知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-04-25
(45)【発行日】2024-05-08
(54)【発明の名称】インターロイキン－２２の治療用誘導体
(51)【国際特許分類】
C07K 14/54 20060101AFI20240426BHJP
C12P 21/02 20060101ALI20240426BHJP
A61K 38/20 20060101ALI20240426BHJP
A61K 9/72 20060101ALI20240426BHJP
A61P 3/00 20060101ALI20240426BHJP
A61P 1/16 20060101ALI20240426BHJP
A61P 11/00 20060101ALI20240426BHJP
A61P 1/00 20060101ALI20240426BHJP
A61P 13/12 20060101ALI20240426BHJP
A61P 17/00 20060101ALI20240426BHJP
A61P 3/10 20060101ALI20240426BHJP
A61P 3/06 20060101ALI20240426BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240426BHJP
A61P 11/16 20060101ALI20240426BHJP
A61P 31/12 20060101ALI20240426BHJP
A61P 31/04 20060101ALI20240426BHJP
A61P 31/10 20060101ALI20240426BHJP
A61P 1/04 20060101ALI20240426BHJP
A61P 37/06 20060101ALI20240426BHJP
A61P 17/02 20060101ALI20240426BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20240426BHJP
C12N 15/24 20060101ALN20240426BHJP
【ＦＩ】
C07K14/54 ZNA
C12P21/02 K
A61K38/20
A61K9/72
A61P3/00
A61P1/16
A61P11/00
A61P1/00
A61P13/12
A61P17/00
A61P3/10
A61P3/06
A61P43/00 105
A61P11/16
A61P31/12
A61P31/04
A61P31/10
A61P1/04
A61P37/06
A61P17/02
A61P29/00
C12N15/24
【請求項の数】
6
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2023064366
(22)【出願日】2023-04-11
(62)【分割の表示】P 2022526450の分割
【原出願日】2020-11-09
(65)【公開番号】P2023083380
(43)【公開日】2023-06-15
【審査請求日】2023-04-13
(31)【優先権主張番号】19207766.7
(32)【優先日】2019-11-07
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
【早期審査対象出願】
(73)【特許権者】
【識別番号】522179105
【氏名又は名称】サイトカイ・ファーマ・アーペーエス
(74)【代理人】
【識別番号】100108453
【弁理士】
【氏名又は名称】村山 靖彦
(74)【代理人】
【識別番号】100110364
【弁理士】
【氏名又は名称】実広 信哉
(74)【代理人】
【識別番号】100133400
【弁理士】
【氏名又は名称】阿部 達彦
(72)【発明者】
【氏名】クリスティアン・サス－ウルム
(72)【発明者】
【氏名】ラスムス・ヨルゲンセン
(72)【発明者】
【氏名】セバスティアン・ベック・ヨルゲンセン
(72)【発明者】
【氏名】ヘニング・トゥーヤスン
(72)【発明者】
【氏名】トマス・ホウ－イェンセン
(72)【発明者】
【氏名】ミカエル・パオロ・バストナー・サンドリニ
【審査官】坂崎 恵美子
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１４－５０１２６２（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１６－５３１１５６（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１８－５１１５７４（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１３－５３３２２７（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１６－５２２７９５（ＪＰ，Ａ）
【文献】ACS Medicinal Chemistry Letters，2018年，Vol.9，p.577-580
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ０７Ｋ １４／５４
Ａ６１Ｋ ３８／２０
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
構造：
【化1】
【請求項2】
構造：
【化2】
【請求項3】
療法において使用するための、請求項１もしくは２に記載の誘導体または請求項１もしくは２に記載の誘導体を含む薬学的組成物。
【請求項4】
代謝、肝臓、肺、腸、腎臓または皮膚の疾患、障害または状態の治療において使用するための、請求項１もしくは２に記載の誘導体または請求項１もしくは２に記載の誘導体を含む薬学的組成物。
【請求項5】
前記使用が、それを必要とする患者に、０．００１μｇ／ｋｇ体重～１０ｍｇ／ｋｇ体重の間の前記誘導体の１週用量を投与することを含む、請求項４に記載の誘導体または薬学的組成物。
【請求項6】
（ｉ）前記代謝の疾患、障害または状態は、肥満、１型糖尿病、２型糖尿病、脂質異常症、高血糖または高インスリン血症である；（ｉｉ）前記肝臓の疾患、障害または状態は、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、肝硬変、アルコール性肝炎、急性肝不全、慢性肝不全、慢性肝不全急性増悪（ＡＣＬＦ）、アセトアミノフェン誘導性肝臓毒性、急性肝臓傷害、硬化性胆管炎、胆汁性肝硬変または手術もしくは移植によって引き起こされる病理学的状態である；
（ｉｉｉ）前記肺の疾患、障害または状態は、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、嚢胞性線維症、気管支拡張症、特発性肺線維症、急性窮迫症候群、化学的傷害、ウイルス感染症、細菌感染症または真菌感染症である；
（ｉｖ）前記腸の疾患、障害または状態は、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、潰瘍性結腸炎、クローン病、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）、化学的傷害、ウイルス感染症または細菌感染症である；
（ｖ）前記腎臓の疾患、障害または状態は、急性腎臓疾患または慢性腎臓疾患である；又は
（ｖｉ）前記皮膚の疾患、障害または状態は、創傷、炎症性疾患またはＧｖＨＤである
請求項４または５に記載の誘導体または薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、インターロイキン－２２（ＩＬ－２２）の新規誘導体、及び特にＩＬ－２２タンパク質に共有結合した脂肪酸を含む誘導体に関する。本発明はまた、それらの生成ならびに代謝、肝臓、肺、腸、腎臓及び皮膚の疾患、障害及び病態の処置、予防及び改善を含む療法におけるそれらの使用のための方法を包含する。
【背景技術】
【0002】
ＩＬ－２２は、１７ＫＤａの分子量を有する１４６アミノ酸タンパク質である。それは、サイトカインのＩＬ－１０ファミリーに属し、遍在的に発現するＩＬ－１０受容体Ｂサブユニット（ＩＬ－１０ＲＡ２）及び上皮に限定した発現を有するＩＬ－２２受容体Ａサブユニット（ＩＬ－２２ＲＡ１）からなるヘテロ二量体受容体を選択的に活性化する。それは、免疫細胞から放出れるが、上皮細胞を選択的に標的とするという点でユニークなサイトカインである。よって、ＩＬ－２２によって誘導されるシグナル伝達経路は、種々の組織において関連性を有し得る（標的には皮膚、腸、肺、肝臓、腎臓、膵臓及び胸腺が含まれる）が、ＩＬ－２２は、上皮特異的にそれらを活性化する。可溶性結合タンパク質であるＩＬ－２２ＢＰはＩＬ－２２を中和し、それによりその作用を制御する。
【0003】
ＩＬ－２２は、化学的または機械的傷害を反映するシグナル、例えば、環境毒素またはトリプトファン中間体に反応するアリール炭化水素受容体活性化、及び死にゆく細胞または侵入病原体からのタンパク質、断片及びデブリに反応するトル様受容体４などのパターン認識受容体の活性化に対する反応として放出される。ＩＬ－２２放出は、所定のサイトカイン、特にＩＬ－２３及びより少ない程度であるがＩＬ１βによってさらに刺激される。よって、ＩＬ－２２は、病原体感染症及び免疫活性化も反映する合図に対する反応として分泌される。
【0004】
ＩＬ－２２の作用は、いくつかの活性／経路の編成された関与の結果である。ＩＬ－２２は、傷害時に上皮障壁組織及び器官で作用して、細胞を保護し、障壁機能を維持する（例えば、抗アポトーシス遺伝子プログラムの活性化を介して）。それはまた、修復を加速させ（例えば、成熟細胞の増殖及び幹細胞の活性化を誘導することによって）、線維化を防止し（例えば、上皮間葉移行を減少させること、ＮＬＲＰ３インフラマソームに拮抗すること及び肝臓星細胞老化を誘導することによる）、炎症を制御する（例えば、抗微生物ペプチド及び走化性シグナルを誘導することによって）。ＩＬ－２２は、様々な医学的病態（高血糖、脂質異常症及び高インスリン血症などの、糖尿病または過体重哺乳動物でしばしば観察されるものを含む）を処置することができるものとして報告されている。
【0005】
しかしながら、ＩＬ－２２は通常、腎臓によって身体から迅速に消失し、これにより臨床実務ではその使用が制限される。そのため、循環ＩＬ－２２の半減期を延長させるための既知の方法は、腎臓クリアランスを避けるように、ＩＬ－２２のサイズを７０ｋＤａを超えるように人工的に拡大しようとするものである。Ｆｃ抗体断片へのＩＬ－２２の連結は現在、この作用に対する最も良好な解決策である；Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ及びＧｅｎｅｒｏｎ Ｓｈａｎｇｈａｉはいずれとも、臨床開発中の長期作用型ＩＬ－２２－Ｆｃ融合体を有している。ポリエチレングリコールでのＩＬ－２２の改変（ＰＥＧ化）は、腎臓クリアランスを避けるための別の既知の手段である。
【0006】
しかしながら、これらの既存の解決策は、それらの欠点がないわけではない。利用可能なデータは、ＰＥＧ自体が免疫原性であり、ペグ化生物製剤を用いると細胞においてＰＥＧ含有液胞が観察されることを示唆している。低下した活性及び不均一性もまた、ＰＥＧ化の不利な面である。Ｆｃ融合技術は極めてよく知られているが、Ｆｃ抗体断片の付加は、ＩＬ－２２の構造の主要な変化を意味し、これは半減期延長を超えてその特性に影響を及ぼす。Ｆｃ融合は、タンパク質のサイズをおよそ１７ｋＤａからおよそ８５ｋＤａまで増加させるので、拡散速度、分布及び受容体係合動態などの特性が影響を受け得る。例えば、いくつかのＦｃ融合体は徐々に吸収され、及び／または所定の経路を介した投与にとっては大きすぎる。Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ及びＧｅｎｅｒｏｎはまた、ＩＬ－２２－Ｆｃ融合体の用量制限的有害作用として中程度の可逆的皮膚反応を報告している。さらに、効力は、大きな融合パートナーによって引き起こされる立体障害を介して影響を受け得る。
【0007】
そのため、循環半減期を向上させ、かつネイティブ分子と比較して最適化された薬物動態的及び薬力学的特性を実証するＩＬ－２２の新たな生体適合性改変剤が当該技術分野で依然として必要とされている。理想的には、それらは、ネイティブ分子の効力及び他の特性を維持し、また、既知の誘導体によって示される毒性、免疫原性及び任意の他の有害な反応を回避すべきである。
【発明の概要】
【0008】
第１の態様では、ＩＬ－２２タンパク質に共有結合した脂肪酸を含むＩＬ－２２の誘導体が提供される。
【0009】
本発明の一実施形態では、脂肪酸は、リンカーによってＩＬ－２２タンパク質に共有結合されている。
【0010】
脂肪酸は、式Ｉ：
ＨＯＯＣ－（ＣＨ２）ｘ－ＣＯ－＊，
（式中、ｘは、１０～１８、任意に１２～１８、１４～１６または１６～１８の範囲の整数であり、＊は、ＩＬ－２２タンパク質またはリンカーの結合点を示す）のものであり得る。それは脂肪二酸、例えば、Ｃ１２、Ｃ１４、Ｃ１６、Ｃ１８またはＣ２０二酸であり得る。有利には、脂肪酸はＣ１６またはＣ１８二酸、最も有利にはそれはＣ１８二酸である。
ＨＯＯＣ－（ＣＨ２）ｘ－ＣＯ－＊，
（式中、ｘは、１０～１８、任意に１２～１８、１４～１６または１６～１８の範囲の整数であり、＊は、ＩＬ－２２タンパク質またはリンカーの結合点を示す）のものであり得る。それは脂肪二酸、例えば、Ｃ１２、Ｃ１４、Ｃ１６、Ｃ１８またはＣ２０二酸であり得る。有利には、脂肪酸はＣ１６またはＣ１８二酸、最も有利にはそれはＣ１８二酸である。
【0011】
ＩＬ－２２タンパク質は、ネイティブ成熟ヒトＩＬ－２２（以下、「ｈＩＬ－２２」）またはそのバリアントであり得る。バリアントは、位置１、２１、３５、６４、１１３及び／または１１４で任意に置換された、ｈＩＬ－２２の置換形態であり得る。それは、Ａ１Ｃ、Ａ１Ｇ、Ａ１Ｈ、Ｎ２１Ｃ、Ｎ２１Ｄ、Ｎ２１Ｑ、Ｎ３５Ｃ、Ｎ３５Ｄ、Ｎ３５Ｈ、Ｎ３５Ｑ、Ｎ６４Ｃ、Ｎ６４Ｄ、Ｎ６４Ｑ、Ｎ６４Ｗ、Ｑ１１３Ｃ、Ｑ１１３Ｒ、Ｋ１１４Ｃ及びＫ１１４Ｒからなる群から選択されるｈＩＬ－２２の置換を含み得る。有利には、バリアントは、ｈＩＬ－２２の位置１でＣｙｓ残基を含む。
【0012】
バリアントは、ｈＩＬ－２２の伸長形態であり得る。それは、Ｎ末端ペプチド、例えば、Ｎ末端トリマーを含み得る。有利には、バリアントは、Ｎ末端Ｇ－Ｐ－Ｇを含む。
【0013】
リンカーは、グルタミン酸（Ｇｌｕ）及び／またはリジン（Ｌｙｓ）を任意に含む、１つ以上のアミノ酸を含み得る。リンカーは、オキシエチレングリシン単位または複数の連結されたオキシエチレングリシン単位、任意にそのような２～５単位、有利には２単位を含み得る。リンカーは、１つ以上のオリゴ（エチレングリコール）（ＯＥＧ）残基を含み得る。それは、エチレンジアミン（Ｃ２ＤＡ）基及び／またはアセトアミド（Ａｃ）基を含み得る。有利には、リンカーは、前述した要素のすべてを組み合わせて含む。特に、リンカーは、γＧｌｕ－ＯＥＧ－ＯＥＧ－Ｃ２ＤＡ－Ａｃ、γＧｌｕ－γＧｌｕ－γＧｌｕ－γＧｌｕ－ＯＥＧ－ＯＥＧ－εＬｙｓ－αＡｃまたはγＧｌｕ－ＯＥＧ－ＯＥＧ－εＬｙｓ－αＡｃであり得る。
【0014】
リンカーは、ｈＩＬ－２２またはそのバリアントにおけるＣｙｓ残基に結合したＣｙｓ反応性リンカーであり得る。それは、ｈＩＬ－２２またはそのバリアントの位置－７、－５、１、６、３３、１１３、１１４または１５３で結合され得る（位置－７、－５などは本明細書で定義されているとおりである）。例として、リンカーは、ｈＩＬ－２２の位置１、６、３３、１１３または１１４で置換されたＣｙｓ残基に結合され得る。それは、ｈＩＬ－２２に対して位置－５、－７または１５３でＣｙｓ残基に結合され得る。有利には、リンカーは、ｈＩＬ－２２の位置１で置換されたＣｙｓ残基に結合される。
【0015】
一実施形態では、誘導体は、ｈＩＬ－２２のバリアントにリンカーによって共有結合したＣ１４、Ｃ１６、Ｃ１８またはＣ２０二酸を含み、バリアントは、Ｎ末端Ｇ－Ｐ－Ｇ及びｈＩＬ－２２の位置１におけるＣｙｓ残基を含み、リンカーは、前記Ｃｙｓ残基に任意に結合されている。例示的な本発明の誘導体は、誘導体１～１０として本明細書で特定されているものである。
【0016】
第２の態様では、第１の態様の誘導体を調製するためのプロセスであって、脂肪酸をＩＬ－２２タンパク質に共有結合させることを含む、プロセスが提供される。
【0017】
第３の態様では、第１の態様の誘導体、及び薬学的に許容可能なビヒクルを含む薬学的組成物が提供される。
【0018】
第４の態様では、療法において使用するための、第１の態様の誘導体または第３の態様の薬学的組成物が提供される。
【0019】
第５の態様では、代謝、肝臓、肺、腸、腎臓または皮膚の疾患、障害または病態を処置する方法において使用するための、第１の態様の誘導体または第３の態様の薬学的組成物が提供される。
【0020】
代謝疾患、障害または病態は、肥満、１型糖尿病、２型糖尿病、脂質異常症、高血糖または高インスリン血症であり得る。
【0021】
肝臓疾患、障害または病態は、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、肝硬変、アルコール性肝炎、急性肝不全、慢性肝不全、慢性肝不全急性増悪（ＡＣＬＦ）、急性肝臓傷害、アセトアミノフェン誘導性肝臓毒性、硬化性胆管炎、胆汁性肝硬変または手術もしくは移植によって引き起こされる病理学的状態であり得る。
【0022】
肺疾患、障害または病態は、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、嚢胞性線維症、気管支拡張症、特発性肺線維症、急性窮迫症候群、化学的傷害、ウイルス感染症、細菌感染症または真菌感染症であり得る。
【0023】
腸疾患、障害または病態は、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、潰瘍性結腸炎、クローン病、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）、化学的傷害、ウイルス感染症または細菌感染症であり得る。
【0024】
腎臓疾患、障害または病態は、急性腎臓疾患または慢性腎臓疾患であり得る。
【0025】
皮膚疾患、障害または病態は、創傷、炎症性疾患またはＧｖＨＤであり得る。
【図面の簡単な説明】
【0026】
【図1】Ｃｙｓ反応性単位を含むリンカーにそれぞれ接続された（Ａ）Ｃ１８二酸、（Ｂ）Ｃ１６二酸、及び（Ｃ）Ｃ１４二酸を示している。脂肪酸及びリンカーのこれらの組み合わせは、誘導体１～１０として本明細書で特定される本発明の誘導体において用いられる。
【図2】誘導体１として本明細書で特定される本発明の誘導体の構造を示している。
【図3】誘導体６として本明細書で特定される本発明の誘導体の構造を示している。
【図4】誘導体１０として本明細書で特定される本発明の誘導体の構造を示している。
【図5】糖尿病マウスモデルでの８日間の研究における血中グルコースに対するｈＩＬ－２２及び骨格バリエーションのみを有する比較用ＩＬ－２２バリアント（本明細書で比較物３として特定される）の毎日の投薬の効果を示している（平均±ＳＥＭ）。
【図6】糖尿病マウスモデルでの１６日間の研究における（Ａ）血中グルコース、及び（Ｂ）食物摂取に対する、ＩＬ－２２－Ｆｃ融合体（具体的には、ｈＩＬ－２２にＮ末端で融合したヒトＦｃ；以下「ｈＦｃ－ｈＩＬ－２２」）と比較した本発明の誘導体（本明細書で誘導体１として特定される）の毎日の投薬の効果を示している（平均±ＳＥＭ；＊は対応のないｔ検定を使用してｐ＜０．０５を意味する）。
【図7A】糖尿病マウスモデルでの１６日間の研究における３つの異なる標的係合バイオマーカーに対する誘導体１及びｈＦｃ－ｈＩＬ－２２の毎日の投薬の効果を示している（平均±ＳＥＭ；＊＊＊は対応のないｔ検定を使用して（Ａ）ｐ＜０．０００２を意味する）。
【図7B】糖尿病マウスモデルでの１６日間の研究における３つの異なる標的係合バイオマーカーに対する誘導体１及びｈＦｃ－ｈＩＬ－２２の毎日の投薬の効果を示している（平均±ＳＥＭ；＊＊＊は対応のないｔ検定を使用して（Ｂ）ｐ＜０．０００３を意味する）。
【図7C】糖尿病マウスモデルでの１６日間の研究における３つの異なる標的係合バイオマーカーに対する誘導体１及びｈＦｃ－ｈＩＬ－２２の毎日の投薬の効果を示している（平均±ＳＥＭ；＊＊＊は対応のないｔ検定を使用して（Ｃ）ｐ＜０．００２６を意味する）。
【図8】糖尿病マウスモデルでの１３日間の研究における血中グルコースに対する、誘導体１及びｈＦｃ－ｈＩＬ－２２と比較した本発明の誘導体（本明細書で誘導体６として特定される）（３つの異なる用量）の毎日の投薬についての用量－反応曲線を示している（平均±ＳＥＭ）。
【図9A】２つの異なる肝臓酵素の血漿レベルによって明らかであるように、アセトアミノフェン（ＡＰＡＰ）誘導性肝臓傷害マウスモデルにおける肝臓傷害の予防における誘導体１及び６の効果を示している。ダネット検定単一因子線形モデルを使用して、ビヒクル＋ＡＰＡＰと比較して、＊はｐ＜０．０５を意味し、＊＊ｐ＜０．０１を意味する。
【図9B】２つの異なる肝臓酵素の血漿レベルによって明らかであるように、アセトアミノフェン（ＡＰＡＰ）誘導性肝臓傷害マウスモデルにおける肝臓傷害の予防における誘導体１及び６の効果を示している。ダネット検定単一因子線形モデルを使用して、ビヒクル＋ＡＰＡＰと比較して、＊はｐ＜０．０５を意味し、＊＊ｐ＜０．０１を意味する。
【図10A】ＡＰＡＰ誘導性肝臓傷害マウスモデルにおける（Ａ）アポトーシスの予防に対する誘導体１及び６の効果を示している。ＮＳは非有意を意味する。
【図10B】ＡＰＡＰ誘導性肝臓傷害マウスモデルにおける（Ｂ）細胞増殖に対する誘導体１及び６の効果を示している。ＮＳは非有意を意味する。
【図11A】ブレオマイシン誘導性肺傷害ラットモデルにおける（Ａ）肺炎症の予防及び／または減少におけるプレドニゾロンと比較した誘導体６の効果を示している。
【図11B】ブレオマイシン誘導性肺傷害ラットモデルにおける（Ｂ）肺線維症の予防及び／または減少におけるプレドニゾロンと比較した誘導体６の効果を示している。
【図11C】ブレオマイシン誘導性肺傷害ラットモデルにおける（Ｃ）肺線維症の予防及び／または減少におけるプレドニゾロンと比較した誘導体６の効果を示している。
【図12】デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）誘導性大腸炎マウスモデルにおける結腸炎の予防における誘導体６の効果を示している。＊＊＊＊は、ビヒクル（ＤＳＳを含有する）と比較してｐ＜０．０００１を意味する。
【図13】ＤＳＳ誘導性大腸炎マウスモデルにおける粘膜上皮創傷の予防におけるｈＦｃ－ｈＩＬ－２２と比較した誘導体６の効果を示している。倍率４ｘ、目盛り棒＝５００μｍ。
【図14】標的係合の指標としての、ＤＳＳ誘導性大腸炎マウスモデルにおける血漿再生膵島由来タンパク質３ガンマ（Ｒｅｇ３ｇ）レベルを示している（Ｒｅｇ３ｇはＩＬ－２２の標的係合マーカーである）。
【図15A】２つの異なる肝臓酵素の血清レベルによって明らかであるように、コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）誘導性肝臓傷害マウスモデルにおける肝臓傷害の予防における誘導体１の効果を示している。
【図15B】２つの異なる肝臓酵素の血清レベルによって明らかであるように、コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）誘導性肝臓傷害マウスモデルにおける肝臓傷害の予防における誘導体１の効果を示している。
【図16】食餌誘導性肥満マウスにおける体重に対する、ｈＦｃ－ｈＩＬ－２２及び既知の肪酸コンジュゲーションＧＬＰ－１誘導体であるセマグルチドと比較した誘導体６の効果を示している。
【発明を実施するための形態】
【0027】
以下では、ギリシャ文字は、それらの書き言葉の名称ではなくそれらの記号によって表される。例えば、α＝アルファ、ε＝イプシロン、γ＝ガンマ及びμ＝ミュー。アミノ酸残基は、それらの完全名称、３文字コードまたは１文字コードによって特定され得、それらのすべては完全に同等である。
【0028】
用語「ＩＬ－２２の誘導体」は、本明細書で使用される場合、共有結合した脂肪酸を有するＩＬ－２２タンパク質を指す。その用語は、脂肪酸がＩＬ－２２タンパク質に直接的に共有結合した誘導体及び共有結合がリンカーによるものであるものの両方を包含する。
【0029】
脂肪酸の共有結合は、ペプチド及びタンパク質の半減期延長のための認められた技術であり、ペプチドまたはタンパク質から脂肪酸を包む方法である。それは、１型及び２型糖尿病の上市された製品、例えば、インスリンであるＬｅｖｅｍｉｒ（登録商標）（デテミル）及びＴｒｅｓｉｂａ（登録商標）（デグルデク）、ならびにグルカゴン様ペプチド－１（ＧＬＰ－１）誘導体Ｖｉｃｔｏｚａ（登録商標）（リラグルチド）及びＯｚｅｍｐｉｃ（登録商標）（セマグルチド）から知られている。
【0030】
脂肪酸結合により、アルブミンへの結合が可能となり、それにより腎臓排泄を防止し、タンパク質分解に対するある程度の立体的保護を提供する。有利には、それは、Ｆｃ融合またはＰＥＧ化と比較してＩＬ－２２に対する最小の改変を提供する。この点に関して、Ｆｃ融合及びＰＥＧ化は、腎臓クリアランスの閾値を超えてＩＬ－２２のサイズの増加を目標とするが、ＩＬ－２２タンパク質に共有結合した脂肪酸を含む誘導体は、ＩＬ－２２タンパク質のものに類似する小さなサイズを保持する。よって、脂肪酸結合は最小の改変であるため、生じる誘導体は、分布、拡散速度及び受容体係合（結合、活性化及びトラフィッキング）を含むネイティブ様特性を維持し、免疫原性リスクを最小化すると考えられる。
【0031】
上記のように、脂肪酸結合は、糖尿病のためのインスリン及びＧＬＰ－１誘導体で治療的有効性を証明してきた。しかしながら、ＩＬ－２２は、そのサイズ、配列及び生物学的特性の観点から極めて異なるタンパク質である。そのため、脂肪酸がＩＬ－２２に、治療効果を維持しながら共有結合することができたことは発明者にとって直観で分かるものではないことであった。ＩＬ－２２に対するそのような最小の改変は、極めて長い循環半減期と組み合わされた高い効力（ｈＩＬ－２２と近い）をもたらすことができたことが特に驚くべきことであった。
【0032】
そのため、第１の態様では、本発明は、ＩＬ－２２タンパク質に共有結合した脂肪酸を含むＩＬ－２２の誘導体に関する。脂肪酸は、直接的にまたはリンカーを介してＩＬ－２２タンパク質に共有結合され得、それ自体は様々なサブユニットから考案され得る。用語「ＩＬ－２２タンパク質」は、本明細書で使用される場合、ネイティブＩＬ－２２タンパク質、例えば、ｈＩＬ－２２、またはそのバリアントを意味し得る。「バリアント」は、本明細書でさらに定義されるように、ネイティブタンパク質のものと類似するアミノ酸配列を有するタンパク質であり得る。
【0033】
本来、ヒトＩＬ－２２タンパク質は、分泌のための３３アミノ酸のシグナルペプチドと共に合成される。成熟ヒトＩＬ－２２タンパク質（すなわち、ｈＩＬ－２２）は、長さが１４６アミノ酸であり、マウスＩＬ－２２と８０．８％の配列同一性を有する（後者は長さが１４７アミノ酸である）。ｈＩＬ－２２のアミノ酸配列は、配列番号１として本明細書で特定される。他のＩＬ－１０ファミリーメンバーのように、ＩＬ－２２構造は、６つのα－ヘリックス（ヘリックスＡ～Ｆと称される）を含有する。
【0034】
よって、本発明の誘導体は、ｈＩＬ－２２のネイティブアミノ酸配列を有し得る。代替的には、それらは、ネイティブ配列内の１つ以上のアミノ酸配列バリエーションを有し得る。それらは、追加的または代替的に、ネイティブ配列に対して（すなわち、外側に）１つ以上のアミノ酸配列バリエーションを含み得る。よって、一実施形態では、誘導体は、ｈＩＬ－２２またはそのバリアントに共有結合した脂肪酸を含む。
【0035】
「内」、「に対して」、「に対応する」及び「と同等」などの表現は、ネイティブタンパク質、例えば、ｈＩＬ－２２の配列に対する参照によってＩＬ－２２タンパク質における脂肪酸の変化及び／または共有結合の部位を特性化するために本明細書で使用される。配列番号１において、ｈＩＬ－２２（アラニン（Ａｌａ））の最初のアミノ酸残基は、位置１として割り当てられる。
【0036】
よって、ｈＩＬ－２２の配列内のバリエーションは、配列番号１における残基番号１～１４６のいずれかに対するバリエーションである。例えば、ｈＩＬ－２２における残基１０におけるネイティブＡｓｐに対するＧｌｕ置換は、本明細書では「Ｄ１０Ｅ」として表される。誘導体がまた、位置１０で共有結合した脂肪酸を有する場合、それは、本明細書では残基「１０Ｅ」における結合と称される。
【0037】
しかしながら、ｈＩＬ－２２の配列に対するバリエーションは、配列番号１における残基番号１～１４６に対して外部のバリエーションである。例えば、本明細書で定義される誘導体２は、長さが１５アミノ酸のＮ末端ペプチドを含む。Ｎ末端ペプチドにおける残基は、ｈＩＬ－２２における残基１に結合した残基から開始して負に付番される。すなわち、ｈＩＬ－２２における残基１に結合したＮ末端ペプチドにおける１番目の残基は、「－１」と表される。よって、誘導体２は、位置－１から開始するＮ末端における７番目の残基で共有結合した脂肪酸を有し、これはＣｙｓであるため、誘導体２についての共有結合部位は、本明細書で「－７Ｃ」と称される。しかしながら、当然ながら、誘導体２の配列表において使用される付番は、ＷＩＰＯ規格ＳＴ．２５に従って１から開始する；このように、誘導体２の配列表における位置１は、実際には、本明細書で称される残基－７である。
【0038】
２、３、４、５またはそれ以上のバリエーションが、本発明の誘導体を形成するためにネイティブ配列内で生成され得る。この点に関して、例えば、１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００を超えるまたはさらに１２５を超えるバリエーションが生成され得る。ネイティブ配列における残基１～１４６のいずれかが変更され得る。バリエーションのための例示的な残基は、ｈＩＬ－２２における残基１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２４、２５、２６、２７、２９、３０、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４４、４５、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５８、５９、６１、６２、６３、６４、６５、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７７、７８、７９、８２、８３、８４、８６、８８、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３２、１３３、１３４、１３５、１３７、１３８、１３９、１４１、１４３、１４４、１４５及び／または１４６である。残基１、２１、３５、６４、１１３及び／または１１４におけるバリエーションが特に有利である。
【0039】
ネイティブ配列内のバリエーションは、典型的にはアミノ酸置換である。用語「置換」は、本明細書で使用される場合、ネイティブタンパク質におけるアミノ酸を別のもので置き換えることを意味し得る。それらは、保存的または非保存的置換であり得る。例示的な置換は、Ａ１Ｃ、Ａ１Ｇ、Ａ１Ｈ、Ｐ２Ｃ、Ｐ２Ｈ、Ｉ３Ｃ、Ｉ３Ｈ、Ｉ３Ｖ、Ｓ４Ｈ、Ｓ４Ｎ、Ｓ５Ｈ、Ｓ５Ｔ、Ｈ６Ｃ、Ｈ６Ｒ、Ｃ７Ｇ、Ｒ８Ｇ、Ｒ８Ｋ、Ｌ９Ｓ、Ｄ１０Ｅ、Ｄ１０Ｓ、Ｋ１１Ｃ、Ｋ１１Ｇ、Ｋ１１Ｖ、Ｓ１２Ｃ、Ｎ１３Ｃ、Ｎ１３Ｇ、Ｆ１４Ｓ、Ｑ１５Ｃ、Ｑ１５Ｅ、Ｑ１６Ｖ、Ｐ１７Ｌ、Ｙ１８Ｆ、Ｉ１９Ｑ、Ｔ２０Ｖ、Ｎ２１Ｃ、Ｎ２１Ｄ、Ｎ２１Ｑ、Ｒ２２Ｓ、Ｆ２４Ｈ、Ｍ２５Ｅ、Ｍ２５Ｌ、Ｌ２６Ｓ、Ａ２７Ｌ、Ｅ２９Ｐ、Ａ３０Ｑ、Ｌ３２Ｃ、Ｌ３２Ｒ、Ａ３３Ｃ、Ａ３３Ｎ、Ｄ３４Ｆ、Ｎ３５Ｃ、Ｎ３５Ｄ、Ｎ３５Ｈ、Ｎ３５Ｑ、Ｎ３６Ｑ、Ｔ３７Ｃ、Ｔ３７Ｉ、Ｄ３８Ｌ、Ｖ３９Ｑ、Ｒ４０Ｗ、Ｌ４１Ｑ、Ｉ４２Ｐ、Ｅ４４Ｒ、Ｋ４５Ａ、Ｆ４７Ｔ、Ｈ４８Ｇ、Ｈ４８Ｒ、Ｇ４９Ｎ、Ｖ５０Ｓ、Ｓ５１Ｃ、Ｍ５２Ａ、Ｍ５２Ｃ、Ｍ５２Ｌ、Ｍ５２Ｖ、Ｓ５３Ｃ、Ｓ５３Ｋ、Ｓ５３Ｙ、Ｅ５４Ｄ、Ｅ５４Ｆ、Ｒ５５Ｑ、Ｒ５５Ｖ、Ｃ５６Ｑ、Ｌ５８Ｋ、Ｍ５９Ｉ、Ｑ６１Ｅ、Ｖ６２Ｄ、Ｌ６３Ｃ、Ｎ６４Ｃ、Ｎ６４Ｄ、Ｎ６４Ｑ、Ｎ６４Ｗ、Ｆ６５Ｇ、Ｌ６７Ｑ、Ｅ６９Ｄ、Ｅ６９Ｌ、Ｖ７０Ｓ、Ｌ７１Ｃ、Ｆ７２Ｄ、Ｆ７２Ｌ、Ｐ７３Ｃ、Ｐ７３Ｌ、Ｑ７４Ｔ、Ｒ７７Ｉ、Ｆ７８Ｑ、Ｑ７９Ｅ、Ｍ８２Ｙ、Ｑ８３Ｇ、Ｅ８４Ｒ、Ｖ８６Ａ、Ｆ８８Ｎ、Ａ９０Ｐ、Ａ９０Ｔ、Ｒ９１Ｃ、Ｒ９１Ｋ、Ｒ９１Ｙ、Ｌ９２Ｒ、Ｓ９３Ｙ、Ｎ９４Ｃ、Ｎ９４Ｑ、Ｒ９５Ｋ、Ｒ９５Ｑ、Ｌ９６Ｅ、Ｓ９７Ｋ、Ｔ９８Ｃ、Ｔ９８Ｎ、Ｔ９８Ｓ、Ｃ９９Ｖ、Ｈ１００Ｓ、Ｅ１０２Ｓ、Ｇ１０３Ｄ、Ｄ１０４Ｙ、Ｄ１０５Ｙ、Ｌ１０６Ｅ、Ｌ１０６Ｑ、Ｈ１０７Ｌ、Ｈ１０７Ｎ、Ｉ１０８Ｌ、Ｑ１０９Ｙ、Ｒ１１０Ｃ、Ｒ１１０Ｋ、Ｎ１１１Ｋ、Ｖ１１２Ｅ、Ｑ１１３Ｃ、Ｑ１１３Ｒ、Ｋ１１４Ｃ、Ｋ１１４Ｒ、Ｌ１１５Ｖ、Ｋ１１６Ｙ、Ｄ１１７Ｅ、Ｔ１１８Ｇ、Ｖ１１９Ａ、Ｋ１２０Ｈ、Ｋ１２１Ｒ、Ｌ１２２Ａ、Ｇ１２３Ｖ、Ｇ１２６Ｙ、Ｅ１２７Ｃ、Ｉ１２８Ｖ、Ｋ１２９Ｖ、Ｇ１３２Ｙ、Ｅ１３３Ｑ、Ｌ１３４Ｐ、Ｄ１３５Ｍ、Ｌ１３７Ｄ、Ｆ１３８Ｒ、Ｍ１３９Ｌ、Ｍ１３９Ｒ、Ｌ１４１Ｑ、Ｎ１４３Ｓ、Ａ１４４Ｅ、Ｃ１４５Ｅ、Ｉ１４６Ｒ及び／またはＩ１４６Ｖである。有利には、置換は、Ａ１Ｃ、Ａ１Ｇ、Ａ１Ｈ、Ｎ２１Ｃ、Ｎ２１Ｄ、Ｎ２１Ｑ、Ｎ３５Ｃ、Ｎ３５Ｄ、Ｎ３５Ｈ、Ｎ３５Ｑ、Ｎ６４Ｃ、Ｎ６４Ｄ、Ｎ６４Ｑ、Ｎ６４Ｗ、Ｑ１１３Ｃ、Ｑ１１３Ｒ、Ｋ１１４Ｃ及びＫ１１４Ｒからなる群から選択され得る。驚くべきことに、本発明において用いられる置換は、ＩＬ－２２活性に悪影響を及ぼさない。
【0040】
置換の特定の組み合わせには、（ｉ）Ａ１Ｇ、Ｎ２１Ｄ、Ｎ３５Ｄ及びＮ６４Ｄ；（ｉｉ）Ａ１Ｇ、Ｉ３Ｖ、Ｓ４Ｎ、Ｓ５Ｔ、Ｈ６Ｒ、Ｒ８Ｋ、Ｄ１０Ｅ、Ｋ１１Ｖ、Ｔ２０Ｖ、Ｈ４８Ｒ、Ｍ５２Ａ、Ｓ５３Ｋ、Ｅ５４Ｄ、Ｒ５５Ｑ、Ｅ６９Ｄ、Ｆ７２Ｌ、Ａ９０Ｔ、Ｒ９１Ｋ、Ｒ９５Ｑ、Ｔ９８Ｓ、Ｅ１０２Ｓ、Ｌ１０６Ｑ、Ｈ１０７Ｎ、Ｒ１１０Ｋ、Ｑ１１３Ｒ、Ｋ１１４Ｒ、Ｄ１１７Ｅ及びＩ１４６Ｖ；（ｉｉｉ）Ａ１Ｇ、Ｉ３Ｖ、Ｓ４Ｎ、Ｓ５Ｔ、Ｈ６Ｒ、Ｒ８Ｋ、Ｄ１０Ｅ、Ｋ１１Ｖ、Ｔ２０Ｖ、Ｈ４８Ｒ、Ｍ５２Ａ、Ｓ５３Ｋ、Ｅ５４Ｄ、Ｒ５５Ｑ、Ｅ６９Ｄ、Ｆ７２Ｌ、Ａ９０Ｔ、Ｒ９１Ｋ、Ｒ９５Ｑ、Ｔ９８Ｓ、Ｅ１０２Ｓ、Ｌ１０６Ｑ、Ｈ１０７Ｎ、Ｒ１１０Ｋ、Ｑ１１３Ｒ、Ｋ１１４Ｒ、Ｄ１１７Ｅ及びＩ１４６Ｖ；（ｉｖ）Ａ１Ｇ、Ｎ３５Ｑ及びＮ６４Ｑ；（ｖ）Ａ１Ｇ及びＮ６４Ｃ；（ｖｉ）Ａ１Ｇ及びＱ１１３Ｃ；（ｖｉｉ）Ａ１Ｇ及びＫ１１４Ｃ；（ｖｉｉｉ）Ａ１Ｇ及びＭ２５Ｌ；（ｉｘ）Ａ１Ｇ及びＭ５２Ｌ；（ｘ）Ａ１Ｇ及びＭ１３９Ｌ；（ｘｉ）Ａ１Ｇ及びＮ３６Ｑ；（ｘｉｉ）Ａ１Ｇ及びＤ１１７Ｅ；（ｘｉｉｉ）Ａ１Ｇ及びＮ２１Ｑ；（ｘｉｖ）Ａ１Ｇ及びＮ３５Ｑ；（ｘｖ）Ａ１Ｇ及びＮ６４Ｑ；（ｘｖｉ）Ａ１Ｇ、Ｎ２１Ｑ及びＮ３５Ｑ；（ｘｖｉｉ）Ａ１Ｇ、Ｎ２１Ｑ及びＮ６４Ｑ；（ｘｖｉｉｉ）Ａ１Ｇ、Ｎ２１Ｑ、Ｎ３５Ｑ及びＮ６４Ｑ；（ｘｉｘ）Ａ１Ｇ及びＫ１１Ｃ；（ｘｘ）Ａ１Ｇ及びＮ１３Ｃ；（ｘｘｉ）Ｎ３５Ｑ及びＮ６４Ｑ；（ｘｘｉｉ）Ａ１Ｃ、Ｎ３５Ｑ及びＮ６４Ｑ；（ｘｘｉｉｉ）Ｈ６Ｃ、Ｎ３５Ｑ及びＮ６４Ｑ；（ｘｘｉｖ）Ｉ３Ｃ、Ｎ３５Ｑ及びＮ６４Ｑ；（ｘｘｖ）Ｐ２Ｃ、Ｎ３５Ｑ及びＮ６４Ｑ；（ｘｘｖｉ）Ｌ３２Ｃ、Ｎ３５Ｑ及びＮ６４Ｑ；（ｘｘｖｉｉ）Ｎ３５Ｑ、Ｍ５２Ｃ及びＮ６４Ｑ；（ｘｘｖｉｉｉ）Ｎ１３Ｃ、Ｎ３５Ｑ及びＮ６４Ｑ；（ｘｘｉｘ）Ｎ２１Ｃ、Ｎ３５Ｑ及びＮ６４Ｑ；（ｘｘｘ）Ｎ３５Ｑ、Ｎ６４Ｑ及びＮ９４Ｃ；（ｘｘｘｉ）Ｎ３５Ｑ、Ｎ６４Ｑ及びＰ７３Ｃ；（ｘｘｘｉｉ）Ｎ３５Ｑ、Ｎ６４Ｑ及びＱ１１３Ｃ；（ｘｘｘｉｉｉ）Ｎ３５Ｑ、Ｎ６４Ｑ及びＲ９１Ｃ；（ｘｘｘｉｖ）Ｎ３５Ｑ、Ｎ６４Ｑ及びＲ１１０Ｃ；（ｘｘｘｖ）Ｓ１２Ｃ、Ｎ３５Ｑ及びＮ６４Ｑ；（ｘｘｘｖｉ）Ｎ３５Ｑ、Ｓ５１Ｃ及びＮ６４Ｑ；（ｘｘｘｖｉｉ）Ｎ３５Ｑ、Ｓ５３Ｃ及びＮ６４Ｑ；（ｘｘｘｖｉｉｉ）Ｎ３５Ｑ、Ｔ３７Ｃ及びＮ６４Ｑ；（ｘｘｘｉｘ）Ｎ３５Ｑ、Ｎ６４Ｑ及びＴ９８Ｃ；（ｘｘｘｘ）Ｑ１５Ｃ、Ｎ３５Ｑ及びＮ６４Ｑ；（ｘｘｘｘｉ）Ｎ３５Ｃ及びＮ６４Ｑ；（ｘｘｘｘｉｉ）Ｈ６Ｃ、Ｎ３５Ｑ及びＮ６４Ｑ；（ｘｘｘｘｉｉｉ）Ａ３３Ｃ、Ｎ３５Ｑ及びＮ６４Ｑ；及び（ｘｘｘｘｉｖ）Ａ１Ｈ、Ｐ２Ｈ、Ｉ３Ｈ、Ｓ４Ｈ、Ｓ５Ｈ、Ｃ７Ｇ、Ｒ８Ｇ、Ｌ９Ｓ、Ｄ１０Ｓ、Ｋ１１Ｇ、Ｎ１３Ｇ、Ｆ１４Ｓ、Ｑ１５Ｅ、Ｑ１６Ｖ、Ｐ１７Ｌ、１８Ｆ、Ｙ１９Ｑ、Ｎ２１Ｑ、Ｒ２２Ｓ、Ｆ２４Ｈ、Ｍ２５Ｅ、Ｌ２６Ｓ、Ａ２７Ｌ、Ｅ２９Ｐ、Ａ３０Ｑ、Ｌ３２Ｒ、Ａ３３Ｎ、Ｄ３４Ｆ、Ｎ３５Ｈ、Ｔ３７Ｉ、Ｄ３８Ｌ、Ｖ３９Ｑ、Ｒ４０Ｗ、Ｌ４１Ｑ、Ｉ４２Ｐ、Ｅ４４Ｒ、Ｋ４５Ａ、Ｆ４７Ｔ、Ｈ４８Ｇ、Ｇ４９Ｎ、Ｖ５０Ｓ、Ｍ５２Ｖ、Ｓ５３Ｙ、Ｅ５４Ｆ、Ｒ５５Ｖ、Ｃ５６Ｑ、Ｌ５８Ｋ、Ｍ５９Ｉ、Ｑ６１Ｅ、Ｖ６２Ｄ、Ｌ６３Ｃ、Ｎ６４Ｗ、Ｆ６５Ｇ、Ｌ６７Ｑ、Ｅ６９Ｌ、Ｖ７０Ｓ、Ｌ７１Ｃ、Ｆ７２Ｄ、Ｐ７３Ｌ、Ｑ７４Ｔ、Ｒ７７Ｉ、Ｆ７８Ｑ、Ｑ７９Ｅ、Ｍ８２Ｙ、Ｑ８３Ｇ、Ｅ８４Ｒ、Ｖ８６Ａ、Ｆ８８Ｎ、Ａ９０Ｐ、Ｒ９１Ｙ、Ｌ９２Ｒ、Ｓ９３Ｙ、Ｎ９４Ｑ、Ｒ９５Ｋ、Ｌ９６Ｅ、Ｓ９７Ｋ、Ｔ９８Ｎ、Ｃ９９Ｖ、Ｈ１００Ｓ、Ｇ１０３Ｄ、Ｄ１０４Ｙ、Ｄ１０５Ｙ、Ｌ１０６Ｅ、Ｈ１０７Ｌ、Ｉ１０８Ｌ、Ｑ１０９Ｙ、Ｒ１１１Ｋ、Ｖ１１２Ｅ、Ｌ１１５Ｖ、Ｋ１１６Ｙ、Ｄ１１７Ｅ、Ｔ１１８Ｇ、Ｖ１１９Ａ、Ｋ１２０Ｈ、Ｋ１２１Ｒ、Ｌ１２２Ａ、Ｇ１２３Ｖ、Ｇ１２６Ｙ、Ｅ１２７Ｃ、Ｉ１２８Ｖ、Ｋ１２９Ｖ、Ｇ１３２Ｙ、Ｅ１３３Ｑ、Ｌ１３４Ｐ、Ｄ１３５Ｍ、Ｌ１３７Ｄ、Ｆ１３８Ｒ、Ｍ１３９Ｒ、Ｌ１４１Ｑ、Ｎ１４３Ｓ、Ａ１４４Ｅ、Ｃ１４５Ｅ及びＩ１４６Ｒが含まれる。置換のあらゆる組み合わせが想定され、本発明の一部を形成する。
【0041】
第１の態様の誘導体は典型的には、任意に上で特定された位置、例えば、位置１、２、３、６、１１、１２、１３、１５、２１、３２、３３、３５、３７、５１、５２、５３、６３、６４、７１、７３、９１、９４、９８、１１０、１１３、１１４及び／または１２７のいずれかにおいて、ネイティブ残基に対してＣｙｓが置換されたアミノ酸置換を含み得る。有利には、第１の態様の誘導体に含まれるＩＬ－２２タンパク質は、ｈＩＬ－２２の位置１でＣｙｓ残基を含む。位置３５及び６４における２つのグリコシル化部位における置換と組み合わされたＡ１Ｃ置換は、効力または半減期に不利に影響を及ぼすことなくより速い取り込みにつながるので特に有利である（実施例１及び２における誘導体６及び１０参照）。
【0042】
代替的に、または追加的に、ネイティブ配列内のバリエーションは、アミノ酸挿入であり得る。最大で５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５個またはさらに最大で５０個のアミノ酸が、ネイティブ配列内に挿入され得る。トリマー、ペンタマー、セプタマー、オクタマー、ノナマー及び４４－ｍｅｒがこの点に関して特に有利である。例示的な配列が表１に示されている。挿入は、ネイティブ配列における任意の位置でなされ得るが、ヘリックスＡにおけるもの（例えば、残基３０）、ループＣＤにおけるもの（例えば、残基７５）、ヘリックスＤにおけるもの（例えば、残基８５）及び／またはヘリックスＦにおけるもの（例えば、残基１２４）が好ましい。
【0043】
【表1】
【0044】
ｈＩＬ－２２のアミノ酸配列に対する配列バリエーションは、存在する場合、典型的には、伸長、例えば、Ｎ末端におけるペプチドの付加を含む。ペプチドは、最大で５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５個またはさらに最大で５０個のアミノ酸からなり得る。モノマー、トリマー、オクタマー、１３－ｍｅｒ、１５－ｍｅｒ、１６－ｍｅｒ、２１－ｍｅｒ、２８－ｍｅｒがこの点に関して特に有利である。例示的な配列が表２に示されている。好適には、第１の態様の誘導体に含まれるＩＬ－２２タンパク質は、Ｎ末端Ｇ－Ｐ－Ｇを含む。特に好ましい例では、第１の態様の誘導体は、ｈＩＬ－２２（配列番号１）の位置１におけるＣｙｓ残基及びＮ末端Ｇ－Ｐ－Ｇの両方を含む。これは、極めて良好な半減期及び効力を有する誘導体を生成することが判明した（実施例１及び２における誘導体１、３及び５参照）。
【0045】
【表2】
【0046】
ｈＩＬ－２２のアミノ酸配列に対する配列バリエーションは、存在する場合、Ｃ末端におけるペプチドの付加を含み得る。ペプチドは、最大で５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５個またはさらに最大で５０個のアミノ酸からなり得る。任意にアミノ酸配列Ｇ－Ｓ－Ｇ－Ｓ－Ｇ－Ｓ－Ｃ（配列番号１５）を有するセプタマーがこの点に関して特に有利である。
【0047】
本発明の誘導体は、本明細書に記載されるネイティブまたはバリアントｈＩＬ－２２アミノ酸配列に加えてＮ末端及びＣ末端ペプチドの両方を含み得る。本明細書に記載のＮ末端ペプチド及びＣ末端ペプチドの任意の組み合わせが想定され、本発明に明示的に含まれる。
【0048】
本発明は、ｈＩＬ－２２またはそのバリアントに共有結合した脂肪酸を含む、ＩＬ－２２の任意の誘導体まで及ぶことが理解される。「バリアント」は、ｈＩＬ－２２と少なくとも１０％の配列同一性を有するタンパク質であり得る。一実施形態では、バリアントは、ｈＩＬ－２２と少なくとも２０％、またはさらに少なくとも３０％の配列同一性を有する。バリアントは、ｈＩＬ－２２のアミノ酸配列と少なくとも４０％の配列同一性を有する配列を意味し得る、ｈＩＬ－２２の「実質的アミノ酸配列」を有し得る。したがって、一実施形態では、第１の態様の誘導体は、ｈＩＬ－２２と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または１００％のアミノ酸配列同一性を有する。実験セクションで開示されている本発明の特定の誘導体に組み込まれる例示的なＩＬ－２２タンパク質バリアントが配列番号１６～２１に示されている。
【0049】
当業者は、２つのアミノ酸配列間の同一率を計算する仕方を知っている。２つの配列のアライメントがまず準備され、続いて配列同一性値が計算されなければならない。２つの配列についての同一率は、（ｉ）配列をアライメントするために使用される方法、例えば、ＣｌｕｓｔａｌＷ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍ（異なるプログラムで実行される）、または３Ｄ比較からの構造的アライメント；及び（ｉｉ）アライメント方法によって使用されるパラメータ、例えば、ローカル対グローバルアライメント、使用されるペアスコアマトリックス（例えば、ＢＬＯＳＵＭ６２、ＰＡＭ２５０、Ｇｏｎｎｅｔなど）及びギャップ－ペナルティ、例えば、機能形態及び定数に応じて異なる値をとり得る。
【0050】
アライメントを行った後、２つの配列間の同一率を計算する多くの異なる方法が存在する。例えば、同一の数を（ｉ）最短配列の長さ；（ｉｉ）アライメントの長さ；（ｉｉｉ）配列の平均長さ；（ｉｖ）非ギャップ位置の数；または（ｉｖ）オーバーハングを除く等価位置の数で除算し得る。さらに、同一率はまた、長さに強く依存することが理解される。そのため、配列の対がより短いほど、配列同一性は高くなり、偶然に生じることが予想され得る。
【0051】
よって、アミノ酸配列の正確なアライメントは複雑なプロセスであることが理解される。評判の良い多重アライメントプログラムＣｌｕｓｔａｌＷ［４８，４９］は、本発明に従ってタンパク質の多重アライメントを生成するための好ましい方法である。ＣｌｕｓｔａｌＷのための好適なパラメータは次のとおりであり得る：タンパク質アライメントの場合：ギャップオープンペナルティ＝１０．０、ギャップ伸長ペナルティ＝０．２、及びマトリックス＝ゴネット（Ｇｏｎｎｅｔ）。ＤＮＡ及びタンパク質アライメントの場合：ＥＮＤＧＡＰ＝－１、及びＧＡＰＤＩＳＴ＝４。当業者は、最適な配列アライメントのためにこれらの及び他のパラメータを変更する必要があり得ることを知っている。
【0052】
好ましくは、次いで２つのアミノ酸配列間の同一率の計算が、（Ｎ／Ｔ）＊１００（Ｎは、配列が同一の残基を共有する位置の数であり、Ｔは、ギャップを含むがオーバーハングを除く比較された位置の総数である）としてそのようなアライメントから計算され得る。よって、２つの配列間の同一率を計算するための最も好ましい方法は、（ｉ）好適なパラメータのセット、例えば、上記で示されるものを使用してＣｌｕｓｔａｌＷプログラムを使用して配列アライメントを作成すること；及び（ｉｉ）Ｎ及びＴの値を次の式：配列同一性＝（Ｎ／Ｔ）＊１００に挿入することを含む。
【0053】
類似配列を特定するための代替的方法が当業者に知られている。
【0054】
好適には、第１の態様の誘導体は、２００以下のアミノ酸を含む。例えば、誘導体は、１９０未満、１８０未満、１７０未満、１６０未満またはさらに１５０未満のアミノ酸を含む。好適には、誘導体は、少なくとも１４６アミノ酸を含むが、これはｈＩＬ－２２におけるアミノ酸の数である。それは、少なくとも１５０アミノ酸、少なくとも１６０アミノ酸、少なくとも１７０アミノ酸またはさらに少なくとも１８０アミノ酸を含み得る。本発明の誘導体は、上記範囲内の任意の長さのタンパクを含み得るが、それらは典型的には、長さが１４６～１８０アミノ酸である。
【0055】
本発明の誘導体は、ネイティブまたはバリアントアミノ酸配列を有するかどうかにかかわらず、ＩＬ－２２タンパク質に共有結合した脂肪酸を含む。脂肪酸は典型的には、リンカーによってＩＬ－２２タンパク質に共有結合する。脂肪酸及びリンカーは好適には、アミド結合を介して互いに接続され、リンカーは、ＩＬ－２２タンパク質に共有結合する。よって、脂肪酸及びリンカーは、ＩＬ－２２タンパク質上に側鎖として存在し得る。共有結合した脂肪酸は、ＩＬ－２２活性に悪影響を及ぼさないことは発明者にとって驚くべきことであった。脂肪酸結合がさらなる利点、例えば、半減期の延長に関連することは特に驚くべきことであった。
【0056】
脂肪酸は、任意の好適な脂肪酸であり得る。特に、脂肪酸は、式Ｉ：
ＨＯＯＣ－（ＣＨ２）ｘ－ＣＯ－＊，
（式中、ｘは、１０～１８、任意に１２～１８、１４～１６または１６～１８の範囲の整数であり、＊は、ＩＬ－２２タンパク質またはリンカーの結合点を示す）のものであり得る。それは脂肪二酸、例えば、Ｃ１２、Ｃ１４、Ｃ１６、Ｃ１８またはＣ２０二酸であり得る。有利には、脂肪酸はＣ１６またはＣ１８二酸、最も有利にはそれはＣ１８二酸である。
ＨＯＯＣ－（ＣＨ２）ｘ－ＣＯ－＊，
（式中、ｘは、１０～１８、任意に１２～１８、１４～１６または１６～１８の範囲の整数であり、＊は、ＩＬ－２２タンパク質またはリンカーの結合点を示す）のものであり得る。それは脂肪二酸、例えば、Ｃ１２、Ｃ１４、Ｃ１６、Ｃ１８またはＣ２０二酸であり得る。有利には、脂肪酸はＣ１６またはＣ１８二酸、最も有利にはそれはＣ１８二酸である。
【0057】
例えば、式Ｉにおける－（ＣＨ２）ｘ－は、ｘが１０である直鎖アルキレンであり得る。この脂肪酸は好都合には、Ｃ１２二酸、すなわち、１２個の炭素原子を有する脂肪ジ－カルボン酸と称され得る。代替的には、式Ｉにおける－（ＣＨ２）ｘ－は、ｘが１２である直鎖アルキレンであり得る。この脂肪酸は好都合には、Ｃ１４二酸、すなわち、１４個の炭素原子を有する脂肪ジ－カルボン酸と称され得る。同様の様式において、式Ｉにおける－（ＣＨ２）ｘ－は、ｘが１４（Ｃ１６二酸）、１６（Ｃ１８二酸）または１８（Ｃ２０二酸）である直鎖アルキレンであり得る。好適には、第１の態様の誘導体は、Ｃ１４、Ｃ１６、Ｃ１８またはＣ２０二酸；より好適には、Ｃ１６またはＣ１８二酸、さらにより好適にはＣ１８二酸を含む。
【0058】
二酸は、アルブミンと非共有結合性会合を形成することが可能であり、それにより血流における誘導体の循環を促進し得る。より短い二酸（例えば、Ｃ１６二酸）は、より低いアルブミン親和性を有し、よって、より長い二酸（例えば、Ｃ１８二酸）よりも短い半減期を有する。しかしながら、それらは依然として、１日を超えるヒトにおける予測される半減期を有する長期に作用する誘導体である。
【0059】
脂肪酸結合はまた、それ自体で、タンパク質分解に対してＩＬ－２２タンパク質を安定化する。得られる半減期は典型的には、ＩＬ－２２－Ｆｃ融合体のものと類似する（すなわち、ｈＩＬ－２２と比較して大幅に改善される）。
【0060】
第１の態様の誘導体は、脂肪酸及びＩＬ－２２タンパク質の特定の組み合わせを含み得る。例えば、Ｃ１４、Ｃ１６、Ｃ１８またはＣ２０二酸は、ｈＩＬ－２２の位置１におけるＣｙｓ残基及び／またはＮ末端Ｇ－Ｐ－Ｇを含むＩＬ－２２タンパク質に結合され得る。一例では、第１の態様の誘導体はＣ１８二酸を含み、ＩＬ－２２タンパク質は、ｈＩＬ－２２の位置１におけるＣｙｓ残基及びＮ末端Ｇ－Ｐ－Ｇの両方を含む。
【0061】
上記のように、脂肪酸は好適には、ＩＬ－２２タンパク質に結合されるリンカーに接続される。リンカーは、１つ以上のアミノ酸、例えば、１つ以上のＧｌｕ及び／またはＬｙｓ残基を含む、いくつかのリンカー要素を含み得る。リンカーは、オキシエチレングリシン単位または複数の連結されたオキシエチレングリシン単位、任意にそのような２～５単位、有利には２単位を含み得る。１つ以上のＯＥＧ残基、Ｃ２ＤＡ及び／またはＡｃ基が代替的にまたは追加的に含まれ得る。リンカーは、Ｃｙｓ反応性単位を含み得る。「Ｃｙｓ反応性単位」は、本明細書で使用される場合、Ｃｙｓの硫黄原子と反応して炭素－硫黄共有結合を生成することが可能な機能性単位を意味し得る。Ｃｙｓ反応性単位は、いくつかの形態のいずれかを有し得るが、好適には、脱離基に結合した炭素原子を含み、その脱離基は、炭素－硫黄結合の形成中にＣｙｓの硫黄原子と置き換わる。脱離基は、ハロゲン、任意に臭素原子であり得る。この臭化物脱離基は、アクタミド官能基に対してアルファであり得；有利にはそれは、ブロモ－アセトアミド官能基である。脱離基は代替的に、メシレートもしくはトシレート形態の官能化ヒドロキシル基、または非官能化ヒドロキシル基であり得る。さらに、脱離基は、マレイミドまたは他の官能基であり得る。例示的なリンカーには、γＧｌｕ－ＯＥＧ－ＯＥＧ－Ｃ２ＤＡ－Ａｃ、γＧｌｕ－γＧｌｕ－γＧｌｕ－γＧｌｕ－ＯＥＧ－ＯＥＧ－εＬｙｓ－αＡｃ及びγＧｌｕ－ＯＥＧ－ＯＥＧ－εＬｙｓ－αＡｃが含まれるが、任意の好適なリンカーが用いられ得る。
【0062】
脂肪酸、またはリンカーは、ＩＬ－２２タンパク質における任意のアミノ酸残基に結合され得る。この点に関する例示は、ｈＩＬ－２２アミノ酸配列におけるまたはそれに対する残基－７、－５、１、６、３３、１１３、１１４及び１５３である。ネイティブ残基は典型的には、脂肪酸またはリンカーの結合を可能にするためにＣｙｓまたはＬｙｓで置換される。代替的には脂肪酸またはリンカーは、ネイティブＣｙｓまたはＬｙｓ残基で結合され得る。好適には、脂肪酸またはリンカーは、ｈＩＬ－２２の位置１、６、３３、１１３または１１４で置換されたＣｙｓ残基、またはｈＩＬ－２２に対する位置－５、－７または１５３におけるＣｙｓ残基に結合され得る。特に、脂肪酸またはリンカーは、ｈＩＬ－２２の位置１で置換されたＣｙｓ残基に結合され得る。
【0063】
ＩＬ－２２タンパク質への脂肪酸またはリンカーの結合は、共有結合である。例えば、Ｃｙｓ反応性脂肪酸またはリンカーは、ＩＬ－２２タンパク質におけるＣｙｓ残基に脂肪酸またはリンカーを結合させるために使用され得る。脂肪酸またはリンカーは、チオエーテル結合を介してＣｙｓ残基の硫黄原子に共有結合し得る。例えば、Ｌｙｓ反応性脂肪酸またはリンカーは、ＩＬ－２２タンパク質におけるＬｙｓ残基に脂肪酸またはリンカーを結合させるために使用され得る。脂肪酸またはリンカーは代替的に、ＩＬ－２２タンパク質のＮ末端における遊離アミン（－ＮＨ２）基に共有結合され得る（位置１におけるアミノ酸にかかわらない）。結合は、準化学量論量の好適なＮ反応性種を含有する脂肪酸またはリンカーを用いるが、Ｃｙｓ結合と同じように進行し得る。脂肪酸またはリンカーは、アルデヒドの形態（Ｎ反応性種）で提供され得、従来から知られている還元的アミノ化を用いて遊離アミンに共有結合され得る。
【0064】
よって、第１の態様の誘導体は、ｈＩＬ－２２のバリアントにリンカーによって結合したＣ１４、Ｃ１６、Ｃ１８またはＣ２０二酸を含み、バリアントは、ｈＩＬ－２２の位置１でＮ末端Ｇ－Ｐ－Ｇ及びＣｙｓ残基を好適に含み、リンカーは、Ｃｙｓ残基に任意に結合されている。
【0065】
第１の態様の例示的な誘導体は、配列番号１６～２１のいずれかに示されるＩＬ－２２タンパク質を含む。特に有利な誘導体は、表３に示されており、図１～４に図示されており、本明細書に例示されている。
【0066】
【表3】
【0067】
図１Ａは、Ｃｙｓ反応性単位を含むリンカーに接続されたＣ１８二酸を示している。これは、誘導体１、２及び６～９で使用された脂肪酸及びリンカー（側鎖）である。図１Ｂは、Ｃｙｓ反応性単位を含むリンカーに接続されたＣ１６二酸を示している。これは、誘導体３、４及び１０で使用された脂肪酸及びリンカー（側鎖）である。図１Ｃは、Ｃｙｓ反応性単位を含むリンカーに接続されたＣ１４二酸を示している。これは、誘導体５で使用された脂肪酸及びリンカー（側鎖）である。
【0068】
誘導体１、６及び１０がそれぞれ図２～４に示されている。
【0069】
本発明の誘導体は異なる立体異性体で存在し得、本発明はこれらのすべてに関する。
【0070】
本発明の第２の態様によれば、第１の態様の誘導体を調製するためのプロセスであって、脂肪酸をＩＬ－２２タンパク質に共有結合させることを含む、プロセスが提供される。
【0071】
そのプロセスは、本明細書で記載または想定されるＩＬ－２２の異なる誘導体のいずれかを生成するために使用され得るが、それは、脂肪酸がバリアントＩＬ－２２タンパク質に共有結合される場合に特に有利である。よって、一実施形態では、第２の態様で用いられるＩＬ－２２タンパク質は、位置１、２１、３５、６４、１１３及び／または１１４で任意に置換された、ｈＩＬ－２２の置換形態である。例示的な置換には、Ａ１Ｃ、Ａ１Ｇ、Ａ１Ｈ、Ｎ２１Ｃ、Ｎ２１Ｄ、Ｎ２１Ｑ、Ｎ３５Ｃ、Ｎ３５Ｄ、Ｎ３５Ｈ、Ｎ３５Ｑ、Ｎ６４Ｃ、Ｎ６４Ｄ、Ｎ６４Ｑ、Ｎ６４Ｗ、Ｑ１１３Ｃ、Ｑ１１３Ｒ、Ｋ１１４Ｃ及び／またはＫ１１４Ｒが含まれる。好ましくは、ＩＬ－２２タンパク質は、位置１でＣｙｓ残基で置換される。
【0072】
脂肪酸は、組換え手段を含む、当該技術分野で知られている任意の手段によって得られ得る。好適な脂肪酸は、市販されており、または標準的な化学的合成を使用して利用可能な出発物質から誘導される。
【0073】
ＩＬ－２２タンパク質は、組換え手段を含む、当該技術分野で知られている任意の手段によって得られ得る。組換えｈＩＬ－２２の生成は、先行記載されており、当該技術分野でよく知られている。所望のバリアントＩＬ－２２タンパク質は、類似する手法で生成され得る。その分野における熟練した調査者は、所望のバリアントＩＬ－２２タンパク質をコードする好適な核酸配列を容易に特定することができるであろう。よって、当業者は、当該技術分野における既存の知識に基づいて、本発明のこの部分を容易に実施することができるであろう。好適には、ＩＬ－２２タンパク質は、標準的な技術を使用して、哺乳動物システムにおいて、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞において生成される。ポリヒスチジンタグ（Ｈｉｓ－ｔａｇ）は、組換えタンパク質のアフィニティー精製を補助するために用いられ得る。
【0074】
この点に関して、本発明において使用されるＩＬ－２２タンパク質は、発現後に切断可能なＨｉｓ－ｔａｇ－ニッケルカラムに対する親和性によって精製され得る１０個未満、好ましくは６個のヒスチジン残基の－Ｎ－またはＣ末端付加を使用して調製され得る。Ｈｉｓ－ｔａｇは、既知のプロテアーゼによって消化されて遊離ＩＬ－２２タンパク質をもたらし得るリンカーを介してタンパク質のＮまたはＣ末端に連結される。切断可能なＨｉｓ－ｔａｇは、アミノ酸配列ＨＨＨＨＨＨＧＧＳＳＧＳＧＳＥＶＬＦＱ（配列番号２５）を有し得、プロテアーゼで切断可能なリンカーは、タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）リンカー（ネイティブ切断部位についてのコンセンサス配列がＥＮＬＹＦＱ＼Ｓ（配列番号２６）である）（「＼」は切断されるペプチド結合を示す）またはＥＶＬＦＱコンセンサス切断部位を有するヒトライノウイルス－１４ ３Ｃ（ＨＲＶ１４－３Ｃ）プロテアーゼ切断性リンカーであり得る。切断は、２．５μｇのタンパク質及び１０ｍＭの２－メルカプトエタノールと共におよそ１０μｇのプロテアーゼを室温で４時間インキュベーションすることによって達成され得る。
【0075】
本発明をさらに説明するために、タンパク質調製のための代表的プロセスが以下のとおり提供される。プロセスは、ＩＬ－２２タンパク質の所望のアミノ酸配列をコードするプラスミドＤＮＡを調製することを含む。このプラスミドは、細胞株、例えばＣＨＯ－Ｋ１に一過性にトランスフェクションされ得、その細胞株は、成長が既知のエンハンサーの添加によって増大する前に関連する培地において成長させられる。次いで分泌されたＩＬ－２２タンパク質は、遠心分離及び滅菌濾過の既知の方法を介して採取され得、それからタンパク質がニッケルカラムで精製される。濃縮及び緩衝液交換の後、Ｈｉｓ－ｔａｇがＨＲＶ１４－３Ｃプロテアーゼを使用して除去されてから、脂肪酸でのアルキル化（以下にさらに記載される）ならびに最終精製及び緩衝液交換がなされる。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、サイズ排除クロマトグラフィーまたは脱グリコシル化を伴うまたは伴わないタンデム質量分析を伴う液体クロマトグラフィー（ＬＣ－ＭＳ－ＭＳ）を使用する最終生成物の分析が、最終生成物の品質を確保するために使用され得る。
【0076】
脂肪酸は、第１の態様について記載されるように直接的にまたはリンカーを使用してＩＬ－２２タンパク質に共有結合され得る。リンカーは、当該技術分野で知られている任意の手段によって得られ得る。脂肪酸及びリンカー（用いられる場合）を調製するための代表的な方法は以下のとおりである（誘導体１０で使用されたＣ１６二酸によって例示されるが、任意の誘導体が類似の方法を使用して作製され得る）。
【0077】
ジクロロメタン（５００ｍｌ）中のＮ－（ベンゾイルオキシカルボニルオキシ）スクシンイミド（１００ｇ、４０１ｍｍｏｌ）の溶液をジクロロメタン（７５０ｍｌ）中のエチレンジアミン（１８９ｍｌ、２．８１ｍｏｌ）の溶液に添加する。３０分後、懸濁液を濾過し、洗浄し、真空中で濃縮する。残渣をトルエン（７５０ｍｌ）で希釈し、洗浄し、ジクロロメタン（４×２００ｍｌ）で抽出し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、真空中で濃縮し、ヘキサン（２００ｍｌ）で希釈する。エーテル（１００ｍｌ、４００ｍｍｏｌ）中の塩酸の４Ｍ溶液を溶液に添加し、得られた懸濁液を真空中で濃縮し、ヘキサン（１ ｌ）で希釈する。沈殿した固体を濾過し、ヘキサンで洗浄し、真空中で乾燥させ、（２－アミノエチル）カルバミン酸ベンジルエステル塩酸塩を白色の粉末として得る。
【0078】
２－クロロトリチル樹脂１００－２００に｛２－［２－（９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシカルボニルアミノ）－エトキシ］－エトキシ｝－酢酸（Ｆｍｏｃ－Ａｄｏ－ＯＨ、１７．５ｇ、４５．４ｍｍｏｌ）をロードする。Ｆｍｏｃ基を除去し、Ｎ，Ｎジメチルホルムアミド（１４０ｍｌ）中の０－６－クロロ－ベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（ＴＣＴＵ、２４．２ｇ、６８．１ｍｍｏｌ）及びＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（２１．４ｍｌ、１２３ｍｍｏｌ）の溶液を樹脂に添加し、混合物を１時間振盪する。樹脂は濾過され、洗浄される。Ｆｍｏｃ基を前述のように２０％ピペリジンでの処置によって除去する。樹脂を前述のように洗浄する。
【0079】
Ｎ，Ｎジメチルホルムアミド（１４０ｍｌ）中の（Ｓ）－２－（フルオレン－９－イルメトキシカルボニルアミノ）－ペンタン二酸１－ｔｅｒｔ－ブチルエステル（Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ－ＯｔＢｕ、２９．０ｇ、６８．１ｍｍｏｌ）、ＴＣＴＵ（２４．２ｇ、６８．１ｍｍｏｌ）及びＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（２１．４ｍｌ、１２３ｍｍｏｌ）の溶液を樹脂に添加し、混合物を１時間振盪する。樹脂を濾過し、前述のように洗浄する。Ｆｍｏｃ基を前述のように２０％ピペリジンでの処置によって除去する。樹脂を前述のように洗浄する。
【0080】
Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド／ジクロロメタン混合物（４：１、２００ｍｌ）中の１６－ｔｅｒｔ－ブトキシ）－１６－オキソヘキサデカン酸（２３．３ｇ、６８．１ｍｍｏｌ）、ＴＣＴＵ（２４．２ｇ、６８．１ｍｍｏｌ）及びＮ，Ｎジイソプロピルエチルアミン（２１．４ｍｌ、１２３ｍｍｏｌ）の溶液を樹脂に添加する。樹脂を１時間振盪し、濾過し、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（３×２５０ｍｌ）、ジクロロメタン（２×２５０ｍｌ）、メタノール（２×２５０ｍｌ）及びジクロロメタン（６×２５０ｍｌ）で洗浄する。生成物を、１８時間の２，２，２－トリフルオロエタノール（２５０ｍｌ）での処置によって樹脂から切断する。樹脂は、濾過し、ジクロロメタン（２×２５０ｍｌ）、２－プロパノール／ジクロロメタン混合物（１：１、２×２５０ｍｌ）、２－プロパノール（２５０ｍｌ）及びジクロロメタン（３×２５０ｍｌ）で洗浄する。
【0081】
溶液を組み合わせ、溶媒を蒸発させ、粗生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィーによって精製する。純粋な（Ｓ）－２２－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）－４１，４１－ジメチル－１０，１９，２４，３９－テトラオキソ－３，６，１２，１５，４０－ペンタオキサ－９，１８，２３－トリアザドテトラコンタン酸を真空中で乾燥させ、淡黄色の粘度が高い黄色の油として得る。
【0082】
その後、２－（７－アザ－１Ｈ－ベンゾトリアゾール－１－イル）－１，１，３，３－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ、１１．４ｇ、３０．１ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン（８．７７ｍｌ、６２．９ｍｍｏｌ）を、乾燥ジクロロメタン（１１０ｍｌ）中の（Ｓ）－２２－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）－４１，４１－ジメチル－１０，１９，２４，３９－テトラオキソ－３，６，１２，１５，４０－ペンタオキサ－９，１８，２３－トリアゾドテトラコンタン酸（２２．４ｇ、２７．４ｍｍｏｌ）の溶液に添加する。トリエチルアミン（７２ｍｌ、４１．０ｍｍｏｌ）を乾燥ジクロロメタン（１６５ｍｌ）中の（２－アミノ－エチル）－カルバミン酸ベンジルエステル塩酸塩（６．９４ｇ、３０．１ｍｍｏｌ）の懸濁液に添加し、得られた混合物を上記溶液に添加する。混合物を室温で一晩撹拌し、次いで乾燥するまで蒸発させる。残渣を再溶解し、洗浄する；無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、カラムクロマトグラフィー（シリカゲル６０、０．０４０～０．０６０ｍｍ；溶離剤：ジクロロメタン／メタノール９５：５）で蒸発させて１５－［（Ｓ）３－（２－｛２－［（２－｛２－［（２－ベンジルオキシカルボニルアミノ－エチルカルバモイル）－メトキシ］－エトキシ｝エチル－カルバモイル）メトキシ］エトキシ）－エチルカルバモイル）－１－ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニルプロピルカルバモイル］－ペンタデカン酸ｔｅｒｔ－ブチルエステルを淡黄色の粘度の高い油として得る。
【0083】
パラジウム担持炭素（１０％、１．２７ｇ、１．２０ｍｍｏｌ）をメタノール（３５０ｍｌ）中の上記化合物（２３．８ｇ、２４．０ｍｍｏｌ）の溶液に添加し、得られた混合物を標準圧で４時間水素化する。触媒を濾過し、濾液を乾燥するまで蒸発させる。残渣を、メタノールの残渣を除去するためにジクロロメタンから数回蒸発させ、真空中で乾燥させてｔｅｒｔ－ブチル（Ｓ）－１－アミノ－２５－ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）－４，１３，２２，２７－テトラオキソ－６，９，１５，１８－テトラオキサ－３，１２，２１，２６－テトラアザドテトラコンタン－４２－オエートを粘度の高い無色の油として生成する。
【0084】
Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（４．９８ｍｌ、２８．６ｍｍｏｌ）を乾燥ジクロロメタン（２９０ｍｌ）中の上記アミン（２０．５ｇ、２３．８ｍｍｏｌ）の溶液に－３０℃でアルゴン下で添加する。臭化ブロモアセチル（２．４８ｍｌ、２８．６ｍｍｏｌ）を滴下添加し、得られた溶液を－３０℃でさらに３時間撹拌する。冷却浴を除去し、混合物を室温で１時間撹拌し、溶媒を真空中で除去する。残基を酢酸エチル（４５０ｍｌ）に再溶解し、クエン酸（３００ｍｌ）の５％水溶液で洗浄する。相は１時間以内に分離される。有機層を一晩放置して分離して３つの層を得る。透明な水性層を除去し、残りの２つの相を臭化カリウムの飽和水溶液（１００ｍｌ）と共に振盪する。有機層を一晩放置して分離し、水相を除去し、有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥させる。溶媒を真空中で除去し、残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー：ジクロロメタン／メタノール９５：５）によって精製してｔｅｒｔブチル（Ｓ）－１－ブロモ－２８－ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）－２，７，１６，２５，３０－ペンタオキソ－９，１２，１８，２１－テトラオキサ－３，６，１５，２４，２９－ペンタアザペンタ－テトラコンタン－４５－オエートを無色の固体として得る。
【0085】
上記化合物（１９．５ｇ、１９．８ｍｍｏｌ）をトリフルオロ酢酸（１２０ｍｌ）に溶解し、得られた溶液を室温で１．５時間撹拌する。トリフルオロ酢酸を真空中で除去し、残基をジクロロメタン（６×２００ｍｌ）から蒸発させる。ジエチルエーテル（２００ｍｌ）を油性残渣に添加し、混合物を一晩撹拌して懸濁液を得る。固体生成物を濾過し、ジエチルエーテル及びヘキサンで洗浄し、真空中で乾燥させて所望の生成物１５－｛（Ｓ）－１－カルボキシ３－［２－（２－｛［２－（２－｛［２－（２－ブロモアセチルアミノ）エチルカルバモイル］メトキシ｝－エトキシエチル－カルバモイル］メトキシ｝エトキシル－エチルカルバモイル］プロピルカルバモイル｝ペンタデカン酸を白色の粉末として得る。
【0086】
ＩＬ－２２タンパク質への脂肪酸またはリンカーの共有結合は、当該技術分野で標準的な手順を使用して行われ得る。よって、リンカーは、用いられる場合、脂肪酸へのＩＬ－２２タンパク質の共有結合を可能とする。非限定的な例として、Ｃｙｓ反応性脂肪酸またはリンカーをＩＬ－２２タンパク質におけるＣｙｓ残基の硫黄原子と反応させ、これによりチオエーテル結合を形成し得る。共有結合工程のための好適な条件が以下のとおり例示され得る：水中のトリスをトリス及びＮａＣｌ－緩衝液（１．３５ｍｇ／ｍｌ）中のＩＬ－２２タンパク質（７０ｍｇ）に添加して、ｐＨ８に調整する。水に溶解したビス（ｐ－スルホナトフェニル）－フェニルホスフィン二水和物二カリウム（ＢＳＰＰ）塩（１２ｍｇ）を添加し、４時間室温で穏やかに撹拌する。エタノール（０．５ｍｌ）中の１５－｛（Ｓ）－１－カルボキシ－３－［２－（２－｛［２－（２－｛［２－（２－ブロモアセチルアミノ）－エチルカルバモイル］エトキシ｝エトキシ）エチルカルバモイル］メトキシ｝エトキシ）エチルカルバモイル］プロピル－カルバモイル｝ペンタデカン酸（１９ｍｇ、０．０２２ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を一晩撹拌する。ＭｉｌｉＱ水（１５０ｍｌ）を添加して伝導率を２．５ｍＳ／ｃｍまで低下させる。次いで混合物を、結合緩衝液（２０ｍＭトリス、ｐＨ８．０）、溶出緩衝液（２０ｍＭトリス、５００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．０）、フロー６ｍｌ及び６０カラム体積で０～８０％の溶出緩衝液の勾配を使用してＭｏｎｏＱ １０／１００ ＧＬカラムで陰イオン交換を使用して精製する。
【0087】
本発明の誘導体は、当該技術分野で知られている任意の好適な手順、例えば、クロマトグラフィー、電気泳動、溶解度差または抽出を使用して精製され得る。
【0088】
本明細書に記載されるように、発明者は、驚くべきことに、脂肪酸がＩＬ－２２タンパク質に共有結合することができた一方で、生物学的活性を維持したことを見出した。ＩＬ－２２に対するそのような最小の改変は、極めて長い循環半減期と組み合わされた高い効力（ｈＩＬ－２２と近い）をもたらすことができたことが特に驚くべきことであった。この特定の特性の組み合わせが非常に所望であり得る。
【0089】
誘導体の効力は、ヒトＩＬ－２２受容体を発現する全細胞を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイで決定され得る。例えば、ヒトＩＬ－２２受容体の反応は、ＩＬ－２２Ｒ１、ＩＬ－１０Ｒ２及びホスホ－ＳＴＡＴ３（ｐＳＴＡＴ３）反応性レポーター遺伝子を過剰発現するベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞を使用して測定され得る。代替的には、ＩＬ－２２受容体を内因的に発現するＨｅｐＧ２細胞が使用され得る。受容体の活性化は、ＳＴＡＴ３シグナル伝達経路の活性化につながり、これは、例えば、ＳＴＡＴ３誘導プロモーターを有するルシフェラーゼレポーター遺伝子を使用してまたはｐＳＴＡＴ３をアッセイすることによって測定され得る。そのようなアッセイの非限定的な例は実施例２に記載されている。ｉｎ ｖｉｖｏ効力は、当該技術分野で知られているように、動物モデルまたは臨床試験において決定され得る。
【0090】
最大半量有効濃度（ＥＣ５０）値はしばしば、薬物の効力の指標として使用される。これは、最大効果の５０％をもたらすのに必要とされる薬物の濃度を表すので、ＥＣ５０値が低いほど効力が良好である。本発明の誘導体は好適には、１．５ｎＭ未満、１．２５ｎＭ未満、１ｎＭ未満、０．７５ｎＭ未満、０．５ｎＭ未満、０．２５ｎＭ未満またはさらに０．１ｎＭ未満の、細胞におけるＩＬ－２２受容体媒介ＳＴＡＴ３活性化を使用して測定された効力（ＥＣ５０値）を有する（例えば、実施例２において記載されているように決定される）。本発明の誘導体は好適には、１５ｎＭ未満、１２ｎＭ未満、１０ｎＭ未満、７ｎＭ未満またはさらに５ｎＭ未満の、細胞におけるｐＳＴＡＴ３をアッセイすることによって測定される効力（ＥＣ５０値）を有する（例えば、実施例２において記載されているように決定される）。
【0091】
有利には、ＩＬ－２２の誘導体の効力は、ＩＬ－２２－Ｆｃ融合体のものよりも高い場合がある。例えば、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈは、ｈＩＬ－２２と比較して、そのＩＬ－２２－Ｆｃ融合体であるＵＴＴＲ１１４７Ａについてｉｎ ｖｉｔｒｏ効力の３４分の１の減少を報告した（Ｓｔｅｆａｎｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，２０１８，１５２：２２４－２３５）。一方、ｈＩＬ－２２への脂肪酸の共有結合は、７分の１の効力減少しか引き起こさないことが示された（実施例における誘導体１参照）。ＩＬ－２２－Ｆｃ融合体及び本発明の誘導体の両方は、ｈＩＬ－２２に対するそれらの改善された半減期及び少なくとも一部の状況における生物学的機能の観点から同等であり得るが、本発明の誘導体は、効力の最小限の喪失というさらなる利点を有し得る。
【0092】
誘導体の循環消失半減期（Ｔ１／２）は、マウス、ラットまたはミニブタなどの好適な動物モデルにおいて誘導体を皮下または静脈内に投与することによってｉｎ ｖｉｖｏで決定され得る。好適な方法は実施例１に記載されている。非限定的な例として、第１の態様の誘導体は、少なくとも１時間、少なくとも３時間、少なくとも５時間またはさらに少なくとも８時間の、マウスへの皮下または静脈内投与後の循環半減期を有する。誘導体は、少なくとも３時間、少なくとも５時間、少なくとも８時間、少なくとも１０時間またはさらに少なくとも１３時間の、ラットへの皮下または静脈内投与後の循環半減期を有し得る。誘導体は、少なくとも２５時間、少なくとも４０時間、少なくとも７０時間またはさらに少なくとも１００時間の、ミニブタへの皮下または静脈内投与後の循環半減期を有し得る（すべては、例えば、実施例１に記載されているように決定される）。
【0093】
本明細書で例示されているように、発明者はまた、本発明の誘導体がｉｎ ｖｉｖｏで急速に吸収されることを見出した。有利には、誘導体の吸収は、ＩＬ－２２－Ｆｃ融合体のものよりも早く生じ得る。平均吸収時間は、取り込みを測定するための正確なパラメータであるが、なぜならそれは、用量及び薬物投与後の最大血漿濃度とは無関係だからである。それは、平均滞留時間、すなわち、吸収が完了した後に排泄前に身体において薬物が存在する時間に基づいて計算され得る。本発明の誘導体は好適には、１００時間未満、９０時間未満、８０時間未満、７０時間未満またはさらに６０時間未満の平均吸収時間を有する（例えば、実施例１に記載されているように決定される）。
【0094】
本発明の誘導体はまた、良好な生物物理学的特性、例えば、高い物理的安定性及び／または溶解性を有し、これらは当該技術分野における標準的な方法を使用して測定され得る。
【0095】
そのため、本発明の第３の態様によれば、第１の態様の誘導体及び薬学的に許容可能なビヒクルを含む薬学的組成物が提供される。
【0096】
第３の態様の薬学的組成物は、本明細書で記載または想定されるＩＬ－２２の異なる誘導体のいずれかを含み得る。好適には、それは、誘導体１～１０として本明細書で特定されるＩＬ－２２の誘導体のうちの１つを含む。
【0097】
第１の態様の誘導体、または第３の態様の薬学的組成物は好適には、ｈＩＬ－２２と比較して増加した循環消失半減期を示す。有利にはそれは、ｈＩＬ－２２と比較して少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも１００％またはそれ以上増加した循環消失半減期を示す。
【0098】
第３の態様の薬学的組成物は、治療的有効量の第１の態様の誘導体を薬学的に許容可能なビヒクルと組み合わせるによって調製され得る。様々な賦形剤を用いた薬学的活性成分の製剤化は、当該技術分野で知られている。
【0099】
第１の態様の誘導体の「治療的有効量」は、対象に投与された場合に、疾患、障害または病態を処置するまたは所望の効果をもたらすために必要とされる誘導体の量である任意の量である。
【0100】
例えば、使用される誘導体の治療的有効量は、約０．００１ｍｇ～約１０００ｍｇ、好ましくは約０．０１ｍｇ～約５００ｍｇであり得る。誘導体の量は、約０．１ｍｇ～約１００ｍｇ、最も好ましくは約０．５ｍｇ～約５０ｍｇの量であることが好ましい。指針として、本明細書に記載の実施例３においてマウスで使用された誘導体の用量は０．５ｍｇ／ｋｇであった（皮下投与された）。
【0101】
「薬学的に許容可能なビヒクル」は、本明細書で言及される場合、薬学的組成物の製剤化において有用であることが当業者に知られている任意の既知の化合物または既知の化合物の組み合わせである。
【0102】
一実施形態では、薬学的に許容可能なビヒクルは、固体であり得；任意に組成物は、再懸濁のための粉末の形態であり得る。固体の薬学的に許容可能なビヒクルは、香味剤、滑沢剤、可溶化剤、懸濁剤、色素、充填剤、流動促進剤、不活性結合剤、防腐剤または色素としても作用し得る１つ以上の物質を含み得る。ビヒクルはまた、カプセル化物質であり得る。粉末において、ビヒクルは、微細化された本発明による誘導体と混合された微細化された固体である。粉末は好ましくは、最大で９９％の誘導体を含有する。好適な固体ビヒクルには、例えば、リン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、糖類、ラクトース、デキストリン、デンプン、ゼラチン、セルロース及びイオン交換樹脂が含まれる。
【0103】
別の実施形態では、薬学的ビヒクルはゲルであり得、組成物はクリームなどの形態であり得る。
【0104】
しかしながら、薬学的ビヒクルは液体であり得；任意に薬学的組成物は溶液の形態であり得る。液体ビヒクルは、溶液、懸濁液、エマルション、シロップ、エリキシル及び加圧組成物の調製において使用される。本発明による誘導体は、薬学的に許容可能な液体ビヒクル、例えば、水、有機溶媒、その両方の混合物または薬学的に許容可能な油または脂肪に溶解または懸濁され得る。液体ビヒクルは、他の好適な薬学的添加剤、例えば、可溶化剤、乳化剤、緩衝液、防腐剤、甘味料、香味剤、懸濁剤、増粘剤、着色剤、粘度調整剤、安定化剤または浸透圧調整剤を含有し得る。非経口投与のための液体ビヒクルの好適な例には、水（上記添加剤、例えば、セルロース誘導体、好ましくはカルボキシメチルセルロースナトリウム溶液を部分的に含有する）、アルコール（一価アルコール及び多価アルコール、例えば、グリコールを含む）及びそれらの誘導体、ならびに油（例えば、分画されたココナッツ油及びラッカセイ油）が含まれる。非経口投与の場合、ビヒクルはまた、油性エステル、例えば、オレイン酸エチル及びミリスチン酸イソプロピルであり得る。滅菌液体ビヒクルは、非経口投与のための滅菌液体形態の組成物において有用である。加圧組成物のための液体ビヒクルは、ハロゲン化炭化水素または他の薬学的に許容可能なプロペラントであり得る。
【0105】
よって、本発明の薬学的組成物を調製するためのプロセスは、当該技術分野において標準的である通常の工程を含み得る。
【0106】
そのため、本発明の第４の態様によれば、療法において使用するための、第１の態様の誘導体または第３の態様の薬学的組成物が提供される。対象を本発明の誘導体、またはそれを含む薬学的組成物で処置する方法も提供される。本明細書で記載または想定されるＩＬ－２２の異なる誘導体のいずれかは、本発明のこれらの態様に明示的に含まれる。
【0107】
「処置すること」及び「療法」などの用語には、本明細書で使用される場合、疾患、障害または病態の処置、改善または予防が明示的に含まれる。
【0108】
ＩＬ－２２の誘導体またはそれを含む薬学的組成物は、処置される対象に直接的に投与され得る。誘導体または薬学的組成物は、吸入、注射、局所的または眼科的を含む任意の手段によって投与され得る。吸入によって投与される場合、それは鼻または口を介するものであり得る。好ましくは、誘導体または薬学的組成物は、注射によって、典型的には皮下または静脈内に投与される。そのため、誘導体は、それらのより小さなサイズ及びより高い効力のため、投与（例えば、注射、吸入、局所適用または眼送達）のそれらの柔軟性においてＦｃ融合体を上回る明らかな利点を有する。処置される対象への本発明の誘導体の投与は、ｈＩＬ－２２と比較して増加した循環時間をもたらすこと、及びこれは疾患、障害または病態の処置を補助することが理解される。上記のとおり、「処置すること」にはまた、疾患、障害または病態を改善すること及び予防することが含まれる。
【0109】
滅菌溶液または懸濁液である液体薬学的組成物は、例えば、筋肉内、髄腔内、硬膜外、腹腔内及び特に皮下または静脈内注射によって利用され得る。誘導体は、滅菌水、生理食塩水または他の適切な滅菌注射媒体を使用して投与時に溶解または懸濁され得る滅菌固体組成物として調製され得る。
【0110】
吸入に有用な形態には、滅菌溶液、エマルション及び懸濁液が含まれる。代替的には、誘導体は、Ｄｉｓｃｈａｌｅｒ（登録商標）またはＴｕｒｂｏｈａｌｅｒ（登録商標）を介して微粉末またはエアロゾルの形態で投与され得る。鼻吸入剤は好適には、微粉末またはエアロゾル鼻スプレーまたは改変されたＤｉｓｃｈａｌｅｒ（登録商標）もしくはＴｕｒｂｏｈａｌｅｒ（登録商標）の形態であり得る。
【0111】
局所製剤には、溶液、クリーム、フォーム、ゲル、ローション、軟膏、ペースト、チンキ剤及び粉末が含まれる。それらは経皮であり得、すなわち、皮膚に直接的に適用され、または粘膜に適用され得る。
【0112】
眼投与のための製剤は典型的には、局所適用のための溶液、懸濁液及び軟膏、例えば、点眼の形態である。代替的には滅菌溶液または懸濁液は、眼内注射によって利用され得る。誘導体は、滅菌水、生理食塩水または他の適切な滅菌注射媒体を使用して投与時に溶解または懸濁され得る滅菌固体組成物として調製され得る。製剤は、結膜下、硝子体内、球後または前房内注射のためのものであり得る。
【0113】
本発明のための誘導体または薬学的組成物は、それを必要とする任意の対象に投与され得る。「対象」は、本明細書で使用される場合、脊椎動物、哺乳動物または家畜であり得る。よって、本発明による誘導体及び組成物は、任意の哺乳動物、例えば、家畜（例えば、ウマ）、ペットを処置するために使用され得、または他の獣医学的用途において使用され得る。最も好ましくは、対象はヒトである。誘導体及び組成物は、疾患、障害または病態の兆候をすでに示している者のみに投与される必要はない。むしろ、それらは、将来のそのような疾患、障害または病態の可能性に対する純粋な予防的手段として明らかに健康な対象に投与され得る。
【0114】
本発明によるＩＬ－２２の誘導体及び組成物は、疾患、障害または病態を処置するために単独療法（すなわち、その誘導体または組成物の単独使用）で使用され得ることが理解される。代替的には、本発明による誘導体及び組成物は、疾患、障害または病態を処置するための既知の療法の補助として、またはそれと組み合わせて使用され得る。
【0115】
必要とされるＩＬ－２２の誘導体の量は、その生物学的活性、半減期及びバイオアベイラビリティによって決定され、それは今度は、投与様式、誘導体及び組成物の生理化学的特性、及びそれが単独療法として使用されるかまたは併用療法において使用されるかに依存することが理解される。投与の頻度はまた、処置されている対象内の誘導体の半減期によって影響を受け得る。投与される最適な投薬量は、当業者によって決定され得、使用中の特定の誘導体、薬学的組成物の強度、投与様式、及び疾患、障害または病態の進展によって変わる。対象年齢、体重、性別、食餌及び投与の時間を含む、処置されている特定の対象に依存するさらなる要因は、投薬量を調整する必要性をもたらす。
【0116】
通常、０．００１μｇ／ｋｇ体重～１０ｍｇ／ｋｇ体重の間の本発明によるＩＬ－２２の誘導体の１日用量が、どの誘導体または組成物が使用されるかに応じて、疾患、障害または病態を処置するために使用され得る。より好ましくは、１日用量は、０．０１μｇ／ｋｇ体重～１ｍｇ／ｋｇ体重の間、より好ましくは０．１μｇ／ｋｇ～５００μｇ／ｋｇ体重の間、最も好ましくはおよそ０．１μｇ／ｋｇ～１００μｇ／ｋｇ体重の間である。
【0117】
ＩＬ－２２の誘導体または組成物は、疾患、障害または病態の発症の前、間または後に投与され得る。１日用量は、単回投与（例えば、単回の１日注射）として提供され得る。代替的には、誘導体または組成物は、１日に２回またはそれ以上の回数の投与を必要とし得る。例として、誘導体は、２回（処置されている疾患、障害または病態の重症度に応じて２回以上）の０．０７μｇ～７００ｍｇの間の１日用量（すなわち、７０ｋｇの体重を想定）で投与され得る。処置を受ける患者は、起床すると第１の用量を摂取し、次いで第２の用量を夕方に（２用量レジームの場合）又その後３時間もしくは４時間間隔で摂取し得る。用量は代替的に、週１回、２週間毎または月１回、またはそれ以上の頻度で、例えば、週２回または３回で提供され得る。既知の手順、例えば、薬学産業で従来から用いられているもの（例えば、ｉｎ ｖｉｖｏ実験、臨床試験など）が、本発明による誘導体及び組成物の特定の製剤及び正確な治療レジーム（例えば、薬剤の１日用量及び投与の頻度）を生成するために使用され得る。
【0118】
多くの研究が特に肺、肝臓、腸、腎臓、皮膚、膵臓及び胸腺における複数の上皮傷害モデルでのＩＬ－２２の重要な効果を実証してきた。機構的に、例えば、抗アポトーシス、増殖、自然免疫、抗酸化ストレス、抗線維化、及び幹細胞／前駆細胞動員におけるいくつかの経路は、複数の調査者による研究においてＩＬ－２２の効果を媒介することがよく立証されている。ヒト細胞株を使用してｉｎ ｖｉｔｒｏでまたはヒトｅｘ ｖｉｖｏモデル（例えば、初代ヒト腸管オルガノイド）で重要な機構的知見がさらに確認されている。そのため、上皮傷害における細胞死の防止、再生の確保、及び炎症の制御におけるＩＬ－２２の強力な役割がよく確立されている。
【0119】
多くの研究は、傷害に供された遺伝子モデル（ＩＬ－２２ノックアウトまたはトランスジェニック過剰発現）を分析することによって実施される。これらの研究において、ＩＬ－２２の欠如またはＩＬ－２２過剰発現が傷害の時点で存在する。他の研究において、ＩＬ－２２は、傷害の時点で抗体で中和され、いくつかの場合では、ＩＬ－２２は、急性傷害期を超えて（例えば、亜急性でまたは再生期に十分に入って）中和される。他の研究は、外因的に投与されたＩＬ－２２の効果を調べることによって処置シナリオにより近づけている。利用可能な文献を総体的に調べると、異なるモデルは、ノックアウト、過剰発現、傷害前もしくは後のＩＬ－２２中和または外因性タンパク質投薬にかかわらず、傷害した器官を保護し、再生を促進するＩＬ－２２の同じ実体を表すことに気づくことが重要である。このことは、ＩＬ－２２処置潜在性のための広い用途及び広い時間ウインドウを示し、また、ｈＩＬ－２２よりも長期に作用するＩＬ－２２タンパク質が必要とされる理由を示している。
【0120】
よって、本発明の第５の態様によれば、代謝、肝臓、肺、腸、腎臓または皮膚の疾患、障害または病態を処置する方法において使用するための、第１の態様の誘導体または第３の態様の薬学的組成物が提供される。本明細書で記載または想定されるＩＬ－２２の異なる誘導体のいずれかは、本発明のこの態様に明示的に含まれる。
【0121】
代謝疾患、障害または病態は、肥満、１型糖尿病、２型糖尿病、脂質異常症、高血糖または高インスリン血症であり得る。
【0122】
肝臓疾患、障害または病態は、ＮＡＦＬＤ、ＮＡＳＨ、肝硬変、アルコール性肝炎、急性肝不全、慢性肝不全、ＡＣＬＦ、アセトアミノフェン誘導性肝臓毒性、急性肝臓傷害、硬化性胆管炎、胆汁性肝硬変または手術もしくは移植によって引き起こされる病理学的状態であり得る。
【0123】
肺疾患、障害または病態は、ＣＯＰＤ、嚢胞性線維症、気管支拡張症、特発性肺線維症、急性窮迫症候群、化学的傷害、ウイルス感染症、細菌感染症または真菌感染症であり得る。
【0124】
腸疾患、障害または病態は、ＩＢＤ、潰瘍性結腸炎、クローン病、ＧｖＨＤ、化学的傷害、ウイルス感染症または細菌感染症であり得る。
【0125】
腎臓疾患、障害または病態は、急性腎臓疾患または慢性腎臓疾患であり得る。
【0126】
皮膚疾患、障害または病態は、創傷、炎症性疾患またはＧｖＨＤであり得る。
【0127】
ＩＬ－２２処置に対して反応性の病態、例えば、上記疾患、障害または病態のうちの１つ以上を有する対象をＩＬ－２２の誘導体、またはそれを含む薬学的組成物で処置する方法も提供される。
【0128】
ＩＬ－２２の誘導体は、本発明の第１の態様について特定された特徴のすべてを有する。薬学的組成物は、本発明の第３の態様について特定された特徴のすべてを有する。ＩＬ－２２処置に対して反応性の病態、例えば、上記疾患、障害または病態のうちの１つ以上を有する対象を処置する方法は、本発明の第４の態様について特定された特徴のすべてを有する。
【0129】
本明細書に記載されるどのＩＬ－２２の誘導体または組成物がどの患者に投与されるべきであるかに関する制限はない。むしろ、本明細書に記載の誘導体及び組成物のいずれかが、本明細書に記載される任意の患者に投与され得ることが意図される。
【0130】
本明細書（任意の添付の特許請求の範囲、要約書及び図面を含む）に記載の特徴のすべて、及び／またはそれにより開示される任意の方法またはプロセスの工程のすべては、そのような特徴及び／または工程の少なくとも一部が相互に排他的である組み合わせを除き、上記の態様のいずれかと任意の組み合わせで組み合わされ得る。
【0131】
本発明のより良好な理解のため、及び同一の実施形態がどのように実現され得るかを示すために、これより実施例を参照するが、本発明を限定することはどのようにも意図されていない。
【実施例】
【0132】
実施例に記載の研究で用いられた物質及び方法は、別段示されない限り、以下のとおりである。
【0133】
誘導体
表４は、データセットで表されるＩＬ－２２の誘導体及び比較物の概要を提供する。
表４は、データセットで表されるＩＬ－２２の誘導体及び比較物の概要を提供する。
【0134】
ＩＬ－２２の誘導体は、様々な骨格、脂肪酸のタイプ及び共有結合の部位を有し、よって、本発明に包含される誘導体の多様性の代表的なものであった。すべての場合において使用されたリンカーは、γＧｌｕ－ＯＥＧ－ＯＥＧ－Ｃ２ＤＡ－Ａｃであった。すべての場合においてリンカーは、誘導体２（－７Ｃ）、４（－７Ｃ）、８（６Ｃ）及び９（３３Ｃ）を除き、残基１Ｃに結合された。誘導体７は、１Ｃにおける共有結合を例示する一方で、それは、１Ｃで共有結合した脂肪酸を有する他の誘導体のすべてに存在するＧ－Ｐ－Ｇ Ｎ末端ペプチドを欠く。
【0135】
比較物はｈＩＬ－２２、ｈＦｃ－ｈＩＬ－２２（組換え融合タンパク質）及びｈＩＬ－２２バリアント（すなわち、１つ以上の骨格バリエーションのみを有するｈＩＬ－２２）であった。
【0136】
【表4】
【0137】
例について生成された誘導体の品質管理分析を以下のように行った。
【0138】
脱グリコシル化後のサンプルにおいて２０μｌの１ｍｇ／ｍｌのサンプルを２μｌのＮ－グリコシダーゼＦに室温で４８時間添加することによってタンパク質のインタクトな質量を決定した。次いでサンプルをＰＢＳでｐＨ７．４で０．２ｍｇ／ｍｌまで希釈し、Ｗａｔｅｒｓ ＭａｓｓＬｙｎｘ ４．１を有するＷａｔｅｒｓ Ｓｙｎａｐｔ Ｇ２に接続されたＳｙｎａｐｔ Ｇ２を使用して分析した。１０－９０ Ｃｏｌｕｍｎ Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＢＥＨ Ｃ４ １．７μｍ １ｘ１００ｍｍを以下の移動相（複数可）：Ａ：水中０．１％ギ酸；及びＢ：アセトニトリル、０．０９％ギ酸で使用した。流速は１２０μｌ／分、ＵＶ２１４ｎｍ（２０ｐｔｓ／ｓ）であり、勾配は表５に示されているとおりであった。
【0139】
【表5】
【0140】
結果が表６に示されている。
【0141】
【表6】
【0142】
よって、品質管理データは、意図された誘導体が実際に生成されたことを実証した。
【0143】
以下は、請求された発明を示すために意図されたにすぎない例示されたプロトコルである。研究で用いられた動物及び時間経過の正確な数字は、当業者に知られているように変更され得る。
【0144】
実施例１－薬物動態研究
方法
マウス（ｎ＝２７）、ラット（ｎ＝４～８）及びミニブタ（ｎ＝２～５）において選択された誘導体について薬物動態研究を行った。ＩＬ－２２の誘導体は、比較物としてのｈＩＬ－２２、ｈＦｃ－ｈＩＬ－２２及び／またはｈＩＬ－２２バリアントと並行して試験した。
方法
マウス（ｎ＝２７）、ラット（ｎ＝４～８）及びミニブタ（ｎ＝２～５）において選択された誘導体について薬物動態研究を行った。ＩＬ－２２の誘導体は、比較物としてのｈＩＬ－２２、ｈＦｃ－ｈＩＬ－２２及び／またはｈＩＬ－２２バリアントと並行して試験した。
【0145】
（ｉ）マウス＆ラット
３０匹の８週齢のＣ５７Ｂｌ／６雄マウス及び５匹のＳｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ雄ラットをＴａｃｏｎｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから入手した。マウスを１０匹の群で飼育した。動物を実験前の１週間馴化させた。薬物動態計算のために重要である、投薬の前の体重を測定した。動物は、食物及び水へのアクセスができて、実験を通して起きていた。
３０匹の８週齢のＣ５７Ｂｌ／６雄マウス及び５匹のＳｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ雄ラットをＴａｃｏｎｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから入手した。マウスを１０匹の群で飼育した。動物を実験前の１週間馴化させた。薬物動態計算のために重要である、投薬の前の体重を測定した。動物は、食物及び水へのアクセスができて、実験を通して起きていた。
【0146】
すべての誘導体及び比較物は、マウスで使用する場合はＰＢＳ、ｐＨ７．４中の０．３ｍｇ／ｍｌ溶液、及びラットで使用する場合は０．５ｍｇ／ｍｌ溶液として調製した。マウスでは２．０ｍｇ／ｋｇの用量を試験した。ラットでは１ｍｇ／ｋｇの用量を試験した。
【0147】
誘導体及び比較物を動物に皮下投与した。血液サンプルを投薬後の特定の時点で採取した。
【0148】
マウスではスパージサンプリングを使用した；よって、２７匹のマウスにＩＬ－２２の誘導体または比較物を投薬し、血液サンプルを以下の時点の各々で３匹の異なるマウスから採取した：５分、１５分、３０分、４５分、６０分、７５分、９０分、１０５分、１２０分、１５０分、３時間、４時間、６時間、８時間、１６時間、２４時間、３２時間及び４８時間。そのため、各マウスは、研究の過程において２つのサンプルしか採取されなかった。最後のサンプルが採取された後、マウスを頸椎脱臼によって安楽死させた。
【0149】
５匹のラットにＩＬ－２２の誘導体または比較物を投薬し、３つの血液サンプルを以下の時点の各々で採取した：５分、１５分、３０分、４５分、６０分、７５分、９０分、１０５分、１２０分、１５０分、３時間、４時間、６時間、８時間及び２４時間。各ラットは、研究の過程において１７個のサンプルが採取された。最後のサンプルが採取された後、ラットを二酸化炭素によって安楽死させた。
【0150】
血液サンプル（１００μｌ）をマウス及びラットから舌血液によって採取し、ＥＤＴＡチューブ（Ｍｉｃｒｏｖｅｔｔｅ（登録商標）ＶｅｔＭｅｄ ２００ Ｋ３Ｅ，Ｓａｒｓｔｅｄｔ ｎｒ ０９．１２９３．１００）に移した。採血から２０分以内に血液を８０００Ｇ、４℃で５分間遠心分離した。血漿サンプル（４０～５０μｌ）をハーフマイクロニックチューブに移した。
【0151】
（ｉｉ）ミニブタ
およそ１５ｋｇの体重を有する９ヶ月齢の雌のＧｏｔｔｉｎｇｅｎミニブタをＥｌｌｅｇａａｒｄ Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ Ｍｉｎｉｐｉｇｓ Ａ／Ｓから入手した。手術（カテーテルの挿入）前におよそ１８日間の馴化期間を設け、その間、ミニブタを社会化し、カテーテルからの皮下投薬及び血液サンプリングのために訓練した。手術の３～５日前にミニブタを一匹で飼育した。投薬の６日前に、すべてのミニブタに２つの中心静脈カテーテル（Ｃｏｏｋ Ｍｅｄｉｃａｌ、Ｃ－ＴＰＮＳ－６．５－９０－ＲＥＤＯ、ケイ素、サイズ６．５フレンチ、１０６ｃｍ長タイプＴＰＮ）を挿入し、これにより研究開始（投薬）の少なくとも５日前の手術後に回復時間を設けた。
およそ１５ｋｇの体重を有する９ヶ月齢の雌のＧｏｔｔｉｎｇｅｎミニブタをＥｌｌｅｇａａｒｄ Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ Ｍｉｎｉｐｉｇｓ Ａ／Ｓから入手した。手術（カテーテルの挿入）前におよそ１８日間の馴化期間を設け、その間、ミニブタを社会化し、カテーテルからの皮下投薬及び血液サンプリングのために訓練した。手術の３～５日前にミニブタを一匹で飼育した。投薬の６日前に、すべてのミニブタに２つの中心静脈カテーテル（Ｃｏｏｋ Ｍｅｄｉｃａｌ、Ｃ－ＴＰＮＳ－６．５－９０－ＲＥＤＯ、ケイ素、サイズ６．５フレンチ、１０６ｃｍ長タイプＴＰＮ）を挿入し、これにより研究開始（投薬）の少なくとも５日前の手術後に回復時間を設けた。
【0152】
すべての誘導体及び比較物をＰＢＳ、ｐＨ７．４中の溶液として調製した。使用した用量は、０．１ｍｇ／ｋｇ（静脈内投与）または０．２ｍｇ／ｋｇ（皮下投与）であった。
【0153】
ミニブタを投薬中にプロポフォールで軽く麻酔をかけた。長い中心カテーテルを介して静脈内注射をミニブタに投与した。投与後、カテーテルを１０ｍｌの滅菌生理食塩水でフラッシュした。２５Ｇの針を使用して５ｍｍの深さで皮下注射を行った。逆流を避けるために針を注射後１０秒間皮膚内で維持した。
【0154】
血液サンプルをミニブタから静脈内投薬後の以下の時点で採取した：１．５時間、２時間、３時間、４時間、６時間、８時間、１０時間、１２時間、２４時間、２８時間、４８時間、７２時間、９６時間、１４４時間、１６８時間、１９２時間、２１６時間、２４０時間、２６４時間、３１２時間、３３６時間、３６０時間、３８４時間、４０８時間、４３２時間及び４８０時間。血液サンプルを皮下投薬後の以下の時点で採取した：１．５時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、８時間、１０時間、１２時間、１４時間、１６時間、１８時間、２０時間、２２時間、２４時間、２６時間、２８時間、４６時間、５２時間、７２時間、９６時間、１４４時間、１６８時間、１９２時間、２１６時間、２４０時間、２６４時間、３１２時間、３３６時間、３６０時間、３８４時間、４０８時間、４３２時間及び４８０時間。
【0155】
ミニブタから血液サンプル（１ｍｌ）をＥＤＴＡチューブ（１．６ｍｇ Ｋ３ＥＤＴＡ／ｍｌ血液をもたらすためのＫ３ＥＤＴＡを含有する１．３ｍｌチューブ（Ｓａｒｓｔｅｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ））内に収集した。サンプルを遠心分離（１０分、４℃、２０００Ｇ）まで最大で３０分間湿った氷上で維持した。２００μｌの血漿をＩＬ－２２の誘導体または比較物の測定のためのマイクロニックチューブに移し、分析まで－２０℃で保存した。
【0156】
（ｉｉｉ）サンプル処理
ＩＬ－２２の誘導体または比較物の血漿レベルを、先行記載されているインハウスで開発された発光酸素チャネリング（ＬＯＣＩ（登録商標））アッセイを使用して測定した（Ｐｏｕｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｂｉｏｍｏｌ Ｓｃｒｅｅｎ，２００７，１２（２）：２４０－７）。アッセイ中に、濃度依存的ビーズ－分析物－免疫複合体が形成されて光出力が生じ、これをＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｅｎｖｉｓｉｏｎリーダーで測定した。ビーズに対する抗体のカップリング、抗体のビオチン化及びＬＯＣＩアッセイ手順は、先行記載されているように実施した（Ｐｅｔｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ Ｂｉｏｍｅｄ，２０１０，５１（１）：２１７－２４）。キャリブレータ及び品質管理（ＱＣ）サンプルを研究サンプルとして同じマトリックスで生成した。アッセイ精度（％ＣＶ）をアッセイし、試験されたサンプルのすべてについて２０％未満であることが示された。
ＩＬ－２２の誘導体または比較物の血漿レベルを、先行記載されているインハウスで開発された発光酸素チャネリング（ＬＯＣＩ（登録商標））アッセイを使用して測定した（Ｐｏｕｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｂｉｏｍｏｌ Ｓｃｒｅｅｎ，２００７，１２（２）：２４０－７）。アッセイ中に、濃度依存的ビーズ－分析物－免疫複合体が形成されて光出力が生じ、これをＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｅｎｖｉｓｉｏｎリーダーで測定した。ビーズに対する抗体のカップリング、抗体のビオチン化及びＬＯＣＩアッセイ手順は、先行記載されているように実施した（Ｐｅｔｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ Ｂｉｏｍｅｄ，２０１０，５１（１）：２１７－２４）。キャリブレータ及び品質管理（ＱＣ）サンプルを研究サンプルとして同じマトリックスで生成した。アッセイ精度（％ＣＶ）をアッセイし、試験されたサンプルのすべてについて２０％未満であることが示された。
【0157】
アッセイは、抗ヒトＩＬ－２２モノクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＭＡＢ７８２２）がコンジュゲーションされたアクセプタービーズをビオチン化モノクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＢＡＭ７８２１；ヒトＩＬ－２２に対して生成された）及びノーブランドのストレプトアビジンが被覆されたドナービーズと共に使用した。ラット血漿におけるヒトＩＬ－２２についての定量の下限（ＬＬＯＱ）は、４ｐＭであった。しかしながら、各誘導体または比較物は、同じ誘導体のキャリブレータ列に対して測定した。ｈＩＬ－２２に対する各誘導体または比較物の交差反応性を測定し、アッセイ感受性を調整するために使用した。
【0158】
血漿濃度－時間プロファイルをミニブタについてＰｈｏｅｎｉｘ ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ ６．４（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ Ｉｎｃ）でノンコンパートメント分析（ＮＣＡ）を使用して測定した。個々の濃度を使用し、１／（Ｙ＊Ｙ）によって計量し、線形対数台形を使用して計算を実施した。循環消失半減期（Ｔ１／２）が主要なスクリーニングパラメータであったため静脈内投薬を使用した。クリアランス及び分布容積は、対象となる二次的パラメータであり、よって、研究の１日目での幾つもの血液サンプルの理由であった。
【0159】
マウス及びラットにおける薬物動態を評価するために測定された唯一のパラメータは循環消失半減期（Ｔ１／２）であった。ミニブタにおいて、測定された追加のパラメータは、薬物投与後の最大（ピーク）血漿濃度（Ｃｍａｘ）、Ｃｍａｘに達するまでの時間（Ｔｍａｘ）、薬物用量について正規化された血漿薬物濃度－時間曲線下面積（ＡＵＣ；薬物の用量の投与後の薬物に対する実際の身体曝露を反映する）（ＡＵＣ／Ｄ）、平均滞留時間（ＭＲＴ；すなわち、吸収が完了した後に排泄前に身体において薬物が存在する時間）、平均吸収時間（ＭＡＴ）及び投与された用量の全身利用可能性（すなわち、バイオアベイラビリティ；Ｆ）であった。ＭＡＴは、皮下投与後のＭＲＴ（ＭＲＴＳＣ）から静脈内投与後のＭＲＴ（ＭＲＴＩＶ）を減算したものとして計算される。
【0160】
結果
表７はマウスで得られたを示しており、表８はラットで得られたを示しており、表９及び１０はミニブタで得られた結果を示している。ＮＤ＝未決定。ＩＶ＝静脈内投与。ＳＣ＝皮下投与。
表７はマウスで得られたを示しており、表８はラットで得られたを示しており、表９及び１０はミニブタで得られた結果を示している。ＮＤ＝未決定。ＩＶ＝静脈内投与。ＳＣ＝皮下投与。
【0161】
【表7】
【0162】
表７に示されるように、骨格バリエーションのみを有するｈＩＬ－２２バリアント（比較物１及び３）は、投与経路にかかわらず、短い循環半減期を有していた。Ｆｃ融合体（ｈＦｃ－ｈＩＬ－２２）での延長は、半減期をかなり増加させた。脂肪酸の共有結合（Ｃ１８二酸；誘導体１及び６）は、マウスにおいて中間的な循環半減期をもたらした。ＩＬ－２２の誘導体は、マウスにおいて、皮下投与された場合、静脈内と比較してより長い間循環した。
【0163】
【表8】
【0164】
表８に示されるように、骨格バリエーションのみを有するｈＩＬ－２２バリアント（比較物１）は、短い循環半減期を有していた。脂肪酸の共有結合（誘導体１、３及び６）は、用いられた脂肪酸（Ｃ１６対Ｃ１８二酸）及び投与経路にかかわらず、ラットにおいて増加した循環半減期をもたらした。ＩＬ－２２の誘導体は典型的には、皮下投与された場合、静脈内と比較してより長い間循環した。
【0165】
【表9】
【0166】
表９に示されるように、骨格バリエーションのみを有するｈＩＬ－２２バリアント（比較物１及び２）は、ｈＩＬ－２２と匹敵する短い循環半減期を有していた。比較物のＦｃ融合体（ｈＦｃ－ｈＩＬ－２２）及びＩＬ－２２の誘導体のすべて（誘導体１、６及び１０）は、有意に増加した循環半減期を有していた。ＩＬ－２２の誘導体は、ミニブタにおいて静脈内投与された場合、５０時間を超える循環半減期を有し、これは比較物のＩＬ－２２－Ｆｃ融合体と同等であった。
【0167】
【表10】
【0168】
表１０に示されるように、ＩＬ－２２の誘導体（誘導体６）について、比較物のＦｃ融合体（ｈＦｃ－ＩＬ－２２）と比較してより早いＭＡＴが実証された。ＭＡＴは、Ｔｍａｘを単純に比較するよりも正確な薬物の取り込みの指標であり、なぜならそれは、Ｃｍａｘの相違も考慮に入れるからである（Ｔｍａｘは、用量及びＣｍａｘの両方によって影響を受ける）。ミニブタは、それらのヒトとの類似性により、マウスまたはラットではなく、この研究に使用された。
【0169】
結論
既知の脂肪酸アルキル化ＧＬＰ－１誘導体であるセマグルチドは、ミニブタにおいて４６時間の半減期（Ｌａｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ，２０１５，５８（１８）：７３７０－８０）及びヒトにおいて１６０時間の半減期を有し、これは２のピーク対トラフ比を有する週１回投薬プロファイルに対応する。Ｆｃ－融合ＧＬＰ－１誘導体であるデュラグルチドの半減期も同様である。
既知の脂肪酸アルキル化ＧＬＰ－１誘導体であるセマグルチドは、ミニブタにおいて４６時間の半減期（Ｌａｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ，２０１５，５８（１８）：７３７０－８０）及びヒトにおいて１６０時間の半減期を有し、これは２のピーク対トラフ比を有する週１回投薬プロファイルに対応する。Ｆｃ－融合ＧＬＰ－１誘導体であるデュラグルチドの半減期も同様である。
【0170】
そのため、皮下投与された場合の少なくとも４０時間及び静脈内投与された場合の５０時間超の、ミニブタにおけるＩＬ－２２の誘導体によって実証された半減期は、２のピーク対トラフ比を有するヒトにおける週１回投薬プロファイルに対応することが想定される。
【0171】
よって、データは、本発明の誘導体が、ＩＬ－２２の循環半減期を増加させ、最適化された薬物動態及び薬力学的特性を実証し、代謝、肝臓、肺、腸、腎臓、眼、胸腺、膵臓、及び皮膚の疾患、障害及び病態を含む多様な範囲の適応症のための新規かつ改善された処置を提供する。
【0172】
実施例２－ｉｎ ｖｉｔｒｏ効力研究
方法
２つのｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイを効力を研究するために用いた。
方法
２つのｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイを効力を研究するために用いた。
【0173】
１つ目は、ＩＬ－２２Ｒａ、ＩＬ－１０Ｒｂ及びルシフェラーゼがＳＴＡＴ３誘導プロモーターと共に三重でトランスフェクションされたＢＨＫ細胞におけるレポーター遺伝子アッセイであった。これは、ＩＬ－２２受容体媒介ＳＴＡＴ３活性化を測定した高感度のハイスループットアッセイである。
【0174】
以下のプラスミドを使用して安定なレポーターＢＨＫ細胞株を生成した：（ｉ）ｐｃＤＮＡ３，１ｈｙｇｒｏ（＋）におけるｈＩＬ－１０Ｒｂ、（ｉｉ）ｐｃＤＮＡ３，１（Ｚｅｏｃｉｎ）におけるＩＬ２２Ｒ及び（ｉｉｉ）ｐＧＬ４．２０における２ｘＫＺｄｅｌ２。よって、細胞株は、ｐＳＴＡＴ３駆動プロモーターの制御下でヒトＩＬ－１０Ｒｂ、ヒトＩＬ－２２Ｒａ及びルシフェラーゼレポーターを発現した。
【0175】
アッセイプロトコルの０日目に、９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ＃３８４２、黒色、透明底）において１５，０００～２０，０００細胞／ウェルで細胞を基礎培地（５００ｍｌの場合：ＤＭＥＭ＋Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ，ｃａｔ．番号：３１９６６－０２１）、１０％（ｗ／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＣＳ；アルブミンを含有する）（５０ｍｌ）及び１％（ｗ／ｖ）ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）（５ｍｌ））に播種した。１日目に、プレートを反転させることによって培地を除去した。新たな基礎培地を１ウェル当たり５０μｌで添加し、細胞を６０分間インキュベーションした。
【0176】
ＩＬ－２２の誘導体を、比較物としてのｈＩＬ－２２及び骨格バリエーションのみを有するｈＩＬ－２２バリアントと並行して試験した。各誘導体または比較物を試験するために使用された動物の「ｎ」数は、１～３６の範囲であった。
【0177】
よって、５０μｌの希釈された誘導体または比較物（基礎培地に希釈した）を各ウェルに添加し、プレートを４時間放置した。そのため、誘導体及び比較物は、既にウェルにおいて５０μｌの培地に希釈されていたので、２倍希釈された。１００μｌのＳｔｅａｄｙｌｉｔｅ＋試薬（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ｃａｔ番号６０６６７５９）を添加することによって刺激を４時間後に終了させた。プレートをＴｏｐＳｅａｌ Ａで封止し、４５０ｒｐｍで１５分間振盪し、次いで１２時間後よりも前にＭｉｔｈｒａｓまたは同様のシステムを使用して読み取った。
【0178】
データ分析をＧｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍを使用して実施した。各誘導体または比較物の最大半量有効濃度（ＥＣ５０）を、その効力の指標として評価した。ＥＣ５０は、Ｌｏｇ（化合物）対反応－可変スロープ（４ｐ）を使用して決定した。ヒルスロープを標準として１に拘束した。
【0179】
２番目のｉｎ ｖｉｔｒｏ効力アッセイは、ＩＬ－２２Ｒａ及びＩＬ－１０Ｒｂを内因的に発現するＨｅｐＧ２細胞－ヒト肝臓由来細胞株におけるｐＳＴＡＴ３を測定した。
【0180】
１日目に、ＨｅｐＧ２細胞を９６ウェルプレート（Ｂｉｏｃｏａｔ＃３５－４４０７ Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）に２５，０００～３０，０００細胞／ウェルで播種した。播種及び継代に使用した細胞は、ＤＭＥＭ（１ｘ）＋２５ｍＭ（４．５ｇ／ｌ）グルコース、－ピルベート（Ｇｉｂｃｏ，ｃａｔ．番号６１９６５－０２６）＋１０％（ｗ／ｖ）ＦＣＳ＋１％（ｗ／ｖ）Ｐ／Ｓであった。２日目に、細胞はアッセイするための準備が整った。細胞をＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ，ｃａｔ．番号６１９６５－０２６）中の０．１％（ｗ／ｖ）ＦＣＳ（すなわち、極めて低いアルブミン濃度）で飢餓状態とした－５０μｌを各ウェルに添加し、６０分間放置した。
【0181】
技術的二連（ｔｅｃｈｎｉｃａｌ ｄｕｐｌｉｃａｔｅｓ）を使用して各誘導体または標準としての比較物の７種の濃度（０．００１、０．０１、０．１、１、１０、１００、１０００ｎＭ）で試験を実施した。よって、５０μｌの希釈された誘導体または比較物（ＤＭＥＭ中の０．１％（ｗ／ｖ）ＦＣＳに希釈した）を各ウェルに添加し、プレートを１５分間放置した。そのため、誘導体及び比較物は、既にウェルにおいて５０μｌの培地に希釈されていたので、２倍希釈された。細胞を溶解するために、培地を細胞から除去し、５０μｌの新たに調製された１ｘ溶解緩衝液（キットからのＳｕｒｅＦｉｒｅ溶解緩衝液）を各ウェルに添加した。プレートを３５０ｒｐｍで１０分間室温で撹拌した。
【0182】
ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（登録商標）ＳｕｒｅＦｉｒｅ（登録商標）ＳＴＡＴ３（ｐ－Ｔｙｒ７０５）アッセイプロトコル（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ｃａｔ．番号ＴＧＲＳ３Ｓ（５００－１０Ｋ－５０Ｋ））に従ってＳＴＡＴ３のＩＬ－２２誘導リン酸化を測定した。この点に関して、４μｌのライセートをアッセイのための３８４ウェルプロキシプレートに移した（４μｌの陽性対照及び陰性対照を添加した）。使用直前に、アクセプターミックスを調製した（反応緩衝液に活性化緩衝液を５倍希釈し、希釈された緩衝液にアクセプタービーズを５０倍希釈することによって）。５μｌのアクセプターミックスを各ウェルに添加し、プレートをＴｏｐｓｅａｌ Ａ接着フィルムで封止し、室温で２時間インキュベーションした。使用直前に、ドナーミックスを調製した（希釈緩衝液にドナービーズを２０倍希釈することによって）。２μｌのドナーミックスを薄明かりの下でウェルに添加した。プレートをＴｏｐｓｅａｌ Ａ接着フィルムで再度封止し、室温で２時間インキュベーションした。プレートをＡｌｐｈａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ－適合性プレートリーダーで読み取った。
【0183】
Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍを使用してデータ分析を実施した。まず、ＰｒｉｓｍにおいてＬｏｇ（化合物）対反応－可変スロープ（４ｐ）分析を使用して非線形回帰を行った。ヒルスロープを１に拘束した。次いで対照化合物（Ｈｉｓタグ付きｈＩＬ－２２またはｈＩＬ－２２のいずれか）からのＹ＝最高値をＰｒｉｓｍにおいて正規化のために使用した。各データセットにおいて０％を最小値に設定し、１００％を上記非線形回帰（対照について）からのＹ＝最高値に設定した。非線形回帰を上述したように繰り返し、試験された誘導体の％活性／ｗｔ及びＥＣ５０をそれぞれ最高値及びＥＣ５０下の結果において読み取った。
【0184】
結果
表１１は、ＩＬ－２２受容体媒介ＳＴＡＴ３活性化についてのＢＨＫ細胞レポーター遺伝子アッセイで測定された重要な誘導体及び比較物のＥＣ５０を示している。
表１１は、ＩＬ－２２受容体媒介ＳＴＡＴ３活性化についてのＢＨＫ細胞レポーター遺伝子アッセイで測定された重要な誘導体及び比較物のＥＣ５０を示している。
【0185】
【表11】
【0186】
ＢＨＫ細胞アッセイは高量のアルブミンを含有していたので、測定されたＥＣ５０は、誘導体を試験した場合にアルブミン結合の効果を組み込んでいた。
【0187】
骨格バリエーションのみを有するＩＬ－２２バリアントである比較物４は、ｈＩＬ－２２と同等効力であることが示された。比較物４と同じ骨格を有するが、中親和性アルブミン結合剤（Ｃ１６二酸）に共有結合した誘導体３は、効力がｈＩＬ－２２と比較して４分の１の減少を示した。この場合も同じ骨格を有するが、高親和性アルブミン結合剤（Ｃ１８二酸）に共有結合した誘導体１は、効力がｈＩＬ－２２と比較して７分の１の減少しか示さなかった。
【0188】
アルキル化位置及び骨格バリエーションのスキャンを、誘導体６～９の結果を比較することによって３５Ｑ、６４Ｑバックグラウンド（すなわち、変異した３つのＩＬ－２２グリコシル化部位のうち２つ）におけるオフセットを用いて実施した。これらの誘導体における共有結合部位は、表面露出していることが予測され、受容体結合に関与しない位置を同定するＩＬ－２２構造の分析に基づいて選択された。これらの誘導体で得られた結果は、Ｃｙｓ置換及び脂肪酸共有結合がいくつかの（選抜）位置で許容され得ることを実証し、これは発明者にとって驚くべきことであった。
【0189】
表１２は、ｐＳＴＡＴ３についてのＨｅｐＧ２細胞アッセイで測定された重要な誘導体及び比較物のＥＣ５０を示している。
【0190】
【表12】
【0191】
受容体が内因性発現レベルであり、シグナル増幅がほとんどなく、アルブミンなしのＨｅｐＧ２細胞アッセイにおいて、誘導体１は、ｈＩＬ－２２と比較して２．５分の１に減少した効力（誘導体１と同じ骨格を有するが脂肪酸を有さないｈＩＬ－２２バリアントである比較物４と類似する）を有していた。
【0192】
表１３は、Ｎ末端伸長における脂肪酸共有結合及びグリコシル化部位の変異を評価するためにＢＨＫ及びＨｅｐＧ２細胞アッセイの両方の結果を並べている。ＮＤ＝未決定。
【0193】
【表13】
【0194】
誘導体６は、追加のＮ３５Ｑ及びＮ６４Ｑ置換（変異した３つのグリコシル化部位のうちの２つ）によって誘導体１とは異なるが、それらは同等効力である（誘導体６については効力をわずかに低下させる傾向を有する）。
【0195】
誘導体２及び４は、１５－ｍｅｒのＮ末端伸長部を有し、伸長部において脂肪酸結合のためのＣｙｓ残基（－７Ｃ）を有するが、これは、驚くべきことに良好に許容されることが示されている。
【0196】
結論
試験された本発明の誘導体における脂肪酸共有結合で観察された効力減少は主に、アルブミン結合によって促進され、骨格置換はほとんど寄与しなかった。これは、比較物４及びｈＩＬ－２２の驚くべき同等効力によって実証された。比較において、前述したように、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈは、ＩＬ－２２のそのＦｃ融合体についてｉｎ ｖｉｔｒｏ効力の３４分の１の減少を報告している。
試験された本発明の誘導体における脂肪酸共有結合で観察された効力減少は主に、アルブミン結合によって促進され、骨格置換はほとんど寄与しなかった。これは、比較物４及びｈＩＬ－２２の驚くべき同等効力によって実証された。比較において、前述したように、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈは、ＩＬ－２２のそのＦｃ融合体についてｉｎ ｖｉｔｒｏ効力の３４分の１の減少を報告している。
【0197】
極めて低いアルブミンレベルでのＨｅｐＧ２細胞アッセイにおいて、誘導体１（ＢＨＫアッセイ（アルブミン結合を伴う）において７分の１の効力減少を示したＩＬ－２２の誘導体）は、ｈＩＬ－２２と比較して効力が２．５分の１の減少しか示さなかった。
【0198】
誘導体１及び６の同等効力（表１３）は、３５Ｑ及び６４Ｑ変異が驚くべきことに効力に対する影響を伴わずに許容されることを示した。
【0199】
よって、ＩＬ－２２の誘導体は、アルブミンの存在下で高い効力を維持し、アルブミンの非存在下でｈＩＬ－２２とほぼ同等効力である。Ｃｙｓ置換及び脂肪酸共有結合は、いくつかの位置において許容される。
【0200】
よって、データは、本発明の誘導体が良好なバイオアベイラビリティ及び効力を示し、代謝、肝臓、肺、腸、腎臓及び皮膚の疾患、障害及び病態を含む多様な範囲の適応症のための新規かつ改善された処置を提供する。
【0201】
実施例３－糖尿病におけるｉｎ ｖｉｖｏ有効性研究
この研究は、糖尿病マウスモデルにおける８～１６日間の本発明の誘導体の１日１回の投薬の効果を調査するために設計された。研究は、投薬が開始する前に糖尿病病理が発症したことを意味する、処置（予防ではない）様式で行われた。マウスモデルは脂肪肝臓（レプチン受容体ノックアウト）を有するので、それはまた、肝臓疾患の代謝モデルとして機能する。
この研究は、糖尿病マウスモデルにおける８～１６日間の本発明の誘導体の１日１回の投薬の効果を調査するために設計された。研究は、投薬が開始する前に糖尿病病理が発症したことを意味する、処置（予防ではない）様式で行われた。マウスモデルは脂肪肝臓（レプチン受容体ノックアウト）を有するので、それはまた、肝臓疾患の代謝モデルとして機能する。
【0202】
方法
７～８週齢の雄のＣ５７ＢＫＳ ｄｂ／ｄｂマウスをＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手し（－１０日目）、実験の開始前の少なくとも１週間馴化させた。到着から１週間後（－３日目）、マウスを無作為化し、１０匹の群で（または食物摂取研究の場合は単独で）飼育した。－３日目、及び研究の１～１６日目の各々で、血中グルコース及び食物摂取を測定した。
７～８週齢の雄のＣ５７ＢＫＳ ｄｂ／ｄｂマウスをＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手し（－１０日目）、実験の開始前の少なくとも１週間馴化させた。到着から１週間後（－３日目）、マウスを無作為化し、１０匹の群で（または食物摂取研究の場合は単独で）飼育した。－３日目、及び研究の１～１６日目の各々で、血中グルコース及び食物摂取を測定した。
【0203】
ＩＬ－２２の誘導体（誘導体１）を、比較物としてのＩＬ－２２のＦｃ融合体（ｈＦｃ－ｈＩＬ－２２）及び陰性対照としてのビヒクルのみと並行して試験した。各薬剤を、糖尿病ｄｂ／ｄｂマウス（各群においてｎ＝６～１０）において１～１６日目の各々で０．１、０．２５、０．５または１．０ｍｇ／ｋｇの１日１回用量で皮下投与した。誘導体／比較物／対照投薬の後に食物摂取を減少させた。
【0204】
研究期間にわたって毎日、血中グルコースを測定した。麻酔したマウスにおいて終了時に眼血液サンプルを採取した。５００μｌの血液をＥＤＴＡチューブ内に収集した。サンプルを氷上で維持し、２０分以内に６０００Ｇで４℃で５分間遠心分離した。血漿を０．７５ｍｌのマイクロニックチューブに分け、後の成分濃度の測定のために直ちに凍結した。
【0205】
誘導体または比較物濃度を測定することに加え、標的係合バイオマーカー（肝臓由来急性期タンパク質、ハプトグロビン及び血清アミロイドＰ成分（ＳＡＰ）、及び腸由来ペプチドＹＹ（ＰＹＹ））の血漿レベルを研究終了時に測定した。ハプトグロビンは、製造業者の指示書に従って市販のキットを用いてＣＯＢＡＳ装置（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）で測定した。ＰＹＹは、製造業者の指示書に従ってマウス及びラットＰＹＹを認識する市販のＥＬＩＳＡアッセイ（ＡＬＰＣＯ）を用いて測定した。ＳＡＰは、製造業者の指示書に従ってマウスペントラキシン２／ＳＡＰを認識する市販のＥＬＩＳＡアッセイ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて測定した。
【0206】
結果
研究期間にわたる血中グルコースレベルが図５及び６Ａに示されている。
研究期間にわたる血中グルコースレベルが図５及び６Ａに示されている。
【0207】
図５から分かるように、ｈＩＬ－２２及び骨格バリエーションのみを有するｈＩＬ－２２バリアント（比較物３）は、ビヒクル対照と比較して研究の過程にわたって血中グルコースを減少させなかった。
【0208】
図６Ａから分かるように、誘導体１及びｈＦｃ－ｈＩＬ－２２はいずれとも、特定の研究においてより高い定常状態曝露レベルを反映するｈＦｃ－ｈＩＬ－２２のより高い標的係合にもかかわらず、研究の最終日において誘導体１のわずかにより高い有効性を伴って正常レベルに向かって同等に血中グルコースを減少させた。処置された動物においてビヒクル対照と比較して食物摂取の減少が観察された（図６Ｂ参照）。よって、試験された誘導体は、ｈＦｃ－ｈＩＬ－２２と同様にｄｂ／ｄｂモデルにおいて血中グルコースを正常化した；上記のとおり、そのような効果はｈＩＬ－２２または比較物３では観察されなかった。
【0209】
研究終了時に測定された標的係合バイオマーカーであるハプトグロビン、ＳＡＰ及びＰＹＹのレベルが図７Ａ～Ｃにそれぞれ示されている。グラフで分かるように、３つすべての標的係合バイオマーカーは、試験された誘導体及びｈＦｃ－ｈＩＬ－２２によって上方制御され、誘導体１よりもｈＦｃ－ｈＩＬ－２２によってより上方制御された。
【0210】
図８は、誘導体６（本発明の別の誘導体、それは、２つのグリコシル化部位における追加の置換以外は誘導体１と同じである）についての用量－反応データを示している。試験された３つすべての用量（０．１、０．２５及び０．５ｍ／ｋｇ）は、血中グルコースを経時的に減少させるのに有効であり、濃度の増加と共に次第により減少した。
【0211】
結論
試験された誘導体及びｈＦｃ－ｈＩＬ－２２の両方は、ｄｂ／ｄｂモデルにおいて血中グルコースを正常化し、それによりｉｎ ｖｉｖｏ治療効果を実証している。重要なことに、そのような効果は、ｈＩＬ－２２の投薬では見られず、長期作用性の誘導体及びＦｃ融合体で得られた慢性曝露が治療効果に必要であることを実証している。抗糖尿病効果のための作用の様式はまだ十分に解明されていないが、肝臓に対するＩＬ－２２の効果（肝臓糖新生及び脂質生成）が主要な要因であると考えられる。
試験された誘導体及びｈＦｃ－ｈＩＬ－２２の両方は、ｄｂ／ｄｂモデルにおいて血中グルコースを正常化し、それによりｉｎ ｖｉｖｏ治療効果を実証している。重要なことに、そのような効果は、ｈＩＬ－２２の投薬では見られず、長期作用性の誘導体及びＦｃ融合体で得られた慢性曝露が治療効果に必要であることを実証している。抗糖尿病効果のための作用の様式はまだ十分に解明されていないが、肝臓に対するＩＬ－２２の効果（肝臓糖新生及び脂質生成）が主要な要因であると考えられる。
【0212】
食物摂取もまた、本発明の誘導体での処置によって減少することが示され、よって、肥満処置としての有効性を実証している。
【0213】
標的係合バイオマーカーもまた、誘導体及びｈＦｃ－ｈＩＬ－２２によって上方制御されることが観察された。ｄｂ／ｄｂマウスにおいて測定された特定のバイオマーカーは、ヒトに変換できることが知られている。
【0214】
皮下投与されたｈＦｃ－ｈＩＬ－２２の循環半減期（Ｔ１／２）は、特にマウスにおいて、誘導体１よりも長いことに留意することが重要である（それぞれ２０時間及び８時間のＴ１／２；表７参照）。そのため、ｈＦｃ－ｈＩＬ－２２の曝露は定常状態で高い。このことは、標的係合バイオマーカー（ハプトグロビン、ＳＡＰ及びＰＹＹ）が、ｈＦｃ－ｈＩＬ－２２群において誘導体１群よりも高かった（図７）という観察によってさらに裏付けられ、示された実験においてより高い標的係合それ自体を実証している。よって、より高い曝露及び標的係合にもかかわらず、Ｆｃ融合体（ｈＦｃ－ｈＩＬ－２２）の有効性は、１６日間の投薬研究の最後の３日間において、本発明の誘導体（誘導体１）と比較して劣っていた。
【0215】
よって、データは、本発明の誘導体が、糖尿病及び肝臓疾患のマウスモデルにおいて良好な治療的有効性を実証している。ｄｂ／ｄｂマウスにおいて測定された特定のバイオマーカーは、ヒトに変換できることが知られているので、そのような治療的有効性が同様に変換できることを予測するのは妥当である。
【0216】
実施例４－肝臓傷害におけるｉｎ ｖｉｖｏ有効性研究（ｉ）
この研究は、肝臓傷害マウスモデルにおける本発明の誘導体の投薬の効果を調査するために設計された。研究は、肝臓傷害が投薬が開始された後に初めて誘導されたことを意味する、予防様式で行われた。
この研究は、肝臓傷害マウスモデルにおける本発明の誘導体の投薬の効果を調査するために設計された。研究は、肝臓傷害が投薬が開始された後に初めて誘導されたことを意味する、予防様式で行われた。
【0217】
方法
１０週齢のＣ５７Ｂｌ／６Ｒｊマウスを入手し、研究開始前の１週間馴化させた。肝臓傷害をＡＰＡＰの単回腹腔内用量（３００ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｌ／ｋｇ）で誘導した。ＩＬ－２２の試験誘導体（誘導体１及び６）をビヒクル対照（ｎ＝５～１０）と並行して、ＡＰＡＰ投薬の２時間前に１．５ｍｇ／ｋｇで皮下に投薬した。研究は、ＡＰＡＰ投薬から２４時間後に終了した。血漿アラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）及びアスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）の測定のために最終的出血を確保した。
１０週齢のＣ５７Ｂｌ／６Ｒｊマウスを入手し、研究開始前の１週間馴化させた。肝臓傷害をＡＰＡＰの単回腹腔内用量（３００ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｌ／ｋｇ）で誘導した。ＩＬ－２２の試験誘導体（誘導体１及び６）をビヒクル対照（ｎ＝５～１０）と並行して、ＡＰＡＰ投薬の２時間前に１．５ｍｇ／ｋｇで皮下に投薬した。研究は、ＡＰＡＰ投薬から２４時間後に終了した。血漿アラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）及びアスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）の測定のために最終的出血を確保した。
【0218】
血液サンプルをヘパリン化チューブ内に収集し、血漿を分離し、分析まで－８０℃で保存した。ＡＬＴ及びＡＳＴは、製造業者の指示書に従ってＣＯＢＡＳ ｃ５０１自動分析機で市販のキット（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を使用して測定した。
【0219】
肝臓を、組織学的分析のためにホルマリン固定及びパラフィン包埋に供した。
【0220】
ｋｉ６７免疫組織化学（ＩＨＣ）染色を介して増殖を測定した。ＶＩＳソフトウェア（Ｖｉｓｉｏｐｈａｒｍ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を使用して画像分析によってＩＨＣ陽性染色を定量した。
【0221】
末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼｄＵＴＰニック末端標識（ＴＵＮＥＬ）アッセイでアポトーシスを測定した。簡潔には、パラフィン包埋された切片を有するスライドをキシレン中で脱パラフィン化し、一連の段階的なエタノールで再水和した。スライドをプロテイナーゼＫで前処理し、内因性ペルオキシダーゼ活性を過酸化水素でブロックした。ＴＵＮＥＬ混合物（ｉｎ ｓｉｔｕ細胞死検出キット、ＰＯＤ、Ｒｏｃｈｅ）をスライドに添加し、続いて西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）で増幅させ、ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）（Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎ）によって可視化した。最後に、スライドをヘマトキシリン中で対比染色し、カバーガラスで覆った。
【0222】
結果
研究の終了時のＡＬＴ及びＡＳＴの血漿レベルが図９Ａ及び９Ｂにそれぞれ示されている。ＡＬＴ及びＡＳＴの量は、誘導体１または６で処置されたマウスにおいてビヒクル／ＡＰＡＰ対照と比較して肝臓傷害の前に有意に減少することが示された。
研究の終了時のＡＬＴ及びＡＳＴの血漿レベルが図９Ａ及び９Ｂにそれぞれ示されている。ＡＬＴ及びＡＳＴの量は、誘導体１または６で処置されたマウスにおいてビヒクル／ＡＰＡＰ対照と比較して肝臓傷害の前に有意に減少することが示された。
【0223】
研究終了時のＴＵＮＥＬ陽性細胞及びｋｉ６７陽性細胞の数が図１０Ａ及び１０Ｂにそれぞれ示されている。ＴＵＮＥＬ陽性細胞の量は、誘導体１または６で処置されたマウスにおいてビヒクル／ＡＰＡＰ対照と比較して肝臓傷害の前に有意に減少することが示された。ｋｉ６７陽性細胞の量は、ＡＰＡＰ処置群間で同等であった。
【0224】
結論
ＡＬＴ及びＡＳＴは、肝臓損傷の指標として使用される肝臓酵素である。よって、誘導体１及び６は、ＡＰＡＰによって誘導された傷害に対して肝臓を保護することが示された。
ＡＬＴ及びＡＳＴは、肝臓損傷の指標として使用される肝臓酵素である。よって、誘導体１及び６は、ＡＰＡＰによって誘導された傷害に対して肝臓を保護することが示された。
【0225】
ＴＵＮＥＬアッセイの結果は、誘導体１及び６が、ビヒクル／ＡＰＡＰ対照と比較して、肝臓傷害によって引き起こされたアポトーシスに対して保護したことを示した。しかしながら、細胞増殖は、ＩＬ－２２のこれらの誘導体によって影響を受けなかった。増殖は、傷害に対する反応として生理的に上方制御されるので（対照で見られるように）、結果は、傷害の減少に増殖の減少が続かない（傷害に対する増殖の比が増加する）ので誘導体１及び６の増殖作用を実証している。
【0226】
よって、データは、本発明の誘導体が、マウスモデルにおける肝臓傷害に対する保護において良好な有効性を実証することを示している。マウスで測定された特定のバイオマーカーは、ヒトに変換できることが知られているので、観察された保護が同様に変換できるであろうということを予測するのは妥当である。
【0227】
実施例５－肺傷害におけるｉｎ ｖｉｖｏ有効性研究
この研究は、肺傷害ラットモデルにおける本発明の誘導体の投薬の効果を調査するために設計された。研究は、投薬が肺傷害が誘導される前に開始され、その後も継続されたことを意味する、予防及び処置様式の両方で行われた。
この研究は、肺傷害ラットモデルにおける本発明の誘導体の投薬の効果を調査するために設計された。研究は、投薬が肺傷害が誘導される前に開始され、その後も継続されたことを意味する、予防及び処置様式の両方で行われた。
【0228】
方法
肺傷害を誘導するために、１日目に単回用量として口腔咽頭吸入によって１００μｌのブレオマイシンを雄のＳｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットの肺に投与した（群２～６）。生理食塩水を陰性対照として投与した（群１）。
肺傷害を誘導するために、１日目に単回用量として口腔咽頭吸入によって１００μｌのブレオマイシンを雄のＳｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットの肺に投与した（群２～６）。生理食塩水を陰性対照として投与した（群１）。
【0229】
群３、４及び５における動物に（皮下注射によって）誘導体６をそれぞれ０．５、１．５または４．５ｍｇ／ｋｇで－１日目から３日目まで１日１回投薬した。群６における動物には（経口摂取によって）プレドニゾロンを１０ｍｇ／ｋｇで－１日目から３日目まで１日１回投薬した。
【0230】
ラットからの気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）における可溶性コラーゲンを測定するために、添加プロテアーゼ阻害剤カクテル含む滅菌ＰＢＳ（カルシウム及びマグネシウムを有さない）で肺を洗浄し（３×４ｍｌ）、動物当たりの洗浄物を１つのチューブに入れた。可溶性コラーゲンアッセイＳｉｒｃｏｌ Ｓ１０００（Ｂｉｏｃｏｌｏｒ）（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用してＢＡＬＦ上清における可溶性コラーゲンを測定した。
【0231】
４日目にすべての動物を剖検のために提供した（最終的安楽死）。組織病理学的試験のためにすべての動物から右肺を収集し、１０％中性緩衝ホルマリン（ＮＢＦ）で膨張固定してから、ＮＢＦ中で浸漬固定した。右尾側肺葉から３つの平行な縦断切片を切り出し、カセット０１に搭載した。右肺の前葉、中葉及び副葉も縦断切片化し、カセット０２に搭載した。
【0232】
各カセットから２つのスライドを作製し；一方のスライドをヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色したのに対し、他方をヘマトキシリン及びピクロシリウスレッド（Ｈ＆ＰＳＲ）で染色した。
【0233】
次いで各スライドに乱数発生機を使用して乱数を割り当てた。検索表をＭｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌスプレッドシートに記録し、コピーをスライド評価後に研究病理学者に提供した。そのため、１つの肺当たり６つの切片をブラインドで読み取った。
【0234】
次いで獣医学病理学者が炎症の重症度についての各々のＨ＆Ｅ染色スライドについて各切片をスコア化した（０＝なし、１＝最小、２＝軽度、３＝中程度及び４＝重度）。群当たりの平均及び中央値スコアを計算した。病理学者はまた、線維症の重症度について各々のＨ＆ＰＳＲ染色スライドについて各切片をスコア化した（０＝低から８＝高までの改変Ａｓｈｃｒｏｆｔスコアを使用した）。１群当たりの平均及び中央値スコアを計算し、ノンパラメトリックＡＮＯＶＡ、クラスカル・ウォリス検定後分析に供した。
【0235】
結果
顕微鏡的知見の概要が表１４に示されており、各群の炎症及び線維症についての平均及び中央値スコアが明らかにされている。
顕微鏡的知見の概要が表１４に示されており、各群の炎症及び線維症についての平均及び中央値スコアが明らかにされている。
【0236】
【表14】
【0237】
表１４における群１及び２を比較するによって明らかになるように、ブレオマイシンは、ラットモデルにおいて肺炎症及び線維症の両方を誘導した。平均及び中央値スコアは、群３～５、すなわち、本発明の誘導体である誘導体６で処置されたラットにおいてより低かった。これらのより低いスコアは、プレドニゾロンで処置されたラット（群６）で見られたものと同等であった。
【0238】
研究における各動物についての炎症及び線維症スコアの中央値も図１１Ａ及び１１Ｂにそれぞれ示されている。
【0239】
図１１Ａに示されるように、炎症スコアの群中央値は、陰性対照（群１）と比較してブレオマイシン／ビヒクル対照（群２）で増加した。炎症スコアの群中央値は、ブレオマイシン／ビヒクル対照と比較して、誘導体６で処置されたラット（高用量群５において有意に低下した）及びプレドニゾロンで処置されたラット（群６）において低下した。
【0240】
図１１Ｂに示されるように、線維症スコアの群中央値は、陰性対照（群１）と比較してブレオマイシン／ビヒクル対照（群２）で増加した。しかしながら、線維症スコアの群中央値は、ブレオマイシン／ビヒクル対照と比較して、誘導体６で処置されたラットにおいて低下した（また、高用量群５において有意に低下した）が、対照プレドニゾロンと比較すると低下しなかった。
【0241】
図１１Ｃに示されるように、ブレオマイシン誘導性肺傷害の後のＢＡＬＦにおける可溶性コラーゲンの量は、ブレオマイシン／ビヒクル対照（群２）において陰性対照（群１）と比較して増加し、これはプレドニゾロンでの処置では減少しなかった（群６）。しかしながら、誘導体６で処置されたラットからのＢＡＬＦでは（試験されたすべての用量にわたって）、ブレオマイシン／ビヒクル対照と比較して有意に減少した量の可溶性コラーゲンが観察された。ＢＡＬＦにおける可溶性コラーゲンは線維症についての読み取り値であるため、これらの結果は、上記で直ちに報告された組織学データを即座に確認するものである。
【0242】
結論
顕微鏡的研究の結果は、本発明の誘導体が、ラットモデルにおいてブレオマイシン誘導性肺炎症及び線維症を予防及び／または減少させることができることを示した。炎症に関して見られた効果は、肺炎症を処置するために知られているコルチコステロイドであるプレドニゾロンで観察されたものと同等であった。しかしながら、本発明の誘導体は、プレドニゾロンでは見られない、線維症に対する独自の作用を有していた。
顕微鏡的研究の結果は、本発明の誘導体が、ラットモデルにおいてブレオマイシン誘導性肺炎症及び線維症を予防及び／または減少させることができることを示した。炎症に関して見られた効果は、肺炎症を処置するために知られているコルチコステロイドであるプレドニゾロンで観察されたものと同等であった。しかしながら、本発明の誘導体は、プレドニゾロンでは見られない、線維症に対する独自の作用を有していた。
【0243】
実施例６－大腸炎におけるｉｎ ｖｉｖｏ有効性研究
この研究は、大腸炎マウスモデルにおける本発明の誘導体の投薬の効果を調査するために設計された。研究は、投薬が結腸炎が誘導された日と同じ日に開始され、その後も継続されたことを意味する、予防及び処置様式の両方で行われた。
この研究は、大腸炎マウスモデルにおける本発明の誘導体の投薬の効果を調査するために設計された。研究は、投薬が結腸炎が誘導された日と同じ日に開始され、その後も継続されたことを意味する、予防及び処置様式の両方で行われた。
【0244】
方法
食餌が与えられた雌のＣ５７Ｂｌ／６ＪＲｊマウスを体重に基づいて５つの群（１群当たりｎ＝８）に無作為化した。５群のうち４群においてＤＳＳを使用して大腸炎を誘導した。これらのマウスは、研究０日目から６日目までの７日間、それらの飲料水中のＤＳＳを摂取した。５つ目の群では、動物はＤＳＳを有さない水を摂取し、よって、健康な対照として機能した。研究０日目から、ＤＳＳマウスをビヒクル、ＩＬ－２２の試験誘導体（誘導体６；０．３５ｍｇ／ｋｇまたは１ｍｇ／ｋｇで腹腔内に投薬した）または比較物としてのＩＬ－２２－Ｆｃ融合体（ｈＦｃ－ｈＩＬ－２２；０．５ｍｇ／ｋｇで腹腔内に投薬した）を１０日間で１日１回処置した。体重、食物及び水の摂取を毎日モニタリングした。
食餌が与えられた雌のＣ５７Ｂｌ／６ＪＲｊマウスを体重に基づいて５つの群（１群当たりｎ＝８）に無作為化した。５群のうち４群においてＤＳＳを使用して大腸炎を誘導した。これらのマウスは、研究０日目から６日目までの７日間、それらの飲料水中のＤＳＳを摂取した。５つ目の群では、動物はＤＳＳを有さない水を摂取し、よって、健康な対照として機能した。研究０日目から、ＤＳＳマウスをビヒクル、ＩＬ－２２の試験誘導体（誘導体６；０．３５ｍｇ／ｋｇまたは１ｍｇ／ｋｇで腹腔内に投薬した）または比較物としてのＩＬ－２２－Ｆｃ融合体（ｈＦｃ－ｈＩＬ－２２；０．５ｍｇ／ｋｇで腹腔内に投薬した）を１０日間で１日１回処置した。体重、食物及び水の摂取を毎日モニタリングした。
【0245】
研究１０日目に、血液サンプルをマウスからＥＤＴＡチューブに収集し、血漿を分離し、分析まで－８０℃で保存した。再生膵島由来タンパク質３ガンマ（Ｒｅｇ３ｇ）をＥＬＩＳＡキット（Ｃｌｏｕｄ－Ｃｌｏｎｅ Ｃｏｒｐ）を使用して製造業者の指示書にしたがって二重に測定した。Ｒｅｇ３ｇは、ＩＬ－２２の標的係合マーカーである。
【0246】
終了時に、腸を立体解析学的分析のために除去した。したがって、腸を氷冷生理食塩水でフラッシュし、その内容物を穏やかに除去してからサンプリングした。
【0247】
腸をホルマリン中で一晩浸漬し（Ｔｉｓｓｕｅ－Ｔｅｋ ＶＩＰ）、その後、パラフィンのブロックに包埋した。次いでホルマリン固定された腸を、体系的均一ランダムサンプリング（ＳＵＲＳ）原理を使用して近位から遠位方向にサンプリングし、合計で４つのスラブを得、マルチカセットに入れた。すべての組織スラブを、個々のスラブの特定がより後の段階で可能となるような方法で配置した。パラフィンブロックをトリミングし、５μｍの上部切片を切断し、Ｓｕｐｅｒｆｒｏｓｔ＋対物レンズに載せた。大きな腸の場合、上部切片まで５００μｍの長さで別の切片を切断し、これにより各動物から合計で８つの結腸切片を得た。
【0248】
結腸炎体積を立体学的に、すなわち、結腸の二次元横断面の三次元解釈を使用して測定した。スキャンされたＨ＆Ｅ染色スライドに対してｎｅｗＣＡＳＴシステム（Ｖｉｓｉｏｐｈａｒｍ）を使用して立体学的体積推定を実施した。総腸体積、粘膜の体積、粘膜下層及び筋層の体積ならびに炎症組織の体積を、適切なサイズのグリッドシステムを使用してポイント計数によって推定し、その場合、対象となる構造に当たるすべてのポイントを計数した。対象となる構造に当たるポイントの数を以下の数学的関係性に従って体積に変換した：
【0249】
【数1】
【0250】
式中、Ａ（ｐ）はポイント当たりの面積であり、ｐは対象となる構造に当たるポイントの総数であり、ｔは断面間の距離である。１群当たりの平均炎症体積を計算し、統計的分析に供した。
【0251】
終了時にＨ＆Ｅ染色スライドを観察することによって結腸形態も評価した。
【0252】
結果
結腸炎体積は図１２に示されている。炎症は、ビヒクル対照（ＤＳＳも含有する）と比較して、誘導体６で処置されたマウスにおいて、いずれの用量でも予防されたことが示された。特に、炎症は、健康な対照（ＤＳＳを有さないビヒクル）として処置された群について同じ結腸炎体積から明らかなように、誘導体６で処置された群では正常なレベルで維持された。ｈＦｃ－ｈＩＬ－２２で処置された群についても同じであった。
結腸炎体積は図１２に示されている。炎症は、ビヒクル対照（ＤＳＳも含有する）と比較して、誘導体６で処置されたマウスにおいて、いずれの用量でも予防されたことが示された。特に、炎症は、健康な対照（ＤＳＳを有さないビヒクル）として処置された群について同じ結腸炎体積から明らかなように、誘導体６で処置された群では正常なレベルで維持された。ｈＦｃ－ｈＩＬ－２２で処置された群についても同じであった。
【0253】
終了時の結腸形態の代表的なＨ＆Ｅ染色画像が図１３に示されている。ＤＳＳ処置の後、粘膜上皮創傷がビヒクルで処置された動物で確認することができるが（黒色の矢印によって示されている）、誘導体６でいずれかの用量で処置されたまたはｈＦｃ－ｈＩＬ－２２で処置された動物では確認することはできない。このことは、上皮組織に対する保護的効果を実証する。
【0254】
血漿Ｒｅｇ３ｇレベルが図１４に示されている。ＤＳＳ処置は、基礎的Ｒｅｇ３ｇレベルの増加を誘導した（ビヒクルとＤＳＳなしビヒクルとの比較）。低用量（０．３５ｍｇ／ｋｇ）誘導体６群ではさらなる増加は検出可能ではなかったが、より高い用量（１ｍｇ／ｋｇ）の誘導体６群及びｈＦｃ－ｈＩＬ－２２群では検出可能であった。誘導体６（１ｍｇ／ｋｇ）群と比較してｈＦｃ－ｈＩＬ－２２（０．５ｍｇ／ｋｇ）群におけるより高いＲｅｇ３ｇレベルは、より低い用量にもかかわらず、より高い標的係合を示し、これは、ｈＦｃ－ｈＩＬ－２２のマウスにおけるより長い半減期と関連している可能性が高かった（ｈＦｃ－ｈＩＬ－２２の３０時間対誘導体６の９．１時間のＴ１／２）。
【0255】
結論
よって、データは、本発明の誘導体がマウスモデルにおける大腸炎及び粘膜上皮創傷に対する保護において良好な有効性を実証することを示している。このことは、腸の疾患、障害及び病態のための新規かつ改善された処置が見出されたことを示している。特に、その知見は、炎症性腸疾患などの粘膜上皮損傷を特徴とする疾患を処置する潜在性を実証している。
よって、データは、本発明の誘導体がマウスモデルにおける大腸炎及び粘膜上皮創傷に対する保護において良好な有効性を実証することを示している。このことは、腸の疾患、障害及び病態のための新規かつ改善された処置が見出されたことを示している。特に、その知見は、炎症性腸疾患などの粘膜上皮損傷を特徴とする疾患を処置する潜在性を実証している。
【0256】
実施例７－肝臓傷害におけるｉｎ ｖｉｖｏ有効性研究（ｉｉ）
この研究は、第２の肝臓傷害マウスモデル（第１は実施例４で上述されている）における本発明の誘導体の投薬の効果を調査するために設計された。研究は、肝臓傷害が投薬が開始された後に初めて誘導されたことを意味する、予防様式で行われた。
この研究は、第２の肝臓傷害マウスモデル（第１は実施例４で上述されている）における本発明の誘導体の投薬の効果を調査するために設計された。研究は、肝臓傷害が投薬が開始された後に初めて誘導されたことを意味する、予防様式で行われた。
【0257】
方法
Ｃ５７Ｂｌ６／６ｊ雄マウスを５群（１群当たりｎ＝８）に分けた。ＣｏｎＡ処置に対して－２６時間及び－２時間で５群のうち２群においてＩＬ－２２の試験誘導体（誘導体１）を１ｍｇ／ｋｇで腹腔内に投薬した。別の２群は、これらの時点でビヒクルのみを摂取した。ＣｏｎＡを１５ｍｇ／ｋｇの用量で３０秒間にわたって静脈内ボーラスとして４群すべてに与えて肝臓傷害を誘導した。５つ目の群は、健康な対照としてＣｏｎＡを摂取しなかった（上記のようにビヒクルのみ）。
Ｃ５７Ｂｌ６／６ｊ雄マウスを５群（１群当たりｎ＝８）に分けた。ＣｏｎＡ処置に対して－２６時間及び－２時間で５群のうち２群においてＩＬ－２２の試験誘導体（誘導体１）を１ｍｇ／ｋｇで腹腔内に投薬した。別の２群は、これらの時点でビヒクルのみを摂取した。ＣｏｎＡを１５ｍｇ／ｋｇの用量で３０秒間にわたって静脈内ボーラスとして４群すべてに与えて肝臓傷害を誘導した。５つ目の群は、健康な対照としてＣｏｎＡを摂取しなかった（上記のようにビヒクルのみ）。
【0258】
ＣｏｎＡ注射の８または２４時間後、マウスをイソフルラン麻酔下に置き、最大体積の血液を心穿刺によって採取した（凝固活性化剤を含有するポリプロピレン血清ゲルチューブを使用した）。処置を受けなかったマウス（群５）を８時間の時点で屠殺した。血液を各チューブ内でチューブを数回反転させることによって凝固活性化剤と混合した。チューブを１５分間室温で維持し、次いで２０００ｇで１０分間４℃で遠心分離した。血清サンプルにおけるＡＬＴ及びＡＳＴを自動化システム（Ｋｏｎｅｌａｂ ２０）を使用して製造業者の指示書に従って測定した。
【0259】
結果
研究の終了時のＡＬＴ及びＡＳＴの血漿レベルが図１５Ａ及び１５Ｂにそれぞれ示されている。ＡＬＴ及びＡＳＴの量は、肝臓傷害の前に誘導体１で処置されたマウスでは、ビヒクル／ＣｏｎＡ対照と比較して、試験された両方の時点で減少したことが示された。
研究の終了時のＡＬＴ及びＡＳＴの血漿レベルが図１５Ａ及び１５Ｂにそれぞれ示されている。ＡＬＴ及びＡＳＴの量は、肝臓傷害の前に誘導体１で処置されたマウスでは、ビヒクル／ＣｏｎＡ対照と比較して、試験された両方の時点で減少したことが示された。
【0260】
結論
ＡＬＴ及びＡＳＴは、肝臓損傷の指標として使用される肝臓酵素である。よって、誘導体１は、実施例４においてＡＰＡＰによって誘導される傷害に対するものとちょうど同じように、ＣｏｎＡによって誘導される傷害に対して肝臓を保護することが示された。マウスで測定された特定のバイオマーカーは、ヒトに変換できることが知られているので、観察された保護が同様に変換できるであろうということを予測するのは妥当である。
ＡＬＴ及びＡＳＴは、肝臓損傷の指標として使用される肝臓酵素である。よって、誘導体１は、実施例４においてＡＰＡＰによって誘導される傷害に対するものとちょうど同じように、ＣｏｎＡによって誘導される傷害に対して肝臓を保護することが示された。マウスで測定された特定のバイオマーカーは、ヒトに変換できることが知られているので、観察された保護が同様に変換できるであろうということを予測するのは妥当である。
【0261】
実施例８－肥満及びＮＡＳＨにおけるｉｎ ｖｉｖｏ有効性研究
この研究は、肥満及びＮＡＳＨマウスモデルにおける本発明の誘導体の投薬の効果を調査するために設計された。研究は、投薬が開始する前に肥満及びＮＡＳＨ病理が発症したことを意味する、処置（予防ではない）様式で行われた。
この研究は、肥満及びＮＡＳＨマウスモデルにおける本発明の誘導体の投薬の効果を調査するために設計された。研究は、投薬が開始する前に肥満及びＮＡＳＨ病理が発症したことを意味する、処置（予防ではない）様式で行われた。
【0262】
方法
食餌誘導性肥満マウスモデルは、実験前の少なくとも３０週間高脂肪食餌が供給された雄のＣ５７ＢＬ／６ＪＲｊマウスに基づいていた。食餌は、脂肪（４０％）、フルクトース（２２％）及びコレステロール（２％）が高かった（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｅｔｓ Ｄ０９１００３１０）。これにより、肥満、ＮＡＦＬＤ及び最終的にＮＡＳＨがもたらされた。
食餌誘導性肥満マウスモデルは、実験前の少なくとも３０週間高脂肪食餌が供給された雄のＣ５７ＢＬ／６ＪＲｊマウスに基づいていた。食餌は、脂肪（４０％）、フルクトース（２２％）及びコレステロール（２％）が高かった（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｅｔｓ Ｄ０９１００３１０）。これにより、肥満、ＮＡＦＬＤ及び最終的にＮＡＳＨがもたらされた。
【0263】
動物を試験誘導体（または他のもの）の最初の投薬前に６日間単独で飼育し、体重を実験を通して毎日モニタリングした。マウスを６つの群（１群当たりｎ＝１２）に分けた。投薬を研究０日目に開始し（図１６において点線で示されている）、以下の用量で１日１回皮下投与した。
【0264】
長期作用型ＧＬＰ－１受容体アゴニストであるセマグルチドを第１群において陽性対照として使用し、また、第２群においてＩＬ－２２の試験誘導体（誘導体６）と組み合わせて調査した。セマグルチドの投薬は、以下のスケジュールに従って徐々に漸増した：０．６ｎｍｏｌ／ｋｇ ０日目－１．２ｎｍｏｌ／ｋｇ １日目－２．４ｎｍｏｌ／ｋｇ ２日目－４．８ｎｍｏｌ／ｋｇ ３日目－１２ｎｍｏｌ／ｋｇ ４日目－３０ｎｍｏｌ／ｋｇ ５日目。組み合わせの群では、セマグルチド投薬を０日目で開始し、体重減少がセマグルチド処置群においてプラトーになった後に誘導体６の投薬を１２日目で開始した（図１６において点線で示されている）。
【0265】
第３の「高用量」群における誘導体６の投薬は、以下のスケジュールに従って徐々に漸増した：０．０５ｍｇ／ｋｇ ０日目－０．１ｍｇ／ｋｇ １日目－０．１５ｍｇ／ｋｇ ２日目－０．２ｍｇ／ｋｇ ３日目－０．２５ｍｇ／ｋｇ ４日目。用量を１４日目で０．２５ｍｇ／ｋｇから０．１ｍｇ／ｋｇに変更した（図１６において点線で示されている）。第４の「低用量」群において、誘導体６の投薬は、０．０５ｍｇ／ｋｇで開始し、さらなる漸増をしなかった。
【0266】
第５の群において、比較物としてのＩＬ－２２－Ｆｃ融合体（ｈＦｃ－ｈＩＬ－２２）の投薬は、以下のスケジュールに従って徐々に漸増した：０．０２ｍｇ／ｋｇ ０日目－０．０４ｍｇ／ｋｇ １日目－０．０６ｍｇ／ｋｇ ２日目－０．０８ｍｇ／ｋｇ ３日目－０．１ｍｇ／ｋｇ ４日目。ｈＦｃ－ｈＩＬ－２２の用量は、実施例６で見られるように（図１４参照）、より長い半減期に基づく標的係合、及びそれに応じて誘導体６と比較してより高い標的係合について０．２５ｍｇ／ｋｇの誘導体６群と一致するように選択した。
【0267】
第６の群は、陰性対照としてビヒクルのみが投薬された。
【0268】
血漿トリグリセリド（ＴＧ）レベルを、ベースライン（－２日目）、投薬開始後２週目（１４日目）及び４週目（２８日目）で測定した。具体的には、適切な抗凝固剤で処置された開口Ｍｉｃｒｏｖｅｔｔｅ（１００μｌまたは２００μｌ）チューブ内に尾血液体積を２００μｌまたはそれ未満で圧入することによって尾血液サンプルを分析のため収集した。血液を、３０００ｇで１０分間遠心分離するまで４℃で放置した。血漿上清を新たなチューブに移し、ドライアイス上ですぐに凍結し、－８０℃で保存した。ｃｏｂａｓ（登録商標）ｃ５０１分析機で市販のキット（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を使用して製造業者の指示書に従ってＴＧレベルを測定した。
【0269】
結果
実験の過程にわたる体重が図１６に示されている。
実験の過程にわたる体重が図１６に示されている。
【0270】
研究は、肥満マウスモデルの体重の減少において誘導体６の用量依存的な高い有効性を実証した。さらに、それはＧＬＰ－１受容体アゴニスト（セマグルチド）に対する相加性を実証し、これは肥満処置についての後期臨床試験において調査されている。データは、体重減少の誘導においてｈＦｃ－ｈＩＬ－２２と比較して誘導体６の優位性を示唆していた。重要なことに、ｈＦｃ－ｈＩＬ－２２は、マウスにおいて誘導体６よりも長い半減期を有し、誘導体６の半分の用量で投薬された場合であってもより高い標的係合を実証した。よって、この研究において使用された０．１ｍｇ／ｋｇのｈＦｃ－ｈＩＬ－２２の用量は、０．２５ｍｇ／ｋｇの誘導体６群と類似する標的係合のために選択された。
【0271】
ここで食餌誘導性肥満マウスで観察される誘導体６によって誘導される体重減少に対する感受性は、痩せたマウスでは観察されない。例えば、１日１回の投薬での１０日間のＤＳＳ誘導性大腸炎研究（実施例６）において、研究開始時の体重は、ＤＳＳ／ビヒクル群及びＤＳＳ／誘導体６（０．３５ｍｇ／ｋｇ）群の両方で１９．０ｇであった。研究終了時では、体重は、ＤＳＳ／ビヒクル群では１７．６グラムであったのに対し、ＤＳＳ／誘導体６（０．３５ｍｇ／ｋｇ）群では１７．４グラムであり、これらは異なる（対応のないスチューデントのｔ検定でｐ＝０．８２）。比較により、本研究において１０日目のビヒクル群及び誘導体６（０．２５ｍｇ／ｋｇ）群におけるマウスは、それぞれ４３．５ｇ及び３５．２ｇの体重を有していた。よって、ビヒクル群と比較して誘導体６群において有意な体重減少が観察された（１０日目の体重について対応のないスチューデントのｔ検定でｐ＜０．０００１）。研究開始時では、体重は、ビヒクル群対誘導体６群において同様であった（それぞれ４４．３ｇ及び４４．１ｇ）。
【0272】
ベースライン（－２日目）、投薬開始後２週目（１４日目）及び４週目（２８日目）で測定された血漿ＴＧレベルが表１５に示されている。
【0273】
【表15】
【0274】
デルタは、示された処置及び時点についてのベースラインからのＴＧレベル（ｎｍｏｌ／ｌ）の変化を指す。表１５から分かるように、レベルの変化は、ビヒクル群では上がった（増加した）が、すべての他の群では下がった（減少した）。
【0275】
誘導体６は、ＴＧレベルの低下においてセマグルチドによりも高い有効性を低用量でも有し、セマグルチドよりも体重減少を起こしにくい（例えば、セマグルチドについては－０．１４±０．０６６、誘導体６（０．０５ｍｇ／ｋｇ）については－０．３０±０．０３４及び誘導体６（０．２５／０．１ｍｇ／ｋｇ）については－０．３５±０．０５２）の４週目のデルタＴＧレベル（ｎｍｏｌ／ｌ））。結果は、誘導体６が、体重減少効果とは部分的に無関係に、ＴＧ低下における高い有効性を有していたことを示している。さらに、セマグルチドに加えて誘導体６の効果の完全な相加性が存在した。４週目において、デルタＴＧとして計算されるＴＧレベル（ｎｍｏｌ／ｌ）の低下は、誘導体６（０．０５ｍｇ／ｋｇ）では－０．３０±０．０３４、セマグルチドでは－０．１４±０．０６６及びセマグルチド＋誘導体６（０．０５ｍｇ／ｋｇ）では－０．５３±０．０４２であった。研究の過程にわたって増加するビヒクル群のＴＧレベルにもかかわらず、ベースラインと比較してＴＧが低下する結果（デルタＴＧ）となった。
【0276】
結論
研究は、本発明の誘導体（誘導体６）が、陽性対照として使用されたセマグルチド－長期作用型ＧＬＰ－１受容体アゴニストで見られたものと少なくとも同等のレベルまで、肥満マウスにおいて用量依存的に体重減少を誘導し得ることを実証した。さらに、セマグルチド及び誘導体６の組み合わせを使用して体重減少に対する相加的効果が存在した。体重減少の誘導における誘導体６の有効性は、同様のレベルの標的係合を提供するために選択された用量を用いてｈＦｃ－ＩＬ－ｈ２２で観察されたものよりも高かった。食餌誘導性肥満マウスにおいて誘導体６によって誘導された体重減少は、ＤＳＳで処置された痩せたマウスでは見られず、肥満マウスが誘導体６誘導性体重減少に対してより感受性であることを実証している。食餌誘導性肥満マウスにおいて観察された体重減少は、ヒトにおいて使用されるであろうものと同じ読み取り値であるため、観察された体重減少が同様に変換できるであろうということを予測するのは妥当である。
研究は、本発明の誘導体（誘導体６）が、陽性対照として使用されたセマグルチド－長期作用型ＧＬＰ－１受容体アゴニストで見られたものと少なくとも同等のレベルまで、肥満マウスにおいて用量依存的に体重減少を誘導し得ることを実証した。さらに、セマグルチド及び誘導体６の組み合わせを使用して体重減少に対する相加的効果が存在した。体重減少の誘導における誘導体６の有効性は、同様のレベルの標的係合を提供するために選択された用量を用いてｈＦｃ－ＩＬ－ｈ２２で観察されたものよりも高かった。食餌誘導性肥満マウスにおいて誘導体６によって誘導された体重減少は、ＤＳＳで処置された痩せたマウスでは見られず、肥満マウスが誘導体６誘導性体重減少に対してより感受性であることを実証している。食餌誘導性肥満マウスにおいて観察された体重減少は、ヒトにおいて使用されるであろうものと同じ読み取り値であるため、観察された体重減少が同様に変換できるであろうということを予測するのは妥当である。
【0277】
誘導体６はまた、ＴＧレベルの低下において高い有効性を示した。誘導体６は、試験された用量の両方で、セマグルチドよりも高い有効性を示し、組み合わせ投薬における有効性に対する完全な相加性が観察された。０．０５ｍｇ／ｋｇ用量の誘導体６が、より少ない体重減少にもかかわらずセマグルチドよりも高い有効性を有していたことを考慮すると、誘導体６のＴＧ低下効果は、少なくとも体重減少とは部分的に無関係であったことが結論付けられ得る。さらに、誘導体６は、試験された用量の両方でｈＦｃ－ｈＩＬ－２２比較物よりも優れていた。食餌誘導性肥満マウスにおいて観察されたＴＧ低下は、ヒトにおいて使用されるであろうものと同じ読み取り値であったため、観察された効果が同様に変換できるであろうということを予測するのは妥当である。よって、結果は、高いＴＧレベルを特徴とする障害及び病態のための新たな処置が見出されたことを示している。
【0278】
本発明の所定の特徴が本明細書で例示及び記載されているが、多くの改変及び均等物が当業者に明らかになる。そのため、特許請求の範囲は、本発明の真の趣旨に入るそのような改変及び均等物のすべてを包含することが意図されている。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7A】
【図7B】
【図7C】
【図8】
【図9A】
【図9B】
【図10A】
【図10B】
【図11A】
【図11B】
【図11C】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15A】
【図15B】
【図16】
【配列表】