(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-04-30
(45)【発行日】2024-05-10
(54)【発明の名称】物理混合ＨＡ－コラーゲン皮膚充填剤
(51)【国際特許分類】
A61L 27/20 20060101AFI20240501BHJP
A61L 27/24 20060101ALI20240501BHJP
A61L 27/50 20060101ALI20240501BHJP
A61L 27/54 20060101ALI20240501BHJP
A61L 27/52 20060101ALI20240501BHJP
C08L 5/08 20060101ALI20240501BHJP
C08L 89/06 20060101ALI20240501BHJP
C08K 5/16 20060101ALI20240501BHJP
【ＦＩ】
A61L27/20
A61L27/24
A61L27/50
A61L27/54
A61L27/52
C08L5/08
C08L89/06
C08K5/16
【請求項の数】
17
(21)【出願番号】P 2022539293
(86)(22)【出願日】2020-12-28
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2023-03-02
(86)【国際出願番号】 US2020067232
(87)【国際公開番号】W WO2021134084
(87)【国際公開日】2021-07-01
【審査請求日】2022-08-23
(31)【優先権主張番号】62/953,925
(32)【優先日】2019-12-26
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(73)【特許権者】
【識別番号】591018268
【氏名又は名称】アラーガン、インコーポレイテッド
【氏名又は名称原語表記】ＡＬＬＥＲＧＡＮ，ＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＥＤ
(74)【代理人】
【識別番号】110000855
【氏名又は名称】弁理士法人浅村特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】ストレヒン、イオシフ
(72)【発明者】
【氏名】ユー、シャオジェ
(72)【発明者】
【氏名】メッシーナ、ダリン ジェイ．
(72)【発明者】
【氏名】モレル、ジュリー
(72)【発明者】
【氏名】ドゥリュー、フローラン
(72)【発明者】
【氏名】ロカ、マルチネス、ジャン － グザヴィエ
【審査官】渡邉 潤也
(56)【参考文献】
【文献】特開平０１－２６５９７０（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１４－５１３９８８（ＪＰ，Ａ）
【文献】J. Microbiol. Biotechnol.，2015年，25(3)，pp.399-406
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｌ
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
高分子マトリックスを調製する方法であって、架橋ヒアルロン酸を提供すること、
コラーゲンを含む溶液を提供すること、ここでコラーゲン溶液は酸性ｐＨを有する、
並びに
前記コラーゲン溶液を前記架橋ヒアルロン酸に物理的に混合すること、ここで、前記コラーゲン溶液が前記架橋ヒアルロン酸全体にわたって均質に混合され、それによって前記高分子マトリックスが形成される、
を含む、上記方法。
【請求項2】
前記コラーゲン溶液が約２．０～約５．５のｐＨを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記コラーゲン溶液が、約２．０、約２．５、約３．０、約３．５、約４．０、約４．５、約５．０、約５．５、約６．０、約６．５のｐＨ、又は任意の２つの前述の値によって定義される範囲内の任意のｐＨを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
前記コラーゲン溶液及び前記架橋ヒアルロン酸が、緩衝液と物理的に混合される、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
前記緩衝液が、リン酸緩衝生理食塩水を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
前記方法が、リドカインを前記高分子マトリックスに添加することをさらに含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
前記リドカインが、前記高分子マトリックスの約０．１５％（ｗ／ｗ）～約０．４５％（ｗ／ｗ）の濃度である、請求項６に記載の方法。
【請求項8】
前記方法が、前記コラーゲン溶液を前記架橋ヒアルロン酸全体にわたって均質に混合した後、前記高分子マトリックスを約７のｐＨに中和することをさらに含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
前記高分子マトリックスに非架橋ヒアルロン酸を追加することをさらに含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
前記非架橋ヒアルロン酸が、前記マトリックス中の最大約５％（ｗ／ｗ）の濃度を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項11】
前記コラーゲンが、ウシコラーゲン、マリンコラーゲン、ヒトコラーゲン又はブタコラーゲンである、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
前記高分子マトリックスが、約１００Ｐａ、約２００Ｐａ、約３００Ｐａ、約４００Ｐａ、約５００Ｐａ、約６００Ｐａ、約７００Ｐａ、約８００Ｐａ、約９００Ｐａ、約１０００Ｐａ、約１１００Ｐａ、約１２００Ｐａ、約１３００Ｐａ、約１４００Ｐａ、約１５００Ｐａ、約１６００Ｐａ、約１７００Ｐａ、約１８００Ｐａ、約１９００Ｐａ、約２０００Ｐａ、約２１００Ｐａ、約２２００Ｐａ、約２３００Ｐａ、約２４００Ｐａ、約２５００Ｐａ、約２６００Ｐａ、約２７００Ｐａ、約２８００Ｐａ、約２９００Ｐａ、約３０００Ｐａ、又は任意の２つの前述の値によって定義される範囲の間の任意の値の弾性率（Ｇ’）を有する、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項13】
前記高分子マトリックスが、約１０ｇｍｆ、約２０ｇｍｆ、約３０ｇｍｆ、約４０ｇｍｆ、約５０ｇｍｆ、約６０ｇｍｆ、約７０ｇｍｆ、約８０ｇｍｆ、約９０ｇｍｆ、約１００ｇｍｆ、約１１０ｇｍｆ、約１２０ｇｍｆ、約１３０ｇｍｆ、約１４０ｇｍｆ、約１５０ｇｍｆ、約１６０ｇｍｆ、約１７０ｇｍｆ、約１８０ｇｍｆ、約１９０ｇｍｆ、約２００ｇｍｆ、約２１０ｇｍｆ、約２２０ｇｍｆ、約２３０ｇｍｆ、約２４０ｇｍｆ、約２５０ｇｍｆ、約２６０ｇｍｆ、約２７０ｇｍｆ、約２８０ｇｍｆ、約２９０ｇｍｆ、約３００ｇｍｆ、約３１０ｇｍｆ、約３２０ｇｍｆ、約３３０ｇｍｆ、約３４０ｇｍｆ、約３５０ｇｍｆ、約３６０ｇｍｆ、約３７０ｇｍｆ、約３８０ｇｍｆ、約３９０ｇｍｆ、約４００ｇｍｆ、約４１０ｇｍｆ、約４２０ｇｍｆ、約４３０ｇｍｆ、約４４０ｇｍｆ、約４５０ｇｍｆ、約４６０ｇｍｆ、約４７０ｇｍｆ、約４８０ｇｍｆ、約４９０ｇｍｆ、約５００ｇｍｆ、約５１０ｇｍｆ、約５２０ｇｍｆ、約５３０ｇｍｆ、約５４０ｇｍｆ、約５５０ｇｍｆ、約５６０ｇｍｆ、約５７０ｇｍｆ、約５８０ｇｍｆ、約５９０ｇｍｆ若しくは約６００ｇｍｆの圧縮力値、又は任意の２つの前述の値によって定義される範囲の間の任意の圧縮力値を有する、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項14】
前記ヒアルロン酸が、約２ｍｇ／ｍｌ、約４ｍｇ／ｍｌ、約６ｍｇ／ｍｌ、約８ｍｇ／ｍｌ、約１０ｍｇ／ｍｌ、約１２ｍｇ／ｍｌ、約１４ｍｇ／ｍｌ、約１６ｍｇ／ｍｌ、約１８ｍｇ／ｍｌ、約２０ｍｇ／ｍｌ、約２２ｍｇ／ｍｌ、約２４ｍｇ／ｍｌ、約２６ｍｇ／ｍｌ、約２８ｍｇ／ｍｌ、約３０ｍｇ／ｍｌ、３２ｍｇ／ｍｌ、約３４ｍｇ／ｍｌ若しくは約３６ｍｇ／ｍｌの濃度、又は任意の２つの前述の値によって定義される範囲の間の任意の濃度である、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項15】
前記ヒアルロン酸が、約５ｍｇ／ｍｌ～約２８ｍｇ／ｍｌの濃度である、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項16】
前記コラーゲンが、約１ｍｇ／ｍｌ、約２ｍｇ／ｍｌ、約３ｍｇ／ｍｌ、約４ｍｇ／ｍｌ、約６ｍｇ／ｍｌ、約７ｍｇ／ｍｌ、約８ｍｇ／ｍｌ、約９ｍｇ／ｍｌ、約１０ｍｇ／ｍｌ、約１１ｍｇ／ｍｌ、約１２ｍｇ／ｍｌ、約１３ｍｇ／ｍｌ、約１４ｍｇ／ｍｌ若しくは約１５ｍｇ／ｍｌ、約１６ｍｇ／ｍｌ、約１７ｍｇ／ｍｌ、約１８ｍｇ／ｍｌ、約１９ｍｇ／ｍｌ、約２０ｍｇ／ｍｌ、約２１ｍｇ／ｍｌ、約２２ｍｇ／ｍｌ、約２３ｍｇ／ｍｌ、約２４ｍｇ／ｍｌ、約２５ｍｇ／ｍｌの濃度、又は任意の２つの前述の値によって定義される範囲の間の任意の濃度である、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項17】
前記架橋ヒアルロン酸が、約１万ダルトン、約２万ダルトン、約３万ダルトン、４万ダルトン、約５万ダルトン、約６万ダルトン、約７万ダルトン、約８万ダルトン、約１０万ダルトン、約２０万ダルトン、約３０万ダルトン、約４０万ダルトン、約５０万ダルトン、約６０万ダルトン、約７０万ダルトン、約８０万ダルトン、約９０万ダルトン、約１００万ダルトン、約１１０万ダルトン、約１２０万ダルトン、約１３０万ダルトン、約１４０万ダルトン、約１５０万ダルトン、約１６０万ダルトン、約１７０万ダルトン、約１８０万ダルトン、約１９０万ダルトン、約２００万ダルトン、約２１０万ダルトン、約２２０万ダルトン、約２３０万ダルトン、約２４０万ダルトン、約２５０万ダルトン、約２６０万ダルトン、約２７０万ダルトン、約２８０万ダルトン、約２９０万ダルトン、約３００万ダルトン、約３１０万ダルトン、約３２０万ダルトン、約３３０万ダルトン、約３４０万ダルトン、約３５０万ダルトン、約３６０万ダルトン、約３７０万ダルトン、約３８０万ダルトン、約３９０万ダルトン、約４００万ダルトン、約４１０万ダルトン、約４２０万ダルトン、約４３０万ダルトン、約４４０万ダルトン、約４５０万ダルトン、約４６０万ダルトン、約４７０万ダルトン、約４８０万ダルトン、約４９０万ダルトン、約５００万ダルトン、約５１０万ダルトン、約５２０万ダルトン、約５３０万ダルトン、約５４０万ダルトン、約５５０万ダルトン、約５６０万ダルトン、約５７０万ダルトン、約５８０万ダルトン、約５９０万ダルトン、約６００万ダルトン、約６１０万ダルトン、約６２０万ダルトン、約６３０万ダルトン、約６４０万ダルトン、約６５０万ダルトン、約６６０万ダルトン、約６７０万ダルトン、約６８０万ダルトン、約６９０万ダルトン、約７００万ダルトン、約７１０万ダルトン、約７２０万ダルトン、約７３０万ダルトン、約７４０万ダルトン、約７５０万ダルトン、約７６０万ダルトン、約７７０万ダルトン、約７８０万ダルトン、約７９０万ダルトン、約８００万ダルトン、約８１０万ダルトン、約８２０万ダルトン、約８３０万ダルトン、約８４０万ダルトン、約８５０万ダルトン、約８６０万ダルトン、約８７０万ダルトン、約８８０万ダルトン、約８９０万ダルトン、約９００万ダルトン、約９１０万ダルトン、約９２０万ダルトン、約９３０万ダルトン、約９４０万ダルトン、約９５０万ダルトン、約９６０万ダルトン、約９７０万ダルトン、約９８０万ダルトン、約９９０万ダルトン若しくは約１０００万ダルトンの平均分子量、又は任意の２つの前述の値によって定義される範囲の間の任意の重量を有するヒアルロン酸成分を含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年１２月２６日に出願された米国特許出願第６２／９５３，９２５号の優先権の利益を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０１９年１２月２６日に出願された米国特許出願第６２／９５３，９２５号の優先権の利益を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
本開示は、充填剤として使用するための、コラーゲンと混合されたヒアルロン酸を含む組成物及び組成物の製造方法に関する。さらなる方法には、組織内の容積欠損を処置する方法が含まれる。
【背景技術】
【0003】
本明細書に記載の実施形態は、皮膚充填剤組成物に関し、より具体的には、コラーゲンと物理的に混合されたヒアルロン酸を含む皮膚充填剤組成物に関する。
【0004】
皮膚の老化は経時的に起こり、例えば、日光曝露（ＵＶＡ線及びＵＶＢ線）、遺伝並びに喫煙、飲酒及び貧しい食生活などの悪い個人的習慣などの様々な要因によって悪化し得る。皮膚が老化するにつれて、皮膚はより粗く感じられ、より粗く見えることがあり、皮膚はまた薄くなり始め、弾力性が低下することがある。
【0005】
ヒアルロン酸（ＨＡ）としても知られるヒアルロナンは、結合組織、上皮組織及び神経組織において人体全体に広く分布する非硫酸化グリコサミノグリカンである。ヒアルロナンは、皮膚の異なる層に豊富に存在し、そこで、それは、良好な水和を確実にし、細胞外マトリックスの組織化を補助し、空間充填剤として作用し、組織修復機構に関与するように機能する。しかしながら、年齢と共に、皮膚に存在するヒアルロナン、コラーゲン、エラスチン及び他のマトリックスポリマーの量は減少する。例えば、太陽からの紫外線への反復曝露は、皮膚細胞にヒアルロナンの産生を減少させるだけでなく、その分解速度を増加させる。このヒアルロナンの損失は、皮膚の乾燥、しわ、不完全性、欠損及び皮膚の厚さの減少などの様々な皮膚状態に寄与する。
【0006】
身体はまた、腱、筋肉、骨、皮膚及び靭帯に見られる内因性コラーゲンを有する。しかしながら、経時的に、体内のコラーゲン成分は、紫外線、タバコ、アルコールへの曝露、及び加齢過程のために失われる可能性がある。皮膚のコラーゲンの減少は、皮膚の弾力性の損失、皮膚の厚さの減少、しわの形成、及びたるみをもたらし得る。
【0007】
したがって、加齢に対処するための外科的及び非外科的処置に対する関心が高まっている。非外科的処置には、ボツリヌス毒素注入、及び顔の若返りのために最も頻繁に行われる手技である軟組織充填剤の注入が含まれる。
【0008】
皮膚充填剤は、容積欠損の処置、しわの外観の平滑化、顔の非対称性の補正、並びに顔及び身体の他の部分の輪郭形成に使用されてきた。結果は、充填剤注入の位置及び患者に応じて、数ヶ月から２年続く場合がある。しかしながら、充填剤の効果は一時的であり、所望の審美的効果を維持するためにその後の処置を必要とする。
【0009】
ヒアルロン酸（ＨＡ）ベースの充填剤はほぼ２０年前に開発され、そのような充填剤による処置は、美容皮膚科学の実務において最も一般的に行われている手技の１つである。ＨＡ充填剤の主な利点は、生物工学的方法によって生成されたＨＡは、人体によって天然に生成されるＨＡと化学的に同一であり得、したがって、アレルギー反応を生じさせにくいことである。ＨＡは、内因性酵素及び身体によるクリアランスのために組織における酵素分解を受けやすいため、ＨＡを架橋又は他の方法で修飾して充填剤の滞留時間を増加させることができる。さらに、ＨＡはヒアルロニダーゼ酵素による酵素分解を受けやすいため、ＨＡ充填剤は迅速に分解することができ、有害事象の場合には外因性ヒアルロニダーゼによる処置によって充填効果を逆転させることができる。したがって、ＨＡ充填剤は、ＨＡ処置からの補正が長く持続し、ＨＡ充填剤が良好な安全性プロファイルを有するため、多くの患者にとって魅力的な選択肢である。
【0010】
多くの利点とは別に、ＨＡ充填剤にはいくつかの欠点もある。そのような欠点の１つは、チンダル効果であり、特定の表面ＨＡ充填剤注入部位で見ることができる青みがかった色相である。ＨＡは親水性であり、水を吸収するため、注入部位での膨潤も起こり得る。架橋度が高いほど、ＨＡは炎症及び肉芽腫形成のリスクが高くなる可能性があることにも留意されたい。
【0011】
市場にＨＡ充填剤が登場する前に入手可能であったが、コラーゲン充填剤は１９８０年代に市場に導入された。コラーゲンは、充填剤材料としていくつかの好ましい特性を有する。例えば、コラーゲン充填剤は不透明であり、したがって、皮膚下へのこれらの材料の注入は、ＨＡ充填剤で見られるようなチンダル効果をもたらさない。さらに、コラーゲンは、足場として作用し、組織内殖を充填剤材料内に支持することができる。しかしながら、コラーゲン充填剤には欠点がないわけではない。充填剤配合物中の高いコラーゲン濃度は、所望の充填効果を達成するために必要であり、これらの高いコラーゲン濃度にもかかわらず、材料の容積充填能力及びしわ充填能力は、ＨＡ充填剤のそれらの能力よりも低い。さらに、しわ補正の期間はわずか３～６ヶ月であることが示されており、コラーゲン材料を分解するために利用可能な酵素処理がないため、これらの充填剤は可逆的ではない。
【0012】
したがって、ＨＡとコラーゲン充填剤の両方の利点を提供する皮膚充填剤の必要性が望まれている。本明細書の実施形態に記載されるように、コラーゲン及びＨＡ充填剤の利益を与えながら、注入時にリフト及び容積を提供する組成物である。
【発明の概要】
【0013】
したがって、新しい皮膚充填剤組成物及びその製造方法が提供される。いくつかの実施形態は、ヒアルロン酸及びコラーゲンから調製された均質なヒドロゲル組成物を含む。いくつかの実施形態はまた、全体にわたって均等に混合されたＨＡ及び／又はコラーゲンの粒子を含有するヒドロゲル組成物を含む。いくつかの実施形態はまた、コラーゲン原線維などのＨＡ又はコラーゲンの粒子を含有する部分的に均質又は不均質な生成物を含んでもよい。これらの組成物は、ヒアルロン酸を架橋し、それによって架橋ヒアルロン酸を生成した後、架橋ヒアルロン酸をコラーゲンと混合することを含む方法によって調製してもよい。
【0014】
第１の態様において、高分子マトリックスを調製する方法が提供される。本方法は、架橋ヒアルロン酸を提供すること、コラーゲンを提供すること、並びにコラーゲンを架橋ヒアルロン酸に物理的に混合することであって、コラーゲンが架橋ヒアルロン酸全体にわたって均質に混合され、それによって高分子マトリックスが形成され、高分子マトリックスが、架橋ヒアルロン酸及び物理的に混合されたコラーゲンを含む、混合することを含む。
【0015】
上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、コラーゲンは、溶液として可溶性状態で提供される。
【0016】
上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、コラーゲンは、溶液として提供され、コラーゲン溶液は、約２．０、約２．５、約３．０、約３．５、約４．０、約４．５、約５．０、５．５、約６．０、約６．５、約７．０のｐＨ、又は任意の２つの前述の値によって定義される範囲内の任意のｐＨを含み、コラーゲンは、酸性ｐＨで可溶性である。上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、コラーゲンは、酸性ｐＨの溶液として提供され、コラーゲン溶液は、約２．０、約２．５、約３．０、約３．５、約４．０、約４．５、約５．０、約５．５のｐＨ、又は任意の２つの前述の値によって定義される範囲内の任意のｐＨを含み、コラーゲンは、酸性ｐＨで可溶性である。上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、コラーゲンは中性ｐＨの溶液として提供される。
【0017】
上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、コラーゲン及び架橋ヒアルロン酸は緩衝液と物理的に混合される。上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、緩衝液はＰＢＳを含む。
【0018】
上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、方法は、コラーゲンを架橋ヒアルロン酸全体にわたって均質に混合した後、高分子マトリックスを約７のｐＨに中和することをさらに含む。
【0019】
上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、本方法は、コラーゲンを架橋ヒアルロン酸と物理的に混合する前に、コラーゲンを約７のｐＨに中和することをさらに含む。上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、コラーゲンを架橋ヒアルロン酸に物理的に混合する前にコラーゲンを中和することにより、コラーゲンはコラーゲンの原線維又は粒子に沈殿し、コラーゲンの原線維又は粒子は架橋ヒアルロン酸にさらに混合され、原線維又は粒子は架橋ヒアルロン酸全体にわたって均質に混合される。
【0020】
上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、コラーゲンは、フィブリル化コラーゲン又はコラーゲン線維として提供される。上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、コラーゲンは、フィブリル化コラーゲンとして提供され、コラーゲンは中性又は塩基性ｐＨで調製され、それによってコラーゲン線維のフィブリル化コラーゲンが生成された。
【0021】
上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、コラーゲンは、フィブリル化コラーゲン又はコラーゲン線維を得るために少なくとも１つの塩を用いて調製された。上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、少なくとも１つの塩は、約２０ｍＭ、約５０ｍＭ、約１００ｍＭ、約１５０ｍＭ、約２００ｍＭ、約２５０ｍＭ、約３００ｍＭ、約３５０ｍＭ、約４００ｍＭ、約４５０ｍＭ若しくは約５００ｍＭの濃度、又は任意の２つの前述の値によって定義される範囲の間の任意の濃度を含む。上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、少なくとも１つの塩はアニオンを含み、アニオンはＨ２ＰＯ４－、ＳＯ４
２－、Ｃｌ－又はＳＣＮ－を含む。上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、少なくとも１つの塩は、ＮａＣｌ、Ｎａ２ＳＯ４又はＬｉ２ＳＯ４を含む。
【0022】
上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、コラーゲンは高分子マトリックス全体にわたって均質に混合される。
【0023】
上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、架橋ヒアルロン酸は、約１万ダルトン、約２万ダルトン、約３万ダルトン、約４万ダルトン、約５万ダルトン、約６万ダルトン、約７万ダルトン、約８万ダルトン、約９万ダルトン、約１０万ダルトン、約２０万ダルトン、約３０万ダルトン、約４０万ダルトン、約５０万ダルトン、約６０万ダルトン、約７０万ダルトン、約８０万ダルトン、約９０万ダルトン、約１００万ダルトン、約１１０万ダルトン、約１２０万ダルトン、約１３０万ダルトン、約１４０万ダルトン、約１５０万ダルトン、約１６０万ダルトン、約１７０万ダルトン、約１８０万ダルトン、約１９０万ダルトン、約２００万ダルトン、約２１０万ダルトン、約２２０万ダルトン、約２３０万ダルトン、約２４０万ダルトン、約２５０万ダルトン、約２６０万ダルトン、約２７０万ダルトン、約２８０万ダルトン、約２９０万ダルトン、約３００万ダルトン、約３１０万ダルトン、約３２０万ダルトン、約３３０万ダルトン、約３４０万ダルトン、約３５０万ダルトン、約３６０万ダルトン、約３７０万ダルトン、約３８０万ダルトン、約３９０万ダルトン、約４００万ダルトン、約４１０万ダルトン、約４２０万ダルトン、約４３０万ダルトン、約４４０万ダルトン、約４５０万ダルトン、約４６０万ダルトン、約４７０万ダルトン、約４８０万ダルトン、約４９０万ダルトン、約５００万ダルトン、約５１０万ダルトン、約５２０万ダルトン、約５３０万ダルトン、約５４０万ダルトン、約５５０万ダルトン、約５６０万ダルトン、約５７０万ダルトン、約５８０万ダルトン、約５９０万ダルトン、約６００万ダルトン、約６１０万ダルトン、約６２０万ダルトン、約６３０万ダルトン、約６４０万ダルトン、約６５０万ダルトン、約６６０万ダルトン、約６７０万ダルトン、約６８０万ダルトン、約６９０万ダルトン、約７００万ダルトン、約７１０万ダルトン、約７２０万ダルトン、約７３０万ダルトン、約７４０万ダルトン、約７５０万ダルトン、約７６０万ダルトン、約７７０万ダルトン、約７８０万ダルトン、約７９０万ダルトン、約８００万ダルトン、約８１０万ダルトン、約８２０万ダルトン、約８３０万ダルトン、約８４０万ダルトン、約８５０万ダルトン、約８６０万ダルトン、約８７０万ダルトン、約８８０万ダルトン、約８９０万ダルトン、約９００万ダルトン、約９１０万ダルトン、約９２０万ダルトン、約９３０万ダルトン、約９４０万ダルトン、約９５０万ダルトン、約９６０万ダルトン、約９７０万ダルトン、約９８０万ダルトン、約９９０万ダルトン若しくは約１０００万ダルトンの平均分子量、又は任意の２つの前述の値によって定義される範囲の間の任意の分子量を含むヒアルロン酸成分を含む。上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、架橋ヒアルロン酸は、少なくとも２つの異なる分子量を含むヒアルロン酸成分の混合物を含む。
【0024】
上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、本方法は、リドカインを高分子マトリックスに添加することをさらに含む。上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、リドカインは、マトリックス中の０．１５％（ｗ／ｗ）～０．４５％（ｗ／ｗ）の範囲の間の濃度である。上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、リドカインは、マトリックス中の０．２７％（ｗ／ｗ）～０．３３％（ｗ／ｗ）の範囲の間の濃度である。上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、リドカインは、マトリックスの約０．１５％（ｗ／ｗ）、約０．１７％（ｗ／ｗ）、約０．１９％（ｗ／ｗ）、約０．２１％（ｗ／ｗ）、約０．２３％（ｗ／ｗ）、約０．２５％（ｗ／ｗ）、約０．２７％（ｗ／ｗ）、約０．２９％（ｗ／ｗ）、約０．３１％（ｗ／ｗ）、約０．３３％（ｗ／ｗ）、約０．３５％（ｗ／ｗ）、約０．３７％（ｗ／ｗ）、約０．３９％（ｗ／ｗ）、約０．４１％（ｗ／ｗ）、約０．４３％（ｗ／ｗ）若しくは約０．４５％（ｗ／ｗ）の濃度、又は任意の２つの前述の値によって定義される範囲の間の任意の濃度である。上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、リドカインは、マトリックス中の約０．３％（ｗ／ｗ）の濃度である。
【0025】
上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、本方法は、非架橋ＨＡをマトリックスに添加することをさらに含む。上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、非架橋ＨＡは、マトリックス中の最大約５％（ｗ／ｗ）の濃度を含む。上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、非架橋ＨＡは、マトリックス中の約０％（ｗ／ｗ）、約１％（ｗ／ｗ）、約２％（ｗ／ｗ）、約３％（ｗ／ｗ）、約４％（ｗ／ｗ）、約５％（ｗ／ｗ）の濃度、又は任意の２つの前述の値によって定義される範囲の間の任意の濃度を含む。上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、非架橋ＨＡは、マトリックス中の約１％（ｗ／ｗ）の濃度を含む。上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、非架橋ＨＡは、マトリックス中の２％（ｗ／ｗ）の濃度を含む。上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、非架橋ＨＡは、マトリックス中の約５％（ｗ／ｗ）の濃度を含む。上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、非架橋ＨＡは、マトリックスの押出性を改善する。
【0026】
上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、高分子マトリックスは、針を通じた向上した押出性を有し、針は、２７Ｇ、２８Ｇ、２９Ｇ、３０Ｇ、３１Ｇ又は３２Ｇのゲージサイズを含む。
【0027】
上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、高分子マトリックスは少なくとも６ヶ月間安定である。上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、高分子マトリックスは、約６、約９、約１２、約１５、約１８、約２１、約２４、約２７、約３０、約３３若しくは約３６ヶ月間、又は任意の２つの前述の値によって定義される範囲の間の任意の時間にわたって安定である。上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、高分子マトリックスは、約４℃～約２５℃の温度で安定である。上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、高分子マトリックスは、約４℃、約５℃、約１０℃、約１５℃、約２０℃、約２５℃の温度、又は任意の２つの前述の値によって定義される範囲の間の任意の温度で安定である。上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、高分子マトリックスは、４℃で安定である。上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、高分子マトリックスは、約２５℃で安定である。
【0028】
上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、高分子マトリックスは、約３、約６、約９、約１２、約１５、約１８、約２１、約２４、約２７、約３０、約３３、約３６ヶ月、又は任意の２つの前述の値によって定義される範囲の間の任意の時間で最小の分解を有する。
【0029】
第２の態様において、高分子マトリックスを調製する方法が提供される。本方法は、ヒアルロン酸を水溶液に溶解して、反応前水溶液を形成すること、並びに第２の溶液を調製することであって、第２の溶液が、水溶性カルボジイミド、及びＮ－ヒドロキシスクシンイミド若しくはＮ－ヒドロキシスルホスクシンイミド、又は水酸化ナトリウムの存在下でのヒアルロン酸ナトリウムの溶液中の１，４－ブタンジオールジグリシジルエーテル（ＢＤＤＥ）を含む、調製すること、並びに第２の溶液を反応前水溶液に添加して、架橋反応混合物を形成すること、ヒアルロン酸を架橋することであって、ヒアルロン酸を架橋することにより、架橋反応混合物が反応し、それによって架橋ヒアルロン酸が形成される、架橋すること、並びにコラーゲンを提供すること、並びにコラーゲンを架橋ヒアルロン酸に物理的に混合することであって、それによって架橋ヒアルロン酸とコラーゲンとを含む高分子マトリックスが生成され、コラーゲンが、架橋ヒアルロン酸全体にわたって均質に混合される、混合することを含む。上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、第２の溶液は、水溶性カルボジイミド及びＮ－ヒドロキシスクシンイミド又はＮ－ヒドロキシスルホスクシンイミドを含み、ヒアルロン酸は天然に存在するアミンで架橋され、それによって架橋ヒアルロン酸が形成される。上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、第２の溶液は、水溶性カルボジイミド及びＮ－ヒドロキシスクシンイミド又はＮ－ヒドロキシスルホスクシンイミドを含み、架橋はＭＥＳの存在下で行われる。上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、第２の溶液は、水酸化ナトリウムの存在下でのヒアルロン酸ナトリウムの溶液中の１，４－ブタンジオールジグリシジルエーテル（ＢＤＤＥ）を含み、ＢＤＤＥは、エポキシド化学を用いてヒアルロン酸を架橋するために使用される。上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、物理的混合工程は緩衝液の存在下で行われる。上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、緩衝液はＰＢＳを含む。上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、コラーゲンは、コラーゲン溶液として提供され、コラーゲン溶液は、約２．０、約２．５、約３．０、約３．５、約４．０、約４．５、約５．０、約５．５、約６．０、約６．５若しくは約７．０のｐＨ、又は任意の２つの前述の値によって定義される範囲内の任意のｐＨを含み、コラーゲンは、酸性ｐＨで可溶性である。上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、コラーゲンは、酸性ｐＨの溶液として提供され、コラーゲン溶液は、約２．０、約２．５、約３．０、約３．５、約４．０、約４．５、約５．０、約５．５のｐＨ、又は任意の２つの前述の値によって定義される範囲内の任意のｐＨを含み、コラーゲンは、酸性ｐＨで可溶性である。上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、コラーゲンは、コラーゲン溶液として提供され、コラーゲン溶液は、約２．０、約２．５、約３．０、約３．５、約４．０、約４．５、約５．０、約５．５、約６．０、約６．５若しくは約７．０のｐＨ、又は任意の２つの前述の値によって定義される範囲内の任意のｐＨを含み、コラーゲンは、酸性ｐＨで可溶性である。
【0030】
上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、コラーゲンは、酸性から中性のｐＨで提供される。
【0031】
上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、本方法は、コラーゲンを架橋ヒアルロン酸全体にわたって均質に混合した後、高分子マトリックスを約７のｐＨに中和することをさらに含む。
【0032】
上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、本方法は、コラーゲンを架橋ヒアルロン酸全体にわたって均質に混合した後、高分子マトリックスを約７のｐＨに中和することをさらに含む。
【0033】
上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、コラーゲンは、プレフィブリル化のために約ｐＨ５～ｐＨ７の溶液中で提供される。上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、コラーゲンは、プレフィブリル化のために、約５．０、約５．５、約６．０、約６．５若しくは約７のｐＨ、又は任意の２つの前述の値によって定義される範囲の間の任意のｐＨを含む溶液中で提供される。
【0034】
上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、本方法は、コラーゲンを架橋ヒアルロン酸全体にわたって均質に混合した後、高分子マトリックスを約７のｐＨに中和することをさらに含む。
【0035】
上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、本方法は、コラーゲンを架橋ヒアルロン酸と物理的に混合する前に、コラーゲンを約７のｐＨに中和することを含むことをさらに含み、コラーゲンを架橋ヒアルロン酸に物理的に混合する前にコラーゲンを中和することにより、コラーゲンはコラーゲンの原線維又は粒子に沈殿し、コラーゲンの原線維又は粒子は架橋ヒアルロン酸にさらに混合され、原線維又は粒子は架橋ヒアルロン酸全体にわたって均質に混合される。
【0036】
上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、コラーゲンは、フィブリル化コラーゲン又はコラーゲン線維として提供される。
【0037】
上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、コラーゲンは塩基性ｐＨで調製され、それによってフィブリル化コラーゲン又はコラーゲン線維が生成された。
【0038】
上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、コラーゲンは、フィブリル化コラーゲン又はコラーゲン線維を得るために少なくとも１つの塩を用いて調製された。
【0039】
上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、コラーゲンは、フィブリル化コラーゲン又はコラーゲン線維を得るために少なくとも１つの塩を用いて調製された。
【0040】
上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、少なくとも１つの塩は、約２０ｍＭ、約５０ｍＭ、約１００ｍＭ、約１５０ｍＭ、約２００ｍＭ、約２５０ｍＭ、約３００ｍＭ、約３５０ｍＭ、約４００ｍＭ、約４５０ｍＭ若しくは約５００ｍＭの濃度、又は任意の２つの前述の値によって定義される範囲の間の任意の濃度を含む。
【0041】
上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、少なくとも１つの塩はアニオンを含み、アニオンはＨ２ＰＯ４－、ＳＯ４
２－、Ｃｌ－又はＳＣＮ－を含む。上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、少なくとも１つの塩は、ＮａＣｌ、Ｎａ２ＳＯ４又はＬｉ２ＳＯ４を含む。
【0042】
上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、ヒアルロン酸は、少なくとも２つの異なる分子量を含むヒアルロン酸成分の混合物を含む。
【0043】
上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、溶解工程は、ヒアルロン酸とコラーゲンの両方を水溶液に溶解して、ヒアルロン酸とコラーゲンの両方を含む反応前水溶液を形成することをさらに含み、架橋反応は、ヒアルロン酸とコラーゲンの両方を架橋してＨＡ－コラーゲン結合ゲルにすることによって反応し、混合工程は、ＨＡ－コラーゲン結合ゲルを追加のコラーゲンと物理的に混合することを含み、コラーゲンは可溶性状態にあり、コラーゲンは溶液中にあり、溶液は酸性ｐＨにあり、それによって、物理的に混合されたコラーゲンと共にＨＡ－コラーゲン結合ゲルを含む高分子マトリックスが生成される。
【0044】
上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、コラーゲン原線維又はコラーゲン沈殿物は、コラーゲンとの混合工程後に形成され、コラーゲン原線維又はコラーゲン沈殿物は、架橋ヒアルロン酸内で均質に混合される。上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、コラーゲン原線維又はコラーゲン沈殿物は、コラーゲンとの混合工程中に形成され、コラーゲン原線維又はコラーゲン沈殿物は、架橋ヒアルロン酸内で均質に混合される。
【0045】
上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、本方法は、コラーゲンを架橋ヒアルロン酸全体にわたって混合した後、高分子マトリックスの容積オスモル濃度（ｏｓｍｏｌａｒｉｔｙ）を調整することをさらに含む。
【0046】
上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、混合工程は室温で行われる。上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、混合工程は約４℃で行われる。上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、本方法は約４℃で行われる。
【0047】
上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、本方法は、架橋ヒアルロン酸又はＨＡ－コラーゲン結合ゲルを精製することをさらに含み、精製はコラーゲンとの混合工程の前に行われる。上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、精製は透析精製を用いて行われる。上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、架橋反応混合物のｐＨは、架橋が完了した後に調整され、ｐＨの調整は、精製工程の前に行われ、ｐＨは、約７．０、約７．２、約７．４、約７．６、又は任意の２つの前述の値によって定義される範囲の間の任意のｐＨに調整される。上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、精製は、約２℃～約８℃の範囲で行われる。上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、精製は、約２℃、約４℃、約６℃若しくは約８℃、又は任意の２つの前述の値によって定義される範囲の間の任意の温度で行われる。
【0048】
上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、本方法は、コラーゲンと混合する前に架橋ヒアルロン酸又はＨＡ－コラーゲン結合ゲルを滅菌することをさらに含み、滅菌工程は精製工程の後に行われる。上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、滅菌工程は、滅菌のために、架橋ヒアルロン酸又はＨＡ－コラーゲン結合ゲルを容器に移すこと、及び架橋ヒアルロン酸又はＨＡ－コラーゲン結合ゲルを滅菌することを含む。上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、容器はシリンジである。上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、滅菌は、熱（乾熱、蒸気熱、湿熱滅菌）放射（すなわち、非イオン化、ＵＶ）、イオン化（微粒子（例えば、ベータ線、ガンマ線、Ｘ線）、電磁（例えば、電子ビーム）、濾過）又は最終滅菌によって行われる。
【0049】
上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、本方法は、架橋高分子マトリックス又はＨＡ－コラーゲン結合ゲルを透析することをさらに含み、透析は、約１０００ダルトン～約１０万ダルトンの範囲内の分画分子量を有する膜を介して行われ、透析は滅菌前に行われる。上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、透析は緩衝液中で行われる。上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、透析は、リン酸緩衝生理食塩水又はリン酸ナトリウム緩衝液中で行われる。上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、緩衝液はＮａＣｌ及び／又はＫＣｌをさらに含む。
【0050】
上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、本方法は、架橋反応が完了した後に、架橋ヒアルロン酸又はＨＡ－コラーゲン結合ゲルのｐＨを中性ｐＨに上昇させることをさらに含み、ｐＨの上昇は滅菌工程の前に行われる。上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、本方法は、架橋反応が完了した後に、架橋ヒアルロン酸又はＨＡ－コラーゲン結合ゲルのｐＨを約７．０、約７．２若しくは約７．４、又は任意の２つの前述の値によって定義される範囲の間の任意のｐＨに上昇させることをさらに含み、ｐＨの上昇は滅菌工程の前に行われる。
【0051】
上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、第２の溶液は、水溶性カルボジイミド及びＮ－ヒドロキシスクシンイミド又はＮ－ヒドロキシスルホスクシンイミドを含み、添加及び架橋工程は約２℃～約２２℃の温度で行われる。上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、添加及び架橋工程は、約２℃、約４℃、約６℃、約８℃、約１０℃、約１２℃、約１４℃、約１６℃、約１８℃、約２０℃、約２２℃の温度、又は任意の２つの前述の値によって定義される範囲の間の任意の温度で行われる。
【0052】
上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、架橋は約２２℃で行われる。上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、架橋は約４℃で行われる。
【0053】
上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、第２の溶液は、水酸化ナトリウムの存在下でのヒアルロン酸ナトリウムの溶液中の１，４－ブタンジオールジグリシジルエーテル（ＢＤＤＥ）を含み、添加及び架橋工程は約４５℃～約７５℃で行われる。上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、第２の溶液は、水酸化ナトリウムの存在下でのヒアルロン酸ナトリウムの溶液中の１，４－ブタンジオールジグリシジルエーテル（ＢＤＤＥ）を含み、添加及び架橋工程は、約４５℃、約５０℃、約５５℃、約６０℃、約６５℃、約７０℃、約７５℃の温度、又は任意の２つの前述の値によって定義される範囲の間の任意の温度で行われる。上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、第２の溶液は、水酸化ナトリウムの存在下でのヒアルロン酸ナトリウムの溶液中の１，４－ブタンジオールジグリシジルエーテル（ＢＤＤＥ）を含み、添加及び架橋工程は約５０℃の温度で行われる。
【0054】
上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、本方法は、架橋工程を停止することをさらに含み、停止工程は、塩基を架橋反応混合物に約８～約１０のｐＨまで少なくとも約１０分間添加し、次いで、約７のｐＨに達するまで酸性溶液を架橋混合物に添加することを含む。
【0055】
上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、架橋反応混合物は約４．０～約１０．０のｐＨを含む。上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、架橋反応混合物のｐＨは約４．０～約６．０である。
【0056】
上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、第２の溶液は、水酸化ナトリウムの存在下でのヒアルロン酸ナトリウムの溶液中の１，４－ブタンジオールジグリシジルエーテル（ＢＤＤＥ）を含み、架橋はアルカリ性条件下で行われる。
【0057】
上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、反応前溶液は塩を含み、塩は、約５０ｍＭ、約７５ｍＭ、約１００ｍＭ、約１２５ｍＭ、約１５０ｍＭ、約１７５ｍＭ、約２００ｍＭ、約２２５ｍＭ、約２５０ｍＭ、約２７５ｍＭ、約３００ｍＭ、３２５ｍＭ、約３５０ｍＭ、約３７５ｍＭ、約４００ｍＭ、約４２５ｍＭ、約４５０ｍＭ、約４７５ｍＭ、約５００ｍＭの濃度、又は任意の２つの前述の値によって定義される範囲内の任意の濃度を含む。
【0058】
上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、水溶性カルボジイミドは１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドであり、水溶性カルボジイミドは架橋反応混合物中の約２０ｍＭ～約３００ｍＭの濃度である。上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、水溶性カルボジイミドの濃度は、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドであり、約２０ｍＭ、約４０ｍＭ、約６０ｍＭ、約８０ｍＭ、約１００ｍＭ、約１２０ｍＭ、約１４０ｍＭ、約１６０ｍＭ、約１８０ｍＭ、約２００ｍＭ、約２２０ｍＭ、約２４０ｍＭ、約２６０ｍＭ、約２８０ｍＭ、約３００、又は任意の２つの前述の値によって定義される範囲の間の任意の濃度である。上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、水溶性カルボジイミド及びヒアルロン酸は、約０．３～約３．０の水溶性カルボジイミド：ヒアルロン酸繰返し単位のモル対モル比である。上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、水溶性カルボジイミド及びヒアルロン酸は、約０．３、約０．４、約０．５、約０．６、約０．７、約０．８、約０．９、約１．０、約１．１、約１．２、約１．３、約１．４、約１．５、約１．６、約１．７、約１．８、約１．９、約２．０、約２．１、約２．２、約２．３、約２．４、約２．５、約２．６、約２．７、約２．８、約２．９若しくは約３．０の水溶性カルボジイミド：ヒアルロン酸繰返し単位のモル対モル比、又は任意の２つの前述の値によって定義される範囲の間の任意のモル対モル比である。
【0059】
上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、リシン及びヒアルロン酸は、約０．０１～約０．６のモル：モル（リシン：ＨＡ繰返し単位）比である。上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、リシン及びヒアルロン酸は、約０．０１、約０．０２、約０．０３、約０．０４、約０．０５、約０．０６、約０．０７、約０．０８、約０．０９、約０．１０、約０．１１、約０．１２、約０．１３、約０．１４、約０．１５、約０．１６、約０．１７、約０．１８、約０．１９、約０．２、約０．２１、約０．２２、約０．２３、約０．２４、約０．２５、約０．２６、約０．２７、約０．２８、約０．２９、約０．３、約０．３１、約０．３２、約０．３３、約０．３４、約０．３５、約０．３６、約０．３７、約０．３８、約０．３９、約０．４、約０．４１、約０．４２、約０．４３、約０．４４、約０．４５、約０．４６、約０．４７、約０．４８、約０．４９、約０．５、約０．５１、約０．５２、約０．５３、約０．５４、約０．５５、約０．５６、約０．５７、約０．５８、約０．５９、約０．６のモル：モル（リシン：ＨＡ繰返し単位）比、又は任意の２つの前述の値によって定義される範囲の間の任意のモル対モル比である。
【0060】
上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、反応前溶液中のヒアルロン酸は、第２の溶液を添加する前に少なくとも約６０分間水和する。上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、架橋反応混合物は約４時間～約２４時間行われる。
【0061】
上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、本方法は、リドカインを高分子マトリックスに添加することをさらに含む。上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、リドカインは、マトリックス中の約０．１５％（ｗ／ｗ）～約０．４５％（ｗ／ｗ）の範囲の間の濃度である。上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、リドカインは、マトリックス中の約０．２７％（ｗ／ｗ）～約０．３３％（ｗ／ｗ）の範囲の間の濃度である。上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、リドカインは、マトリックスの約０．１５％（ｗ／ｗ）、約０．１７％（ｗ／ｗ）、約０．１９％（ｗ／ｗ）、約０．２１％（ｗ／ｗ）、約０．２３％（ｗ／ｗ）、約０．２５％（ｗ／ｗ）、約０．２７％（ｗ／ｗ）、約０．２９％（ｗ／ｗ）、約０．３１％（ｗ／ｗ）、約０．３３％（ｗ／ｗ）、約０．３５％（ｗ／ｗ）、約０．３７％（ｗ／ｗ）、約０．３９％（ｗ／ｗ）、約０．４１％（ｗ／ｗ）、約０．４３％（ｗ／ｗ）若しくは約０．４５％（ｗ／ｗ）の濃度、又は任意の２つの前述の値によって定義される範囲の間の任意の濃度である。上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、リドカインは、マトリックス中の約０．３％（ｗ／ｗ）の濃度である。
【0062】
上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、本方法は、非架橋ＨＡをマトリックスに添加することをさらに含む。上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、非架橋ＨＡは、マトリックス中の最大約５％（ｗ／ｗ）の濃度を含む。上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、非架橋ＨＡは、マトリックス中の約０％（ｗ／ｗ）、約１％（ｗ／ｗ）、約２％（ｗ／ｗ）、約３％（ｗ／ｗ）、約４％（ｗ／ｗ）、約５％（ｗ／ｗ）の濃度、又は任意の２つの前述の値によって定義される範囲の間の任意の濃度を含む。上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、非架橋ＨＡは、マトリックス中の約１％（ｗ／ｗ）の濃度を含む。上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、非架橋ＨＡは、マトリックス中の約２％（ｗ／ｗ）の濃度を含む。上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、非架橋ＨＡは、マトリックス中の約５％（ｗ／ｗ）の濃度を含む。上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、非架橋ＨＡは、マトリックスの押出性を改善する。
【0063】
上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、本方法は、架橋ヒアルロン酸及びコラーゲンを含む高分子マトリックスを形成した後、又は物理的に混合されたコラーゲンと共にＨＡ－コラーゲン結合ゲルを形成した後に行われる中和工程を含み、中和工程は、高分子マトリックスを生理学的ｐＨ及び生理学的塩濃度に調整することを含む。
【0064】
上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、中和は、ｐＨを調整するために無菌条件下で混合工程の後に塩基性溶液又は緩衝溶液を添加することを含む。上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、ｐＨ及び生理学的塩濃度を調整することにより、コラーゲンの原線維又は粒子への沈殿が生じ、コラーゲン原線維又は粒子は高分子マトリックス中に均質に分布している。
【0065】
上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、高分子マトリックスは、針を通じた向上した押出性を有し、針は、２７Ｇ、２８Ｇ、２９Ｇ、３０Ｇ、３１Ｇ又は３２Ｇのゲージサイズを含む。
【0066】
第３の態様において、高分子マトリックスが提供され、高分子マトリックスは、本明細書に記載の実施形態のいずれか１つによって調製される。
【0067】
上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、高分子マトリックスは架橋ヒアルロン酸を含み、コラーゲンは架橋ヒアルロン酸と物理的に混合され、コラーゲンは高分子複合体全体にわたって均質である。上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、コラーゲンは高分子複合体全体にわたって均等に混合される。上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、高分子マトリックスはＨＡ－コラーゲン結合ゲルを含み、ＨＡ－コラーゲン結合ゲルは、ＨＡ－コラーゲン結合ゲルに架橋されていない物理的に混合されたコラーゲンも含む。上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、高分子マトリックスはリドカインをさらに含む。上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、リドカインは、マトリックス中の約０．１５％（ｗ／ｗ）～約０．４５％（ｗ／ｗ）の範囲の間の濃度である。上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、リドカインは、マトリックス中の約０．２７％（ｗ／ｗ）～約０．３３％（ｗ／ｗ）の範囲の間の濃度である。上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、リドカインは、マトリックスの約０．１５％（ｗ／ｗ）、約０．１７％（ｗ／ｗ）、約０．１９％（ｗ／ｗ）、約０．２１％（ｗ／ｗ）、約０．２３％（ｗ／ｗ）、約０．２５％（ｗ／ｗ）、約０．２７％（ｗ／ｗ）、約０．２９％（ｗ／ｗ）、約０．３１％（ｗ／ｗ）、約０．３３％（ｗ／ｗ）、約０．３５％（ｗ／ｗ）、約０．３７％（ｗ／ｗ）、約０．３９％（ｗ／ｗ）、約０．４１％（ｗ／ｗ）、約０．４３％（ｗ／ｗ）若しくは約０．４５％（ｗ／ｗ）の濃度、又は任意の２つの前述の値によって定義される範囲の間の任意の濃度である。上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、リドカインは、マトリックス中の約０．３％（ｗ／ｗ）の濃度である。
【0068】
上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、マトリックスは非架橋ＨＡをさらに含む。上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、非架橋ＨＡは、マトリックス中の最大５％（ｗ／ｗ）の濃度を含む。上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、非架橋ＨＡは、マトリックス中の約０％（ｗ／ｗ）、約１％（ｗ／ｗ）、約２％（ｗ／ｗ）、約３％（ｗ／ｗ）、約４％（ｗ／ｗ）、約５％（ｗ／ｗ）の濃度、又は任意の２つの前述の値によって定義される範囲の間の任意の濃度を含む。上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、非架橋ＨＡは、マトリックス中の約１％（ｗ／ｗ）の濃度を含む。上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、非架橋ＨＡは、マトリックス中の約２％（ｗ／ｗ）の濃度を含む。上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、非架橋ＨＡは、マトリックス中の約５％（ｗ／ｗ）の濃度を含む。上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、非架橋ＨＡは、マトリックスの押出性を改善する。
【0069】
第４の態様において、高分子マトリックスが提供され、高分子マトリックスは、上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかの実施形態のいずれか１つによって記載されるプロセスによって作製される。上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、本方法は、コラーゲンを架橋ＨＡに添加する前に、コラーゲンを濃縮することをさらに含む。
【0070】
第５の態様において、高分子マトリックスが提供され、高分子マトリックスは、ヒアルロン酸であって、ヒアルロン酸が架橋されている、ヒアルロン酸、及びコラーゲンであって、コラーゲンが、架橋ヒアルロン酸と物理的に混合されている、コラーゲンを含む。上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、高分子マトリックスはリドカインをさらに含む。上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、リドカインは、マトリックス中の約０．１５％（ｗ／ｗ）～約０．４５％（ｗ／ｗ）の範囲の間の濃度である。上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、リドカインは、マトリックス中の約０．２７％（ｗ／ｗ）～約０．３３％（ｗ／ｗ）の範囲の間の濃度である。上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、リドカインは、マトリックスの約０．１５％（ｗ／ｗ）、約０．１７％（ｗ／ｗ）、約０．１９％（ｗ／ｗ）、約０．２１％（ｗ／ｗ）、約０．２３％（ｗ／ｗ）、約０．２５％（ｗ／ｗ）、約０．２７％（ｗ／ｗ）、約０．２９％（ｗ／ｗ）、約０．３１％（ｗ／ｗ）、約０．３３％（ｗ／ｗ）、約０．３５％（ｗ／ｗ）、約０．３７％（ｗ／ｗ）、約０．３９％（ｗ／ｗ）、約０．４１％（ｗ／ｗ）、約０．４３％（ｗ／ｗ）若しくは約０．４５％（ｗ／ｗ）の濃度、又は任意の２つの前述の値によって定義される範囲の間の任意の濃度である。上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、リドカインは、マトリックス中の０．３％（ｗ／ｗ）の濃度である。
【0071】
上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、マトリックスは非架橋ＨＡをさらに含む。上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、非架橋ＨＡは、マトリックス中の最大約５％（ｗ／ｗ）の濃度を含む。上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、非架橋ＨＡは、マトリックス中の約０％（ｗ／ｗ）、約１％（ｗ／ｗ）、約２％（ｗ／ｗ）、約３％（ｗ／ｗ）、約４％約（ｗ／ｗ）、５％（ｗ／ｗ）の濃度、又は任意の２つの前述の値によって定義される範囲の間の任意の濃度を含む。上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、非架橋ＨＡは、マトリックス中の約１％（ｗ／ｗ）の濃度を含む。上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、非架橋ＨＡは、マトリックス中の約２％（ｗ／ｗ）の濃度を含む。上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、非架橋ＨＡは、マトリックス中の約５％（ｗ／ｗ）の濃度を含む。上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、非架橋ＨＡは、マトリックスの押出性を改善する。
【0072】
第６の態様において、高分子マトリックスが提供され、高分子マトリックスは、ＨＡ－コラーゲン結合ゲルであって、ＨＡ－コラーゲン結合ゲルが、コラーゲンで架橋されたヒアルロン酸を含む、ＨＡ－コラーゲン結合ゲル、及び物理的に混合されたコラーゲンであって、物理的に混合されたコラーゲンが、ＨＡ－コラーゲン結合ゲルに架橋されておらず、物理的に混合されたコラーゲンが、ＨＡ－コラーゲン結合ゲル内で均質に混合されている、物理的に混合されたコラーゲンを含む。上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、高分子マトリックスはリドカインをさらに含む。上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、リドカインは、マトリックス中の約０．１５％（ｗ／ｗ）～約０．４５％（ｗ／ｗ）の範囲の間の濃度である。上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、リドカインは、マトリックス中の約０．２７％（ｗ／ｗ）～約０．３３％（ｗ／ｗ）の範囲の間の濃度である。上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、リドカインは、マトリックスの約０．１５％（ｗ／ｗ）、約０．１７％（ｗ／ｗ）、約０．１９％（ｗ／ｗ）、約０．２１％（ｗ／ｗ）、約０．２３％（ｗ／ｗ）、約０．２５％（ｗ／ｗ）、約０．２７％（ｗ／ｗ）、約０．２９％（ｗ／ｗ）、約０．３１％（ｗ／ｗ）、約０．３３％（ｗ／ｗ）、約０．３５％（ｗ／ｗ）、約０．３７％（ｗ／ｗ））、約０．３９％（ｗ／ｗ）、約０．４１％（ｗ／ｗ）、約０．４３％（ｗ／ｗ）若しくは約０．４５％（ｗ／ｗ）の濃度、又は任意の２つの前述の値によって定義される範囲の間の任意の濃度である。上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、リドカインは、マトリックス中の約０．３％（ｗ／ｗ）の濃度である。
【0073】
上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、マトリックスは非架橋ＨＡをさらに含む。上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、非架橋ＨＡは、マトリックス中の最大約５％（ｗ／ｗ）の濃度を含む。上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、非架橋ＨＡは、マトリックス中の約０％（ｗ／ｗ）、約１％（ｗ／ｗ）、約２％（ｗ／ｗ）、約３％（ｗ／ｗ）、約４％（ｗ／ｗ）、約５％（ｗ／ｗ）の濃度、又は任意の２つの前述の値によって定義される範囲の間の任意の濃度を含む。上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、非架橋ＨＡは、マトリックス中の約１％（ｗ／ｗ）の濃度を含む。上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、非架橋ＨＡは、マトリックス中の約２％（ｗ／ｗ）の濃度を含む。上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、非架橋ＨＡは、マトリックス中の約５％（ｗ／ｗ）の濃度を含む。上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、非架橋ＨＡは、マトリックスの押出性を改善する。
【0074】
上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、ヒアルロン酸は天然に存在するアミンで架橋されている。上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、天然に存在するアミンはリシンに由来する。上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、コラーゲンは、ウシコラーゲン、マリンコラーゲン、ヒトコラーゲン又はブタコラーゲンに由来する。上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、コラーゲンは組換えヒトコラーゲンである。
【0075】
上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、高分子マトリックスは、約１００Ｐａ、約２００Ｐａ、約３００Ｐａ、約４００Ｐａ、約５００Ｐａ、約６００Ｐａ、約７００Ｐａ、約８００Ｐａ、約９００Ｐａ、約１０００Ｐａ、約１１００Ｐａ、約１２００Ｐａ、約１３００Ｐａ、約１４００Ｐａ、約１５００Ｐａ、約１６００Ｐａ、約１７００Ｐａ、約１８００Ｐａ、約１９００Ｐａ、約２０００Ｐａ、約２１００Ｐａ、約２２００Ｐａ、約２３００Ｐａ、約２４００Ｐａ、約２５００Ｐａ、約２６００Ｐａ、約２７００Ｐａ、約２８００Ｐａ、約２９００Ｐａ若しくは約３０００Ｐａ、又は任意の２つの前述の値によって定義される範囲の間の任意の値の弾性率（Ｇ’）を含む。
【0076】
上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、高分子マトリックスは、約１０ｇｍｆ、約２０ｇｍｆ、約３０ｇｍｆ、約４０ｇｍｆ、約５０ｇｍｆ、約６０ｇｍｆ、約７０ｇｍｆ、約８０ｇｍｆ、約９０ｇｍｆ、約１００ｇｍｆ、約１１０ｇｍｆ、約１２０ｇｍｆ、約１３０ｇｍｆ、約１４０ｇｍｆ、約１５０ｇｍｆ、約１６０ｇｍｆ、約１７０ｇｍｆ、約１８０ｇｍｆ、約１９０ｇｍｆ、約２００ｇｍｆ、約２１０ｇｍｆ、約２２０ｇｍｆ、約２３０ｇｍｆ、約２４０ｇｍｆ、約２５０ｇｍｆ、約２６０ｇｍｆ、約２７０ｇｍｆ、約２８０ｇｍｆ、約２９０ｇｍｆ、約３００ｇｍｆ、約３１０ｇｍｆ、約３２０ｇｍｆ、約３３０ｇｍｆ、約３４０ｇｍｆ、約３５０ｇｍｆ、約３６０ｇｍｆ、約３７０ｇｍｆ、約３８０ｇｍｆ、約３９０ｇｍｆ、約４００ｇｍｆ、約４１０ｇｍｆ、約４２０ｇｍｆ、約４３０ｇｍｆ、約４４０ｇｍｆ、約４５０ｇｍｆ、約４６０ｇｍｆ、約４７０ｇｍｆ、約４８０ｇｍｆ、約４９０ｇｍｆ、約５００ｇｍｆ、約５１０ｇｍｆ、約５２０ｇｍｆ、約５３０ｇｍｆ、約５４０ｇｍｆ、約５５０ｇｍｆ、約５６０ｇｍｆ、約５７０ｇｍｆ、約５８０ｇｍｆ、約５９０ｇｍｆ若しくは約６００ｇｍｆの圧縮力値、又は任意の２つの前述の値によって定義される範囲の間の任意の圧縮力値を含む。
【0077】
上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、ヒアルロン酸は、約２ｍｇ／ｍｌ、約４ｍｇ／ｍｌ、約６ｍｇ／ｍｌ、約８ｍｇ／ｍｌ、約１０ｍｇ／ｍｌ、約１２ｍｇ／ｍｌ、約１４ｍｇ／ｍｌ、約１６ｍｇ／ｍｌ、約１８ｍｇ／ｍｌ、約２０ｍｇ／ｍｌ、約２２ｍｇ／ｍｌ、約２４ｍｇ／ｍｌ、約２６ｍｇ／ｍｌ、約２８ｍｇ／ｍｌ、約３０ｍｇ／ｍｌ、３２ｍｇ／ｍｌ、約３４ｍｇ／ｍｌ若しくは約３６ｍｇ／ｍｌの濃度、又は任意の２つの前述の値によって定義される範囲の間の任意の濃度である。
【0078】
上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、ヒアルロン酸対コラーゲンの重量比は、約２０：３、約２４：２．３、約２４：１０、約２４：１２、約２４：４、約２４：６、約２８：６又は約２８：１１である。
【0079】
上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、ヒアルロン酸はヒアルロン酸の混合物を含み、混合物は、２つの異なる分子量を含むＨＡの５０：５０ブレンドを含む。
【0080】
上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、コラーゲンはＩ型コラーゲン及び／又はＩＩＩ型コラーゲンを含む。
【0081】
上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、コラーゲンは、約１ｍｇ／ｍｌ、約２ｍｇ／ｍｌ、約３ｍｇ／ｍｌ、約４ｍｇ／ｍｌ、約６ｍｇ／ｍｌ、約７ｍｇ／ｍｌ、約８ｍｇ／ｍｌ、約９ｍｇ／ｍｌ、約１０ｍｇ／ｍｌ、約１１ｍｇ／ｍｌ、約１２ｍｇ／ｍｌ、約１３ｍｇ／ｍｌ、約１４ｍｇ／ｍｌ若しくは約１５ｍｇ／ｍｌ、約１６ｍｇ／ｍｌ、約１７ｍｇ／ｍｌ、約１８ｍｇ／ｍｌ、約１９ｍｇ／ｍｌ、約２０ｍｇ／ｍｌ、約２１ｍｇ／ｍｌ、約２２ｍｇ／ｍｌ、約２３ｍｇ／ｍｌ、約２４ｍｇ／ｍｌ、約２５ｍｇ／ｍｌの濃度、又は任意の２つの前述の値によって定義される範囲の間の任意の濃度である。
【0082】
上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、高分子マトリックスは、２５０ｍＯｓｍ／ｋｇ～３５０ｍＯｓｍ／ｋｇの重量オスモル濃度を含む。
【0083】
上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、高分子マトリックスは、約２５０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２７５ｍＯｓｍ／ｋｇ、約３００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約３２５ｍＯｓｍ／ｋｇ若しくは約３５０ｍＯｓｍ／ｋｇの間の重量オスモル濃度、又は任意の２つの前述の値によって定義される範囲の間の任意の重量オスモル濃度を含む。
【0084】
上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、ヒアルロン酸は直鎖状である。
【0085】
上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、高分子マトリックスは、約１０Ｐａ、約２０Ｐａ、約３０Ｐａ、約４０Ｐａ、約５０Ｐａ、約６０Ｐａ、約７０Ｐａ、約８０Ｐａ、約９０Ｐａ、約１００Ｐａ、約２００Ｐａ、約３００Ｐａ、約４００Ｐａ、約５００Ｐａ、約６００Ｐａ、約７００Ｐａ、約８００Ｐａ、約９００Ｐａ若しくは約１０００Ｐａの粘性率（Ｇ’’）、又は任意の２つの前述の値によって定義される範囲の間の任意の粘性率（Ｇ’’）を含む。
【0086】
上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、高分子マトリックスは、約０．０１、約０．０２、約０．０３、約０．０４、約０．０５、約０．０６、約０．０７、約０．０８、約０．０９、約０．１、約０．１２、約０．１４、約０．１６、約０．１８、約０．２０、約０．２２、約０．２４、約０．２６、約０．２８、約０．３０、約０．３２、約０．３４、約０．３６、約０．３８、約０．４０、約０．４２、約０．４４、約０．４６、約０．４８、約０．５０のタンデルタ（Ｇ’’／Ｇ’）、又は任意の２つの前述の値によって定義される範囲の間のタンデルタ（Ｇ’’／Ｇ’）を含む。
【0087】
上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、高分子マトリックスは、約６．５、約６．６、約６．７、約６．８、約６．９、約７．０、約７．１、約７．２、約７．３、約７．４、約７．５、約７．６、約７．７、約７．８、約７．９、約８．０のｐＨ、又は任意の２つの前述の値によって定義される範囲内の任意のｐＨを含む。
【0088】
第７の態様において、ヒトの解剖学的特徴の審美的質を改善する方法が提供される。本方法は、ヒトの組織に組成物を注入し、それによって解剖学的特徴の審美的質を改善することであって、組成物が、本明細書に記載の実施形態のいずれか１つの方法によって調製された高分子マトリックス又は本明細書に記載の実施形態のいずれか１つの高分子マトリックスを含む、改善することを含む。
【0089】
第８の態様において、ヒトの解剖学的特徴の審美的質を改善する方法が提供され、本方法は、ヒトの組織に組成物を注入し、それによって解剖学的特徴の審美的質を改善することであって、組成物が、架橋ヒアルロン酸、リシン、及びコラーゲンを含む高分子マトリックスを含み、コラーゲンが架橋ヒアルロン酸に物理的に混合されている、改善することを含む。
【0090】
上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、コラーゲンはＩ型コラーゲン及び／又はＩＩＩ型コラーゲンを含む。
【0091】
上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、本方法は、注入部位に青みがかった変色を引き起こさない。
【0092】
第９の態様では、組成物をヒトの組織に注入することによってヒトの外観を改善する方法であって、それによって、組成物が、それが注入された周囲組織から組成物への細胞浸潤及びコラーゲン沈着を促進する、方法が提供される。本方法は、ヒトの組織に組成物を注入し、それによって解剖学的特徴の審美的質を改善することであって、組成物が、ヒアルロン酸、リシン、及びコラーゲンを含む架橋高分子マトリックスを含み、ヒアルロン酸が、コラーゲンと物理的に混合された架橋ヒアルロン酸を含み、かつ組成物によって注入された組織が、組成物と一体化することが示される、改善することを含む。上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、高分子マトリックスはリドカインをさらに含む。上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、リドカインは、マトリックス中の約０．１５％（ｗ／ｗ）～約０．４５％（ｗ／ｗ）の範囲の間の濃度である。上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、リドカインは、マトリックス中の約０．２７％（ｗ／ｗ）～約０．３３％（ｗ／ｗ）の範囲の間の濃度である。上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、リドカインは、マトリックスの約０．１５％（ｗ／ｗ）、約０．１７％（ｗ／ｗ）、約０．１９％（ｗ／ｗ）、約０．２１％（ｗ／ｗ）、約０．２３％（ｗ／ｗ）、約０．２５％（ｗ／ｗ）、約０．２７％（ｗ／ｗ）、約０．２９％（ｗ／ｗ）、約０．３１％（ｗ／ｗ）、約０．３３％（ｗ／ｗ）、約０．３５％（ｗ／ｗ）、約０．３７％（ｗ／ｗ）、約０．３９％（ｗ／ｗ）、約０．４１％（ｗ／ｗ）、約０．４３％（ｗ／ｗ）若しくは約０．４５％（ｗ／ｗ）の濃度、又は任意の２つの前述の値によって定義される範囲の間の任意の濃度である。上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、リドカインは、マトリックス中の０．３％（ｗ／ｗ）の濃度である。
【0093】
上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、マトリックスは非架橋ＨＡをさらに含む。上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、非架橋ＨＡは、マトリックス中の最大約５％（ｗ／ｗ）の濃度を含む。上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、非架橋ＨＡは、マトリックス中の０％（ｗ／ｗ）、約１％（ｗ／ｗ）、約２％（ｗ／ｗ）、約３％（ｗ／ｗ）、約４％（ｗ／ｗ）若しくは約５％（ｗ／ｗ）の濃度、又は任意の２つの前述の値によって定義される範囲の間の任意の濃度を含む。上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、非架橋ＨＡは、マトリックス中の約１％（ｗ／ｗ）の濃度を含む。上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、非架橋ＨＡは、マトリックス中の約２％（ｗ／ｗ）の濃度を含む。上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、非架橋ＨＡは、マトリックス中の約５％（ｗ／ｗ）の濃度を含む。上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、非架橋ＨＡは、マトリックスの押出性を改善する。
【0094】
上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、ヒアルロン酸成分は、約１万ダルトン、約２万ダルトン、約３万ダルトン、４万ダルトン、約５万ダルトン、約６万ダルトン、約７万ダルトン、約８万ダルトン、約１０万ダルトン、約２０万ダルトン、約３０万ダルトン、約４０万ダルトン、約５０万ダルトン、約６０万ダルトン、約７０万ダルトン、約８０万ダルトン、約９０万ダルトン、約１００万ダルトン、約１１０万ダルトン、約１２０万ダルトン、約１３０万ダルトン、約１４０万ダルトン、約１５０万ダルトン、約１６０万ダルトン、約１７０万ダルトン、約１８０万ダルトン、約１９０万ダルトン、約２００万ダルトン、約２１０万ダルトン、約２２０万ダルトン、約２３０万ダルトン、約２４０万ダルトン、約２５０万ダルトン、約２６０万ダルトン、約２７０万ダルトン、約２８０万ダルトン、約２９０万ダルトン、約３００万ダルトン、約３１０万ダルトン、約３２０万ダルトン、約３３０万ダルトン、約３４０万ダルトン、約３５０万ダルトン、約３６０万ダルトン、約３７０万ダルトン、約３８０万ダルトン、約３９０万ダルトン、約４００万ダルトン、約４１０万ダルトン、約４２０万ダルトン、約４３０万ダルトン、約４４０万ダルトン、約４５０万ダルトン、約４６０万ダルトン、約４７０万ダルトン、約４８０万ダルトン、約４９０万ダルトン、約５００万ダルトン、約５１０万ダルトン、約５２０万ダルトン、約５３０万ダルトン、約５４０万ダルトン、約５５０万ダルトン、約５６０万ダルトン、約５７０万ダルトン、約５８０万ダルトン、約５９０万ダルトン、約６００万ダルトン、約６１０万ダルトン、約６２０万ダルトン、約６３０万ダルトン、約６４０万ダルトン、約６５０万ダルトン、約６６０万ダルトン、約６７０万ダルトン、約６８０万ダルトン、約６９０万ダルトン、約７００万ダルトン、約７１０万ダルトン、約７２０万ダルトン、約７３０万ダルトン、約７４０万ダルトン、約７５０万ダルトン、約７６０万ダルトン、約７７０万ダルトン、約７８０万ダルトン、約７９０万ダルトン、約８００万ダルトン、約８１０万ダルトン、約８２０万ダルトン、約８３０万ダルトン、約８４０万ダルトン、約８５０万ダルトン、約８６０万ダルトン、約８７０万ダルトン、約８８０万ダルトン、約８９０万ダルトン、約９００万ダルトン、約９１０万ダルトン、約９２０万ダルトン、約９３０万ダルトン、約９４０万ダルトン、約９５０万ダルトン、約９６０万ダルトン、約９７０万ダルトン、約９８０万ダルトン、約９９０万ダルトン若しくは約１０００万ダルトンの平均分子量、又は任意の２つの前述の値によって定義される範囲の間の任意の重量を有する。上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、架橋ヒアルロン酸のヒアルロン酸は、少なくとも２つの異なる分子量を含むヒアルロン酸成分の混合物を含む。
【0095】
上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、コラーゲンはＩ型コラーゲン及び／又はＩＩＩ型コラーゲンを含む。
【0096】
上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、組成物によって注入された組織は、周囲組織からの細胞に浸潤することによって、組成物内のコラーゲン沈着と共に組成物と一体化することが示される。
【0097】
上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、組成物によって注入された組織は、組成物の注入後に注入組成物内のコラーゲン沈着と共に組成物と一体化することが示される。
【図面の簡単な説明】
【0098】
【図1】様々な量のコラーゲン及びヒアルロン酸を有するヒドロゲルの異なる組成のいくつかの例を示す図である。ヒドロゲルの不透明度は、約６．５ｍｇ／ｍｌ ＨＡを含有するゲル及び約１２．７ｍｇ／ｍｌヒアルロン酸を含有するゲルについて、コラーゲン濃度の増加と共に増加する。
【0099】
【図2】直径２５ｍｍ及びギャップ長１ｍｍの２つの平行プレート間での周波数５Ｈｚ及び歪み０．８％での２５℃におけるＨＡ－コラーゲンヒドロゲルのＧ’、Ｇ’’及びタンデルタを示す図である。
【0100】
【図3】ヒドロゲル配合物の膨潤を示す図である。
【0101】
【図4】ＨＡ－コラーゲン配合物に関する２．５から０．９ｍｍのギャップの圧縮力の変化を示す図である。
【0102】
【図5】１ｍＬ ＢＤツベルクリンシリンジを用いた２７Ｇ－１／２インチ針を通じたＨＡ－コラーゲンヒドロゲルの平均押出力を示す図である。
【0103】
【図6】ＨＡ濃度の増加に伴うＮＯＡ架橋配合物のリフトを示すラットモデルに埋め込まれたＢＤＤＥ架橋及び天然に存在するアミン（ＮＯＡ）架橋ＨＡヒドロゲル試料の経時的な平均高さを示す図である。
【0104】
【図7】リフト能力に対するコラーゲン混合（３ｍｇ／ｍＬ未満）の効果を示す、ラットモデルに埋め込まれたＢＤＤＥ架橋及びＮＯＡ架橋ＨＡ－コラーゲンヒドロゲル試料の経時的な平均高さを示す図である。
【0105】
【図8】リフト能力に対するコラーゲン混合（最大１１ｍｇ／ｍＬ）の効果を示す、ラットモデルに埋め込まれたＢＤＤＥ架橋及びＮＯＡ架橋ＨＡ－コラーゲンヒドロゲル試料の経時的な平均高さを示す図である。
【0106】
【図9】ＢＤＤＥ架橋及びＮＯＡ架橋ＨＡ－コラーゲンヒドロゲル上で培養したヒト皮膚線維芽細胞の細胞生存率を示す図である。＊ｐ＜０．０５、Ｔｕｋｅｙ事後検定によるＡＮＯＶＡ。
【0107】
【図10】ＮＯＡヒドロゲル又はＮＯＡ架橋ＨＡ－コラーゲンヒドロゲル（２４ｍｇ／ｍＬ ＨＡ、６ｍｇ／ｍＬコラーゲン）上で培養したヒト皮膚線維芽細胞の細胞形態解析を示す図である。＊ｐ＜０．０５、スチューデントｔ検定。
【0108】
【図11】３ｍｇ／ｍＬコラーゲンを含有する２０ｍｇ／ｍＬ ＨＡヒドロゲルボーラス中のコラーゲン沈着の増加を示すラットＩ型コラーゲンの免疫組織化学を示す図である。
【0109】
【図12】２８ｍｇ／ｍＬ ＨＡを含有するヒドロゲルボーラスの中心の封入を示すラットＩ型コラーゲンの免疫組織化学を示す図である。最大１１ｍｇ／ｍＬのコラーゲンの添加は、ヒドロゲルボーラスの周囲に沿ったコラーゲン沈着の中程度の改善をもたらす。
【0110】
【図13】コラーゲン濃度の増加（２．３ｍｇ／ｍＬ～６ｍｇ／ｍＬ）に伴う２４ｍｇ／ｍＬ ＨＡヒドロゲルボーラス内のコラーゲン沈着の増加を示すラットＩ型コラーゲンの免疫組織化学を示す図である。２４ｍｇ／ｍＬ ＨＡ及び６ｍｇ／ｍＬコラーゲン（２４ＮＯＡ６ＣＮ）を含有する配合物は、最も堅固な組織一体化を示す。
【0111】
【図14】ラットへの皮下埋込み後４～１２週のＢＤＤＥ架橋ＨＡ及びＮＯＡ架橋ＨＡ－コラーゲンヒドロゲル内のコラーゲン沈着／組織一体化を示すラットＩ型コラーゲンの免疫組織化学を示す図である。２４ｍｇ／ｍＬ ＨＡ及び６ｍｇ／ｍＬコラーゲン（２４ＮＯＡ６ＣＮ）を含有する配合物は、ＢＤＤＥ架橋ＨＡのみのゲルよりも４週及び１２週でより堅固な組織一体化を示す。組織一体化は、２４ＮＯＡ６ＣＮ配合物において４週～１２週で改善するようである。
【0112】
【図15】ＢＤＤＥ架橋ＨＡのみのヒドロゲル及び２４ＮＯＡ６ＣＮヒドロゲルへの組織一体化の半定量的組織病理スコアリングを示す図である。スコアリングシステム：最良の一体化＝１０、最悪の一体化＝－５。（Ａ）２４ＮＯＡ６ＣＮヒドロゲルボーラスへの組織一体化の増強及び関連する組織病理スコアを示すコロイド鉄染色。（Ｂ）ラットへの４及び１２週の皮下埋込み後のＨＡのみのＢＤＤＥ架橋ヒドロゲル及び２４ＮＯＡ６ＣＮの組織病理学的スコアリングを示す棒グラフである。２４ＮＯＡ６ＣＮゲルは、１２週後に最も高い組織一体化を示す。
【発明を実施するための形態】
【0113】
日光曝露、遺伝、疾患、傷害及び生活習慣などの要因は、我々の根底にある組織を破壊し、組織のしわ、ひだ及びたるみをもたらし、老化の目に見える影響をもたらす我々の皮膚の望ましくない変化をもたらし得る。これらの変化は、大部分が脂肪組織並びにコラーゲン及びエラスチンなどの細胞外マトリックスタンパク質の損失に起因し得る。これらの成分の損失は、皮膚の層の薄層化に寄与し得、これは骨及び筋肉構造の変化と共に、容積の損失及び線の形成をもたらし得る。皮膚をその以前の若い外観に戻すために、現在のアプローチは、皮膚の容積を回復させ、厚さを増加させることを目的としている。
【0114】
皮膚充填剤は、線の消去及び容積の回復に利用可能な多くの処置の１つである。注入後、皮膚充填剤は、失われたコラーゲン及びエラスチンの代わりをするように働き、したがって皮膚を厚くし、組織を持ち上げ、最終的に線を除去する。皮膚充填剤の効果は一時的であり、経時的に徐々に失われる。その結果、その後の注入は、若い外観を維持するために必要とされる。
【0115】
ヒアルロン酸（ＨＡ）皮膚充填剤は、線の除去に非常に効果的であり、いくつかの理由で市場を独占している。皮膚充填剤は、組織中の充填剤の持続時間に影響を及ぼすように修飾されてもよい。限定するものではないが、皮膚充填剤の架橋を変化させるなどの修飾は、例えば、組織中の充填剤の持続時間に影響を及ぼす可能性がある。
【0116】
その長く持続する利益とは別に、ＨＡ皮膚充填剤は可逆的でもある。可逆性は、特に充填剤が誤って配置された場合、又は閉塞した血管などの有害事象（ＡＥ）が発生した場合に重要な利益である。例えばＡＥの場合には、患部にヒアルロニダーゼを注入することにより、皮膚充填剤を迅速に分解することができる。ヒアルロニダーゼは、ＨＡを分解し、ゲル充填剤を患部から拡散し得る液体溶液に変換する酵素である。これらの利益が、ＨＡ皮膚充填剤を今日の市場で最も人気のある充填剤の１つにした。
【0117】
ＨＡ皮膚充填剤の利益にもかかわらず、それらの性能を改善することができる。例えば、ＨＡ充填剤は、コラーゲンなどの若さに関連する細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質の合成を補充及び／又は有意に刺激しない。さらに、表面的に注入された場合、ＨＡ皮膚充填剤は、チンダル効果として知られる皮膚の表面で青みがかった変色として現れるＡＥをもたらす場合がある（Ｃｏｈｅｎら、Ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ，ａｖｏｉｄｉｎｇ，ａｎｄ ｍａｎａｇｉｎｇ ｄｅｒｍａｌ ｆｉｌｌｅｒ ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ Ｓｕｒｇ，２００８．３４補遺１：第Ｓ９２－９頁、参照により本明細書に組み込まれる）。これは、皮膚充填剤中の透明粒子が青みがかった色合いをもたらすように光を散乱させる結果である。注入されたＨＡ製品及び注入の解剖学的領域は両方とも、チンダル効果を示す確率に影響を及ぼし得る（Ｂａｉｌｅｙら、Ｅｔｉｏｌｏｇｙ，ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ，ａｎｄ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｄｅｒｍａｌ ｆｉｌｌｅｒ ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ａｅｓｔｈｅｔ Ｓｕｒｇ Ｊ、２０１１．３１（１）：第１１０－２１頁、参照により本明細書に組み込まれる）。ＨＡは極めて親水性であり、水を強く引き付けるため、膨潤もＨＡ充填剤の懸念となり得る。したがって、ヒドロゲル中のＨＡの濃度が増加するか、又は架橋度が低下するにつれて、水の吸収も増加する。例えば、いくつかのＨＡ充填剤は、塩水に曝露された場合、それらの開始重量の６倍超を吸収することができる。水の吸収は、特に充填剤が表面的に注入されるか、又は皮膚が薄い領域に注入される場合に、膨潤をもたらし得る。さらに、ＨＡのみを含む市場で入手可能な充填剤は、組織一体化を可能にすることが示されなかった。これらの懸念にもかかわらず、ＨＡ皮膚充填剤は、その性能のために依然として市場で最も人気のある充填剤である。
【0118】
コラーゲン皮膚充填剤は１９８１年に市場に導入された。コラーゲンは、皮膚の天然成分であり、皮膚に強度、ふんわり感及び質感を与えるため、この用途に理想的な材料である。注入されると、これらの充填剤はコラーゲンを皮膚に戻し、したがって若さに関連するＥＣＭタンパク質を補充する。さらに、ゲルはチンダル効果をもたらさない。例えば、Ｚｙｄｅｒｍ（登録商標）１及びＣｏｓｍｏｄｅｒｍ（登録商標）１のようなコラーゲン皮膚充填剤が、真皮乳頭層への注入に推奨された（Ｇｏｌｄら、Ｕｓｅ ｏｆ ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ ｆｉｌｌｅｒｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ａｇｉｎｇ ｆａｃｅ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎｓ ｉｎ Ａｇｉｎｇ、２００７．２（３）：第３６９～３７６頁、参照により本明細書に組み込まれる）。それらが表面的に注入されたとしても、材料の不透明な外観が、チンダル効果の観察を妨げた。したがって、コラーゲン充填剤は、ＨＡ系充填剤よりもいくつかの利益を提供する。
【0119】
これらの利益にもかかわらず、コラーゲン充填剤には、ＨＡ充填剤を好ましいものにするいくつかの欠点がある。例えば、コラーゲン充填剤は、ＨＡ充填剤と同様に、注入可能な市販の酵素溶液を使用して逆転させることができない。コラーゲン皮膚充填剤は、所望の結果を達成するために高いコラーゲン濃度（３５～６５ｍｇ／ｍＬコラーゲン）で提供され、この高いコラーゲン濃度は、有害反応の場合に除去することが困難であり得る。さらに、コラーゲン皮膚充填剤は、限られた期間、平均して３～６ヶ月の補正を示した。コラーゲンの架橋は、皮膚のより深くに配置することができるより堅固なヒドロゲルをもたらし、持続時間の改善をもたらすことができる。しかしながら、架橋コラーゲンゲルは、非架橋コラーゲン充填剤よりも体内に存在するコラーゲンに類似しておらず、したがって天然性が低い。
【0120】
以下の実施形態では、物理的に混合されたコラーゲンを含有するＨＡ充填剤で作製されたハイブリッド材料の調製及び特性評価を記載する。材料は、各材料が単独で示す懸念を排除しながら、コラーゲン及びＨＡ充填剤の両方によって提供される利益を利用する。
【0121】
材料のハイブリッドの性質により、ＨＡ皮膚充填剤の利益が保持される一方で、コラーゲンの包含がこれらの懸念に積極的に対処する。例えば、ＨＡゲルへのコラーゲンの添加は、チンダル効果の懸念に対処することができる不透明な配合物をもたらす（例２及び図１参照）。さらに、コラーゲンを含めることにより、膨潤特性を変えることなく高いゲル剛性が可能になる。ＨＡ充填剤単独では、Ｇ’（すなわち、剛性）は、ＨＡ濃度を増加させるか、又はヒドロゲルネットワークの架橋密度を増加させることによって増加させることができる。しかしながら、ＨＡ濃度の増加は膨潤の増加をもたらすが、より高度に架橋されたゲルはより低い膨潤を示す。したがって、物理的に混合されたＨＡコラーゲンヒドロゲルは、膨潤特性に影響を及ぼすことなく、Ｇ’／剛性がコラーゲン濃度と共に増加するという点で独特である（例３及び４）。最後に、コラーゲンは若い皮膚に関連するので、コラーゲンと混合したＨＡ充填剤の組成物の注入は、若い皮膚に関連するＥＣＭタンパク質を補充することができる。コラーゲンと混合されたＨＡ充填剤は、注入後の組織内殖及び新たなコラーゲン沈着のための足場としても機能する。この増強された組織一体化は、より自然で長く持続する効果につながる可能性がある。したがって、コラーゲンをＨＡ皮膚充填剤に組み込んだ場合、驚くべきことに、最終製品の物理的特性及び生物学的性能が改善される。
【0122】
同様に、コラーゲン皮膚充填剤の欠点は、配合物中にＨＡ皮膚充填剤を含めることによって対処することができる。例えば、コラーゲンと混合されたより長く持続するＨＡ皮膚充填剤を使用することによって、コラーゲン充填剤の短い持続時間を改善することができる。さらに、所望の生物学的効果を達成するためにコラーゲンと混合されたＨＡ充填剤の配合物に必要なコラーゲンは有意に少なく、したがって、注入されたヒアルロニダーゼを使用して組成物のＨＡ部分を分解することができるため、配合物の可逆性はコラーゲンのみの皮膚充填剤よりも向上する。ＨＡ－コラーゲンゲルでは、充填効果はＨＡ皮膚充填剤に起因する。ＡＥに遭遇した場合、ヒアルロニダーゼを使用してＨＡを分解し、したがって材料を液体にし、患者の安全性を保証することができる。したがって、コラーゲン配合物との混合ＨＡ皮膚充填剤は、ＨＡ又はコラーゲンを単独で使用するよりも実質的な利益を提供する。
【0123】
本明細書の実施形態に記載されるように、混合ＨＡ及びコラーゲン組成物は、驚くべき有益な特性を有するヒドロゲルをもたらした。ＨＡとコラーゲンの異なる組合せ濃度は、リフト及び組織一体化を可能にするヒドロゲルをもたらすことが見出された。いくつかの実施形態において、２０ｍｇ／ｍｌ ＨＡ又は２４ｍｇ／ｍｌ ＨＡを含む組成物は、組織の良好なリフトをもたらした。しかしながら、濃度が少なくとも２８ｍｇ／ｍｌに増加したいくつかの組成物は、改善されたリフトをもたらしたが、注入部位への組織一体化を改善しなかった。いくつかの実施形態において、組成物は、２４ｍｇ／ｍｌのＨＡ及び６ｍｇ／ｍｌのコラーゲンを含んでいた。いくつかの実施形態において、組成物は、２０ｍｇ／ｍｌのＨＡ及び１０ｍｇ／ｍｌのコラーゲンを含んでいた。いくつかの実施形態において、組成物は、組織リフト及び組成物注入部位への組織一体化の増強をもたらした。いくつかの実施形態において、組成物は、ＨＡのみのゲルと比較して、良好なリフト及びより高い組織一体化を有していた。
【0124】
注入の容易さもまた、皮膚充填剤の重要な特性であり、押出力（ＥＦ）測定を使用して定量化することができる。本質的に、ＥＦは、特定のゲージ針を通じてゲルを押し出すためにプランジャに加えられる必要がある力である。容易に注入される皮膚充填剤は、大きさがより小さい押出力と、シリンジの長さにわたって滑らかで均一な押出プロファイルとを特徴とするであろう。４０Ｎ未満の力が許容可能であると考えられ、注入中の注入の容易さ、並びに制御及び精度を可能にする。ＨＡコラーゲン配合物の平均押出力は、実質的に４０Ｎ未満である（例６参照）。本明細書のいくつかの実施形態において、高分子マトリックスは４０Ｎ未満の押出力を有する。さらに、押出力曲線は滑らかに見え、材料が均質であることを示唆する。したがって、ＨＡコラーゲン皮膚充填剤は、細ゲージ針を通じて容易に注入される。上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、高分子複合体は非架橋ＨＡをさらに含む。上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、非架橋ＨＡは、１％、２％又は５％の高分子複合体中の濃度である。上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、非架橋ＨＡは、押出性を容易にし、組成物の押出力を低下させる。
【0125】
本明細書のこれらの実施形態は、コラーゲンと物理的に混合されたＨＡ皮膚充填剤を具体的に記載する。あるいは、コラーゲンをＨＡと化学的に架橋して、異なる種類のＨＡコラーゲンゲルを形成することができる。しかしながら、化学的に架橋されたゲルと比較した場合、物理的に混合されたゲルは、天然の組織に見られるコラーゲンによりよく似たコラーゲンを含有する。
【0126】
上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、組成物は、皮膚の水和、弾力性の改善及び皮膚の細い線の減少などの皮膚の質の改善をもたらす。
【0127】
他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
【0128】
本明細書で使用される場合、「ａ」又は「ａｎ」は、１つ以上を意味する場合がある。測定可能な値に言及するときに本明細書で使用される「約」は、指定された値から＋２０％又は＋１０％、より好ましくは＋５％、さらにより好ましくは＋１％、さらにより好ましくは＋０．１％の変動を包含することを意味する。
【0129】
本明細書で使用される場合、文脈がそうでないことを要求する場合を除いて、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という用語並びに「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」及び「含まれる（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ）」などの用語の変形は、さらなる付加物、構成要素、整数又は工程を排除することを意図しない。
【0130】
「ヒアルロン酸」又は「ＨＡ」という用語は、結合組織、上皮組織及び神経組織において人体全体に広く分布する非硫酸化グリコサミノグリカンである。限定するものではないが、このヒアルロン酸ナトリウムも使用してもよい。ヒアルロナンは、皮膚の異なる層に豊富に存在し、そこで、それは、例えば、良好な水和を確実にするため、細胞外マトリックスの組織化を補助するため、充填剤材料として作用するため、組織修復機構に関与するためなどの複数の機能を有する。しかしながら、年齢と共に、皮膚に存在するヒアルロナン、コラーゲン、エラスチン及び他のマトリックスポリマーの量は減少する。例えば、例えば太陽からの紫外線への反復曝露は、皮膚細胞にヒアルロナンの産生を減少させるだけでなく、その分解速度を増加させる。このヒアルロナンの損失は、例えば、不完全性、欠損、疾患及び／又は障害などの様々な皮膚状態をもたらす。例えば、皮膚中の含水量と皮膚組織中のヒアルロナンのレベルとの間には強い相関関係がある。皮膚が老化するにつれて、皮膚中のヒアルロナンの量及び質が低下する。これらの変化は、皮膚の乾燥及びしわをもたらす。
【0131】
ＨＡは、ヒアルロン酸、並びに、例えば、ヒアルロン酸ナトリウム（ナトリウム塩）、ヒアルロン酸カリウム、ヒアルロン酸マグネシウム及びヒアルロン酸カルシウムを含む、そのヒアルロン酸塩のいずれかを含んでもよい。様々な供給源からのヒアルロン酸を本明細書で使用してもよい。例えば、ヒアルロン酸は、動物組織から抽出してもよく、細菌発酵の産物として回収してもよく、又はバイオプロセス技術によって市販量で製造されてもよい。本明細書に記載の実施形態において、架橋ヒアルロン酸は、約１万ダルトン～約１０００万ダルトンの分子量を含む。
【0132】
「高分子マトリックス」は、コラーゲンと物理的に混合された架橋ＨＡによって形成されたマトリックスを指す。いくつかの実施形態において、高分子マトリックスは、ＨＡに架橋されたコラーゲンをさらに含む。
【0133】
本明細書に記載の「コラーゲン」は、体内の様々な結合組織に見られる構造タンパク質である。任意の種類のコラーゲンを、本明細書に記載の方法及び組成物において使用してもよい。いくつかの実施形態において、Ｉ型コラーゲン、ＩＩ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、ＶＩ型コラーゲン、又はそれらの組合せを使用してもよい。コラーゲンは、細胞培養物、動物組織又は組換え手段に由来してもよく、例えば、ヒト、ブタ、組換え又はウシの供給源に由来してもよい。いくつかの実施形態は、ヒト線維芽細胞培養物に由来するコラーゲンを含む。いくつかの実施形態は、ゼラチンに変性されたコラーゲンを含む。高分子複合体のいくつかの実施形態において、高分子複合体は、Ｉ型及び／又はＩＩＩ型コラーゲンを含む。
【0134】
当業者は、コラーゲンの異なる供給源についての考慮事項を理解するであろう。組織病理学的に、ウシコラーゲン線維は、ヒトコラーゲンよりも厚く、それらの間にほとんど空間がなく、線維芽細胞が少ない均質な外観を有し、偏光を屈折させることができない場合がある。皮膚試験は、ウシ又は他の動物コラーゲン製品の注入の前に必要とされる場合がある。ウシコラーゲンに対する異物肉芽腫及び柵状肉芽腫を含むまれな過敏反応が報告されている。まれな全身性合併症には、インフルエンザ様症状、知覚異常又は呼吸困難が含まれ、ウシコラーゲンの注入後に重度のアナフィラキシーショックが報告されている。したがって、注入前の皮膚試験が、アレルギー反応のリスクがある患者及びその短時間の効果を特定するために必要とされる場合がある。当業者は、本明細書の実施形態で使用されるコラーゲンの種類を考慮し、コラーゲンの供給源間の違いを理解するであろう。
【0135】
上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、組成物は、ＨＡの粒子又はコラーゲンの粒子若しくは原線維をさらに含む。
【0136】
本明細書に記載される場合、「局所送達」は、治療用組成物を必要とする組織内又はその近くへの組成物の投与を指す。上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、高分子マトリックスは、容積欠損を有する患者の身体上の領域に局所送達される。
【0137】
処置方法
上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、組成物は、顔の軟組織への注入として投与されて、唇、頬又は目の領域のサイズ、形状及び／又は輪郭の増加のような、顔の特徴のサイズ、形状及び／又は輪郭の増加、唇、頬又は目の領域の形状のサイズ、形状及び／又は輪郭の変更のような、顔の特徴のサイズ、形状及び／又は輪郭の変更、皮膚のしわ、ひだ又は線の減少又は除去、皮膚のしわ、ひだ又は線に対する抵抗性、皮膚の再水和、皮膚に対する弾力性の増加、皮膚の荒れの低減又は解消、皮膚の張りの増加及び／又は改善をもたらす。限定するものではないが、これらの領域は、例えば、目の領域、頬の領域及び／又は首の領域を含んでもよい。
上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、組成物は、顔の軟組織への注入として投与されて、唇、頬又は目の領域のサイズ、形状及び／又は輪郭の増加のような、顔の特徴のサイズ、形状及び／又は輪郭の増加、唇、頬又は目の領域の形状のサイズ、形状及び／又は輪郭の変更のような、顔の特徴のサイズ、形状及び／又は輪郭の変更、皮膚のしわ、ひだ又は線の減少又は除去、皮膚のしわ、ひだ又は線に対する抵抗性、皮膚の再水和、皮膚に対する弾力性の増加、皮膚の荒れの低減又は解消、皮膚の張りの増加及び／又は改善をもたらす。限定するものではないが、これらの領域は、例えば、目の領域、頬の領域及び／又は首の領域を含んでもよい。
【0138】
当業者は、投与前に、２～４％クロルヘキシジン又は７０％イソプロピルアルコール溶液による適切な皮膚滅菌及び患者の皮膚を洗浄した後の処置領域の汚染の回避などの無菌技術を使用してもよいことを理解するであろう。皮膚穿刺の回数を減らし、注入に可能な最小ゲージ針を使用する注入アプローチを使用すべきである。炎症を起こした又は感染した皮膚への注入を避けることも重要である。
【0139】
上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、本明細書に記載の組成物は、コラーゲンを送達及び捕捉しながら、注入時に即時のリフト及び容積を提供する。本明細書に記載の実施形態において、本方法は、注入を受けている患者に自然な外観効果を提供する。
【0140】
上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、コラーゲンは、架橋ＨＡネットワークに化学的に結合していない。
【0141】
上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、ＨＡ成分は直鎖状ＨＡである。上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、ＨＡは、ＥＤＣ及びＮＨＳ化学又はＢＤＤＥ架橋ＨＡを用いて、天然に存在するアミンで架橋される。上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、天然に存在するアミンはリシンである。
【0142】
上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、組成物は、ＥＣＭタンパク質などの皮膚の必須構成要素の合成を刺激する。限定するものではないが、コラーゲン産生などのタンパク質は、組成物が注入された組織から刺激される場合がある。
【0143】
上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、処置方法は、ヒアルロニダーゼ処置時に可逆的である。有害反応中又は結果が好ましくない場合、ヒアルロニダーゼ処置を行ってもよい。
【0144】
上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、組成物を使用して、頬の増強のための細い線及び深い（皮下及び／又は骨膜上）を表面的に除去して、顔の中央の加齢性容積欠損を補正してもよい。
【0145】
上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、処置方法は、注入部位においてチンダル効果をもたらさない。
【0146】
当業者は、高分子マトリックスを必要とする患者に投与してもよい異なる方法を理解するであろう。上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、高分子マトリックスは、針又はカニューレを用いて投与される。
【0147】
本明細書の実施形態で使用されるコラーゲンは、任意の供給源から提供されてもよい。限定するものではないが、例えば、ブタ、ウシ、組換え及びヒトのコラーゲンを使用してもよい。いくつかの実施形態において、記載される組成物は、アレルギー試験を必要としない。
【0148】
本明細書に記載されるように、ＨＡコラーゲン皮膚充填剤は、同時にコラーゲンを送達及び捕捉しながら、注入時に即時のリフト及び容積を提供する可能性がある。上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、組成物は、若い外観の健康な皮膚をもたらす必須構成要素の合成を刺激する可能性がある。上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、本方法は、ヒアルロニダーゼ処置時に可逆的である。上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、組成物は、充填剤の膨潤特性に有意に影響を及ぼさずに、率（剛性）の増加を可能にする。
【0149】
上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、組成物は、頬の増強のための細い線及び深い（皮下及び／又は骨膜上の）線を表面的に除去して、顔の中央の加齢性容積欠損を補正する可能性がある。
【0150】
上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、組成物は、充填剤の寿命を通じて肉芽腫をほとんど又は全く生成しない。したがって、充填剤は、皮膚上又は注入領域内に「敷石状」の外観をもたらさない。
【0151】
上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、組成物は、皮膚の水和及び若返りなどの利益を提供する。
【0152】
ヒドロゲルの作製方法
上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、ヒドロゲルを作製する方法は、ＨＡ、コラーゲン、水及びＰＢＳを提供すること、並びに酸性ｐＨで混合することを含む。本方法で使用されるＨＡは架橋されていてもよい。コラーゲンは、任意の供給源によって提供されてもよい。限定するものではないが、コラーゲンは、ブタコラーゲン、ヒトコラーゲン又はコラーゲンの組換え形態であってもよい。
上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、ヒドロゲルを作製する方法は、ＨＡ、コラーゲン、水及びＰＢＳを提供すること、並びに酸性ｐＨで混合することを含む。本方法で使用されるＨＡは架橋されていてもよい。コラーゲンは、任意の供給源によって提供されてもよい。限定するものではないが、コラーゲンは、ブタコラーゲン、ヒトコラーゲン又はコラーゲンの組換え形態であってもよい。
【0153】
コラーゲンをヒアルロン酸又は上記混合物に混合する異なる方法がある。当業者は、ヒドロゲルを作製するための様々な方法を理解するであろう。限定するものではないが、コラーゲンは、例えば、シンキーミキサ、音響ミキサ、反応器、シリンジ－シリンジ混合、ステンレス鋼カートリッジを用いて架橋ヒアルロン酸に混合されてもよい。
【0154】
上記又は下記の実施形態のいずれか１つのいくつかの実施形態において、混合物は、約５ｍｇ／ｍｌ、約１０ｍｇ／ｍｌ、約１５ｍｇ／ｍｌ、約２０ｍｇ／ｍｌ、約２４ｍｇ／ｍｌ、約２８ｍｇ／ｍｌのＨＡ濃度、又は任意の２つの前述の値の間の範囲内の任意の濃度を含む。上記又は下記の実施形態のいずれか１つのいくつかの実施形態において、混合物は、約５ｍｇ／ｍｌのＨＡ濃度を含む。上記又は下記の実施形態のいずれか１つのいくつかの実施形態において、混合物は、約２５ｍｇ／ｍｌのＨＡ濃度を含む。
【0155】
ＨＡ濃度が約２０ｍｇ／ｍｌを含むいくつかの実施形態において、組成物はリフト及び組織一体化を提供する。
【0156】
上記又は下記の実施形態のいずれか１つのいくつかの実施形態において、組成物は、２４ｍｇ／ｍｌのＨＡ及び約６ｍｇ／ｍｌのコラーゲンを含む。
【0157】
上記又は下記の実施形態のいずれか１つのいくつかの実施形態において、組成物は、２０ｍｇ／ｍｌのＨＡ及び約１０ｍｇ／ｍｌのコラーゲンを含む。
【0158】
上記又は下記の実施形態のいずれか１つのいくつかの実施形態において、本方法は、組成物を滅菌することをさらに含む。ヒドロゲルを滅菌する多くの方法があり、これらの方法は当業者によって理解される可能性がある。限定するものではないが、組成物は、例えば、熱（乾熱、蒸気熱）放射（非イオン化、イオン化（微粒子（例えば、ガンマ線）、電磁（例えば、電子ビーム）、濾過）又は最終滅菌（例えば、シリンジなどの最終容器内の製品の滅菌）によって滅菌されてもよい。上記又は下記の実施形態のいずれか１つのいくつかの実施形態において、組成物は、熱（乾熱、蒸気熱）放射（非イオン化、イオン化（微粒子（例えば、ガンマ線）、電磁（例えば、電子ビーム）、濾過）又は最終滅菌（シリンジなどの最終容器内の製品の滅菌）によって滅菌されてもよい。
【0159】
蒸気熱を使用して、例えば、圧力下で組成物を飽和蒸気に曝露することによって製品を滅菌してもよい。例えば、これは、１２１～１２４℃で１５分間行ってもよい。いくつかの代替実施形態において、例えば、異なる時間及びより高い温度を使用してもよい。
【0160】
乾熱を使用してもよく、乾熱は、より高い温度及びより長い曝露時間を必要とする場合がある（Ｇａｌａｎｔｅら、２０１７）。上記又は下記の実施形態のいずれかのいくつかの実施形態において、架橋ＨＡヒドロゲルが提供され、コラーゲンが提供され、コラーゲンが溶液中で可溶性状態にあり、コラーゲンが架橋ＨＡヒドロゲルに物理的に混合される、高分子マトリックスを調製する方法が提供される。
【0161】
上記又は下記の実施形態のいずれかのいくつかの実施形態において、コラーゲンは溶液中で提供され、溶液は酸性である。上記又は下記の実施形態のいずれかのいくつかの実施形態において、コラーゲンは溶液状態で提供される。上記又は下記の実施形態のいずれかのいくつかの実施形態において、コラーゲンは可溶性状態である。上記又は下記の実施形態のいずれかのいくつかの実施形態において、高分子マトリックスを作製する方法は、架橋ヒアルロン酸を含み、コラーゲンに混合された混合物を中和することをさらに含む。上記又は下記の実施形態のいずれかのいくつかの実施形態において、コラーゲン原線維又はコラーゲン沈殿物が、混合後に形成される。しかしながら、コラーゲン原線維又はコラーゲン沈殿物は、ＨＡヒドロゲルに均質に混合される。上記又は下記の実施形態のいずれかのいくつかの実施形態において、本方法は、可溶性コラーゲンを架橋ＨＡと混合した後に、ヒドロゲルの容積オスモル濃度（ｏｓｍｏｌａｒｉｔｙ）を調整することをさらに含む。いくつかの実施形態において、調整工程は、コラーゲンに沈殿物又は原線維を形成させる可能性があるが、コラーゲン沈殿物又は原線維は、架橋ヒアルロン酸の周りで均質に混合される。
【0162】
本明細書に記載の実施形態において、ＨＡが架橋され、コラーゲンが溶液として添加されることが重要である。混合物は、混合物が十分に混合され、均質になるように混合されるべきである。次いで、混合物は中和され、高分子マトリックスが正しいｐＨ／容積オスモル濃度（ｏｓｍｏｌａｒｉｔｙ）になるように容積オスモル濃度（ｏｓｍｏｌａｒｉｔｙ）が調整される。本質的には、組成物がリフト能力及び組織一体化を可能にすることなどの特性を有する充填剤としての機能を果たし得るように、組成物は均一かつ均質であることが重要である。
【0163】
いくつかの実施形態において、架橋ヒアルロン酸に混合する前に、コラーゲン（酸性溶液中）は中和される。いくつかの実施形態において、約７のｐＨへの中和は、異なるコラーゲン構造、例えばコラーゲンのフィブリル化をもたらす。いくつかの実施形態において、これらの原線維は、架橋ヒアルロン酸に均質に混合される。
【0164】
いくつかの実施形態では、架橋ヒアルロン酸及びコラーゲンを酸性ｐＨで一緒に混合する。混合後、塩基を添加し、２回目の混合をすることによって、溶液のｐＨを７．０～７．５のｐＨに上昇させてもよい。いくつかの実施形態において、ｐＨの上昇は、コラーゲンネットワークの自己集合を開始させる可能性がある。いくつかの実施形態において、混合物は、混合後にオートクレーブ処理されてもよい。
【0165】
他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
【0166】
本明細書で使用される場合、「ａ」又は「ａｎ」は、１つ以上を意味する場合がある。測定可能な値に言及するときに本明細書で使用される「約」は、指定された値から＋２０％又は＋１０％、より好ましくは＋５％、さらにより好ましくは＋１％、さらにより好ましくは＋０．１％の変動を包含することを意味する。
【0167】
本明細書で使用される場合、文脈がそうでないことを要求する場合を除いて、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という用語並びに「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」及び「含まれる（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ）」などの用語の変形は、さらなる付加物、構成要素、整数又は工程を排除することを意図しない。
【0168】
「ヒアルロン酸」又は「ＨＡ」という用語は、結合組織、上皮組織及び神経組織において人体全体に広く分布する非硫酸化グリコサミノグリカンである。ヒアルロナンは、皮膚の異なる層に豊富に存在し、そこで、それは、例えば、良好な水和を確実にするため、細胞外マトリックスの組織化を補助するため、充填剤材料として作用するため、組織修復機構に関与するためなどの複数の機能を有する。しかしながら、年齢と共に、皮膚に存在するヒアルロナン、コラーゲン、エラスチン及び他のマトリックスポリマーの量は減少する。例えば、例えば太陽からの紫外線への反復曝露は、皮膚細胞にヒアルロナンの産生を減少させるだけでなく、その分解速度を増加させる。このヒアルロナンの損失は、例えば、不完全性、欠損、疾患及び／又は障害などの様々な皮膚状態をもたらす。例えば、皮膚中の含水量と皮膚組織中のヒアルロナンのレベルとの間には強い相関関係がある。皮膚が老化するにつれて、皮膚中のヒアルロナンの量及び質が低下する。これらの変化は、皮膚の乾燥及びしわをもたらす。
【0169】
ＨＡは、ヒアルロン酸、並びに、例えば、ヒアルロン酸ナトリウム（ナトリウム塩）、ヒアルロン酸カリウム、ヒアルロン酸マグネシウム及びヒアルロン酸カルシウムを含む、そのヒアルロン酸塩のいずれかを含んでもよい。様々な供給源からのヒアルロン酸を本明細書で使用してもよい。例えば、ヒアルロン酸は、動物組織から抽出してもよく、細菌発酵の産物として回収してもよく、又はバイオプロセス技術によって市販量で製造されてもよい。
【0170】
本明細書に記載の「コラーゲン」は、体内の様々な結合組織に見られる構造タンパク質である。提供されるコラーゲンは、任意の供給源に由来してもよい。限定するものではないが、コラーゲンは、例えば、マリンコラーゲン、ウシコラーゲン、ブタコラーゲン、ヒトコラーゲン、細胞培養由来のヒトコラーゲン又は組換えコラーゲンであってもよい。
【0171】
本明細書に記載される場合、「局所送達」は、治療用組成物を必要とする組織内又はその近くへの組成物の投与を指す。上記又は下記の実施形態のそれぞれのいずれか１つ又はいずれかのいくつかの実施形態において、高分子マトリックスは、容積欠損を有する患者の身体上の領域に局所送達される。
【0172】
「物理的に混合する」とは、混合のために別の物質を加えるか、又は混ぜ入れることである。限定するものではないが、物理的混合は、例えば、撹拌、撹拌棒、音響ミキサ、オービタルミキサによって行ってもよい。
【0173】
条項としての主題技術の例示
本開示の態様の様々な例は、便宜上番号付きの条項（１、２、３など）として記載されている。これらは例として提供されており、主題技術を限定するものではない。図面及び参照番号の特定は、単に例として、例示を目的として以下に提供されており、条項はそれらの特定によって限定されない。
本開示の態様の様々な例は、便宜上番号付きの条項（１、２、３など）として記載されている。これらは例として提供されており、主題技術を限定するものではない。図面及び参照番号の特定は、単に例として、例示を目的として以下に提供されており、条項はそれらの特定によって限定されない。
【0174】
条項１．高分子マトリックスを調製する方法であって、架橋ヒアルロン酸を提供すること、コラーゲンを提供すること、並びに前記コラーゲンを前記架橋ヒアルロン酸に物理的に混合することであって、前記コラーゲンが前記架橋ヒアルロン酸全体にわたって均質に混合され、それによって前記高分子マトリックスが形成され、前記高分子マトリックスが、架橋ヒアルロン酸及び物理的に混合されたコラーゲンを含む、混合することを含む、方法。
【0175】
条項２．前記コラーゲンが、溶液として可溶性状態で提供される、条項１に記載の方法。
【0176】
条項３．前記コラーゲンが、酸性ｐＨの溶液として提供され、前記コラーゲン溶液が、約２．０、約２．５、約３．０、約３．５、約４．０、約４．５、約５．０、約５．５、約６．０、約６．５、約７．０のｐＨ、又は任意の２つの前述の値によって定義される範囲内の任意のｐＨを含み、前記コラーゲンが、前記酸性ｐＨで可溶性である、条項１又は２に記載の方法。
【0177】
条項４．前記コラーゲンが、酸性ｐＨの溶液として提供され、前記コラーゲン溶液が、約２．０、約２．５、約３．０、約３．５、約４．０、約４．５、約５．０、約５．５のｐＨ、又は任意の２つの前述の値によって定義される範囲内の任意のｐＨを含み、前記コラーゲンが、前記酸性ｐＨで可溶性である、条項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【0178】
条項５．前記コラーゲンが、中性ｐＨの溶液として提供される、条項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【0179】
条項６．前記コラーゲン及び前記架橋ヒアルロン酸が、緩衝液と物理的に混合される、条項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【0180】
条項７．緩衝溶液がＰＢＳを含む、条項６に記載の方法。
【0181】
条項８．前記方法が、前記コラーゲンを前記架橋ヒアルロン酸全体にわたって均質に混合した後、前記高分子マトリックスを約７のｐＨに中和することをさらに含む、条項１～７のいずれか一項に記載の方法。
【0182】
条項９．前記方法が、前記コラーゲンを前記架橋ヒアルロン酸と物理的に混合する前に、前記コラーゲンを約７のｐＨに中和することをさらに含む、条項１～８のいずれか一項に記載の方法。
【0183】
条項１０．前記コラーゲンを前記架橋ヒアルロン酸に物理的に混合する前に前記コラーゲンを中和することにより、前記コラーゲンがコラーゲンの原線維又は粒子に沈殿し、前記コラーゲンの原線維又は粒子が前記架橋ヒアルロン酸にさらに混合され、前記原線維又は粒子が架橋ヒアルロン酸全体にわたって均質に混合される、条項９に記載の方法。
【0184】
条項１１．前記コラーゲンが、フィブリル化コラーゲン又はコラーゲン線維として提供される、条項１に記載の方法。
【0185】
条項１２．前記コラーゲンが塩基性ｐＨで調製され、それによって前記フィブリル化コラーゲン又はコラーゲン線維が生成された、条項１１に記載の方法。
【0186】
条項１３．前記コラーゲンが、フィブリル化コラーゲン又はコラーゲン線維を得るために少なくとも１つの塩を用いて調製された、条項１１又は１２に記載の方法。
【0187】
条項１４．前記少なくとも１つの塩が、約２０ｍＭ、約５０ｍＭ、約１００ｍＭ、約１５０ｍＭ、約２００ｍＭ、約２５０ｍＭ、約３００ｍＭ、約３５０ｍＭ、約４００ｍＭ、約４５０ｍＭ若しくは約５００ｍＭの濃度、又は任意の２つの前述の値によって定義される範囲の間の任意の濃度を含む、条項１３に記載の方法。
【0188】
条項１５．前記少なくとも１つの塩がアニオンを含み、前記アニオンがＨ２ＰＯ４－、ＳＯ４２－、Ｃｌ－又はＳＣＮ－を含む、条項１３又は１４に記載の方法。
【0189】
条項１６．前記少なくとも１つの塩が、ＮａＣｌ、Ｎａ２ＳＯ４又はＬｉ２ＳＯ４を含む、条項１３～１５のいずれか一項に記載の方法。
【0190】
条項１７．前記コラーゲンが、前記高分子マトリックス全体にわたって均質に混合される、条項１～１６のいずれか一項に記載の方法。
【0191】
条項１８．前記コラーゲンが、前記高分子マトリックス全体にわたって均等に混合される、条項１～１６のいずれか一項に記載の方法。
【0192】
条項１９．前記架橋ヒアルロン酸が、約１万ダルトン、約２万ダルトン、約３万ダルトン、約４万ダルトン、約５万ダルトン、約６万ダルトン、約７万ダルトン、約８万ダルトン、約９万ダルトン、約１０万ダルトン、約２０万ダルトン、約３０万ダルトン、約４０万ダルトン、約５０万ダルトン、約６０万ダルトン、約７０万ダルトン、約８０万ダルトン、約９０万ダルトン、約１００万ダルトン、約１１０万ダルトン、約１２０万ダルトン、約１３０万ダルトン、約１４０万ダルトン、約１５０万ダルトン、約１６０万ダルトン、約１７０万ダルトン、約１８０万ダルトン、約１９０万ダルトン、約２００万ダルトン、約２１０万ダルトン、約２２０万ダルトン、約２３０万ダルトン、約２４０万ダルトン、約２５０万ダルトン、約２６０万ダルトン、約２７０万ダルトン、約２８０万ダルトン、約２９０万ダルトン、約３００万ダルトン、約３１０万ダルトン、約３２０万ダルトン、約３３０万ダルトン、約３４０万ダルトン、約３５０万ダルトン、約３６０万ダルトン、約３７０万ダルトン、約３８０万ダルトン、約３９０万ダルトン、約４００万ダルトン、約４１０万ダルトン、約４２０万ダルトン、約４３０万ダルトン、約４４０万ダルトン、約４５０万ダルトン、約４６０万ダルトン、約４７０万ダルトン、約４８０万ダルトン、約４９０万ダルトン、約５００万ダルトン、約５１０万ダルトン、約５２０万ダルトン、約５３０万ダルトン、約５４０万ダルトン、約５５０万ダルトン、約５６０万ダルトン、約５７０万ダルトン、約５８０万ダルトン、約５９０万ダルトン、約６００万ダルトン、約６１０万ダルトン、約６２０万ダルトン、約６３０万ダルトン、約６４０万ダルトン、約６５０万ダルトン、約６６０万ダルトン、約６７０万ダルトン、約６８０万ダルトン、約６９０万ダルトン、約７００万ダルトン、約７１０万ダルトン、約７２０万ダルトン、約７３０万ダルトン、約７４０万ダルトン、約７５０万ダルトン、約７６０万ダルトン、約７７０万ダルトン、約７８０万ダルトン、約７９０万ダルトン、約８００万ダルトン、約８１０万ダルトン、約８２０万ダルトン、約８３０万ダルトン、約８４０万ダルトン、約８５０万ダルトン、約８６０万ダルトン、約８７０万ダルトン、約８８０万ダルトン、約８９０万ダルトン、約９００万ダルトン、約９１０万ダルトン、約９２０万ダルトン、約９３０万ダルトン、約９４０万ダルトン、約９５０万ダルトン、約９６０万ダルトン、約９７０万ダルトン、約９８０万ダルトン、約９９０万ダルトン若しくは約１０００万ダルトンの平均分子量、又は任意の２つの前述の値によって定義される範囲の間の任意の分子量を含むヒアルロン酸成分を含む、条項１～１８のいずれか一項に記載の方法。
【0193】
条項２０．前記架橋ヒアルロン酸が、少なくとも２つの異なる分子量を含むヒアルロン酸成分の混合物を含む、条項１～１９のいずれか一項に記載の方法。
【0194】
条項２１．前記方法が、リドカインを前記高分子マトリックスに添加することをさらに含む、条項１～２０のいずれか一項に記載の方法。
【0195】
条項２２．前記リドカインが、前記マトリックス中の約０．１５％（ｗ／ｗ）～約０．４５％（ｗ／ｗ）の範囲の間の濃度である、条項１～２１のいずれか一項に記載の方法。
【0196】
条項２３．前記リドカインが、前記マトリックスの約０．１５％（ｗ／ｗ）、約０．１７％（ｗ／ｗ）、約０．１９％（ｗ／ｗ）、約０．２１％（ｗ／ｗ）、約０．２３％（ｗ／ｗ）、約０．２５％（ｗ／ｗ）、約０．２７％（ｗ／ｗ）、約０．２９％（ｗ／ｗ）、約０．３１％（ｗ／ｗ）、約０．３３％（ｗ／ｗ）、約０．３５％（ｗ／ｗ）、約０．３７％（ｗ／ｗ））、約０．３９％（ｗ／ｗ）、約０．４１％（ｗ／ｗ）、約０．４３％（ｗ／ｗ）若しくは約０．４５％（ｗ／ｗ）の濃度、又は任意の２つの前述の値によって定義される範囲の間の任意の濃度である、条項２１又は２２に記載の方法。
【0197】
条項２４．前記リドカインが、前記マトリックス中の約０．２７％（ｗ／ｗ）～約０．３３％（ｗ／ｗ）の範囲の間の濃度である、条項２１～２３のいずれか一項に記載の方法。
【0198】
条項２５．前記マトリックスが、非架橋ＨＡをさらに含む、条項１～２４のいずれか一項に記載の方法。
【0199】
条項２６．前記非架橋ＨＡが、前記マトリックス中の最大約５％（ｗ／ｗ）の濃度を含む、条項２５に記載の方法。
【0200】
条項２７．前記非架橋ＨＡが、前記マトリックス中の約０％（ｗ／ｗ）、約１％（ｗ／ｗ）、約２％（ｗ／ｗ）、約３％（ｗ／ｗ）、約４％（ｗ／ｗ）、約５％（ｗ／ｗ）の濃度、又は任意の２つの前述の値によって定義される範囲の間の任意の濃度を含む、条項２５又は２６に記載の方法。
【0201】
条項２８．前記非架橋ＨＡが、前記マトリックス中の約１％（ｗ／ｗ）の濃度を含む、条項２５～２７のいずれか一項に記載の方法。
【0202】
条項２９．前記非架橋ＨＡが、前記マトリックス中の約２％（ｗ／ｗ）の濃度を含む、条項２５～２７のいずれか一項に記載の方法。
【0203】
条項３０．前記非架橋ＨＡが、前記マトリックス中の約５％（ｗ／ｗ）の濃度を含む、条項２５～２７のいずれか一項に記載の方法。
【0204】
条項３１．前記高分子マトリックスが、針を通じた向上した押出性を有し、前記針が、２７Ｇ、２８Ｇ、２９Ｇ、３０Ｇ、３１Ｇ又は３２Ｇのゲージサイズを含む、条項１～３０のいずれか一項に記載の方法。
【0205】
条項３２．前記高分子マトリックスが、少なくとも６ヶ月間安定である、条項１～３１のいずれか一項に記載の方法。
【0206】
条項３３．前記高分子マトリックスが、約６、約９、約１２、約１５、約１８、約２１、約２４、約２７、約３０、約３３若しくは約３６ヶ月間、又は任意の２つの前述の値によって定義される範囲の間の任意の時間にわたって安定である、条項１～３２のいずれか一項に記載の方法。
【0207】
条項３４．前記高分子マトリックスが、約４℃、約５℃、約１０℃、約１５℃、約２０℃、約２５℃の温度、又は任意の２つの前述の値によって定義される範囲の間の任意の温度で安定である、条項１～３３のいずれか一項に記載の方法。
【0208】
条項３５．前記高分子マトリックスが約４℃で安定である、条項１～３４のいずれか一項に記載の方法。
【0209】
条項３６．前記高分子マトリックスが約２５℃で安定である、条項１～３５のいずれか一項に記載の方法。
【0210】
条項３７．前記高分子マトリックスが、約３、約６、約９、約１２、約１５、約１８、約２１、約２４、約２７、約３０、約３３若しくは約３６ヶ月、又は任意の２つの前述の値によって定義される範囲の間の任意の時間で最小の分解を有する、条項１～３６のいずれか一項に記載の方法。
【0211】
条項３８．高分子マトリックスを調製する方法であって、ヒアルロン酸を水溶液に溶解して、反応前水溶液を形成すること、並びに第２の溶液を調製することであって、前記第２の溶液が、ａ）水溶性カルボジイミド、及びＮ－ヒドロキシスクシンイミド若しくはＮ－ヒドロキシスルホスクシンイミド、又はｂ）水酸化ナトリウムの存在下でのヒアルロン酸ナトリウムの溶液中の１，４－ブタンジオールジグリシジルエーテル（ＢＤＤＥ）を含む、調製すること、並びに前記第２の溶液を前記反応前水溶液に添加して、架橋反応混合物を形成すること、前記ヒアルロン酸を架橋することであって、前記ヒアルロン酸を架橋することにより、前記架橋反応混合物が反応し、それによって前記架橋ヒアルロン酸が形成される、架橋すること、並びに
【0212】
コラーゲンを提供すること、並びに前記コラーゲンを前記架橋ヒアルロン酸に物理的に混合することであって、それによって架橋ヒアルロン酸とコラーゲンとを含む高分子マトリックスが生成され、前記コラーゲンが、前記架橋ヒアルロン酸全体にわたって均質に混合される、混合することを含む、方法。
【0213】
条項３９．前記第２の溶液が、前記水溶性カルボジイミド及び前記Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド又は前記Ｎ－ヒドロキシスルホスクシンイミドを含み、前記ヒアルロン酸が天然に存在するアミンで架橋され、それによって前記架橋ヒアルロン酸が形成される、条項３８に記載の方法。
【0214】
条項４０．前記第２の溶液が、前記水溶性カルボジイミド及び前記Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド又は前記Ｎ－ヒドロキシスルホスクシンイミドを含み、前記架橋がＭＥＳの存在下で行われる、条項３８又は３９に記載の方法。
【0215】
条項４１．前記第２の溶液が、水酸化ナトリウムの存在下でのヒアルロン酸ナトリウムの溶液中の前記１，４－ブタンジオールジグリシジルエーテル（ＢＤＤＥ）を含み、前記ＢＤＤＥが、エポキシド化学を用いて前記ヒアルロン酸を架橋するために使用される、条項３８に記載の方法。
【0216】
条項４２．前記コラーゲンが溶液として可溶性状態で提供される、条項３８～４１のいずれか一項に記載の方法。
【0217】
条項４３．物理的混合工程が、緩衝液の存在下で行われる、条項３８～４２のいずれか一項に記載の方法。
【0218】
条項４４．前記緩衝液がＰＢＳを含む、条項４３に記載の方法。
【0219】
条項４５．前記コラーゲンが、コラーゲン溶液として提供され、前記コラーゲン溶液が、約２．０、約２．５、約３．０、約３．５、約４．０、約４．５、約５．０、約５．５、約６．０、約６．５、約７．０のｐＨ、又は任意の２つの前述の値によって定義される範囲内の任意のｐＨを含み、前記コラーゲンが、酸性ｐＨで可溶性である、条項３８～４４のいずれか一項に記載の方法。
【0220】
条項４６．前記コラーゲンが、酸性ｐＨの溶液として提供され、前記コラーゲン溶液が、約２．０、約２．５、約３．０、約３．５、約４．０、約４．５、約５．０、約５．５のｐＨ、又は任意の２つの前述の値によって定義される範囲内の任意のｐＨを含み、前記コラーゲンが、前記酸性ｐＨで可溶性である、条項３８～４５のいずれか一項に記載の方法。
【0221】
条項４７．前記コラーゲンが、酸性から中性のｐＨで提供される、条項３８～４６のいずれか一項に記載の方法。
【0222】
条項４８．前記コラーゲンを前記架橋ヒアルロン酸全体にわたって均質に混合した後、前記高分子マトリックスを約７のｐＨに中和することをさらに含む、条項３８～４６のいずれか一項に記載の方法。
【0223】
条項４９．前記コラーゲンを前記架橋ヒアルロン酸と物理的に混合する前に、前記コラーゲンを約７のｐＨに中和することをさらに含み、前記コラーゲンを前記架橋ヒアルロン酸に物理的に混合する前に前記コラーゲンを中和することにより、前記コラーゲンがコラーゲンの原線維又は粒子に沈殿し、前記コラーゲンの原線維又は粒子が前記架橋ヒアルロン酸にさらに混合され、前記原線維又は粒子が前記架橋ヒアルロン酸全体にわたって均質に混合される、条項３８～４８のいずれか一項に記載の方法。
【0224】
条項５０．前記コラーゲンが、フィブリル化コラーゲン又はコラーゲン線維として提供される、条項４９に記載の方法。
【0225】
条項５１．前記コラーゲンが塩基性ｐＨで調製され、それによって前記フィブリル化コラーゲン又はコラーゲン線維が生成された、条項５０に記載の方法。
【0226】
条項５２．前記コラーゲンが、フィブリル化コラーゲン又はコラーゲン線維を得るために少なくとも１つの塩を用いて調製された、条項５０又は５１に記載の方法。
【0227】
条項５３．前記少なくとも１つの塩が、約２０ｍＭ、約５０ｍＭ、約１００ｍＭ、約１５０ｍＭ、約２００ｍＭ、約２５０ｍＭ、約３００ｍＭ、約３５０ｍＭ、約４００ｍＭ、約４５０ｍＭ若しくは約５００ｍＭの濃度、又は任意の２つの前述の値によって定義される範囲の間の任意の濃度を含む、条項５２に記載の方法。
【0228】
条項５４．前記少なくとも１つの塩がアニオンを含み、前記アニオンがＨ２ＰＯ４－、ＳＯ４２－、Ｃｌ－又はＳＣＮ－を含む、条項５２又は５３に記載の方法。
【0229】
条項５５．前記少なくとも１つの塩が、ＮａＣｌ、Ｎａ２ＳＯ４又はＬｉ２ＳＯ４を含む、条項５２～５４のいずれか一項に記載の方法。
【0230】
条項５６．前記ヒアルロン酸が、約１万ダルトン、約２万ダルトン、約３万ダルトン、４万ダルトン、約５万ダルトン、約６万ダルトン、約７万ダルトン、約８万ダルトン、約９万ダルトン、約１０万ダルトン、約２０万ダルトン、約３０万ダルトン、約４０万ダルトン、約５０万ダルトン、約６０万ダルトン、約７０万ダルトン、約８０万ダルトン、約９０万ダルトン、約１００万ダルトン、約１１０万ダルトン、約１２０万ダルトン、約１３０万ダルトン、約１４０万ダルトン、約１５０万ダルトン、約１６０万ダルトン、約１７０万ダルトン、約１８０万ダルトン、約１９０万ダルトン、約２００万ダルトン、約２１０万ダルトン、約２２０万ダルトン、約２３０万ダルトン、約２４０万ダルトン、約２５０万ダルトン、約２６０万ダルトン、約２７０万ダルトン、約２８０万ダルトン、約２９０万ダルトン、約３００万ダルトン、約３１０万ダルトン、約３２０万ダルトン、約３３０万ダルトン、約３４０万ダルトン、約３５０万ダルトン、約３６０万ダルトン、約３７０万ダルトン、約３８０万ダルトン、約３９０万ダルトン、約４００万ダルトン、約４１０万ダルトン、約４２０万ダルトン、約４３０万ダルトン、約４４０万ダルトン、約４５０万ダルトン、約４６０万ダルトン、約４７０万ダルトン、約４８０万ダルトン、約４９０万ダルトン、約５００万ダルトン、約５１０万ダルトン、約５２０万ダルトン、約５３０万ダルトン、約５４０万ダルトン、約５５０万ダルトン、約５６０万ダルトン、約５７０万ダルトン、約５８０万ダルトン、約５９０万ダルトン、約６００万ダルトン、約６１０万ダルトン、約６２０万ダルトン、約６３０万ダルトン、約６４０万ダルトン、約６５０万ダルトン、約６６０万ダルトン、約６７０万ダルトン、約６８０万ダルトン、約６９０万ダルトン、約７００万ダルトン、約７１０万ダルトン、約７２０万ダルトン、約７３０万ダルトン、約７４０万ダルトン、約７５０万ダルトン、約７６０万ダルトン、約７７０万ダルトン、約７８０万ダルトン、約７９０万ダルトン、約８００万ダルトン、約８１０万ダルトン、約８２０万ダルトン、約８３０万ダルトン、約８４０万ダルトン、約８５０万ダルトン、約８６０万ダルトン、約８７０万ダルトン、約８８０万ダルトン、約８９０万ダルトン、約９００万ダルトン、約９１０万ダルトン、約９２０万ダルトン、約９３０万ダルトン、約９４０万ダルトン、約９５０万ダルトン、約９６０万ダルトン、約９７０万ダルトン、約９８０万ダルトン、約９９０万ダルトン若しくは約１０００万ダルトンの平均分子量、又は任意の２つの前述の値によって定義される範囲の間の任意の分子量を含む、条項３８～５５のいずれか一項に記載の方法。
【0231】
条項５７．前記ヒアルロン酸が、少なくとも２つの異なる分子量を含むヒアルロン酸成分の混合物を含む、条項３８～５６のいずれか一項に記載の方法。
【0232】
条項５８．前記溶解工程が、ヒアルロン酸とコラーゲンの両方を水溶液に溶解して、ヒアルロン酸とコラーゲンの両方を含む反応前水溶液を形成することをさらに含み、前記架橋反応が、前記ヒアルロン酸とコラーゲンの両方を架橋してＨＡ－コラーゲン結合ゲルにすることによって反応し、前記混合工程が、前記ＨＡ－コラーゲン結合ゲルを追加のコラーゲンと物理的に混合することを含み、前記コラーゲンが可溶性状態にあり、前記コラーゲンが溶液中にあり、前記溶液が酸性ｐＨにあり、それによって、物理的に混合されたコラーゲンと共にＨＡ－コラーゲン結合ゲルを含む高分子マトリックスが生成される、条項３８～５７のいずれか一項に記載の方法。
【0233】
条項５９．コラーゲン原線維又はコラーゲン沈殿物が、コラーゲンとの前記混合工程後に形成され、前記コラーゲン原線維又はコラーゲン沈殿物が、前記架橋ヒアルロン酸内で均質に混合される、条項３８～５８のいずれか一項に記載の方法。
【0234】
条項６０．コラーゲン原線維又はコラーゲン沈殿物が、コラーゲンとの前記混合工程中に形成され、前記コラーゲン原線維又はコラーゲン沈殿物が、前記架橋ヒアルロン酸内で均質に混合される、条項３８～５８のいずれか一項に記載の方法。
【0235】
条項６１．前記方法が、前記コラーゲンを前記架橋ヒアルロン酸全体にわたって混合した後、前記高分子マトリックスの容積オスモル濃度（ｏｓｍｏｌａｒｉｔｙ）を調整することをさらに含む、条項１～６０のいずれか一項に記載の方法。
【0236】
条項６２．前記混合工程が室温で行われる、条項１～６１のいずれか一項に記載の方法。
【0237】
条項６３．前記混合工程が約４℃で行われる、条項１～６１のいずれか一項に記載の方法。
【0238】
条項６４．前記方法が約４℃で行われる、条項１～６３のいずれか一項に記載の方法。
【0239】
条項６５．前記方法が、前記架橋ヒアルロン酸又はＨＡ－コラーゲン結合ゲルを精製することをさらに含み、前記精製が前記コラーゲンとの前記混合工程の前に行われる、条項１～６４のいずれか一項に記載の方法。
【0240】
条項６６．前記精製が、透析精製を用いて行われる、条項６５に記載の方法。
【0241】
条項６７．前記架橋反応混合物のｐＨが、前記架橋が完了した後に調整され、前記ｐＨの調整が、前記精製工程の前に行われ、前記ｐＨが、約７．０、約７．２、約７．４、約７．６、又は任意の２つの前述の値によって定義される範囲の間の任意のｐＨに調整される、条項６５又は６６に記載の方法。
【0242】
条項６８．前記精製が、約２℃～約８℃の範囲で行われる、条項６５～６７のいずれか一項に記載の方法。
【0243】
条項６９．前記精製が、約２℃、約４℃、約６℃若しくは約８℃、又は任意の２つの前述の値によって定義される範囲の間の任意の温度で行われる、条項６５～６８のいずれか一項に記載の方法。
【0244】
条項７０．前記方法が、コラーゲンと混合する前に前記架橋ヒアルロン酸又はＨＡ－コラーゲン結合ゲルを滅菌することをさらに含み、前記滅菌工程が前記精製工程の後に行われる、条項６５～６９のいずれか一項に記載の方法。
【0245】
条項７１．前記滅菌工程が、滅菌のために、前記架橋ヒアルロン酸又はＨＡ－コラーゲン結合ゲルを容器に移すこと、及び前記架橋ヒアルロン酸又はＨＡ－コラーゲン結合ゲルを滅菌することを含む、条項７０に記載の方法。
【0246】
条項７２．前記容器がシリンジである、条項７１に記載の方法。
【0247】
条項７３．前記滅菌が、熱（乾熱、蒸気熱、湿熱滅菌）放射（非イオン化、ＵＶ）、イオン化（微粒子（ベータ線、ガンマ線、Ｘ線）、電磁（電子ビーム）、濾過又は最終滅菌によって行われる、条項７０～７２のいずれか一項に記載の方法。
【0248】
条項７４．前記方法が、前記架橋高分子マトリックス又はＨＡ－コラーゲン結合ゲルを透析することをさらに含み、透析が、１０００ダルトン～約１０万ダルトンの範囲内の分画分子量を有する膜を介して行われ、前記透析が滅菌前に行われる、条項１～７３のいずれか一項に記載の方法。
【0249】
条項７５．前記透析が緩衝液中で行われる、条項７４に記載の方法。
【0250】
条項７６．前記緩衝液が、リン酸緩衝生理食塩水又はリン酸ナトリウム緩衝液を含む、条項７５に記載の方法。
【0251】
条項７７．前記緩衝液が、ＮａＣｌ及び／又はＫＣｌをさらに含む、条項７５又は７６のいずれか一項に記載の方法。
【0252】
条項７８．前記方法が、前記架橋反応が完了した後に、前記架橋ヒアルロン酸又はＨＡ－コラーゲン結合ゲルのｐＨを中性ｐＨに上昇させることをさらに含み、前記ｐＨの上昇が滅菌工程の前に行われる、条項３８～７５のいずれか一項に記載の方法。
【0253】
条項７９．前記方法が、前記架橋反応が完了した後に、前記架橋ヒアルロン酸又はＨＡ－コラーゲン結合ゲルのｐＨを約７．０、約７．２若しくは約７．４、又は任意の２つの前述の値によって定義される範囲の間の任意のｐＨに上昇させることをさらに含み、前記ｐＨの上昇が滅菌工程の前に行われる、条項３８～７５のいずれか一項に記載の方法。
【0254】
条項８０．前記第２の溶液が、前記水溶性カルボジイミド及び前記Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド又はＮ－ヒドロキシスルホスクシンイミドを含み、前記添加及び架橋工程が約４℃～約２２℃の温度で行われる、条項３８～７８のいずれか一項に記載の方法。
【0255】
条項８１．前記架橋が約２２℃で行われる、条項８０に記載の方法。
【0256】
条項８２．前記架橋が約４℃で行われる、条項８０に記載の方法。
【0257】
条項８３．前記第２の溶液が、水酸化ナトリウムの存在下での前記ヒアルロン酸ナトリウムの溶液中の前記１，４－ブタンジオールジグリシジルエーテル（ＢＤＤＥ）を含み、前記添加及び架橋工程が約４５℃～約７５℃で行われる、条項３８～７８のいずれか一項に記載の方法。
【0258】
条項８４．前記第２の溶液が、水酸化ナトリウムの存在下での前記ヒアルロン酸ナトリウムの溶液中の前記１，４－ブタンジオールジグリシジルエーテル（ＢＤＤＥ）を含み、前記添加及び架橋工程が、約４５℃、約５０℃、約５５℃、約６０℃、約６５℃、約７０℃、約７５℃の温度、又は任意の２つの前述の値によって定義される範囲の間の任意の温度で行われる、条項３８～８３のいずれか一項に記載の方法。
【0259】
条項８５．前記第２の溶液が、水酸化ナトリウムの存在下での前記ヒアルロン酸ナトリウムの溶液中の前記１，４－ブタンジオールジグリシジルエーテル（ＢＤＤＥ）を含み、前記添加及び架橋工程が約５０℃の温度で行われる、条項３８～８４のいずれか一項に記載の方法。
【0260】
条項８６．前記方法が、前記架橋ヒアルロン酸及びコラーゲンを含む前記高分子マトリックスを形成した後、又は物理的に混合されたコラーゲンと共に前記ＨＡ－コラーゲン結合ゲルを形成した後に行われる中和工程を含み、前記中和工程が、前記高分子マトリックスを生理学的ｐＨ及び生理学的塩濃度に調整することを含む、条項１～８５のいずれか一項に記載の方法。
【0261】
条項８７．前記中和が、前記ｐＨを調整するために無菌条件下で前記混合工程の後に塩基性溶液又は緩衝溶液を添加することを含む、条項８６に記載の方法。
【0262】
条項８８．前記ｐＨ及び生理学的塩濃度を調整することにより、前記コラーゲンの原線維又は粒子への沈殿が生じ、前記コラーゲン原線維又は粒子が前記高分子マトリックス中に均質に分布している、条項８６又は８７に記載の方法。
【0263】
条項８９．前記方法が、前記架橋工程を停止することをさらに含み、前記停止工程が、塩基を前記架橋反応混合物に約８～約１０のｐＨまで少なくとも１０分間添加し、次いで、約７のｐＨに達するまで酸性溶液を前記架橋混合物に添加することを含む、条項３８～８８のいずれか一項に記載の方法。
【0264】
条項９０．前記天然に存在するアミンがリシンに由来する、条項３８～８９のいずれか一項に記載の方法。
【0265】
条項９１．前記架橋反応混合物が約４．０～約１０．０のｐＨを含む、条項３８～９０のいずれか一項に記載の方法。
【0266】
条項９２．前記架橋反応混合物のｐＨが約４．０～約６．０である、条項９１に記載の方法。
【0267】
条項９３．前記第２の溶液が、水酸化ナトリウムの存在下でのヒアルロン酸ナトリウムの溶液中の１，４－ブタンジオールジグリシジルエーテル（ＢＤＤＥ）を含み、前記架橋がアルカリ性条件下で行われる、条項３８～７８又は８３～９２のいずれか一項に記載の方法。
【0268】
条項９４．前記反応前溶液が塩を含み、前記塩が、約５０ｍＭ、約７５ｍＭ、約１００ｍＭ、約１２５ｍＭ、約１５０ｍＭ、約１７５ｍＭ、約２００ｍＭ、約２２５ｍＭ、約２５０ｍＭ、約２７５ｍＭ、約３００ｍＭ、３２５ｍＭ、約３５０ｍＭ、約３７５ｍＭ、約４００ｍＭ、約４２５ｍＭ、約４５０ｍＭ、約４７５ｍＭ、約５００ｍＭの濃度、又は任意の２つの前述の値によって定義される範囲内の任意の濃度を含む、条項３８～９３のいずれか一項に記載の方法。
【0269】
条項９５．前記水溶性カルボジイミドが１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドであり、前記水溶性カルボジイミドが前記架橋反応混合物中の約２０ｍＭ～約３００ｍＭの濃度である、条項３８～８１、８６～９２又は９４のいずれか一項に記載の方法。
【0270】
条項９６．前記水溶性カルボジイミドの濃度が、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドであり、約２０ｍＭ、約４０ｍＭ、約６０ｍＭ、約８０ｍＭ、約１００ｍＭ、約１２０ｍＭ、約１４０ｍＭ、約１６０ｍＭ、約１８０ｍＭ、約２００ｍＭ、約２２０ｍＭ、約２４０ｍＭ、約２６０ｍＭ、約２８０ｍＭ、約３００ｍＭ、又は任意の２つの前述の値によって定義される範囲の間の任意の濃度である、条項９５に記載の方法。
【0271】
条項９７．前記水溶性カルボジイミド及びヒアルロン酸が、約０．３～約３．０の水溶性カルボジイミド：ヒアルロン酸繰返し単位のモル対モル比である、条項３８～８１、８６～９２又は９４～９６のいずれか一項に記載の方法。
【0272】
条項９８．前記水溶性カルボジイミド及びヒアルロン酸が、約０．３、約０．４、約０．５、約０．６、約０．７、約０．８、約０．９、約１．０、約１．１、約１．２、約１．３、約１．４、約１．５、約１．６、約１．７、約１．８、約１．９、約２．０、約２．１、約２．２、約２．３、約２．４、約２．５、約２．６、約２．７、約２．８、約２．９若しくは約３．０の水溶性カルボジイミド：ヒアルロン酸繰返し単位のモル対モル比、又は任意の２つの前述の値によって定義される範囲の間の任意のモル対モル比である、条項９７に記載の方法。
【0273】
条項９９．前記リシン及びヒアルロン酸が、約０．０１～約０．６のモル：モル（リシン：ＨＡ繰返し単位）比である、条項３８～９８のいずれか一項に記載の方法。
【0274】
条項１００．前記リシン及びヒアルロン酸が、約０．０１、約０．０２、約０．０３、約０．０４、約０．０５、約０．０６、約０．０７、約０．０８、約０．０９、約０．１０、約０．１１、約０．１２、約０．１３、約０．１４、約０．１５、約０．１６、約０．１７、約０．１８、約０．１９、約０．２、約０．２１、約０．２２、約０．２３、約０．２４、約０．２５、約０．２６、約０．２７、約０．２８、約０．２９、約０．３、約０．３１、約０．３２、約０．３３、約０．３４、約０．３５、約０．３６、約０．３７、約０．３８、約０．３９、約０．４、約０．４１、約０．４２、約０．４３、約０．４４、約０．４５、約０．４６、約０．４７、約０．４８、約０．４９、約０．５、約０．５１、約０．５２、約０．５３、約０．５４、約０．５５、約０．５６、約０．５７、約０．５８、約０．５９、約０．６のモル：モル（リシン：ＨＡ繰返し単位）比、又は任意の２つの前述の値によって定義される範囲の間の任意のモル対モル比である、条項９９に記載の方法。
【0275】
条項１０１．前記反応前溶液中の前記ヒアルロン酸が、前記第２の溶液を添加する前に少なくとも約６０分間水和する、条項３８～１００のいずれか一項に記載の方法。
【0276】
条項１０２．前記架橋反応混合物が約４時間～約２４時間行われる、条項３８～１０１のいずれか一項に記載の方法。
【0277】
条項１０３．前記方法が、リドカインを前記高分子マトリックスに添加することをさらに含む、条項３８～１０２のいずれか一項に記載の方法。
【0278】
条項１０４．前記リドカインが、前記マトリックス中の約０．１５％（ｗ／ｗ）～約０．４５％（ｗ／ｗ）の範囲の間の濃度である、条項１０３に記載の方法。
【0279】
条項１０５．前記リドカインが、前記マトリックスの約０．１５％（ｗ／ｗ）、約０．１７％（ｗ／ｗ）、約０．１９％（ｗ／ｗ）、約０．２１％（ｗ／ｗ）、約０．２３％（ｗ／ｗ）、約０．２５％（ｗ／ｗ）、約０．２７％（ｗ／ｗ）、約０．２９％（ｗ／ｗ）、約０．３１％（ｗ／ｗ）、約０．３３％（ｗ／ｗ）、約０．３５％（ｗ／ｗ）、約０．３７％（ｗ／ｗ）、約０．３９％（ｗ／ｗ）、約０．４１％（ｗ／ｗ）、約０．４３％（ｗ／ｗ）若しくは約０．４５％（ｗ／ｗ）の濃度、又は任意の２つの前述の値によって定義される範囲の間の任意の濃度である、条項１０３又は１０４に記載の方法。
【0280】
条項１０６．前記リドカインが、前記マトリックス中の約０．２７％（ｗ／ｗ）～約０．３３％（ｗ／ｗ）の範囲の間の濃度である、条項１０３～１０５のいずれか一項に記載の方法。
【0281】
条項１０７．前記マトリックスが非架橋ＨＡをさらに含む、条項３８～１０６のいずれか一項に記載の方法。
【0282】
条項１０８．前記非架橋ＨＡが、前記マトリックス中の最大約５％（ｗ／ｗ）の濃度を含む、条項１０７に記載の方法。
【0283】
条項１０９．前記非架橋ＨＡが、前記マトリックス中の約０％（ｗ／ｗ）、約１％（ｗ／ｗ）、約２％（ｗ／ｗ）、約３％（ｗ／ｗ）、約４％（ｗ／ｗ）、約５％（ｗ／ｗ）の濃度、又は任意の２つの前述の値によって定義される範囲の間の任意の濃度を含む、条項１０７～１０８に記載の方法。
【0284】
条項１１０．前記非架橋ＨＡが、前記マトリックス中の約１％（ｗ／ｗ）の濃度を含む、条項１０７～１０９のいずれか一項に記載の方法。
【0285】
条項１１１．前記非架橋ＨＡが、前記マトリックス中の約２％（ｗ／ｗ）の濃度を含む、条項１０７～１０９のいずれか一項に記載の方法。
【0286】
条項１１２．前記非架橋ＨＡが、前記マトリックス中の約５％（ｗ／ｗ）の濃度を含む、条項１０７～１０９のいずれか一項に記載の方法。
【0287】
条項１１３．前記高分子マトリックスが、針を通じた向上した押出性を有し、前記針が、２７Ｇ、２８Ｇ、２９Ｇ、３０Ｇ、３１Ｇ又は３２Ｇのゲージサイズを含む、条項３８～１１２のいずれか一項に記載の方法。
【0288】
条項１１４．前記方法が、前記コラーゲンを前記架橋ＨＡに添加する前に、前記コラーゲンを濃縮することをさらに含む、条項１～１１３のいずれか一項に記載の方法。
【0289】
条項１１５．条項１～１１４のいずれか一項に記載の方法によって作製された、高分子マトリックス。
【0290】
条項１１６．前記高分子マトリックスが架橋ヒアルロン酸を含み、前記コラーゲンが架橋ヒアルロン酸と物理的に混合され、前記コラーゲンが高分子複合体全体にわたって均質である、条項１１５に記載の高分子マトリックス。
【0291】
条項１１７．前記高分子マトリックスがＨＡ－コラーゲン結合ゲルを含み、前記ＨＡ－コラーゲン結合ゲルが、前記ＨＡ－コラーゲン結合ゲルに架橋されていない物理的に混合されたコラーゲンも含む、条項１１５に記載の高分子マトリックス。
【0292】
条項１１８．高分子マトリックスであって、ヒアルロン酸であって、前記ヒアルロン酸が架橋されている、ヒアルロン酸、及びコラーゲンであって、前記コラーゲンが、前記架橋ヒアルロン酸と物理的に混合されている、コラーゲンを含む、高分子マトリックス。
【0293】
条項１１９．高分子マトリックスであって、ＨＡ－コラーゲン結合ゲルであって、前記ＨＡ－コラーゲン結合ゲルが、コラーゲンで架橋されたヒアルロン酸を含む、ＨＡ－コラーゲン結合ゲル、及び物理的に混合されたコラーゲンであって、前記物理的に混合されたコラーゲンが、ＨＡ－コラーゲン結合ゲルに架橋されておらず、前記物理的に混合されたコラーゲンが、前記ＨＡ－コラーゲン結合ゲル内で均質に混合されている、物理的に混合されたコラーゲンを含む、高分子マトリックス。
【0294】
条項１２０．前記ヒアルロン酸が天然に存在するアミンで架橋されている、条項１１５～１１９のいずれか一項に記載の高分子マトリックス。
【0295】
条項１２１．前記天然に存在するアミンがリシンに由来する、条項１２０に記載の高分子マトリックス。
【0296】
条項１２２．前記コラーゲンが、ウシコラーゲン、マリンコラーゲン、ヒトコラーゲン又はブタコラーゲンに由来する、条項１１５～１２１のいずれか一項に記載の高分子マトリックス。
【0297】
条項１２３．前記コラーゲンが組換えヒトコラーゲンである、条項１１５～１２２のいずれか一項に記載の高分子マトリックス。
【0298】
条項１２４．前記高分子マトリックスが、約１００Ｐａ、約２００Ｐａ、約３００Ｐａ、約４００Ｐａ、約５００Ｐａ、約６００Ｐａ、約７００Ｐａ、約８００Ｐａ、約９００Ｐａ、約１０００Ｐａ、約１１００Ｐａ、約１２００Ｐａ、約１３００Ｐａ、約１４００Ｐａ、約１５００Ｐａ、約１６００Ｐａ、約１７００Ｐａ、約１８００Ｐａ、約１９００Ｐａ、約２０００Ｐａ、約２１００Ｐａ、約２２００Ｐａ、約２３００Ｐａ、約２４００Ｐａ、約２５００Ｐａ、約２６００Ｐａ、約２７００Ｐａ、約２８００Ｐａ、約２９００Ｐａ若しくは約３０００Ｐａ、又は任意の２つの前述の値によって定義される範囲の間の任意の値の弾性率（Ｇ’）を含む、条項１１５～１２３のいずれか一項に記載の高分子マトリックス。
【0299】
条項１２５．前記高分子マトリックスが、約１０ｇｍｆ、約２０ｇｍｆ、約３０ｇｍｆ、約４０ｇｍｆ、約５０ｇｍｆ、約６０ｇｍｆ、約７０ｇｍｆ、約８０ｇｍｆ、約９０ｇｍｆ、約１００ｇｍｆ、約１１０ｇｍｆ、約１２０ｇｍｆ、約１３０ｇｍｆ、約１４０ｇｍｆ、約１５０ｇｍｆ、約１６０ｇｍｆ、約１７０ｇｍｆ、約１８０ｇｍｆ、約１９０ｇｍｆ、約２００ｇｍｆ、約２１０ｇｍｆ、約２２０ｇｍｆ、約２３０ｇｍｆ、約２４０ｇｍｆ、約２５０ｇｍｆ、約２６０ｇｍｆ、約２７０ｇｍｆ、約２８０ｇｍｆ、約２９０ｇｍｆ、約３００ｇｍｆ、約３１０ｇｍｆ、約３２０ｇｍｆ、約３３０ｇｍｆ、約３４０ｇｍｆ、約３５０ｇｍｆ、約３６０ｇｍｆ、約３７０ｇｍｆ、約３８０ｇｍｆ、約３９０ｇｍｆ、約４００ｇｍｆ、約４１０ｇｍｆ、約４２０ｇｍｆ、約４３０ｇｍｆ、約４４０ｇｍｆ、約４５０ｇｍｆ、約４６０ｇｍｆ、約４７０ｇｍｆ、約４８０ｇｍｆ、約４９０ｇｍｆ、約５００ｇｍｆ、約５１０ｇｍｆ、約５２０ｇｍｆ、約５３０ｇｍｆ、約５４０ｇｍｆ、約５５０ｇｍｆ、約５６０ｇｍｆ、約５７０ｇｍｆ、約５８０ｇｍｆ、約５９０ｇｍｆ若しくは約６００ｇｍｆの圧縮力値、又は任意の２つの前述の値によって定義される範囲の間の任意の圧縮力値を含む、条項１１５～１２４のいずれか一項に記載の高分子マトリックス。
【0300】
条項１２６．前記ヒアルロン酸が、約２ｍｇ／ｍｌ、約４ｍｇ／ｍｌ、約６ｍｇ／ｍｌ、約８ｍｇ／ｍｌ、約１０ｍｇ／ｍｌ、約１２ｍｇ／ｍｌ、約１４ｍｇ／ｍｌ、約１６ｍｇ／ｍｌ、約１８ｍｇ／ｍｌ、約２０ｍｇ／ｍｌ、約２２ｍｇ／ｍｌ、約２４ｍｇ／ｍｌ、約２６ｍｇ／ｍｌ、約２８ｍｇ／ｍｌ、約３０ｍｇ／ｍｌ、３２ｍｇ／ｍｌ、約３４ｍｇ／ｍｌ若しくは約３６ｍｇ／ｍｌの濃度、又は任意の２つの前述の値によって定義される範囲の間の任意の濃度である、条項１１５～１２５のいずれか一項に記載の高分子マトリックス。
【0301】
条項１２７．約２０：３、約２４：２．３、約２４：１０、約２４：１２、約２４：４、約２４：６、約２８：６又は約２８：１１のヒアルロン酸対コラーゲンの重量比を有する、条項１１５～１２６のいずれか一項に記載の高分子マトリックス。
【0302】
条項１２８．前記架橋ヒアルロン酸が、約１万ダルトン、約２万ダルトン、約３万ダルトン、４万ダルトン、約５万ダルトン、約６万ダルトン、約７万ダルトン、約８万ダルトン、約１０万ダルトン、約２０万ダルトン、約３０万ダルトン、約４０万ダルトン、約５０万ダルトン、約６０万ダルトン、約７０万ダルトン、約８０万ダルトン、約９０万ダルトン、約１００万ダルトン、約１１０万ダルトン、約１２０万ダルトン、約１３０万ダルトン、約１４０万ダルトン、約１５０万ダルトン、約１６０万ダルトン、約１７０万ダルトン、約１８０万ダルトン、約１９０万ダルトン、約２００万ダルトン、約２１０万ダルトン、約２２０万ダルトン、約２３０万ダルトン、約２４０万ダルトン、約２５０万ダルトン、約２６０万ダルトン、約２７０万ダルトン、約２８０万ダルトン、約２９０万ダルトン、約３００万ダルトン、約３１０万ダルトン、約３２０万ダルトン、約３３０万ダルトン、約３４０万ダルトン、約３５０万ダルトン、約３６０万ダルトン、約３７０万ダルトン、約３８０万ダルトン、約３９０万ダルトン、約４００万ダルトン、約４１０万ダルトン、約４２０万ダルトン、約４３０万ダルトン、約４４０万ダルトン、約４５０万ダルトン、約４６０万ダルトン、約４７０万ダルトン、約４８０万ダルトン、約４９０万ダルトン、約５００万ダルトン、約５１０万ダルトン、約５２０万ダルトン、約５３０万ダルトン、約５４０万ダルトン、約５５０万ダルトン、約５６０万ダルトン、約５７０万ダルトン、約５８０万ダルトン、約５９０万ダルトン、約６００万ダルトン、約６１０万ダルトン、約６２０万ダルトン、約６３０万ダルトン、約６４０万ダルトン、約６５０万ダルトン、約６６０万ダルトン、約６７０万ダルトン、約６８０万ダルトン、約６９０万ダルトン、約７００万ダルトン、約７１０万ダルトン、約７２０万ダルトン、約７３０万ダルトン、約７４０万ダルトン、約７５０万ダルトン、約７６０万ダルトン、約７７０万ダルトン、約７８０万ダルトン、約７９０万ダルトン、約８００万ダルトン、約８１０万ダルトン、約８２０万ダルトン、約８３０万ダルトン、約８４０万ダルトン、約８５０万ダルトン、約８６０万ダルトン、約８７０万ダルトン、約８８０万ダルトン、約８９０万ダルトン、約９００万ダルトン、約９１０万ダルトン、約９２０万ダルトン、約９３０万ダルトン、約９４０万ダルトン、約９５０万ダルトン、約９６０万ダルトン、約９７０万ダルトン、約９８０万ダルトン、約９９０万ダルトン若しくは約１０００万ダルトンの平均分子量、又は任意の２つの前述の値によって定義される範囲の間の任意の重量を含むヒアルロン酸成分を含む、条項１１５～１２７のいずれか一項に記載の高分子マトリックス。
【0303】
条項１２９．前記ヒアルロン酸成分が、少なくとも２つの異なる分子量を含むヒアルロン酸成分の混合物を含む、条項１２８に記載の高分子マトリックス。
【0304】
条項１３０．前記ヒアルロン酸がヒアルロン酸の混合物を含み、前記混合物が、２つの異なる分子量を含むＨＡの５０：５０ブレンドを含む、条項１１５～１２９のいずれか一項に記載の高分子マトリックス。
【0305】
条項１３１．前記コラーゲンが、Ｉ型コラーゲン及び／又はＩＩＩ型コラーゲンを含む、条項１１５～１３０のいずれか一項に記載の高分子マトリックス。
【0306】
条項１３２．前記コラーゲンが、約１ｍｇ／ｍｌ、約２ｍｇ／ｍｌ、約３ｍｇ／ｍｌ、約４ｍｇ／ｍｌ、約６ｍｇ／ｍｌ、約７ｍｇ／ｍｌ、約８ｍｇ／ｍｌ、約９ｍｇ／ｍｌ、約１０ｍｇ／ｍｌ、約１１ｍｇ／ｍｌ、約１２ｍｇ／ｍｌ、約１３ｍｇ／ｍｌ、約１４ｍｇ／ｍｌ若しくは約１５ｍｇ／ｍｌ、約１６ｍｇ／ｍｌ、約１７ｍｇ／ｍｌ、約１８ｍｇ／ｍｌ、約１９ｍｇ／ｍｌ、約２０ｍｇ／ｍｌ、約２１ｍｇ／ｍｌ、約２２ｍｇ／ｍｌ、約２３ｍｇ／ｍｌ、約２４ｍｇ／ｍｌ、約２５ｍｇ／ｍｌの濃度、又は任意の２つの前述の値によって定義される範囲の間の任意の濃度である、条項１１５～１３１のいずれか一項に記載の高分子マトリックス。
【0307】
条項１３３．前記高分子マトリックスが、約２５０ｍＯｓｍ／ｋｇ～約３９０ｍＯｓｍ／ｋｇの重量オスモル濃度を含む、条項１１５～１３２のいずれか一項に記載の高分子マトリックス。
【0308】
条項１３４．前記高分子マトリックスが、約２５０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２７５ｍＯｓｍ／ｋｇ、約３００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約３２５ｍＯｓｍ／ｋｇ若しくは約３９０ｍＯｓｍ／ｋｇの間の重量オスモル濃度、又は任意の２つの前述の値によって定義される範囲の間の任意の重量オスモル濃度を含む、条項１１５～１３３のいずれか一項に記載の高分子マトリックス。
【0309】
条項１３５．前記ヒアルロン酸が直鎖状である、条項１１５～１３４のいずれか一項に記載の高分子マトリックス。
【0310】
条項１３６．前記高分子マトリックスが、約１０Ｐａ、約２０Ｐａ、約３０Ｐａ、約４０Ｐａ、約５０Ｐａ、約６０Ｐａ、約７０Ｐａ、約８０Ｐａ、約９０Ｐａ、約１００Ｐａ、約２００Ｐａ、約３００Ｐａ、約４００Ｐａ、約５００Ｐａ、約６００Ｐａ、約７００Ｐａ、約８００Ｐａ、約９００Ｐａ若しくは約１０００Ｐａの粘性率（Ｇ’’）、又は任意の２つの前述の値によって定義される範囲の間の任意の粘性率（Ｇ’’）を含む、条項１１５～１３５のいずれか一項に記載の高分子マトリックス。
【0311】
条項１３７．前記高分子マトリックスが、約０．０１、約０．０２、約０．０３、約０．０４、約０．０５、約０．０６、約０．０７、約０．０８、約０．０９、約０．１、約０．１２、約０．１４、約０．１６、約０．１８、約０．２０、約０．２２、約０．２４、約０．２６、約０．２８、約０．３０、約０．３２、約０．３４、約０．３６、約０．３８、約０．４０、約０．４２、約０．４４、約０．４６、約０．４８、約０．５０のタンデルタ（Ｇ’’／Ｇ’）、又は任意の２つの前述の値によって定義される範囲の間のタンデルタ（Ｇ’’／Ｇ’）を含む、条項１１５～１３６のいずれか一項に記載の高分子マトリックス。
【0312】
条項１３８．前記高分子マトリックスが、約６．５、約６．６、約６．７、約６．８、約６．９、約７．０、約７．１、約７．２、約７．３、約７．４、約７．５、約７．６、約７．７、約７．８、約７．９、約８．０のｐＨ、又は任意の２つの前述の値によって定義される範囲内の任意のｐＨを含む、条項１１５～１３７のいずれか一項に記載の高分子マトリックス。
【0313】
条項１３９．前記高分子マトリックスがリドカインをさらに含む、条項１１５～１３８のいずれか一項に記載の高分子マトリックス。
【0314】
条項１４０．前記リドカインが、前記マトリックスの約０．１５％（ｗ／ｗ）、約０．１７％（ｗ／ｗ）、約０．１９％（ｗ／ｗ）、約０．２１％（ｗ／ｗ）、約０．２３％（ｗ／ｗ）、約０．２５％（ｗ／ｗ）、約０．２７％（ｗ／ｗ）、約０．２９％（ｗ／ｗ）、約０．３１％（ｗ／ｗ）、約０．３３％（ｗ／ｗ）、約０．３５％（ｗ／ｗ）、約０．３７％（ｗ／ｗ）、約０．３９％（ｗ／ｗ）、約０．４１％（ｗ／ｗ）、約０．４３％（ｗ／ｗ）若しくは約０．４５％（ｗ／ｗ）の濃度、又は任意の２つの前述の値によって定義される範囲の間の任意の濃度である、条項１３９に記載の高分子マトリックス。
【0315】
条項１４１．前記リドカインが、前記マトリックス中の約０．２７％（ｗ／ｗ）～約０．３３％（ｗ／ｗ）の範囲の間の濃度である、条項１３９又は１４０のいずれか一項に記載の高分子マトリックス。
【0316】
条項１４２．前記マトリックスが非架橋ＨＡをさらに含む、条項１１５～１４１のいずれか一項に記載の高分子マトリックス。
【0317】
条項１４３．前記非架橋ＨＡが、前記マトリックス中の最大約５％（ｗ／ｗ）の濃度を含む、条項１４２に記載の高分子マトリックス。
【0318】
条項１４４．前記非架橋ＨＡが、前記マトリックス中の約０％（ｗ／ｗ）、約１％（ｗ／ｗ）、約２％（ｗ／ｗ）、約３％（ｗ／ｗ）、約４％（ｗ／ｗ）、約５％（ｗ／ｗ）の濃度、又は任意の２つの前述の値によって定義される範囲の間の任意の濃度を含む、条項１４２～１４３に記載の高分子マトリックス。
【0319】
条項１４５．前記非架橋ＨＡが、前記マトリックス中の約１％（ｗ／ｗ）の濃度を含む、条項１４２～１４４のいずれか一項に記載の高分子マトリックス。
【0320】
条項１４６．前記非架橋ＨＡが、前記マトリックス中の約２％（ｗ／ｗ）の濃度を含む、条項１４２～１４４のいずれか一項に記載の高分子マトリックス。
【0321】
条項１４７．前記非架橋ＨＡが、前記マトリックス中の約５％（ｗ／ｗ）の濃度を含む、条項１４２～１４４のいずれか一項に記載の高分子マトリックス。
【0322】
条項１４８．前記高分子マトリックスが、針を通じた向上した押出性を有し、前記針が、２７Ｇ、２８Ｇ、２９Ｇ、３０Ｇ、３１Ｇ又は３２Ｇのゲージサイズを含む、条項１１５～１４７のいずれか一項に記載の高分子マトリックス。
【0323】
条項１４９．ヒトの解剖学的特徴の審美的質を改善する方法であって、前記ヒトの組織に組成物を注入し、それによって前記解剖学的特徴の審美的質を改善することであって、前記組成物が、条項１～１０２のいずれか一項に記載の方法によって調製された高分子マトリックス又は条項１１５～１３９のいずれか一項に記載の高分子マトリックスを含む、改善することを含む、方法。
【0324】
条項１５０．ヒトの解剖学的特徴の審美的質を改善する方法であって、前記ヒトの組織に組成物を注入し、それによって前記解剖学的特徴の審美的質を改善することであって、前記組成物が、架橋ヒアルロン酸、リシン、及びコラーゲンを含む高分子マトリックスを含み、前記コラーゲンが前記架橋ヒアルロン酸に物理的に混合されている、改善することを含む、方法。
【0325】
条項１５１．前記組成物がリドカインをさらに含む、条項１５０に記載の方法。
【0326】
条項１５２．前記リドカインが、前記マトリックス中の０．１５％（ｗ／ｗ）～０．４５％（ｗ／ｗ）の範囲の間の濃度である、条項１５１に記載の方法。
【0327】
条項１５３．前記リドカインが、前記マトリックスの約０．１５％（ｗ／ｗ）、約０．１７％（ｗ／ｗ）、約０．１９％（ｗ／ｗ）、約０．２１％（ｗ／ｗ）、約０．２３％（ｗ／ｗ）、約０．２５％（ｗ／ｗ）、約０．２７％（ｗ／ｗ）、約０．２９％（ｗ／ｗ）、約０．３１％（ｗ／ｗ）、約０．３３％（ｗ／ｗ）、約０．３５％（ｗ／ｗ）、約０．３７％（ｗ／ｗ）、約０．３９％（ｗ／ｗ）、約０．４１％（ｗ／ｗ）、約０．４３％（ｗ／ｗ）若しくは約０．４５％（ｗ／ｗ）の濃度、又は任意の２つの前述の値によって定義される範囲の間の任意の濃度である、条項１５１又は１５２に記載の方法。
【0328】
条項１５４．前記リドカインが、前記マトリックス中の約０．２７％（ｗ／ｗ）～約０．３３％（ｗ／ｗ）の範囲の間の濃度である、条項１５１～１５３のいずれか一項に記載の方法。
【0329】
条項１５５．前記組成物が非架橋ＨＡをさらに含む、条項１５０～１５４のいずれか一項に記載の方法。
【0330】
条項１５６．前記非架橋ＨＡが、前記マトリックス中の最大約５％（ｗ／ｗ）の濃度を含む、条項１５５に記載の方法。
【0331】
条項１５７．前記非架橋ＨＡが、前記マトリックス中の約０％（ｗ／ｗ）、約１％（ｗ／ｗ）、約２％（ｗ／ｗ）、約３％（ｗ／ｗ）、約４％（ｗ／ｗ）、約５％（ｗ／ｗ）の濃度、又は任意の２つの前述の値によって定義される範囲の間の任意の濃度を含む、条項１５５又は１５６に記載の方法。
【0332】
条項１５８．前記非架橋ＨＡが、前記マトリックス中の約１％（ｗ／ｗ）の濃度を含む、条項１５５～１５７のいずれか一項に記載の方法。
【0333】
条項１５９．前記非架橋ＨＡが、前記マトリックス中の約２％（ｗ／ｗ）の濃度を含む、条項１５５～１５７のいずれか一項に記載の方法。
【0334】
条項１６０．前記非架橋ＨＡが、前記マトリックス中の約５％（ｗ／ｗ）の濃度を含む、条項１５５～１５７のいずれか一項に記載の方法。
【0335】
条項１６１．前記架橋ヒアルロン酸が、約１万ダルトン、約２万ダルトン、約３万ダルトン、４万ダルトン、約５万ダルトン、約６万ダルトン、約７万ダルトン、約８万ダルトン、約１０万ダルトン、約２０万ダルトン、約３０万ダルトン、約４０万ダルトン、約５０万ダルトン、約６０万ダルトン、約７０万ダルトン、約８０万ダルトン、約９０万ダルトン、約１００万ダルトン、約１１０万ダルトン、約１２０万ダルトン、約１３０万ダルトン、約１４０万ダルトン、約１５０万ダルトン、約１６０万ダルトン、約１７０万ダルトン、約１８０万ダルトン、約１９０万ダルトン、約２００万ダルトン、約２１０万ダルトン、約２２０万ダルトン、約２３０万ダルトン、約２４０万ダルトン、約２５０万ダルトン、約２６０万ダルトン、約２７０万ダルトン、約２８０万ダルトン、約２９０万ダルトン、約３００万ダルトン、約３１０万ダルトン、約３２０万ダルトン、約３３０万ダルトン、約３４０万ダルトン、約３５０万ダルトン、約３６０万ダルトン、約３７０万ダルトン、約３８０万ダルトン、約３９０万ダルトン、約４００万ダルトン、約４１０万ダルトン、約４２０万ダルトン、約４３０万ダルトン、約４４０万ダルトン、約４５０万ダルトン、約４６０万ダルトン、約４７０万ダルトン、約４８０万ダルトン、約４９０万ダルトン、約５００万ダルトン、約５１０万ダルトン、約５２０万ダルトン、約５３０万ダルトン、約５４０万ダルトン、約５５０万ダルトン、約５６０万ダルトン、約５７０万ダルトン、約５８０万ダルトン、約５９０万ダルトン、約６００万ダルトン、約６１０万ダルトン、約６２０万ダルトン、約６３０万ダルトン、約６４０万ダルトン、約６５０万ダルトン、約６６０万ダルトン、約６７０万ダルトン、約６８０万ダルトン、約６９０万ダルトン、約７００万ダルトン、約７１０万ダルトン、約７２０万ダルトン、約７３０万ダルトン、約７４０万ダルトン、約７５０万ダルトン、約７６０万ダルトン、約７７０万ダルトン、約７８０万ダルトン、約７９０万ダルトン、約８００万ダルトン、約８１０万ダルトン、約８２０万ダルトン、約８３０万ダルトン、約８４０万ダルトン、約８５０万ダルトン、約８６０万ダルトン、約８７０万ダルトン、約８８０万ダルトン、約８９０万ダルトン、約９００万ダルトン、約９１０万ダルトン、約９２０万ダルトン、約９３０万ダルトン、約９４０万ダルトン、約９５０万ダルトン、約９６０万ダルトン、約９７０万ダルトン、約９８０万ダルトン、約９９０万ダルトン若しくは約１０００万ダルトンの平均分子量、又は任意の２つの前述の値によって定義される範囲の間の任意の重量を含むヒアルロン酸成分を含む、条項１５０～１６０のいずれか一項に記載の方法。
【0336】
条項１６２．前記架橋ヒアルロン酸の前記ヒアルロン酸が、少なくとも２つの異なる分子量を含むヒアルロン酸成分の混合物を含む、条項１５０～１６１のいずれか一項に記載の方法。
【0337】
条項１６３．前記コラーゲンが、Ｉ型コラーゲン及び／又はＩＩＩ型コラーゲンを含む、条項１５０～１６２のいずれか一項に記載の方法。
【0338】
条項１６４．前記方法が、注入部位に青みがかった変色を引き起こさない、条項１５０～１６３のいずれか一項に記載の方法。
【0339】
条項１６５．前記組成物が、針を通じた向上した押出性を有し、前記針が、２７Ｇ、２８Ｇ、２９Ｇ、３０Ｇ、３１Ｇ又は３２Ｇのゲージサイズを含む、条項１５０～１６４のいずれか一項に記載の方法。
【0340】
条項１６６．組成物をヒトの組織に注入することによってヒトの外観を改善する方法であって、それによって、前記組成物が、それが注入された周囲組織から前記組成物への細胞浸潤及びコラーゲン沈着を促進し、前記方法が、前記ヒトの組織に組成物を注入し、それによって前記解剖学的特徴の審美的質を改善することであって、前記組成物が、ヒアルロン酸、リシン、及びコラーゲンを含む架橋高分子マトリックスを含み、前記ヒアルロン酸が、前記コラーゲンと物理的に混合された架橋ヒアルロン酸を含み、かつ前記組成物によって注入された前記組織が、組織一体化を有することが示される、改善することを含む、方法。
【0341】
条項１６７．前記組成物がリドカインをさらに含む、条項１６６に記載の方法。
【0342】
条項１６８．前記ヒアルロン酸成分が、約１万ダルトン、約２万ダルトン、約３万ダルトン、４万ダルトン、約５万ダルトン、約６万ダルトン、約７万ダルトン、約８万ダルトン、約１０万ダルトン、約２０万ダルトン、約３０万ダルトン、約４０万ダルトン、約５０万ダルトン、約６０万ダルトン、約７０万ダルトン、約８０万ダルトン、約９０万ダルトン、約１００万ダルトン、約１１０万ダルトン、約１２０万ダルトン、約１３０万ダルトン、約１４０万ダルトン、約１５０万ダルトン、約１６０万ダルトン、約１７０万ダルトン、約１８０万ダルトン、約１９０万ダルトン、約２００万ダルトン、約２１０万ダルトン、約２２０万ダルトン、約２３０万ダルトン、約２４０万ダルトン、約２５０万ダルトン、約２６０万ダルトン、約２７０万ダルトン、約２８０万ダルトン、約２９０万ダルトン、約３００万ダルトン、約３１０万ダルトン、約３２０万ダルトン、約３３０万ダルトン、約３４０万ダルトン、約３５０万ダルトン、約３６０万ダルトン、約３７０万ダルトン、約３８０万ダルトン、約３９０万ダルトン、約４００万ダルトン、約４１０万ダルトン、約４２０万ダルトン、約４３０万ダルトン、約４４０万ダルトン、約４５０万ダルトン、約４６０万ダルトン、約４７０万ダルトン、約４８０万ダルトン、約４９０万ダルトン、約５００万ダルトン、約５１０万ダルトン、約５２０万ダルトン、約５３０万ダルトン、約５４０万ダルトン、約５５０万ダルトン、約５６０万ダルトン、約５７０万ダルトン、約５８０万ダルトン、約５９０万ダルトン、約６００万ダルトン、約６１０万ダルトン、約６２０万ダルトン、約６３０万ダルトン、約６４０万ダルトン、約６５０万ダルトン、約６６０万ダルトン、約６７０万ダルトン、約６８０万ダルトン、約６９０万ダルトン、約７００万ダルトン、約７１０万ダルトン、約７２０万ダルトン、約７３０万ダルトン、約７４０万ダルトン、約７５０万ダルトン、約７６０万ダルトン、約７７０万ダルトン、約７８０万ダルトン、約７９０万ダルトン、約８００万ダルトン、約８１０万ダルトン、約８２０万ダルトン、約８３０万ダルトン、約８４０万ダルトン、約８５０万ダルトン、約８６０万ダルトン、約８７０万ダルトン、約８８０万ダルトン、約８９０万ダルトン、約９００万ダルトン、約９１０万ダルトン、約９２０万ダルトン、約９３０万ダルトン、約９４０万ダルトン、約９５０万ダルトン、約９６０万ダルトン、約９７０万ダルトン、約９８０万ダルトン、約９９０万ダルトン若しくは約１０００万ダルトンの平均分子量、又は任意の２つの前述の値によって定義される範囲の間の任意の重量を有する、条項１６６又は１６７に記載の方法。
【0343】
条項１６９．前記架橋ヒアルロン酸の前記ヒアルロン酸が、少なくとも２つの異なる分子量を含むヒアルロン酸成分の混合物を含む、条項１６６～１６８のいずれか一項に記載の方法。
【0344】
条項１７０．前記コラーゲンが、Ｉ型コラーゲン及び／又はＩＩＩ型コラーゲンを含む、条項１６６～１６９のいずれか一項に記載の方法。
【0345】
条項１７１．前記組成物によって注入された前記組織が、周囲組織からの細胞に浸潤することによって、前記組成物への組織一体化及び前記組成物内のコラーゲン沈着を有することが示される、条項１６６～１７０のいずれか一項に記載の方法。
【0346】
条項１７２．前記組成物によって注入された前記組織が、前記組成物の注入後に前記組成物への組織一体化及び前記組成物内のコラーゲン沈着を有することが示される、条項１６６～１７１のいずれか一項に記載の方法。
【0347】
条項１７３．前記組成物が、針を通じた向上した押出性を有し、前記針が、２７Ｇ、２８Ｇ、２９Ｇ、３０Ｇ、３１Ｇ又は３２Ｇのゲージサイズを含む、条項１６６～１７２のいずれか一項に記載の方法。
【0348】
さらなる考察
いくつかの実施形態において、本明細書の条項のいずれかは、独立条項のいずれか１つ又は従属条項のいずれか１つに依存してもよい。一態様において、条項（例えば、従属条項又は独立条項）のいずれかは、任意の他の１つ以上の条項（例えば、従属条項又は独立条項）と組み合わせてもよい。一態様において、請求項は、節、文、句又は段落に列挙された単語（例えば、工程、動作、手段又は構成要素）の一部又は全部を含んでもよい。一態様において、請求項は、１つ以上の節、文、句又は段落に列挙された単語の一部又は全部を含んでもよい。一態様において、各節、文、句又は段落の単語の一部が削除されてもよい。一態様において、追加の単語又は要素が、節、文、句又は段落に追加されてもよい。一態様において、主題技術は、本明細書に記載の構成要素、要素、機能又は動作の一部を利用することなく実施されてもよい。一態様において、主題技術は、追加の構成要素、要素、機能又は動作を利用して実施されてもよい。
いくつかの実施形態において、本明細書の条項のいずれかは、独立条項のいずれか１つ又は従属条項のいずれか１つに依存してもよい。一態様において、条項（例えば、従属条項又は独立条項）のいずれかは、任意の他の１つ以上の条項（例えば、従属条項又は独立条項）と組み合わせてもよい。一態様において、請求項は、節、文、句又は段落に列挙された単語（例えば、工程、動作、手段又は構成要素）の一部又は全部を含んでもよい。一態様において、請求項は、１つ以上の節、文、句又は段落に列挙された単語の一部又は全部を含んでもよい。一態様において、各節、文、句又は段落の単語の一部が削除されてもよい。一態様において、追加の単語又は要素が、節、文、句又は段落に追加されてもよい。一態様において、主題技術は、本明細書に記載の構成要素、要素、機能又は動作の一部を利用することなく実施されてもよい。一態様において、主題技術は、追加の構成要素、要素、機能又は動作を利用して実施されてもよい。
【0349】
例
実施された実験及び達成された結果を含む以下の例は、例示目的のみで提供されており、本開示を限定するものと解釈されるべきではない。
実施された実験及び達成された結果を含む以下の例は、例示目的のみで提供されており、本開示を限定するものと解釈されるべきではない。
【0350】
例１－ヒドロゲルの調製
ヒドロゲル配合物を調製するために、最初に、ＨＡ皮膚充填剤、ブタコラーゲン、水及び１０倍ＰＢＳを酸性ｐＨで一緒に混合した。１０倍ＰＢＳを添加して、溶液を等張及び緩衝条件に調整した。次いで、９．１重量％のＮａＯＨを添加し、２回目の混合をすることによって、溶液のｐＨを約７．４に上昇させた。ｐＨの上昇は、コラーゲンネットワークの自己集合を開始させた（表１）。いくつかの配合物は、混合後にオートクレーブ処理もした。
ヒドロゲル配合物を調製するために、最初に、ＨＡ皮膚充填剤、ブタコラーゲン、水及び１０倍ＰＢＳを酸性ｐＨで一緒に混合した。１０倍ＰＢＳを添加して、溶液を等張及び緩衝条件に調整した。次いで、９．１重量％のＮａＯＨを添加し、２回目の混合をすることによって、溶液のｐＨを約７．４に上昇させた。ｐＨの上昇は、コラーゲンネットワークの自己集合を開始させた（表１）。いくつかの配合物は、混合後にオートクレーブ処理もした。
【表1】
【0351】
例２－不透明度
コラーゲンの添加により、ヒドロゲルは外観が白色になり、次第により不透明になった（図１）。コラーゲンの自己集合は、光を散乱させてゲルに不透明な外観を与える線維の物理的に架橋したネットワークをもたらした。したがって、ヒドロゲルの不透明度は、患者の注入部位でチンダル効果を生じさせないという透明なＨＡのみのヒドロゲルを超える利点を提供した。
コラーゲンの添加により、ヒドロゲルは外観が白色になり、次第により不透明になった（図１）。コラーゲンの自己集合は、光を散乱させてゲルに不透明な外観を与える線維の物理的に架橋したネットワークをもたらした。したがって、ヒドロゲルの不透明度は、患者の注入部位でチンダル効果を生じさせないという透明なＨＡのみのヒドロゲルを超える利点を提供した。
【0352】
例３－レオロジー特性
ＨＡ／コラーゲンヒドロゲルの粘弾性（Ｇ’、Ｇ’’）を測定するために用いたレオロジー設定は、１ｍｍのギャップ高さに設定された直径２５ｍｍの平行プレートからなった。測定温度は、発振周波数５Ｈｚ、歪み０．８％で２５℃に設定した。弾性率（Ｇ’）は、コラーゲン及びＨＡ濃度の増加と共に増加した。Ｇ’値は、コラーゲンの存在下ではオートクレーブ処理後に減少したが、コラーゲンの非存在下では減少しなかった（図２）。
ＨＡ／コラーゲンヒドロゲルの粘弾性（Ｇ’、Ｇ’’）を測定するために用いたレオロジー設定は、１ｍｍのギャップ高さに設定された直径２５ｍｍの平行プレートからなった。測定温度は、発振周波数５Ｈｚ、歪み０．８％で２５℃に設定した。弾性率（Ｇ’）は、コラーゲン及びＨＡ濃度の増加と共に増加した。Ｇ’値は、コラーゲンの存在下ではオートクレーブ処理後に減少したが、コラーゲンの非存在下では減少しなかった（図２）。
【0353】
例４－膨潤
各ヒドロゲル配合物の膨潤を定量化した。簡潔に述べると、２つの接続されたシリンジを使用して、ヒドロゲル試料（１部）をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（７部）と混合した。混合は少なくとも１時間行った。１時間後、ゲル及びＰＢＳを１つのシリンジに移し、遠心分離した（７５０ＲＣＦ、１０分、室温）。色素を含有するポリマービーズを上清に添加し、シリンジを再びスピンダウンして（５０ＲＣＦ、２分、室温）、ゲル／上清界面を可視化した。総容積に対するゲル容積の変化を使用して、ヒドロゲル材料の膨潤を計算した（図３）。より高いコラーゲン濃度を有する配合物は、コラーゲンを含有しない同様のゲルと比較して膨潤の減少を示した。
各ヒドロゲル配合物の膨潤を定量化した。簡潔に述べると、２つの接続されたシリンジを使用して、ヒドロゲル試料（１部）をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（７部）と混合した。混合は少なくとも１時間行った。１時間後、ゲル及びＰＢＳを１つのシリンジに移し、遠心分離した（７５０ＲＣＦ、１０分、室温）。色素を含有するポリマービーズを上清に添加し、シリンジを再びスピンダウンして（５０ＲＣＦ、２分、室温）、ゲル／上清界面を可視化した。総容積に対するゲル容積の変化を使用して、ヒドロゲル材料の膨潤を計算した（図３）。より高いコラーゲン濃度を有する配合物は、コラーゲンを含有しない同様のゲルと比較して膨潤の減少を示した。
【0354】
例５－凝集性
ＨＡ－コラーゲン材料の圧縮力を測定することによって凝集性を定量化し、平行な直径２５ｍｍのプレートとしての垂直力の差は、０．８ｍｍ／分で２．５ｍｍから０．９ｍｍのギャップ高さに低下した。より高い圧縮力（２．５～０．９ｍｍのギャップ高さの垂直力の変化）を有するゲルは、より凝集性が高いと考えられる。凝集性は、コラーゲンの添加及びより高いＨＡ濃度で増加した（図４）。コラーゲンを含有するオートクレーブ配合物は、同様のＨＡ濃度を有するがコラーゲンを含有しない配合物と同等の凝集性値をもたらした。
ＨＡ－コラーゲン材料の圧縮力を測定することによって凝集性を定量化し、平行な直径２５ｍｍのプレートとしての垂直力の差は、０．８ｍｍ／分で２．５ｍｍから０．９ｍｍのギャップ高さに低下した。より高い圧縮力（２．５～０．９ｍｍのギャップ高さの垂直力の変化）を有するゲルは、より凝集性が高いと考えられる。凝集性は、コラーゲンの添加及びより高いＨＡ濃度で増加した（図４）。コラーゲンを含有するオートクレーブ配合物は、同様のＨＡ濃度を有するがコラーゲンを含有しない配合物と同等の凝集性値をもたらした。
【0355】
例６－押出力
押出力は、２７Ｇ、１／２インチ針を備えた１ｍＬ ＢＤツベルクリンシリンジを用いて１００ｍｍ／分の速度で測定した。押出力は、コラーゲン含有量と共に増加した（図５）。オートクレーブ処理後、押出力は、オートクレーブ処理前の同じ配合物よりも低いことが分かった。
押出力は、２７Ｇ、１／２インチ針を備えた１ｍＬ ＢＤツベルクリンシリンジを用いて１００ｍｍ／分の速度で測定した。押出力は、コラーゲン含有量と共に増加した（図５）。オートクレーブ処理後、押出力は、オートクレーブ処理前の同じ配合物よりも低いことが分かった。
【0356】
例７－インビボリフト能力
組織突出（リフト）を支持するヒドロゲルの能力を、ラットの皮下埋込みモデルを用いてインビボで評価した。１２５μＬのヒドロゲル（ｎ＝１０）を頭蓋骨の上に皮下ボーラスとして注入した。臨床３Ｄイメージングシステム（Ｃａｎｆｉｅｌｄ Ｖｅｃｔｒａ）を使用して、１２週にわたってボーラスの３Ｄ再構築を生成した。ボーラスの平均高さは、医用イメージングソフトウェア（Ｃａｎｆｉｅｌｄ Ｍｉｒｒｏｒ）を用いて解析した。
組織突出（リフト）を支持するヒドロゲルの能力を、ラットの皮下埋込みモデルを用いてインビボで評価した。１２５μＬのヒドロゲル（ｎ＝１０）を頭蓋骨の上に皮下ボーラスとして注入した。臨床３Ｄイメージングシステム（Ｃａｎｆｉｅｌｄ Ｖｅｃｔｒａ）を使用して、１２週にわたってボーラスの３Ｄ再構築を生成した。ボーラスの平均高さは、医用イメージングソフトウェア（Ｃａｎｆｉｅｌｄ Ｍｉｒｒｏｒ）を用いて解析した。
【0357】
４～１２週の間に測定された一連のＮＯＡ架橋ＨＡ配合物（コラーゲンなし）及び増加する［ＨＡ］のインビボリフト能力は、２０ｍｇ／ｍＬ～２４ｍｇ／ｍＬのＨＡ濃度と正の相関を示した（図６）。２４ｍｇ／ｍＬを超える［ＨＡ］を含有する配合物は、リフト能力の増加を示さなかった。さらに、２４ＮＯＡゲルのリフト能力は、ＨＡのみのＢＤＤＥ架橋ゲルに匹敵する。
【0358】
４～１２週の間に測定された２０ｍｇ／ｍＬ又は２４ｍｇ／ｍＬのＨＡ及び低濃度のコラーゲン（２．３ｍｇ／ｍＬ～３．０ｍｇ／ｍＬ）を含有する一連のＮＯＡ架橋ＨＡ配合物のインビボリフト能力は、ＨＡゲルへのコラーゲンの混合はリフト能力に影響を及ぼさないことを示した（図７）。さらに、２４ＮＯＡ２．３ゲルのリフト能力は、ＨＡのみのＢＤＤＥ架橋ゲルに匹敵する。
【0359】
４～５２週の間に測定された２４ｍｇ／ｍＬ ＨＡ又は２８ｍｇ／ｍＬ及び高濃度のコラーゲン（６ｍｇ／ｍＬ～１１ｍｇ／ｍＬ）を含有する一連のＮＯＡ架橋ＨＡ配合物のインビボリフト能力は、ＮＯＡで架橋され、コラーゲンと混合されたゲルは、ＨＡのみの比較対照と同等又はそれより良好な長期リフト能力を示すことを示した（図８）。さらに、ＮＯＡ架橋ＨＡゲル又はＨＡ－コラーゲンゲルのリフト能力は、ＢＤＤＥ架橋ＨＡのみのゲルと同等である。
【0360】
例８－ヒドロゲルに対する細胞応答のインビトロ試験
ＨＡ－コラーゲンヒドロゲルと密接に接触している線維芽細胞の生存率を定量化した。このアッセイは、細胞酵素によるテトラゾリウム塩の着色ホルマザン生成物への還元を監視することによって、細胞活性を測定する。より高い生存率を示す細胞は、特定の波長でより高い吸光度を示すが、より低い生存率／増殖を示す細胞は、より低い吸光度を示す。吸光度を測定し、陽性対照（組織培養プレート）及び陰性対照（ＨＡのみのヒドロゲル）と比較して、相対増殖値を得ることができる。より大きな細胞生存率を支持するヒドロゲルは、それらの細胞がゲルマトリックス内にＥＣＭを沈着させてゲル内により多くの細胞浸潤を誘導すると予想される可能性があり、ヒドロゲルデポーへのインビボ組織一体化に有益である可能性がある。逆に、より低い細胞増殖値をもたらす配合物は、より不活性に挙動し、より少ない組織浸潤及び一体化を可能にするであろう。
ＨＡ－コラーゲンヒドロゲルと密接に接触している線維芽細胞の生存率を定量化した。このアッセイは、細胞酵素によるテトラゾリウム塩の着色ホルマザン生成物への還元を監視することによって、細胞活性を測定する。より高い生存率を示す細胞は、特定の波長でより高い吸光度を示すが、より低い生存率／増殖を示す細胞は、より低い吸光度を示す。吸光度を測定し、陽性対照（組織培養プレート）及び陰性対照（ＨＡのみのヒドロゲル）と比較して、相対増殖値を得ることができる。より大きな細胞生存率を支持するヒドロゲルは、それらの細胞がゲルマトリックス内にＥＣＭを沈着させてゲル内により多くの細胞浸潤を誘導すると予想される可能性があり、ヒドロゲルデポーへのインビボ組織一体化に有益である可能性がある。逆に、より低い細胞増殖値をもたらす配合物は、より不活性に挙動し、より少ない組織浸潤及び一体化を可能にするであろう。
【0361】
１００μＬのヒドロゲル（ｎ＝３）を、低接着表面コーティングを有する２４ウェル細胞培養プレートの底部に重層し、３７℃の加湿インキュベータに３０分間入れた。５００μＬの細胞培養培地中の５万個の成体ヒト皮膚線維芽細胞をヒドロゲル床の上に加え、３７℃でインキュベートした。４８時間のインキュベーション後、各ウェルにＸＴＴ試薬２５０μＬを添加し、３７℃で４時間インキュベートした。次いで、プレートを３００×ｇで５分間回転させ、各ウェルからの２００μＬの上清を２０μｍメッシュの９６ウェルフィルタプレートのウェルに移した。ＸＴＴ上清を含むフィルタプレートを３００×ｇで５分間回転させた。各ウェルからの１００μＬの濾過上清を清浄な９６ウェルプレート（黒壁、透明底）に移し、上清の吸光度をマイクロプレートリーダで読み取った（６３０ｎｍバックグラウンド補正で４５０ｎｍ）。陽性対照の組織培養ポリスチレン（ＴＣＰＳ）上で培養した線維芽細胞のＸＴＴ細胞生存率に対してデータを正規化した。
【0362】
コラーゲンをＨＡマトリックスに混合した配合物では、コラーゲンを含有しない配合物よりも細胞活性が高いことが分かった（図９）。例えば、ＨＡのみから構成されるヒドロゲル（ＢＤＤＥ架橋又はＮＯＡ架橋）は、１８．９％～２１％の細胞生存率値を示した。６ｍｇ／ｍＬ又は１１ｍｇ／ｍＬのコラーゲンを添加したヒドロゲルは、２８．７％（２８ＮＯＡ１１ＣＮ）、２９．２％（２４ＮＯＡ６ＣＮ）又は３０．４％（２８ＮＯＡ６ＣＮ）の細胞生存率値を示した。
【0363】
上記の細胞活性アッセイに加えて、細胞のサイズ、形状及び細胞骨格組織化に対する特定の配合物の効果をよりよく理解するために、細胞形態解析を実施した。ＨＡのみ又はＨＡ／コラーゲン架橋ヒドロゲル上で培養した線維芽細胞のアクチンフィラメント・アラインメント・インデックス及び形態を画像化し、定量化した。アクチンフィラメントのアラインメントの増加は、細胞の基質への接着の増加と相関する可能性がある。長さ対幅の比の増加は、基質上の細胞伸展の増加と相関する。より大きな細胞接着及び伸展を支持するヒドロゲルは、それらの細胞がゲルマトリックス内にＥＣＭを沈着させてゲル内により多くの細胞浸潤を誘導すると予想されるであろう。細胞浸潤及びＥＣＭ沈着の増加は、ヒドロゲルデポーへのインビボ組織一体化に有益であり得る。逆に、より低い細胞接着及び伸展の値をもたらす配合物は、より不活性に挙動し、より少ない組織浸潤及び一体化を可能にするであろう。
【0364】
典型的な手順において、細胞培養培地中のヒドロゲル（ｎ＝３）及びヒト皮膚線維芽細胞を、低接着表面コーティングを有する９６ウェル細胞培養プレートに添加した。４８時間のインキュベーション後、細胞をホルマリンで固定し、Ｈｏｅｃｈｓｔ、ＷＧＡ－４８８及びＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ－ファロイジンで染色した。ウェルを共焦点顕微鏡で画像化し、アクチンフィラメント・アラインメント（ファロイジン）及び細胞形態（ＷＧＡ－４８８）を画像解析ソフトウェアを用いて解析した。
【0365】
ヒドロゲルを含有するコラーゲンは、ヒドロゲル材料上での改善された細胞接着及び伸展を示す（図１０）。アクチンフィラメント・アラインメント・インデックスは、ＨＡのみ（０．０１６）と比較して２４ＮＯＡ６ＣＮゲル（０．０２６）に対してより高い傾向がある。細胞の長さ対幅の比（細胞伸展）は、ＨＡのみのヒドロゲル（１．２８）よりも２４ＮＯＡ６ＣＮヒドロゲル（１．４１）において有意に高い。
【0366】
細胞形態解析は、活性アッセイにおいてＨＡのみのゲルよりも高い活性を示した２４ＮＯＡ６ＣＮ配合物が、形態アッセイにおいて細胞接着及び伸展の増強の証拠も示したという点で、ＸＴＴ細胞活性アッセイと良好に相関した。
【0367】
例９－インビボ組織一体化
ラットの皮下埋込みモデルを用いて、一連の配合物のインビボ組織一体化を評価した。典型的な手順において、１２５μＬのヒドロゲルをラットの背側面に皮下ボーラスとして送達した。４又は１２週後に、ボーラスを外植し、ホルマリンで固定し、組織学的検査のためにパラフィンに包埋した。組織切片をヘマトキシリン＆エオシン（Ｈ＆Ｅ）及びコロイド鉄で染色した。外因性ブタコラーゲンと反応しない抗体を用いて、ラットＩ型コラーゲンの免疫組織化学染色を行った。
ラットの皮下埋込みモデルを用いて、一連の配合物のインビボ組織一体化を評価した。典型的な手順において、１２５μＬのヒドロゲルをラットの背側面に皮下ボーラスとして送達した。４又は１２週後に、ボーラスを外植し、ホルマリンで固定し、組織学的検査のためにパラフィンに包埋した。組織切片をヘマトキシリン＆エオシン（Ｈ＆Ｅ）及びコロイド鉄で染色した。外因性ブタコラーゲンと反応しない抗体を用いて、ラットＩ型コラーゲンの免疫組織化学染色を行った。
【0368】
２０ｍｇ／ｍＬのＨＡ（２０ＮＯＡ）及び３ｍｇ／ｍＬの添加されたコラーゲンを含有する配合物は、注入したヒドロゲルボーラスに見られる線維芽細胞による新たな宿主コラーゲン沈着によって判断されるように、４週後に注入した充填剤への細胞浸潤及び組織一体化の増強を示した（図１１）。
【0369】
２８ｍｇ／ｍＬ ＨＡ（２８ＮＯＡ）を含有する配合物は、４週後にヒドロゲルボーラスの内部の封入を示した（図１２）。最大１１ｍｇ／ｍＬのコラーゲンの添加は、ヒドロゲルボーラスの周囲の組織一体化／コラーゲン沈着を改善したが、封入を妨げなかった。これは、組織一体化を妨げる可能性があるＨＡ濃度に上限があることを示している可能性がある。
【0370】
２４ｍｇ／ｍＬ ＨＡ（２４ＮＯＡ）を含有する配合物は、４週後にヒドロゲルボーラスの大部分を通して組織内殖及びコラーゲン沈着を示した（図１３）。コラーゲンの添加は、用量依存的に組織一体化を改善するようであった。２４ＮＯＡ６ＣＮゲルは、ヒドロゲル粒子を取り囲む堅固な新しいコラーゲン沈着を示した。
【0371】
２４ｍｇ／ｍＬ ＨＡ及び６ｍｇ／ｍＬコラーゲン（２４ＮＯＡ６ＣＮ）を含有する配合物は、皮下埋込みの４～１２週で組織一体化／コラーゲン沈着の改善を示した（図１４）。２４ＮＯＡ６ＣＮ配合物の組織一体化は、ＢＤＤＥ架橋ＨＡのみのゲルよりも実質的に改善されたようであった。重要なことに、この混合ゲル配合物（２４ＮＯＡ６ＣＮ）はまた、高リフトＢＤＤＥ架橋ＨＡのみのゲルと同様のリフト能力を示した。２４ＮＯＡ６ＣＮ配合物は、容積損失の補正及び組織一体化の増強に適したリフト能力の組合せを示した。これは、最初の容積補正に次いで、自然な外観／感触及び効果の持続時間の増加という臨床的利益をもたらす可能性がある。
【0372】
ラットへの皮下注入後のヒドロゲルボーラスの組織一体化を評価するために、半定量的組織病理学的スコアリングシステムを開発した。簡潔に述べると、盲検病理学者が、Ｈ＆Ｅ染色切片に基づいて、組織内殖の密度（０＝最悪、５＝最良）、組織帯の厚さ（０＝最悪、５＝最良）、及びボーラスの組織充填（－５＝充填なし、０＝組織で充填されたボーラス）をスコア化した。これらの３つのスコアを組み合わせて、最も高度に一体化された配合物については１０、最も一体化されていない配合物については－５の合計スコアを付した。このスコアリングシステムを用いて２４ＮＯＡ６ＣＮゲルの組織一体化を定量化し、ＢＤＤＥ架橋ＨＡのみのゲルと比較した（図１５）。２４ＮＯＡ６ＣＮの一体化は、４週目のＨＡのみのゲルと同等であった（それぞれ２．３３及び２．５）。２４ＮＯＡ６ＣＮゲルの一体化は、１２週間後にＨＡのみのゲルよりもスコアが高かった（それぞれ５．１７対２．８３）。ＨＡのみのゲルは本質的に同じままであったが、２４ＮＯＡ６ＣＮゲルの一体化は経時的に改善されたことに留意することも重要である。これは、ＨＡ－コラーゲン混合ゲルによる経時的な改善効果を示している可能性がある。
【0373】
本明細書における複数及び／又は単数の用語の使用に関して、当業者は、文脈及び／又は用途に適切であるように、複数から単数へ、及び／又は単数から複数へと変換することができる。様々な単数／複数の置換は、明確にするために本明細書に明示的に記載される場合がある。
【0374】
一般に、本明細書、特に添付の特許請求の範囲（例えば、添付の特許請求の範囲の本体）で使用される用語は、一般に「オープン」用語（例えば、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語は「限定されるものではないが、～を含む」と解釈されるべきであり、「有する」という用語は「少なくとも、～を有する」と解釈されるべきであり、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」という用語は「限定されるものではないが、～を含む」と解釈されるべきである、など）として意図されることが当業者によって理解されよう。特定の数の導入された請求項の列挙が意図される場合、そのような意図は請求項に明示的に記載され、そのような列挙がない場合、そのような意図は存在しないことが当業者によってさらに理解されるであろう。例えば、理解を助けるために、以下の添付の特許請求の範囲は、請求項の列挙を導入するための導入句「少なくとも１つ」及び「１つ以上」の使用を含む場合がある。しかしながら、そのような句の使用は、不定冠詞「ａ」又は「ａｎ」による請求項の列挙の導入が、そのような導入された請求項の列挙を含む任意の特定の請求項を、同じ請求項が導入句「１つ以上」又は「少なくとも１つ」及び「ａ」若しくは「ａｎ」などの不定冠詞（例えば、「ａ」及び／又は「ａｎ」は、「少なくとも１つ」又は「１つ以上」を意味すると解釈されるべきである）を含む場合であっても、１つのそのような列挙のみを含む実施形態に限定することを意味すると解釈されるべきではない。請求項の列挙を導入するために使用される定冠詞の使用についても同じことが当てはまる。さらに、特定の数の導入された請求項の列挙が明示的に列挙されている場合でも、当業者は、そのような列挙が少なくとも列挙された数を意味する（例えば、他の修飾語を含まない「２つの列挙」の無修飾の列挙は、少なくとも２つの列挙、又は２つ以上の列挙を意味する）と解釈されるべきであることを認識するであろう。さらに、「Ａ、Ｂ及びＣなどのうちの少なくとも１つ」に類似した慣例が使用される場合、一般に、そのような構成は、当業者がその慣例を理解するであろう意味で意図される（例えば、「Ａ、Ｂ及びＣのうちの少なくとも１つを有するシステム」は、Ａのみ、Ｂのみ、Ｃのみ、ＡとＢとを一緒に、ＡとＣとを一緒に、ＢとＣとを一緒に、及び／又はＡとＢとＣとを一緒に有するシステムなどを含むが、これらに限定されない）。「Ａ、Ｂ又はＣなどのうちの少なくとも１つ」に類似した慣例が使用される場合、一般に、そのような構成は、当業者がその慣例を理解するであろう意味で意図される（例えば、「Ａ、Ｂ又はＣのうちの少なくとも１つを有するシステム」は、Ａのみ、Ｂのみ、Ｃのみ、ＡとＢとを一緒に、ＡとＣとを一緒に、ＢとＣとを一緒に、及び／又はＡとＢとＣとを一緒に有するシステムなどを含むが、これらに限定されない）。２つ以上の代替的な用語を提示する実質的に任意の離接的な単語及び／又は句は、明細書、特許請求の範囲、又は図面のいずれかにかかわらず、用語の１つ、用語のいずれか、又は両方の用語を含む可能性を考慮すると理解されるべきであることが当業者によってさらに理解されるであろう。例えば、「Ａ又はＢ」という句は、「Ａ」又は「Ｂ」又は「Ａ及びＢの可能性を含むと理解されるであろう。
【0375】
さらに、本開示の特徴又は態様がマーカッシュ群に関して記載されている場合、当業者は、本開示がそれによってマーカッシュ群の任意の個々のメンバー又はメンバーのサブグループに関しても記載されていることを認識するであろう。
【0376】
第１～第６の態様の実施形態の特徴のいずれも、本明細書で特定されるすべての態様及び実施形態に適用可能である。さらに、第１～第６の態様の実施形態の特徴のいずれも、任意の方法で本明細書に記載の他の実施形態と独立して、部分的に又は全体的に組み合わせることができ、例えば、１つ、２つ、又は３つ以上の実施形態を、全体的に又は部分的に組み合わせることができる。さらに、第１～第９の態様の実施形態の特徴のいずれも、他の態様又は実施形態に対して任意選択的にすることができる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
