特許 7475828 鼻腔にウイルス特異的抗体を誘導可能な季節性インフルエンザワクチン

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-04-19

(45)【発行日】2024-04-30

(54)【発明の名称】鼻腔にウイルス特異的抗体を誘導可能な季節性インフルエンザワクチン

(51)【国際特許分類】

   A61K 39/145 20060101AFI20240422BHJP

   A61P 31/16 20060101ALI20240422BHJP

【ＦＩ】

A61K39/145

A61P31/16

【請求項の数】 4

(21)【出願番号】P 2019160280

(22)【出願日】2019-09-03

(65)【公開番号】P2021038167

(43)【公開日】2021-03-11

【審査請求日】2022-07-21

(73)【特許権者】

【識別番号】000003296

【氏名又は名称】デンカ株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】110000084

【氏名又は名称】弁理士法人アルガ特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】三股 亮大郎

(72)【発明者】

【氏名】神田 明日美

(72)【発明者】

【氏名】中田 渚

(72)【発明者】

【氏名】三森 重孝

【審査官】春田 由香

(56)【参考文献】

【文献】特表２００３－５２８８１８（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２０１５／１５２３６０（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１０／００１６７１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】CHEN, D. et al.，Serum and mucosal immune responses to an inactivated influenza virus vaccine induced by epidermal powder immunization，Journal of Virology，2001年，Vol.75, No.17，p.7956-7965，doi: 10.1128/jvi.75.17.7956-7965.2001，ISSN 0022-538X

【文献】NAKATSUKASA, A. et al.，Potency of whole virus particle and split virion vaccines using dissolving microneedle against challenges of H1N1 and H5N1 influenza viruses in mice，Vaccine，2017年，Vol.35, No.21，p.2855-2861，doi: 10.1016/j.vaccine.2017.04.009，ISSN 0264-410X

【文献】酒井 伸夫，インフルエンザワクチンの歴史と展望，医学のあゆみ，2012年，第241巻, 第1号，p.55-63，ISSN 0039-2359

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ａ６１Ｋ ３９／００－３９／４４

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＰｕｂＭｅｄ

医中誌ＷＥＢ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

鼻腔粘膜においてウイルス特異的ＩｇＧを誘導するためのインフルエンザワクチンであって、インフルエンザウイルス不活化全粒子を有効成分とし、１回当たり抗原量として１５μｇＨＡ／株以上が、皮内針又はマイクロニードルによって０．１～０．３ｍＬ用量で皮内投与される季節性インフルエンザワクチン。

【請求項2】

インフルエンザウイルスの不活化全粒子が、季節性のＡ型インフルエンザウイルス株又はＢ型インフルエンザウイルス株のいずれか又は両方を含有する、請求項１に記載のワクチン。

【請求項3】

インフルエンザウイルスの不活化全粒子を含有し、１回当たり抗原量として１５μｇＨＡ／株以上が、皮内針又はマイクロニードルによって０．１～０．３ｍＬ用量で皮内投与される、鼻腔粘膜においてウイルス特異的ＩｇＧを誘導するための季節性インフルエンザワクチン投与液。

【請求項4】

アジュバントを含有しない、請求項３に記載のワクチン投与液。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、鼻腔にウイルス特異的な抗体応答を誘導可能な、有効性の高いインフルエンザワクチンに関する。

【背景技術】

【0002】

冬季に流行するインフルエンザは、インフルエンザウイルスを病原体とする急性の呼吸器感染症であり、くしゃみ等の飛沫や飛沫が付着した物への接触を介して伝播する。このインフルエンザの流行が大きいシーズンでは、インフルエンザ及びその関連疾患による死亡数が増加し、これは特に高齢者において顕著となる。この現象は、先進国で共通の現象であり、高齢者の割合が急増している我が国においても深刻な社会的問題である。

【0003】

この季節性インフルエンザの予防に最も効果的な方法の１つとしてワクチンが挙げられる。現在、日本国において用いられているインフルエンザワクチンは、ウイルス粒子を界面活性剤やエーテルで解裂したスプリット抗原を用いたワクチンである。具体的にはＡ／Ｈ１Ｎ１亜型、Ａ／Ｈ３Ｎ２亜型、Ｂ／Ｙａｍａｇａｔａ系統及びＢ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ系統のそれぞれの抗原を混合した多価のスプリットワクチンが、皮下投与にて接種されている。このスプリットワクチンは、ワクチン株と流行株の抗原性が一致する場合、４０～６０％程度の有効性を示すことが知られている。このスプリットワクチンの有効性は４０％と低いようにもみえるが、国民の４０％が接種することで、インフルエンザ感染者は２１００万人、インフルエンザによる入院者が１３万人、死亡者が６万人、それぞれ減少するという米国の研究報告がある（非特許文献１）。

【0004】

一方、臨床の現場では、より有効性の高いインフルエンザワクチンが望まれており、そのため２０１３年の厚生科学審議会予防接種・ワクチン分科会研究開発及び生産流通部会においても開発優先度の高いワクチンとして、有効性の高いインフルエンザワクチンが挙げられている。既に欧米では弱毒生経鼻ワクチン、アジュバント製剤及び高力価ワクチンといった有効性の高いインフルエンザワクチンが承認されているが、これらは免疫応答の弱い高齢者や小児を対象としたワクチンであり、全年齢層を対象とするものではない。また、近年では弱毒生経鼻ワクチンの有効性がスプリットワクチンの有効性に劣るという研究報告もあり（非特許文献２）、高い有効性が期待されたインフルエンザワクチンにおいても、その効力は未だ確立したものではない。
そのため、有効性の高いインフルエンザワクチンの開発は未だ望まれているのが現状である。

【0005】

現在の季節性インフルエンザワクチンの有効性の基準は、欧州医薬品庁（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ Ａｇｅｎｃｙ：ＥＭＡ）のガイドラインで規定されており（非特許文献３）、血清のＨＩ抗体価若しくはＳＲＨ抗体価を指標としている。しかし、インフルエンザウイルスは気道局所において増殖して病原性を発揮するウイルスであり、この気道局所の感染症に対して血中の抗体が効力を示す機序は明確ではない。
したがって、インフルエンザウイルスの感染防御若しくは発症阻止に直接的に関連する免疫学的指標を明らかにし、その免疫学的指標を基に有効性の高いワクチンを創出しなければならない。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0006】

【文献】Sah P, Medlock J, Fitzpatrick MC, Singer BH, Galvani AP. Optimizing the impact of low-efficacy influenza vaccines. Proc Natl Acad Sci U S A. 2018 May 15;115(20):5151-5156.

【文献】Jackson ML, Chung JR, Jackson LA, Phillips CH, Benoit J, Monto AS, Martin ET, Belongia EA, McLean HQ, Gaglani M, Murthy K, Zimmerman R, Nowalk MP, Fry AM, Flannery B. Influenza Vaccine Effectiveness in the United States during the 2015-2016 Season. N Engl J Med. 2017 Aug 10;377(6):534-543.

【文献】Note for guidance on harmonisation of requirements for influenza vaccines.（CPMP/BWP/214/96）

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

本発明は、スプリットワクチンに比べて有効性の高い季節性インフルエンザワクチンを提供することに関する。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本願発明者らは、鋭意研究の結果、季節性インフルエンザウイルスに対する不活化全粒子ワクチンが、鼻腔粘膜におけるウイルス特異的な抗体（ＩｇＧ）誘導能が高く、この粘膜のＩｇＧが上気道におけるウイルス排除に効果的に作用することを発見した。そして、更に検討した結果、当該不活化全粒子ワクチンを高用量で皮内投与することによって、従来のスプリットワクチンの投与と比べて鼻腔粘膜のウイルス特異的抗体誘導が有意に高まることを見出した。

【0009】

すなわち、本発明は以下の１）～５）に係るものである。
１）鼻腔粘膜においてウイルス特異的抗体を誘導するインフルエンザワクチンであってインフルエンザウイルス不活化全粒子を有効成分とし、１回当たり抗原量として１５μｇＨＡ／株以上が皮内投与される季節性インフルエンザワクチン。
２）インフルエンザウイルスの不活化全粒子が、季節性のＡ型インフルエンザウイルス株又はＢ型インフルエンザウイルス株のいずれか又は両方を含有する、１）に記載のワクチン。
３）インフルエンザウイルスの不活化全粒子を、ヘムアグルチニン量として１株当たり１５μｇ以上含有する、皮内投与のための季節性インフルエンザワクチン組成物。
４）アジュバントを含有しない、３）に記載のワクチン組成物。
５）皮内針又はマイクロニードルによって投与される、１）若しくは２）に記載のワクチン、又は３）若しくは４）に記載のワクチン組成物。

【発明の効果】

【0010】

本発明によれば、鼻腔粘膜におけるウイルス特異的な抗体誘導能が高く、上気道におけるウイルス排除効果に優れた季節性インフルエンザワクチンを提供することが可能となり、付加価値の高い予防薬の創製として医薬品産業に大きく貢献できる。

【図面の簡単な説明】

【0011】

【図1】ワクチンの皮下投与における血清のＢ／Ｐｈｕｋｅｔ／３０７３／２０１３株に対するＨＩ抗体価。

【図2】ワクチンの皮下投与における鼻腔洗浄液のＢ／Ｐｈｕｋｅｔ／３０７３／２０１３株に対するＩｇＧ力価。

【図3】ウイルス接種３日後における鼻腔洗浄液のウイルス含量。

【図4A】Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／ＧＰ１９０８／２０１５株に対する鼻腔洗浄液のＩｇＧ力価。

【図4B】Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／ＩＮＦＩＭＨ－１６－００１９／２０１６株に対する鼻腔洗浄液のＩｇＧ力価。

【図4C】Ｂ／Ｐｈｕｋｅｔ／３０７３／２０１３株に対する鼻腔洗浄液のＩｇＧ力価。

【図4D】Ｂ／Ｍａｒｙｌａｎｄ／１５／２０１６株に対する鼻腔洗浄液のＩｇＧ力価。

【図5】Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／ＧＰ１９０８／２０１５株に対する鼻腔洗浄液の中和抗体価。

【発明を実施するための形態】

【0012】

以下に本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。

【0013】

本発明において、「季節性インフルエンザワクチン」とは、季節性インフルエンザのワクチンであり、少なくとも季節性のＡ型インフルエンザウイルス又はＢ型インフルエンザウイルスのいずれかの抗原を含んでいるワクチンを意味する。すなわち、本発明の季節性インフルエンザワクチンは、季節性のＡ型インフルエンザウイルス又はＢ型インフルエンザウイルスの一方のみを含む単価ワクチンでもよく、それらを両方含んでいる多価ワクチンでもよいが、好ましくは少なくとも３種類以上のインフルエンザウイルス株、例えば２種類のＡ型インフルエンザウイルス株及び１若しくは２種類のＢ型インフルエンザウイルス株を含有する３価以上のワクチンであり、好ましくは４価ワクチンが挙げられる。より好ましくは、２種のＡ型株（Ａ／Ｈ１Ｎ1亜型株及びＡ／Ｈ３Ｎ２亜型株）、２種のＢ型株（Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ系統株及びＢ／Ｙａｍａｇａｔａ系統株）を含む４価ワクチンが挙げられる。

【0014】

本発明において、「インフルエンザウイルス」と言った場合、季節性のＡ型インフルエンザウイルス若しくはＢ型インフルエンザウイルス、又はその両者を示す。また、インフルエンザウイルスは、現在知られているすべての亜型、及び将来単離、同定される亜型をも含む。
本発明のワクチン調製に用いるインフルエンザウイルス株は、感染動物または患者から単離された株であっても、遺伝子工学的に培養細胞で樹立された組換えウイルスであってもよい。

【0015】

本発明の季節性インフルエンザワクチンの抗原である、「インフルエンザウイルス不活化全粒子」とは、季節性のインフルエンザウイルスを培養して得られるウイルスの形態を保持したままのウイルス粒子であって、不活化処理がなされたものを指す。

【0016】

本発明のインフルエンザウイルス不活化全粒子は、発育鶏卵法若しくは細胞培養法を用いて調製することができる。
「発育鶏卵法」とは、ウイルス株を孵化鶏卵に接種して培養した後、ウイルス浮遊液を清澄化、濃縮、精製及び不活化して、ウイルス粒子を含むウイルス液を得る方法である。また、「細胞培養法」とは、ウイルス株を培養細胞に接種して培養した後、上記の発育鶏卵法と同様に培養上清よりウイルス粒子を含むウイルス液を得る方法である。
ここで、培養は、インフルエンザウイルス株を接種して、３０～３７℃で１～７日程度、好ましくは３３～３５℃で２日間程度行われる。培養終了後、ウイルス浮遊液（感染尿膜腔液若しくは感染細胞培養上清）が回収され、清澄化のため、遠心分離または濾過が行われる。次いで、濃縮のために、バリウム塩吸着溶出反応や限外濾過が行われる。ウイルス精製は、ショ糖密度勾配遠心分離等の超遠心分離や液体クロマトグラフィー等の手段を用いて行うことができる。
精製ウイルス液は不活化処理される。ウイルスの不活化方法は、ホルマリン処理、紫外線照射、ベータプロピオラクトン、バイナリーエチレンイミン等による処理が挙げられる。

【0017】

後述する実施例に示すとおり、４種のインフルエンザウイルス不活化全粒子を１株当たりヘムアグルチニン（ＨＡ）として１５μｇ以上皮内投与した場合に、鼻腔におけるウイルス特異的抗体誘導能が顕著に向上し、スプリットワクチンの皮内及び皮下投与に比べて、早期により高い抗体誘導が達成できる（図４Ａ－４Ｄ）。斯かる鼻腔のウイルス特異的抗体誘導効率の良いワクチンではウイルス中和活性が高く、鼻腔における高いウイルス排除能を有する（図５）。
したがって、インフルエンザウイルス不活化全粒子の１５μｇＨＡ／株以上の皮内投与は、鼻腔粘膜においてウイルス特異的抗体を誘導する季節性インフルエンザのワクチン療法となり得る。換言すると、インフルエンザウイルスの不活化全粒子は、鼻腔粘膜においてウイルス特異的抗体を誘導する季節性インフルエンザワクチンであって、１５μｇＨＡ／株以上を皮内投与されるワクチンとなり得る。
ここで、鼻腔粘膜においてウイルス特異的抗体を誘導するとは、例えば、鼻腔粘膜において、ワクチン接種したインフルエンザウイルス抗原に対して産生される中和抗体価が、８０以上となること、好ましくは１６０以上となることを意味する。ここで、中和抗体価は、ウイルスのＭＤＣＫ細胞に対する細胞傷害の阻止活性を評価することにより測定することができる。

【0018】

本発明の季節性インフルエンザワクチンは、皮内投与のためのワクチン組成物（以下、「本発明のワクチン組成物」と称す）として製剤化され得る。
本発明において皮内投与とは、皮膚の真皮への投与を意味し、投与されたワクチン組成物が真皮だけに局在することを意味するものではない。真皮層の厚さは、個体間及び個体内の部位の違いでも異なるため、皮内投与されたワクチン組成物は皮内のみ若しくは主に皮内に存在するか、又は表皮内に存在する可能性もあり、本発明の皮内投与にはこれらが包含される。
皮膚は、表皮、真皮及び皮下組織の３層で構成される。表皮は皮膚表面から０．０５～０．２ｍｍの層、真皮は表皮から皮下組織の間に存在する１．５～３．０ｍｍの層、皮下組織は真皮の内側に存在する３．０～１０．０ｍｍの層である。真皮へ投与される皮内投与は、皮下投与用針に比べ、細く短い針を用いることから、皮下若しくは筋肉内投与される既存のワクチンに比べて、針刺し時の痛みや精神的負担の軽減が図れる。

【0019】

本発明のワクチン組成物は、インフルエンザ不活化全粒子に加えて、さらに医薬として許容され得る担体を含んでいてもよい。当該担体としては、ワクチンの製造に通常用いられる担体が挙げられ、具体的には、緩衝剤、乳化剤、保存剤（例えば、チメロサール）、等張化剤、ｐＨ調整剤、不活化剤（例えば、ホルマリン）、アジュバント若しくは免疫刺激剤等が例示される。アジュバントとは、抗原と共に投与することで、当該抗原に対する免疫応答を増強させる物質であるが、本発明のワクチン組成物は、上記のとおりワクチン抗原であるインフルエンザ不活化全粒子自体が、高い抗体誘導能を有することから、アジュバントの添加は必ずしも必要とせず、アジュバントを含有しない組成物とすることができる。

【0020】

本発明のワクチン組成物中のインフルエンザウイルス不活化全粒子の含有量は、ヘムアグルチニン量としてウイルス１株当たり１５μｇ以上、すなわち１５μｇＨＡ／株以上であり、好ましくは１５～６０μｇＨＡ／株であり、より好ましくは１５～２１μｇＨＡ／株である。なお、ヘムアグルチニン含量は、一元放射免疫拡散試験法等の、ＷＨＯや国の基準で定められた試験法で測定することによって得られる値である。

【0021】

本発明のワクチン組成物の１回の投与量は、抗原（インフルエンザウイルス不活化全粒子）として、ウイルス１株当たり１５μｇＨＡ以上であればよく、対象の年齢、性別、体重等を考慮して適宜増量できるが、好ましくは、１５～６０μｇＨＡ／株、より好ましくは１５～２１μｇＨＡ／株、さらに好ましくは１５μｇＨＡ／株を、１回又は２回以上投与することが挙げられる。好ましくは複数回の投与であり、この場合、１～４週間の間隔をあけて投与することが好ましい。

【0022】

本発明のワクチン組成物の１回の皮内投与容量としては、投与部位や投与デバイスによって決定されるが、通常、０．０５～０．５ｍＬ程度であり、好ましくは０．１～０．３ｍＬ，より好ましくは０．２ｍＬである。

【0023】

本発明のワクチン組成物を皮内投与するための投与デバイスとしては、皮内への投与が可能な皮内針若しくはマイクロニードルを使用できるが、例えば、針管の突出長が０．９ｍｍ～１．５ｍｍ、好ましくは１．０～１．２ｍｍ、より好ましくは１．２ｍｍの皮内針若しくはマイクロニードルである。
皮内投与デバイスの針管は、１本でもよく、複数本でもよいが、好ましくは１～３本であり、より好ましくは３本の針管を有する皮内針である。

【0024】

本発明のワクチン組成物の投与対象は、ヒト及びヒトを除く哺乳動物が挙げられるが、ヒトが好ましい。ヒトを除く哺乳動物としては、例えば、ラット、モルモット、ウサギ、ブタ、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ネコ、アカゲザル、カニクイザル、オランウータン、チンパンジー等が挙げられる。

【実施例】

【0025】

以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらに何ら限定されるものではない。

【0026】

参考例１ 不活化全粒子ワクチンによる鼻腔へのウイルス特異的ＩｇＧの誘導
インフルエンザＨＡワクチン「生研」のＢ／Ｙａｍａｇａｔａ系統（Ｂ／Ｐｈｕｋｅｔ／３０７３／２０１３株）の原液をスプリット抗原とし、０．２ｍＬ当りにヘムアグルチニンが１５μｇＨＡとなるよう１ｗ／ｗ％しょ糖含有６．７ｍＭリン酸緩衝生理食塩液（ｐＨ７．２）で調整し、これをスプリットワクチンとした。また、以下に記載する通りに調製したＢ／Ｙａｍａｇａｔａ系統（Ｂ／Ｐｈｕｋｅｔ／３０７３／２０１３株）の不活化全粒子抗原も同様に、０．２ｍＬ当りにヘムアグルチニンが１５μｇＨＡとなるよう１ｗ／ｗ％しょ糖含有６．７ｍＭリン酸緩衝生理食塩液（ｐＨ７．２）で調整し、これを不活化全粒子ワクチンとした。

【0027】

本参考例で使用した不活化全粒子抗原の調製は以下に記す通りである。１２日齢の発育鶏卵のしょう尿膜腔内にＢ／Ｐｈｕｋｅｔ／３０７３／２０１３株のウイルスを接種して、３日間培養後にしょう尿液を採取した。採取したしょう尿液をフィルターろ過で清澄化した後、硫酸バリウム塩に吸着させ、１２％クエン酸ナトリウム溶液で溶出してインフルエンザウイルスを回収した。回収したウイルスは、更に限外ろ過で６．７ｍＭリン酸緩衝生理食塩液（ｐＨ７．２）に置換し、バッファー置換後にしょ糖密度勾配遠心でインフルエンザウイルスを含む画分を回収することによって精製した。この精製インフルエンザウイルスに終濃度０．０５％となるように不活化剤であるベータプロピオラクトンを添加して、４℃、２４時間の反応でインフルエンザウイルスの感染性を不活化させた。この不活化反応後に限外ろ過（ＭＷＣＯ：１００，０００）でバッファーを１ｗ／ｗ％しょ糖含有６．７ｍＭリン酸緩衝生理食塩液（ｐＨ７．２）に置換し、これを不活化全粒子ワクチンとした。

【0028】

上記の通りに調製した投与液（表１）を、ＢＡＬＢ／ｃマウス（雌、５週齢）の皮下へ１匹当り０．２ｍＬを投与し、投与から２１、４２及び６３日後に全採血した（各時点当り８匹より採血）。また、同様に各投与液を２１日間隔で２回投与し、１回目投与から４２及び６２日後（２回目投与からそれぞれ２１及び４２日後）に全採血を行った。
全採血の後、上顎の咽側よりピペットマンを挿し込み、０．１７５％ＢＳＡ及びプロテアーゼインヒビター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を含有するＤ－ＰＢＳを流し込み、外鼻孔より回収した溶液を鼻腔洗浄液とした。採取した血液は、遠心分離により血清を調製し、血清のＢ／Ｐｈｕｋｅｔ／３０７３／２０１３株に対するＨＩ抗体価を測定した。また、鼻腔洗浄液については、Ｂ／Ｐｈｕｋｅｔ／３０７３／２０１３株に結合するＩｇＧ力価を測定した。

【0029】

【表1】

【0030】

Ｂ／Ｐｈｕｋｅｔ／３０７３／２０１３株に対する血清のＨＩ抗体価は図１に示す通りである。１回投与群の比較では、不活化全粒子ワクチンに比べて、スプリットワクチンは抗体誘導が遅いため、Ｄａｙ２１ではスプリットワクチン投与群の抗体価は低いが、Ｄａｙ４２及び６３では徐々にスプリットワクチン投与群の抗体価が高まり、Ｄａｙ４２以降ではいずれのワクチン投与群の抗体価も同程度となる。また、２回投与群では、不活化全粒子ワクチンはＤａｙ４２及び６３で同程度の抗体価であったが、スプリットワクチンではＤａｙ４２から６３にかけて、わずかに低減する傾向が確認された。このため、Ｄａｙ４２においては、不活化全粒子ワクチンとスプリットワクチンのＨＩ抗体価は同等であったが、Ｄａｙ６３では、不活化全粒子ワクチンの方が高い傾向を示した。

【0031】

鼻腔洗浄液のウイルス特異的なＩｇＧ力価は図２に示す通りであり、１回投与群の比較では、スプリットワクチン投与群ではＤａｙ２１から６３にかけて徐々に高まっていくが相対的に抗体価は低く、これに対して不活化全粒子ワクチン投与群ではＤａｙ４２をピークとしたベルシェイプを描き、ＨＩ抗体価とは異なる傾向を示した。このため、Ｄａｙ４２及び６３における血清のＨＩ抗体価は、いずれのワクチンも同程度であったが、鼻腔洗浄液のウイルス特気的なＩｇＧ力価ではＤａｙ４２において不活化全粒子ワクチン投与群はスプリットワクチン投与群に比べて有意に高い抗体誘導を示した。

【0032】

また、２回投与群では、スプリットワクチン投与群でもＤａｙ４２の鼻腔洗浄液におけるウイルス特異的ＩｇＧ力価は高まるものの、不活化全粒子ワクチン投与群と比べると抗体価は低い。更に、Ｄａｙ６３（２回目投与から４２日後）の比較では、不活化全粒子ワクチン投与群では抗体価が上昇傾向であるのに対して、スプリットワクチン投与群では低下傾向を示し、鼻腔粘膜のウイルス特異的ＩｇＧの持続性においても不活化全粒子ワクチンの方が優れていると考えられた。

【0033】

参考例２ ウイルスチャレンジ試験
参考例１と同様に、Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ系統（Ｂ／Ｔｅｘａｓ／２／２０１３株）のスプリット抗原若しくは不活化全粒子抗原を０．２ｍＬ当りにヘムアグルチニンが１５μｇＨＡとなるよう１ｗ／ｗ％しょ糖含有６．７ｍＭリン酸緩衝生理食塩液（ｐＨ７．２）で調整し、これをスプリットワクチン又は不活化全粒子ワクチンとした。

【0034】

上記の通りに調製した投与液（表２）を、ＢＡＬＢ／ｃマウス（雌、５週齢）に１匹当り０．２ｍＬを１回若しくは３週間隔で２回皮下投与した。対照群へは生理食塩液（大塚製薬工場）を３週間隔で２回皮下投与した。１回目投与から４２日後、イソフルラン麻酔下でＢ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ系統のＢ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８株を１×１０^４ＴＣＩＤ_５０／１０μＬ／ｈｅａｄで鼻腔にウイルス接種した。ウイルス接種より３日後に各マウスを放血致死させ、その後参考例１と同様の方法で鼻腔洗浄液を回収した。
回収した鼻腔洗浄液に含まれるウイルス量をｑＰＣＲで測定し、鼻腔粘膜におけるウイルスの排除能を比較評価した。

【0035】

【表2】

【0036】

ウイルス接種３日後における鼻腔洗浄液のウイルス含量は、図３に示す通りである。不活化全粒子ワクチンの皮下投与によって、鼻腔粘膜におけるウイルス特異的ＩｇＧは１回投与４２日後及び２回投与後で高まるが（参考例１）、ウイルスチャレンジ試験においても、上記の時点で接種した場合、ほとんどウイルスが検出されなかった。一方で、スプリットワクチンの皮下投与では、１回投与４２日後は鼻腔粘膜のウイルス特異的ＩｇＧ力価が低いためか、対照群と比較するとわずかにウイルス含量は低減しているが、鼻腔洗浄液のウイルス含量は高いことが確認された。しかし、スプリットワクチンの皮下投与においても、２回投与することでＤａｙ４２の鼻腔粘膜でのウイルス特異的ＩｇＧ力価は高まるため（参考例１）、２回投与群のウイルス含量は対照に比べて１０分の１未満であり、鼻腔粘膜におけるウイルス含量の有意な低下が確認された。
これらの結果より、鼻腔粘膜のウイルス特異的ＩｇＧ力価を高いレベルで誘導することがインフルエンザワクチンの有効性と関連していることが示唆された。

【0037】

実施例１ インフルエンザワクチンの皮内投与における鼻腔粘膜の抗体誘導評価
参考例１と同様に調製した４株（Ａ／Ｈ１Ｎ１、Ａ／Ｈ３Ｎ２、Ｂ／Ｙａｍａｇａｔａ系統、Ｂ／Ｖｉｃtｏｒｉａ系統）のスプリット抗原と不活化全粒子抗原を用いて、不活化全粒子ワクチン及びスプリットワクチンを調製した。皮内投与に供するワクチンは、０．２ｍＬ当りにヘムアグルチニンが１５、３、若しくは０．６μｇＨＡとなるよう、皮下投与に供するワクチンは、０．５ｍＬ当りにヘムアグルチニンが１５、３、若しくは０．６μｇＨＡとなるよう１ｗ／ｗ％しょ糖含有６．７ｍＭリン酸緩衝生理食塩液（ｐＨ７．２）で調整した。

【0038】

上記の通りに調製した投与液（表３－１、表３－２）を、皮内投与は１匹当り０．２ｍＬ、皮下投与は１匹当り０．５ｍＬでＳＤラット（雄、９週齢）の後背部に３週間隔で２回投与し、２回目投与の２１日後にイソフルラン麻酔下にて脱血し、その後鼻腔洗浄液を採取した。鼻腔洗浄液の採取方法は、参考例１と同様に、上顎の咽側よりピペットマンを挿し込み、０．１７５％ＢＳＡ及びプロテアーゼインヒビター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を含有するＤ－ＰＢＳを流し込み、外鼻孔より回収した溶液を鼻腔洗浄液とした。なお、皮内投与にはパスキン３本針（南部化成、３４Ｇ、１．２ｍｍ）を使用した。
回収した鼻腔洗浄液は、各ワクチン株に対して結合するウイルス特異的ＩｇＧ力価の測定及びＡ/Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ/ＧＰ１９０８/２０１５株に対する中和抗体価の測定に供した。

【0039】

【表3-1】

【0040】

【表3-2】

【0041】

鼻腔洗浄液のウイルス特異的ＩｇＧ力価の結果は、図４Ａ～Ｄに示す通りである。Ａ/Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ/ＧＰ１９０８/２０１５株（Ａ／Ｈ１Ｎ１亜型）及びＡ/Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ/ＩＮＦＩＭＨ－１６－００１９/２０１６株（Ａ／Ｈ３Ｎ２亜型）に対するＩｇＧ力価は、不活化全粒子ワクチンの皮内投与群若しくは不活化全粒子ワクチンの皮下投与群の高用量において誘導が確認され、その他の群ではほとんど誘導されなかった（図４Ａ及びＢ）。また、鼻腔粘膜でウイルス特異的なＩｇＧの誘導が確認された群のなかでも、不活化全粒子ワクチンの１５μｇＨＡ／株／ｈｅａｄを皮内投与した群で最も誘導効率が高いことが確認された。したがって、Ａ型ウイルスに対する鼻腔粘膜のウイルス特異的ＩｇＧを誘導するためには、不活化全粒子ワクチンの投与が有効であり、特に不活化全粒子ワクチンを高用量で皮内投与することによって高い抗体誘導が達成できる。
また、Ｂ／Ｐｈｕｋｅｔ／３０７３／２０１３株及びＢ／Ｍａｒｙｌａｎｄ／１５／２０１６株に対するＩｇＧ力価においても、不活化全粒子ワクチンの皮内投与群で最も高い誘導を示した（図４Ｃ及びＤ）。Ｂ型では、スプリットワクチンの皮内投与群でも鼻腔粘膜にウイルス特異的なＩｇＧの誘導が確認されたが、現行のインフルエンザワクチンと同一のスプリットワクチンの皮下投与（ＳＶ（S.C.））では最も誘導効率が低いことがわかった。したがって、Ａ型及びＢ型のいずれのウイルスに対しても鼻腔粘膜に特異的なＩｇＧを効率的に誘導できるのは、不活化全粒子ワクチンの皮内投与であると考えられた。

【0042】

図５には鼻腔洗浄液のＡ/Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ/ＧＰ１９０８/２０１５株（Ａ／Ｈ１Ｎ１亜型）に対する中和抗体価の結果を示すが、不活化全粒子ワクチンの１５μｇＨＡ／株／ｈｅａｄを皮内投与した群のみが、高いウイルス中和活性を示した。
したがって、鼻腔粘膜のウイルス特異的なＩｇＧ力価の結果においても、不活化全粒子ワクチン（１５μｇＨＡ／株／ｈｅａｄ）の皮内投与はいずれの株に対するＩｇＧ力価も高く、また、ウイルスの中和活性も最も高い。すなわち、高用量の不活化全粒子ワクチンの皮内投与によって、鼻腔粘膜でウイルスを排除する抗体誘導が高まり、現行のワクチンよりも有効性の高いインフルエンザワクチンとなる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図4D】

【図5】