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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-04-22
(45)【発行日】2024-05-01
(54)【発明の名称】新規な等温単一反応用プローブセット及びその用途
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/6876 20180101AFI20240423BHJP
C12Q 1/6862 20180101ALI20240423BHJP
C12N 15/09 20060101ALN20240423BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/6876 Z
C12Q1/6862 Z
C12N15/09 Z ZNA
【請求項の数】
16
(21)【出願番号】P 2021562969
(86)(22)【出願日】2020-04-22
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-06-27
(86)【国際出願番号】 KR2020005331
(87)【国際公開番号】W WO2020218831
(87)【国際公開日】2020-10-29
【審査請求日】2021-10-27
(31)【優先権主張番号】10-2019-0046713
(32)【優先日】2019-04-22
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(73)【特許権者】
【識別番号】520077610
【氏名又は名称】ポステック・リサーチ・アンド・ビジネス・ディベロップメント・ファウンデーション
【氏名又は名称原語表記】ＰＯＳＴＥＣＨ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＡＮＤ ＢＵＳＩＮＥＳＳＤＥＶＥＬＯＰＭＥＮＴ ＦＯＵＮＤＡＴＩＯＮ
(74)【代理人】
【識別番号】110003007
【氏名又は名称】弁理士法人謝国際特許商標事務所
(72)【発明者】
【氏名】リー、ジョンウク
(72)【発明者】
【氏名】ジュン、ギョヨル
(72)【発明者】
【氏名】ウー、チャンハ
(72)【発明者】
【氏名】チャン、ソンホ
(72)【発明者】
【氏名】シン、ギヨン
【審査官】山内 達人
(56)【参考文献】
【文献】米国特許第０６３７９８９９（ＵＳ，Ｂ１）
【文献】米国特許出願公開第２０１２／０１９６３３０（ＵＳ，Ａ１）
【文献】Chem. Commun.，2018年，54，p. 3010-3013及びSupporting Information
【文献】CLIN. CHEM.，1993年，39/9，p. 1934-1938
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｑ
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
第１プローブ及び第２プローブを含む、ターゲット核酸配列検出用プローブセットであって、前記第１プローブは、下記一般式（Ｉ）の構造を有するプロモータープローブ（ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｐｒｏｂｅ、ＰＰ）であり；
３’－Ｘ－Ｙ－５’ （Ｉ）
一般式（Ｉ）において、
前記Ｘは、ＲＮＡ重合酵素が認識できるプロモーター配列を含むステム－ループ構造（Ｓｔｅｍ－ｌｏｏｐ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）部位であり；前記Ｙは、ターゲット核酸配列と相補的な混成化配列を有するＵＨＳ（Ｕｐｓｔｒｅａｍ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ）部位であり；前記ターゲット核酸配列は、ＤＮＡまたはＲＮＡであり；前記Ｘ及びＹは、デオキシリボヌクレオチドであり；
前記第２プローブは、下記一般式（II）の構造を有するレポータープローブ（ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｐｒｏｂｅ、ＲＰ）であり；
３’－Ｙ’－Ｚ－５’ （II）
一般式（II）において、
前記Ｙ’は、ターゲット核酸配列と相補的な混成化配列を有するＤＨＳ（Ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ）部位であり；前記Ｚは、検出可能なシグナルを発生させる一つの標識（ｌａｂｅｌ）または二つ以上の標識を含む相互作用的標識システムを有するアプタマー配列部位であり；前記ターゲット核酸配列は、ＤＮＡまたはＲＮＡであり；前記Ｙ’及びＺは、デオキシリボヌクレオチドであり；
前記第１プローブ及び第２プローブは、ターゲット核酸配列と混成化された後、ライゲーション（ｌｉｇａｔｉｏｎ）されて、前記第１プローブ及び第
２プローブからなるライゲーション産物を形成し、前記ライゲーション産物の転写はＲＮＡ重合酵素によって開始され、アプタマーを含む転写産物を形成し、転写産物内のアプタマーのシグナル生成を検出し；
ここで、ライゲーション、転写、及び検出は、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）なしで、単一の温度条件下で1つの容器内で実行され；かつ
ライゲーション、転写、及び検出は、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＮＴＰ、ＮａＣｌ、及びＥＴ－ＳＳＢ（Ｅｘｔｒｅｍｅ Ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ Ｓｉｎｇｌｅ－Ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ）を含むバッファーで実行されることを特徴とする、
ターゲット核酸配列検出用プローブセット。
【請求項2】
前記ライゲーションは、ＳｐｌｉｎｔＲリガーゼ、バクテリオファージＴ４リガーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉリガーゼ、Ａｆｕリガーゼ、Ｔａｑリガーゼ、Ｔｆｌリガーゼ、Ｍｔｈリガーゼ、Ｔｔｈリガーゼ、Ｔｔｈ ＨＢ８リガーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｓｐｅｃｉｅｓ ＡＫ１６Ｄリガーゼ、Ａｐｅリガーゼ、ＬｉｇＴｋリガーゼ、Ａａｅリガーゼ、Ｒｍリガーゼ、Ｐｆｕリガーゼ、及びリボザイム（ｒｉｂｏｚｙｍｅ）からなる群から選択された１種のライゲーション作用剤により実施されることを特徴とする、請求項１に記載のターゲット核酸配列検出用プローブセット。
【請求項3】
前記ＲＮＡ重合酵素は、バクテリオファージＴ７ ＲＮＡ重合酵素、バクテリオファージＴ３重合酵素、バクテリオファージＲＮＡ重合酵素、バクテリオファージΦII重合酵素、サルモネラバクテリオファージｓｐ６重合酵素、シュードモナスバクテリオファージｇｈ－１重合酵素、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＲＮＡ重合酵素ホロ酵素（ｈｏｌｏｅｎｚｙｍｅ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＲＮＡ重合酵素コア酵素、ヒトＲＮＡ重合酵素Ｉ、ヒトＲＮＡ重合酵素II、ヒトＲＮＡ重合酵素III、及びヒトミトコンドリアＲＮＡ重合酵素からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載のターゲット核酸配列検出用プローブセット。
【請求項4】
前記標識は、化学的標識、酵素標識、放射能標識、蛍光標識、発光標識、化学発光標識及び金属標識からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載のターゲット核酸配列検出用プローブセット。
【請求項5】
単一の温度条件は、１５℃～５０℃の範囲から選択される温度であることを特徴とする、請求項１に記載のターゲット核酸配列検出用プローブセット。
【請求項6】
バッファーは ５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１０ ｍＭ ＭｇＣｌ２、 １ ｍＭ ＮＴＰ、１０．５ ｍＭ ＮａＣｌ、及び４００ ｎｇ の ＥＴ－ＳＳＢ（Ｅｘｔｒｅｍｅ Ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ Ｓｉｎｇｌｅ－Ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ）を含むことを特徴とする、請求項１に記載のターゲット核酸配列検出用プローブセット。
【請求項7】
請求項１に記載の第１プローブ及び第２プローブを含むターゲット核酸配列検出用プローブセット、ライゲーション作用剤、ＲＮＡ重合酵素及びＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＮＴＰ、ＮａＣｌ、及びＥＴ－ＳＳＢ（Ｅｘｔｒｅｍｅ Ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ Ｓｉｎｇｌｅ－Ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ）を含むバッファーを含む、ターゲット核酸配列検出用組成物。
【請求項8】
前記組成物は、２種以上のターゲット核酸配列検出用プローブセットを含むことを特徴とする、請求項７に記載のターゲット核酸配列検出用組成物。
【請求項9】
前記２種以上のターゲット核酸配列検出用プローブセットは、それぞれ互いに異なる相互作用的標識システムを含み；前記２種以上のプローブセットそれぞれは、それぞれ互いに異なるターゲット核酸配列に結合して；これによって互いに異なるターゲット核酸配列の多重検出が可能であることを特徴とする、請求項８に記載のターゲット核酸配列検出用組成物。
【請求項10】
請求項７乃至９のいずれか一項に記載のターゲット核酸配列検出用組成物を含む、ターゲット核酸配列検出用キット。
【請求項11】
次のステップを含む、ターゲット核酸配列を検出する方法：（ａ）請求項１に記載の第１プローブ及び第２プローブを含むターゲット核酸配列検出用プローブセットで、サンプルを処理してターゲット核酸配列と混成化させるステップ；
（ｂ）（ａ）ステップの混成化産物をライゲーション作用剤で処理して前記プローブセットの第１プローブ及び第２プローブをライゲーションさせ、ライゲーション産物をＲＮＡ重合酵素で処理して転写を開始させるステップ；及び
（ｃ）（ｂ）ステップの転写産物をアプタマー－反応物質で処理して転写産物内のアプタマーのシグナル生成を検出するステップであって、前記シグナル生成は、サンプル中のターゲット核酸配列の存在を示すステップ；
ここで、ライゲーション、転写、及び検出は、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）なしで、単一の温度条件下で1つの容器内で実行され；かつ
ライゲーション、転写、及び検出は、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＮＴＰ、ＮａＣｌ、及びＥＴ－ＳＳＢ（Ｅｘｔｒｅｍｅ Ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ Ｓｉｎｇｌｅ－Ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ）を含むバッファーで実行されることを特徴とする、
ターゲット核酸配列を検出する方法。
【請求項12】
単一の温度条件は、１５℃～５０℃の範囲から選択される温度であることを特徴とする、請求項１１に記載のターゲット核酸配列を検出する方法。
【請求項13】
バッファーは ５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１０ ｍＭ ＭｇＣｌ２、 １ ｍＭ ＮＴＰ、１０．５ ｍＭ ＮａＣｌ、及び４００ ｎｇ の ＥＴ－ＳＳＢ（Ｅｘｔｒｅｍｅ Ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ Ｓｉｎｇｌｅ－Ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ）を含むことを特徴とする、請求項１１に記載のターゲット核酸配列を検出する方法。
【請求項14】
次のステップを含む、病原性微生物の検出方法であって：（ａ）サンプルを、請求項１に記載の第１プローブ及び第２プローブを含むターゲット核酸配列検出用プローブセットで処理して、病原性微生物のターゲット核酸配列と混成化させるステップ；
（ｂ）（ａ）ステップの混成化産物をライゲーション作用剤で処理して前記プローブセットの第１プローブ及び第２プローブをライゲーションさせ、ライゲーション産物をＲＮＡ重合酵素で処理して転写を開始させるステップ；及び
（ｃ）（ｂ）ステップの転写産物をアプタマー－反応物質で処理して転写産物内のアプタマーのシグナル生成を検出するステップであって、前記シグナル生成は、サンプル中のターゲット核酸配列の存在を示すステップ；
ここで、ライゲーション、転写、及び検出は、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）なしで、単一の温度条件下で1つの容器内で実行され；
ライゲーション、転写、及び検出は、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＮＴＰ、ＮａＣｌ、及びＥＴ－ＳＳＢ（Ｅｘｔｒｅｍｅ Ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ Ｓｉｎｇｌｅ－Ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ）を含むバッファーで実行され；かつ
病原性微生物は、スタフィロコッカスアウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ Ａｕｒｅｕｓ）、ビブリオバルニフィカス（Ｖｉｂｒｉｏ ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、中東呼吸器症候群コロナウイルス（Ｍｉｄｄｌｅ Ｅａｓｔ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ）、インフルエンザＡウイルス（Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ ｖｉｒｕｓ）、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス（Ｓｅｖｅｒｅ Ａｃｕｔｅ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ）、呼吸器細胞融合ウイルス（ＲＳＶ）、ヒト免疫欠乏ウイルス（ＨＩＶ）、ヘルペスシンプレックスウイルス（ＨＳＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、ヒトパラインフルエンザウイルス（ＨＰＩＶ）、デング熱ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ Ｖｉｒｕｓ（ＨＢＶ））、黄熱病ウイルス、狂犬病ウイルス、プラスモジウム、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ミコバクテリウムチュバクローシス、クラミジアトラコマチス、ロタウイルス、ヒトメタニューモウイルス（ｈＭＰＶ）、クリミアコンゴ出血熱ウイルス（Ｃｒｉｍｅａｎ－Ｃｏｎｇｏ ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ ｆｅｖｅｒ ｖｉｒｕｓ）、エボラウイルス、ジカウイルス、ヘニパウイルス、ノロウイルス、ラッサウイルス、ライノウイルス、フラビウイルス、リフトバレー熱ウイルス、手足口病ウイルス、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐ．）、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｐ．）、エンテロバクテリアセアエ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ ｓｐ．）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）、モラクセラ（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｓｐ．）、ヘリコバクター（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）及びステノトロホモナス（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）からなる群から選択された１種以上であることを特徴とする、病原性微生物の検出方法。
【請求項15】
単一の温度条件は、１５℃～５０℃の範囲から選択される温度であることを特徴とする、請求項１４に記載の病原性微生物の検出方法。
【請求項16】
バッファーは ５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１０ ｍＭ ＭｇＣｌ２、 １ ｍＭ ＮＴＰ、１０．５ ｍＭ ＮａＣｌ、及び４００ ｎｇ の ＥＴ－ＳＳＢ（Ｅｘｔｒｅｍｅ Ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ Ｓｉｎｇｌｅ－Ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ）を含むことを特徴とする、請求項１４に記載の病原性微生物の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、新規な等温単一反応用プローブセット及びその用途に関する。具体的に、等温条件下、単一反応組成物を利用して核酸配列－基盤に現場適用可能な形態の易しく正確で速やかに現場で分子診断する方法を提供する。
【背景技術】
【0002】
特定の核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）またはタンパク質を検出する方法は、科学研究の分野で基本的に重要な技術である。特定の核酸またはタンパク質を検出し、同定できるようになることで、研究者らは、どのような遺伝的、生物学的標識がヒトの健康状態を示す指標になるかを判定できるようになった。
このような核酸またはタンパク質を検出する方法を利用すると、試料に存在するターゲット遺伝子、例えば、病原体遺伝子及びその変形、または特定の遺伝子の発現等を見出すことができる。
しかし、現代に所得の水準が高くなるにつれ、健康及び衛生に対して高い関心を示すのに対し、直接目に見えない微生物を検出し、それを定量的に評価することは容易でない状況である。
ヒトが使用するくし、携帯電話、机、衣服等のような日常的な物やトイレ、寝室等の空間、その上に一般的な空気中には多様な微生物が生息しており、このような微生物の中には日和見感染菌及び病原性細菌等が含まれている可能性がある。
微生物の量を測定する伝統的な方法としては、標準平板法であって、微生物を培養できる培地に環境から採取した試料をステップ希釈して塗抹し、２～３日後に培地から生成されるコロニーの数を計算してその量を推定することである。このような伝統的な方法は、専門的な実験道具及び熟練した実験者が必要であるだけではなく、時間も非常に長くかかる短所を持っており、普通の人が速やかに生存微生物を測定するには困難なところがある。
伝統的な方法の問題点を解決するために、近年、様々な方法が開発されている。細胞内に常時存在する多様な構成物質の量を測定することで間接的に微生物の量を測定することである。
代表的な方法として、ＡＴＰの量を基盤に測定する方法がある。ＡＴＰは、細胞内で主な生体エネルギー源として使用されており、全ての生物に共通して存在する構成物であり、試料で細胞量を測定するに有用な物質である。このような長所によって、ＡＴＰ測定方法は、微生物定量測定に現在広く使用されており、それを測定するために、一般にルシフェラーゼ（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）酵素を使用して発光反応を誘導し、光の強度を通して定量をするようになる。このとき、基質としては、ルシフェリン（ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ）を使用する。
しかし、前記方法は、反応試料内のＡＴＰが早く枯渇して信号が長く持続できず、添加する酵素及び基質の生産単価が高い短所が存在する。
また、測定するための構成物が酵素である点によって貯蔵性に限界点を保有しており、問題になっている。このようなＡＴＰ測定を通した微生物細胞の定量方法には、また他の問題点が存在する。細胞が死滅してもＡＴＰの機能は維持され、死滅したか、または生存力が非常に低い微生物もまた測定される可能性が高いということである。
病原性微生物を診断するまた他の一般的な方法は、ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）またはＩＲＭＡ（Ｉｍｍｕｎｏｒａｄｉｏｍｅｔｒｉｃ ａｓｓａｙ）等のような抗体基盤の技術である。しかし、この方法もまた特定の抗原に反応する抗体を生成するのに２～３ヶ月が必要となるので、変異が頻繁で短時間で拡散されるので、伝染性疾病の診断方法として適していない。
従って、伝染性疾病を診断するためには、抗体基盤の診断技術の代わりに極微量の感染物質の情報を含んでいるＤＮＡ、ＲＮＡのような核酸を検査して判断できる分子水準の分子診断技術が適している。
このような分子診断技術の中にリガーゼ（ｌｉｇａｓｅ）を利用する方法がある。これは、特定のＤＮＡ断片を試料に入れると、細胞内に存在するリガーゼがこれを認知し、重合反応を通して二つの断片を繋ぐようになる。このように繋いだ断片に特定のプライマーを利用してｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ分析を遂行する場合、微生物の量も評価できるものと知られている。
しかし、リガーゼとＤＮＡ鎖との反応を通して作られた新たな核酸分子を確認するためには、ＲＴ－ＰＣＲ及びＰＣＲ、ゲル電気泳動過程が要求されるため、高価な装備及び熟練した実験者が必要であり、分析時間が非常に長く必要となる。また、ルシフェラーゼ測定法のようにＡＴＰ分子が死んだ細胞上にも存在するため、生存微生物だけの測定が不可能であるという短所がある。
即ち、このような核酸を用いた分子診断技術は、既存の診断方法より感度に優れるので、疾患の予防を目的として特定の遺伝子を検出するか感染疾患を予防するための選別検査、早期確認及び早い対応が可能であるが、ほとんどの核酸を用いた分子診断技術は、温度循環型核酸増幅装置（ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ）の装備とその機械を扱うことのできる専門人材が必要であるという短所がある。
従って、上述した従来の抗体基盤の診断技術が有する問題点である特定の抗原に結合して抗体が生成されるのに必要となる時間的な消耗を減らし、高価な装備及び熟練した人材の確保なしに非常に効果的に正確に短時間内に目的のＤＮＡ／ＲＮＡ配列の検出および／または診断できる方法の開発が必要である。
このような核酸またはタンパク質を検出する方法を利用すると、試料に存在するターゲット遺伝子、例えば、病原体遺伝子及びその変形、または特定の遺伝子の発現等を見出すことができる。
しかし、現代に所得の水準が高くなるにつれ、健康及び衛生に対して高い関心を示すのに対し、直接目に見えない微生物を検出し、それを定量的に評価することは容易でない状況である。
ヒトが使用するくし、携帯電話、机、衣服等のような日常的な物やトイレ、寝室等の空間、その上に一般的な空気中には多様な微生物が生息しており、このような微生物の中には日和見感染菌及び病原性細菌等が含まれている可能性がある。
微生物の量を測定する伝統的な方法としては、標準平板法であって、微生物を培養できる培地に環境から採取した試料をステップ希釈して塗抹し、２～３日後に培地から生成されるコロニーの数を計算してその量を推定することである。このような伝統的な方法は、専門的な実験道具及び熟練した実験者が必要であるだけではなく、時間も非常に長くかかる短所を持っており、普通の人が速やかに生存微生物を測定するには困難なところがある。
伝統的な方法の問題点を解決するために、近年、様々な方法が開発されている。細胞内に常時存在する多様な構成物質の量を測定することで間接的に微生物の量を測定することである。
代表的な方法として、ＡＴＰの量を基盤に測定する方法がある。ＡＴＰは、細胞内で主な生体エネルギー源として使用されており、全ての生物に共通して存在する構成物であり、試料で細胞量を測定するに有用な物質である。このような長所によって、ＡＴＰ測定方法は、微生物定量測定に現在広く使用されており、それを測定するために、一般にルシフェラーゼ（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）酵素を使用して発光反応を誘導し、光の強度を通して定量をするようになる。このとき、基質としては、ルシフェリン（ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ）を使用する。
しかし、前記方法は、反応試料内のＡＴＰが早く枯渇して信号が長く持続できず、添加する酵素及び基質の生産単価が高い短所が存在する。
また、測定するための構成物が酵素である点によって貯蔵性に限界点を保有しており、問題になっている。このようなＡＴＰ測定を通した微生物細胞の定量方法には、また他の問題点が存在する。細胞が死滅してもＡＴＰの機能は維持され、死滅したか、または生存力が非常に低い微生物もまた測定される可能性が高いということである。
病原性微生物を診断するまた他の一般的な方法は、ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）またはＩＲＭＡ（Ｉｍｍｕｎｏｒａｄｉｏｍｅｔｒｉｃ ａｓｓａｙ）等のような抗体基盤の技術である。しかし、この方法もまた特定の抗原に反応する抗体を生成するのに２～３ヶ月が必要となるので、変異が頻繁で短時間で拡散されるので、伝染性疾病の診断方法として適していない。
従って、伝染性疾病を診断するためには、抗体基盤の診断技術の代わりに極微量の感染物質の情報を含んでいるＤＮＡ、ＲＮＡのような核酸を検査して判断できる分子水準の分子診断技術が適している。
このような分子診断技術の中にリガーゼ（ｌｉｇａｓｅ）を利用する方法がある。これは、特定のＤＮＡ断片を試料に入れると、細胞内に存在するリガーゼがこれを認知し、重合反応を通して二つの断片を繋ぐようになる。このように繋いだ断片に特定のプライマーを利用してｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ分析を遂行する場合、微生物の量も評価できるものと知られている。
しかし、リガーゼとＤＮＡ鎖との反応を通して作られた新たな核酸分子を確認するためには、ＲＴ－ＰＣＲ及びＰＣＲ、ゲル電気泳動過程が要求されるため、高価な装備及び熟練した実験者が必要であり、分析時間が非常に長く必要となる。また、ルシフェラーゼ測定法のようにＡＴＰ分子が死んだ細胞上にも存在するため、生存微生物だけの測定が不可能であるという短所がある。
即ち、このような核酸を用いた分子診断技術は、既存の診断方法より感度に優れるので、疾患の予防を目的として特定の遺伝子を検出するか感染疾患を予防するための選別検査、早期確認及び早い対応が可能であるが、ほとんどの核酸を用いた分子診断技術は、温度循環型核酸増幅装置（ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ）の装備とその機械を扱うことのできる専門人材が必要であるという短所がある。
従って、上述した従来の抗体基盤の診断技術が有する問題点である特定の抗原に結合して抗体が生成されるのに必要となる時間的な消耗を減らし、高価な装備及び熟練した人材の確保なしに非常に効果的に正確に短時間内に目的のＤＮＡ／ＲＮＡ配列の検出および／または診断できる方法の開発が必要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0003】
このような状況下で、本発明者らは、従来の技術の問題点を克服しながら単一または多数のターゲット核酸配列の検出をより簡便かつ偽陽性及び偽陰性結果なしに検出できる技術を開発しようと鋭意研究努力した。その結果、本発明者らは、特定のプロモーター配列；及びターゲット遺伝子と混成化する配列で構成されるプロモータープローブ（ＰＰ、ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｐｒｏｂｅ）である第１ＤＮＡプローブ、及びターゲット遺伝子と混成化する配列；及び蛍光－標識ＲＮＡアプタマーを暗号化する配列で構成されるレポータープローブ（ＲＰ、ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｐｒｏｂｅ）である第２ＤＮＡプローブを設計した。また、ターゲット遺伝子を副木（ｓｐｌｉｎｔ）として使用した前記ＤＮＡプローブのライゲーション反応、前記ライゲーションされた一本鎖ＤＮＡからＲＮＡ重合酵素による転写過程及び前記転写過程で生成された転写産物内のアプタマー構造が特定の化学分子と結合する蛍光反応の３ステップを等温条件下で様々なステップ、特に、増幅ステップなしに、単一反応で遂行され得るように一元化し、これによって容易かつ簡便にターゲット遺伝子を検出するだけではなく、実際に高病原性微生物を単独または多重検出して、速やかな対応が必要な高病原性疾患を診断するプラットホームになり得ることを糾明することで本発明を完成した。
従って、本発明の一目的は、ターゲット核酸配列検出用等温単一反応（ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ｏｎｅ－ｐｏｔ ｒｅａｃｔｉｏｎ）プローブセットを提供することにある。
また、本発明の他の目的は、前記プローブセットを含むターゲット核酸配列検出用組成物を提供することにある。
また、本発明のまた他の目的は、ターゲット核酸配列検出用キットを提供することにある。
また、本発明のまた他の目的は、別途の増幅反応なしに、等温単一反応条件下でターゲット核酸配列を検出する方法を提供することにある。
また、本発明のまた他の目的は、別途の増幅反応なしに、等温単一反応条件下での現場用分子診断方法を提供することにある。
本発明の他の目的及び利点は、下記の添付の請求の範囲及び図面からより明確になる。
従って、本発明の一目的は、ターゲット核酸配列検出用等温単一反応（ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ｏｎｅ－ｐｏｔ ｒｅａｃｔｉｏｎ）プローブセットを提供することにある。
また、本発明の他の目的は、前記プローブセットを含むターゲット核酸配列検出用組成物を提供することにある。
また、本発明のまた他の目的は、ターゲット核酸配列検出用キットを提供することにある。
また、本発明のまた他の目的は、別途の増幅反応なしに、等温単一反応条件下でターゲット核酸配列を検出する方法を提供することにある。
また、本発明のまた他の目的は、別途の増幅反応なしに、等温単一反応条件下での現場用分子診断方法を提供することにある。
本発明の他の目的及び利点は、下記の添付の請求の範囲及び図面からより明確になる。
【課題を解決するための手段】
【0004】
本明細書において使用した用語は、単に説明を目的として使用されたものであり、限定しようとする意図で解釈されてはならない。単数の表現は、文脈上、明らかに異に意味しない限り、複数の表現を含む。本明細書において、「含む」または「有する」等の用語は、明細書上に記載の特徴、数字、ステップ、動作、構成要素、部品またはこれらを組み合わせたものが存在することを指定しようとするものであり、一つまたはそれ以上の他の特徴や数字、ステップ、動作、構成要素、部品またはこれらを組み合わせたものの存在または付加可能性を予め排除しないものと理解されるべきである。
異に定義されない限り、技術的または科学的な用語を含めてここで使用される全ての用語は、実施例の属する技術の分野における通常の知識を有する者により一般的に理解されるものと同じ意味を有している。一般的に使用される辞書に定義されているような用語は、関連技術の文脈上有する意味と一致する意味を有するものと解釈されるべきであり、本出願において明らかに定義しない限り、理想的であるか過度に形式的な意味に解釈されない。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の一様態によれば、本発明は、第１プローブ及び第２プローブで構成される、ターゲット核酸配列検出用等温単一反応（ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ｏｎｅ－ｐｏｔ ｒｅａｃｔｉｏｎ）プローブセットを提供し、
前記第１プローブは、下記一般式Ｉの構造を有するプロモータープローブ（ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｐｒｏｂｅ、ＰＰ）であり；
３’－Ｘ－Ｙ－５’ （I）
前記一般式（I）において、
前記Ｘは、ＲＮＡ重合酵素が認識できるプロモーター配列を含むステム－ループ構造（Ｓｔｅｍ－ｌｏｏｐ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）部位であり；前記Ｙは、ターゲット核酸配列と相補的な混成化配列を有するＵＨＳ（Ｕｐｓｔｒｅａｍ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ）部位であり；前記ターゲット核酸配列は、ＤＮＡまたはＲＮＡであり；前記Ｘ及びＹは、デオキシリボヌクレオチドであり；
前記第２プローブは、下記一般式IIの構造を有するレポータープローブ（ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｐｒｏｂｅ、ＲＰ）であり；
３’－Ｙ’－Ｚ－５’ （II）
前記一般式（II）において、
前記Ｙ’は、ターゲット核酸配列と相補的な混成化配列を有するＤＨＳ（Ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ）部位であり；前記Ｚは、検出可能なシグナルを発生させる一つの標識（ｌａｂｅｌ）または多数の標識を含む相互作用的標識システムを有するアプタマー配列部位であり；前記ターゲット核酸配列は、ＤＮＡまたはＲＮＡであり；前記Ｙ’及びＺは、デオキシリボヌクレオチドであり；
前記第１プローブ及び第２プローブは、ターゲット核酸配列と混成化された後、ライゲーション（ｌｉｇａｔｉｏｎ）され；前記ライゲーション産物は、ＲＮＡ重合酵素により転写が開始されてシグナルを生成する。
本発明の前記プローブセットを利用する本発明の技術は、「等温単一反応プラットホーム」または「ライゲーション反応を利用した分子診断プラットホーム」等と呼称される。
本発明のプローブセットの第１プローブは、それぞれ一つのオリゴヌクレオチド分子の中に２個の固有の他の部位（ｐｏｒｔｉｏｎ）を含む構造を有する：
ＲＮＡ重合酵素が認識できるプロモーター配列を含むステム－ループ構造（Ｓｔｅｍ－ｌｏｏｐ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）部位であるＸ；及びターゲット核酸配列と相補的な混成化配列を有するＵＨＳ（Ｕｐｓｔｒｅａｍ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ）部位であるＹ。
また、本発明のプローブセットの第２プローブもそれぞれ一つのオリゴヌクレオチド分子の中に２個の固有の他の部位を含む構造を有する：
ターゲット核酸配列と相補的な混成化配列を有するＤＨＳ（Ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ）部位であるＹ’；検出可能なシグナルを発生させる一つの標識（ｌａｂｅｌ）または多数の標識を含む相互作用的標識システムを有するアプタマー配列部位であるＺ。
このような構造は、本発明のプローブセットが一元化されたステップで等温単一反応条件下で短時間で高い検出効果を示すプローブになるようにする。
より具体的に、本発明のプローブデザインは、二つの一本鎖ＤＮＡプローブがターゲット認識配列が露出されるように設計されて等温（例えば、酵素が作用できる温度）でターゲットＲＮＡ／ＤＮＡとプローブセットの混成化を可能とする。混成化配列は、ターゲットＲＮＡ／ＤＮＡに対する混成化を最大化しながら任意の他の構造形成を最小化するようにデザインする。プローブとターゲットＲＮＡ／ＤＮＡとの間の効率的な混成化過程は、等温反応の間、高い敏感度を有するようにする。
第１プローブであるプロモータープローブは、幹－ループ構造（Ｓｔｅｍ－ｌｏｏｐ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）を形成できるようにデザインされ、幹部分は、二本鎖のＲＮＡ重合酵素プロモーター配列を形成してＲＮＡ重合酵素を利用した転写過程が開始されるようにする。二本鎖のＲＮＡ重合酵素プロモーター部分が物理的にループ配列により連結されているため、二本鎖プロモーターが機能できる形態に形成される確率がループ配列により連結されていない場合より高い。従って、プロモータープローブでヘアピン構造が形成された自己組み立てプロモーター配列は、混成化過程及び後続転写過程を効果的に促進できる。
第２プローブであるレポータープローブは、レポーターとしてアプタマー配列を含むようにデザインされ、特定の物質に反応してシグナルを生成するアプタマーにより最終生産物を確認することができる。
本発明において、レポーターとして使用される「アプタマー（Ａｐｔａｍｅｒ）」は、それ自体で安定した三次構造を有しながら標的分子に高い親和性と特異性で結合できる特徴を有する一本鎖核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡまたは変形核酸）である。
ＳＥＬＥＸ（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ ＥＸｐｏｎｅｎｔｉａｌ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）というアプタマー発掘技術が開発された以後、低分子有機物、ペプチド、膜タンパク質まで多様な標的分子に結合できるアプタマーが引き続き発掘されてきた。アプタマーは、固有の高い親和性（普通ｐＭ水準）と特異性で標的分子に結合できるという特性のため、よく単一抗体と比較され、特に「化学抗体」というほど代替抗体としての高い可能性がある。また、結合する物質によって吸収する波長帯と放出される波長帯が異なり、蛍光を発現する等の方法でアプタマーと特定の化学分子の結合を確認することができる。
本発明のアプタマー及び前記アプタマーと相互作用する反応物質は、目的効果として検出可能なシグナルを発生できる限り、いかなる種類のアプタマー及び反応物質を利用してよい。
混成化後、ターゲット核酸配列に混成化された第１プローブ及び第２プローブがライゲーションされる。
即ち、本発明の第１プローブ及び第２プローブがターゲット核酸配列と混成化された以後、ライゲーション作用剤を利用して二つのプローブの間に形成されたニック（ｎｉｃｋ）をライゲーションさせる。
本発明の好ましい具現例によれば、第１プローブ及び第２プローブが前記ターゲット核酸配列とそれぞれ混成化する場合、第１プローブ及び第２プローブは、互いに直に近接した（ｉｍｍｅｄｉａｔｅｌｙ ａｄｊａｃｅｎｔ）位置に位置する。
近接した位置に位置することが二つのプローブの間のライゲーション反応のために必要である。本明細書において、第１プローブ及び第２プローブの混成化位置を言及しながら使用される用語「近接した（ａｄｊａｃｅｎｔ）」は、前記二つのプローブの末端が互いに連結され得るように前記一つのプローブの３’－末端及び残りの一つのプローブの５’－末端が互いに十分に隣接していることを意味する。
酵素性ライゲーションは、第１プローブ及び第２プローブを共有結合で連結させる好ましい方法であるので、用語「ライゲーション」は、本明細書全体的に利用される。
しかし、用語「ライゲーション」は、一般的な用語であり、二つのプローブを共有結合で連結させるいかなる方法も含むというものと理解される。
本発明のライゲーション反応は、非常に多様なライゲーション作用剤を利用して実施され得、酵素性ライゲーション作用剤及び非－酵素性ライゲーション作用剤（例えば、化学的作用剤及びフォトライゲーション作用剤）を含む。
化学的ライゲーション作用剤は、カルボジイミド、ＢｒＣＮ（ｃｙａｎｏｇｅｎ ｂｒｏｍｉｄｅ）、Ｎ－シアノイミダゾール、イミダゾール、１－メチルイミダゾール／カルボジイミド／シスタミン、ＤＴＴ（ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）及びウルトラバイオレットライトのような活性剤、凝縮剤及び還元剤を含むが、これに限定されるものではない。
また、オートライゲーション、即ち、ライゲーション作用剤の不存在下での自発的ライゲーションも本発明の教示範囲に含まれる。化学的ライゲーション方法の詳細なプロトコル及び適切な作用基の詳細な説明は、Ｘｕ等、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２７：８７５－８１（１９９９）；Ｇｒｙａｚｎｏｖ ａｎｄ Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２１：１４０３－０８（１９９３）；Ｇｒｙａｚｎｏｖ等、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．２２：２３６６－６９（１９９４）；ＫａｎａｙａとＹａｎａｇａｗａ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２５：７４２３－３０（１９８６）；ＬｕｅｂｋｅとＤｅｒｖａｎ、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０：３００５－０９（１９９２）；Ｓｉｅｖｅｒｓとｖｏｎ Ｋｉｅｄｒｏｗｓｋｉ、Ｎａｔｕｒｅ ３６９：２２１－２４（１９９４）；ＬｉｕとＴａｙｌｏｒ、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２６：３３００－０４（１９９９）；ＷａｎｇとＫｏｏｌ、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２：２３２６－３３（１９９４）から見つけることができる。
ライゲーション作用剤として適した波長の光を利用したフォトライゲーションもまた本発明の教示範囲に含まれる。本発明の具現例によれば、フォトライゲーションは、ヌクレオチドアナログを含むプローブを含み、ｓ４Ｔ（４－ｔｈｉｏｔｈｙｍｉｄｉｎｅ）、５－ビニルウラシル及びその類似物またはこれらの組み合わせ物を含むが、これに限定されるものではない。
本発明の好ましい具現例によれば、ライゲーション反応は、酵素性ライゲーション作用剤によるものであり、前記ライゲーション作用剤は、ＳｐｌｉｎｔＲリガーゼ、バクテリオファージＴ４リガーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉリガーゼ、Ａｆｕリガーゼ、Ｔａｑリガーゼ、Ｔｆｌリガーゼ、Ｍｔｈリガーゼ、Ｔｔｈリガーゼ、Ｔｔｈ ＨＢ８リガーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｓｐｅｃｉｅｓ ＡＫ１６Ｄリガーゼ、Ａｐｅリガーゼ、ＬｉｇＴｋリガーゼ、Ａａｅリガーゼ、Ｒｍリガーゼ、Ｐｆｕリガーゼ、リボザイム（ｒｉｂｏｚｙｍｅ）及びその変異体からなる群から選択された１種を利用して実施される。
ライゲーションにより生成されたヌクレオチド間連結（ｉｎｔｅｒｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｌｉｎｋａｇｅ）は、ホスホジエステル結合及び他の連結を含む。例えば、リガーゼを利用したライゲーションは、一般的にホスホジエステル結合を生成する。
ライゲーションのための非－酵素性方法は、他のヌクレオチド間連結を形成することができる。他のヌクレオチド間連結は、α－ハロアシル基及びホスホチオエート基の間に形成されるチオホスホリルアセチルアミノ基、ホスホチオエート基及びトシレート基またはアイオダイド基の間に形成される５’－ホスホロチオエステル、及びピロホスフェート連結のような適した反応基の間の共有結合の形成を含むが、これに限定されるものではない。
ライゲーション反応後、その結果物であるライゲーション産物は、アプタマー配列を含み、ターゲットＲＮＡ／ＤＮＡを増幅させるための鋳型として一本鎖ＤＮＡとなる。
次いで、ＲＮＡ重合酵素により転写過程が開始されると、前記アプタマー配列を含有するターゲットＲＮＡ／ＤＮＡを増幅させるための鋳型である一本鎖ＤＮＡからターゲットＲＮＡ／ＤＮＡが延び、特定の化学分子と結合することで蛍光を示すように導入されたアプタマーにより速やかで簡単にシグナルが生成される。
また、従来の蛍光タンパク質を利用する蛍光シグナルと比較したとき、ＲＮＡアプタマーをレポーターとして使用した場合、生成されたシグナルを観察するのにかかる時間が短縮される。
仮に、第１プローブ及び第２プローブが前記のように実施されなければ、最終的に第１プローブ及び第２プローブの転写結果物上の標識から出るシグナルが生成されないので、ターゲット核酸配列検出は達成されない。
本発明の前記ＲＮＡ重合酵素は、目的効果として転写を開始できるようにプロモーター部位を認識できる限り、いかなる種類のＲＮＡ重合酵素も利用できる。
好ましくは、前記ＲＮＡ重合酵素は、バクテリオファージＴ７ ＲＮＡ重合酵素、バクテリオファージＴ３重合酵素、バクテリオファージＲＮＡ重合酵素、バクテリオファージΦII重合酵素、サルモネラバクテリオファージｓｐ６重合酵素、シュードモナスバクテリオファージｇｈ－１重合酵素、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＲＮＡ重合酵素ホロ酵素（ｈｏｌｏｅｎｚｙｍｅ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＲＮＡ重合酵素コア酵素、ヒトＲＮＡ重合酵素Ｉ、ヒトＲＮＡ重合酵素ＩＩ、ヒトＲＮＡ重合酵素III、ヒトミトコンドリアＲＮＡ重合酵素及びその変異体からなる群から選択され得るが、これに限定されない。
本発明の一実施例においては、バクテリオファージＴ７ ＲＮＡ重合酵素を利用した。
同様に、ＲＮＡ重合酵素により転写が開始され得る限り、ＲＮＡ重合酵素が認識する本発明の第１プローブ内のプロモーター部位は、当業界に公知になった任意のプロモーター配列を利用できる。
本発明の等温単一反応の最適化のために、ライゲーション作用剤及び重合酵素は適切に調節され得、好ましくは、単一反応溶液内１：１～１：５ｕｎｉｔ、より好ましくは１：４ｕｎｉｔ、最も好ましくは１：１ｕｎｉｔで含まれ得る。
本発明の好ましい具現例によれば、前記標識は、化学的標識、酵素標識、放射能標識、蛍光標識、発光標識、化学発光標識及び金属標識からなる群から選択され得る。
本発明の前記等温単一反応は、別途の増幅反応なしに、１５℃～５０℃の範囲の温度のいずれか一つの指定された温度に一元化して同時遂行される。
前記１５℃～５０℃の範囲の温度は、当業界に酵素が作用するものと知られた温度であって、本発明の目的効果を獲得できる限り、これに制限されない。
本発明の一実施例においては、好ましくは、前記指定された温度は、３７℃である。
また、前記等温単一反応は、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＮＴＰｓ、ＮａＣｌ及びＥＴ－ＳＳＢ（Ｅｘｔｒｅｍｅ Ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ Ｓｉｎｇｌｅ－Ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ）が含まれた単一反応溶液に一元化されて同時遂行される。
本発明において、前記単一反応溶液は、好ましくは、１～１００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ；１～５０ｍＭ ＭｇＣｌ２；０．１～１０ｍＭ ＮＴＰｓ及び１～５０ｍＭ ＮａＣｌ；及び１～８００ｎｇ ＥＴ－ＳＳＢを含み、より好ましくは、１０～６０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ；１～３０ｍＭ ＭｇＣｌ２；０．５～５ｍＭ ＮＴＰｓ；１～３０ｍＭ ＮａＣｌ；及び１００～６００ｎｇ ＥＴ－ＳＳＢを含み、最も好ましくは、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ；１０ｍＭ ＭｇＣｌ２；１ｍＭ ＮＴＰｓ；１０．５ｍＭ ＮａＣｌ；及び４００ｎｇ ＥＴ－ＳＳＢを含む。
本発明の他の様態によれば、本発明は、次のステップを含む、別途の増幅反応なしに、等温単一反応条件下でターゲット核酸配列を検出する方法を提供する：
（ａ）サンプルに、上述した第１プローブ及び第２プローブで構成されるターゲット核酸配列検出用等温単一反応（ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ｏｎｅ－ｐｏｔ ｒｅａｃｔｉｏｎ）プローブセットを処理してターゲット核酸配列と混成化させるステップ；
（ｂ）前記（ａ）ステップの混成化産物にライゲーション作用剤を処理して前記プローブセットの第１プローブ及び第２プローブをライゲーションさせ、前記ライゲーション産物に重合酵素を処理して転写を開始させるステップ；及び
（ｃ）前記（ｂ）ステップの転写産物にアプタマー－反応物質を処理して転写産物内のアプタマーのシグナル生成を検出するステップであって、前記シグナル生成は、サンプル中のターゲット核酸配列の存在を示す。
本発明の前記等温単一反応は、別途の増幅反応なしに、１５℃～５０℃の範囲の温度のいずれか一つの指定された温度に一元化して同時遂行され、好ましくは、前記指定された温度は、３７℃である。
前記等温単一反応は、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＮＴＰｓ、ＮａＣｌ及びＥＴ－ＳＳＢ（Ｅｘｔｒｅｍｅ Ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ Ｓｉｎｇｌｅ－Ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ）が含まれた単一反応溶液に一元化されて同時遂行される。
また、本発明は、さらなる別個の増幅過程（例えば、ＰＣＲ）が要求されず、単一等温反応が起こる過程で増幅過程が自動的に実施されることを特徴とする。
このような増幅過程が含まれている単一等温反応が可能である理由は、（i）ヘアピン構造を持つ二本鎖のプロモーター配列を含む第１プローブとライゲーション反応が起こってはじめて下流に存在するアプタマーが形成されるように設計した第２プローブのデザインのためであり；（ii）ライゲーションされた産物が転写開始を通した転写されたとき、ターゲット配列（即ち、副木）のように使用され得ることを利用して別途の増幅過程がなくても反応内で自然的に増幅過程が起こるためである。
即ち、第１プローブと第２プローブのライゲーション反応が起こったライゲーション産物がヘアピン構造を形成する第１プローブのＲＮＡ重合酵素プロモーター配列から転写開始が起こって転写体が作られると、前記転写体は、ターゲットＲＮＡ配列と同じ配列を含んでいるので、ターゲットＲＮＡのように使用され得る。また、転写されたライゲーション産物は、ターゲット核酸配列のような配列を含んでいるので、ターゲット核酸の中でもターゲットＲＮＡとして作用され得るものである。
従って、本発明のプローブセットを利用するプラットホームは、ライゲーション、転写反応、蛍光反応まで同時に起こるように設計されたものであり、併せてライゲーションされた産物の転写反応が起こった転写体が副木ＲＮＡとして使用されて増幅過程が含まれている単一等温反応であるものである。
従って、本発明の（ａ）～（ｃ）ステップは、一つの容器、例えば、チューブ内で同時に遂行可能である。
本発明において、ＤＮＡプローブの配列は、目的効果を達成する限り、本発明の実施例に記載の配列に制限されず、全てのターゲット遺伝子配列に適用が可能である。また、最終信号確認に使用されるアプタマーは、マラカイトグリーンアプタマーに制限せず、いかなる種類のＲＮＡ基盤の蛍光アプタマーも使用可能である。
本発明の一実施例によれば、１）作製した二つのＤＮＡプローブとターゲットＲＮＡ、ＳｐｌｉｎｔＲリガーゼを使用したライゲーションステップ、２）前記ライゲーションされたプローブアセンブリをＴ７ ＲＮＡ重合酵素を通した転写産物を作り出すステップ、３）前記生成された転写産物の下流に存在するアプタマーが特定の化学分子に結合して蛍光の強さで検出有無を確認するステップを含む特定の疾病の感染有無を見出すことができる分子診断法を提供する。これに対する図式を図６に示した。
本発明の他の様態によれば、本発明は、上述した第１プローブ及び第２プローブで構成されるターゲット核酸配列検出用等温単一反応プローブセット；ライゲーション作用剤、重合酵素及び等温単一反応溶液を含むターゲット核酸配列検出用組成物を提供する。
本発明の好ましい具現例によれば、前記組成物は、２種以上のターゲット核酸配列検出用等温単一反応プローブセットを含むことができる。
前記２種以上のターゲット核酸配列検出用等温単一反応プローブセットは、それぞれ互いに異なる相互作用的標識システムを含み；前記２種以上のプローブセットそれぞれは、それぞれ互いに異なるターゲット核酸配列に結合して；これによって互いに異なるターゲット核酸配列の多重検出が可能である。
即ち、前記２種以上のターゲットは、相互作用的に異なる分子診断対象、例えば、感染性有害微生物であってよく、この場合、互いに異なる病原体を同時検出及び診断が可能である。
また、前記２種以上のターゲットは、単一病原体に存在する互いに異なるターゲット部位であってよく、この場合、ターゲットの異なる部位を効果的に検出してさらに正確かつ精密な診断が可能である。
本発明の組成物は、上述された本発明のプローブセットによるターゲット核酸配列検出を実施するために作製されるため、重複した内容は、本明細書の複雑性を避けるために、その記載を省略する。
本発明のまた他の様態によれば、本発明は、上述したターゲット核酸配列検出用組成物を含む、ターゲット核酸配列検出用キットを提供する。
本明細書において上述した本発明のキットは、さらに、多様なポリヌクレオチド分子、酵素、多様なバッファ及び試薬を含むことができる。また、本発明のキットは、陽性対照群及び陰性対照群反応を実施するのに必須な試薬を含むことができる。ある一つの特定の反応で使用される試薬の最適量は、本明細書に開示事項を習得した当業者によって容易に決定され得る。
典型的に、本発明のキットは、先に言及された構成成分を含む別途の包装または区分で作製される。
本発明のキットは、上述された本発明のプローブセットによるターゲット核酸配列検出を実施するために作製されるため、重複した内容は、本明細書の複雑性を避けるために、その記載を省略する。
本発明のまた他の様態によれば、本発明は、次のステップを含む、別途の増幅反応なしに、等温単一反応条件下での現場用分子診断方法を提供する：
（ａ）サンプルに、上述した第１プローブ及び第２プローブで構成されるターゲット核酸配列検出用等温単一反応（ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ｏｎｅ－ｐｏｔ ｒｅａｃｔｉｏｎ）プローブセットを処理してターゲット核酸配列と混成化させるステップ；
（ｂ）前記（ａ）ステップの混成化産物にライゲーション作用剤を処理して前記プローブセットの第１プローブ及び第２プローブをライゲーションさせ、前記ライゲーション産物に重合酵素を処理して転写を開始させるステップ；及び
（ｃ）前記（ｂ）ステップの転写産物にアプタマー－反応物質を処理して転写産物内のアプタマーのシグナル生成を検出するステップであって、前記シグナル生成は、サンプル中のターゲット核酸配列の存在を示す。
本発明の方法により診断され得る限り、前記ターゲットの種類は制限されない。
本発明においては、好ましくは、感染性有害微生物である。
前記感染性有害微生物は、スタフィロコッカスアウレウス（ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓＡｕｒｅｕｓ）、ビブリオバルニフィカス（Ｖｉｂｒｉｏ ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、中東呼吸器症候群コロナウイルス（Ｍｉｄｄｌｅ Ｅａｓｔ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ）、インフルエンザＡウイルス（Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ ｖｉｒｕｓ）、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス（Ｓｅｖｅｒｅ Ａｃｕｔｅ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ）、呼吸器細胞融合ウイルス（ＲＳＶ）、ヒト免疫欠乏ウイルス（ＨＩＶ）、ヘルペスシンプレックスウイルス（ＨＳＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、ヒトパラインフルエンザウイルス（ＨＰＩＶ）、デング熱ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ Ｖｉｒｕｓ（ＨＢＶ））、黄熱病ウイルス、狂犬病ウイルス、プラスモジウム、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ミコバクテリウムチュバクローシス、クラミジアトラコマチス、ロタウイルス、ヒトメタニューモウイルス（ｈＭＰＶ）、クリミアコンゴ出血熱ウイルス（Ｃｒｉｍｅａｎ－Ｃｏｎｇｏ ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ ｆｅｖｅｒ ｖｉｒｕｓ）、エボラウイルス、ジカウイルス、ヘニパウイルス、ノロウイルス、ラッサウイルス、ライノウイルス、フラビウイルス、リフトバレー熱ウイルス、手足口病ウイルス、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐ．）、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｐ．）、エンテロバクテリアセアエ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ ｓｐ．）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）、モラクセラ（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｓｐ．）、ヘリコバクター（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）及びステノトロホモナス（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）からなる群から選択された１種以上であってよい。
本発明の方法は、２種以上のターゲット核酸配列検出用等温単一反応プローブセットを設計し、それを利用して２種以上のターゲット核酸配列を現場で速やかで正確に検出できる。
本発明の一実施例において、本発明者らは、高度にモジュール化されたプローブ構造を基盤に最小限の設計だけを利用して６個の病原体に適用し、成功的に多重－検出及び診断した。
従って、本発明のプローブセットは、ターゲット核酸配列の長さが適切であれば、いかなるＲＮＡ／ＤＮＡからデザインされ得るので、このような特徴により伝染病の発生に速やかに対応でき、抗体基盤診断に比して相当な利点を提供する。
即ち、本発明のプローブセットを利用したターゲット配列検出プラットホームは、目的対象のＲＮＡ／ＤＮＡ探知のための強力な診断プラットホームとして作用して短い診断時間、高い感度及び特異度（ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）及び簡単な分析手順を提供するだけではなく、高価な機器及び診断専門家を要しないので、速やかな対応が必要な新種の感染病に適した診断方法になるだろう。
また、このような高度にモジュール化された構造を有する本発明の第１プローブ及び第２プローブのプローブセットは、多重ターゲット検出において偽陽性及び偽陰性結果から完壁に自由になる。
本発明の方法は、上述した本発明のプローブセットを含むので、重複した内容は、本明細書の過度な複雑性を避けるために、その記載を省略する。
異に定義されない限り、技術的または科学的な用語を含めてここで使用される全ての用語は、実施例の属する技術の分野における通常の知識を有する者により一般的に理解されるものと同じ意味を有している。一般的に使用される辞書に定義されているような用語は、関連技術の文脈上有する意味と一致する意味を有するものと解釈されるべきであり、本出願において明らかに定義しない限り、理想的であるか過度に形式的な意味に解釈されない。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の一様態によれば、本発明は、第１プローブ及び第２プローブで構成される、ターゲット核酸配列検出用等温単一反応（ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ｏｎｅ－ｐｏｔ ｒｅａｃｔｉｏｎ）プローブセットを提供し、
前記第１プローブは、下記一般式Ｉの構造を有するプロモータープローブ（ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｐｒｏｂｅ、ＰＰ）であり；
３’－Ｘ－Ｙ－５’ （I）
前記一般式（I）において、
前記Ｘは、ＲＮＡ重合酵素が認識できるプロモーター配列を含むステム－ループ構造（Ｓｔｅｍ－ｌｏｏｐ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）部位であり；前記Ｙは、ターゲット核酸配列と相補的な混成化配列を有するＵＨＳ（Ｕｐｓｔｒｅａｍ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ）部位であり；前記ターゲット核酸配列は、ＤＮＡまたはＲＮＡであり；前記Ｘ及びＹは、デオキシリボヌクレオチドであり；
前記第２プローブは、下記一般式IIの構造を有するレポータープローブ（ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｐｒｏｂｅ、ＲＰ）であり；
３’－Ｙ’－Ｚ－５’ （II）
前記一般式（II）において、
前記Ｙ’は、ターゲット核酸配列と相補的な混成化配列を有するＤＨＳ（Ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ）部位であり；前記Ｚは、検出可能なシグナルを発生させる一つの標識（ｌａｂｅｌ）または多数の標識を含む相互作用的標識システムを有するアプタマー配列部位であり；前記ターゲット核酸配列は、ＤＮＡまたはＲＮＡであり；前記Ｙ’及びＺは、デオキシリボヌクレオチドであり；
前記第１プローブ及び第２プローブは、ターゲット核酸配列と混成化された後、ライゲーション（ｌｉｇａｔｉｏｎ）され；前記ライゲーション産物は、ＲＮＡ重合酵素により転写が開始されてシグナルを生成する。
本発明の前記プローブセットを利用する本発明の技術は、「等温単一反応プラットホーム」または「ライゲーション反応を利用した分子診断プラットホーム」等と呼称される。
本発明のプローブセットの第１プローブは、それぞれ一つのオリゴヌクレオチド分子の中に２個の固有の他の部位（ｐｏｒｔｉｏｎ）を含む構造を有する：
ＲＮＡ重合酵素が認識できるプロモーター配列を含むステム－ループ構造（Ｓｔｅｍ－ｌｏｏｐ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）部位であるＸ；及びターゲット核酸配列と相補的な混成化配列を有するＵＨＳ（Ｕｐｓｔｒｅａｍ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ）部位であるＹ。
また、本発明のプローブセットの第２プローブもそれぞれ一つのオリゴヌクレオチド分子の中に２個の固有の他の部位を含む構造を有する：
ターゲット核酸配列と相補的な混成化配列を有するＤＨＳ（Ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ）部位であるＹ’；検出可能なシグナルを発生させる一つの標識（ｌａｂｅｌ）または多数の標識を含む相互作用的標識システムを有するアプタマー配列部位であるＺ。
このような構造は、本発明のプローブセットが一元化されたステップで等温単一反応条件下で短時間で高い検出効果を示すプローブになるようにする。
より具体的に、本発明のプローブデザインは、二つの一本鎖ＤＮＡプローブがターゲット認識配列が露出されるように設計されて等温（例えば、酵素が作用できる温度）でターゲットＲＮＡ／ＤＮＡとプローブセットの混成化を可能とする。混成化配列は、ターゲットＲＮＡ／ＤＮＡに対する混成化を最大化しながら任意の他の構造形成を最小化するようにデザインする。プローブとターゲットＲＮＡ／ＤＮＡとの間の効率的な混成化過程は、等温反応の間、高い敏感度を有するようにする。
第１プローブであるプロモータープローブは、幹－ループ構造（Ｓｔｅｍ－ｌｏｏｐ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）を形成できるようにデザインされ、幹部分は、二本鎖のＲＮＡ重合酵素プロモーター配列を形成してＲＮＡ重合酵素を利用した転写過程が開始されるようにする。二本鎖のＲＮＡ重合酵素プロモーター部分が物理的にループ配列により連結されているため、二本鎖プロモーターが機能できる形態に形成される確率がループ配列により連結されていない場合より高い。従って、プロモータープローブでヘアピン構造が形成された自己組み立てプロモーター配列は、混成化過程及び後続転写過程を効果的に促進できる。
第２プローブであるレポータープローブは、レポーターとしてアプタマー配列を含むようにデザインされ、特定の物質に反応してシグナルを生成するアプタマーにより最終生産物を確認することができる。
本発明において、レポーターとして使用される「アプタマー（Ａｐｔａｍｅｒ）」は、それ自体で安定した三次構造を有しながら標的分子に高い親和性と特異性で結合できる特徴を有する一本鎖核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡまたは変形核酸）である。
ＳＥＬＥＸ（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ ＥＸｐｏｎｅｎｔｉａｌ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）というアプタマー発掘技術が開発された以後、低分子有機物、ペプチド、膜タンパク質まで多様な標的分子に結合できるアプタマーが引き続き発掘されてきた。アプタマーは、固有の高い親和性（普通ｐＭ水準）と特異性で標的分子に結合できるという特性のため、よく単一抗体と比較され、特に「化学抗体」というほど代替抗体としての高い可能性がある。また、結合する物質によって吸収する波長帯と放出される波長帯が異なり、蛍光を発現する等の方法でアプタマーと特定の化学分子の結合を確認することができる。
本発明のアプタマー及び前記アプタマーと相互作用する反応物質は、目的効果として検出可能なシグナルを発生できる限り、いかなる種類のアプタマー及び反応物質を利用してよい。
混成化後、ターゲット核酸配列に混成化された第１プローブ及び第２プローブがライゲーションされる。
即ち、本発明の第１プローブ及び第２プローブがターゲット核酸配列と混成化された以後、ライゲーション作用剤を利用して二つのプローブの間に形成されたニック（ｎｉｃｋ）をライゲーションさせる。
本発明の好ましい具現例によれば、第１プローブ及び第２プローブが前記ターゲット核酸配列とそれぞれ混成化する場合、第１プローブ及び第２プローブは、互いに直に近接した（ｉｍｍｅｄｉａｔｅｌｙ ａｄｊａｃｅｎｔ）位置に位置する。
近接した位置に位置することが二つのプローブの間のライゲーション反応のために必要である。本明細書において、第１プローブ及び第２プローブの混成化位置を言及しながら使用される用語「近接した（ａｄｊａｃｅｎｔ）」は、前記二つのプローブの末端が互いに連結され得るように前記一つのプローブの３’－末端及び残りの一つのプローブの５’－末端が互いに十分に隣接していることを意味する。
酵素性ライゲーションは、第１プローブ及び第２プローブを共有結合で連結させる好ましい方法であるので、用語「ライゲーション」は、本明細書全体的に利用される。
しかし、用語「ライゲーション」は、一般的な用語であり、二つのプローブを共有結合で連結させるいかなる方法も含むというものと理解される。
本発明のライゲーション反応は、非常に多様なライゲーション作用剤を利用して実施され得、酵素性ライゲーション作用剤及び非－酵素性ライゲーション作用剤（例えば、化学的作用剤及びフォトライゲーション作用剤）を含む。
化学的ライゲーション作用剤は、カルボジイミド、ＢｒＣＮ（ｃｙａｎｏｇｅｎ ｂｒｏｍｉｄｅ）、Ｎ－シアノイミダゾール、イミダゾール、１－メチルイミダゾール／カルボジイミド／シスタミン、ＤＴＴ（ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）及びウルトラバイオレットライトのような活性剤、凝縮剤及び還元剤を含むが、これに限定されるものではない。
また、オートライゲーション、即ち、ライゲーション作用剤の不存在下での自発的ライゲーションも本発明の教示範囲に含まれる。化学的ライゲーション方法の詳細なプロトコル及び適切な作用基の詳細な説明は、Ｘｕ等、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２７：８７５－８１（１９９９）；Ｇｒｙａｚｎｏｖ ａｎｄ Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２１：１４０３－０８（１９９３）；Ｇｒｙａｚｎｏｖ等、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．２２：２３６６－６９（１９９４）；ＫａｎａｙａとＹａｎａｇａｗａ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２５：７４２３－３０（１９８６）；ＬｕｅｂｋｅとＤｅｒｖａｎ、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０：３００５－０９（１９９２）；Ｓｉｅｖｅｒｓとｖｏｎ Ｋｉｅｄｒｏｗｓｋｉ、Ｎａｔｕｒｅ ３６９：２２１－２４（１９９４）；ＬｉｕとＴａｙｌｏｒ、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２６：３３００－０４（１９９９）；ＷａｎｇとＫｏｏｌ、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２：２３２６－３３（１９９４）から見つけることができる。
ライゲーション作用剤として適した波長の光を利用したフォトライゲーションもまた本発明の教示範囲に含まれる。本発明の具現例によれば、フォトライゲーションは、ヌクレオチドアナログを含むプローブを含み、ｓ４Ｔ（４－ｔｈｉｏｔｈｙｍｉｄｉｎｅ）、５－ビニルウラシル及びその類似物またはこれらの組み合わせ物を含むが、これに限定されるものではない。
本発明の好ましい具現例によれば、ライゲーション反応は、酵素性ライゲーション作用剤によるものであり、前記ライゲーション作用剤は、ＳｐｌｉｎｔＲリガーゼ、バクテリオファージＴ４リガーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉリガーゼ、Ａｆｕリガーゼ、Ｔａｑリガーゼ、Ｔｆｌリガーゼ、Ｍｔｈリガーゼ、Ｔｔｈリガーゼ、Ｔｔｈ ＨＢ８リガーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｓｐｅｃｉｅｓ ＡＫ１６Ｄリガーゼ、Ａｐｅリガーゼ、ＬｉｇＴｋリガーゼ、Ａａｅリガーゼ、Ｒｍリガーゼ、Ｐｆｕリガーゼ、リボザイム（ｒｉｂｏｚｙｍｅ）及びその変異体からなる群から選択された１種を利用して実施される。
ライゲーションにより生成されたヌクレオチド間連結（ｉｎｔｅｒｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｌｉｎｋａｇｅ）は、ホスホジエステル結合及び他の連結を含む。例えば、リガーゼを利用したライゲーションは、一般的にホスホジエステル結合を生成する。
ライゲーションのための非－酵素性方法は、他のヌクレオチド間連結を形成することができる。他のヌクレオチド間連結は、α－ハロアシル基及びホスホチオエート基の間に形成されるチオホスホリルアセチルアミノ基、ホスホチオエート基及びトシレート基またはアイオダイド基の間に形成される５’－ホスホロチオエステル、及びピロホスフェート連結のような適した反応基の間の共有結合の形成を含むが、これに限定されるものではない。
ライゲーション反応後、その結果物であるライゲーション産物は、アプタマー配列を含み、ターゲットＲＮＡ／ＤＮＡを増幅させるための鋳型として一本鎖ＤＮＡとなる。
次いで、ＲＮＡ重合酵素により転写過程が開始されると、前記アプタマー配列を含有するターゲットＲＮＡ／ＤＮＡを増幅させるための鋳型である一本鎖ＤＮＡからターゲットＲＮＡ／ＤＮＡが延び、特定の化学分子と結合することで蛍光を示すように導入されたアプタマーにより速やかで簡単にシグナルが生成される。
また、従来の蛍光タンパク質を利用する蛍光シグナルと比較したとき、ＲＮＡアプタマーをレポーターとして使用した場合、生成されたシグナルを観察するのにかかる時間が短縮される。
仮に、第１プローブ及び第２プローブが前記のように実施されなければ、最終的に第１プローブ及び第２プローブの転写結果物上の標識から出るシグナルが生成されないので、ターゲット核酸配列検出は達成されない。
本発明の前記ＲＮＡ重合酵素は、目的効果として転写を開始できるようにプロモーター部位を認識できる限り、いかなる種類のＲＮＡ重合酵素も利用できる。
好ましくは、前記ＲＮＡ重合酵素は、バクテリオファージＴ７ ＲＮＡ重合酵素、バクテリオファージＴ３重合酵素、バクテリオファージＲＮＡ重合酵素、バクテリオファージΦII重合酵素、サルモネラバクテリオファージｓｐ６重合酵素、シュードモナスバクテリオファージｇｈ－１重合酵素、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＲＮＡ重合酵素ホロ酵素（ｈｏｌｏｅｎｚｙｍｅ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＲＮＡ重合酵素コア酵素、ヒトＲＮＡ重合酵素Ｉ、ヒトＲＮＡ重合酵素ＩＩ、ヒトＲＮＡ重合酵素III、ヒトミトコンドリアＲＮＡ重合酵素及びその変異体からなる群から選択され得るが、これに限定されない。
本発明の一実施例においては、バクテリオファージＴ７ ＲＮＡ重合酵素を利用した。
同様に、ＲＮＡ重合酵素により転写が開始され得る限り、ＲＮＡ重合酵素が認識する本発明の第１プローブ内のプロモーター部位は、当業界に公知になった任意のプロモーター配列を利用できる。
本発明の等温単一反応の最適化のために、ライゲーション作用剤及び重合酵素は適切に調節され得、好ましくは、単一反応溶液内１：１～１：５ｕｎｉｔ、より好ましくは１：４ｕｎｉｔ、最も好ましくは１：１ｕｎｉｔで含まれ得る。
本発明の好ましい具現例によれば、前記標識は、化学的標識、酵素標識、放射能標識、蛍光標識、発光標識、化学発光標識及び金属標識からなる群から選択され得る。
本発明の前記等温単一反応は、別途の増幅反応なしに、１５℃～５０℃の範囲の温度のいずれか一つの指定された温度に一元化して同時遂行される。
前記１５℃～５０℃の範囲の温度は、当業界に酵素が作用するものと知られた温度であって、本発明の目的効果を獲得できる限り、これに制限されない。
本発明の一実施例においては、好ましくは、前記指定された温度は、３７℃である。
また、前記等温単一反応は、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＮＴＰｓ、ＮａＣｌ及びＥＴ－ＳＳＢ（Ｅｘｔｒｅｍｅ Ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ Ｓｉｎｇｌｅ－Ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ）が含まれた単一反応溶液に一元化されて同時遂行される。
本発明において、前記単一反応溶液は、好ましくは、１～１００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ；１～５０ｍＭ ＭｇＣｌ２；０．１～１０ｍＭ ＮＴＰｓ及び１～５０ｍＭ ＮａＣｌ；及び１～８００ｎｇ ＥＴ－ＳＳＢを含み、より好ましくは、１０～６０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ；１～３０ｍＭ ＭｇＣｌ２；０．５～５ｍＭ ＮＴＰｓ；１～３０ｍＭ ＮａＣｌ；及び１００～６００ｎｇ ＥＴ－ＳＳＢを含み、最も好ましくは、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ；１０ｍＭ ＭｇＣｌ２；１ｍＭ ＮＴＰｓ；１０．５ｍＭ ＮａＣｌ；及び４００ｎｇ ＥＴ－ＳＳＢを含む。
本発明の他の様態によれば、本発明は、次のステップを含む、別途の増幅反応なしに、等温単一反応条件下でターゲット核酸配列を検出する方法を提供する：
（ａ）サンプルに、上述した第１プローブ及び第２プローブで構成されるターゲット核酸配列検出用等温単一反応（ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ｏｎｅ－ｐｏｔ ｒｅａｃｔｉｏｎ）プローブセットを処理してターゲット核酸配列と混成化させるステップ；
（ｂ）前記（ａ）ステップの混成化産物にライゲーション作用剤を処理して前記プローブセットの第１プローブ及び第２プローブをライゲーションさせ、前記ライゲーション産物に重合酵素を処理して転写を開始させるステップ；及び
（ｃ）前記（ｂ）ステップの転写産物にアプタマー－反応物質を処理して転写産物内のアプタマーのシグナル生成を検出するステップであって、前記シグナル生成は、サンプル中のターゲット核酸配列の存在を示す。
本発明の前記等温単一反応は、別途の増幅反応なしに、１５℃～５０℃の範囲の温度のいずれか一つの指定された温度に一元化して同時遂行され、好ましくは、前記指定された温度は、３７℃である。
前記等温単一反応は、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＮＴＰｓ、ＮａＣｌ及びＥＴ－ＳＳＢ（Ｅｘｔｒｅｍｅ Ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ Ｓｉｎｇｌｅ－Ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ）が含まれた単一反応溶液に一元化されて同時遂行される。
また、本発明は、さらなる別個の増幅過程（例えば、ＰＣＲ）が要求されず、単一等温反応が起こる過程で増幅過程が自動的に実施されることを特徴とする。
このような増幅過程が含まれている単一等温反応が可能である理由は、（i）ヘアピン構造を持つ二本鎖のプロモーター配列を含む第１プローブとライゲーション反応が起こってはじめて下流に存在するアプタマーが形成されるように設計した第２プローブのデザインのためであり；（ii）ライゲーションされた産物が転写開始を通した転写されたとき、ターゲット配列（即ち、副木）のように使用され得ることを利用して別途の増幅過程がなくても反応内で自然的に増幅過程が起こるためである。
即ち、第１プローブと第２プローブのライゲーション反応が起こったライゲーション産物がヘアピン構造を形成する第１プローブのＲＮＡ重合酵素プロモーター配列から転写開始が起こって転写体が作られると、前記転写体は、ターゲットＲＮＡ配列と同じ配列を含んでいるので、ターゲットＲＮＡのように使用され得る。また、転写されたライゲーション産物は、ターゲット核酸配列のような配列を含んでいるので、ターゲット核酸の中でもターゲットＲＮＡとして作用され得るものである。
従って、本発明のプローブセットを利用するプラットホームは、ライゲーション、転写反応、蛍光反応まで同時に起こるように設計されたものであり、併せてライゲーションされた産物の転写反応が起こった転写体が副木ＲＮＡとして使用されて増幅過程が含まれている単一等温反応であるものである。
従って、本発明の（ａ）～（ｃ）ステップは、一つの容器、例えば、チューブ内で同時に遂行可能である。
本発明において、ＤＮＡプローブの配列は、目的効果を達成する限り、本発明の実施例に記載の配列に制限されず、全てのターゲット遺伝子配列に適用が可能である。また、最終信号確認に使用されるアプタマーは、マラカイトグリーンアプタマーに制限せず、いかなる種類のＲＮＡ基盤の蛍光アプタマーも使用可能である。
本発明の一実施例によれば、１）作製した二つのＤＮＡプローブとターゲットＲＮＡ、ＳｐｌｉｎｔＲリガーゼを使用したライゲーションステップ、２）前記ライゲーションされたプローブアセンブリをＴ７ ＲＮＡ重合酵素を通した転写産物を作り出すステップ、３）前記生成された転写産物の下流に存在するアプタマーが特定の化学分子に結合して蛍光の強さで検出有無を確認するステップを含む特定の疾病の感染有無を見出すことができる分子診断法を提供する。これに対する図式を図６に示した。
本発明の他の様態によれば、本発明は、上述した第１プローブ及び第２プローブで構成されるターゲット核酸配列検出用等温単一反応プローブセット；ライゲーション作用剤、重合酵素及び等温単一反応溶液を含むターゲット核酸配列検出用組成物を提供する。
本発明の好ましい具現例によれば、前記組成物は、２種以上のターゲット核酸配列検出用等温単一反応プローブセットを含むことができる。
前記２種以上のターゲット核酸配列検出用等温単一反応プローブセットは、それぞれ互いに異なる相互作用的標識システムを含み；前記２種以上のプローブセットそれぞれは、それぞれ互いに異なるターゲット核酸配列に結合して；これによって互いに異なるターゲット核酸配列の多重検出が可能である。
即ち、前記２種以上のターゲットは、相互作用的に異なる分子診断対象、例えば、感染性有害微生物であってよく、この場合、互いに異なる病原体を同時検出及び診断が可能である。
また、前記２種以上のターゲットは、単一病原体に存在する互いに異なるターゲット部位であってよく、この場合、ターゲットの異なる部位を効果的に検出してさらに正確かつ精密な診断が可能である。
本発明の組成物は、上述された本発明のプローブセットによるターゲット核酸配列検出を実施するために作製されるため、重複した内容は、本明細書の複雑性を避けるために、その記載を省略する。
本発明のまた他の様態によれば、本発明は、上述したターゲット核酸配列検出用組成物を含む、ターゲット核酸配列検出用キットを提供する。
本明細書において上述した本発明のキットは、さらに、多様なポリヌクレオチド分子、酵素、多様なバッファ及び試薬を含むことができる。また、本発明のキットは、陽性対照群及び陰性対照群反応を実施するのに必須な試薬を含むことができる。ある一つの特定の反応で使用される試薬の最適量は、本明細書に開示事項を習得した当業者によって容易に決定され得る。
典型的に、本発明のキットは、先に言及された構成成分を含む別途の包装または区分で作製される。
本発明のキットは、上述された本発明のプローブセットによるターゲット核酸配列検出を実施するために作製されるため、重複した内容は、本明細書の複雑性を避けるために、その記載を省略する。
本発明のまた他の様態によれば、本発明は、次のステップを含む、別途の増幅反応なしに、等温単一反応条件下での現場用分子診断方法を提供する：
（ａ）サンプルに、上述した第１プローブ及び第２プローブで構成されるターゲット核酸配列検出用等温単一反応（ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ｏｎｅ－ｐｏｔ ｒｅａｃｔｉｏｎ）プローブセットを処理してターゲット核酸配列と混成化させるステップ；
（ｂ）前記（ａ）ステップの混成化産物にライゲーション作用剤を処理して前記プローブセットの第１プローブ及び第２プローブをライゲーションさせ、前記ライゲーション産物に重合酵素を処理して転写を開始させるステップ；及び
（ｃ）前記（ｂ）ステップの転写産物にアプタマー－反応物質を処理して転写産物内のアプタマーのシグナル生成を検出するステップであって、前記シグナル生成は、サンプル中のターゲット核酸配列の存在を示す。
本発明の方法により診断され得る限り、前記ターゲットの種類は制限されない。
本発明においては、好ましくは、感染性有害微生物である。
前記感染性有害微生物は、スタフィロコッカスアウレウス（ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓＡｕｒｅｕｓ）、ビブリオバルニフィカス（Ｖｉｂｒｉｏ ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、中東呼吸器症候群コロナウイルス（Ｍｉｄｄｌｅ Ｅａｓｔ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ）、インフルエンザＡウイルス（Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ ｖｉｒｕｓ）、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス（Ｓｅｖｅｒｅ Ａｃｕｔｅ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ）、呼吸器細胞融合ウイルス（ＲＳＶ）、ヒト免疫欠乏ウイルス（ＨＩＶ）、ヘルペスシンプレックスウイルス（ＨＳＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、ヒトパラインフルエンザウイルス（ＨＰＩＶ）、デング熱ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ Ｖｉｒｕｓ（ＨＢＶ））、黄熱病ウイルス、狂犬病ウイルス、プラスモジウム、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ミコバクテリウムチュバクローシス、クラミジアトラコマチス、ロタウイルス、ヒトメタニューモウイルス（ｈＭＰＶ）、クリミアコンゴ出血熱ウイルス（Ｃｒｉｍｅａｎ－Ｃｏｎｇｏ ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ ｆｅｖｅｒ ｖｉｒｕｓ）、エボラウイルス、ジカウイルス、ヘニパウイルス、ノロウイルス、ラッサウイルス、ライノウイルス、フラビウイルス、リフトバレー熱ウイルス、手足口病ウイルス、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐ．）、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｐ．）、エンテロバクテリアセアエ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ ｓｐ．）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）、モラクセラ（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｓｐ．）、ヘリコバクター（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）及びステノトロホモナス（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）からなる群から選択された１種以上であってよい。
本発明の方法は、２種以上のターゲット核酸配列検出用等温単一反応プローブセットを設計し、それを利用して２種以上のターゲット核酸配列を現場で速やかで正確に検出できる。
本発明の一実施例において、本発明者らは、高度にモジュール化されたプローブ構造を基盤に最小限の設計だけを利用して６個の病原体に適用し、成功的に多重－検出及び診断した。
従って、本発明のプローブセットは、ターゲット核酸配列の長さが適切であれば、いかなるＲＮＡ／ＤＮＡからデザインされ得るので、このような特徴により伝染病の発生に速やかに対応でき、抗体基盤診断に比して相当な利点を提供する。
即ち、本発明のプローブセットを利用したターゲット配列検出プラットホームは、目的対象のＲＮＡ／ＤＮＡ探知のための強力な診断プラットホームとして作用して短い診断時間、高い感度及び特異度（ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）及び簡単な分析手順を提供するだけではなく、高価な機器及び診断専門家を要しないので、速やかな対応が必要な新種の感染病に適した診断方法になるだろう。
また、このような高度にモジュール化された構造を有する本発明の第１プローブ及び第２プローブのプローブセットは、多重ターゲット検出において偽陽性及び偽陰性結果から完壁に自由になる。
本発明の方法は、上述した本発明のプローブセットを含むので、重複した内容は、本明細書の過度な複雑性を避けるために、その記載を省略する。
【発明の効果】
【0005】
本発明に係る分子診断プラットホームを利用すると、ターゲット遺伝子が非常に低い濃度で存在しても、速く正確に病原菌を検出できる。また、診断過程で必要な要素（反応溶液、酵素）が既存の抗体基盤の診断より遥かに簡素かつ簡便であり、誰でも進行でき、一般的な核酸基盤分子診断技術に使用される高価な装備なしに等温で全ての反応が同時に進行するので、診断の敏感度と迅速性を高めることができる。
【図面の簡単な説明】
【0006】
【図1a】本発明の二つのＤＮＡプローブの構造を示す。
【図1b】ＳｐｌｉｎｔＲリガーゼを利用したライゲーション反応を示す。
【図1c】本発明のライゲーション基盤の分子診断方法の３つの核心反応を示す。
【図1d】本発明のライゲーション反応を利用した核酸検出法の全体的な概略図を示す。
【図2】ターゲットＲＮＡが存在するとき、二つのプローブがライゲーション反応が起こったことを毛細管電気泳動（Ｃａｐｉｌｌａｒｙ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）で確認した結果を示す。
【図3】本発明のライゲーション反応が起こった産物が転写過程を通して転写されて作られた転写産物を確認するためのアガロースゲル電気泳動の結果を示す。
【図4】転写産物が正確にマラカイトグリーンアプタマー構造を形成したかを確認するために、ターゲット物質であるマラカイトグリーンを添加して蛍光値を測定した結果を示す。
【図5a】本発明の等温単一反応でなされた核酸検出プラットホームの概略図を示す。
【図5b】２０個の単一反応溶液候補群の中で単一反応のために適した反応溶液を見つけるために蛍光値を測定した結果を示す。
【図5c】ライゲーションの効率を高めるために選別された反応溶液（１番の反応溶液）にさらにタンパク質（ＥＴ－ＳＳＢ）を添加することで現れる蛍光値の差を示す。
【図5d】本発明の単一反応溶液が実際に一つのチューブ内で一連の反応（ライゲーション、転写反応、蛍光反応）を実施するのに適していることを示す。
【図6a】単一反応の最適化のために必要な酵素（ＳｐｌｉｎｔＲリガーゼ、Ｔ７ ＲＮＡ重合酵素）の量を調節して最適な酵素量を見出した結果を示す。
【図6b】単一反応で蛍光反応を媒介するマラカイトグリーンの量を最適化した結果を示す。
【図6c】等温単一反応のために３７℃でターゲットＲＮＡを検出できるかを確認した結果である。
【図7a】副木（Ｓｐｌｉｎｔ）としてＤＮＡを利用する場合の本発明のプローブセットによる検出結果（ゲルイメージ）を示す。
【図7b】副木（Ｓｐｌｉｎｔ）としてＤＮＡを利用する場合の本発明のプローブセットによる検出結果（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｅｒｏｇｒａｍ）を示す。
【図7c】副木（Ｓｐｌｉｎｔ）としてＤＮＡを利用する場合の本発明のプローブセットによる転写産物がマラカイトグリーンと結合して蛍光シグナルを示す結果を示す。
【図7d】３７℃等温下で、単一反応溶液で一つの容器で副木（Ｓｐｌｉｎｔ）としてＤＮＡを利用する場合の本発明のプローブセットによる結果を示す。
【図8a】等温単一反応で進行される反応を通してターゲットＲＮＡがどの程度時間が過ぎてはじめて検出され得るのか診断の迅速性を示した結果を示す。
【図8b】等温単一反応で進行される反応を通してターゲットＲＮＡ濃度による蛍光値の変化を通して検出限界を示した結果を示す。
【図9a-9f】等温単一反応で進行される反応を通して多様な病原菌のターゲットＲＮＡ濃度による蛍光値の強さを示した結果を示す。
【図10a-10d】等温単一反応で進行される反応を通して実際に病原菌の細胞が直接検出されるかに対する結果を示す。
【図11a-11c】等温単一反応で進行される反応を通して互いに異なる二つの病原菌を独立してそれぞれ異なる蛍光信号と強さで探知できるかに対する結果を示す。
【図12a-12c】等温単一反応で進行される反応を通して特定の病原体の互いに異なるターゲット部位をそれぞれ異なる蛍光信号と強さで探知できるかに対する結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【0007】
以下、実施例を通して本発明をさらに詳細に説明する。これらの実施例は、ひたすら本発明を例示するためのものであって、本発明の範囲がこれらの実施例により制限されるものとは解釈されないことは、当業界において通常の知識を有する者にとって自明であるだろう。
【0008】
実施例１．ライゲーション反応を利用した分子診断プラットホームの検証
１－１．リガーゼを利用したライゲーション反応
本発明者らは、速く安価で正確にターゲット（例えば、特定の疾患）を検出するためにライゲーション反応を利用した極微量のターゲットＲＮＡを検出する分子診断プラットホームを開発しようとした。
そこで、本実施例においては、直接作製した特殊なＤＮＡプローブ構造及び配列を基盤にリガーゼのライゲーション反応を利用した。本発明において、特殊なＤＮＡプローブは、ライゲーション、それ以後の転写、アプタマー構造形成及び蛍光発現まで３つが全て可能にデザインした。
そのためには、下記のような３つの条件が満たされなければならない。
第一に、まず、等温（例えば、３７℃）で全ての反応が進行されなければならないので、この温度でプローブとターゲットＲＮＡ配列との間の重合反応が十分によく起こらなければならず、その過程で所望しない構造が形成されてはならない。
第二に、ターゲットＲＮＡと重合するＤＮＡプローブ上の区域が不要な構造をなすことなく、一本鎖で存在しなければならない。また、ライゲーション反応が起こった後、ＲＮＡ重合酵素により転写が起こらなければならないので、ＤＮＡプローブ上に二本鎖のプロモーターが存在しなければならない。
第三に、下流に存在するアプタマーが上流の混成化（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）配列と相互作用せず、独立した構造をよく形成しなければならない。
上述した３つの条件を満たしたＤＮＡプローブセットの構造及び反応は、図１ａ及び図１ｂに示したとおりである。
上述したＤＮＡプローブセットは、２個のプローブで構成され、前記プラットホームは、下記のような３つの核心技術からなっている（図１ｃ）：
（１）リガーゼを利用したプローブ同士のライゲーション反応
－ＤＮＡプローブとＲＮＡが存在するとき、ターゲットＲＮＡを副木（ｓｐｌｉｎｔ）として２種のＤＮＡプローブからなるプローブセットを連結させる。即ち、ターゲットＲＮＡの配列に相補的なＤＮＡプローブ２種を作製し、リガーゼ（ＳｐｌｉｎｔＲ ｌｉｇａｓｅ）を利用して互いに連結させることでライゲーション反応を遂行する。
（２）ライゲーションされた産物（Ｌｉｇａｔｅｄ ｐｒｏｄｕｃｔ）のＩｎ ｖｉｔｒｏ転写反応
－ライゲーションされた産物の５’部分に位置したＴ７プロモーター配列にＴ７ ＲＮＡ重合酵素がついて転写過程を進行して、ライゲーションされた産物から転写産物であるＲＮＡを作り出す。
（３）ＲＮＡアプタマーを利用した蛍光発現
－ＲＮＡ３´末端部分に位置したアプタマーが特定の化学物質と結合して示す蛍光を利用して目標ＲＮＡ分子の存在有無を確認する。
本実施例においては、前記（１）－（３）の核心技術を通して一具現例としてＭＲＳＡ感染有無を診断しようとする。
この過程は、２時間以内で反応が完了するので、早く結果が導出され得、（１）の反応が起こってはじめてそれ以後の過程が順になされ、そのように（１）－（３）までの反応が全てなされる時にのみ所望の結果を得ることができるので、診断の正確性を信頼できる（図１ｄ）。
前記ＤＮＡプローブセットは、下記２種のプローブで構成されている：
第１ＤＮＡプローブ［プロモータープローブ（ＰＰ、ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｐｒｏｂｅ）と命名］であって、
前記ＰＰは、プロモーター配列とターゲット遺伝子と混成化（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）するＵＨＳ（Ｕｐｓｔｒｅａｍ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ）配列の二つの部分からなっており；
第２ＤＮＡプローブ［レポータープローブ（ＲＰ、ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｐｒｏｂｅ）と命名］であって、
前記ＲＰは、ターゲット遺伝子と混成化するＤＨＳ（Ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ）配列と最終生産物を確認できるレポーターとして蛍光－反応ＲＮＡアプタマーを暗号化する配列の二つの部分からなっている。
本実施例１において、ターゲットＲＮＡ（副木ＲＮＡ）としてＭＲＳＡ（Ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ Ａｕｒｅｕｓ）のターゲット遺伝子であるｍｅｃＡ；プロモーター配列としてＴ７プロモーター配列；及び蛍光－反応ＲＮＡアプタマーとしてマラカイトグリーンＲＮＡアプタマーを利用し、本実施例１に利用された前記２種のＤＮＡプローブの詳細な配列は、下記表１に示した。
［表１］
（大文字で表示したヌクレオチドは、ターゲット核酸配列と相補的な混成化配列を指す。小文字で表示したヌクレオチドは、ステム－ループ構造（Ｓｔｅｍ－ｌｏｏｐ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）をなすＴ７プロモーターｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ配列＋ループ配列＋Ｔ７プロモーター配列を指し、下線を引いたヌクレオチドは、ステム－ループ構造（Ｓｔｅｍ－ｌｏｏｐ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）中、ステムをなすヌクレオチドを指す。
小文字イタリック体で表示したヌクレオチドは、アプタマー配列を指す。）
簡略に、先に作製した二つのＤＮＡプローブとターゲットＲＮＡを１０ｘアニーリング（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）反応溶液［１００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、５００ｍＭ ＫＣｌ］で９５℃で３分間熱で変性させた後、常温でゆっくり冷ました。ターゲットＲＮＡは、ＭＲＳＡ（Ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ Ａｕｒｅｕｓ）のターゲット遺伝子であるｍｅｃＡ ＤＮＡ配列上流にＴ７プロモーター配列を挿入してクローニングした後、Ｔ７ ＲＮＡ重合酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＵＳＡ）を使用して転写させた。転写反応で得たＲＮＡは、ＤＮａｓｅＩ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ Ｉｎｃ．，Ｎｏｊｉｈｉｇａｓｈｉ，Ｊａｐａｎ）で処理した後、ＲｉｂｏＣｌｅａｒ（(株)ジーンオールバイオテクノロジー、ソウル、大韓民国）を利用して精製した。
このようにアニーリングされたオリゴヌクレオチドを、通常知られている方法で、ＳｐｌｉｎｔＲリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、１０ｘ ＳｐｌｉｎｔＲリガーゼ反応反応溶液［５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭ ＤＴＴ、１５ｍＭ ＮａＣｌ］を入れて３７℃で３０分間反応させた。
１－２．Ｔ７重合酵素を利用した転写反応
前記実施例１－１においてライゲーションされた産物を、通常知られている方法で、２５ｍＭ ＮＴＰｓ、１０ｍＭ ＤＴＴ、ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ Ｉｎｃ）と共に１０ｘ Ｔ７重合酵素反応溶液［４０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．９）、６ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＤＴＴ、１０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ Ｓｐｅｒｍｉｄｉｎｅ］を入れて３７℃で１６時間の間反応させた。
１－３．下流のアプタマー配列とマラカイトグリーン結合を通した蛍光反応
前記実施例１－２において生成されたＲＮＡ（アプタマー配列のある）を1μＭになるように入れて、マラカイトグリーンアプタマー反応溶液［５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭ ＮａＣｌ、１４０ｍＭ ＫＣｌ］に混ぜた後、通常知られている方法で、９５℃で１０分間熱で変性させてリフォールディングさせた後、２０分間室温に冷却させた。ＭｇＣｌ２をＲＮＡ溶液に最終濃度１０ｍＭになるように添加し、溶液を室温で１５分間安定化させた。それ以後、ターゲット物質は、マラカイトグリーン水溶液（３２０μＭ）を５μＬ添加した。マラカイトグリーン水溶液は、マラカイトグリーンシュウ酸塩（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＵＳＡ）をＲＮａｓｅ－ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒに希釈させて使用した。それ以後、９６ｗｅｌｌ ｂｌａｃｋ ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｃｌｅａｒ ｆｌａｔ ｂｏｔｔｏｍ（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ）に１００μＬの容量でＨｉｄｅｘ Ｓｅｎｓｅ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒで蛍光を測定した（ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ：６１６ｎｍ、ｅｍｉｓｓｉｏｎ：６６５ｎｍ）。上述した実施例１での一連の反応を図１ｃに示した。
１－４．結果
本実施例においては、マラカイトグリーンと結合して蛍光を発現するＲＮＡアプタマーを利用してターゲット遺伝子を感知してライゲーションされたプローブで生成された転写産物を検出しようとした。
前記設計したプローブのＳｐｌｉｎｔＲリガーゼを通したライゲーション反応遂行有無を検証するために、反応産物を電気泳動方法で確認した。このとき、ライゲーションされたプローブアセンブリ（Ｆｕｌｌ－ｌｅｎｇｔｈプローブ）の敏感な検出のために毛細管電気泳動（Ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）［ＡＢＩ ３１３０ＸＬ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（１６－Ｃａｐｉｌｌａｒｙ Ａｒｒａｙ，５０ｃｍ；Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＵＳＡ）］を使用して分析した。まず、ＲＰの５’に６－ＦＡＭ（６－Ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）を付けたオリゴヌクレオチドを作製した。この５’６－ＦＡＭ ＲＰは、ライゲーション反応有無と関係なく特定の位置のピークを示すようになり、ライゲーションが起こった試料ではこれと異なる位置にピークが現れるようになる。ＳｐｌｉｎｔＲリガーゼは、ターゲットＲＮＡが存在する場合にのみ２個のプローブを連結させるため、ターゲットＲＮＡが入っている試料でだけライゲーション反応が起こり、それによって５’６－ＦＡＭ ＲＰのピークと異なる位置に２個のプローブが連結されたライゲーションされたプローブアセンブリピークが生成された（図２）。
以後、プローブアセンブリが正しく転写されるかを検討するためにアガロースゲル電気泳動でバンドの位置を確認した。使用したゲルは、２．５％アガロースゲル変性ゲルであり、ターゲットＲＮＡが存在しないサンプルを陰性対照群に、合成したプローブアセンブリ［Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｉｇｅｓ，ＩＮＣ．（ＩＤＴ）．，Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＵＳＡ］を陽性対照群に設定した。このとき、陰性対照群ではライゲーション反応が起こらなかったので、Ｔ７プロモーター配列からＰＰまでの長さである５５ｎｔの転写産物が作られ、陽性対照群と実験群ではライゲーション反応が進行されたので、Ｔ７プロモーター配列からＰＰ、ＲＰを全て含む８９ｎｔの転写産物が作られることを確認することができる（図３）。
また、転写産物がマラカイトグリーンと結合して蛍光を出すかをＨｉｄｅｘ Ｓｅｎｓｅ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｈｉｄｅｘ．，Ｌｅｍｍｉｎｋａｉｓｅｎｋａｔｕ，Ｆｉｎｌａｎｄ）を利用して確認した（図４）。
１－１．リガーゼを利用したライゲーション反応
本発明者らは、速く安価で正確にターゲット（例えば、特定の疾患）を検出するためにライゲーション反応を利用した極微量のターゲットＲＮＡを検出する分子診断プラットホームを開発しようとした。
そこで、本実施例においては、直接作製した特殊なＤＮＡプローブ構造及び配列を基盤にリガーゼのライゲーション反応を利用した。本発明において、特殊なＤＮＡプローブは、ライゲーション、それ以後の転写、アプタマー構造形成及び蛍光発現まで３つが全て可能にデザインした。
そのためには、下記のような３つの条件が満たされなければならない。
第一に、まず、等温（例えば、３７℃）で全ての反応が進行されなければならないので、この温度でプローブとターゲットＲＮＡ配列との間の重合反応が十分によく起こらなければならず、その過程で所望しない構造が形成されてはならない。
第二に、ターゲットＲＮＡと重合するＤＮＡプローブ上の区域が不要な構造をなすことなく、一本鎖で存在しなければならない。また、ライゲーション反応が起こった後、ＲＮＡ重合酵素により転写が起こらなければならないので、ＤＮＡプローブ上に二本鎖のプロモーターが存在しなければならない。
第三に、下流に存在するアプタマーが上流の混成化（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）配列と相互作用せず、独立した構造をよく形成しなければならない。
上述した３つの条件を満たしたＤＮＡプローブセットの構造及び反応は、図１ａ及び図１ｂに示したとおりである。
上述したＤＮＡプローブセットは、２個のプローブで構成され、前記プラットホームは、下記のような３つの核心技術からなっている（図１ｃ）：
（１）リガーゼを利用したプローブ同士のライゲーション反応
－ＤＮＡプローブとＲＮＡが存在するとき、ターゲットＲＮＡを副木（ｓｐｌｉｎｔ）として２種のＤＮＡプローブからなるプローブセットを連結させる。即ち、ターゲットＲＮＡの配列に相補的なＤＮＡプローブ２種を作製し、リガーゼ（ＳｐｌｉｎｔＲ ｌｉｇａｓｅ）を利用して互いに連結させることでライゲーション反応を遂行する。
（２）ライゲーションされた産物（Ｌｉｇａｔｅｄ ｐｒｏｄｕｃｔ）のＩｎ ｖｉｔｒｏ転写反応
－ライゲーションされた産物の５’部分に位置したＴ７プロモーター配列にＴ７ ＲＮＡ重合酵素がついて転写過程を進行して、ライゲーションされた産物から転写産物であるＲＮＡを作り出す。
（３）ＲＮＡアプタマーを利用した蛍光発現
－ＲＮＡ３´末端部分に位置したアプタマーが特定の化学物質と結合して示す蛍光を利用して目標ＲＮＡ分子の存在有無を確認する。
本実施例においては、前記（１）－（３）の核心技術を通して一具現例としてＭＲＳＡ感染有無を診断しようとする。
この過程は、２時間以内で反応が完了するので、早く結果が導出され得、（１）の反応が起こってはじめてそれ以後の過程が順になされ、そのように（１）－（３）までの反応が全てなされる時にのみ所望の結果を得ることができるので、診断の正確性を信頼できる（図１ｄ）。
前記ＤＮＡプローブセットは、下記２種のプローブで構成されている：
第１ＤＮＡプローブ［プロモータープローブ（ＰＰ、ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｐｒｏｂｅ）と命名］であって、
前記ＰＰは、プロモーター配列とターゲット遺伝子と混成化（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）するＵＨＳ（Ｕｐｓｔｒｅａｍ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ）配列の二つの部分からなっており；
第２ＤＮＡプローブ［レポータープローブ（ＲＰ、ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｐｒｏｂｅ）と命名］であって、
前記ＲＰは、ターゲット遺伝子と混成化するＤＨＳ（Ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ）配列と最終生産物を確認できるレポーターとして蛍光－反応ＲＮＡアプタマーを暗号化する配列の二つの部分からなっている。
本実施例１において、ターゲットＲＮＡ（副木ＲＮＡ）としてＭＲＳＡ（Ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ Ａｕｒｅｕｓ）のターゲット遺伝子であるｍｅｃＡ；プロモーター配列としてＴ７プロモーター配列；及び蛍光－反応ＲＮＡアプタマーとしてマラカイトグリーンＲＮＡアプタマーを利用し、本実施例１に利用された前記２種のＤＮＡプローブの詳細な配列は、下記表１に示した。
［表１］
小文字イタリック体で表示したヌクレオチドは、アプタマー配列を指す。）
簡略に、先に作製した二つのＤＮＡプローブとターゲットＲＮＡを１０ｘアニーリング（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）反応溶液［１００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、５００ｍＭ ＫＣｌ］で９５℃で３分間熱で変性させた後、常温でゆっくり冷ました。ターゲットＲＮＡは、ＭＲＳＡ（Ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ Ａｕｒｅｕｓ）のターゲット遺伝子であるｍｅｃＡ ＤＮＡ配列上流にＴ７プロモーター配列を挿入してクローニングした後、Ｔ７ ＲＮＡ重合酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＵＳＡ）を使用して転写させた。転写反応で得たＲＮＡは、ＤＮａｓｅＩ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ Ｉｎｃ．，Ｎｏｊｉｈｉｇａｓｈｉ，Ｊａｐａｎ）で処理した後、ＲｉｂｏＣｌｅａｒ（(株)ジーンオールバイオテクノロジー、ソウル、大韓民国）を利用して精製した。
このようにアニーリングされたオリゴヌクレオチドを、通常知られている方法で、ＳｐｌｉｎｔＲリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、１０ｘ ＳｐｌｉｎｔＲリガーゼ反応反応溶液［５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭ ＤＴＴ、１５ｍＭ ＮａＣｌ］を入れて３７℃で３０分間反応させた。
１－２．Ｔ７重合酵素を利用した転写反応
前記実施例１－１においてライゲーションされた産物を、通常知られている方法で、２５ｍＭ ＮＴＰｓ、１０ｍＭ ＤＴＴ、ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ Ｉｎｃ）と共に１０ｘ Ｔ７重合酵素反応溶液［４０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．９）、６ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＤＴＴ、１０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ Ｓｐｅｒｍｉｄｉｎｅ］を入れて３７℃で１６時間の間反応させた。
１－３．下流のアプタマー配列とマラカイトグリーン結合を通した蛍光反応
前記実施例１－２において生成されたＲＮＡ（アプタマー配列のある）を1μＭになるように入れて、マラカイトグリーンアプタマー反応溶液［５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭ ＮａＣｌ、１４０ｍＭ ＫＣｌ］に混ぜた後、通常知られている方法で、９５℃で１０分間熱で変性させてリフォールディングさせた後、２０分間室温に冷却させた。ＭｇＣｌ２をＲＮＡ溶液に最終濃度１０ｍＭになるように添加し、溶液を室温で１５分間安定化させた。それ以後、ターゲット物質は、マラカイトグリーン水溶液（３２０μＭ）を５μＬ添加した。マラカイトグリーン水溶液は、マラカイトグリーンシュウ酸塩（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＵＳＡ）をＲＮａｓｅ－ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒに希釈させて使用した。それ以後、９６ｗｅｌｌ ｂｌａｃｋ ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｃｌｅａｒ ｆｌａｔ ｂｏｔｔｏｍ（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ）に１００μＬの容量でＨｉｄｅｘ Ｓｅｎｓｅ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒで蛍光を測定した（ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ：６１６ｎｍ、ｅｍｉｓｓｉｏｎ：６６５ｎｍ）。上述した実施例１での一連の反応を図１ｃに示した。
１－４．結果
本実施例においては、マラカイトグリーンと結合して蛍光を発現するＲＮＡアプタマーを利用してターゲット遺伝子を感知してライゲーションされたプローブで生成された転写産物を検出しようとした。
前記設計したプローブのＳｐｌｉｎｔＲリガーゼを通したライゲーション反応遂行有無を検証するために、反応産物を電気泳動方法で確認した。このとき、ライゲーションされたプローブアセンブリ（Ｆｕｌｌ－ｌｅｎｇｔｈプローブ）の敏感な検出のために毛細管電気泳動（Ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）［ＡＢＩ ３１３０ＸＬ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（１６－Ｃａｐｉｌｌａｒｙ Ａｒｒａｙ，５０ｃｍ；Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＵＳＡ）］を使用して分析した。まず、ＲＰの５’に６－ＦＡＭ（６－Ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）を付けたオリゴヌクレオチドを作製した。この５’６－ＦＡＭ ＲＰは、ライゲーション反応有無と関係なく特定の位置のピークを示すようになり、ライゲーションが起こった試料ではこれと異なる位置にピークが現れるようになる。ＳｐｌｉｎｔＲリガーゼは、ターゲットＲＮＡが存在する場合にのみ２個のプローブを連結させるため、ターゲットＲＮＡが入っている試料でだけライゲーション反応が起こり、それによって５’６－ＦＡＭ ＲＰのピークと異なる位置に２個のプローブが連結されたライゲーションされたプローブアセンブリピークが生成された（図２）。
以後、プローブアセンブリが正しく転写されるかを検討するためにアガロースゲル電気泳動でバンドの位置を確認した。使用したゲルは、２．５％アガロースゲル変性ゲルであり、ターゲットＲＮＡが存在しないサンプルを陰性対照群に、合成したプローブアセンブリ［Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｉｇｅｓ，ＩＮＣ．（ＩＤＴ）．，Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＵＳＡ］を陽性対照群に設定した。このとき、陰性対照群ではライゲーション反応が起こらなかったので、Ｔ７プロモーター配列からＰＰまでの長さである５５ｎｔの転写産物が作られ、陽性対照群と実験群ではライゲーション反応が進行されたので、Ｔ７プロモーター配列からＰＰ、ＲＰを全て含む８９ｎｔの転写産物が作られることを確認することができる（図３）。
また、転写産物がマラカイトグリーンと結合して蛍光を出すかをＨｉｄｅｘ Ｓｅｎｓｅ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｈｉｄｅｘ．，Ｌｅｍｍｉｎｋａｉｓｅｎｋａｔｕ，Ｆｉｎｌａｎｄ）を利用して確認した（図４）。
【0009】
実施例２．ライゲーション反応を利用した単一反応分子診断プラットホームの構築
前記実施例１においてライゲーション反応を基盤とした分子診断プラットホームを検証する過程で、実施例１－１、１－２、１－３それぞれの反応は、互いに異なるチューブで互いに異なる反応溶液の条件で進行した。また、各ステップ反応に最適化された温度を使用して温度も一定に維持させなかった。
前記工程は、非常に煩わしく、時間的な消耗が大きい。
そこで、本発明者らは、簡便で速やかにターゲット配列の検出を通した診断を遂行するために、図５ａに示したように、単一組成の反応溶液を利用して一つのチューブで一定の温度条件下で全ての反応を進行させることができるように一元化された「等温単一反応分子診断法」を開発しようとした。
このとき、使用される構成成分が少ないほど、温度及び緩衝液組成の側面で最適化することがさらに容易である。
そこで、本発明者らは、検出プラットホームを設計するとき、意図的に構成成分の種類を減らすことを試みた。
このとき、本実施例２においては、前記実施例１において設計されたプローブセット（ターゲットＲＮＡとしてＭＲＳＡのターゲット遺伝子であるｍｅｃＡに混成化される配列；プロモーター配列としてＴ７プロモーター配列；及びマラカイトグリーンＲＮＡアプタマー配列部位を含む構成のプローブセット）とＳｐｌｉｎｔＲリガーゼ、Ｔ７ ＲＮＡ重合酵素及びマラカイトグリーンを利用した。
２－１．反応溶液の一元化
ライゲーション反応を利用した分子診断プラットホームを構成する反応は、それぞれ最適な反応溶液がある。当業界に公知になったそれぞれの反応溶液の構成成分及び反応に必要な構成要素を濃度と共に下記表２に示した。
［表２］
上述したように、反応溶液の一元化を進行するために、ＳｐｌｉｎｔＲリガーゼ、Ｔ７ ＲＮＡ重合酵素それぞれの反応プロトコルに出ている構成成分のうちＡＴＰ、Ｓｐｅｒｍｉｄｉｎｅ等を除く、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＮＴＰｓ、ＮａＣｌ、ＤＴＴを基本成分として一元化された反応溶液の候補群２０個を作製した。
作製した反応溶液の候補は、下記表３に示した。
［表３］
前記した２０種の反応溶液候補を利用してライゲーション、転写、蛍光反応を順次に進行した後、蛍光の強さを測定して、各反応溶液が３ステップの反応に全て適するか、そして、どの反応溶液候補で反応効率が最も高いかを確認した。
その結果、ＤＴＴが除去された、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＮＴＰｓ、１０．５ｍＭ ＮａＣｌで構成された１番の候補を利用して反応させた時に測定された蛍光の強さが最も強かった（図５ｂ）。
また、上述したように副木ＲＮＡの存在有無に依存してＰＰとＲＰのライゲーション反応が起こってはじめてその後の過程が進行されるので、ライゲーション反応は、診断の側面で精密性と正確性を決定づけるステップといえる。また、ライゲーション反応の効率が診断の効率及び敏感度を決定する。
そこで、本発明者らは、ライゲーション反応の効率を高めるために、さらに前記１番の反応溶液に、ＥＴ－ＳＳＢ（Ｅｘｔｒｅｍｅ Ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ Ｓｉｎｇｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を添加した。ＥＴ－ＳＳＢは、一本鎖ＤＮＡを安定化させ、ライゲーション反応時にｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔ効果を減らすことでライゲーション効率を高めるタンパク質と知られている。このタンパク質は、重合酵素が作用する反応溶液の中では全て活性を帯びる。この点に着眼して、本発明者は、ＥＴ－ＳＳＢを１００μＬの反応容量基準に０．８μＬ（５０μＬ反応容量に４００ｎｇのＥＴ－ＳＳＢ）添加して蛍光を測定した。
その結果、図５ｃに示したように、ＥＴ－ＳＳＢが添加されていない試料より添加された試料の蛍光がさらに高く出たことを確認することができた。
このように、ライゲーション反応に必要な酵素、化学物質、タンパク質等の添加量を最適化することで、先に作製した表３の「１番の反応溶液」上でターゲットＲＮＡが存在するとき、下流のアプタマー配列とマラカイトグリーンが特異的に結合して蛍光を出す反応の効率を極大化した。
また、ＥＴ－ＳＳＢが添加された１番の候補反応溶液でライゲーション、転写、蛍光反応を一つのチューブで同時に進行させた時も蛍光が検出されることを確認した（図５ｄ）。
結果的に、ステップ別に進行してきたライゲーション、転写、蛍光反応まで３ステップの反応を、本発明のＥＴ－ＳＳＢが添加された１番の反応溶液を含む一つのチューブで同時に進行しても一連の反応が問題なく起こるということを確認した。
以下、下記実施例においては、１番の反応溶液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＮＴＰｓ、１０．５ｍＭ ＮａＣｌ）にＥＴ－ＳＳＢを添加して作製した、本発明の一連の反応を最適に達成できる溶液を「単一反応溶液」と命名して利用した。
２－２．反応に必要な分子の量の最適化
ライゲーション反応を利用した分子診断プラットホームに核心的な役割を果たすタンパク質には、リガーゼ、ＲＮＡ重合酵素等の酵素も存在し、マラカイトグリーンのような化学物質もある。そこで、本発明者らは、単一反応溶液上で蛍光の強さを極大化するために前記した分子の添加量を最適化した。
このとき、リガーゼは、ＳｐｌｉｎｔＲリガーゼを利用し、ＲＮＡ重合酵素は、Ｔ７ ＲＮＡ重合酵素を利用した。
まず、本発明者らは、ＳｐｌｉｎｔＲリガーゼとＴ７ ＲＮＡ重合酵素の添加量を最適化するために、多様な組み合わせで実験した。
その結果、数回の最適化実験を通して１００μＬの容量を基準にＳｐｌｉｎｔ Ｒリガーゼは２５０ｕｎｉｔ、Ｔ７ ＲＮＡ重合酵素は２５０ｕｎｉｔであるとき、蛍光値が最も大きく測定された（図６ａ）。
また、本発明者らは、蛍光信号と直接的な関連のある下流アプタマー配列と特異的に結合する化学分子であるマラカイトグリーンの濃度を最適化した。
マラカイトグリーンの添加量を多様に調節してみた結果、１６μＭを添加したとき、最も大きな蛍光値を示した（図６ｂ）。
２－３．反応温度の単一化（等温反応化）
本発明は、単一反応溶液を利用した単一ステップ反応であるので、全ての反応が一か所で起こらなければならない。単一ステップ反応が成立するためには、反応温度も単一化されなければならない。実施例１での各反応がなされる温度が互いに全て異なる。アニーリング過程とライゲーション過程とマラカイトグリーン反応でそれぞれ９５℃という高温が必要である。しかし、この温度でＳｐｌｉｎｔＲリガーゼとＴ７ ＲＮＡ重合酵素は変性する。また、分子診断を構成するほとんどの反応は、全て３７℃で進行される。
そこで、本発明者らは、反応温度もまた一元化するために、先に確認された単一反応溶液を利用して分子診断を構成する全ての反応（ライゲーション、転写及び蛍光反応）を一つのチューブで３７℃の条件で進行した。
その結果、ターゲットＲＮＡの存在有無によって区別可能な水準の蛍光が発現されることを確認することができた（図６ｃ）。
前記結果を通して３７℃の等温条件で単一反応溶液を利用して単一ステップ反応を実施できることを立証した。
以下、本発明において、前記反応を「等温単一反応（ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ｏｎｅ－ｐｏｔ ｒｅａｃｔｉｏｎ）」と命名し、本実施例上で利用された前記等温単一反応溶液の組成及び濃度を下記表４にまとめた。
［表４］
前記実施例１においてライゲーション反応を基盤とした分子診断プラットホームを検証する過程で、実施例１－１、１－２、１－３それぞれの反応は、互いに異なるチューブで互いに異なる反応溶液の条件で進行した。また、各ステップ反応に最適化された温度を使用して温度も一定に維持させなかった。
前記工程は、非常に煩わしく、時間的な消耗が大きい。
そこで、本発明者らは、簡便で速やかにターゲット配列の検出を通した診断を遂行するために、図５ａに示したように、単一組成の反応溶液を利用して一つのチューブで一定の温度条件下で全ての反応を進行させることができるように一元化された「等温単一反応分子診断法」を開発しようとした。
このとき、使用される構成成分が少ないほど、温度及び緩衝液組成の側面で最適化することがさらに容易である。
そこで、本発明者らは、検出プラットホームを設計するとき、意図的に構成成分の種類を減らすことを試みた。
このとき、本実施例２においては、前記実施例１において設計されたプローブセット（ターゲットＲＮＡとしてＭＲＳＡのターゲット遺伝子であるｍｅｃＡに混成化される配列；プロモーター配列としてＴ７プロモーター配列；及びマラカイトグリーンＲＮＡアプタマー配列部位を含む構成のプローブセット）とＳｐｌｉｎｔＲリガーゼ、Ｔ７ ＲＮＡ重合酵素及びマラカイトグリーンを利用した。
２－１．反応溶液の一元化
ライゲーション反応を利用した分子診断プラットホームを構成する反応は、それぞれ最適な反応溶液がある。当業界に公知になったそれぞれの反応溶液の構成成分及び反応に必要な構成要素を濃度と共に下記表２に示した。
［表２］
作製した反応溶液の候補は、下記表３に示した。
［表３］
その結果、ＤＴＴが除去された、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＮＴＰｓ、１０．５ｍＭ ＮａＣｌで構成された１番の候補を利用して反応させた時に測定された蛍光の強さが最も強かった（図５ｂ）。
また、上述したように副木ＲＮＡの存在有無に依存してＰＰとＲＰのライゲーション反応が起こってはじめてその後の過程が進行されるので、ライゲーション反応は、診断の側面で精密性と正確性を決定づけるステップといえる。また、ライゲーション反応の効率が診断の効率及び敏感度を決定する。
そこで、本発明者らは、ライゲーション反応の効率を高めるために、さらに前記１番の反応溶液に、ＥＴ－ＳＳＢ（Ｅｘｔｒｅｍｅ Ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ Ｓｉｎｇｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を添加した。ＥＴ－ＳＳＢは、一本鎖ＤＮＡを安定化させ、ライゲーション反応時にｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔ効果を減らすことでライゲーション効率を高めるタンパク質と知られている。このタンパク質は、重合酵素が作用する反応溶液の中では全て活性を帯びる。この点に着眼して、本発明者は、ＥＴ－ＳＳＢを１００μＬの反応容量基準に０．８μＬ（５０μＬ反応容量に４００ｎｇのＥＴ－ＳＳＢ）添加して蛍光を測定した。
その結果、図５ｃに示したように、ＥＴ－ＳＳＢが添加されていない試料より添加された試料の蛍光がさらに高く出たことを確認することができた。
このように、ライゲーション反応に必要な酵素、化学物質、タンパク質等の添加量を最適化することで、先に作製した表３の「１番の反応溶液」上でターゲットＲＮＡが存在するとき、下流のアプタマー配列とマラカイトグリーンが特異的に結合して蛍光を出す反応の効率を極大化した。
また、ＥＴ－ＳＳＢが添加された１番の候補反応溶液でライゲーション、転写、蛍光反応を一つのチューブで同時に進行させた時も蛍光が検出されることを確認した（図５ｄ）。
結果的に、ステップ別に進行してきたライゲーション、転写、蛍光反応まで３ステップの反応を、本発明のＥＴ－ＳＳＢが添加された１番の反応溶液を含む一つのチューブで同時に進行しても一連の反応が問題なく起こるということを確認した。
以下、下記実施例においては、１番の反応溶液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＮＴＰｓ、１０．５ｍＭ ＮａＣｌ）にＥＴ－ＳＳＢを添加して作製した、本発明の一連の反応を最適に達成できる溶液を「単一反応溶液」と命名して利用した。
２－２．反応に必要な分子の量の最適化
ライゲーション反応を利用した分子診断プラットホームに核心的な役割を果たすタンパク質には、リガーゼ、ＲＮＡ重合酵素等の酵素も存在し、マラカイトグリーンのような化学物質もある。そこで、本発明者らは、単一反応溶液上で蛍光の強さを極大化するために前記した分子の添加量を最適化した。
このとき、リガーゼは、ＳｐｌｉｎｔＲリガーゼを利用し、ＲＮＡ重合酵素は、Ｔ７ ＲＮＡ重合酵素を利用した。
まず、本発明者らは、ＳｐｌｉｎｔＲリガーゼとＴ７ ＲＮＡ重合酵素の添加量を最適化するために、多様な組み合わせで実験した。
その結果、数回の最適化実験を通して１００μＬの容量を基準にＳｐｌｉｎｔ Ｒリガーゼは２５０ｕｎｉｔ、Ｔ７ ＲＮＡ重合酵素は２５０ｕｎｉｔであるとき、蛍光値が最も大きく測定された（図６ａ）。
また、本発明者らは、蛍光信号と直接的な関連のある下流アプタマー配列と特異的に結合する化学分子であるマラカイトグリーンの濃度を最適化した。
マラカイトグリーンの添加量を多様に調節してみた結果、１６μＭを添加したとき、最も大きな蛍光値を示した（図６ｂ）。
２－３．反応温度の単一化（等温反応化）
本発明は、単一反応溶液を利用した単一ステップ反応であるので、全ての反応が一か所で起こらなければならない。単一ステップ反応が成立するためには、反応温度も単一化されなければならない。実施例１での各反応がなされる温度が互いに全て異なる。アニーリング過程とライゲーション過程とマラカイトグリーン反応でそれぞれ９５℃という高温が必要である。しかし、この温度でＳｐｌｉｎｔＲリガーゼとＴ７ ＲＮＡ重合酵素は変性する。また、分子診断を構成するほとんどの反応は、全て３７℃で進行される。
そこで、本発明者らは、反応温度もまた一元化するために、先に確認された単一反応溶液を利用して分子診断を構成する全ての反応（ライゲーション、転写及び蛍光反応）を一つのチューブで３７℃の条件で進行した。
その結果、ターゲットＲＮＡの存在有無によって区別可能な水準の蛍光が発現されることを確認することができた（図６ｃ）。
前記結果を通して３７℃の等温条件で単一反応溶液を利用して単一ステップ反応を実施できることを立証した。
以下、本発明において、前記反応を「等温単一反応（ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ｏｎｅ－ｐｏｔ ｒｅａｃｔｉｏｎ）」と命名し、本実施例上で利用された前記等温単一反応溶液の組成及び濃度を下記表４にまとめた。
［表４］
【0010】
実施例３．副木（Ｓｐｌｉｎｔ）としてＤＮＡを利用する場合の本発明のプローブセットによる検出
前記実施例１－１～１－３においては、副木（Ｓｐｌｉｎｔ）、即ち、ターゲット配列としてＲＮＡを利用したが、本発明者らは、さらにターゲット配列としてＤＮＡを利用して、前記実施例１－１及び１－２に開示されたものと同じ条件及び方法でＳｐｌｉｎｔ Ｒリガーゼを利用したプローブ同士のライゲーション反応、Ｔ７重合酵素を利用した転写反応を実施した後、バイオアナライザを通して確認した。
バイオアナライザは、Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００を使用し、この時に使用したｋｉｔは、Ａｇｉｌｅｎｔ ＲＮＡ ６０００ ｎａｎｏ ｋｉｔである。これは、電気泳動分離と微細流体技術の特性を有するＲＮＡの断片と大きさの分析が敏感にできる。
その結果、図７ａ（ゲルイメージ）及び図７ｂ（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｅｒｏｇｒａｍ）に示したように、副木としてＤＮＡを利用した場合にも、ターゲットＤＮＡが検出されることを確認した。
即ち、前記結果を通して、プロモータープローブ（ＰＰ）、レポータープローブ（ＲＰ）、ターゲットＤＮＡ、ＳｐｌｉｎｔＲリガーゼが全て存在してはじめてライゲーション反応が起こって、プローブアセンブリになり、そのプローブアセンブリが正しく転写されることを、合成したプローブアセンブリを陽性対照群として使用することで確認した。
また、図７ｃに示したように、転写産物がマラカイトグリーンと結合して蛍光を出すかをＨｉｄｅｘ Ｓｅｎｓｅ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｈｉｄｅｘ．，Ｌｅｍｍｉｎｋδｉｓｅｎｋａｔｕ，Ｆｉｎｌａｎｄ）を利用して確認した。
即ち、前記結果を通して、副木（Ｓｐｌｉｎｔ）がＲＮＡでないＤＮＡでもライゲーション反応、Ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応、ＲＮＡアプタマーを利用した蛍光発現反応の全てがよく起こることを確認した。
また、さらに上述した３つの反応（ライゲーション反応、Ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応、ＲＮＡアプタマーを利用した蛍光発現反応）が、前記実施例２において糾明された「等温単一反応」条件、即ち、３７℃の等温下で、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＮＴＰｓ、１０．５ｍＭ ＮａＣｌ及びＥＴ－ＳＳＢ ４００ｎｇを含む単一反応溶液で一つの容器で実施する場合にも起こるかを確認した。
副木ＤＮＡとしてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（新種のコロナウイルス）のターゲット遺伝子であるＲｄＲｐ（ＲＮＡ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）のＤＮＡを利用し、ＤＦＨＢＩ－１Ｔ（（５Ｚ）－５－［（３，５－Ｄｉｆｌｕｏｒｏ－４－ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ｍｅｔｈｙｌｅｎｅ］－３，５－ｄｉｈｙｄｒｏ－２－ｍｅｔｈｙｌ－３－（２，２，２－ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｅｔｈｙｌ）－４Ｈ－ｉｍｉｄａｚｏｌ－４－ｏｎｅ）に結合するブロッコリーアプタマー（ＤＦＨＢＩ－１Ｔ／ＢＲＡｐｔ）を利用してこれらの間の蛍光反応でターゲット対象を検出しようとした。
その結果、図７ｄに示したように、ターゲットＤＮＡが入っていない状態よりターゲットＤＮＡが入っているサンプルで蛍光の強さがさらに高くなることを確認することができる。
従って、本発明のライゲーション反応を利用した分子診断プラットホームは、副木としてＤＮＡを使用してもターゲット検出に無理なく適用できるということを立証した。
前記実施例１－１～１－３においては、副木（Ｓｐｌｉｎｔ）、即ち、ターゲット配列としてＲＮＡを利用したが、本発明者らは、さらにターゲット配列としてＤＮＡを利用して、前記実施例１－１及び１－２に開示されたものと同じ条件及び方法でＳｐｌｉｎｔ Ｒリガーゼを利用したプローブ同士のライゲーション反応、Ｔ７重合酵素を利用した転写反応を実施した後、バイオアナライザを通して確認した。
バイオアナライザは、Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００を使用し、この時に使用したｋｉｔは、Ａｇｉｌｅｎｔ ＲＮＡ ６０００ ｎａｎｏ ｋｉｔである。これは、電気泳動分離と微細流体技術の特性を有するＲＮＡの断片と大きさの分析が敏感にできる。
その結果、図７ａ（ゲルイメージ）及び図７ｂ（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｅｒｏｇｒａｍ）に示したように、副木としてＤＮＡを利用した場合にも、ターゲットＤＮＡが検出されることを確認した。
即ち、前記結果を通して、プロモータープローブ（ＰＰ）、レポータープローブ（ＲＰ）、ターゲットＤＮＡ、ＳｐｌｉｎｔＲリガーゼが全て存在してはじめてライゲーション反応が起こって、プローブアセンブリになり、そのプローブアセンブリが正しく転写されることを、合成したプローブアセンブリを陽性対照群として使用することで確認した。
また、図７ｃに示したように、転写産物がマラカイトグリーンと結合して蛍光を出すかをＨｉｄｅｘ Ｓｅｎｓｅ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｈｉｄｅｘ．，Ｌｅｍｍｉｎｋδｉｓｅｎｋａｔｕ，Ｆｉｎｌａｎｄ）を利用して確認した。
即ち、前記結果を通して、副木（Ｓｐｌｉｎｔ）がＲＮＡでないＤＮＡでもライゲーション反応、Ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応、ＲＮＡアプタマーを利用した蛍光発現反応の全てがよく起こることを確認した。
また、さらに上述した３つの反応（ライゲーション反応、Ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応、ＲＮＡアプタマーを利用した蛍光発現反応）が、前記実施例２において糾明された「等温単一反応」条件、即ち、３７℃の等温下で、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＮＴＰｓ、１０．５ｍＭ ＮａＣｌ及びＥＴ－ＳＳＢ ４００ｎｇを含む単一反応溶液で一つの容器で実施する場合にも起こるかを確認した。
副木ＤＮＡとしてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（新種のコロナウイルス）のターゲット遺伝子であるＲｄＲｐ（ＲＮＡ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）のＤＮＡを利用し、ＤＦＨＢＩ－１Ｔ（（５Ｚ）－５－［（３，５－Ｄｉｆｌｕｏｒｏ－４－ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ｍｅｔｈｙｌｅｎｅ］－３，５－ｄｉｈｙｄｒｏ－２－ｍｅｔｈｙｌ－３－（２，２，２－ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｅｔｈｙｌ）－４Ｈ－ｉｍｉｄａｚｏｌ－４－ｏｎｅ）に結合するブロッコリーアプタマー（ＤＦＨＢＩ－１Ｔ／ＢＲＡｐｔ）を利用してこれらの間の蛍光反応でターゲット対象を検出しようとした。
その結果、図７ｄに示したように、ターゲットＤＮＡが入っていない状態よりターゲットＤＮＡが入っているサンプルで蛍光の強さがさらに高くなることを確認することができる。
従って、本発明のライゲーション反応を利用した分子診断プラットホームは、副木としてＤＮＡを使用してもターゲット検出に無理なく適用できるということを立証した。
【0011】
実施例４．等温単一反応プラットホームを利用した診断の迅速性、敏感性及び特異性の確認
４－１．等温単一反応プラットホームを利用した迅速性の確認
本発明者らは、前記実施例２の表４で確認した本発明の最適な等温単一反応条件である３７℃等温及び単一反応溶液の条件下で、本発明のプローブセット、ターゲットＲＮＡ（副木ＲＮＡとしてＭＲＳＡのターゲット遺伝子であるｍｅｃＡ）、マラカイトグリーン、リガーゼ及び重合酵素が含まれた一つの容器で等温単一反応を実施した時に必要となる時間を測定した。
このとき、９６－ｗｅｌｌ ｂｌａｃｋ ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｃｌｅａｒ ｆｌａｔ ｂｏｔｔｏｍ（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ）を使用し、反応容量は、１００μＬであった。
ターゲットＲＮＡの分子数を異にして添加し、０分、３０分、６０分、９０分、１２０分の経過後、Ｈｉｄｅｘ Ｓｅｎｓｅ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒを利用して蛍光を測定した。
その結果、図８ａに示したように、最終結果を単に２時間ぶりに速やかに確保することができ、これは、従来の増幅反応を利用するＰＣＲ方法より検出時間を顕著に短縮させたということを示す。
特に、３０分以後から蛍光値の差を示し始め、６０分の反応時間が過ぎると、ターゲットＲＮＡの存在有無によって蛍光値の差を明確に区分できるものと示された。
４－２．等温単一反応プラットホームを利用した診断敏感性（ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）の確認
等温単一反応が可能であることを明らかにした後、この反応を通した検出限界（Ｌｉｍｉｔ ｏｆ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）を測定した。まず、ターゲットＲＮＡのステップ別の希釈を通して２２０ｎＭ－０．１ａＭの濃度範囲の試料を作製した。検出しようとするターゲットＲＮＡの分子数で示すと、２２０ｎＭのｍｅｃＡ ＲＮＡは２５３ｎｔの長さであり、１００μＬ反応に含まれたＲＮＡは２．２ｐｍｏｌｅｓであるので、これは、１．３２ｘ１０１２個のＲＮＡ分子に該当する。
本実施例においては、１．３２ｘ１０１２個のＲＮＡ（２２０ｎＭ）から６個のＲＮＡ（０．１ａＭ）までの範囲のターゲットＲＮＡを添加し、等温単一反応を進行した後に蛍光を測定して、ターゲットＲＮＡが存在しない陰性対照群との蛍光差を通してターゲットＲＮＡの存在有無を判断した。本発明者らは、本発明において開発した等温単一反応で６個のＲＮＡまで検出できることを確認した（図８ｂ）。
４－１．等温単一反応プラットホームを利用した迅速性の確認
本発明者らは、前記実施例２の表４で確認した本発明の最適な等温単一反応条件である３７℃等温及び単一反応溶液の条件下で、本発明のプローブセット、ターゲットＲＮＡ（副木ＲＮＡとしてＭＲＳＡのターゲット遺伝子であるｍｅｃＡ）、マラカイトグリーン、リガーゼ及び重合酵素が含まれた一つの容器で等温単一反応を実施した時に必要となる時間を測定した。
このとき、９６－ｗｅｌｌ ｂｌａｃｋ ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｃｌｅａｒ ｆｌａｔ ｂｏｔｔｏｍ（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ）を使用し、反応容量は、１００μＬであった。
ターゲットＲＮＡの分子数を異にして添加し、０分、３０分、６０分、９０分、１２０分の経過後、Ｈｉｄｅｘ Ｓｅｎｓｅ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒを利用して蛍光を測定した。
その結果、図８ａに示したように、最終結果を単に２時間ぶりに速やかに確保することができ、これは、従来の増幅反応を利用するＰＣＲ方法より検出時間を顕著に短縮させたということを示す。
特に、３０分以後から蛍光値の差を示し始め、６０分の反応時間が過ぎると、ターゲットＲＮＡの存在有無によって蛍光値の差を明確に区分できるものと示された。
４－２．等温単一反応プラットホームを利用した診断敏感性（ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）の確認
等温単一反応が可能であることを明らかにした後、この反応を通した検出限界（Ｌｉｍｉｔ ｏｆ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）を測定した。まず、ターゲットＲＮＡのステップ別の希釈を通して２２０ｎＭ－０．１ａＭの濃度範囲の試料を作製した。検出しようとするターゲットＲＮＡの分子数で示すと、２２０ｎＭのｍｅｃＡ ＲＮＡは２５３ｎｔの長さであり、１００μＬ反応に含まれたＲＮＡは２．２ｐｍｏｌｅｓであるので、これは、１．３２ｘ１０１２個のＲＮＡ分子に該当する。
本実施例においては、１．３２ｘ１０１２個のＲＮＡ（２２０ｎＭ）から６個のＲＮＡ（０．１ａＭ）までの範囲のターゲットＲＮＡを添加し、等温単一反応を進行した後に蛍光を測定して、ターゲットＲＮＡが存在しない陰性対照群との蛍光差を通してターゲットＲＮＡの存在有無を判断した。本発明者らは、本発明において開発した等温単一反応で６個のＲＮＡまで検出できることを確認した（図８ｂ）。
【0012】
実施例５．等温単一反応プラットホームを通した多様な病原菌ＲＮＡ検出の確認
次に、本発明者らは、多様な病原体からＲＮＡマーカーの検出のために等温単一反応プラットホームを再構成して本発明の等温単一反応用プローブを利用する場合、実際に目的とするターゲットを速やかで正確かつ容易で効果的に検出できるだけではなく、高い敏感度で検出できることを糾明した。
ターゲット遺伝子によってターゲット遺伝子と混成化（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）するプローブの二つの領域（ＵＨＳ及びＤＨＳ）だけを変えればよいので、多くの計算ステップなしにプローブ設計プロセスを速く簡単に遂行できる。この等温単一反応は、ヌクレオチド配列だけを必要とするので、多様な感染性疾患に対して容易くプローブをデザインし、構成できるようにする（図９ａ）。ターゲット遺伝子の配列だけ確保されれば、本発明者らが所望の配列を上流、下流に加えることで容易にプローブセットを作製できる。そのように作製されたプローブ配列は、表５に並べた。
［表５］
（ＭＧ－ＲＰは、マラカイトグリーンアプタマー配列を含むレポータープローブ配列を指す。ＢＲ－ＲＰは、ブロッコリーアプタマー配列を含むレポータープローブ配列を指す。大文字で表示したヌクレオチドは、ターゲット核酸配列と相補的な混成化配列を指す。
小文字で表示したヌクレオチドは、ステム－ループ構造（Ｓｔｅｍ－ｌｏｏｐ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）をなすＴ７プロモーターｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ配列＋ループ配列＋Ｔ７プロモーター配列を指し、下線を引いたヌクレオチドは、ステム－ループ構造（Ｓｔｅｍ－ｌｏｏｐ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）中、ステムをなすヌクレオチドを指す。
小文字イタリック体で表示したヌクレオチドは、アプタマー配列を指す（マラカイトグリーンアプタマー；ＭＧ、ブロッコリーアプタマー配列；ＢＲ）。
５’－Ｐｈは、５’－末端にリン酸化させたものを指す。）
そこで、等温単一反応に対する多様な病原体検出を立証するために、まず、Ｖ．ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ（Ｖｉｂｒｉｏ ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ）とＥ．ｃｏｌｉ Ｏ１５７：Ｈ７（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｏ１５７：Ｈ７）の二つの病原性微生物を標的にした。Ｖ．ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓは、ヒトの胃腸炎、傷感染及び敗血症を誘発するものと知られている。これを検出するために、本発明者は、ｖｖｈＡ遺伝子をターゲットにした。ｖｖｈＡは、細胞外で細胞毒性効果、溶血活性を有する遺伝子である。
その結果、本発明の等温単一反応を通してＶ．ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓが効果的に検出された。また、Ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応を通して作られたｖｖｈＡを検出するためのプローブ対を利用した等温単一反応の敏感度は、０．１ａＭ（１０－１８ｍｏｌ／Ｌ）であり、ターゲット遺伝子濃度と蛍光の強さとの間の線形相関関係Ｒ２＝０．９５６６と観察された（図９ｂ）。
また、食中毒を起こすＥ．ｃｏｌｉ Ｏ１５７：Ｈ７を検出するプローブ対をデザインし、そのプローブ対でｔｉｒ遺伝子をターゲット遺伝子として利用して検出した。
その結果、本発明の等温単一反応を通してＥ．ｃｏｌｉ Ｏ１５７：Ｈ７が効果的に検出された。また、類似するように、０．１ａＭの低いＲＮＡ濃度が等温単一反応により検出され、ＲＮＡの濃度と蛍光の強さとの間の高い線形相関関係Ｒ２＝０．９６８４が観察された（図９ｃ）。
また、ターゲットを致命的な疾病を起こすヒト感染性ＲＮＡウイルスに拡張した。
まず、中東呼吸器症候群関連コロナウイルス（Ｍｉｄｄｌｅ Ｅａｓｔ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）を目標とした。ＭＥＲＳ－ＣｏＶの死亡率は３５％と報告されており、ヒトからヒトへ伝染され得、速く敏感な現場診断テストの必要性が高い。
その結果、本発明の等温単一反応を通してＭＥＲＳ－ＣｏＶが効果的に検出された。また、ＭＥＲＳ－ＣｏＶターゲット遺伝子ｕｐＥに対するプローブ対は、バクテリアの事例と類似した敏感度及び線形性を示した（図９ｄ）。
また、本発明者らは、インフルエンザＡウイルスターゲット遺伝子、ＨＡ（血球凝集素）遺伝子に対するプローブ対を設計した。
その結果、本発明の等温単一反応を通してインフルエンザＡウイルスが効果的に検出された。また、同様に高い敏感度と高い線形性を示した（図９ｅ）。
また、近年出現したウイルスであるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（Ｓｅｖｅｒｅ Ａｃｕｔｅ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ２）（新種のコロナウイルス）に対するプローブ対を設計した。ＲＮＡ－依存的ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）遺伝子をターゲットにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する標準リアルタイム重合酵素連鎖反応（Ｒｅａｌ ｔｉｍｅ－ＰＣＲ）に基づいてターゲット遺伝子配列を選択した。
その結果、本発明の等温単一反応を通してＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が効果的に検出された。また、等温単一反応は、０．１ａＭだけ低い標的ＲＮＡを成功的に検出しており（図９ｆ）、これは、多様なターゲットＲＮＡ検出において高い汎用性を立証する。
次に、本発明者らは、多様な病原体からＲＮＡマーカーの検出のために等温単一反応プラットホームを再構成して本発明の等温単一反応用プローブを利用する場合、実際に目的とするターゲットを速やかで正確かつ容易で効果的に検出できるだけではなく、高い敏感度で検出できることを糾明した。
ターゲット遺伝子によってターゲット遺伝子と混成化（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）するプローブの二つの領域（ＵＨＳ及びＤＨＳ）だけを変えればよいので、多くの計算ステップなしにプローブ設計プロセスを速く簡単に遂行できる。この等温単一反応は、ヌクレオチド配列だけを必要とするので、多様な感染性疾患に対して容易くプローブをデザインし、構成できるようにする（図９ａ）。ターゲット遺伝子の配列だけ確保されれば、本発明者らが所望の配列を上流、下流に加えることで容易にプローブセットを作製できる。そのように作製されたプローブ配列は、表５に並べた。
［表５］
小文字で表示したヌクレオチドは、ステム－ループ構造（Ｓｔｅｍ－ｌｏｏｐ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）をなすＴ７プロモーターｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ配列＋ループ配列＋Ｔ７プロモーター配列を指し、下線を引いたヌクレオチドは、ステム－ループ構造（Ｓｔｅｍ－ｌｏｏｐ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）中、ステムをなすヌクレオチドを指す。
小文字イタリック体で表示したヌクレオチドは、アプタマー配列を指す（マラカイトグリーンアプタマー；ＭＧ、ブロッコリーアプタマー配列；ＢＲ）。
５’－Ｐｈは、５’－末端にリン酸化させたものを指す。）
そこで、等温単一反応に対する多様な病原体検出を立証するために、まず、Ｖ．ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ（Ｖｉｂｒｉｏ ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ）とＥ．ｃｏｌｉ Ｏ１５７：Ｈ７（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｏ１５７：Ｈ７）の二つの病原性微生物を標的にした。Ｖ．ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓは、ヒトの胃腸炎、傷感染及び敗血症を誘発するものと知られている。これを検出するために、本発明者は、ｖｖｈＡ遺伝子をターゲットにした。ｖｖｈＡは、細胞外で細胞毒性効果、溶血活性を有する遺伝子である。
その結果、本発明の等温単一反応を通してＶ．ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓが効果的に検出された。また、Ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応を通して作られたｖｖｈＡを検出するためのプローブ対を利用した等温単一反応の敏感度は、０．１ａＭ（１０－１８ｍｏｌ／Ｌ）であり、ターゲット遺伝子濃度と蛍光の強さとの間の線形相関関係Ｒ２＝０．９５６６と観察された（図９ｂ）。
また、食中毒を起こすＥ．ｃｏｌｉ Ｏ１５７：Ｈ７を検出するプローブ対をデザインし、そのプローブ対でｔｉｒ遺伝子をターゲット遺伝子として利用して検出した。
その結果、本発明の等温単一反応を通してＥ．ｃｏｌｉ Ｏ１５７：Ｈ７が効果的に検出された。また、類似するように、０．１ａＭの低いＲＮＡ濃度が等温単一反応により検出され、ＲＮＡの濃度と蛍光の強さとの間の高い線形相関関係Ｒ２＝０．９６８４が観察された（図９ｃ）。
また、ターゲットを致命的な疾病を起こすヒト感染性ＲＮＡウイルスに拡張した。
まず、中東呼吸器症候群関連コロナウイルス（Ｍｉｄｄｌｅ Ｅａｓｔ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）を目標とした。ＭＥＲＳ－ＣｏＶの死亡率は３５％と報告されており、ヒトからヒトへ伝染され得、速く敏感な現場診断テストの必要性が高い。
その結果、本発明の等温単一反応を通してＭＥＲＳ－ＣｏＶが効果的に検出された。また、ＭＥＲＳ－ＣｏＶターゲット遺伝子ｕｐＥに対するプローブ対は、バクテリアの事例と類似した敏感度及び線形性を示した（図９ｄ）。
また、本発明者らは、インフルエンザＡウイルスターゲット遺伝子、ＨＡ（血球凝集素）遺伝子に対するプローブ対を設計した。
その結果、本発明の等温単一反応を通してインフルエンザＡウイルスが効果的に検出された。また、同様に高い敏感度と高い線形性を示した（図９ｅ）。
また、近年出現したウイルスであるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（Ｓｅｖｅｒｅ Ａｃｕｔｅ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ２）（新種のコロナウイルス）に対するプローブ対を設計した。ＲＮＡ－依存的ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）遺伝子をターゲットにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する標準リアルタイム重合酵素連鎖反応（Ｒｅａｌ ｔｉｍｅ－ＰＣＲ）に基づいてターゲット遺伝子配列を選択した。
その結果、本発明の等温単一反応を通してＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が効果的に検出された。また、等温単一反応は、０．１ａＭだけ低い標的ＲＮＡを成功的に検出しており（図９ｆ）、これは、多様なターゲットＲＮＡ検出において高い汎用性を立証する。
【0013】
実施例６．等温単一反応プラットホームを通した実際の病原菌検出の確認
次に、本発明者らは、病原体の生きている細胞からターゲットＲＮＡ検出のために等温単一反応を使用した。既に等温単一反応で検出されたことがあるＭＲＳＡをターゲット病原菌とした。実験の正確度を高めるためにターゲットＲＮＡを持っていないＭＳＳＡ（ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ－ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）を陰性対照群として使用した。ＭＲＳＡとＭＳＳＡ細胞を９５℃に加熱して溶解させた後、ＲＮＡを放出させた。これを希釈した後、等温単一反応に添加して特異性及び敏感度を調査した。
その結果、ＭＲＳＡとＭＳＳＡを入れたサンプルの蛍光の強さにおいて有意味な差が観察された。１００μＬ反応当たり２ＣＦＵ（Ｃｅｌｌ ｆｏｒｍｉｎｇ ｕｎｉｔ）からＭＲＳＡ、ＭＳＳＡを入れたサンプル間の蛍光の差が明確に現れ、生きている病原体サンプルを利用した等温単一反応でも高い敏感度と特異性を表すことを示した（図１０ａ及び図１０ｂ）。
最後に、ヒト血清に希釈したＭＲＳＡ、ＭＳＳＡ病原菌サンプルを注入して臨床サンプルと類似した状態でのターゲットＲＮＡ検出に対する等温単一反応の性能をさらに検証した（図１０ｃ）。
その結果、図１０ｄに示したように、２ＣＦＵ／μＬから検出可能であることを確認した。
これを通して、本発明の等温単一反応が実際の応用分野（類似臨床サンプル）でも高い敏感度及び特異度で適用可能であることを確認した。
次に、本発明者らは、病原体の生きている細胞からターゲットＲＮＡ検出のために等温単一反応を使用した。既に等温単一反応で検出されたことがあるＭＲＳＡをターゲット病原菌とした。実験の正確度を高めるためにターゲットＲＮＡを持っていないＭＳＳＡ（ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ－ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）を陰性対照群として使用した。ＭＲＳＡとＭＳＳＡ細胞を９５℃に加熱して溶解させた後、ＲＮＡを放出させた。これを希釈した後、等温単一反応に添加して特異性及び敏感度を調査した。
その結果、ＭＲＳＡとＭＳＳＡを入れたサンプルの蛍光の強さにおいて有意味な差が観察された。１００μＬ反応当たり２ＣＦＵ（Ｃｅｌｌ ｆｏｒｍｉｎｇ ｕｎｉｔ）からＭＲＳＡ、ＭＳＳＡを入れたサンプル間の蛍光の差が明確に現れ、生きている病原体サンプルを利用した等温単一反応でも高い敏感度と特異性を表すことを示した（図１０ａ及び図１０ｂ）。
最後に、ヒト血清に希釈したＭＲＳＡ、ＭＳＳＡ病原菌サンプルを注入して臨床サンプルと類似した状態でのターゲットＲＮＡ検出に対する等温単一反応の性能をさらに検証した（図１０ｃ）。
その結果、図１０ｄに示したように、２ＣＦＵ／μＬから検出可能であることを確認した。
これを通して、本発明の等温単一反応が実際の応用分野（類似臨床サンプル）でも高い敏感度及び特異度で適用可能であることを確認した。
【0014】
実施例７．等温単一反応の直交性（ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ）２個のプローブ対を利用した二重ターゲットの探知
７－１．等温単一反応を利用した互いに異なる種類の病原体の同時探知
本発明者らは、簡単なプローブデザインを活用して等温単一反応で二つのターゲットＲＮＡを同時に検出できるようにその機能を拡張した。
偽陽性及び偽陰性結果を減らすことでもう少し正確なターゲット検出有無に対する判断を下すためには、様々なバイオマーカーを探知することが重要である。等温単一反応プローブの高い特異性と独特なスペクトル特性を有するＲＮＡアプタマーの可溶性に基づいて、本発明者らは、それぞれの標的ＲＮＡを検出するために、単一反応で直交性を有する２セットの等温単一反応プローブを設計した。まず、インフルエンザＡウイルスに対する直交レポータープローブを開発した。ＭＲＳＡ感染は、インフルエンザと類似した症状を誘発するので、一般的なインフルエンザＡウイルスとこの病原体を区別すべき必要性がある。また、インフルエンザＡ感染患者は、ＭＲＳＡ感染にさらに脆弱である。総合的に、二つの病原体の同時探知及び識別は、診断と後続措置に役立つことができる。インフルエンザＡウイルスに対する直交レポータープローブは、そのアプタマー配列をＤＦＨＢＩ－１Ｔ（（５Ｚ）－５－［（３，５－Ｄｉｆｌｕｏｒｏ－４－ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ｍｅｔｈｙｌｅｎｅ］－３，５－ｄｉｈｙｄｒｏ－２－ｍｅｔｈｙｌ－３－（２，２，２－ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｅｔｈｙｌ）－４Ｈ－ｉｍｉｄａｚｏｌ－４－ｏｎｅ）に結合するブロッコリーアプタマー配列に変えてデザインした。ブロッコリーアプタマーは、マラカイトグリーンアプタマーとは全く異なるスペクトル特性を示す。マラカイトグリーンのスペクトル範囲がｅｍｉｓｓｉｏｎ：６１６ｎｍ、ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ：６６５ｎｍであるのに対し、ブロッコリーアプタマーは、スペクトルの範囲がｅｍｉｓｓｉｏｎ：４６０ｎｍ、ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ：５２０ｎｍである。ＮＵＰＡＣＫを使用して新たなレポータープローブ及び該当ｆｕｌｌ－ｌｅｎｇｔｈ ＲＮＡ転写体の二次構造をシミュレーションし、これは、さらなる最適化なしでも本発明者らのプローブ設計基準を満たした。ＭＲＳＡ及びインフルエンザＡウイルスの二重検出は、２個のプローブ対、それらが結合する蛍光染料及び多様な濃度のターゲットＲＮＡが添加された状況で等温単一反応で進行された（図１１ａ）。プローブ対がそれらのそれぞれの標的ＲＮＡに混成化（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）され、成功的な転写反応が後続するようになると、ＲＮＡアプタマーは、それらが結合する蛍光染料に結合して区別可能な蛍光を放出する。それぞれのターゲットＲＮＡの存在は、等温単一反応からの蛍光パターンにより決定され得る：ＭＲＳＡに対するマラカイトグリーンアプタマー蛍光及びインフルエンザＡウイルスに対するブロッコリーアプタマー蛍光。実際に、ターゲットＲＮＡ（１ｎＭ）の存在は、互いに異なる蛍光パターンにより容易に検出された（図１１ｂ）。多様な濃度の各ターゲットＲＮＡにわたって、等温単一反応プローブは、それぞれの標的にのみ反応する蛍光が特異的に生成されることを確認し（図１１ｃ）、本発明者らは、等温単一反応を利用した２個病原体の二重探知が可能であることを検証した。
７－２．等温単一反応を利用した特定の病原体の多数のターゲット領域の同時探知
本発明者らは、直交二重検出をＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に適用した。ゲノムに沿って多数のターゲット部位を同時に検出すると、この病原体を高い配列相同性を有する多くの関連ウイルスから区別することができる。以前に立証された（図９ｆ参照）プローブ対の他にもマラカイトグリーンアプタマー（ＭＧ）またはブロッコリーアプタマー（ＢＲ）を使用してＲｄＲｐ遺伝子の他の領域に対して３個の追加のプローブ対をデザインした。それぞれのプローブ対は、プロモータープローブ（ＰＰ、ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｐｒｏｂｅ）の５’－末端またはレポータープローブ（ＲＰ、ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｐｒｏｂｅ）の３’－末端にｍｉｓｍａｔｃｈされた塩基を含んでおり、これは他の類似したウイルスに比較してＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２にのみ存在する（図１２ａ）。プローブとターゲットでないＲＮＡとの間では混成化（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）ができないので、それ以後の過程であるライゲーション及び転写反応、蛍光反応を含む反応が起こらずＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の特異的検出を可能にすることができる。実際に、この４個のプローブ対は、１ａＭのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ターゲットＲＮＡを検出することができ、関連ウイルスＲＮＡ配列に比してさらに高い蛍光の強さを示す（図１２ｂ）。その後、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＭＧ１及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＢＲ２プローブ対を使用して二つの対象領域の直交二重探知が可能であるかを実験した。
その結果、等温単一反応の二重探知でターゲットＲＮＡの他の領域をそれぞれ効果的に検出することを確認した（図１２ｃ）。
従って、等温単一反応を利用した二重探知は、互いに補完できる二つの検出結果を提供して、さらに正確な診断のために使用され得る。
以上、本発明内容の特定の部分を詳細に記述したが、当業界における通常の知識を有する者にとって、このような具体的な記述は単に好ましい実施様態であるだけで、これによって本発明の範囲が制限されるものではない点は明らかであるだろう。従って、本発明の実質的な範囲は、添付の請求項とそれらの等価物により定義されるといえるだろう。
７－１．等温単一反応を利用した互いに異なる種類の病原体の同時探知
本発明者らは、簡単なプローブデザインを活用して等温単一反応で二つのターゲットＲＮＡを同時に検出できるようにその機能を拡張した。
偽陽性及び偽陰性結果を減らすことでもう少し正確なターゲット検出有無に対する判断を下すためには、様々なバイオマーカーを探知することが重要である。等温単一反応プローブの高い特異性と独特なスペクトル特性を有するＲＮＡアプタマーの可溶性に基づいて、本発明者らは、それぞれの標的ＲＮＡを検出するために、単一反応で直交性を有する２セットの等温単一反応プローブを設計した。まず、インフルエンザＡウイルスに対する直交レポータープローブを開発した。ＭＲＳＡ感染は、インフルエンザと類似した症状を誘発するので、一般的なインフルエンザＡウイルスとこの病原体を区別すべき必要性がある。また、インフルエンザＡ感染患者は、ＭＲＳＡ感染にさらに脆弱である。総合的に、二つの病原体の同時探知及び識別は、診断と後続措置に役立つことができる。インフルエンザＡウイルスに対する直交レポータープローブは、そのアプタマー配列をＤＦＨＢＩ－１Ｔ（（５Ｚ）－５－［（３，５－Ｄｉｆｌｕｏｒｏ－４－ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ｍｅｔｈｙｌｅｎｅ］－３，５－ｄｉｈｙｄｒｏ－２－ｍｅｔｈｙｌ－３－（２，２，２－ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｅｔｈｙｌ）－４Ｈ－ｉｍｉｄａｚｏｌ－４－ｏｎｅ）に結合するブロッコリーアプタマー配列に変えてデザインした。ブロッコリーアプタマーは、マラカイトグリーンアプタマーとは全く異なるスペクトル特性を示す。マラカイトグリーンのスペクトル範囲がｅｍｉｓｓｉｏｎ：６１６ｎｍ、ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ：６６５ｎｍであるのに対し、ブロッコリーアプタマーは、スペクトルの範囲がｅｍｉｓｓｉｏｎ：４６０ｎｍ、ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ：５２０ｎｍである。ＮＵＰＡＣＫを使用して新たなレポータープローブ及び該当ｆｕｌｌ－ｌｅｎｇｔｈ ＲＮＡ転写体の二次構造をシミュレーションし、これは、さらなる最適化なしでも本発明者らのプローブ設計基準を満たした。ＭＲＳＡ及びインフルエンザＡウイルスの二重検出は、２個のプローブ対、それらが結合する蛍光染料及び多様な濃度のターゲットＲＮＡが添加された状況で等温単一反応で進行された（図１１ａ）。プローブ対がそれらのそれぞれの標的ＲＮＡに混成化（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）され、成功的な転写反応が後続するようになると、ＲＮＡアプタマーは、それらが結合する蛍光染料に結合して区別可能な蛍光を放出する。それぞれのターゲットＲＮＡの存在は、等温単一反応からの蛍光パターンにより決定され得る：ＭＲＳＡに対するマラカイトグリーンアプタマー蛍光及びインフルエンザＡウイルスに対するブロッコリーアプタマー蛍光。実際に、ターゲットＲＮＡ（１ｎＭ）の存在は、互いに異なる蛍光パターンにより容易に検出された（図１１ｂ）。多様な濃度の各ターゲットＲＮＡにわたって、等温単一反応プローブは、それぞれの標的にのみ反応する蛍光が特異的に生成されることを確認し（図１１ｃ）、本発明者らは、等温単一反応を利用した２個病原体の二重探知が可能であることを検証した。
７－２．等温単一反応を利用した特定の病原体の多数のターゲット領域の同時探知
本発明者らは、直交二重検出をＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に適用した。ゲノムに沿って多数のターゲット部位を同時に検出すると、この病原体を高い配列相同性を有する多くの関連ウイルスから区別することができる。以前に立証された（図９ｆ参照）プローブ対の他にもマラカイトグリーンアプタマー（ＭＧ）またはブロッコリーアプタマー（ＢＲ）を使用してＲｄＲｐ遺伝子の他の領域に対して３個の追加のプローブ対をデザインした。それぞれのプローブ対は、プロモータープローブ（ＰＰ、ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｐｒｏｂｅ）の５’－末端またはレポータープローブ（ＲＰ、ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｐｒｏｂｅ）の３’－末端にｍｉｓｍａｔｃｈされた塩基を含んでおり、これは他の類似したウイルスに比較してＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２にのみ存在する（図１２ａ）。プローブとターゲットでないＲＮＡとの間では混成化（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）ができないので、それ以後の過程であるライゲーション及び転写反応、蛍光反応を含む反応が起こらずＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の特異的検出を可能にすることができる。実際に、この４個のプローブ対は、１ａＭのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ターゲットＲＮＡを検出することができ、関連ウイルスＲＮＡ配列に比してさらに高い蛍光の強さを示す（図１２ｂ）。その後、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＭＧ１及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＢＲ２プローブ対を使用して二つの対象領域の直交二重探知が可能であるかを実験した。
その結果、等温単一反応の二重探知でターゲットＲＮＡの他の領域をそれぞれ効果的に検出することを確認した（図１２ｃ）。
従って、等温単一反応を利用した二重探知は、互いに補完できる二つの検出結果を提供して、さらに正確な診断のために使用され得る。
以上、本発明内容の特定の部分を詳細に記述したが、当業界における通常の知識を有する者にとって、このような具体的な記述は単に好ましい実施様態であるだけで、これによって本発明の範囲が制限されるものではない点は明らかであるだろう。従って、本発明の実質的な範囲は、添付の請求項とそれらの等価物により定義されるといえるだろう。
【図1a】
【図1b】
【図1c】
【図1d】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5a】
【図5b】
【図5c】
【図5d】
【図6a】
【図6b】
【図6c】
【図7a】
【図7b】
【図7c】
【図7d】
【図8a】
【図8b】
【図9a-9f】
【図10a-10d】
【図11a-11c】
【図12a-12c】
【配列表】