特許 7479623 抗炎症Ｍ２表現型ミクログリアへの極性転換促進剤

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-04-26

(45)【発行日】2024-05-09

(54)【発明の名称】抗炎症Ｍ２表現型ミクログリアへの極性転換促進剤

(51)【国際特許分類】

   A61K 38/12 20060101AFI20240430BHJP

   C07K 7/56 20060101ALI20240430BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20240430BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240430BHJP

【ＦＩ】

A61K38/12

C07K7/56 ZNA

A61P25/00

A61P43/00 111

【請求項の数】 2

(21)【出願番号】P 2020026373

(22)【出願日】2020-02-19

(65)【公開番号】P2020196699

(43)【公開日】2020-12-10

【審査請求日】2023-01-19

(31)【優先権主張番号】P 2019102983

(32)【優先日】2019-05-31

(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】501474081

【氏名又は名称】株式会社バイオコクーン研究所

(73)【特許権者】

【識別番号】504145342

【氏名又は名称】国立大学法人九州大学

(74)【代理人】

【識別番号】110003395

【氏名又は名称】弁理士法人蔦田特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】鈴木 幸一

(72)【発明者】

【氏名】武 洲

(72)【発明者】

【氏名】石黒 慎一

(72)【発明者】

【氏名】苅間澤 真弓

(72)【発明者】

【氏名】シラパコング・ピヤマース

(72)【発明者】

【氏名】江幡 真規子

(72)【発明者】

【氏名】石黒 裕美

【審査官】伊藤 良子

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０１６／０４７６３８（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特開２０１５－０４４７８５（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２０１３－１８４９２３（ＪＰ，Ａ）

【文献】PLoS ONE，2021年，Vol.16, No.1:e0245235，pp.1-26

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ａ６１Ｋ

Ａ６１Ｐ

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

下記一般式（１）で表される環状ペプチド誘導体を含む、ミクログリアの抗炎症Ｍ２表現型への極性転換促進剤。

【化1】

式（１）中、ｍは０～３、ｎ≧１であり、Ｒ_１～Ｒ_６はそれぞれ独立に水素原子または炭化水素基であり、Ｒ_７およびＲ_８はそれぞれ独立にカルボキシ基もしくはその塩、またはアルコキシカルボニル基であり、Ｒ_９は炭化水素基、ヒドロキシ基、アルコキシ基またはアルキルカルボニルオキシ基であり、Ｒ_１０およびＲ_１１はそれぞれ独立に水素原子、炭化水素基またはアルキルカルボニルオキシ基であり、Ｒ_１２～Ｒ_１６はそれぞれ独立に水素原子または炭化水素基である。

【請求項2】

前記一般式（１）において、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３およびＲ_４はそれぞれ独立にアルキル基であり、ｎ＝２～４であり、Ｒ_５およびＲ_６はそれぞれ水素原子であり、Ｒ_７およびＲ_８はそれぞれ独立にカルボキシ基またはその塩である、請求項１に記載のミクログリアの抗炎症Ｍ２表現型への極性転換促進剤。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ミクログリアの抗炎症Ｍ２表現型への極性転換を促進することができる極性転換促進剤に関する。

【背景技術】

【0002】

グリア細胞の１種であるミクログリアは、中胚葉由来の卵黄嚢から分化した細胞と考えられている。ミクログリアは、損傷を受けた細胞の除去やシナプスの保守点検など、脳内外の環境を調整する免疫細胞としての役割を持つことがわかってきた。例えば、外傷性脳損傷から脳を保護する場合、ミクログリアが活性化して炎症性サイトカインを放出することでアストロサイトを反応性アストロサイトに変化し、脳の保護に作用する。また、活性化したミクログリアは脳炎症を誘発し、神経変性疾患を促進することが知られている。

【0003】

一方、ミクログリアを標的とした神経変性疾患の治療方法が開示されている。例えば、グリチルレチン酸誘導体の一種でありギャップ結合阻害剤を用いる方法（非特許文献１、特許文献１）、イソα酸を用いる方法（非特許文献２）などが提案されている。

【0004】

ミクログリアには、２つの活性化タイプがあることが知られている（非特許文献３）。すなわち、図１に示すように、炎症促進Ｍ１表現型ミクログリアと、抗炎症Ｍ２表現型ミクログリアがある。炎症促進Ｍ１表現型ミクログリアは、インターロイキン－１β（ＩＬ－１β）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ－α）、誘導型一酸化炭素合成酵素（ｉＮＯＳ）等を産生する。ＩＬ－１βはエフェクタであり、ＩＬ－１βの存在下でミクログリアが脳内炎症を起こし、ラジカル活性酸素等のフリーラジカルが放出される。また、ＩＬ－１βを産生するミクログリアにおいては、老化した（壊れた）細胞などの老廃物を貪食する能力が低下する。そのため、炎症促進Ｍ１表現型ミクログリアは、神経細胞傷害的に作用する。一方、抗炎症Ｍ２表現型ミクログリアは、アルギナーゼ－１（ＡＲＧ１）、インターロイキン－１０（ＩＬ－１０）、インターロイキン－４（ＩＬ－４）、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）－β１等を産生する。ＡＲＧ１はエフェクタであり、これを放出することで神経細胞の保護に働く。抗炎症Ｍ２表現型ミクログリアは、脳内炎症を抑えると同時に、老化した細胞などの老廃物を貪食する能力が高く、そのため抗炎症、即ち神経細胞保護的に作用する。

【0005】

ところで、本発明者らは、特許文献２において新規な環状ペプチド誘導体を提供している。この環状ペプチド誘導体は、冬虫夏草の一種であるハナサナギタケから採取されたものであり、アストロサイトに対して増殖活性を有することが示されているが、ミクログリアに作用して抗炎症Ｍ２表現型ミクログリアへの極性転換を促進することは知られていない。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0006】

【文献】国際公開２００７／０８８７１２号

【文献】国際公開２０１６／０４７６３８号

【非特許文献】

【0007】

【文献】Takeuchi, H., Mizoguchi, H., Doi, Y., Jin,S., Noda, M., Liang, J., Li,H., Zhou, Y., Mori, R., Yasuka, S., Li, E.,Parajuli, B., Kawanokuchi, J.,Sonobe, Y., Sato, J., Yamanaka, K. and Sobue G.(2011) Blockade of gap junctionhemichannel suppresses disease progression inmouse models of amyotrophiclateral sclerosis and Alzheimer’s disease. ProsOne, 6(6), e21108.

【文献】Ano, Y., Dohata, A., Taniguchi, Y., Hoshi,A., Uchida, K.,Takashima, A. and Nakayama, H. (2017) Iso-α-acids, bittercomponents of beer, prevent inflammation and cognitivedecline induced in amouse model of Alzheimer’s disease.Journal of Biological Chemistry, 292, 3720-3728.

【文献】Ni J, Wu Z, Peters C, Yamamoto K, Qing H,Nakanishi H. (2015): The Critical Role of Proteolytic Relay throughCathepsins Band E in the Phenotypic Change of Microglia/Macrophage. J Neurosci. 35(36):12488-501.

【文献】Wu Z, Sun L, Hashioka S, Yu S, Schwab C,Okada R, Hayashi Y,McGeerPL, Nakanishi H. (2013) Differential pathways forinterleukin-1β production activated by chromogranin Aand amyloid β in microglia. NeurobiologyAging.34(12):2715-25.

【文献】1582087454977_0.fcgi?cmd=Retrieve&db=pubmed&dopt=Abstract&list_uids=8864135&query_hl=131&itool=pubmed_docsum (1996) Regulation ofmicroglial activation by TGF-β, IL-10, and CSF-1. J. Leukoc Biol. 60, 502-508.

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

本発明は、神経細胞保護的に作用する抗炎症Ｍ２表現型ミクログリアへの新規な極性転換促進剤を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0009】

本発明の実施形態に係る抗炎症Ｍ２表現型ミクログリアへの極性転換促進剤は、下記一般式（１）で表される環状ペプチド誘導体を含むものである。

【化1】

式（１）中、ｍは０～３、ｎ≧１であり、Ｒ_１～Ｒ_６はそれぞれ独立に水素原子または炭化水素基であり、Ｒ_７およびＲ_８はそれぞれ独立にカルボキシ基もしくはその塩、またはアルコキシカルボニル基であり、Ｒ_９は炭化水素基、ヒドロキシ基、アルコキシ基またはアルキルカルボニルオキシ基であり、Ｒ_１０およびＲ_１１はそれぞれ独立に水素原子、炭化水素基またはアルキルカルボニルオキシ基であり、Ｒ_１２～Ｒ_１６はそれぞれ独立に水素原子または炭化水素基である。

【発明の効果】

【0010】

本発明の実施形態によれば、神経細胞保護的に作用する抗炎症Ｍ２表現型ミクログリアへの極性転換促進剤を提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【0011】

【図1】ミクログリアの活性化メカニズムを説明するための図である。

【図2】ＭＧ６ミクログリアについて環状ペプチド誘導体の濃度と細胞生存率との関係を示すグラフである。

【図3】実施例におけるＭＧ６ミクログリアの分極化試験結果を示すグラフであり、ＣＧＡ単独で処理したＭＧ６ミクログリアと、ＣＧＡ存在下において環状ペプチド誘導体で処理したＭＧ６ミクログリアが、それぞれ産生するＩＬ－１βとＡＲＧ１の遺伝子発現量を示すグラフである。

【図4】環状ペプチド誘導体の安全性試験結果を示すグラフである。

【図5】初代ミクログリアについて環状ペプチド誘導体の濃度と細胞生存率との関係を示すグラフである。

【図6】初代ミクログリアについての分極化試験結果を示すグラフである。無刺激のコントロール、環状ペプチド誘導体単独処理、ＣＧＡ単独処理、及びＣＧＡと環状ペプチド誘導体との組合せ処理による初代ミクログリアが産生するサイトカインの遺伝子発現量を示すグラフであり、（ａ）は処理２４時間後のＴＧＦ－１βの遺伝子発現量、（ｂ）は処理７２時間後のＴＧＦ－１βの遺伝子発現量、（ｃ）は処理２４時間後のＩＬ－１βの遺伝子発現量、（ｄ）は処理７２時間後のＩＬ－１βの遺伝子発現量を示す。なお、ＩＬ－１βは神経細胞障害で、ＴＧＦ－β１は神経細胞保護である。

【発明を実施するための形態】

【0012】

本実施形態に係る抗炎症Ｍ２表現型ミクログリアへの極性転換促進剤（以下、単に「極性転換促進剤」ともいう。）は、次の一般式（１）で表される環状ペプチド誘導体を有効成分として含有する。

【0013】

【化2】

【0014】

式中、ｍは０～３の整数であり、ｎは１以上の整数である。Ｒ_１～Ｒ_６は、それぞれ独立に水素原子または炭化水素基である。Ｒ_７およびＲ_８は、それぞれ独立にカルボキシ基もしくはその塩、またはアルコキシカルボニル基である。Ｒ_９は、炭化水素基、ヒドロキシ基、アルコキシ基またはアルキルカルボニルオキシ基である。Ｒ_１０およびＲ_１１は、それぞれ独立に水素原子、炭化水素基またはアルキルカルボニルオキシ基である。Ｒ_１２～Ｒ_１６は、それぞれ独立に水素原子または炭化水素基である。

【0015】

ここで、炭化水素基としては、例えば脂肪族炭化水素基、即ち、直鎖状もしくは分枝鎖状の飽和もしくは不飽和の炭化水素基、または脂環式の炭化水素基が挙げられる。炭化水素基の炭素数は特に限定しないが、好ましくは炭素数１～６、より好ましくは炭素数１～４である。アルコキシ基、アルコキシカルボニル基、アルキルカルボニルオキシ基における炭化水素部分も同様である。好ましい例としては、炭化水素基および炭化水素部分は、それぞれ炭素数１～４のアルキル基である。

【0016】

Ｒ_７およびＲ_８について、カルボキシ基の塩としては、例えば、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩等の金属塩や、酢酸アンモニウム塩などのアンモニウム塩、ジエチルアミン塩などのアミン塩等が例示される。

【0017】

式（１）においては、例えば、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３およびＲ_４がそれぞれ独立にアルキル基であり、ｎ＝２～４であり、Ｒ_５およびＲ_６がそれぞれ水素原子であり、Ｒ_７およびＲ_８がそれぞれ独立にカルボキシ基またはその塩であってもよい。

【0018】

式（１）においては、例えば、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３およびＲ_４がそれぞれ独立にアルキル基、特に好ましくはメチル基およびエチル基のいずれかであり、ｎ＝２～４であり、Ｒ_５およびＲ_６がそれぞれ水素原子であり、Ｒ_７およびＲ_８がそれぞれ独立にカルボキシ基またはその塩であり、ｍ＝０であり、Ｒ_１０およびＲ_１１がそれぞれ水素原子であり、Ｒ_１２およびＲ_１３がそれぞれ水素原子であり、Ｒ_１４およびＲ_１５がそれぞれ独立に水素原子またはアルキル基（特に好ましくはメチル基）のいずれかであり、Ｒ_１６が水素原子であるものが挙げられる。

【0019】

一実施形態において、式（１）で表される環状ペプチド誘導体としては、下記式（２）で表される化合物又はその塩でもよい。

【化3】

この式（２）で表される化合物は、Ｎ－メチル－β－ヒドロキシドーパ、バリン、β－ヒドロキシロイシン、グルタミン酸の４種のアミノ酸からなるペプチドが環状構造をとったものである。

【0020】

式（１）で表される環状ペプチド誘導体の製造方法は、特に限定されず、例えば、特許文献２（ＷＯ２０１６／０４７６３８）に記載の通り、ハナサナギタケから各種の抽出、分離方法を用いて採取してもよく、ペプチド合成等の各種の公知の化学合成方法を組み合わせることによって製造してもよい。

【0021】

式（１）で表される環状ペプチド誘導体は、ミクログリアを炎症促進Ｍ１表現型から抗炎症Ｍ２表現型に極性転換させることを促進する作用を有することから、抗炎症Ｍ２表現型ミクログリアへの極性変換促進剤として用いることができる。すなわち、式（１）で表される環状ペプチド誘導体をグリア細胞の一種であるミクログリアに作用させることにより、ミクログリアを抗炎症性のＭ２表現型に極性転換（極化）させることができ、Ｍ２表現型となることでミクログリアを神経細胞保護的に作用させることができる。そのため、本実施形態に係る極性変換促進剤は、脳疾患や老化に伴う神経細胞傷害の治療や予防のための医薬品や食品に利用することができる。

【0022】

一実施形態において、上記極性変換促進剤は、医薬組成物または食品組成物の有効成分としてそれらに配合してもよく、抗炎症Ｍ２表現型ミクログリアへの極性転換を促進するための医薬組成物または食品組成物を提供することができる。これらの医薬組成物または食品組成物は、例えば、ヒトまたはヒト以外の哺乳動物（実験動物、ペット等）に対して用いることができる。

【0023】

医薬組成物は、上記極性変換促進剤と、医薬品として許容される種々の添加剤等やその他の成分とを混合するなど、公知の技術を用いて製造することができる。医薬組成物は、経口投与または非経口投与が可能であり、その形態としては、経口投与用であれば、例えば、錠剤、丸剤、粉剤、顆粒剤、カプセル剤、液状製剤（エリキシル剤、シロップ剤、懸濁剤、溶液剤を含む。）などが挙げられ、非経口投与用であれば、例えば、注射剤、点滴剤などが挙げられ、脳内への直接投与でもよい。

【0024】

食品組成物は、上記極性変換促進剤と、食品として許容される種々の添加剤等やその他の成分とを混合するなど、公知の技術を用いて製造することができる。食品組成物としては、保健機能食品（栄養機能食品、特定保健用食品および機能性表示食品）、サプリメントなどが挙げられる。食品組成物の形態の例としては、経口投与用の医薬組成物と同様の形態が挙げられ、また飲料や菓子等の形態でもよい。

【0025】

医薬組成物または食品組成物に配合することのできる添加剤としては、例えば、賦形剤、酸化防止剤、香料、調味料、甘味料、着色料、増粘安定剤、発色剤、漂白剤、ガムベース、乳化剤、結合剤、希釈剤、防腐剤、安定化剤、凝固剤などが挙げられる。

【0026】

医薬組成物の一投与または一日あたりの有効成分量、及び、食品組成物の一食分または一日あたりの有効成分量は、投与または摂取対象の年齢、体重、性別や、適用される疾患または状態などに応じて、また非臨床的または臨床的な試験結果等に基づいて、適宜設定することができる。特に限定しないが、上記極性転換促進剤の経口摂取量としては、式（１）の環状ペプチド誘導体の量として、例えば、ヒトを含む哺乳動物に対し、１日あたり0.1μg/kg以上50μg/kg以下でもよく、1μg/kg以上25μg/kg以下でもよい。

【0027】

また、上記極性転換促進剤は、in vitroの実験系において低濃度でも効果が得られる。in vitroの実験系における上記極性転換促進剤の濃度は、特に限定されず、式（１）の環状ペプチド誘導体の濃度として、例えば、０．０１μＭ以上５μＭ以下（即ち、１×１０^－８～５×１０^－６ｍｏｌ／Ｌ）でもよく、０．０１μＭ以上１μＭ以下でもよく、０．０３μＭ以上０．３μＭ以下でもよい。

【実施例】

【0028】

１．ＭＧ６ミクログリア細胞培養
ＭＧ６ミクログリア細胞株（Riken Cell Bank）を用いた以下の試験において、ＭＧ６ミクログリア細胞の培養は、Dulbecco's Modified Eagle Medium（DMEM,Thermo Fisher Scientific）培地を用いて行った。DMEM中に100μMのβ-メルカプトエタノール、10μg/mlのインスリン、10％ウシ胎仔血清（Gibco）、ペニシリン－ストレプトマイシン（Gibco）、450mg/mlグルコース（Gibco）を含む。

【0029】

２．ＭＧ６ミクログリア細胞生存率の測定
ＭＧ６ミクログリア細胞を96ウェルプレート中で37℃にて24時間（5×10³細胞／ウェル）培養し、次いで、様々な濃度の環状ペプチド誘導体と共に37℃にて48時間インキュベートした。環状ペプチド誘導体としては、特許文献２の実施例に記載の方法により得られた上記式（２）で表される化合物のジエチルアミン塩を用いた（以下の各試験において同じ）。環状ペプチド誘導体の濃度としては、培養液中の濃度が0μM、0.01μM、0.03μM、0.1μM、0.3μM、1μMとなるように調整した。

【0030】

細胞生存率の評価は、Cell-Counting Kit-8（CCK-8;Dojindo、Kumamoto、Japan）を使用して以下のように製造業者の指示に従い行った。すなわち、環状ペプチド誘導体で処理した後、10μLのCCK-8を96ウェルプレートに移し、次いで37℃で2時間インキュベートした。この指示に従って、マイクロプレートリーダーを用いて光学濃度を波長450nmで読み取った。細胞生存率は、以下の式を用いて計算した。細胞生存率＝（処置群の光学濃度／対照群の光学濃度）×100％

【0031】

環状ペプチド誘導体の投与４８時間後、ミクログリアの生存率を検討した結果、図２に示したように環状ペプチド誘導体の濃度が0.01～1μMの範囲内においてミクログリアの増殖は認められず、また生存が抑制されることもなかった。そこで、以後の実験では環状ペプチド誘導体の最適濃度を1μMと設定して機能性解析に使用した。なお、図２における「ns」は非有意であることを意味する。

【0032】

３．ＭＧ６ミクログリアの分極化試験
アツルハイマー認知症の脳における老人班の成分であるクロモグラニンＡ（Chromogranin A,ＣＧＡ）はアミロイドβよりも神経毒性が強い。また、ＣＧＡの蓄積した老人斑は周囲にミクログリアが数多く認められ、ミクログリアの活性化起因であると考えられている（非特許文献４）。そこで、脳内環境に近い条件としてＣＧＡが存在する病態条件下において、環状ペプチド誘導体によるミクログリアの分極化試験を行った。

【0033】

ＭＧ６ミクログリア細胞を96ウェルプレート中で37℃にて24時間（5×10³細胞／ウェル）培養し、次いで、ＣＧＡ（Peptide Institute, Osaka）を濃度が10nMとなるように添加するとともに、環状ペプチド誘導体を濃度が1μMとなるように添加して37℃でインキュベートした。環状ペプチド誘導体を添加せずにＣＧＡを添加したもの、および、環状ペプチド誘導体とＣＧＡをともに添加していないもの（コントロール）についても、同様にインキュベートした。

【0034】

添加処理24時間後と72時間後にリアルタイム定量ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）分析および統計分析を行い、インターロイキン－１β（ＩＬ－１β）とアルギナーゼ－１（ＡＲＧ１）の遺伝子発現量を求めた。刺激を受けたミクログリアは、産生するファクターによって、神経細胞傷害的に働くＭ１表現型と神経細胞保護的に働くＭ２表現型に分極化され、Ｍ１表現型ミクログリアはＩＬ－１βを産生し、Ｍ２表現型ミクログリアはＡＲＧ１を産生することが知られている（非特許文献３）。そこで、Ｍ１表現型であることをＩＬ－１βの遺伝子発現により、また、Ｍ２表現型であることをＡＲＧ１の遺伝子発現により特定した。リアルタイム定量ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）分析および統計分析の方法は以下の通りである。

【0035】

［リアルタイム定量ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）分析］
環状ペプチド誘導体による処理後のＭＧ６ミクログリア細胞株からmRNAを単離し、全RNAをRNAiso Plus（Takara、Japan）を用いて製造者の指示に従って抽出した。QuantiTect ReverseTranscription Kit（Qiagen、Japan）を用いて、合計800ngの抽出されたRNAをcDNAに逆転写した。95℃で5分間の最初の変性工程の後、温度サイクリングを開始した。各サイクルは、95℃で5秒間の変性、60℃で10秒間のアニーリング、および30秒間の伸長からなる。合計で40回のサイクルを行った。Corbett Rotor-Gene RG-3000AReal-Time PCR Systemを用いたRotor-Gene SYBR Green RT-PCRキット（Qiagen、Japan）を使用して、cDNAを2連で増幅した。データは、RG-3000Aソフトウェアプログラム（バージョンRotor-Gene6.1.93、Corbett）を用いて評価した。プライマー対（Invitrogen社製, カスタムプライマー）の配列を以下に記載する。
IL-1β：5'-CAACCAACAAGTGATATTCTCCATG-3'（配列番号１）、
および、5'-GATCCACACTCTCCAGCTGCA-3'（配列番号２）
ARG：5'-CGCCTTTCTCAAAAGGACAG-3'（配列番号３）、
および、5'-CCAGCTCTTCATTGGCTTTC-3'（配列番号４）
データの正規化のために、内在性対照（アクチン）をcDNAの入力を制御するために評価し、相対単位を比較Ct法により計算した。全てのリアルタイムRT-PCR実験を3回繰り返し、結果を平均±SEMとして示した。

【0036】

［統計分析］
データは平均±SEMとして表される。統計分析は、GraphPadPrismソフトウェアパッケ
ージを使用したポストホックTukey検定を用いた一元または二元ANOVAによって行った。p<0.05の値は、統計的有意性を示すと考えられる（GraphPadSoftware）。

【0037】

結果は、ＣＧＡ及び環状ペプチド誘導体を添加したもの（実施例）と、ＣＧＡのみ添加したもの（比較例）について、コントロール（環状ペプチド誘導体とＣＧＡをともに添加していないもの）に対するmRNAの相対発現量として図３に示した。

【0038】

ＣＧＡとともに環状ペプチド誘導体で処理した場合、添加処理24時間後には、ＩＬ－１βの遺伝子発現がＡＲＧ１の遺伝子発現よりも約５倍高く、ミクログリアが炎症促進Ｍ１表現型に極化されたが、72時間後には逆転してＡＲＧ１の遺伝子発現がＩＬ－１βの遺伝子発現よりも約９倍高くなった。この結果は、ミクログリアの分極化として、環状ペプチド誘導体の長期時間処理によって抗炎症Ｍ２表現型に極化し、神経細胞保護的に作用することを示している。また、一旦炎症促進Ｍ１表現型に極化することにより、短時間でミクログリアの活力を高め、効率よくかつ速やかに抗炎症Ｍ２表現型に極化できると考えられる。

【0039】

また、ＣＧＡのみで処理した場合と比較すると、ＣＧＡとともに環状ペプチド誘導体で処理した場合、添加処理24時間後では、ＩＬ－１βの遺伝子発現量が約４倍と大きく炎症促進Ｍ１表現型の活性化効果が高いが、添加処理72時間後には、ＣＧＡのみで処理した場合と有意差がない程度まで炎症促進Ｍ１表現型の活性が低下していた。一方、ＡＲＧ１の遺伝子発現量については、ＣＧＡとともに環状ペプチド誘導体で処理した場合、ＣＧＡのみで処理した場合と比較して、添加処理24時間後に約４倍大きく、添加処理72時間後にも２倍以上の高い活性化効果を示した。このことから、脳内環境に近いＣＧＡが存在する環境（即ち、ミクログリアが活性化される病態条件下）において、環状ペプチド誘導体を長期間処理することにより、神経細胞保護的に作用する抗炎症Ｍ２表現型ミクログリアへの極性転換が促進されることがわかった。

【0040】

ミクログリアは脳内環境と脳炎症を制御する脳内免疫第一線に位置する細胞である。Ｍ２表現型ミクログリアは脳内に死んだ神経細胞や脳内に蓄積したアミロイド蛋白質など老廃物を取り入れ脳外に排出する能力をもつ。さらに、脳炎症の際にＭ２表現型ミクログリアが脳炎症を速やかに収束し、神経細胞を保護する。そのため、環状ペプチド誘導体は、抗炎症Ｍ２表現型へのミクログリアの極性転換を促進することで、脳老化を遅らせ、また外傷性脳損傷、脳卒中や認知症など急性・慢性脳炎症関連性疾患の予防や病態回復に役立つと考えられる。さらには自閉症やうつ病も含めた精神疾患などの予防や病態回復に役立つと考えられる。

【0041】

４．環状ペプチド誘導体の安全性試験
ＭＧ６ミクログリア細胞を96ウェルプレート中で37℃にて24時間（5×10³細胞／ウェル）培養し、次いで、環状ペプチド誘導体を濃度が1μMとなるように添加して37℃でインキュベートした。添加処理24時間後と72時間後に、上記と同様のリアルタイム定量ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）分析および統計分析を行い、インターロイキン－１β（ＩＬ－１β）とアルギナーゼ－１（ＡＲＧ１）の遺伝子発現量を求めた。

【0042】

結果は図４に示すとおりであり、環状ペプチド誘導体の単独投与では24時間後においても72時間後においてミクログリアは活性化されず、炎症促進Ｍ１表現型にも抗炎症Ｍ２表現型にも分極化されなかった。このことから、環状ペプチド誘導体は、ミクログリアに異物として認識されず、非病態条件ではミクログリアを活性化しないことから、ミクログリアに対する環状ペプチド誘導体の安全性が確認された。

【0043】

５．初代ミクログリア培養
初代ミクログリア細胞であるＣＤ１１ｂ^＋細胞を、磁気細胞選別ＭＡＣＳ法により、成体マウスの脳（８週齢、雄、日本エスエルシー、浜松、日本）から分離した。詳細には、脳を小片に切断し、得られた細胞懸濁液を、Neural Tissue Dissociation Kit（MiltenyiBiotec）を用いた酵素消化とともにgentle MACS Dissociator（Milteny Biotec）を用いて機械的に解離させ、更に３０ｍｍの細胞ストレーナーに移して単細胞懸濁液を得た。CD11b MicroBeads（Miltenyi Biotec）で磁気標識した後、細胞懸濁液を磁気分離器（Milteny Biotec）に設置した磁気（ＭＡＣＳ）カラムに注入した。ＭＡＣＳカラムをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）ですすいだ後、ＣＤ１１ｂ陽性画分を非特許文献４に記載の方法に従って収集した。初代ミクログリア細胞を用いた以下の試験において、初代ミクログリア細胞の培養は、Eagle’s MEM（Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.）培地を用いて行った。

【0044】

６．初代ミクログリア細胞生存率の測定
初代ミクログリア細胞を96ウェルプレートに撒き（１０^４細胞／ウェル）、様々な濃度の環状ペプチド誘導体と共に37℃で24時間、72時間培養した。環状ペプチド誘導体の濃度としては、培養液中の濃度が０μＭ、０．０１μＭ、０．１μＭ、１μＭ、５μＭとなるように調整した。細胞生存率の評価(24時間、72時間)は、上記２．のＭＧ６ミクログリア細胞生存率の測定に記載した通りである。

【0045】

結果は図５に示す通りであり、環状ペプチド誘導体の濃度が０．０１～５μＭの範囲内において初代ミクログリア細胞の増殖は認められず、また生存が抑制されることもほぼなかった。なお、「＊」はP<0.05であることを示す。

【0046】

７．初代ミクログリア細胞の分極化試験
脳の常在免疫細胞であるミクログリアは、炎症促進性サイトカインおよび抗炎症性サイトカインを調節することにより、アルツハイマー病を含む神経変性疾患の神経炎症に重要な役割を果たす。インターロイキン－１β（ＩＬ－１β）が主要な炎症性サイトカインであり、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）－β１が重要な抗炎症性サイトカインであることが知られている（非特許文献５）。上記のように、神経分泌酸性糖タンパク質であるクロモグラニンＡ（ＣＧＡ）は、ミクログリアの活性化候補因子としてアルツハイマー病の老人斑に見出されている。そこで、初代ミクログリア細胞とマーカーとしてＩＬ－１βおよびＴＧＦ－β１を使用して、環状ペプチド誘導体及びＣＧＡが炎症または抗炎症に及ぼす影響を調べた。

【0047】

初代ミクログリア細胞を96ウェルプレート中で37℃にて24時間（１０^４細胞／ウェル）培養し、次いで、ＣＧＡ（American Peptide Company、Anaspec）を濃度が10nMとなるように添加するとともに、環状ペプチド誘導体を濃度が1μMとなるように添加して37℃でインキュベートした。環状ペプチド誘導体を添加せずにＣＧＡを添加したもの、ＣＧＡを添加せずに環状ペプチド誘導体を添加したもの、および、環状ペプチド誘導体とＣＧＡをともに添加していないもの（コントロール）についても、同様にインキュベートした。

【0048】

添加処理24時間後と72時間後にリアルタイム定量ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）分析および統計分析を行い、ＴＧＦ－β１とＩＬ－１βの遺伝子発現量を求めた。リアルタイム定量ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）分析および統計分析の方法は、上記３．のＭＧ６ミクログリアの分極化試験に記載した通りである。但し、ＴＧＦ－β１のプライマー対（Invitrogen社製, カスタムプライマー）は以下の配列とした。
TGF-β1：5'-TCAGACATTCGGGAAGCAGTG-3'（配列番号５）、
および、5'-ATTCCGTCTCCTTGGTTCAGC-3'（配列番号６）

【0049】

結果は、図６に示す通りである。なお、図６における「＊」はP<0.05であることを示し、「＃＃」はP<0.01であることを示し、「＃＃＃」はP<0.001であることを示す。また、「con」はコントロール、「ペプチド」は環状ペプチド誘導体単独処理、「ＣＧＡ」はＣＧＡ単独処理、「ペプチド＋ＣＧＡ」は環状ペプチド誘導体とＣＧＡとの組合せ処理を示す。

【0050】

図６（ａ）及び（ｂ）に示すように、初代ミクログリアにおいてコントロールに比較してＣＧＡ単独処理は、24時間及び72時間で、ＴＧＦ－β１の発現を多少増加させた。ＣＧＡ処理と環状ペプチド誘導体の組合せ処理では、24時間と72時間でＴＧＦ－β１の発現を大幅に増加させた（平均3倍程度）。なお、コントロールに比較して、環状ペプチド誘導体単独処理は、ＴＧＦ－β１の発現に影響しなかった。

【0051】

一方、ＩＬ－１βの発現については、図６（ｃ）及び（ｄ）に示すように、ＣＧＡ単独処理で顕著に増加し、ＣＧＡ処理と環状ペプチド誘導体の組合せ処理では、ＩＬ－１βの発現がコントロールと同等以下と小さく、ＴＧＦ－β１の発現とは傾向が逆転していた。なお、コントロールに比較して、環状ペプチド誘導体単独処理は、ＩＬ－１βの発現に影響しなかった。

【0052】

この結果は、環状ペプチド誘導体がＴＧＦ－β１を増加させ、ＩＬ－１βを抑制することにより、ＣＧＡで活性化されたミクログリア（炎症促進表現型Ｍ１）を抗炎症表現型Ｍ２にシフト、即ち極性転換させることを意味する。環状ペプチド誘導体自体が初代ミクログリア細胞におけるＴＧＦ－β１またはＩＬ－１βの発現に影響を与えないことを考慮すると、初代ミクログリアを用いた本試験によっても、ミクログリアに対する環状ペプチド誘導体の安全性が確認されする共に、環状ペプチド誘導体が神経変性疾患を改善するために有効であろうことが理解できる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【配列表】

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