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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-04-22
(45)【発行日】2024-05-01
(54)【発明の名称】幹細胞療法
(51)【国際特許分類】
A61K 35/28 20150101AFI20240423BHJP
A61P 7/00 20060101ALI20240423BHJP
A61P 37/02 20060101ALI20240423BHJP
A61P 3/00 20060101ALI20240423BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20240423BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20240423BHJP
A61K 35/51 20150101ALI20240423BHJP
C12N 5/0789 20100101ALN20240423BHJP
【ＦＩ】
A61K35/28
A61P7/00
A61P37/02
A61P3/00
A61P25/00
A61P35/02
A61K35/51
C12N5/0789
【請求項の数】
23
(21)【出願番号】P 2021547955
(86)(22)【出願日】2019-10-24
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-02-07
(86)【国際出願番号】 GB2019053027
(87)【国際公開番号】W WO2020084310
(87)【国際公開日】2020-04-30
【審査請求日】2022-10-18
(31)【優先権主張番号】1817385.6
(32)【優先日】2018-10-25
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(73)【特許権者】
【識別番号】521176684
【氏名又は名称】プラスティセル リミテッド
【氏名又は名称原語表記】ＰＬＡＳＴＩＣＥＬＬ ＬＩＭＩＴＥＤ
(74)【代理人】
【識別番号】110000774
【氏名又は名称】弁理士法人 もえぎ特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】フェルナンデス，ダイアナ
【審査官】渡邉 潤也
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１８－５１９２９８（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２００４／０４６３１２（ＷＯ，Ａ２）
【文献】特表２０１６－５２４４６８（ＪＰ，Ａ）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ
Ｃ１２Ｎ
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
療法における使用のための拡大された細胞の集団を含む医薬組成物であって、前記細胞が、ｉ）単離されたＨＳＰＣの集団を取得することと、
ｉｉ）ヒストンデアセチラーゼ阻害剤（ＨＤＡＣ阻害剤）の存在下で前記単離されたＨＳＰＣの集団を培養して、培養された集団を形成することと、
ｉｉｉ）式ＲＮＨ（ＣｎＨ２ｎ）ＮＨ（ＣｎＨ２ｎ）ＳＸ（式中、Ｒは、水素、アリール、アシル、または１～７個の炭素原子を含むアルキル基であり、各ｎは２～６の値を有し、ＸはＨまたはＰＯ３Ｈ２である）を有するアミノチオール化合物、またはその薬学的に許容される塩を前記培養されたＨＳＰＣの集団に加えて、拡大された細胞を形成することと、を含む、方法によって拡大されている、医薬組成物。
【請求項2】
血液学的障害、免疫障害、代謝障害、または神経変性障害の治療における使用のための、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項3】
前記療法が哺乳動物の骨髄を再増殖させることを含む、請求項１または２に記載の医薬組成物。
【請求項4】
急性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、非ホジキンリンパ腫、重症再生不良性貧血、重症複合免疫不全症または鎌状赤血球症の治療における使用のための、請求項１～３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項5】
遺伝子療法における使用のための、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項6】
工程ｉ）が、ＣＤ１３３＋である細胞を選択することを含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項7】
工程ｉ）が、ＣＤ３４＋である細胞を選択することを含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項8】
前記ＨＤＡＣ阻害剤がスクリプタイド（ｓｃｒｉｐｔａｉｄ）またはキシノスタットである、請求項１～７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項9】
前記ＨＤＡＣ阻害剤がスクリプタイドである、請求項１～８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項10】
前記アミノチオール化合物が、アミホスチン：【化1】
ＷＲ１０６５：
【化2】
【請求項11】
前記アミノチオール化合物がＷＲ１０６５である、請求項１～１０のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項12】
前記単離された集団が臍帯血から取得される、請求項１～１１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項13】
前記単離された集団が末梢血から取得される、請求項１～１２のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項14】
前記単離された集団が骨髄から取得される、請求項１～１２のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項15】
前記工程ｉｉ）およびｉｉｉ）が、拡大された細胞を形成するために５日～１０日の合計時間にわたって実施される、請求項１～１４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項16】
前記細胞が無血清組織培養系またはフィーダーフリー組織培養系において培養される、請求項１～１５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項17】
前記細胞が、哺乳動物又はヒトから取得される、請求項１～１６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項18】
前記拡大された細胞がＨＳＣについて富化されている、請求項１～１７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項19】
前記拡大された細胞がＬｉｎ－、ＣＤ３８－、ＣＤ３４＋、ＣＤ１３３＋、ＣＤ４５ＲＡ－、ＣＤ９０＋、ＣＤ４９ｆ＋について富化されている、請求項１～１８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項20】
全細胞拡大が２倍～２０倍である、請求項１～１９のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項21】
Ｌｉｎ－、ＣＤ３８－、ＣＤ３４＋、ＣＤ１３３＋、ＣＤ４５ＲＡ－、ＣＤ９０＋およびＣＤ４９ｆ＋細胞の拡大が４００～６００倍である、請求項１～２０のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項22】
前記ＨＤＡＣ阻害剤が０．０１～５０μＭの濃度で使用される、請求項１～２１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項23】
前記アミノチオール化合物が５０～５００μＭの濃度で使用される、請求項１～２２のいずれか１項に記載の医薬組成物。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、造血幹細胞および前駆細胞を拡大するための方法に関する。療法における使用のために、本発明の方法を使用して拡大させた多能性細胞もまた本明細書に開示される。
【背景技術】
【0002】
造血幹細胞および前駆細胞移植（ＨＳＣＴ）は、これまでで最も成功し、広く使用されている幹細胞療法である。ＨＳＣＴは、血液障害または化学放射線療法治療など、既存の（ｒｅｓｉｄｅｎｔ）免疫系が損なわれている状態を治療するために使用される。ＨＳＣＴの使用はまた、遺伝子療法においても臨床的に証明されており、新しいゲノム編集技術を用いてさらに拡大されることが期待されている。それにもかかわらず、移植片はレシピエントに組織を適合させる必要があり、需要が供給よりも高くなるため、課題は依然として存在する。
【0003】
当初、移植用の造血幹細胞および前駆細胞（ＨＳＰＣ）は、骨髄（ＢＭ）のみに由来していた。より最近では、臍帯血（ＵＣＢ）にもまた、骨髄に生着し、レシピエントの生涯を通じて血球を生成できるＨＳＰＣが含まれていることが発見された。ＨＳＣＴにおける使用のためのＨＳＰＣの供給源としてＵＣＢを使用することは、より従来型のＢＭに比べていくつかの利点があり、すなわち、ＵＣＢはまた、使用に先立ってテストおよび保管されており、それゆえにより容易に入手可能であり、ＵＣＢはまた、より多くの未成熟幹細胞を含んでおり、組織型の非互換性に起因して、移植片対宿主病の関連性が低くなっていることを示している。しかし、ＵＣＢ由来の細胞を使用する移植は、１つのＵＣＢ単位に存在する細胞の数によって制限される。この量的制限は、１つのＵＣＢ単位のみからのＨＳＰＣの優勢的な生着のため、単一の被験者への複数のＵＣＢ単位の移植によって克服することはできない。したがって、今日まで、これらの移植は小さな子供における使用に制限されてきた。
【0004】
移植前に、最初に全臍帯血単位が分離されて赤血球を廃棄し、続いてＣＤ３４＋細胞またはＣＤ１３３＋細胞のいずれかを選別することによって有核細胞がさらに富化される。マーカーＣＤ１３３は、造血系のものを含む多数の前駆細胞／幹細胞の中に見られる。さらに、長期の再増殖細胞が存在するのは造血細胞のＣＤ１３３＋区画であることが実証されている。したがって、これらの特定の細胞型の数を増やすことにより、生着を大幅に増強し、ＵＣＢ ＨＳＣＴを年長の子供および大人を治療するために適用できるようになる。残念ながら、従来の培養方法を使用すると、マーカーＣＤ１３３、ＣＤ３４、ＣＤ９０、およびＣＤ４９ｆの発現によって特徴付けられるＨＳＣは、これらが増殖しかつ同時に効力が制限された細胞型に分化するにつれて、急速に枯渇する。そのため、幹細胞の特性を損なうことなく、これらのＨＳＣの拡大を可能にする培養条件の開発に大きな関心が寄せられている。
【0005】
これらの細胞が通常存在するニッチまたは環境を模倣しようとすることにより、ＵＣＢ単位内の細胞の総数を増やすためのいくつかの戦略（ｓｔａｔｅｇｉｅｓ）が存在する。１９７０年代に、血清および特定のサイトカイン、主に、幹細胞因子（ＳＣＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、インターロイキン－３（ＩＬ３）、インターロイキン－６（ＩＬ６）、および顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）を含む条件が、インビトロでのＨＳＣの拡大のために使用できることが確立された。９０年代初頭までに、ＳＣＦ、Ｇ－ＣＳＦ、ＭＧＤＦを含む無血清培地中で１０日間拡大されたＵＣＢ細胞を使用する最初の臨床試験が実施された。この拡大法は、全有核細胞（ＴＮＣ）について５６倍の拡大、およびＣＤ３４＋細胞について４倍の拡大をもたらした。患者は、１つの操作された画分と１つの操作されていない画分を一緒にまたは１０日間隔のいずれかで注入された。この試験は、ＵＣＢ単位をエキソビボで拡大する実行可能性と、それらの全体的な安全性を実証した。治療された３７人の患者のうち、すべてが生着を示したが、３０ヶ月後に生存していたのはわずか１２人であった。サイトカインの様々な組み合わせを使用するさらなる研究は、インビトロ拡大のためのより規定されたプロトコルをもたらし、そのいくつかは前臨床モデルにおいて有望であることが示されてきた。これらには、ＳＣＦ、ＴＰＯ、ｆｍｓ様チロシンキナーゼ３－リガンド（ＦＬＴ３ＬＧ）、ＩＬ３およびＩＬ６、ならびにより最近では、Ｗｎｔ１、骨形成タンパク質７（ＢＭＰ７）、アンジオポエチン様５ ＡＮＧＰＴＬ５およびインスリン増殖因子結合タンパク質２（ＩＧＦＢＰ２）の使用が含まれる。
【0006】
造血細胞のインビトロ拡大の間の初期の観察は、細胞の加速された増殖が、これらの細胞の、より連携している（ｃｏｍｍｉｔｅｄ）前駆体またはより最終的に分化した細胞への同時連携している（ｃｏｎｃｏｍｍｉｔａｌ）分化と関連していることを示した。これは、運命の連携がエピジェネティックなレベルで制御されている可能性が高く、特定の遺伝子セットが様々な段階で転写またはサイレンシングされるという仮説をもたらした。それゆえに、エピゲノムを制御または変更することは、細胞の全体的な表現型およびその挙動に対して因果関係を有する。ヒストンデアセチラーゼ阻害剤を含むヒストン修飾因子を使用する調査研究は、有望な結果を生み出した。このような研究の最初のものは、５アザ２’デオキシシチジンおよびトリコスタチンＡを使用した。このレジームを使用すると、ＵＣＢ ＣＤ３４＋／ＣＤ９０＋細胞は、サイトカインのみで拡大された細胞よりも４倍拡大し、ＮＯＤ ＳＣＩＤマウスを再増殖させる能力をさらに保持した。代替のヒストン修飾酵素を含めるためのこれらの研究の拡張は、他のＨＤＡＣ阻害剤もまた同様の特性を有し、これらの中でバルプロ酸およびスクリプタイド（ｓｃｒｉｐｔａｉｄ）が特に有効であることを明らかにした。これは、Ｃｈａｕｒａｓｉａ，Ｐ．＆Ｈｏｆｆｍａｎ，Ｒ．ｉｎ“Ｅｎｒｉｃｈｅｄ ａｎｄ ｅｘｐａｎｄｅｄ ｈｕｍａｎ ｃｏｒｄ ｂｌｏｏｄ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌ ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ”（２０１４），Ａｒａｋｉ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．“Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｃｏｒｄ ｂｌｏｏｄ ＳＣＩＤ－ｒｅｐｏｐｕｌａｔｉｎｇ ｃｅｌｌｓ ｕｓｉｎｇ ｃｈｒｏｍａｔｉｎ－ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ ａｇｅｎｔｓ”（２００６），およびまたＷＯ２０１４／１８９７８１によっても報告された。
【0007】
ＣＤ３４＋細胞の拡大を優先的に可能にし、それらの分化を防ぐ分子を見つけるための化学ライブラリースクリーニングは、いくつかの目的の分子を生じた。注目すべきは、現在臨床試験で細胞を拡大するために使用されているアリール炭化水素受容体アンタゴニストＳｔｅｍＲｅｇｅｎｉｎ１である。注目すべき別の化合物のセットは、ピリミドインドール誘導体ＵＭ７２９およびＵＭ１７１であり、これらは、マーカーＣＤ３４、ＣＤ９０（Ｔｈｙ１）、およびＣＤ４９ｆの存在、ならびにＣＤ３８およびＣＤ４５ＲＡの非存在によって決定されるように、ＨＳＣを優先的に拡大することが見出された。ＣＤ３４＋細胞を優先的に拡大させることが見出されている他の分子には、レスベラトロール、ＧＳＫ－３阻害剤、ｐ１８タンパク質阻害剤などが挙げられる。
【0008】
ＷＲ１０６５のプロドラッグであるアミホスチンは、米軍によって放射線防護化合物として開発され、１９９５年にＥｔｈｙｏｌという名前で臨床使用が承認された。この薬物がその効果を発揮する正確なメカニズムはまだ研究されているところであるが、これは、ｐ５３の活性化を通じてＤＮＡ損傷を防ぐＲＯＳスカベンジャーであるＷＲ１０６５にインビボで代謝される。インビトロでの造血細胞に対するこの化合物の作用の研究は、ＷＲ１０６５を用いた骨髄由来のＣＤ３４＋細胞の前処理が、ＣＦＵ－ＧＥＭＭおよびＢＦＵ－Ｅコロニーの両方の形成が３８倍まで多く増強されることを示した。
【0009】
ＷＯ９６２５０４５は、造血幹細胞増殖のためのアミホスチンを含むチオールを開示している。
【発明の概要】
【0010】
驚くべきことに、ＨＤＡＣ阻害剤、例えば、スクリプタイド、およびＷＲ１０６５などのアミノチオール化合物の組み合わせの存在下で細胞を培養することにより、ＨＳＰＣの拡大を達成することが可能であることが見出された。本発明は、本明細書に提示されたデータに少なくとも部分的に基づいている。本発明の重要な特徴は、細胞がＨＤＡＣ阻害剤の存在下で培養されて培養された集団を形成し、次いで、引き続いてアミノチオール化合物が培養された集団に加えられることである。この方法は、全有核細胞の数が増加する拡大された細胞を生成する。
【0011】
本発明の方法は、ＨＳＣである細胞のサブセットの富化を示す拡大された細胞を生成することが見出された。
【0012】
相乗効果は、ＨＤＡＣ阻害剤とアミノチオール化合物であるＷＲ１０６５との組み合わせを使用することによって観察されている。ＨＳＣの倍数拡大は、ＨＤＡＣ阻害剤単独またはＷＲ１０６５単独の存在下でＨＳＰＣを培養することによる付加的な効果を超えたものである。本明細書に提示されたデータは、この相乗効果が、５００倍までのＨＳＣの富化を伴う拡大された細胞を生成できることを示す。
【0013】
本発明の方法を使用して拡大された細胞が使用されて、インビボで骨髄を再増殖させることができることもまた見出された。ＨＤＡＣ阻害剤とＷＲ１０６５の両方の存在下で拡大された細胞は、照射されたマウスに投与された場合、長期の生着を実証した。さらに、ＨＤＡＣ阻害剤とＷＲ１０６５の両方の存在下で拡大された細胞を投与されたマウスは、全血サンプルに存在するＣＤ４５＋細胞の頻度が高かった。ＣＤ４５は白血球共通抗原であり、多くの免疫系細胞に存在する。
【0014】
したがって、本発明の第１の態様は、造血幹細胞および前駆細胞（ＨＳＰＣ）を拡大する方法に関し、この方法は、
ｉ）単離されたＨＳＰＣの集団を取得することと、
ｉｉ）ヒストンデアセチラーゼ阻害剤（ＨＤＡＣ阻害剤）の存在下で単離されたＨＳＰＣの集団を培養して、培養された集団を形成することと、
ｉｉｉ）式ＲＮＨ（ＣｎＨ２ｎ）ＮＨ（ＣｎＨ２ｎ）ＳＸ（式中、Ｒは、水素、アリール、アシル、または１～７個の炭素原子を含むアルキル基であり、各ｎは２～６の値を有し、ＸはＨまたはＰＯ３Ｈ２である）を有するアミノチオール化合物、またはその薬学的に許容される塩を培養されたＨＳＰＣの集団に加えて、拡大された細胞を形成することと、を含む。
ｉ）単離されたＨＳＰＣの集団を取得することと、
ｉｉ）ヒストンデアセチラーゼ阻害剤（ＨＤＡＣ阻害剤）の存在下で単離されたＨＳＰＣの集団を培養して、培養された集団を形成することと、
ｉｉｉ）式ＲＮＨ（ＣｎＨ２ｎ）ＮＨ（ＣｎＨ２ｎ）ＳＸ（式中、Ｒは、水素、アリール、アシル、または１～７個の炭素原子を含むアルキル基であり、各ｎは２～６の値を有し、ＸはＨまたはＰＯ３Ｈ２である）を有するアミノチオール化合物、またはその薬学的に許容される塩を培養されたＨＳＰＣの集団に加えて、拡大された細胞を形成することと、を含む。
【0015】
第２の態様は、上記に定義されたＨＳＰＣの拡大のためのキットであり、このキットはＨＳＰＣの拡大のための滅菌要素、ＨＤＡＣ阻害剤、および式ＲＮＨ（ＣｎＨ２ｎ）ＮＨ（ＣｎＨ２ｎ）ＳＸ（式中、Ｒは水素、アリール、アシル、または１～７個の炭素原子を含むアルキル基であり、各ｎは２～６の値を有し、ＸはＨまたはＰＯ３Ｈ２である）を有するアミノチオール化合物、またはその薬学的に許容される塩を含む。
【0016】
第３の態様は、拡大された細胞の集団、好ましくはＨＳＣであり、拡大された集団は、Ｌｉｎ－、ＣＤ３８、ＣＤ３４＋、ＣＤ１３３＋、ＣＤ４５ＲＡ－、ＣＤ９０＋およびＣＤ４９ｆ＋について富化されている。
【0017】
第４の態様は、上記の方法によって取得される拡大された細胞の集団である。
【0018】
第５の態様は、療法における使用のための細胞の拡大した集団を含む組成物であり、この細胞は、以下の方法、
ｉ）単離されたＨＳＰＣの集団を取得することと、
ｉｉ）ヒストンデアセチラーゼ阻害剤（ＨＤＡＣ阻害剤）の存在下で単離されたＨＳＰＣの集団を培養して、培養された集団を形成することと、
ｉｉｉ）式ＲＮＨ（ＣｎＨ２ｎ）ＮＨ（ＣｎＨ２ｎ）ＳＸ（式中、Ｒは、水素、アリール、アシル、または１～７個の炭素原子を含むアルキル基であり、各ｎは２～６の値を有し、ＸはＨまたはＰＯ３Ｈ２である）を有するアミノチオール化合物、またはその薬学的に許容される塩を培養されたＨＳＰＣの集団に加えて、拡大された細胞を形成することと、に従って拡大されている
ｉ）単離されたＨＳＰＣの集団を取得することと、
ｉｉ）ヒストンデアセチラーゼ阻害剤（ＨＤＡＣ阻害剤）の存在下で単離されたＨＳＰＣの集団を培養して、培養された集団を形成することと、
ｉｉｉ）式ＲＮＨ（ＣｎＨ２ｎ）ＮＨ（ＣｎＨ２ｎ）ＳＸ（式中、Ｒは、水素、アリール、アシル、または１～７個の炭素原子を含むアルキル基であり、各ｎは２～６の値を有し、ＸはＨまたはＰＯ３Ｈ２である）を有するアミノチオール化合物、またはその薬学的に許容される塩を培養されたＨＳＰＣの集団に加えて、拡大された細胞を形成することと、に従って拡大されている
【0019】
第６の態様は、
ｉ）単離されたＨＳＰＣの集団を取得する工程と、
ｉｉ）ヒストンデアセチラーゼ阻害剤（ＨＤＡＣ阻害剤）の存在下で単離されたＨＳＰＣの集団を培養して、培養された集団を形成する工程と、
ｉｉｉ）式ＲＮＨ（ＣｎＨ２ｎ）ＮＨ（ＣｎＨ２ｎ）ＳＸ（式中、Ｒは、水素、アリール、アシル、または１～７個の炭素原子を含むアルキル基であり、各ｎは２～６の値を有し、ＸはＨまたはＰＯ３Ｈ２である）を有するアミノチオール化合物、またはその薬学的に許容される塩培養されたＨＳＰＣの集団に加えて、拡大された細胞を形成する工程と、
ｉｖ）拡大された細胞を対象に投与する工程と、を含む、治療方法である。
ｉ）単離されたＨＳＰＣの集団を取得する工程と、
ｉｉ）ヒストンデアセチラーゼ阻害剤（ＨＤＡＣ阻害剤）の存在下で単離されたＨＳＰＣの集団を培養して、培養された集団を形成する工程と、
ｉｉｉ）式ＲＮＨ（ＣｎＨ２ｎ）ＮＨ（ＣｎＨ２ｎ）ＳＸ（式中、Ｒは、水素、アリール、アシル、または１～７個の炭素原子を含むアルキル基であり、各ｎは２～６の値を有し、ＸはＨまたはＰＯ３Ｈ２である）を有するアミノチオール化合物、またはその薬学的に許容される塩培養されたＨＳＰＣの集団に加えて、拡大された細胞を形成する工程と、
ｉｖ）拡大された細胞を対象に投与する工程と、を含む、治療方法である。
【0020】
第７の態様は、療法における使用のための薬剤の製造における、拡大された細胞の集団を含む組成物の使用であり、細胞は、
ｉ）単離されたＨＳＰＣの集団を取得することと、
ｉｉ）ヒストンデアセチラーゼ阻害剤（ＨＤＡＣ阻害剤）の存在下で単離されたＨＳＰＣの集団を培養して、培養された集団を形成することと、
ｉｉｉ）式ＲＮＨ（ＣｎＨ２ｎ）ＮＨ（ＣｎＨ２ｎ）ＳＸ（式中、Ｒは、水素、アリール、アシル、または１～７個の炭素原子を含むアルキル基であり、各ｎは２～６の値を有し、ＸはＨまたはＰＯ３Ｈ２である）を有するアミノチオール化合物、またはその薬学的に許容される塩を培養されたＨＳＰＣの集団に加えて、拡大された細胞を形成することと、を含む方法によって拡大されている。
ｉ）単離されたＨＳＰＣの集団を取得することと、
ｉｉ）ヒストンデアセチラーゼ阻害剤（ＨＤＡＣ阻害剤）の存在下で単離されたＨＳＰＣの集団を培養して、培養された集団を形成することと、
ｉｉｉ）式ＲＮＨ（ＣｎＨ２ｎ）ＮＨ（ＣｎＨ２ｎ）ＳＸ（式中、Ｒは、水素、アリール、アシル、または１～７個の炭素原子を含むアルキル基であり、各ｎは２～６の値を有し、ＸはＨまたはＰＯ３Ｈ２である）を有するアミノチオール化合物、またはその薬学的に許容される塩を培養されたＨＳＰＣの集団に加えて、拡大された細胞を形成することと、を含む方法によって拡大されている。
【図面の簡単な説明】
【0021】
【図1】サイトカインを補充した基本培地（基本）、サイトカインおよびＷＲ１０６５を補充した培地（ＷＲ１０６５）、サイトカインおよびスクリプタイドを補充した培地（スクリプタイド）、サイトカイン、スクリプタイドおよびＷＲ１０６５を補充した培地（スクリプタイド＋ＷＲ１０６５）の条件下での、臍帯血由来の全有核細胞の拡大倍率を示す。
【図2】サイトカインを補充した基本培地（基本）、サイトカインおよびスクリプタイドを補充した培地（スクリプタイド）、サイトカイン、スクリプタイドおよびＷＲ１０６５を補充した培地（スクリプタイド＋ＷＲ１０６５）の条件下での、臍帯血に由来する拡大された細胞の集団に存在するＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋細胞の割合を示す。
【図3】サイトカインを補充した基本培地（基本）、サイトカインおよびＷＲ１０６５を補充した培地（ＷＲ１０６５）、サイトカインおよびスクリプタイドを補充した培地（スクリプタイド）、サイトカイン、スクリプタイドおよびＷＲ１０６５（を補充した培地スクリプタイド＋ＷＲ１０６５）の条件下での、臍帯血由来の拡大された細胞の最終集団におけるｌｉｎ－／ＣＤ３８－／ＣＤ３４＋／ＣＤ４５ＲＡ－／ＣＤ１３３＋／ＣＤ９０＋／ＣＤ４９ｆ＋細胞の拡大倍率を示す。
【図4】サイトカインを補充した基本培地（基本）、サイトカインおよびスクリプタイドを補充した培地（スクリプタイド）、サイトカイン、スクリプタイドおよびＷＲ１０６５を補充した培地（スクリプタイド＋ＷＲ１０６５）の条件下での、臍帯血に由来する拡大された細胞の最終集団に存在する、顆粒球、赤血球、単球、巨核球（ＣＦＵ－ＧＥＭＭ）のコロニーのコロニー形成単位の数を示す。
【図5】サイトカインを補充した培地（基本）、サイトカインおよびＷＲ１０６５を補充した培地（ＷＲ１０６５）、サイトカインおよびスクリプタイドを補充した培地（スクリプタイド）、サイトカインを補充した培地、スクリプタイドおよびＷＲ１０６５（スクリプタイド＋ＷＲ１０６５）の条件下で増殖させた場合の、骨髄由来の全有核細胞、ＣＤ３４＋細胞、およびＨＳＣの拡大倍率を示す。
【図6】サイトカインを補充した培地（基本）、サイトカインおよびスクリプタイドを補充した培地（スクリプタイド）、サイトカイン、スクリプタイドおよびＷＲ１０６５を補充した培地（スクリプタイド＋ＷＲ１０６５）の条件下で増殖させた場合の、末梢血由来の全有核細胞、ＣＤ３４＋細胞、およびＨＳＣの拡大倍率を示す。
【図7】細胞拡大に対するクラスＩ ＨＤＡＣ阻害剤ＲＧ２８３３の効果を示す。ＴＮＣおよびＨＳＣの拡大倍率は、サイトカインを補充した培地（基本）、サイトカインおよびスクリプタイドを補充した培地（スクリプタイド）、サイトカイン、スクリプタイドおよびＷＲ１０６５を補充した培地（ＳＣ＋ＷＲ）、サイトカインおよび１０ｎＭ ＲＧ２８３３を補充した培地（ＲＧ２ １０ｎＭ）、サイトカイン１０ｎＭ ＲＧ２８３３およびＷＲ１０６５を補充した培地、（ＲＧ２ １０ｎＭ＋ＷＲ）、サイトカインおよび１００ｎＭ ＲＧ２８３３を補充した培地（ＲＧ２ １００ｎＭ）、サイトカイン、１００ｎＭ ＲＧ２８３３およびＷＲ１０６５を補充した培地（ＲＧ２ １００ｎＭ＋ＷＲの条件下で増殖した細胞について示される。
【図8】細胞拡大に対するクラスＩ ＨＤＡＣ阻害剤ＲＧＦＰ９６６の効果を示す。ＴＮＣとＨＳＣの拡大倍率は、サイトカインを補充した培地（基本）、サイトカインおよびスクリプタイドを補充した培地（スクリプタイド）、サイトカイン、スクリプタイドおよびＷＲ１０６５を補充した培地（ＳＣ＋ＷＲ）、サイトカインおよび１００ｎＭ ＲＧＦＰ９６６を補充した培地（ＲＧＦＰ １００ｎＭ）、サイトカイン、１００ｎＭ ＲＧＦＰ９６６およびＷＲ１０６５を補充した培地（ＲＧＦＰ １００ｎＭ＋ＷＲ）、サイトカインおよび１μＭ ＲＧＦＰ９６６を補充した培地（ＲＧＦＰ１μＭ）、サイトカイン、１μＭ ＲＧＦＰ９６６およびＷＲ１０６５を補充した培地（ＲＧＦＰ１μＭ＋ＷＲ）の条件下で増殖した細胞について示される。
【図9】クラスＩｉａ ＨＤＡＣ阻害剤ＬＭＫ２３５の細胞拡大への影響を示す。ＴＮＣとＨＳＣの拡大倍率は、サイトカインを補充した培地（基本）、サイトカインおよびスクリプタイドを補充した培地（スクリプタイド）、サイトカイン、スクリプタイドおよびＷＲ１０６５（ＳＣ＋ＷＲ）を補充した培地、サイトカインおよび１０ｎＭ ＬＭＫ２３５を補充した培地（ＬＭＫ １０ｎＭ）、サイトカイン、１０ｎＭ ＬＭＫ２３５およびＷＲ１０６５を補充した培地（ＬＭＫ １０ｎＭ＋ＷＲ）、サイトカインおよび５０ｎＭ ＬＭＫ２３５を補充した培地（ＬＭＫ ５０ｎＭ）、サイトカイン、５０ｎＭ ＬＭＫ２３５およびＷＲ１０６５を補充した培地（ＬＭＫ ５０ｎＭ＋ＷＲ）の条件下で増殖した細胞について示される。
【図10】クラスＩＩｂ ＨＤＡＣ阻害剤であるツバスタチンＡが細胞拡大に及ぼす影響を示す。ＴＮＣとＨＳＣの拡大倍率は、サイトカインを補充した培地（基本）、サイトカインおよびスクリプタイドを補充した培地（スクリプタイド）、サイトカイン、スクリプタイドおよびＷＲ１０６５を補充した培地（ＳＣ＋ＷＲ）、サイトカインおよび１μＭのツバスタチンＡ（Ｔｕｂ １μＭ）を補充した培地、サイトカイン、１μＭツバスタチンＡおよびＷＲ１０６５を補充した培地（Ｔｕｂ １μＭ＋ＷＲ）、サイトカインおよび１０μＭツバスタチンＡを補充した培地（Ｔｕｂ １０μＭ）、サイトカイン、１０μＭツバスタチンＡおよびＷＲ１０６５を補充した培地（Ｔｕｂ １０μＭ＋ＷＲ）の条件下で増殖した細胞について示される。
【図11】広域スペクトルのＨＤＡＣ阻害剤であるフェニル酪酸ナトリウムが細胞拡大に及ぼす影響を示す。ＴＮＣとＨＳＣの拡大倍率は、サイトカインを補充した培地（基本）、サイトカインおよびスクリプタイドを補充した培地（スクリプタイド）、サイトカイン、スクリプタイドおよびＷＲ１０６５を補充した培地（ＳＣ＋ＷＲ）、サイトカインおよびフェニル酪酸ナトリウムを補充した培地（ＮａＰＢ）、サイトカイン、フェニル酪酸ナトリウムおよびＷＲ１０６５を補充した培地（ＮａＰＢ＋ＷＲ）の条件下で増殖した細胞について示される。
【図12】広域スペクトルのＨＤＡＣ阻害剤であるキシノスタットが細胞拡大に及ぼす影響を示す。ＴＮＣとＨＳＣの拡大倍率は、サイトカインを補充した培地（基本）、サイトカインおよびスクリプタイドを補充した培地（スクリプタイド）、サイトカイン、スクリプタイドおよびＷＲ１０６５を補充した培地（ＳＣ＋ＷＲ）、サイトカインおよび１００ｎＭキシノスタットを補充した培地（Ｑｕｉｎ １００ｎＭ）、サイトカイン、１００ｎＭ ｑｕｉｓｉｎｏｓｔａｔおよびＷＲ１０６５を補充した培地（Ｑｕｉｎ １００ｎＭ＋ＷＲ）、サイトカインおよび１０ｎＭ ｑｕｉｓｉｎｏｓｔａｔ（Ｑｕｉｎ １０ｎＭ）を補充した培地、サイトカイン、１０ｎＭ ｑｕｉｓｉｎｏｓｔａｔおよびＷＲ１０６５（Ｑｕｉｎ １０ｎＭ＋ＷＲ）を補充した培地の条件下で増殖した細胞について示される。
【図13】基本培地、スクリプタイド、スクリプタイドおよびＷＲ１０６５の併用処理を用いた細胞増殖プロトコルの再現性を示す。ＨＳＣの拡大倍率は、３人の別々のドナーからの細胞および細胞のプールされたサンプルについて示される。
【図14】細胞を様々な培養プレート、Ｎａｎｅｘ足場、ＴＣ処理されたＣｏｒｎｉｎｇ２４ウェルプレートまたは懸濁Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ２４ウェルプレート上で拡大させたときのＨＳＣの拡大倍率を示す。
【図15】マウス全血サンプル中のＣＤ４５＋細胞の頻度を、生存可能なシングレットのパーセンテージとして示す。ｙ軸は対数目盛でプロットされる。ビヒクルとともに拡大された細胞（拡大＋ビヒクル）、スクリプタイドとともに拡大された細胞（拡大＋ＳＳ）、スクリプタイドおよびＷＲ１０６５とともに拡大された細胞（拡大＋ＳＷ）の条件下で、拡大させた細胞をマウスに投与した。拡大されていない細胞のセットも対照として含まれていた。一旦、細胞がエキソビボで拡大されると、それらは免疫無防備状態のＮＳＧマウスに導入された。２０週間後、これらのマウスを屠殺し、骨髄細胞サンプルを採取して、二次マウスセットに導入した。マウスは８週間目に採血され、全血サンプルに存在するヒトＣＤ４５＋細胞の頻度が分析された。
【図16】様々な細胞集団を投与されたマウスの全血サンプルに存在するＣＤ４５＋細胞のパーセンテージを示す。ＣＤ３４＋細胞は末梢血サンプルから得られ、これらは、標準培地で培養された細胞（Ｂ ３日目）、スクリプタイドの存在下で拡大された細胞（ＳｃｒＡ ３日目）、スクリプタイドおよびＷＲ１０６５の存在下で拡大された細胞（ＰＬ ３日目）の条件下で拡大された。拡大されていない細胞のセットも対照として含まれていた（０日目）。ＨＳＣ（ＣＤ３４＋、ＣＤ３８－、ＣＤ９０＋、ＣＤ４５ＲＡ－）を拡大された細胞から選別し、対照およびマウス（免疫無防備状態のＮＳＧマウス）あたり８０，０００個の細胞を投与した。次に、生着のレベルを、８週間および１２週間に採取した全血サンプルに存在するＣＤ４５＋細胞のパーセンテージによって評価した。
【発明を実施するための形態】
【0022】
本明細書で使用される場合、造血幹細胞および前駆細胞（ＨＳＰＣ）という用語は、骨髄、臍帯血、および末梢血に見出され、分化および／または増殖して血球を形成することができる細胞を指し、血球の例には、単球、マクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、赤血球、樹状細胞、巨核球、血小板、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞が含まれるがこれらに限定されない。
【0023】
本明細書で使用される場合、「造血幹細胞」または「ＨＳＣ」という用語は、すべての系統の血球に分化し、それらの多能性特性を維持しながら自らを再生する能力を有する多能性または多能性細胞を指す。本明細書で使用される「ＨＳＣ」という用語は、Ｌｉｎ－、ＣＤ３８－、ＣＤ３４＋、ＣＤ１３３＋、ＣＤ４５ＲＡ－、ＣＤ９０＋、ＣＤ４９ｆ＋である細胞を指す場合がある。「ＨＳＣ」という用語はまた、ＣＤ３８－、ＣＤ３４＋、ＣＤ４５ＲＡ－、ＣＤ９０＋である細胞を指す場合がある。「ＣＤ３４＋」、「ＣＤ１３３＋」、「ＣＤ９０＋」、「ＣＤ４９ｆ＋」という用語の中で、（＋）の指定は、指定された分化クラスター（ＣＤ）が細胞によって発現され、細胞表面に存在することを示す。「ＣＤ３８－」、「ＣＤ４５ＲＡ－」という用語の中で、（－）の指定は、指定されたＣＤが細胞によって発現されていないか、発現が不十分であることを示す。しかし、ヒト胚性幹細胞およびヒト胚の破壊から生じる任意の細胞は、本発明の範囲内にない。
【0024】
本明細書で使用される場合、「単離された集団」という用語は、供給源から得られた細胞のサンプルを指す。ここで、細胞は商業的に入手されたものでもよく、または細胞は対象から取得されたものである。単離された集団の供給源には、臍帯血、骨髄、および末梢血が挙げられるが、これらに限定されない。「単離された集団」は、新鮮なまたは凍結された供給源から得られたものであってもよく、新鮮な供給源は使用前に凍結されていなかったものである。サンプルが凍結している場合は、本発明における使用の前に細胞は解凍される。
【0025】
本明細書で使用される場合、「培養された集団」という用語は、エキソビボで人工培地中にて増殖された細胞の単離された集団を指す。どのタイプの人工培地を使用するかは当業者には明らかであり、適切な培地の例は、ＳｔｅｍＳｐａｎ ＡＣＦ培地（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）である。人工培地は、細胞の増殖を改善するために他の因子またはサイトカインを補充されてもよく、補充物の例には、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ３－リガンド（ＦＬＴ３ＬＧ）、およびトロンボポエチン（ＴＰＯ）が挙げられるがこれらに限定されない。単離された集団は、培養された集団を形成するために、多くの日数にわたって培養／増殖され得る。いくつかの実施形態において、培養時間は、２～２０日、より好ましくは３～２０日、最も好ましくは４～１５日である。例えば、培養／繁殖は、２０、１５、１０、９、８、７、６、５または４日にわたって行うことができる。全培養時間は、工程（ｉｉ）および（ｉｉｉ）を実施するためにかかる時間を含む。
【0026】
本明細書で使用される用語ヒストンデアセチラーゼ阻害剤（ＨＤＡＣ阻害剤）は、酵素ヒストンデアセチラーゼの活性を阻害する化合物を指す。ヒストンデアセチラーゼには４つの分類、クラスＩ、クラスＩＩ、クラスＩＩＩ、およびクラスＩＶが存在する。それらの配列相同性およびドメイン構成に基づいて、クラスＩＩ阻害剤は、さらにクラスＩＩａおよびクラスＩＩｂに細分することができる。本明細書で使用される場合、ヒストンデアセチラーゼという用語は、ヒストンデアセチラーゼのクラスのいずれかの活性を阻害することができる化合物を指す。
【0027】
ＨＤＡＣ阻害剤の例には、スクリプタイド、ボリノスタット、タセジナリン、ＲＧ２８３３、ＲＧＦＰ９６６、トリコスタチンＡ、ＬＭＫ２３５、ツバスタチンＡ、キシノスタット、ＬＢＨ５８９、ＰＸＤ１０１、ＩＴＦ２３５７、ＰＣＩ－２４７８１、ＦＫ２２８ ＭＳ－２７５、ＭＧＣＤ０１０３、フェニル酪酸ナトリウム、バルプロ酸、ＡＮ－９、バセカ、サビコールが挙げられるが、これらに限定されない。
【0028】
本発明の一態様は、式ＲＮＨ（ＣｎＨ２ｎ）ＮＨ（ＣｎＨ２ｎ）ＳＸ（式中、Ｒは、水素、アリール、アシル、または１～７個の炭素原子を含むアルキル基であり、各ｎは２～６の値を有し、ＸはＨまたはＰＯ３Ｈ２である）を有するアミノチオール化合物、またはその薬学的に許容される塩の使用を含む。
【0029】
本明細書で使用される場合、「アリール」とは、フェニル、ビフェニル、ナフチル、アントラセニルなどの単環式、二環式、または三環式の一価または二価（必要に応じて）の芳香族ラジカルを意味し、これらは、好ましくは、Ｃ１－Ｃ６アルキル、ヒドロキシ、Ｃ１－Ｃ３ヒドロキシアルキル、Ｃ１－Ｃ３アルコキシ、Ｃ１－Ｃ３ハロアルコキシ、アミノ、Ｃ１－Ｃ３モノアルキルアミノ、Ｃ１－Ｃ３ビスアルキルアミノ、Ｃ１－Ｃ３アシルアミノ、Ｃ１－Ｃ３アミノアルキル、モノ（Ｃ１－Ｃ３アルキル）アミノＣ１－Ｃ３アルキル、ビス（Ｃ１－Ｃ３アルキル）アミノＣ１－Ｃ３アルキル、Ｃ１－Ｃ３－アシルアミノ、Ｃ１－Ｃ３アルキルスルホニルアミノ、ハロ、ニトロ、シアノ、トリフルオロメチル、カルボキシ、Ｃ１－Ｃ３アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、モノＣ１－Ｃ３アルキルアミノカルボニル、ビスＣ１－Ｃ３アルキルアミノカルボニル、－ＳＯ３Ｈ、Ｃ１－Ｃ３アルキルスルホニル、アミノスルホニル、モノＣ１－Ｃ３アルキルアミノスルホニルおよびビスＣ１－Ｃ３－アルキルアミノスルホニルの基から選択される５つまでの置換基で任意選択で置換することができる。
【0030】
本明細書で使用する場合、「アルキル」とは、直鎖状または分枝状であり得るＣ１－Ｃ７アルキル基を意味する。好ましくは、Ｃ１－Ｃ６アルキル部分である。より好ましくは、それはＣ１－Ｃ４アルキル部分である。例としては、メチル、エチル、ｎ－プロピル、ｔ－ブチルなどが挙げられる。それは二価、例えばプロピレンであり得る。
【0031】
本明細書で使用される場合、アシルは、カルボニル基（Ｃ＝Ｏ）を含む、上記に定義されたアルキル基である。
【0032】
アルキル基およびアシル基のそれぞれは、任意に、アリール、シクロアルキル（好ましくはＣ３－Ｃ１０）、またはヘテロアリールで置換されてもよい。それらはまた、ハロゲン（例えば、Ｆ、Ｃｌ）、ＮＨ２、ＮＯ２またはヒドロキシルで置換され得る。
【0033】
本明細書で使用される場合、「臍帯血」という用語は、当該分野におけるその従来の使用法を有し、これは一般的に、分娩後に臍帯および胎盤に残る血液である。ヒト臍帯血は本発明の範囲内であり、書面による情報に基づく事前の同意および倫理的承認を得て取得される。
【0034】
本明細書で使用される場合、「末梢血」という用語は、当該分野におけるその従来の使用法を有し、これは一般的に、循環器系全体を循環している血液である。ヒト末梢血は、本発明の範囲内であり、書面による情報に基づく事前の同意および倫理的承認を得て取得される。
【0035】
本明細書で使用される場合、「骨髄」という用語は、当該分野におけるその従来の使用法を有し、すなわち、一般的に骨空洞に存在するゼラチン状の組織である。組織は、造血幹細胞、前駆細胞、および前駆細胞の集団を有する骨髄のサブセットである赤色骨髄を含む。ヒト骨髄は本発明の範囲内であり、書面による情報に基づく事前の同意および倫理的承認を得て取得される。
【0036】
本明細書で使用される場合、「拡大された細胞」という用語は、適切な条件下でエキソビボにて培養され、細胞分裂を受けて細胞数を増幅した細胞を指す。本明細書で使用される場合、「細胞拡大」という用語は、適切な条件下での細胞のエキソビボ培養による細胞数の増幅を指し、培養の終わりに存在する細胞の数は、培養開始時に存在する細胞の数よりも多い。
【0037】
細胞が細胞の単離された集団、細胞の培養された集団、または拡大された細胞の一部であり得る細胞の中には、細胞のサブタイプが存在する。細胞のサブタイプの例は、造血幹細胞、造血前駆細胞、およびそれらの表現型マーカーによって定義される細胞であるが、これらに限定されない。表現型マーカーの非限定的な例は、ＬｉｎまたはＣＤ３８またはＣＤ３４またはＣＤ１３３またはＣＤ４５ＲＡまたはＣＤ９０またはＣＤ４９ｆであり、これらの表現型マーカーの組み合わせによって細胞を定義することもできる。本明細書で使用される場合、「富化された」という用語は、細胞の特定のサブセット／サブタイプを高い割合で含む細胞のセットを指すために使用され、この細胞のセットは、細胞の特定のサブセット／サブタイプの、２％、または５％、または１０％、または１５％、または２０％、または２５％、または３０％、または３５％、または４０％、または４５％、または５０％、または５５％、または６０％、または６５％、または７０％、または７５％、または８０％、または８５％、または９０％を含んでもよい。本発明において、「富化された」という用語は、細胞が拡大を受け、細胞の特定のサブタイプが集団内の他の細胞よりも比例して数が増加した細胞の集団を指すために使用することができる。この富化された細胞集団は、細胞の特定のサブタイプの有意な割合を含み、この有意な割合は、全集団の２％、または５％、または１０％、または１５％、または２０％、または２５％、または３０％、または３５％、または４０％、または４５％、または５０％、または５５％、または６０％、または６５％、または７０％、または７５％、または８０％、または８５％、または９０％であり得る。
【0038】
本明細書で使用される場合、「無血清組織培養系」という用語は、動物由来の血清が補充されていない培地中で細胞を培養することを指す。
【0039】
本明細書で使用される場合、「フィーダーフリー組織培養系」という用語は、結合組織細胞の層を利用することなく細胞を培養して、成長中の細胞を支持および提供する方法を指す。
【0040】
本明細書で使用される場合、「全細胞拡大」という用語は、全有核細胞の数の増加を指す。
【0041】
本明細書で使用される場合、「全培養時間」という用語は、工程ｉｉ）およびｉｉｉ）が実行される時間を指す。ここで、工程ｉｉ）は、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤（ＨＤＡＣ阻害剤）の存在下で単離されたＨＳＰＣの集団を培養して、培養された集団を形成することを含み、工程ｉｉｉ）は、式ＲＮＨ（ＣｎＨ２ｎ）ＮＨ（ＣｎＨ２ｎ）ＳＸ（式中、Ｒは水素、アリール、アシル、または１～７個の炭素原子を含むアルキル基であり、各ｎは２～６の値を有し、ＸはＨまたはＰＯ３Ｈ２である）を有するアミノチオール化合物、またはその薬学的に許容される塩を培養されたＨＳＰＣの集団に加えて、拡大された細胞を形成することを含む。全培養時間の間、細胞は、ＨＤＡＣ阻害剤が補充された適切な培地上で増殖させることができ、全培養時間の終わりは、細胞が収集／プール／分析されることによって表される。
【0042】
本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、本発明の使用に従う療法のレシピエントである、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、げっ歯類などを含むがこれらに限定されない任意の動物（例えば、哺乳動物）を指す。ヒトの被験体が特に想定されている。「患者」は、本明細書では、ヒト被験体を指すために使用される。
【0043】
本発明の一態様は、造血幹細胞および前駆細胞（ＨＳＰＣ）を拡大するための方法であり、この方法は、
ｉ）単離されたＨＳＰＣの集団を取得することと、
ｉｉ）ヒストンデアセチラーゼ阻害剤（ＨＤＡＣ阻害剤）の存在下で単離されたＨＳＰＣの集団を培養して、培養された集団を形成することと、
ｉｉｉ）式ＲＮＨ（ＣｎＨ２ｎ）ＮＨ（ＣｎＨ２ｎ）ＳＸ（式中、Ｒは、水素、アリール、アシル、または１～７個の炭素原子を含むアルキル基であり、各ｎは２～６の値を有し、ＸはＨまたはＰＯ３Ｈ２である）を有するアミノチオール化合物、またはその薬学的に許容される塩を培養されたＨＳＰＣの集団に加えて、拡大された細胞を形成することと、を含む。
ｉ）単離されたＨＳＰＣの集団を取得することと、
ｉｉ）ヒストンデアセチラーゼ阻害剤（ＨＤＡＣ阻害剤）の存在下で単離されたＨＳＰＣの集団を培養して、培養された集団を形成することと、
ｉｉｉ）式ＲＮＨ（ＣｎＨ２ｎ）ＮＨ（ＣｎＨ２ｎ）ＳＸ（式中、Ｒは、水素、アリール、アシル、または１～７個の炭素原子を含むアルキル基であり、各ｎは２～６の値を有し、ＸはＨまたはＰＯ３Ｈ２である）を有するアミノチオール化合物、またはその薬学的に許容される塩を培養されたＨＳＰＣの集団に加えて、拡大された細胞を形成することと、を含む。
【0044】
本発明の一実施形態では、工程ｉ）は、ＣＤ１３３＋である細胞を選択することをさらに含む。いくつかの実施形態において、単離された集団は、ＣＤ１３３＋である細胞を含む。一実施形態では、工程ｉ）は、ＣＤ３４＋である細胞を選択することをさらに含む。単離されたＨＳＰＣの集団が凍結された供給源から取得される場合、ＣＤ３４＋である細胞を選択することが好ましい場合がある。ＨＳＰＣの分離された集団が新鮮な供給源から取得される場合、ＣＤ１３３＋である細胞を選択することが好ましい場合がある。細胞表面マーカーによって細胞を選択するための適切な方法は、当該分野で知られており、例えば、磁気活性化細胞選別（ＭＡＣ）または蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を使用する。好ましくは、単離された集団は、ＣＤ３８－またはＣＤ３４＋またはＣＤ１３３＋またはＣＤ４５ＲＡ－またはＣＤ９０＋またはＣＤ４９ｆ＋、またはそれらの任意の組み合わせである細胞を含む。
【0045】
本発明の一実施形態では、単離された細胞集団は、臍帯血または骨髄または末梢血から取得される。好ましい実施形態では、単離された細胞集団は、臍帯血から取得される。いくつかの実施形態において、細胞は、哺乳動物（例えば、マウス、ラット、イヌ、またはヒト）から取得される。好ましい実施形態は、細胞がヒトから取得される場合である。
【0046】
本発明の一実施形態では、ＨＤＡＣ阻害剤は、広域スペクトル阻害剤、または選択的クラスＩ、クラスＩＩａ、クラスＩＩｂ、クラスＩＩＩまたはクラスＩＶ阻害剤から選択される。好ましくは、ＨＤＡＣ阻害剤は、広域スペクトル阻害剤、または選択的クラスＩ、クラスＩＩａ、クラスＩＩＩまたはクラスＩＶ阻害剤から選択される。より好ましくは、ＨＤＡＣ阻害剤は、広域スペクトル阻害剤、クラスＩまたはクラスＩＩａ阻害剤である。
【0047】
好ましい実施形態では、ＨＤＡＣ阻害剤は、スクリプタイド、ＲＧ２８３３、ＲＧＦＰ９６６、ＬＭＫ２３５、ツバスタチンＡ、キシノスタット、フェニル酪酸ナトリウムから選択される。本発明のいくつかの実施形態において、ＨＤＡＣ阻害剤は、スクリプタイドまたはキシノスタットである。好ましい実施形態では、ＨＤＡＣ阻害剤は、以下の構造を有するスクリプタイドである。
【化1】
【0048】
本発明のアミノチオール化合物は、式ＲＮＨ（ＣｎＨ２ｎ）ＮＨ（ＣｎＨ２ｎ）ＳＸ（式中、Ｒは、水素、アリール、アシル、または１～７個の炭素原子を含むアルキル基であって、各ｎが２～６の値を有し、ＸはＨまたはＰＯ３Ｈ２である）を有するか、またはその薬学的に許容される塩である。
【0049】
好ましい実施形態では、Ｒは水素である。
【0050】
いくつかの実施形態において、本発明のアミノチオール化合物は、アミホスチン：
または
ＷＲ１０６５：
である。
【化2】
ＷＲ１０６５：
【化3】
【0051】
最も好ましくは、アミノチオール化合物はＷＲ１０６５である。
【0052】
本発明の一実施形態では、ＨＤＡＣ阻害剤は、０．０１μＭ～５０μＭ、好ましくは０．１μＭ～１０μＭの濃度で使用され、より好ましくは、ＨＤＡＣ阻害剤は１μＭの濃度で使用される。
【0053】
本発明の好ましい実施形態において、アミノチオール化合物、例えばＷＲ１０６５は、５０μＭ～５００μＭ、好ましくは５０μＭ～１５０μＭの濃度で、より好ましくは１００μＭの濃度で使用される。
【0054】
本発明の好ましい実施形態において、ＨＤＡＣ阻害剤は、１μＭの濃度で使用され、好ましくは、アミノチオール化合物、例えば、ＷＲ１０６５は、１００μＭの濃度で使用される。
【0055】
本発明のいくつかの実施形態では、工程ｉｉ）およびｉｉｉ）は、２日～１０日にわたって実施される。好ましい実施形態では、工程ｉｉ）およびｉｉｉ）は、５日～１０日にわたって実施される。より好ましい実施形態では、工程ｉｉ）およびｉｉｉ）は、約５日間にわたって実施される。本発明の一実施形態では、工程ｉｉｉ）は、全培養時間の終了（すなわち、工程（ｉｉｉ）の終了）の４８時間前までに開始する。本発明のいくつかの実施形態において、工程ｉｉｉ）は、全培養時間の終了の１６～２０時間前に開始する。好ましくは、工程ｉｉ）およびｉｉｉ）は５日間にわたって実施され、より好ましくは、工程ｉｉｉ）は、全培養時間の終了の１６～２０時間前に実施される。
【0056】
好ましくは、本発明では、工程ｉｉ）は４日～１０日にわたって実施される。好ましい実施形態では、工程ｉｉ）は、少なくとも４日間にわたって実施される。いくつかの実施形態において、工程ｉｉｉ）は、細胞がＨＤＡＣ阻害剤と共に（工程ｉｉ）に従って）、少なくとも４～１０日間、好ましくは少なくとも４日間培養された後に実行される。いくつかの実施形態において、工程ｉｉｉ）は、細胞が工程ｉｉ）におけるのと同様に、少なくとも４～１０日間、好ましくは少なくとも４日間培養された後に実行される。好ましくは、工程ｉｉｉ）は、全培養時間の終了の４８時間前までに開始される。
【0057】
好ましくは、細胞は無血清組織培養系において培養される。本発明のいくつかの実施形態において、細胞は、フィーダーフリー組織培養系において培養される。培養系は無血清および／またはフィーダーフリーであるが、細胞に適切な増殖および拡大条件を提供するために、様々な栄養素を追加することができる。適切な培地の例には、ＳｔｅｍＳｐａｎ ＡＣＦ培地（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＳｔｅｍＰｒｏ３４無血清培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｓｔｅｍｌｉｎｅ ＩＩ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）、ＨＰＣ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ ＤＸＦ（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ）、ＱＢＳＦ－６０（Ｑｕａｌｉｔｙ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）、ＳｔｅｍＭＡＣＳ ＨＳＣ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ ＸＦ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）が挙げられる。本発明の好ましい実施形態では、細胞は、ＳｔｅｍＳｐａｎ ＡＣＦ培地（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で培養される。適切な培地はまた、化学的または生物学的成分であり得る様々な添加物および構成成分を含み得る。これらの構成成分は、単独でまたは組み合わせて適切な培地に取り込むことができ、当業者は、必要に応じて適切な構成成分を選択することができる。これらの成分は、必要に応じて培養中に取り込むこともできる。生物学的と化学的の両方の成分の例には、アミノ酸、ビタミン、サイトカイン、増殖因子、ホルモン、抗生物質、脂肪酸、糖類、ナトリウム、カルシウム、カリウム、マグネシウム、リン、寒天、アガロース、メチルセルロース、コラーゲン、インスリン、トランスフェリン、ラクトフェリン、コレステロール、エタノールアミン、ピルビン酸ナトリウム、２－メルカプトエタノール、ポリエチレングリコール、セレン酸ナトリウムが挙げられるが、これらに限定されない。
【0058】
様々なサイトカインが培地に取り込まれ、および／または培養中に取り込むことができ、適切なサイトカインの例には、インターロイキン－１（ＩＬ－１）、インターロイキン－２（ＩＬ－２）、インターロイキン－３（ＩＬ－３）、インターロイキン－４（ＩＬ－４）、インターロイキン－５（ＩＬ－５）、インターロイキン－６（ＩＬ－６）、インターロイキン－７（ＩＬ－７）、インターロイキン－８（ＩＬ－８）、インターロイキン－９（ＩＬ－９）、インターロイキン－１０（ＩＬ－１０）、インターロイキン－１１（ＩＬ－１１）、インターロイキン－１２（ＩＬ－１２）、インターロイキン－１３（ＩＬ－１３）、インターロイキン－１４（ＩＬ－１４）、インターロイキン－１５（ＩＬ－１５）、インターロイキン－１８（ＩＬ－１８）、インターロイキン－２１（ＩＬ－２１）、インターロイキン－α（ＩＮＦ－α）、インターロイキン－β（ＩＮＦ－β）、インターロイキン－γ（ＩＮＦ－γ）、顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、Ｗｎｔ１、骨形態形成タンパク質７（ＢＭＰ７）、アンギオポイエチン様５（ＡＮＧＰＴＬ５）、インスリン増殖因子結合タンパク質２（ＩＧＦＢＰ２）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ３－リガンド（ＦＬＴ３ＬＧ）が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の一実施形態では、培地は、ＳＣＦ、ＴＰＯおよびＦＬＴ３ＬＧが補充される。
【0059】
様々な増殖因子が培地に取り込まれ、および／または培養中に取り込まれ得る。適切な増殖因子の例には、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、ヒト上皮増殖因子（ｈＥＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、線維芽細胞増殖因子１（ＦＧＦ１）、神経増殖因子（ＮＧＦ）、マクロファージ炎症性タンパク質１－α（ＭＩＰ－１α）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【0060】
本発明の一実施形態では、単離された集団は、３２℃～３９℃、好ましくは３６℃～３８℃の温度で培養される。本発明の一実施形態では、細胞は、約１％～約５０％のＣＯ２、好ましくは約１％～約２５％のＣＯ２、より好ましくは約１％～約１０％のＣＯ２を含む加湿インキュベーター内で培養される。本発明は、動物細胞培養に適した培養容器内で実施することができる。一実施形態では、本発明は、Ｎａｎｅｘ造血幹／前駆細胞（ＨＳＰＣ）拡大プレートまたはＴＣ処理されたＣｏｒｎｉｎｇ ２４ウェルプレートまたは懸濁Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ２４ウェルプレート中で実施される。好ましい実施形態では、本発明は、従来の細胞培養プレート、または細胞培養バッグ（例えば、ＶｕｅＬｉｆｅ（登録商標））もしくは攪拌バイオリアクターなどの適切な閉鎖系で実施される。
【0061】
本発明の好ましい実施形態において、全細胞拡大は、約２倍～約５０倍、または約２倍～約２５倍、または約２倍～約２０倍である。全細胞拡大は、培養時間の開始時に全有核細胞の数を測定し、培養時間の終了時に存在する全有核細胞の数と比較することによって決定される。
【0062】
好ましい実施形態では、Ｌｉｎ－、ＣＤ３８－、ＣＤ３４＋、ＣＤ１３３＋、ＣＤ４５ＲＡ－、ＣＤ９０＋およびＣＤ４９ｆ＋細胞の拡大は、５０～８００倍、より好ましくは４００～６００倍、最も好ましくは５００倍である。Ｌｉｎ－、ＣＤ３８－、ＣＤ３４＋、ＣＤ１３３＋、ＣＤ４５ＲＡ－、ＣＤ９０＋、およびＣＤ４９ｆ＋細胞の拡大は、培養時間の開始時に存在するＬｉｎ－、ＣＤ３８－、ＣＤ３４＋、ＣＤ１３３＋、ＣＤ４５ＲＡ－、ＣＤ９０＋、およびＣＤ４９ｆ＋細胞の数を測定し、それを培養時間の終わりに存在するＬｉｎ－、ＣＤ３８－、ＣＤ３４＋、ＣＤ１３３＋、ＣＤ４５ＲＡ－、ＣＤ９０＋、およびＣＤ４９ｆ＋細胞の数と比較することによって決定される。一実施形態では、ＣＤ３８－、ＣＤ３４＋、ＣＤ４５ＲＡ－およびＣＤ９０＋細胞の拡大は、５０～８００倍、より好ましくは４００～６００倍、最も好ましくは５００倍である。ＣＤ３８－、ＣＤ３４＋、ＣＤ４５ＲＡ－、およびＣＤ９０＋細胞の拡大は、培養時間の開始時に存在するＣＤ３８－、ＣＤ３４＋、ＣＤ４５ＲＡ－、およびＣＤ９０＋細胞の数を測定し、それを培養時間の終わりに存在するＣＤ３８－、ＣＤ３４＋、ＣＤ４５ＲＡ－およびＣＤ９０＋細胞の数と比較することによって決定される。細胞拡大を決定するための適切な方法は当該分野において知られており、例えば、全細胞計数と組み合わせた多色フローサイトメトリー分析、フローサイトメトリー分析と組み合わせた絶対計数ビーズの使用、手動血球計または自動血球計（Ｖｉａｃｅｌｌ，Ｃｏｕｎｔｅｓｓ，Ｎｕｃｌｅｏｃｏｕｎｔｅｒ，Ｎｅｘｃｅｌｏｍｅ）使用する細胞アリコートの画像解析に基づく細胞計数が挙げられる。
【0063】
いくつかの実施形態では、拡大された細胞は、ＨＳＣについて富化されている。一実施形態では、拡大された細胞は、Ｌｉｎ－またはＣＤ３８－またはＣＤ３４＋またはＣＤ１３３＋またはＣＤ４５ＲＡ－またはＣＤ９０＋またはＣＤ４９ｆ＋またはそれらの任意の組み合わせについて富化され、好ましくは、細胞は、ＣＤ３４＋、ＣＤ１３３＋について富化され、より好ましくは、拡大された細胞は、ＣＤ３８－、ＣＤ３４＋、ＣＤ１３３＋について富化され、最も好ましくは、拡大された細胞は、Ｌｉｎ－、ＣＤ３８－、ＣＤ３４＋、ＣＤ１３３＋、ＣＤ４５ＲＡ－、ＣＤ９０＋、ＣＤ４９ｆ＋が富化されている。一実施形態では、拡大された細胞は、ＣＤ３８－またはＣＤ３４＋またはＣＤ４５ＲＡ－またはＣＤ９０＋またはそれらの任意の組み合わせについて富化されている。
【0064】
本発明の一態様は、上記に定義されたＨＳＰＣの拡大のためのキットであり、このキットは、ＨＳＰＣの拡大のための滅菌要素、ＨＤＡＣ阻害剤、および式ＲＮＨ（ＣｎＨ２ｎ）ＮＨ（ＣｎＨ２ｎ）ＳＸ（式中、Ｒは水素、アリール、アシル、または１～７個の炭素原子を含むアルキル基であり、各ｎは２～６の値を有し、ＸはＨまたはＰＯ３Ｈ２である）を有するアミノチオール化合物、またはその薬学的に許容される塩を含む。好ましい実施形態では、このキットはまた、単離されたＨＳＰＣの集団を取得するための装置および／または材料を含む。当業者は、適切な要素、装置、および／または材料について知っている。例としては、磁気ビーズ分離、ＭＡＣＳビーズ分離カラム、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）またはＦＡＣＳソーティングが挙げられる。
【0065】
本明細書に記載の方法によって生成された拡大された細胞の集団は、ＨＳＣについて富化され得、拡大された細胞は、長期の生着能力および哺乳動物の骨髄を再増殖する能力を有することが示されている。したがって、本発明の一態様は、療法における使用のための拡大された細胞の集団であり、細胞は、以下の方法、
ｉ）単離されたＨＳＰＣの集団を取得することと、
ｉｉ）ヒストンデアセチラーゼ阻害剤（ＨＤＡＣ阻害剤）の存在下で単離されたＨＳＰＣの集団を培養して、培養された集団を形成することと、
ｉｉｉ）式ＲＮＨ（ＣｎＨ２ｎ）ＮＨ（ＣｎＨ２ｎ）ＳＸ（式中、Ｒは、水素、アリール、アシル、または１～７個の炭素原子を含むアルキル基であり、各ｎは２～６の値を有し、ＸはＨまたはＰＯ３Ｈ２である）を有するアミノチオール化合物、またはその薬学的に許容される塩を培養されたＨＳＰＣの集団に加えて、拡大された細胞を形成することと、に従って拡大されている。
ｉ）単離されたＨＳＰＣの集団を取得することと、
ｉｉ）ヒストンデアセチラーゼ阻害剤（ＨＤＡＣ阻害剤）の存在下で単離されたＨＳＰＣの集団を培養して、培養された集団を形成することと、
ｉｉｉ）式ＲＮＨ（ＣｎＨ２ｎ）ＮＨ（ＣｎＨ２ｎ）ＳＸ（式中、Ｒは、水素、アリール、アシル、または１～７個の炭素原子を含むアルキル基であり、各ｎは２～６の値を有し、ＸはＨまたはＰＯ３Ｈ２である）を有するアミノチオール化合物、またはその薬学的に許容される塩を培養されたＨＳＰＣの集団に加えて、拡大された細胞を形成することと、に従って拡大されている。
【0066】
療法における使用のために拡大された細胞を生成する方法は、本明細書で提供される追加の特徴のいずれかを含み得る。
【0067】
本発明の一態様は、
ｉ）単離されたＨＳＰＣの集団を取得する工程と、
ｉｉ）ヒストンデアセチラーゼ阻害剤（ＨＤＡＣ阻害剤）の存在下で単離されたＨＳＰＣの集団を培養して、培養された集団を形成する工程と、
ｉｉｉ）式ＲＮＨ（ＣｎＨ２ｎ）ＮＨ（ＣｎＨ２ｎ）ＳＸ（式中、Ｒは、水素、アリール、アシル、または１～７個の炭素原子を含むアルキル基であり、各ｎは２～６の値を有し、ＸはＨまたはＰＯ３Ｈ２である）を有するアミノチオール化合物、またはその薬学的に許容される塩を培養されたＨＳＰＣの集団に加えて、拡大された細胞を形成する工程と、
ｉｖ）拡大された細胞を被験体に投与する工程と、を含む、治療方法である。
ｉ）単離されたＨＳＰＣの集団を取得する工程と、
ｉｉ）ヒストンデアセチラーゼ阻害剤（ＨＤＡＣ阻害剤）の存在下で単離されたＨＳＰＣの集団を培養して、培養された集団を形成する工程と、
ｉｉｉ）式ＲＮＨ（ＣｎＨ２ｎ）ＮＨ（ＣｎＨ２ｎ）ＳＸ（式中、Ｒは、水素、アリール、アシル、または１～７個の炭素原子を含むアルキル基であり、各ｎは２～６の値を有し、ＸはＨまたはＰＯ３Ｈ２である）を有するアミノチオール化合物、またはその薬学的に許容される塩を培養されたＨＳＰＣの集団に加えて、拡大された細胞を形成する工程と、
ｉｖ）拡大された細胞を被験体に投与する工程と、を含む、治療方法である。
【0068】
治療方法は、本明細書で提供される追加の特徴のいずれかを含み得る。
本発明の別の態様は、療法における使用のための薬剤の製造における組成物の使用であり、この組成物は、
ｉ）単離されたＨＳＰＣの集団を取得する工程と、
ｉｉ）ヒストンデアセチラーゼ阻害剤（ＨＤＡＣ阻害剤）の存在下で単離されたＨＳＰＣの集団を培養して、培養された集団を形成する工程と、
ｉｉｉ）式ＲＮＨ（ＣｎＨ２ｎ）ＮＨ（ＣｎＨ２ｎ）ＳＸ（式中、Ｒは、水素、アリール、アシル、または１～７個の炭素原子を含むアルキル基であり、各ｎは２～６の値を有し、ＸはＨまたはＰＯ３Ｈ２である）を有するアミノチオール化合物、またはその薬学的に許容される塩を培養されたＨＳＰＣの集団に加えて、拡大された細胞を形成する工程と、を含む。
本発明の別の態様は、療法における使用のための薬剤の製造における組成物の使用であり、この組成物は、
ｉ）単離されたＨＳＰＣの集団を取得する工程と、
ｉｉ）ヒストンデアセチラーゼ阻害剤（ＨＤＡＣ阻害剤）の存在下で単離されたＨＳＰＣの集団を培養して、培養された集団を形成する工程と、
ｉｉｉ）式ＲＮＨ（ＣｎＨ２ｎ）ＮＨ（ＣｎＨ２ｎ）ＳＸ（式中、Ｒは、水素、アリール、アシル、または１～７個の炭素原子を含むアルキル基であり、各ｎは２～６の値を有し、ＸはＨまたはＰＯ３Ｈ２である）を有するアミノチオール化合物、またはその薬学的に許容される塩を培養されたＨＳＰＣの集団に加えて、拡大された細胞を形成する工程と、を含む。
【0069】
上記のような医薬品の製造における使用は、本明細書で提供される追加の特徴のいずれかを含み得る。
【0070】
本明細書に提示される方法によって拡大された細胞は、細胞移植物として使用することができる。本明細書に提示された方法によって拡大された細胞は、哺乳動物の骨髄を再増殖させるために使用され得る。したがって、本発明の実施形態は、血液学的障害、免疫障害、代謝障害、または神経変性障害の治療における使用のための拡大された細胞の集団である。ここで、被験体は、上記の方法に従って拡大された拡大された細胞の集団を投与される。特定の実施形態では、拡大された細胞の集団は、血液学的障害の治療における使用のためのものである。
【0071】
拡大された細胞集団は、従来の骨髄、臍帯血、または末梢血移植の代替として、造血幹細胞療法の移植片として使用できる。拡大された細胞集団の移植は、従来の骨髄、臍帯血、または末梢血の移植と同じ様式で実行することができる。移植片は、以下の構成要素、緩衝液、抗生物質、医薬化合物のいずれかとともに、拡大された細胞の集団を含み得る。
【0072】
拡大された細胞集団を使用して治療できる障害の例には、急性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、非ホジキンリンパ腫、重症再生不良性貧血、重症複合免疫不全症、鎌状細胞疾患、慢性肉芽腫症、重症複合免疫不全症候群、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）欠損症、再生不良性貧血、ウィスコット－アルドリッチ症候群、チェディアック－東症候群、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）などの免疫不全症候群、Ｃ３欠損症、サラセミアなどの先天性貧血、酵素欠損症および鎌状赤血球貧血による溶血性貧血、ゴーチャー病およびムコ多糖症などのリソソーム蓄積症、副腎白血病、様々な種類の癌および腫瘍、特に急性または慢性白血病、ファンコニ症候群、再生不良性貧血、顆粒球減少症、リンパ球減少症、血小板減少症、特発性血小板減少性紫斑病、血栓性血小板減少性紫斑病、カサバッハ－メリット症候群、悪性リンパ腫、ホジキン病、多発性骨髄腫、慢性肝障害、腎不全、バンク血液または手術中の大量輸血、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、重度の感染症、全身性紅斑性狼瘡、関節リウマチ、異種皮膚症、全身性硬化症、多発性筋炎、皮膚筋炎、混合結合組織疾患、真性多血症、橋本病、バセドウ病、重力筋無力症、インスリン依存性真性糖尿病、自己免疫性溶血性貧血、ヘビ咬傷、溶血性尿毒症症候群、脾機能亢進症、出血、ベルナール－スーリエ症候群、グランツマン血小板減少症、尿毒症、脊髄異形成症候群、真性赤血球増加症、赤血病、本質的な血小板血症、骨髄増殖性疾患、外傷性脊髄損傷、神経損傷、神経断裂症、骨格筋損傷、瘢痕、真性糖尿病、脳梗塞、心筋梗塞、および閉塞性無気肺（ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｖｅ ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）が含まれる。
【0073】
拡大された細胞集団は、以下の投与経路、皮下、頭頂間、筋肉内、静脈内、腫瘍内、眼内、網膜内、硝子体内、または頭蓋内で投与することができる。
【0074】
拡大された細胞集団は、投与、安定性、均一性、生物学的利用能、またはそれらの任意の組み合わせを改善および増強するために、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、または担体と組み合わせることができる。特定の実施形態において、本開示の細胞外小胞または細胞は、無菌溶液に懸濁して投与される。特定の実施形態では、この溶液は、０．９％のＮａＣｌを含む。特定の実施形態では、この溶液は、緩衝液、例えば、酢酸、クエン酸、ヒスチジン、コハク酸、リン酸、重炭酸、またはヒドロキシメチルアミノメタン（トリス）、界面活性剤、例えば、ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）、ポリソルベート２０（Ｔｗｅｅｎ２０）、またはポロキサマー１８８、ポリオール／二糖／多糖、例えば、グルコース、デキストロース、マンノース、マンニトール、ソルビトール、スクロース、トレハロース、またはデキストラン４０、アミノ酸、例えば、グリシンまたはアルギニン、抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸またはメチオニン、およびキレート剤、例えば、ＥＧＴＡまたはＥＧＴＡのうちの１つ以上をさらに含む。
【0075】
本発明の方法によって生成された拡大された細胞の集団は、遺伝子療法において使用され得る。治療遺伝子を患者に導入するために、目的の遺伝子は、単離された集団のＨＳＣにトランスフェクトされるべきである。治療遺伝子は、ウイルス性または非ウイルス性の方法を使用して導入することができる。適切なウイルスベクターには、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスおよび単純ヘルペスウイルスが挙げられる。目的の遺伝子を含む細胞は、患者に導入される前に、本方法に従って拡大させることができる。
【0076】
以下の実施例は本発明を例証する。
【実施例】
【0077】
実施例１ 臍帯血からの細胞の増殖
材料および方法
細胞培養
ヒトのＵＣＢ単位は、Ｏｘｆｏｒｄ ａｎｄ Ｂｅｒｋｓｈｉｒｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｅｔｈｉｃａｌ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅｓからの書面による情報に基づく事前同意および倫理的承認、ならびにＮＨＳＢＴ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｃｏｍｍｉｔｔｅｅの承認を得て実施された研究によって収集された。ＵＣＢ単核細胞（ＭＮＣ）は、リンパ球分離培地１０７７（ＰＡＡ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｐａｓｃｈｉｎｇ，Ａｕｓｔｒｉａ、密度＜１．０７７ｇ／ｍｌ）での密度勾配遠心分離によって単離された。ＣＤ１３３＋細胞は、免疫磁気ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用してＭＮＣから単離された。単離後、細胞をＦＣＳ中の１０％ＤＭＳＯ（ウシ胎児血清）中で凍結保存し、１×１０５細胞／バイアルのアリコートで－１５０℃にて保存した。ＣＤ３４－ＡＰＣ、ＣＤ１３３－ＰＥ、および適切なアイソタイプ対照（すべてＭｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して、ＢＤ ＬＳＲ ＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＣＡ）でフローサイトメトリーを用いて、分離の純度について細胞を分析した。骨髄由来のＣＤ１３３＋細胞はＬｏｎｚａから商業的に入手し、末梢血ＣＤ１３３＋細胞は、Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓから商業的に入手した全末梢血単核細胞から上記の免疫磁気ビーズを使用して単離した。
材料および方法
細胞培養
ヒトのＵＣＢ単位は、Ｏｘｆｏｒｄ ａｎｄ Ｂｅｒｋｓｈｉｒｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｅｔｈｉｃａｌ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅｓからの書面による情報に基づく事前同意および倫理的承認、ならびにＮＨＳＢＴ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｃｏｍｍｉｔｔｅｅの承認を得て実施された研究によって収集された。ＵＣＢ単核細胞（ＭＮＣ）は、リンパ球分離培地１０７７（ＰＡＡ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｐａｓｃｈｉｎｇ，Ａｕｓｔｒｉａ、密度＜１．０７７ｇ／ｍｌ）での密度勾配遠心分離によって単離された。ＣＤ１３３＋細胞は、免疫磁気ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用してＭＮＣから単離された。単離後、細胞をＦＣＳ中の１０％ＤＭＳＯ（ウシ胎児血清）中で凍結保存し、１×１０５細胞／バイアルのアリコートで－１５０℃にて保存した。ＣＤ３４－ＡＰＣ、ＣＤ１３３－ＰＥ、および適切なアイソタイプ対照（すべてＭｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して、ＢＤ ＬＳＲ ＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＣＡ）でフローサイトメトリーを用いて、分離の純度について細胞を分析した。骨髄由来のＣＤ１３３＋細胞はＬｏｎｚａから商業的に入手し、末梢血ＣＤ１３３＋細胞は、Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓから商業的に入手した全末梢血単核細胞から上記の免疫磁気ビーズを使用して単離した。
【0078】
２人または３人のドナーからのバイアルを解凍し、１００ｎｇ／ｍＬ ＳＣＦ、１００ｎｇ／ｍＬ ＦＬＴ３ＬＧ、および２０ｎｇ／ｍＬ ＴＰＯ（すべてＭｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を含むＳｔｅｍＳｐａｎ ＡＣＦ培地（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にプールした。計数後、細胞を上記の培地中２０，０００細胞／ウェルにて９６ウェル丸底懸濁液プレートにプレーティングした。細胞は、これらの条件下で、５％ＣＯ２を用いて、３７℃加湿インキュベーター中で一晩回復させた。
【0079】
翌日、計数したプレートから細胞を回収し、２４ウェルＮａｎｅｘプレート（Ｃｏｍｐａｓｓ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ）または標準的な組織培養処理プレートに、ＨＤＡＣ阻害剤を含む（ほとんどの実験では、スクリプタイドを１μＭの濃度で使用した）１ｍＬの基本培地（１００ｎｇ／ｍＬ ＳＣＦ、１００ｎｇ／ｍＬ ＦＬＴ３ＬＧおよび２０ｎｇ／ｍＬ ＴＰＯを伴うＳｔｅｍＳｐａｎ ＡＣＦ）中に２５００細胞／ウェルで播種した。細胞のアリコートをＣＦＵ分析に使用し、別のアリコートをフローサイトメトリー分析に使用した。
【0080】
培養３日後、培地をサイトカイン（ＳＣＦ、ＴＰＯ、ＦＬＴ３ＬＧ）およびＨＤＡＣ阻害剤（スクリプタイド１μＭ）を有する新鮮な培地に交換または補充のいずれかを行った。収集の１６～２０時間前に、ＷＲ１０６５を１００μＭの濃度で補充した。合計５日間の増殖後、細胞を収集し、計数し、フローサイトメトリーで分析する。
【0081】
ＣＦＵアッセイ
ＣＦＵアッセイは、ＭｅｔｈｏＣｕｌｔ Ｃｌａｓｓｉｃキット（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を製造元の指示に従って使用して実施した。簡単に説明すると、細胞のアリコート（既知の数または体積）を３ｍＬのＭｅｔｈｏＣｕｌｔ培地と混合し、鈍針およびシリンジを使用して６ウェル懸濁プレートの１つのウェルにプレーティングした。プレートは、培地を交換せずに、５％ＣＯ２を有する加湿インキュベーター内で３７℃にて２週間インキュベートした。２週間後、コロニーを解剖顕微鏡下で写真撮影し、計数した。次に、異なる種類のコロニーの割合をスコアリングし、割合／サンプルを計算した。
ＣＦＵアッセイは、ＭｅｔｈｏＣｕｌｔ Ｃｌａｓｓｉｃキット（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を製造元の指示に従って使用して実施した。簡単に説明すると、細胞のアリコート（既知の数または体積）を３ｍＬのＭｅｔｈｏＣｕｌｔ培地と混合し、鈍針およびシリンジを使用して６ウェル懸濁プレートの１つのウェルにプレーティングした。プレートは、培地を交換せずに、５％ＣＯ２を有する加湿インキュベーター内で３７℃にて２週間インキュベートした。２週間後、コロニーを解剖顕微鏡下で写真撮影し、計数した。次に、異なる種類のコロニーの割合をスコアリングし、割合／サンプルを計算した。
【0082】
フローサイトメトリーアッセイ
細胞を収集し、洗浄し、プレコンジュゲート抗体のパネルを使用して、ＰＢＳ中の３％ＦＢＳ中で染色した。細胞を氷上で抗体とともに３０分間インキュベートし、次いで、ＰＢＳ中の３％ＦＢＳで２回洗浄し、上記の緩衝液２５０ｕＬに再懸濁し、その後ＢＤ Ｃａｎｔｏ ＩＩフローサイトメーターを使用して分析した。［抗体パネルは次のとおりであった。５Ｌｉｎカスタムカクテル（ＣＤ２３５ａ、ＣＤ４、ＣＤ１０、ＣＤ１１ｂおよびＣＤ１９）ＡＰＣ－Ｖｉｏ７７０、ＣＤ３８－ＰＥ－Ｖｉｏ７７０、ＣＤ３４－ＰｅｒＣＰ－Ｖｉｏ７００、ＣＤ１３３－ＰＥ、ＣＤ４５ＲＡ－ＶｉｏＢｌｕｅ、ＣＤ４９ｆ－ＦＩＴＣ、ＣＤ９０－ＡＰＣ（すべてＭｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）。］
細胞を収集し、洗浄し、プレコンジュゲート抗体のパネルを使用して、ＰＢＳ中の３％ＦＢＳ中で染色した。細胞を氷上で抗体とともに３０分間インキュベートし、次いで、ＰＢＳ中の３％ＦＢＳで２回洗浄し、上記の緩衝液２５０ｕＬに再懸濁し、その後ＢＤ Ｃａｎｔｏ ＩＩフローサイトメーターを使用して分析した。［抗体パネルは次のとおりであった。５Ｌｉｎカスタムカクテル（ＣＤ２３５ａ、ＣＤ４、ＣＤ１０、ＣＤ１１ｂおよびＣＤ１９）ＡＰＣ－Ｖｉｏ７７０、ＣＤ３８－ＰＥ－Ｖｉｏ７７０、ＣＤ３４－ＰｅｒＣＰ－Ｖｉｏ７００、ＣＤ１３３－ＰＥ、ＣＤ４５ＲＡ－ＶｉｏＢｌｕｅ、ＣＤ４９ｆ－ＦＩＴＣ、ＣＤ９０－ＡＰＣ（すべてＭｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）。］
【0083】
細胞計数
細胞数は、計数ビーズ（ＣｏｕｎｔＢｒｉｇｈｔ ｂｅａｄｓ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を活用したフローサイトメトリーを使用して測定した。
細胞数は、計数ビーズ（ＣｏｕｎｔＢｒｉｇｈｔ ｂｅａｄｓ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を活用したフローサイトメトリーを使用して測定した。
【0084】
結果
図１は、すべての処理群にわたる全有核細胞の分析を示し、これは、すべての培養条件で細胞の拡大にほとんど違いがないことを示す。５日間の培養期間では、サイトカインを含む基本培地中の細胞の拡大は約２０～４０倍であり（異なるドナーと異なる生物学的反復の間で違いが見られる）、これは、サイトカインを伴い、ＷＲ１０６５（１００μＭ）を伴うかまたは伴わないスクリプタイド（１μＭ）で増殖した細胞ではわずかに減少するが、しかし、この減少は有意ではない。［基本対スクリプタイドｐ＝０．１９１、基本対スクリプタイド＋ＷＲ１０６５ｐ＝０．２８］ｎ＝１４。しかし、ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋細胞の増殖を比較すると（図３を参照）、スクリプタイド単独およびＷＲ１０６５と組み合わせたスクリプタイドで処理した細胞は、サイトカインのみで増殖された細胞と比較して、ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋細胞の割合の増加を示す。エキソビボ培養前の細胞の分析（図２）は、開始集団の純度が高いことを示す（９０～９８％ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋）。基本培地＋サイトカイン（基本として示される）で５日間培養した後、割合は約５０％に低下する。併用処理で拡大された細胞では、この割合は約７２％とはるかに高いままである。この差は統計学的に有意である（それぞれ＊＊ｐ＝０．００３および＊＊＊ｐ＝０．０００１）。
図１は、すべての処理群にわたる全有核細胞の分析を示し、これは、すべての培養条件で細胞の拡大にほとんど違いがないことを示す。５日間の培養期間では、サイトカインを含む基本培地中の細胞の拡大は約２０～４０倍であり（異なるドナーと異なる生物学的反復の間で違いが見られる）、これは、サイトカインを伴い、ＷＲ１０６５（１００μＭ）を伴うかまたは伴わないスクリプタイド（１μＭ）で増殖した細胞ではわずかに減少するが、しかし、この減少は有意ではない。［基本対スクリプタイドｐ＝０．１９１、基本対スクリプタイド＋ＷＲ１０６５ｐ＝０．２８］ｎ＝１４。しかし、ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋細胞の増殖を比較すると（図３を参照）、スクリプタイド単独およびＷＲ１０６５と組み合わせたスクリプタイドで処理した細胞は、サイトカインのみで増殖された細胞と比較して、ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋細胞の割合の増加を示す。エキソビボ培養前の細胞の分析（図２）は、開始集団の純度が高いことを示す（９０～９８％ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋）。基本培地＋サイトカイン（基本として示される）で５日間培養した後、割合は約５０％に低下する。併用処理で拡大された細胞では、この割合は約７２％とはるかに高いままである。この差は統計学的に有意である（それぞれ＊＊ｐ＝０．００３および＊＊＊ｐ＝０．０００１）。
【0085】
表現型Ｌｉｎ－、ＣＤ３８－、ＣＤ３４＋、ＣＤ４５ＲＡ－、ＣＤ１３３＋、ＣＤ９０＋、ＣＤ４９ｆ＋を特徴とする特定のＨＳＣが富化された集団の拡大倍率は、サイトカイン単独よりも併用処理で２０倍高くなっている。培養の最後に存在する表現型（Ｌｉｎ－、ＣＤ３８－、ＣＤ３４＋、ＣＤ４５ＲＡ－、ＣＤ１３３＋、ＣＤ９０＋、ＣＤ４９ｆ＋）の細胞数の測定値を、増殖の開始時に播種した細胞と比較して、「拡大倍率」として表すことができる。拡大倍率の比較は、スクリプタイドで処理された細胞が、サイトカインを含む基本培地で増殖させた細胞よりも約１０倍高い拡大を有することを示す。スクリプタイドとＷＲ１０６５の組み合わせで増殖させた細胞は、サイトカインを含む基本培地で増殖させた細胞よりも２０倍高い拡大を示す（図３）。この違いは統計学的に有意である。薬剤の組み合わせの作用は、各々個別の化合物の付加的な効果以上のものである。サイトカイン＋ＷＲ１０６５で拡大された細胞は、サイトカイン単独の約３倍の「ＨＳＣ」区画の拡大を示し、スクリプタイド単独で増殖された細胞は、基本の１０倍の拡大を示し、組み合わせは、基本の２０倍の拡大を示し（図３）、したがって、これは付加的な効果よりも大きい。ＨＤＡＣ阻害剤およびＷＲ１０６５を用いたＵＣＢ由来ＣＤ１３３＋細胞のインビトロ培養は、サイトカインのみで拡大された細胞と比較して、コロニー形成単位である顆粒球、赤血球、単球、巨核球（ＣＦＵ－ＧＥＭＭ）コロニーの数を増加させる。併用処理で拡大し、ＭｅｔｈｏＣｕｌｔ中の限界希釈でプレーティングした細胞は、図４に示すように、事前に拡大された細胞の６～７倍、サイトカイン単独で拡大された細胞の少なくとも２．５倍のＧＥＭＭコロニーを生成し、この差は統計学的に有意である。
【0086】
実施例２ 骨髄からの細胞の増殖
上記に定義された拡大プロトコルはまた、骨髄由来の細胞でも実施された。骨髄細胞は、併用処理で培養した場合、全有核細胞とＣＤ３４＋細胞の両方で５倍の拡大を示す。しかし、ＨＳＣ（表現型Ｌｉｎ－、ＣＤ３８－、ＣＤ３４＋、ＣＤ４５ＲＡ－、ＣＤ１３３＋、ＣＤ９０＋、ＣＤ４９ｆ＋で特徴付けられる）の細胞拡大は、図５のサイトカインを含む基本培地で拡大された細胞と比較して、スクリプタイドおよびＷＲ１０６５で増殖された細胞の方が１７倍高い。
上記に定義された拡大プロトコルはまた、骨髄由来の細胞でも実施された。骨髄細胞は、併用処理で培養した場合、全有核細胞とＣＤ３４＋細胞の両方で５倍の拡大を示す。しかし、ＨＳＣ（表現型Ｌｉｎ－、ＣＤ３８－、ＣＤ３４＋、ＣＤ４５ＲＡ－、ＣＤ１３３＋、ＣＤ９０＋、ＣＤ４９ｆ＋で特徴付けられる）の細胞拡大は、図５のサイトカインを含む基本培地で拡大された細胞と比較して、スクリプタイドおよびＷＲ１０６５で増殖された細胞の方が１７倍高い。
【0087】
実施例３ 末梢血に由来する細胞の増殖
上記に定義された拡大プロトコルはまた、末梢血に由来する細胞に対しても実施された。末梢血に由来する細胞の全体的な拡大倍率は、臍帯血に由来する細胞のそれよりも低かった。末梢血細胞は、すべての増殖条件下で、全有核細胞とＣＤ３４＋細胞の両方で２～６倍の増殖を示す。しかし、ＨＳＣ（表現型Ｌｉｎ－、ＣＤ３８－、ＣＤ３４＋、ＣＤ４５ＲＡ－、ＣＤ１３３＋、ＣＤ９０＋、ＣＤ４９ｆ＋によって特徴付けられる）の細胞拡大は、図６のサイトカインを含む基本培地で増殖された細胞と比較して、スクリプタイドおよびＷＲ１０６５で増殖した細胞で３００倍高い。
上記に定義された拡大プロトコルはまた、末梢血に由来する細胞に対しても実施された。末梢血に由来する細胞の全体的な拡大倍率は、臍帯血に由来する細胞のそれよりも低かった。末梢血細胞は、すべての増殖条件下で、全有核細胞とＣＤ３４＋細胞の両方で２～６倍の増殖を示す。しかし、ＨＳＣ（表現型Ｌｉｎ－、ＣＤ３８－、ＣＤ３４＋、ＣＤ４５ＲＡ－、ＣＤ１３３＋、ＣＤ９０＋、ＣＤ４９ｆ＋によって特徴付けられる）の細胞拡大は、図６のサイトカインを含む基本培地で増殖された細胞と比較して、スクリプタイドおよびＷＲ１０６５で増殖した細胞で３００倍高い。
【0088】
実施例４ クラスＩ ＨＤＡＣ阻害剤ＲＧ２８３３およびＲＧＦＰ９６６を使用した細胞の拡大
上記に定義された拡大プロトコルは、クラスＩ ＨＤＡＣ阻害剤ＲＧ２８３３およびＲＧＦＰ９６６を使用して実施された。ＲＧ２８３３はＨＤＡＣ１および３に選択的であり、ＲＧＦＰ９６６はＨＤＡＣ３に選択的である。サイトカインを含む培地（基本）、ＲＧ２８３３またはＲＧＦＰ９６６のいずれかを含む基本培地、ならびにＲＧ２８３３およびＷＲ１０６５またはＲＧＦＰ９６６およびＷＲ１０６５のいずれかを含む基本培地で細胞を拡大させた。図７は、基本培地、ＲＧ２８３３を含む培地、ＲＧ２８３３およびＷＲ１０６５を含む培地で増殖させた細胞のＴＮＣおよびＨＳＣの拡大を示す（スクリプタイドで処理した培地、ならびにスクリプタイドおよびＷＲ１０６５を含む培地で増殖された細胞の増殖データもまた比較として示される）。ＴＮＣの倍数拡大は、基本培地で増殖された細胞と比較した場合、ＲＧ２８３３を用いて、またはＲＧ２８３３およびＷＲ１０６５を用いて処理した場合に増加することが示される。ＨＳＣの倍数拡大は、基本培地で増殖された細胞と比較して、ＲＧ２８３３を用いて、またはＲＧ２８３３およびＷＲ１０６５を用いて処理した細胞でも２倍になる。ＲＧ２８３３およびＷＲ１０６５で処理された細胞は、ＲＧ２８３３単独で処理された細胞と比較して、ＨＳＣでの倍数拡大を示すことが注目されるべきである。
上記に定義された拡大プロトコルは、クラスＩ ＨＤＡＣ阻害剤ＲＧ２８３３およびＲＧＦＰ９６６を使用して実施された。ＲＧ２８３３はＨＤＡＣ１および３に選択的であり、ＲＧＦＰ９６６はＨＤＡＣ３に選択的である。サイトカインを含む培地（基本）、ＲＧ２８３３またはＲＧＦＰ９６６のいずれかを含む基本培地、ならびにＲＧ２８３３およびＷＲ１０６５またはＲＧＦＰ９６６およびＷＲ１０６５のいずれかを含む基本培地で細胞を拡大させた。図７は、基本培地、ＲＧ２８３３を含む培地、ＲＧ２８３３およびＷＲ１０６５を含む培地で増殖させた細胞のＴＮＣおよびＨＳＣの拡大を示す（スクリプタイドで処理した培地、ならびにスクリプタイドおよびＷＲ１０６５を含む培地で増殖された細胞の増殖データもまた比較として示される）。ＴＮＣの倍数拡大は、基本培地で増殖された細胞と比較した場合、ＲＧ２８３３を用いて、またはＲＧ２８３３およびＷＲ１０６５を用いて処理した場合に増加することが示される。ＨＳＣの倍数拡大は、基本培地で増殖された細胞と比較して、ＲＧ２８３３を用いて、またはＲＧ２８３３およびＷＲ１０６５を用いて処理した細胞でも２倍になる。ＲＧ２８３３およびＷＲ１０６５で処理された細胞は、ＲＧ２８３３単独で処理された細胞と比較して、ＨＳＣでの倍数拡大を示すことが注目されるべきである。
【0089】
図８は、基本培地、ＲＧＦＰ９６６を含む培地、ＲＧＦＰ９６６およびＷＲ１０６５を含む培地で増殖された細胞のＴＮＣの拡大およびＨＳＣの拡大を示す（スクリプタイドを含む培地、ならびにスクリプタイドおよびＷＲ１０６５を含む培地で増殖させた細胞の増殖データもまた比較として示される）。ＴＮＣの倍数拡大は、基本培地で増殖された細胞と比較した場合、ＲＧＦＰ９６６、またはＲＧＦＰ９６６およびＷＲ１０６５で処理した場合に増加することが示される。ＨＳＣの拡大倍率は、基本培地で増殖された細胞と比較して、ＲＧＦＰ９６６、またはＲＧＦＰ９６６およびＷＲ１０６５で処理した細胞で類似している。しかし、ＲＧＦＰ９６６およびＷＲ１０６５で処理された細胞は、ＲＧＦＰ９６６単独で処理された細胞と比較して、ＨＳＣでの倍数拡大の増加を示すことが注目されるべきである。
【0090】
これらの例は、クラスＩ ＨＤＡＣ阻害剤およびＷＲ１０６５で処理された細胞が、基本培地で増殖された細胞と比較して、ＴＮＣの拡大倍率の増加を示すことを示す。クラスＩ ＨＤＡＣ阻害剤およびＷＲ１０６５で処理された細胞は、基本培地で増殖された細胞、またはクラスＩ ＨＤＡＣ阻害剤単独で処理された細胞で見られるよりも、ＨＳＣ区画の拡大倍率の増加もまた示す。
【0091】
実施例５ クラスＩＩａＨＤＡＣ阻害剤ＬＭＫ２３５を使用する細胞の増殖
上記に定義された拡大プロトコルは、クラスＩＩａＨＤＡＣ阻害剤ＬＭＫ２３５を使用して実施された。ＬＭＫ２３５はＨＤＡＣ４および５に選択的である。図９は、サイトカインを含む培地（基本）、ＬＭＫ２３５を含む基本培地、ならびにＬＭＫ２３５およびＷＲ１０６５を含む基本培地で拡大された細胞のＴＮＣの拡大およびＨＳＣの拡大を示す（スクリプタイドを含む培地ならびにスクリプタイドおよびＷＲ１０６５を含む培地で増殖された細胞の拡大データも比較として示される）。ＬＭＫ２３５またはＬＭＫ２３５およびＷＲ１０６５で処理した場合のＴＮＣの拡大倍率は、基本培地で増殖された細胞よりもわずかに低い。しかし、ＨＳＣの倍数拡大は、基本培地で増殖された細胞と比較して、ＬＭＫ２３５を用いて、またはＬＭＫ２３５およびＷＲ１０６５を用いて処理した細胞で顕著に増加する。
上記に定義された拡大プロトコルは、クラスＩＩａＨＤＡＣ阻害剤ＬＭＫ２３５を使用して実施された。ＬＭＫ２３５はＨＤＡＣ４および５に選択的である。図９は、サイトカインを含む培地（基本）、ＬＭＫ２３５を含む基本培地、ならびにＬＭＫ２３５およびＷＲ１０６５を含む基本培地で拡大された細胞のＴＮＣの拡大およびＨＳＣの拡大を示す（スクリプタイドを含む培地ならびにスクリプタイドおよびＷＲ１０６５を含む培地で増殖された細胞の拡大データも比較として示される）。ＬＭＫ２３５またはＬＭＫ２３５およびＷＲ１０６５で処理した場合のＴＮＣの拡大倍率は、基本培地で増殖された細胞よりもわずかに低い。しかし、ＨＳＣの倍数拡大は、基本培地で増殖された細胞と比較して、ＬＭＫ２３５を用いて、またはＬＭＫ２３５およびＷＲ１０６５を用いて処理した細胞で顕著に増加する。
【0092】
実施例６ クラスＩＩｂ ＨＤＡＣ阻害剤ツバスタチンＡを使用する細胞の拡大
上記に定義された拡大プロトコルは、クラスＩＩｂ ＨＤＡＣ阻害剤ツバスタチンＡを使用して実施された。ツバスタチンＡはＨＤＡＣ６に選択的である。図１０は、サイトカインを含む培地（基本）、ツバスタチンＡを含む基本培地、およびツバスタチンＡとＷＲ１０６５を含む基本培地（スクリプタイドおよび培地を含む培地で増殖した細胞の拡大データ）で増殖した細胞のＴＮＣの増殖とＨＳＣの増殖を示す。スクリプタイドとＷＲ１０６５を含むものも比較として示される）。ツバスタチンＡ、またはツバスタチンＡおよびＷＲ１０６５で処理した場合のＴＮＣの拡大倍率は、基本培地で増殖された細胞と同様である。しかし、ＨＳＣの倍数拡大は、基本培地で増殖された細胞と比較して、ツバスタチンＡで処理した細胞、ならびにツバスタチンＡおよびＷＲ１０６５で処理した細胞で有意に増加している。ツバスタチンＡとＷＲ１０６５の組み合わせで処理された細胞は、ツバスタチンＡのみで処理された細胞よりもＨＳＣの拡大倍率の増加を示すことにも注意する必要がある。
上記に定義された拡大プロトコルは、クラスＩＩｂ ＨＤＡＣ阻害剤ツバスタチンＡを使用して実施された。ツバスタチンＡはＨＤＡＣ６に選択的である。図１０は、サイトカインを含む培地（基本）、ツバスタチンＡを含む基本培地、およびツバスタチンＡとＷＲ１０６５を含む基本培地（スクリプタイドおよび培地を含む培地で増殖した細胞の拡大データ）で増殖した細胞のＴＮＣの増殖とＨＳＣの増殖を示す。スクリプタイドとＷＲ１０６５を含むものも比較として示される）。ツバスタチンＡ、またはツバスタチンＡおよびＷＲ１０６５で処理した場合のＴＮＣの拡大倍率は、基本培地で増殖された細胞と同様である。しかし、ＨＳＣの倍数拡大は、基本培地で増殖された細胞と比較して、ツバスタチンＡで処理した細胞、ならびにツバスタチンＡおよびＷＲ１０６５で処理した細胞で有意に増加している。ツバスタチンＡとＷＲ１０６５の組み合わせで処理された細胞は、ツバスタチンＡのみで処理された細胞よりもＨＳＣの拡大倍率の増加を示すことにも注意する必要がある。
【0093】
実施例７ 広域スペクトルＨＤＡＣ阻害剤であるフェニル酪酸ナトリウムおよびＱｕｉｓｉｎｏｓｔａｔを使用する細胞の増殖
上記に定義された拡大プロトコルは、広域スペクトルＨＤＡＣ阻害剤であるフェニル酪酸ナトリウムとキシノスタットを使用して実施された。フェニル酪酸ナトリウムは現在、尿素回路障害の治療に使用されており、キシノスタットは現在、癌における使用のための臨床試験中である。サイトカインを含む培地（基本）、フェニル酪酸ナトリウムまたはキシノスタットのいずれかを含む基本培地、およびフェニル酪酸ナトリウムとＷＲ１０６５またはキシノスタットとＷＲ１０６５のいずれかを含む基本培地中で細胞を拡大させた。図１１は、基本培地、フェニル酪酸ナトリウムを含む培地、フェニル酪酸ナトリウムおよびＷＲ１０６５を含む培地で増殖された細胞のＴＮＣの拡大およびＨＳＣの拡大を示す（スクリプタイドを含む培地、ならびにスクリプタイドおよびＷＲ１０６５を含む培地で増殖された細胞の拡大データもまた比較として示される）。ＴＮＣの拡大倍率は、フェニル酪酸ナトリウムを用いて、またはフェニル酪酸ナトリウムおよびＷＲ１０６５を用いて処理した場合、基本培地で増殖された細胞と比較された場合に増加することが示される。ＨＳＣの拡大倍率は、基本培地で増殖した細胞と比較して、フェニル酪酸ナトリウムを用いて、またはフェニル酪酸ナトリウムおよびＷＲ１０６５を用いて処理した細胞についてもまた増加される。
上記に定義された拡大プロトコルは、広域スペクトルＨＤＡＣ阻害剤であるフェニル酪酸ナトリウムとキシノスタットを使用して実施された。フェニル酪酸ナトリウムは現在、尿素回路障害の治療に使用されており、キシノスタットは現在、癌における使用のための臨床試験中である。サイトカインを含む培地（基本）、フェニル酪酸ナトリウムまたはキシノスタットのいずれかを含む基本培地、およびフェニル酪酸ナトリウムとＷＲ１０６５またはキシノスタットとＷＲ１０６５のいずれかを含む基本培地中で細胞を拡大させた。図１１は、基本培地、フェニル酪酸ナトリウムを含む培地、フェニル酪酸ナトリウムおよびＷＲ１０６５を含む培地で増殖された細胞のＴＮＣの拡大およびＨＳＣの拡大を示す（スクリプタイドを含む培地、ならびにスクリプタイドおよびＷＲ１０６５を含む培地で増殖された細胞の拡大データもまた比較として示される）。ＴＮＣの拡大倍率は、フェニル酪酸ナトリウムを用いて、またはフェニル酪酸ナトリウムおよびＷＲ１０６５を用いて処理した場合、基本培地で増殖された細胞と比較された場合に増加することが示される。ＨＳＣの拡大倍率は、基本培地で増殖した細胞と比較して、フェニル酪酸ナトリウムを用いて、またはフェニル酪酸ナトリウムおよびＷＲ１０６５を用いて処理した細胞についてもまた増加される。
【0094】
図１２は、基本培地、キジノスタットを含む培地、キジノスタットおよびＷＲ１０６５を含む培地で増殖した細胞のＴＮＣの拡大およびＨＳＣの拡大を示す（スクリプタイドを含む培地およびスクリプタイドおよびＷＲ１０６５を含む培地で増殖された細胞の拡大データもまた比較として示される）。ＴＮＣの拡大倍率は、基本培地中で増殖された細胞と比較した場合、キシノスタット、またはキシノスタットおよびＷＲ１０６５で処理した細胞の方がわずかに低い。しかし、ＨＳＣの倍数拡大は、基本培地で増殖された細胞と比較して、キジノスタット、またはキシノスタットおよびＷＲ１０６５で処理した細胞で顕著に増加する。キシノスタットおよびＷＲ１０６５で処理された細胞は、キシノスタットのみで処理された細胞と比較して、ＨＳＣ中での増加した倍数の拡大を示すこともまた注目されるべきである。
【0095】
実施例８ スクリプタイドおよびＷＲ１０６５を使用する個々のドナーからの細胞の増殖
上記に定義された拡大プロトコルは、３人の別々のドナーからのＵＣＢ細胞、ならびに細胞のプールされたサンプルに対して実施された。細胞は、スクリプタイドを含むサイトカイン（基本）培地、およびスクリプタイドとＷＲ１０６５を含む培地を補充した培地で増殖させた。図１３は、基本培地で培養された細胞と比較した場合、スクリプタイドで処理した細胞のＨＳＣの拡大倍率が平均３０倍（範囲１０～５５）高かったことを示す。スクリプタイドとＷＲ１０６５の組み合わせで処理された細胞は、スクリプタイド単独での倍数拡大に関係なく、ＨＳＣの倍数拡大の２倍の増加を示した。ドナーのバリエーションは存在するが、併用処理は、テストされたすべてのドナーのＨＳＣの拡大を増強する。
上記に定義された拡大プロトコルは、３人の別々のドナーからのＵＣＢ細胞、ならびに細胞のプールされたサンプルに対して実施された。細胞は、スクリプタイドを含むサイトカイン（基本）培地、およびスクリプタイドとＷＲ１０６５を含む培地を補充した培地で増殖させた。図１３は、基本培地で培養された細胞と比較した場合、スクリプタイドで処理した細胞のＨＳＣの拡大倍率が平均３０倍（範囲１０～５５）高かったことを示す。スクリプタイドとＷＲ１０６５の組み合わせで処理された細胞は、スクリプタイド単独での倍数拡大に関係なく、ＨＳＣの倍数拡大の２倍の増加を示した。ドナーのバリエーションは存在するが、併用処理は、テストされたすべてのドナーのＨＳＣの拡大を増強する。
【0096】
実施例９ 様々な組織培養プレートを使用する細胞の拡大
スクリプタイドとＷＲ１０６５の併用処理は、細胞を増殖させるために使用される表面のタイプに関係なく、ＨＳＣ細胞の拡大を増強する。細胞培養における足場の使用は、インビボ条件をより良好に模倣し、結果として、細胞が増殖するためのより良好なニッチを提供することが知られている。以前のすべての例は、表面アミノ化で処理されたＰＥＳエレクトロスピニング繊維で作られた薄い足場材料を含むＮａｎｅｘプレートを使用して実施された。実験は、標準的な組織培養処理プレートならびにＮａｎｅｘプレートを使用して細胞が培養される場合に、スクリプタイドおよびＷＲ１０６５を用いる処理が、ＨＳＣの拡大を促進することを示すために実施された。細胞増殖プロトコルは上記のように実行され、細胞は３タイプの表面、Ｎａｎｅｘ足場、ＴＣ処理されたＣｏｒｎｉｎｇ２４ウェルプレートまたは懸濁Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ２４ウェルプレートに同じ密度で播種された。サイトカイン（基本）を補充した培地中で培養された細胞のＨＳＣの拡大倍率は、Ｎａｎｅｘプレートで増殖された細胞について有意に高くなっている。しかし、ＨＳＣの倍数拡大は、基本培地で培養された細胞と比較した場合、スクリプタイドまたは併用処理のいずれかで処理された細胞で大幅に増加する。この効果は、使用されるすべての表面にわたって同様であり、わずかな違いは統計的に有意ではない。
スクリプタイドとＷＲ１０６５の併用処理は、細胞を増殖させるために使用される表面のタイプに関係なく、ＨＳＣ細胞の拡大を増強する。細胞培養における足場の使用は、インビボ条件をより良好に模倣し、結果として、細胞が増殖するためのより良好なニッチを提供することが知られている。以前のすべての例は、表面アミノ化で処理されたＰＥＳエレクトロスピニング繊維で作られた薄い足場材料を含むＮａｎｅｘプレートを使用して実施された。実験は、標準的な組織培養処理プレートならびにＮａｎｅｘプレートを使用して細胞が培養される場合に、スクリプタイドおよびＷＲ１０６５を用いる処理が、ＨＳＣの拡大を促進することを示すために実施された。細胞増殖プロトコルは上記のように実行され、細胞は３タイプの表面、Ｎａｎｅｘ足場、ＴＣ処理されたＣｏｒｎｉｎｇ２４ウェルプレートまたは懸濁Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ２４ウェルプレートに同じ密度で播種された。サイトカイン（基本）を補充した培地中で培養された細胞のＨＳＣの拡大倍率は、Ｎａｎｅｘプレートで増殖された細胞について有意に高くなっている。しかし、ＨＳＣの倍数拡大は、基本培地で培養された細胞と比較した場合、スクリプタイドまたは併用処理のいずれかで処理された細胞で大幅に増加する。この効果は、使用されるすべての表面にわたって同様であり、わずかな違いは統計的に有意ではない。
【0097】
実施例１０ 免疫無防備状態のＮＳＧマウスにおける拡大された細胞の再増殖能力
インビボで骨髄を再増殖させる細胞の能力に対する様々なエキソビボ拡大プロトコルの効果を調査した。細胞は臍帯血から得られ、４つの細胞調製物が生成された－１。拡大していない細胞、２。ビヒクルの存在下で細胞が拡大した、３。スクリプタイドの存在下で細胞が拡大した（拡大＋ＳＳ－図１５）、４。スクリプタイドおよびＷＲ１０６５の存在下で拡大された細胞（拡大＋ＳＷ－図１５）。次に、これらの細胞調製物を、照射された成体（＜８週間）の雄ＮＳＧ（ＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ）マウスに注射した。
インビボで骨髄を再増殖させる細胞の能力に対する様々なエキソビボ拡大プロトコルの効果を調査した。細胞は臍帯血から得られ、４つの細胞調製物が生成された－１。拡大していない細胞、２。ビヒクルの存在下で細胞が拡大した、３。スクリプタイドの存在下で細胞が拡大した（拡大＋ＳＳ－図１５）、４。スクリプタイドおよびＷＲ１０６５の存在下で拡大された細胞（拡大＋ＳＷ－図１５）。次に、これらの細胞調製物を、照射された成体（＜８週間）の雄ＮＳＧ（ＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ）マウスに注射した。
【0098】
フローサイトメトリー分析は、明確な移植の証拠を有する動物を識別するために（ＣＤ４５ＨＵおよびＣＤ４５ＭＵのみ）週１５で採取された血液サンプルに対して行われた（１２週目の血液中のヒトＣＤ４５＋細胞および１５週目の１％を超えるヒトＣＤ４５＋計数）。１％を超えるヒトＣＤ４５＋計数を有する動物のうち１０例を、１０例の二次レシピエントのドナーとして１対１の様式で使用した。
【0099】
細胞投与後２０週目に、初代動物を屠殺した。骨髄サンプルを大腿骨と脛骨から採取し、細胞を洗浄し、その後計数した。回収された細胞の５０％を二次照射された動物に注射した。このような様式で、拡大された細胞の長期の生着能力を決定することができた。
【0100】
二次動物は８週目に採血され、全血サンプルは生着の証拠についてＦＡＣによって分析された。８週間の全血サンプルのフローサイトメトリーのデータを図１５に示す。図１５は、マウス全血サンプル中のヒトＣＤ４５＋細胞の頻度を、生存可能なシングレットのパーセンテージとして示す。スクリプタイドおよびＷＲ１０６５で拡大された細胞を受容したマウスの全血中のヒトＣＤ４５＋の平均頻度は、スクリプタイド単独で拡大された細胞を受容したマウス（０．０４％）よりも高い（２．５％）。ＷＲ１０６５とスクリプタイドの組み合わせは、拡大していない細胞とビヒクルで拡大された細胞の両方よりもＣＤ４５＋の平均頻度が高いことを示す。
【0101】
実施例１１ 末梢血から取得された拡大された細胞の生着能力
ＣＤ３４＋細胞は、健康なドナーの動員された末梢血から単離された。これらの細胞を解凍し、１％Ｐｅｎｎ Ｓｔｒｅｐ、１００ｎｇ／ｍＬ ｈＦｌｔ－３、１００ｎｇ／ｍＬ ＳＣＦ、２０ｎｇ／ｍＬ ＴＰＯ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を補充したＳＣＧＭ培地（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ）中で１ｘ１０６／ｍＬにて３日間培養した。細胞は、スクリプタイドの非存在下（Ｂ ３日目－図１６）、またはスクリプタイドの存在下（ＳｃｒＡ ３日目－図１６）、またはスクリプタイドおよびＷＲ１０６５の組み合わせ（ＰＬ ３日目－図１６）で培養され、ＷＲ１０６５は培養時間の２日目に加えられる。
ＣＤ３４＋細胞は、健康なドナーの動員された末梢血から単離された。これらの細胞を解凍し、１％Ｐｅｎｎ Ｓｔｒｅｐ、１００ｎｇ／ｍＬ ｈＦｌｔ－３、１００ｎｇ／ｍＬ ＳＣＦ、２０ｎｇ／ｍＬ ＴＰＯ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を補充したＳＣＧＭ培地（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ）中で１ｘ１０６／ｍＬにて３日間培養した。細胞は、スクリプタイドの非存在下（Ｂ ３日目－図１６）、またはスクリプタイドの存在下（ＳｃｒＡ ３日目－図１６）、またはスクリプタイドおよびＷＲ１０６５の組み合わせ（ＰＬ ３日目－図１６）で培養され、ＷＲ１０６５は培養時間の２日目に加えられる。
【0102】
培養後、ＨＳＣ ＣＤ３４＋、ＣＤ３８－、ＣＤ９０＋、ＣＤ４５ＲＡ－は、ＦＡＣＳを使用して選別し、致死量以下に照射された免疫不全ＮＳＧマウスに注射した。マウス１匹あたり８０，０００個の細胞を投与した。対照サンプル（０日目－図１６）には、新鮮に解凍して選別したＨＳＣ ＣＤ３４＋、ＣＤ３８－、ＣＤ９０＋、ＣＤ４５ＲＡ－が含まれ、これらの細胞はエキソビボで増殖しなかった。ヒト細胞の生着は、８週目と１２週目に動物の全血サンプルに存在するＣＤ４５＋細胞のパーセンテージによって評価された。
【0103】
図１６は、全血サンプルに存在するＣＤ４５＋細胞のパーセンテージを示す。スクリプタイドとＷＲ１０６５の両方の存在下で拡大された細胞によって達成された生着のレベル（ＣＤ４５＋細胞のパーセンテージによって示される）は、非増殖対照、培地中で拡大された細胞、およびスクリプタイド単独の存在下で拡大された細胞のレベルよりも高い。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
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【図15】
【図16】
