特許 7478443 少なくとも１つの微生物を、その染色反応速度に従って検出するための方法および装置、ならびに検出支持体

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-04-24

(45)【発行日】2024-05-07

(54)【発明の名称】少なくとも１つの微生物を、その染色反応速度に従って検出するための方法および装置、ならびに検出支持体

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/04 20060101AFI20240425BHJP

   C12M 1/34 20060101ALI20240425BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/04

C12M1/34 B

【請求項の数】 28

(21)【出願番号】P 2021517590

(86)(22)【出願日】2019-10-04

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2022-01-11

(86)【国際出願番号】 EP2019076869

(87)【国際公開番号】W WO2020070265

(87)【国際公開日】2020-04-09

【審査請求日】2022-07-01

(31)【優先権主張番号】18/59253

(32)【優先日】2018-10-05

(33)【優先権主張国・地域又は機関】FR

(73)【特許権者】

【識別番号】521123828

【氏名又は名称】レッドベリー

(74)【代理人】

【識別番号】110000659

【氏名又は名称】弁理士法人広江アソシエイツ特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】ピアキン，ジョゼフ

【審査官】鳥居 敬司

(56)【参考文献】

【文献】特開２００６－０２９７９３（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１５－５１０３９４（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１３－５２４７７０（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２０１７／１１５７６８（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特表２０１５－５２８２８３（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２０１８／１０５４３２（ＷＯ，Ａ１）

【文献】PLOS ONE, 2014, Vol.9, No.1, Article No.e85177

【文献】G3 Genes Genomes Genetics, 2017, Vol.7, pp.279-288

【文献】Scientific Reports, 2015, 5:15983

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｑ １／００－１／７０

Ｃ１２Ｍ １／００－１／４２

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

固体検出支持体（１、２１）上で、分析すべきサンプル（３）中に存在し、少なくとも１つの細胞マーカー（４）によって発現する細菌、酵母またはカビタイプの少なくとも１つの微生物（２）を検出するための方法であって、少なくとも以下の、
ａ）分析すべき前記サンプル（３）を前記固体検出支持体（１、２１）上に堆積させるステップと、
ｂ）前記少なくとも１つの細胞マーカー（４）を発現させることができる光放射（６）で前記固体検出支持体（１）を少なくとも１回照射するステップと、
ｃ）少なくとも１０ｍｍの長さ×少なくとも１０ｍｍの幅の視野を標的とする光学撮像装置（７）を用いて、前記固体検出支持体（１，２１）の少なくとも一部で前記サンプル（３）の第１のフェーズＰ_０において少なくとも１つの画像（Ｉ_０）を取得するステップと、
ｄ）固体検出支持体（１、２１）を介して前記少なくとも１つの細胞マーカー（４）の制御された放出を実行して、前記少なくとも１つの細胞マーカー（４）を前記微生物（２）と接触させるステップと、
ｅ）前記微生物（２）の染色反応速度の変化に従って前記微生物（２）を検出するように、前記光学撮像装置（７）を用いて、前記少なくとも１つの細胞マーカー（４）の前記制御された放出のステップの後、少なくとも１つの後続のフェーズＰ_ｉにおいてＰ_０で画像が取得された前記固体検出支持体（１、２１）の各部分の画像（Ｉ_ｉ）（ｉ≧１）を取得するステップと、
ｆ）Ｐ_０で取得された前記画像（Ｉ_０）と少なくとも１つの後続のフェーズＰ_ｉで取得された各画像（Ｉ_ｉ）との間で前記固体検出支持体（１、２１）の部分ごとに比較分析を実行し、前記サンプル（３）中の少なくとも１つの前記微生物（２）の存在または不在に関して結論を引き出すステップと、をこの順序で含むことを特徴とする、検出するための方法。

【請求項2】

前記固体検出支持体（１、２１）は、Ｐ_０、Ｐ_ｉで画像が取得されるたびに光放射（６）で局所的に照射されることを特徴とする、請求項１に記載の検出方法。

【請求項3】

固体検出支持体（１、２１）上で、分析すべきサンプル（３）中に存在し、少なくとも１つの細胞マーカー（４）によって発現する細菌、酵母またはカビタイプの少なくとも１つの微生物（２）を検出するための方法であって、
少なくとも以下の、
ａ１）分析すべき前記サンプル（３）を前記固体検出支持体（１、２１）の上に堆積させるステップと、
ｂ１）前記固体検出支持体（１、２１）を前記少なくとも１つの細胞マーカー（４）を発現させることができる光放射（６）によって局所的に照射するステップと、
ｃ１）前記照射するステップｂ１）と同時に、少なくとも１０ｍｍの長さ×少なくとも１０ｍｍの幅の視野を標的とする光学撮像装置（７）を用いて、前記固体検出支持体（１、２１）の少なくとも一部で前記サンプル（３）の第１のフェーズＰ_０において少なくとも１つの微生物の微少コロニーを含む画像（Ｉ_０、Ｉ´_０）を取得するステップと、
ｄ１）前記固体検出支持体（１、２１）を介して前記少なくとも１つの細胞マーカー（４）の制御された放出を実行して、前記少なくとも１つの細胞マーカー（４）を前記微生物（２）と接触させるステップと、
ｅ１）前記少なくとも１つの細胞マーカー（４）の前記制御された放出のステップｄ１）の後の５秒未満の経過時間の範囲内で、前記少なくとも１つの細胞マーカー（４）を発現させることができる前記光放射（６）で前記固体検出支持体（１、２１）を局所的に照射するステップと、
ｆ１）前記照射ステップｅ１）と同時に、前記光学撮像装置（７）を用いて、前記少なくとも１つの細胞マーカー（４）の前記制御された放出のステップの後、少なくとも１つの後続のフェーズＰ_１においてＰ_０で画像が取得された前記固体検出支持体（１、２１）の微生物の微少コロニーを含む画像（Ｉ_１、Ｉ´_１）を取得するステップと、
ｇ１）前記光放射（６）で前記固体検出支持体（１、２１）を少なくとも１回局所的に再照射するステップと、
ｈ１）前記再照射するステップｇ１）と同時に、前記微生物（２）の染色反応速度の変化に従って少なくとも１つの前記微生物（２）を検出するために、前記光学撮像装置（７）を用いて、少なくとも１つの第２の後続のフェーズＰ_２でＰ_０およびＰ_１で画像が取得された前記固体検出支持体（１、２１）の微生物の微少コロニーを含む画像（Ｉ_２、Ｉ´_２）を取得するステップと、
ｉ１）Ｐ_０で取得された前記画像（Ｉ_０、Ｉ´_０）と少なくとも２つの後続のフェーズＰ_１およびＰ_２で取得された前記画像（Ｉ_１、Ｉ´_１；Ｉ_２、Ｉ´_２）との間で前記固体検出支持体（１、２１）の部分ごとに比較分析を実行し、前記サンプル（３）中の少なくとも１つの前記微生物（２）の存在または不在に関して結論を引き出すステップと、をこの順序で含むことを特徴とする、検出方法。

【請求項4】

前記固体検出支持体（１、２１）は、前記固体検出支持体（１、２１）を空間的に異なる複数の部分を観察する目的で、別個の経路に沿ってｎ回の移動を受け、ここで、ｎは、２０以下の整数であり、
前記固体検出支持体（１、２１）全体の画像は、少なくとも２つのフェーズＰ_０およびＰ_ｉで取得される、
請求項１～３のいずれかに記載の検出方法。

【請求項5】

光学撮像装置（７）が、少なくとも２０メガピクセルで使用されることを特徴とする、請求項１～４のいずれかに記載の検出方法。

【請求項6】

少なくとも１つの前記微生物（２）が前記サンプル（３）に存在すると結論付けられた場合、前記サンプル（３）中に存在する前記微生物（２）の列挙が実行されることを特徴とする、請求項１～５のいずれかに記載の検出方法。

【請求項7】

前記少なくとも１つの細胞マーカー（４）が蛍光マーカーであることを特徴とする、請求項１～６のいずれかに記載の検出方法。

【請求項8】

前記少なくとも１つの細胞マーカー（４）は、カプセル化手段（８）にカプセル化されていることを特徴とする、請求項１～７のいずれかに記載の検出方法。

【請求項9】

前記少なくとも１つの細胞マーカー（４）は、粉末の形態の固体形態でカプセル化手段（８）にカプセル化されること、および前記固体検出支持体（１）は、前記少なくとも１つの細胞マーカー（４）を溶解するための溶媒を含むことを特徴とする、請求項８に記載の検出方法。

【請求項10】

前記少なくとも１つの細胞マーカー（４）は液体の形態でカプセル化されていることを特徴とする、請求項８に記載の検出方法。

【請求項11】

前記カプセル化手段（８）は熱感受性であり、
前記少なくとも１つの細胞マーカー（４）の制御された放出が、熱感受性の前記カプセル化手段（８）を、溶融することができる温度上昇に曝すことによって実行される、請求項８～１０の一項に記載の検出方法。

【請求項12】

感熱性の前記カプセル化手段（８）を溶融する温度は、最高温度４５℃であることを特徴とする、請求項１１に記載の検出方法。

【請求項13】

液体溶液中の前記少なくとも１つの細胞マーカー（４）は、制御された方法で、分析すべき前記サンプル（３）を含む前記固体検出支持体（２１）まで運ばれることを特徴とする、請求項１～７のいずれかに記載の検出方法。

【請求項14】

分析すべき前記サンプル（３）の１０～２０００μＬの間に含まれる容積が前記固体検出支持体（１、２１）上に直接堆積されることを特徴とする、請求項１～１３のいずれかに記載の検出方法。

【請求項15】

分析すべき前記サンプル（３）は、０．２～０．４５μｍに含まれるカットオフ閾値、を有する濾過膜（５、２５）を通して濾過され、前記濾過膜（５、２５）は、前記固体検出支持体（１、２１）内に位置していることを特徴とする、請求項１～１３のいずれかに記載の検出方法。

【請求項16】

分析すべき前記サンプルを受け取った前記固体検出支持体（１、２１）上で微生物を塵から区別するために、以下のステップ、
－各画像の取得後、検出された発光ピクセルまたはピクセルのクラスターの輝度を測定するステップと、
－前記各画像において検出された各発光ピクセルまたはピクセルのクラスターの輝度を比較するステップと、
－前記染色反応速度中で、少なくとも２つの連続する画像において実質的に変化しない輝度を有するピクセルまたはピクセルのクラスターを識別するステップと、
－前記染色反応速度中で、変化する輝度を有するピクセルまたはピクセルのクラスターを分析およびカウントするステップと、が実施されることを特徴とする、請求項１～１５のいずれかに記載の検出方法。

【請求項17】

分析すべきサンプル（３）に存在する細菌、酵母またはカビタイプの少なくとも１つの微生物（２）を検出するためのものであり、請求項１～１６のいずれかに記載の方法を実施することが可能な装置（１４）であって、
少なくとも、
－少なくとも１つの前記微生物（２）を含みやすい分析すべき前記サンプル（３）を受け取ることが意図された固体検出支持体（１、２１）と、
－前記微生物（２）の少なくとも１つの細胞マーカー（４）を貯蔵する貯蔵手段と、
－前記少なくとも１つの細胞マーカー（４）を分析すべき前記サンプル（３）と接触させるための前記少なくとも１つの細胞マーカー（４）の制御された放出のための手段（１５）と、
－前記固体検出支持体（１、２１）を照射する手段（６）と、
－前記固体検出支持体（１、２１）の少なくとも一部の画像を取得するための光学撮像装置（７）であって、少なくとも１０ｍｍの長さ×少なくとも１０ｍｍの幅の視野を有する光学撮像装置（７）と、
－少なくとも１つの前記微生物（２）の染色反応速度の変化に従って、前記サンプル（３）中に潜在的に存在する少なくとも１つの前記微生物（２）を検出するために、前記光学撮像装置（７）によって取得された前記画像をメモリに記憶し、比較し、分析するための手段と、を備えることを特徴とする、検出するための検出装置（１４）。

【請求項18】

前記光学撮像装置（７）の下に前記固体検出支持体（１、２１）を移動させるための手段を備えることを特徴とする、請求項１７に記載の検出装置（１４）。

【請求項19】

前記固体検出支持体（１、２１）が、ガラス繊維支持ディスク（１３、２３）上に載っている少なくとも１つの濾過膜（５、２５）を含むことを特徴とする、請求項１７または１８のいずれかに記載の検出装置（１４）。

【請求項20】

前記少なくとも１つの細胞マーカー（４）を貯蔵する手段（１９）が、固体検出支持体（１）に含まれ、カプセル化手段（８）にカプセル化された前記少なくとも１つの細胞マーカー（４）によって形成されたマイクロカプセル（９）の層で構成されており、マイクロカプセル（９）の前記層は、ガラス繊維支持ディスク（１３）と濾過膜（５）との間に配置されることを特徴とする、請求項１９に記載の検出装置（１４）。

【請求項21】

前記少なくとも１つの細胞マーカー（４）の制御された放出のための前記手段は、検出装置（１４）の内部で温度上昇を生じさせることができ、また前記少なくとも１つの細胞マーカー（４）をカプセル化する前記カプセル化手段（８）を溶融させることができる加熱手段と、温度制御および調整手段とを含むことを特徴とする、請求項２０に記載の検出装置（１４）。

【請求項22】

前記検出装置（１４）は、前記少なくとも１つの細胞マーカー（４）を前記貯蔵手段から前記固体検出支持体（２１）に運ぶための手段を備えることを特徴とする、請求項１７～１９のいずれかに記載の検出装置（１４）。

【請求項23】

前記少なくとも１つの細胞マーカー（４）の制御された放出のための前記手段（１５）は、少なくとも１つの制御された流れポンプを含むことを特徴とする、請求項２２に記載の検出装置（１４）。

【請求項24】

前記光学撮像装置（７）は、０．５ｍｍの焦点深度を有することを特徴とする、請求項１７～２３のいずれかに記載の検出装置（１４）。

【請求項25】

前記光学撮像装置（７）は、ＣＭＯＳセンサカメラである請求項１７～２４のいずれかに記載の検出装置（１４）。

【請求項26】

前記光学撮像装置（７）は２５ｍｍ＊２５ｍｍの視野を有することを特徴とする、請求項１７～２５のいずれかに記載の検出装置（１４）。

【請求項27】

前記光学撮像装置（７）は、少なくとも２０メガピクセルに等しい、解像度を有することを特徴とする、請求項１７～２６のいずれかに記載の検出装置（１４）。

【請求項28】

請求項１～１５のいずれかに記載の検出方法において使用されるか、または請求項１７～２７のいずれかに記載の検出装置（１４）に含まれる固体検出支持体（２１）であって、少なくとも１つの液体供給ライン（２６ａ）および少なくとも１つの液体吸引および排出ライン（２６ｃ）が中を通る剛性ベース（２６）で少なくとも構成されており、
前記供給ライン（２６ａ）は、前記ベース（２６）から突出し、一方では、前記ベース（２６）の上の剛性で透過性の支持手段（２４）の中に作成された第１のオリフィス（２４ａ）の中を通り、他方では、ガラス繊維で作成された可撓性の支持ディスク（２３）内に作成された第２のオリフィス（２３ａ）の中を通る通気孔（２６ｂ）によって延長されており、前記ディスク（２３）は、前記剛性で透過性の支持手段（２４）上に位置し、０．２～０．４５μｍの間に含まれるカットオフ閾値を有し、かつ微生物（２）を保持することが可能な濾過膜（２５）を支持しており、前記固体検出支持体（２１）は、それが前記ベース（２６）と一体になるように固定され、前記ベース（２６）、前記剛性で透過性の支持手段（２４）、前記支持ディスク（２３）および前記濾過膜（２５）を一緒に保持するクランプリング（２７）をさらに備えることを特徴とする、固体検出支持体（２１）。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、固相中の細菌、酵母、カビタイプなどの微生物を検出する分野に関する。

【背景技術】

【0002】

本発明は、産業微生物学の分野、例えば、これらに限定されないが、製薬、バイオテクノロジー、化粧品もしくは食品加工産業、または臨床または環境微生物学の分野に主に適用可能である。

【0003】

本発明は、より詳細には、適切な支持体上の固相中の微生物を、その増殖のために微生物を培養する必要なしに、極めて早期に検出するための装置および方法に関する。

【0004】

現在、テストすべきサンプル中の細菌などの汚染物質を検出するために多くの技術が実施されている。

【0005】

最も古く、最も一般的な方法は、栄養寒天増殖培地の表面上に、サンプルを任意選択で濾過した後に堆積させることで構成されており、これは、１つまたは複数のタイプの微生物に対して多かれ少なかれ選択的である可能性がある。

【0006】

次に、培地は、作業者が肉眼で見えるコロニーを「手作業で」数える前に、所望の微生物を成長させるのに適切な温度で、しばしば最大で数日間、インキュベートされる。

【0007】

このような方法は、感度が高く、単一の生存可能で培養可能な汚染物質を元のサンプル内で検出することを可能にするが、寒天上に形成されたコロニーを肉眼で検出できるようにするために比較的長いインキュベーション期間を必要とするという欠点がある。

【0008】

固体寒天の代わりに、別の可能性は、微生物の成長が、濁度測定によって、インキュベーション後に検出される液体培地に接種することを含み、例えば濁度測定によって測定された吸光度は、培地中に存在する微生物の濃度に比例する。

【0009】

液相検出技術の欠点は、１０^６または１０^７細胞／ｍＬ未満の微生物濃度を検出しないことである。したがって、そのような細胞濃度に到達するために、サンプルを可変の期間にわたって再度インキュベートしなければならない。

【0010】

特定の微生物は、例えば熱ストレスなどのストレスの影響下で、またはサンプル中の阻害剤の存在の結果として、増殖するのに特に長い時間がかかる場合があり、したがって、それらが従来の培養技術を使用して検出可能になる所定の時間の瞬間をさらに引き延ばす場合があることにも留意されたい。

【0011】

従来技術における別の既知の方法は、ＰＣＲ増幅としても知られるポリメラーゼ連鎖反応を実施して、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列の増幅によってサンプル中の特定の微生物の存在を判定することを含む。

【0012】

しかしながら、これらの方法には、核酸の複数の鎖、すなわち、サンプル中の複数の汚染微生物、および一般に少なくとも数十の微生物を必要とするという欠点がある。したがって、そのような方法は、微生物の成長に基づく従来の培養技術よりも感度が低い。

【0013】

したがって、従来の成長ベースの技術の感度を維持しようとしながら、微生物を検出する速度を上げるために、近年、多くの方法が開発され、完成されてきた。

【0014】

これらの方法のほとんどは、特有の蛍光化学物質、フルオロフォアまたは蛍光色素によって放出される蛍光を検出することに基づいており、これらは、さまざまな染色技術によって、検出すべき微生物の細胞機能または構造（核酸、タンパク質、酵素など）に結合される。

【0015】

これらの方法では、「ＤＥＦＴ」（直接落射蛍光フィルタ技術）用の顕微鏡やサイトメータなど、特定の検出装置を実装する必要がある。
したがって、フローサイトメトリーの技術が現在、サンプルに存在する微生物を検出し、カウントするために一般的に使用されている。

【0016】

この技術では、細胞または粒子は、フルオロフォアで染色して液体に懸濁させることができ、単一細胞ストリームの形で次々に分離される。次に、それらは一つずつ、高速で、光源、例えばレーザからの光ビームの中に通される。

【0017】

細胞によって拡散および放出された光は、所与の波長でのその励起後にフルオロフォアで染色した場合に蛍光を発し、サイトメータの光学装置を構成するミラーおよびフィルタのシステムによって一組の光検出器に向けて誘導される。これらの検出器は、特に、光信号を電気信号に変換し、この電気信号をその後コンピュータで分析して、例えば細胞の物理的特徴に関するデータを生成することができる光電子増倍管を組み込んでいる。

【0018】

現在市販されているフローサイトメータは、１秒あたり数百の細胞、つまり「イベント」をリアルタイムで分析することが可能であり、これらの機器の一部は、細胞または粒子をその光学特性に応じて分類することを可能にするように構成することができる。

【0019】

ただし、フローサイトメトリーを実施する場合でも、顕微鏡技術を実施する場合でも、まれにしか起こらないイベントの検出は複雑になることがよくある。

【0020】

実際、フローサイトメトリーの感度は限られており、最良のシナリオでは、懸濁液１ｍＬあたり１０^２～１０^３細胞と推定され、これは母材に依存する。

【0021】

「ＤＥＦＴ」技術では、分析すべきサンプルは、サンプルに含まれやすい微生物を保持する膜を通して濾過される。

【0022】

次に、微生物は、ＤＮＡまたはＲＮＡと相互作用する蛍光色素、例えばアクリジンオレンジで染色され、次いで、落射蛍光顕微鏡を使用して膜の複数の領域の視覚的分析によってカウントされる。

【0023】

蛍光顕微鏡の場合、カウントが膜の小さい部分のみで実行されること（全体のサイズの１０％未満）、および細胞の均一な分布が前提とされており、確実ではないことを念頭に置くと、代表的な結果を得るには、２５ｍｍの直径を有する膜上に少なくとも１０^４個の細胞が存在する必要があると推定される。

【0024】

しかしながら、産業微生物学または臨床微生物学の一部の用途では、サンプル内の単一の汚染物質または少数の汚染物質の存在を早期に検出することが特に重要になり得る。実際、このタイプの業界で製造および/または改造された製品は、特にその最終的な目的（食品、消費者の健康など）の結果として、とりわけ影響されやすい。したがって、可能な限り迅速に、その非の打ちどころのない微生物学的品質を確保することが不可欠であり、そうでない場合は、汚染源を迅速に特定できることが不可欠である。

【0025】

レーザースキャニングサイトメトリーとしても知られる固相サイトメトリー法は、特にこれらの理由から近年開発され、濾過可能なサンプルに適用可能である。これは特に、特許文献１の主題である。

【0026】

この方法では、適切な膜上でサンプルを濾過する最初のステップの後、膜上に潜在的に存在する微生物は、フルオロフォアを使用して染色ステップにかけられる。

【0027】

次に、膜の表面全体をレーザービームでスキャンしてフルオロフォアを励起させ、放出された蛍光を測定することによって、分析すべき元のサンプルに潜在的に存在し、生存可能であるいかなる微生物もカウントする。

【0028】

ＣｈｅｍＳｃａｎ ＲＤＩ（登録商標）として知られるこの装置は、この固相サイトメトリー法を実施する。

【0029】

しかしながら、固相サイトメトリー技術を実施するために現在市販されている装置、ならびに必要な試薬は、とりわけ高価であり、多額の投資を必要とする。その結果、この手法はすべての研究所で利用できるわけではない。

【0030】

さらに、微生物の検出および列挙（ｅｎｕｍｅｒａｔｉｏｎ）が行われると、細胞代謝に使用される試薬の毒性効果が、微生物を識別するためのその後の培養を妨げる可能性がある。
この固相サイトメトリー法は濾過可能な母材のみに適用可能であること、固体支持体上にサンプルを堆積させてから、固体支持体上に存在する微生物の列挙で結果が得られるまでに必要な時間が相対的に長く、必要とされる時間は、実際には少なくとも９０分と見積もられ、用途によっては最大４時間に達する場合もあることにも留意されたい。

【0031】

最後に、フローサイトメトリー技術を使用するか、固相サイトメトリー技術を使用するかにかかわらず、検出される偽陽性率は比較的高いままである。確かに、微生物ではない不活性粒子、例えば塵もまた、自然の蛍光を発する傾向があり、あるいは蛍光色素と結合して干渉する蛍光を発する傾向もある。
これは、用途の分野によっては、偽陽性であることが判明したサンプルがさらなる調査を必要とすることになり、時間の点でコストがかかり、とりわけ、調査の期間中、生産ライン（例えばバイオ医薬品など）を運転停止にする必要がある場合、重大な経済的影響を与える可能性がある限りにおいて、既存の方法の真の欠点を構成する。

【0032】

一般に、フルオロフォアによる細胞染色を実施する方法では、資格のある担当者がサンプルを手で取り扱い、同様に蛍光試薬も手で取り扱い、検出すべき微生物と接触させる必要があり、これにより、必然的にサンプルが汚染されるリスクが生じる。

【0033】

また、これらすべての作業、およびサンプル準備の上流で実行される作業、特に濾過、活性化、染色および洗浄などは、必然的に作業者による手で処理するかなりの時間を必要とし、これも同様に、潜在的な汚染が検出される瞬間を遅らせることにも留意されたい。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0034】

【文献】欧州特許第０７１３０８７号明細書

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0035】

本発明は、分析すべき元のサンプルに潜在的に存在する１つまたは複数の微生物（複数可）を極めて早期に、必要に応じてほぼ瞬時に検出するための方法および装置を提案することにより、先行技術の前述の様々な欠点を少なくともある程度克服する可能性を提供する。

【課題を解決するための手段】

【0036】

本発明の方法および装置は、制御された方法で、かつ特にサンプルの汚染を引き起こしやすい時間のかかる手作業なしに送達される細胞マーカーによって、潜在的な微生物の染色反応速度（ｓｔａｉｎｉｎｇ ｋｉｎｅｔｉｃｓ）を検出および分析することに基づいている。

【0037】

この目的のために、本発明は、固体検出支持体上で、分析すべきサンプル中に存在し、少なくとも１つの細胞マーカーによって発現する細菌、酵母またはカビタイプの少なくとも１つの微生物を検出するための方法に関し、方法は、少なくとも以下のステップ、
ａ）分析すべきサンプルを固体検出支持体上に堆積させるステップと、
ｂ）少なくとも１つの細胞マーカーを発現させる（ｒｅｖｅａｌ）ことができる光放射で検出支持体を少なくとも１回照射するステップと、
ｃ）少なくとも１０ｍｍの長さ×少なくとも１０ｍｍの幅の視野を標的とする光学撮像装置を用いて、検出支持体の少なくとも一部でサンプルの第１のフェーズＰ_０において少なくとも１つの画像Ｉ_０を取得するステップと、
ｄ）検出支持体を介して少なくとも１つの細胞マーカーの制御された放出を実行して、マーカーを微生物と接触させるステップと、
ｅ）微生物の染色反応速度の変化に従って少なくとも１つの微生物を検出するように、光学装置を用いて、前記マーカーの制御された放出のステップの後、少なくとも１つの後続のフェーズＰ_ｉにおいてＰ_０で画像が取得された検出支持体の各部分の画像Ｉ_ｉ（ｉ≧１）を取得するステップと、
ｆ）Ｐ_０で取得された画像Ｉ_０と少なくとも１つの後続のフェーズＰ_ｉで取得された各画像Ｉ_ｉとの間で検出支持体の部分ごとに比較分析を実行し、サンプル中の少なくとも１つの微生物の存在または不在に関して結論を引き出すステップとをこの順序で含んでいる。

【0038】

好ましくは、検出支持体は、画像がＰ_０、Ｐ_ｉで取得されるたびに、光放射で局所的に照射される。

【0039】

１つの特に有利な例示的な実施形態では、本発明の方法は、少なくとも以下のステップ、
ａ１）分析すべきサンプルを固体検出支持体上に堆積させるステップと、
ｂ１）少なくとも１つの細胞マーカーを発現させることができる光放射によって検出支持体を局所的に照射するステップと、
ｃ１）照射ステップｂ１）と同時に、少なくとも１０ｍｍの長さ×少なくとも１０ｍｍの幅の視野を標的とする光学撮像装置を用いて、検出支持体の少なくとも一部でサンプルの第１のフェーズＰ_０において少なくとも１つの画像Ｉ_０、Ｉ´_０を取得するステップと、
ｄ１）検出支持体を介して少なくとも１つの細胞マーカーの制御された放出を実行して、マーカーを微生物と接触させるステップと、
ｅ１）細胞マーカーの制御された放出のステップｄ１）の後の５秒未満の経過時間の範囲内で、少なくとも１つの細胞マーカーを発現させることができる光放射で検出支持体を局所的に照射するステップと、
ｆ１）照射ステップｅ１）と同時に、光学装置を用いて、マーカーの制御された放出のステップ後、少なくとも１つの後続のフェーズＰ_１においてＰ_０で画像が取得された検出支持体の各部分の画像Ｉ_１、Ｉ´_１を取得するステップと、
ｇ１）光放射で検出支持体を少なくとも１回局所的に再照射するステップと、
ｈ１）照射ステップｇ１）と同時に、微生物の染色反応速度の変化に従って少なくとも１つの微生物を検出するために、光学装置を用いて、
少なくとも１つの第２の後続のフェーズＰ_２でＰ_０およびＰ_１で画像が取得された検出支持体の各部分の画像Ｉ_２、Ｉ´_２を取得するステップと、
ｉ１）Ｐ_０で取得された画像Ｉ_０、Ｉ´_０と少なくとも２つの後続のフェーズＰ_１およびＰ_２で取得された画像Ｉ_１、Ｉ´_１；Ｉ_２、Ｉ´_２との間で検出支持体の部分ごとに比較分析を実行し、サンプル中の少なくとも１つの微生物の存在または不在に関して結論を引き出すステップとをこの順序で含んでいる。

【0040】

本発明の方法の特定かつ非限定的な特徴によれば、
－検出支持体は、検出支持体をｎ＋１の部分に空間的に分割する目的で、別個の経路に沿ってｎ個の移動を受け、その画像は、少なくとも２つのフェーズＰ_０およびＰ_ｉで取得され、ここで、ｎは、２０以下の整数である、
－少なくとも２０メガピクセルに等しい、好ましくは１００メガピクセルを超える解像度を有する光学撮像装置が画像取得ステップｃ）およびｅ）またはｃ１）、ｆ１）およびｈ１）において使用される、
－ステップｆ）またはｉ１）において少なくとも１つの微生物がサンプル中に存在すると結論付けられる場合、サンプル中に存在する微生物の列挙が実行される、
－細胞マーカーは蛍光マーカーである、
－ステップｄ）またはｄ１）において制御された方法で放出された細胞マーカーは、例えば粉末の形態の固体形態のカプセル化手段にカプセル化され、検出支持体は、マーカーを溶解させるための溶媒を含む、
－細胞マーカーは、液体形態のカプセル化手段にカプセル化される、
－カプセル化手段は熱感受性であり、ステップｄ）またはｄ１）において、熱感受性カプセル化手段にカプセル化された細胞マーカーの制御された放出は、例えば、温度を周囲温度から最高温度４５℃まで上昇させることによってカプセル化手段を、熱感受性カプセル化手段を溶融することができる温度上昇に曝すことによって実行される、
－液体溶液中の細胞マーカーは、制御された方法で、分析すべきサンプルを含む固体検出支持体まで運ばれる、
－分析すべきサンプルの１０～２，０００μＬに含まれる容積が検出支持体上に直接堆積される、
－分析すべきサンプルは、０．２～０．４５μｍに含まれる、好ましくは０．３μｍに等しいカットオフ閾値を有する濾過膜を通して濾過され、濾過膜は、検出支持体内に直接位置決めされる。

【0041】

本発明はさらに、分析すべきサンプルを受け取った検出支持体上で微生物を塵から区別するための方法に関し、これは、
－各画像の取得後、検出された発光ピクセルまたはピクセルのクラスターの輝度を測定するステップと、
－異なる画像において検出された各発光ピクセルまたはピクセルのクラスターの輝度を比較するステップと、
－染色反応速度中で、少なくとも２つの連続する画像において実質的に変化しない輝度を有するピクセルまたはピクセルのクラスターを識別するステップと、
－染色反応速度中に変化する輝度を有するピクセルまたはピクセルのクラスターを分析およびカウントするステップとによって特徴付けられる。
本発明はさらに、本発明の検出方法を実施することが可能であり、分析すべきサンプル中に存在する細菌、酵母またはカビタイプの少なくとも１つの微生物を検出するための装置であって、少なくとも、
－少なくとも１つの微生物を含みやすい分析すべきサンプルを受け取ることが意図された固体検出支持体と、
－微生物の少なくとも１つの細胞マーカーを貯蔵する手段と、
－マーカーを分析すべきサンプルと接触させるための細胞マーカーの制御された放出のための手段と、
－検出支持体を照射する手段と、
－少なくとも１０ｍｍの長さ×少なくとも１０ｍｍの幅の視野を有する、検出支持体の少なくとも一部の画像を取得するための光学装置と、
－少なくとも１つの微生物の染色反応速度の変化に従ってサンプル中に潜在的に存在する少なくとも１つの微生物を検出するように、光学装置によって取得された画像をメモリに記憶し、比較し、分析するための手段とを備える装置に関する。

【0042】

好ましくは、本発明の装置は、光学撮像装置の下に検出支持体を移動させるための手段を備える。

【0043】

有利なことに、本発明の検出装置において、
－固体検出支持体は、ガラス繊維支持ディスク上に載っている少なくとも１つの濾過膜を含む、
－細胞マーカーを貯蔵するための手段は、検出支持体内に含まれ、カプセル化手段にカプセル化された細胞マーカーによって形成されたマイクロカプセルの層で構成されており、マイクロカプセルの層は、ガラス繊維支持ディスクと濾過膜との間に配置され、そのような場合、細胞マーカーの制御された放出のための手段は、装置の内部で温度上昇を生じさせることができ、また細胞マーカーをカプセル化するカプセル化手段を溶融させることができる加熱手段と、温度制御および調節手段とを含む、
－細胞マーカー貯蔵手段は、検出支持体とは別個の液体細胞マーカー溶液の予備で構成され、検出装置は、細胞マーカーを貯蔵手段から検出支持体に運ぶための手段を備え、そのような場合、細胞マーカーの制御された放出のための前記手段は、少なくとも１つの制御された流れポンプを含むことができる、
－光学撮像装置は、０．５ｍｍオーダーの、または０．５ｍｍに等しい焦点深度を有する、
－光学撮像装置は、ＣＭＯＳセンサカメラに基づいている、
－上記の光学撮像装置の視野は２５ｍｍ＊２５ｍｍである、
－光学撮像装置は、少なくとも２０メガピクセルに等しく、好ましくは１００メガピクセルを超える解像度を有する。

【0044】

本発明はさらに、本発明による検出方法において実施することができるか、または本発明による検出装置の組成物の一部を形成することができる検出支持体であって、少なくとも１つの液体供給ラインおよび少なくとも１つの液体吸引および排出ラインを通過する剛性ベースから少なくとも構成されており、供給ラインは、ベースから突出し、一方では、ベースの上の剛性で透過性の支持手段の中に作成された第１のオリフィスの中を通り、一方では、ガラス繊維で作成された可撓性の支持ディスク内に作成された第２のオリフィスの中を通る通気孔によって延長されており、ディスクは、剛性で透過性の支持手段上に位置決めされ、０．２～０．４５μｍの間に含まれるカットオフ閾値を有し、かつ微生物を保持することが可能な濾過膜を支持しており、検出支持体は、それがベースと一体になるように固定され、ベース、剛性で透過性の支持手段、支持ディスクおよび濾過膜を一緒に保持するクランプリングをさらに備える。

【0045】

本発明には多くの利点がある。一方で、微生物の染色反応速度の評価に基づく本方法は、サンプルを準備した後、最大で数分または数十分以内に、かつ培養を必要とせずに、サンプル中の１つまたは複数の生きている微生物の存在または不在をほぼ即座に検出し、その一方で、非常に信頼できる方法で、これらの微生物と塵などの潜在的な人工物とを区別することを可能にする。

【0046】

他方、本発明は、サンプルを手で扱うことが非常に少なく、またいずれの場合も、その作業が、複雑であり、資格のある要員を必要とし、サンプルを汚染する無視できないリスクを生み出す細胞マーカーを手で扱うことも全く必要としない。
本発明の他の特徴および利点は、添付の図を参照して与えられる、本発明の非制限的な実施形態の以下の詳細な説明から明らかになるであろう。

【図面の簡単な説明】

【0047】

【図1】図１は、固体検出支持体上にサンプルを堆積させる２つの特有の実施形態の異なるステップを図式的に示す図であり、これらのステップは、本発明による少なくとも１つの微生物を検出するための方法において実施することができる。

【図2】図２は、特に、検出支持体上にサンプルを堆積するステップと、このサンプルを染色する前にＰ_０画像を取得するステップと、細胞マーカーの制御された放出後、Ｐ_１からＰ_４の複数の画像を連続して取得するステップと、様々な画像の比較分析を実行することで分析結果を生み出すステップとを含む、本発明の検出方法の様々なステップを実施する特有の方法を図式的に示す図である。

【図3A】図３Ａは、本発明の方法または装置で使用することができる検出支持体の２つの非限定的な例示的実施形態の完全な図式的な分解組立斜視図である。

【図3B】図３Ｂは、本発明の方法または装置で使用することができる検出支持体の２つの非限定的な例示的実施形態の中央断面を通る図式的な分解および斜視図である。

【図4A】図４Ａは、図３Ａおよび図３Ｂに示されるものとは異なっており、本発明の方法または装置で使用することができる検出支持体の、とりわけ好ましい実施形態の全体の図式的な分解組立斜視図である。

【図4B】図４Ｂは、図３Ａおよび図３Ｂに示されるものとは異なっており、本発明の方法または装置で使用することができる検出支持体の、とりわけ好ましい実施形態の中央断面を通る図式的な分解組立斜視図である。

【図5】図５は、テストすべきサンプルが、マイクロカプセルの形態でカプセル化された細胞マーカーと接触させられ、細胞マーカーは、外部刺激の作用下で制御された方法で放出されて、サンプル中に潜在的に存在する微生物を検出することを可能にする、本発明の検出方法の特有の実施形態を示す図である。

【図6】図６は、培養段階の後の枯草菌の微小コロニーの一連の画像の取得を示しており、左側のＩ_０の画像は細胞マーカーの放出前に取得されているのに対して、他の画像Ｉ_１からＩ_５は、マーカーの制御された放出に続く定期的な間隔で取得され、これらの連続した画像取得を介して枯草菌コロニーの染色反応速度を評価することを可能にする図である。

【図7】図７は、一方では塵が存在し、他方ではテストサンプル中で検出すべき細胞、この場合、カンジダ属とアルビカンス種に属する酵母が存在している、検出支持体の、参照Ｉ´_０からＩ´_４で示される、一連の５つの連続した画像の取得を示す図である。 支持体は、本発明の方法に従って、細胞マーカーの放出前（画像Ｉ´_０）およびこのマーカーの制御された放出後（画像Ｉ´_１～Ｉ´_４）に写真撮影され、 この図はさらに、３つのプロファイルＰｒ_１、Ｐｒ_２ａおよびＰｒ_２ｂを示しており、これは画像Ｉ´_０からＩ´_４の取得と並行して、染色後、時間の関数として、特に連続する画像取得の関数として、細胞マーカー（Ｐｒ_１）を吸収できる塵および酵母（Ｐｒ_２ａおよびＰｒ_２ｂ）よって放出される光強度の変化（グレーレベルで表され、ピクセルの輝度を表し、０（黒）から２５５（白）で符号化される）をグラフで示しており、２つの連続した画像取得は２０秒間隔で行われ、染色後に塵から放出される光強度は、強力であり経時的に静止する強度に急激に増加するのに対して、酵母によって放出される光強度は、それが、光退色としても知られる、光強度の低下の前に最大強度のピークに達するまで、マーカーが細胞によって同化されるのにつれて徐々に増加することを示している。

【発明を実施するための形態】

【0048】

添付の図面の図１～図７に示されるように、本発明はまず、固体検出支持体１、２１上で少なくとも１つの微生物２、または場合によっては、テストすべきサンプル３に潜在的に、しかし必ずしも存在するわけではないが、複数の微生物２を検出するための方法に関する。

【0049】

本発明の検出方法において、１つまたは複数の微生物２は、これより前の培養段階の後に単細胞形態で存在するか、または微小コロニーの形態で存在するかにかかわらず、少なくとも１つの細胞マーカー４と接触させられる。

【0050】

「細胞マーカー」という用語は、以下の説明において、発光によって、特に蛍光によって、任意選択で生物発光によって、またはさらには染色によって、テストすべき元のサンプルに潜在的に存在する微生物を発現させることができる物質であると理解され、この細胞マーカーは、好ましくは、生存可能な微生物のみを発現させることができる、生存可能な微生物と生存不可能な微生物を区別することができる、あるいはさらには目的の特定の病原性微生物のみを染色することができる蛍光マーカーであり得ることが理解される。

【0051】

テストすべきサンプル３は、例えば、但し非制限的な方法で、製薬または食品加工産業に由来し得るか、または臨床または医療微生物学におけるヒト起源のサンプル、または環境起源のサンプルで構成される場合があり、このサンプル３で検出すべき微生物２は、主に細菌、酵母、またはカビタイプである。

【0052】

本発明による検出方法の第１のステップａ）において、テストすべきサンプル３は、好ましくは少なくとも１つの濾過膜５、２５を備える固体検出支持体１、２１上に堆積される。

【0053】

図１の下部に示される、本発明の方法のステップａ）の一例の実施形態では、分析すべきサンプル３は、１ｍＬ～５００ｍＬの範囲の容積を有する液体母材で構成され、少なくとも１つの濾過膜５を備える検出支持体１を介して濾過され、前記支持体１は、濾過に適した装置Ｄの上に位置決めされている。

【0054】

膜５は、サンプル３に潜在的に存在する微生物２を保持し、一方ではこのサンプル３の残留液体を主に除去するため、また場合により他方では、そのサイズがカットオフ閾値よりも小さい、中に含まれる不純物を主に除去するために適切なカットオフ閾値を有する。

【0055】

したがって、本発明の方法の第１のステップａ）を実施するために選択された実施形態にかかわらず、膜５、２５は、好ましくは、０．２０～０．４５μｍの間に含まれるカットオフ閾値を有する。さらにより好ましくは、この膜５、２５のカットオフ閾値は、０．３０μｍに等しい、または０．３０μｍオーダーである。

【0056】

そのようなカットオフ閾値は、サイズが約０．５～約１０μｍの間で変動し、かつサンプル３中に存在しやすい細菌、酵母またはカビタイプの全ての微生物２を膜５、２５の表面上に保持することを可能にする。

【0057】

しかしながら、このようなカットオフ閾値を使用すると、サンプル３の残りの部分からの微生物２の分離が促進されるだけでなく、同様にサンプル３に元々存在している大半の不活性粒子（塵など）の保持も向上することに留意されたい。

【0058】

図に示されていない、本発明の方法のステップａ）の第２の例示的な実施形態では、１～５００ｍＬの間に含まれる容積を有する液体サンプル３が、適切な濾過装置Ｄ上の濾過膜５を通して濾過され、膜５は、０．２０～０．４５μｍの間に含まれる、好ましくは０．３μｍに等しいカットオフ閾値を有する。

【0059】

サンプル３が濾過されると、濾過膜５は濾過装置Ｄから取り外され検出装置１上に置かれる。

【0060】

検出支持体１はまた、透過性材料、例えばガラス繊維で作成された少なくとも１つの支持ディスク１３で補足される場合もある。

【0061】

この例示の実施形態では、固体検出支持体１を形成するために、濾過膜５が装置Ｄから取り外された後、濾過膜５が任意選択で載せられるそのような支持ディスク１３は、特に添付の図３Ａおよび図３Ｂに示されている。

【0062】

より小さい容積、典型的には１０～２０００μＬのサンプル３に適用される第３の例示的な実施形態では、サンプル３は、図１の上部に示されるように、少なくとも膜５、２５と、支持ディスク１３、２３とを備える検出支持体１、２１に直接接種される。

【0063】

次に、好ましくは、検出支持体１は、本発明の方法を実施することができる完全に自動化された検出装置１４に挿入される。装置１４については、以下でより詳細に説明する。

【0064】

１つの特に有利な例示的な実施形態では、サンプル３を堆積するステップａ）は、この作業専用であり、かつ検出装置１４の外部にある濾過装置Ｄを使用せずに、１０～２０００μＬの間に含まれる少量のサンプル３の濾過膜２５上での堆積、または２，０００μＬを超える、通常は１００ｍＬまでのより大きな容積のサンプル３の直接濾過のいずれかを好ましくは可能にするように構成された検出支持体２１を使用することに留意されたい。
サンプル３は、濾過膜上に少量が堆積している場合でも、検出装置１４において自動化された方法で濾過することができる。

【0065】

検出支持体２１は、図４Ａおよび図４Ｂを参照して、以下の説明において詳細に説明される。

【0066】

従来の方法では、サンプル３を手で扱い、支持体１、２１上に堆積させるこれらの作業は、好ましくは、例えば図１に見ることができる生物学的に安全なキャビネットＢＳＣ性において作業を実行することによって無菌環境で作業者によって実行することができることに留意されたい。

【0067】

添付の図２に示される本発明による検出方法のステップｂ）において、サンプル３を含む検出支持体１、２１は、細胞マーカー４を観察する、または発現させるのに適した光放射６で少なくとも１回照射される。

【0068】

実際、本発明の検出方法の１つの特有の例示的な実施形態では、方法の実施全体を通して検出支持体１、２１の連続照射が実行可能である。しかしながら、以下の説明で詳細に説明されるように、検出支持体１、２１を局所的に照射すること、および各画像取得と同時に、またはほぼ同時に照射することが、さらにより好ましい。

【0069】

この照射ステップｂ）の後、およびステップｃ）において、サンプル３の少なくとも１つの画像Ｉ_０、Ｉ´_０が、第１のフェーズＰ_０において、検出支持体１、２１の少なくとも一部で取得され、画像Ｉ_０、Ｉ´_０の２つの例を図６および図７で見ることができる。

【0070】

本発明の方法において行われる画像取得は、好ましくは、２０メガピクセル以上、好ましくは１００メガピクセルを超える光学分解能を有し、少なくとも０．５μｍに等しいサイズを有する染色された微生物が所定の表面で検出されることを可能にする光学撮像装置７によって実行される。

【0071】

特に重要な方法において、光学装置７は、実際に比較的広い視野を有し、典型的には、少なくとも１０ｍｍの長さ×少なくとも１０ｍｍ幅であり、さらにより好ましくは、この視野は２５＊２５ｍｍであり、例えば、検出支持体１、２１全体を単一の画像で取得することができる。

【0072】

また、好ましくは、光学装置７は、検出支持体１、２１の膜５、２５のいかなる潜在的な平面度の欠陥も克服するために、＋／－０．５ｍｍの焦点深度を有することにも留意されたい。

【0073】

したがって、優先的に、ステップｃ）において、検出支持体１、２１の表面全体の単一の画像Ｉ_０、Ｉ´_０が取得される。

【0074】

本発明の方法において、検出支持体１、２１のサイズが大きすぎて単一の画像取得によって観察することができない場合、および非標準的な光学装置に投資して、これによりはるかに不利な経済的条件を生み出すことなく、より広い視野を観察できるようにするために、検出支持体１、２１に別個の経路に沿ったｎ個の移動を受けさせることが考慮される場合もあり、ここで、ｎは、１より大きく２０以下、さらにより好ましくは１０以下の整数である。

【0075】

別個の経路に沿ったこれらのｎ個の移動によって、検出支持体１、２１は、ｎ＋１の部分に空間的に分割され、部分のそれぞれは、画像取得時に、特にＰ_０で、および以下でより詳細に記載される少なくとも１つの後続のフェーズＰ_ｉの間に少なくとも１つの画像取得の対象であり、したがって、異なる部分の画像取得の合計によって、異なるフェーズＰ_０、Ｐ_ｉのそれぞれで検出支持体１、２１全体を観察することが可能になる。

【0076】

実際、この支持体１、２１の全体を一回で、またはそれ以上の回数で観察する能力は、少数の微生物が検出されることを保証する、またはさらにはテストすべきサンプル３に最初に存在する単一の微生物さえも検出されることを保証するために特に興味深い。

【0077】

画像Ｉ_０、Ｉ´_０の取得に続いて、ステップｄ）が、検出支持体１、２１を介する、少なくとも１つの細胞マーカー４の制御された放出のために実行され、その結果、マーカー４は、元のサンプル３に潜在的に存在し、支持体１、２１上に堆積された微生物と接触するようになる。

【0078】

この制御された放出ステップｄ）の１つの特有の実施形態は、より具体的に図５に示されている。

【0079】

好ましくは、本発明の方法で実装される細胞マーカー４は、蛍光マーカーである。

【0080】

このマーカー４は、当業者によって、それについてよく知られており、例えば、現在のサイトメトリー技術で一般的に使用される全ての細胞マーカーの中から当業者によって有利に選択することができる。

【0081】

したがって、細胞マーカーは、例えば、以下のマーカーから選択することができる。アクリジンオレンジ、ＤＡＰＩ（４´、６－ジアミジノ－２－フェニルインドール）、ＰＩ（ヨウ化プロピジウム）、ＤＲＡＱ７＊（ディープレッドアントラキノン７）、７－ＡＡＤ（７－アミノアクチノマイシンＤ）、ＴＯ－ＰＲＯ－１＊、ＴＯ－ＰＲＯ－３＊、ＳＹＴＯＸ＊、ＬＤＳ７５１、臭化エチジウム、エオシン－５´－マレイミド（ＥＭＡ）などのＤＮＡマーカー、「Ｚｏｍｂｉｅ Ｆｉｘａｂｌｅ＊」、「Ｆｉｘａｂｌｅ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｄｙｅ ｅＦｌｕｏｒ＊」、「ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ Ｆｉｘａｂｌｅ ｄｅａｄ＊」、「Ｖｉｏｂｉｌｉｔｙ Ｆｉｘａｂｌｅ＊」、「Ｈｏｒｉｚｏｎ Ｆｉｘａｂｌｅ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ＊」、「Ｇｈｏｓｔ＊」などのアミノ反応マーカー、カルセインＡＭ（アセトキシメチル）、ｃＦＤＡ（カルボキシフルオレセインジアセテート）、「ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ Ｇｒｅｅｎ ＣＭＦＤＡ＊」などのエステラーゼ活性マーカー、レサズリンやテトラゾリウム塩などのレドックスマーカー、または「ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ＊」キットなどのキットでの細胞マーカーの中から選択することができ、この段落に記載されている試薬の名前、およびそれに続くアスタリスクは登録商標である。

【0082】

上記のものからの複数の細胞マーカーの組み合わせを使用することもできる。

【0083】

本発明の方法において蛍光細胞マーカー４が使用される場合、光放射６は、レーザービームおよび１つまたは複数の発光ダイオードから選択され、後者の解決策が特に好ましいことに留意されたい。

【0084】

本方法の代替の一実施形態では、ステップｄ）において、存在する１つまたは複数の潜在的な微生物２はまた、少なくとも１つの非蛍光性であるが目で見ることができ検出可能な細胞マーカー４と接触させることもできる。

【0085】

細胞マーカー４はさらに生物発光マーカーで構成される場合があり、このシナリオでは、本発明の微生物を検出するための方法は、検出支持体１、２１を照射する１つまたは複数のステップを取り除くことによって実施されることを理解されたい。言い換えれば、支持体の照射を除いて、本明細書に詳細に記載されている本発明の方法の他のすべてのステップ、代替の実施形態および例示的な実施形態は、これが、適用され実行可能であり、当然のことながら、好適な生物発光マーカーを実装することが証明されるならば、適切な生物発光マーカーを実装する生物発光によって微生物を検出するための方法に適用可能である。

【0086】

いずれにせよ、特に有利な方法で、制御された放出のステップｄ）の第１の厳密かつ非限定的な実施形態において、本発明の方法において制御された方法で放出すべき細胞マーカー４は、カプセル化手段８にカプセル化され、したがって、例えば、１００μｍオーダーの直径を有するマイクロカプセル、マイクロビーズ、またはミクロスフェア９を有利に形成する。

【0087】

好ましくは、カプセル化手段８は、それを破裂させ、細胞マーカー４を放出させる外部刺激１０の適用に敏感である。

【0088】

したがって、好ましくは、カプセル化手段８は、感熱性脂質ワックスによって形成されており、カプセル化手段８が溶融し、マーカー４を放出して検出すべき潜在的微生物２と接触するように、カプセル化手段８に徐々に温度上昇を加えることによって、カプセル化マーカー４の放出が実現される。

【0089】

このような場合、感熱カプセル化手段８がさらされる温度は、周囲温度から４５℃を超えない温度まで徐々に上昇させることができ、それを超えると、特定の微生物２が破壊される可能性がある。

【0090】

本発明において、細胞マーカー４の放出は、好ましくは、自動化された方法で実行され、したがって、それは汚染源を構成するいかなる手作業からも解放され、また、適切な量のマーカー４で、かつ微生物２を効率的に染色するための正しい反応速度で行われるように制御される。

【0091】

第１の代替実施形態によれば、細胞マーカー４は液体形態でカプセル化され、したがって、マイクロカプセル９は、マーカー４に加えて、その溶解のための溶媒も含む。

【0092】

第２の代替実施形態では、細胞マーカー４は、固体形態、特に粉末形態でカプセル化される。細胞マーカー４の放出に続いて、後者は次に、微生物２の染色を行うことができるように、適切な溶解溶媒、例えば水の存在下に置かれる。

【0093】

好ましくは、この代替の実施形態では、固体細胞マーカー４を溶解させるための溶媒は、ガラス繊維支持ディスク１３に含まれ、サンプル３が通過した濾過膜５は、支持ディスク１３の上に配置される。

【0094】

したがって、濾過膜５が支持ディスク１３の上に置かれた後（サンプル３の表面的な濾過後）、またはサンプル３が堆積され、検出支持体１内の濾過膜５上で直接濾過された後、サンプル３の容積に関わらず、細胞マーカー４を含むマイクロカプセル９の層は、膜５とディスク１３との間に位置決めされ、支持ディスク１３は、適切な溶媒に浸されて、細胞マーカー４がそのカプセル９から放出されると、（例えば温度を上げることによって）カプセルが溶解することを可能にする。
この例は図３Ｂに示される。

【0095】

図３Ｂに示される構成では、支持ディスク１３はまた、適切な溶媒に浸され、カプセル化層８を溶融させることができる温度に保たれ、したがって、カプセル化された細胞マーカー４を固体粉末形態で放出し、同時にそれを溶解させて膜５上の微生物２の潜在的な存在を発現させることができる。

【0096】

いずれにせよ、固体または液体の形態の細胞マーカー４を含むマイクロカプセル９の層が支持ディスク１３の上に位置決めされる場合、その主な機能は、マイクロカプセル９の破裂後、拡散によって、膜５の下での前記マーカー４の分布を均質化にすることであり、膜はそれ自体マイクロカプセル９の層の上に配置される。
したがって、膜５に存在しやすい各微生物２は、本発明の方法によって発現されるであろう。

【0097】

ステップｄ）のこの実施形態において、および小さい容積（１０～２０００μＬ）を有するサンプル３を堆積するステップａ）が、同様にマイクロカプセル９の層を取り囲む少なくとも１つの支持ディスク１３および濾過膜５によって形成することができる固体検出支持体１上で直接実行される際、支持ディスク１３は、堆積中に濾過された液体と共に放出されるのを防ぐためにマイクロカプセル９を支持する機能もさらに果たすことに留意されたい。

【0098】

図３Ａでは、マイクロカプセル９の層は、例えばガラス繊維で作成された支持ディスク１３の下に配置され、ディスク１３は、細胞マーカーが制御された方法で放出されると、マイクロカプセル９または細胞マーカー４の毛細管拡散を確実にし、ならびにこれらのマイクロカプセル９の均質な分布が濾過膜５の下に拡散されることを確実にする。

【0099】

マーカー４が含まれるカプセル化手段８を破壊することによる細胞マーカー４の制御された放出は、特に興味深いことが証明されているが、本発明の方法のステップｄ）の唯一の実施形態であると見なすべきではない。

【0100】

実際、このステップｄ）の第２の実施形態では、細胞マーカー４は、液体溶液の形態で、かつ制御され自動化された方法で、例えば、制御された流れポンプなどの適切な手段によって制御された流量で直接運ばれ、検出支持体１、２１の濾過膜５、２５の表面に存在する１つまたは複数の微生物２と接触させられる。

【0101】

この場合、細胞マーカー４を制御された方法で１つまたは複数の微生物２と接触させるために選択された放出様式に関わらず、マーカー４は、それが好ましくは蛍光性であるか、代わりに生物発光性であるか、またはそれ以外であっても、好ましくは膜５に潜在的に存在する微生物２に対して最小限の毒性を有する。

【0102】

実際、この方法の実施中にサンプル３の汚染が検出された場合、および特定の用途、特に工業薬学の分野においては、検出された微生物２をその後に識別する能力は特に興味深いものであり得る。

【0103】

したがって、図２に示されるそのような識別ステップ１２は、特に濾過膜５、２５を除去することによって、検出後にサンプル３を培養し、微生物が増殖することを可能にする適切な栄養寒天培地にそれを堆積させ、その後、当業者によく知られている従来の識別方法、次に例えば質量分析法を実施することによって実施することができる。

【0104】

本発明による１つまたは複数の微生物を検出するための方法において、少なくとも１つの細胞マーカー４の制御された放出のステップの終わりに、ステップｅ）において、およびフェーズＰ_０に続く少なくとも１つのフェーズＰ_ｉの間に少なくとも１つの画像Ｉ_ｉ（ここで、ｉは１以上の整数である）が取得される。

【0105】

図６および図７は、フェーズＰ_０の間に、およびＰ_０の後の複数の後続のフェーズの間に取得された一連の画像、それぞれＩ_０～Ｉ_５およびＩ´_０～Ｉ´_４を示している。

【0106】

少なくとも１つの後続のフェーズＰ_ｉの間に取得された各画像Ｉ_ｉは、適切な場合、検出支持体１、２１の部分にカットされる。

【0107】

細胞マーカー４の制御された放出による微生物２の染色前に１つ（例えばＩ_０）が取得され、この放出後に少なくとも１つ（Ｉ_ｉ）が取得される、このような一連の画像の取得により、マーカー４の存在しない画像Ｉ_０の最初の取得と、マーカーの放出後の画像Ｉ_ｉの少なくとも２回目の取得との間で、これらの微生物２の染色反応速度を特徴付けることが可能になり、言い換えれば、これによるマーカー４の同化に対応する挙動の変化、特に、好ましくは微生物の蛍光の変化、場合により生物発光の変化を特徴付けることが可能になる。

【0108】

これにより、例えば自然蛍光を発しやすい不活性粒子、例えば塵の挙動を、方法の実施の間に効果的に染色された微生物２と区別することが可能になる。

【0109】

実際、潜在的な微生物２が蛍光細胞マーカー４によって発現されるこの仮説では、生来蛍光性であり、濾過膜５上に保持されている不活性粒子または塵は、マーカー４の制御された放出前、画像Ｉ_０において観察可能かつ検出可能であり、またこの放出後少なくとも１つの画像Ｉ_ｉにおいて観察可能かつ検出可能であり、一方、微生物２は、画像Ｉ_ｉ、特に画像Ｉ_１またはＩ´_１においてのみ観察可能で検出可能である。

【0110】

画像Ｉ_０およびＩ_ｉ、特に少なくともＩ_１またはＩ´_１の比較分析が実行される次のステップｆ）は、元のサンプル３内の微生物２の存在または不在に関して結論を引き出すことを可能にするであろう。

【0111】

フェーズＰ_０の間に、検出支持体１、２１が別個の経路に沿ってｎ個の移動を受けたという仮説を考慮すると、この支持体１、２１は、フェーズＰ_ｉの間に、Ｐ_０とＰ_ｉでそれぞれ取得された画像Ｉ_０およびＩ_ｉを後続の比較分析ステップ（ステップｆ）において比較することができるように、ｎ個の同一の移動を再び受ける。

【0112】

さらに、同様のロジックが、存在する場合は後続の画像に適用される。
実際、図６および図７に示される１つの好ましい実施形態では、第１の後続のフェーズＰ_１の間の画像Ｉ_１、Ｉ´_１の最初の取得後、数秒から数十秒ほどの、例えば１０秒～３０秒の間の可変の時間経過後に、フェーズＰ_０およびＰ_１の間に画像が取得された支持体１の各部分から画像Ｉ_２、Ｉ´_２が再度取得される。

【0113】

したがって、本発明の検出方法において、画像Ｉ_ｉを取得するステップｅ）は、細胞マーカー４の制御された放出のステップｄ）の後、かつ画像Ｉ_０、Ｉ´_０；Ｉ_１、Ｉ´_１；Ｉ_２、Ｉ´_２などの画像の比較分析のステップｆ）の前に、実行可能かつ有利に数回繰り返すことができ、画像Ｉ_ｉの連続取得は、１０秒～３０秒の間に含まれる、好ましくは２０秒に等しい時間の経過によって間隔を置かれている。
言うまでもなく、各画像は、特に比較のために、後続の処理作業のために装置１４によってメモリに格納される。

【0114】

好ましくは、その画像が、後続の画像取得フェーズＰ_１、Ｐ_２、およびＰ_３のそれぞれの間にＰ_０で取得された検出支持体１、２１の各部分の３つの画像Ｉ_１、Ｉ´_１；Ｉ_２、Ｉ´_２；Ｉ_３、Ｉ´_３を生成するように、本方法のステップｅ）は、比較分析ステップｆ）の前に連続して３回繰り返される。

【0115】

さらにより好ましくは、Ｉ_１～Ｉ_５まで、またはＩ´_１～Ｉ´_５までの５つの画像（ただし、画像Ｉ´_５は図７には示されていない）は、フェーズＰ_０の間に観察される検出支持体１、２１の各部分から生成される。

【0116】

したがって、特に独自の方法で、サンプル３を検出支持体１、２１に堆積させた後、およびフェーズＰ_０で画像Ｉ_０を最初に取得した後、細胞マーカー４を放出することにより、サンプル３に仮想的に存在する微生物２は、微生物２による細胞マーカー４の同化反応の反応速度に対応して、好ましくは単細胞マーカー段階の初期に、数分のオーダーの短い経過時間の間に染色され、したがって、様々なフェーズＰ_０、Ｐ_１などの間に染色した後の支持体１、２１の画像Ｉ_０、Ｉ´_０；Ｉ_１、Ｉ´_１、などを連続して取得することによって迅速な検出結果を獲得することになる。

【0117】

方法のステップｄ）で使用される細胞マーカー４の性質に応じて、微生物２によるその同化の生化学的反応は、特に、酵素反応、または酸化還元反応、あるいはさらには核酸の塩基間に前記マーカーを挿入する反応であり得る。

【0118】

テストすべきサンプル３に潜在的に存在する微生物２の染色反応速度の特徴付けはまた、自然に蛍光を発しやすい不活性粒子または塵の挙動を、微生物２の挙動から迅速に区別することを可能にし、従来技術で提案されたシステムと比較して偽陽性の有意な減少をもたらす。

【0119】

上記から、本発明の方法の実施は、当業者によって使用される専門用語に従って、ＣＦＵ、すなわちコロニー形成単位に対応する、元のサンプル３に含まれている可能性がある、単一の汚染物質の検出を可能にすることも明らかである。

【0120】

サンプル３が汚染されているかどうかに関する結論は、第１のフェーズＰ_０の間に取得された画像Ｉ_０；Ｉ´_０と少なくとも画像Ｉ_ｉ（例えば、画像Ｉ_１；Ｉ´_１）との間で比較分析を実行するステップｆ）の終わりに引き出され、このステップは、この説明において上記で既に言及されており、画像検出および処理アルゴリズム１１によって有利に実施される。

【0121】

この分析ステップｆ）の間に少なくとも１つの汚染微生物２の存在が検出された場合、サンプル３および検出支持体１、２１上に存在する１つまたは複数の微生物２を列挙するステップｇ）を実行することができることにも留意されたい。

【0122】

このオプションのステップｇ）は、アルゴリズム１１によって実行することもできる。
したがって、このアルゴリズム１１は、特に、経時的に微生物２の挙動の変化を評価することによって、およびそれらを潜在的な人工物、特に塵から区別することによって、画像Ｉ_１、Ｉ´_１、Ｉ_２、Ｉ´_２などにおける微生物２の存在または不在を可能な限り正確に迅速に検出することを可能にする必要があり、そして次にこれらの微生物２を列挙することを可能にする必要がある。

【0123】

さらに、アルゴリズム１１は、好ましくは、光学撮像装置７のセンサの解像度のオーダーまたはそれ以下の寸法を有する要素（塵、微生物など）を検出することが可能である。

【0124】

これは、本発明の主な利点の１つであり、微生物２による細胞マーカー４の同化の反応速度に基づく方法の使用は、光学分解能の要件をある程度克服する。

【0125】

確かに、染色反応速度に起因する蛍光強度の変動は、単一のピクセルで検出することができる。したがって、微生物２のサイズは、必ずしもピクセルのサイズよりも大きいとは限らない。場合によっては、ピクセルよりも小さい微生物２によって放出される光強度は、ピクセルを照射するのにちょうど十分である。この強度は、微生物２を確実に検出するには不十分である可能性があるが、染色中の強度の変動は、それを検出するのに十分であり得る。

【0126】

好ましくは、細胞マーカー４の制御された放出後の検出支持体１、２１の画像Ｉ_ｉを取得するステップｅ）は、典型的には２０～３００秒、例えばアクリジンオレンジで染色した場合、好ましくは８０～１６０秒の間に含まれるマーカー４の放出後の時間遅延で実行される。
マーカー４の制御された放出後、およびしたがってこのマーカー４が検出支持体上に潜在的に存在する微生物２と接触させられた後、それぞれ画像Ｉ_ｉが取得される前のそのような時間遅延は、微生物２がマーカー４を正しく同化したことを確実にすることを可能にする。

【0127】

１つの非常に好ましい例示的な実施形態では、検出支持体１、２１は、画像取得の各々、すなわち第１のフェーズＰ_０におけるステップｂ）の画像Ｉ_０、Ｉ´_０の両方の最初の取得が実行されるのと同時に、またはほぼ同時に、および少なくとも１つの後続のフェーズＰ_ｉで行われる画像Ｉ_ｉの取得と同時に、細胞マーカー４の発現を可能にする光放射６によって局所的に照射される。

【0128】

言い換えれば、画像取得フェーズＰ_０およびＰ_ｉの外では、検出支持体１、２１は、光放射６によって照射され得ない。
好ましくは、本発明の方法は、少なくとも以下のステップをこの順序で含むことに留意されたく、
ａ１）分析すべきサンプル３を固体検出支持体１、２１上に堆積させるステップと、
ｂ１）少なくとも１つの細胞マーカー４を発現させることができる光放射６によって検出支持体１、２１を局所的に照射するステップと、
ｃ１）照射ステップｂ１）と同時に、少なくとも２０メガピクセルに等しい解像度および１０ｍｍ以上の長さｘ１０ｍｍ以上の幅の視野を有する光学撮像装置７を用いて、検出支持体１、２１の少なくとも一部でサンプル３の第１のフェーズＰ_０において少なくとも１つの画像Ｉ_０、Ｉ´_０を取得するステップと、
ｄ１）検出支持体１、２１を介して、細胞マーカー４の制御された放出、あるいは一連の細胞マーカー４または試薬の制御された放出を実行して、マーカー４を微生物２と接触させるステップと、
ｅ１）細胞マーカー４の制御された放出のステップｄ１）の後の５秒未満の経過時間内に、少なくとも１つの細胞マーカー４を発現させることができる光放射６で検出支持体１、２１を局所的に照射するステップと、
ｆ１）照射ステップｅ１）と同時に、その画像Ｉ_０、Ｉ´_０が、マーカー４の制御された放出のステップ後の少なくとも１つの後続のフェーズＰ_１においてＰ_０で取得された検出支持体１、２１の各部分の画像Ｉ_１、Ｉ´_１を取得するステップと、
ｇ１）光放射６で検出支持体１、２１を少なくとも１回局所的に再照射するステップと、
ｈ１）照射ステップｇ１）と同時に、微生物２の染色反応速度の変化に従って少なくとも１つの微生物２を検出するために、その画像Ｉ_０、Ｉ´_０がＰ_０で取得され、その画像Ｉ_１、Ｉ´_１が少なくとも１つの第２の後続フェーズＰ_２におけるＰ_１で取得された検出支持体１、２１の各部分の画像Ｉ_２、Ｉ´_２を取得するステップと、
ｉ１）検出支持体１、２１の部分ごとに、Ｐ_０で取得された画像Ｉ_０、Ｉ´_０と少なくとも２つの後続のフェーズＰ_１およびＰ_２で取得された画像Ｉ_１、Ｉ´_１；Ｉ_２、Ｉ´_２との間で比較分析を実行し、サンプル３における少なくとも１つの微生物２の存在または不在に関する結論を導き出すステップとを、この順序で含むことに留意されたい。
画像Ｉ_２、Ｉ´_２を取得するためのステップｇ１）およびｈ１）は、好ましくは、画像Ｉ_１、Ｉ´_１が取得されたステップｆ１）の後、２０～３００秒、好ましくは８０～１６０秒の経過時間内に実施される。
説明において上記のステップａ）～ｆ）の代替の実施形態または好ましい例は、上記の段落に提示された方法の対応するステップａ１）～ｉ１）にも適用可能であることに留意されたい。
そのような方法は、一方で、以下の
－例えば、蛍光または生物発光を自然に放出し、細胞マーカー４の制御された放出のステップｄ１）の前に第１のフェーズＰ_０において取得された画像Ｉ_０、Ｉ´_０に観察される不活性粒子または塵の最初のカテゴリ、
－自家蛍光ではない（したがって、画像Ｉ_０、Ｉ´_０において観察することはできない）が、制御された放出後に細胞マーカー４を急速に吸収する不活性粒子または塵であって、この塵は画像Ｉ_１、Ｉ´_１においてはっきりと観察することができる第２のカテゴリとの間の効果的な区別を可能にするため特に興味深い。
－分析すべき元のサンプル３に潜在的に存在し、画像Ｉ_０、Ｉ´_０において観察することができない１つまたは複数の微生物２は、低い光強度で画像Ｉ_１、Ｉ´_１に現れ始める場合があり、これは、その後、より高い光強度で、画像Ｉ_２、Ｉ´_２および潜在的な後続の画像においてはっきりと観察することができ、ステップｇ１）およびｈ１）は、後続のフェーズＰ_２、Ｐ_３の間に画像を取得するために必要な回数だけ繰り返すことができることが理解される。

【0129】

図７は、画像Ｉ´_０～Ｉ´_４の一連の取得を示し、これらの画像、特に画像Ｉ´_１～Ｉ´_４に見ることができる要素の一部と一致しており、プロファイルＰｒ_１、Ｐｒ_２ａおよびＰｒ_２ｂは、細胞マーカー４が制御された方法で放出され、サンプル３内および固体検出支持体１、２１上に存在する要素、この場合は塵やカンジダアルビカンス酵母と接触させられる瞬間（横軸は０）の後の時間の関数としての、問題の要素の光強度の変化を示している。

【0130】

細胞マーカー４の制御された放出のステップの前に取得された画像Ｉ´_０では、要素は観察することができない。したがって、この画像Ｉ´_０は、元のサンプル３に自然に発光する塵が存在しないことを示している。

【0131】

以下の画像Ｉ´_１～Ｉ´_４では、染色後、サンプル３に存在するいくつかの要素は、染色ステップ後、強力であり、経時的にほぼ一定である光強度を有することが分かる。この場合、連続する画像Ｉ´_１～Ｉ´_４を比較すると、これは細胞マーカーを吸収した塵であるという結論に至り、そのプロファイルＰｒ_１は、光の特定されたスポットに関連してグラフで示される。

【0132】

染色後の画像Ｉ´_１～Ｉ´_４の連続では、他の要素も見られ、この場合は微生物であり、プロファイルＰｒ_２ａおよびＰｒ_２ｂに示されているその光強度は、光退色現象に対応して、この光強度が、これも段階的なやり方で減少する前に、微生物２（この場合はカンジダアルビカンス酵母）による細胞マーカー４の段階的な同化に対応する強度ピークに達するまで経時的に徐々に増大する。

【0133】

本発明の方法の第１のステップａ１）において、不活性粒子、例えば、自然に発光する塵が検出支持体１、２１上に堆積された場合、これは、画像Ｉ´_０および後続のすべての画像Ｉ´_ｉにおいて観察可能である。したがって、そのような塵もまた、本発明による検出方法を実施することによって微生物２と区別することが可能である。

【0134】

本発明はさらに、テストすべきサンプル３に潜在的に存在し、上記の検出方法のステップを実施することができる、細菌、酵母またはカビタイプの少なくとも１つの微生物２を自動的に検出するための装置１４に関する。

【0135】

有利には、本発明による装置１４は、
－少なくとも１つの微生物２を含みやすい分析すべきサンプル３を受け取ることが意図された固体検出支持体１、２１を少なくとも含む。この支持体１、２１は、好ましくは、サンプル３が通過する少なくとも１つの濾過膜５、２５、および膜５、２５がその上に置かれる支持ディスク１３、２３で構成される。
図３Ａおよび図３Ｂに示される実施形態では、検出支持体１は、保護カバー１６によって、および支持体１のすべての要素を剛性支持プレート１８上に保持するための手段によって補完することができ、保持手段は、フープの形態１７を採ることが可能である。

【0136】

図４Ａおよび図４Ｂにより具体的に示される別の実施形態では、ガラス繊維の支持ディスク２３上に載っている濾過膜２５を含む検出支持体２１は、
・剛性であり、特にプラスチック材料で作成され、複数の円形の穿孔および／または長方形の穿孔の存在を通じて透過性である支持手段２４であって、剛性支持手段２４は、以下の説明においてドレイン２４としても参照され、ドレインは、支持ディスク２３および濾過膜２５のものと類似の、または幾分類似した形状および寸法を有する支持手段２４と、
・例えばプラスチック材料で作成された剛性ベース２６であって、一方では、液体、この場合は細胞マーカー４を供給する供給ライン２６ａが中を通っており、ライン２６ａは、ベース２６から突出し、ドレイン２４に作成された第１のオリフィス２４ａおよび例えばガラス繊維で作成された支持ディスク２３に作成された第２のオリフィス２３ａの中を通る通気孔２６ｂによって延長されており、また一方では、液体用の吸引および排出ライン２６ｃが中を通っており、このライン２６ｃは、適切な手段によって、その後の処理またはその廃棄を目的として排出された残留液体を受け取るための容器に接続されている剛性ベース２６と、
・検出支持体２１のすべての構成要素を互いに一体になるように一緒に保持するクランプリング２７であって、この目的のために、クランプリング２７およびベース２６は好ましくはねじ山を有し、検出支持体２１のすべての構成要素を締め付けることができるクランプリング２７と、
・検出支持体２１の漏れ防止シーリングを保証するために追加することができるガスケット２８と、によって補完される。
－少なくとも、微生物２の少なくとも１つの細胞マーカー４を貯蔵する手段。

【0137】

図３Ａおよび図３Ｂに示される一実施形態では、貯蔵手段１９は検出支持体１に含まれる。より具体的には、そのような貯蔵手段１９は、濾過膜５の下に、好ましくは膜５とガラス繊維支持ディスク１３との間に優先的に位置決めされる。そのような貯蔵手段１９は図５にも示され、有利には、マイクロカプセル９の層の形態を採り、層内の各マイクロカプセル９は、カプセル化手段８にカプセル化された細胞マーカー４によって形成されている。この貯蔵手段１９はまた、濾過膜５がその上に直接置かれるガラス繊維支持ディスク１３の下に実行可能に位置決めされる場合もある。

【0138】

別の実施形態では、検出装置１４は、図４Ａおよび図４Ｂに示される検出支持体２１を含み、細胞マーカー４を貯蔵するための手段は、マーカー４の液体溶液の予備で構成され、この予備は、検出支持体２１とは別個であり、したがって、装置１４は、細胞マーカー４を貯蔵手段から検出支持体２１に搬送するための手段を備える。したがって、細胞マーカー４を液体の形で運ぶこれらの手段は、適切な接続手段によって、検出支持体２１のベース２６の液体供給ライン２６ａに接続されている。供給ライン２６ａを介して、次に、オリフィス２４ａを介してドレイン２４の中を通り、オリフィス２３ａを介して支持ディスク２３の中を通るベース２６の通気孔２６ｂを介して、液体形態の細胞マーカー４は、このシナリオでは、検出すべき微生物２を含みやすい濾過膜２５の下の支持ディスク２３の頂部に直接運ばれる。
－少なくとも、マーカー４を分析すべきサンプル３と接触させるための細胞マーカー４の制御された放出のための手段１５。

【0139】

そのような手段は、例えば、少なくとも１つの細胞マーカー４を貯蔵するための手段がマイクロカプセル９の層の形態を採る実施形態において、温度を制御し調整する従来の手段と関連付けられた検出支持体１を加熱する手段を含むことで、温度上昇を適用してカプセル化手段８を溶融させマーカー４を放出することができる。

【0140】

別の例示的な実施形態では、好ましくは液体形態の細胞マーカー４は、適切な時間に、別個の予備から検出支持体１、２１に、その下から、特に支持体ディスク１３、２３の下から徐々に運ばれ、マーカー４を膜５、２５上に保持することができる微生物２と接触させるために、ディスク１３、２３による毛細管現象によって拡散させることができる。そのような場合、図２に注射器の形で極めて図式的に示される制御された放出の手段１５は、液体マーカー４を吸引するための手段および供給流量を調節するための手段、例えば、流量が制御されたポンプで構成することができ；
－特にレーザービーム、またはさらにより好ましくは高出力発光ダイオードに基づいて、細胞マーカー４を発現させることができる、検出支持体１、２１を照射する手段６と、
－検出支持体１、２１の少なくとも一部の画像を取得し、この支持体１、２１の上に位置決めされる光学装置７であって、好ましくは少なくとも２０メガピクセルに等しい、より好ましくは少なくとも１００メガピクセルに等しい解像度を有する光学装置７と、を含む。この光学装置７は、観察すべき検出支持体１の平面度に関する欠陥を克服するために、より好ましくは、０．５ｍｍオーダーまたは０．５ｍｍに等しい焦点深度を有する。それは、有利には、ＣＭＯＳセンサを備えたカメラで構成され、特定の視野を有し、その寸法は、例えば、少なくとも１０ｍｍの長さ×少なくとも１０ｍｍの幅であり、さらにより好ましくは、２５＊２５ｍｍである。

【0141】

検出支持体１、２１はさらに、染色の前後の画像を取得するため、およびより広い視野を観察するために検出支持体１、２１を複数の部分に分割する必要がある場合、検出支持体１、２１をこの光学撮像装置７の下に移動させる手段と協働することができる。これらの移動手段は図には示されていない。
－少なくとも１つの微生物２の染色反応速度の変化に従ってサンプル３に潜在的に存在する少なくとも１つの微生物２を検出するように、光学装置７によって取得された画像をメモリに記憶し、比較し、分析するための手段。そのような分析手段は、好ましくは、画像検出および処理アルゴリズム１１で構成される。

【0142】

図４Ａおよび図４Ｂは、少なくとも１つの微生物２を含みやすい分析すべきサンプル３を受け取ることが意図された固体検出支持体２１の特に好ましい実施形態を示しており、これは、本発明による検出方法において実施することができるか、またはこの方法のステップを実施することができる検出装置１４の一部であり得る。

【0143】

図４Ａおよび図４Ｂに示されるように、この検出支持体２１は、サンプル３が通される少なくとも１つの濾過膜２５と、膜２５が上に載っているガラス繊維支持ディスク２３とで構成される。
そのような検出装置はまた、複数の円形の穿孔および／または長方形の穿孔を通して透過可能である剛性の支持手段２４、またはドレイン２４を備えている。濾過膜２５の下に位置決めされたガラス繊維支持ディスク２３は、このドレイン２４上に載っている。したがって、これらの３つの要素、支持ディスク２３、ドレイン２４、および濾過膜２５は、有利には、本質的に円形であり、同様のまたはいくらか同様の寸法である形状を有する。

【0144】

そのような剛性で透過性の支持体２４はとりわけ、本発明の方法を実施するとき、またはサンプル３の膜２５の表面上での堆積により、残留液体の吸引などにより、支持体によって支持される可撓性要素、ディスク２３および膜２５の平面度を維持する。さらに、多数の穿孔が存在するため、この支持体２４を通して液体を排出することができる。

【0145】

剛性支持体またはドレイン２４は、それ自体が剛性ベース２６に取り付けられており、その中を少なくとも１つの液体供給ライン２６ａが通っており、また少なくとも１つの液体吸引および排出ライン２６ｃが通っている。

【0146】

供給ライン２６ａの目的は、液体細胞マーカー４を検出支持体２１に運ぶことであり、ライン２６ａは、液体細胞マーカー４を濾過膜２５と、したがって潜在的にそこに含まれる微生物２と直に接触させるように、ベース２６から突出し、一方では、ドレイン２４に作成された第１のオリフィス２４ａの中を通り、一方では、ガラス繊維支持ディスク２３内に作成された第２のオリフィス２３ａの中を通る通気孔２６ｂによってさらに延長されている。

【0147】

供給ライン２６ａに加えて少なくとも１つの吸引および排出ライン２６ｃも同様に、濾過膜２５と接触させた後の過剰な液体細胞マーカー４であるか、または他の任意の液体、例えば、膜２５による濾過後のサンプル３の残留液体、あるいは洗浄液であるかどうかにかかわらず、液体のためにベース２６の中を通っている。

【0148】

検出支持体２１のすべての構成要素を互いに一体になるように一緒に保持するクランプリング２７、および任意選択でガスケット２８が支持体２１を補完する。

【0149】

検出支持体１、２１に関して選択された実施形態にかかわらず、濾過膜５、２５は、放出された光と濾過膜５、２５の暗い色合いとのコントラストによって、細胞マーカー４の蛍光または生物発光の最適な発現を可能にするために、有利には色が暗く、好ましくは黒色であることに留意されたい。

【0150】

本発明の検出方法または検出装置１４が単細胞ステージで細胞または微生物２を検出する目的で実施される場合、ポリエステルまたはポリカーボネートで作成された膜５、２５が好ましいが、培養段階後の微小コロニーの形態の細胞のクラスターを検出するでは、ニトロセルロースまたはエステルで作成された膜５、２５が好ましい。

【0151】

一般的に言えば、検出方法について上記で説明した要素は、これが適切かつ実行可能であることが証明された場合、本発明による検出装置および検出支持体１、２１に適用することができ、逆もまた同様である。

【0152】

言うまでもなく、本発明は、上記に示され、説明された例に限定されるものではなく、これらの例には、本発明の範囲内になおも留まったままで代替案および修正を加えることができる。

【図1】

【図2】

【図3A】

【図3B】

【図4A】

【図4B】

【図5】

【図6】

【図7】