特許 7480037 細胞培養用足場材料及び細胞培養用容器

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-04-26

(45)【発行日】2024-05-09

(54)【発明の名称】細胞培養用足場材料及び細胞培養用容器

(51)【国際特許分類】

   C12M 3/00 20060101AFI20240430BHJP

   C08F 265/06 20060101ALI20240430BHJP

   C08F 261/12 20060101ALI20240430BHJP

   C12N 5/071 20100101ALN20240430BHJP

【ＦＩ】

C12M3/00 A

C08F265/06

C08F261/12

C12N5/071

【請求項の数】 8

(21)【出願番号】P 2020524924

(86)(22)【出願日】2020-03-27

(86)【国際出願番号】 JP2020014012

(87)【国際公開番号】W WO2020203768

(87)【国際公開日】2020-10-08

【審査請求日】2022-12-14

(31)【優先権主張番号】P 2019068404

(32)【優先日】2019-03-29

(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】000002174

【氏名又は名称】積水化学工業株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】110001232

【氏名又は名称】弁理士法人大阪フロント特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】井口 博貴

(72)【発明者】

【氏名】中村 雄太

(72)【発明者】

【氏名】石井 亮馬

(72)【発明者】

【氏名】新井 悠平

(72)【発明者】

【氏名】羽根田 聡

【審査官】野村 英雄

(56)【参考文献】

【文献】特開２０１０－２２０５８１（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開平１０－２３１３７３（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２０１９－００４７４５（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２００６－３１４２８５（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２０１４／０５０７４６（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１９／０２２０００（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１９／０２１９９９（ＷＯ，Ａ１）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｍ １／００－ ３／１０

Ｃ１２Ｎ １／００－ ７／０８

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

主鎖と、グラフト鎖とを有する合成樹脂を含み、
前記合成樹脂が、ポリビニルアセタール骨格を有し、
前記グラフト鎖が、下記式（２）又は下記式（３）で表される多座水素結合性基を側鎖に有する、細胞培養用足場材料。

【化1】

前記式（２）中、Ｒ _１ は芳香族環骨格又は脂環式骨格を有しかつ炭素数が５０以下である基を表し、Ａ _１ 及びＡ _２ は、それぞれアミノ基又は水酸基を表し、＊は前記グラフト鎖を構成する他の原子との結合部位を表す。Ａ _１ 及びＡ _２ は、それぞれ同一であってもよく、異なっていてもよい。

【化2】

前記式（３）中、Ｒ _１ は芳香族環骨格又は脂環式骨格を有しかつ炭素数が５０以下である基を表し、Ｒ _２ はホウ素原子、リン原子、ケイ素原子、窒素原子、又は金属原子を表し、Ａ _１ 及びＡ _２ は、それぞれアミノ基又は水酸基を表し、＊は前記グラフト鎖を構成する他の原子との結合部位を表す。Ａ _１ 及びＡ _２ は、それぞれ同一であってもよく、異なっていてもよい。

【請求項2】

前記多座水素結合性基が、水酸基を１個以上有する、請求項１に記載の細胞培養用足場材料。

【請求項3】

前記多座水素結合性基が、水酸基を２個以上有する、請求項１又は２に記載の細胞培養用足場材料。

【請求項4】

前記多座水素結合性基が、カテコール骨格、フェニレンジアミン骨格、フェニルボロン酸骨格、及びナフタレンボロン酸骨格からなる群から選ばれる少なくとも１種の骨格を有する、請求項１～３のいずれか１項に記載の細胞培養用足場材料。

【請求項5】

前記合成樹脂が、ポリビニルアセタール樹脂と、前記多座水素結合性基を有するモノマーとのグラフト共重合体であるか、又は、前記合成樹脂が、ポリビニルアセタール樹脂と、前記多座水素結合性基を有するモノマーと、前記多座水素結合性基を有するモノマー以外のモノマーとのグラフト共重合体である、請求項１～４のいずれか１項に記載の細胞培養用足場材料。

【請求項6】

動物由来の原料を実質的に含まない、請求項１～５のいずれか１項に記載の細胞培養用足場材料。

【請求項7】

前記合成樹脂の全構造単位１００モル％中、前記多座水素結合性基を有する構造単位の割合が、１モル％以上、３０モル％以下である、請求項１～６のいずれか１項に記載の細胞培養用足場材料。

【請求項8】

容器本体と、
請求項１～７のいずれか１項に記載の細胞培養用足場材料とを備え、
前記容器本体の表面上に、前記細胞培養用足場材料が配置されている、細胞培養用容器。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、細胞を培養するために用いられる細胞培養用足場材料に関する。また、本発明は、上記細胞培養用足場材料を用いた細胞培養用容器に関する。

【背景技術】

【0002】

学術分野、創薬分野及び再生医療分野等の研究開発において、ヒト、マウス、ラット、ブタ、ウシ及びサル等の動物細胞が用いられている。動物細胞を培養するために用いられる足場材料として、ラミニン及びビトロネクチン等の接着タンパク質、並びにマウス肉腫由来のマトリゲル等の天然高分子材料が用いられている。

【0003】

また、下記の特許文献１～３に示すように合成樹脂を用いた足場材料も知られている。

【0004】

下記の特許文献１には、ポリビニルアセタール化合物からなる成形物又は該ポリビニルアセタール化合物と水溶性多糖類とからなる成形物からなり、該ポリビニルアセタール化合物のアセタール化度が２０～６０モル％である細胞培養用担体が開示されている。

【0005】

また、下記の特許文献２には、第１の繊維ポリマー足場材を含み、該第１の繊維ポリマー足場材の繊維が整列されている組成物（足場材料）が開示されている。この繊維ポリマーの材料として、脂肪族ポリエステル等が用いられている。

【0006】

また、下記の特許文献３には、多能性幹細胞の未分化性を維持するための細胞培養方法であって、ポリロタキサンブロック共重合体で被覆された表面を有する培養器上で該多能性幹細胞を培養する工程を含む方法が開示されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0007】

【文献】特開２００６－３１４２８５号公報

【文献】ＷＯ２００７／０９０１０２Ａ１

【文献】特開２０１７－０２３００８号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

動物細胞の培養では、細胞塊を足場材料に播種して培養することがある。足場材料として天然高分子材料を用いることで、播種後の細胞の定着性を高めることができる。しかしながら、天然高分子材料は、高価であったり、天然由来物質であるためロット間のばらつきが大きかったり、動物由来の成分による安全上の懸念があったりする。

【0009】

一方、特許文献１～３に記載のような合成樹脂を用いた足場材料は、天然高分子材料を用いた足場材料と比べて、安価であり、ロット間のばらつきが小さく、かつ安全性に優れる。しかしながら、特許文献１～３に記載のような従来の合成樹脂を用いた足場材料では、合成樹脂と細胞との親和性が低かったり、親水性が高い合成樹脂が用いられているために該合成樹脂が過度に膨潤したりして、播種した細胞塊が培養中に足場材料から剥離しやすく、細胞の定着性が低いという問題がある。

【0010】

本発明の目的は、細胞の定着性に優れる細胞培養用足場材料を提供することである。また、本発明は、上記細胞培養用足場材料を用いた細胞培養用容器を提供することも目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0011】

本発明の広い局面によれば、主鎖と、グラフト鎖とを有する合成樹脂を含み、前記グラフト鎖が、下記式（１）で表される多座水素結合性基を側鎖に有する、細胞培養用足場材料が提供される。

【0012】

【化1】

【0013】

前記式（１）中、Ｒは炭素数が５０以下である基を表し、Ａ_ｉはアミノ基、カルボキシル基、水酸基、スルホン基、イミノ基、又はチオール基を表し、ｉは自然数を表し、ｎは２以上、４以下の整数を表し、＊は前記グラフト鎖を構成する他の原子との結合位置を表す。Ａ_ｉは、それぞれ同一であってもよく、異なっていてもよい。

【0014】

本発明に係る細胞培養用足場材料のある特定の局面では、前記多座水素結合性基が、下記式（２）、下記式（３）又は下記式（４）で表される多座水素結合性基である。

【0015】

【化2】

【0016】

前記式（２）中、Ｒ_１は環状骨格を有しかつ炭素数が５０以下である基を表し、Ａ_１及びＡ_２は、それぞれアミノ基、カルボキシル基、水酸基、スルホン基、イミノ基、又はチオール基を表し、＊は前記グラフト鎖を構成する他の原子との結合部位を表す。Ａ_１及びＡ_２は、それぞれ同一であってもよく、異なっていてもよい。

【0017】

【化3】

【0018】

前記式（３）中、Ｒ_１は環状骨格を有しかつ炭素数が５０以下である基を表し、Ｒ_２はホウ素原子、リン原子、ケイ素原子、窒素原子、又は金属原子を表し、Ａ_１及びＡ_２は、それぞれアミノ基、カルボキシル基、水酸基、スルホン基、イミノ基、又はチオール基を表し、＊は前記グラフト鎖を構成する他の原子との結合部位を表す。Ａ_１及びＡ_２は、それぞれ同一であってもよく、異なっていてもよい。

【0019】

【化4】

【0020】

前記式（４）中、Ｒ_３は鎖状骨格を有しかつ炭素数が５０以下である基を表し、Ａ_１及びＡ_２は、それぞれアミノ基、カルボキシル基、水酸基、スルホン基、イミノ基、又はチオール基を表し、＊は前記グラフト鎖を構成する他の原子との結合部位を表す。Ａ_１及びＡ_２は、それぞれ同一であってもよく、異なっていてもよい。

【0021】

本発明に係る細胞培養用足場材料のある特定の局面では、前記多座水素結合性基が、前記式（２）又は前記式（３）で表される多座水素結合性基である。

【0022】

本発明に係る細胞培養用足場材料のある特定の局面では、前記多座水素結合性基が、アミノ基、カルボキシル基、及び水酸基からなる群から選ばれる少なくとも１種の官能基を２個以上有する。

【0023】

本発明に係る細胞培養用足場材料のある特定の局面では、前記多座水素結合性基が、カテコール骨格、フェニレンジアミン骨格、フェニルボロン酸骨格、ナフタレンボロン酸骨格、グリセロール骨格、エチレングリコール骨格、及びグリシン誘導体骨格からなる群から選ばれる少なくとも１種の骨格を有する。

【0024】

本発明に係る細胞培養用足場材料のある特定の局面では、前記細胞培養用足場材料は、動物由来の原料を実質的に含まない。

【0025】

本発明に係る細胞培養用足場材料のある特定の局面では、前記合成樹脂の全構造単位１００モル％中、前記多座水素結合性基を有する構造単位の割合が、１モル％以上、３０モル％以下である。

【0026】

本発明に係る細胞培養用足場材料のある特定の局面では、前記合成樹脂が、ポリビニルアルコール誘導体又はポリ（メタ）アクリル酸エステル誘導体である。

【0027】

本発明に係る細胞培養用足場材料のある特定の局面では、前記合成樹脂が、ポリビニルアセタール骨格又はポリ（メタ）アクリル酸エステル骨格を有する。

【0028】

本発明に係る細胞培養用足場材料のある特定の局面では、前記合成樹脂が、ポリビニルアセタール骨格を有する。

【0029】

本発明の広い局面によれば、容器本体と、上述した細胞培養用足場材料とを備え、前記容器本体の表面上に、前記細胞培養用足場材料が配置されている、細胞培養用容器が提供される。

【発明の効果】

【0030】

本発明によれば、細胞の定着性に優れる細胞培養用足場材料を提供することができる。また、本発明によれば、上記細胞培養用足場材料を用いた細胞培養用容器を提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【0031】

【図1】図１は、本発明の一実施形態に係る細胞培養用容器を模式的に示す断面図である。

【図2】図２は、本発明に係る細胞培養用足場材料を用いて細胞を培養した場合に、細胞の定着性が向上する推定メカニズムを説明するための模式図である。

【発明を実施するための形態】

【0032】

以下、本発明の詳細を説明する。

【0033】

（多座水素結合性基）

本発明に係る細胞培養用足場材料は、細胞を培養するために用いられる。本発明に係る細胞培養用足場材料は、グラフト鎖の側鎖に下記式（１）で表される多座水素結合性基（以下、「多座水素結合性基」と略記することがある）を有する合成樹脂を含む。上記多座水素結合性基とは、２以上の水素結合を形成可能な基である。

【0034】

【化4】

上記式（１）中、Ｒは炭素数が５０以下である基を表し、Ａ_ｉはアミノ基、カルボキシル基、水酸基、スルホン基、イミノ基、又はチオール基を表し、ｉは自然数を表し、ｎは２以上、４以下の整数を表し、＊は上記グラフト鎖を構成する他の原子との結合位置を表す。上記式（１）中、Ａ_ｉは、それぞれ同一であってもよく、異なっていてもよい。

【0035】

上記式（１）中、Ｒは環状骨格を有する基であってもよく、鎖状骨格を有する基であってもよい。細胞の定着性をより一層高める観点から、上記式（１）中、Ｒは環状骨格を有する基であることが好ましい。

【0036】

本発明の効果をより一層効果的に発揮させる観点からは、上記式（１）中、Ｒの炭素数は、好ましくは４５以下、より好ましくは３０以下、さらに好ましくは２０以下である。

【0037】

上記式（１）中、Ａ_ｉはアミノ基、カルボキシル基、水酸基、スルホン基、イミノ基、又はチオール基である。本発明の効果をより一層効果的に発揮させる観点からは、上記式（１）中、Ａ_ｉは、アミノ基、カルボキシル基、及び水酸基からなる群から選ばれる少なくとも１種の官能基であることが好ましく、アミノ基及び水酸基からなる群から選ばれる少なくとも１種の官能基であることがより好ましく、水酸基であることがさらに好ましい。

【0038】

本発明の効果をより一層効果的に発揮させる観点からは、上記式（１）で表される多座水素結合性基は、アミノ基、カルボキシル基、及び水酸基からなる群から選ばれる少なくとも１種の官能基を１個以上有することが好ましく、２個以上有することがより好ましい。本発明の効果を更に一層効果的に発揮させる観点からは、上記式（１）で表される多座水素結合性基は、アミノ基及び水酸基からなる群から選ばれる少なくとも１種の官能基を１個以上有することが好ましく、水酸基を１個以上有することがより好ましく、水酸基を２個以上有することがさらに好ましい。

【0039】

上記式（１）中、ｎは２以上、４以下の整数である。本発明の効果をより一層効果的に発揮させる観点からは、上記式（１）中、ｎは、好ましくは２又は３であり、より好ましくは２である。したがって、上記多座水素結合性基は、Ａ_ｉを２個又は３個有することが好ましく、２個有することがより好ましい。

【0040】

また、本発明の効果をより一層効果的に発揮させる観点からは、上記式（１）中、任意のＡ_ｉと、その隣りのＡ_ｉとの間に存在する原子数は、好ましくは４個以下、より好ましくは３個以下、さらに好ましくは２個又は１個である。

【0041】

なお、上記式（１）中、任意のＡ_ｉと、その隣りのＡ_ｉとの間に存在する原子数とは、これら２個のＡ_ｉを最短で結ぶ原子数を意味する。例えば、任意のＡ_ｉと、その隣りのＡ_ｉとの間に存在する原子数が２個であるとは、一方のＡ_ｉが結合している原子と、他方のＡ_ｉが結合している原子とが結合していることを意味する。また、例えば、任意のＡ_ｉと、その隣りのＡ_ｉとの間に存在する原子数が１個であるとは、一方のＡ_ｉと他方Ａ_ｉとが、同一の原子に結合していることを意味する。

【0042】

本発明の効果をより一層効果的に発揮させる観点からは、上記式（１）で表される多座水素結合性基は、下記式（２）、下記式（３）又は下記式（４）で表される多座水素結合性基であることが好ましく、下記式（２）又は下記式（３）で表される多座水素結合性基であることがより好ましい。

【0043】

【化5】

上記式（２）中、Ｒ_１は環状骨格を有しかつ炭素数が５０以下である基を表し、Ａ_１及びＡ_２は、それぞれアミノ基、カルボキシル基、水酸基、スルホン基、イミノ基、又はチオール基を表し、＊は上記グラフト鎖を構成する他の原子との結合部位を表す。上記式（２）中、Ａ_１及びＡ_２は、それぞれ同一であってもよく、異なっていてもよい。

【0044】

上記式（２）中、Ｒ_１としては、例えば、芳香族環を有する基及び脂肪族環を有する基等が挙げられる。なお、脂肪族環は、環の一部に二重結合を有していてもよい。

【0045】

上記芳香族環を有する基としては、例えば、フェニル骨格を有する基、ナフチル骨格を有する基及びアントリル骨格を有する基等が挙げられる。細胞との接着性を高める観点から、上記芳香族環を有する基は、フェニル骨格を有する基又はナフチル骨格を有する基であることが好ましく、フェニル骨格を有する基であることがより好ましい。

【0046】

上記脂肪族環を有する基としては、例えば、シクロブチル基、シクロペンチル基及びシクロヘキシル基等が挙げられる。細胞との接着性を高める観点から、上記脂肪族環を有する基は、シクロペンチル基又はシクロへキシル基であることが好ましい。

【0047】

また、本発明の効果をより一層効果的に発揮させる観点からは、上記式（２）中、Ａ_１とＡ_２との間に存在する原子数は、好ましくは４個以下、より好ましくは３個以下、さらに好ましくは２個である。

【0048】

なお、上記式（２）中、Ａ_１とＡ_２との間に存在する原子数とは、Ａ_１とＡ_２とを最短で結ぶ原子数を意味する。例えば、Ａ_１とＡ_２との間に存在する原子数が２個であるとは、Ａ_１が結合している原子と、Ａ_２が結合している原子とが結合していることを意味する。

【0049】

本発明の効果をより一層効果的に発揮させる観点からは、上記式（２）中、Ａ_１及びＡ_２は、Ｒ_１の環状骨格を構成する２つの隣り合う原子にそれぞれ結合していることが特に好ましい。

【0050】

上記式（２）で表される多座水素結合性基としては、例えば、カテコール骨格を有する基、フェニレンジアミン骨格を有する基等が挙げられる。細胞の定着性を高める観点から、上記式（２）で表される多座水素結合性基は、カテコール骨格を有する基であることが好ましい。

【0051】

【化6】

上記式（３）中、Ｒ_１は環状骨格を有しかつ炭素数が５０以下である基を表し、Ｒ_２はホウ素原子、リン原子、ケイ素原子、窒素原子、又は金属原子を表し、Ａ_１及びＡ_２は、それぞれアミノ基、カルボキシル基、水酸基、スルホン基、イミノ基、又はチオール基を表し、＊は上記グラフト鎖を構成する他の原子との結合部位を表す。上記式（３）中、Ａ_１及びＡ_２は、それぞれ同一であってもよく、異なっていてもよい。

【0052】

上記式（３）中、上記金属原子としては、白金原子及びアルミニウム原子等が挙げられる。

【0053】

本発明の効果をより一層効果的に発揮させる観点からは、上記式（３）中、Ｒ_２は、ホウ素原子、リン原子、ケイ素原子、又は窒素原子であることが好ましく、ホウ素原子であることがより好ましい。

【0054】

上記式（３）で表される多座水素結合性基としては、例えば、フェニルボロン酸骨格を有する基、ナフタレンボロン酸骨格を有する基等が挙げられる。細胞の定着性を高める観点から、上記式（３）で表される多座水素結合性基は、フェニルボロン酸骨格を有する基であることが好ましい。

【0055】

【化7】

上記式（４）中、Ｒ_３は鎖状骨格を有しかつ炭素数が５０以下である基を表し、Ａ_１及びＡ_２、それぞれアミノ基、カルボキシル基、水酸基、スルホン基、イミノ基、又はチオール基を表し、＊は上記グラフト鎖を構成する他の原子との結合部位を表す。上記式（４）中、Ａ_１及びＡ_２は、それぞれ同一であってもよく、異なっていてもよい。

【0056】

上記式（４）中、Ｒ_３は、直鎖である鎖状骨格を有する基であってもよく、分岐鎖を有する鎖状骨格を有する基であってもよい。上記Ｒ_３としては、例えば、炭素数が５０以下であるアルキル基が挙げられる。

【0057】

また、本発明の効果をより一層効果的に発揮させる観点からは、上記式（４）中、Ａ_１とＡ_２との間に存在する原子数は、好ましくは４個以下、より好ましくは３個以下、さらに好ましくは２個である。

【0058】

なお、上記式（４）中、Ａ_１とＡ_２との間に存在する原子数とは、Ａ_１とＡ_２とを最短で結ぶ原子数を意味する。例えば、Ａ_１とＡ_２との間に存在する原子数２個であるとは、Ａ_１が結合している原子と、Ａ_２が結合している原子とが結合していることを意味する。

【0059】

上記式（４）で表される多座水素結合性基としては、例えば、グリセロール骨格を有する基、エチレングリコール骨格を有する基、グリシン誘導体骨格（末端の炭素にカルボキシル基とアミノ基が結合している構造）を有する基等が挙げられる。

【0060】

本発明の効果をより一層効果的に発揮させる観点からは、上記多座水素結合性基は、環状骨格を有することが好ましい。上記環状骨格としては、芳香族環骨格、及び脂環式骨格等が挙げられる。該脂環式骨格は二重結合を有しない飽和脂環式骨格であってもよく、二重結合を有する不飽和脂環式骨格であってもよい。また、上記環状骨格は、該環状骨格を構成する原子に、炭素原子以外の原子を含んでいてもよい。

【0061】

上記環状骨格を構成している原子の数は、好ましくは５個以上、より好ましくは１０個以上、好ましくは４０個以下、より好ましくは３０個以下である。

【0062】

本発明の効果をより一層効果的に発揮させる観点からは、上記多座水素結合性基は、カテコール骨格、フェニレンジアミン骨格、フェニルボロン酸骨格、ナフタレンボロン酸骨格、グリセロール骨格、エチレングリコール骨格、及びグリシン誘導体骨格からなる群から選ばれる少なくとも１種の骨格を有することが好ましい。

【0063】

上記多座水素結合性基が環状骨格を有する場合に、水素結合性官能基（Ａ_ｉ）は、該環状骨格を構成する原子に直接結合していてもよく、直接結合していなくてもよい。

【0064】

上記多座水素結合性基が環状骨格を有する場合に、上記多座水素結合性基は、環状骨格に直接結合した水素結合性官能基を有するか、又は、環状骨格に１個の原子を介して結合した水素結合性官能基を有することが好ましい。この場合には、本発明の効果を更に効果的に発揮することができる。

【0065】

（合成樹脂Ｘ）

本発明に係る細胞培養用足場材料は、主鎖と、グラフト鎖とを有し、上記グラフト鎖が上記式（１）で表される多座水素結合性基を側鎖に有する合成樹脂（以下、「合成樹脂Ｘ」と記載することがある）を含む。したがって、本発明に係る細胞培養用足場材料は、合成樹脂Ｘを含む。合成樹脂Ｘは、複合樹脂であってもよい。上記合成樹脂Ｘは、１種のみが用いられてもよく、２種以上が併用されてもよい。また、上記合成樹脂Ｘは、上記多座水素結合性基を１種のみ有していてもよく、２種以上有していてもよい。

【0066】

上記多座水素結合性基は、グラフト鎖の主鎖に直接結合していてもよく、グラフト鎖の主鎖に他の基を介して結合していてもよい。

【0067】

合成樹脂Ｘは、例えば、以下の（１）又は（２）の方法により合成することができる。

【0068】

（１）主鎖のポリマーに対して、多座水素結合性基を有するモノマー、又は、多座水素結合性基を有するモノマーと多座水素結合性基を有さないモノマーとの混合モノマーをグラフト重合させる方法。

【0069】

（２）主鎖のポリマーに対して、側鎖に多座水素結合性基を有するポリマーを縮合等によって枝状に結合させる方法。

【0070】

上記多座水素結合性基を有するモノマー及び上記多座水素結合性基を有さないモノマーとしては、ビニル化合物、（メタ）アクリルモノマー及びマレイミド化合物等が挙げられる。上記モノマーは１種のみが用いられてもよく、２種以上が併用されてもよい。合成樹脂Ｘを合成する際には、上記式（１）で表される多座水素結合性基を有するモノマーを、少なくとも１種用いることが好ましい。

【0071】

上記多座水素結合性基を有するモノマーとしては、（メタ）アクリロイル基を有し、かつ、アミノ基、カルボキシル基、水酸基、スルホン基、イミノ基、及びチオール基からなる群から選ばれる少なくとも１種以上の官能基を２個以上有するモノマー等が挙げられる。このような多座水素結合性基を有するモノマーとしては、例えば、ドーパミンアクリルアミド、４－メタクリルアミドフェニルボロン酸、グリセロールモノメタクリレート、ＤＬ－２－アリルグリシン、ビニルカテコール、３－メタクリルアミドフェニルボロン酸、２－［２－ヒドロキシ－５－［２－（メタクリロイルオキシ）エチル］フェニル］－２Ｈ－ベンゾトリアゾール等が挙げられる。

【0072】

本発明に係る細胞培養用足場材料は、上記多座水素結合性基を有する合成樹脂Ｘを含むので、該多座水素結合性基と細胞（例えば、膜タンパク質、リン脂質、糖鎖、糖タンパク質、細胞外マトリックス及び接着タンパク質）とを良好に水素結合させることができ、かつ該水素結合の数を多くすることができる。そのため、本発明では、合成樹脂Ｘと細胞との親和性が高められ、その結果、細胞が細胞培養用足場材料から剥離しにくく、細胞の定着性を高めることができる。

【0073】

また、本発明に係る細胞培養用足場材料は、従来の天然高分子を用いた細胞足場材料と比べて、安価であり、ロット間のばらつきが小さく、安全性に優れる。

【0074】

図２は、本発明に係る細胞培養用足場材料を用いて細胞を培養した場合に、細胞の定着性が向上する推定メカニズムを説明するための模式図である。

【0075】

図２に示すように、細胞１０は、細胞膜上に膜タンパク質及び糖鎖を有する化合物等の水素結合を形成可能な物質１１を有する。また、本発明に係る細胞培養用足場材料２０は、上記多座水素結合性基を有する合成樹脂Ｘを含む。細胞を細胞培養用足場材料２０の表面に播種すると、上記多座水素結合性基と、細胞膜に存在する膜タンパク質及び糖鎖との間で、１つの多座水素結合性基あたり、２以上の水素結合３０が形成される。これによって、上記多座水素結合性基を介して、細胞１０と細胞培養用足場材料２０との間に強固な結合が形成される。従って、細胞と細胞培養用足場材料との接着性が向上し、その結果、細胞の定着性が向上するものと考えられる。

【0076】

また、本発明では、合成樹脂Ｘがグラフト鎖の側鎖に上記多座水素結合性基を有するので、細胞との接着性が向上しやすくなる。このメカニズムの詳細は不明であるが、同一のグラフト鎖に配置された複数の上記多座水素結合性基がクラスターを形成し、上記多座水素結合性基を介して、細胞と細胞培養用足場材料との間に強固な水素結合を形成するためと考えられる。

【0077】

上記合成樹脂Ｘとしては、ポリオレフィン誘導体、ポリエーテル誘導体、ポリビニルアルコール誘導体、ポリエステル誘導体、ポリ（メタ）アクリル酸エステル誘導体、エポキシ樹脂誘導体、ポリアミド誘導体、ポリイミド誘導体、ポリウレタン誘導体、ポリカーボネート誘導体、セルロース誘導体、及びポリペプチド誘導体等が挙げられる。

【0078】

本発明の効果を効果的に発揮させる観点からは、上記合成樹脂Ｘは、ポリビニルアルコール誘導体又はポリ（メタ）アクリル酸エステル誘導体であることが好ましい。上記ポリビニルアルコール誘導体は、少なくともビニルアルコールをモノマーとして用いて合成される合成樹脂である。上記ポリ（メタ）アクリル酸エステル誘導体は、少なくともアクリル酸エステルをモノマーとして用いて合成される合成樹脂である。

【0079】

上記ポリビニルアルコール誘導体は、ポリビニルアセタール骨格を有する樹脂であることが好ましい。

【0080】

したがって、合成樹脂Ｘは、ポリビニルアセタール骨格又はポリ（メタ）アクリル酸エステル骨格を有することが好ましい。この場合に、合成樹脂Ｘは、ポリビニルアセタール骨格を有する樹脂であってもよく、ポリ（メタ）アクリル酸エステル骨格を有する樹脂であってもよく、ポリビニルアセタール骨格とポリ（メタ）アクリル酸エステル骨格との双方を有する樹脂であってもよい。

【0081】

本発明の効果を効果的に発揮させる観点からは、合成樹脂Ｘは、ポリビニルアセタール骨格を有する樹脂であるか、又はポリビニルアセタール骨格とポリ（メタ）アクリル酸エステル骨格とを有する樹脂であることが好ましい。合成樹脂Ｘは、少なくともポリビニルアセタール骨格を有する樹脂であることが好ましい。

【0082】

合成樹脂Ｘの全構造単位１００モル％中、上記多座水素結合性基を有する構造単位の割合（上記多座水素結合性基を有する構造単位の含有率）は、好ましくは１モル％以上、より好ましくは５モル％以上、好ましくは３０モル％以下、より好ましくは２０モル％以下である。上記割合が上記下限以上及び上記上限以下であると、本発明の効果をより一層効果的に発揮させることができる。上記多座水素結合性基を有する構造単位は、例えば、多座水素結合性基を有するモノマーに由来する構造単位である。

【0083】

上記多座水素結合性基を有する構造単位の割合は、^１Ｈ－ＮＭＲ（核磁気共鳴スペクトル）により測定することができる。

【0084】

細胞培養用足場材料１００重量％中、上記合成樹脂Ｘの含有量は、好ましくは７０重量％以上、より好ましくは７５重量％以上、更に好ましくは８０重量％以上、特に好ましくは９０重量％以上、最も好ましくは１００重量％（全量）である。したがって、上記細胞培養用足場材料は、合成樹脂Ｘであることが最も好ましい。上記合成樹脂Ｘの含有量が上記下限以上であると、本発明の効果をより一層効果的に発揮させることができる。

【0085】

＜ポリビニルアセタール骨格を有する合成樹脂Ｘ＞

細胞培養用足場材料は、ポリビニルアセタール骨格を有する合成樹脂Ｘを含むことが好ましい。

【0086】

本明細書において、「ポリビニルアセタール骨格を有する合成樹脂Ｘ」を、「ポリビニルアセタール樹脂Ｘ」と記載することがある。

【0087】

したがって、ポリビニルアセタール樹脂Ｘは、ポリビニルアセタール骨格及び多座水素結合性基を有する樹脂である。

【0088】

ポリビニルアセタール樹脂Ｘは、側鎖にアセタール基と、アセチル基と、水酸基とを有する。また、ポリビニルアセタール樹脂Ｘは、多座水素結合性基を有する。

【0089】

ポリビニルアセタール樹脂Ｘを合成する際には、ポリビニルアルコールをアルデヒドによりアセタール化する工程を少なくとも備える。

【0090】

ポリビニルアセタール樹脂Ｘ、又は、ポリビニルアセタール樹脂（多座水素結合性基を有するモノマー重合前）の平均重合度は、好ましくは１００以上、より好ましくは２００以上、更に好ましくは５００以上、特に好ましくは１５００以上、好ましくは６０００以下、より好ましくは３０００以下、更に好ましくは２５００以下である。上記平均重合度が上記下限以上であると、液体培地による膨潤を効果的に抑えることができるため、細胞培養用足場材料の強度を良好に維持することできる。そのため、細胞増殖性を高めることができる。また、上記平均重合度が上記上限以下であると、取扱性を高めることができ、細胞培養用足場材料の成形性を高めることができる。

【0091】

ポリビニルアセタール樹脂Ｘ、又は、ポリビニルアセタール樹脂（多座水素結合性基を有するモノマー重合前）の数平均分子量（Ｍｎ）は、好ましくは１００００以上、好ましくは６０００００以下である。ポリビニルアセタール樹脂Ｘ、又は、ポリビニルアセタール樹脂（多座水素結合性基を有するモノマー重合前）の重量平均分子量（Ｍｗ）は、好ましくは２０００以上、好ましくは１２０００００以下である。また、ポリビニルアセタール樹脂Ｘ、又は、ポリビニルアセタール樹脂（多座水素結合性基を有するモノマー重合前）において、数平均分子量（Ｍｎ）に対する重量平均分子量（Ｍｗ）の比（Ｍｗ／Ｍｎ）は、好ましくは２．０以上、好ましくは４０以下である。上記Ｍｎ、上記Ｍｗ、上記Ｍｗ／Ｍｎが上記下限以上及び上記上限以下であると、細胞培養用足場材料の強度を高めることができる。

【0092】

ポリビニルアセタール樹脂Ｘ、又は、ポリビニルアセタール樹脂（多座水素結合性基を有するモノマー重合前）のアセタール化度（ポリビニルブチラール樹脂の場合にはブチラール化度）は、好ましくは６０モル％以上、より好ましくは６５モル％以上、好ましくは９０モル％以下、より好ましくは８５モル％以下である。上記アセタール化度が上記下限以上であると、細胞の定着性をより高めることができ、細胞が効率よく増殖する。上記アセタール化度が上記上限以下であると、溶剤への溶解性を良好にすることができる。

【0093】

上記ポリビニルアセタール樹脂Ｘ、又は、ポリビニルアセタール樹脂（多座水素結合性基を有するモノマー重合前）のアセチル化度（アセチル基量）は、好ましくは０．０００１モル％以上、好ましくは５モル％以下である。

【0094】

上記ポリビニルアセタール樹脂Ｘ、又は、ポリビニルアセタール樹脂（多座水素結合性基を有するモノマー重合前）の水酸基の含有率（水酸基量）は、好ましくは１モル％以上、より好ましくは１０モル％以上、好ましくは８０モル％以下、より好ましくは６０モル％以下である。

【0095】

上記ポリビニルアセタール樹脂Ｘ、又は、多座水素結合性基を有するモノマー重合前のポリビニルアセタール樹脂のアセタール化度、アセチル化度（アセチル基量）及び水酸基量は、^１Ｈ－ＮＭＲ（核磁気共鳴スペクトル）により測定することができる。

【0096】

上記ポリビニルアセタール樹脂Ｘは、例えば、以下の（１）又は（２）の方法により合成することができる。（１）ポリビニルアセタール樹脂に、多座水素結合性基を有するモノマー、又は、多座水素結合性基を有するモノマーと多座水素結合性基を有さないモノマーとの混合モノマーをグラフト重合させる方法。（２）ポリビニルアセタール樹脂に、側鎖に多座水素結合性基を有するポリマーを縮合等によって枝状に結合させる方法。

【0097】

アセタール化度、水酸基量及びアセチル基量等の含有率の調整が容易であることから、ポリビニルアセタール樹脂Ｘは、ポリビニルアセタール樹脂と、多座水素結合性基を有するモノマーとのグラフト共重合体であることが好ましい。また、ポリビニルアセタール樹脂Ｘは、ポリビニルアセタール樹脂と、多座水素結合性基を有するモノマーと、上記多座水素結合性基を有するモノマー以外のモノマーとのグラフト共重合体であることがより好ましい。この場合、ポリビニルアセタール樹脂Ｘに含まれる多座水素結合性基と細胞とが結合しやすくなるため、細胞の定着性をより高めることができる。

【0098】

上記多座水素結合性基を有するモノマーとしては、上述したモノマーが挙げられる。

【0099】

上記多座水素結合性基を有するモノマー以外のモノマーとしては、多座水素結合性基を有さないビニル化合物等が挙げられる。

【0100】

上記多座水素結合性基を有さないビニル化合物としては、エチレン、アリルアミン、ビニルピロリドン、無水マレイン酸、マレイミド、イタコン酸、多座水素結合性基を有さない（メタ）アクリル酸、ビニルアミン及び多座水素結合性基を有さない（メタ）アクリル酸エステル等が挙げられる。上記多座水素結合性基を有さないビニル化合物は、１種のみが用いられてもよく、２種以上が併用されてもよい。なお、ポリビニルアセタール樹脂と（メタ）アクリル酸エステルとの共重合体については、後述する。

【0101】

＜ポリ（メタ）アクリル酸エステル骨格を有する合成樹脂Ｘ＞

細胞培養用足場材料は、ポリ（メタ）アクリル酸エステル骨格を有する合成樹脂Ｘを含むことが好ましい。

【0102】

本明細書において、「ポリ（メタ）アクリル酸エステル骨格を有する合成樹脂Ｘ」を、「ポリ（メタ）アクリル酸エステル樹脂Ｘ」と記載することがある。

【0103】

したがって、ポリ（メタ）アクリル酸エステル樹脂Ｘは、ポリ（メタ）アクリル酸エステル骨格及び多座水素結合性基を有する樹脂である。

【0104】

上記ポリ（メタ）アクリル酸エステル樹脂Ｘは、（メタ）アクリル酸エステルと、上記多座水素結合性基を有するモノマーとを重合することにより得られる。なお、上記ポリ（メタ）アクリル酸エステル樹脂Ｘは、上記（メタ）アクリル酸エステルと、上記多座水素結合性基を有するモノマーと、（メタ）アクリル酸エステル及び多座水素結合性基を有するモノマーの双方とは異なるモノマーとを共重合した樹脂であってもよい。

【0105】

上記（メタ）アクリル酸エステルとしては、（メタ）アクリル酸アルキルエステル、（メタ）アクリル酸環状アルキルエステル、（メタ）アクリル酸アリールエステル、（メタ）アクリルアミド類、（メタ）アクリル酸ポリエチレングリコール類、及び（メタ）アクリル酸ホスホリルコリン等が挙げられる。

【0106】

上記（メタ）アクリル酸アルキルエステルとしては、メチル（メタ）アクリレート、エチル（メタ）アクリレート、ｎ－プロピル（メタ）アクリレート、イソプロピル（メタ）アクリレート、ｎ－ブチル（メタ）アクリレート、イソブチル（メタ）アクリレート、ｔ－ブチル（メタ）アクリレート、ｎ－オクチル（メタ）アクリレート、イソオクチル（メタ）アクリレート、２－エチルヘキシル（メタ）アクリレート、ノニル（メタ）アクリレート、イソノニル（メタ）アクリレート、デシル（メタ）アクリレート、イソデシル（メタ）アクリレート、ラウリル（メタ）アクリレート、ステアリル（メタ）アクリレート、及びイソテトラデシル（メタ）アクリレート等が挙げられる。

【0107】

なお、上記（メタ）アクリル酸アルキルエステルは、炭素数１～３のアルコキシ基及びテトラヒドロフルフリル基等の置換基で置換されていてもよい。このような（メタ）アクリル酸アルキルエステルの例としては、メトキシエチルアクリレート、テトラヒドロフルフリルアクリレート等が挙げられる。

【0108】

上記（メタ）アクリル酸環状アルキルエステルとしては、シクロヘキシル（メタ）アクリレート、及びイソボルニル（メタ）アクリレート等が挙げられる。

【0109】

上記（メタ）アクリル酸アリールエステルとしては、フェニル（メタ）アクリレート、及びベンジル（メタ）アクリレート等が挙げられる。

【0110】

上記（メタ）アクリルアミド類としては、（メタ）アクリルアミド、Ｎ－イソプロピル（メタ）アクリルアミド、Ｎ－ｔｅｒｔ－ブチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ’－ジメチル（メタ）アクリルアミド、(３－（メタ）アクリルアミドプロピル)トリメチルアンモニウムクロリド、４－（メタ）アクリロイルモルホリン、３－（メタ）アクリロイル－２－オキサゾリジノン、Ｎ－[３－(ジメチルアミノ)プロピル]（メタ）アクリルアミド、Ｎ－(２－ヒドロキシエチル)（メタ）アクリルアミド、Ｎ－メチロール（メタ）アクリルアミド、及び６－（メタ）アクリルアミドヘキサン酸等が挙げられる。

【0111】

上記（メタ）アクリル酸ポリエチレングリコール類としては、例えば、メトキシ－ポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、エトキシ－ポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、ヒドロキシ－ポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、メトキシ－ジエチレングリコール（メタ）アクリレート、エトキシ－ジエチレングリコール（メタ）アクリレート、ヒドロキシ－ジエチレングリコール（メタ）アクリレート、メトキシ－トリエチレングルコール（メタ）アクリレート、エトキシ－トリエチレングルコール（メタ）アクリレート、及びヒドロキシ－トリエチレングルコール（メタ）アクリレート等が挙げられる。

【0112】

上記（メタ）アクリル酸ホスホリルコリンとしては、２－（メタ）アクリロイルオキシエチルホスホリルコリン等が挙げられる。

【0113】

上記多座水素結合性基を有するモノマーとしては、上述したモノマーが挙げられる。

【0114】

上記（メタ）アクリル酸エステル及び多座水素結合性基を有するモノマーの双方とは異なるモノマーとしては、（メタ）アクリル酸、エチレン、ビニルエステル等が挙げられる。

【0115】

なお、本明細書において、「（メタ）アクリル」とは、「アクリル」又は「メタクリル」を意味し、「（メタ）アクリレート」とは、「アクリレート」又は「メタクリレート」を意味する。

【0116】

ポリ（メタ）アクリル酸エステル樹脂Ｘの数平均分子量（Ｍｎ）は、好ましくは１００以上、好ましくは２０００００以下である。ポリ（メタ）アクリル酸エステル樹脂Ｘの重量平均分子量（Ｍｗ）は、好ましくは１００以上、好ましくは２０００００以下である。

【0117】

＜ポリビニルアセタール骨格とポリ（メタ）アクリル酸エステル骨格とを有する合成樹脂Ｘ＞

細胞培養用足場材料は、ポリビニルアセタール骨格とポリ（メタ）アクリル酸エステル骨格とを有する合成樹脂Ｘを含むことが好ましい。上記合成樹脂Ｘは、ポリビニルアセタール骨格とポリ（メタ）アクリル酸エステル骨格とを有する複合樹脂であることが好ましい。

【0118】

上記ポリビニルアセタール骨格とポリ（メタ）アクリル酸エステル骨格とを有する合成樹脂Ｘは、ポリビニルアセタール骨格、ポリ（メタ）アクリル酸エステル骨格及び多座水素結合性基を有する樹脂である。

【0119】

上記ポリビニルアセタール骨格とポリ（メタ）アクリル酸エステル骨格とを有する合成樹脂Ｘは、例えば、上述したポリビニルアセタール樹脂Ｘの合成方法及びポリ（メタ）アクリル酸エステル樹脂Ｘの合成方法を適宜組み合わせることにより合成することができる。

【0120】

ポリビニルアセタール骨格とポリ（メタ）アクリル酸エステル骨格とを有する合成樹脂Ｘは、上述したポリビニルアセタール樹脂に上述した（メタ）アクリル酸エステルがグラフト共重合された合成樹脂Ｘであることが好ましい。

【0121】

ポリビニルアセタール骨格とポリ（メタ）アクリル酸エステル骨格とを有する合成樹脂Ｘの数平均分子量（Ｍｎ）は、好ましくは１００００以上、好ましくは６０００００以下である。ポリビニルアセタール骨格とポリ（メタ）アクリル酸エステル骨格とを有する合成樹脂Ｘの重量平均分子量（Ｍｗ）は、好ましくは２０００以上、好ましくは１２０００００以下である。また、ポリビニルアセタール骨格とポリ（メタ）アクリル酸エステル骨格とを有する合成樹脂Ｘにおいて、数平均分子量（Ｍｎ）に対する重量平均分子量（Ｍｗ）の比（Ｍｗ／Ｍｎ）は、好ましくは２．０以上、好ましくは４０以下である。上記Ｍｎ、上記Ｍｗ、上記Ｍｗ／Ｍｎが上記下限以上及び上記上限以下であると、細胞培養用足場材料の強度を高めることができる。

【0122】

合成樹脂Ｘ以外のポリマー：

上記細胞培養用足場材料は、合成樹脂Ｘ以外のポリマーを含んでいてもよい。該ポリマーとしては、ポリオレフィン樹脂、ポリエーテル樹脂、ポリビニルアルコール樹脂、ポリエステル、エポキシ樹脂、ポリアミド樹脂、ポリイミド樹脂、ポリウレタン樹脂、ポリカーボネート樹脂、セルロース、及びポリペプチド等が挙げられる。

【0123】

本発明の効果を効果的に発揮させる観点からは、合成樹脂Ｘ以外のポリマーの含有量は少ないほどよい。上記細胞培養用足場材料１００重量％中、該ポリマーの含有量は、好ましくは２０重量％以下、より好ましくは１０重量％以下、更に好ましくは５重量％以下、特に好ましくは１重量％以下、最も好ましくは０重量％（未含有）である。したがって、細胞培養用足場材料は、合成樹脂Ｘ以外のポリマーを含まないことが最も好ましい。

【0124】

本発明に係る細胞培養用足場材料は、動物由来の原料を実質的に含まないことが好ましい。動物由来の原料を実質的に含まないことにより、ロット間のばらつきが少なく、コスト、安全性に優れる細胞培養用足場材料を提供することができる。なお、「動物由来の原料を実質的に含まない」とは、細胞培養用足場材料中における動物由来の原料が、３重量％以下であることを意味する。本発明に係る細胞培養用足場材料は、細胞培養用足場材料中における動物由来の原料が、１重量％以下であることが好ましく、０重量％であることがより好ましい。すなわち、上記細胞培養用足場材料は、細胞培養用足場材料中に動物由来の原料を含まないことがより好ましい。

【0125】

（細胞培養用足場材料の他の詳細）

本発明に係る細胞培養用足場材料は、細胞を培養するために用いられる。本発明に係る細胞培養用足場材料は、細胞を培養する際の該細胞の足場として用いられる。

【0126】

上記細胞としては、ヒト、マウス、ラット、ブタ、ウシ及びサル等の動物細胞が挙げられる。また、上記細胞としては、体細胞、幹細胞、前駆細胞及び分化細胞等が挙げられる。上記体細胞は、癌細胞であってもよい。

【0127】

上記幹細胞としては、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞、Ｍｕｓｅ細胞、胚性がん細胞、胚性生殖幹細胞、及びｍＧＳ細胞等が挙げられる。

【0128】

上記細胞培養用足場材料の形状は特に限定されない。上記細胞培養用足場材料の形状は、膜状であっても、粒子状であってもよい。膜状には、フィルム状、シート状が含まれる。

【0129】

上記細胞培養用足場材料は、細胞の二次元培養（平面培養）、三次元培養又は浮遊培養に用いられることが好ましく、二次元培養（平面培養）に用いられることがより好ましい。

【0130】

また、上記細胞培養用足場材料は、該細胞培養用足場材料と、多糖類とを含む細胞培養用担体（媒体）として用いることもできる。上記多糖類は、特に限定されず、従来公知の多糖類を用いることができる。上記多糖類は、水溶性多糖類であることが好ましい。

【0131】

また、上記細胞培養用足場材料は、繊維本体と、該繊維本体の表面上に配置された細胞培養用足場材料とを備える細胞培養用繊維として用いることもできる。この場合、細胞培養用足場材料は、繊維本体の表面に塗布されていることが好ましく、塗布物であることが好ましい。この細胞培養用繊維では、繊維本体中に細胞培養用足場材料が存在していてもよい。例えば、繊維本体を液状の細胞培養用足場材料に含浸したり、練り込んだりすることにより細胞培養用足場材料を繊維本体中に存在させることができる。幹細胞は、一般に、平面構造には接着しにくく、線維状構造などの立体構造には接着しやすい性質を有するため、細胞培養用繊維は、幹細胞の三次元培養に好適に用いられる。幹細胞のなかでも、脂肪幹細胞の三次元培養により好適に用いられる。

【0132】

上記細胞培養用足場材料における合成樹脂は、架橋されていてもよい。架橋された合成樹脂を含む細胞培養用足場材料は、水膨潤性が効果的に抑制され、強度を高めることができる。架橋剤を用いることにより、合成樹脂を架橋させることができる。

【0133】

（細胞培養用容器）

本発明に係る細胞培養用容器は、容器本体と、上述した細胞培養用足場材料とを備え、上記容器本体の表面上に、該細胞培養用足場材料が配置されている。

【0134】

図１は、本発明の一実施形態に係る細胞培養用容器を模式的に示す断面図である。

【0135】

細胞培養用容器１は、容器本体２と、細胞培養用足場材料３とを備える。容器本体２の表面２ａ上に細胞培養用足場材料３が配置されている。容器本体２の底面上に細胞培養用足場材料３が配置されている。細胞培養用容器１に液体培地を添加し、また、細胞塊等の細胞を細胞培養用足場材料３の表面に播種することで、細胞を平面培養することができる。

【0136】

なお、容器本体は、第１の容器本体の底面上にカバーガラス等の第２の容器本体を備えていてもよい。第１の容器本体と第２の容器本体とは分離可能であってもよい。この場合、第２の容器本体の表面上に、該細胞培養用足場材料が配置されていてもよい。

【0137】

上記容器本体として、従来公知の容器本体（容器）を用いることができる。上記容器本体の形状および大きさは特に限定されない。

【0138】

上記容器本体としては、１個又は複数個のウェル（穴）を備える細胞培養用プレート、及び細胞培養用フラスコ等が挙げられる。上記プレートのウェル数は特に限定されない。該ウェル数としては、特に限定されないが、例えば、２、４、６、１２、２４、４８、９６、３８４等が挙げられる。上記ウェルの形状としては、特に限定されないが、真円、楕円、三角形、正方形、長方形、五角形等が挙げられる。上記ウェル底面の形状としては、特に限定されないが、平底、丸底、凹凸等が挙げられる。上記容器本体の材質は特に限定されないが、樹脂、金属及び無機材料が挙げられる。

【実施例】

【0139】

以下に実施例及び比較例を掲げて本発明を更に詳しく説明する。本発明はこれら実施例のみに限定されない。

【0140】

細胞培養用足場材料の材料として、以下の合成樹脂Ｘ１～Ｘ１５、Ｙ１～Ｙ４を用意した。合成樹脂Ｘ１～Ｘ１５に用いた多座水素結合性基を有するモノマーの詳細を、表１に示す。

【0141】

【表1】

【0142】

なお、得られた合成樹脂における構造単位の含有率は、合成樹脂をＤＭＳＯ－ｄ６（ジメチルスルホキサイド）に溶解した後、^１Ｈ-ＮＭＲ（核磁気共鳴スペクトル）により測定した。合成樹脂が有する各構造単位の含有率を表２～４に示した。なお、表中、多座水素結合性基の含有率は、多座水素結合性基を有する構造単位の割合である。

【0143】

合成樹脂Ｘ１：合成例Ｘ１

攪拌装置を備えた反応機に、イオン交換水２７００ｍＬ、平均重合度２５０、鹸化度９９モル％のポリビニルアルコールを３００重量部投入し、攪拌しながら加熱溶解し、溶液を得た。得られた溶液に、触媒として、塩酸濃度が０．２重量％となるように３５重量％塩酸を添加した。次いで、温度を１５℃に調整し、攪拌しながらｎ－ブチルアルデヒド２２重量部を添加した。次いで、ｎ－ブチルアルデヒド１４８重量部を添加し、白色粒子状のポリビニルブチラール樹脂を析出させた。析出してから１５分後に、塩酸濃度が１．８重量％になるように３５重量％塩酸を添加した後、５０℃に加熱し、５０℃で２時間保持した。次いで、溶液を冷却し、中和した後、ポリビニルブチラール樹脂を水洗し、乾燥させて、ポリビニルブチラール樹脂（平均重合度２５０、アセタール化度（ブチラール化度）７１モル％、水酸基量２８モル％、アセチル基量１モル％）を得た。

【0144】

このポリビニルブチラール樹脂９５重量部を、２０重量％の溶液となるようにテトラヒドロフランに溶解させ、開始剤としてイルガキュア１８４を０．１重量部及びドーパミンアクリルアミド５重量部を添加し、グラフト重合を行うことで、合成樹脂Ｘ１を得た。

【0145】

得られた合成樹脂Ｘ１は、ポリビニルアセタール骨格（ポリビニルブチラール骨格）を有し、また、多座水素結合性基としてカテコール骨格を有する基を有する。合成樹脂Ｘ１において、平均重合度２５０、多座水素結合性基を有さない構造単位における水酸基量３８モル％、アセチル基量１モル％、アセタール化度６０モル％、多座水素結合性基の含有率１モル％であった。

【0146】

合成樹脂Ｘ２：合成例Ｘ２

ポリビニルブチラール樹脂の配合量を９５重量部から９０重量部に変更したこと、及びドーパミンアクリルアミドの配合量を５重量部から１０重量部に変更したこと以外は、合成例Ｘ１と同様にして、合成樹脂Ｘ２を得た。

【0147】

得られた合成樹脂Ｘ２は、ポリビニルアセタール骨格（ポリビニルブチラール骨格）を有し、また、多座水素結合性基としてカテコール骨格を有する基を有する。合成樹脂Ｘ２において、平均重合度２５０、多座水素結合性基を有さない構造単位における水酸基量３７モル％、アセチル基量１モル％、アセタール化度５９モル％、多座水素結合性基の含有率３モル％であった。

【0148】

合成樹脂Ｘ３：合成例Ｘ３

ポリビニルブチラール樹脂の配合量を９５重量部から８０重量部に変更したこと、及びドーパミンアクリルアミドの配合量を５重量部から２０重量部に変更したこと以外は、合成例Ｘ１と同様にして、合成樹脂Ｘ３を得た。

【0149】

得られた合成樹脂Ｘ３は、ポリビニルアセタール骨格（ポリビニルブチラール骨格）を有し、また、多座水素結合性基としてカテコール骨格を有する基を有する。合成樹脂Ｘ３において、平均重合度２５０、多座水素結合性基を有さない構造単位における水酸基量３６モル％、アセチル基量１モル％、アセタール化度５７モル％、多座水素結合性基の含有率７モル％であった。

【0150】

合成樹脂Ｘ４：合成例Ｘ４

ポリビニルブチラール樹脂の配合量を９５重量部から９０重量部に変更したこと、及びグラフト重合する際に、ドーパミンアクリルアミド５重量部と、Ｎ－（４－ヒドロキシフェニル）メタクリルアミド５重量部とを用いたこと以外は、合成例Ｘ１と同様にして、合成樹脂Ｘ４を得た。

【0151】

得られた合成樹脂Ｘ４は、ポリビニルアセタール骨格（ポリビニルブチラール骨格）を有し、また、多座水素結合性基としてカテコール骨格を有する基を有する。合成樹脂Ｘ４において、平均重合度２５０、多座水素結合性基を有さない構造単位における水酸基量３８モル％、アセチル基量１モル％、アセタール化度５９モル％、多座水素結合性基の含有率２モル％であった。

【0152】

合成樹脂Ｘ５：合成例Ｘ５

ドーパミンアクリルアミド５重量部に代えて、４－メタクリルアミドフェニルボロン酸５重量部を用いたこと以外は、合成例Ｘ１と同様にして、合成樹脂Ｘ５を得た。

【0153】

得られた合成樹脂Ｘ５は、ポリビニルアセタール骨格（ポリビニルブチラール骨格）を有し、また、多座水素結合性基としてボロン酸骨格（フェニルボロン酸骨格）を有する基を有する。合成樹脂Ｘ５において、平均重合度２５０、多座水素結合性基を有さない構造単位における水酸基量３８モル％、アセチル基量１モル％、アセタール化度６０モル％、多座水素結合性基の含有率１モル％であった。

【0154】

合成樹脂Ｘ６：合成例Ｘ６

ポリビニルブチラール樹脂の配合量を９５重量部から９０重量部に変更したこと、及び４－メタクリルアミドフェニルボロン酸の配合量を５重量部から１０重量部に変更したこと以外は、合成例Ｘ５と同様にして、合成樹脂Ｘ６を得た。

【0155】

得られた合成樹脂Ｘ６は、ポリビニルアセタール骨格（ポリビニルブチラール骨格）を有し、また、多座水素結合性基としてボロン酸骨格（フェニルボロン酸骨格）を有する基を有する。合成樹脂Ｘ６において、平均重合度２５０、多座水素結合性基を有さない構造単位における水酸基量３７モル％、アセチル基量１モル％、アセタール化度５９モル％、多座水素結合性基の含有率３モル％であった。

【0156】

合成樹脂Ｘ７：合成例Ｘ７

平均重合度１７００、ブチラール化度６３モル％、水酸基量３４モル％、アセチル化度３モル％のポリビニルブチラール樹脂を用いたこと以外は、合成例Ｘ１と同様にして、合成樹脂Ｘ７を得た。

【0157】

得られた合成樹脂Ｘ７は、ポリビニルアセタール骨格（ポリビニルブチラール骨格）を有し、また、多座水素結合性基としてカテコール骨格を有する基を有する。合成樹脂Ｘ７において、平均重合度１７００、多座水素結合性基を有さない構造単位における水酸基量３４モル％、アセチル基量３モル％、アセタール化度６２モル％、多座水素結合性基の含有率１モル％であった。

【0158】

合成樹脂Ｘ８：合成例Ｘ８

ポリビニルブチラール樹脂の配合量を９５重量部から９０重量部に変更したこと、及びドーパミンアクリルアミドの配合量を５重量部から１０重量部に変更したこと以外は、合成例Ｘ７と同様にして、合成樹脂Ｘ８を得た。

【0159】

得られた合成樹脂Ｘ８は、ポリビニルアセタール骨格（ポリビニルブチラール骨格）を有し、また、多座水素結合性基としてカテコール骨格を有する基を有する。合成樹脂Ｘ８において、平均重合度１７００、多座水素結合性基を有さない構造単位における水酸基量３３モル％、アセチル基量３モル％、アセタール化度６２モル％、多座水素結合性基の含有率２モル％であった。

【0160】

合成樹脂Ｘ９：合成例Ｘ９

ポリビニルブチラール樹脂の配合量を９５重量部から８０重量部に変更したこと、及びドーパミンアクリルアミドの配合量を５重量部から２０重量部に変更したこと以外は、合成例Ｘ７と同様にして、合成樹脂Ｘ９を得た。

【0161】

得られた合成樹脂Ｘ９は、ポリビニルアセタール骨格（ポリビニルブチラール骨格）を有し、また、多座水素結合性基としてカテコール骨格を有する基を有する。合成樹脂Ｘ９において、平均重合度１７００、多座水素結合性基を有さない構造単位における水酸基量３２モル％、アセチル基量３モル％、アセタール化度６０モル％、多座水素結合性基の含有率５モル％であった。

【0162】

合成樹脂Ｘ１０：合成例Ｘ１０

ドーパミンアクリルアミド５重量部に代えて、グリセリンモノメタクリレート５重量部を用いたこと以外は、合成例Ｘ７と同様にして、合成樹脂Ｘ１０を得た。

【0163】

得られた合成樹脂Ｘ１０は、ポリビニルアセタール骨格（ポリビニルブチラール骨格）を有し、また、多座水素結合性基としてエチレングリコール骨格を有する基を有する。合成樹脂Ｘ１０において、平均重合度１７００、多座水素結合性基を有さない構造単位における水酸基量３４モル％、アセチル基量３モル％、アセタール化度６２モル％、多座水素結合性基の含有率１モル％であった。

【0164】

合成樹脂Ｘ１１：合成例Ｘ１１

ポリビニルブチラール樹脂の配合量を９５重量部から９０重量部に変更したこと、及びグリセリンモノメタクリレートの配合量を５重量部から１０重量部に変更したこと以外は、合成例Ｘ１０と同様にして、合成樹脂Ｘ１１を得た。

【0165】

得られた合成樹脂Ｘ１１は、ポリビニルアセタール骨格（ポリビニルブチラール骨格）を有し、また、多座水素結合性基としてエチレングリコール骨格を有する基を有する。合成樹脂Ｘ１１において、平均重合度１７００、多座水素結合性基を有さない構造単位における水酸基量３３モル％、アセチル基量３モル％、アセタール化度６１モル％、多座水素結合性基の含有率３モル％であった。

【0166】

合成樹脂Ｘ１２：合成例Ｘ１２

ポリビニルブチラール樹脂の配合量を９５重量部から８０重量部に変更したこと、及びグリセリンモノメタクリレートの配合量を５重量部から２０重量部に変更したこと以外は、合成例Ｘ７と同様にして、合成樹脂Ｘ１２を得た。

【0167】

得られた合成樹脂Ｘ１２は、ポリビニルアセタール骨格（ポリビニルブチラール骨格）を有し、また、多座水素結合性基としてエチレングリコール骨格を有する基を有する。合成樹脂Ｘ１２において、平均重合度１７００、多座水素結合性基を有さない構造単位における水酸基量３２モル％、アセチル基量３モル％、アセタール化度５９モル％、多座水素結合性基の含有率６モル％であった。

【0168】

合成樹脂Ｘ１３：合成例Ｘ１３

グリセリンモノメタクリレート１０重量部に代えて、ＤＬ－２－アリルグリシン１０重量部に変更したこと以外は、合成例Ｘ１１と同様にして、合成樹脂Ｘ１３を得た。

【0169】

得られた合成樹脂Ｘ１３は、ポリビニルアセタール骨格（ポリビニルブチラール骨格）を有し、また、多座水素結合性基としてアミノ基とカルボキシル基を有する。合成樹脂Ｘ１３において、平均重合度１７００、多座水素結合性基を有さない構造単位における水酸基量３３モル％、アセチル基量３モル％、アセタール化度６０モル％、多座水素結合性基の含有率４モル％であった。

【0170】

合成樹脂Ｘ１４：合成例Ｘ１４

ドーパミンアクリルアミド５重量部に代えて、４－メタクリルアミドフェニルボロン酸５重量部を用いたこと以外は、合成例Ｘ７と同様にして、合成樹脂Ｘ１４を得た。

【0171】

得られた合成樹脂Ｘ１４は、ポリビニルアセタール骨格（ポリビニルブチラール骨格）を有し、また、多座水素結合性基としてボロン酸骨格（フェニルボロン酸骨格）を有する基を有する。合成樹脂Ｘ１４において、平均重合度１７００、多座水素結合性基を有さない構造単位における水酸基量３３モル％、アセチル基量３モル％、アセタール化度６２モル％、多座水素結合性基の含有率２モル％であった。

【0172】

合成樹脂Ｘ１５：合成例Ｘ１５

ポリビニルブチラール樹脂の配合量を９５重量部から９０重量部に変更したこと、及び４－メタクリルアミドフェニルボロン酸の配合量を５重量部から１０重量部に変更したこと以外は、合成例Ｘ１４と同様にして、合成樹脂Ｘ１５を得た。

【0173】

得られた合成樹脂Ｘ１５は、ポリビニルアセタール骨格（ポリビニルブチラール骨格）を有し、また、多座水素結合性基としてボロン酸骨格（フェニルボロン酸骨格）を有する基を有する。合成樹脂Ｘ１５において、平均重合度１７００、多座水素結合性基を有さない構造単位における水酸基量３３モル％、アセチル基量３モル％、アセタール化度６１モル％、多座水素結合性基の含有率３モル％であった。

【0174】

合成樹脂Ｙ１：合成例Ｙ１

攪拌装置を備えた反応機に、イオン交換水２７００ｍＬ、平均重合度２５０、鹸化度９９モル％のポリビニルアルコールを３００重量部投入し、攪拌しながら加熱溶解し、溶液を得た。得られた溶液に、触媒として、塩酸濃度が０．２重量％となるように３５重量％塩酸を添加した。次いで、温度を１５℃に調整し、攪拌しながらｎ－ブチルアルデヒド２２重量部を添加した。次いで、ｎ－ブチルアルデヒド１４８重量部を添加し、白色粒子状のポリビニルブチラール樹脂を析出させた。析出してから１５分後に、塩酸濃度が１．８重量％となるように３５重量％塩酸を添加した後、５０℃に加熱し、５０℃で２時間保持した。次いで、溶液を冷却し、中和した後、ポリビニルブチラール樹脂を水洗し、乾燥させて、ポリビニルブチラール樹脂である合成樹脂Ｙ１を得た。

【0175】

得られた合成樹脂Ｙ１は、平均重合度２５０、水酸基量５７モル％、アセチル基量３モル％、アセタール化度４０モル％であった。

【0176】

合成樹脂Ｙ２：合成例Ｙ２

酢酸ビニルモノマーをメタノールに溶解させ、開始剤を添加しながら６５℃、５時間攪拌させ、重合した。得られた酢酸ビニルポリマー溶液に水酸化ナトリウム水溶液（１０％）を添加し、６０分間けん化反応を行った。オーブンにて乾燥させ、合成樹脂Ｙ２を得た。

【0177】

得られた合成樹脂Ｙ２は、平均重合度１０００、水酸基量９８モル％、アセチル基量２モル％であった。

【0178】

合成樹脂Ｙ３：合成例Ｙ３

攪拌装置を備えた反応機に、イオン交換水２７００ｍＬ、平均重合度２５０、鹸化度９９モル％のポリビニルアルコールを３００重量部投入し、攪拌しながら加熱溶解し、溶液を得た。得られた溶液に、触媒として、塩酸濃度が０．２重量％となるように３５重量％塩酸を添加した。次いで、温度を１５℃に調整し、攪拌しながらｎ－ブチルアルデヒド２２重量部を添加した。次いで、ｎ－ブチルアルデヒド１４８重量部を添加し、白色粒子状のポリビニルブチラール樹脂を析出させた。析出してから１５分後に、塩酸濃度が１．８重量％になるように３５重量％塩酸を添加した後、５０℃に加熱し、５０℃で２時間保持した。次いで、溶液を冷却し、中和した後、ポリビニルブチラール樹脂を水洗し、乾燥させて、合成樹脂Ｙ３を得た。

【0179】

得られた合成樹脂Ｙ３は、平均重合度２５０、水酸基量２８モル％、アセチル基量１モル％、アセタール化度７１モル％であった。

【0180】

合成樹脂Ｙ４：合成例Ｙ４

攪拌装置を備えた反応機に、イオン交換水２７００ｍＬ、平均重合度１７００、鹸化度９９モル％のポリビニルアルコールを３００重量部投入し、攪拌しながら加熱溶解し、溶液を得た。得られた溶液に、触媒として、塩酸濃度が０．２重量％となるように３５重量％塩酸を添加した。次いで、温度を１５℃に調整し、攪拌しながらｎ－ブチルアルデヒド２２重量部を添加した。次いで、ｎ－ブチルアルデヒド１４８重量部を添加し、白色粒子状のポリビニルブチラール樹脂を析出させた。析出してから１５分後に、塩酸濃度が１．８重量％となるように３５重量％塩酸を添加した後、５０℃に加熱し、５０℃で２時間保持した。次いで、溶液を冷却し、中和した後、ポリビニルブチラール樹脂を水洗し、乾燥させて、ポリビニルブチラール樹脂である合成樹脂Ｙ４を得た。

【0181】

得られた合成樹脂Ｙ４は、平均重合度１７００、水酸基量３４モル％、アセチル基量３モル％、アセタール化度６３モル％であった。

【0182】

（実施例１～６及び比較例１～４）

細胞培養用容器の作製：

表２に示す合成樹脂１重量部をブタノール１９重量部に溶解させた。得られた溶液１５０μＬを、エアダスターで除塵したφ２２ｍｍのカバーガラス（松浪社製「２２丸Ｎｏ．１」）の表面上に吐出し、スピンコーターを用いて２０００ｒｐｍ、２０秒回転させた後、６０℃で６０分間加熱して、表面が平滑な樹脂膜（細胞培養用足場材料）を得た。得られた樹脂膜とカバーガラスとの積層体を、φ２２ｍｍのポリスチレンディッシュに配置することにより細胞培養用容器を得た。

【0183】

なお、比較例１では、ポリスチレンディッシュ自体を細胞培養用容器として用いた。

【0184】

細胞塊の播種及び培養：

以下の液体培地及びＲＯＣＫ（Ｒｈｏ結合キナーゼ）特異的阻害剤を用意した。

【0185】

ＴｅＳＲ Ｅ８培地（ＳＴＥＭ ＣＥＬＬ社製）

ＲＯＣＫ－Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｙ２７６３２）

【0186】

得られた細胞培養用容器にリン酸緩衝生理食塩水１ｍＬを加えて３７℃のインキュベーター内で１時間静置後、細胞培養用容器からリン酸緩衝生理食塩水を除去した。

【0187】

φ３５ｍｍディッシュにコンフルエント状態になったｈ－ｉＰＳ細胞２５２Ｇ１のコロニーを配置し、０．５ｍＭエチレンジアミン／リン酸緩衝溶液１ｍＬを加え、室温で２分静置した。エチレンジアミン／リン酸緩衝溶液を除去した後、液体培地１ｍＬでピペッティングすることにより５０μｍ～２００μｍの大きさに砕かれた細胞塊を得た。得られた細胞塊（細胞数１．０×１０^５ｃｅｌｌｓ）を上記の細胞培養用容器にクランプ播種した。

【0188】

播種時は１．５ｍＬの液体培地と、終濃度が１０μＭとなるようにＲＯＣＫ特異的阻害剤とを細胞培養用容器に添加した。また、３７℃及びＣＯ_２濃度５％のインキュベーター内で培養を行った。２４時間毎に、液体培地を１ｍＬ除去し、ＲＯＣＫ特異的阻害剤を添加していない新鮮な液体培地を１ｍＬ加えることで培地交換を行った。

【0189】

（評価）

（１）細胞塊の定着性

播種から２４時間毎の培地交換の後に、顕微鏡で写真を撮影した。得られた顕微鏡写真から、播種した細胞塊が、細胞培養用足場材料から剥離するまでの日数を確認した。

【0190】

＜細胞塊の定着性の判定基準＞

○○○：培養開始後、５日目以降に細胞塊の剥離が生じる

○○：培養開始後、４日目に細胞塊の剥離が生じる

○：培養開始後、３日目に細胞塊の剥離が生じる

×：培養開始後、１、２日目に細胞塊の剥離が生じる

【0191】

詳細及び結果を下記の表２に示す。

【0192】

【表2】

【0193】

（実施例７～９、参考例１０～１３、実施例１４，１５及び比較例５～７）
細胞培養用容器の作製：
表３，４に示す合成樹脂１重量部をブタノール１９重量部に溶解させた。得られた溶液１５０μＬを、エアダスターで除塵したφ２２ｍｍのカバーガラス（松浪社製「２２丸Ｎｏ．１」）の表面上に吐出し、スピンコーターを用いて２０００ｒｐｍ、２０秒回転させた後、６０℃で６０分間加熱して、表面が平滑な樹脂膜（細胞培養用足場材料）を得た。得られた樹脂膜とカバーガラスとの積層体を、φ２２ｍｍのポリスチレンディッシュに配置することにより細胞培養用容器を得た。

【0194】

細胞の播種及び培養：

以下の液体培地及び添加剤を用意した。液体培地であるＭｅｓｅｎＣｕｌｔ－ＡＣＦ Ｐｌｕｓ Ｍｅｄｉｕｍに終濃度が１Ｘとなるように、ＭｅｓｅｎＣｕｌｔ－ＡＣＦ Ｐｌｕｓ ５００Ｘ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ及びＬ－Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ ２００ｍｍｏｌ／Ｌ（１００Ｘ）を加えた。

【0195】

ＭｅｓｅｎＣｕｌｔ－ＡＣＦ Ｐｌｕｓ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）

ＭｅｓｅｎＣｕｌｔ－ＡＣＦ Ｐｌｕｓ ５００Ｘ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）

Ｌ－Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ ２００ｍｍｏｌ／Ｌ（１００Ｘ）（富士フイルム和光純薬社製）

【0196】

以下の細胞を間葉系幹細胞（ＭＳＣ）として用意した。ＭＳＣを含む骨髄間質細胞をＭＳＣ用培地で馴化し、ＭＳＣの陽性マーカー（ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５）が９５％以上、ＭＳＣの陰性マーカー（ＣＤ１４、ＣＤ３４、ＣＤ４５）が５％未満の純度である細胞をＭＳＣとして使用した。

【0197】

Ｈｕｍａｎ Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ Ｓｔｒｏｍａｌ Ｃｅｌｌｓ Ｄｅｒｉｖｅｄ ｉｎ ＡＣＦ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）

【0198】

得られた細胞培養用容器にリン酸緩衝生理食塩水１ｍＬを加えて３７℃のインキュベーター内で１時間静置後、細胞培養用容器からリン酸緩衝生理食塩水を除去した。

【0199】

φ３５ｍｍディッシュにコンフルエント状態になったＭＳＣを配置し、ＡＣＦ Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）２ｍＬを加え、３７℃及びＣＯ_２濃度５％のインキュベーター内で３分静置した。さらに、ＡＣＦ Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）２ｍＬを加えた。３００ｒｐｍで８分間遠心後、上清を除去して、液体培地で懸濁し細胞懸濁液を得た。得られた細胞懸濁液（細胞数８．０×１０^４ｃｅｌｌｓ）を上記の細胞培養用容器に播種した。

【0200】

播種時は１．５ｍＬの液体培地を細胞培養用容器に添加した。また、３７℃及びＣＯ_２濃度５％のインキュベーター内で培養を行った。

【0201】

（評価）

（１）細胞の定着性

播種から１日後、３日後、４日後、５日後に、顕微鏡で写真を撮影した。得られた顕微鏡写真から、播種した細胞が、細胞培養用足場材料に接着し、増殖する日数を確認した。

【0202】

＜細胞の定着性の判定基準＞

○○○：培養開始後、１日目に細胞が接着し、４日目を超えても接着及び増殖を維持する

○○：培養開始後、１日目に細胞が接着し、３日目まで接着及び増殖を維持する

○：培養開始後、１日目に細胞が接着し、３日目を超えても接着を維持する（増殖はしない）

×：培養開始後、１日目に細胞が接着せず剥離が生じる

【0203】

詳細及び結果を下記の表３，４に示す。

【0204】

【表3】

【0205】

【表4】

【符号の説明】

【0206】

１…細胞培養用容器

２…容器本体

２ａ…表面

３…細胞培養用足場材料

１０…細胞

１１…水素結合を形成可能な物質

２０…細胞培養用足場材料

３０…水素結合

【図1】

【図2】