸技術またはリボザイム技術の使用は、当業者によく知られており、標的タンパク質（例えば、ＩＦＰ３５および／またはＮＭＩ）の配列構造に従って適切なｄｓＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡまたはリボザイム分子を設計すること、ならびに対応する製造および試験も、当業者によって容易に達成される。いくつかの実施形態において、阻害剤は、ＩＦＰ３５および／またはＮＭＩの機能／活性を阻害することができる阻害剤である。いくつかの関連する実施形態において、阻害剤は、ＩＦＰ３５および／またはＮＭＩに対する抗体またはその抗原結合フラグメント、小分子化合物を含むが、これらに限定されない。本発明で使用されることができる抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を含み得る。さらに、抗体は、天然の供給源または組換えの供給源に由来する免疫グロブリン全体であってもよい。抗体は、例えば、抗体全体として、または抗体フラグメントとして、または相補性決定領域等の他の免疫学的活性フラグメントとして、様々な形態で存在することができる。同様に、抗体は、機能的な抗原結合ドメイン、即ち、重鎖および軽鎖可変ドメインを有する抗体フラグメントとして存在することができる。同様に、抗体フラグメントは、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）２、ｓｃＦｖ（単鎖Ｆｖ）、ｄＡｂ（単一ドメイン抗体）、二重特異的抗体、二本鎖抗体および三本鎖抗体等から選択されることができるが、これらに限定されない。
【0117】
一方で、本発明は、ウイルスに感染された個体の炎症反応の程度を診断または評価する方法を提供し、前記個体から得られた生体試料中のインターフェロン誘導タンパク質３５ｋＤ（ＩＦＰ３５）および／またはＮ－Ｍｙｃ相互作用タンパク質（ＮＭＩ）の量を測定するステップを含む。
【0118】
いくつかの実施形態において、前記方法は、重症または重篤の罹患個体を診断または診断補助ために使用される。
【0119】
いくつかの実施形態において、前記ウイルスは、コロナウイルス科のウイルス、例えば新型コロナウイルス（ＣＯＶＩＤ－１９）、ＳＡＲＳウイルス、ＭＥＲＳウイルスであるか、またはオルトミクソウイルス科のウイルス、例えばインフルエンザウイルス（例えばＡ型インフルエンザウイルス）である。
【0120】
いくつかの実施形態において、生体試料中のＩＦＰ３５および／またはＮＭＩの量を測定することは、生体試料中のＩＦＰ３５および／またはＮＭＩのタンパク質含有量を測定することであるか、またはｍＲＮＡ含有量等の生体試料中のＩＦＰ３５および／またはＮＭＩの核酸レベルの発現量を測定することである。
【0121】
いくつかの実施形態において、個体は哺乳類、例えばヒトである。
いくつかの実施形態において、生体試料は、血液、血漿、血清、脳脊髄液または肺胞洗浄液である。
いくつかの実施形態において、生体試料は、血液、血漿、血清、脳脊髄液または肺胞洗浄液である。
【0122】
一方で、本発明は、ウイルスに感染された個体の炎症反応の程度を診断または評価するためのキットを提供し、前記個体から得られた生体試料中のインターフェロン誘導タンパク質３５ｋＤ（ＩＦＰ３５）および／またはＮ－Ｍｙｃ相互作用タンパク質（ＮＭＩ）の量を測定するための試薬を含む。
【0123】
いくつかの実施形態において、キットは、重症または重篤の罹患個体を診断または診断補助するために使用される。
いくつかの実施形態において、前記ウイルスは、コロナウイルス科のウイルス、例えば新型コロナウイルス（ＣＯＶＩＤ－１９）、ＳＡＲＳウイルス、ＭＥＲＳウイルスであるか、またはオルトミクソウイルス科のウイルス、例えばインフルエンザウイルス（例えばＡ型インフルエンザウイルス）である。
いくつかの実施形態において、前記ウイルスは、コロナウイルス科のウイルス、例えば新型コロナウイルス（ＣＯＶＩＤ－１９）、ＳＡＲＳウイルス、ＭＥＲＳウイルスであるか、またはオルトミクソウイルス科のウイルス、例えばインフルエンザウイルス（例えばＡ型インフルエンザウイルス）である。
【0124】
いくつかの実施形態において、生体試料中のＩＦＰ３５および／またはＮＭＩの量を測定することは、生体試料中のＩＦＰ３５および／またはＮＭＩのタンパク質含有量を測定することであり、前記試薬は、例えばＩＦＰ３５および／またはＮＭＩに特異的に結合する抗体を含む。
【0125】
いくつかの実施形態において、生体試料中のＩＦＰ３５および／またはＮＭＩの量を測定することは、生体試料中のＩＦＰ３５および／またはＮＭＩの核酸の発現レベル、例えばｍＲＮＡ含有量を測定することであり、前記試薬は、例えばＩＦＰ３５および／またはＮＭＩのｃＤＮＡ配列に対して設計された特異的増幅プライマーを含む。
【0126】
いくつかの実施形態において、個体は哺乳類、例えばヒトである。
いくつかの実施形態において、前記試薬は、前記生体試料を処理してタンパク質または核酸物質を抽出するための試薬を含み、前記生体試料は、例えば、血液、血漿、血清、脳脊髄液または肺胞洗浄液である。
いくつかの実施形態において、前記試薬は、前記生体試料を処理してタンパク質または核酸物質を抽出するための試薬を含み、前記生体試料は、例えば、血液、血漿、血清、脳脊髄液または肺胞洗浄液である。
【0127】
一方で、本発明は、ウイルスに感染された個体の炎症反応を治療または緩和するための方法を提供し、治療有効量のインターフェロン誘導タンパク質３５ｋＤ（ＩＦＰ３５）および／またはＮ－Ｍｙｃ相互作用タンパク質（ＮＭＩ）の阻害剤を前記個体に投与するステップを含む。
【0128】
いくつかの実施形態において、前記個体は、重症または重篤の罹患個体である。
いくつかの実施形態において、前記ウイルスは、コロナウイルス科のウイルス、例えば新型コロナウイルス（ＣＯＶＩＤ－１９）、ＳＡＲＳウイルス、ＭＥＲＳウイルスであるか、またはオルトミクソウイルス科のウイルス、例えばインフルエンザウイルス（例えばＡ型インフルエンザウイルス）である。
いくつかの実施形態において、前記ウイルスは、コロナウイルス科のウイルス、例えば新型コロナウイルス（ＣＯＶＩＤ－１９）、ＳＡＲＳウイルス、ＭＥＲＳウイルスであるか、またはオルトミクソウイルス科のウイルス、例えばインフルエンザウイルス（例えばＡ型インフルエンザウイルス）である。
【0129】
いくつかの実施形態において、前記ＩＦＰ３５および／またはＮＭＩの阻害剤は、ＩＦＰ３５および／またはＮＭＩの機能阻害剤または発現阻害剤である。
【0130】
いくつかの実施形態において、前記ＩＦＰ３５および／またはＮＭＩの機能阻害剤は、ＩＦＰ３５および／またはＮＭＩの抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または小分子化合物である。
【0131】
いくつかの実施形態において、前記ＩＦＰ３５および／またはＮＭＩの発現阻害剤は、ＩＦＰ３５および／またはＮＭＩの転写および／または翻訳レベルに作用することにより、生成された機能的ＩＦＰ３５および／またはＮＭＩの量を減少させることができる阻害剤、例えばｄｓＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡまたはリボザイムである。
【0132】
いくつかの実施形態において、前記個体は哺乳類、例えばヒトである。
一方で、本発明は、治療有効量のインターフェロン誘導タンパク質３５ｋＤ（ＩＦＰ３５）および／またはＮ－Ｍｙｃ相互作用タンパク質（ＮＭＩ）の阻害剤と、薬学的に許容される担体とを含む、ウイルスに感染された個体の炎症反応を治療または緩和するための医薬組成物を提供する。
一方で、本発明は、治療有効量のインターフェロン誘導タンパク質３５ｋＤ（ＩＦＰ３５）および／またはＮ－Ｍｙｃ相互作用タンパク質（ＮＭＩ）の阻害剤と、薬学的に許容される担体とを含む、ウイルスに感染された個体の炎症反応を治療または緩和するための医薬組成物を提供する。
【0133】
いくつかの実施形態において、前記個体は、重症または重篤の罹患個体である。
いくつかの実施形態において、前記ウイルスは、コロナウイルス科のウイルス、例えば新型コロナウイルス（ＣＯＶＩＤ－１９）、ＳＡＲＳウイルス、ＭＥＲＳウイルスであるか、またはオルトミクソウイルス科のウイルス、例えばインフルエンザウイルス（例えばＡ型インフルエンザウイルス）である。
いくつかの実施形態において、前記ウイルスは、コロナウイルス科のウイルス、例えば新型コロナウイルス（ＣＯＶＩＤ－１９）、ＳＡＲＳウイルス、ＭＥＲＳウイルスであるか、またはオルトミクソウイルス科のウイルス、例えばインフルエンザウイルス（例えばＡ型インフルエンザウイルス）である。
【0134】
いくつかの実施形態において、前記ＩＦＰ３５および／またはＮＭＩの阻害剤は、ＩＦＰ３５および／またはＮＭＩの機能阻害剤または発現阻害剤である。
【0135】
いくつかの実施形態において、前記ＩＦＰ３５および／またはＮＭＩの機能阻害剤は、ＩＦＰ３５および／またはＮＭＩの抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または小分子化合物である。
【0136】
いくつかの実施形態において、前記ＩＦＰ３５および／またはＮＭＩの発現阻害剤は、ＩＦＰ３５および／またはＮＭＩの転写および／または翻訳レベルに作用することにより、生成された機能的ＩＦＰ３５および／またはＮＭＩの量を減少させることができる阻害剤、例えばｄｓＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡまたはリボザイムである。
【0137】
いくつかの実施形態において、前記個体は哺乳類、例えばヒトである。
【発明の効果】
【0138】
上記の詳細な説明は、当業者が本発明の内容をより明確に理解できるようにするためだけのものであり、いかなる側面においてもそれを制限することを意図するものではないことを理解されたい。当業者は、記載された実施形態に様々な修正および変更を加えることができる。
【図面の簡単な説明】
【0139】
【図1】ＭＯＧおよびＨ３７ＲａがマウスマクロファージからのＮＭＩ放出を誘導する図である。ＭＯＧ３５－５５およびＨ３７Ｒａを検出してインビトロでマクロファージ（ＢＭＤＭ、Ｒａｗ２６４．７およびＴｈｐ１の三つのマクロファージ細胞株）を刺激し、細胞濃度を１ｍＬあたり１０６細胞に調節し、ＭＯＧ ５０ｎｇ／ｍＬおよび／またはＨ３７Ｒａ １００ｎｇ／ｍＬを８時間インキュベートし、細胞上清からのＮＭＩ分泌を検出する。この図は、ＭＯＧ３５－５５とＨ３７Ｒａとの組み合わせがマウスマクロファージからのＮＭＩの分泌を誘導することができ、Ｈ３７Ｒａが主な役割を果たしていることを示す。
【図2】ＬＰＳがミクログリアＢＶ２からのＮＭＩ放出を誘導する図である。（ａ）１００ｎｇ／ｍＬのＬＰＳとＢＶ２細胞とを共培養し、０、２、４、６、８時間でのＮＭＩの分泌発現を検出し、（ｂ）０、１０、２０、５０、１００ｎｇ／ｍＬのＬＰＳを検出してＢＶ２細胞を８時間刺激し、上清のＮＭＩ発現を検出する。この図は、中枢神経系が炎症を起こし、ミクログリアが活性化されると、ＮＭＩを分泌されることもできる。
【図3】ｍＮＭＩタンパク質がマウスミクログリアのＭ１型分極を誘導する図である。（ａ）ミクログリアＭ１型マーカー分子であるＴＮＦ、ｉＮＯＳ、ＩＬ１βのｍＲＮＡの発現は、ＬＰＳおよびＮＭＩの刺激下で増加し、（ｂ）ミクログリアＭ２型マーカー分子であるＡｒｇ１、ＩＬ１０、ＴＧＦ－β、ＣＤ２０６のｍＲＮＡは、ＬＰＳおよびＮＭＩ刺激にほとんど変化が大きくなく、この図は、ｍＮＭＩがミクログリアを炎症誘導性Ｍ１型に向かって分極させることができることを示す。
【図4】ＥＡＥモデリング後の様々な時点でのマウスにおけるＮＭＩ分泌発現を示す図である。偽処置マウスおよびＥＡＥマウスにおいて、発症前期間（７日）、初期発症期間（１２日）、発症ピーク期間（２０日）、疾患緩和期間（３０日）におけるＮＭＩの発現を検出する。この図は、マウスのＭＳ発症の各期間におけるＮＭＩの発現量がＭＳの発症程度と密接に関連していることを示す。
【図5】ＥＡＥモデリング後のマウス脊髄組織におけるＮＭＩおよび他の炎症因子の発現を示す図である。ＥＡＥモデリング後の様々な時点で、マウス脊髄組織内におけるＮＭＩおよび主な炎症因子であるｉＮＯＳ、ＣＯＸ２、ＨＭＧＢ１の発現を検出する。正常なマウスの脊髄ではｉＮＯＳをほとんど検出せず、ＭＳがピーク期間に入ると、ｉＮＯＳ発現量は、最高レベルに達し、ＣＯＸ２およびＨＭＧＢ１は、ＭＳの発症とともに増加し、ＮＭＩの正常な発現量はより低く、ＭＳが発症し始めると発現量が最も高くなる。この図は、ＭＳの発生とともにＮＭＩおよび他の炎症因子の発現が増加することができ、ＮＭＩは比較的早い時期で上方制御される因子の一つである。
【図6】ＮＭＩノックアウトがマウスのＭＳの臨床症状を軽減する図である。（ａ）ＮＭＩノックアウトは、マウスのＭＳの臨床スコアを低下させ、（ｂ）ＮＭＩノックアウトは、脊髄の炎症性細胞浸潤を減少させ、（ｃ）ＮＭＩノックアウトは、マウスの脊髄脱髄症状を軽減し、ＮＭＩノックアウトは、マウスの脊髄の白質（ｄ）および灰白質（ｅ）内側のアストロサイトおよびミクログリアの活性化状況を減少させる。この図は、ＮＭＩが神経炎症を促進し、ＭＳの臨床症状を悪化させ、ＮＭＩをノックアウトした後マウスのＭＳの症状を軽減することを示す。
【図7】ＩＦＰ３５抗体がマウスのＭＳの症状を軽減できることを示す図である。（ａ）精製されたＩＦＰ３５抗体において、５５ｋＤの位置は、抗体の重鎖であり、２５ｋＤの位置は、抗体の軽鎖である。（ｂ）ＩＦＰ３５抗体に１００μｇ（５ｍｇ／ｋｇ）を１０日間（１２～２２日）静脈内注射マウスのＭＳの症状を緩和する。
【図8】ＮＭＩノックアウトは、ＭＳマウスの脊髄白血球の浸潤および炎症を軽減することができる。（ａ）ＮＭＩノックアウトは、脊髄炎症におけるＣＤ４５陽性白血球の浸潤を減少させ、（ｂ）ＮＭＩノックアウトは、脊髄炎症因子ｉＮＯＳおよびＣＯＸ２の発現を低下させる。
【図9】ＬＰＳ誘導性炎症のマウスにおけるＮＭＩとＰＣＴとの比較を示す図である。ＬＰＳ（ｉ．ｐ．、１０ｍｇ／ｋｇ）でＬＰＳ誘導性炎症モデルを構築した後、ＮＭＩ（ａ）およびＰＣＴ（ｂ）は時間に伴って変化し、ＣＬＰがマウス炎症モデルを構築した１６時間後のＮＭＩ（ｃ）およびＰＣＴ（ｄ）の含有量。この図は、ＰＣＴに比較して、ＮＭＩが炎症の発生を早期（１～２時間）に検出でき、ＮＭＩのバックグラウンド発現がＰＣＴよりも少ないことを示し、ＮＭＩがＰＣＴよりも優れた臨床リスク指数検出指標として使用されることができることを示す。
【図10】インフルエンザウイルスＡ／プエルトリコ（Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ）／８／１９３４（Ｈ１Ｎ１）毒株がマウスを感染した後マウス血清中の分泌されたＮＭＩ／ＩＦＰ３５の存在を検出する図である。図ＡおよびＢに示されるように、血清中のＩＦＰ３５（ＩＦＩ３５とも呼ばれる）およびＮＭＩのタンパク質レベルは、ウイルス感染後の三日目に有意に上昇し、インフルエンザウイルス感染が野生型マウスに炎症反応を引き起こす可能性があることを示す。ＮＭＩまたはＩＦＰ３５遺伝子ノックアウトマウスの血清中のＩＦＰ３５（ＩＦＩ３５とも呼ばれる）およびＮＭＩのタンパク質レベルは、有意に上昇していない。同時に、ＩＦＩ３５－／－遺伝子ノックアウトマウスの血清中のＮＭＩのタンパク質レベルもＷＴマウスよりも有意に低いことが分かり、ＮＭＩ－／－遺伝子ノックアウトマウスの血清中のＩＦＩ３５のタンパク質レベルもＷＴマウスよりも兼チョン低い（図Ａおよび図Ｂ）。ＩＦＩ３５とＮＭＩとの間の分泌が相互に関連し、相互作用していることを示す。同時に、本発明の発明者らは、インフルエンザウイルス感染が血清中のＩＬ－６およびＴＮＦ－αの分泌レベルを増加させることができることを発見し（図Ｃおよび図Ｄ）、ＮＭＩまたはＩＦＰ３５遺伝子ノックアウトマウスの血清中のＩＬ－６およびＴＮＦ－αのタンパク質レベルは、野生型マウスよりも有意に低い。
【図11】開始マウス抗体ＡＥ００１－ＶＨ＋ＶＬ（３５ＮＩＤｍＡｂ）およびヒト化抗体（ヒト化改変された抗体）ＡＥ００１－Ｈ１＋Ｌ１、ＡＥ００１－Ｈ２＋Ｌ２、ＡＥ００１－Ｈ３＋Ｌ３の抗原結合能試験を示す図である。
【図12】様々な改変後の抗体の発現および精製の結果を示す図である。。
【図13】様々な改変後の抗体の抗原結合能試験を示す図である。
【図14】抗原ＩＦＰ３５ ＮＩＤおよび中和抗体３５ＮＩＤｍＡｂのＦａｂ複合体の構造図である。
【図15】健康な人（健常者）および新型コロナウイルス（ＣＯＶＩＤ－１９）感染が確認された患者の血清中のＩＦＰ３５およびＮＭＩ含有量の測定のドットブロットを示す図である。ここで、各ドットは健康な人または患者の血清サンプルを示す。
【図16】インフルエンザウイルスがインビボおよびインビトロでＮＭＩ生成を引き起こすことの検証を示す図である。（Ａ）インフルエンザウイルスに感染された患者の血清中のＮＭＩ含有量、（Ｂ）インフルエンザウイルスによって刺激されたＴＨＰ１細胞の上清液中のＮＭＩ含有量、（Ｃ）インフルエンザウイルスによって刺激されたＡ５４９細胞の上清液中のＮＭＩ含有量、（Ｄ）インフルエンザウイルス毒株ＰＲ８またはＭｏｃｋに感染されたＣ５７ＢＬ／６野生型マウスの血清ＮＭＩ含有量、（Ｅ）インフルエンザウイルスによって刺激されたＲＡＷ２６４．７細胞の上清液中のＮＭＩ含有量、（Ｆ）インフルエンザウイルス毒株ＰＲ８またはＭｏｃｋに感染されたＡ５４９細胞中のＮＭＩ／ＩＦＰ３５のタンパク質発現レベルを示す。（＊はＰ＜０．０５を表し、＊＊はＰ＜０．０１を表し、＊＊＊はＰ＜０．００１を表す）
【図17】インフルエンザウイルスがインビボおよびインビトロでＩＦＰ３５生成を引き起こすことの検証を示す図である。（Ａ）インフルエンザウイルスによって刺激されたＲＡＷ２６４．７細胞の上清液中のＩＦＰ３５含有量、（Ｂ）インフルエンザウイルスに感染された患者の血清中のＩＦＰ３５含有量、（Ｃ）ＰＲ８またはＭｏｃｋに感染されたＣ５７ＢＬ／６野生型マウスの血清ＩＦＰ３５含有量を示す。＊はＰ＜０．０５を表し、＊＊はＰ＜０．０１を表し、＊＊＊はＰ＜０．００１を表す。
【図18】１６人のインフルエンザ患者および１０人の健康な人の血清中のＮＭＩおよびＩＦＰ３５含有量を示す図である。集中治療室（ＩＣＵ）で重度の肺炎に発展した患者は、塗りつぶされた四角でマークされる。
【図19】インフルエンザウイルス毒株ＰＲ８に感染された後のＮＭＩ遺伝子ノックアウトマウスおよび野生型マウスの様々な指標を示すずである。（Ａ）体重変化（％）、（Ｂ）臨床スコア、ここで、マウスの倦怠感、忍び寄り、しわの寄った毛皮、腰下ろし、急速な浅い呼吸、聞こえるラ音、（健康）０≦スコア≦５（死にかけ）、（Ｃ）肺組織のＨ＆Ｅ染色、スケールは、１００μｍであり、（Ｄ）生存率（％）。２×１０６ｐｆｕのＰＲ８ウイルスでマウスを感染させることを示す。ログランク検定（ｌｏｇ－ｒａｎｋ ｔｅｓｔ）を使用して、異なる処理におけるマウスの生存率に有意な差があるかどうかを分析する。＊＊はＰ＜０．０１を表す。
【図20】インフルエンザウイルス毒株ＰＲ８に感染された後のＩＦＰ３５遺伝子ノックアウトマウスおよび野生型マウスの様々な指標を示す図である。（Ａ）体重変化（％）、（Ｂ）肺組織のＨ＆Ｅ染色、スケールは、１００μｍであり、（Ｃ）生存率（％）を示す。２×１０６ｐｆｕのＰＲ８ウイルスでマウスを感染させる。ログランク検定を使用して、異なる処理におけるマウスの生存率に有意な差があるかどうかを分析する。＊はＰ＜０．０５を表す。
【図21】ＩＦＰ３５中和抗体の治療效果を示す図である。（Ａ）実験プロトコル、（Ｂ）体重変化（％）、（Ｃ）臨床スコア、（Ｄ）生存率（％）を示す。２×１０６ｐｆｕのＰＲ８ウイルスでマウスを感染させる。ログランク検定を使用して、異なる処理におけるマウスの生存率に有意な差があるかどうかを分析する。＊＊はＰ＜０．０１を表す。
【発明を実施するための形態】
【0140】
実施例
以下の実施例は、本発明のいくつかの実施形態を説明するためにのみ提供されており、制限的な目的または性質はない。
以下の実施例は、本発明のいくつかの実施形態を説明するためにのみ提供されており、制限的な目的または性質はない。
【0141】
実施例１：マウスのＭＳを治療するための抗体の使用
マウスのＭＳモデルを構築し、ＩＦＰ３５抗体で治療する。結果は、図７に示される。ＩＦＰ３５抗体の治療により、マウスのＭＳの症状は、有意に軽減される。
マウスのＭＳモデルを構築し、ＩＦＰ３５抗体で治療する。結果は、図７に示される。ＩＦＰ３５抗体の治療により、マウスのＭＳの症状は、有意に軽減される。
【0142】
実施例２：核酸薬物によるマウスのＭＳの治療
マウスのＮＭＩ遺伝子をノックアウトする。ＮＭＩノックアウトマウスのＭＳの症状を観察する。結果は、図６および図８に示される。ＮＭＩをノックアウトした後、マウスのＭＳの症状は軽減される。
マウスのＮＭＩ遺伝子をノックアウトする。ＮＭＩノックアウトマウスのＭＳの症状を観察する。結果は、図６および図８に示される。ＮＭＩをノックアウトした後、マウスのＭＳの症状は軽減される。
【0143】
実施例３：ＭＳマウスを検出するための血清または体液（例えば、脳脊髄液）マーカーとするＩＦＰ３５／ＮＭＩの使用
細胞実験によると、ＬＰＳ、ＭＯＧおよびＨ３７Ｒａによって誘導されるマクロファージ（ＭＳ動物モデルと同様）と比較して、正常細胞が誘導された後、マクロファージにおけるＩＦＰ３５／ＮＭＩ発現量は、有意に上昇し、細胞外に分泌されるため、血清中でＩＦＰ３５／ＮＭＩ含有量の増加を検出することができることを示す。同時に、ＬＰＳおよびＮＭＩの刺激下でのミクログリアＭ１型マーカー分子ＴＮＦ、ｉＮＯＳ、ＩＬ１βのｍＲＮＡの発現等、他のいくつかの炎症サイトカインの発現および血清での含有量も増加していることが分かり、ｉＮＯＳ、ＨＭＧＢ１、ＴＮＦ、ｉＮＯＳ、ＩＬ１βなどが図１、図２および図３に示される。
細胞実験によると、ＬＰＳ、ＭＯＧおよびＨ３７Ｒａによって誘導されるマクロファージ（ＭＳ動物モデルと同様）と比較して、正常細胞が誘導された後、マクロファージにおけるＩＦＰ３５／ＮＭＩ発現量は、有意に上昇し、細胞外に分泌されるため、血清中でＩＦＰ３５／ＮＭＩ含有量の増加を検出することができることを示す。同時に、ＬＰＳおよびＮＭＩの刺激下でのミクログリアＭ１型マーカー分子ＴＮＦ、ｉＮＯＳ、ＩＬ１βのｍＲＮＡの発現等、他のいくつかの炎症サイトカインの発現および血清での含有量も増加していることが分かり、ｉＮＯＳ、ＨＭＧＢ１、ＴＮＦ、ｉＮＯＳ、ＩＬ１βなどが図１、図２および図３に示される。
【0144】
ＭＳの動物モデル実験によると（実験方法を参照する）、正常マウスは、ＭＳマウスモデルと比較して、ＭＳマウスモデルにおけるＩＦＰ３５／ＮＭＩの発現量は、有意に上昇し、血清に分泌され、炎症因子としてのＩＦＰ３５／ＮＭＩは、ＭＳマウスモデルにおける他のＭＳ特徴的な炎症因子ＴＮＦ、ｉＮＯＳ、ＩＬ１βの高発現および放出と一致する。ＩＦＰ３５／ＮＭＩが血清中または体液中のＭＳの特徴的なバイオマーカーおよび検出指標として使用されることができる（図４、図５に示される）。この結果は、ＬＰＳ誘導性動物モデルおよびインフルエンザウイルス誘導性ウイルス動物モデルの結果と一致し、これらの急性および慢性炎症性疾患は、すべてＩＦＰ３５およびＮＭＩの分泌を引き起こす（図９、図１０に示される）。しかしながら、ＰＣＴはこの点で異なり、一般にウイルス感染の状況下で血清含有量を増加させない。
【0145】
従って、マウスの脊髄組織におけるＩＦＰ３５／ＮＭＩの発現量が有意に上昇しているかどうかを検出するか、またはＩＦＰ３５／ＮＭＩがマウスの血液中または体液中に分泌されるかどうか（例えば、脳脊髄液）、および血液または体液への分泌と含有量の増加との間の相関関係を検出することにより、マウスがＭＳおよび疾患を引き起こす炎症因子を有するかどうかを診断するのに役立てることができる。マウス組織におけるＩＦＰ３５／ＮＭＩの発現量が異常に増加し、ＩＦＰ３５／ＮＭＩがマウスの血液中または体液中に分泌されると（例えば、脳脊髄液）、またはＩＦＰ３５／ＮＭＩ発現の増加が、マウスにおける他の炎症因子（インターフェロン、ＴＮＦ、ＩＬ１、ＩＬ６等）の発現および血液に分泌されるのと一致して、マウスの歩行の変化、手足の麻痺等の明らかな外的症状を引き起こす場合、基本的にマウスがＭＳを罹患していることを診断することができる。
【0146】
実験方法：
ＢＭＤＭ培養：
頚椎脱臼法によりマウスを犠牲死させ、マウスの二つの後肢を取り、７０％アルコールに１分間浸し、后骨の筋肉を極力除去し、注射器で二重抗体（ペニシリン）を含むＰＢＳを吸い込み、骨髓腔を洗浄する。４００ｇで１０分間遠心分離し、上清を捨て、赤血球溶解液１ｍＬで赤血球を３０秒溶解し、次にＰＢＳ １０ｍＬを加えて赤血球溶解液を中和する。４００ｇで１０分間遠心分離し、１０％のＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）、１％のペニシリン、１％のＬ－グルタミンのＤＭＥＭ（Ｇｉｂｉｃｏ）完全培地を加え、最終濃度が２０ｎｇ／ｍＬであるＭＣＳＦ（ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を加え、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターで培養する。
ＢＭＤＭ培養：
頚椎脱臼法によりマウスを犠牲死させ、マウスの二つの後肢を取り、７０％アルコールに１分間浸し、后骨の筋肉を極力除去し、注射器で二重抗体（ペニシリン）を含むＰＢＳを吸い込み、骨髓腔を洗浄する。４００ｇで１０分間遠心分離し、上清を捨て、赤血球溶解液１ｍＬで赤血球を３０秒溶解し、次にＰＢＳ １０ｍＬを加えて赤血球溶解液を中和する。４００ｇで１０分間遠心分離し、１０％のＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）、１％のペニシリン、１％のＬ－グルタミンのＤＭＥＭ（Ｇｉｂｉｃｏ）完全培地を加え、最終濃度が２０ｎｇ／ｍＬであるＭＣＳＦ（ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を加え、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターで培養する。
【0147】
Ｒａｗ２６４．７細胞培養：
１０％のＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）、１％のペニシリン、１％のＬ－グルタミンのＤＭＥＭ（Ｇｉｂｉｃｏ）の完全培地、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターで培養する。
１０％のＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）、１％のペニシリン、１％のＬ－グルタミンのＤＭＥＭ（Ｇｉｂｉｃｏ）の完全培地、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターで培養する。
【0148】
Ｔｈｐ１細胞培養：
１０％のＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）、１％のペニシリン、１％のＬ－グルタミンの１６４０（Ｇｉｂｉｃｏ）の完全培地、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターで培養する。
１０％のＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）、１％のペニシリン、１％のＬ－グルタミンの１６４０（Ｇｉｂｉｃｏ）の完全培地、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターで培養する。
【0149】
ＢＶ２細胞培養：
１０％のＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）、１％のペニシリン、１％のＬ－グルタミンのＤＭＥＭ（Ｇｉｂｉｃｏ）の完全培地、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターで培養する。
１０％のＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）、１％のペニシリン、１％のＬ－グルタミンのＤＭＥＭ（Ｇｉｂｉｃｏ）の完全培地、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターで培養する。
【0150】
ＭＯＧおよびＨ３７Ｒａの細胞刺激：
ＭＯＧおよびＨ３７Ｒａを最終濃度が１００ｎｇ／ｍＬである上記細胞に加えて８時間刺激する。
ＭＯＧおよびＨ３７Ｒａを最終濃度が１００ｎｇ／ｍＬである上記細胞に加えて８時間刺激する。
【0151】
ｍＮＭＩのＢＶ２細胞刺激：
マウス組換えタンパク質ｍＮＭＩを発現させ、インビトロでマウス初代ミクログリアを刺激し、細胞濃度を２×１０６に調節し、５μｇ／ｍＬのｍＮＭＩで６時間インキュベートし、ＱＰＣＲでマクロファージの分極マーカーを検出する。
マウス組換えタンパク質ｍＮＭＩを発現させ、インビトロでマウス初代ミクログリアを刺激し、細胞濃度を２×１０６に調節し、５μｇ／ｍＬのｍＮＭＩで６時間インキュベートし、ＱＰＣＲでマクロファージの分極マーカーを検出する。
【0152】
細胞からのトータル（Ｔｏｔａｌ）ＲＮＡ抽出：
ＢＭＤＭ細胞のトータルＲＮＡ抽出は、康為世紀生物公司のＲＮＡ抽出キットカタログ番号ＣＷ０５９７ ＢＶ２細胞のトータルＲＮＡ抽出用Ｔｒｉｚｏｌ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用する。
ＢＭＤＭ細胞のトータルＲＮＡ抽出は、康為世紀生物公司のＲＮＡ抽出キットカタログ番号ＣＷ０５９７ ＢＶ２細胞のトータルＲＮＡ抽出用Ｔｒｉｚｏｌ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用する。
【0153】
ｍＲＮＡのｃＤＮＡへの逆転写：
ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標） ＩＩ １ｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ カタログ番号６２１０ＡおよびＳＹＢＲ（登録商標） Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ（登録商標）（Ｔｌｉ ＲＮａｓｅＨ Ｐｌｕｓ）、ＲＯＸ ｐｌｕｓ Ｑ－ＰＣＲキットのカタログ番号ＲＲ４２ＬＲは、すべてＴＡＫＡＲＡ社製である。
ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標） ＩＩ １ｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ カタログ番号６２１０ＡおよびＳＹＢＲ（登録商標） Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ（登録商標）（Ｔｌｉ ＲＮａｓｅＨ Ｐｌｕｓ）、ＲＯＸ ｐｌｕｓ Ｑ－ＰＣＲキットのカタログ番号ＲＲ４２ＬＲは、すべてＴＡＫＡＲＡ社製である。
【0154】
ＭＳマウスモデル（ＥＡＥ）の構築：
実験で選択されたマウスは、バイタルリバー実験動物技術（Ｖｉｔａｌ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）社から購入した、８～１２週齢のＣ５７ＢＬ／６バックグラウンドの雌マウスである。オリゴデンドロサイトタンパク質ＭＯＧ３５－５５およびフロイント完全アジュバントＣＦＡで乳化し、各マウスに０．２ｍｇのＭＯＧ３５－５５および０．２ｍｇのＣＦＡを皮下注射し、百日咳毒素ＰＴＸと組み合わせ、各マウスの腹腔内に５００ｎｇを注射し、４８時間目でＰＴＸを１回注射する。偽処置グループは、ＭＯＧ３５－５５の代わりにＰＢＳを投与し、残りは、同量のＣＦＡおよびＰＴＸで処理し、マウスの発症情况および生活状態を毎日観察し、記録する。マウスの発症後に、マウスの発症に対して採点し、採点基準は、次のとおりである。０：臨床症状なし、１：マウスの尾の麻痺、２：マウスの片方の後肢の麻痺または両後肢の衰弱、３：マウスの両後肢の麻痺、４：マウスの両後肢の麻痺かつ前肢が影響を受けること、５：マウスの死にかけることである。採点基準に従って、発症マウスに対して採点して評価した。
実験で選択されたマウスは、バイタルリバー実験動物技術（Ｖｉｔａｌ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）社から購入した、８～１２週齢のＣ５７ＢＬ／６バックグラウンドの雌マウスである。オリゴデンドロサイトタンパク質ＭＯＧ３５－５５およびフロイント完全アジュバントＣＦＡで乳化し、各マウスに０．２ｍｇのＭＯＧ３５－５５および０．２ｍｇのＣＦＡを皮下注射し、百日咳毒素ＰＴＸと組み合わせ、各マウスの腹腔内に５００ｎｇを注射し、４８時間目でＰＴＸを１回注射する。偽処置グループは、ＭＯＧ３５－５５の代わりにＰＢＳを投与し、残りは、同量のＣＦＡおよびＰＴＸで処理し、マウスの発症情况および生活状態を毎日観察し、記録する。マウスの発症後に、マウスの発症に対して採点し、採点基準は、次のとおりである。０：臨床症状なし、１：マウスの尾の麻痺、２：マウスの片方の後肢の麻痺または両後肢の衰弱、３：マウスの両後肢の麻痺、４：マウスの両後肢の麻痺かつ前肢が影響を受けること、５：マウスの死にかけることである。採点基準に従って、発症マウスに対して採点して評価した。
【0155】
マウス脊髄組織からの全タンパク質の抽出：
灌流および脱血されたマウス脊髄組織１００ｍｇを取り、ＲＩＰＡ（Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌ、Ｒｏｃｈｅ）を氷上で３０分間加え、１２０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離し、５Ｘ ＳＤＳ－ＰＡＧＥローディング緩衝液（ｌｏａｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ）で９５℃、５分間行う。
灌流および脱血されたマウス脊髄組織１００ｍｇを取り、ＲＩＰＡ（Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌ、Ｒｏｃｈｅ）を氷上で３０分間加え、１２０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離し、５Ｘ ＳＤＳ－ＰＡＧＥローディング緩衝液（ｌｏａｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ）で９５℃、５分間行う。
【0156】
インフルエンザウイルスがマウスを感染した後、マウス血清の分泌されたＮＭＩ／ＩＦＰ３５の存在の検出
Ｃ５７ＢＬ／６ ＷＴ、ＩＦＩ３５－／－およびＮＭＩ－／－は、チャレンジ実験グループとして３００ｐｆｕの用量でＡ／ＰＲ８毒株に感染し、同時に、Ｃ５７ＢＬ／６野生型マウスに陰性対照グループとして同量のＰＢＳを接種する。マウスの血清中のＩＦＰ３５およびＮＭＩのタンパク質レベルがウイルス感染後三日目に変化するかどうかを検出し、同時に、血清中のＴＮＦおよびＩＬ６の含有量を検出する。
Ｃ５７ＢＬ／６ ＷＴ、ＩＦＩ３５－／－およびＮＭＩ－／－は、チャレンジ実験グループとして３００ｐｆｕの用量でＡ／ＰＲ８毒株に感染し、同時に、Ｃ５７ＢＬ／６野生型マウスに陰性対照グループとして同量のＰＢＳを接種する。マウスの血清中のＩＦＰ３５およびＮＭＩのタンパク質レベルがウイルス感染後三日目に変化するかどうかを検出し、同時に、血清中のＴＮＦおよびＩＬ６の含有量を検出する。
【0157】
ＩＦＰ３５中和抗体の製造：
マウスにＩＦＰ３５モノクローナルハイブリドーマ細胞を腹腔内注射し、７～１０日後、マウスの腹水を採取し、次のようにプロティンＧアグロスビーズ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ Ａｇｒｏｓｅ ｂｅａｄｓ）（ＧＥ）で腹水の抗体を精製する。
（１）プロティンＧアグロスビーズスラリー（ｓｌｕｒｒｙ）１ｍＬを、タンパク質精製充填カラムに加え、
（２）リン酸塩緩衝液１０ｍＬで精製カラムのマトリックスを洗浄し、
（３）腹水１ｍＬをリン酸塩緩衝液５ｍＬに加え、精製カラムに加え、４℃で２時間インキュベートし、
（４）洗浄：２０ｍＬのリン酸塩緩衝液でカラムを洗浄し、
（５）溶出：適切な量の０．１Ｍグリシン（Ｇｌｙｃｉｎｅ）（ＰＨ＝２．５～３．０）緩衝液で抗体を溶出し、ここで溶出チューブに１Ｍ ＰＨ＝１０．０のＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液を事前に加え、溶出液を中和し、
限外ろ過チューブで抗体を濃縮し、かつ抗体濃度を測定する。
マウスにＩＦＰ３５モノクローナルハイブリドーマ細胞を腹腔内注射し、７～１０日後、マウスの腹水を採取し、次のようにプロティンＧアグロスビーズ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ Ａｇｒｏｓｅ ｂｅａｄｓ）（ＧＥ）で腹水の抗体を精製する。
（１）プロティンＧアグロスビーズスラリー（ｓｌｕｒｒｙ）１ｍＬを、タンパク質精製充填カラムに加え、
（２）リン酸塩緩衝液１０ｍＬで精製カラムのマトリックスを洗浄し、
（３）腹水１ｍＬをリン酸塩緩衝液５ｍＬに加え、精製カラムに加え、４℃で２時間インキュベートし、
（４）洗浄：２０ｍＬのリン酸塩緩衝液でカラムを洗浄し、
（５）溶出：適切な量の０．１Ｍグリシン（Ｇｌｙｃｉｎｅ）（ＰＨ＝２．５～３．０）緩衝液で抗体を溶出し、ここで溶出チューブに１Ｍ ＰＨ＝１０．０のＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液を事前に加え、溶出液を中和し、
限外ろ過チューブで抗体を濃縮し、かつ抗体濃度を測定する。
【0158】
ＭＳマウスのＩＦＰ３５抗体治療：
マウスＥＡＥモデルを構築し、ＩＦＰ３５抗体治療グループおよびＩｇＧ対照グループに分け、１２日目に抗体の投与を開始し、各マウスに毎日１００μｇ（５ｍｇ／ｋｇ）の抗体を１０日間連続的に静脈内注射し、マウスの二つのグループの臨床症状を比較する。
マウスＥＡＥモデルを構築し、ＩＦＰ３５抗体治療グループおよびＩｇＧ対照グループに分け、１２日目に抗体の投与を開始し、各マウスに毎日１００μｇ（５ｍｇ／ｋｇ）の抗体を１０日間連続的に静脈内注射し、マウスの二つのグループの臨床症状を比較する。
【0159】
Ｅｌｉｓａ実験：
（１）Ｅｌｉｓａプレートを取り出し、室温に戻せ、希釈された標準品およびサンプルをウェルあたり１００ｍＬ、室温下で２時間加える。標準品およびサンプルは、１％ＢＳＡのＰＢＳＴ（０．０５％のＴｗｅｅｎ－２０）で希釈する。
（１）Ｅｌｉｓａプレートを取り出し、室温に戻せ、希釈された標準品およびサンプルをウェルあたり１００ｍＬ、室温下で２時間加える。標準品およびサンプルは、１％ＢＳＡのＰＢＳＴ（０．０５％のＴｗｅｅｎ－２０）で希釈する。
【0160】
（２）洗浄：ＰＢＳＴ（０．０５％のＴｗｅｅｎ－２０）で３回洗浄し、脱イオン水で２回洗浄する。
【0161】
（３）検出用抗体の追加：ウェルあたり１００ｍＬ、室温下で２時間加える。１％ＢＳＡのＰＢＳＴ（０．０５％のＴｗｅｅｎ－２０）で希釈する。
【0162】
（４）発色用基質の追加：ウェルあたり１００ｍＬのＴＭＢを加え、光を避け、シェーカーで１０～２０分間脱色する
（５）終了：ウェルあたり２Ｍｏｌ／ＬのＨ２ＳＯ４を５０ｍＬ加える。
ＥＬＩＳＡプレート、４５０ｎｍのスキャンでＯＤ値を得る。
（５）終了：ウェルあたり２Ｍｏｌ／ＬのＨ２ＳＯ４を５０ｍＬ加える。
ＥＬＩＳＡプレート、４５０ｎｍのスキャンでＯＤ値を得る。
【0163】
遺伝子ノックアウトマウスの作製方法：Ｃ５７ＢＬ／６マウスを使用する。８～１２週齢。使用されるすべてのマウスは、頸椎脱臼により殺される。Ｃ５７ＢＬ／６野生型マウス（０００６６４）は、バイタルリバー実験動物技術有限公司から購入される。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９を使用して、ＮＭＩおよびＩｆｐ３５ノックアウトマウス技術を生成する。過排卵する卵管から受精卵を収集し、雌のＣ５７ＢＬ／６マウスを雄のＣ５７ＢＬ／６マウスと交配させる。Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ（１５０ｎｇｍｌ－１）は、転写によって生成されたｓｇＲＮＡ（１００ｎｇｍｌ－１）と混合され、細胞にマイクロインジェクションされる。レシピエント卵の細胞質は、Ｍ２培地で認識された前核を有する（Ｓｉｇｍａ、Ｍ７１６７－１００ＭＬ）。ＮＭＩのｓｇＲＮＡ配列は、５’－ＡＡＡＡＣＡＡＡＧＡＡＣＴＡＧＡＣＧＡＧＧ－３’であり、ＩＦＰ３５のｓｇＲＮＡ配列は、５’－ＣＡＧＣＴＣＡＡＡＡＧＧＧＡＧＣＧＣＡＣＡＧＧ－３’である。ＣＲＩＳＰＲ技術によって生成されたＮＭＩおよびＩｆｐ３５遺伝子のフレームシフト突然変異により、ＮＭＩおよびＩＦＰ３５の生成に失敗する。対応する各ｓｇＲＮＡに約１００～２５０個の受精卵を注入し、次に代理ＩＣＲ雌マウスの子宮に移して、Ｆ１世代のマウスを得る。
【0164】
結果：
１．ＭＯＧおよびＨ３７Ｒａによる、マウスマクロファージからのＮＭＩ放出の誘導。
１．ＭＯＧおよびＨ３７Ｒａによる、マウスマクロファージからのＮＭＩ放出の誘導。
【0165】
図１の方法：ＢＭＤＭ、ＲＡＷ２６７．４およびＴｈｐ１細胞の濃度を１ｍＬあたり１０６細胞に調節し、ＭＯＧ３５－５５（５０ｎｇ／ｍＬ）およびＨ３７Ｒａ（１００ｎｇ／ｍＬ）を使用して、マウスマクロファージを誘導し、８時間インキュベートした後、細胞上清に分泌されたＮＭＩの量を検出する。図のエラーバーは、三つの繰り返し実験±ｓ．ｅ．ｍを表し、有意差は、マッチングしないｔ検定によって検出され、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。
【0166】
図１の結果：ＭＯＧ３５－５５およびＨ３７Ｒａは、マウスでＭＳを誘導するために使用される主な試薬であり、ＭＯＧ３５－５５は、オリゴデンドロサイトの表面にある糖タンパク質であり、免疫細胞に自己抗原を攻撃させるために使用され、Ｈ３７Ｒａは、免疫反応の拡大を活性化するために使用される不活化された結核菌である。ＭＯＧ３５－５５およびＨ３７Ｒａを組み合わせてマウス末梢マクロファージを刺激すると、ＮＭＩが大量に分泌されていることが検出でき、ここで、主な役割は、Ｈ３７Ｒａの成分である。Ｈ３７Ｒａの誘導効果は、ＭＯＧ３５－５５の誘導効果よりもはるかに大きく、Ｈ３７Ｒａがマクロファージを活性化し、炎症発生の主な促進因子であることを示し、ＭＯＧ３５－５５は、マクロファージの活性化を誘導する点でＨ３７Ｒａほど強力ではなく、二つの刺激効果は、一つの刺激効果よりも高くなる。マウスでＭＳの発症を誘導する試薬がマクロファージから細胞外へのＮＭＩの放出を誘導できることを示す。当該実験は、誘導されたマクロファージ活性化モデルにおいて、ＮＭＩ発現量が増加し、細胞外に放出されることを証明することができる。
【0167】
２．ＬＰＳによる、ミクログリアＢＶ２からのＮＭＩ放出の誘導
図２の方法：ａ、１００ｎｇ／ｍＬのＬＰＳを使用してミクログリアＢＶ２を誘導し、０、２、４、６、８時間で細胞から上清に分泌されるＮＭＩの量を検出し、ｂ、異なる濃度のＬＰＳ（０、１０、２０、５０、１００ｎｇ／ｍＬ）を使用してＢＶ２細胞を８時間刺激し、上清中のＮＭＩの量を検出する。図のエラーバーは、三つの繰り返し実験±ｓ．ｅ．ｍを表し、有意差は、マッチングしないｔ検定によって検出され、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
図２の方法：ａ、１００ｎｇ／ｍＬのＬＰＳを使用してミクログリアＢＶ２を誘導し、０、２、４、６、８時間で細胞から上清に分泌されるＮＭＩの量を検出し、ｂ、異なる濃度のＬＰＳ（０、１０、２０、５０、１００ｎｇ／ｍＬ）を使用してＢＶ２細胞を８時間刺激し、上清中のＮＭＩの量を検出する。図のエラーバーは、三つの繰り返し実験±ｓ．ｅ．ｍを表し、有意差は、マッチングしないｔ検定によって検出され、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【0168】
図２の結果：ミクログリアは、中枢神経系の主要な免疫細胞であり、ＭＳの発生および発展の過程を含む、中枢神経の炎症性疾患に関与する。ＬＰＳ（リポ多糖またはエンドトキシン）は、ミクログリアの活性化を誘導することができる。実験結果によると、ＬＰＳによって誘導されたミクログリアが活性化された後、大量のＮＭＩ分泌があることを示し、分泌量は、ＬＰＳ刺激の時間と強度と正の相関があり、ＮＭＩがＭＳの発症における一つのＤＡＭＰの発揮作用であり、中枢マクロファージの活性化がＮＭＩの放出につながることを示す。
【0169】
３．ｍＮＭＩタンパク質による、マウスミクログリアのＭ１型分極の誘導
図３の方法：精製されたマウスＮＭＩ（ｍＮＭＩ）タンパク質（５μｇ／ｍＬ）を使用して、マウスミクログリアを６時間誘導し、ＬＰＳまたはＮＭＩの刺激下で、ミクログリアのＭ１型マーカー分子であるＴＮＦ、ｉＮＯＳ、ＩＬ１β（ａ）およびＭ２型マーカー分子であるＡｒｇ１、ＩＬ１０、ＴＧＦ－β、ＣＤ２０６（ｂ）ｍＲＮＡの変化を検出し、図のエラーバーは、三つの繰り返し実験±ｓ．ｅ．ｍを表し、有意差は、マッチングしないｔ検定によって検出され、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
図３の方法：精製されたマウスＮＭＩ（ｍＮＭＩ）タンパク質（５μｇ／ｍＬ）を使用して、マウスミクログリアを６時間誘導し、ＬＰＳまたはＮＭＩの刺激下で、ミクログリアのＭ１型マーカー分子であるＴＮＦ、ｉＮＯＳ、ＩＬ１β（ａ）およびＭ２型マーカー分子であるＡｒｇ１、ＩＬ１０、ＴＧＦ－β、ＣＤ２０６（ｂ）ｍＲＮＡの変化を検出し、図のエラーバーは、三つの繰り返し実験±ｓ．ｅ．ｍを表し、有意差は、マッチングしないｔ検定によって検出され、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【0170】
図３の結果：マクロファージの一つとして、ミクログリアは、Ｍ１型およびＭ２型に分極される。ここで、Ｍ１型ミクログリアは、主に炎症誘導性反応に関与し、食作用、炎症因子の分泌および組織損傷を媒介し、Ｍ１型ミクログリアは、ＭＳ発症における疾患の発症を促進する役割を果たす。Ｍ２型ミクログリアは、抗炎症反応を媒介し、組織修復過程に参加する。図３の実験結果によると、ｍＮＭＩがミクログリアを誘導して炎症誘導性Ｍ１型に向かって分極させ、ＭＳの炎症反応を促進することができることを示す。
【0171】
４．ＥＡＥモデリング後の異なる時点でのマウスにおけるＮＭＩ分泌および発現
図４によると、ＥＡＥモデリング後、異なる時点でのマウスのＮＭＩ分泌および発現は、偽処置対照実験グループマウスおよびＥＡＥマウスの発症前期間（７日）、初期発症期間（１２日）、発症ピーク期間（２０日）、疾患緩和期間（３０日）のＮＭＩ発現を検出すことを示す。結果によると、マウスにおけるＭＳの発症の様々な期間でのＮＭＩの発現量がＭＳの発症と密接に関連していることを示す。
図４によると、ＥＡＥモデリング後、異なる時点でのマウスのＮＭＩ分泌および発現は、偽処置対照実験グループマウスおよびＥＡＥマウスの発症前期間（７日）、初期発症期間（１２日）、発症ピーク期間（２０日）、疾患緩和期間（３０日）のＮＭＩ発現を検出すことを示す。結果によると、マウスにおけるＭＳの発症の様々な期間でのＮＭＩの発現量がＭＳの発症と密接に関連していることを示す。
【0172】
５．ＥＡＥモデリング後のマウス脊髄組織におけるＮＭＩおよび他の炎症因子の発現
図５によると、ＥＡＥモデリング後、異なる時点でのマウス脊髄組織内におけるＮＭＩおよび主な炎症因子ｉＮＯＳ、ＣＯＸ２、ＨＭＧＢ１の発現を検出し、正常なマウスの脊髄ではｉＮＯＳがほとんど検出されないことが分かり、ＭＳがピーク期間に入ると、ｉＮＯＳの発現量が最高レベルに達し、ＣＯＸ２およびＨＭＧＢ１は、ＭＳの発症とともに増加し、ＮＭＩの正常な発現量は低く、ＭＳが発症し始めると発現量が最も高いことを示す。ＮＭＩおよび他の炎症因子の発現は、ＭＳの発生とともに増加することができ、ＮＭＩは比較的早い時期で上方制御される因子の一つであることを示す。マウスの脳脊髄液は入手が難しいため、ここで検出されたのは脊髄組織である。
図５によると、ＥＡＥモデリング後、異なる時点でのマウス脊髄組織内におけるＮＭＩおよび主な炎症因子ｉＮＯＳ、ＣＯＸ２、ＨＭＧＢ１の発現を検出し、正常なマウスの脊髄ではｉＮＯＳがほとんど検出されないことが分かり、ＭＳがピーク期間に入ると、ｉＮＯＳの発現量が最高レベルに達し、ＣＯＸ２およびＨＭＧＢ１は、ＭＳの発症とともに増加し、ＮＭＩの正常な発現量は低く、ＭＳが発症し始めると発現量が最も高いことを示す。ＮＭＩおよび他の炎症因子の発現は、ＭＳの発生とともに増加することができ、ＮＭＩは比較的早い時期で上方制御される因子の一つであることを示す。マウスの脳脊髄液は入手が難しいため、ここで検出されたのは脊髄組織である。
【0173】
図４および図５の結果のむすび：血液中の炎症因子の増加は、免疫性炎症性疾患の特徴の一つであり、ＮＭＩがＭＳのｂｉｏｍａｒｋｅｒとして使用できるかどうか、およびｂｉｏｍａｒｋｅｒとしての潜在的な機能を検出するために、本発明の発明者らは、ＭＳマウスモデルの血液（ａ）および脊髄組織内部における（ｂ）ＮＭＩの発現状況を検出する。結果によると、ＭＳマウスの発症の各期間におけるＮＭＩの発現量は、ＭＳの発症程度と密接に関連しており、ＭＳの発症がピーク期間（２０日目）に達すると、ＮＭＩの発現量は、最高レベルに達する。脊髄組織において、正常なマウスの脊髄ではｉＮＯＳはほとんど検出されなく、ＭＳがピーク期間に入ると、ｉＮＯＳの発現量は、最高レベルに達し、ＣＯＸ２およびＨＭＧＢ１は、ＭＳの発症とともに増加し、正常な脊髄組織におけるＮＭＩの発現量は低く、ＭＳが発症し始める際に発現量が最も高く、疾患の緩和期間にダウンレギュレーションされ、ＮＭＩおよび他の炎症因子の発現がすべてＭＳの発症とともに増加することができることを示し、ＮＭＩは比較的早い時期で上方制御される炎症因子の一つである。
【0174】
この実験は、ＭＳ疾患の動物モデルにおいれ、ＮＭＩの発現量が増加し、血液に放出されることを証明できるが、ＮＭＩおよび他の炎症因子ｉＮＯＳ、ＣＯＸ２、ＨＭＧＢ１が一緒に検出され、先後の印加関係がないため、ＮＭＩが他の炎症因子の放出を促進すると言えない。
【0175】
６．ＮＭＩノックアウトによる、マウスのＭＳの臨床症状の軽減
図６の方法：ａ、ＮＭＩノックアウトマウス（ＮＭＩ－／－）および野生型マウス（ＷＴ）のＭＳ動物モデルを構築し、それらの臨床症状を比較する。採点基準は、次のとおりである。０：臨床症状なし、１：マウスの尾の麻痺、２：マウスの片方の後肢の麻痺または両後肢の衰弱、３：マウスの両後肢の麻痺、４：マウスの両後肢の麻痺かつ前肢が影響を受け、５：マウスの死にかけることである。採点基準に従って、発症マウスに対して採点して評価した。ｂ、ＮＭＩ－／－およびＷＴマウスの脊髄組織のＨＥ病理学的切片。ｃ、ＮＭＩ－／－およびＷＴマウスの脊髄組織のＬＦＢ病理学的切片、ＩＦ実験において、ＧＦＡＰでアストロサイトを標識し、ＩＢＡ１でミクログリアを標識し、ＮＭＩ－／－およびＷＴマウスの脊髄組織の白質（ｄ）および灰白質（ｅ）内側におけるアストロサイトおよびミクログリアの活性化状況を比較する。
図６の方法：ａ、ＮＭＩノックアウトマウス（ＮＭＩ－／－）および野生型マウス（ＷＴ）のＭＳ動物モデルを構築し、それらの臨床症状を比較する。採点基準は、次のとおりである。０：臨床症状なし、１：マウスの尾の麻痺、２：マウスの片方の後肢の麻痺または両後肢の衰弱、３：マウスの両後肢の麻痺、４：マウスの両後肢の麻痺かつ前肢が影響を受け、５：マウスの死にかけることである。採点基準に従って、発症マウスに対して採点して評価した。ｂ、ＮＭＩ－／－およびＷＴマウスの脊髄組織のＨＥ病理学的切片。ｃ、ＮＭＩ－／－およびＷＴマウスの脊髄組織のＬＦＢ病理学的切片、ＩＦ実験において、ＧＦＡＰでアストロサイトを標識し、ＩＢＡ１でミクログリアを標識し、ＮＭＩ－／－およびＷＴマウスの脊髄組織の白質（ｄ）および灰白質（ｅ）内側におけるアストロサイトおよびミクログリアの活性化状況を比較する。
【0176】
図６の結果：ＮＭＩノックアウトマウスを使用してＭＳの動物モデルを構築し、野生型マウスから製造されたＭＳモデルとその臨床症状を比較する。ａ図によると、ＮＭＩ－／－マウスおよびＷＴマウスのＭＳへの侵入時間は基本的に同じであるが、ＮＭＩ－／－マウスのＭＳの症状は、その後の野生型マウスよりも軽いことを示す。ｂ図は、脊髄組織切片のＨＥ染色を使用して、ＮＭＩ－／－マウスおよびＷＴマウスの脊髄における炎症性細胞の浸潤状況を観察し、ＮＭＩノックアウトが、ＭＳマウスの脊髄における炎症性細胞の浸潤を減少させることが分かる。ｃ図は、脊髄組織切片のＬＦＢ染色分析によって、ＮＭＩ－／－マウスの脊髄脱髄症状が軽減されることを示す。ＩＦ実験において、ＮＭＩ－／－マウスの脊髄の白質（ｄ図）および灰白質（ｅ図）内側のアストロサイトおよびミクログリアの活性化が減少される。上記の結果を要約すると、ＮＭＩは神経炎症を促進し、ＭＳの臨床症状を悪化させ、ＮＭＩがノックアウトされたマウスのＭＳの症状を軽減することができる。
【0177】
７．ＩＦＰ３５抗体による、マウスのＭＳの症状の軽減可能
図７によると、遺伝子ノックアウトがＭＳマウスの症状を有意に改善することができるため、本発明の発明者らは、ＩＦＰ３５の中和抗体を使用して、ＭＳマウスの症状を軽減できるかどうかを観察することを示す。ａ図は、精製された本発明に記載のＩＦＰ３５中和抗体を使用して、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ検出することを表し、ここで、５５ｋＤ位置は、抗体重鎖であり、２５ｋＤ位置は、抗体軽鎖であることが分かる。抗体が十分に精製されていることを示す。ｂ図は、当該精製されたＩＦＰ３５抗体に１００μｇ（５ｍｇ／ｋｇ）の抗体を１０日間（１２～２２日）静脈内注射して、ＭＳマウスの症状を観察および採点することを示す、当該抗体は、マウスＭＳの症状を有意に緩和できることが分かる。この結果によると、ＩＦＰ３５ファミリータンパク質を阻害モノクローナル抗体は、多発性硬化症（ＭＳ）の治療に使用できることを示す。マウスＭＳモデリングは、公認された評価基準を最小氏、採点基準は、次のとおりである。０：臨床症状なし、１：マウスの尾の麻痺、２：マウスの片方の後肢の麻痺または両後肢の衰弱、３：マウスの両後肢の麻痺、４：マウスの両後肢の麻痺かつ前肢が影響を受け、５：マウスの死にかけることである。採点基準に従って、発症マウスに対して採点して評価した。
図７によると、遺伝子ノックアウトがＭＳマウスの症状を有意に改善することができるため、本発明の発明者らは、ＩＦＰ３５の中和抗体を使用して、ＭＳマウスの症状を軽減できるかどうかを観察することを示す。ａ図は、精製された本発明に記載のＩＦＰ３５中和抗体を使用して、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ検出することを表し、ここで、５５ｋＤ位置は、抗体重鎖であり、２５ｋＤ位置は、抗体軽鎖であることが分かる。抗体が十分に精製されていることを示す。ｂ図は、当該精製されたＩＦＰ３５抗体に１００μｇ（５ｍｇ／ｋｇ）の抗体を１０日間（１２～２２日）静脈内注射して、ＭＳマウスの症状を観察および採点することを示す、当該抗体は、マウスＭＳの症状を有意に緩和できることが分かる。この結果によると、ＩＦＰ３５ファミリータンパク質を阻害モノクローナル抗体は、多発性硬化症（ＭＳ）の治療に使用できることを示す。マウスＭＳモデリングは、公認された評価基準を最小氏、採点基準は、次のとおりである。０：臨床症状なし、１：マウスの尾の麻痺、２：マウスの片方の後肢の麻痺または両後肢の衰弱、３：マウスの両後肢の麻痺、４：マウスの両後肢の麻痺かつ前肢が影響を受け、５：マウスの死にかけることである。採点基準に従って、発症マウスに対して採点して評価した。
【0178】
この実験における対応する抗体は、３５ＮＩＤｍＡｂであり、軽鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０であり、重鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９である。
【0179】
重鎖可変領域は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、ＣＤＲ１の配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９（ＧＹＴＦＴＮＹＧ）の２５位～３２位のアミノ酸であり、ＣＤＲ２の配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９（ＩＮＴＹＴＧＥＰ）の５０位～５７位のアミノ酸であり、ＣＤＲ３の配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９（ＹＧＹＳＷＡＭＤＹ）の９８位～１０６位のアミノ酸である。
【0180】
軽鎖可変領域は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、ＣＤＲ１の配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０（ＳＳＳＶＳＹ）の２６位～３１位のアミノ酸であり、ＣＤＲ２の配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０（ＤＴＳ）の４９位～５１位のアミノ酸であり、ＣＤＲ３の配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０（ＷＳＳＮＰＰＩ）の９０位～９６位のアミノ酸であり、命名システムは、Ｋａｂａｔである。
【0181】
本実験でＮＭＩ／ＩＦＰ３５がＭＳ動物モデルおよびＭＳを誘導する試薬ＭＯＧ等によって誘導されたマクロファージ実験にあることが分かり、ＩＦＰ３５／ＮＭＩが血清中に放出されることが分かり、従って、本プロジェクトは、放出されたＩＦＰ３５／ＮＭＩと疾患との関係を研究することである。ＩＦＰ３５／ＮＭＩは、本発明の発明者らによって、一度血清中に放出されるとＤＡＭＰｓの役割を果たすことが以前に証明されているので、従って、本研究は、実際に、疾患における血清中に放出されるＩＦＰ３５／ＮＭＩの役割、即ちＤＡＭＰの機能に関する。
【0182】
８．ＮＭＩノックアウトによる、ＭＳマウスの脊髄白血球の浸潤および炎症の軽減可能
結果は図８に示される。ａ図．ＮＭＩノックアウトは、脊髄炎症におけるＣＤ４５陽性白血球の浸潤を減少させ、ｂ図．ＮＭＩノックアウトは、脊髄炎症因子ｉＮＯＳおよびＣＯＸ２の発現を減少させる。
結果は図８に示される。ａ図．ＮＭＩノックアウトは、脊髄炎症におけるＣＤ４５陽性白血球の浸潤を減少させ、ｂ図．ＮＭＩノックアウトは、脊髄炎症因子ｉＮＯＳおよびＣＯＸ２の発現を減少させる。
【0183】
９．ＬＰＳ誘導性炎症のあるマウスの血清中のＮＭＩとＰＣＴとの比較
結果は図９に示される。ＬＰＳ（ｉ．ｐ．、１０ｍｇ／ｋｇ）でＬＰＳ誘導性炎症モデルを構築した後、時間とともにＮＭＩ（ａ図）およびＰＣＴ（ｂ図）を変化させ、同様に、腸結紮ＣＬＰは、マウス炎症モデル１６時間後、ＮＭＩ（ｃ図）およびＰＣＴ（ｄ図）の含有量を構築する。この図によると、ＰＣＴと比較して、ＮＭＩは、炎症の発生を早期（１～２時間）に検出でき、ＮＭＩのバックグラウンド発現は、ＰＣＴよりも少なく、ＮＭＩがＰＣＴよりも優れた臨床リスク指数検出指標として使用できることを示す。
結果は図９に示される。ＬＰＳ（ｉ．ｐ．、１０ｍｇ／ｋｇ）でＬＰＳ誘導性炎症モデルを構築した後、時間とともにＮＭＩ（ａ図）およびＰＣＴ（ｂ図）を変化させ、同様に、腸結紮ＣＬＰは、マウス炎症モデル１６時間後、ＮＭＩ（ｃ図）およびＰＣＴ（ｄ図）の含有量を構築する。この図によると、ＰＣＴと比較して、ＮＭＩは、炎症の発生を早期（１～２時間）に検出でき、ＮＭＩのバックグラウンド発現は、ＰＣＴよりも少なく、ＮＭＩがＰＣＴよりも優れた臨床リスク指数検出指標として使用できることを示す。
【0184】
１０．インフルエンザウイルスＡ／プエルトリコ／８／１９３４（ＰＲ８）毒株がマウスに感染された後、マウス血清中の分泌されるＮＭＩ／ＩＦＰ３５の存在を検出する。
【0185】
対照として、本発明の発明者らは、ウイルス感染の状況下でＩＦＰ３５およびＮＭＩが分泌されるかどうかを同時に比較した。研究方法：３００ｐｆｕの用量でＰＲ８毒株にＣ５７ＢＬ／６ＷＴ、ＩＦＩ３５－／－およびＮＭＩ－／－をチャレンジ実験グループとして感染させ、同時に同量のＰＢＳをＣ５７ＢＬ／６野生型マウスに陰性対照グループとして接種した。図１０のＡおよびＢに示されるように、ウイルスに感染された三日目に、血清中のＩＦＰ３５（ＩＦＩ３５とも呼ぶ）およびＮＭＩのタンパク質レベルは、有意に上昇し、インフルエンザウイルス感染が野生型マウスに炎症反応を引き起こすことができることを示す。ＮＭＩまたはＩＦＰ３５遺伝子ノックアウトマウスの血清中のＩＦＰ３５（ＩＦＩ３５とも呼ぶ）およびＮＭＩのタンパク質レベルは、有意に上昇しない。同時に、ＩＦＩ３５－／－遺伝子ノックアウトマウスの血清中のＮＭＩのタンパク質レベルもＷＴマウスよりも有意に低く、ＮＭＩ－／－遺伝子ノックアウトマウスの血清中のＩＦＩ３５のタンパク質レベルも、ＷＴマウスよりも有意に低いことが分かった（図Ａおよび図Ｂ）。ＩＦＩ３５とＮＭＩとの間の分泌は、相互に牽連し、相互作用していることを示す。同時に、本発明の発明者らは、インフルエンザウイルス感染が血清中のＩＬ－６およびＴＮＦ－αの分泌レベルを増加させることができ（図Ｃおよび図Ｄ）、ＮＭＩまたはＩＦＰ３５遺伝子ノックアウトマウスの血清中のＩＬ－６およびＴＮＦ－αタンパク質レベルは、野生型マウスよりも有意に低いことを示す。さらに、炎症反応および感染が、ＮＭＩおよびＩＦＰ３５の分泌につながることができ、ＩＦＰ３５またはＮＭＩを阻害（遺伝子ノックアウト）すると、炎症反応を軽減することができる。この結果は、ウイルス感染の状況下で血清中の含有量が一般に増加しないＰＣＴとは異なる。上記の結果は、ウイルス、細菌、または慢性炎症性疾患のいずれかであっても、ＩＦＰ３５およびＮＭＩが体液（血液を含む）に分泌されることができることを示唆する。従って、慢性炎症性疾患等の検出指標として使用されることができる。
【0186】
実施例４：抗体の改善
一．抗体のヒト化：
１．実験方法：ＰＣＲ部位特異的突然変異誘発方法を介してマウス抗体の特定のアミノ酸残基位置のＤＮＡ配列に突然変異を導入して、マウス抗体のいくつかのアミノ酸を変化させて、ヒト抗体配列に変換することにより、抗体のヒト化改変を実現する。次に、配列が改変された抗体遺伝子をｐＣＤＮＡ３．１、ｐＣＤＮＡ３．４等の対応する抗体発現ベクターにクローニングする。ヒト腎臓細胞株ｅＥｘｐｉ２９３ＦまたはＨＥＫ２９３Ｔ細胞に形質転換して発現し、次に、細胞外に分泌される発現抗体を精製する。発現および精製の改変後の抗体と抗原ＩＦＰ３５との結合能を検出する。使用される機器は、ＢｉＡＣｏまたはＩＴＣ等である。Ｅｌｉｓａ法を使用して抗原に対するヒト化改変後の抗体との結合能を検出することができる。抗原は、ヒトＩＦＰ３５タンパク質である。
一．抗体のヒト化：
１．実験方法：ＰＣＲ部位特異的突然変異誘発方法を介してマウス抗体の特定のアミノ酸残基位置のＤＮＡ配列に突然変異を導入して、マウス抗体のいくつかのアミノ酸を変化させて、ヒト抗体配列に変換することにより、抗体のヒト化改変を実現する。次に、配列が改変された抗体遺伝子をｐＣＤＮＡ３．１、ｐＣＤＮＡ３．４等の対応する抗体発現ベクターにクローニングする。ヒト腎臓細胞株ｅＥｘｐｉ２９３ＦまたはＨＥＫ２９３Ｔ細胞に形質転換して発現し、次に、細胞外に分泌される発現抗体を精製する。発現および精製の改変後の抗体と抗原ＩＦＰ３５との結合能を検出する。使用される機器は、ＢｉＡＣｏまたはＩＴＣ等である。Ｅｌｉｓａ法を使用して抗原に対するヒト化改変後の抗体との結合能を検出することができる。抗原は、ヒトＩＦＰ３５タンパク質である。
【0187】
改変前のマウス抗体（３５ＮＩＤｍＡｂ）配列および改変後の抗体配列は、次のとおりである。
【0188】
ＡＥ００１ＶＬ（改変前のマウス抗体（３５ＮＩＤｍＡｂ）の軽鎖定常領域の配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４であり、ヒト化改変後のマウス軽鎖定常領域の配列ＡＥ００１Ｌ１は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３であり、ＡＥ００１Ｌ２は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７であり、ＡＥ００１Ｌ３は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２である。
【0189】
ＡＥ００１ＶＨ（改変前のマウス抗体（３５ＮＩＤｍＡｂ）の重鎖定常領域の配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５であり、ヒト化改変後のマウス重鎖定常領域の配列ＡＥ００１Ｈ１は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１であり、ＡＥ００１Ｈ２は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５であり、ＡＥ００１Ｈ３は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１である。
【0190】
実験結果は図１１に示される。ＡＥ００１－ＶＨ＋ＶＬ（３５ＮＩＤｍＡｂ）は、開始マウス抗体である。ＡＥ００１－Ｈ１＋Ｌ１、ＡＥ００１－Ｈ２＋Ｌ２およびＡＥ００１－Ｈ３＋Ｌ３は、それぞれ三つのグループのヒト化抗体（ヒト化改変された抗体）であり、これから、ヒト化抗体は、すべて抗原に結合できることが分かる。ＡＥ００１－Ｈ３＋Ｌ３がヒト抗体に最も近いため、このグループの抗体を選択して、以下の抗体親和性成熟度の改変を行う、結果によると、マウス抗体のアミノ酸配列がヒト化程度を向上させて、抗体をヒト化にもっとも近い抗体配列にすることを示す。本実験においても、マウス抗体とヒト抗体との差異に基づいて、抗体のさらなるヒト化改変を達成できることを示す。しかし、抗体の可変領域の配列等の抗体によって識別されるバックボーン配列は、抗原を識別する主要なフラグメントである。より重要な領域は、抗体可変領域のＣＤＲ領域であり、抗原識別にとってより重要である。これらの配列のコア領域は、抗原識別の特異性を决定する。
【0191】
二．抗体の親和性成熟の改変
１．実験方法：実験は、一般的な突然変異プラスミド構築方法およびタンパク質抗体発現方法を採用する。まず、ＰＣＲランダム突然変異方法により、ヒト化改変後の一つの抗体の組み合わせＡＥ００１－Ｈ３＋Ｌ３のＣＤＲ領域のＤＮＡ配列にランダムに突然変異を導入することにより、ヒト化抗体のＣＤＲ配列を改変する。次に、改変後の抗体配列は、ｐＣＤＮＡ３．１またはｐＣＤＮＡ３．４等の対応する抗体発現ベクターにクローンされる。ランダム突然変異抗体ライブラリーを構築する。ライブラリープラスミドをヒト腎臓細胞株２９３ＴまたはＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞に移して発現し、次に細胞外に分泌される発現抗体を精製する。改変後の抗体およびインビトロで精製された抗原ＩＦＰ３５またはＮＭＩまたはＩＦＰ３５／ＮＭＩ複合体の発現および精製を使用して、結合力を検出する。使用される機器は、ＢｉＡＣｏまたはＩＴＣ等である。Ｅｌｉｓａ法を使用して、ＣＤＲ領域が改変された後、抗原に対する抗体の結合能を検出する。
１．実験方法：実験は、一般的な突然変異プラスミド構築方法およびタンパク質抗体発現方法を採用する。まず、ＰＣＲランダム突然変異方法により、ヒト化改変後の一つの抗体の組み合わせＡＥ００１－Ｈ３＋Ｌ３のＣＤＲ領域のＤＮＡ配列にランダムに突然変異を導入することにより、ヒト化抗体のＣＤＲ配列を改変する。次に、改変後の抗体配列は、ｐＣＤＮＡ３．１またはｐＣＤＮＡ３．４等の対応する抗体発現ベクターにクローンされる。ランダム突然変異抗体ライブラリーを構築する。ライブラリープラスミドをヒト腎臓細胞株２９３ＴまたはＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞に移して発現し、次に細胞外に分泌される発現抗体を精製する。改変後の抗体およびインビトロで精製された抗原ＩＦＰ３５またはＮＭＩまたはＩＦＰ３５／ＮＭＩ複合体の発現および精製を使用して、結合力を検出する。使用される機器は、ＢｉＡＣｏまたはＩＴＣ等である。Ｅｌｉｓａ法を使用して、ＣＤＲ領域が改変された後、抗原に対する抗体の結合能を検出する。
【0192】
２．結果
１）Ｅｌｉｓａ法によるランダム突然変異抗体親和性検出の予備スクリーニング結果：
１）Ｅｌｉｓａ法によるランダム突然変異抗体親和性検出の予備スクリーニング結果：
【0193】
【表5】
【0194】
上記の結果から、結合能の高い五つのグループの抗体（上記の下線付き抗体）を選択し、それぞれの番号は、ＡＥ００１－５、ＡＥ００１－６、ＡＥ００１－７、ＡＥ００１－８、ＡＥ００１－９である。情况リストは、次のとおりである。
【0195】
２）予備スクリーニングされた突然変異抗体の重鎖および軽鎖のペアリング状況：
【0196】
【表6】
【0197】
【0198】
５）抗体および抗原との親和性測定データの五つのグループを取得する。
【0199】
【表7】
【0200】
結論：得られた五つの好ましい抗体（番号は５～９である）は、すべて異なる程度の親和性の改善があり、親和性動態測定（ｆｏｒｔｅｂｉｏ）後、各抗体の親和性は、２．５～４．６倍向上し、ここで、親和性の向上は、主にＫｏｆｆの大幅な改善によるものであり、ＡＥ００１－６ＨＣ＋８ＬＣ（ＡＥ００１－８の抗体）クローンは、親和性の改善が最も優れている。
【0201】
重鎖配列の改変：
【表8】
【0202】
軽鎖配列の改変：
図示の説明：ｃｙａｎで標識された残基は、抗原結合残基である。
【表9】
【0203】
結論：最初にスクリーニングされた抗体に基づいて、ＣＤＲ配列のアミノ酸残基の一部を改変することにより、最適化された抗原－抗体結合能を有する抗体を得ることができ、さらに活性がより良い中和抗体を得ることができる。上記のリストから、発明者らは、元の抗体に基づいて、ＣＤＲ配列の一部を改変することにより、抗原ＩＦＰ３５に結合できるいくつかの抗体をスクリーニングして取得することが分かる。結論は、上記のＣＤＲの一部のアミノ酸配列を改変すると、より優れた活性を有する抗体を得るのに役立つ。ＣＤＲ配列の一部を改変することは、より最適化された抗体を得るために国際的に一般的に使用される重要な方法である。従って、本発明に開示された抗体の前記ＣＤＲ配列の相同性（同じＣＤＲ位置、同じ配列番号位置にある同じアミノ酸）は、５０％以上に達し、ＩＦＰ３５に結合する抗体は、本発明の保護範囲内に属するべきである。
【0204】
実施例５：中和抗体および抗原ＩＦＰ３５の複合体の微細な三次元結晶構造は、抗体が抗原を識別するための重要な残基およびＩＦＰ３５エピトープのアミノ酸残基の特徴を開示する
ＩＦＰ３５のＮＩＤドメイン（アミノ酸１２４－２２０のフラグメント）を免疫原として使用して、マウスを免疫し、マウス脾臓からＩＦＰ３５に対するモノクローナル抗体をスクリーニングして製造し、３５ＮＩＤｍＡｂとして記録する。
ＩＦＰ３５のＮＩＤドメイン（アミノ酸１２４－２２０のフラグメント）を免疫原として使用して、マウスを免疫し、マウス脾臓からＩＦＰ３５に対するモノクローナル抗体をスクリーニングして製造し、３５ＮＩＤｍＡｂとして記録する。
【0205】
当該モノクローナル抗体３５ＮＩＤｍＡｂは、中和活性を有するＩＦＰ３５ ＮＩＤ（フラグメント１２４～２２０）を標的とするモノクローナル抗体である。ＩＦＰ３５ ＮＩＤを標的とする３５ＮＩＤｍＡｂは、ＩＦＰ３５ ＮＩＤに強く結合する（Ｋｄ＝２８－１０－９Ｍ）。インビトロ精製実験は、３５ＮＩＤｍＡｂとＩＦＰ３５ ＮＩＤとを混合してから、ゲルろ過クロマトグラフィーによって精製され、二つが依然として結合していない。これらの結果は、ＩＦＰ３５ ＮＩＤを標的とする３５ＮＩＤｍＡｂがＩＦＰ３５ ＮＩＤに強く結合できることを示し、実験により、当該抗体は、中和活性を有することを示す。前述の実験において、当該モノクローナル抗体は、多発性硬化症（ＭＳ）の症状からマウスを保護できることを証明した。
【0206】
ＩＦＰ３５ ＮＩＤに対する３５ＮＩＤｍＡｂの中和活性の構造的基礎を明らかにするために、３５ＮＩＤｍＡｂおよびＩＦＰ３５ ＮＩＤの高親和性結合に基づいて、本発明の発明者らは、２．９オングストロームの解像度で３５ＮＩＤｍＡｂ ＦａｂおよびＩＦＰ３５ ＮＩＤ複合体の結晶構造およびＩＦＰ３５ ＮＩＤの構造を分析した。３５ＮＩＤｍＡｂ Ｆａｂ－ＩＦＰ３５ ＮＩＤの構造において、ＩＦＰ３５は、モノマーとして存在しないが、ＩＦＰ３５ ＮＩＤのみの構造において、ＩＦＰ３５ ＮＩＤは、ダイマーとして存在する。さらに、これらの二つの構造の単一のＩＦＰ３５ ＮＩＤの構造は、類似している。３５ＮＩＤｍＡｂ Ｆａｂ－ＩＦＰ３５ ＮＩＤ構造において、非対称ユニットに四つの３５ＮＩＤｍＡｂ Ｆａｂ－ＩＦＰ３５ ＮＩＤ複合体がある。各３５ＮＩＤｍＡｂ Ｆａｂは、それぞれ重鎖（Ａｂ＿ＶＨ）および軽鎖（Ａｂ＿ＶＬ）で構成され、一つのＩＦＰ３５ ＮＩＤと相互作用する。３５ＮＩＤｍＡｂ Ｆａｂは、主にＩＦＰ３５ ＮＩＤのｃ－末端を識別して結合する。当該相互作用インターフェースにおいて、関与するＩＦＰ３５ ＮＩＤの主なアミノ酸残基は、Ａｒｇ１６３、Ａｓｎ１６４、Ａｒｇ１９１、Ｇｌｎ１９４、Ｉｌｅ１９５、Ｇｌｎ１９７、Ｐｈｅ１９８、Ｔｈｒ１９９、Ｐｒｏ２０１、Ｇｌｎ２０６、Ｐｒｏ２０８、Ａｒｇ２１０を有する。
【0207】
さらに、本発明の発明者らは、構造を介して抗原と相互作用する重要な抗体アミノ酸を明らかにすることができる。これらのアミノ酸は、次のとおりである。
【0208】
抗体の重鎖可変領域のＣＤＲ１配列（２５ ＧＹＴＦＴＮＹＧ ３２）において、抗原に結合する二つのアミノ酸は、主にＡｓｎ３０およびＴｙｒ３１であり、抗体の重鎖可変領域のＣＤＲ２配列（５０ ＩＮＴＹＴＧＥＰ ５７）において、抗原に結合する三つのアミノ酸は、主にＡｓｎ５１、Ｔｙｒ５３およびＴｈｒ５４であり、抗体の重鎖可変領域のＣＤＲ３配列（９８ ＹＧＹＳＷＡＭＤＹ １０６）において、抗原に結合する二つのアミノ酸は、主にＴｙｒ１００およびＴｒｐ１０２である。
【0209】
抗体の軽鎖可変領域のＣＤＲ１配列（２６ ＳＳＳＶＳＹ ３１）において、抗原に結合する主なアミノ酸は、Ｓｅｒ３０およびＴｙｒ３１であり、抗体の軽鎖可変領域のＣＤＲ２配列（４９ ＤＴＳ ５１）において、抗原に結合する主なアミノ酸は、Ａｓｐ４９であり、抗体の軽鎖可変領域のＣＤＲ３配列（９０ ＷＳＳＮＰＰＩ ９６）において、抗原に結合する主なアミノ酸は、Ｓｅｒ９２およびＡｓｎ９３である。
【0210】
図１４に示されるように、抗原ＩＦＰ３５ ＮＩＤおよび中和抗体３５ＮＩＤｍＡｂ Ｆａｂの複合体の構造図である。Ａ図は、抗体および抗原の構造の全体像であり、抗体重鎖（Ａｂ－ＶＨ）は水色であり、抗体軽鎖（Ａｂ－ＶＬ）は緑色であり、抗原（ＩＦＰ３５ ＮＩＤ）は紫色である。Ｂ図は、二つの角度から見た抗体自体の構造図であり、ここで抗原と相互作用する残基が短い棒（ｓｔｉｃｋ）で表され、重要な残基は図にマークされており、抗体重鎖（Ａｂ－ＶＨ）は水色であり、抗体軽鎖（Ａｂ－ＶＬ）は緑色である。図Ｃは、抗体重鎖と抗原との間の相互作用の図であり、重要な残基は短い棒（ｓｔｉｃｋ）で表される。図Ｄは抗体軽鎖と抗原との間の相互作用の図であり、重要な残基は短い棒（ｓｔｉｃｋ）で表される。
【0211】
ＮＭＩ ＮＩＤの構造
ＩＦＰ３５ ＮＩＤの構造ならびに３５ＮＩＤｍＡｂ ＦａｂおよびＩＦＰ３５ ＮＩＤの複合体の構造に加えて、本発明の発明者らは、ＮＭＩ ＮＩＤの構造を分析した。ＮＭＩ ＮＩＤの全体的な構造は、ＩＦＰ３５ ＮＩＤの構造と非常によく似ている。ＩＦＰ３５ ＮＩＤの３５ＮＩＤｍＡｂ Ｆａｂの相互作用に関与するアミノ酸と比較して、ＮＭＩ ＮＩＤの対応する位置のアミノ酸は、ＩＦＰ３５ ＮＩＤとは異なり（以下の配列の比較図を参照）、対応する残基は、それぞれＡｒｇ１８５、Ａｓｎ１８６、Ｌｙｓ２１５、Ｌｙｓ２１８、Ｌｙｓ２１９、Ｇｌｕ２２１、Ｔｙｒ２２２、Ｐｒｏ２２３、Ｔｙｒ２２５、Ｃｙｓ２３０、Ａｒｇ２３２、Ｔｈｒ２３４である。これらのアミノ酸は、ＮＭＩ ＮＩＤと３５ＮＩＤｍＡｂとの相互作用に影響を与えることができる。しかし、これらのＮＭＩアミノ酸残基は、ＮＭＩ上の抗体結合エピトープを表しており、スクリーニングして中和抗体を取得するのに役立つ。
ＩＦＰ３５ ＮＩＤの構造ならびに３５ＮＩＤｍＡｂ ＦａｂおよびＩＦＰ３５ ＮＩＤの複合体の構造に加えて、本発明の発明者らは、ＮＭＩ ＮＩＤの構造を分析した。ＮＭＩ ＮＩＤの全体的な構造は、ＩＦＰ３５ ＮＩＤの構造と非常によく似ている。ＩＦＰ３５ ＮＩＤの３５ＮＩＤｍＡｂ Ｆａｂの相互作用に関与するアミノ酸と比較して、ＮＭＩ ＮＩＤの対応する位置のアミノ酸は、ＩＦＰ３５ ＮＩＤとは異なり（以下の配列の比較図を参照）、対応する残基は、それぞれＡｒｇ１８５、Ａｓｎ１８６、Ｌｙｓ２１５、Ｌｙｓ２１８、Ｌｙｓ２１９、Ｇｌｕ２２１、Ｔｙｒ２２２、Ｐｒｏ２２３、Ｔｙｒ２２５、Ｃｙｓ２３０、Ａｒｇ２３２、Ｔｈｒ２３４である。これらのアミノ酸は、ＮＭＩ ＮＩＤと３５ＮＩＤｍＡｂとの相互作用に影響を与えることができる。しかし、これらのＮＭＩアミノ酸残基は、ＮＭＩ上の抗体結合エピトープを表しており、スクリーニングして中和抗体を取得するのに役立つ。
【0212】
ＩＦＰ３５上の抗体結合部位配列とＮＭＩ相同フラグメントの配列との比較：
ＩＦＰ３５＿ヒト１５６ ＥＩＦＦＧＫＴＲＮＧＧＧＤＶＤＶＲＥＬ－－ＬＰＧＳＶＭＬＧＦＡＲＤＧＶＡＱＲＬＣＱＩＧＱＦＴＶＰＬＧＧＱＱＶＰＬＲＶ ２１１
ＮＭＩ＿＿ヒト １７８ ＥＬＳＦＳＫＳＲＮＧＧＧＥＶＤＲＶＤＹＤＲＱＳＧＳＡＶＩＴＦＶＥＩＧＶＡＤＫＩＬＫＫＫＥＹＰＬＹＩＮＱＴＣＨＲＶＴＶ ２３５
ＩＦＰ３５＿ヒト１５６ ＥＩＦＦＧＫＴＲＮＧＧＧＤＶＤＶＲＥＬ－－ＬＰＧＳＶＭＬＧＦＡＲＤＧＶＡＱＲＬＣＱＩＧＱＦＴＶＰＬＧＧＱＱＶＰＬＲＶ ２１１
ＮＭＩ＿＿ヒト １７８ ＥＬＳＦＳＫＳＲＮＧＧＧＥＶＤＲＶＤＹＤＲＱＳＧＳＡＶＩＴＦＶＥＩＧＶＡＤＫＩＬＫＫＫＥＹＰＬＹＩＮＱＴＣＨＲＶＴＶ ２３５
【0213】
実験方法：
（１）ＩＦＰ３５ ＮＩＤおよびＮＭＩ ＮＩＤの発現および精製
ＩＦＰ３５ ＮＩＤをコードする遺伝子フラグメント（残基１２４～２２０）をｐＧＥＸ－６ｐ－１にクローニングし、大腸菌で発現させる。ＩＦＰ３５ ＮＩＤのプラスミドをＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換する。ＬＢ培地に１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを加え、３７℃で細菌を培養する。ＯＤ６００が０．８～１．０に達する場合、最終濃度が０．５ｍＭであるイソプロピル（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ）－β－Ｄ－チオグラクトシダーゼ（ｔｈｉｏｇｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ）を使用して１６℃で２０時間誘導する。その後、４０００ｒｐｍで１５分間遠心分離して細菌を収集する。溶解緩衝液（２０Ｍｍ Ｔｒｉｓ ａｔ ｐＨ８．０、４００ｍＭのＮａＣｌ、５％のグリセロール（Ｇｌｙｃｅｒｏｌ））で細菌を再懸濁し、超音波ディスラプターで細菌を破壊し、その後、１６０００ｒｐｍで３０分間高速で遠心分離する。遠心分離された上清液をＧＳＴアフィニティーカラムと１時間結合させた後、ＧＳＴアフィニティーカラムを洗浄する。溶出緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ ａｔ Ｐｈ８．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３０ｍＭのグルタチオン（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ））で組換えタンパク質を溶出し、溶出されたタンパク質をＰＰａｓｅ酵素で消化し、イオン交換カラム（高塩緩衝液：２０ｍＭのＴｒｉｓ ａｔ Ｐｈ８．０、１ＭのＮａＣｌ、５％のグリセロール、低塩緩衝液：２０ｍＭのＴｒｉｓ ａｔ Ｐｈ８．０、１００ｍＭのＮａＣｌ、５％のグリセロール）およびゲルろ過クロマトグラフィーカラムＳｕｐｅｒｄｅｘ２００（緩衝液：２０ｍＭのＴｒｉｓ ａｔ Ｐｈ８．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ）でさらに精製する。ＳＤＳ－ＰＡＧＥタンパク質接着剤およびクマシーブリリアントブルー染色を使用して、組換えタンパク質の純度および完全性を検証する。
（１）ＩＦＰ３５ ＮＩＤおよびＮＭＩ ＮＩＤの発現および精製
ＩＦＰ３５ ＮＩＤをコードする遺伝子フラグメント（残基１２４～２２０）をｐＧＥＸ－６ｐ－１にクローニングし、大腸菌で発現させる。ＩＦＰ３５ ＮＩＤのプラスミドをＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換する。ＬＢ培地に１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを加え、３７℃で細菌を培養する。ＯＤ６００が０．８～１．０に達する場合、最終濃度が０．５ｍＭであるイソプロピル（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ）－β－Ｄ－チオグラクトシダーゼ（ｔｈｉｏｇｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ）を使用して１６℃で２０時間誘導する。その後、４０００ｒｐｍで１５分間遠心分離して細菌を収集する。溶解緩衝液（２０Ｍｍ Ｔｒｉｓ ａｔ ｐＨ８．０、４００ｍＭのＮａＣｌ、５％のグリセロール（Ｇｌｙｃｅｒｏｌ））で細菌を再懸濁し、超音波ディスラプターで細菌を破壊し、その後、１６０００ｒｐｍで３０分間高速で遠心分離する。遠心分離された上清液をＧＳＴアフィニティーカラムと１時間結合させた後、ＧＳＴアフィニティーカラムを洗浄する。溶出緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ ａｔ Ｐｈ８．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３０ｍＭのグルタチオン（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ））で組換えタンパク質を溶出し、溶出されたタンパク質をＰＰａｓｅ酵素で消化し、イオン交換カラム（高塩緩衝液：２０ｍＭのＴｒｉｓ ａｔ Ｐｈ８．０、１ＭのＮａＣｌ、５％のグリセロール、低塩緩衝液：２０ｍＭのＴｒｉｓ ａｔ Ｐｈ８．０、１００ｍＭのＮａＣｌ、５％のグリセロール）およびゲルろ過クロマトグラフィーカラムＳｕｐｅｒｄｅｘ２００（緩衝液：２０ｍＭのＴｒｉｓ ａｔ Ｐｈ８．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ）でさらに精製する。ＳＤＳ－ＰＡＧＥタンパク質接着剤およびクマシーブリリアントブルー染色を使用して、組換えタンパク質の純度および完全性を検証する。
【0214】
ＮＭＩ ＮＩＤ（１５５～２４０）遺伝子フラグメントの発現および精製の方法は、ＩＦＰ３５ ＮＩＤと同じである。
【0215】
（２）３５ＮＩＤｍＡｂ Ｆａｂの生成および精製
文献で報告された方法を使用して、３５ＮＩＤｍＡｂハイブリッド腫瘍細胞を作成し、３５ＮＩＤｍＡｂ抗体を生成する。３５ＮＩＤｍＡｂを取得した後、ＰＢＳに１ｍＭのＥＤＴＡおよび１ｍＭのを加え、この緩衝液を使用してパパイン（ｐａｐａｉｎ）を溶解する。精製された３５ｎｉｄｍａｂをパパインで溶解し、１００：１（３５ｎｉｄｍａｂ：パパイン）の質量比で３７℃で６～８時間反応させて、３５ＮＩＤｍＡｂ Ｆａｂを取得する。
文献で報告された方法を使用して、３５ＮＩＤｍＡｂハイブリッド腫瘍細胞を作成し、３５ＮＩＤｍＡｂ抗体を生成する。３５ＮＩＤｍＡｂを取得した後、ＰＢＳに１ｍＭのＥＤＴＡおよび１ｍＭのを加え、この緩衝液を使用してパパイン（ｐａｐａｉｎ）を溶解する。精製された３５ｎｉｄｍａｂをパパインで溶解し、１００：１（３５ｎｉｄｍａｂ：パパイン）の質量比で３７℃で６～８時間反応させて、３５ＮＩＤｍＡｂ Ｆａｂを取得する。
【0216】
（３）結晶および構造の解析
結晶化プロセスにおいて、３５ＮＩＤｍＡｂ ＦａｂおよびＩＦＰ３５ ＮＩＤを１：１の比率で混合し、ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００を使用して、ゲルろ過クロマトグラフィーによって分離および精製する。結晶スクリーニングは、ハンギングドロップ法を使用し、１６℃で０．２μＬのタンパク質（１０ｍｇ／ｍＬ）＋０．２μＬのプール液の混合物でスポットする。３５ＮＩＤｍＡｂ ＦａｂおよびＩＦＰ３５ ＮＩＤの結晶は、０．１ＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．５）、０．２ＭのＭｇＣｌ２、１８％のＰＥＧ３３５０を含むプール液で成長する。結晶液に１５％のＤＭＳＯを加えて低温で結晶を保護し、上海シンクロトロン放射装置のビームライン（ｂｅａｍｌｉｎｅ）ＢＬ１７ＵおよびＢＬ１８Ｕで結晶を回折する。ＨＫＬ３０００で回折データを処理する。
結晶化プロセスにおいて、３５ＮＩＤｍＡｂ ＦａｂおよびＩＦＰ３５ ＮＩＤを１：１の比率で混合し、ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００を使用して、ゲルろ過クロマトグラフィーによって分離および精製する。結晶スクリーニングは、ハンギングドロップ法を使用し、１６℃で０．２μＬのタンパク質（１０ｍｇ／ｍＬ）＋０．２μＬのプール液の混合物でスポットする。３５ＮＩＤｍＡｂ ＦａｂおよびＩＦＰ３５ ＮＩＤの結晶は、０．１ＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．５）、０．２ＭのＭｇＣｌ２、１８％のＰＥＧ３３５０を含むプール液で成長する。結晶液に１５％のＤＭＳＯを加えて低温で結晶を保護し、上海シンクロトロン放射装置のビームライン（ｂｅａｍｌｉｎｅ）ＢＬ１７ＵおよびＢＬ１８Ｕで結晶を回折する。ＨＫＬ３０００で回折データを処理する。
【0217】
単一波長異常分散法によって、ＩＦＰ３５ ＮＩＤおよびＮＭＩ ＮＩＤの構造を分析する。ＳＨＥＬＸ Ｃ／Ｄ、Ｐｈｅｎｉｘ．ＡｕｔｏｓｏｌおよびＰｈｅｎｉｘ．Ａｕｔｏｂｕｉｌｄを使用して、両方の初期構造モデルを取得する。ｃｏｏｔおよびｐｈｅｎｉｘを使用して構造を修正する。ＨＩＶ中和モノクローナル抗体ＹＺ２３（ＰＤＢコード３ＣＬＦ）およびＩＦＰ３５ＮＩＤの構造をモデルとして、分子置換法により３５ＮＩＤｍＡｂ Ｆａｂ －ＩＦＰ３５ ＮＩＤの複合体の構造を分析する。当該構造の初期モデルは、Ｐｈｅｎｉｘ．Ａｕｔｏｂｕｉｌｄを使用して構築された。ｃｏｏｔおよびｐｈｅｎｉｘを使用して構造を修正する。
【0218】
以下は、ＣＯＶＩＤ－１９およびインフルエンザウイルス感染に関する研究である。
【0219】
材料および方法
人体（患者または健常者）の血清中のＩＦＰ３５および／またはＮＭＩの検出方法
（１）サンプル採取：４ｍＬの静脈血を空腹時に採取し、抗凝固剤を含まない使い捨ての真空採血管に入れ、３０００ｒ／ｍｉｎで１５分間遠心分離し、血清を分離した後、血清サンプルチューブを５６℃の水浴に３０分間以上入れてウイルスを不活化する。その後、サンプルチューブはテストのために－２０℃または－８０℃の冷蔵庫に保管され、凍結と解凍の繰り返しを回避する。
（２）サンプルの検出：
酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）を使用して、血清中のＩＦＰ３５および／またはＮＭＩの濃度を検出し、検出ステップは、次のとおりである。
２．１ 試薬、サンプル、標準品の製造：
サンプルおよび試薬を徐々に室温（１８～２５℃）まで溶解する。標準品を５０００ｐｇ／ｍＬ、２５００ｐｇ／ｍＬ、１２５０ｐｇ／ｍＬ、６２５ｐｇ／ｍＬ、３１２ｐｇ／ｍＬ、１５６ｐｇ／ｍＬ、７８ｐｇ／ｍＬの順に希釈する。標準品の希釈液（０ｐｇ／ｍＬ）は、空白ウェルとして直接使用される。検出結果の妥当性を確保するために、各検出の対照品は、すぐに使用できるように調整する必要がある。
２．２ 検出：
基準ウェル、試験サンプルウェル、空白ウェルをそれぞれ設定する。ＥＬＩＳＡプレートを覆い、３７℃で２時間インキュベートする。液体を廃棄し、スピンドライし、試験作業溶液Ａを追加し、ＥＬＩＳＡプレートを覆い、３７℃で１時間インキュベートする。ウェル内の液体を廃棄し、スピンドライし、プレートを５回洗浄する。試験作業溶液Ｂを加え、３７℃で１時間インキュベートし、ウェル内の液体を廃棄し、スピンドライし、プレートを５回洗浄する。各ウェルに９０μＬの基質溶液を加え、ＥＬＩＳＡプレートを覆い、暗所で３７℃で発色し（反応時間は、１５～２５分間に制御し、基準ウェルの最初３～４ウェルに明確な青色の勾配がある場合、最後の３～４ウェルの勾配が明らかでない場合、終了することができる）、各ウェルに５０μＬの停止溶液加えて、反応を停止し、停止溶液の追加順は、基質溶液と同じであり、色が不均一な場合、ＥＬＩＳＡプレートを静かに振って、溶液ができるだけ均一になるようにしてください。ＥＬＩＳＡプレートの底に水滴がなく、ウェルに気泡がないことを確認した後、マイクロプレートリーダーを使用して各ウェルの光学密度を測定する。
２．３ 結果の処理：
標準曲線から血清中のＩＦＰ３５および／またはＮＭＩの濃度を計算し、ＳＰＳＳ統計ソフトウェアを使用してデータを処理し、平均値±標準差を使用して、サンプルグループおよび対照グループのデータに対するｔ検定を表し、Ｐ＜０．０５は、差が統計学的に意味を有することを示す。
人体（患者または健常者）の血清中のＩＦＰ３５および／またはＮＭＩの検出方法
（１）サンプル採取：４ｍＬの静脈血を空腹時に採取し、抗凝固剤を含まない使い捨ての真空採血管に入れ、３０００ｒ／ｍｉｎで１５分間遠心分離し、血清を分離した後、血清サンプルチューブを５６℃の水浴に３０分間以上入れてウイルスを不活化する。その後、サンプルチューブはテストのために－２０℃または－８０℃の冷蔵庫に保管され、凍結と解凍の繰り返しを回避する。
（２）サンプルの検出：
酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）を使用して、血清中のＩＦＰ３５および／またはＮＭＩの濃度を検出し、検出ステップは、次のとおりである。
２．１ 試薬、サンプル、標準品の製造：
サンプルおよび試薬を徐々に室温（１８～２５℃）まで溶解する。標準品を５０００ｐｇ／ｍＬ、２５００ｐｇ／ｍＬ、１２５０ｐｇ／ｍＬ、６２５ｐｇ／ｍＬ、３１２ｐｇ／ｍＬ、１５６ｐｇ／ｍＬ、７８ｐｇ／ｍＬの順に希釈する。標準品の希釈液（０ｐｇ／ｍＬ）は、空白ウェルとして直接使用される。検出結果の妥当性を確保するために、各検出の対照品は、すぐに使用できるように調整する必要がある。
２．２ 検出：
基準ウェル、試験サンプルウェル、空白ウェルをそれぞれ設定する。ＥＬＩＳＡプレートを覆い、３７℃で２時間インキュベートする。液体を廃棄し、スピンドライし、試験作業溶液Ａを追加し、ＥＬＩＳＡプレートを覆い、３７℃で１時間インキュベートする。ウェル内の液体を廃棄し、スピンドライし、プレートを５回洗浄する。試験作業溶液Ｂを加え、３７℃で１時間インキュベートし、ウェル内の液体を廃棄し、スピンドライし、プレートを５回洗浄する。各ウェルに９０μＬの基質溶液を加え、ＥＬＩＳＡプレートを覆い、暗所で３７℃で発色し（反応時間は、１５～２５分間に制御し、基準ウェルの最初３～４ウェルに明確な青色の勾配がある場合、最後の３～４ウェルの勾配が明らかでない場合、終了することができる）、各ウェルに５０μＬの停止溶液加えて、反応を停止し、停止溶液の追加順は、基質溶液と同じであり、色が不均一な場合、ＥＬＩＳＡプレートを静かに振って、溶液ができるだけ均一になるようにしてください。ＥＬＩＳＡプレートの底に水滴がなく、ウェルに気泡がないことを確認した後、マイクロプレートリーダーを使用して各ウェルの光学密度を測定する。
２．３ 結果の処理：
標準曲線から血清中のＩＦＰ３５および／またはＮＭＩの濃度を計算し、ＳＰＳＳ統計ソフトウェアを使用してデータを処理し、平均値±標準差を使用して、サンプルグループおよび対照グループのデータに対するｔ検定を表し、Ｐ＜０．０５は、差が統計学的に意味を有することを示す。
【0220】
細胞株およびウイルス株
ＨＥＫ２９３Ｔ（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ－１１２６８）、Ａ５４９（ＡＴＣＣ、ＣＲＭ－ＣＲＬ－１８５）およびＭＤＣＫ（ＮＢＬ－２）（ＡＴＣＣ ＣＣＬ－３４ＴＭ）細胞株をＤＭＥＭ培地で培養し、１０％のウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ）を追加する。ＴＨＰ１（ＡＴＣＣ、ＴＩＢ－２０２ＴＭ）およびＲＡＷ２６４．７細胞（ＡＴＣＣＴＩＢ－７１ＴＭ）をＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ、Ｃ１８７５５００ＢＴ）で培養する。９日齢のＳＰＦニワトリ胚は、広東大華農生物技術有限公司から購入した。Ａ型インフルエンザウイルスＡ／プエルトリコ／８／１９３４（Ｈ１Ｎ１）（ＰＲ８）毒株をＳＰＦニワトリ胚で増殖させ、ショ糖密度勾配遠心分離で精製した後、ＭＯＣＫ細胞でウイルス力価を測定する。
ＨＥＫ２９３Ｔ（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ－１１２６８）、Ａ５４９（ＡＴＣＣ、ＣＲＭ－ＣＲＬ－１８５）およびＭＤＣＫ（ＮＢＬ－２）（ＡＴＣＣ ＣＣＬ－３４ＴＭ）細胞株をＤＭＥＭ培地で培養し、１０％のウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ）を追加する。ＴＨＰ１（ＡＴＣＣ、ＴＩＢ－２０２ＴＭ）およびＲＡＷ２６４．７細胞（ＡＴＣＣＴＩＢ－７１ＴＭ）をＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ、Ｃ１８７５５００ＢＴ）で培養する。９日齢のＳＰＦニワトリ胚は、広東大華農生物技術有限公司から購入した。Ａ型インフルエンザウイルスＡ／プエルトリコ／８／１９３４（Ｈ１Ｎ１）（ＰＲ８）毒株をＳＰＦニワトリ胚で増殖させ、ショ糖密度勾配遠心分離で精製した後、ＭＯＣＫ細胞でウイルス力価を測定する。
【0221】
抗体および試薬
ＩＦＰ３５モノクローナル抗体（Ｈ００００３４３０－Ｍ０１）は、Ａｂｎｏｖａ会社から購入した。ＮＭＩ抗体（ａｂ１８３７２４）は、ａｂｃａｍから購入した。Ａ型インフルエンザウイルスＮＳ１抗体（ｓｃ－１３０５６８）は、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚから購入した。抗Ａ型インフルエンザウイルス核タンパク質抗体は、ａｂｃａｍ（ａｂ１２８１９３）から購入した。Ｅ６４４６（二塩酸塩）（ＨＹ－１２７５６Ａ）（ＴＬＲ７／９阻害剤）およびＣＵ－ＣＰＴ－９ｂ（ＨＹ－１１２０５１）（ＴＬＲ８阻害剤）は、Ｍｅｄ ＣｈｅｍＥｘｐｒｅｓｓ（ＭＣＥ、米国）から購入した。ＴＬＲ３ ｄｓＲＮＡ阻害剤（６１４３１０）は、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅから購入した。Ｒｅｓａｔｏｒｖｉｄ（ＴＡＫ－２４２）は、Ｓｅｌｌｅｃｋ（米国）から購入した。
ＩＦＰ３５モノクローナル抗体（Ｈ００００３４３０－Ｍ０１）は、Ａｂｎｏｖａ会社から購入した。ＮＭＩ抗体（ａｂ１８３７２４）は、ａｂｃａｍから購入した。Ａ型インフルエンザウイルスＮＳ１抗体（ｓｃ－１３０５６８）は、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚから購入した。抗Ａ型インフルエンザウイルス核タンパク質抗体は、ａｂｃａｍ（ａｂ１２８１９３）から購入した。Ｅ６４４６（二塩酸塩）（ＨＹ－１２７５６Ａ）（ＴＬＲ７／９阻害剤）およびＣＵ－ＣＰＴ－９ｂ（ＨＹ－１１２０５１）（ＴＬＲ８阻害剤）は、Ｍｅｄ ＣｈｅｍＥｘｐｒｅｓｓ（ＭＣＥ、米国）から購入した。ＴＬＲ３ ｄｓＲＮＡ阻害剤（６１４３１０）は、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅから購入した。Ｒｅｓａｔｏｒｖｉｄ（ＴＡＫ－２４２）は、Ｓｅｌｌｅｃｋ（米国）から購入した。
【0222】
マウス
Ｃ５７ＢＬ／６（Ｂ６）野生型マウスは、広東省医学実験動物センター（ＧＤＭＬＡＣ）から購入した。公表された文献報告によると、Ｃ５７ＢＬ／６マウスモデルを使用して、ＮＭＩ－／－またはＩＦＰ３５－／－純合子ホモ接合型遺伝子ノックアウトマウスを構築する。実験で使用されるすべてのマウスは、８～１２週齢であり、性別が一致している。マウスは、ＳＰＦ環境で飼育され、飼育条件は、中山大学動物福祉使用委員会の基準を満たす。
Ｃ５７ＢＬ／６（Ｂ６）野生型マウスは、広東省医学実験動物センター（ＧＤＭＬＡＣ）から購入した。公表された文献報告によると、Ｃ５７ＢＬ／６マウスモデルを使用して、ＮＭＩ－／－またはＩＦＰ３５－／－純合子ホモ接合型遺伝子ノックアウトマウスを構築する。実験で使用されるすべてのマウスは、８～１２週齢であり、性別が一致している。マウスは、ＳＰＦ環境で飼育され、飼育条件は、中山大学動物福祉使用委員会の基準を満たす。
【0223】
プラスミドの構築およびトランスフェクション
すべてのベクターは、シーケンシングによって検証され、一過性発現のためにＥｘＦｅｃｔ２０００トランスフェクション試薬（Ｖａｚｙｍｅ、Ｔ２０２－１）で細胞をトランスフェクトする。簡単に説明すると、ウイルス感染の２４時間前に、２９３Ｔ細胞に各プラスミドを一過性にトランスフェクトし、次に５ＭＯＩ ＰＲ８ウイルスを６ウェルプレートの細胞に接種する。細胞を１時間インキュベートした後、ＰＢＳで１回洗浄してから、ＦＢＳを含まない正常なＤＭＥＭ培地と交換する。次に、上清液を収集して、ウイルス力価を測定し、異なる時点でのサンプルを収集し、Ｗｅｓｔｅｒｎブロット電気泳動によって分析する。
すべてのベクターは、シーケンシングによって検証され、一過性発現のためにＥｘＦｅｃｔ２０００トランスフェクション試薬（Ｖａｚｙｍｅ、Ｔ２０２－１）で細胞をトランスフェクトする。簡単に説明すると、ウイルス感染の２４時間前に、２９３Ｔ細胞に各プラスミドを一過性にトランスフェクトし、次に５ＭＯＩ ＰＲ８ウイルスを６ウェルプレートの細胞に接種する。細胞を１時間インキュベートした後、ＰＢＳで１回洗浄してから、ＦＢＳを含まない正常なＤＭＥＭ培地と交換する。次に、上清液を収集して、ウイルス力価を測定し、異なる時点でのサンプルを収集し、Ｗｅｓｔｅｒｎブロット電気泳動によって分析する。
【0224】
リアルタイム－蛍光定量ＰＣＲ
ＴＲＩｚｏｌ ＬＳ試薬（米国）を使用して、細胞または肺組織からトータルＲＮＡを抽出する。次に、特異的プライマーＵ１２Ａ：ＡＧＣＡＡＡＡＧＡＧＧレトロウイルスゲノムＲＮＡ（１μｇ）を使用し、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＩＩ第一の鎖ｃＤＮＡ合成キット（Ｔａｋａｒａ）を使用して逆転写システムを構成する。ウイルスｍＲＮＡは、最初にｍＲＮＡ分離キット（中国葉森生物技術有限公司）で精製し、次にオリゴ（ｏｌｉｇｏ）（ｄＴ）１８をプライマーとして逆転写反応する。ｃＤＮＡ産物をテンプレートとして使用し、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用してｑＰＣＲ増幅を行う。Ｑｕａｎｔ Ｓｔｕｄｉｏ５（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、定量的ＰＣＲ反応を実行する。標準曲線法を使用してデータを分析する。
ＴＲＩｚｏｌ ＬＳ試薬（米国）を使用して、細胞または肺組織からトータルＲＮＡを抽出する。次に、特異的プライマーＵ１２Ａ：ＡＧＣＡＡＡＡＧＡＧＧレトロウイルスゲノムＲＮＡ（１μｇ）を使用し、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＩＩ第一の鎖ｃＤＮＡ合成キット（Ｔａｋａｒａ）を使用して逆転写システムを構成する。ウイルスｍＲＮＡは、最初にｍＲＮＡ分離キット（中国葉森生物技術有限公司）で精製し、次にオリゴ（ｏｌｉｇｏ）（ｄＴ）１８をプライマーとして逆転写反応する。ｃＤＮＡ産物をテンプレートとして使用し、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用してｑＰＣＲ増幅を行う。Ｑｕａｎｔ Ｓｔｕｄｉｏ５（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、定量的ＰＣＲ反応を実行する。標準曲線法を使用してデータを分析する。
【0225】
ＥＬＩＳＡ
マウスｍＩＦＰ３５（Ｅ１０４６０ｍ）ＥＬＩＳＡキットは、ＥＩＡａｂ社から購入した。ヒトＩＦＰ３５ ＥＬＩＳＡキット（ＯＫＥＨ０２０８８）は、ＡＶＩＶＡ ＳＹＳＴＥＭ ＢＩＯＬＯＧＹから購入した。ヒトｈＮＭＩ（ＣＳＢ－ＥＬ０１５ ８９３ＨＵ）、マウスｍＮＭＩ（ＣＳＢ－ＥＬ０１５８９３ＭＯ）ＥＬＩＳＡキットは、すべてＣＵＳＡＢＩＯ社から購入した。取扱説明書に従ってＥＬＩＳＡ実験を行う。簡単な説明は次のとおりである。１００μＬの多重希釈の標準品、検出サンプル、陰性および空白対照をそれぞれ対応する検出ＥＬＩＳＡプレートに追加し、サンプルごとに二つの複製（二重）を設定する。メンブレンを覆った後、３７℃で２時間インキュベートする。メンブレンをはがし、ウェル中の液体を捨て、紙タオルの上にバックオフするように逆様にして置き、軽く叩いて残りの液体を捨てる。各ウェルに１００μＬのビオチン標識（１×）の検出用抗体を加え、メンブレンを覆い、３７℃で１時間インキュベートする。メンブレンをはがし、ウェル中の液体を捨て、紙タオルの上にバックオフするように逆様にして置き、軽く叩いて残りの液体を捨てる。１×洗浄緩衝液でプレートを３回洗浄する。各ウェルに１００μＬのＨＲＰ標識の検出二次抗体を加えた後、メンブレンを覆い、３７℃で１時間インキュベートする。メンブレンをはがし、ウェル中の液体を捨て、紙タオルの上にバックオフするように逆様にして置き、軽く叩いて残りの液体を捨てる。１×洗浄緩衝液でプレートを５回洗浄する。各ウェルに９０μｌのＴＭＢ基質を加え、暗所で３７℃で１５～３０分間インキュベートする。各ウェルに５０μｌの停止溶液を加え、ＥＬＩＳＡプレートリーダーでＯＤ４５０吸光度値を読み取る。
マウスｍＩＦＰ３５（Ｅ１０４６０ｍ）ＥＬＩＳＡキットは、ＥＩＡａｂ社から購入した。ヒトＩＦＰ３５ ＥＬＩＳＡキット（ＯＫＥＨ０２０８８）は、ＡＶＩＶＡ ＳＹＳＴＥＭ ＢＩＯＬＯＧＹから購入した。ヒトｈＮＭＩ（ＣＳＢ－ＥＬ０１５ ８９３ＨＵ）、マウスｍＮＭＩ（ＣＳＢ－ＥＬ０１５８９３ＭＯ）ＥＬＩＳＡキットは、すべてＣＵＳＡＢＩＯ社から購入した。取扱説明書に従ってＥＬＩＳＡ実験を行う。簡単な説明は次のとおりである。１００μＬの多重希釈の標準品、検出サンプル、陰性および空白対照をそれぞれ対応する検出ＥＬＩＳＡプレートに追加し、サンプルごとに二つの複製（二重）を設定する。メンブレンを覆った後、３７℃で２時間インキュベートする。メンブレンをはがし、ウェル中の液体を捨て、紙タオルの上にバックオフするように逆様にして置き、軽く叩いて残りの液体を捨てる。各ウェルに１００μＬのビオチン標識（１×）の検出用抗体を加え、メンブレンを覆い、３７℃で１時間インキュベートする。メンブレンをはがし、ウェル中の液体を捨て、紙タオルの上にバックオフするように逆様にして置き、軽く叩いて残りの液体を捨てる。１×洗浄緩衝液でプレートを３回洗浄する。各ウェルに１００μＬのＨＲＰ標識の検出二次抗体を加えた後、メンブレンを覆い、３７℃で１時間インキュベートする。メンブレンをはがし、ウェル中の液体を捨て、紙タオルの上にバックオフするように逆様にして置き、軽く叩いて残りの液体を捨てる。１×洗浄緩衝液でプレートを５回洗浄する。各ウェルに９０μｌのＴＭＢ基質を加え、暗所で３７℃で１５～３０分間インキュベートする。各ウェルに５０μｌの停止溶液を加え、ＥＬＩＳＡプレートリーダーでＯＤ４５０吸光度値を読み取る。
【0226】
肺の組織病理学
すべてのマウス肺組織を４％のパラホルムアルデヒドで固定し、パラフィンに包埋し、４μｍのスライスに切断する。次に、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）ですべての切片を染色し、顕微鏡下で組織の損傷、壊死および炎症性細胞の浸潤状況を確認し、様々な領域をランダムに選択して写真を撮る。
すべてのマウス肺組織を４％のパラホルムアルデヒドで固定し、パラフィンに包埋し、４μｍのスライスに切断する。次に、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）ですべての切片を染色し、顕微鏡下で組織の損傷、壊死および炎症性細胞の浸潤状況を確認し、様々な領域をランダムに選択して写真を撮る。
【0227】
患者の血清サンプル
インフルエンザウイルスの研究での患者の血液および正常なボランティア対照サンプルは、中山大学医学部、中山大学第６付属病院、中山大学第１付属病院、広州医科大学第１附属病院、広東省の婦人や子供などからのものである。血清を分離した後、－８０℃で保存する。血清サンプルの検出は、すべての参加者のインフォームドコンセントを得た上で関連病院の人体実験論理委員会によって承認された（２０１７０１０９３）。
インフルエンザウイルスの研究での患者の血液および正常なボランティア対照サンプルは、中山大学医学部、中山大学第６付属病院、中山大学第１付属病院、広州医科大学第１附属病院、広東省の婦人や子供などからのものである。血清を分離した後、－８０℃で保存する。血清サンプルの検出は、すべての参加者のインフォームドコンセントを得た上で関連病院の人体実験論理委員会によって承認された（２０１７０１０９３）。
【0228】
論理的説明
中華人民共和国国務院が承認した「実験動物管理規則」に従って動物実験を行う。当該動物実験は、中山大学動物福祉使用委員会（ＩＡＣＵＣ）によって承認され、ライセンス番号は、ＳＹＸＫ２０１６－０１１２である。インフルエンザウイルスに関連するすべてのの操作は、第３レベルのバイオセーフティラボで完了した。
中華人民共和国国務院が承認した「実験動物管理規則」に従って動物実験を行う。当該動物実験は、中山大学動物福祉使用委員会（ＩＡＣＵＣ）によって承認され、ライセンス番号は、ＳＹＸＫ２０１６－０１１２である。インフルエンザウイルスに関連するすべてのの操作は、第３レベルのバイオセーフティラボで完了した。
【0229】
データ分析
定量的データは、平均値±ＳＤで示し、ペアリングしない学生のｔ検定を使用して、グループ間の差が統計学的意味を有するかどうかを判断する。ログランク検定を使用して、異なる治療を受けたマウスの生存率に有意差があるかどうかを分析する。Ｐ値が０．０５未満である場合、統計学的意味を有すると見なされ、Ｐ値が０．００１未満である場合、有意差があると見なされ、Ｐ＞０．０５、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
定量的データは、平均値±ＳＤで示し、ペアリングしない学生のｔ検定を使用して、グループ間の差が統計学的意味を有するかどうかを判断する。ログランク検定を使用して、異なる治療を受けたマウスの生存率に有意差があるかどうかを分析する。Ｐ値が０．０５未満である場合、統計学的意味を有すると見なされ、Ｐ値が０．００１未満である場合、有意差があると見なされ、Ｐ＞０．０５、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【0230】
実施例６：新型コロナウイルス肺炎（ＣＯＶＩＤ－１９）の血清学的指標としてのＩＦＰ３５および／またはＮＭＩの同定
本発明の発明者らは、指定された病院によって新型コロナウイルス肺炎について収集された新型コロナウイルス感染症の５人の重症／重篤の患者の血漿サンプルを検出し、すべての患者のＩＦＰ３５およびＮＭＩレベルが有意に上昇したことを発見した。同様に、より多くの（数十の）患者血清サンプルを使用してさらに分析すると、同じ結果が得られる。さらに注目すべきは、患者の臨床症状と予後を合わせて見ると、ＩＦＰ３５およびＮＭＩのレベルには高い相関関係があり、即ち、ＩＦＰ３５およびＮＭＩのレベルが高いほど、患者の臨床症状は重症になり、予後は悪化する（本研究でＩＦＰ３５およびＮＭＩのレベルが最も高い患者は、最終的に死亡する）。図１５は、５人の患者の血清ＩＦＰ３５およびＮＭＩの結果を示し、一部のサンプル中のＩＦＰ３５の含有量は、５００～７００ｐｇ／ｍＬのレベルに達し、これは、本発明の発明者らによって以前に発見された敗血症患者の致死レベル（約７００ｐｇ／ｍＬ）に近いレベルに達し、これは、ＩＦＰ３５および／またはＮＭＩが、特に重症／重篤の患者において、新型コロナウイルス感染の炎症反応に関連していることを示すため、ＣＯＶＩＤ－１９に感染された患者の血液検出マーカーとして使用して、医療スタッフが患者の炎症性疾患の重症度および予後を判断するのに役立てることができる。
本発明の発明者らは、指定された病院によって新型コロナウイルス肺炎について収集された新型コロナウイルス感染症の５人の重症／重篤の患者の血漿サンプルを検出し、すべての患者のＩＦＰ３５およびＮＭＩレベルが有意に上昇したことを発見した。同様に、より多くの（数十の）患者血清サンプルを使用してさらに分析すると、同じ結果が得られる。さらに注目すべきは、患者の臨床症状と予後を合わせて見ると、ＩＦＰ３５およびＮＭＩのレベルには高い相関関係があり、即ち、ＩＦＰ３５およびＮＭＩのレベルが高いほど、患者の臨床症状は重症になり、予後は悪化する（本研究でＩＦＰ３５およびＮＭＩのレベルが最も高い患者は、最終的に死亡する）。図１５は、５人の患者の血清ＩＦＰ３５およびＮＭＩの結果を示し、一部のサンプル中のＩＦＰ３５の含有量は、５００～７００ｐｇ／ｍＬのレベルに達し、これは、本発明の発明者らによって以前に発見された敗血症患者の致死レベル（約７００ｐｇ／ｍＬ）に近いレベルに達し、これは、ＩＦＰ３５および／またはＮＭＩが、特に重症／重篤の患者において、新型コロナウイルス感染の炎症反応に関連していることを示すため、ＣＯＶＩＤ－１９に感染された患者の血液検出マーカーとして使用して、医療スタッフが患者の炎症性疾患の重症度および予後を判断するのに役立てることができる。
【0231】
本発明の発明者らの他の研究によると（例えば、以下のインフルエンザウイルス研究を参照）、血清におけるこれらの炎症因子の増加は炎症反応を活性化し、過剰な炎症反応を引き起こすので、これらの炎症因子を阻害し、炎症反応の程度を減少させ、ウイルス感染によって引き起こされる病気および脂肪の程度を減少させることができることを証明した。これから、血液中のＩＦＰ３５および／またはＮＭＩを阻害するための薬物（抗体薬物または化学薬物）の使用は、新型コロナウイルスＣＯＶＩＤ－１９感染によって引き起こされる過度の炎症反応の発生を阻害できると推測することができる。
【0232】
実施例７：インフルエンザウイルス感染の血清学的指標としてのＩＦＰ３５および／またはＮＭＩの同定
本発明の発明者らの予備研究（早時研究）は、ＬＰＳ刺激がマクロファージにＮＭＩを発現および放出させることを誘導できることを示すため、本研究では、陽性対照として使用し、ＰＢＳを陰性対照として使用する。
本発明の発明者らの予備研究（早時研究）は、ＬＰＳ刺激がマクロファージにＮＭＩを発現および放出させることを誘導できることを示すため、本研究では、陽性対照として使用し、ＰＢＳを陰性対照として使用する。
【0233】
ＮＭＩの場合、Ａ型インフルエンザウイルスに感染された患者の血清ＮＭＩは、健康なドナーの血清ＮＭＩよりも高く（図１６のＡ図）、インフルエンザウイルスＰＲ８は、ヒト単球（ＴＨＰ１）、上皮細胞（Ａ５４９）を刺激して、ＲＡＷ２６４．７細胞は、細胞が培地にＮｍｉを放出させることができ（図１６のＢ、Ｃ、Ｅ図）、ＰＲ８に感染されたＣ５７ＢＬ／６マウスにおいて、血清ＮＭＩは、対照グループよりも有意に高く（図１６のＤ図）、細胞ＮＭＩおよびＩＦＰ３５は、ＰＲ８感染後の徐々に増加し、Ａ５４９細胞で異なる存在量を示す（図１６のＦ図）。
【0234】
ＩＦＰ３５で観察された結果は、ＮＭＩと同様であり、Ａ型インフルエンザウイルスに感染された患者の血清ＮＭＩは、健康なドナーの血清ＮＭＩよりも高く（図１７のＢ図）、インフルエンザウイルスＰＲ８は、ＲＡＷ２６４．７細胞を刺激して、細胞が培地にＮｍｉを放出させることができ（図１７のＡ図）、ＰＲ８に感染されたＣ５７ＢＬ／６マウスにおいて、血清ＩＦＰ３５は、対照グループよりも有意に高い（図１７のＣ図）。
【0235】
図１８は、１６人のインフルエンザ患者および１０人の健康な人の血清中のＮＭＩおよびＩＦＰ３５の含有量を示し、ここで、インフルエンザ患者の血清中のＮＭＩおよびＩＦＰ３５の含有量は、健康な人の含有量よりもはるかに高く、集中治療室（ＩＣＵ）で重度の肺炎を発症する患者（黒四角でマーク）の含有量は、特に高い。
【0236】
これらのすべての結果は、インフルエンザウイルス感染がインビトロおよびインビボでＮＭＩ／ＩＦＰ３５の生成につながることができることを示す。
【0237】
実施例８：インフルエンザウイルス感染に対するＮＭＩおよびＩＦＰ３５欠失の保護効果の検証
Ｃ５７ＢＬ／６マウスモデルでＮＭＩ－／－ノックアウトマウスを構築する。一つのグループのＣ５７ＢＬ／６野生型またはＮＭＩ－／－ノックアウトマウスをそれぞれ２×１０６ｐｆｕのＰＲ８ウイルスで試験し、感染されたマウスの９０％を殺すことができる。すべてのマウスを毎日監視して、生きているかどうか、体重が減っているかどうか、および病気の臨床症状があるかどうかを判断する（例えば、無気力、脱毛、しわの寄った毛皮、腰下ろしの姿勢、急速な浅い呼吸、聞こえるラ音）。各マウスの毎日の臨床スコアは、０（無症状）～５（死にかけ）等である。図１９のＡ図およびＢ図に示されるように、ＮＮＭＩ－／－マウスは、軽度の臨床症状を示し、体重が減少する（％）。対照的に、野生型マウスの臨床スコアははるかに高く、体重は、３０％近く減少する。Ｈ＆Ｅ染色の結果（図１９のＣ図）：ＰＲ８に感染された野生型マウスの肺組織が損傷され、炎症性滲出液およびうっ血が肺泡空間および肺泡間隔を満たす。ＮＭＩ－／－マウスの肺組織は、ＰＢＳに感染された対象マウスと同様に、明らかな病変がなく、基本的に無傷のままである。実験が終わる際に、野生型マウスと比較して、ＮＮＭＩ－／－マウスは、致死的なＰＲ８感染（ＬＤ９０）から大きい程度で保護される（図１９のＤ図）。
Ｃ５７ＢＬ／６マウスモデルでＮＭＩ－／－ノックアウトマウスを構築する。一つのグループのＣ５７ＢＬ／６野生型またはＮＭＩ－／－ノックアウトマウスをそれぞれ２×１０６ｐｆｕのＰＲ８ウイルスで試験し、感染されたマウスの９０％を殺すことができる。すべてのマウスを毎日監視して、生きているかどうか、体重が減っているかどうか、および病気の臨床症状があるかどうかを判断する（例えば、無気力、脱毛、しわの寄った毛皮、腰下ろしの姿勢、急速な浅い呼吸、聞こえるラ音）。各マウスの毎日の臨床スコアは、０（無症状）～５（死にかけ）等である。図１９のＡ図およびＢ図に示されるように、ＮＮＭＩ－／－マウスは、軽度の臨床症状を示し、体重が減少する（％）。対照的に、野生型マウスの臨床スコアははるかに高く、体重は、３０％近く減少する。Ｈ＆Ｅ染色の結果（図１９のＣ図）：ＰＲ８に感染された野生型マウスの肺組織が損傷され、炎症性滲出液およびうっ血が肺泡空間および肺泡間隔を満たす。ＮＭＩ－／－マウスの肺組織は、ＰＢＳに感染された対象マウスと同様に、明らかな病変がなく、基本的に無傷のままである。実験が終わる際に、野生型マウスと比較して、ＮＮＭＩ－／－マウスは、致死的なＰＲ８感染（ＬＤ９０）から大きい程度で保護される（図１９のＤ図）。
【0238】
相同タンパク質ＩＦＰ３５を研究するために、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９技術を使用してＣ５７ＢＬ／６マウスのＩＦＰ３５遺伝子をノックアウトする。それぞれＬＤ９０用量のＰＲ８ウイルスを使用してＣ５７ＢＬ／６野生型またはＩＦＰ３５－／－遺伝子ノックアウトマウスを感染して、試験を行う。図２０に示されるように、ＩＦＰ３５－／－ノックアウトマウスは、明らかな肺損傷（Ｂ図）がなく、野生型マウスと比較して、生存率（％）はわずかに増加し（Ｃ図）、興味深いことは、体重変化（％）は対照グループと有意差がない（Ａ図）。
【0239】
上記の証拠は、ＮＭＩおよび／またはＩＦＰ３５のインビボレベルを低下させることが、インフルエンザウイルス感染に対する保護効果を有することを示す。
【0240】
実施例９：インフルエンザウイルス感染に対する外因性阻害剤の保護効果の検証
ＩＦＰ３５の外因性阻害が同様の保護効果を達成できるかどうかを検証するために、薬物としてＩＦＰ３５中和抗体を使用して、ウイルス感染の１日前に１２匹のＣ５７ＢＬ／６野生型マウスを治療し、同時に、陰性対照として同量のマウスＩｇＧを摂取して、Ｃ５７ＢＬ／６野生型マウスの別のグループを治療し、各マウスに２００μｇの抗体を５日間連続して静脈内注射し、次に、すべてのマウスは、０日目にＬＤ９０のＰＲ８ウイルスを接種する。各マウスに対して体重を測定し、しわの寄った毛皮、無気力、忍び寄り、腰下ろし、息切れ、聞こえるラ音などを監視し、毎日臨床症状に対して採点し、２週間持続する。実験プロトコルの概略図は、図２１のＡ図を参照する。
ＩＦＰ３５の外因性阻害が同様の保護効果を達成できるかどうかを検証するために、薬物としてＩＦＰ３５中和抗体を使用して、ウイルス感染の１日前に１２匹のＣ５７ＢＬ／６野生型マウスを治療し、同時に、陰性対照として同量のマウスＩｇＧを摂取して、Ｃ５７ＢＬ／６野生型マウスの別のグループを治療し、各マウスに２００μｇの抗体を５日間連続して静脈内注射し、次に、すべてのマウスは、０日目にＬＤ９０のＰＲ８ウイルスを接種する。各マウスに対して体重を測定し、しわの寄った毛皮、無気力、忍び寄り、腰下ろし、息切れ、聞こえるラ音などを監視し、毎日臨床症状に対して採点し、２週間持続する。実験プロトコルの概略図は、図２１のＡ図を参照する。
【0241】
結果は、ＩＦＰ３５中和抗体で治療されたマウスが致死的なＰＲ８感染（ＬＤ９０用量）からそれらを有意に保護できる一方、ｍＩｇＧを投与したマウスのほとんどが死亡し（図２１のＤ図）、臨床スコアが生存率と一致し（図２１のＣ図）、しかしながら、体重変化に有意差がない（図２１のＡ図）とを示し、これは、図２０のＡ図の結果と一致しており、さらに研究してそのメカニズムを決定する必要がある。一般に、ＩＦＰ３５中和抗体は、臨床症状を軽減し、致死的なインフルエンザウイルス感染からマウスを保護する。
【0242】
パンデミックＨ１Ｎ１、高病原性Ｈ５Ｎ１および新型組換えＨ７Ｎ９のようなインフルエンザウイルスは、ヒトに直接感染し、重度の急性肺損傷、急性呼吸窮迫症候群、そして最終的に呼吸不全を引き起こすことができる。これは、通常、二次的な細菌感染を引き起こし、様々な感染性肺炎、脳炎、心筋炎，そして最終的に多臓器不全を引き起こす。
【0243】
本発明のインフルエンザウイルスの研究は、次の結論を支持する。インフルエンザウイルス感染は、個体の血液中のＩＦＰ３５および／またはＮＭＩの量の増加につながることができ、この結果は、臨床検出でインフルエンザウイルス感染を検出するための特徴的な指標として使用されることができる。同時に、ＩＦＰ３５および／またはＮＭＩを阻害するための抗体薬物、化学薬物等の外因性投与方法の使用は、インフルエンザウイルスの治療に使用されることができる。
【0244】
本発明の開示の精神および範囲から逸脱することない限り、本発明に開示される様々な実施形態に対して様々な変更および同等の置換を行うことができる。文脈に別の説明がない限り、本開示の実施形態の任意の特徴、手順（ステップ）または実施形態を、他の任意の特徴、手順または実施形態と組み合わせて使用することができる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14A】
【図14B】
【図14C】
【図14D】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【配列表】