特許 7475570 ＳＳＡ阻害活性を有する化合物の試験方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-04-19

(45)【発行日】2024-04-30

(54)【発明の名称】ＳＳＡ阻害活性を有する化合物の試験方法

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/6897 20180101AFI20240422BHJP

   C12Q 1/06 20060101ALI20240422BHJP

   G01N 33/15 20060101ALI20240422BHJP

   G01N 33/58 20060101ALI20240422BHJP

   C12N 15/62 20060101ALN20240422BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/6897 Z

C12Q1/06

G01N33/15 Z

G01N33/58 Z

C12N15/62 Z ZNA

【請求項の数】 7

(21)【出願番号】P 2020031591

(22)【出願日】2020-02-27

(65)【公開番号】P2021132577

(43)【公開日】2021-09-13

【審査請求日】2023-02-14

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 ウェブサイトの掲載日：令和元年（２０１９年）９月８日 ウェブサイトのアドレス：ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００２／ｉｊｃ．３２６７０ 公開者名：香■正宙、大津山彰、孫略、盛武敬、岡■龍史 ＲＥＣＱＬ４欠損細胞におけるＲＡＤ５２による誤りがち一本鎖ＤＮＡ修復機構に関する研究について公開した

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 開催日：令和元年（２０１９年）１２月２０日 集会名：名古屋大学環境医学研究所２０１９年度カンファレンス 開催場所：名古屋大学環境医学研究所 （〒４６４－０８０５愛知県名古屋市千種区不老町） 公開者名：香■正宙 ＲＥＣＱＬ４欠損細胞におけるＲＡＤ５２による誤りがち一本鎖ＤＮＡ修復機構に関する研究について発表した

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 ウェブサイトの掲載日：令和元年（２０１９年）１１月２０日 ウェブサイトのアドレス：ｈｔｔｐｓ：／／ｃｏｎｆｉｔ．ａｔｌａｓ．ｊｐ／ｇｕｉｄｅ／ｅｖｅｎｔ／ｍｂｓｊ２０１９／ｔｏｐ 公開者名：香■正宙 ＲＥＣＱＬ４欠損細胞におけるＲＡＤ５２による誤りがち一本鎖ＤＮＡ修復機構に関する研究について４Ｐ－０１１８として公開した

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 開催日：令和元年（２０１９年）１２月６日 集会名：第４２回分子生物学会 開催場所：マリンメッセ福岡（〒８１２－００３１福岡県福岡市博多区沖浜町７－１） 公開者名：香■正宙 ＲＥＣＱＬ４欠損細胞におけるＲＡＤ５２による誤りがち一本鎖ＤＮＡ修復機構に関する研究について発表した

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 ウェブサイトの掲載日：令和元年（２０１９年）９月 ウェブサイトのアドレス：ｈｔｔｐｓ：／／ｈｏｍｅ．ｈｉｒｏｓｈｉｍａ－ｕ．ａｃ．ｊｐ／ｈｏｕｓａｉ／ｔｏｐｉｃｓ＿ｐｄｆ／ＲｅｓｅｒｃｈＲｅｐｏｒｔＦＹ２０１８．ｐｄｆ 公開者名：香■正宙 ＲＥＣＱＬ４欠損細胞におけるＲＡＤ５２による誤りがち一本鎖ＤＮＡ修復機構に関する研究について公開した

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 ウェブサイトの掲載日：令和元年（２０１９年）１１月 ウェブサイトのアドレス：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｂｃ．ｋｙｏｔｏ－ｕ．ａｃ．ｊｐ／ｗｐ－ｃｏｎｔｅｎｔ／ｕｐｌｏａｄｓ／２０１９／１１／％Ｅ６％９４％ＢＥ％Ｅ７％９４％９Ｆ％Ｅ５％８６％８Ａ％Ｅ５％ＡＤ％９０．ｐｄｆ 公開者名：香■正宙 ＲＥＣＱＬ４欠損細胞におけるＲＡＤ５２による誤りがち一本鎖ＤＮＡ修復機構に関する研究について公開した

(73)【特許権者】

【識別番号】506087705

【氏名又は名称】学校法人産業医科大学

(73)【特許権者】

【識別番号】519413704

【氏名又は名称】公益財団法人ふじのくに医療城下町推進機構

(74)【代理人】

【識別番号】100149076

【弁理士】

【氏名又は名称】梅田 慎介

(74)【代理人】

【識別番号】100173185

【弁理士】

【氏名又は名称】森田 裕

(72)【発明者】

【氏名】香▲崎▼ 正宙

(72)【発明者】

【氏名】安藤 隆幸

【審査官】伊達 利奈

(56)【参考文献】

【文献】特開２０１９－１９０８２（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２０１９／１３１９６１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】Molecular and Cellular Biology，2004, Vol.24, pp.9305-9316

【文献】Nucleic Acids Research，2016, Vol.44, pp.4189-4199

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｑ １／００

Ｃ１２Ｎ １５／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

被検化合物が一本鎖アニーリング（ＳＳＡ）によるＤＮＡ修復経路を阻害するか否かを試験する方法であって、
二本鎖切断の修復を評価するレポーター系が導入されたＲＥＣＱＬ４欠損細胞内の当該レポーター系にＤＮＡの二本鎖切断を誘導し、ＳＳＡによるＤＮＡ修復を誘発することと、
ここで、当該レポーター系は、マーカー遺伝子を有し、マーカー遺伝子は、第一の部分と第二の部分とに分断されており、第一の部分は、制御配列に作動可能に連結し、第一の部分と第二の部分の間には、ＤＮＡ配列が介在し、これにより、少なくとも第二の部分は転写または翻訳がなされず、介在するＤＮＡ配列は、制限酵素の切断部位を有し、当該制限酵素による切断により、細胞内でＳＳＡによるＤＮＡ修復を誘発し、当該ＳＳＡによるＤＮＡ修復によって分断された第一の部分と第二の部分とがインフレームで再連結されると、インフレームで連結された第一の部分と第二の部分が発現し、これによって、当該第一の部分と第二の部分とを含むマーカー遺伝子を検出することができる系であり、
ＳＳＡによるＤＮＡ修復の前または修復中に前記細胞と被検化合物とを接触させることと、
マーカー遺伝子の発現量を測定すること
を含み、
マーカー遺伝子の発現量の減少が、被検化合物によるＳＳＡによるＤＮＡ修復経路の阻害強度を示す、
方法。

【請求項2】

マーカー遺伝子が、蛍光タンパク質、および薬剤選択マーカーから選択されるタンパク質をコードする遺伝子である、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

マーカー遺伝子が、緑色蛍光タンパク質ＧＦＰである、請求項１または２に記載の方法。

【請求項4】

介在するＤＮＡ配列が、マーカー遺伝子とは異なる薬剤選択マーカーをコードする遺伝子を発現可能に含む、請求項１または２に記載の方法。

【請求項5】

制限酵素が、Ｉ－ＳｃｅＩである、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

被検化合物で処理した細胞においてＲＡＤ５２の活性が非処理と比較して抑制されていることをさらに評価することを含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

ＲＡＤ５２の活性の抑制を、ＲＡＤ５２の核内でのフォーカス形成を指標として評価する、請求項６に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ＳＳＡ阻害活性を有する化合物の試験方法に関する。

【背景技術】

【0002】

非特許文献１によれば、ＲＥＣＱＬ４のＣ末端ドメインの欠損（ＲＥＣＱＬ４ΔＣ）を有する細胞株が、誤りがちな一本鎖アニーリング（ＳＳＡ）活性を向上させ、代替末端結合（Ａｌｔ－ＥＪ）の活性を低下させること、およびＲＥＣＱＬ４が二本鎖切断におけるＤＮＡ修復経路を制御しているであろうと示唆されることが報告されている。また、ＲＥＣＱＬ４ΔＣを有するがん細胞は、電離放射線照射やシスプラチン処置などのがん治療後にＳＳＡに関与する因子であるＲＰＡ２／ＲＡＤ５２のフォーカスを増加させ、ＤＮＡ損傷部位にＲＰＡ２／ＲＡＤ５２を集積させる。そして、ＲＡＤ５２に対するノックダウンやＲＡＤ５２阻害剤である、５－アミノイミダゾール－４－カルボキサミド－１－β－Ｄ－リボフラノシド（ＡＩＣＡＲ）、エピガロカテキン（ＥＧＣ）、およびＲＡＤ５２フェニルアラニン７９アプタマーが、ＲＥＣＱＬ４ΔＣを有する大腸がん細胞株（ＨＣＴ１１６細胞）の増殖を抑制することをインビトロおよびインビボグラフトモデルを用いて示している。

【0003】

特許文献１によれば、ＲＡＤ５２の阻害剤であるエピガロカテキン（ＥＧＣ）およびＡＩＣＡＲがＲＥＣＱＬ４欠損細胞でのＳＳＡ活性を阻害する可能性が明らかにされている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0004】

【文献】特開２０１９－１９０８２号公報

【非特許文献】

【0005】

【文献】Ｋｏｈｚａｋｉ Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ， ＤＯＩ： １０．１００２／ｉｊｃ．３２６７０

【発明の概要】

【0006】

ＤＮＡが損傷された後のＤＮＡ修復において、一本鎖アニーリング（ＳＳＡ）によるＤＮＡ修復経路が働き、これにより細胞は生存確率を高める。腫瘍に対してＤＮＡ損傷（特にＤＮＡの二本鎖切断）を誘発する治療（例えば、電離放射線照射やシスプラチン処置）でＲＡＤ５２を増加および活性化させＳＳＡが生じる。これに対して、ＲＡＤ５２によるＳＳＡ経路を阻害すると抗腫瘍効果が奏されると考えられる。ＳＳＡ阻害活性を有する化合物は、抗がん剤候補ととなり得る。また、ＲＡＤ５２の増加および活性化を阻害する化合物は、抗がん剤候補となり得る。本発明では、ＳＳＡ阻害活性を有する化合物およびＲＡＤ５２の増加および活性化を阻害する化合物を試験する方法を提供する。

【0007】

本発明では、以下の発明が提供される。
［１］被検化合物が一本鎖アニーリング（ＳＳＡ）によるＤＮＡ修復経路を阻害するか否かを試験する方法であって、
二本鎖切断の修復を評価するレポーター系が導入されたＲＥＣＱＬ４欠損細胞内の当該レポーター系にＤＮＡの二本鎖切断を誘導し、ＳＳＡによるＤＮＡ修復を誘発することと、
ここで、当該レポーター系は、マーカー遺伝子を有し、マーカー遺伝子は、第一の部分と第二の部分とに分断されており、第一の部分は、制御配列に作動可能に連結し、第一の部分と第二の部分の間には、ＤＮＡ配列が介在し、これにより、少なくとも第二の部分は転写または翻訳がなされず、介在するＤＮＡ配列は、制限酵素の切断部位を有し、当該制限酵素による切断により、細胞内でＳＳＡによるＤＮＡ修復を誘発し、当該ＳＳＡによるＤＮＡ修復によって分断された第一の部分と第二の部分とがインフレームで再連結されると、インフレームで連結された第一の部分と第二の部分が発現し、これによって、当該第一の部分と第二の部分とを含むマーカー遺伝子を検出することができる系であり、
ＳＳＡによるＤＮＡ修復の前または修復中に前記細胞と被検化合物とを接触させることと、
マーカー遺伝子の発現量を測定すること
を含み、
マーカー遺伝子の発現量の減少が、被検化合物によるＳＳＡによるＤＮＡ修復経路の阻害強度を示す、
方法。
［２］マーカー遺伝子が、蛍光タンパク質、および薬剤選択マーカーから選択されるタンパク質をコードする遺伝子である、上記［１］に記載の方法。
［３］マーカー遺伝子が、緑色蛍光タンパク質ＧＦＰである、上記［１］または［２］に記載の方法。
［４］介在するＤＮＡ配列が、マーカー遺伝子とは異なる薬剤選択マーカーをコードする遺伝子を発現可能に含む、上記［１］または［２］に記載の方法。
［５］制限酵素が、Ｉ－ＳｃｅＩである、上記［１］～［４］のいずれかに記載の方法。
［６］被検化合物で処理した細胞においてＲＡＤ５２の活性が非処理と比較して抑制されていることをさらに評価することを含む、上記［１］～［５］のいずれかに記載の方法。
［７］ＲＡＤ５２の活性の抑制を、ＲＡＤ５２の核内でのフォーカス形成を指標として評価する、上記［６］に記載の方法。

【図面の簡単な説明】

【0008】

【図1】図１は、二本鎖切断の修復を評価するレポーター系の一例としてＳＡＧＦＰを用いたＳＳＡによるＤＮＡ修復の測定原理を説明する。

【図2】図２は、ＲＥＣＱＬ４ΔＣ細胞では、Ｉ－ＳｃｅＩによって二本鎖切断を誘発させたときのＳＳＡによるＤＮＡ修復を、二本鎖切断の修復を評価するレポーター系の一例としてＳＡＧＦＰを用いて測定したＧＦＰ陽性細胞数が、野生型細胞（ＷＴ）の約２～３倍であったことを示す。

【図3】図３は、３３種類の被検化合物を用いてＳＳＡによるＤＮＡ修復の阻害をＧＦＰ陽性細胞の率に基づいて確認した結果である。

【図4】図４は、シスプラチン処理によって誘発されるＳＳＡ修復の過程においてＲＡＤ５２が核内でフォーカスを形成する様子を示す。

【図5】図５は、ＳＳＡ修復を阻害する化合物で処理した細胞において、ＲＡＤ５２の核内で形成するフォーカスの数を示す。細胞のシスプラチン処理により細胞内でＤＮＡ損傷が誘発され、当該ＤＮＡ損傷部位にはＲＡＤ５２が集積して図４に示されるような輝点を形成する。当該輝点数／細胞を減少させる化合物は、ＲＡＤ５２のＤＮＡ損傷部位への集積を阻害する化合物である。

【図6】図６は、実施例で用いたレポーター系においてＧＦＰ発現を駆動するために用いたプロモーターに作動可能に連結させたＧＦＰレポーターによるＧＰＦ発現に対する、表示された化合物の影響を示す。テアフラビンは、プロモーター自体に影響する、もしくはトランスフェクション自体に影響するアーティファクトを生じていた。

【図7】図７は、ＲＥＣＱＬ４ΔＣを有するＨＣＴ１１６細胞における、ＳＳＡ経路、Ａｌｔ－ＥＪ経路、およびＨＲ経路それぞれへのＲＡＤ５２のノックダウンの影響を示す。ｓｉＲＡＤ５２は、ＲＡＤ５２に対するｓｉＲＮＡ処理をしたことを示す。

【図8】図８は、ヒトＲＥＣＱＬ４のドメイン構造の模式図（上パネル）と、ヒトＲＥＣＱＬ４をコードする遺伝子の破壊スキームを示す。この破壊スキームでは、核移行シグナル（ＮＬＳ）のＣ末端側にストップコドンおよび制御配列に作動可能に連結したブラスチシジンＳ耐性遺伝子（Ｂｓｒ）とを含む挿入が行われた。

【発明の具体的な説明】

【0009】

本明細書では、細胞は、哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、サル、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ラマ、およびロバ）、例えば、ヒトの細胞であり得る。細胞は、細胞株であり得る。細胞株は、様々な細胞株を用いることができる。初代体細胞を株化する方法は当業者に周知である。

【0010】

本明細書では、「ＲＥＣＱＬ４」は、ＲｅｃＱヘリカーゼファミリーの一員であり、ゲノムの安定性維持に必要とされる。図８で示す通り、ＲＥＣＱＬ４は、Ｎ末端側から、Ｓｌｄ２様ドメイン、核移行シグナル（ＮＬＳ）、ヘリカーゼドメイン、およびＨｒｑ１ドメインをこの順番で有する。ＲＥＣＱＬ４のＣ末端側の領域（ヘリカーゼドメインを含む領域）を欠損した場合に、ロスムンド・トムソン症候群（ＲＴＳ）が誘発されることが知られている。ＲＥＣＱＬ４変異は、バラー・ゲロルド症候群（ＢＧＳ）およびラパジリノ症候群とも関連している。ＲＥＣＱＬ４は、いくつものＤＮＡ修復機構に関連しており、ＰＡＲＰ－１と相互作用し、ＢＥＲを制御して、一本鎖切断（ＳＳＢ）を修復する。発明者らの既報（Ｋｏｈｚａｋｉ Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ， ＤＯＩ： １０．１００２／ｉｊｃ．３２６７０）によれば、ＲＥＣＱＬ４のＣ末端ドメインの欠損（ＲＥＣＱＬ４ΔＣ）を有する細胞株が、誤りがちな一本鎖アニーリング（ＳＳＡ）活性を向上させ、代替末端結合（Ａｌｔ－ＥＪ）の活性を低下させること、およびＲＥＣＱＬ４が二本鎖切断におけるＤＮＡ修復経路を制御しているであろうと示唆されることが報告されている。また、ＲＥＣＱＬ４ΔＣを有するがん細胞は、電離放射線照射や白金製剤処置（例えば、シスプラチン処置）などのがん治療後にＲＰＡ２／ＲＡＤ５２のフォーカスを増加させる。そして、ＲＡＤ５２に対するノックダウンやＲＡＤ５２阻害剤である、５－アミノイミダゾール－４－カルボキサミド－１－β－Ｄ－リボフラノシド（ＡＩＣＡＲ）、エピガロカテキン（ＥＧＣ）、およびＲＡＤ５２フェニルアラニン７９アプタマーが、ＲＥＣＱＬ４ΔＣを有する大腸がん細胞株（ＨＣＴ１１６細胞）の増殖を抑制することをインビトロおよびインビボグラフトモデルを用いて示している。ヒトＲＥＣＱＬ４は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＡＨ１３２７７．２で登録されたアミノ酸配列を有するＲＥＣＱＬ４または当該アミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有するヒトＲＥＣＱＬ４であり得る。Ｃ末端ドメインは、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＡＨ１３２７７．２で登録されたアミノ酸配列において、４９０～１２０８番目のアミノ酸配列の領域であり得る。ヒト以外の細胞においても、ヒトＲＥＣＱＬ４のオーソログがゲノム上に存在し、当該オーソログが発現している。

【0011】

本明細書では、「ＲＥＣＱＬ４ΔＣ細胞」とは、ＲＥＣＱＬ４ΔＣを発現する細胞を意味する。ＲＥＣＱＬ４ΔＣは、ＲＥＣＱＬ４のうち、少なくともＮ末端側のＳｌｄ２様ドメイン（すなわち、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＡＨ１３２７７．２で登録されたアミノ酸配列において１～４９０番目のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有するＲＥＣＱＬ４の領域）を含む。ＲＥＣＱＬ４ΔＣは、例えば、Ｓｌｄ２様ドメインを含み得る。ＲＥＣＱＬ４ΔＣは、例えば、Ｓｌｄ２様ドメインと核移行シグナル（ＮＬＳ）とを含み得る。ＲＥＣＱＬ４ΔＣは、例えば、Ｓｌｄ２様ドメインと核移行シグナル（ＮＬＳ）とからなり得る。ＲＥＣＱＬ４ΔＣは、例えば、Ｃ末端側の領域（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＡＨ１３２７７．２で登録されたアミノ酸配列において４９０～１２０８番目のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有するＲＥＣＱＬ４の領域）の一部または全部を欠失している。ＲＥＣＱＬ４ΔＣを発現する細胞とは、ゲノム上に存在する内在性ＲＥＣＱＬ４をコードする遺伝子についてＲＥＣＱＬ４ΔＣとなる改変がなされた細胞であり得る。改変は、例えば、フレームシフト変異またはナンセンス変異の導入、例えば、ストップコドンの導入により行うことができる。また、遺伝子の改変は、当業者であれば、特に限定されないが例えば、ゲノム編集技術などの当業者に周知の方法を用いて適宜行うことができる。

【0012】

本明細書では、「ＲＥＣＱＬ４欠損細胞」とは、内在性のＲＥＣＱＬ４のヘリカーゼの機能および／または構造が欠失または阻害された細胞を意味する。ＲＥＣＱＬ４欠損細胞においては、内在性のＲＥＣＱＬ４が、遺伝子改変によってヘリカーゼ活性を低減または欠失している。ＲＥＣＱＬ４欠損細胞としては、例えば、ＲＥＣＱＬ４のヘリカーゼドメインが欠失した細胞、およびヘリカーゼドメインおよびＨｒｑ１ドメインが欠失した細胞、例えば、ＲＥＣＱＬ４ΔＣを有する細胞が挙げられる。ＲＥＣＱＬ４欠損細胞は、Ｓｌｄ２様ドメインを有する内在性のＲＥＣＱＬ４を有し得る。

【0013】

本明細書では、「ＲＡＤ５２」は、ＤＮＡ修復に関与するタンパク質である。ヒトＲＡＤ５２は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＡＡ８５７９３．１で登録されたアミノ酸配列を有するＲＡＤ５２または当該アミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有するヒトＲＡＤ５２であり得る。用いる細胞種が由来する動物種にＲＡＤ５２のオーソログが存在する。

【0014】

本明細書では、「処置」は、治療的処置および予防的処置を意味する。

【0015】

本明細書では、「白金製剤」は、抗腫瘍活性を有する抗がん剤であり、例えば、シスプラチンが挙げられる。

【0016】

本明細書では、「電離放射線照射」は、対象の悪性腫瘍の処置を目的として対象に当該悪性腫瘍に対して行われる放射線療法である。電離放射線照射は、Ｘ線、γ線、または粒子線の照射によりなされ得る。電離放射線照射は、照射した細胞内のＤＮＡに二本鎖切断を誘発させる。

【0017】

（１次アッセイ系）
本発明によれば、
被検化合物が一本鎖アニーリング（ＳＳＡ）によるＤＮＡ修復経路を阻害するか否かを試験する方法であって、
ＲＥＣＱＬ４欠損細胞を用いて、被検化合物がＳＳＡによるＤＮＡ修復経路を阻害するかを評価することを含む方法が提供される。

【0018】

本発明によれば、ＲＥＣＱＬ４欠損細胞は、ＲＥＣＱＬ４のノックアウト細胞であり得る。本発明によれば、ＲＥＣＱＬ４欠損細胞は、ＲＥＣＱＬ４ΔＣを発現する細胞であり得る。本発明によれば、ＲＥＣＱＬ４欠損細胞は、内在性のＲＥＣＱＬ４が、ＲＥＣＱＬ４ΔＣとなる改変がなされた細胞であり得る。

【0019】

より具体的には、本発明によれば、
被検化合物が一本鎖アニーリング（ＳＳＡ）によるＤＮＡ修復経路を阻害するか否かを試験する方法であって、
ＲＥＣＱＬ４欠損細胞に対して、二本鎖切断の修復を評価するレポーター系を導入することと、
ここで、当該レポーター系は、マーカー遺伝子を有し、マーカー遺伝子は、第一の部分と第二の部分とに分断されており、第一の部分は、制御配列に作動可能に連結し、第一の部分と第二の部分の間には、ＤＮＡ配列が介在し、これにより、少なくとも第二の部分は転写または翻訳がなされず、介在するＤＮＡ配列は、１６塩基以上の配列特異性を有する制限酵素の切断部位を有し、当該制限酵素による切断により、細胞内でＳＳＡによるＤＮＡ修復を誘発し、当該ＳＳＡによるＤＮＡ修復によって分断された第一の部分と第二の部分とがインフレームで再連結されると、インフレームで連結された第一の部分と第二の部分が発現し、これによって、当該第一の部分と第二の部分とを含むマーカー遺伝子を検出することができるベクター系であり、
上記ＲＥＣＱＬ４欠損細胞に対して、前記１６塩基以上の配列特異性を有する制限酵素を導入して、ＤＮＡの二本鎖切断を誘導し、ＳＳＡによるＤＮＡ修復を誘発することと、
ＳＳＡによるＤＮＡ修復の前または修復中に前記細胞と被検化合物とを接触させることと、
マーカー遺伝子の発現量を測定すること
を含み、
マーカー遺伝子の発現量の減少が、被検化合物によるＳＳＡによるＤＮＡ修復経路の阻害強度を示す、
方法
が提供される。

【0020】

本発明によればまた、
被検化合物が一本鎖アニーリング（ＳＳＡ）によるＤＮＡ修復経路を阻害するか否かを試験する方法であって、
二本鎖切断の修復を評価するレポーター系が導入されたＲＥＣＱＬ４欠損細胞内の当該レポーター系にＤＮＡの二本鎖切断を誘導し、ＳＳＡによるＤＮＡ修復を誘発することと、
ここで、当該レポーター系は、マーカー遺伝子を有し、マーカー遺伝子は、第一の部分と第二の部分とに分断されており、第一の部分は、制御配列に作動可能に連結し、第一の部分と第二の部分の間には、ＤＮＡ配列が介在し、これにより、少なくとも第二の部分は転写または翻訳がなされず、介在するＤＮＡ配列は、制限酵素の切断部位を有し、当該制限酵素による切断により、細胞内でＳＳＡによるＤＮＡ修復を誘発し、当該ＳＳＡによるＤＮＡ修復によって分断された第一の部分と第二の部分とがインフレームで再連結されると、インフレームで連結された第一の部分と第二の部分が発現し、これによって、当該第一の部分と第二の部分とを含むマーカー遺伝子を検出することができる系であり、
ＳＳＡによるＤＮＡ修復の前または修復中に前記細胞と被検化合物とを接触させることと、
マーカー遺伝子の発現量を測定すること
を含み、
マーカー遺伝子の発現量の減少が、被検化合物によるＳＳＡによるＤＮＡ修復経路の阻害強度を示す、
方法
が提供される。

【0021】

用いる細胞は、上記の通りである。細胞としては、例えば、がんではない細胞（非がん細胞）を用いることができ、または、例えば、がん細胞株を用いることができる。がん細胞株としては、例えば、大腸がん細胞株（例えば、ＨＣＴ１１６細胞）、ヒト肺がん細胞株（例えば、Ａ５４９細胞）、およびヒト乳がん細胞株（例えば、ＭＣＦ７細胞）を用いることができる。細胞は、哺乳動物細胞であり得、好ましくは、マウス細胞およびヒト細胞であり得、好ましくは、ヒト細胞である。

【0022】

本発明では、ＲＥＣＱＬ４欠損細胞に対して二本鎖切断の修復を評価するレポーター系を導入することができる。二本鎖切断の修復を評価するレポーター系は、ベクター系であり得る。二本鎖切断の修復を評価するレポーター系は、マーカー遺伝子の発現の有無によってＤＮＡ修復経路の活性を評価することができる系であり得る。ＲＥＣＱＬ４欠損細胞では、Ａｌｔ－ＥＪおよびＨＲに対してＳＳＡが亢進していることから、ＳＳＡによるＤＮＡ修復の評価を好適に行いうることを本発明では利用する。すなわち、二本鎖切断の修復を評価するレポーター系は、ＲＥＣＱＬ４欠損細胞では、ＳＳＡによるＤＮＡ修復の活性を評価することに適している。

【0023】

二本鎖切断の修復を評価するレポーター系は、ＤＮＡ修復によって破壊されたマーカー遺伝子が回復する仕組みを利用する。例えば、マーカー遺伝子を第一の部分と第二の部分とに分けることができる。第一の部分と第二の部分の間には、ＤＮＡ配列を介在させることができる。介在するＤＮＡ配列には、制限酵素の切断部位（すなわち二本鎖切断の誘導部位）を含めておくことができる。これにより、人為的に介在するＤＮＡ配列に二本鎖切断を誘導することができる。系は、細胞内に導入することから、制限酵素は、細胞のゲノムを切断しないことが好ましい。このことから、制限酵素の切断部位は、細胞のゲノムＤＮＡには存在しないことが好ましい。但し、評価系を著しく破壊しない程度の二本鎖切断を細胞のゲノムＤＮＡに誘発することは許容される。例えば、ヒトゲノムは、３０億塩基対であることから、１６塩基以上の特異性を有する制限酵素の切断部位は、理論上３箇所程度存在し得、１８塩基以上の特異性を有する制限酵素の切断部位は、理論上０．２箇所未満程度存在し得る。当業者であれば、これらを参考として、例えば、１６塩基以上の特異性を有する制限酵素、１７塩基以上の特異性を有する制限酵素、および１８塩基以上の特異性を有する制限酵素、ならびにその切断部位（または認識部位）を用いる系を用いることができる。本発明のある態様では、制限酵素およびその切断部位（または認識部位）としては、例えば、Ｉ－ＳｃｅＩ、Ｉ－ＳｃｅＩＩ、Ｉ－ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ－ＳｃｅＩＶ、Ｉ－ＳｃｅＶ、Ｉ－ＳｃｅＶＩ、Ｉ－ＳｃｅＶＩＩ、Ｉ－ＣｅｕＩ、Ｉ－ＣｅｕＡＩＩＰ、Ｉ－ＣｒｅＩ、Ｉ－ＣｒｅｐｓｂＩＰ、Ｉ－ＣｒｅｐｓｂＩＩＰ、Ｉ－ＣｒｅｐｓｂＩＩＩＰ、Ｉ－ＣｒｅｐｓｂＩＶＰ、Ｉ－ＴｌｉＩ、Ｉ－ＰｐｏＩ、ＰＩ－ＰｓｐＩ、Ｆ－ＳｃｅＩ、Ｆ－ＳｃｅＩＩ、Ｆ－ＳｕｖＩ、Ｆ－ＴｅｖＩ、Ｆ－ＴｅｖＩＩ、Ｉ－ＡｍａＩ、Ｉ－ＡｎｉＩ、Ｉ－ＣｈｕＩ、Ｉ－ＣｍｏｅＩ、Ｉ－ＣｐａＩ、Ｉ－ＣｐａＩＩ、Ｉ－ＣｓｍＩ、Ｉ－ＣｖｕＩ、Ｉ－ＣｖｕＡＩＰ、Ｉ－ＤｄｉＩ、Ｉ－ＤｄｉＩＩ、Ｉ－ＤｉｒＩ、Ｉ－ＤｍｏＩ、Ｉ－ＨｍｕＩ、Ｉ－ＨｍｕＩＩ、Ｉ－ＨｓＮＩＰ、Ｉ－ＬｌａＩ、Ｉ－ＭｓｏＩ、Ｉ－ＮａａＩ、Ｉ－ＮａｎＩ、Ｉ－ＮｃｌＩＰ、Ｉ－ＮｇｒＩＰ、Ｉ－ＮｉｔＩ、Ｉ－ＮｊａＩ、Ｉ－Ｎｓｐ２３６ＩＰ、Ｉ－ＰａｋＩ、Ｉ－ＰｂｏＩＰ、Ｉ－ＰｃｕＩＰ、Ｉ－ＰｃｕＡＩ、Ｉ－ＰｃｕＶＩ、Ｉ－ＰｇｒＩＰ、Ｉ－ＰｏｂＩＰ、Ｉ－ＰｏｒＩ、Ｉ－ＰｏｒＩＩＰ、Ｉ－ＰｂｐＩＰ、Ｉ－ＳｐＢｅｔａＩＰ、Ｉ－ＳｃａＩ、Ｉ－ＳｅｘＩＰ、Ｉ－ＳｎｅＩＰ、Ｉ－ＳｐｏｍＩ、Ｉ－ＳｐｏｍＣＰ、Ｉ－ＳｐｏｍＩＰ、Ｉ－ＳｐｏｍＩＩＰ、Ｉ－ＳｑｕＩＰ、Ｉ－Ｓｓｐ６８０３１、Ｉ－ＳｔｈＰｈｉＪＰ、Ｉ－ＳｔｈＰｈｉＳＴ３Ｐ、Ｉ－ＳｔｈＰｈｉＳＴｅ３ｂＰ、Ｉ－ＴｄｅＩＰ、Ｉ－ＴｅｖＩ、Ｉ－ＴｅｖＩＩ、Ｉ－ＴｅｖＩＩＩ、Ｉ－ＵａｒＡＰ、Ｉ－ＵａｒＨＧＰＡＩＰ、Ｉ－ＵａｒＨＧＰＡ１３Ｐ、Ｉ－ＶｉｎＩＰ、Ｉ－ＺｂｉＩＰ、ＰＩ－Ｍｔｕｌ、ＰＩ－ＭｔｕＨＩＰ ＰＩ－ＭｔｕＨＩＩＰ、ＰＩ－ＰｆｕＩ、ＰＩ－ＰｆｕＩＩ、ＰＩ－ＰｋｏＩ、ＰＩ－ＰｋｏＩＩ、ＰＩ－Ｒｍａ４３８１２ＩＰ、ＰＩ－ＳｐＢｅｔａＩＰ、ＰＩ－ＳｃｅＩ、ＰＩ－ＴｆｕＩ、ＰＩ－ＴｆｕＩＩ、ＰＩ－ＴｈｙＩ、ＰＩ－ＴｌｉＩ、およびＰＩ－ＴｌｉＩＩ、並びにこれらの機能的な誘導体制限酵素からなる群から選択されるメガヌクレアーゼおよびその切断部位（または認識部位）、好ましくは、１８塩基以上の配列特異性を有する制限酵素であるメガヌクレアーゼおよびその切断部位（または認識部位）、特に細胞のゲノムを１箇所または複数箇所以上切断しないメガヌクレアーゼおよびその切断部位、例えば、Ｉ－ＳｃｅＩおよびその切断部位（または認識部位）を用いることができる。レポーター系は、細胞のゲノムに外来的に挿入されていてもよい。レポーター系は、細胞のゲノム外に存在していてもよい。

【0024】

ある態様では、介在する配列は、制御配列に作動可能に連結された薬剤選択マーカーをコードする遺伝子を有していてもよい。

【0025】

制限酵素によってＤＮＡの二本鎖切断（切断部は、ブラントエンドでもコヒーシブエンドでもよい）を生じさせると、細胞内では亢進したＳＳＡによるＤＮＡ修復が生じる。当該ＤＮＡ修復では、損傷した部位を除去するようにＤＮＡ修復が生じ得る。ＤＮＡ修復では、例えば、第一の部分と第二の部分の間に介在するＤＮＡ配列の全部または一部をレポーター系から消失させ得る。この消失によって、第一の部分と第二の部分とに分けられたマーカー遺伝子が、インフレームで連結されると、少なくともマーカー遺伝子の第二の部分が転写および翻訳される。インフレームで連結されるかどうかは確率現象であると考えられるが、しかし一定の割合で連結されると想定でき、少なくともマーカー遺伝子の第二の部分が翻訳されたことを検出することによって、第一の部分と第二の部分とを含むマーカー遺伝子を検出することができ、これにより、ＳＳＡによるＤＮＡ修復の活性を推定することができる。少なくともマーカー遺伝子の第二の部分が翻訳されたことを検出することによって、ＳＳＡによるＤＮＡ修復の活性を推定するため、レポーター系は、切断前およびＤＮＡ修復前には、マーカー遺伝子の少なくとも第二の部分を転写または翻訳しない。

【0026】

マーカー遺伝子としては、膜貫通タンパク質、薬剤選択マーカーおよび蛍光タンパク質からなる群から選択されるタンパク質をコードする遺伝子を用いることができる。薬剤選択マーカーとしては、細胞の薬剤選択に用いることができる薬剤選択マーカーが挙げられ、例えば、ピューロマイシン、ジェネティシン（Ｇ４１８）、ハイグロマイシン、およびブラストシジンから選択される抗生物質に対する薬剤選択マーカーを用いることができる。蛍光タンパク質としては、検出に適するものであれば特に限定されないが、可視光域に蛍光波長を有する蛍光タンパク質を用いることができる。可視光域に蛍光波長を有する蛍光タンパク質は、数多くの蛍光タンパク質が開発されており、当業者であれば、適宜選択して用いることができる。可視光域に蛍光波長を有する蛍光タンパク質としては、特に限定されないが、例えば、ｓｕｐｅｒｆｏｌｄｅｒ ＧＦＰ （ｓｆＧＦＰ）、ＥＧＦＰ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ｍＶｅｎｕｓ、ＹＦＰ、ｍＡｐｐｌｅ、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ＢＦＰ、ＴａｇＢＦＰ、ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ、およびＣｅｒｕｌｅａｎ、ｍＨｏｎｅｙｄｅｗ、ｍＢａｎａｎａ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ｍＰｌｕｍ、ｍＳｃａｒｌｅｔ、ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ、ｍＮｅｐｔｕｎｅおよびＮｉｒＦＰなどのＧＦＰ様蛍光タンパク質、並びにこれらの改変体蛍光タンパク質の円順列変異体が挙げられる。

【0027】

本発明のある態様では、レポーター系としては、ＳＳＡにより修復されると、ＧＦＰ陽性細胞を生み出すレポーター系（例えば、ＳＡ－ＧＦＰの系）を用いることができる。ＳＡ－ＧＦＰの系としては、ｈｐｒｔＳＡＧＦＰベクター（Ａｄｄｇｅｎｅ＿４１５９４， Ａｄｄｇｅｎｅ）を用いることができる。

【0028】

細胞に対して制限酵素を導入することは、例えば、制御配列に作動可能に連結された制限酵素をコードする核酸を発現可能に含む遺伝子発現ベクターを細胞に導入することによってなされ得る。制御配列に作動可能に連結された制限酵素をコードする核酸は、細胞のゲノムに組込まれていてもよいし、細胞のゲノム外に存在してもよい。

【0029】

マーカー遺伝子および制限酵素を発現させるための制御配列としては、導入する細胞で恒常的にまたは一過性に遺伝子を発現させるプロモーターおよび誘導性プロモーターが挙げられ、いずれも本発明で用いることができる。制御配列に作動可能に連結された制限酵素をコードする核酸が細胞のゲノムに組込まれている場合には、制限酵素を駆動する制御配列は、誘導性プロモーターとすることができる。そして、制限酵素によるレポーター系の切断を誘発させる場合に、当該誘導性プロモーターに対して誘導因子を作用させて制限酵素を発現させることができる。

【0030】

本発明では、恒常的に発現を促進するプロモーターとしては、本発明のレポーター系の効果を著しく低減しない限り、様々なプロモーターを用いることができるが、例えば、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）、ＲＳＶ（ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ）、ＳＶ４０（ｓｉｍｉａｎ ｖｉｒｕｓ ４０）等のウイルス由来プロモーター、アクチンプロモーター、ＥＦ（伸長因子）１αプロモーター、ＣＡＧプロモーター（ＣＭＶ初期エンハンサ、チキンβ－アクチン遺伝子の第一エキソンおよびイントロンのプロモーター、およびウサギβ－グロビン遺伝子のスプライスアクセプターを含む）等が挙げられる。

【0031】

誘導性プロモーターとしては、テトラサイクリン応答因子（例えば、ＴＲＥ３Ｇプロモーター）、Ｃｕｍａｔｅオペレーター配列、λオペレーター配列（例えば、１２×λＯｐ）、ヒートショックプロモーター等が挙げられる。

【0032】

本発明ではまた、マーカー遺伝子および制限酵素を発現させるための制御配列としては、誘導性プロモーターが挙げられ、本発明で用いることができる。テトラサイクリン応答因子は、誘導因子であるテトラサイクリン又はその誘導体（例えば、ドキシサイクリン等）及びリバーステトラサイクリン制御性トランス活性化因子（ｒｔＴＡ）の存在下において、該因子に作動可能に連結された遺伝子の発現を誘導する。Ｃｕｍａｔｅオペレーター配列は、ＣｙｍＲリプレッサー存在下において不活性であるが、誘導因子であるＣｕｍａｔｅの存在下において、ＣｙｍＲリプレッサーと解離して、該プロモーターに作動可能に連結された遺伝子の発現を誘導する。λオペレーター配列は、二量体化により転写活性化能を有するアクチベーター（λＲｅｐ－ＧｙｒＢ－ＡＤ）を二量体化する誘導因子（例えば、クメルマイシン）の存在下において、該プロモーターに作動可能に連結された遺伝子の発現を誘導する。ヒートショックプロモーターは、誘導因子である熱ショックの存在下において、該プロモーターに作動可能に連結された遺伝子の発現を誘導する。

【0033】

第一の部分と第二の部分の間に介在するＤＮＡ配列がマーカー遺伝子を有する場合には、このマーカー遺伝子と、第一の部分と第二の部分の由来するマーカー遺伝子とは異なるマーカー遺伝子とすることができる。

【0034】

マーカー遺伝子の発現量の測定は、マーカー遺伝子が薬剤選択マーカーをコードする遺伝子である場合には、対応する選択用抗生物質中で細胞を培養して、生存する細胞の数や割合に基づいて行うことができる。この細胞数や割合は、ＳＳＡによるＤＮＡ修復の活性と正または負に相関する。

【0035】

マーカー遺伝子の発現量の測定は、マーカー遺伝子が膜貫通タンパク質である場合には、細胞膜表面の当該膜貫通タンパク質をフローサイトメトリーで検出することによって行うことができる。当業者であれば、膜貫通タンパク質を検出するフローサイトメトリーの系を選択することができ、本発明に用いることができる。この蛍光強度は、ＳＳＡによるＤＮＡ修復の活性と正に相関する。

【0036】

マーカー遺伝子の発現量の測定は、マーカー遺伝子が蛍光タンパク質である場合には、細胞に対して励起光を照射したときの蛍光の強度に基づいて行うことができる。蛍光の強度は、様々な当業者に周知の方法で測定することができる。例えば、当業者であれば、フローサイトメトリーを用いて蛍光強度を測定することができ、または、一定以上の蛍光強度を有する細胞の数を測定することができる。これらの蛍光強度および細胞数は、ＳＳＡによるＤＮＡ修復の活性と正に相関する。

【0037】

本発明によれば、ＳＳＡによるＤＮＡ修復の前または修復中に細胞と被検化合物とを接触させることができる。当該接触は、培養系において行うことができる。被検化合物が、ＳＳＡによるＤＮＡ修復を阻害する場合には、修復の結果としてのマーカー遺伝子の少なくとも第二の部分の転写および／または翻訳の量が低減し得る。従って、被検化合物がＳＳＡによるＤＮＡ修復を阻害するか否かは、マーカー遺伝子の発現量を測定することによって推定することができる。

【0038】

本発明による被検化合物が一本鎖アニーリング（ＳＳＡ）によるＤＮＡ修復経路を阻害するか否かを試験する方法は、化合物のスクリーニングに用いることができる。従って、本発明によれば、一本鎖アニーリング（ＳＳＡ）によるＤＮＡ修復経路を阻害する化合物のスクリーニング方法であって、
二本鎖切断の修復を評価するレポーター系が導入されたＲＥＣＱＬ４欠損細胞内の当該レポーター系にＤＮＡの二本鎖切断を誘導し、ＳＳＡによるＤＮＡ修復を誘発することと、
ここで、当該レポーター系は、マーカー遺伝子を有し、マーカー遺伝子は、第一の部分と第二の部分とに分断されており、第一の部分は、制御配列に作動可能に連結し、第一の部分と第二の部分の間には、ＤＮＡ配列が介在し、これにより、少なくとも第二の部分は転写または翻訳がなされず、介在するＤＮＡ配列は、制限酵素の切断部位を有し、当該制限酵素による切断により、細胞内でＳＳＡによるＤＮＡ修復を誘発し、当該ＳＳＡによるＤＮＡ修復によって分断された第一の部分と第二の部分とがインフレームで再連結されると、インフレームで連結された第一の部分と第二の部分が発現し、これによって、当該第一の部分と第二の部分とを含むマーカー遺伝子を検出することができる系であり、
ＳＳＡによるＤＮＡ修復の前または修復中に前記細胞と被検化合物とを接触させることと、
マーカー遺伝子の発現量を測定すること
マーカー遺伝子の発現量を減少させる化合物を選択すること
を含む、
方法
が提供される。

【0039】

ある態様では、本発明の試験方法またはスクリーニング方法では、例えば、ピロガロール構造を有する化合物、およびＡＩＣＡＲ誘導体ならびにエピガロカテキンの誘導体からなる群から選択される化合物を被検化合物として試験またはスクリーニングすることができる。ある態様では、本発明の試験方法またはスクリーニング方法では、被検化合物は、ＥＧＣ、ＡＩＣＡＲ、およびＦ７９アプタマー（例えば、Ａｃ－ＶＩＮＬＡＮＥＭＦＧＹＮＧ－ＧＧＧ－ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡ－Ｃ（Ｏ）ＮＨ₂またはＦ７９Ａアプタマー（例えば、Ａｃ－ＶＩＮＬＡＮＥＭＡＧＹＮＧ－ＧＧＧ－ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡ－Ｃ（Ｏ）ＮＨ₂）ではない。

【0040】

（２次アッセイ系）
被検化合物が、一本鎖アニーリング（ＳＳＡ）によるＤＮＡ修復経路を阻害する場合には、２次アッセイ系によって被検化合物がＲＡＤ５２に作用するか否かを試験することができる。

【0041】

具体的には、２次アッセイ系は、被検化合物で処理した細胞においてＲＡＤ５２の活性が抑制されていることをさらに評価することを含む方法であり得る。ＲＡＤ５２の活性の亢進および抑制は、ＲＡＤ５２が核内においてフォーカス形成をしているか否か、または形成されたフォーカスの数を測定することによって評価できる。ＲＡＤ５２は、活性が亢進しているときには、核内においてフォーカスを形成し、およびフォーカスの数は増加する。また、ＲＡＤ５２の活性の抑制は、形成されるフォーカスの数の減少により評価することができる。

【0042】

ＲＡＤ５２が核内においてフォーカスを形成するか否か、およびそのフォーカスの数は、当業者に周知の方法によって決定することができる。当業者に周知の方法としては、例えば、ＲＡＤ５２に対する細胞免疫化学染色が挙げられる。具体的には、細胞を固定し、細胞膜と核膜を破壊し、その後、ＲＡＤ５２に結合する抗体（１次抗体）と細胞とを接触させ、当該抗体を認識する２次抗体（通常は標識されている）と１次抗体を反応させ、標識を検出することによってなされ得る。細胞免疫化学染色でも値いられる標識は、当業者に周知である。標識としては、例えば、蛍光色素（特に限定されないが、例えば、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８）やアルカリフォスファターゼを用いることができる。標識の検出も、当業者であれば適宜行うことができる。

【0043】

本発明のある態様では、被検化合物で処理した細胞においてＲＡＤ５２の活性が、当該被検化合物で非処理の細胞と比較して抑制されていることをさらに評価することができる。抑制されている場合には、当該被検化合物は、ＲＡＤ５２の活性を抑制していることが示唆される。また、ＲＡＤ５２の核内でのフォーカス形成を指標とすることによって、被検化合物が、ＲＡＤ５２に対して作用しているのかを決定することができる。フォーカス数が減少している場合には、当該被検化合物は、ＲＡＤ５２の活性を抑制していることが示唆される。

【0044】

（得られた化合物）
被検化合物のうち、一本鎖アニーリング（ＳＳＡ）によるＤＮＡ修復経路を阻害する化合物は、電離放射線照射や白金製剤処置（例えば、シスプラチン処置）などのＤＮＡ損傷を与える処置後の腫瘍細胞に対して抗腫瘍活性を奏し得る。従って、当該化合物は、電離放射線照射や白金製剤処置（例えば、シスプラチン処置）などのＤＮＡ損傷を与える処置（すなわち、ＤＮＡに損傷を与えるがん療法）後の腫瘍を有する対象に対して投与され得る。対象は、ＲＡＤ５２を高発現した対象であり得る。対象は、ＲＡＤ５２の高い活性を有する対象であり得る。

【0045】

従って、上記アッセイ系は、電離放射線照射や白金製剤処置（例えば、シスプラチン処置）などのＤＮＡ損傷を与える処置後の腫瘍細胞に対して抗腫瘍活性を奏するか否かを試験する方法であり得、または、電離放射線照射や白金製剤処置（例えば、シスプラチン処置）などのＤＮＡ損傷を与える処置後のＲＡＤ５２を高発現した腫瘍細胞または高活性のＲＡＤ５２を有する腫瘍細胞に対して抗腫瘍活性を奏するか否かを試験する方法であり得る。また、上記アッセイ系は、ＲＡＤ５２を高発現する腫瘍または高活性のＲＡＤ５２を有する腫瘍を処置する化合物をスクリーニングする方法であり得る。

【0046】

腫瘍は、例えば、悪性腫瘍であり得る。腫瘍は、ＲＡＤ５２を発現し、ＳＳＡ活性が亢進した腫瘍であり得る。ある態様では、悪性腫瘍は、ブルーム症候群、ワーナー症候群、およびロスムンド・トムソン症候群（ＲＴＳ）における悪性腫瘍であり得る。ある態様では、悪性腫瘍は、ＢＲＣＡ１欠損および／またはＢＲＣＡ２欠損による乳がんや子宮がんであり得る（Ｌｏｋ ａｎｄ Ｐｏｗｅｌｌ， Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ， １８， ６４００－６， ２０１２）。悪性腫瘍はまた、例えば、ＡＴＭ欠損による白血病やリンパ腫（Ｔｒｅｕｎｅｒ ｅｔ ａｌ， Ｏｎｃｏｇｅｎｅ， ２３， ４６５５－６１， ２００４）、およびＡＰＣ^min欠損による家族性大腸腺腫症（Ｓｏｔｉｒｉｏｕ ｅｔ ａｌ， Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ， ６４， １１２７－１１３４， ２０１６）からなる群から選択される腫瘍であり得る。

【実施例】

【0047】

実施例１：一本鎖アニーリングによるＤＮＡ修復経路を標的とする化合物のアッセイ系の構築
これまでに、Ｋｏｈｚａｋｉ Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ， ＤＯＩ： １０．１００２／ｉｊｃ．３２６７０で示されたように、ヒトＲＥＣＱＬ４欠損（例えば、ＲＥＣＱＬ４ΔＣのヒト大腸がん細胞株ＨＣＴ１１６、ヒト肺がん細胞株Ａ５４９、およびヒト乳がん細胞株ＭＣＦ７）細胞は、電離放射線照射や白金製剤処置（例えば、シスプラチン処置）などのＤＮＡ損傷の誘発処置の後に働く一本鎖アニーリング（ＳＳＡ）によるＤＮＡ修復経路を活性化することが見出されている。ヒトＲＥＣＱＬ４を欠損した大腸がん細胞株ＨＣＴ１１６細胞が、ＳＳＡ経路を活性化させる一方で代替非相同末端結合（Ａｌｔ－ＥＪ）の活性化は抑制された。すなわち、ヒトＲＥＣＱＬ４欠損は、ＨＣＴ１１６細胞において、修復機構の中でＳＳＡ経路を選択的に活性化させると考えられる。

【0048】

本実施例では、ヒトＲＥＣＱＬ４欠損を有するＨＣＴ１１６細胞（図８に示されるように、内在性ＲＥＣＱＬ４のアミノ酸番号４９０、すなわちヘリカーゼドメインの開始部位付近にストップコドンおよびブラスチシジンＳ耐性遺伝子を導入し、薬剤選択により遺伝子改変がなされた細胞を選択することにより、樹立したヘリカーゼドメイン以降のＲＥＣＱＬ４のＣ末端側の領域を欠失させた細胞株である）を用いて、ＳＳＡ経路を抑制することができる化合物を試験するアッセイ系を構築した。

【0049】

１次アッセイ系
ステップ１：ＲＥＣＱＬ４欠損大腸がんＨＣＴ１１６細胞に、ｈｐｒｔＳＡＧＦＰベクター（Ａｄｄｇｅｎｅ＿４１５９４， Ａｄｄｇｅｎｅ）をトランスフェクションして、ピューロマイシン（２～４μｇ／ｍｌ）で選択し、ベクターを安定的に組み込んだ細胞を樹立した。ＲＥＣＱＬ４欠損細胞では、ＲＡＤ５２が発現向上している。図１に示されるように、ｈｐｒｔＳＡＧＦＰベクターは、ＳＳＡの基質として用いられ、ベクター中では、緑色蛍光タンパク質ＧＦＰが、薬剤選択マーカーにより２つに分断されている。上記分断されたＧＦＰをコードする遺伝子には、制限酵素Ｉ－ＳｃｅＩの切断部位が導入されており、Ｉ－ＳｃｅＩをＨＣＴ１１６細胞に強制発現させることで分断されたＧＦＰをコードする遺伝子に二本鎖切断が加わる。そうすると、細胞のＳＳＡ修復経路によって、分断されたＧＦＰ遺伝子が再連結し、ＧＦＰの発現によって、ＳＳＡ経路の活性強度を測定することができる。当該ベクターでは、ＧＦＰ遺伝子は、ＣＡＧプロモーターによって駆動される。

【0050】

ステップ２：２×１０⁵個の上記細胞を、３００μｌ培地を含む２４穴プレートに播種した。

【0051】

ステップ３：翌日、制限酵素Ｉ－ＳｃｅＩの発現ベクターであるｐＣＢＡＳｃｅＩベクター（Ａｄｄｇｅｎｅ＿２６４７７，Ａｄｄｇｅｎｅ）、もしくは空のコントロールベクターｐＣＡＧＧＳそれぞれ０．４μｇを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＬＴＸ Ｒｅａｇｅｎｔ ｗｉｔｈ ＰＬＵＳ Ｒｅａｇｅｎｔ（１５３３８１００， ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、またはＡｍａｘａ ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ （ｐｒｏｇｒａｍ Ｄ－０３２） ｗｉｔｈ Ｋｉｔ Ｖ （ＶＣＡ－１００３， Ｌｏｎｚａ， Ｂａｓｅｌ， Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使って播種した細胞にトランスフェクションした。
図２に示されるように、この処理により、ＲＥＣＱＬ４欠損細胞では、野生型と比較して、ＤＮＡ切断後のＧＦＰ陽性細胞数が２～３倍向上した。そのため、本アッセイ系は、ＳＳＡ阻害活性を検査するには適していると考えられた。したがって、ステップ３として、前記トランスフェクションの数時間前または直後に、１０μＭの被検化合物で細胞を処理した。

【0052】

ステップ４：３６～４８時間後に、フローサイトメトリーによってＧＦＰ陽性細胞の割合からＳＳＡ活性を定量化し、被検化合物がＤＮＡ二本鎖切断後に活性化するＳＳＡに対する阻害効果を有するか否かを調べた。スクリーニングは独立して２回行い、ＳＳＡ活性の平均値と標準偏差を得た。実際に３３種類の被検化合物を本アッセイ系を用いて試験した結果は図３に示される通りであった。図３に示されるように、化合物７～９は、ＧＦＰ陽性細胞数を減少させたことから、ＳＳＡ阻害活性を有する可能性が示唆された。このようにして、本アッセイ系では、被検化合物がＳＳＡ阻害活性を有するか否かを試験することができた。

【0053】

ステップ５：阻害剤候補が得られた際は、上記ステップ３でｐｍａｘＧＦＰ（ＶＤＣ－１０４０，Ｌｏｎｚａ）ベクターをトランスフェクションし、被検化合物を１０μＭで処理して３６～４８時間後にフローサイトメトリーにより解析し、トランスフェクション自体を阻害しないことを確認した。

【0054】

ステップ６：さらに、被検化合物による濃度依存的な阻害効果を確認するために、１０、５、２．５μＭと濃度を変えて、２回以上独立して解析することで、濃度依存的な阻害効果と再現性を確認した。

【0055】

２次アッセイ系
上記アッセイ系でＳＳＡ阻害活性を有すると評価された被検化合物については、当該被検化合物で処理した細胞内におけるＲＡＤ５２の細胞内局在を確認することで、ＳＳＡ経路の抑制がＲＡＤ５２を介することの分子的証拠を得てもよい。具体的な方法は以下の通りである。ＲＡＤ５２の誘導能についての情報を得たい場合は、１次アッセイ系に加えて、２次アッセイ系による評価を行うことができる。

【0056】

ステップ１：ＲＥＣＱＬ４欠損大腸がんＨＣＴ１１６細胞２×１０⁵個を、１ｍｌ培地を含む１２穴プレートに播種した。あらかじめ１２穴にはカバーガラスを入れ、これに細胞を接着させる。

【0057】

ステップ２：２～３日後に、シスプラチンを処理する６時間前から被検化合物を１０μＭの濃度で添加する。その後、３μｇ／ｍｌシスプラチンで上記ＨＣＴ１１６細胞を１６時間処理して、その後、処理細胞を２％スクロースと３％パラホルムアルデヒドを含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で室温で１５分間処理して固定した。

【0058】

ステップ３：０．２％ Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ含有ＰＢＳを２分間処理後、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで室温１５分間処理してブロッキングした。

【0059】

ステップ４：１次抗体として、マウスＲＡＤ５２抗体（１：２００希釈；ｓｃ－３６５３４１）、またはラビットＲＡＤ５２抗体（１：５００希釈；ｓｃ－８３５０）を室温１時間処理した。

【0060】

ステップ５：ＰＢＳＴ（ＰＢＳと０．０５％ Ｔｗｅｅｎ－２０）で３回洗浄後、２次抗体として、ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体であるｇｏａｔ ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ （１：２，０００； Ａ－１１００１）、またはヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体であるｇｏａｔ ａｎｔｉ－ｒａｂｂｉｔＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ （１：２，０００； Ａ－１１００８）で細胞を室温で４５分間処理した。

【0061】

ステップ６：ＰＢＳＴで洗浄し、１μｇ／ｍｌのＤＡＰＩを１分間処理後にもう一度ＰＢＳＴで洗浄し、最後にＦｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ－Ｇ（０１００－２０，ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ）で細胞を封入した。

【0062】

ステップ７：Ａｘｉｏ Ｏｂｓｅｒｖｅｒ （Ｚｅｉｓｓ， Ｏｂｅｒｋｏｃｈｅｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ）または、ＢＺ－Ｘ７００（Ｋｅｙｅｎｃｅ， Ｏｓａｋａ， Ｊａｐａｎ）顕微鏡で、細胞内で蛍光を発する輝点を定量・定性解析した。当該輝点は、ＲＡＤ５２が修復に関与している際に生じるフォーカス像と考えられる。

【0063】

図４にはＲＡＤ５２を介するＳＳＡ阻害活性が発現した蛍光顕微鏡像が示される。シスプラチン処理をしてＳＳＡを活性化させた場合には、ＲＡＤ５２は、核内（ＤＡＰＩで染色）においてスポットを多数形成している。細胞数あたりのこのスポット数を計数することによって、ＲＡＤ５２の誘導の度合いを評価することができる。

【0064】

実際の被検化合物を用いたデータは図５に示される通りであった。図５に示されるように、陽性対照（ポジコン）としてエピガロカテキン（ＥＧＣ）とアカデシン（ＡＩＣＡＲ）を用いた場合、ＲＡＤ５２の細胞あたりの輝点数は、被検化合物を含まないシスプラチン処理群における輝点数よりも減少した。このことからＥＧＣおよびＡＩＣＡＲは、ＤＮＡ損傷に対するＲＡＤ５２機能の阻害効果を示したことが分かる。また、ピロガロールおよび１つの被検化合物は、ＲＡＤ５２の輝点数を減少させた。このことからピロガロールおよび当該１つの被検化合物もＤＮＡ損傷に対するＲＡＤ５２機能の阻害効果を示したことが分かる。ピロガロールおよび当該１つの被検化合物は、１次アッセイ系においてＩ－ＳｃｅＩ誘発ＳＳＡを阻害した化合物であった。このことからこれらの化合物は、ＲＡＤ５２機能を阻害することによるＳＳＡ阻害活性を有する化合物であると考えられる。

【0065】

ところで、図５では、１次アッセイ系において陽性であったテアフラビンに関して、シスプラチン処置により誘発されるＲＡＤ５２による輝点形成の阻害の活性が弱いことが示されている。鋭意確認したところ、図６に示されるようにテアフラビンは、ＧＦＰレポーターの発現そのものを停止させるアーティファクトを生じていた。

【0066】

このようにして、１次アッセイ系では、被検化合物はＳＳＡ阻害活性を有するか否かの観点で試験されるが、２次アッセイ系では、ＳＳＡの修復系を阻害する化合物が、ＲＡＤ５２のフォーカス形成を抑制するか否かの観点で試験された。

【0067】

このようにして、本願発明では、被検化合物がＳＳＡ阻害活性を有するか否かの測定系を構築することができた。また、本願発明では、被検化合物が、ＲＡＤ５２の阻害活性を有するか否かを決定できる測定系も構築することができた。なお、図７に示されるように、通常の細胞ではＲＡＤ５２をｓｉＲＮＡによりノックダウンすると、ＳＳＡが阻害される一方でＡｌｔ－ＥＪおよびＨＲの活性が向上して、ＳＳＡ阻害が補完されるのに対して、ＲＥＣＱＬ４ΔＣ細胞においては、ＲＡＤ５２のｓｉＲＮＡによる阻害効果は、Ａｌｔ－ＥＪおよびＨＲによる補完が生じない。このことから、ＲＥＣＱＬ４欠損のがんにおいて、ＲＡＤ５２によるＳＳＡを阻害する化合物は、有望な抗がん剤候補となり得る。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】