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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-04-18
(45)【発行日】2024-04-26
(54)【発明の名称】消光子およびこの用途
(51)【国際特許分類】
C09B 23/08 20060101AFI20240419BHJP
C09B 23/06 20060101ALI20240419BHJP
C12Q 1/6876 20180101ALI20240419BHJP
【ＦＩ】
C09B23/08
C09B23/06
C12Q1/6876 Z ZNA
【請求項の数】
23
(21)【出願番号】P 2022529074
(86)(22)【出願日】2020-11-09
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2023-01-26
(86)【国際出願番号】 KR2020015592
(87)【国際公開番号】W WO2021101145
(87)【国際公開日】2021-05-27
【審査請求日】2022-05-18
(31)【優先権主張番号】10-2019-0148348
(32)【優先日】2019-11-19
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(31)【優先権主張番号】10-2020-0144159
(32)【優先日】2020-11-02
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(73)【特許権者】
【識別番号】507074834
【氏名又は名称】エスエフシー カンパニー リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100094112
【弁理士】
【氏名又は名称】岡部 讓
(74)【代理人】
【識別番号】100136799
【弁理士】
【氏名又は名称】本田 亜希
(74)【代理人】
【識別番号】100128668
【弁理士】
【氏名又は名称】齋藤 正巳
(74)【代理人】
【識別番号】100189474
【弁理士】
【氏名又は名称】田村 修
(72)【発明者】
【氏名】キム，テ ヤン
(72)【発明者】
【氏名】マサンタ，ゴータム
(72)【発明者】
【氏名】イ，ド ミン
(72)【発明者】
【氏名】ソン，ジュ マン
(72)【発明者】
【氏名】チェ，ジョン テ
【審査官】桜田 政美
(56)【参考文献】
【文献】特表２００３－５０７０２４（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１６－５０８１２８（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２００２－５０１１０２（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２００７－５１０４０１（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２０１９－０９９８０５（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２０２０－０８９３６１（ＪＰ，Ａ）
【文献】Vuuren, R.D. Jansen-van et. al.，Tuning the optoelectronic properties of cyanine and ketocyanine dyes by incorporation of 9,9-di-n-propylfluorenylindolenine，Dyes and Pigments，vol.101，2014年，pp.1-8
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ０９Ｂ ２３／０８
Ｃ０９Ｂ ２３／０６
Ｃ１２Ｑ １／６８７６
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
下記の化学式１で表示される消光剤：［化学式１］
Ｒ１が結合する炭素の位置およびＲ２が結合する炭素の位置は、それぞれ下記の化学式２のａおよびｂ、ｂおよびｃまたはｃおよびｄの位置と接合され、環を形成し、
［化学式２］
ｎは１～２の整数であり、
Ｒ３～Ｒ１１及びＲ１４～Ｒ１９はそれぞれ独立的に水素、重水素、置換または非置換されたＣ１－Ｃ１０アルキル、少なくとも一つのヘテロ原子を含む置換または非置換されたＣ１－Ｃ１０ヘテロアルキル、置換または非置換されたＣ２－Ｃ１０アルケニル、置換または非置換されたＣ２－Ｃ１０アルキニル、置換または非置換されたＣ３－Ｃ２０シクロアルキル、置換または非置換されたＣ１－Ｃ１０アルコキシ、置換または非置換されたアリールオキシ、置換または非置換されたＣ１－Ｃ１０ハロアルキル、ハロゲン、シアノ、ヒドロキシ、置換または非置換されたアミノ、置換または非置換されたアミド、カーバメート、スルフヒドリル、ニトロ、カルボキシル、カルボン酸塩、置換または非置換されたアリール、置換または非置換されたヘテロアリール、置換または非置換されたアラルキル、四級アンモニウム、リン酸、リン酸塩、置換されたケトン、アルデヒド、置換されたエステル、置換されたスルホニル、置換または非置換されたスルホンアミド、アシルクロライド、スルホン酸、スルホン酸塩、ヒドラジン、アセタール、ケタール、ホスホネート（亜リン酸塩）、次亜リン酸塩、スルホヒドロキシ、スルフェート、アジド、グアニジウム、ケテン、チオカルボニル、アミノチオカルボニル、ポリアルキレンオキシド、カルボキシル誘導体、親ジエン体、スルホニルハライド、エポキシドおよびホスホロアミダイトから選択される作用基であり、
Ｒ５とＲ６はそれぞれ独立的に存在するか互いに連結されて環を形成し、
Ｒ７とＲ８はそれぞれ独立的に存在するか互いに連結されて環を形成し、
Ｒ１８とＲ１９はそれぞれ独立的に存在するか互いに連結されて環を形成し、
Ｌ１およびＬ３は単結合または１～４０個の非水素原子を含むリンカーであり、Ｌ２およびＬ４は１～４０個の非水素原子を含むリンカーであり、
Ｒ３～Ｒ１１及びＲ１４～Ｒ１９のうち少なくとも一つ及び／又は Ｒ３～Ｒ１１、Ｒ１４～Ｒ１９およびＡｒ１の置換基のうち少なくとも一つはカルボキシル、カルボキシル誘導体、ヒドロキシル、ハロアルキル、親ジエン体、アルデヒド、ケトン、スルホニルハライド、アミン、スルフヒドリル、アルケン、エポキシドおよびホスホロアミダイトから選択される作用基である。
【請求項2】
前記化学式１のＲ１が結合する炭素の位置およびＲ２が結合する炭素の位置は前記化学式２のａおよびｂの位置と接合される、請求項１に記載の消光剤。
【請求項3】
前記化学式１のＲ１が結合する炭素の位置およびＲ２が結合する炭素の位置は前記化学式２のｂおよびｃの位置と接合される、請求項１に記載の消光剤。
【請求項4】
前記化学式１のＲ１が結合する炭素の位置およびＲ２が結合する炭素の位置は前記化学式２のｃおよびｄの位置と接合される、請求項１に記載の消光剤。
【請求項5】
Ｒ
３
～Ｒ
１１
及びＲ
１４
～Ｒ
１９
のうち少なくとも一つ及び／又は Ｒ
３
～Ｒ
１１
、Ｒ
１４
～Ｒ
１９
およびＡｒ
１
の置換基のうち少なくとも一つはカルボキシル、カルボキシル誘導体、ヒドロキシル、ハロアルキル、親ジエン体、アルデヒド、ケトン、スルホニルハライド、アミン、スルフヒドリル、アルケン、エポキシドおよびホスホロアミダイトから選択される作用基である場合、前記作用基は保護基で保護される、請求項１に記載の消光剤。
【請求項6】
Ｒ１４～Ｒ１７のうち隣接した置換基は互いに連結されて環を形成する、請求項１に記載の消光剤。
【請求項7】
Ａｒ１の置換基のうち少なくとも一つは置換されたアミノ基である、請求項１に記載の消光剤。
【請求項8】
前記アミノ基の窒素に結合された置換基は前記窒素に結合された他の置換基と連結されて環を形成したり、前記アミノ基以外の他の置換基と連結されて環を形成する、請求項７に記載の消光剤。
【請求項9】
下記の化学式３で表示される、請求項１に記載の消光剤：［化学式３］
Ｒ １ が結合する炭素の位置およびＲ ２ が結合する炭素の位置は、それぞれ下記の化学式２のａおよびｂ、ｂおよびｃまたはｃおよびｄの位置と接合され、環を形成し、
［化学式２］
Ｒ２０～Ｒ２３の定義はＲ３～Ｒ１１およびＲ１４～Ｒ１９の定義と同一であり、
Ｒ３～Ｒ１１およびＲ１４～Ｒ２３のうち少なくとも一つはカルボキシル、カルボキシル誘導体、ヒドロキシル、ハロアルキル、親ジエン体、アルデヒド、ケトン、スルホニルハライド、アミン、スルフヒドリル、アルケン、エポキシドおよびホスホロアミダイトから選択される作用基であり、
Ｒ３～Ｒ１１およびＲ１４～Ｒ２３のうち少なくとも一つは置換または非置換されたアミノ基である。
【請求項10】
Ｒ２０～Ｒ２３のうち少なくとも一つは置換されたアミノ基である、請求項９に記載の消光剤。
【請求項11】
Ｒ２１は置換されたアミノ基である、請求項９に記載の消光剤。
【請求項12】
前記アミノ基の窒素に結合された置換基は前記窒素に結合された他の置換基と連結されて環を形成したり、前記アミノ基以外の他の置換基と連結されて環を形成する、請求項１０に記載の消光剤。
【請求項13】
下記の化学式１で表示される消光剤：［化学式１］
Ｒ１が結合する炭素の位置およびＲ２が結合する炭素の位置は、それぞれ下記の化学式２のａおよびｂ、またはｃおよびｄの位置と接合され、環を形成し、
［化学式２］
Ａｒ１が置換されたアリールである場合、 前記アリールには置換または非置換アミノ基が結合し、
Ａｒ１が置換されたヘテロアリールである場合、前記ヘテロアリールには置換または非置換アミノ基が結合し、
Ａｒ１が化学式２である場合、Ｒ１４～Ｒ１９のうちの１つは置換または非置換のアミノ基であり、
ｎは１～２の整数であり、
Ｒ３～Ｒ１１及びＲ１４～Ｒ１９はそれぞれ独立的に水素、重水素、置換または非置換されたＣ１－Ｃ１０アルキル、少なくとも一つのヘテロ原子を含む置換または非置換されたＣ１－Ｃ１０ヘテロアルキル、置換または非置換されたＣ２－Ｃ１０アルケニル、置換または非置換されたＣ２－Ｃ１０アルキニル、置換または非置換されたＣ３－Ｃ２０シクロアルキル、置換または非置換されたＣ１－Ｃ１０アルコキシ、置換または非置換されたアリールオキシ、置換または非置換されたＣ１－Ｃ１０ハロアルキル、ハロゲン、シアノ、ヒドロキシ、置換または非置換されたアミノ、置換または非置換されたアミド、カーバメート、スルフヒドリル、ニトロ、カルボキシル、カルボン酸塩、置換または非置換されたアリール、置換または非置換されたヘテロアリール、置換または非置換されたアラルキル、四級アンモニウム、リン酸、リン酸塩、置換されたケトン、アルデヒド、置換されたエステル、置換されたスルホニル、置換または非置換されたスルホンアミド、アシルクロライド、スルホン酸、スルホン酸塩、ヒドラジン、アセタール、ケタール、ホスホネート（亜リン酸塩）、次亜リン酸塩、スルホヒドロキシ、スルフェート、アジド、グアニジウム、ケテン、チオカルボニル、アミノチオカルボニル、ポリアルキレンオキシド、カルボキシル誘導体、親ジエン体、スルホニルハライド、エポキシドおよびホスホロアミダイトから選択される作用基であり、
Ｒ５とＲ６はそれぞれ独立的に存在するか互いに連結されて環を形成し、
Ｒ７とＲ８はそれぞれ独立的に存在するか互いに連結されて環を形成し、
Ｒ１８とＲ１９はそれぞれ独立的に存在するか互いに連結されて環を形成し、
Ｌ１およびＬ３は単結合または１～４０個の非水素原子を含むリンカーであり、Ｌ２およびＬ４は１～４０個の非水素原子を含むリンカーであり、
Ｒ３～Ｒ１１及びＲ１４～Ｒ１９のうち少なくとも一つ及び／又は Ｒ３～Ｒ１１、Ｒ１４～Ｒ１９およびＡｒ１の置換基のうち少なくとも一つはカルボキシル、カルボキシル誘導体、ヒドロキシル、ハロアルキル、親ジエン体、アルデヒド、ケトン、スルホニルハライド、アミン、スルフヒドリル、アルケン、エポキシドおよびホスホロアミダイトから選択される作用基である。
【請求項14】
前記アミノ基の窒素に結合された置換基は前記窒素に結合された他の置換基と連結されて環を形成したり、前記アミノ基以外の他の置換基と連結されて環を形成する、請求項１３に記載の消光剤。
【請求項15】
請求項１～請求項１４のいずれか一項に記載された消光剤；マイナーグルーブバインダー（ＭＧＢ；ｍｉｎｏｒ ｇｒｏｏｖｅ ｂｉｎｄｅｒ）；および
蛍光団；を含む、オリゴヌクレオチド。
【請求項16】
前記蛍光団はクマリン、シアニン、ボディピー、フルオレセイン、ローダミン、ピレン、カルボピロニン、オキサジン、キサンテン、チオキサンテン、アクリジンおよびまたはこの誘導体から選択される少なくとも一つである、請求項１５に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項17】
請求項１５に記載されたオリゴヌクレオチドを含む、核酸検出用組成物。
【請求項18】
請求項１～請求項１４のいずれか一項に記載された消光剤；支持体；および
前記消光剤と前記支持体を連結するリンカー；を含む、核酸検出用支持体。
【請求項19】
前記支持体はガラス、セルロース、ナイロン、アクリルアミドゲル、デキストラン、ポリスチレンまたはレジンである、請求項１８に記載の核酸検出用支持体。
【請求項20】
前記リンカーは置換または非置換されたＣ１－Ｃ３０アルキル、少なくとも一つのヘテロ原子を含む置換または非置換されたＣ２－Ｃ３０ヘテロアルキル、置換または非置換されたＣ６－Ｃ３０アリールおよび置換または非置換されたＣ３－Ｃ３０ヘテロアリールから選択される、請求項１８に記載の核酸検出用支持体。
【請求項21】
（ａ）標的核酸、前記標的核酸を増幅させるために必要な試薬および請求項１５に記載されたオリゴヌクレオチドを含む反応混合物を準備する段階；（ｂ）前記反応混合物のうち標的核酸をポリメラーゼ連鎖反応によって増幅する段階；および
（ｃ）前記反応混合物の蛍光強度を測定する段階；を含む、核酸検出方法。
【請求項22】
前記段階（ｂ）は、（ｂ－１）前記標的核酸に混成化されたオリゴヌクレオチドがポリメラーゼによって伸長する段階；
（ｂ－２）前記ポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性によって前記標的核酸から前記オリゴヌクレオチドの消光剤と蛍光団が分離される段階；および
（ｂ－３）前記消光剤から離れた前記蛍光団が蛍光を発する段階；を含む、請求項２１に記載の核酸検出方法。
【請求項23】
前記段階（ｃ）で測定された蛍光強度から標的核酸の増幅量を測定する段階（ｄ）をさらに含む、請求項２１に記載の核酸検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は励起状態のエネルギー準位で発光特性を示す蛍光物質に対する消光効果を示す消光子とその多様な用途に関する。
【背景技術】
【0002】
消光子（ｑｕｅｎｃｈｅｒ）とは蛍光分子の蛍光を消光（ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ）させ得る分子を意味し、一般的に光を吸収できる特性を有する染料が使われる。
【0003】
消光現象のメカニズムとしては、蛍光共鳴エネルギー遷移（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ、ＦＲＥＴ）、光－誘導電子伝達（ｐｈｏｔｏ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｔｒａｎｓｆｅｒ）およびＨ－二量体の形成のような染料の凝集を通じて起こるものと知られている。
【0004】
蛍光染料の蛍光を制御または消滅させるために消光子を使う場合、消光染料の吸収波長の範囲が蛍光染料が示す蛍光の波長領域の相当部分または全体領域を包括（重畳）するかが最も重要である。
【0005】
また、消光効果を得るにあたって蛍光染料と消光子の間の長さも重要であるが、例えばＤＮＡの場合は塩基の個数、ペプチド／蛋白質の場合、アミノ酸の個数などが考慮され、より高い消光効果を得るために蛍光染料および消光子が標識されるリンカーの長さを調節したりもする。
【0006】
バイオ分野で商業的に主に使用される消光子の場合、一般的に光を出せず吸収のみ可能な染料構造が選択されるが、ＦＲＥＴ現象を利用した蛍光－蛍光染料の組み合わせも多く活用されている。このように組み合わせられた蛍光－消光、蛍光－蛍光染料は相互間の距離が遠くなるか生体分子内で離脱する場合、本来の蛍光が復元されたり強くなるため一種の蛍光のｏｎ／ｏｆｆ機能を付与できるようになり、このような特性を考慮して特定の蛋白質／酵素などのバイオマーカーに感応できるバイオセンサや活性化プローブなどを設計する時に多く使われている。
【0007】
バイオ分野で使われる蛍光または消光染料の場合、単独で使われる場合はＩｎｄｏｃｙａｎｉｎｅ ｇｒｅｅｎやＭｅｔｈｙｌｅｎｅ ｂｌｕｅのようにＦＤＡの承認を受けた限定された染料に限られ、一般的には生体分子が有する置換基に結合できる反応性基が導入される。前記反応性基としては多様なものが知られているが、置換基の選択性、反応速度、収率、再現性、安定性などが多い研究者から長時間検証されてきており、最近では実際の研究や商業的な目的で染料に導入される反応性基はいくつかに限定されている。
【0008】
例えば、蛋白質分子のアミン基と結合を目的とする反応性基として最も多く利用されるものはスクシンイミジルエステルとイソチオシアネート（ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）であり、蛋白質分子のチオール基と結合を目的とする反応性基として最も多く利用されるものはマレイミドであり、蛋白質分子のヒドロキシ基と結合を目的とする反応性基としてはジクロロトリアジン（ｄｉｃｈｌｏｒｏｔｒｉａｚｉｎｅ）が主に選択される。
【0009】
ただし、前記反応性基は置換反応で結合となるか水溶性条件で長時間反応および保管安定性を維持し難い場合がほとんどである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0010】
アメリカ公開特許公報第２００５－０２２７２５４号（２００５．１０．１３公開）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0011】
本発明は光学映像分野で生体分子の同定を観察するために広範囲に使われ得る化合物であって、新規の消光子を提供することを目的とする。
【0012】
また、本発明は前記新規の消光子を含む核酸検出用オリゴヌクレオチド、組成物、支持体および核酸検出方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0013】
前述した技術的課題を解決するための本発明の一側面によると、下記の化学式１で表示される消光子が提供される。
［化学式１］
ここで、
Ｒ１およびＲ２はそれぞれ下記の化学式２のａおよびｂ、ｂおよびｃまたはｃおよびｄと接合され、
［化学式２］
Ａｒ１は置換または非置換されたアリール、置換または非置換されたヘテロアリールおよび化学式２から選択され、
ｎは１～３の整数であり、
Ｒ３～Ｒ１９はそれぞれ独立的に水素、重水素、置換または非置換されたＣ１－Ｃ１０アルキル、少なくとも一つのヘテロ原子を含む置換または非置換されたＣ１－Ｃ１０ヘテロアルキル、置換または非置換されたＣ２－Ｃ１０アルケニル、置換または非置換されたＣ２－Ｃ１０アルキニル、置換または非置換されたＣ３－Ｃ２０シクロアルキル、置換または非置換されたＣ１－Ｃ１０アルコキシ、置換または非置換されたアリールオキシ、置換または非置換されたＣ１－Ｃ１０ハロアルキル、ハロゲン、シアノ、ヒドロキシ、置換または非置換されたアミノ、置換または非置換されたアミド、カーバメート、スルフヒドリル、ニトロ、カルボキシル、カルボン酸塩、置換または非置換されたアリール、置換または非置換されたヘテロアリール、置換または非置換されたアラルキル、四級アンモニウム、リン酸、リン酸塩、置換されたケトン、アルデヒド、置換されたエステル、置換されたスルホニル、置換または非置換されたスルホンアミド、アシルクロライド、スルホン酸、スルホン酸塩、ヒドラジン、チオール、アセタール、ケタール、ホスホネート（亜リン酸塩）、次亜リン酸塩、スルホヒドロキシ、スルフェート、アジド、グアニジウム、ケテン、チオカルボニル、アミノチオカルボニル、ポリアルキレンオキシド、カルボキシル誘導体、親ジエン体、スルホニルハライド、エポキシドおよびホスホロアミダイトから選択される作用基であるか、カルボキシル、カルボキシル誘導体、ヒドロキシル、ハロアルキル、親ジエン体、アルデヒド、ケトン、スルホニルハライド、チオール、アミン、スルフヒドリル、アルケン、エポキシドおよびホスホロアミダイトから選択される作用基と共有結合可能な反応性基から選択され、
Ｒ５とＲ６はそれぞれ独立的に存在するか互いに連結されて環を形成し、
Ｒ７とＲ８はそれぞれ独立的に存在するか互いに連結されて環を形成し、
Ｒ１８とＲ１９はそれぞれ独立的に存在するか互いに連結されて環を形成し、
Ｌ１およびＬ３は単結合または１～４０個の非水素原子を含むリンカーであり、Ｌ２およびＬ４は１～４０個の非水素原子を含むリンカーである。
［化学式１］
【化1】
Ｒ１およびＲ２はそれぞれ下記の化学式２のａおよびｂ、ｂおよびｃまたはｃおよびｄと接合され、
［化学式２］
【化2】
ｎは１～３の整数であり、
Ｒ３～Ｒ１９はそれぞれ独立的に水素、重水素、置換または非置換されたＣ１－Ｃ１０アルキル、少なくとも一つのヘテロ原子を含む置換または非置換されたＣ１－Ｃ１０ヘテロアルキル、置換または非置換されたＣ２－Ｃ１０アルケニル、置換または非置換されたＣ２－Ｃ１０アルキニル、置換または非置換されたＣ３－Ｃ２０シクロアルキル、置換または非置換されたＣ１－Ｃ１０アルコキシ、置換または非置換されたアリールオキシ、置換または非置換されたＣ１－Ｃ１０ハロアルキル、ハロゲン、シアノ、ヒドロキシ、置換または非置換されたアミノ、置換または非置換されたアミド、カーバメート、スルフヒドリル、ニトロ、カルボキシル、カルボン酸塩、置換または非置換されたアリール、置換または非置換されたヘテロアリール、置換または非置換されたアラルキル、四級アンモニウム、リン酸、リン酸塩、置換されたケトン、アルデヒド、置換されたエステル、置換されたスルホニル、置換または非置換されたスルホンアミド、アシルクロライド、スルホン酸、スルホン酸塩、ヒドラジン、チオール、アセタール、ケタール、ホスホネート（亜リン酸塩）、次亜リン酸塩、スルホヒドロキシ、スルフェート、アジド、グアニジウム、ケテン、チオカルボニル、アミノチオカルボニル、ポリアルキレンオキシド、カルボキシル誘導体、親ジエン体、スルホニルハライド、エポキシドおよびホスホロアミダイトから選択される作用基であるか、カルボキシル、カルボキシル誘導体、ヒドロキシル、ハロアルキル、親ジエン体、アルデヒド、ケトン、スルホニルハライド、チオール、アミン、スルフヒドリル、アルケン、エポキシドおよびホスホロアミダイトから選択される作用基と共有結合可能な反応性基から選択され、
Ｒ５とＲ６はそれぞれ独立的に存在するか互いに連結されて環を形成し、
Ｒ７とＲ８はそれぞれ独立的に存在するか互いに連結されて環を形成し、
Ｒ１８とＲ１９はそれぞれ独立的に存在するか互いに連結されて環を形成し、
Ｌ１およびＬ３は単結合または１～４０個の非水素原子を含むリンカーであり、Ｌ２およびＬ４は１～４０個の非水素原子を含むリンカーである。
【0014】
また、本発明の他の側面によると、前記消光子とマイナーグルーブバインダー（ＭＧＢ；ｍｉｎｏｒ ｇｒｏｏｖｅ ｂｉｎｄｅｒ）および蛍光団を含むオリゴヌクレオチドが提供される。
【0015】
また、本発明のさらに他の側面によると、前記オリゴヌクレオチドを含む核酸検出用組成物が提供される。
【0016】
また、本発明のさらに他の側面によると、前記消光子、支持体および前記消光子と前記支持体を連結するリンカーを含む核酸検出用支持体が提供される。
【0017】
また、本発明のさらに他の側面によると、（ａ）標的核酸、前記標的核酸を増幅させるために必要な試薬および前記消光子とマイナーグルーブバインダー（ＭＧＢ；ｍｉｎｏｒ ｇｒｏｏｖｅ ｂｉｎｄｅｒ）および蛍光団を含むオリゴヌクレオチドを含む反応混合物を準備する段階、（ｂ）前記反応混合物のうち標的核酸をポリメラーゼ連鎖反応によって増幅する段階および（ｃ）前記反応混合物の蛍光強度を測定する段階を含む核酸検出方法が提供される。
【発明の効果】
【0018】
本発明は励起状態のエネルギー準位で発光特性を示す蛍光物質に対する消光効果を示す消光子とこの多様な用途に関するものであり、本発明に係る消光子は既存消光子対比消光効率が高いため優秀な消光特性を示すことができる。
【図面の簡単な説明】
【0019】
【図1】本発明の多様な実施例に係る消光子を含む二重標識プローブを使ったｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲ増幅結果を示したものである。
【図2】本発明の多様な実施例に係る消光子を含む二重標識プローブを使ったｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲ増幅結果を示したものである。
【図3】本発明の多様な実施例に係る消光子を含む二重標識プローブを使ったｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲ増幅結果を示したものである。
【図4】本発明の多様な実施例に係る消光子を含む二重標識プローブを使ったｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲ増幅結果を示したものである。
【発明を実施するための形態】
【0020】
本発明をさらに容易に理解するために、便宜上特定用語を本願に定義する。本願で特に定義しない限り、本発明に使われた科学用語および技術用語は該当技術分野で通常の知識を有する者によって一般的に理解される意味を有し得る。
【0021】
また、文脈上特に指定しない限り、単数形態の用語はその複数形態も含むものであり、複数形態の用語はその単数形態も含むことができる。
【0022】
本研究は大韓民国産業通商資源部による「優秀技術研究センター（ＡＴＣ）事業（課題番号１００７６９８８、分子診断のための蛍光体とその応用技術の開発）」からの助成金の支援を受けたものである。
【0023】
新規消光子
本発明の一側面によると、下記の化学式１で表示される消光子が提供される。
［化学式１］
ここで、
Ｒ１およびＲ２はそれぞれ下記の化学式２のａおよびｂ、ｂおよびｃまたはｃおよびｄと接合され、
［化学式２］
Ａｒ１は置換または非置換されたアリール、置換または非置換されたヘテロアリールおよび化学式２から選択され、
ｎは１～３の整数であり、
Ｒ３～Ｒ１９はそれぞれ独立的に水素、重水素、置換または非置換されたＣ１－Ｃ１０アルキル、少なくとも一つのヘテロ原子を含む置換または非置換されたＣ１－Ｃ１０ヘテロアルキル、置換または非置換されたＣ２－Ｃ１０アルケニル、置換または非置換されたＣ２－Ｃ１０アルキニル、置換または非置換されたＣ３－Ｃ２０シクロアルキル、置換または非置換されたＣ１－Ｃ１０アルコキシ、置換または非置換されたアリールオキシ、置換または非置換されたＣ１－Ｃ１０ハロアルキル、ハロゲン、シアノ、ヒドロキシ、置換または非置換されたアミノ、置換または非置換されたアミド、カーバメート、スルフヒドリル、ニトロ、カルボキシル、カルボン酸塩、置換または非置換されたアリール、置換または非置換されたヘテロアリール、置換または非置換されたアラルキル、四級アンモニウム、リン酸、リン酸塩、置換されたケトン、アルデヒド、置換されたエステル、置換されたスルホニル、置換または非置換されたスルホンアミド、アシルクロライド、スルホン酸、スルホン酸塩、ヒドラジン、チオール、アセタール、ケタール、ホスホネート（亜リン酸塩）、次亜リン酸塩、スルホヒドロキシ、スルフェート、アジド、グアニジウム、ケテン、チオカルボニル、アミノチオカルボニル、ポリアルキレンオキシド、カルボキシル誘導体、親ジエン体、スルホニルハライド、エポキシドおよびホスホロアミダイトから選択される作用基であるか、カルボキシル、カルボキシル誘導体、ヒドロキシル、ハロアルキル、親ジエン体、アルデヒド、ケトン、スルホニルハライド、チオール、アミン、スルフヒドリル、アルケン、エポキシドおよびホスホロアミダイトから選択される作用基と共有結合可能な反応性基から選択され得る。
本発明の一側面によると、下記の化学式１で表示される消光子が提供される。
［化学式１］
【化3】
Ｒ１およびＲ２はそれぞれ下記の化学式２のａおよびｂ、ｂおよびｃまたはｃおよびｄと接合され、
［化学式２］
【化4】
ｎは１～３の整数であり、
Ｒ３～Ｒ１９はそれぞれ独立的に水素、重水素、置換または非置換されたＣ１－Ｃ１０アルキル、少なくとも一つのヘテロ原子を含む置換または非置換されたＣ１－Ｃ１０ヘテロアルキル、置換または非置換されたＣ２－Ｃ１０アルケニル、置換または非置換されたＣ２－Ｃ１０アルキニル、置換または非置換されたＣ３－Ｃ２０シクロアルキル、置換または非置換されたＣ１－Ｃ１０アルコキシ、置換または非置換されたアリールオキシ、置換または非置換されたＣ１－Ｃ１０ハロアルキル、ハロゲン、シアノ、ヒドロキシ、置換または非置換されたアミノ、置換または非置換されたアミド、カーバメート、スルフヒドリル、ニトロ、カルボキシル、カルボン酸塩、置換または非置換されたアリール、置換または非置換されたヘテロアリール、置換または非置換されたアラルキル、四級アンモニウム、リン酸、リン酸塩、置換されたケトン、アルデヒド、置換されたエステル、置換されたスルホニル、置換または非置換されたスルホンアミド、アシルクロライド、スルホン酸、スルホン酸塩、ヒドラジン、チオール、アセタール、ケタール、ホスホネート（亜リン酸塩）、次亜リン酸塩、スルホヒドロキシ、スルフェート、アジド、グアニジウム、ケテン、チオカルボニル、アミノチオカルボニル、ポリアルキレンオキシド、カルボキシル誘導体、親ジエン体、スルホニルハライド、エポキシドおよびホスホロアミダイトから選択される作用基であるか、カルボキシル、カルボキシル誘導体、ヒドロキシル、ハロアルキル、親ジエン体、アルデヒド、ケトン、スルホニルハライド、チオール、アミン、スルフヒドリル、アルケン、エポキシドおよびホスホロアミダイトから選択される作用基と共有結合可能な反応性基から選択され得る。
【0024】
一実施例において、前記化学式１で表示される消光子はＲ３～Ｒ１９およびＡｒ１の置換基のうち少なくとも一つは置換または非置換されたアミノ基であり得る。また、他の実施例において、Ａｒ１の置換基のうち少なくとも一つは置換または非置換されたアミノ基であり得る。
【0025】
Ｒ３～Ｒ１９およびＡｒ１の置換基のうち少なくとも一つが置換されたアミノ基である場合、前記アミノ基はモノ－またはジ－置換されたアミノ基であり得る。
【0026】
前記モノ－またはジ－置換されたアミノ基に含まれた置換基は前記アミノ基の窒素に結合され、前記置換基としては前述したＲ３～Ｒ１９の定義と同一の作用基および／または反応性基が使われ得る。好ましくは、前記アミノ基の窒素に結合された置換基は水素、重水素、置換または非置換されたＣ１－Ｃ１０アルキル、置換または非置換されたＣ２－Ｃ１０アルケニル、置換または非置換されたＣ３－Ｃ２０シクロアルキル、置換または非置換されたアリール、置換または非置換されたヘテロアリールまたは置換または非置換されたアラルキルであり得る。
【0027】
また、前記アミノ基の窒素に結合された置換基は前記窒素に結合された他の置換基と連結されて環を形成したり、前記アミノ基以外の他の置換基と連結されて環を形成することができる。
【0028】
前記化学式１で表示される消光子の具体的な例の一つである［化合物１４］を参照すると、もし前記アミノ基の窒素に結合された置換基が前記窒素に結合された他の置換基と連結されて環を形成する場合、両置換基が連結されて環を形成した前記アミノ基はヘテロシクロアルキル基として定義されてもよい。
【0029】
一実施例において、Ｒ３～Ｒ１９のうちＲ５とＲ６は前述した作用基でそれぞれ独立的に存在することができるが、いくつかの実施例において互いに連結されて環（例えば、４原子環、５原子環、６原子環またはそれ以上の原子からなる環、複数の環が接合された融合環など）を形成することができる。
【0030】
一実施例において、Ｒ３～Ｒ１９のうちＲ７とＲ８は前述した作用基でそれぞれ独立的に存在することができるが、いくつかの実施例において互いに連結されて環（例えば、４原子環、５原子環、６原子環またはそれ以上の原子からなる環、複数の環が接合された融合環など）を形成することができる。
【0031】
一実施例において、Ｒ３～Ｒ１９のうちＲ１８とＲ１９は前述した作用基でそれぞれ独立的に存在することができるが、いくつかの実施例において互いに連結されて環（例えば、４原子環、５原子環、６原子環またはそれ以上の原子からなる環、複数の環が接合された融合環など）を形成することができる。
【0032】
他の実施例において、Ｒ３～Ｒ１９のうちＲ５とＲ６、Ｒ７とＲ８およびＲ１８とＲ１９がすべて互いに連結されて環（例えば、４原子環、５原子環、６原子環またはそれ以上の原子からなる環、複数の環が接合された融合環など）を形成することができる。
【0033】
この時、Ｒ５とＲ６、Ｒ７とＲ８およびＲ１８とＲ１９から選択される少なくとも一つの組み合わせが互いに連結されて環を形成する場合、環内の任意の炭素は重水素、置換または非置換されたＣ１－Ｃ４０アルキル、少なくとも一つのヘテロ原子を含む置換または非置換されたＣ１－Ｃ４０ヘテロアルキル、置換または非置換されたＣ２－Ｃ４０アルケニル、置換または非置換されたＣ２－Ｃ４０アルキニル、置換または非置換されたＣ１－Ｃ４０アルコキシ、置換または非置換されたアリールオキシ、置換または非置換されたＣ１－Ｃ４０ハロアルキル、ハロゲン、シアノ、ヒドロキシ、置換または非置換されたアミノ、置換または非置換されたアミド、カーバメート、スルフヒドリル、ニトロ、カルボキシル、カルボン酸塩、置換または非置換されたアリール、置換または非置換されたヘテロアリール、置換または非置換されたアラルキル、四級アンモニウム、リン酸、リン酸塩、ケトン、アルデヒド、エーテル、アシルクロライド、スルホン酸およびスルホン酸塩、置換または非置換されたＣ１－Ｃ４０アルキルチオ、置換または非置換されたアリールチオ、置換または非置換されたＣ３－Ｃ２０シクロアルキル、少なくとも一つのヘテロ原子を含む置換または非置換されたＣ１－Ｃ２０ヘテロシクロアルキル、置換または非置換されたＣ３－Ｃ２０シクロアルケニル、少なくとも一つのヘテロ原子を含む置換または非置換されたＣ２－Ｃ２０ヘテロシクロアルケニル、置換または非置換されたシリル、置換または非置換されたゲルマニウム、エーテル、ニトリル、ポリアルキレンオキシド、カルボキシル、カルボキシル誘導体、ヒドロキシル、ハロアルキル、親ジエン体、スルホニルハライド、エポキシドおよびホスホロアミダイトから選択される作用基であるか前記作用基と共有結合可能な反応性基から選択される少なくとも一つで置換され得る。
【0034】
また、前記化学式１のＲ１およびＲ２に連結される前記化学式２において、Ｒ１４～Ｒ１７は前述した作用基でそれぞれ独立的に存在することができるが、いくつかの実施例において、互いに連結されて
Ｒ１４～Ｒ１７のうち隣接した置換基は互いに連結されて環（例えば、４原子環、５原子環、６原子環またはそれ以上の原子からなる環、複数の環が接合された融合環など）を形成することができる。
Ｒ１４～Ｒ１７のうち隣接した置換基は互いに連結されて環（例えば、４原子環、５原子環、６原子環またはそれ以上の原子からなる環、複数の環が接合された融合環など）を形成することができる。
【0035】
この時、Ｒ１４～Ｒ１７のうち隣接した置換基は互いに連結されて環を形成する場合、環内の任意の炭素は前述したＲ３～Ｒ１９の定義と同一の作用基および／または反応性基で置換され得る。
【0036】
Ｌ１およびＬ３は単結合または１～４０個の非水素原子を含むリンカーであり、Ｌ２およびＬ４は１～４０個の非水素原子を含むリンカーである。ここで、非水素原子を含むリンカーとは、水素ではなく、炭素、窒素、酸素などのような原子の結合からなるグループを意味する。これに伴い、リンカーは炭素、窒素、酸素などのような非水素原子の結合からなる鎖および／または環（例えば、芳香族性環および／または脂肪族性環）を含むことができる。
【0037】
より具体的には、前記リンカーは置換または非置換されたＣ１－Ｃ５０アルキルまたは少なくとも一つのヘテロ原子を含む置換または非置換されたＣ２－Ｃ５０ヘテロアルキルであり得るが必ずしもこれに制限されるものではない。
【0038】
また、前記非水素原子を含むリンカーは前記で明示的に言及されていなくても、前記化学式１で表示される消光子の具体的な例を示した［化合物１］～［化合物２２］から確認可能な変形例を含むであろう。
【0039】
一実施例において、Ｒ３～Ｒ１９のうち少なくとも一つはカルボキシル、カルボキシル誘導体、ヒドロキシル、ハロアルキル、親ジエン体、アルデヒド、ケトン、スルホニルハライド、チオール、アミン、スルフヒドリル、アルケン、エポキシドおよびホスホロアミダイトから選択される作用基であるか前記作用基と共有結合可能な反応性基であり得る。
【0040】
特に、Ｒ３およびＲ４のうち少なくとも一つはカルボキシル、カルボキシル誘導体、ヒドロキシル、ハロアルキル、親ジエン体、アルデヒド、ケトン、スルホニルハライド、チオール、アミン、スルフヒドリル、アルケン、エポキシドおよびホスホロアミダイトから選択される作用基であるか前記作用基と共有結合可能な反応性基であり得る。
【0041】
他の実施例において、Ｒ３～Ｒ１９およびＡｒ１の置換基のうち少なくとも一つはカルボキシル、カルボキシル誘導体、ヒドロキシル、ハロアルキル、親ジエン体、アルデヒド、ケトン、スルホニルハライド、チオール、アミン、スルフヒドリル、アルケン、エポキシドおよびホスホロアミダイトから選択される作用基であるか前記作用基と共有結合可能な反応性基である。
【0042】
ここで、反応性基としては（ａ）カルボキシルグループとこの誘導体：Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、Ｎ－ヒドロキシベンゾトリアゾールエステル、アシルハライド、アシルイミダゾール、チオエステル、ｐ－ニトロフェニルエステル、アルキルエステル、アルケニルエステル、アルキニルエステルおよび芳香族性エステル；（ｂ）エステル、エーテル、アルデヒドに転換され得るヒドロキシル；（ｃ）ハロゲンが例えば、アミン、カルボキシレートアニオン、チオールアニオン、カルボアニオンまたはアルコキシドイオンのような求核性作用基で置換されることによって、他の作用基に共有的に付着され得るハロアルキル；（ｄ）例えば、マレイミド基とディールスアルダー反応ができる親ジエン体；（ｅ）イミン、ヒドラゾン、セミカルバゾンまたはオキシムのようなカルボニル誘導体を形成することが可能なアルデヒドまたはケトン；（ｆ）アミンと反応してスルホンアミドを形成するスルホニルハライド；（ｇ）ジスルフィドに転換されるかアシルハライドと反応できるチオール；（ｈ）アシル化、アルキル化または酸化され得るアミンまたはスルフヒドリル；（ｉ）環化添加、アシル化、マイケル反応などのような反応を遂行できるアルケン；（ｊ）アミンまたはヒドロキシル化合物と反応できるエポキシド；（ｋ）ホスホロアミダイトおよび核酸反応に有用な他の標準作用基などが使われ得る。このような反応性基は反応性消光子の合成に必要な反応に参加したり干渉しないように適切に選択され得る。
【0043】
他の実施例において、このような反応性基は保護基で保護されることによって反応性基が保護基の存在下で任意の反応に参加しないようにすることができる。例えば、反応性基がヒドロキシルである場合、保護基としてはトリアルキルシリル、４，４－ジメトキシトリチルまたはその類似体が使われ得る。好ましい保護基の例としては、次の参照文献に記載された内容を参照することができる（Ｇｒｅｅｎｅ ｅｔ ａｌ．、ＰＲＯＴＥＣＴＩＶＥ ＧＲＯＵＰＳ ＩＮ ＯＲＧＡＮＩＣ ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９１）。
【0044】
本発明の多様な実施例に係る消光子は、前述した反応性基を通じて標的生体分子（例えば、核酸）と結合して標識することが可能である。
【0045】
前述した反応性基は標的生体分子のアミノ基、イミノ基、チオール基またはヒドロキシル基などのような作用基と反応できる官能基であって、消光子と標的生体分子の間にアミド結合、イミド結合、ウレタン結合、エステル結合、ホスファイト結合、ホスフェート結合またはグアニジン結合のような共有結合を形成することができる。
【0046】
また、前記化学式１のＲ１およびＲ２はそれぞれ前記化学式２のａおよびｂ、ｂおよびｃまたはｃおよびｄと接合され得る。例えば、Ｒ１が前記化学式２のａと接合され、Ｒ２が前記化学式２のｂと接合され得、この逆に接合されてもよい。
【0047】
また、Ｒ３～Ｒ１９およびＡｒ１のうち任意の作用基が置換された場合、前記作用基内の任意の炭素は重水素、置換または非置換されたＣ１－Ｃ４０アルキル、少なくとも一つのヘテロ原子を含む置換または非置換されたＣ１－Ｃ４０ヘテロアルキル、置換または非置換されたＣ２－Ｃ４０アルケニル、置換または非置換されたＣ２－Ｃ４０アルキニル、置換または非置換されたＣ１－Ｃ４０アルコキシ、置換または非置換されたアリールオキシ、置換または非置換されたＣ１－Ｃ４０ハロアルキル、ハロゲン、シアノ、ヒドロキシ、置換または非置換されたアミノ、置換または非置換されたアミド、カーバメート、スルフヒドリル、ニトロ、カルボキシル、カルボン酸塩、置換または非置換されたアリール、置換または非置換されたヘテロアリール、置換または非置換されたアラルキル、四級アンモニウム、リン酸、リン酸塩、ケトン、アルデヒド、エーテル、アシルクロライド、スルホン酸およびスルホン酸塩、置換または非置換されたＣ１－Ｃ４０アルキルチオ、置換または非置換されたアリールチオ、置換または非置換されたＣ３－Ｃ２０シクロアルキル、少なくとも一つのヘテロ原子を含む置換または非置換されたＣ１－Ｃ２０ヘテロシクロアルキル、置換または非置換されたＣ３－Ｃ２０シクロアルケニル、少なくとも一つのヘテロ原子を含む置換または非置換されたＣ２－Ｃ２０ヘテロシクロアルケニル、置換または非置換されたシリル、置換または非置換されたゲルマニウム、エーテル、ニトリル、ポリアルキレンオキシド、カルボキシル、カルボキシル誘導体、ヒドロキシル、ハロアルキル、親ジエン体、アルデヒド、ケトン、スルホニルハライド、チオール、アミン、スルフヒドリル、アルケン、エポキシドおよびホスホロアミダイトから選択される作用基であるか前記作用基と共有結合可能な反応性基から選択される少なくとも一つで置換され得る。
【0048】
本願で、Ｒａがアルケニルまたはアルキニルであるとき、アルケニルのｓｐ２－混成炭素またはアルキニルのｓｐ－混成炭素が直接的に結合されるか、アルケニルのｓｐ２－混成炭素またはアルキニルのｓｐ－混成炭素に結合されたアルキルのｓｐ３－混成炭素によって間接的に結合された形態であり得る。
【0049】
本願でＣａ－Ｃｂ作用基はａ～ｂ個の炭素原子を有する作用基を意味する。例えば、Ｃａ－Ｃｂアルキルはａ～ｂ個の炭素原子を有する、直鎖アルキルおよび分岐鎖アルキルなどを含む飽和脂肪族基を意味する。 直鎖または粉砕アルキルは、その主鎖に最大４０個の炭素を含み得る（例えば、Ｃ１－Ｃ１０の直鎖、Ｃ３－Ｃ１０の分岐鎖）。
【0050】
具体的には、アルキルはメチル、エチル、ｎ－プロピル、ｉ－プロピル、ｎ－ブチル、ｓ－ブチル、ｉ－ブチル、ｔ－ブチル、ペント－１－イル、ペント－２－イル、ペント－３－イル、３－メチルブト－１－イル、３－メチルブト－２－イル、２－メチルブト－２－イル、２，２，２－トリメチレート－１－イル、ｎ－ヘキシル、ｎ－ヘプチルおよびｎ－オクチルであり得る。
【0051】
また、本願でアルコキシは－Ｏ－（アルキル）基と－Ｏ－（非置換されたシクロアルキル）基の両方を意味するものであり、一つ以上のエーテル基および１～１０個の炭素原子を有する直鎖または分岐鎖炭化水素である。
【0052】
具体的には、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ－ブトキシ、ｔｅｒｔ－ブトキシ、ｓｅｃ－ブトキシ、ｎ－ペントキシ、ｎ－ヘキソキシ、１，２－ジメチルブトキシ、シクロプロピルオキシ、シクロブチルオキシ、シクロペンチルオキシ、シクロヘキシルオキシなどを含むが、これに限定されるものではない。
【0053】
また、本願でハロゲンはフルオロ（－Ｆ）、クロロ（－Ｃｌ）、ブロモ（－Ｂｒ）またはヨウ素（－Ｉ）を意味し、ハロアルキルは前述したハロゲンで置換されたアルキルを意味する。例えば、ハロメチルはメチルの水素のうち少なくとも一つがハロゲンで代替されたメチル（－ＣＨ２Ｘ、－ＣＨＸ２または－ＣＸ３）を意味する。
【0054】
本願でアラルキルはアリールがアルキルの炭素に置換された形態の作用基であって、－（ＣＨ２）ｎＡｒの総称である。アラルキルの例として、ベンジル（－ＣＨ２Ｃ６Ｈ５）またはフェネチル（－ＣＨ２ＣＨ２Ｃ６Ｈ５）等がある。
【0055】
本願でアリールは別途に定義されない限り、単環または互いに接合または共有結合で連結された多環（好ましくは１～４個の環）を含む不飽和芳香族性環を意味する。アリールの非制限的な例としては、フェニル、ビフェニル、ｏ－テルフェニル（ｔｅｒｐｈｅｎｙｌ）、ｍ－テルフェニル、ｐ－テルフェニル、１－ナフチル、２－ナフチル、１－アントリル（ａｎｔｈｒｙｌ）、２－アントリル、９－アントリル、１－ふぇなん（ｐｈｅｎａｎｔｈｒｅｎｙｌ）、２－フェナントレニル、３－－フェナントレニル、４－－フェナントレニル、９－フェナントレニル、１－ピレニル、２－ピレニルおよび４－ピレニルなどがある。
【0056】
本願でヘテロアリールは前記で定義されたアリール内の一つ以上の炭素原子が窒素、酸素または硫黄のような非－炭素原子で置換された作用基を意味する。ヘテロアリールの非制限的な例としては、フリル（ｆｕｒｙｌ）、テトラヒドロフリル、ピロリル（ｐｈｒｒｏｌｙｌ）、ピロリジニル（ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｙｌ）、チエニル（ｔｈｉｅｎｙｌ）、テトラヒドロチエニル、オキサゾリル（ｏｘａｚｏｌｙｌ）、イソオキサゾリル（ｉｓｏｘａｚｏｌｙｌ）、トリアゾリル（ｔｒｉａｚｏｌｙｌ）、チアゾリル（ｔｈｉａｚｏｌｙｌ）、イソチアゾリル（ｉｓｏｔｈｉａｚｏｌｙｌ）、ピラゾリル（ｐｙｒａｚｏｌｙｌ）、ピラゾリジニル（ｐｙｒａｚｏｌｉｄｉｎｙｌ）、オキサジアゾリル（ｏｘａｄｉａｚｏｌｙｌ）、チアジアゾリル（ｔｈｉａｄｉａｚｏｌｙｌ）、イミダゾリル（ｉｍｉｄａｚｏｌｙｌ）、イミダゾリニル（ｉｍｉｄａｚｏｌｉｎｙｌ）、ピリジル（ｐｙｒｉｄｙｌ）、ピリダジイル（ｐｙｒｉｄａｚｉｙｌ）、トリアジニル（ｔｒｉａｚｉｎｙｌ）、ピペリジニル（ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｙｌ）、モルホリニル（ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｙｌ）、チオモルホリニル（ｔｈｉｏｍｏｒｐｈｏｌｉｎｙｌ）、ピラジニル（ｐｙｒａｚｉｎｙｌ）、ピペライニル（ｐｉｐｅｒａｉｎｙｌ）、ピリミジニル（ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｙｌ）、ナプチリジニル（ｎａｐｈｔｈｙｒｉｄｉｎｙｌ）、ベンゾフラニル、ベンゾチエニル、インドリル（ｉｎｄｏｌｙｌ）、インドリニル、インドリジニル、インダゾリル（ｉｎｄａｚｏｌｙｌ）、キノリジニル、キノリニル、イソキノリニル、シノリニル（ｃｉｎｎｏｌｉｎｙｌ）、プタラジニル（ｐｈｔｈａｌａｚｉｎｙｌ）、キナゾリニル、キノキサリニル、プテリジニル（ｐｔｅｒｉｄｉｎｙｌ）、キヌクリジニル（ｑｕｉｎｕｃｌｉｄｉｎｙｌ）、カルバゾイル、アクリジニル、フェナジニル、フェノチジニル（ｐｈｅｎｏｔｈｉｚｉｎｙｌ）、フェノキサニル、プリニル、ベンゾイミダゾリル（ｂｅｎｚｉｍｉｄａｚｏｌｙｌ）およびベンゾチアゾリルなどとこれらが接合された類似体がある。
【0057】
本願で炭化水素環（ｃｙｃｌｏａｌｋｙｌ）またはヘテロ原子を含む炭化水素環（ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｏａｌｋｙｌ）は、別途に定義されない限りそれぞれアルキルまたはヘテロアルキルの環状構造と理解され得るであろう。
【0058】
炭化水素環の非制限的な例としては，シクロペンチル、シクロヘキシル、１－シクロヘキセニル、３－シクロヘキセニルおよびシクロヘプチルなどがある。ヘテロ原子を含む炭化水素環の非制限的な例としては、１－（１，２，５，６－テトラヒドロピリジル）、１－ピペリジニル、２－ピペリジニル、３－ピペリジニル、４－モルホリニル、３－モルホリニル、テトラヒドロフラン－２－イル、ヒドロフラン－３－イル、テトラヒドロチエン－２－イル、テトラヒドロチエン－３－イル、１－ピペラジニル、２－ピペラジニルなどがある。
【0059】
また、炭化水素環またはヘテロ原子を含む炭化水素環は、これに炭化水素環、ヘテロ原子を含む炭化水素環、アリールまたはヘテロアリールが接合されるか共有結合で連結された形態を有することができる。
【0060】
ここで、ポリアルキレンオキシドは水溶性ポリマー作用基としてポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）、ポリエチレングリコール－ポリプロピレングリコール（ＰＥＧ－ＰＰＧ）コポリマーおよびＮ－置換されたメタクリルアミド－含有ポリマーおよびコポリマーを含む。
【0061】
ポリアルキレンオキシドはポリマーの特性が維持される限度内で必要に応じて追加的に置換され得る。例えば、前記置換はポリマーの化学的または生物学的安定性を増加または減少させるための化学的結合であり得る。具体的な例として、ポリアルキレンオキシド内の任意の炭素または末端炭素はヒドロキシ、アルキルエーテル（メチルエーテル、エチルエーテル、プロピルエーテルなど）、カルボキシメチルエーテル、カルボキシエチルエーテル、ベンジルエーテル、ジベンジルメチレンエーテルまたはジメチルアミンで置換され得る。一実施例において、ポリアルキレンオキシドはメチルエーテルで終結するポリエチレンオキシド（ｍＰＥＧ）であり得、ここでｍＰＥＧは－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ３の化学式で表現され、エチレングリコール繰り返し単位の数に該当するｎの大きさによりｍＰＥＧの大きさが変わり得る。
【0062】
また、化学式１で表示される消光子はカウンターイオンをさらに含む構造を有することができる。カウンターイオンは有機または無機アニオンであって、消光子の溶解度および安定性などを考慮して適切に選択され得る。
【0063】
本発明の一実施例に係る消光子のカウンターイオンの例として、ホスホリック酸６フルオライドイオン、ハロゲンイオン、ホスホリック酸イオン、過塩素酸イオン、過ヨウ素酸イオン、アンチモン６フルオライドイオン、酒石酸６フルオライドイオン、フルオロホウ酸イオンおよび４フルオロイオンなどのような無機酸アニオンとチオシアン酸イオン、ベンゼンスルホン酸イオン、ナフタレンスルホン酸イオン、ｐ－トルエンスルホン酸イオン、アルキルスルホン酸イオン、ベンゼンカルボン酸イオン、アルキルカルボン酸イオン、３ハロアルキルカルボン酸イオン、アルキルスルホン酸イオン、トリハロアルキルスルホン酸イオン、およびニコチン酸イオンなどのような有機酸イオンがある。また、ビスフェニルジオール、チオビスフェノールキレートおよびビスジオール－α－ジケトンなどのような金属化合物イオン、ソジウおよびポタシウムなどのような金属イオンと四級アンモニウム塩もカウンターイオンとして選択され得る。
【0064】
より具体的には、本発明の一実施例に係る消光子は下記の化学式３で表示され得る。
［化学式３］
Ｒ２１～Ｒ２３の定義はＲ３～Ｒ１９の定義と同一であり、
Ｒ３～Ｒ２３のうち少なくとも一つはカルボキシル、カルボキシル誘導体、ヒドロキシル、ハロアルキル、親ジエン体、アルデヒド、ケトン、スルホニルハライド、チオール、アミン、スルフヒドリル、アルケン、エポキシドおよびホスホロアミダイトから選択される作用基であるか前記作用基と共有結合可能な反応性基であり、
Ｒ３～Ｒ２３のうち少なくとも一つは置換または非置換されたアミノ基であり得る。また、他の実施例において、Ｒ３～Ｒ２３のうち少なくとも一つは置換されたアミノ基であり得る。好ましくは、少なくともＲ２１は置換されたアミノ基であり得る。
Ｒ３～Ｒ２３のうち少なくとも一つが置換されたアミノ基である場合、前記アミノ基はモノ－またはジ－置換されたアミノ基であり得る。
［化学式３］
【化5】
Ｒ３～Ｒ２３のうち少なくとも一つはカルボキシル、カルボキシル誘導体、ヒドロキシル、ハロアルキル、親ジエン体、アルデヒド、ケトン、スルホニルハライド、チオール、アミン、スルフヒドリル、アルケン、エポキシドおよびホスホロアミダイトから選択される作用基であるか前記作用基と共有結合可能な反応性基であり、
Ｒ３～Ｒ２３のうち少なくとも一つは置換または非置換されたアミノ基であり得る。また、他の実施例において、Ｒ３～Ｒ２３のうち少なくとも一つは置換されたアミノ基であり得る。好ましくは、少なくともＲ２１は置換されたアミノ基であり得る。
Ｒ３～Ｒ２３のうち少なくとも一つが置換されたアミノ基である場合、前記アミノ基はモノ－またはジ－置換されたアミノ基であり得る。
【0065】
前記モノ－またはジ－置換されたアミノ基に含まれた置換基は前記アミノ基の窒素に結合され、前記置換基としては前述したＲ３～Ｒ１９の定義と同一の作用基および／または反応性基が使われ得る。好ましくは、前記アミノ基の窒素に結合された置換基は水素、重水素、置換または非置換されたＣ１－Ｃ１０アルキル、置換または非置換されたＣ２－Ｃ１０アルケニル、置換または非置換されたＣ３－Ｃ２０シクロアルキル、置換または非置換されたアリール、置換または非置換されたヘテロアリールまたは置換または非置換されたアラルキルであり得る。
【0066】
また、前記アミノ基の窒素に結合された置換基は前記窒素に結合された他の置換基と連結されて環を形成したり、前記アミノ基以外の他の置換基と連結されて環を形成することができる。
【0067】
もし前記アミノ基の窒素に結合された置換基が前記窒素に結合された他の置換基と連結されて環を形成する場合、両置換基が連結されて環を形成した前記アミノ基はヘテロシクロアルキル基として定義されてもよい。
【0068】
前記化学式１で表示される消光子の具体的な例は次の通りである。下記に例示として挙げた消光子は化学式１で表示される消光子のいくつかの例示であり、本願に係る消光子は化学式１で表示される基本骨格を有する消光子をその対象とする。すなわち、下記に例示として挙げた消光子だけでなく、化学式１で表示される基本骨格を有する化合物は励起状態のエネルギー準位で発光特性を示す蛍光物質に対して、同等または類似する水準の消光効果を示すものと理解されるべきである。
【0069】
［化合物１］
［化合物２］
［化合物３］
［化合物４］
［化合物５］
［化合物６］
［化合物７］
［化合物８］
［化合物９］
［化合物１０］
［化合物１１］
［化合物１２］
［化合物１３］
［化合物１４］
［化合物１５］
［化合物１６］
［化合物１７］
［化合物１８］
［化合物１９］
［化合物２０］
［化合物２１］
［化合物２２］
【化6】
【化7】
【化8】
【化9】
【化10】
【化11】
【化12】
【化13】
【化14】
【化15】
【化16】
【化17】
【化18】
【化19】
【化20】
【化21】
【化22】
【化23】
【化24】
【化25】
【化26】
【化27】
【0070】
本願で開示された化学式１で表示される消光子の標的となる生体分子は、抗体、脂質、蛋白質、ペプチド、炭水化物、核酸（ヌクレオチドを含む）から選択される少なくとも一つであり得る。
【0071】
脂質の具体的な例としては、脂肪酸（ｆａｔｔｙ ａｃｉｄｓ）、リン脂質（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄｓ）、リポ多糖類（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ）等があり、炭水化物の具体的な例としては単糖類、二糖類、多糖類（例えば、デキストラン）を含む。
【0072】
この時、生体分子は化学式１で表示される消光子の任意の作用基または化学式１で表示される消光子に結合された反応性基と反応するための作用基として、アミノ、スルフヒドリル（ｓｕｌｐｈｙｄｒｙｌ）、カルボニル、ヒドロキシル、カルボキシル、ホスフェートおよびチオホスフェートから選択される少なくとも一つを含むかこの誘導体の形態を有することができる。
【0073】
また、生体分子はアミノ、スルフヒドリル（ｓｕｌｐｈｙｄｒｙｌ）、カルボニル、ヒドロキシル、カルボキシル、ホスフェートおよびチオホスフェートから選択される少なくとも一つを含むかこの誘導体の形態を有するオキシまたはジオキシポリ核酸であり得る。
【0074】
併せて、生体分子以外に化学式１で表示される消光子はアミノ、スルフヒドリル（ｓｕｌｐｈｙｄｒｙｌ）、カルボニル、ヒドロキシル、カルボキシル、ホスフェートおよびチオホスフェートから選択される少なくとも一つを含む薬品、ホルモン（受容体リガンドを含む）、受容体、酵素または酵素気質、細胞、細胞膜、毒素、微生物またはナノバイオ素材（ポリスチレンマイクロスピアなど）等を標識するために使われ得る。
【0075】
新規消光子を含むオリゴヌクレオチド、核酸検出用組成物、核酸検出用支持体
本発明の他の側面によると、化学式１で表示される消光子から選択される少なくとも一つを含むオリゴヌクレオチドが提供される。
本発明の他の側面によると、化学式１で表示される消光子から選択される少なくとも一つを含むオリゴヌクレオチドが提供される。
【0076】
オリゴヌクレオチドは一つ～数百個のヌクレオチドのポリマーを意味するもので、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＰＮＡをすべて含む。また、これらの類似体、例えば前記ヌクレオチドに化学的変更が加えられたもの、または糖が結合されたものなど、通常の技術者が容易に変形を加えることができるものなどをすべて含み、一本鎖または二重鎖からなるものをすべて含むことを意味する。
【0077】
オリゴヌクレオチドはプローブを含むことが好ましい。このようなプローブは標的となる核酸と相補的に結合できるプローブであることがさらに好ましいがこれに限定されない。ここで、プローブは核酸、ペプチド、サッカライド、オリゴヌクレオチド、蛋白質、抗体またはこれらの組み合わせで選択されたものであり得るがこれに限定されない。
【0078】
一実施例において、オリゴヌクレオチドは蛍光団を含むことができる。例えば、オリゴヌクレオチドの５’末端には蛍光団が標識され、３’末端には化学式１で表示される消光子から選択される少なくとも一つが標識され得る。５’末端と３’末端の間には標的となる核酸と相補的に結合できるプローブが位置することができる。
【0079】
蛍光団は次の参照文献に公開された蛍光団の種類を参照することができる（Ｃａｒｄｕｌｌｏ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：８７９０－８７９４（１９８８）；Ｄｅｘｔｅｒ、Ｄ．Ｌ．、Ｊ．ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｈｙｓｉｃｓ ２１：８３６－８５０（１９５３）；Ｈｏｃｈｓｔｒａｓｓｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４５：１３３－１４１（１９９２）；Ｓｅｌｖｉｎ、Ｐ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２４６：３００－３３４（１９９５）；Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ、Ｉ．Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、４０：８３－１１４（１９７１）；Ｓｔｒｙｅｒ、Ｌ．Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、４７：８１９－８４６（１９７８）；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３１：６４９３－６４９６（１９９０）；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６７：１１９７－１２０３（１９９５））。
【0080】
また、本願に使用可能な蛍光団の非制限的な例としては、４－ａｃｅｔａｍｉｄｏ－４’－ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｏｓｔｉｌｂｅｎｅ－２，２’ｄｉｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ、アクリジンおよびこの誘導体、５－（２’－ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ－１－ｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ（ＥＤＡＮＳ）、４－ａｍｉｎｏ－Ｎ－［３－ｖｉｎｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ］ｎａｐｈｔｈａｌｉｍｉｄｅ－３、５ ｄｉｓｕｌｆｏｎａｔｅ、Ｎ－（４－ａｎｉｌｉｎｏ－１－ｎａｐｈｔｈｙｌ）ｍａｌｅｉｍｉｄｅ、ａｎｔｈｒａｎｉｌａｍｉｄｅ、ＢＯＤＩＰＹ、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｙｅｌｌｏｗ、クマリン（？７－ａｍｉｎｏ－４－ｍｅｔｈｙｌｃｏｕｍａｒｉｎ（ＡＭＣ、Ｃｏｕｍａｒｉｎ １２０）、７－ａｍｉｎｏ－４－ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌｃｏｕｌｕａｒｉｎ（Ｃｏｕｍａｒａｎ １５１））およびこの誘導体、シアン染料、シアノシン、４’，６－ｄｉａｍｉｎｉｄｉｎｏ－２－ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ（ＤＡＰＩ）、５’，５”－ｄｉｂｒｏｍｏｐｙｒｏｇａｌｌｏｌ－ｓｕｌｆｏｎａｐｈｔｈａｌｅｉｎ（Ｂｒｏｍｏｐｙｒｏｇａｌｌｏｌ Ｒｅｄ）、７－ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ－３－（４’－ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｏｐｈｅｎｙｌ）－４－ｍｅｔｈｙｌｃｏｕｍａｒｉｎ、ｄｉｅｔｈｙｌｅｎｅｔｒｉａｍｉｎｅ ｐｅｎｔａａｃｅｔａｔｅ、４，４’－ｄｉｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｏｄｉｈｙｄｒｏ－ｓｔｉｌｂｅｎｅ－２，２’－ｄｉｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ、４，４’－ｄｉｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｏｓｔｉｌｂｅｎｅ－２，２’－ｄｉｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ、５－［ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ］ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ－１－ｓｕｌｆｏｎｙｌ ｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＤＮＳ、ｄａｎｓｙｌｃｈｌｏｒｉｄｅ）、４－（４’－ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｈｅｎｙｌａｚｏ）ｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ（ＤＡＢＣＹＬ）、４－ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｈｅｎｙｌａｚｏｐｈｅｎｙｌ－４’－ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ（ＤＡＢＩＴＣ）、エオシンおよびこの誘導体（エオシンイソシアネート）、エリスロシンおよびこの誘導体（エリスロシンＢ、エリスロシンイソシアネート）、イチジウム、フルオレセインおよびこの誘導体（５－カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ））、５－（４，６－ｄｉｃｈｌｏｒｏｔｒｉａｚｉｎ－２－ｙｌ）ａｍｉｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ（ＤＴＡＦ）、２’，７’－ｄｉｍｅｔｈｏｘｙ－４’５’－ｄｉｃｈｌｏｒｏ－６－ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ（ＪＯＥ）、ＱＦＩＴＣ（ＸＲＩＴＣ）、ｆｌｕｏｒｅｓｃａｍｉｎｅ、ＩＲ１４４、ＩＲ１４４６、Ｍａｌａｃｈｉｔｅ Ｇｒｅｅｎ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ、４－ｍｅｔｈｙｌｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｏｎｅ、ｏｒｔｈｏ ｃｒｅｓｏｌｐｈｔｈａｌｅｉｎ、ｎｉｔｒｏｔｙｒｏｓｉｎｅ、ｐａｒａｒｏｓａｎｉｌｉｎｅ、フェノールレッド、Ｂ－ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ、ｏ－フタルジアルデヒド、ピレンおよびこの誘導体（ピレンブチレート、スクシンイミジル１－ピレンブチレート）、量子ドット、Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｒｅｄ ４（Ｃｉｂａｃｒｏｎ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｒｅｄ ３Ｂ－Ａ）、ローダミンおよびこの誘導体（６－カルボキシル－Ｘ－ローダミン、６－カルボキシルローダミン、ローダミンＢ、ローダミン１２３、ローダミンＸイソシアネート、スルホローダミンＢ、スルホローダミン１０１、テトラメチルローダミン、テトラメチルローダミンイソシアネート）、リボフラビン、ｒｏｓｏｌｉｃ ａｃｉｄ、ピレン、カルボピロニン、オキサジン、キサンテン、チオキサンテンおよびｔｅｒｂｉｕｍ ｃｈｅｌａｔｅ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓなどがある。
【0081】
また、本発明に係るオリゴヌクレオチドは核酸との結合力を向上させるために、マイナーグルーブバインダー（ＭＧＢ；ｍｉｎｏｒ ｇｒｏｏｖｅ ｂｉｎｄｅｒ）をさらに含むことができる。
【0082】
このようなオリゴヌクレオチドは化学的、生物学的領域で多様に活用することができる。特にリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応またはマイクロアッセイ（ｍｉｃｒｏａｓｓａｙ）等に有用に使われ得るが、これに限定されるものではない。
【0083】
また、本発明の他の側面によると、前記オリゴヌクレオチドを含む核酸検出用組成物が提供される。
【0084】
本発明の一実施例に係る核酸検出用組成物は、化学式１で表示される消光子とマイナーグルーブバインダーおよび蛍光団を同時に含むオリゴヌクレオチドとともに標的生体分子との反応のための酵素、溶媒（緩衝液など）およびその他の試薬などをさらに含むことができる。
【0085】
ここで、溶媒としてはホスフェート緩衝液、カーボネート緩衝液およびトリス緩衝液で構成された群から選択される緩衝液、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、ジクロロメタン、メタノール、エタノールおよびアセトニトリルから選択される有機溶媒または水などが使われ得、溶媒の種類によって消光子に多様な作用基を導入することによって溶解度を調節することが可能である。
【0086】
また、本発明のさらに他の側面によると、化学式１で表示される消光子、支持体および前記消光子と前記支持体を連結するリンカーを含む核酸検出用支持体が提供される。
【0087】
これに伴い、サンプル内の生体分子は支持体上に固定化された消光子との相互作用を通じて支持マトリックス上に固定され得る。
【0088】
前記支持マトリックスはガラス、セルロース、ナイロン、アクリルアミドゲル、デキストラン、ポリスチレン、アルジネート、コラーゲン、ペプチド、フィブリン、ヒアルロン酸、アガロース、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、ポリエチレンオキシド、ポリエチレングリコールジアクリレート、ゼラチン、マトリゲル（ｍａｔｒｉｇｅｌ）、ポリ乳酸、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、キトサン、ラテックスおよびセパロースから選択される少なくとも一つで製造され得、ビーズまたはメンブレンの形態であり得る。
【0089】
ここで、リンカーは消光子と支持体を連結する部分であって、消光子と支持体を連結できる任意の物質はすべて本願で意図したリンカーとして使われ得る。
【0090】
例えば、リンカーは置換または非置換されたＣ１－Ｃ３０アルキル、少なくとも一つのヘテロ原子を含む置換または非置換されたＣ２－Ｃ３０ヘテロアルキル、置換または非置換されたＣ６－Ｃ３０アリールおよび置換または非置換されたＣ３－Ｃ３０ヘテロアリールから選択され得、より具体的には、１～６個のエチレングリコールが連結された鎖であり得る。
【0091】
このようなリンカーは消光子と支持体を連結するだけであり、消光子または蛍光団の他の反応または蛍光および消光作用に影響を及ぼさない。
【0092】
核酸検出方法
本発明の一実施例によると、標的核酸に消光子で標識されたプローブを反応させて標識する方法が具現され得る。また、標的生体分子の種類によって消光子に適切な反応性基を導入することによって、標的－特異的相互作用を利用した生体分子の標識方法が具現されてもよい。併せて、消光子で標識した生体分子を電気泳動を通じて同定する方法が具現されてもよい。
本発明の一実施例によると、標的核酸に消光子で標識されたプローブを反応させて標識する方法が具現され得る。また、標的生体分子の種類によって消光子に適切な反応性基を導入することによって、標的－特異的相互作用を利用した生体分子の標識方法が具現されてもよい。併せて、消光子で標識した生体分子を電気泳動を通じて同定する方法が具現されてもよい。
【0093】
ＤＮＡマイクロアレイ法
ＤＮＡマイクロアレイ法は標識しなければならない標的核酸に染料を反応させて標識する一方、標的核酸に対して相補的な塩基配列を有する一本鎖のプローブ核酸を準備し、一本鎖に変性させた標的核酸とプローブ核酸を基板の上で混成化して、標的核酸の蛍光を測定する。
ＤＮＡマイクロアレイ法は標識しなければならない標的核酸に染料を反応させて標識する一方、標的核酸に対して相補的な塩基配列を有する一本鎖のプローブ核酸を準備し、一本鎖に変性させた標的核酸とプローブ核酸を基板の上で混成化して、標的核酸の蛍光を測定する。
【0094】
本標識方法で基板に固定するプローブ核酸としては、遺伝子の発現を調査する場合、ｃＤＮＡなどのｃＤＮＡのライブラリ、ゲノムのライブラリまたはすべてのゲノムを鋳型としてＰＣＲ法によって増幅して調製したものを使うことができる。
【0095】
また、遺伝子の変移などを調査する場合、標準となるすでに知られている配列を根拠として、変移などに対応する種々のオリゴヌクレオチドを合成したものを使うことができる。
【0096】
プローブ核酸を基板の上に固定することは、核酸の種類や基板の種類によって適当な方法を選択することができる。例えば、ＤＮＡの電荷を利用して、ポリリシンなどのカチオンで表面処理した基板に静電結合させる方法を利用してもよい。
【0097】
一本鎖に変性させた標的核酸を基板の上に固定し、オリゴヌクレオチドと混成化する。ここで、オリゴヌクレオチドの５’末端には蛍光団が標識され、３’末端には化学式１で表示される消光子から選択される少なくとも一つが標識される。５’末端と３’末端の間には標的となる核酸と相補的に結合できるプローブが位置することができる。
【0098】
混成化は室温～７０℃、そして２～４８時間の範囲で行うことが好ましい。混成化によってプローブ核酸と相補的な塩基配列を有する標的核酸が選択的にプローブ核酸と結合する。その後、基板を洗浄して室温で乾燥する。
【0099】
この時、オリゴヌクレオチドはプローブによって標的核酸に混成化されるが、５’末端の蛍光団は３’末端の消光子によって消光された状態で存在する。
【0100】
引き続き、標的核酸に混成化されたオリゴヌクレオチドはポリメラーゼによって伸長するが、オリゴヌクレオチドはポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性によって標的核酸から分離および分解され、オリゴヌクレオチドの５’末端の蛍光団と３’末端の消光子は互いに分離され、これに伴い、蛍光団は蛍光を発することができるようになる。
【0101】
この時、発生する蛍光強度を測定して標的核酸の増幅量を測定できるようになる。
【0102】
以下では、本発明の具体的な実施例を提示する。ただし、下記に記載された実施例は本発明を具体的に例示または説明するためのものに過ぎず、これにより本発明が制限されてはならない。
【0103】
製造例１．化合物１の合成
【化28】
【0104】
中間体２の合成
５００ｍＬ １ツ口反応器に２，３，３－トリメチルインドレニン（３０ｇ、０．１８８ｍｏｌ）と硫酸１２０ｍｌを入れて０℃で撹はんした。ＫＮＯ３（１９．０ｇ、０．１８８ｍｍｏｌ）と硫酸（１２０ｍＬ）を混ぜた溶液を０℃で滴加した。１時間後氷を入れてＮａＯＨ（ａｑ）で中和した。引き続き、生成された固体をフィルタ後乾燥した。
５００ｍＬ １ツ口反応器に２，３，３－トリメチルインドレニン（３０ｇ、０．１８８ｍｏｌ）と硫酸１２０ｍｌを入れて０℃で撹はんした。ＫＮＯ３（１９．０ｇ、０．１８８ｍｍｏｌ）と硫酸（１２０ｍＬ）を混ぜた溶液を０℃で滴加した。１時間後氷を入れてＮａＯＨ（ａｑ）で中和した。引き続き、生成された固体をフィルタ後乾燥した。
【0105】
中間体３の合成
２Ｌ反応器に中間体２（３６．３ｇ、０．１７８ｍｏｌ）と６Ｍ ＨＣｌ ９５０ｍｌを入れて撹はんした。Ｔｉｎ（ＩＩ）ｃｈｌｏｒｉｄｅ ｄｅｈｙｄｒａｔｅ（２４０．６ｇ、１．０６６ｍｏｌ）を入れて１００℃で２時間撹はんした。反応が終了すると室温で冷却した後ＮａＯＨで中和した。引き続き、ＭＣと水で抽出後濃縮して乾燥した。
２Ｌ反応器に中間体２（３６．３ｇ、０．１７８ｍｏｌ）と６Ｍ ＨＣｌ ９５０ｍｌを入れて撹はんした。Ｔｉｎ（ＩＩ）ｃｈｌｏｒｉｄｅ ｄｅｈｙｄｒａｔｅ（２４０．６ｇ、１．０６６ｍｏｌ）を入れて１００℃で２時間撹はんした。反応が終了すると室温で冷却した後ＮａＯＨで中和した。引き続き、ＭＣと水で抽出後濃縮して乾燥した。
【0106】
中間体４の合成
反応器に中間体３（５．０ｇ、０．０２９ｍｏｌ）ＤＩＰＥＡ（１４．８ｇ、０．１１５ｍｏｌ）、ＣＨ３Ｉ（１２．２ｇ、０．０８６ｍｏｌ）とアセトン５０．０ｍｌを入れて３日間撹はんした。引き続き、ＭＣと水で抽出した後濃縮してカラム（ＨＥＰ：ＥＡ＝４：１）精製した。
反応器に中間体３（５．０ｇ、０．０２９ｍｏｌ）ＤＩＰＥＡ（１４．８ｇ、０．１１５ｍｏｌ）、ＣＨ３Ｉ（１２．２ｇ、０．０８６ｍｏｌ）とアセトン５０．０ｍｌを入れて３日間撹はんした。引き続き、ＭＣと水で抽出した後濃縮してカラム（ＨＥＰ：ＥＡ＝４：１）精製した。
【0107】
中間体６の合成
反応器に中間体４（１．４ｇ、０．００７ｍｏｌ）と中間体５（１．５ｇ、０．００８ｍｏｌ）をジオキサン（１４ｍｌ）に溶かして１４時間還流撹はんした。引き続き、溶媒を濃縮後カラム精製した。
反応器に中間体４（１．４ｇ、０．００７ｍｏｌ）と中間体５（１．５ｇ、０．００８ｍｏｌ）をジオキサン（１４ｍｌ）に溶かして１４時間還流撹はんした。引き続き、溶媒を濃縮後カラム精製した。
【0108】
中間体８の合成
１００ｍＬ １ツ口反応器に中間体６（１ｇ、０．００３ｍｏｌ）、マロンアルデヒドジアニリド塩酸塩（０．７ｇ、０．００３ｍｏｌ）、酢酸（２ｍＬ）、無水酢酸（１０ｍＬ）を入れて１００℃で１時間撹はんした。引き続き、エチルアセテートで固体を析出させた後カラム精製した（ＭＣ：ＭｅＯＨ＝５０：１）。
１００ｍＬ １ツ口反応器に中間体６（１ｇ、０．００３ｍｏｌ）、マロンアルデヒドジアニリド塩酸塩（０．７ｇ、０．００３ｍｏｌ）、酢酸（２ｍＬ）、無水酢酸（１０ｍＬ）を入れて１００℃で１時間撹はんした。引き続き、エチルアセテートで固体を析出させた後カラム精製した（ＭＣ：ＭｅＯＨ＝５０：１）。
【0109】
中間体１１の合成
反応器に中間体９（１００ｇ、０．３６６ｍｏｌ）と中間体１０（８６．２ｇ、０．４３９ｍｏｌ）、Ｐｄ（ＯＡｃ）２（８．２ｇ、０．０３７ｍｏｌ）、ＢＩＮＡＰ（２２．８ｇ、０．０３７ｍｏｌ）、ＳＴＢ（４９．３ｇ、０．５１３ｍｏｌ）、トルエン１０００ｍｌを入れて還流撹はんした。ＴＬＣ確認後常温で冷却した。引き続き、濃縮後ＭＣ／Ｈ２Ｏで抽出してカラム精製した。
反応器に中間体９（１００ｇ、０．３６６ｍｏｌ）と中間体１０（８６．２ｇ、０．４３９ｍｏｌ）、Ｐｄ（ＯＡｃ）２（８．２ｇ、０．０３７ｍｏｌ）、ＢＩＮＡＰ（２２．８ｇ、０．０３７ｍｏｌ）、ＳＴＢ（４９．３ｇ、０．５１３ｍｏｌ）、トルエン１０００ｍｌを入れて還流撹はんした。ＴＬＣ確認後常温で冷却した。引き続き、濃縮後ＭＣ／Ｈ２Ｏで抽出してカラム精製した。
【0110】
中間体１３の合成
反応器に中間体１１（１００ｇ、０．２５７ｍｏｌ）と中間体１２（４４．３、０．５１４ｍｏｌ）、Ｃｏｎ．ＨＣｌ ２５０ｍｌとエタノール８００ｍｌを入れて一日の間還流撹はんした。ＴＬＣ確認後常温で冷却した。引き続き、エチルアセテートで固体を析出してフィルタ後乾燥した。
反応器に中間体１１（１００ｇ、０．２５７ｍｏｌ）と中間体１２（４４．３、０．５１４ｍｏｌ）、Ｃｏｎ．ＨＣｌ ２５０ｍｌとエタノール８００ｍｌを入れて一日の間還流撹はんした。ＴＬＣ確認後常温で冷却した。引き続き、エチルアセテートで固体を析出してフィルタ後乾燥した。
【0111】
中間体１５の合成
反応器に中間体１３（１０．０ｇ ０．０３６ｍｏｌ）と中間体１４（８．５ｇ、０．０４４ｍｏｌ）とＤＣＢ ２０ｍｌを入れて一日の間還流撹はんした。エチルアセテートを使って個体析出後フィルタして乾燥した。
反応器に中間体１３（１０．０ｇ ０．０３６ｍｏｌ）と中間体１４（８．５ｇ、０．０４４ｍｏｌ）とＤＣＢ ２０ｍｌを入れて一日の間還流撹はんした。エチルアセテートを使って個体析出後フィルタして乾燥した。
【0112】
中間体１６の合成
反応器に中間体８（２．０ｇ、０．００５ｍｏｌ）、中間体１５（３．３ｇ、０．００５ｍｍｏｌ）、無水酢酸（０．９ｍｌ、９．７１ｍｍｏｌ）、ピリジン（４０ｍＬ）を入れて還流下で２時間撹はんした。引き続き、濃縮後カラム精製した。
反応器に中間体８（２．０ｇ、０．００５ｍｏｌ）、中間体１５（３．３ｇ、０．００５ｍｍｏｌ）、無水酢酸（０．９ｍｌ、９．７１ｍｍｏｌ）、ピリジン（４０ｍＬ）を入れて還流下で２時間撹はんした。引き続き、濃縮後カラム精製した。
【0113】
化合物１（１８）の合成
反応器に中間体１６（５００ｍｇ、０．７２６ｍｍｏｌ）と中間体１７（１１０．１ｍｇ、１．０８９ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（３３１．１ｍｇ、０．８７１ｍｍｏｌ）、ｍｅｔｈｙｌｍｏｐｈｏｒｉｎｅ（２２０．２ｍｇ、２．１７７ｍｍｏｌ）、ＤＭＦ（１０ｍｌ）を入れて常温で撹はんした。引き続き、ＭＣと水を使って抽出後カラム精製した。
反応器に中間体１６（５００ｍｇ、０．７２６ｍｍｏｌ）と中間体１７（１１０．１ｍｇ、１．０８９ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（３３１．１ｍｇ、０．８７１ｍｍｏｌ）、ｍｅｔｈｙｌｍｏｐｈｏｒｉｎｅ（２２０．２ｍｇ、２．１７７ｍｍｏｌ）、ＤＭＦ（１０ｍｌ）を入れて常温で撹はんした。引き続き、ＭＣと水を使って抽出後カラム精製した。
【0114】
製造例２．化合物２の合成
【化29】
【0115】
中間体２０の合成
反応器に中間体６（１０．０ｇ、０．０２６ｍｏｌｅ）と中間体１９（５．６ｇ、０．０２９ｍｏｌｅ）、酢酸（５ｍＬ）、無水酢酸（１５ｍＬ）を入れて１００℃で１時間撹はんした。引き続き、エチルアセテートで固体を析出させた後カラム精製した（ＭＣ：ＭｅＯＨ＝５０：１）。
反応器に中間体６（１０．０ｇ、０．０２６ｍｏｌｅ）と中間体１９（５．６ｇ、０．０２９ｍｏｌｅ）、酢酸（５ｍＬ）、無水酢酸（１５ｍＬ）を入れて１００℃で１時間撹はんした。引き続き、エチルアセテートで固体を析出させた後カラム精製した（ＭＣ：ＭｅＯＨ＝５０：１）。
【0116】
中間体２１の合成
反応器に中間体８（２．０ｇ、０．００４ｍｏｌ）、中間体１５（２．３ｇ、０．００４ｍｍｏｌ）、無水酢酸（０．９ｍｌ、９．７１ｍｍｏｌ）、ピリジン（４０ｍＬ）を入れて還流下で２時間撹はんした。引き続き、濃縮後カラム精製した。
反応器に中間体８（２．０ｇ、０．００４ｍｏｌ）、中間体１５（２．３ｇ、０．００４ｍｍｏｌ）、無水酢酸（０．９ｍｌ、９．７１ｍｍｏｌ）、ピリジン（４０ｍＬ）を入れて還流下で２時間撹はんした。引き続き、濃縮後カラム精製した。
【0117】
化合物２（２２）の合成
反応器に中間体１６（５００ｍｇ、０．７２６ｍｍｏｌ）と中間体１７（１０７．９ｍｇ、１．０６７ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（３２４．５ｍｇ、０．８５４ｍｍｏｌ）、ｍｅｔｈｙｌｍｏｐｈｏｒｉｎｅ（２１５．８ｍｇ、２．１３４ｍｍｏｌ）、ＤＭＦ（１０ｍｌ）を入れて常温で撹はんした。引き続き、ＭＣと水を使って抽出後カラム精製した。
反応器に中間体１６（５００ｍｇ、０．７２６ｍｍｏｌ）と中間体１７（１０７．９ｍｇ、１．０６７ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（３２４．５ｍｇ、０．８５４ｍｍｏｌ）、ｍｅｔｈｙｌｍｏｐｈｏｒｉｎｅ（２１５．８ｍｇ、２．１３４ｍｍｏｌ）、ＤＭＦ（１０ｍｌ）を入れて常温で撹はんした。引き続き、ＭＣと水を使って抽出後カラム精製した。
【0118】
製造例３．化合物６の合成
【化30】
【0119】
中間体２５の合成
反応器に中間体２３（２５．０ｇ、０．１５２ｍｏｌ）、中間体２４（３０．１ｇ、０．１８３ ｍｏｌ）、Ｋ２ＣＯ３（２５．２ｇ、０．１８３ｍｏｌ）、ＤＭＦ（２５０ｍｌ）を入れて５０℃で一日の間撹はんした。ＴＬＣ確認後ＥＡと水で抽出して濃縮した後にトルエン（２５０ｍｌ）とＴｓＯＨ（５．２ｇ、０．０３０ｍｏｌ）を入れて一日の間還流撹はんした。引き続き、ＭＣと水で抽出した後カラム精製した。
反応器に中間体２３（２５．０ｇ、０．１５２ｍｏｌ）、中間体２４（３０．１ｇ、０．１８３ ｍｏｌ）、Ｋ２ＣＯ３（２５．２ｇ、０．１８３ｍｏｌ）、ＤＭＦ（２５０ｍｌ）を入れて５０℃で一日の間撹はんした。ＴＬＣ確認後ＥＡと水で抽出して濃縮した後にトルエン（２５０ｍｌ）とＴｓＯＨ（５．２ｇ、０．０３０ｍｏｌ）を入れて一日の間還流撹はんした。引き続き、ＭＣと水で抽出した後カラム精製した。
【0120】
中間体２６の合成
反応器に中間体２５（１０．０ｇ、０．０４３ｍｏｌ）、ヨードプロパノール（９．７ｇ、０．０５２ｍｏｌ）、１，４－ジオキサン（２０．０ｍｌ）を入れて一日の間還流撹はんした。引き続き、ＴＬＣ確認後カラム精製した。
反応器に中間体２５（１０．０ｇ、０．０４３ｍｏｌ）、ヨードプロパノール（９．７ｇ、０．０５２ｍｏｌ）、１，４－ジオキサン（２０．０ｍｌ）を入れて一日の間還流撹はんした。引き続き、ＴＬＣ確認後カラム精製した。
【0121】
中間体２８の合成
反応器に中間体２６（５．０ｇ、０．０１２ｍｏｌ）、中間体２７（２．６ｇ、０．０１３ｍｏｌ）、Ａｃ２Ｏ（１５ｍｌ）を入れて３時間の間還流撹はんした。引き続き、常温で冷却後溶媒除去した後カラム精製した。
反応器に中間体２６（５．０ｇ、０．０１２ｍｏｌ）、中間体２７（２．６ｇ、０．０１３ｍｏｌ）、Ａｃ２Ｏ（１５ｍｌ）を入れて３時間の間還流撹はんした。引き続き、常温で冷却後溶媒除去した後カラム精製した。
【0122】
中間体３０の合成
反応器に中間体２８（１．３ｇ、０．００３ｍｏｌ）、ピリジン（１３ｍｌ）を入れて常温で撹はんした。中間体２９（１．０ｇ、０．００３ｍｏｌ）をＭＣ（１３ｍｌ）に添加した後常温で一日の間撹はんした。引き続き、溶媒を濃縮した後カラム精製した。
反応器に中間体２８（１．３ｇ、０．００３ｍｏｌ）、ピリジン（１３ｍｌ）を入れて常温で撹はんした。中間体２９（１．０ｇ、０．００３ｍｏｌ）をＭＣ（１３ｍｌ）に添加した後常温で一日の間撹はんした。引き続き、溶媒を濃縮した後カラム精製した。
【0123】
中間体３１の合成
反応器に中間体１３（１０．０ｇ、０．０３６ｍｏｌ）、ヨードプロパノール（６．８ｇ、０．０３６ｍｏｌ）、１，４－ジオキサン（５０ｍｌ）を入れて一日の間還流撹はんした。引き続き、溶媒を除去した後カラム精製した。
反応器に中間体１３（１０．０ｇ、０．０３６ｍｏｌ）、ヨードプロパノール（６．８ｇ、０．０３６ｍｏｌ）、１，４－ジオキサン（５０ｍｌ）を入れて一日の間還流撹はんした。引き続き、溶媒を除去した後カラム精製した。
【0124】
化合物６ ３２の合成
反応器に中間体３０（１．１ｇ、０．００１ｍｏｌ）、中間体３１（０．６ｇ、０．００１ｍｏｌ）、ＫＯＡｃ（０．２ｇ、０．００２ｍｏｌ）、エタノール（２２ｍｌ）を入れて一日の間還流撹はんした。引き続き、常温で冷却した後溶媒を濃縮した後にカラー精製した。
反応器に中間体３０（１．１ｇ、０．００１ｍｏｌ）、中間体３１（０．６ｇ、０．００１ｍｏｌ）、ＫＯＡｃ（０．２ｇ、０．００２ｍｏｌ）、エタノール（２２ｍｌ）を入れて一日の間還流撹はんした。引き続き、常温で冷却した後溶媒を濃縮した後にカラー精製した。
【0125】
製造例４．化合物７の合成
【化31】
【0126】
中間体３３の合成
反応器に中間体２６（５．０ｇ、０．０１２ｍｏｌ）、中間体７（３．７ｇ、０．０１４ｍｏｌ）、Ａｃ２Ｏ（２０ｍｌ）を入れて３時間の間還流撹はんした。引き続き、溶媒を濃縮した後カラム精製した。
反応器に中間体２６（５．０ｇ、０．０１２ｍｏｌ）、中間体７（３．７ｇ、０．０１４ｍｏｌ）、Ａｃ２Ｏ（２０ｍｌ）を入れて３時間の間還流撹はんした。引き続き、溶媒を濃縮した後カラム精製した。
【0127】
中間体３４の合成
反応器に中間体３３（２．０ｇ、０．００４ｍｏｌ）、中間体２９（１．５ｇ、０．００４ｍｏｌ）を入れて中間体３０と同一の方法で合成した。
反応器に中間体３３（２．０ｇ、０．００４ｍｏｌ）、中間体２９（１．５ｇ、０．００４ｍｏｌ）を入れて中間体３０と同一の方法で合成した。
【0128】
化合物７（３５）の合成
反応器に中間体３４（１．５ｇ、０．００２ｍｏｌ）、中間体３１（０．８ｇ、０．００２ｍｏｌ）、ＫＯＡｃ（０．２ｇ、０．００２ｍｏｌ）、エタノール（３０ｍｌ）を入れて化合物２の合成と同一の方法で合成した。
反応器に中間体３４（１．５ｇ、０．００２ｍｏｌ）、中間体３１（０．８ｇ、０．００２ｍｏｌ）、ＫＯＡｃ（０．２ｇ、０．００２ｍｏｌ）、エタノール（３０ｍｌ）を入れて化合物２の合成と同一の方法で合成した。
【0129】
製造例５．化合物９の合成
【化32】
【0130】
中間体３６の合成
５００ｍＬ １ツ口反応器にＮ，Ｎ－ジエチル－１，４－フェニレンジアミン（２５ｇ、０．１５２ｍｏｌ）、３－ブロモ－３－メチル－２－ブタノン （３０．１ｇ、０．１８３ｍｏｌ）、ポタシウムカーボネート（２５．２ｇ、０．１８３ｍｏｌ）、ジメチルホルムアミド（２５０ｍＬ）を入れて５０℃で１２時間撹はんした。反応器に水（１００ｍＬ）を入れて強撹はんした後エチルアセテート（１００ｍＬ ｘ ２）で抽出した。有機層に無水硫酸マグネシウムを入れて５分間撹はんした後固体を濾過した。ろ液は濃縮して濃縮液にｐ－トルエンスルホン酸（５．２ｇ、０．０３ｍｏｌ）、トルエン（２５０ｍＬ）を入れて還流下で１２時間撹はんした。反応器に水（１００ｍＬ）を入れて強撹はんした後エチルアセテート（１００ｍＬ ｘ ２）で抽出した。有機層に無水硫酸マグネシウムを入れて５分間撹はんした後固体を濾過した。引き続き、ろ液は濃縮後カラム精製した。
５００ｍＬ １ツ口反応器にＮ，Ｎ－ジエチル－１，４－フェニレンジアミン（２５ｇ、０．１５２ｍｏｌ）、３－ブロモ－３－メチル－２－ブタノン （３０．１ｇ、０．１８３ｍｏｌ）、ポタシウムカーボネート（２５．２ｇ、０．１８３ｍｏｌ）、ジメチルホルムアミド（２５０ｍＬ）を入れて５０℃で１２時間撹はんした。反応器に水（１００ｍＬ）を入れて強撹はんした後エチルアセテート（１００ｍＬ ｘ ２）で抽出した。有機層に無水硫酸マグネシウムを入れて５分間撹はんした後固体を濾過した。ろ液は濃縮して濃縮液にｐ－トルエンスルホン酸（５．２ｇ、０．０３ｍｏｌ）、トルエン（２５０ｍＬ）を入れて還流下で１２時間撹はんした。反応器に水（１００ｍＬ）を入れて強撹はんした後エチルアセテート（１００ｍＬ ｘ ２）で抽出した。有機層に無水硫酸マグネシウムを入れて５分間撹はんした後固体を濾過した。引き続き、ろ液は濃縮後カラム精製した。
【0131】
中間体３７の合成
１００ｍＬ １ツ口反応器に中間体３６（４．４６ｇ、０．０１９４ｍｏｌ）、ヨードメタン（４．５３ｇ、０．０２９ｍｏｌ）、アセトニトリル（４５ｍＬ）を入れて還流下で１２時間撹はんした。引き続き、濃縮後カラム精製した。
１００ｍＬ １ツ口反応器に中間体３６（４．４６ｇ、０．０１９４ｍｏｌ）、ヨードメタン（４．５３ｇ、０．０２９ｍｏｌ）、アセトニトリル（４５ｍＬ）を入れて還流下で１２時間撹はんした。引き続き、濃縮後カラム精製した。
【0132】
中間体３８の合成
１００ｍＬ １ツ口反応器に中間体３７（２．７３ｇ、７．０６６ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ’－ジフェニルホルムアミジン．（１．５３ｇ、７．７７４ｍｍｏｌ）、無数酢酸（２５ｍＬ）を入れて１１０℃で１時間撹はんした。引き続き、濃縮後カラム精製した。
１００ｍＬ １ツ口反応器に中間体３７（２．７３ｇ、７．０６６ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ’－ジフェニルホルムアミジン．（１．５３ｇ、７．７７４ｍｍｏｌ）、無数酢酸（２５ｍＬ）を入れて１１０℃で１時間撹はんした。引き続き、濃縮後カラム精製した。
【0133】
中間体３９の合成
５００ｍＬ ３ツ口反応器にブロモ－９，９－ジメチルフルオレン（２５ｇ、０．０９１５ｍｏｌ）、ベンゾフェノールヒドラジン（２１．５５ｇ、０．１０９ｍｏｌ）、Ｐｄ２（ｄｂａ）３（３．３５ｇ、３．６６０ｍｍｏｌ）、ＢＩＮＡＰ（２．２８ｇ、３．６６ ｍｍｏｌ）、ソジウム－ｔｅｒｔ－ブトキシド（１２．３１ｇ、０．１２８ｍｏｌ）、トルエン（２５０ｍＬ）を入れて１００℃で１２時間撹はんした。セライトを敷いて熱い状態で固体を濾過した。引き続き、濃縮後カラム精製した。
５００ｍＬ ３ツ口反応器にブロモ－９，９－ジメチルフルオレン（２５ｇ、０．０９１５ｍｏｌ）、ベンゾフェノールヒドラジン（２１．５５ｇ、０．１０９ｍｏｌ）、Ｐｄ２（ｄｂａ）３（３．３５ｇ、３．６６０ｍｍｏｌ）、ＢＩＮＡＰ（２．２８ｇ、３．６６ ｍｍｏｌ）、ソジウム－ｔｅｒｔ－ブトキシド（１２．３１ｇ、０．１２８ｍｏｌ）、トルエン（２５０ｍＬ）を入れて１００℃で１２時間撹はんした。セライトを敷いて熱い状態で固体を濾過した。引き続き、濃縮後カラム精製した。
【0134】
中間体４０の合成
５００ｍＬ １ツ口反応器に中間体３９（３２．４ｇ、０．０８３４ｍｏｌ）、３－メチル－２－ブタノン（２２．５ｇ、０．２５０ｍｏｌ）、濃い塩酸（８０ｍＬ）、エタノール（３３０ｍＬ）を入れて還流下で１２時間撹はんした。濃縮後反応器に水（５００ｍＬ）を入れてエチルアセテート（５００ｍＬ ｘ ２）で抽出した。有機層に無水硫酸マグネシウムを入れて５分間撹はんした後固体を濾過した。引き続き、ろ液は濃縮後カラム精製した。
５００ｍＬ １ツ口反応器に中間体３９（３２．４ｇ、０．０８３４ｍｏｌ）、３－メチル－２－ブタノン（２２．５ｇ、０．２５０ｍｏｌ）、濃い塩酸（８０ｍＬ）、エタノール（３３０ｍＬ）を入れて還流下で１２時間撹はんした。濃縮後反応器に水（５００ｍＬ）を入れてエチルアセテート（５００ｍＬ ｘ ２）で抽出した。有機層に無水硫酸マグネシウムを入れて５分間撹はんした後固体を濾過した。引き続き、ろ液は濃縮後カラム精製した。
【0135】
中間体４１の合成
１００ｍＬ １ツ口反応器に中間体４０（２ｇ、７．２６２ｍｍｏｌ）、６－ヨードヘキサノイック酸（２．６３ｇ、１０．８９３ｍｍｏｌ）、１，４－ジオキサン（２０ｍＬ）を入れて還流下で１２時間撹はんした。引き続き、冷却後反応器にエチルアセテート（１００ｍＬ）を入れて結晶化した後固体を濾過した。
１００ｍＬ １ツ口反応器に中間体４０（２ｇ、７．２６２ｍｍｏｌ）、６－ヨードヘキサノイック酸（２．６３ｇ、１０．８９３ｍｍｏｌ）、１，４－ジオキサン（２０ｍＬ）を入れて還流下で１２時間撹はんした。引き続き、冷却後反応器にエチルアセテート（１００ｍＬ）を入れて結晶化した後固体を濾過した。
【0136】
中間体４２の合成
１００ｍＬ １ツ口反応器に中間体３８（２．４６ｇ、４．６３８ｍｍｏｌ）、中間体４１（１．２ｇ、２．３１９ｍｍｏｌ）、ピリジン（２５ｍＬ）を入れて８０℃で２時間撹はんした。引き続き、濃縮後カラム精製した。
１００ｍＬ １ツ口反応器に中間体３８（２．４６ｇ、４．６３８ｍｍｏｌ）、中間体４１（１．２ｇ、２．３１９ｍｍｏｌ）、ピリジン（２５ｍＬ）を入れて８０℃で２時間撹はんした。引き続き、濃縮後カラム精製した。
【0137】
化合物９ ４３の合成
１００ｍＬ １ツ口反応器に中間体４２（７００ｍｇ、０．８９ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ’－ジシクロヘキシルカルボイミド（２２０ｍｇ、１．０６８ｍｍｏｌ）、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（１２３ｍｇ、１．０６８ｍｍｏｌ）、ジクロロメタン（２０ｍＬ）を入れて常温で１時間撹はんした。生成された固体を濾過した後カラム精製した。
１００ｍＬ １ツ口反応器に中間体４２（７００ｍｇ、０．８９ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ’－ジシクロヘキシルカルボイミド（２２０ｍｇ、１．０６８ｍｍｏｌ）、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（１２３ｍｇ、１．０６８ｍｍｏｌ）、ジクロロメタン（２０ｍＬ）を入れて常温で１時間撹はんした。生成された固体を濾過した後カラム精製した。
【0138】
１Ｈ－ＮＭＲ（３００ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３） ８．３７（ｔ、１Ｈ、Ｊ＝１３．５Ｈｚ）、７．７１（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝７．５Ｈｚ）、７．６２（ｓ、１Ｈ）、７．４４－７．２６（ｍ、４Ｈ）、７．０９－７．０６（ｍ、３Ｈ）、６．６８－６．６６（ｍ、２Ｈ）、４．３６（ｑ、２Ｈ、Ｊ＝７．２Ｈｚ）、４．２０（ｔ、２Ｈ、Ｊ＝７．８Ｈｚ）、３．４３（ｑ、４Ｈ、Ｊ＝７．２Ｈｚ）、２．８５（ｓ、４Ｈ）、２．７２（ｔ、２Ｈ、Ｊ＝７．２Ｈｚ）、１．９６－１．９１（ｍ、４Ｈ）、１．７６（ｓ、６Ｈ）、１．７３（ｓ、６Ｈ）、１．６０（ｍ、２Ｈ）、１．５３（ｓ、６Ｈ）、１．２５（ｔ、９Ｈ、Ｊ＝６．３Ｈｚ）
【0139】
製造例６．消光子－ＣＰＧの合成
【化33】
【0140】
１０ｍＬ ｖｉａｌに化合物２（７５ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）、スクシン酸無水物（９．９ｍｇ、０．０９９ｍｍｏｌ）、４－ジメチルアミノピリジン（１２．１ｍｇ、０．０９９ｍｍｏｌ）、ジクロロメタン（５ｍｌ）を入れて常温で１．５時間ローリングした。完全に濃縮して１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（５２．７ｍｇ、０．２７５ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（２８μｌ）、ピリジン（５ｍｌ）、ＣＰＧ－ＮＨ２（１ｇ）を入れて常温で２時間ローリングした。ｐｏｗｄｅｒを濾過してアセトニトリル、メタノール、ジクロロメタンでそれぞれ３回ずつ洗浄した。乾燥後ＣａｐＡ／ＣａｐＢ＝１ｍｌ／１ｍｌを入れて常温で２時間ローリングし、アセトニトリル、ジクロロメタンでそれぞれ３回ずつ洗浄した後乾燥した。また、前記と同じ方法で化合物６－ＣＰＧ、化合物７－ＣＰＧおよび化合物９－ＣＰＧを合成した。
【0141】
実験例１．化合物２の消光特性測定
二重標識オリゴヌクレオチドの合成
製造例６で合成した化合物２－ＣＰＧとＣａｌｆｌｕｏｒＲｅｄ（商標）６１０を利用して１０－Ｃｏｌｕｍｎ Ｐｏｌｙｇｅｎ ＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒで二重標識オリゴヌクレオチドを合成した。合成した二重標識オリゴヌクレオチドを一般的な方法でＣｌｅａｖａｇｅおよびＤｅｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎした後ＲＰ ＨＰＬＣで精製した。二重標識合成したオリゴヌクレオチドの配列は下記の表１の通りである。
二重標識オリゴヌクレオチドの合成
製造例６で合成した化合物２－ＣＰＧとＣａｌｆｌｕｏｒＲｅｄ（商標）６１０を利用して１０－Ｃｏｌｕｍｎ Ｐｏｌｙｇｅｎ ＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒで二重標識オリゴヌクレオチドを合成した。合成した二重標識オリゴヌクレオチドを一般的な方法でＣｌｅａｖａｇｅおよびＤｅｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎした後ＲＰ ＨＰＬＣで精製した。二重標識合成したオリゴヌクレオチドの配列は下記の表１の通りである。
【表1】
【0142】
消光特性の測定
前記表１の二重標識プローブの消光特性を確認するために下記の表２に記載された組成でｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲを遂行した（Ｂｉｏｒａｄ社、ＣＦＸ－９６使用）。Ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲ結果は図１に示した。ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ：９５℃、３ｍｉｎ－［９５℃、１０ｓ－６０℃、３０ｓ］ ｘ ５０ｃｙｃｌｅｓ
前記表１の二重標識プローブの消光特性を確認するために下記の表２に記載された組成でｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲを遂行した（Ｂｉｏｒａｄ社、ＣＦＸ－９６使用）。Ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲ結果は図１に示した。ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ：９５℃、３ｍｉｎ－［９５℃、１０ｓ－６０℃、３０ｓ］ ｘ ５０ｃｙｃｌｅｓ
【表2】
【0143】
蛍光団と消光子がそれぞれＣａｌｆｌｕｏｒＲｅｄ（商標）６１０と化合物２で構成された二重標識プローブのｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲ結果を示した図１を参照すると、化合物２がＣａｌｆｌｕｏｒＲｅｄ（商標）６１０の蛍光を効果的に消光させ、ＰＣＲ増幅も理想的なパターンで進行されることを確認することができる。
【0144】
実験例２．化合物６の消光特性測定
二重標識オリゴヌクレオチドの合成
製造例６で合成した化合物６－ＣＰＧとＣａｌｆｌｕｏｒＲｅｄ（商標）６１０を利用して１０－Ｃｏｌｕｍｎ Ｐｏｌｙｇｅｎ ＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒで二重標識オリゴヌクレオチドを合成した。合成した二重標識オリゴヌクレオチドを一般的な方法でＣｌｅａｖａｇｅおよびＤｅｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎした後ＲＰ ＨＰＬＣで精製した。二重標識合成したオリゴヌクレオチドの配列は下記の表３の通りである。
二重標識オリゴヌクレオチドの合成
製造例６で合成した化合物６－ＣＰＧとＣａｌｆｌｕｏｒＲｅｄ（商標）６１０を利用して１０－Ｃｏｌｕｍｎ Ｐｏｌｙｇｅｎ ＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒで二重標識オリゴヌクレオチドを合成した。合成した二重標識オリゴヌクレオチドを一般的な方法でＣｌｅａｖａｇｅおよびＤｅｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎした後ＲＰ ＨＰＬＣで精製した。二重標識合成したオリゴヌクレオチドの配列は下記の表３の通りである。
【表3】
【0145】
消光特性測定
前記表３の二重標識プローブの消光特性を確認するために下記の表４に記載された組成でｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲを遂行した（Ｂｉｏｒａｄ社、ＣＦＸ－９６使用）。Ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲ結果は図２に示した。ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ：９５℃、３ｍｉｎ－［９５℃、１０ｓ－６０℃、３０ｓ］ ｘ ５０ｃｙｃｌｅｓ
前記表３の二重標識プローブの消光特性を確認するために下記の表４に記載された組成でｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲを遂行した（Ｂｉｏｒａｄ社、ＣＦＸ－９６使用）。Ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲ結果は図２に示した。ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ：９５℃、３ｍｉｎ－［９５℃、１０ｓ－６０℃、３０ｓ］ ｘ ５０ｃｙｃｌｅｓ
【表4】
【0146】
蛍光団と消光子がそれぞれＣａｌｆｌｕｏｒＲｅｄ（商標）６１０と化合物６で構成された二重標識プローブのｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲ結果を示した図２を参照すると、化合物６がＣａｌｆｌｕｏｒＲｅｄ（商標）６１０の蛍光を効果的に消光させ、ＰＣＲ増幅も理想的なパターンで進行されることを確認することができる。
【0147】
実験例３．化合物７の消光特性測定
二重標識オリゴヌクレオチドの合成
製造例６で合成した化合物７－ＣＰＧとＣａｌｆｌｕｏｒＲｅｄ（商標）６１０を利用して１０－Ｃｏｌｕｍｎ Ｐｏｌｙｇｅｎ ＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒで二重標識オリゴヌクレオチドを合成した。合成した二重標識オリゴヌクレオチドを一般的な方法でＣｌｅａｖａｇｅおよびＤｅｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎした後ＲＰ ＨＰＬＣで精製した。二重標識合成したオリゴヌクレオチドの配列は下記の表５の通りである。
二重標識オリゴヌクレオチドの合成
製造例６で合成した化合物７－ＣＰＧとＣａｌｆｌｕｏｒＲｅｄ（商標）６１０を利用して１０－Ｃｏｌｕｍｎ Ｐｏｌｙｇｅｎ ＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒで二重標識オリゴヌクレオチドを合成した。合成した二重標識オリゴヌクレオチドを一般的な方法でＣｌｅａｖａｇｅおよびＤｅｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎした後ＲＰ ＨＰＬＣで精製した。二重標識合成したオリゴヌクレオチドの配列は下記の表５の通りである。
【表5】
【0148】
消光特性測定
前記表５の二重標識プローブの消光特性を確認するために下記の表６に記載された組成でｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲを遂行した（Ｂｉｏｒａｄ社、ＣＦＸ－９６使用）。Ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲ結果は図３に示した。ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ：９５℃、３ｍｉｎ－［９５℃、１０ｓ－６０℃、３０ｓ］ ｘ ５０ｃｙｃｌｅｓ
前記表５の二重標識プローブの消光特性を確認するために下記の表６に記載された組成でｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲを遂行した（Ｂｉｏｒａｄ社、ＣＦＸ－９６使用）。Ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲ結果は図３に示した。ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ：９５℃、３ｍｉｎ－［９５℃、１０ｓ－６０℃、３０ｓ］ ｘ ５０ｃｙｃｌｅｓ
【表6】
【0149】
蛍光団と消光子がそれぞれＣａｌｆｌｕｏｒＲｅｄ（商標）６１０と化合物７で構成された二重標識プローブのｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲ結果を示した図３を参照すると、化合物７がＣａｌｆｌｕｏｒＲｅｄ（商標）６１０の蛍光を効果的に消光させ、ＰＣＲ増幅も理想的なパターンで進行されることを確認することができる。
【0150】
実験例４．化合物９の消光特性測定
二重標識オリゴヌクレオチドの合成
製造例６で合成した化合物９－ＣＰＧとＣａｌｆｌｕｏｒＲｅｄ（商標）６１０を利用して１０－Ｃｏｌｕｍｎ Ｐｏｌｙｇｅｎ ＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒで二重標識オリゴヌクレオチドを合成した。合成した二重標識オリゴヌクレオチドを一般的な方法でＣｌｅａｖａｇｅおよびＤｅｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎした後ＲＰ ＨＰＬＣで精製した。二重標識合成したオリゴヌクレオチドの配列は下記の表７の通りである。
二重標識オリゴヌクレオチドの合成
製造例６で合成した化合物９－ＣＰＧとＣａｌｆｌｕｏｒＲｅｄ（商標）６１０を利用して１０－Ｃｏｌｕｍｎ Ｐｏｌｙｇｅｎ ＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒで二重標識オリゴヌクレオチドを合成した。合成した二重標識オリゴヌクレオチドを一般的な方法でＣｌｅａｖａｇｅおよびＤｅｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎした後ＲＰ ＨＰＬＣで精製した。二重標識合成したオリゴヌクレオチドの配列は下記の表７の通りである。
【表7】
【0151】
消光特性測定
前記表７の二重標識プローブの消光特性を確認するために下記の表８に記載された組成でｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲを遂行した（Ｂｉｏｒａｄ社、ＣＦＸ－９６使用）。Ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲ結果は図４に示した。ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ：９５℃、３ｍｉｎ－［９５℃、１０ｓ－６０℃、３０ｓ］ ｘ ５０ｃｙｃｌｅｓ
前記表７の二重標識プローブの消光特性を確認するために下記の表８に記載された組成でｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲを遂行した（Ｂｉｏｒａｄ社、ＣＦＸ－９６使用）。Ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲ結果は図４に示した。ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ：９５℃、３ｍｉｎ－［９５℃、１０ｓ－６０℃、３０ｓ］ ｘ ５０ｃｙｃｌｅｓ
【表8】
【0152】
蛍光団と消光子がそれぞれＣａｌｆｌｕｏｒＲｅｄ（商標）６１０と化合物９で構成された二重標識プローブのｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲ結果を示した図４を参照すると、化合物９がＣａｌｆｌｕｏｒＲｅｄ（商標）６１０の蛍光を効果的に消光させ、ＰＣＲ増幅も理想的なパターンで進行されることを確認することができる。
【0153】
以上、本発明の一実施例に対して説明したが、該当技術分野で通常の知識を有する者であれば特許請求の範囲に記載された本発明の思想から逸脱しない範囲内で、構成要素の付加、変更、削除または追加などによって本発明を多様に修正および変更することができ、これもまた本発明の権利範囲内に含まれるものと言える。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】