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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-04-26
(45)【発行日】2024-05-09
(54)【発明の名称】蛍光色素
(51)【国際特許分類】
C09B 57/00 20060101AFI20240430BHJP
C09B 23/14 20060101ALI20240430BHJP
C09K 11/06 20060101ALI20240430BHJP
G01N 33/58 20060101ALI20240430BHJP
A61K 49/00 20060101ALN20240430BHJP
【ＦＩ】
C09B57/00 L CSP
C09B23/14 500
C09K11/06
G01N33/58 Z
A61K49/00
【請求項の数】
4
(21)【出願番号】P 2019161457
(22)【出願日】2019-09-04
(65)【公開番号】P2021038336
(43)【公開日】2021-03-11
【審査請求日】2022-07-22
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 平成３１年３月１日、下司康仁、松岡洋平、付文強、西健太郎、回岩、水城圭司、矢住京、木山亮一、礒部信一郎が、日本化学会第９９春季年会（２０１９）ＷＥＢ予稿集１ＰＢ－０８６において公開。
(73)【特許権者】
【識別番号】503361813
【氏名又は名称】学校法人 中村産業学園
(74)【代理人】
【識別番号】100145403
【弁理士】
【氏名又は名称】山尾 憲人
(74)【代理人】
【識別番号】100138885
【弁理士】
【氏名又は名称】福政 充睦
(72)【発明者】
【氏名】礒部 信一郎
(72)【発明者】
【氏名】又賀 駿太郎
(72)【発明者】
【氏名】松岡 洋平
【審査官】桜田 政美
(56)【参考文献】
【文献】特開２０１６－０２３２８６（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２０１６－０２９１４５（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２０１７－０５７３５５（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１８／０４２６４３（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特開２０１３－０７２０８７（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１５／０２３５７４（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１５／１６８４３９（ＷＯ，Ａ１）
【文献】PATEL, Dinesh G., et al.，It Takes More Than an Imine: The Role of the Central Atom on the Electron-Accepting Ability of Benzotriazole and Benzothiadiazole Oligomers，Journal of the American Chemical Society，2012年，134(5)，2599-2612
【文献】KANIK, Ekiz Fulya, et al.，A novel DAD type and folic acid conjugated fluorescent monomer as a targeting probe for imaging of folate receptor overexpressed cells，Biotechnology Progress，2014年，30(4)，952-959
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ０９Ｂ ５７／００
Ｃ０９Ｂ ２３／１４
Ｃ０９Ｋ １１／０６
Ｇ０１Ｎ ３３／５８
Ａ６１Ｋ ４９／００
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
以下の一般式（Ｉ）で表されるトリアゾール縮合環化合物からなる蛍光色素。【化1】
【請求項2】
以下の一般式（ＩＩ）で表されるトリアゾール縮合環化合物からなる蛍光色素。【化2】
【請求項3】
以下の一般式（ＩＶ）で表されるトリアゾール縮合環化合物からなる蛍光色素。【化3】
【請求項4】
以下の一般式（Ｖ）で表されるトリアゾール縮合環化合物からなる蛍光色素。【化4】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、蛍光色素に関し、さらに詳しくは核酸、タンパク質、ペプチド類、そして糖類等の生体分子の検出に用いる蛍光色素に関する。
【背景技術】
【0002】
ニューバイオケミストリー分野では、現在特定遺伝子解析、遺伝子治療、テーラーメイド医療を目的とした研究が盛んに行われている。この分野では有機蛍光試薬を用いる研究が殆どであり蛍光色素が存在しなければ、ＤＮＡ解析や抗体を含むタンパク質を用いた解析技術は完成しなかったと言われている。これらの分野で主に使用されている既存の蛍光試薬として、シアニン骨格を有するＣｙ色素やローダミン骨格を有するＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒなどの有機蛍光色素が多く用いられている（例えば、非特許文献１）。
【0003】
しかしながら、上記の既存の蛍光色素は、固体状態でも発光する利点を有するが、非常に高価であるため、生体分子の検出方法が高コストにならざるを得ないという問題がある。これに対し、本出願人は、アゾール誘導体からなる有機ＥＬ色素を蛍光色素として用いることを提案しており、これによれば、検出方法の低コスト化が可能で、固体状態でも高い蛍光強度を得ることが可能である（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0004】
【文献】国際公開第２００５／０６２０４６号
【非特許文献】
【0005】
【文献】Science 283,1,January,1999,83-87
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
しかしながら、より一層の検出感度向上のために、より高い蛍光強度を有する蛍光色素が必要とされている。
【0007】
そこで、本発明は、より高い蛍光強度を有する蛍光色素を提供することを目的とした。
【課題を解決するための手段】
【0008】
上記課題を解決するため、本発明者らは鋭意検討した結果、特定構造を有するトリアゾール縮合環化合物からなる蛍光色素が高い蛍光強度を有することを見出して本発明を完成させたものである。
【0009】
本発明の一態様に係る蛍光色素は、以下の一般式（Ｉ）で表されるトリアゾール縮合環化合物からなることを特徴とするものである。
【0010】
【化1】
【0011】
ここで、一般式（Ｉ）中、Ｒ１、Ｒ２は、それぞれ独立に、置換または非置換のアリール基あるいは置換または非置換のヘテロアリール基を示し、Ａ１は、－（ＣＨ＝ＣＲａ）ｎ－（ｎは１～６の整数）、－（ＣＨ２）ｎ－（ｎは１～６の整数）、－（ＡＯ）ｎ－（ＡＯは炭素数２～６のアルキレンオキサイドで、ｎは１～１０の整数）、－ＮＨＣＯＯ－、－ＣＯＮＨ－、－ＣＯＮＨ（Ｒｂ）－、－ＣＯＯ－、－ＳＯ２ＮＨ－、－ＨＮ－Ｃ（＝ＮＨ）－ＮＨ－、－Ｏ－、－Ｓ－、－ＮＲｂ－、－Ａｒ－（Ａｒはアリール基またはヘテロアリール基）、－ＣＯ－Ａｒ－ＮＲｂ－、からなる群から選択された１種以上の官能基を示し、Ｒａは水素原子または炭素数１～４のアルキル基、Ｒｂは炭素数１～４のアルキル基であり、Ｂ１は、アルキルエステル基、アルキルエーテル基、アルキルアミド基、またはそれらのアルキレンオキサイド（炭素数２～６）付加体、またはＡ１との連結基を有してもよい生体分子との反応性基を示す。
【0012】
また、本発明の別の態様に係る蛍光色素は、以下の一般式（ＩＩ）で表されるトリアゾール縮合環化合物からなることを特徴とするものである。
【0013】
【化2】
【0014】
ここで、一般式（ＩＩ）中、Ｒ３、Ｒ４は、それぞれ水素を示し、Ｒ５は、中心ピリジン環との連結基を有してもよい生体分子との反応性基を示し、Ａ２は、－（ＣＨ＝ＣＲａ）ｎ－（ｎは１～６の整数）、－（ＣＨ２）ｎ－（ｎは１～６の整数）、－（ＡＯ）ｎ－（ＡＯは炭素数２～６のアルキレンオキサイドで、ｎは１～１０の整数）、－ＮＨＣＯＯ－、－ＣＯＮＨ－、－ＣＯＮＨ（Ｒｂ）－、－ＣＯＯ－、－ＳＯ２ＮＨ－、－ＨＮ－Ｃ（＝ＮＨ）－ＮＨ－、－Ｏ－、－Ｓ－、－ＮＲｂ－、－Ａｒ－（Ａｒはアリール基またはヘテロアリール基）、－ＣＯ－Ａｒ－ＮＲｂ－、からなる群から選択された１種以上の官能基を示し、Ｒａは水素原子または炭素数１～４のアルキル基、Ｒｂは炭素数１～４のアルキル基であり、Ｘ＋はカチオンを示す。
【0015】
さらに、本発明の別の態様に係る蛍光色素は、以下の一般式（ＩＩＩ）で表されるトリアゾール縮合環化合物からなることを特徴とするものである。
【0016】
【化3】
【0017】
ここで、一般式（ＩＩＩ）中、Ｒ６、Ｒ７は、それぞれ独立に、中心ベンゼン環との間に１種以上の連結基を有してもよい置換または非置換の、ヘテロアリール基、ヘテロアリールアミノアリール基またはジアリールアミノヘテロアリール基、アリール基またはジアリールアミノアリール基を示し、Ａ３は、－（ＣＨ＝ＣＲａ）ｎ－（ｎは１～６の整数）、－（ＣＨ２）ｎ－（ｎは１～６の整数）、－（ＡＯ）ｎ－（ＡＯは炭素数２～６のアルキレンオキサイドで、ｎは１～１０の整数）、－ＮＨＣＯＯ－、－ＣＯＮＨ－、－ＣＯＮＨ（Ｒｂ）－、－ＣＯＯ－、－ＳＯ２ＮＨ－、－ＨＮ－Ｃ（＝ＮＨ）－ＮＨ－、－Ｏ－、－Ｓ－、－ＮＲｂ－、－Ａｒ－（Ａｒはアリール基またはヘテロアリール基）、－ＣＯ－Ａｒ－ＮＲｂ－、からなる群から選択された１種以上の官能基を示し、Ｒａは水素原子または炭素数１～４のアルキル基、Ｒｂは炭素数１～４のアルキル基であり、Ｂ２は、アルキルエステル基、アルキルエーテル基、アルキルアミド基、またはそれらのアルキレンオキサイド（炭素数２～６）付加体、またはＡ３との連結基を有してもよい生体分子との反応性基を示す。
【発明の効果】
【0018】
本発明によれば、より高い蛍光強度を有する蛍光色素を提供することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【0019】
【発明を実施するための形態】
【0020】
以下、本発明の実施の形態について説明する。なお、本明細書で用いる「トリアゾール縮合環化合物」とは、２個以上の環が２個またはそれ以上の原子を共有して結合している化合物であり、その２個以上の環の内の１個の環がトリアゾールである化合物をいう。
【0021】
（実施の形態１）
本実施の形態に係る蛍光色素は、以下の一般式（Ｉ）で表されるトリアゾール縮合環化合物からなることを特徴とする。
本実施の形態に係る蛍光色素は、以下の一般式（Ｉ）で表されるトリアゾール縮合環化合物からなることを特徴とする。
【0022】
【化4】
【0023】
ここで、一般式（Ｉ）中、Ｒ１、Ｒ２は、それぞれ独立に、置換または非置換のアリール基あるいは置換または非置換のヘテロアリール基を示す。アリール基は、単環でも多環でもよく、例えば、フェニル基、ナフチル基、アントラセニル基を挙げることができ、好ましくはフェニル基である。また、ヘテロアリール基としては、単環でも多環でもよく、例えば、チエニル基、フラニル基、ピロリル基、イミダゾリル基、オキサゾリル基、チアジアゾリル基、ピラゾリル基、ピリジル基、キノリル基を挙げることができ、好ましくはチエニル基である。上記のアリール基または上記のヘテロアリール基の置換基としては、直鎖状または分岐状のアルキル基、アルコキシ基、アルキニル基、アルケニル基、アルキルエステル基、アミノアリール基、アリールアミノアリール基、ジアリールアミノアリール基、リン酸エステル基、硫酸エステル基、ニトリル基、ヒドロキシ基、シアノ基、またはスルホニル基を挙げることができる。好ましい置換基としては、アルコキシ基、アミノアリール基、アリールアミノアリール基、ジアリールアミノアリール基を挙げることができる。また、Ｒ１、Ｒ２は、それぞれ独立に、アミノアリール基、アリールアミノアリール基、ジアリールアミノアリール基でもよい。
【0024】
また、上記のアリール基またはヘテロアリール基の置換基に関し、アルキル基は、好ましくは炭素数１から６の直鎖状または分岐状のアルキル基である。また、アルケニル基は、好ましくはビニル基、アリル基、クロチル基、チグリル基またはプレニル基である。また、アルキニル基は、好ましくはエチニル基またはプロパルギル基である。また、アルコキシ基は、好ましくはメトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基、ブトキシ基、ペンチロキシ基またはフェノキシ基である。また、アルキルエステル基は、好ましくはメチルエステル基、エチルエステル基、プロピルエステル基、イソプロピルエステル基、ブチルエステル基またはイソブチルエステル基である。アミノアリール基は、好ましくはｐ－ジメチルアミノフェニル基、ｐ－ジエチルアミノフェニル基、またはｐ－ジプロピルアミノフェニル基である。アリールアミノアリール基は、好ましくはジメチルアミノフェニルアミノフェニル基、アミノフェニルアミノフェニル基、メトキシフェニルアミノフェニル基、ヒドロキシフェニルアミノフェニル基、クロロフェニルアミノフェニル基、ブロモフェニルアミノフェニル基、ヨードフェニルアミノフェニル基である。ここで、ジメチルアミノフェニルアミノフェニル基に対応する化合物の一例としてはジメチルアミノジフェニルアミン、アミノフェニルアミノフェニル基に対応する化合物の一例としては、アミノジフェニルアミン、メトキシフェニルアミノフェニル基に対応する化合物の一例としてはメトキシジフェニルアミン、ヒドロキシフェニルアミノフェニル基に対応する化合物の一例としてはヒドロキシジフェニルアミン、クロロフェニルアミノフェニル基に対応する化合物の一例としてはクロロジフェニルアミン、ブロモフェニルアミノフェニル基に対応する化合物の一例としてはブロモジフェニルアミン、ヨードフェニルアミノフェニル基に対応する化合物の一例としては、ヨードジフェニルアミンを挙げることができる。上記のジアリールアミノアリール基は、好ましくはジフェニルアミノフェニル基である。
【0025】
Ｒ１、Ｒ２の具体例としては、フェニル基や、ｐ－メトキシフェニル基、ｐ－エトキシフェニル基、ｐ－プロポキシフェニル基、ｐ－ブトキシフェニル基、ｐ－ペントキシフェニル基、ｐ－ヘキシルオキシフェニル基、ｐ－ヘプチルオキシフェニル基、ｐ－オクチルオキシフェニル基、ジメトキシフェニル基、ジエトキシフェニル基、ジプロポキシフェニル基、ジブトキシフェニル基、ジペントキシフェニル基、ジヘキシルオキシフェニル基等のアルコキシフェニル基や、ｐ－メチルフェニル基、ｐ－エチルフェニル基、ｐ－プロピルフェニル基、ｐ－ブチルフェニル基、ｐ－ペンチルフェニル基、ｐ－ヘキシルフェニル基、ｐ－ヘプチルフェニル基、ｐ－オクチルフェニル基、ジメチルフェニル基、ジエチルフェニル基、ジプロピルフェニル基、ジブチルフェニル基、ジペンチルフェニル基、ジヘキシルフェニル基等のアルキルフェニル基や、ｐ－ジメチルアミノフェニル基、ジフェニルアミノフェニル基等のアミノフェニル基を挙げることができる。好ましくは、アルコキシフェニル基やアミノフェニル基である。
【0026】
Ａ１は、－（ＣＨ＝ＣＲａ）ｎ－（ｎは１～６の整数）、－（ＣＨ２）ｎ－（ｎは１～６の整数）、－（ＡＯ）ｎ－（ＡＯは炭素数２～６のアルキレンオキサイドで、ｎは１～１０の整数）、－ＮＨＣＯＯ－、－ＣＯＮＨ－、－ＣＯＮＨ（Ｒｂ）－、－ＣＯＯ－、－ＳＯ２ＮＨ－、－ＨＮ－Ｃ（＝ＮＨ）－ＮＨ－、－Ｏ－、－Ｓ－、－ＮＲｂ－、－Ａｒ－（Ａｒはアリール基又はヘテロアリール基）、－ＣＯ－Ａｒ－ＮＲｂ－、からなる群から選択された１種以上の官能基を示し、Ｒａは水素原子または炭素数１～４のアルキル基、Ｒｂは炭素数１～４のアルキル基である。好ましくは、Ａ１は、－（ＣＨ２）ｎ－（ｎは１～６の整数）、－（ＡＯ）ｎ－（ＡＯは炭素数２～６のアルキレンオキサイドで、ｎは１～１０の整数）である。
【0027】
また、Ａ１は、－（ＣＨ２）ｎ－Ｌ－（ＣＨ２）ｎ－、または－（ＡＯ）ｎ－Ｌ－（ＡＯ）ｎ－、で表されるように、アルキレン鎖同士またはアルキレンオキサイド鎖同士が、連結基Ｌで連結された構造をとることもできる。ここで、Ｌは、－ＮＨＣＯＯ－、－ＣＯＮＨ－、－ＣＯＮＨ（Ｒｂ）－、－ＣＯＯ－、－ＳＯ２ＮＨ－、－ＨＮ－Ｃ（＝ＮＨ）－ＮＨ－、－Ｏ－、－Ｓ－、－ＮＲｂ－、－Ａｒ－（Ａｒはアリール基）、－ＣＯ－Ａｒ－ＮＲｂ－、からなる群から選択された１種、好ましくは、－ＮＨＣＯＯ－、－ＣＯＮＨ－、－ＣＯＮＨ（Ｒｂ）－、－ＣＯＯ－である。
【0028】
Ｂ１は、アルキルエステル基、アルキルエーテル基、アルキルアミド基、またはそれらのアルキレンオキサイド（炭素数２～６）付加体、またはＡ１との連結基を有してもよい生体分子との反応性基を示す。アルキルエステル基は、例えば、メチルエステル基、エチルエステル基、プロピルエステル基、イソプロピルエステル基、ブチルエステル基又はイソブチルエステル基を挙げることができるが、好ましくはメチルエステル基、エチルエステル基である。また、上記のアルキレンオキサイド付加体の例としては、Ｒｃ－ＣＯＮＨ－（ＡＯ）ｎ－、Ｒｃ－ＣＯＯ－（ＡＯ）ｎ－、Ｒｃ－Ｏ－（ＡＯ）ｎ－を挙げることができる。ここで、Ｒｃは炭素数１～８のアルキル基、ＡＯは炭素数２～６のアルキレンオキサイドで、ｎは１～１０の整数である。
【0029】
上記の反応性基は共有結合により生体分子と結合する。共有結合として、例えばアミド結合、イミド結合、ウレタン結合、エステル結合、またはグアニジン結合を形成する場合、反応性基には、生体分子のアミノ基、イミノ基、チオール基、カルボキシル基またはヒドロキシル基と反応可能な官能基が好ましい。その官能基には、例えば、イソチオシアネート基、イソシアネート基、無水マレイン酸基、エポキシ基、ハロゲン化スルホニル基、塩化アシル基、ハロゲン化アルキル基、グリオキザル基、アルデヒド基、トリアジン基、カルボジイミド基、および活性エステル化したカルボニル基（以下、活性エステル基ともいう）等を用いることができる。好ましくは、イソチオシアネート基、イソシアネート基、エポキシ基、ハロゲン化アルキル基、トリアジン基、カルボジイミド基、および活性エステル基から選択されたいずれか１種を用いることが好ましい。より好ましくは、イソチオシアネート基、イソシアネート基、エポキシ基、ハロゲン化アルキル基、トリアジン基、カルボジイミド基、および活性エステル基から選択されたいずれか１種である。さらに好ましくはトリアジン基、カルボジイミド基、または活性エステル基である。例えば、活性エステル基には、Ｎ－ヒドロキシ－スクシンイミドエステルやマレイミドエステルを用いることができる。Ｎ－ヒドロキシ－スクシンイミドを用い、縮合剤としてＤＣＣを用いることによりＮ－ヒドロキシ－スクシンイミドエステル体を経由してアミド結合により生体分子と結合する。また、カルボジイミド基には、Ｎ，Ｎ‘－ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）や１－シクロヘキシル－３－（２－モルホリノエチル）カルボジイミド等のカルボジイミド試薬を用いることができる。カルボジイミド体を経由してアミド結合により生体分子と結合することができる。
【0030】
なお、Ｂ１に関し、上記のＡ１との連結基は、エステル基、エーテル基、チオエーテル基、アミド基、スルホンアミド基等を挙げることができる。
【0031】
本実施の形態に係る蛍光色素は、高い蛍光強度を有する。特に、Ｒ１、Ｒ２に、置換または非置換のアリール基あるいは置換または非置換のヘテロアリール基を用いることで、無置換の場合（Ｒ１とＲ２が水素原子の場合）に比べ、モル吸光係数、輝度の向上や蛍光波長の長波長化という効果を有する。
【0032】
（実施の形態２）
本実施の形態に係る蛍光色素は、以下の一般式（ＩＩ）で表されるトリアゾール縮合環化合物からなることを特徴とする。
本実施の形態に係る蛍光色素は、以下の一般式（ＩＩ）で表されるトリアゾール縮合環化合物からなることを特徴とする。
【0033】
【化5】
【0034】
ここで、一般式（ＩＩ）中、Ｒ３、Ｒ４は、それぞれ水素を示し、Ｒ５は、中心ピリジン環との連結基を有してもよい生体分子との反応性基を示し、Ａ２は、－（ＣＨ＝ＣＲａ）ｎ－（ｎは１～６の整数）、－（ＣＨ２）ｎ－（ｎは１～６の整数）、－（ＡＯ）ｎ－（ＡＯは炭素数２～６のアルキレンオキサイドで、ｎは１～１０の整数）、－ＮＨＣＯＯ－、－ＣＯＮＨ－、－ＣＯＮＨ（Ｒｂ）－、－ＣＯＯ－、－ＳＯ２ＮＨ－、－ＨＮ－Ｃ（＝ＮＨ）－ＮＨ－、－Ｏ－、－Ｓ－、－ＮＲｂ－、－Ａｒ－（Ａｒはアリール基またはヘテロアリール基）、－ＣＯ－Ａｒ－ＮＲｂ－、からなる群から選択された１種以上の官能基を示し、Ｒａは水素原子または炭素数１～４のアルキル基、Ｒｂは炭素数１～４のアルキル基であり、Ｘ＋はカチオンを示す。
【0035】
Ｒ３、Ｒ４としては、一般式（Ｉ）のＲ１、Ｒ２に用いたものと同様のものを用いることができる。
【0036】
Ｒ５は、中心ピリジン環との間に連結基を有してもよい生体分子との反応性基を示し、一般式（Ｉ）のＢ１に用いたものと同様のものを用いることができる。すなわち、イソチオシアネート基、イソシアネート基、無水マレイン酸基、エポキシ基、ハロゲン化スルホニル基、塩化アシル基、ハロゲン化アルキル基、グリオキザル基、アルデヒド基、トリアジン基、カルボジイミド基、および活性エステル基からなる群から選択される１種であり、好ましくは、イソチオシアネート基、イソシアネート基、エポキシ基、ハロゲン化アルキル基、トリアジン基、カルボジイミド基、および活性エステル基から選択されたいずれか１種、より好ましくはトリアジン基、カルボジイミド基、または活性エステル基である。なお、上記のＡ２との連結基は、エステル基、エーテル基、チオエーテル基、アミド基、スルホンアミド基等を挙げることができる。
【0037】
Ａ２は、好ましくは、－（ＣＨ２）ｎ－（ｎは１～６の整数）、－（ＡＯ）ｎ－（ＡＯは炭素数２～６のアルキレンオキサイドで、ｎは１～１０の整数）である。
【0038】
Ｘ＋は、カチオンを示し、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｌｉ＋等のアルカリ金属イオンやアンモニウムカチオンを挙げることができる。好ましくはアンモニウムカチオン、より好ましくは、ジアルキルアンモニウムカチオンまたはトリアルキルアンモニウムカチオンである。ジアルキルアンモニウムカチオンとしては、ジイソプロピルアンモニウムカチオンを挙げることができる。また、トリアルキルアンモニウムカチオンとしては、トチメチルアンモニウムカチオン、トリエチルアンモニウムカチオン、トリプロピルアンモニウムカチオン、トリブチルアンモニウムカチオンを挙げることができる。
【0039】
本実施の形態に係る蛍光色素は、スルホン酸基を有しているので、水溶性を向上させることができる。これにより、高い蛍光強度を得ることが可能となる。
【0040】
（実施の形態３）
本実施の形態に係る蛍光色素は、以下の一般式（ＩＩＩ）で表されるトリアゾール縮合環化合物からなることを特徴とする。
本実施の形態に係る蛍光色素は、以下の一般式（ＩＩＩ）で表されるトリアゾール縮合環化合物からなることを特徴とする。
【0041】
【化6】
【0042】
ここで、一般式（ＩＩＩ）中、Ｒ６、Ｒ７は、それぞれ独立に、中心ベンゼン環との間に１種以上の連結基を有してもよい置換または非置換の、ヘテロアリール基、ヘテロアリールアミノアリール基またはジアリールアミノヘテロアリール基、アリール基、アミノアリール基、アリールアミノアリール基またはジアリールアミノアリール基を示し、Ａ３は、－（ＣＨ＝ＣＲａ）ｎ－（ｎは１～６の整数）、－（ＣＨ２）ｎ－（ｎは１～６の整数）、－（ＡＯ）ｎ－（ＡＯは炭素数２～６のアルキレンオキサイドで、ｎは１～１０の整数）、－ＮＨＣＯＯ－、－ＣＯＮＨ－、－ＣＯＮＨ（Ｒｂ）－、－ＣＯＯ－、－ＳＯ２ＮＨ－、－ＨＮ－Ｃ（＝ＮＨ）－ＮＨ－、－Ｏ－、－Ｓ－、－ＮＲｂ－、－Ａｒ－（Ａｒはアリール基またはヘテロアリール基）、－ＣＯ－Ａｒ－ＮＲｂ－、からなる群から選択された１種以上の官能基を示し、Ｒａは水素原子または炭素数１～４のアルキル基、Ｒｂは炭素数１～４のアルキル基であり、Ｂ２は、アルキルエステル基、アルキルエーテル基、アルキルアミド基、またはそれらのアルキレンオキサイド（炭素数２～６）付加体、またはＡ３との連結基を有してもよい生体分子との反応性基を示す。
【0043】
Ｒ６、Ｒ７が置換または非置換のアリール基である場合、Ｒ６、Ｒ７には、一般式（Ｉ）のＲ１、Ｒ２に用いたものと同様のものを用いることができる。
【0044】
また、Ｒ６、Ｒ７が、置換または非置換のジアリールアミノアリール基である場合、ジアリールアミノアリール基は、ジフェニルアミノフェニル基である。また、アリールアミノアリール基である場合、好ましくはジメチルアミノフェニルアミノフェニル基、アミノフェニルアミノフェニル基、メトキシフェニルアミノフェニル基、ヒドロキシフェニルアミノフェニル基、クロロフェニルアミノフェニル基、ブロモフェニルアミノフェニル基、ヨードフェニルアミノフェニル基である。また、アミノアリール基である場合、ｐ－ジメチルアミノフェニル基、ｐ－ジエチルアミノフェニル基、またはｐ－ジプロピルアミノフェニル基である。置換基としては、直鎖状または分岐状のアルキル基や、アルコキシ基を挙げることができる。上記のアルキル基は、好ましくは炭素数１から６の直鎖状または分岐状のアルキル基である。また、上記のアルコキシ基は、好ましくはメトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基、ブトキシ基、ペンチロキシ基またはフェノキシ基である。
【0045】
Ｒ６、Ｒ７は、中心ベンゼン環との間に１種以上の連結基を有していてもよい。連結基には、アルキニル基、アルケニル基、置換または非置換のアリール基またはヘテロアリール基を用いることができる。アルケニル基は、好ましくはビニル基、アリル基、クロチル基、チグリル基またはプレニル基、より好ましくはビニル基である。また、アルキニル基は、好ましくはエチニル基またはプロパルギル基、より好ましくはエチニル基である。また、置換または非置換のアリール基またはヘテロアリール基は、好ましくは置換または非置換のアリール基であり、その置換基としては、炭素数１～８の直鎖状または分岐状のアルキル基、アルコキシ基、アルキニル基、アルケニル基、アルキルエステル基、リン酸エステル基、硫酸エステル基、ニトリル基、ヒドロキシ基、またはシアノ基を挙げることができる。また、２種以上の連結基を用いる場合、アルキニル基、アルケニル基、置換または非置換のアリール基またはヘテロアリール基の中から、２種以上を選択して、適宜組み合わせて用いることができる。例えば、２種の連結基を用いる場合、アルキニル基と、置換または非置換のアリール基またはヘテロアリール基との組み合わせや、アルケニル基と、置換または非置換のアリール基またはヘテロアリール基との組み合わせを挙げることができる。また、２種以上の連結基を用いる場合、中心ベンゼン環側の連結基は、特に限定されないが、アルキニル基またはアルケニル基が好ましい。
【0046】
Ａ３は、好ましくは、－（ＣＨ２）ｎ－（ｎは１～６の整数）、－（ＡＯ）ｎ－（ＡＯは炭素数２～６のアルキレンオキサイドで、ｎは１～１０の整数）である。
【0047】
Ｂ２には、一般式（Ｉ）中のＢ２に用いたものと同様のものを用いることができる。
【0048】
本実施の形態に係る蛍光色素は、高い蛍光強度を有する。また、中心ベンゼン環を有することで、ｐＨによる影響を受けにくいという効果が得られる。
【0049】
一般式（ＩＩＩ）で表されるトリアゾール縮合環化合物の一例としては、以下の一般式（ＩＶ）で表される化合物を挙げることができる。
【0050】
【化7】
【0051】
ここで、一般式（ＩＶ）の化合物は、一般式（ＩＩＩ）のＲ６、Ｒ７として、中心ベンゼン環との連結基としてビニル基を有する置換または非置換の、ヘテロアリール基、ヘテロアリールアミノアリール基またはジアリールアミノヘテロアリール基、アリール基、アリールアミノアリール基またはジアリールアミノアリール基を用いた以外は、一般式（ＩＩＩ）の場合と同様のものを用いることができる。そのため、一般式（ＩＶ）のＢ２とＡ３には、一般式（ＩＩＩ）に用いたものと同様のものを用いることができる。また、Ｒ８、Ｒ９には、一般式（ＩＩＩ）に用いたものと同様の、置換または非置換の、アリール基、アリールアミノアリール基またはジアリールアミノアリール基を用いることができる。
【0052】
ここで、一般式（ＩＶ）の化合物の一例として、以下の一般式（ＩＶ－１）の化合物を挙げることができる。一般式（ＩＶ－１）の化合物は、一般式（ＩＶ）の化合物のＲ８、Ｒ９に、フェノキシアルキルスルホン酸塩を用い、Ａ３には－（ＣＨ２）ｎ－を用い、Ｂ２には生体分子との反応性基を用いたものである。なお、式中、アルキル基の炭素数ｎは、１～８である。また、Ｘ＋は、実施の形態２の場合と同様に、カチオンを示し、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｌｉ＋等のアルカリ金属イオンやアンモニウムカチオンを挙げることができる。好ましくはアンモニウムカチオン、より好ましくは、ジアルキルアンモニウムカチオンまたはトリアルキルアンモニウムカチオンである。
【0053】
【化8】
【0054】
また、一般式（ＩＶ）の化合物の別の例として、以下の一般式（ＩＶ－２）の化合物を挙げることができる。一般式（ＩＶ－２）の化合物は、一般式（ＩＶ）の化合物のＲ８、Ｒ９に、ビニル基との連結基Ａｒを含むフェノキシアルキルスルホン酸塩を用い、Ａ３には－（ＣＨ２）ｎ－を用い、Ｂ２には生体分子との反応性基を用いたものである。なお、式中、アルキル基の炭素数ｎは、１～８である。また、Ｘ＋は、実施の形態２の場合と同様に、カチオンを示し、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｌｉ＋等のアルカリ金属イオンやアンモニウムカチオンを挙げることができる。好ましくはアンモニウムカチオン、より好ましくは、ジアルキルアンモニウムカチオンまたはトリアルキルアンモニウムカチオンである。なお、連結基Ａｒは、置換または非置換のアリール基またはヘテロアリール基を意味し、好ましくは置換または非置換のアリール基である。アリール基は、例えば、フェニル基、ナフチル基、アントラセニル基を挙げることができ、好ましくはフェニル基である。ヘテロアリール基としては、例えば、チエニル基、フラニル基、ピロリル基、イミダゾリル基、オキサゾリル基、チアジアゾリル基、ピラゾリル基、ピリジル基、キノリル基を挙げることができ、好ましくはチエニル基である。その置換基としては、炭素数１～８の直鎖状または分岐状のアルキル基、アルコキシ基、アルキニル基、アルケニル基、アルキルエステル基、リン酸エステル基、硫酸エステル基、ニトリル基、ヒドロキシ基、またはシアノ基を挙げることができるが、好ましくはアルコキシ基である。
【0055】
【化9】
【0056】
また、一般式（ＩＶ）の化合物の別の例として、以下の一般式（ＩＶ－３）の化合物を挙げることができる。一般式（ＩＶ－３）の化合物は、一般式（ＩＶ）の化合物のＲ８、Ｒ９に、二置換アミノ基を有するアリール基を用いたものである。アリール基としては、フェニル基が好ましい。Ｒ１４は、炭素数１～８の直鎖状または分岐状のアルキル基、フェニル基、メトキシフェニル基、ヒドロキシジフェニル基、クロロフェニル基、ブロモフェニル基、またはヨードフェニル基を挙げることができるが、好ましくはフェニル基またはメトキシフェニル基、より好ましくはフェニル基である。
【0057】
【化10】
【0058】
また、一般式（ＩＶ）の化合物の別の例として、以下の一般式（ＩＶ－４）の化合物を挙げることができる。一般式（ＩＶ－４）の化合物は、一般式（ＩＶ）の化合物のＲ８、Ｒ９に、二置換アミノ基を有するヘテロアリール基を用いたものである。Ｒ１５は、炭素数１～８の直鎖状または分岐状のアルキル基、フェニル基、アルコキシフェニル基、ヒドロキシジフェニル基、クロロフェニル基、ブロモフェニル基、またはヨードフェニル基を挙げることができるが、好ましくはフェニル基またはアルコキシフェニル基、より好ましくはフェニル基である。また、Ｙは、酸素原子、窒素原子、または硫黄電子であり、好ましくは、硫黄原子である。
【0059】
【化11】
【0060】
また、一般式（ＩＶ）の化合物の別の例として、一般式（ＩＶ）の化合物のＲ８、Ｒ９に、
ｐ－メトキシフェニル基、ｐ－エトキシフェニル基、ｐ－プロポキシフェニル基、ｐ－ブトキシフェニル基、ｐ－ペントキシフェニル基、ｐ－ヘキシルオキシフェニル基、ｐ－ヘプチルオキシフェニル基、ｐ－オクチルオキシフェニル基、ジメトキシフェニル基、ジエトキシフェニル基、ジプロポキシフェニル基、ジブトキシフェニル基、ジペントキシフェニル基、ジヘキシルオキシフェニル基等のアルコキシフェニル基を用いたものも挙げることができる。
ｐ－メトキシフェニル基、ｐ－エトキシフェニル基、ｐ－プロポキシフェニル基、ｐ－ブトキシフェニル基、ｐ－ペントキシフェニル基、ｐ－ヘキシルオキシフェニル基、ｐ－ヘプチルオキシフェニル基、ｐ－オクチルオキシフェニル基、ジメトキシフェニル基、ジエトキシフェニル基、ジプロポキシフェニル基、ジブトキシフェニル基、ジペントキシフェニル基、ジヘキシルオキシフェニル基等のアルコキシフェニル基を用いたものも挙げることができる。
【0061】
また、一般式（ＩＩＩ）で表されるトリアゾール縮合環化合物の別の例としては、以下の一般式（Ｖ）で表される化合物を挙げることができる。
【0062】
【化12】
【0063】
ここで、一般式（Ｖ）の化合物は、一般式（ＩＩＩ）のＲ６、Ｒ７として、中心ベンゼン環との連結基としてエチニル基を有する置換または非置換のヘテロアリール基、ヘテロアリールアミノアリール基またはジアリールアミノヘテロアリール基、アリール基、ジアリールアミノアリール基を用いた以外は、一般式（ＩＩＩ）の場合と同様のものを用いることができる。そのため、一般式（Ｖ）のＢ２とＡ３には、一般式（ＩＩＩ）に用いたものと同様のものを用いることができる。Ｒ１０、Ｒ１１には、置換または非置換のヘテロアリール基、ヘテロアリールアミノアリール基またはジアリールアミノヘテロアリール基、アリール基、またはジアリールアミノアリール基を用いることができる。
【0064】
ここで、一般式（Ｖ）の化合物の一例として、以下の一般式（Ｖ－１）の化合物を挙げることができる。一般式（Ｖ－１）の化合物は、一般式（Ｖ）の化合物のＲ１０、Ｒ１１に、置換基を有するアリール基として、フェノキシアルキルスルホン酸塩を用い、Ａ３には－（ＣＨ２）ｎ－を用い、Ｂ２には生体分子との反応性基を用いたものである。なお、式中、フェノキシアルキルスルホン酸塩のアルキル基の炭素数ｎは、１～８である。また、Ｘ＋は、実施の形態２の場合と同様に、カチオンを示し、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｌｉ＋等のアルカリ金属イオンやアンモニウムカチオンを挙げることができる。好ましくはアンモニウムカチオン、より好ましくは、ジアルキルアンモニウムカチオンまたはトリアルキルアンモニウムカチオンである。
【0065】
【化13】
【0066】
また、一般式（Ｖ）の化合物の別の例として、以下の一般式（Ｖ－２）の化合物を挙げることができる。一般式（Ｖ－２）の化合物は、一般式（Ｖ）の化合物のＲ１０、Ｒ１１に、エチニル基との連結基Ａｒを含むフェノキシアルキルスルホン酸塩を用い、Ａ３には－（ＣＨ２）ｎ－を用い、Ｂ２には生体分子との反応性基を用いたものである。なお、式中、フェノキシアルキルスルホン酸塩のアルキル基の炭素数ｎは、１～８である。また、Ｘ＋は、実施の形態２の場合と同様に、カチオンを示し、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｌｉ＋等のアルカリ金属イオンやアンモニウムカチオンを挙げることができる。好ましくはアンモニウムカチオン、より好ましくは、ジアルキルアンモニウムカチオンまたはトリアルキルアンモニウムカチオンである。なお、連結基Ａｒは、置換または非置換のアリール基またはヘテロアリール基を意味し、好ましくは置換または非置換のアリール基である。その置換基としては、炭素数１～８の直鎖状または分岐状のアルキル基、アルコキシ基、アルキニル基、アルケニル基、アルキルエステル基、リン酸エステル基、硫酸エステル基、ニトリル基、ヒドロキシ基、またはシアノ基を挙げることができるが、好ましくはアルコキシ基である。
【0067】
【化14】
【0068】
また、一般式（Ｖ）の化合物の別の例として、以下の一般式（Ｖ－３）の化合物を挙げることができる。一般式（Ｖ－３）の化合物は、一般式（Ｖ）の化合物のＲ１０、Ｒ１１に、二置換アミノ基を有するアリール基を用いたものである。Ｒ１４は、炭素数１～８の直鎖状または分岐状のアルキル基、フェニル基、メトキシフェニル基、ヒドロキシジフェニル基、クロロフェニル基、ブロモフェニル基、またはヨードフェニル基を挙げることができるが、好ましくは、フェニル基またはメトキシフェニル基、より好ましくはフェニル基である。
【0069】
【化15】
【0070】
また、一般式（Ｖ）の化合物の別の例として、以下の一般式（Ｖ－４）の化合物を挙げることができる。一般式（Ｖ－４）の化合物は、一般式（Ｖ）の化合物のＲ１０、Ｒ１１に、二置換アミノ基を有するヘテロアリール基を用いたものである。Ｒ１５は、炭素数１～８の直鎖状または分岐状のアルキル基、フェニル基、メトキシフェニル基、ヒドロキシジフェニル基、クロロフェニル基、ブロモフェニル基、またはヨードフェニル基を挙げることができるが、好ましくはフェニル基またはメトキシフェニル基、より好ましくはフェニル基である。また、Ｙは、酸素原子、窒素原子、または硫黄電子であり、好ましくは、硫黄原子である。
【0071】
【化16】
【0072】
また、一般式（ＩＩＩ）で表されるトリアゾール縮合環化合物の別の例としては、以下の一般式（ＶＩ）で表される化合物を挙げることができる。
【0073】
【化17】
【0074】
ここで、一般式（ＶＩ）の化合物は、一般式（ＩＩＩ）のＲ６、Ｒ７として、中心ベンゼン環と直接結合する、置換または非置換の、ヘテロアリール基、ヘテロアリールアミノアリール基またはジアリールアミノヘテロアリール基、アリール基、アリールアミノアリール基またはジアリールアミノアリール基を用いた以外は、一般式（ＩＩＩ）の場合と同様のものを用いることができる。そのため、一般式（Ｖ）のＢ２とＡ３には、一般式（ＩＩＩ）に用いたものと同様のものを用いることができる。Ｒ１２、Ｒ１３には、置換または非置換の、ヘテロアリール基、ヘテロアリールアミノアリール基またはジアリールアミノヘテロアリール基、アリール基、アリールアミノアリール基またはジアリールアミノアリール基を用いることができる。
【0075】
一般式（ＶＩ）の化合物の一例として、以下の一般式（ＶＩ－１）の化合物を挙げることができる。一般式（ＶＩ－１）の化合物は、一般式（ＶＩ）の化合物のＲ１２、Ｒ１３に、置換基を有するアリール基としてフェノキシアルキルスルホン酸塩を用い、Ａ３には－（ＣＨ２）ｎ－を用い、Ｂ２には生体分子との反応性基を用いたものである。なお、式中、フェノキシアルキルスルホン酸塩のアルキル基の炭素数ｎは、１～８である。また、Ｘ＋は、実施の形態２の場合と同様に、カチオンを示し、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｌｉ＋等のアルカリ金属イオンやアンモニウムカチオンを挙げることができる。好ましくはアンモニウムカチオン、より好ましくは、ジアルキルアンモニウムカチオンまたはトリアルキルアンモニウムカチオンである。
【0076】
【化18】
【0077】
また、一般式（ＶＩ）の化合物の別の例として、以下の一般式（ＶＩ－２）の化合物を挙げることができる。一般式（ＶＩ－２）の化合物は、一般式（ＶＩ）の化合物のＲ１２、Ｒ１３に、中心ベンゼン環との１種以上の連結基Ａｒを含むフェノキシアルキルスルホン酸塩を用い、Ａ３には－（ＣＨ２）ｎ－を用い、Ｂ２には生体分子との反応性基を用いたものである。なお、式中、フェノキシアルキルスルホン酸塩のアルキル基の炭素数ｎは、１～８である。また、Ｘ＋は、実施の形態２の場合と同様に、カチオンを示し、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｌｉ＋等のアルカリ金属イオンやアンモニウムカチオンを挙げることができる。好ましくはアンモニウムカチオン、より好ましくは、ジアルキルアンモニウムカチオンまたはトリアルキルアンモニウムカチオンである。なお、連結基Ａｒは、置換または非置換のアリール基またはヘテロアリール基を意味し、好ましくは置換または非置換のアリール基である。アリール基は、例えば、フェニル基、ナフチル基、アントラセニル基を挙げることができ、好ましくはフェニル基である。ヘテロアリール基としては、例えば、チエニル基、フラニル基、ピロリル基、イミダゾリル基、オキサゾリル基、チアジアゾリル基、ピラゾリル基、ピリジル基、キノリル基を挙げることができ、好ましくはチエニル基である。その置換基としては、炭素数１～８の直鎖状または分岐状のアルキル基、アルコキシ基、アルキニル基、アルケニル基、アルキルエステル基、リン酸エステル基、硫酸エステル基、ニトリル基、ヒドロキシ基、またはシアノ基を挙げることができるが、好ましくは、アルコキシ基である。
【0078】
【化19】
【0079】
また、一般式（ＩＩＩ）で表されるトリアゾール縮合環化合物の一例としては、以下の一般式（ＶＩＩ）で表される化合物を挙げることができる。
【0080】
【化20】
【0081】
ここで、一般式（ＶＩＩ）の化合物は、一般式（ＩＩＩ）のＲ６、Ｒ７として、二置換アミノ基を有するアリール基を用いたものである。Ｒ１４は、炭素数１～８の直鎖状または分岐状のアルキル基、フェニル基、アルコキシフェニル基、ヒドロキシジフェニル基、クロロフェニル基、ブロモフェニル基、またはヨードフェニル基を挙げることができるが、好ましくは、アルキル基またはアルコキシフェニル基である。また、アリール基はさらに置換基を有してもよく、その置換基としては、炭素数１～８の直鎖状または分岐状のアルキル基、アルコキシ基、アルキニル基、アルケニル基、アルキルエステル基、リン酸エステル基、硫酸エステル基、ニトリル基、ヒドロキシ基、またはシアノ基を挙げることができるが、好ましくは、アルキル基またはアルコキシ基である。
【0082】
また、一般式（ＩＩＩ）で表されるトリアゾール縮合環化合物の一例としては、以下の一般式（ＶＩＩＩ）で表される化合物を挙げることができる。
【0083】
【化21】
【0084】
ここで、一般式（ＶＩＩＩ）の化合物は、一般式（ＩＩＩ）のＲ６、Ｒ７として、二置換アミノ基を有するヘテロアリール基を用いたものである。Ｒ１５は、炭素数１～８の直鎖状または分岐状のアルキル基、フェニル基、アルコキシフェニル基、ヒドロキシジフェニル基、クロロフェニル基、ブロモフェニル基、またはヨードフェニル基を挙げることができるが、好ましくは、アルキル基、アルコキシフェニル基である。また、ヘテロアリール基はさらに置換基を有してもよく、その置換基としては、炭素数１～８の直鎖状または分岐状のアルキル基、アルコキシ基、アルキニル基、アルケニル基、アルキルエステル基、リン酸エステル基、硫酸エステル基、ニトリル基、ヒドロキシ基、またはシアノ基を挙げることができるが、好ましくは、アルキル基またはアルコキシ基である。また、Ｙは、酸素原子、窒素原子、または硫黄電子であり、好ましくは、硫黄原子である。
【0085】
（用途）
本発明の蛍光色素は、標識された固体あるいは半固体状態の生体分子の蛍光を測定する検出方法であれば、あらゆる生体分子の検出方法に適用することができる。従来の蛍光色素に代えて用いることにより、高感度で、化学的に安定で操作性に優れ、さらに低コストの検出方法を提供することができる。本発明の蛍光色素は、生体分子試料に蛍光色素を直接反応させて標識しても良く、あるいは生体分子試料と、本発明の蛍光色素で標識されたプローブとを反応させて標識する方法を用いることもできる。さらに、本発明の蛍光色素で標識した生体分子試料を電気泳動によりサイズ分離する方法を用いることもできる。例えば、核酸を検出対象とするＤＮＡマイクロアレイ法や、プライマーやターミネータを用いるＰＣＲ法に用いることができる。
本発明の蛍光色素は、標識された固体あるいは半固体状態の生体分子の蛍光を測定する検出方法であれば、あらゆる生体分子の検出方法に適用することができる。従来の蛍光色素に代えて用いることにより、高感度で、化学的に安定で操作性に優れ、さらに低コストの検出方法を提供することができる。本発明の蛍光色素は、生体分子試料に蛍光色素を直接反応させて標識しても良く、あるいは生体分子試料と、本発明の蛍光色素で標識されたプローブとを反応させて標識する方法を用いることもできる。さらに、本発明の蛍光色素で標識した生体分子試料を電気泳動によりサイズ分離する方法を用いることもできる。例えば、核酸を検出対象とするＤＮＡマイクロアレイ法や、プライマーやターミネータを用いるＰＣＲ法に用いることができる。
【0086】
また、タンパク質を検出対象とする場合、通常、電気泳動後のタンパク質の検出には染色色素が用いられている。泳動後のゲル中に、染色色素、例えばクーマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）を浸透させてタンパク質を染色し、ＵＶを照射して発光させる方法が用いられる。しかしながら、従来の染色色素を用いる方法は簡便であるが、感度が１００ｎｇ程度と低く微量のタンパク質の検出には適さない。また、ゲルを介して染色色素を浸透させるため、染色に長時間を要するという問題もある。これに対し、本発明の蛍光色素を用いると高感度であり、微量タンパク質の検出には好適である。さらに、サイズ分離したタンパク質を質量分析して同定することもできる。
【0087】
ここで、タンパク質には、アルブミン、グロブリン、グルテリン、ヒストン、プロタミン、そしてコラーゲン等の単純タンパク質、核タンパク質、糖タンパク質、リボタンパク質、リンタンパク質、金属タンパク質等の複合タンパク質のいずれも検出対象とすることができる。例えば、リンタンパク質、糖タンパク質、総タンパク質の染色色素に対応させて３種の蛍光色素を用い、二次元電気泳動で分離したタンパク質試料において、リンタンパク質、糖タンパク質及び総タンパク質を染色することができる。また、ＴＯＦ－Ｍａｓｓ等の質量分析を行うことにより、タンパク質を同定できるので、特殊なタンパク質を生成させる、ガンやウィルスによる感染症などの疾病の診断や治療に応用することが可能である。また、コラーゲンは、動物の結合組織を構成するタンパク質であり、独特の繊維状構造をとる。すなわち、３本のポリペプチド鎖からなり、そのペプチド鎖が寄り集まって三重鎖を形成する。コラーゲンは、一般に極めて免疫原性が低いタンパク質であり、食品、化粧品、医薬品等の分野で広く利用されている。しかし、コラーゲンのペプチド鎖に蛍光色素を導入しても、従来の蛍光色素ではその安定性が十分とは言えず、より安定な蛍光色素が必要とされている。そこで、本発明の蛍光色素を用いてコラーゲンを標識することにより、安定かつ高感度な検出を行うことが可能となる。
【0088】
また、タンパク質と特異的に結合する抗体を本発明の蛍光色素で標識することにより、タンパク質を標識することもできる。例えば、ＩｇＧ抗体をペプシンで処理するとＦ（ａｂ’)2と呼ばれるフラグメントが得られる。このフラグメントをジチオスレイトール等で還元するとＦａｂ’と呼ばれるフラグメントが得られる。Ｆａｂ’フラグメントは1つもしくは２つのチオール基（－ＳＨ）を有している。このチオール基に対してマレイミド基を作用させて特異的な反応を行うことができる。すなわち、本発明の蛍光色素に反応性基としてマレイミド基を導入し、フラグメントのチオール基と反応させることにより抗体を標識することができる。この場合、抗体の生理活性（抗原捕捉能）を失うことがない。
【0089】
なお、本発明の蛍光色素でアプタマーを標識することもできる。アプタマーはオリゴ核酸からなり、塩基配列に依存して種々の特徴ある立体構造をとることができるので、その立体構造を介してタンパク質を含むあらゆる生体分子に結合することができる。この性質を利用し、本発明の蛍光色素で標識したアプタマーを特定のタンパク質に結合させ、被検出物質との結合によるそのタンパク質の構造変化に伴う蛍光変化から間接的に被検出物質を検出することができる。
【0090】
また、本発明の蛍光色素を用いて、細胞内のシグナル観察を行うこともできる。内部シグナルや環境情報に対する細胞の応答には、イオンから酵素へと多大な分子が関与している。シグナル伝達過程では特殊なプロテインキナーゼが活性化し、特殊な細胞タンパク質のリン酸化を導くことで様々な細胞応答の初期応答を担っていることが知られている。ヌクレオチドの結合と加水分解はこれらの活性に重大な役割を果たしており、ヌクレオチド誘導体を用いることで、シグナル伝達挙動を素早く観察することが出来る。例えば、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）は細胞膜におけるシグナル伝達において重要な役割を果たしている。このＣａ２＋依存セリン／スレオニンプロテインキナーゼはジアシルグリセロールやフォスファティジルセリンの様な膜構成脂質上で活性化され、イオンチャネルや細胞骨格タンパク質に存在するセリンやスレオニンをリン酸化することで膜表面電化を変えシグナル伝達を行っている。これらを生細胞において動的に観察することで細胞のシグナル伝達の観察を行うことができる。
【0091】
ここで、ヌクレオチド誘導体は酵素の基質や阻害剤として供給され、孤立性タンパク質の構造と力学の探査、膜結合タンパク酵素の再構成、ミトコンドリアのようなオルガネラ、除膜筋線維のような組織のヌクレオチド結合タンパク質部分に、結合してその調節を行っている。また、最近ではＧ－タンパク質の阻害剤や活性体のようなシグナル伝達に影響を与える化合物の存在も解ってきている。このヌクレオチド誘導体に本発明の蛍光色素を導入することで、これらの細胞内シグナル伝達の動的観察を高感度で、かつ取り扱い容易に行うことが可能となる。
【0092】
また、本発明の蛍光色素を、組織または細胞試料中の標的核酸や標的タンパク質の発現レベルの検討に用いる組織または細胞の染色色素としても用いることができる。すなわち、本発明の染色色素を真核細胞の染色に用いると、乾燥状態でも蛍光を発することから標識後の保存などの点で従来の色素よりも優れた性能を示す。また、真核細胞のみならず、細胞骨格用色素としても十分に用いることが可能である。この他、ミトコンドリア、ゴルジ体、小胞体、ソリゾーム、脂質二重膜などの標識に用いることが可能である。これら、標識された細胞等は、湿潤及び乾燥のあらゆる条件下で観測が可能であるため、汎用性が大きい。観測に際しては、蛍光顕微鏡などを用いることができる。
【0093】
また、臨床段階で人体より採取された組織は、ミクロトームなどの機器を用いて薄膜にスライスした後、染色されている。ここでは、Ｃｙ色素及びＡｌｅｘａ色素が用いられている。しかしながら、既存の色素は安定性が非常に悪く、再診断の際には、再びサンプルを作製する必要がある。また、作製されたサンプルは標本として保存することが不可能である。しかし、上記の従来の色素に比べ本発明の蛍光色素は、非常に安定な色素であるので、染色した組織を標本として保存することが可能である。
【0094】
なお、病理診断は、生体標本の形態観察のみならず、免疫組織染色法やｉｎ－ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ法により標的物質を可視化する解析方法によっても行われている。免疫組織染色法は、組織上の特定の抗原を、その抗原を特異的に認識する抗体によって検出する方法であり、特定の抗原を認識させる抗体を組織と反応させ、反応した抗体の有無から抗原の存在を判断するが、組織と反応させる抗体を蛍光色素で標識し、組織上の抗原の分布を解析する方法である。抗原に対する特異的抗体である一次抗体に蛍光色素を直接結合させて可視化する直接法と、一次抗体に対する抗体である二次抗体を用いて可視化する間接法が含まれる。また、ｉｎ－ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ法は、目標遺伝子とハイブリダイズするオルゴヌクレオチドプローブやＤＮＡプローブを用いて、組織又は細胞中に目標遺伝子が存在するか否かを判別する方法である。プローブにも蛍光色素を用いている。本発明の蛍光色素を、蛍光顕微鏡と電子顕微鏡の両方で観察できるプローブとして用いることで、より高精度のクレム観察が可能となる。そのプローブとしては、金コロイド標識二次抗体に本発明の蛍光色素を結合させたものを用いることができる。例えば、タンパク質（抗体）としてストレプトアビジンが標識された金ナノ粒子（例えば、金ナノゴールドという名称で市販されているもの）に、本発明の蛍光色素を結合させることができる。この二次抗体を間接蛍光抗体法に用いることで、より高精度のクレム観察が可能となる。また、本発明の蛍光色素を使用することでサンプル基盤作成の際のオスミウム処理を行っても蛍光が残るため、クレム観察などの際には有用である。
【0095】
また、ガンや感染症等の診断には、抗体の特異的認識能を利用したイムノアッセイが用いられている。イムノアッセイは、標識抗体を用いて目的の抗原を検出する方法であり、標識物質に酵素を用いる酵素イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ法）や標識物質に蛍光色素を用いる蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ法）等が用いられている。ＥＬＩＳＡ法は、最終的な検出は標識物質である酵素の反応によって生じるさまざまなシグナル（発色、発光、化学発光等）を検出及び定量することにより行う。一方、ＦＩＡ法は、標識物質である蛍光色素に励起光を照射し、それによる蛍光を検出及び定量することにより行う。ＦＩＡ法は蛍光色素を用いるため鮮明なコントラストを有し定量性に優れ、またＥＬＩＳＡ法に比べ、より短時間での検出が可能でかつ操作も簡便であるという特徴を有している。本発明の蛍光色素を用いることにより、より高感度の検出を行うことが可能となる。
【0096】
また、本発明の蛍光色素を化粧用組成物に用いることもできる。蛍光色素を含む化粧用組成物は、夜間や室内における演出用の化粧としてだけでなく、蛍光色素の明色化効果を利用して、ファンデーションや毛髪の染色剤等に用いられている。ここで、明色化効果とは、蛍光色素が紫外光を吸収して可視光を放出して、皮膚や毛髪に明るさや鮮やかさを与える効果をいう。日本の室内照明には、昼光色や白色の蛍光灯が使われているが、これらの蛍光灯からの光は、青や緑が主であり赤が少ない。そのため、女性の化粧肌は青白くくすんで見えるという問題がある。これに対し、本発明の蛍光色素を用いることにより、例えば、橙色の光を放出する蛍光色素を用い、鮮やかな赤味の色を発色させてくすみの解消を図ることが可能である。また、毛髪の染色に用いると、蛍光色素は可視領域の放出光線により毛髪の色を変えるだけでなく、毛髪の輝きを増加させることも可能である。
【0097】
また、本発明の蛍光色素をマーキング剤に用いることもできる。本発明の蛍光色素を含むマーキング剤は、通常の可視光下では不可視であるが、紫外線等の励起光を照射することにより蛍光色素を発光させて視認することができる。この性質を利用し、犯罪防止や犯罪捜査を目的として、物品や人体等の識別や物質の検出等に使用することができる。マーキング剤の対象物には、偽造や盗難等の犯罪の防止や犯罪捜査の対象となる物品や人体が含まれる。例えば、紙幣、小切手、株券、各種証明書等の重要文書や、自動車、オートバイ、自転車、美術品、家具、ブランド品、衣服等の物品、人体の皮膚、頭髪、爪等の身体表面部分、潜在指紋等の遺留物質等を挙げることができる。さらに、対象物を構成する材料に関しては、上質紙、ＯＣＲ紙、ノーカーボン紙、アート紙等の紙や、塩化ビニル、ポリエステル、ポリエチレンテレフタレート、ポリプロピレン等のプラスチックや、金属や、ガラスや、セラミックスや、羊毛、木綿、絹、麻等の天然繊維や、再生セルロース繊維、ポリビニルアルコール繊維、ポリアミド繊維、ポリエステル繊維等の合成繊維や、人体皮膚や体液中のタンパク質等を挙げることができる。
【実施例】
【0098】
以下、実施例を用いて本発明についてさらに詳細に説明する。
【0099】
（合成例１）
本合成例では、一般式（Ｉ）に包含される、以下のトリアゾロピリジン化合物１０を合成した。
本合成例では、一般式（Ｉ）に包含される、以下のトリアゾロピリジン化合物１０を合成した。
【0100】
【化22】
【0101】
ここで、Ｓｃｈｅｍｅ １中の置換基Ｚには、以下の置換基ａ，ｂ，ｃ，ｄ，ｅを用いた。以下、置換基を区別するため、化合物８は８ａ、８ｂ、８ｃ、８ｄ、８ｅで示し、化合物９は９ａ、９ｂ、９ｃ、９ｄ、９ｅで示し、化合物１０は１０ａ、１０ｂ、１０ｃ、１０ｄ、１０ｅで示す。
【0102】
【化23】
【0103】
化合物２の合成
１００ｍＬのナスフラスコに化合物１を１．５ｇ（４．２ｍｍｏｌ）入れ、エタノール７０．０ｍＬ中、８０℃に設定したオイルバスで撹拌した。水酸化カリウム０．５ｇ（８．４ｍｍｏｌ）を蒸留水２０．０ｍＬに溶かした溶液を作り、添加後、３時間反応を行った。ＴＬＣ（クロロホルム１００％）シートにて反応が終了したことを確認し、５００ｍＬのビーカーに反応溶液を移して、蒸留水を約３００ｍＬ加えて撹拌し、塩酸１０～１５ｍＬを加えｐＨ＝１の酸性にし、蒸留水を約１００ｍＬ加えて１晩撹拌した。吸引濾過で回収し、デシケーターで減圧乾燥して化合物２を得た。収量は１．３４ｇ、収率は９７％であった。
１００ｍＬのナスフラスコに化合物１を１．５ｇ（４．２ｍｍｏｌ）入れ、エタノール７０．０ｍＬ中、８０℃に設定したオイルバスで撹拌した。水酸化カリウム０．５ｇ（８．４ｍｍｏｌ）を蒸留水２０．０ｍＬに溶かした溶液を作り、添加後、３時間反応を行った。ＴＬＣ（クロロホルム１００％）シートにて反応が終了したことを確認し、５００ｍＬのビーカーに反応溶液を移して、蒸留水を約３００ｍＬ加えて撹拌し、塩酸１０～１５ｍＬを加えｐＨ＝１の酸性にし、蒸留水を約１００ｍＬ加えて１晩撹拌した。吸引濾過で回収し、デシケーターで減圧乾燥して化合物２を得た。収量は１．３４ｇ、収率は９７％であった。
【0104】
化合物３の合成
５００ｍＬのナスフラスコに化合物２を１．０ｇ（３．０ｍｍｏｌ）入れ、１５０℃に設定したＴＳＦ４５８－１００（シリコンオイル：ＭＯＭＥＮＴＩＹＥ ＬＯＴ．１５ＢＪＰＡ０６２）で加熱し、５分後に温度を２７０℃まで上げて１時間反応を行った。１時間後、室温になるまで冷まし、ＴＬＣ（クロロホルム１００％）シートにて反応が終了したことを確認し、シリカゲル（ＫＡＮＴＯ ６０Ｎ，クロロホルム）カラムクロマトグラフィーで分離精製し、単離した溶媒をエバポレーターで減圧留去した。エタノール溶媒約２００ｍＬで再結晶を行い、吸引濾過で回収し、デシケーターで減圧乾燥して化合物３を得た。収量は０．６５ｇ、収率は７５％であった。
５００ｍＬのナスフラスコに化合物２を１．０ｇ（３．０ｍｍｏｌ）入れ、１５０℃に設定したＴＳＦ４５８－１００（シリコンオイル：ＭＯＭＥＮＴＩＹＥ ＬＯＴ．１５ＢＪＰＡ０６２）で加熱し、５分後に温度を２７０℃まで上げて１時間反応を行った。１時間後、室温になるまで冷まし、ＴＬＣ（クロロホルム１００％）シートにて反応が終了したことを確認し、シリカゲル（ＫＡＮＴＯ ６０Ｎ，クロロホルム）カラムクロマトグラフィーで分離精製し、単離した溶媒をエバポレーターで減圧留去した。エタノール溶媒約２００ｍＬで再結晶を行い、吸引濾過で回収し、デシケーターで減圧乾燥して化合物３を得た。収量は０．６５ｇ、収率は７５％であった。
【0105】
化合物４の合成
１００ｍＬのナスフラスコに化合物３を０．６５ｇ（２．３ｍｍｏｌ）、水素化ホウ素ナトリウムを２．６ｇ（６９ｍｍｏｌ）入れ、エタノール７０．０ｍＬ中、８０℃に設定したオイルバスで３時間半、反応を行った。ＴＬＣ（クロロホルム：タノール=８：２）にて反応が終了したことを確認して反応溶液を室温まで冷却した。１０００ｍＬのビーカーに飽和重曹水を７００．０ｍＬ入れ、反応溶液を加え１晩撹拌した。生成物を吸引濾過で回収した後、デシケーターで減圧乾燥して化合物４を得た。収量は０．５４ｇ、収率は８７％であった。
１００ｍＬのナスフラスコに化合物３を０．６５ｇ（２．３ｍｍｏｌ）、水素化ホウ素ナトリウムを２．６ｇ（６９ｍｍｏｌ）入れ、エタノール７０．０ｍＬ中、８０℃に設定したオイルバスで３時間半、反応を行った。ＴＬＣ（クロロホルム：タノール=８：２）にて反応が終了したことを確認して反応溶液を室温まで冷却した。１０００ｍＬのビーカーに飽和重曹水を７００．０ｍＬ入れ、反応溶液を加え１晩撹拌した。生成物を吸引濾過で回収した後、デシケーターで減圧乾燥して化合物４を得た。収量は０．５４ｇ、収率は８７％であった。
【0106】
化合物５の合成
２００ｍＬのナスフラスコに化合物４を０．５４ｇ（２．０ｍｍｏｌ）、塩酸を３０．０ｍＬ、蒸留水を５０．０ｍＬ入れ、常温で撹拌を行い溶解させた。溶解後、亜硝酸ナトリウム０．６２ｇ（９．０ｍｍｏｌ）を蒸留水５０．０ｍＬに溶かした溶液を作り、滴下ロートでゆっくり滴下し、滴下後５分間反応を行った。ＴＬＣ（クロロホルム：エタノール＝９：１）シートにて反応が終了したことを確認し、１０００ｍＬ三角フラスコに反応溶液を移して、蒸留水を約２００．０ｍＬ加えて撹拌し、炭酸水素ナトリウムを少しずつ加えｐＨ＝７～８の中性にして、蒸留水を約６００．０ｍＬ加え１晩撹拌した。吸引濾過で回収し、デシケーターで減圧乾燥して化合物５を得た。収量は０．５５ｇ、収率は９８％であった。
２００ｍＬのナスフラスコに化合物４を０．５４ｇ（２．０ｍｍｏｌ）、塩酸を３０．０ｍＬ、蒸留水を５０．０ｍＬ入れ、常温で撹拌を行い溶解させた。溶解後、亜硝酸ナトリウム０．６２ｇ（９．０ｍｍｏｌ）を蒸留水５０．０ｍＬに溶かした溶液を作り、滴下ロートでゆっくり滴下し、滴下後５分間反応を行った。ＴＬＣ（クロロホルム：エタノール＝９：１）シートにて反応が終了したことを確認し、１０００ｍＬ三角フラスコに反応溶液を移して、蒸留水を約２００．０ｍＬ加えて撹拌し、炭酸水素ナトリウムを少しずつ加えｐＨ＝７～８の中性にして、蒸留水を約６００．０ｍＬ加え１晩撹拌した。吸引濾過で回収し、デシケーターで減圧乾燥して化合物５を得た。収量は０．５５ｇ、収率は９８％であった。
【0107】
化合物６の合成
５０ｍＬの三つ口フラスコに化合物５を４．０ｇ（１４．０ｍｍｏｌ）入れ、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド３５ｍＬ中、常温で撹拌した。トリエチルアミン２．９ｍＬ（２１．０ｍｍｏｌ）添加後、１時間撹拌した。５－ブロモ吉草酸エチル（ＮＢＳ）２．２ｍＬ（１４．０ｍｍｏｌ）とＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド５．０ｍＬの混合液を滴下ロートでゆっくり滴下し、滴下後２日間反応を行った。その際、酸素を取り除くためにアルゴン充填し、脱気を行った。ＴＬＣ（クロロホルム：酢酸エチル＝９：１）シートにて反応が終了したことを確認し、エバポレーターでＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミドを減圧留去した。分液ロートにて蒸留水を約２００ｍＬ、塩酸１０～１５ｍＬ加えてクロロホルムで抽出を３回、飽和重曹水を約２００ｍＬ加えてクロロホルムで抽出を２回、蒸留水を約１５０ｍＬ加えてクロロホルムで抽出を２回行った。硫酸マグネシウムを加え、桐山漏斗を用いて吸引濾過し、エバポレーターで減圧留去した。シリカゲル（ｗａｋｏｇｅｌ ｃ３００）カラムクロマトグラフィー（クロロホルム：ヘキサン＝８：２）で分離精製し、単離した溶媒をエバポレーターで減圧留去した。デシケーターで減圧乾燥して化合物６を得た。収量は４．８ｇ、収率は８４％であった。
５０ｍＬの三つ口フラスコに化合物５を４．０ｇ（１４．０ｍｍｏｌ）入れ、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド３５ｍＬ中、常温で撹拌した。トリエチルアミン２．９ｍＬ（２１．０ｍｍｏｌ）添加後、１時間撹拌した。５－ブロモ吉草酸エチル（ＮＢＳ）２．２ｍＬ（１４．０ｍｍｏｌ）とＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド５．０ｍＬの混合液を滴下ロートでゆっくり滴下し、滴下後２日間反応を行った。その際、酸素を取り除くためにアルゴン充填し、脱気を行った。ＴＬＣ（クロロホルム：酢酸エチル＝９：１）シートにて反応が終了したことを確認し、エバポレーターでＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミドを減圧留去した。分液ロートにて蒸留水を約２００ｍＬ、塩酸１０～１５ｍＬ加えてクロロホルムで抽出を３回、飽和重曹水を約２００ｍＬ加えてクロロホルムで抽出を２回、蒸留水を約１５０ｍＬ加えてクロロホルムで抽出を２回行った。硫酸マグネシウムを加え、桐山漏斗を用いて吸引濾過し、エバポレーターで減圧留去した。シリカゲル（ｗａｋｏｇｅｌ ｃ３００）カラムクロマトグラフィー（クロロホルム：ヘキサン＝８：２）で分離精製し、単離した溶媒をエバポレーターで減圧留去した。デシケーターで減圧乾燥して化合物６を得た。収量は４．８ｇ、収率は８４％であった。
【0108】
化合物７の合成
２００ｍＬの三つ口フラスコに化合物６を３．１ｇ（７．５ｍｍｏｌ）入れ、クロロホルム１００ｍＬ中、常温で撹拌した。これにＮＢＳ ２．６６ｇ（１５ｍｍｏｌ）を添加後、１８時間反応を行った。ＴＬＣ（クロロホルム：ヘキサン＝７：３）シートにて反応が進行したことを確認した後、原料若しくはモノ体が多い場合は臭化水素水（４７％）を１０滴程加えて３０分～２時間程反応させた。ＴＬＣにて反応が進行したことを確認した後、反応溶液を分液ロートに入れて重曹水、水の順に洗浄を行った。これに硫酸マグネシウムを加えて桐山漏斗を用いて吸引濾過し、エバポレーターで減圧留去を行った。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｗａｋｏ Ｃ３００，クロロホルム：ヘキサン＝７：３）で精製して、主留をエバポレーターで減圧留去し、デシケーターで減圧乾燥して化合物７を得た。収量は２．７３ｇ、収率は６３％であった。
２００ｍＬの三つ口フラスコに化合物６を３．１ｇ（７．５ｍｍｏｌ）入れ、クロロホルム１００ｍＬ中、常温で撹拌した。これにＮＢＳ ２．６６ｇ（１５ｍｍｏｌ）を添加後、１８時間反応を行った。ＴＬＣ（クロロホルム：ヘキサン＝７：３）シートにて反応が進行したことを確認した後、原料若しくはモノ体が多い場合は臭化水素水（４７％）を１０滴程加えて３０分～２時間程反応させた。ＴＬＣにて反応が進行したことを確認した後、反応溶液を分液ロートに入れて重曹水、水の順に洗浄を行った。これに硫酸マグネシウムを加えて桐山漏斗を用いて吸引濾過し、エバポレーターで減圧留去を行った。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｗａｋｏ Ｃ３００，クロロホルム：ヘキサン＝７：３）で精製して、主留をエバポレーターで減圧留去し、デシケーターで減圧乾燥して化合物７を得た。収量は２．７３ｇ、収率は６３％であった。
【0109】
化合物８ａの合成
１００ｍＬのナスフラスコに化合物７を０．５ｇ（０．８７６ｍｍｏｌ）、フェニルボロン酸０．３２ｇ（２．６２ｍｍｏｌ）を入れてトルエン４０ｍＬ、エタノール２０ｍＬの混合溶媒中で９０℃に設定したオイルバスで撹拌した。これに、テトラキストリフェニルホスフィンパラジウム０．１ｇ（０．０８７６ｍｍｏｌ）、２Ｍ炭酸ナトリウム水溶液５ｍＬを添加後、アルゴン雰囲気下で４時間反応させた。ＴＬＣ（クロロホルム）にて反応が終了したことを確認して、分液ロートに反応溶液を移し、蒸留水とクロロホルムを適量加えて抽出した。有機層を蒸留水で２回程洗浄後、硫酸マグネシウムで乾燥、桐山ロートで吸引濾過し、エバポレーターで減圧留去した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｗａｋｏ Ｃ３００，クロロホルム）で精製して主留をエバポレーターで減圧留去し、デシケーターで減圧乾燥して化合物８ａを得た。収量は０．４４８ｇ、収率は９０％であった。
１００ｍＬのナスフラスコに化合物７を０．５ｇ（０．８７６ｍｍｏｌ）、フェニルボロン酸０．３２ｇ（２．６２ｍｍｏｌ）を入れてトルエン４０ｍＬ、エタノール２０ｍＬの混合溶媒中で９０℃に設定したオイルバスで撹拌した。これに、テトラキストリフェニルホスフィンパラジウム０．１ｇ（０．０８７６ｍｍｏｌ）、２Ｍ炭酸ナトリウム水溶液５ｍＬを添加後、アルゴン雰囲気下で４時間反応させた。ＴＬＣ（クロロホルム）にて反応が終了したことを確認して、分液ロートに反応溶液を移し、蒸留水とクロロホルムを適量加えて抽出した。有機層を蒸留水で２回程洗浄後、硫酸マグネシウムで乾燥、桐山ロートで吸引濾過し、エバポレーターで減圧留去した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｗａｋｏ Ｃ３００，クロロホルム）で精製して主留をエバポレーターで減圧留去し、デシケーターで減圧乾燥して化合物８ａを得た。収量は０．４４８ｇ、収率は９０％であった。
【0110】
化合物８ｂの合成
１００ｍＬのナスフラスコに化合物７を０．３ｇ（０．５２６ｍｍｏｌ）、４－メトキシフェニルボロン酸０．２３ｇ（１．５７ｍｍｏｌ）を入れてトルエン３０ｍＬ、エタノール１５ｍＬの混合溶媒中で９０℃に設定したオイルバスで撹拌した。これに、テトラキストリフェニルホスフィンパラジウム０．０６ｇ（０．０５２６ｍｍｏｌ）、２Ｍ炭酸ナトリウム水溶液３ｍＬを添加後、アルゴン雰囲気下で４時間反応させた。ＴＬＣ（クロロホルム）にて反応が終了したことを確認して、分液ロートに反応溶液を移し、蒸留水とクロロホルムを適量加えて抽出した。有機層を蒸留水で２回程洗浄後、硫酸マグネシウムで乾燥、桐山ロートで吸引濾過し、エバポレーターで減圧留去した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｗａｋｏ Ｃ３００，クロロホルム）で精製して主留をエバポレーターで減圧留去し、デシケーターで減圧乾燥して化合物８ｂを得た。収量は０．２４３ｇ、収率は７３％であった。
１００ｍＬのナスフラスコに化合物７を０．３ｇ（０．５２６ｍｍｏｌ）、４－メトキシフェニルボロン酸０．２３ｇ（１．５７ｍｍｏｌ）を入れてトルエン３０ｍＬ、エタノール１５ｍＬの混合溶媒中で９０℃に設定したオイルバスで撹拌した。これに、テトラキストリフェニルホスフィンパラジウム０．０６ｇ（０．０５２６ｍｍｏｌ）、２Ｍ炭酸ナトリウム水溶液３ｍＬを添加後、アルゴン雰囲気下で４時間反応させた。ＴＬＣ（クロロホルム）にて反応が終了したことを確認して、分液ロートに反応溶液を移し、蒸留水とクロロホルムを適量加えて抽出した。有機層を蒸留水で２回程洗浄後、硫酸マグネシウムで乾燥、桐山ロートで吸引濾過し、エバポレーターで減圧留去した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｗａｋｏ Ｃ３００，クロロホルム）で精製して主留をエバポレーターで減圧留去し、デシケーターで減圧乾燥して化合物８ｂを得た。収量は０．２４３ｇ、収率は７３％であった。
【0111】
化合物８ｃの合成
１００ｍＬのナスフラスコに化合物７を０．３ｇ（０．５２６ｍｍｏｌ）、２，４－ジメトキシフェニルボロン酸０．２３ｇ（１．５７ｍｍｏｌ）を入れてトルエン３０ｍＬ、エタノール１５ｍＬの混合溶媒中で９０℃に設定したオイルバスで撹拌した。これに、テトラキストリフェニルホスフィンパラジウム０．０６ｇ（０．０５２６ｍｍｏｌ）、２Ｍ炭酸ナトリウム水溶液３ｍＬを添加後、アルゴン雰囲気下で４時間反応させた。ＴＬＣ（クロロホルム）にて反応が終了したことを確認して、分液ロートに反応溶液を移し、蒸留水とクロロホルムを適量加えて抽出した。有機層を蒸留水で２回程洗浄後、硫酸マグネシウムで乾燥、桐山ロートで吸引濾過し、エバポレーターで減圧留去した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｗａｋｏ Ｃ３００，クロロホルム：アセトニトリル＝９．５：０．５）で精製して主留をエバポレーターで減圧留去し、デシケーターで減圧乾燥して化合物８ｃを得た。収量は０．２２６ｇ、収率は６２％であった。
１００ｍＬのナスフラスコに化合物７を０．３ｇ（０．５２６ｍｍｏｌ）、２，４－ジメトキシフェニルボロン酸０．２３ｇ（１．５７ｍｍｏｌ）を入れてトルエン３０ｍＬ、エタノール１５ｍＬの混合溶媒中で９０℃に設定したオイルバスで撹拌した。これに、テトラキストリフェニルホスフィンパラジウム０．０６ｇ（０．０５２６ｍｍｏｌ）、２Ｍ炭酸ナトリウム水溶液３ｍＬを添加後、アルゴン雰囲気下で４時間反応させた。ＴＬＣ（クロロホルム）にて反応が終了したことを確認して、分液ロートに反応溶液を移し、蒸留水とクロロホルムを適量加えて抽出した。有機層を蒸留水で２回程洗浄後、硫酸マグネシウムで乾燥、桐山ロートで吸引濾過し、エバポレーターで減圧留去した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｗａｋｏ Ｃ３００，クロロホルム：アセトニトリル＝９．５：０．５）で精製して主留をエバポレーターで減圧留去し、デシケーターで減圧乾燥して化合物８ｃを得た。収量は０．２２６ｇ、収率は６２％であった。
【0112】
化合物８ｄの合成
１００ｍＬのナスフラスコに化合物７を０．５ｇ（０．８７６ｍｍｏｌ）、４－ジフェニルアミノフェニルボロン酸０．７５ｇ（２．６２ｍｍｏｌ）を入れてトルエン４０ｍＬ、エタノール２０ｍＬの混合溶媒中で９０℃に設定したオイルバスで撹拌した。これに、テトラキストリフェニルホスフィンパラジウム０．１ｇ（０．０８７６ｍｍｏｌ）、２Ｍ炭酸ナトリウム水溶液５ｍＬを添加後、アルゴン雰囲気下で４時間反応させた。ＴＬＣ（クロロホルム）にて反応が終了したことを確認して、分液ロートに反応溶液を移し、蒸留水とクロロホルムを適量加えて抽出した。有機層を蒸留水で2回程洗浄後、硫酸マグネシウムで乾燥し、桐山ロートで吸引濾過し、エバポレーターで減圧留去した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｗａｋｏ Ｃ３００，クロロホルム：アセトニトリル＝９．５：０．５）で精製して主留をエバポレーターで減圧留去し、デシケーターで減圧乾燥して化合物８ｄを得た。収量は０．４２ｇ、収率は５３％であった。
１００ｍＬのナスフラスコに化合物７を０．５ｇ（０．８７６ｍｍｏｌ）、４－ジフェニルアミノフェニルボロン酸０．７５ｇ（２．６２ｍｍｏｌ）を入れてトルエン４０ｍＬ、エタノール２０ｍＬの混合溶媒中で９０℃に設定したオイルバスで撹拌した。これに、テトラキストリフェニルホスフィンパラジウム０．１ｇ（０．０８７６ｍｍｏｌ）、２Ｍ炭酸ナトリウム水溶液５ｍＬを添加後、アルゴン雰囲気下で４時間反応させた。ＴＬＣ（クロロホルム）にて反応が終了したことを確認して、分液ロートに反応溶液を移し、蒸留水とクロロホルムを適量加えて抽出した。有機層を蒸留水で2回程洗浄後、硫酸マグネシウムで乾燥し、桐山ロートで吸引濾過し、エバポレーターで減圧留去した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｗａｋｏ Ｃ３００，クロロホルム：アセトニトリル＝９．５：０．５）で精製して主留をエバポレーターで減圧留去し、デシケーターで減圧乾燥して化合物８ｄを得た。収量は０．４２ｇ、収率は５３％であった。
【0113】
化合物８ｅの合成
１００ｍＬのナスフラスコに化合物７を０．５ｇ（０．８７６ｍｍｏｌ）、４－ジメチルアミノフェニルボロン酸０．４３ｇ（２．６２ｍｍｏｌ）を入れてトルエン４０ｍＬ、エタノール２０ｍＬの混合溶媒中で９０℃に設定したオイルバスで撹拌した。これに、テトラキストリフェニルホスフィンパラジウム０．１ｇ（０．０８７６ｍｍｏｌ）、２Ｍ炭酸ナトリウム水溶液５ｍＬを添加後、アルゴン雰囲気下で４時間反応させた。ＴＬＣ（クロロホルム）にて反応が終了したことを確認して、分液ロートに反応溶液を移し、蒸留水とクロロホルムを適量加えて抽出した。有機層を蒸留水で２回程洗浄後、硫酸マグネシウムで乾燥し、桐山ロートで吸引濾過し、エバポレーターで減圧留去した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｗａｋｏ Ｃ３００，クロロホルム：アセトニトリル＝９．５：０．５）で精製して主留をエバポレーターで減圧留去し、デシケーターで減圧乾燥して化合物８ｅを得た。収量は０．４６ｇ、収率は８０％であった。
１００ｍＬのナスフラスコに化合物７を０．５ｇ（０．８７６ｍｍｏｌ）、４－ジメチルアミノフェニルボロン酸０．４３ｇ（２．６２ｍｍｏｌ）を入れてトルエン４０ｍＬ、エタノール２０ｍＬの混合溶媒中で９０℃に設定したオイルバスで撹拌した。これに、テトラキストリフェニルホスフィンパラジウム０．１ｇ（０．０８７６ｍｍｏｌ）、２Ｍ炭酸ナトリウム水溶液５ｍＬを添加後、アルゴン雰囲気下で４時間反応させた。ＴＬＣ（クロロホルム）にて反応が終了したことを確認して、分液ロートに反応溶液を移し、蒸留水とクロロホルムを適量加えて抽出した。有機層を蒸留水で２回程洗浄後、硫酸マグネシウムで乾燥し、桐山ロートで吸引濾過し、エバポレーターで減圧留去した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｗａｋｏ Ｃ３００，クロロホルム：アセトニトリル＝９．５：０．５）で精製して主留をエバポレーターで減圧留去し、デシケーターで減圧乾燥して化合物８ｅを得た。収量は０．４６ｇ、収率は８０％であった。
【0114】
化合物９ａの合成
１００ｍＬのナスフラスコに化合物８ａを０．４４ｇ（０．７７９ｍｍｏｌ）、１，４－ジオキサン４０ｍＬを入れ９０℃に設定したオイルバスで撹拌した。水酸化カリウム０．１ｇ（１．９４ｍｍｏｌ）を蒸留水１３ｍＬに溶かした溶液を添加後、４時間反応を行った。ＴＬＣ（クロロホルム）にて反応が終了したことを確認した。蒸留水約３００ｍＬが入った５００ｍＬの三角フラスコに反応溶液を加えて室温で撹拌した。これにｐＨ＝１になるまで塩酸を加えて１時間ほど撹拌した後、吸引濾過で回収し、デシケーターで減圧乾燥して化合物９ａを得た。収量は０．４ｇ、収率は９５％であった。
１００ｍＬのナスフラスコに化合物８ａを０．４４ｇ（０．７７９ｍｍｏｌ）、１，４－ジオキサン４０ｍＬを入れ９０℃に設定したオイルバスで撹拌した。水酸化カリウム０．１ｇ（１．９４ｍｍｏｌ）を蒸留水１３ｍＬに溶かした溶液を添加後、４時間反応を行った。ＴＬＣ（クロロホルム）にて反応が終了したことを確認した。蒸留水約３００ｍＬが入った５００ｍＬの三角フラスコに反応溶液を加えて室温で撹拌した。これにｐＨ＝１になるまで塩酸を加えて１時間ほど撹拌した後、吸引濾過で回収し、デシケーターで減圧乾燥して化合物９ａを得た。収量は０．４ｇ、収率は９５％であった。
【0115】
化合物９ｂの合成
１００ｍＬのナスフラスコに化合物８ｂを０．２２ｇ（０．３５２ｍｍｏｌ）、１，４－ジオキサン４０ｍＬを入れ９０℃に設定したオイルバスで撹拌した。水酸化カリウム０．０４９ｇ（０．８８ｍｍｏｌ）を蒸留水１０ｍＬに溶かした溶液を添加後、４時間反応を行った。ＴＬＣ（クロロホルム）にて反応が終了したことを確認した。蒸留水約３００ｍＬが入った５００ｍＬの三角フラスコに反応溶液を加えて室温で撹拌した。これにｐＨ＝１になるまで塩酸を加えて１時間ほど撹拌した後、吸引濾過で回収し、デシケーターで減圧乾燥して化合物９ｂを得た。収量は０．１９ｇ、収率は９０％であった。
１００ｍＬのナスフラスコに化合物８ｂを０．２２ｇ（０．３５２ｍｍｏｌ）、１，４－ジオキサン４０ｍＬを入れ９０℃に設定したオイルバスで撹拌した。水酸化カリウム０．０４９ｇ（０．８８ｍｍｏｌ）を蒸留水１０ｍＬに溶かした溶液を添加後、４時間反応を行った。ＴＬＣ（クロロホルム）にて反応が終了したことを確認した。蒸留水約３００ｍＬが入った５００ｍＬの三角フラスコに反応溶液を加えて室温で撹拌した。これにｐＨ＝１になるまで塩酸を加えて１時間ほど撹拌した後、吸引濾過で回収し、デシケーターで減圧乾燥して化合物９ｂを得た。収量は０．１９ｇ、収率は９０％であった。
【0116】
化合物９ｃの合成
１００ｍＬのナスフラスコに化合物８ｃを０．２ｇ（０．３０４ｍｍｏｌ）、１，４－ジオキサン３０ｍＬを入れ９０℃に設定したオイルバスで撹拌した。水酸化カリウム０．０４２ｇ（０．７６ｍｍｏｌ）を蒸留水１０ｍＬに溶かした溶液を添加後、４時間反応を行った。ＴＬＣ（クロロホルム）にて反応が終了したことを確認した。蒸留水約３００ｍＬが入った５００ｍＬの三角フラスコに反応溶液を加えて室温で撹拌した。これにｐＨ＝１になるまで塩酸を加えて１時間ほど撹拌した後、吸引濾過で回収し、デシケーターで減圧乾燥して化合物９ｃを得た。収量は０．１２ｇ、収率は６３％であった。
１００ｍＬのナスフラスコに化合物８ｃを０．２ｇ（０．３０４ｍｍｏｌ）、１，４－ジオキサン３０ｍＬを入れ９０℃に設定したオイルバスで撹拌した。水酸化カリウム０．０４２ｇ（０．７６ｍｍｏｌ）を蒸留水１０ｍＬに溶かした溶液を添加後、４時間反応を行った。ＴＬＣ（クロロホルム）にて反応が終了したことを確認した。蒸留水約３００ｍＬが入った５００ｍＬの三角フラスコに反応溶液を加えて室温で撹拌した。これにｐＨ＝１になるまで塩酸を加えて１時間ほど撹拌した後、吸引濾過で回収し、デシケーターで減圧乾燥して化合物９ｃを得た。収量は０．１２ｇ、収率は６３％であった。
【0117】
化合物９ｄの合成
１００ｍＬのナスフラスコに化合物８ｄを０．４２ｇ（０．４６７ｍｍｏｌ）、１，４－ジオキサン４０ｍＬを入れ１００℃に設定したオイルバスで撹拌した。水酸化カリウム０．０６５ｇ（１．１６ｍｍｏｌ）を蒸留水１３ｍＬに溶かした溶液を添加後、４時間反応を行った。ＴＬＣ（クロロホルム）にて反応が終了したことを確認した。蒸留水約３００ｍＬが入った５００ｍＬの三角フラスコに反応溶液を加えて室温で撹拌した。これにｐＨ＝１になるまで塩酸を加えて１時間ほど撹拌した後、吸引濾過で回収し、デシケーターで減圧乾燥して化合物９ｄを得た。収量は０．３９ｇ、収率は９５％であった。
１００ｍＬのナスフラスコに化合物８ｄを０．４２ｇ（０．４６７ｍｍｏｌ）、１，４－ジオキサン４０ｍＬを入れ１００℃に設定したオイルバスで撹拌した。水酸化カリウム０．０６５ｇ（１．１６ｍｍｏｌ）を蒸留水１３ｍＬに溶かした溶液を添加後、４時間反応を行った。ＴＬＣ（クロロホルム）にて反応が終了したことを確認した。蒸留水約３００ｍＬが入った５００ｍＬの三角フラスコに反応溶液を加えて室温で撹拌した。これにｐＨ＝１になるまで塩酸を加えて１時間ほど撹拌した後、吸引濾過で回収し、デシケーターで減圧乾燥して化合物９ｄを得た。収量は０．３９ｇ、収率は９５％であった。
【0118】
化合物９ｅの合成
１００ｍＬのナスフラスコに化合物８ｅを０．４６ｇ（０．７０６ｍｍｏｌ）、１，４－ジオキサン４０ｍＬを入れ１００℃に設定したオイルバスで撹拌した。水酸化カリウム０．０９８ｇ（１．７６ｍｍｏｌ）を蒸留水１３ｍＬに溶かした溶液を添加後、４時間反応を行った。ＴＬＣ（クロロホルム）にて反応が終了したことを確認した。蒸留水約３００ｍＬが入った５００ｍＬの三角フラスコに反応溶液を加えて室温で撹拌した。これにｐＨ＝１になるまで塩酸を加えて１時間ほど撹拌した後、吸引濾過で回収し、デシケーターで減圧乾燥して化合物９ｅを得た。収量は０．４２ｇ、収率は９５％であった。
１００ｍＬのナスフラスコに化合物８ｅを０．４６ｇ（０．７０６ｍｍｏｌ）、１，４－ジオキサン４０ｍＬを入れ１００℃に設定したオイルバスで撹拌した。水酸化カリウム０．０９８ｇ（１．７６ｍｍｏｌ）を蒸留水１３ｍＬに溶かした溶液を添加後、４時間反応を行った。ＴＬＣ（クロロホルム）にて反応が終了したことを確認した。蒸留水約３００ｍＬが入った５００ｍＬの三角フラスコに反応溶液を加えて室温で撹拌した。これにｐＨ＝１になるまで塩酸を加えて１時間ほど撹拌した後、吸引濾過で回収し、デシケーターで減圧乾燥して化合物９ｅを得た。収量は０．４２ｇ、収率は９５％であった。
【0119】
化合物１０ａの合成
１００ｍＬのナスフラスコに化合物９ａを０．４ｇ（０．７４５ｍｍｏｌ）、Ｎ－ヒドロキシコハク酸イミド０．１２７ｇ（１．１１ｍｍｏｌ）、テトラヒドロフラン４０ｍＬを入れて常温で撹拌した。水溶性カルボジイミド（ＷＳＣ）０．２１２ｇ（１．１１ｍｍｏｌ）とクロロホルム２０ｍＬの混合溶液をゆっくり滴下して、滴下後４時間反応を行った。ＴＬＣ（クロロホルム）にて反応が進行したことを確認して、分液ロートに反応溶液と蒸留水を約２００．０ｍＬ加えてクロロホルムで抽出を行った。クロロホルム層を蒸留水で３回洗浄した後、硫酸マグネシウムで乾燥させて桐山漏斗を用いて吸引濾過し、エバポレーターで減圧留去した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｗａｋｏ Ｃ３００，クロロホルム）で精製して、主留をエバポレーターで減圧留去した後、デシケーターで減圧乾燥して化合物１０ａを得た。収量は０．３７ｇ、収率は７６％であった。
１００ｍＬのナスフラスコに化合物９ａを０．４ｇ（０．７４５ｍｍｏｌ）、Ｎ－ヒドロキシコハク酸イミド０．１２７ｇ（１．１１ｍｍｏｌ）、テトラヒドロフラン４０ｍＬを入れて常温で撹拌した。水溶性カルボジイミド（ＷＳＣ）０．２１２ｇ（１．１１ｍｍｏｌ）とクロロホルム２０ｍＬの混合溶液をゆっくり滴下して、滴下後４時間反応を行った。ＴＬＣ（クロロホルム）にて反応が進行したことを確認して、分液ロートに反応溶液と蒸留水を約２００．０ｍＬ加えてクロロホルムで抽出を行った。クロロホルム層を蒸留水で３回洗浄した後、硫酸マグネシウムで乾燥させて桐山漏斗を用いて吸引濾過し、エバポレーターで減圧留去した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｗａｋｏ Ｃ３００，クロロホルム）で精製して、主留をエバポレーターで減圧留去した後、デシケーターで減圧乾燥して化合物１０ａを得た。収量は０．３７ｇ、収率は７６％であった。
【0120】
化合物１０ｂの合成
１００ｍＬのナスフラスコに化合物９ｂを０．１９ｇ（０．３１８ｍｍｏｌ）、Ｎ－ヒドロキシコハク酸イミド０．０５４ｇ（０．４７７ｍｍｏｌ）、テトラヒドロフラン４０ｍＬを入れて常温で撹拌した。ＷＳＣ ０．０９１ｇ（０．４７７ｍｍｏｌ）とクロロホルム２０ｍＬの混合溶液をゆっくり滴下して、滴下後４時間反応を行った。ＴＬＣ（クロロホルム）にて反応が進行したことを確認して、分液ロートに反応溶液と蒸留水を約２００．０ｍＬ加えてクロロホルムで抽出を行った。クロロホルム層を蒸留水で３回洗浄した後、硫酸マグネシウムで乾燥させて桐山漏斗を用いて吸引濾過し、エバポレーターで減圧留去した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｗａｋｏ Ｃ３００，クロロホルム）で精製して、主留をエバポレーターで減圧留去した後、デシケーターで減圧乾燥した。これを少量のクロロホルムを加えてヘキサン中で撹拌しながら再沈殿を行った。桐山ロートで吸引濾過後、デシケーターで減圧乾燥して化合物１０ｂを得た。収量は０．１６ｇ、収率は７２％であった。
１００ｍＬのナスフラスコに化合物９ｂを０．１９ｇ（０．３１８ｍｍｏｌ）、Ｎ－ヒドロキシコハク酸イミド０．０５４ｇ（０．４７７ｍｍｏｌ）、テトラヒドロフラン４０ｍＬを入れて常温で撹拌した。ＷＳＣ ０．０９１ｇ（０．４７７ｍｍｏｌ）とクロロホルム２０ｍＬの混合溶液をゆっくり滴下して、滴下後４時間反応を行った。ＴＬＣ（クロロホルム）にて反応が進行したことを確認して、分液ロートに反応溶液と蒸留水を約２００．０ｍＬ加えてクロロホルムで抽出を行った。クロロホルム層を蒸留水で３回洗浄した後、硫酸マグネシウムで乾燥させて桐山漏斗を用いて吸引濾過し、エバポレーターで減圧留去した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｗａｋｏ Ｃ３００，クロロホルム）で精製して、主留をエバポレーターで減圧留去した後、デシケーターで減圧乾燥した。これを少量のクロロホルムを加えてヘキサン中で撹拌しながら再沈殿を行った。桐山ロートで吸引濾過後、デシケーターで減圧乾燥して化合物１０ｂを得た。収量は０．１６ｇ、収率は７２％であった。
【0121】
化合物１０ｃの合成
１００ｍＬのナスフラスコに化合物９ｃを０．１２ｇ（０．１８２ｍｍｏｌ）、Ｎ－ヒドロキシコハク酸イミド０．０３１ｇ（０．２７３ｍｍｏｌ）、テトラヒドロフラン２５ｍＬを入れて常温で撹拌した。ＷＳＣ ０．０５２ｇ（０．２７３ｍｍｏｌ）とクロロホルム１０ｍＬの混合溶液をゆっくり滴下して、滴下後４時間反応を行った。ＴＬＣ（クロロホルム）にて反応が進行したことを確認して、分液ロートに反応溶液と蒸留水を約２００．０ｍＬ加えてクロロホルムで抽出を行った。クロロホルム層を蒸留水で３回洗浄した後、硫酸マグネシウムで乾燥させて桐山漏斗を用いて吸引濾過し、エバポレーターで減圧留去した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｗａｋｏ Ｃ３００，クロロホルム：アセトニトリル＝９．５：０．５）で精製して、主留をエバポレーターで減圧留去した後、デシケーターで減圧乾燥した。これを少量のクロロホルムを加えてヘキサン中で撹拌しながら再沈殿を行った。桐山ロートで吸引濾過後、デシケーターで減圧乾燥して化合物１０ｃを得た。収量は０．０３７ｇ、収率は２６％であった。
１００ｍＬのナスフラスコに化合物９ｃを０．１２ｇ（０．１８２ｍｍｏｌ）、Ｎ－ヒドロキシコハク酸イミド０．０３１ｇ（０．２７３ｍｍｏｌ）、テトラヒドロフラン２５ｍＬを入れて常温で撹拌した。ＷＳＣ ０．０５２ｇ（０．２７３ｍｍｏｌ）とクロロホルム１０ｍＬの混合溶液をゆっくり滴下して、滴下後４時間反応を行った。ＴＬＣ（クロロホルム）にて反応が進行したことを確認して、分液ロートに反応溶液と蒸留水を約２００．０ｍＬ加えてクロロホルムで抽出を行った。クロロホルム層を蒸留水で３回洗浄した後、硫酸マグネシウムで乾燥させて桐山漏斗を用いて吸引濾過し、エバポレーターで減圧留去した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｗａｋｏ Ｃ３００，クロロホルム：アセトニトリル＝９．５：０．５）で精製して、主留をエバポレーターで減圧留去した後、デシケーターで減圧乾燥した。これを少量のクロロホルムを加えてヘキサン中で撹拌しながら再沈殿を行った。桐山ロートで吸引濾過後、デシケーターで減圧乾燥して化合物１０ｃを得た。収量は０．０３７ｇ、収率は２６％であった。
【0122】
化合物１０ｄの合成
１００ｍＬのナスフラスコに化合物９ｄを０．５ｇ（０．５７３ｍｍｏｌ）、Ｎ－ヒドロキシコハク酸イミド０．０９８ｇ（０．８５９ｍｍｏｌ）、テトラヒドロフラン５０ｍＬを入れて常温で撹拌した。ＷＳＣ ０．１６４ｇ（０．８５９ｍｍｏｌ）とクロロホルム３０ｍＬの混合溶液をゆっくり滴下して、滴下後４時間反応を行った。ＴＬＣ（クロロホルム）にて反応が進行したことを確認して、分液ロートに反応溶液と蒸留水を約２００．０ｍＬ加えてクロロホルムで抽出を行った。クロロホルム層を蒸留水で３回洗浄した後、硫酸マグネシウムで乾燥させて桐山漏斗を用いて吸引濾過し、エバポレーターで減圧留去した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｗａｋｏ Ｃ３００，クロロホルム）で精製して、主留をエバポレーターで減圧留去した後、デシケーターで減圧乾燥した。これを少量のクロロホルムを加えてヘキサン中で撹拌しながら再沈殿を行った。桐山ロートで吸引濾過後、デシケーターで減圧乾燥して化合物１０ｄを得た。収量は０．４９ｇ、収率は８８％であった。
１００ｍＬのナスフラスコに化合物９ｄを０．５ｇ（０．５７３ｍｍｏｌ）、Ｎ－ヒドロキシコハク酸イミド０．０９８ｇ（０．８５９ｍｍｏｌ）、テトラヒドロフラン５０ｍＬを入れて常温で撹拌した。ＷＳＣ ０．１６４ｇ（０．８５９ｍｍｏｌ）とクロロホルム３０ｍＬの混合溶液をゆっくり滴下して、滴下後４時間反応を行った。ＴＬＣ（クロロホルム）にて反応が進行したことを確認して、分液ロートに反応溶液と蒸留水を約２００．０ｍＬ加えてクロロホルムで抽出を行った。クロロホルム層を蒸留水で３回洗浄した後、硫酸マグネシウムで乾燥させて桐山漏斗を用いて吸引濾過し、エバポレーターで減圧留去した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｗａｋｏ Ｃ３００，クロロホルム）で精製して、主留をエバポレーターで減圧留去した後、デシケーターで減圧乾燥した。これを少量のクロロホルムを加えてヘキサン中で撹拌しながら再沈殿を行った。桐山ロートで吸引濾過後、デシケーターで減圧乾燥して化合物１０ｄを得た。収量は０．４９ｇ、収率は８８％であった。
【0123】
化合物１０ｅの合成
１００ｍＬのナスフラスコに化合物９ｅを０．４２ｇ（０．６７４ｍｍｏｌ）、Ｎ－ヒドロキシコハク酸イミド０．１１６ｇ（１．０１ｍｍｏｌ）、テトラヒドロフラン５０ｍＬを入れて常温で撹拌した。ＷＳＣ ０．１９３ｇ（１．０１ｍｍｏｌ）とクロロホルム３０ｍＬの混合溶液をゆっくり滴下して、滴下後反応溶液にＤＭＳＯを５ｍＬ添加して６０℃に設定したオイルバスで４時間反応を行った。ＴＬＣ（クロロホルム）にて反応が進行したことを確認して、分液ロートに反応溶液と蒸留水を約２００．０ｍＬ加えてクロロホルムで抽出を行った。クロロホルム層を蒸留水で３回洗浄した後、硫酸マグネシウムで乾燥させて桐山漏斗を用いて吸引濾過し、エバポレーターで減圧留去した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｗａｋｏ Ｃ３００，クロロホルム：アセトニトリル＝９．５：０．５）で精製して、主留をエバポレーターで減圧留去した後、デシケーターで減圧乾燥して化合物１０ｅを得た。収量は０．２６５ｇ、収率は５４％であった。
１００ｍＬのナスフラスコに化合物９ｅを０．４２ｇ（０．６７４ｍｍｏｌ）、Ｎ－ヒドロキシコハク酸イミド０．１１６ｇ（１．０１ｍｍｏｌ）、テトラヒドロフラン５０ｍＬを入れて常温で撹拌した。ＷＳＣ ０．１９３ｇ（１．０１ｍｍｏｌ）とクロロホルム３０ｍＬの混合溶液をゆっくり滴下して、滴下後反応溶液にＤＭＳＯを５ｍＬ添加して６０℃に設定したオイルバスで４時間反応を行った。ＴＬＣ（クロロホルム）にて反応が進行したことを確認して、分液ロートに反応溶液と蒸留水を約２００．０ｍＬ加えてクロロホルムで抽出を行った。クロロホルム層を蒸留水で３回洗浄した後、硫酸マグネシウムで乾燥させて桐山漏斗を用いて吸引濾過し、エバポレーターで減圧留去した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｗａｋｏ Ｃ３００，クロロホルム：アセトニトリル＝９．５：０．５）で精製して、主留をエバポレーターで減圧留去した後、デシケーターで減圧乾燥して化合物１０ｅを得た。収量は０．２６５ｇ、収率は５４％であった。
【0124】
（合成例２）
本合成例では、一般式（ＩＩ）に包含される、以下のトリアゾロピリジン化合物１５を合成した。
本合成例では、一般式（ＩＩ）に包含される、以下のトリアゾロピリジン化合物１５を合成した。
【0125】
【化24】
【0126】
化合物１１の合成
３００ｍＬのナスフラスコに化合物１を３．０ｇ（８．４ｍｍｏｌ）、水素化ホウ素ナトリウム０．７９ｇを入れ、エタノール２００．０ｍＬ中、８０℃に設定したオイルバスで撹拌して３時間反応を行った。ＴＬＣ（ヘキサン：クロロホルム：酢酸エチル＝５：２５：１）にて反応が終了したことを確認し、室温になるまで冷却した。５００ｍＬの三角フラスコに反応溶液を移して、クロロホルムを約１５０ｍＬ、蒸留水を約１００ｍＬ加え、常温で撹拌した。水相と有機相に分かれたら、分液ロートにて蒸留水を約１５０ｍＬ加え、クロロホルムで抽出を３回行った。硫酸マグネシウムを加え、桐山漏斗を用いて吸引濾過し、エバポレーターで減圧留去した。シリカゲル（ＫＡＮＴＯ ６０Ｎ 粒径６３～２１０μｍ）カラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン：酢酸エチル＝８：２）で分離精製し、単離した溶媒をエバポレーターで減圧留去した。デシケーターで減圧乾燥して化合物１１を得た。収量は１．８７ｇ、収率は６５％であった。
３００ｍＬのナスフラスコに化合物１を３．０ｇ（８．４ｍｍｏｌ）、水素化ホウ素ナトリウム０．７９ｇを入れ、エタノール２００．０ｍＬ中、８０℃に設定したオイルバスで撹拌して３時間反応を行った。ＴＬＣ（ヘキサン：クロロホルム：酢酸エチル＝５：２５：１）にて反応が終了したことを確認し、室温になるまで冷却した。５００ｍＬの三角フラスコに反応溶液を移して、クロロホルムを約１５０ｍＬ、蒸留水を約１００ｍＬ加え、常温で撹拌した。水相と有機相に分かれたら、分液ロートにて蒸留水を約１５０ｍＬ加え、クロロホルムで抽出を３回行った。硫酸マグネシウムを加え、桐山漏斗を用いて吸引濾過し、エバポレーターで減圧留去した。シリカゲル（ＫＡＮＴＯ ６０Ｎ 粒径６３～２１０μｍ）カラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン：酢酸エチル＝８：２）で分離精製し、単離した溶媒をエバポレーターで減圧留去した。デシケーターで減圧乾燥して化合物１１を得た。収量は１．８７ｇ、収率は６５％であった。
【0127】
化合物１２の合成
２００ｍＬのナスフラスコに化合物１１を１．８７ｇ（５．４１ｍｍｏｌ）、塩酸を３０．０ｍＬ、蒸留水５０ｍＬを入れ、常温で撹拌を行い溶解させた。溶解後、亜硝酸ナトリウム１．６８ｇ（２４．３ｍｍｏｌ）を蒸留水５０．０ｍＬに溶かした溶液を作り、滴下ロートでゆっくり滴下し、滴下後５分間反応を行った。ＴＬＣ（ジクロロメタン：酢酸エチル＝８：２）シートにて反応が終了したことを確認し、１０００ｍＬ三角フラスコに反応溶液を移して、蒸留水を約２００ｍＬ加えて撹拌し、炭酸水素ナトリウムを少しずつ加えｐＨ＝７～８の中性にして、蒸留水を約６００ｍＬ加え１晩撹拌した。吸引濾過で回収し、デシケーターで減圧乾燥して化合物１２を得た。収量は１．９２ｇ、収率は９９％であった。
２００ｍＬのナスフラスコに化合物１１を１．８７ｇ（５．４１ｍｍｏｌ）、塩酸を３０．０ｍＬ、蒸留水５０ｍＬを入れ、常温で撹拌を行い溶解させた。溶解後、亜硝酸ナトリウム１．６８ｇ（２４．３ｍｍｏｌ）を蒸留水５０．０ｍＬに溶かした溶液を作り、滴下ロートでゆっくり滴下し、滴下後５分間反応を行った。ＴＬＣ（ジクロロメタン：酢酸エチル＝８：２）シートにて反応が終了したことを確認し、１０００ｍＬ三角フラスコに反応溶液を移して、蒸留水を約２００ｍＬ加えて撹拌し、炭酸水素ナトリウムを少しずつ加えｐＨ＝７～８の中性にして、蒸留水を約６００ｍＬ加え１晩撹拌した。吸引濾過で回収し、デシケーターで減圧乾燥して化合物１２を得た。収量は１．９２ｇ、収率は９９％であった。
【0128】
化合物１３の合成
２００ｍＬのナスフラスコに化合物１２を１．８７ｇ（５．４ｍｍｏｌ）入れ、エタノール１００．０ｍＬ中、８０℃に設定したオイルバスで加熱還流しながら撹拌した。水酸化カリウム０．６２ｇ（１１．０ｍｍｏｌ）を蒸留水３０．０ｍＬに溶かした溶液を作り、添加後、３時間反応を行った。ＴＬＣ（クロロホルム１００％）シートにて反応が終了したことを確認し、５００ｍＬのビーカーに反応溶液を移して、蒸留水を約２００ｍＬ加えて撹拌し、塩酸１０~１５ｍＬを加えｐＨ＝１の酸性にして、蒸留水を約１００ｍＬ加えて１晩撹拌した。吸引濾過で回収し、デシケーターで減圧乾燥して化合物１３を得た。収量は１．７１ｇ、収率は９６％であった。
２００ｍＬのナスフラスコに化合物１２を１．８７ｇ（５．４ｍｍｏｌ）入れ、エタノール１００．０ｍＬ中、８０℃に設定したオイルバスで加熱還流しながら撹拌した。水酸化カリウム０．６２ｇ（１１．０ｍｍｏｌ）を蒸留水３０．０ｍＬに溶かした溶液を作り、添加後、３時間反応を行った。ＴＬＣ（クロロホルム１００％）シートにて反応が終了したことを確認し、５００ｍＬのビーカーに反応溶液を移して、蒸留水を約２００ｍＬ加えて撹拌し、塩酸１０~１５ｍＬを加えｐＨ＝１の酸性にして、蒸留水を約１００ｍＬ加えて１晩撹拌した。吸引濾過で回収し、デシケーターで減圧乾燥して化合物１３を得た。収量は１．７１ｇ、収率は９６％であった。
【0129】
化合物１４の合成
１００ｍＬのナスフラスコに化合物１３を１．７２ｇ（５．２３ｍｍｏｌ）、Ｎ－ヒドロキシコハク酸イミドを０．９ｇ（７．８５ｍｍｏｌ）入れ、テトラヒドロフラン４０．０ｍＬ中、常温で撹拌した。ＷＳＣ１．５ｇ（７．８５ｍｍｏｌ）とクロロホルム４０．０ｍＬの混合液を滴下ロートでゆっくり滴下し、滴下後４時間反応を行った。ＴＬＣ（クロロホルム：メタノール＝９：１）にて反応が終了したことを確認し、分液ロートにて蒸留水を約２００ｍＬ加えてクロロホルムで抽出を３回行った。硫酸マグネシウムを加え、桐山漏斗を用いて吸引濾過し、エバポレーターで減圧留去した。シリカゲル（ＫＡＮＴＯ ６０Ｎ 粒径６３～２１０μｍ）カラムクロマトグラフィー（クロロホルム：アセトニトリル＝９：１）で分離精製し、単離した溶媒をエバポレーターで減圧留去した。デシケーターで減圧乾燥して化合物１４を得た。収量は１．６６ｇ、収率は７４％であった。
１００ｍＬのナスフラスコに化合物１３を１．７２ｇ（５．２３ｍｍｏｌ）、Ｎ－ヒドロキシコハク酸イミドを０．９ｇ（７．８５ｍｍｏｌ）入れ、テトラヒドロフラン４０．０ｍＬ中、常温で撹拌した。ＷＳＣ１．５ｇ（７．８５ｍｍｏｌ）とクロロホルム４０．０ｍＬの混合液を滴下ロートでゆっくり滴下し、滴下後４時間反応を行った。ＴＬＣ（クロロホルム：メタノール＝９：１）にて反応が終了したことを確認し、分液ロートにて蒸留水を約２００ｍＬ加えてクロロホルムで抽出を３回行った。硫酸マグネシウムを加え、桐山漏斗を用いて吸引濾過し、エバポレーターで減圧留去した。シリカゲル（ＫＡＮＴＯ ６０Ｎ 粒径６３～２１０μｍ）カラムクロマトグラフィー（クロロホルム：アセトニトリル＝９：１）で分離精製し、単離した溶媒をエバポレーターで減圧留去した。デシケーターで減圧乾燥して化合物１４を得た。収量は１．６６ｇ、収率は７４％であった。
【0130】
化合物１５の合成
５０ｍＬのナスフラスコに化合物１４を０．３ｇ（０．７０５ｍｍｏｌ）入れＤＭＦ２０ｍＬ中、室温で攪拌した。トリエチルアミン０．１１ｍＬ（０．８４６ｍｍｏｌ）を加えて３０分程攪拌した後、１，４－ブタンスルトンを０．０９ｍＬ（０．９１６ｍｍｏｌ）添加して反応を開始した。ＴＬＣ（クロロホルム：メタノール＝９：１ 二度上げ)で反応が進行したことを確認して、桐山漏斗を用いて吸引濾過後、桐山ロート上の固体をクロロホルムで洗浄した。これをデシケーターで減圧乾燥して化合物１５を得た。収量は０．０７３ｇ、収率は１６％であった。
５０ｍＬのナスフラスコに化合物１４を０．３ｇ（０．７０５ｍｍｏｌ）入れＤＭＦ２０ｍＬ中、室温で攪拌した。トリエチルアミン０．１１ｍＬ（０．８４６ｍｍｏｌ）を加えて３０分程攪拌した後、１，４－ブタンスルトンを０．０９ｍＬ（０．９１６ｍｍｏｌ）添加して反応を開始した。ＴＬＣ（クロロホルム：メタノール＝９：１ 二度上げ)で反応が進行したことを確認して、桐山漏斗を用いて吸引濾過後、桐山ロート上の固体をクロロホルムで洗浄した。これをデシケーターで減圧乾燥して化合物１５を得た。収量は０．０７３ｇ、収率は１６％であった。
【0131】
（合成例３）
本合成例では、一般式（ＩＩＩ）に包含される、以下のトリアゾロピリジン化合物２４を合成した。
本合成例では、一般式（ＩＩＩ）に包含される、以下のトリアゾロピリジン化合物２４を合成した。
【0132】
【化25】
【0133】
化合物１７の合成
２００ｍＬのナスフラスコに化合物１６を５．０ｇ（１８．３ｍｍｏｌ）、メチルトリフェニルホスホニウムヨージド９．６ｇ（２３．８ｍｍｏｌ）を入れ、ＤＭＦ１００ｍＬ中、室温で攪拌した。これに、カリウムｔｅｒｔ－ブトキシド４０ｍＬを加えて４時間反応させた。ＴＬＣ（ジクロロメタン：ヘキサン＝１：１）)で反応が進行したことを確認して、反応溶液を分液ロートに移して水を加えてクロロホルムで抽出した。クロロホルム層を水で４回洗浄した。これを硫酸マグネシウムで乾燥させて、桐山ロートを用いて吸引濾過桐山漏斗し、エバポレーターで減圧留去を行った。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｗａｋｏ Ｃ３００，ジクロロメタン：ヘキサン＝１：１）で精製し、主留をエバポレーターで減圧留去した。これをデシケーターで減圧乾燥して化合物１７を得た。収量は３．９３ｇ、収率は７９％であった。
２００ｍＬのナスフラスコに化合物１６を５．０ｇ（１８．３ｍｍｏｌ）、メチルトリフェニルホスホニウムヨージド９．６ｇ（２３．８ｍｍｏｌ）を入れ、ＤＭＦ１００ｍＬ中、室温で攪拌した。これに、カリウムｔｅｒｔ－ブトキシド４０ｍＬを加えて４時間反応させた。ＴＬＣ（ジクロロメタン：ヘキサン＝１：１）)で反応が進行したことを確認して、反応溶液を分液ロートに移して水を加えてクロロホルムで抽出した。クロロホルム層を水で４回洗浄した。これを硫酸マグネシウムで乾燥させて、桐山ロートを用いて吸引濾過桐山漏斗し、エバポレーターで減圧留去を行った。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｗａｋｏ Ｃ３００，ジクロロメタン：ヘキサン＝１：１）で精製し、主留をエバポレーターで減圧留去した。これをデシケーターで減圧乾燥して化合物１７を得た。収量は３．９３ｇ、収率は７９％であった。
【0134】
化合物１９の合成
２００ｍＬのナスフラスコに化合物１８を３．０ｇ（１０．２ｍｍｏｌ）、テトラヒドロホウ酸ナトリウム１．３５ｇ（３５．７ｍｍｏｌ）を入れ、エタノール１００ｍＬ中、０～５℃に冷却しながら攪拌した。０～５℃で１時間反応、室温で１７時間反応させた。ＴＬＣ（クロロホルム）で反応が進行したことを確認して、反応溶液を三角フラスコに移して水を加えて３０分程攪拌した。これを分液ロートに移してクロロホルムで抽出した。クロロホルム層を水で４回洗浄して硫酸マグネシウムで乾燥させて、桐山ロートを用いて吸引濾過桐山漏斗、エバポレーターで減圧留去を行った。デシケーターで減圧乾燥させて化合物１９を得た。収量は１．４５ｇ、収率は５３％であった。
２００ｍＬのナスフラスコに化合物１８を３．０ｇ（１０．２ｍｍｏｌ）、テトラヒドロホウ酸ナトリウム１．３５ｇ（３５．７ｍｍｏｌ）を入れ、エタノール１００ｍＬ中、０～５℃に冷却しながら攪拌した。０～５℃で１時間反応、室温で１７時間反応させた。ＴＬＣ（クロロホルム）で反応が進行したことを確認して、反応溶液を三角フラスコに移して水を加えて３０分程攪拌した。これを分液ロートに移してクロロホルムで抽出した。クロロホルム層を水で４回洗浄して硫酸マグネシウムで乾燥させて、桐山ロートを用いて吸引濾過桐山漏斗、エバポレーターで減圧留去を行った。デシケーターで減圧乾燥させて化合物１９を得た。収量は１．４５ｇ、収率は５３％であった。
【0135】
化合物２０の合成
２００ｍＬのナスフラスコに化合物１９を１．４５ｇ（５．４５ｍｍｏｌ）、塩酸３０．０ｍＬ、蒸留水５０ｍＬを入れ、常温で撹拌を行い溶解させた。溶解後、亜硝酸ナトリウム１．６９ｇ（２４．５ｍｍｏｌ）を蒸留水５０．０ｍＬに溶かした溶液を作り、滴下ロートでゆっくり滴下し、滴下後１０分間反応を行った。ＴＬＣ（クロロホルム）にて反応が終了したことを確認し、１０００ｍＬ三角フラスコに反応溶液を移して、蒸留水を約２００ｍＬ加えて撹拌し、炭酸水素ナトリウムを少しずつ加えｐＨ＝７～８の中性にして、蒸留水を約６００ｍＬ加え１晩撹拌した。吸引濾過で回収し、デシケーターで減圧乾燥して化合物２０を得た。収量は１．４９ｇ、収率は９８％であった。
２００ｍＬのナスフラスコに化合物１９を１．４５ｇ（５．４５ｍｍｏｌ）、塩酸３０．０ｍＬ、蒸留水５０ｍＬを入れ、常温で撹拌を行い溶解させた。溶解後、亜硝酸ナトリウム１．６９ｇ（２４．５ｍｍｏｌ）を蒸留水５０．０ｍＬに溶かした溶液を作り、滴下ロートでゆっくり滴下し、滴下後１０分間反応を行った。ＴＬＣ（クロロホルム）にて反応が終了したことを確認し、１０００ｍＬ三角フラスコに反応溶液を移して、蒸留水を約２００ｍＬ加えて撹拌し、炭酸水素ナトリウムを少しずつ加えｐＨ＝７～８の中性にして、蒸留水を約６００ｍＬ加え１晩撹拌した。吸引濾過で回収し、デシケーターで減圧乾燥して化合物２０を得た。収量は１．４９ｇ、収率は９８％であった。
【0136】
化合物２１の合成
１００ｍＬのナス型フラスコに化合物２０を０．８ｇ（２．８８ｍｍｏｌ）入れ、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド３５ｍＬ中、常温で撹拌した。トリエチルアミン０．５９ｍＬ（４．３２ｍｍｏｌ）添加後３０分撹拌した後、５－ブロモ吉草酸エチル０．５５ｍＬ（３．４５ｍｍｏｌ）を加えて２日間反応を行った。ＴＬＣ（クロロホルム）にて反応が進行したことを確認して反応溶液を分液ロート移して蒸留水を約２００ｍＬ、少量の塩酸を加えてクロロホルムで抽出を行った。クロロホルム層を希塩酸水で２回、飽和重曹水で２回、水で１回洗浄を行った。これを硫酸マグネシウムで乾燥させて、桐山漏斗を用いて吸引濾過し、エバポレーターで減圧留去した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｗａｋｏ Ｃ３００，クロロホルム）で精製し、主留をエバポレーターで減圧留去した。デシケーターで減圧乾燥して化合物２１を得た。収量は０．８４ｇ、収率は７１％であった。
１００ｍＬのナス型フラスコに化合物２０を０．８ｇ（２．８８ｍｍｏｌ）入れ、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド３５ｍＬ中、常温で撹拌した。トリエチルアミン０．５９ｍＬ（４．３２ｍｍｏｌ）添加後３０分撹拌した後、５－ブロモ吉草酸エチル０．５５ｍＬ（３．４５ｍｍｏｌ）を加えて２日間反応を行った。ＴＬＣ（クロロホルム）にて反応が進行したことを確認して反応溶液を分液ロート移して蒸留水を約２００ｍＬ、少量の塩酸を加えてクロロホルムで抽出を行った。クロロホルム層を希塩酸水で２回、飽和重曹水で２回、水で１回洗浄を行った。これを硫酸マグネシウムで乾燥させて、桐山漏斗を用いて吸引濾過し、エバポレーターで減圧留去した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｗａｋｏ Ｃ３００，クロロホルム）で精製し、主留をエバポレーターで減圧留去した。デシケーターで減圧乾燥して化合物２１を得た。収量は０．８４ｇ、収率は７１％であった。
【0137】
化合物２２の合成
５０ｍＬの二つ口フラスコに化合物２１を０．１ｇ（０．２４６ｍｍｏｌ）、ジフェニルアミノスチレン０．３３ｇ（１．２３ｍｍｏｌ）、テトラブチルアンモニウムブロミド０．１５８ｇ（０．４９２ｍｍｏｌ）、炭酸カリウム０．０８４ｇ（０．６１５ｍｍｏｌ）、酢酸パラジウム０．００１１ｇ（０．００４９２ｍｍｏｌ）を入れて、アルゴン置換を行った。これに超脱水グレードのＤＭＦ １０ｍＬを加えて１１０℃に設定したオイルバスで１日間反応させた。ＴＬＣ（クロロホルム）にて反応が進行したことを確認して、分液ロートに反応溶液を移し、蒸留水とクロロホルムを適量加えて抽出した。有機層を蒸留水で３回程洗浄後、硫酸マグネシウムで乾燥、桐山ロートで吸引濾過、エバポレーターで減圧留去した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｗａｋｏ Ｃ３００，クロロホルム）で精製して主留をエバポレーターで減圧留去し、デシケーターで減圧乾燥して化合物２２を得た。収量は０．１２５ｇ、収率は６４％であった。
５０ｍＬの二つ口フラスコに化合物２１を０．１ｇ（０．２４６ｍｍｏｌ）、ジフェニルアミノスチレン０．３３ｇ（１．２３ｍｍｏｌ）、テトラブチルアンモニウムブロミド０．１５８ｇ（０．４９２ｍｍｏｌ）、炭酸カリウム０．０８４ｇ（０．６１５ｍｍｏｌ）、酢酸パラジウム０．００１１ｇ（０．００４９２ｍｍｏｌ）を入れて、アルゴン置換を行った。これに超脱水グレードのＤＭＦ １０ｍＬを加えて１１０℃に設定したオイルバスで１日間反応させた。ＴＬＣ（クロロホルム）にて反応が進行したことを確認して、分液ロートに反応溶液を移し、蒸留水とクロロホルムを適量加えて抽出した。有機層を蒸留水で３回程洗浄後、硫酸マグネシウムで乾燥、桐山ロートで吸引濾過、エバポレーターで減圧留去した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｗａｋｏ Ｃ３００，クロロホルム）で精製して主留をエバポレーターで減圧留去し、デシケーターで減圧乾燥して化合物２２を得た。収量は０．１２５ｇ、収率は６４％であった。
【0138】
化合物２３の合成
１００ｍＬのナスフラスコに化合物２２を０．１２ｇ（０．１５２ｍｍｏｌ）入れ、１，４－ジオキサン３０ｍＬ中、９０℃に設定したオイルバスで撹拌した。水酸化カリウム０．０２１ｇ（０．３８ｍｍｏｌ）を蒸留水１０ｍＬに溶かした溶液を作り、添加後、４時間反応を行った。ＴＬＣ（クロロホルム１００％）にて反応が終了したことを確認し、３００ｍＬの三角フラスコに反応溶液を移して、蒸留水を約２００ｍＬ加えて撹拌し、ｐＨ＝１になるまで塩酸を加えて撹拌した。これを吸引濾過で回収し、デシケーターで減圧乾燥して化合物２３を得た。収量は０．１ｇ、収率は８６％であった。
１００ｍＬのナスフラスコに化合物２２を０．１２ｇ（０．１５２ｍｍｏｌ）入れ、１，４－ジオキサン３０ｍＬ中、９０℃に設定したオイルバスで撹拌した。水酸化カリウム０．０２１ｇ（０．３８ｍｍｏｌ）を蒸留水１０ｍＬに溶かした溶液を作り、添加後、４時間反応を行った。ＴＬＣ（クロロホルム１００％）にて反応が終了したことを確認し、３００ｍＬの三角フラスコに反応溶液を移して、蒸留水を約２００ｍＬ加えて撹拌し、ｐＨ＝１になるまで塩酸を加えて撹拌した。これを吸引濾過で回収し、デシケーターで減圧乾燥して化合物２３を得た。収量は０．１ｇ、収率は８６％であった。
【0139】
化合物２４の合成
１００ｍＬのナスフラスコに化合物２３を０．１ｇ（０．１３１ｍｍｏｌ）、Ｎ－ヒドロキシコハク酸イミドを０．０２２ｇ（０．１９６ｍｍｏｌ）入れ、テトラヒドロフラン３０ｍＬ中、常温で撹拌した。ＷＳＣ ０．０３７ｇ（０．１９６ｍｍｏｌ）とクロロホルム２０ｍＬの混合液を滴下ロートでゆっくり滴下し、滴下後４時間反応を行った。ＴＬＣ（クロロホルム）にて反応が進行したことを確認し、分液ロートにて蒸留水を約２００ｍＬ加えてクロロホルムで抽出行った。クロロホルム層を蒸留水で３回洗浄を行い硫酸マグネシウムで乾燥させて、桐山漏斗を用いて吸引濾過し、エバポレーターで減圧留去を行った。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｗａｋｏ Ｃ３００，クロロホルム）で精製して、主留をエバポレーターで減圧留去した後、デシケーターで減圧乾燥した。これを少量のクロロホルムを加えてヘキサン中で撹拌しながら再沈殿を行った。桐山ロートで吸引濾過後、デシケーターで減圧乾燥して化合物２４を得た。収量は０．０４９ｇ、収率は４３％であった。
１００ｍＬのナスフラスコに化合物２３を０．１ｇ（０．１３１ｍｍｏｌ）、Ｎ－ヒドロキシコハク酸イミドを０．０２２ｇ（０．１９６ｍｍｏｌ）入れ、テトラヒドロフラン３０ｍＬ中、常温で撹拌した。ＷＳＣ ０．０３７ｇ（０．１９６ｍｍｏｌ）とクロロホルム２０ｍＬの混合液を滴下ロートでゆっくり滴下し、滴下後４時間反応を行った。ＴＬＣ（クロロホルム）にて反応が進行したことを確認し、分液ロートにて蒸留水を約２００ｍＬ加えてクロロホルムで抽出行った。クロロホルム層を蒸留水で３回洗浄を行い硫酸マグネシウムで乾燥させて、桐山漏斗を用いて吸引濾過し、エバポレーターで減圧留去を行った。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｗａｋｏ Ｃ３００，クロロホルム）で精製して、主留をエバポレーターで減圧留去した後、デシケーターで減圧乾燥した。これを少量のクロロホルムを加えてヘキサン中で撹拌しながら再沈殿を行った。桐山ロートで吸引濾過後、デシケーターで減圧乾燥して化合物２４を得た。収量は０．０４９ｇ、収率は４３％であった。
【0140】
（合成例４）
本合成例では、一般式（ＩＩＩ）に包含される、以下のトリアゾロピリジン化合物２７を合成した。
本合成例では、一般式（ＩＩＩ）に包含される、以下のトリアゾロピリジン化合物２７を合成した。
【0141】
【化26】
【0142】
化合物２５の合成
５０ｍＬの二つ口フラスコに化合物２１を０．３ｇ（０．７４ｍｍｏｌ）、４－メトキシスチレン０．９９ｇ（７．４ｍｍｏｌ）、テトラブチルアンモニウムブロミド０．４７６ｇ（１．４８ｍｍｏｌ）、炭酸カリウム０．２５５ｇ（１．８５ｍｍｏｌ）、酢酸パラジウム０．００６６ｇ（０．０２９６ｍｍｏｌ）を入れて、アルゴン置換を行った。これに超脱水グレードのＤＭＦ ２０ｍＬを加えて１１０℃に設定したオイルバスで１日間反応させた。ＴＬＣ（クロロホルム）にて反応が進行したことを確認して、分液ロートに反応溶液を移し、蒸留水とクロロホルムを適量加えて抽出した。有機層を蒸留水で３回洗浄後、硫酸マグネシウムで乾燥、桐山ロートで吸引濾過し、エバポレーターで減圧留去した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｗａｋｏ Ｃ３００，クロロホルム）で精製して主留をエバポレーターで減圧留去し、デシケーターで減圧乾燥して化合物２５を得た。収量は０．２６３ｇ、収率は６９％であった。
５０ｍＬの二つ口フラスコに化合物２１を０．３ｇ（０．７４ｍｍｏｌ）、４－メトキシスチレン０．９９ｇ（７．４ｍｍｏｌ）、テトラブチルアンモニウムブロミド０．４７６ｇ（１．４８ｍｍｏｌ）、炭酸カリウム０．２５５ｇ（１．８５ｍｍｏｌ）、酢酸パラジウム０．００６６ｇ（０．０２９６ｍｍｏｌ）を入れて、アルゴン置換を行った。これに超脱水グレードのＤＭＦ ２０ｍＬを加えて１１０℃に設定したオイルバスで１日間反応させた。ＴＬＣ（クロロホルム）にて反応が進行したことを確認して、分液ロートに反応溶液を移し、蒸留水とクロロホルムを適量加えて抽出した。有機層を蒸留水で３回洗浄後、硫酸マグネシウムで乾燥、桐山ロートで吸引濾過し、エバポレーターで減圧留去した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｗａｋｏ Ｃ３００，クロロホルム）で精製して主留をエバポレーターで減圧留去し、デシケーターで減圧乾燥して化合物２５を得た。収量は０．２６３ｇ、収率は６９％であった。
【0143】
化合物２６の合成
１００ｍＬのナスフラスコに化合物２５を０．２６ｇ（０．５０８ｍｍｏｌ）入れ、１，４－ジオキサン４０ｍＬ中、１００℃に設定したオイルバスで撹拌した。水酸化カリウム０．０７６ｇ（１．２７ｍｍｏｌ）を蒸留水１３ｍＬに溶かした溶液を作り、添加後、３時間反応を行った。ＴＬＣ（クロロホルム１００％）にて反応が終了したことを確認し、３００ｍＬの三角フラスコに反応溶液を移して、蒸留水を約２００ｍＬ加えて撹拌し、ｐＨ＝１になるまで塩酸を加えて撹拌した。これを吸引濾過で回収し、デシケーターで減圧乾燥して化合物２６を得た。収量は０．２３ｇ、収率は９４％であった。
１００ｍＬのナスフラスコに化合物２５を０．２６ｇ（０．５０８ｍｍｏｌ）入れ、１，４－ジオキサン４０ｍＬ中、１００℃に設定したオイルバスで撹拌した。水酸化カリウム０．０７６ｇ（１．２７ｍｍｏｌ）を蒸留水１３ｍＬに溶かした溶液を作り、添加後、３時間反応を行った。ＴＬＣ（クロロホルム１００％）にて反応が終了したことを確認し、３００ｍＬの三角フラスコに反応溶液を移して、蒸留水を約２００ｍＬ加えて撹拌し、ｐＨ＝１になるまで塩酸を加えて撹拌した。これを吸引濾過で回収し、デシケーターで減圧乾燥して化合物２６を得た。収量は０．２３ｇ、収率は９４％であった。
【0144】
化合物２７の合成
１００ｍＬのナスフラスコに化合物２６を０．２３ｇ（０．４７５ｍｍｏｌ）、Ｎ－ヒドロキシコハク酸イミドを０．０８１ｇ（０．７１２ｍｍｏｌ）入れ、テトラヒドロフラン３０ｍＬ中、常温で撹拌した。ＷＳＣ ０．１３６ｇ（０．７１２ｍｍｏｌ）とクロロホルム３０ｍＬの混合液を滴下ロートでゆっくり滴下し、滴下後３時間反応を行った。ＴＬＣ（クロロホルム）にて反応が進行したことを確認し、分液ロートにて蒸留水を約２００ｍＬ加えてクロロホルムで抽出行った。クロロホルム層を蒸留水で３回洗浄を行い硫酸マグネシウムで乾燥させて、桐山漏斗を用いて吸引濾過し、エバポレーターで減圧留去を行った。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｗａｋｏ Ｃ３００，クロロホルム）で精製して、主留をエバポレーターで減圧留去した後、デシケーターで減圧乾燥して化合物２７を得た。収量は０．１５８ｇ、収率は５７％であった。
１００ｍＬのナスフラスコに化合物２６を０．２３ｇ（０．４７５ｍｍｏｌ）、Ｎ－ヒドロキシコハク酸イミドを０．０８１ｇ（０．７１２ｍｍｏｌ）入れ、テトラヒドロフラン３０ｍＬ中、常温で撹拌した。ＷＳＣ ０．１３６ｇ（０．７１２ｍｍｏｌ）とクロロホルム３０ｍＬの混合液を滴下ロートでゆっくり滴下し、滴下後３時間反応を行った。ＴＬＣ（クロロホルム）にて反応が進行したことを確認し、分液ロートにて蒸留水を約２００ｍＬ加えてクロロホルムで抽出行った。クロロホルム層を蒸留水で３回洗浄を行い硫酸マグネシウムで乾燥させて、桐山漏斗を用いて吸引濾過し、エバポレーターで減圧留去を行った。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｗａｋｏ Ｃ３００，クロロホルム）で精製して、主留をエバポレーターで減圧留去した後、デシケーターで減圧乾燥して化合物２７を得た。収量は０．１５８ｇ、収率は５７％であった。
【0145】
（合成例５）
本合成例では、一般式（ＩＩＩ）に包含される、以下のトリアゾロピリジン化合物３０を合成した。
本合成例では、一般式（ＩＩＩ）に包含される、以下のトリアゾロピリジン化合物３０を合成した。
【0146】
【化27】
【0147】
化合物２８の合成
１００ｍＬの二つ口フラスコに化合物２１を０．３ｇ（０．７４ｍｍｏｌ）、４－エチニルトリフェニルアミン０．８９ｇ（３．３３ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン１０ｍＬ、テトラヒドロフラン３０ｍＬを入れて、８０℃に設定したオイルバスで溶解させた。これに、テトラキストリフェニルホスフィンパラジウム０．０８５ｇ（０．０７４ｍｍｏｌ）、ヨウ化銅０．０１４ｇ（０．０７４ｍｍｏｌ）を加えてアルゴン置換下で４時間反応させた。ＴＬＣ（クロロホルム）にて反応が進行したことを確認して、分液ロートに反応溶液を移し、蒸留水とクロロホルムを適量加えて抽出した。有機層を希塩酸水で３回、飽和重曹水で２回、蒸留水で２回程洗浄後、硫酸マグネシウムで乾燥、桐山ロートで吸引濾過し、エバポレーターで減圧留去した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｗａｋｏ Ｃ３００，クロロホルム）で精製して主留をエバポレーターで減圧留去し、デシケーターで減圧乾燥して化合物２８を得た。収量は０．４ｇ、収率は６９％であった。
１００ｍＬの二つ口フラスコに化合物２１を０．３ｇ（０．７４ｍｍｏｌ）、４－エチニルトリフェニルアミン０．８９ｇ（３．３３ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン１０ｍＬ、テトラヒドロフラン３０ｍＬを入れて、８０℃に設定したオイルバスで溶解させた。これに、テトラキストリフェニルホスフィンパラジウム０．０８５ｇ（０．０７４ｍｍｏｌ）、ヨウ化銅０．０１４ｇ（０．０７４ｍｍｏｌ）を加えてアルゴン置換下で４時間反応させた。ＴＬＣ（クロロホルム）にて反応が進行したことを確認して、分液ロートに反応溶液を移し、蒸留水とクロロホルムを適量加えて抽出した。有機層を希塩酸水で３回、飽和重曹水で２回、蒸留水で２回程洗浄後、硫酸マグネシウムで乾燥、桐山ロートで吸引濾過し、エバポレーターで減圧留去した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｗａｋｏ Ｃ３００，クロロホルム）で精製して主留をエバポレーターで減圧留去し、デシケーターで減圧乾燥して化合物２８を得た。収量は０．４ｇ、収率は６９％であった。
【0148】
化合物２９の合成
１００ｍＬのナスフラスコに化合物２８を０．４６ｇ（０．５１１ｍｍｏｌ）入れ、１，４－ジオキサン４０ｍＬ中、１００℃に設定したオイルバスで撹拌した。水酸化カリウム０．０７１ｇ（１．２７ｍｍｏｌ）を蒸留水１３ｍＬに溶かした溶液を作り、添加後、３時間反応を行った。ＴＬＣ（クロロホルム１００％）にて反応が終了したことを確認し、３００ｍＬの三角フラスコに反応溶液を移して、蒸留水を約２００ｍＬ加えて撹拌し、ｐＨ＝１になるまで塩酸を加えて撹拌した。これを吸引濾過で回収し、デシケーターで減圧乾燥して化合物２９を得た。収量は０．３８ｇ、収率は９８％であった。
１００ｍＬのナスフラスコに化合物２８を０．４６ｇ（０．５１１ｍｍｏｌ）入れ、１，４－ジオキサン４０ｍＬ中、１００℃に設定したオイルバスで撹拌した。水酸化カリウム０．０７１ｇ（１．２７ｍｍｏｌ）を蒸留水１３ｍＬに溶かした溶液を作り、添加後、３時間反応を行った。ＴＬＣ（クロロホルム１００％）にて反応が終了したことを確認し、３００ｍＬの三角フラスコに反応溶液を移して、蒸留水を約２００ｍＬ加えて撹拌し、ｐＨ＝１になるまで塩酸を加えて撹拌した。これを吸引濾過で回収し、デシケーターで減圧乾燥して化合物２９を得た。収量は０．３８ｇ、収率は９８％であった。
【0149】
化合物３０の合成
１００ｍＬのナスフラスコに化合物２９を０．３８ｇ（０．５０４ｍｍｏｌ）、Ｎ－ヒドロキシコハク酸イミドを０．０８７ｇ（０．７５６ｍｍｏｌ）入れ、テトラヒドロフラン４０ｍＬ中、常温で撹拌した。ＷＳＣ ０．１４ｇ（０．７５６ｍｍｏｌ）とクロロホルム２０ｍＬの混合液を滴下ロートでゆっくり滴下し、滴下後４時間反応を行った。ＴＬＣ（クロロホルム）にて反応が進行したことを確認し、分液ロートにて蒸留水を約２００ｍＬ加えてクロロホルムで抽出を行った。クロロホルム層を蒸留水で２回洗浄を行い硫酸マグネシウムで乾燥させて、桐山漏斗を用いて吸引濾過し、エバポレーターで減圧留去を行った。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｗａｋｏ Ｃ３００，クロロホルム）で精製して、主留をエバポレーターで減圧留去した。残渣をアセトニトリルで再結晶した後、桐山ロートで吸引濾過後、デシケーターで減圧乾燥して化合物３０を得た。収量は０．３４５ｇ、収率は８０％であった。
１００ｍＬのナスフラスコに化合物２９を０．３８ｇ（０．５０４ｍｍｏｌ）、Ｎ－ヒドロキシコハク酸イミドを０．０８７ｇ（０．７５６ｍｍｏｌ）入れ、テトラヒドロフラン４０ｍＬ中、常温で撹拌した。ＷＳＣ ０．１４ｇ（０．７５６ｍｍｏｌ）とクロロホルム２０ｍＬの混合液を滴下ロートでゆっくり滴下し、滴下後４時間反応を行った。ＴＬＣ（クロロホルム）にて反応が進行したことを確認し、分液ロートにて蒸留水を約２００ｍＬ加えてクロロホルムで抽出を行った。クロロホルム層を蒸留水で２回洗浄を行い硫酸マグネシウムで乾燥させて、桐山漏斗を用いて吸引濾過し、エバポレーターで減圧留去を行った。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｗａｋｏ Ｃ３００，クロロホルム）で精製して、主留をエバポレーターで減圧留去した。残渣をアセトニトリルで再結晶した後、桐山ロートで吸引濾過後、デシケーターで減圧乾燥して化合物３０を得た。収量は０．３４５ｇ、収率は８０％であった。
【0150】
（合成例６）
比較のため、以下の構造を有するジアゾロピリジン化合物３４（４，７－ジ（メトキシフェニル）－１，２，５－オキサジアゾロピリジンのピリジニウム体の活性エステル体）を合成した。
比較のため、以下の構造を有するジアゾロピリジン化合物３４（４，７－ジ（メトキシフェニル）－１，２，５－オキサジアゾロピリジンのピリジニウム体の活性エステル体）を合成した。
【0151】
４－メトキシアセトフェノン３１を出発原料として用いて、酢酸中、硝酸と亜硝酸ナトリウムの存在下、３０℃で２日間反応を行い、Ｎ－オキシド体３２を収率７８％で得た。次に、アセトニトリル中、塩化第一銅次亜リン酸ナトリウムの存在下、８０℃で１４時間の還元反応を、行いジケトン体３３を収率６２％で得た。さらに、エタノール中、４－ピコリルアミンの存在下、８０℃で２日間の反応を行い、ピリジニウム体を収率７０％で得た。トルエン中、１００℃で３日間、５－ブロモペンタン酸スクシンイミジルエステルと反応させ、ピリジニウム体の活性エステル体３４を収率７８％で得た。
【0152】
【化28】
【0153】
【化29】
【0154】
【化30】
【0155】
（吸収スペクトルおよび蛍光スペクトル測定）
合成した化合物について、溶媒にＤＭＳＯを用いて、蛍光波長の測定および吸収波長の測定を行った。化合物濃度は０．００１ｍＭとしその結果を表１に示す。
合成した化合物について、溶媒にＤＭＳＯを用いて、蛍光波長の測定および吸収波長の測定を行った。化合物濃度は０．００１ｍＭとしその結果を表１に示す。
【0156】
【表1】
【0157】
（光学特性結果）
本発明の蛍光色素である化合物１０ａ～１０ｅ、１５、２４、２７、３０は、比較としても用いた化合物３４に比べ、高い蛍光強度と輝度を有していた。
本発明の蛍光色素である化合物１０ａ～１０ｅ、１５、２４、２７、３０は、比較としても用いた化合物３４に比べ、高い蛍光強度と輝度を有していた。
【0158】
（細胞染色）
検体から採取した組織切片を染色し、包埋剤により包埋して包埋体となし、包埋体を薄切りして切片として観察用の生体標本を作製した。作成した生体標本をＦＬ－ＳＥＭで観察した。
検体から採取した組織切片を染色し、包埋剤により包埋して包埋体となし、包埋体を薄切りして切片として観察用の生体標本を作製した。作成した生体標本をＦＬ－ＳＥＭで観察した。
【0159】
（金ナノ粒子標識二次抗体の調製）
以下の手順で、金ナノ粒子標識二次抗体を調製した。
１．ストレプトアビジン・Ｎａｎｏｇｏｌｄ（登録商標）（Ｎａｎｏ ｐｒｏｂｅｓ社製）をＨＥＰＥＳ・炭酸緩衝液に溶解した。ストレプトアビジン濃度は、８０μｇ/ｍｌである。
２．本発明の蛍光色素として化合物１５のＤＭＳＯ溶液（濃度５ｍＭ）を調製した。
３．ストレプトアビジン・Ｎａｎｏｇｏｌｄ溶液と化合物１０ｂのＤＭＳＯ溶液を、３７℃、１０００ｒｐｍで９０分間、混合攪拌した。これにより、化合物１５をアミド結合によりストレプトアビジン・Ｎａｎｏｇｏｌｄに結合させた。
４．この混合液をＮＡＰＳカラムに流し、精製して、蛍光色素－ストレプトアビジン・Ｎａｎｏｇｏｌｄ二次抗体を得た。
以下の手順で、金ナノ粒子標識二次抗体を調製した。
１．ストレプトアビジン・Ｎａｎｏｇｏｌｄ（登録商標）（Ｎａｎｏ ｐｒｏｂｅｓ社製）をＨＥＰＥＳ・炭酸緩衝液に溶解した。ストレプトアビジン濃度は、８０μｇ/ｍｌである。
２．本発明の蛍光色素として化合物１５のＤＭＳＯ溶液（濃度５ｍＭ）を調製した。
３．ストレプトアビジン・Ｎａｎｏｇｏｌｄ溶液と化合物１０ｂのＤＭＳＯ溶液を、３７℃、１０００ｒｐｍで９０分間、混合攪拌した。これにより、化合物１５をアミド結合によりストレプトアビジン・Ｎａｎｏｇｏｌｄに結合させた。
４．この混合液をＮＡＰＳカラムに流し、精製して、蛍光色素－ストレプトアビジン・Ｎａｎｏｇｏｌｄ二次抗体を得た。
【0160】
細胞染色は、以下の手順で行った。
材料：Ｒａｔ腎臓
１．４％ＰＦＡ+０．０５％ＧＡ（４℃、１時間）、過ヨウ素酸－リジン－パラホルムアルデヒド（４℃、３時間）で浸漬固定した。
２．ビブラトーム切片（１００μｍ厚)を作製した。
３．過酸化水素水で内因性ペルオキシダーゼのブロッキングを行った。
４．セミカルバジド塩酸塩処理
５．抗ＣａｔｈｅｐｓｉｎＤ ウサギポリクローナル抗体（２０μｇ/ｍｌ）で反応（４℃、７日間）。
６．ビオチン標識抗ウサギ抗体（１：５００）で反応（４℃、１８時間）。
７．ＴＳＡビオチン検出キットで免疫染色の増強。
８．蛍光色素－ストレプトアビジン・Ｎａｎｏｇｏｌｄ二次抗体（１：１００）で反応（４℃、１８時間）。
９．１％ＧＡで再固定(室温、１０分間)
１０．ＧｏｌｄｅｎｈａｎｃｅＴＭＥＭキットで金増感反応（３０～６０秒）
１１．０．５％ＯｓＯ４で後固定・染色（室温、５分間）
１２．エタノール上昇系列で脱水
１３．Ｄｕｒｃｕｐａｎ（エポキシ系樹脂）包埋(６０℃、２４時間）
材料：Ｒａｔ腎臓
１．４％ＰＦＡ+０．０５％ＧＡ（４℃、１時間）、過ヨウ素酸－リジン－パラホルムアルデヒド（４℃、３時間）で浸漬固定した。
２．ビブラトーム切片（１００μｍ厚)を作製した。
３．過酸化水素水で内因性ペルオキシダーゼのブロッキングを行った。
４．セミカルバジド塩酸塩処理
５．抗ＣａｔｈｅｐｓｉｎＤ ウサギポリクローナル抗体（２０μｇ/ｍｌ）で反応（４℃、７日間）。
６．ビオチン標識抗ウサギ抗体（１：５００）で反応（４℃、１８時間）。
７．ＴＳＡビオチン検出キットで免疫染色の増強。
８．蛍光色素－ストレプトアビジン・Ｎａｎｏｇｏｌｄ二次抗体（１：１００）で反応（４℃、１８時間）。
９．１％ＧＡで再固定(室温、１０分間)
１０．ＧｏｌｄｅｎｈａｎｃｅＴＭＥＭキットで金増感反応（３０～６０秒）
１１．０．５％ＯｓＯ４で後固定・染色（室温、５分間）
１２．エタノール上昇系列で脱水
１３．Ｄｕｒｃｕｐａｎ（エポキシ系樹脂）包埋(６０℃、２４時間）
【0161】
（顕微鏡観察）
化合物１５ではマウスの腎臓のパラフィン切片を使用して腎臓がんの際に多く発現する膜タンパクＣＤ１０をターゲットとして免疫染色を行った。一方、化合物３４ではラットの十二指腸のパラフィン切片を使用してＤＮＡの修復などに関与しているタンパク質ＰＣＮＡ（proliferating cell nuclear antigen）をターゲットとして免疫染色を行った。染色を行ったターゲットは異なるが、化合物１５の方がより明確にターゲットを染色出来ていることを確認した。
化合物１５ではマウスの腎臓のパラフィン切片を使用して腎臓がんの際に多く発現する膜タンパクＣＤ１０をターゲットとして免疫染色を行った。一方、化合物３４ではラットの十二指腸のパラフィン切片を使用してＤＮＡの修復などに関与しているタンパク質ＰＣＮＡ（proliferating cell nuclear antigen）をターゲットとして免疫染色を行った。染色を行ったターゲットは異なるが、化合物１５の方がより明確にターゲットを染色出来ていることを確認した。
【図1】
【図2】
