特許 7479521 新規なフィーカリバクテリウムプラウスニッツィイＥＢ－ＦＰＤＫ９菌株およびその用途

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-04-25

(45)【発行日】2024-05-08

(54)【発明の名称】新規なフィーカリバクテリウムプラウスニッツィイＥＢ－ＦＰＤＫ９菌株およびその用途

(51)【国際特許分類】

   C12N 1/20 20060101AFI20240426BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20240426BHJP

   A61P 1/16 20060101ALI20240426BHJP

   A61P 3/00 20060101ALI20240426BHJP

   A61K 35/741 20150101ALI20240426BHJP

   A61K 35/74 20150101ALI20240426BHJP

【ＦＩ】

C12N1/20 A

C12N1/20 E ZNA

A61P29/00

A61P1/16

A61P3/00

A61K35/741

A61K35/74 A

A61K35/74 B

【請求項の数】 6

(21)【出願番号】P 2022576179

(86)(22)【出願日】2020-06-26

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2023-07-11

(86)【国際出願番号】 KR2020008345

(87)【国際公開番号】W WO2021261631

(87)【国際公開日】2021-12-30

【審査請求日】2022-12-09

(31)【優先権主張番号】10-2020-0077337

(32)【優先日】2020-06-24

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

【微生物の受託番号】KCCM  KCCM12620P

(73)【特許権者】

【識別番号】521022956

【氏名又は名称】エンテロバイオーム インコーポレイテッド

【氏名又は名称原語表記】ＥＮＴＥＲＯＢＩＯＭＥ ＩＮＣ．

(74)【代理人】

【識別番号】100108453

【弁理士】

【氏名又は名称】村山 靖彦

(74)【代理人】

【識別番号】100110364

【弁理士】

【氏名又は名称】実広 信哉

(74)【代理人】

【識別番号】100133400

【弁理士】

【氏名又は名称】阿部 達彦

(72)【発明者】

【氏名】ジェ・グ・ソ

(72)【発明者】

【氏名】ジュ・ヒュン・シン

(72)【発明者】

【氏名】ド・キュン・イ

【審査官】斉藤 貴子

(56)【参考文献】

【文献】特開平０９－２０８４７９（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２０１８／２３０６９５（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特表２０１６－５１１２７２（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１９－５０８４８６（ＪＰ，Ａ）

【文献】関節リウマチにおけるIL-6阻害治療，Clin. Rheumatol.，2015年，Vol. 27，p.228-231

【文献】慢性肝疾患の窒素代謝における血中亜鉛の意義についての検討，肝臓，2001年，Vol. 42, No. 3，p. 120-125

【文献】多様な酪酸投与とその効果，甲南女子大学研究紀要II，2019年03月，Vol. 13，p.25-35

【文献】C. V. Ferreira-Halder, et al.，Best Practice & Research Clinical Gastroenterology，2017年，Vol.31，p.643-648

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ

Ａ２３Ｌ

Ａ６１Ｐ

Ａ６１Ｋ

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

受託番号ＫＣＣＭ１２６２０Ｐであるフィーカリバクテリウムプラウスニッツィイ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）ＥＢ－ＦＰＤＫ９菌株。

【請求項2】

請求項１に記載の菌株、前記菌株の培養液および前記菌株の破砕物からなる群より１つ以上を含む、炎症性サイトカインＩＬ－８の発現抑制剤。

【請求項3】

請求項１に記載の菌株、前記菌株の培養液および前記菌株の破砕物からなる群より１つ以上を含む、抗炎症サイトカインＩＬ－１０の発現増加剤。

【請求項4】

請求項１に記載の菌株、前記菌株の培養液および前記菌株の破砕物からなる群より１つ以上を含む、非アルコール性脂肪肝炎の予防、改善または治療剤。

【請求項5】

請求項１に記載の菌株、前記菌株の培養液および前記菌株の破砕物からなる群より１つ以上を含む、脂肪蓄積抑制剤。

【請求項6】

請求項１に記載の菌株、前記菌株の培養液および前記菌株の破砕物からなる群より１つ以上を含む、脂肪分化関連遺伝子であるＣ／ＥＢＰα、ＳＲＥＢＰ１ｃ、ａＰ２、ＦＡＳ、ＡＣＣ１またはＬＰＬ遺伝子の発現抑制剤。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、新規なフィーカリバクテリウムプラウスニッツィイＥＢ－ＦＰＤＫ９菌株およびその用途に関する。

【背景技術】

【0002】

プロバイオティクス（ｐｒｏｂｉｏｔｉｃｓ）は、乳酸菌を含めて体の中で有益な効果を示すすべての菌を意味するもので、腸だけでなく、免疫疾患などの多様な身体機能に関与する。一時、プロバイオティクスの餌になる食物繊維、すなわちプレバイオティクス（ｐｒｅｂｉｏｔｉｃｓ）を一緒に服用すれば効果がより良いという研究が注目されていた。最近は、プロバイオティクスが産生する代謝産物であるポストバイオティクスが治療剤や疾病の診断に効率的という主張が注目されており、併せてファーマバイオティクスも注目されている。ファーマバイオティクス（ｐｈａｒｍａｂｉｏｔｉｃｓ）は、医薬を意味する「ファーマシューティカル」と生菌という「プロバイオティクス」の合成語で、疾患ケアのために医療用に使用可能な人体マイクロバイオームを称するもので、プロバイオティクスとポストバイオティクスの両方をすべて含む。

【0003】

一方、フィーカリバクテリウム属（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）細菌は、腸内の粘液層に常に存在する偏性嫌気性桿菌であって、人間において保有率および保有数がいずれも高く、腸内細菌叢の主な構成菌種である。

【0004】

このような背景の下、本発明者らは、人体に有害でない菌株を用いて疾患を治療できる技術を開発するために努力した結果、優れた抗炎症効果および脂肪蓄積抑制効果を示すフィーカリバクテリウムプラウスニッツィイ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）菌株を同定し、これから肝疾患および大腸炎などの治療に適合することを確認して、本発明を完成した。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【文献】WO2018-230695A1

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

本発明の一つの目的は、受託番号ＫＣＣＭ１２６２０Ｐであるフィーカリバクテリウムプラウスニッツィイ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）ＥＢ－ＦＰＤＫ９菌株を提供することである。

【0007】

本発明の他の目的は、フィーカリバクテリウムプラウスニッツィイ（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）ＥＢ－ＦＰＤＫ９、前記フィーカリバクテリウムプラウスニッツィイ（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）ＥＢ－ＦＰＤＫ９菌株の培養液、破砕物または抽出物からなる群より１つ以上を含む炎症性疾患、肝疾患または代謝性疾患の予防または治療用薬学的組成物を提供することである。

【0008】

本発明のさらに他の目的は、フィーカリバクテリウムプラウスニッツィイ（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）ＥＢ－ＦＰＤＫ９、前記フィーカリバクテリウムプラウスニッツィイ（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）ＥＢ－ＦＰＤＫ９菌株の培養液、破砕物または抽出物からなる群より１つ以上を含む炎症性疾患、肝疾患または代謝性疾患の予防または改善用食品組成物を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0009】

本発明の一態様は、受託番号ＫＣＣＭ１２６２０Ｐであるフィーカリバクテリウムプラウスニッツィイ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）ＥＢ－ＦＰＤＫ９菌株を提供する。

【0010】

本発明の一具体例において、前記菌株は、１６Ｓ ｒＲＮＡが配列番号１であるフィーカリバクテリウムプラウスニッツィイ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）ＥＢ－ＦＰＤＫ９菌株を提供するものである。

【0011】

本発明の他の態様は、フィーカリバクテリウムプラウスニッツィイ（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）ＥＢ－ＦＰＤＫ９、前記フィーカリバクテリウムプラウスニッツィイ（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）ＥＢ－ＦＰＤＫ９菌株の培養液、破砕物または抽出物からなる群より１つ以上を含む炎症性疾患の予防または治療用薬学的組成物を提供する。

【0012】

本発明のさらに他の態様は、フィーカリバクテリウムプラウスニッツィイ（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）ＥＢ－ＦＰＤＫ９、前記フィーカリバクテリウムプラウスニッツィイ（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）ＥＢ－ＦＰＤＫ９菌株の培養液、破砕物または抽出物からなる群より１つ以上を含む肝疾患の予防または治療用薬学的組成物を提供する。

【0013】

本発明の他の態様は、フィーカリバクテリウムプラウスニッツィイ（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）ＥＢ－ＦＰＤＫ９、前記フィーカリバクテリウムプラウスニッツィイ（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）ＥＢ－ＦＰＤＫ９菌株の培養液、破砕物または抽出物からなる群より１つ以上を含む代謝性疾患の予防または治療用薬学的組成物を提供する。

【0014】

本発明のさらに他の態様は、フィーカリバクテリウムプラウスニッツィイ（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）ＥＢ－ＦＰＤＫ９、前記フィーカリバクテリウムプラウスニッツィイ（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）ＥＢ－ＦＰＤＫ９菌株の培養液、破砕物または抽出物からなる群より１つ以上を含む炎症性疾患の予防または改善用食品組成物を提供する。

【0015】

本発明の他の態様は、フィーカリバクテリウムプラウスニッツィイ（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）ＥＢ－ＦＰＤＫ９、前記フィーカリバクテリウムプラウスニッツィイ（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）ＥＢ－ＦＰＤＫ９菌株の培養液、破砕物または抽出物からなる群より１つ以上を含む肝疾患の予防または改善用食品組成物を提供する。

【0016】

本発明のさらに他の態様は、フィーカリバクテリウムプラウスニッツィイ（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）ＥＢ－ＦＰＤＫ９、前記フィーカリバクテリウムプラウスニッツィイ（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）ＥＢ－ＦＰＤＫ９菌株の培養液、破砕物または抽出物からなる群より１つ以上を含む代謝性疾患の予防または改善用食品組成物を提供する。

【0017】

本発明の一具体例によれば、前記食品組成物は、健康機能食品の形態に製造される。

【0018】

本発明の一具体例によれば、前記食品組成物は、プロバイオティクス製剤の形態に製造される。

【発明の効果】

【0019】

フィーカリバクテリウムプラウスニッツィイ（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）ＥＢ－ＦＰＤＫ９、前記フィーカリバクテリウムプラウスニッツィイ（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）ＥＢ－ＦＰＤＫ９菌株の培養液、破砕物または抽出物からなる群より１つ以上を含む組成物を摂取すれば、炎症性疾患、肝疾患または代謝性疾患を予防、改善または治療する効果がある。

【図面の簡単な説明】

【0020】

【図1】フィーカリバクテリウムプラウスニッツィイ（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）標準菌株およびＥＢ－ＦＰＤＫ９を顕微鏡で観察したものである。

【図2】フィーカリバクテリウムプラウスニッツィイ（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）標準菌株およびＥＢ－ＦＰＤＫ９をＦＰ－特異性プライマーでＰＣＲ後に電気泳動した結果である。

【図3】フィーカリバクテリウムプラウスニッツィイ（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）標準菌株およびＥＢ－ＦＰＤＫ９をＥＲＩＣ－１、ＥＲＩＣ－２および（ＧＴＧ）_５プライマーでＰＣＲ後に電気泳動した結果である。

【図4】フィーカリバクテリウムプラウスニッツィイ（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）ＥＢ－ＦＰＤＫ９の１６ｒＲＮＡ塩基配列を用いて作成した系統樹である。

【図5】フィーカリバクテリウムプラウスニッツィイ（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）標準菌株およびＥＢ－ＦＰＤＫ９の溶血現象の有無を確認したものである。

【図6】フィーカリバクテリウムプラウスニッツィイ（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）標準菌株およびＥＢ－ＦＰＤＫ９の短鎖脂肪酸を分析したグラフである。

【図7】フィーカリバクテリウムプラウスニッツィイ（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）標準菌株およびＥＢ－ＦＰＤＫ９の炎症サイトカインＩＬ－８ ｍＲＮＡ発現を確認したグラフである。

【図8】フィーカリバクテリウムプラウスニッツィイ（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）標準菌株およびＥＢ－ＦＰＤＫ９の抗炎症サイトカインＩＬ－１０の濃度を確認したグラフである。

【図9】フィーカリバクテリウムプラウスニッツィイ（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）標準菌株およびＥＢ－ＦＰＤＫ９の脂肪蓄積抑制程度を確認した写真およびグラフである。

【図10】フィーカリバクテリウムプラウスニッツィイ（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）標準菌株およびＥＢ－ＦＰＤＫ９培養液の脂肪蓄積抑制程度を確認した写真およびグラフである。

【図11】フィーカリバクテリウムプラウスニッツィイ（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）標準菌株およびＥＢ－ＦＰＤＫ９処理時、脂肪分化誘導後の脂肪細胞分化に関与する遺伝子の発現程度を比較および確認したグラフである。

【図12】非アルコール性脂肪肝炎を誘導したマウスにおいてフィーカリバクテリウムプラウスニッツィイ（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）標準菌株およびＥＢ－ＦＰＤＫ９を投与したマウスの体重と食物摂取量を比較したグラフである。

【図13】非アルコール性脂肪肝炎を誘導したマウスにおいてフィーカリバクテリウムプラウスニッツィイ（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）標準菌株およびＥＢ－ＦＰＤＫ９を投与したマウスの耐糖能を比較したグラフである。

【図14】非アルコール性脂肪肝炎を誘導したマウスにおいてフィーカリバクテリウムプラウスニッツィイ（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）標準菌株およびＥＢ－ＦＰＤＫ９を投与したマウスの肝の重量および形状を比較したグラフである。

【図15】非アルコール性脂肪肝炎を誘導したマウスにおいてフィーカリバクテリウムプラウスニッツィイ（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）標準菌株およびＥＢ－ＦＰＤＫ９を投与したマウスの脾臓の重量および形状を比較したグラフである。

【図16】非アルコール性脂肪肝炎を誘導したマウスにおいてフィーカリバクテリウムプラウスニッツィイ（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）標準菌株およびＥＢ－ＦＰＤＫ９を投与したマウスの血中脂質の生化学的指標を分析して比較したグラフである。

【図17】非アルコール性脂肪肝炎を誘導したマウスにおいてフィーカリバクテリウムプラウスニッツィイ（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）標準菌株およびＥＢ－ＦＰＤＫ９を投与したマウスの肝をＨ＆Ｅ染色により脂肪滴の形成を確認した結果である。

【図18】非アルコール性脂肪肝炎を誘導したマウスにおいてフィーカリバクテリウムプラウスニッツィイ（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）標準菌株およびＥＢ－ＦＰＤＫ９を投与したマウスのコラーゲン沈着量を比較した結果である。

【図19】非アルコール性脂肪肝炎を誘導したマウスにおいてフィーカリバクテリウムプラウスニッツィイ（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）標準菌株およびＥＢ－ＦＰＤＫ９を投与したマウスの肝をα－ＳＭＡにより損傷度を比較した結果である。

【図20】非アルコール性脂肪肝炎を誘導したマウスにおいてフィーカリバクテリウムプラウスニッツィイ（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）標準菌株およびＥＢ－ＦＰＤＫ９を投与したマウスの肝の中性脂肪と総コレステロールを比較した結果である。

【発明を実施するための形態】

【0021】

上記の目的を達成するために、本発明の一態様は、受託番号ＫＣＣＭ１２６２０Ｐであるフィーカリバクテリウムプラウスニッツィイ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）ＥＢ－ＦＰＤＫ９菌株を提供する。

【0022】

本発明の一具体例において、前記菌株は、１６Ｓ ｒＲＮＡが配列番号１であるフィーカリバクテリウムプラウスニッツィイ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）ＥＢ－ＦＰＤＫ９菌株を提供するものである。

【0023】

前記フィーカリバクテリウムプラウスニッツィイ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）は、ヒトの腸内細菌叢を構成する細菌の中で最も豊富に存在する細菌の一つで、運動性のない厚壁細菌である。酸素に非常に敏感で極少量の酸素があっても育たないという特徴を有している。

【0024】

本発明の他の態様は、フィーカリバクテリウムプラウスニッツィイ（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）ＥＢ－ＦＰＤＫ９、前記フィーカリバクテリウムプラウスニッツィイ（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）ＥＢ－ＦＰＤＫ９菌株の培養液、破砕物または抽出物からなる群より１つ以上を含む炎症性疾患の予防または治療用薬学的組成物を提供する。

【0025】

本発明において、用語「培養液」は、培養が完了した後の組成物を称するものであってもよいし、より具体的には、前記培養液は、菌体を含むか、含まなくてもよい。したがって、前記培養液は、培養上澄液、培養上澄液が除去された組成物、またはこれらを濃縮した組成物を含むことができる。前記培養液の組成は、通常のフィーカリバクテリウムプラウスニッツィイの培養に必要な成分だけでなく、フィーカリバクテリウムプラウスニッツィイの生長に相乗的に作用する成分を追加的に含むことができ、これによる組成は、当業界における通常の技術を有する者によって容易に選択可能である。

【0026】

また、菌株の状態は、液相状態または乾燥状態であってもよいし、乾燥方法は、通風乾燥、自然乾燥、噴霧乾燥および凍結乾燥が可能であるが、これに限定されるものではない。

【0027】

本発明の用語、「炎症性疾患」は、炎症を主病変とする疾患の総称で、例えば、炎症性皮膚疾患、クローン病（Ｃｒｏｈｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）および潰瘍性大腸炎のような炎症性腸疾患、肝炎、腹膜炎、骨髄炎、蜂巣炎、脳膜炎、脳炎、膵臓炎、嚢胞性線維症、脳卒中、急性気管支炎、気管支炎、関節炎、関節細胞動脈炎、血色素症、鎌状赤血球症およびその他の血色素病症、敗血症からなる群より選択されるいずれか１つであってもよいし、好ましくは、炎症性皮膚疾患、大腸炎、慢性気管支炎、肝炎、骨関節炎であってもよいが、これに限定されない。

【0028】

本発明のさらに他の態様は、フィーカリバクテリウムプラウスニッツィイ（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）ＥＢ－ＦＰＤＫ９、前記フィーカリバクテリウムプラウスニッツィイ（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）ＥＢ－ＦＰＤＫ９菌株の培養液、破砕物または抽出物からなる群より１つ以上を含む肝疾患の予防または治療用薬学的組成物を提供する。

【0029】

前記肝疾患は、肝線維症または肝硬化症、急性または慢性肝炎、脂肪肝または肝臓癌を含み、好ましくは、脂肪肝または肝炎であってもよいし、さらに好ましくは、非アルコール性脂肪肝炎であってもよいが、これに限定されない。

【0030】

本発明において、前記肝疾患の予防または治療は、肝の重量が異常に増加することを抑制するものであってもよく、脾臓の長さおよび重量が異常に増加することを抑制するものであってもよい。また、中性脂肪、コレステロール、ＧＯＴ、ＧＰＴの濃度を調節したり異常に増加することを抑制するものであってもよく、肝細胞の脂肪滴（ｆａｔ ｄｒｏｐｌｅｔ）生成、肝の線維化およびα－ＳＭＡの発現を抑制するものであってもよい。しかし、予防および治療効果がこれに限定されるものではない。

【0031】

本発明の他の態様は、フィーカリバクテリウムプラウスニッツィイ（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）ＥＢ－ＦＰＤＫ９、前記フィーカリバクテリウムプラウスニッツィイ（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）ＥＢ－ＦＰＤＫ９菌株の培養液、破砕物または抽出物からなる群より１つ以上を含む代謝性疾患の予防または治療用薬学的組成物を提供する。

【0032】

前記代謝性疾患は、高脂血症、糖尿病、痛風、痴呆、肥満、高血圧、低血糖、高コレステロール血症、血色素症、アミロイド症、ポルフィリン症であってもよく、前記糖尿病は、第１型糖尿病および第２型糖尿病を含むことができる。好ましくは、肥満であってもよいが、これに限定されるものではない。

【0033】

本発明で使用される前記薬学的組成物は、薬学的に有効な量でなければならない。本発明で使われる用語、「薬学的に有効な量」は、医学的治療に適用可能な合理的なベネフィット／リスクの比率で疾患を治療するのに十分な量を意味し、有効用量レベルは、個体の種類および重症度、年齢、性別、感染したウイルスの種類、薬物の活性、薬物に対する敏感度、投与時間、投与経路および排出比率、治療期間、同時使用される薬物を含む要素およびその他の医学分野にてよく知られた要素によって決定可能である。有効量は、当業者に認識されているように、処理の経路、賦形剤の使用および他の薬剤と共に使用できる可能性によって変化可能である。

【0034】

本発明の薬学的組成物は、哺乳動物に投与された後、活性成分の迅速、遅速または遅延された放出を提供できるように当業界にてよく知られた方法を用いて薬学的剤形に製造できる。剤形の製造において、活性成分を担体と共に混合または希釈するか、容器形態の担体内に封入させることが好ましい。

【0035】

したがって、本発明の薬学的組成物は、方法によって、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン、シロップ、エアロゾルなどの経口型剤形、外用剤およびパッチの形態に剤形化して使用可能であり、組成物の製造に通常使用する適切な担体、賦形剤または希釈剤を追加的に含むことができる。

【0036】

例えば、本発明の薬学的組成物に含まれる担体、賦形剤および希釈剤としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、デンプン、アカシアガム、アルギネート、ゼラチン、カルシウムホスフェート、カルシウムシリケート、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、マグネシウムステアレートおよび鉱物油が挙げられる。製剤化する場合には、通常使用する充填剤、重量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤などの希釈剤または賦形剤を用いて調製可能である。

【0037】

本発明のさらに他の態様は、フィーカリバクテリウムプラウスニッツィイ（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）ＥＢ－ＦＰＤＫ９、前記フィーカリバクテリウムプラウスニッツィイ（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）ＥＢ－ＦＰＤＫ９菌株の培養液、破砕物または抽出物からなる群より１つ以上を含む炎症性疾患の予防または改善用食品組成物を提供する。

【0038】

本発明の他の態様は、フィーカリバクテリウムプラウスニッツィイ（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）ＥＢ－ＦＰＤＫ９、前記フィーカリバクテリウムプラウスニッツィイ（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）ＥＢ－ＦＰＤＫ９菌株の培養液、破砕物または抽出物からなる群より１つ以上を含む肝疾患の予防または改善用食品組成物を提供する。

【0039】

本発明のさらに他の態様は、フィーカリバクテリウムプラウスニッツィイ（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）ＥＢ－ＦＰＤＫ９、前記フィーカリバクテリウムプラウスニッツィイ（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）ＥＢ－ＦＰＤＫ９菌株の培養液、破砕物または抽出物からなる群より１つ以上を含む代謝性疾患の予防または改善用食品組成物を提供する。

【0040】

本発明において、前記食品組成物は、丸剤、粉末、顆粒、浸剤、錠剤、カプセルまたは液剤などの形態を含み、本発明の組成物を添加できる食品としては、例えば、各種食品類、例えば、飲料、ガム、お茶、ビタミン複合剤、健康補助食品類などがある。

【0041】

本発明の食品組成物で含み得る必須成分として、前記フィーカリバクテリウムプラウスニッツィイ（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）ＥＢ－ＦＰＤＫ９、前記フィーカリバクテリウムプラウスニッツィイ（Ｆ．ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）ＥＢ－ＦＰＤＫ９菌株の培養液、破砕物または抽出物を含む食品組成物またはその有効成分、またはその生理学的に許容可能な塩を含むほかは他の成分には特に限定がなく、通常の食品のような、様々な生薬抽出物、食品補助添加剤または天然炭水化物などを追加成分として含むことができる。

【0042】

また、前述したように、食品補助添加剤を追加的に含むことができる。食品補助添加剤は、当業界にて通常の食品補助添加剤、例えば、香味剤、風味剤、着色剤、充填剤、安定化剤などを含むことができる。

【0043】

前記天然炭水化物は、例えば、ブドウ糖、果糖のようなモノサッカライド、マルトース、スクロースのようなジサッカライド、デキストリン、シクロデキストリンのようなポリサッカライドを含むことができ、キシリトール、ソルビトール、エリスリトールのような糖アルコールを含むことができる。上述のほか、香味剤として、天然香味剤（例えば、レバウジオシドＡ、グリチルリチンなど）または合成香味剤（サッカリン、アスパルテームなど）を適宜使用可能である。

【0044】

上記のほか、本発明の食品組成物は、様々な営養剤、ビタミン、鉱物（電解質）、合成風味剤および天然風味剤などの風味剤、着色剤および充填剤（チーズ、チョコレートなど）、ペクチン酸およびその塩、アルギン酸およびその塩、有機酸、保護性コロイド増粘剤、ｐＨ調整剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料に使用される炭酸化剤などを含むことができる。その他、天然フルーツジュースおよびフルーツジュース飲料および野菜飲料の製造のための果肉を含むことができる。このような成分は、独立にまたは組み合わせて使用可能である。

【0045】

本発明の一具体例によれば、前記食品組成物は、健康機能食品の形態に製造できる。本明細書において、用語、「健康機能食品（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｆｏｏｄ）」は、特定保健用食品（ｆｏｏｄ ｆｏｒ ｓｐｅｃｉａｌ ｈｅａｌｔｈ ｕｓｅ、ＦｏＳＨＵ）と同じ用語で、栄養供給以外にも生体調節機能が効率的に現れるように加工された医学、医療効果が高い食品を意味する。前記機能（性）食品とは、人体の構造および機能に対して栄養素を調節したり、生理学的作用などのような保健用途に有用な効果を得るものを意味する。本発明の食品は、当業界にて通常使用される方法により製造可能であり、前記製造時には、当業界にて通常添加する原料および成分を添加して製造することができる。また、前記食品の剤形も、食品と認められる剤形であれば制限なく製造可能である。本発明の食品組成物は、多様な形態の剤形に製造され、一般の薬品とは異なり、食品を原料とすることで薬品の長期服用時に発生しうる副作用などがないというメリットがあり、携帯性に優れ、本発明の食品組成物は、炎症性疾患、肝疾患または代謝性疾患の予防または改善の効果を増進させるための補助剤として摂取可能である。

【0046】

本発明の一具体例によれば、前記食品組成物は、プロバイオティクス製剤の形態に製造できる。

【0047】

前記プロバイオティクス製剤は、当業界にて公知の方法により多様な剤形と方法で製造および投与可能である。例えば、本発明のフィーカリバクテリウムプラウスニッツィイＥＢ－ＦＰＤＫ１１菌株、その培養液、前記培養液の濃縮液または乾燥物は、薬剤学的分野にて通常使用される担体と混合して、散剤（ｐｏｗｄｅｒ）、液剤（ｌｉｑｕｉｄｓ ａｎｄ ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）、錠剤（ｔａｂｌｅｔ）、カプセル（ｃａｐｓｕｌｅ）、シロップ（ｓｙｒｕｐ）、懸濁剤（ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ）または顆粒剤（ｇｒａｎｕｌｅ）などの形態に製造されて投与可能である。前記担体としては、例えば、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、賦形剤、可溶化剤、分散剤、安定化剤、懸濁化剤、色素および香料などであってもよいが、これに限定されない。また、投与用量は、体内での活性成分の吸収度、不活性率、排泄速度、被投与者の年齢、性別、体重、状態および疾病の重症程度などによって適宜選択可能である。

【実施例】

【0048】

以下、一つ以上の具体例を実施例を通じてより詳細に説明する。しかし、これらの実施例は一つ以上の具体例を例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されるものではない。

【0049】

実施例１：フィーカリバクテリウムプラウスニッツィイ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）ＥＢ－ＦＰＤＫ９菌株の分離および同定
１．１．フィーカリバクテリウムプラウスニッツィイ試料の確保および分離
健康な韓国人（女性、９歳、ＢＭＩ１５．５）の糞便からフィーカリバクテリウムプラウスニッツィイを分離するために、Ｍａｒｔｉｎの方法により、ＹＢＨＩ培地［Ｂｒａｉｎ－ｈｅａｒｔ ｉｎｆｕｓｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄ ｗｉｔｈ ０．５％ｗ／ｖ ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ（Ｄｉｆｃｏ）、０．１％ｗ／ｖ Ｄ－ｃｅｌｌｏｂｉｏｓｅ、０．１％ｗ／ｖ Ｄ－ｍａｌｔｏｓｅ］を用いて培養した後、ＥＯＳ（Ｅｘｔｒｅｍｅｌｙ Ｏｘｙｇｅｎ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）菌種を選別した後に分離した。

【0050】

１．２．顕微鏡観察
分離された菌株がフィーカリバクテリウムプラウスニッツィイ菌株であるか否かを確認するために、分離された菌株を顕微鏡で観察した。その結果、図１に示された標準菌株であるフィーカリバクテリウムプラウスニッツィイＤＳＭ １７６７７^Ｔ菌株であるＡとフィーカリバクテリウムプラウスニッツィイＥＢ－ＦＰＤＫ９菌株を１０００倍の倍率で拡大したＢとも、形状が棒状細胞で真っ直ぐなまたは曲がっている形態で類似の形態を示すことを確認した。

【0051】

１．３．ＰＣＲ分析
フィーカリバクテリウムプラウスニッツィイ菌株であるか否かを確認するために、分離された菌株を下記表１のＦＰ－特異性プライマー（配列番号２、配列番号３）を用いてＰＣＲ分析を実施した。その結果、図２のように、陽性対照群菌株であるフィーカリバクテリウムプラウスニッツィイＤＳＭ １７６７７^Ｔと類似のバンドで結果値が出たことを確認することができた。

【0052】

【表1】

【0053】

１．４．Ｒａｎｄｏｍ Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）分析
前記のように分離された菌株がすでに報告された同種の標準菌株と比較して異なるか否かを確認するために、分子タイピングの一種であるＲＡＰＤ（Ｒａｎｄｏｍ Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ＤＮＡ）分析を実施した。このために、菌体から抽出したｇＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ）を対象に下記表２のｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｐｒｉｍｅｒ（配列番号４～６）を用いてＤＮＡを増幅した後、１％アガロースゲルで９０分間電気泳動し、図３のように、ＵＶ ｔｒａｎｓｉｌｌｕｍｉｎａｔｏｒを用いてＤＮＡ分節パターンを比較した。

【0054】

【表2】

【0055】

ＤＮＡ分節パターンの比較結果、図３から確認したように、フィーカリバクテリウムプラウスニッツィイ標準菌株ＤＳＭ １７６７７^Ｔと一部類似しているものの、異なるパターンであることを確認することができた。したがって、分離された菌株がすでに報告された同種の標準菌株フィーカリバクテリウムプラウスニッツィイＤＳＭ １７６７７^Ｔと種は同じであるものの、異なる菌株であることを確認した。

【0056】

１．５．１６Ｓ ｒＲＮＡ ＢＬＡＳＴ
分離された菌株がフィーカリバクテリウムプラウスニッツィイ菌株であるか否かを確認するために、１６Ｓ ｒＲＮＡ塩基配列を分析した後、ＢＬＡＳＴして確認した結果、フィーカリバクテリウムプラウスニッツィイ種と９９％以上一致しており、このような結果に基づいて分離された菌株をフィーカリバクテリウムプラウスニッツィイＥＢ－ＦＰＤＫ９菌株と名付け、韓国微生物保存センター（ＫＣＣＭ）に寄託して受託番号ＫＣＣＭ１２６２０Ｐを受けた。

【0057】

１．６．１６ｓ ｒＲＮＡ塩基配列を用いた系統樹（ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒｅｅ）分析
前記菌株の同定結果、現在知られている菌株に対して類似の菌株は存在するものの、正確に一致する結果は得られず、系統樹分析を行った。分離されたフィーカリバクテリウムプラウスニッツィイＥＢ－ＦＰＤＫ９菌株の全長１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列分析のために、下記表３の２７Ｆ（配列番号７）および１４９２Ｒ（配列番号８）プライマーを用いて１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を増幅した後、３７３０ｘｌ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）を用いて塩基配列を決定した。このように得たＥＢ－ＦＰＤＫ９菌株および標準菌株を含めてすでに公表された同種の他の菌株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を用いて、Ｍａｘｉｍｕｍ Ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ ｍｅｔｈｏｄにより図４のような系統樹を作成した。

【0058】

【表3】

【0059】

実施例２：フィーカリバクテリウムプラウスニッツィイＥＢ－ＦＰＤＫ９菌株の特性分析
２．１．抗菌剤感受性の確認
フィーカリバクテリウムプラウスニッツィイＥＢ－ＦＰＤＫ９菌株の抗菌剤感受性を把握するために、Ｃｌｉｎｉｃａｌ＆Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＣＬＳＩ）ガイドラインの液体培地微量希釈法によって嫌気性菌用抗菌剤（ｐｉｐｅｒａｃｉｌｌｉｎ－ｔａｚｏｂａｃｔａｍ、ｃｅｆｔｉｚｏｘｉｍｅ、ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ、ｃｌｉｎｄａｍｙｃｉｎ、ｍｅｒｏｐｅｎｅｍ、ｍｏｘｉｆｌｏｘａｃｉｎ、ｍｅｔｒｏｎｉｄａｚｏｌｅ、ｃｉｐｒｏｆｌｏｘａｃｉｎ）に対する最小阻害濃度（ｍｉｎｉｍｕｍ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ、ＭＩＣ）を確認した。

【0060】

【表4】

【0061】

確認結果、前記表４から分かるように、本発明のフィーカリバクテリウムプラウスニッツィイＥＢ－ＦＰＤＫ９菌株は、セフチゾキシム（ＣＴＺ）、クロラムフェニコール（ＣＨＬ）、メロペネム（ＭＥＭ）とフルオロキノロン系の抗生剤であるモキシフロキサシン（ＭＸＦ）とシプロフロキサシン（ＣＩＰ）に耐性を示し、ピペラシリン・タゾバクタム（ＰＴＺ）、クリンダマイシン（ＣＬＩ）とメトロニダゾール（ＭＴＺ）には感受性を示した。標準菌株（ＤＳＭ １７６７７^Ｔ）と比較すれば、ピペラシリン・タゾバクタム（ＰＴＺ）抗生剤において大きな差を示した。

【0062】

２．２．溶血活性（ｈｅｍｏｌｙｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ）の確認
フィーカリバクテリウムプラウスニッツィイＥＢ－ＦＰＤＫ９菌株の安全性検証のために、溶血活性を保有するか否かを評価した。このために、ＹＢＨＩ培地［Ｂｒａｉｎ－ｈｅａｒｔ ｉｎｆｕｓｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄ ｗｉｔｈ ０．５％ｗ／ｖ ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ（Ｄｉｆｃｏ）、０．１％ｗ／ｖ Ｄ－ｃｅｌｌｏｂｉｏｓｅ、０．１％ｗ／ｖ Ｄ－ｍａｌｔｏｓｅ］に１．５％ｗ／ｖ ｂａｃｔｏ－ａｇａｒと５％ｗ／ｖ ｄｅｆｂｒｉｎａｔｅｄ ｓｈｅｅｐ ｂｌｏｏｄを添加して製造した血液寒天培地を用いて菌株を培養した後、コロニー周辺の溶血現象の有無を観察した。陽性対照群としてβ－ｈｅｍｏｌｙｓｉｓを起こすＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ ＡＴＣＣ １９６１５と比較した。

【0063】

その結果、図５に示されるように、本発明のフィーカリバクテリウムプラウスニッツィイＥＢ－ＦＰＤＫ９菌株と標準菌株ＤＳＭ １７６７７^Ｔはいずれも、コロニー周辺が透明になる部分がなくて、病原性に関係するβ－ｈｅｍｏｌｙｓｉｓを起こさないことを確認した。

【0064】

２．３．機能性代謝物（短鎖脂肪酸）分析
分離されたフィーカリバクテリウムプラウスニッツィイＥＢ－ＦＰＤＫ９菌株の機能性代謝物確認のために、培養液に含有された短鎖脂肪酸（ＳＣＦＡ、ｓｈｏｒｔ ｃｈａｉｎ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄｓ）の含有量をガスクロマトグラフィーで分析した。このために、ＹＢＨＩ培地［Ｂｒａｉｎ－ｈｅａｒｔ ｉｎｆｕｓｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄ ｗｉｔｈ ０．５％ｗ／ｖ ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ（Ｄｉｆｃｏ）、０．１％ｗ／ｖ Ｄ－ｃｅｌｌｏｂｉｏｓｅ、０．１％ｗ／ｖ Ｄ－ｍａｌｔｏｓｅ］に菌株を２４時間培養した後、１２，０００×ｇで５分間遠心分離して上澄液を回収し、上澄液は０．２μｍのシリンジフィルタを用いた濾過した後、分析に使用した。ＦＦＡＰ ｃｏｌｕｍｎ（３０ｍ×０．３２０ｍｍ、０．２５μｍ ｐｈａｓｅ）が装着されたガスクロマトグラフィー（Ａｇｉｌｅｎｔ ７８９０Ｎ）を用いており、条件は表５のように設定した。

【0065】

【表5】

【0066】

機能性短鎖脂肪酸を分析した結果、図６のグラフから確認されるように、フィーカリバクテリウムプラウスニッツィイＥＢ－ＦＰＤＫ９菌株は、アセテートを消費し、ブチレートを生成することを確認した。

【0067】

実施例３：フィーカリバクテリウムプラウスニッツィイＥＢ－ＦＰＤＫ９菌株の抗炎症効能の確認
３．１．ＨＴ－２９腸上皮細胞における抗炎症効能評価
炎症性腸疾患において炎症反応調節にサイトカインが関与するので、フィーカリバクテリウムプラウスニッツィイＥＢ－ＦＰＤＫ９菌株を投与してサイトカインの遺伝子発現の変化を確認した。試験管実験で抗炎症効能評価実験をするために、ヒト由来大腸上皮細胞であるＨＴ－２９細胞（ＡＴＣＣ○Ｒ ＨＴＢ－３８^ＴＭ、ＵＳＡ）を培養した。１０％ＦＢＳ（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ、Ｈｙｃｌｏｎｅ、ＵＳＡ）、１０μｇ／ｍｌのゲンタマイシンを添加したＭｃＣｏｙ’ｓ ５Ａ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｍｅｄｉａ（Ｇｉｂｃｏ、ＵＳＡ）を基本培養培地として用いて、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベータ（ＮＵＡＩＲＥ、ＵＳＡ）で培養した。フィーカリバクテリウムプラウスニッツィイＥＢ－ＦＰＤＫ９菌株がＨＴ－２９細胞においてＬＰＳで誘導された炎症性サイトカインであるＩＬ－８遺伝子の発現を抑制するかを確認するために、下記表６のプライマー（配列番号９～１２）を用いてリアルタイムＰＣＲを進行させた。

【0068】

【表6】

【0069】

ＴＲＩ試薬（Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）を用いて全ＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡ合成のために、１μｇのＲＮＡをＭ－ＭＬＶ ｃＤＮＡ合成キット（Ｅｎｚｙｎｏｍｉｃｓ、Ｋｏｒｅａ）でｃＤＮＡを抽出した。リアルタイムＰＣＲはＱｕａｎｔ Ｓｔｕｄｉｏ ３ ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＵＳＡ）を用いて行った。

【0070】

炎症性サイトカインの遺伝子発現はＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＴＯＰｒｅａｌＴＭ ｑＰＣＲ ２Ｘ ＰｒｅＭＩＸ（Ｅｎｚｙｎｏｍｉｃｓ、Ｋｏｒｅａ）を用い、ｉｎｔｅｒｎａｌ ｓｔａｎｄａｒｄとしてはＧＡＰＤＨを使用した。ＰＣＲの条件は、ｐｒｅ－ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎは５０℃で４分、９５℃で１０分、そして４０サイクルは９５℃で１５秒、６０℃で１分間行った。データはＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ Ｄｅｓｉｇｎ＆Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖ１．４．３に内蔵されているプログラムを用いてｄｅｌｔａ ＣＴ方法で分析した。

【0071】

すべての実験で得られた結果は、統計プログラムＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ７（ＧｒａｐｈＰａｄ ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ、ＵＳＡ）を用いて各実験群の平均と標準偏差で計算され、各群間の差はｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ、Ｔｕｋｅｙ’ｓ ｔｅｓｔを用い、ｐ値が０．０５以下の場合に有意性があると判定した。一部の結果ではＡＵＣ（ａｒｅａ ｕｎｄｅｒ ｃｕｒｖｅ）を計算した。

【0072】

その結果、図７に示すように、ＨＴ－２９細胞にＬＰＳ（１００μｇ／ｍｌ）を６時間単独処理した時、代表的な炎症サイトカインであるＩＬ－８の発現が正常群に比べて著しく増加した。これに対し、ＬＰＳを処理した群に比べて、ＬＰＳとフィーカリバクテリウムプラウスニッツィイＡ２－１６５標準菌株の培養液（１０％、ｖ／ｖ）を一緒に処理した群では、ＩＬ－８の発現が減少し、フィーカリバクテリウムプラウスニッツィイＥＢ－ＦＰＤＫ９菌株培養液を一緒に処理した群では、ＬＰＳとＡ２－１６５標準菌株処理群に比べてＩＬ－８の発現を有意にさらに減少させるという結果が出た。したがって、フィーカリバクテリウムプラウスニッツィイＥＢ－ＦＰＤＫ９菌株培養液は炎症性サイトカインＩＬ－８を著しく減少させることを確認した。

【0073】

３．２．マウス骨髄由来樹状細胞における抗炎症効能評価
抗炎症反応を観察するために樹状細胞（Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ、ＤＣ）のサイトカインの分泌を確認した。マウス骨髄由来樹状細胞（ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｄｅｒｉｖｅｄ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ、ＢＭＤＣ）を用いて菌株の抗炎症効能を評価するために、ＢＭＤＣ細胞を分離した。０．５ｍｌのマイクロチューブに１８Ｇニードルを用いて穴を開けた後、６週齢Ｃ５７ＢＬ／６マウスの大腿骨と硬骨を分離して１．５ｍｌの沈殿管に入れた後、１０，０００×ｇに１５秒間遠心分離をした。ＰＢＳを用いて１．５ｍｌの沈殿管に入ったペレットを３回洗浄した後、ペレットにＲＰＭＩ－１６４０（１０％ＦＢＳ、１％Ｐ／Ｓ、ｍｅｄｉａ、１Ｘ ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ、２０μｇ ＧＭ－ＣＳＦ）培地を入れて、１５０ｍｍの培養皿に培養した。翌日に１００ｍｌのペトリ皿にＢＭＤＣを移して培養をし、５日目になる日に培養液１０ｍｌを１５ｍｌのコニカルチューブ（ｃｏｎｉｃａｌ ｔｕｂｅ）に移して入れた後、１，０００×ｇに１５分間遠心分離して、上澄液を除去し、ＢＭＤＣ ｍｅｄｉａ１０ｍｌを添加してペトリ皿に入れた。６～７日目にＢＭＤＣを実験に使用した。フィーカリバクテリウムプラウスニッツィイＥＢ－ＦＰＤＫ９菌株の抗炎症効能分析のために、代表的な抗炎症サイトカインであるインターロイキン－１０（ＩＬ－１０）の分泌をｍＩＬ－１０ ＥＬＩＳＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）で分析した。

【0074】

ＢＭＤＣ細胞にＬＰＳ（１００μｇ／ｍｌ）、Ｅ．ｃｏｌｉ、フィーカリバクテリウムプラウスニッツィイＡ２－１６５標準菌株、ＥＢ－ＦＰＤＫ９菌株を（１０^７ｃｆｕ／ｍｌ、１０％ｖ／ｖ）１時間抗生物質のない培地に処理した後、ペニシリン／ストレプトマイシン抗生剤を入れた培地に切り替えた後、２４時間培養し、培地を１，０００×ｇ遠心分離して、上澄液を用いてＩＬ－１０の分泌をＥＬＩＳＡで測定した。

【0075】

図８のように、ＬＰＳとＥ．ｃｏｌｉを処理した時は、ＩＬ－１０の分泌が正常群と差なく類似のレベルを示した。これに対し、フィーカリバクテリウムプラウスニッツィイＡ２－１６５標準菌株を処理した群は、正常群に比べてＩＬ－１０の分泌量が著しく増加した。フィーカリバクテリウムプラウスニッツィイＥＢ－ＦＰＤＫ９菌株処理群では、Ａ２－１６５標準菌株処理群に比べてＩＬ－１０の発現が有意なレベルにさらに増加した。したがって、フィーカリバクテリウムプラウスニッツィイ菌株が抗炎症サイトカインＩＬ－１０を増加させることと、フィーカリバクテリウムプラウスニッツィイＥＢ－ＦＰＤＫ９菌株がさらに著しく増加させることを確認した。

【0076】

実施例４：脂肪蓄積抑制効果の確認
脂肪蓄積と肥満関連バイオマーカーの発現が本発明の菌株の投与によって影響を受けるか否かを調べた。

【0077】

４．１．脂肪分化細胞を用いたＯｉｌ Ｒｅｄ－Ｏ染色
３Ｔ３－Ｌ１細胞において脂肪細胞の分化および脂肪の生成に本発明のフィーカリバクテリウムプラウスニッツィイＥＢ－ＦＰＤＫ９菌株が及ぼす影響を調べるために、Ｏｉｌ Ｒｅｄ－Ｏ（ＯＲＯ）染色実験を行った。まず、３Ｔ３－Ｌ１脂肪前駆細胞を脂肪細胞に分化させるために、２４ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに２×１０^４／ｗｅｌｌの細胞を分注した。１０％ＢＳを含むＤＭＥＭ培地で４日間培養した後、細胞がプレートで飽和状態になると、分化用培地［ＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、０．５ｍＭ ＩＢＭＸ（３－ｉｓｏｂｕｔｙｌ－１－ｍｅｔｈｙｌｘａｎｔｈｉｎｅ、Ｓｉｇｍａ Ｉ５８７９）、１μＭデキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ Ｄ４９０２、ＦＷ３９２．５）、１０ｍｇ／ｍｌ ｉｎｓｕｌｉｎ］に切り替え、試料（フィーカリバクテリウムプラウスニッツィイの菌株または培養液）５０μｌ（１×１０^７／ｗｅｌｌ）を処理した後、３７℃、５％ＣＯ_２条件で２日間培養した。以後、インスリン培地（１０％ＦＢＳ、１０ｍｇ／ｍｌ ｉｎｓｕｌｉｎ）に２日ごとに切り替えて、８日間同じ条件で培養した。フィーカリバクテリウムプラウスニッツィイの菌株と培養液を培地を切り替えるたびに同時に処理した。菌株と菌株培養液（１０^７ｃｆｕ／ｍｌ）は１０％ｖ／ｖで細胞に処理した。

【0078】

Ｏｉｌ Ｒｅｄ－Ｏ染色法は、分化された３Ｔ３－Ｌ１細胞にＯｉｌ Ｒｅｄ－Ｏ試薬で染色して細胞内生成された脂肪を測定する方法である。マウス脂肪前駆細胞である３Ｔ３－Ｌ１細胞（韓国細胞株銀行、ＫＯＲＥＡ）を培養した。１０％ＦＢＳ（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ、Ｈｙｃｌｏｎｅ、ＵＳＡ）、１％ペニシリン／ストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ、Ｗｅｌｇｅｎｅ、ＫＯＲＥＡ）を基本培養培地として用いて、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベータ（ＮＵＡＩＲＥ、ＵＳＡ）で培養した。フィーカリバクテリウムプラウスニッツィイＥＢ－ＦＰＤＫ９菌株が脂肪細胞である３Ｔ３－Ｌ１でインスリン（１μｇ／ｍｌ）、ＩＢＭＸ（０．５ｍＭ）、デキサメタゾン（１μＭ）で１０日間脂肪分化を誘導した後、培養液をＰＢＳで３回洗浄して培養液を除去し、１０％ホルマリン（Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）を添加してＯｉｌ Ｒｅｄ－Ｏ（Ｏｉｌ ｒｅｄ Ｏ、Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）溶液を細胞と１時間反応させ、蒸留水で洗浄して脂肪球を染色した。

【0079】

細胞染色が終わった後、４０％イソプロパノール（Ｄｕｋｓａｎ、ＫＯＲＥＡ）で３回洗浄後に乾燥して、細胞内脂肪の大きさを光学顕微鏡で観察した。イソプロパノールを添加してＯｉｌ Ｒｅｄ－Ｏ溶液で染色された脂肪球試料を溶かし、Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（Ｅｐｏｃｈ、ＢｉｏＴｅｋ、ＵＳＡ）を用いて５００ｎｍでの吸光度を測定して、その結果を測定した。

【0080】

実験結果、図９に示されるように、３Ｔ３－Ｌ１細胞の分化過程中に本発明のフィーカリバクテリウムプラウスニッツィイＡ２－１６５標準菌株を処理した結果、対照群に比べて脂肪蓄積を抑制させた。フィーカリバクテリウムプラウスニッツィイＥＢ－ＦＰＤＫ９菌株を処理した時、フィーカリバクテリウムプラウスニッツィイＡ２－１６５標準菌株処理群に比べてさらに脂肪蓄積を抑制させた。

【0081】

図１０においても同様に、３Ｔ３－Ｌ１細胞の分化過程中にフィーカリバクテリウムプラウスニッツィイＡ２－１６５標準菌株の培養液を処理した結果、対照群に比べて著しく脂肪蓄積を抑制させた。フィーカリバクテリウムプラウスニッツィイＥＢ－ＦＰＤＫ９菌株の培養液を処理した時、フィーカリバクテリウムプラウスニッツィイＡ２－１６５標準菌株培養液処理群に比べてさらに脂肪蓄積を抑制させた。

【0082】

フィーカリバクテリウムプラウスニッツィイＡ２－１６５標準菌株および培養液よりフィーカリバクテリウムプラウスニッツィイＥＢ－ＦＰＤＫ９菌株および培養液が３Ｔ３－Ｌ１細胞の脂肪分化抑制に効果がさらに優れていることを確認した。

【0083】

４．２．バイオマーカーの遺伝子発現に対する効能評価
菌株の脂肪細胞分化抑制に対する効果を確認するために、下記表７に記載の遺伝子特異的プライマー（配列番号１３～２６）を用いてリアルタイムＰＣＲを進行させて、脂肪細胞への分化段階で脂肪細胞の分化と成熟に関与する転写因子であるＣ／ＥＢＰα（ＣＣＡＡＴ／ｅｎｈａｎｃｅｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｌｐｈａ）、ＳＲＥＢＰ１ｃ（Ｓｔｅｒｏｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｅｌｅｍｅｎｔ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ １ｃ）と脂肪合成遺伝子ａＰ２（ａｄｉｐｏｃｙｔｅ ｐｒｏｔｅｉｎ２）、ＦＡＳ（ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｓｙｎｔｈａｓｅ）、ＡＣＣ１（ａｃｅｔｙｌ－ｃｏｅｎｚｙｍｅ Ａ－ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ）、ＬＰＬ（ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ ｌｉｐａｓｅ）遺伝子のｍＲＮＡ発現を分析した。

【0084】

【表7】

【0085】

具体的には、全ＲＮＡは製造会社の指針に従い、ＴＲＩ試薬（Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）を用いて細胞の単層から抽出し、ｃＤＮＡはＭ－ＭＬＶ ｃＤＮＡ合成キット（Ｅｎｚｙｎｏｍｉｃｓ、Ｋｏｒｅａ）を用いて、全ＲＮＡ１μｇから合成した。ＰＣＲ反応はＱｕａｎｔ Ｓｔｕｄｉｏ ３ ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＵＳＡ）を用いて行った。ＰＣＲの条件は、ｐｒｅ－ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎは５０℃で４分、９５℃で１０分、そして４０サイクルは９５℃で１５秒、６０℃で１分間行った。データはＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ Ｄｅｓｉｇｎ＆Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖ１．４．３に内蔵されているプログラムを用いてｄｅｌｔａ ＣＴ方法で分析した。

【0086】

図１１のように、脂肪分化誘導後、脂肪細胞の分化に関与する遺伝子であるＣ／ＥＢＰα、ＳＲＥＢＰ１ｃ、ａＰ２、ＦＡＳ、ＡＣＣ１、ＬＰＬの増加した発現を１００％に数値化した時、フィーカリバクテリウムプラウスニッツィイＡ２－１６５標準菌株の培養液を一緒に処理した群からＣ／ＥＢＰα、ａＰ２、ＦＡＳ、ＡＣＣ１、ＬＰＬの発現が、フィーカリバクテリウムプラウスニッツィイＥＢ－ＦＰＤＫ９菌株の培養液を一緒に処理した群からＣ／ＥＢＰα、ＳＲＥＢＰ１ｃ、ａＰ２、ＦＡＳ、ＡＣＣ１、ＬＰＬの発現が著しく減少した。ＳＲＥＢＰ１ｃの場合、フィーカリバクテリウムプラウスニッツィイＥＢ－ＦＰＤＫ９菌株の培養液を与えた時のみ対照群に比べて発現が減少し、フィーカリバクテリウムプラウスニッツィイＥＢ－ＦＰＤＫ９菌株が全体的にフィーカリバクテリウムプラウスニッツィイＡ２－１６５標準菌株より発現がさらに減少した。フィーカリバクテリウムプラウスニッツィイＡ２－１６５標準菌株とフィーカリバクテリウムプラウスニッツィイＥＢ－ＦＰＤＫ９菌株はいずれも、３Ｔ３－Ｌ１細胞の脂肪分化関連遺伝子の発現抑制効果があることを確認した。

【0087】

実施例５：非アルコール性脂肪肝炎効果の確認
５．１．非アルコール性脂肪肝炎動物モデルの作製
動物実験はＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）のＡｎｉｍａｌ ｕｓｅ ａｎｄ Ｃａｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌを守って進行させた。実験動物は８週齢雄マウスＣ５７ＢＬ／６（グループあたり９匹）を購入して、１週間適応期間を持った後、１２週間飼育が行われ、飼育環境は一定の温度（２２℃）と相対湿度（４０～６０％）を維持し、１２時間の周期で明暗を調節しながら１週間適応させた。

【0088】

非アルコール性脂肪肝炎を誘導するために、実験食餌（ＮＡＳＨ）として１６週間高脂肪飼料（６０ｋｃａｌ％ｆａｔ；Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｅｔｓ Ｉｎｃ、ＮＪ、ＵＳＡ）と果糖（Ｆｒｕｃｔｏｓｅ）３０％を添加した飲用水で摂取させ、飲用水は自由に摂取させた。

【0089】

実験マウスをランダムに下記表８のように５つのグループに分けた。

【0090】

【表8】

【0091】

実験群ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖの場合には、実験食餌によって非アルコール性脂肪肝炎誘導８週後から、シリマリン（３０ｍｇ／ｋｇ）、フィーカリバクテリウムプラウスニッツィイ生菌を１×１０^８ＣＦＵ／１５０μｌ ＰＢＳ（２５％グリセロール、０．０５％システイン／ＰＢＳ）の濃度で毎日経口投与した。

【0092】

正常食餌群マウスには１０％ｆａｔ飼料を摂取させた。陽性対照群として非アルコール性脂肪肝の改善に役立てられる機能性原料として知られたシリマリンとフィーカリバクテリウムプラウスニッツィイＡ２－１６５標準菌株を投与した。この時、正常食餌群と実験食餌群は、投与によるストレスなどの影響を排除するために、これと同量のリン酸緩衝食塩水（２５％グリセロール、０．０５％システイン／ＰＢＳ）を毎日経口投与した。

【0093】

５．２．体重および餌摂取の変化
非アルコール性脂肪肝炎誘導実験を行って１６週後、実験群の体重の変化を測定して、その結果を図１２に示した。

【0094】

図１２を参照すれば、実験食餌で非アルコール性脂肪肝炎を誘導した全体グループ動物の体重は、正常食餌群に比べて体重が増加した。シリマリンとフィーカリバクテリウムプラウスニッツィイ菌株を投与した８週を起点として１６週までの体重増加を質量（ｇ）と百分率（％）で計算した時、シリマリンとＥＢ－ＦＰＤＫ９菌株投与群において非アルコール性脂肪肝炎誘導グループに比べてやや体重増加が少ないことが観察されたが、有意な減少を示すことは確認できなかった。体重増加の場合、その増加量がＥＢ－ＦＰＤＫ９投与グループにおいて百分率で計算した時、正常食餌群に比べて最も少なく増加したことが観察された。食物摂取量およびカロリーの場合、実験食餌で非アルコール性脂肪肝炎を誘導したグループの間では差が大きくなかった。

【0095】

５．３．耐糖能の変化（ＯＧＴＴ、ｏｒａｌ ｇｌｕｃｏｓｅ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｔｅｓｔ）
フィーカリバクテリウムプラウスニッツィイＥＢ－ＦＰＤＫ９菌株の投与が耐糖能に及ぼす効果を確認するために、実験を行って１６週後、マウスを１８時間絶食にした状態でブドウ糖（ｇｌｕｃｏｓｅ２ｇ／ｋｇ）を経口投与した。ブドウ糖の投与直前と投与後３０、６０、９０、および１２０分後に尾静脈から血液を採取して血糖を血糖測定器で測定して、その結果を図１３に示した。

【0096】

図１３によれば、ブドウ糖投与直前にフィーカリバクテリウムプラウスニッツィイＥＢ－ＦＰＤＫ９菌株を投与した群で投与群のうち血糖が最も減少した傾向を示した。ブドウ糖投与３０分後、すべての投与群で正常食餌群より血糖が増加するが、１２０分間の血糖曲線下面積（ＡＵＣ）を計算した結果、６０分、９０分、１２０分へと時間が経過するほど、シリマリン、フィーカリバクテリウムプラウスニッツィイＡ２－１６５標準菌株およびＥＢ－ＦＰＤＫ９菌株投与群において、非アルコール性脂肪肝炎誘導群に比べて有意に血糖が著しく減少した。このような研究結果により、フィーカリバクテリウムプラウスニッツィイＥＢ－ＦＰＤＫ９菌株の口腔投与が、非アルコール性脂肪肝炎の誘導で低くなった血糖調節能力を緩和させ、耐糖能を高められることを確認した。

【0097】

５．４．脂肪肝炎の観察および組織の重量の変化
実験終了時にＣＯ_２で痲酔した状態で肝と脾臓を摘出して生理食塩水で洗浄し、水分を除去した後、重量を測定し、それらの大きさと色を肉眼的に観察した。

【0098】

図１４を参照すれば、正常食餌群の肝組織の場合、鮮紅色の健康な肝の形態を示したのに対し、実験食餌で非アルコール性脂肪肝炎を誘導したグループの肝からは、脂肪蓄積によって色も濁り、本来の鮮紅色を失ったことが観察された。しかし、シリマリン、フィーカリバクテリウムプラウスニッツィイＡ２－１６５標準菌株とＥＢ－ＦＰＤＫ９菌株を投与したグループでは、正常食餌群に近い鮮紅色の肝形態を示した。肝の重量測定の場合、正常食餌群に比べて非アルコール性脂肪肝炎誘導グループとシリマリン投与グループで重量増加が観察された。しかし、フィーカリバクテリウムプラウスニッツィイＥＢ－ＦＰＤＫ９投与グループの肝組織の重量は、最も正常群と類似の数値を示し、非アルコール性脂肪肝炎誘導グループと比べた時、有意な重量差を示した。図１４を通して、フィーカリバクテリウムプラウスニッツィイＥＢ－ＦＰＤＫ９菌株投与グループが正常食餌群と類似の形態および重量を示すという点を確認した。したがって、フィーカリバクテリウムプラウスニッツィイＥＢ－ＦＰＤＫ９菌株が非アルコール性脂肪肝炎を緩和させることができるという結論を導出することができた。

【0099】

脾臓の場合、図１５に示されるように、長さと重量が正常食餌群に比べて非アルコール性脂肪肝炎誘導グループですべて増加した。肝組織と同様に、シリマリンとフィーカリバクテリウムプラウスニッツィイＡ２－１６５標準菌株を処理したグループの脾臓の長さも正常食餌群に比べて増加したが、フィーカリバクテリウムプラウスニッツィイＥＢ－ＦＰＤＫ９菌株を投与したグループでは、脾臓の長さの増加数値が有意性がないほど低いことが観察された。脾臓の重量は非アルコール性脂肪肝炎誘導群よりその数値が低いことを確認した。

【0100】

５．５．血中脂質の生化学的指標分析
１８時間絶食にした後、各実験動物から血液を採取した後、分離した血清（ｓｅｒｕｍ）で脂質含有量の指標である中性脂肪（ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ、ＴＧ）、総コレステロール（ｔｏｔａｌ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ、ＴＣ）、肝機能の指標であるＧＯＴ（ｇｌｕｔａｍｉｃ ｏｘａｌｏａｃｅｔｉｃ ｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ）、ＧＰＴ（ｇｌｕｔａｍｉｃ ｐｙｒｕｖｉｃ ｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ）を測定して、図１６に示した。脂質組成の指標であるＴＧ、ＴＣ、ＧＯＴ、ＧＰＴの濃度はいずれも、ＡＳＡＮ製薬から購入した個別測定キットを用いて定量した。

【0101】

中性脂肪の場合、非アルコール性脂肪肝炎誘導グループで有意に増加したことを確認した。しかし、シリマリンとフィーカリバクテリウムプラウスニッツィイＥＢ－ＦＰＤＫ９菌株を投与したグループでは、中性脂肪が有意に減少した。総コレステロールの場合、非アルコール性脂肪肝炎誘導グループとフィーカリバクテリウムプラウスニッツィイＡ２－１６５標準菌株処理グループでは、正常群に比べて高いレベルを示した。しかし、フィーカリバクテリウムプラウスニッツィイＥＢ－ＦＰＤＫ９菌株を処理した時、非アルコール性脂肪肝炎誘導グループとフィーカリバクテリウムプラウスニッツィイＡ２－１６５標準菌株を処理したグループに比べて総コレステロールのレベルが著しく減少したことを確認した。肝細胞の損傷程度を示すＧＯＴの濃度は非アルコール性脂肪肝炎誘導グループに比べてすべての投与グループで減少したことを観察し、ＧＰＴの濃度はシリマリンとフィーカリバクテリウムプラウスニッツィイＥＢ－ＦＰＤＫ９菌株投与グループでのみ有意に減少した。血中脂質の生化学的指標分析により非アルコール性脂肪肝炎と密接な関係がある中性脂肪、総コレステロール、ＧＯＴおよびＧＰＴの濃度がフィーカリバクテリウムプラウスニッツィイＥＢ－ＦＰＤＫ９菌株の投与によって減少することを確認した。

【0102】

５．６．肝組織内脂肪肝炎の病理学的深度分析
フィーカリバクテリウムプラウスニッツィイＥＢ－ＦＰＤＫ９菌株の投与が非アルコール性脂肪肝炎の緩和に及ぼす影響を観察するために、肝組織切断面でｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ＆ｅｏｓｉｎ染色と、肝線維化を測定可能なＳｉｒｉｕｓ ｒｅｄ染色、肝損傷時に発現するａｌｐｈａ－ｓｍｏｏｔｈ ｍｕｓｃｌｅ ａｃｔｉｎ（α－ＳＭＡ）の発現を染色して観察した。マウスから分離した肝組織を約５μｍに組織切片にした後、パラフィン包埋し、それぞれの染色により形態学的変化の差を観察した。それぞれの染色による肝損傷の程度はＩｍａｇｅ Ｊプログラムにより百分率（％）に換算して示した。

【0103】

図１７のように、マウスの肝組織をＨ＆Ｅ染色により組織分析した結果、正常群は肝細胞組織の緻密な正常形態で脂肪滴（ｆａｔ ｄｒｏｐｌｅｔ）がないことが観察された。しかし、非アルコール性脂肪肝炎を誘導したマウスの肝組織では、正常群に比べて脂肪滴の形成が多数明確に観察できた。脂肪滴の形成はすべての投与グループにおいて非アルコール性脂肪肝炎誘導グループに比べて減少したことを観察し、シリマリンとフィーカリバクテリウムプラウスニッツィイＥＢ－ＦＰＤＫ９菌株投与群でさらに減少したことを確認した。

【0104】

図１８のように、マウスの肝組織をＳｉｒｉｕｓ ｒｅｄ染色によりコラーゲン沈着量を分析した。肝のコラーゲン沈着量は線維化程度を反映する敏感な指標として知られている。本実験において、正常群に比べて非アルコール性脂肪肝炎誘導群、シリマリン投与群およびフィーカリバクテリウムプラウスニッツィイＡ２－１６５標準菌株投与群のすべてにおいて肝線維化が増加した。しかし、フィーカリバクテリウムプラウスニッツィイＥＢ－ＦＰＤＫ９菌株投与群では、非アルコール性脂肪肝炎とフィーカリバクテリウムプラウスニッツィイＡ２－１６５標準菌株投与群に比べてコラーゲンの生成が有意に抑制されて、肝の線維化による肝損傷が著しく抑制されたことを確認した。

【0105】

また、マウスの肝組織をα－ＳＭＡの発現染色により肝損傷の程度を観察した結果、図１９から確認するように、すべての投与グループにおいて非アルコール性脂肪肝炎誘導群に比べてα－ＳＭＡの発現が減少して肝損傷が抑制されたことが観察され、シリマリンとフィーカリバクテリウムプラウスニッツィイＥＢ－ＦＰＤＫ９菌株投与群の場合、フィーカリバクテリウムプラウスニッツィイＡ２－１６５標準菌株投与群に比べてα－ＳＭＡの発現がさらに有意に減少したことを観察した。

【0106】

５．７．肝組織内の中性脂肪および総コレステロール分析
マウスの肝組織内脂質抽出物により中性脂肪と総コレステロールを分析した。肝組織３０ｍｇにＰＢＳを１２０μｌ入れて、ホモゲナイザーを用いて粉砕後、Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ３２０μｌとＭｅＯＨ１６０μｌを入れて混合物を作った。前記混合物を常温で１日間シェイキングインキュベータで混合した後、２０００ｒｐｍで遠心分離し、上澄液のみ別途に分離して溶媒を蒸発させた。その後、前記溶媒を蒸発させた上澄液を１ｍｌのｉｓｏｐｒｏｐａｎｏｌで溶かした後、ＴＧ、ＴＣ測定キット（ＡＳＡＮ製薬、韓国）を用いてマウスの全体肝重量対比で換算して定量した。

【0107】

その結果、図２０のグラフのように、肝組織内の中性脂肪の場合、非アルコール性脂肪肝炎誘導グループで有意に増加したことを確認した。しかし、シリマリン、フィーカリバクテリウムプラウスニッツィイＡ２－１６５、フィーカリバクテリウムプラウスニッツィイＥＢ－ＦＰＤＫ９菌株を投与したグループでは中性脂肪が有意に減少した。肝組織内の総コレステロールの場合にも、非アルコール性脂肪肝炎誘導グループにおいて正常群に比べて高い数値を示した。しかし、シリマリン、フィーカリバクテリウムプラウスニッツィイＡ２－１６５、フィーカリバクテリウムプラウスニッツィイＥＢ－ＦＰＤＫ９菌株を投与した時、非アルコール性脂肪肝炎誘導群に比べて肝組織内の総コレステロールのレベルが著しく減少した。

【0108】

肝組織内の脂質蓄積の分析結果、シリマリンとともに、フィーカリバクテリウムプラウスニッツィイＥＢ－ＦＰＤＫ９菌株の摂取が中性脂肪とコレステロールの生成を最も多く抑制し、非アルコール性脂肪肝炎の改善効能があることを確認した。

【0109】

肝組織の分析結果、全体的にフィーカリバクテリウムプラウスニッツィイＥＢ－ＦＰＤＫ９菌株投与群において非アルコール性脂肪肝炎によって誘導された肝損傷と脂肪肝炎の進行が最も抑制されたことを確認した。
［寄託証］

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【配列表】

0007479521000001.app