特許 7483774 脊髄性筋萎縮症の治療に有用な組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-05-07

(45)【発行日】2024-05-15

(54)【発明の名称】脊髄性筋萎縮症の治療に有用な組成物

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/864 20060101AFI20240508BHJP

   C12N 7/01 20060101ALI20240508BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20240508BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240508BHJP

   C07K 14/015 20060101ALN20240508BHJP

   C07K 14/47 20060101ALN20240508BHJP

【ＦＩ】

C12N15/864 100Z

C12N7/01 ZNA

C12N15/12

C12N5/10

C07K14/015

C07K14/47

【請求項の数】 17

【外国語出願】

(21)【出願番号】P 2022033576

(22)【出願日】2022-03-04

(62)【分割の表示】P 2019547087の分割

【原出願日】2018-02-27

(65)【公開番号】P2022078208

(43)【公開日】2022-05-24

【審査請求日】2022-03-31

(31)【優先権主張番号】62/464,756

(32)【優先日】2017-02-28

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/618,437

(32)【優先日】2018-01-17

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/515,902

(32)【優先日】2017-06-06

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】502409813

【氏名又は名称】ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア

(74)【代理人】

【識別番号】110000741

【氏名又は名称】弁理士法人小田島特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】ウイルソン，ジェームス・エム

(72)【発明者】

【氏名】ヒンデラー，クリスチャン

(72)【発明者】

【氏名】カッツ，ネイサン

(72)【発明者】

【氏名】ワン，チャン

【審査官】小倉 梢

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０１５／１６４７５７（ＷＯ，Ａ１）

【文献】米国特許出願公開第２０１６／００７４４７４（ＵＳ，Ａ１）

【文献】Mol. Ther. Methods Clin. Dev.，2016年，Vol. 3, 16060，p. 1-8

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ １５／００ － １５／９０

Ｃ１２Ｎ ７／００ － ７／０８

Ｃ０７Ｋ １４／００ － １４／８２５

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

（ａ） ＡＡＶｈｕ６８カプシド中にパッケージングされるための、ベクターゲノムを含む核酸配列であって、ベクターゲノムが、ＡＡＶ ５’末端逆位反復（ＩＴＲ）、発現制御配列に機能可能に繋げられたＳＭＮ１タンパク質をコードする核酸配列、及びＡＡＶ ３'ＩＴＲを含む、核酸配列；
（ｂ） コードされたＡＡＶｈｕ６６カプシドタンパク質の発現を促す調節配列に機能可能に繋げられた、配列番号８をコードするＡＡＶｈｕ６８カプシド核酸配列（ＡＡＶｈｕ６８ ＶＰ１）；
（ｃ） ＡＡＶ ｒｅｐタンパク質の発現を促す調節配列に機能可能に繋げられた、ＡＡＶ ｒｅｐタンパク質をコードする核酸配列；及び
（ｄ） ベクターゲノムの複製およびベクターゲノムのＡＡＶｈｕ６８カプシド中へのパッケージングを可能にするヘルパー機能をコードする核酸配列、
を含む宿主細胞。

【請求項2】

ＳＭＮ１タンパク質をコードする核酸配列が、
（ｉ） 配列番号１か、又は配列番号２のアミノ酸配列のＳＭＮ１タンパク質アイソフォームＤタンパク質をコードする配列番号１と少なくとも７０％同一である配列；
（ｉｉ） 配列番号３；
（ｉｉｉ） 配列番号４；
（ｉｖ） 配列番号５、又は
（ｖ） 配列番号６、
から選択される、請求項１に記載の宿主細胞。

【請求項3】

発現制御配列（ａ）が、エンハンサー、プロモーター、イントロン、コザック配列、ポリＡ、又は翻訳後調節要素の１以上を更に含む、請求項１に記載の宿主細胞。

【請求項4】

プラスミドが（ａ）の核酸配列を含む、請求項１に記載の宿主細胞。

【請求項5】

プラスミドが（ｂ）及び（ｃ）の核酸配列を含む、請求項１に記載の宿主細胞。

【請求項6】

配列番号８をコードする核酸配列が、配列番号７であるか又はそれと９５％同一の配列である、請求項１に記載の宿主細胞。

【請求項7】

宿主細胞が培養物中にある、請求項１に記載の宿主細胞。

【請求項8】

宿主細胞が懸濁液中にある、請求項１に記載の宿主細胞。

【請求項9】

宿主細胞が哺乳動物細胞である、請求項１に記載の宿主細胞。

【請求項10】

宿主細胞がＨＥＫ２９３細胞である、請求項１に記載の宿主細胞。

【請求項11】

宿主細胞が昆虫細胞である、請求項１に記載の宿主細胞。

【請求項12】

請求項１～１１のいずれか１に記載の宿主細胞を用いて産生される、ＳＭＮ１コード配列を含むベクターゲノムを含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｈｕ６８ベクター。

【請求項13】

ベクターゲノムが、５'ＡＡＶ ＩＴＲ、サイトメガロウイルス即時早期エンハンサー、ニワトリベータアクチンプロモーター、イントロン、ポリＡ、及び３’ＡＡＶ ＩＴＲを含む、請求項１２に記載のｒＡＡＶｈｕ６８ベクター。

【請求項14】

ベクターゲノムが配列番号１５又は配列番号２５の配列を有する、請求項１２に記載のｒＡＡＶｈｕ６８ベクター。

【請求項15】

ｒＡＡＶｈｕ６８ベクターが、配列番号７又はそれと９９％同一である配列を用いて産生される、請求項１２から１４のいずれか１に記載のｒＡＡＶｈｕ６８ベクター。

【請求項16】

配列番号２をコードするＳＭＮ１コード配列を含むベクターゲノムを含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｈｕ６８ベクターであって、ｒＡＡＶｈｕ６８カプシドが配列番号８をコードするＡＡＶｈｕ６８ＶＰ１核酸配列から産生される、ｒＡＡＶｈｕ６８ベクター。

【請求項17】

ＳＭＮ１コード配列は配列番号３である、請求項１６に記載のｒＡＡＶｈｕ６８ベクター。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

発明の背景
脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）は、スプライソソーム生合成に関与する遍在的に発現するタンパク質（運動神経細胞生存－ＳＭＮ）をコードする遺伝子であるテロメア側のＳＭＮ１における突然変異によって引き起こされる神経筋疾患である。ＳＭＡはＳＭＮ１遺伝子の突然変異または欠失によって引き起こされる常染色体劣性障害である。機能するＳＭＮ１遺伝子の提供は表現型を救済することが示された。例えば、Ｔａｎｇｕｙ ｅｔ ａｌ，Ｓｙｓｔｅｍｉｃ ＡＡＶｒｈ１０ ｐｒｏｖｉｄｅｓ ｈｉｇｈｅｒ ｔｒａｎｓｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｔｈａｎ ＡＡＶ９ ｉｎ ｔｈｅ ｂｒａｉｎ ａｎｄ
ｔｈｅ ｓｐｉｎａｌ ｃｏｒｄ ｏｆ ｎｅｏｎａｔａｌ ｍｉｃｅ，Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，８（３６）（Ｊｕｌｙ
２０１５）を参照されたい。

【0002】

国際ＳＭＡ協会分類は、ＳＭＡ表現型の重症度のいくつかの度合いを発症年齢及び運動発達マイルストーンに応じて定義している。ＳＭＡ０は、出生前発症及び重度関節拘縮、両側顔面神経麻痺ならびに呼吸不全を表すために提案される呼称である。１型（またはＩ型）ＳＭＡであるウェルドニッヒ・ホフマンＩ病は、出生から６ヶ月以内に発症する最重度の生後形態である。患者は、起き上がることができず、重篤な呼吸不全を有する。２型（またはＩＩ型）ＳＭＡは、最初の２年以内に発症する中間形態であり、子供は起き上がることはできるが歩行はできない。臨床経過は変化しやすい。３型（またはＩＩＩ型）（クーゲルベルグ・ウェランダー病とも呼ぶ）は２歳よりも後に始まり、大抵は慢性的発展をする。子供は少なくとも幼年期には支援なしで起立及び歩行ができる。成人形態（４型またはＩＶ型）は最軽度であり、３０歳よりも後に発症し、症例が報告されたことはほとんどなく、その有病率は正確には知られていない。

【0003】

多くの遺伝性及び後天性神経筋疾患には下位運動ニューロンの変性が伴う。最も一般的及び破壊的な例の１つは脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）であり、これは、下位運動ニューロンの選択的死、進行性の虚弱、及び幼児期に多い死亡によって特徴付けられる、運動神経細胞生存（ＳＭＮ）タンパク質の遺伝性の欠損症である。原因は明らかではないがＳＭＮ欠損症は下位運動ニューロンに対する選択的毒性を生じさせ、結果として進行性のニューロン喪失及び筋力低下を招く。疾患の重症度は、ほんの少量の完全長ＳＭＮ転写産物の産生をもたらすスプライス部位突然変異を有する相同遺伝子（ＳＭＮ２）のセントロメア重複のコピー数によって調整される。１～２コピーのＳＭＮ２を有する患者は、生後の最初の数ヶ月で発症し急速に呼吸不全に進展することによって特徴付けられるＳＭＡの重度形態を示す。３コピーのＳＭＮ２を有する患者は一般に、６ヶ月より後の年齢で現れることが典型的である疾患の減弱化形態を呈する。多くの者は歩行能力を獲得することがないものの、呼吸不全に進展することは稀であり、成人期に入っても生存していることが多い。ＳＭＮ２コピーを４つ有する患者は、成人期までは存在しない場合があり、徐々に筋力低下を発症する。現在、ＳＭＡに対する緩和ケア以外の処置はない。

【0004】

ＳＭＮ発現と疾患重症度との間に明らかな相関があり、罹患細胞の数が比較的少ないことから、ＳＭＡは遺伝子療法の極めて良い対象になる。以前の研究では、遺伝子導入マウスモデルにおいて、血液脳関門を通過する能力を有するＡＡＶベクター血清型の全身注射を用いてＳＭＡ表現型を救済することができることが実証された。例えば、Ｔａｎｇｕｙ
ｅｔ ａｌ，Ｓｙｓｔｅｍｉｃ ＡＡＶｒｈ１０ ｐｒｏｖｉｄｅｓ ｈｉｇｈｅｒ ｔｒａｎｓｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｔｈａｎ ＡＡＶ９ ｉｎ ｔｈｅ ｂｒａｉｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｐｉｎａｌ ｃｏｒｄ ｏｆ ｎｅｏｎａｔａｌ ｍｉｃｅ
，Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，８（３６）（Ｊｕｌｙ ２０１５）を参照されたい。Ｐａｓｓｉｎｉ ｅｔ ａｌ，ＨＧＴ，２０１４は、ＳＭＮΔ７マウスにおいてｓｃＡＡＶ９．ＧｕｓＢ．ＳＭＮ１ベクターを使用して生存期間が用量依存的に２００日まで増加することを報告した。Ｍｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，２０１４は、ｓｃＡＡＶ９．ＣＢＡ．ＳＭＮ１ベクターを２．７×１０^９～３．３×１０^１０ＧＣ／仔の用量で使用して生存期間が用量依存的に４５０日まで増加することを報告した。しかしながら、より低い用量はごくわずかな改善を示した。Ｐａｓｓｉｎｉ ｅｔ ａｌ，ＪＣＩ，２０１０、及びＰａｓｓｉｎｉ ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓ Ｍｅｄ，２０１１も参照されたい。参照によりこれらの文献の各々を本明細書に援用する。
ＳＭＡに対する効果的な処置はなおも必要とされている。

【発明の概要】

【0005】

一態様では、ＡＡＶｈｕ６８カプシドと少なくとも１つの発現カセットとを含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターが提供され、ここで、当該少なくとも１つの発現カセットは、機能性ＳＭＮタンパク質をコードする核酸配列、及び宿主細胞におけるＳＭＮ配列の発現を促す発現制御配列を含むものであり、当該ＡＡＶｈｕ６８カプシドは、配列番号７によってコードされ産生されるタンパク質から独立して選択されるアミノ酸配列、または配列番号８のアミノ酸配列を有するＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ１カプシドタンパク質の集団を含む。特定の実施形態では、ＡＡＶｈｕ６８カプシドはｖｐ１タンパク質の異種集団を有する。特定の実施形態では、ＡＡＶｈｕ６８カプシドはｖｐ２タンパク質の異種集団を有する。特定の実施形態では、ＡＡＶｈｕ６８カプシドはｖｐ３タンパク質の異種集団を有する。一実施形態において、ＡＡＶｈｕ６８カプシドタンパク質コード配列は配列番号７の配列を有する。一実施形態において、ＳＭＡコード配列は配列番号１の配列を有する。

【0006】

さらに、ＡＡＶ ５’ＩＴＲ、ＣＢ７プロモーター、イントロン、配列番号１の核酸配列、ポリＡ及びＡＡＶ ３’末端逆位反復配列を含む核酸分子が中にパッケージングされているＡＡＶｈｕ６８カプシドを含むｒＡＡＶベクターを提供し、ここで、ＡＡＶｈｕ６８カプシドは、ｖｐ１タンパク質の集団、ｖｐ２の集団、及びｖｐ３タンパク質の集団を含み、ＡＡＶｈｕ６８カプシドタンパク質は、配列番号７によって産生されるタンパク質、配列番号８のｖｐ１、ｖｐ２及び／またはｖｐ３のアミノ酸配列を有するカプシドタンパク質から独立して選択される、アミノ酸配列を有する。特定の実施形態では、ＡＡＶｈｕ６８カプシドは、ｖｐ１タンパク質の異種集団を有する。特定の実施形態では、ＡＡＶｈｕ６８カプシドは、ｖｐ２タンパク質の異種集団を有する。特定の実施形態では、ＡＡＶｈｕ６８カプシドは、ｖｐ３タンパク質の異種集団を有する。

【0007】

上に記載したようなＡＡＶｈｕ６８ベクターを含有する医薬組成物を提供する。組成物は少なくとも１つのベクター材料の他に、薬学的に許容できる担体、賦形剤及び／または保存剤のうちの少なくとも１つをさらに含有する。

【0008】

さらに、ｒＡＡＶｈｕ６８．ＳＭＡベクターまたは本明細書に提供する操作型ｈＳＭＮのための別の送達ビヒクルを使用して脊髄性筋萎縮症の治療をそれを必要とする対象に施す方法を提供する。特定の実施形態では、本明細書に提供する組成物はクモ膜下腔内に投与され得る。

【0009】

特定の実施形態では、本明細書に記載のｒＡＡＶｈｕ６８．ＳＭＮ１または、場合によって共療法で患者の脊髄性筋萎縮症の治療に使用するための組成物が提供される。特定の実施形態では、患者は３型ＳＭＡを有する。特定の実施形態では、組成物はクモ膜下腔内送達のために製剤化される。

【0010】

ＳＭＡを有する患者を治療するための、本明細書に記載のｒＡＡＶｈｕ６８．ＳＭＡまたはそれを含有する組成物の使用が、場合によって共治療計画において提供される。そのような組成物はクモ膜下腔内送達のために製剤化され得る。

【0011】

本発明の他の態様及び利点は本発明の以下の詳細な説明からすぐに分かるであろう。

【図面の簡単な説明】

【0012】

【図1】Ａは、ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＳＭＮ１ｃｏ．ＲＢＧベクターゲノムの模式図である。ＩＴＲはＡＡＶ２末端逆位反復配列を表す。ＣＢ７は、サイトメガロウイルスエンハンサーを有するニワトリベータアクチンプロモーターを表す。ＲＢＧポリＡは、ウサギベータグロビンポリアデニル化シグナルを表す。Ｂ～Ｃは、天然ｈＳＭＮ１の変異型Ｄ（受託番号ＮＭ＿０００３４４．３）（配列番号３）と本明細書に記載のコドン最適化配列（配列番号１）とのアラインメントである。

【図2】免疫組織化学（ＩＨＣ）及びｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）による、脳及び脊髄における形質導入の評価である。ＳＭＮ１の免疫組織化学を皮質、小脳及び脊髄切片に対して実施し、代表的な画像を上側３つのパネルに示す。コドン最適化ｈＳＭＮ１リボ核酸（ＲＮＡ）に対するＩＳＨを皮質切片で行い、代表的な結果を下側のパネルに示す。試料は、仔１匹あたり３×１０^１０ＧＣのＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＳＭＮ１．ＲＢＧによる処置を行った、または行わなかったＳＭＮΔ７（ＫＯ）マウスから採集した。野生型（ＷＴ）及びヘテロ接合体（Ｈｅｔ）同腹仔を陽性対照として役立てた。

【図3】Ａは、３×１０^１０または８．７６×１０^１０ＧＣ／仔のＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＳＭＮ１．ＲＢＧによる処置を行った、または行わなかったＳＭＮΔ７（ＫＯ）マウスの生存曲線である。野生型（ＷＴ）／ヘテロ接合体（Ｈｅｔ）同腹仔及びＰＢＳ注射マウスを対照として役立てた。Ｂは、Ａに描写される生存曲線の統計解析の表である。生存期間中央値を算出及び列挙した。

【図4】Ａは、３×１０^１０または８．７６×１０^１０ＧＣ／仔のＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＳＭＮ１．ＲＢＧベクターで処置したＳＭＮΔ７（ＫＯ）マウスの体重の線グラフである。野生型（ＷＴ）／ヘテロ接合体（Ｈｅｔ）同腹仔及びＰＢＳ注射マウスを対照として役立てた。Ｂは、３×１０^１０または８．７６×１０^１０ＧＣ／仔のＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＳＭＮ１．ＲＢＧで処置したＳＭＮΔ７（ＫＯ）マウスの生後日数１５日目の体重のグラフである。野生型（ＷＴ）／ヘテロ接合体（Ｈｅｔ）同腹仔及びＰＢＳ注射マウスを対照として役立てた。Ｃは、３×１０^１０または８．７６×１０^１０ＧＣ／仔のＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＳＭＮ１．ＲＢＧで処置したＳＭＮΔ７（ＫＯ）マウスの生後日数３０日目の体重のグラフである。野生型（ＷＴ）／ヘテロ接合体（Ｈｅｔ）同腹仔を対照として役立てた。Ｄ～Ｊは、性別によって正規化した後の体重の線グラフである。実験は、仔１匹あたり３×１０^１０または８．７６×１０^１０ＧＣのＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＳＭＮ１．ＲＢＧで処置したＳＭＮΔ７（ＫＯ）マウスに対して生後日数３日目から１３または１５日目まで２日ごとに実施した。野生型／ヘテロ接合体同腹仔（ＷＴ）及びＰＢＳ注射マウスを対照として役立てた。Ｐ値を統計解析によって算出し、図中に示した。

【図5】Ａは、後肢懸垂試験で利用した採点方式の図である。Ｂは、仔１匹あたり３×１０^１０または８．７６×１０^１０ＧＣのＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＳＭＮ１．ＲＢＧで処置したＳＭＮΔ７（ＫＯ）マウスにおいて生後日数３日目から１３日目まで２日ごとに記録した後肢スコアのグラフを含む。野生型（ＷＴ）／ヘテロ接合体（Ｈｅｔ）同腹仔及びＰＢＳ注射マウスを対照として役立てた。

【図6】Ａ～Ｃは、立直り反射試験において動物がその正常位置に戻るまでに要した時間を示すグラフを含む。実験は、仔１匹あたり３×１０^１０または８．７６×１０^１０ＧＣのＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＳＭＮ１．ＲＢＧで処置したＳＭＮΔ７（ＫＯ）マウスに対して生後日数７日目から１７日目まで２日ごとに実施した。野生型（ＷＴ）／ヘテロ接合体（Ｈｅｔ）同腹仔及びＰＢＳ注射マウスを対照として役立てた。Ｄ～Ｊは、性別によって正規化した後の、立直り反射試験において動物がその正常位置に戻るまでに要した時間を示すグラフである。実験は、仔１匹あたり３×１０^１０または８．７６×１０^１０ＧＣのＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＳＭＮ１．ＲＢＧで処置したＳＭＮΔ７（ＫＯ）マウスに対して生後日数７日目から１７日目まで２日ごとに実施した。野生型／ヘテロ接合体同腹仔（ＷＴ）及びＰＢＳ注射マウスを対照として役立てた。Ｐ値を統計解析によって算出し、図中に示した。

【図7】１０ｃｃベクターシリンジ、１０ｃｃ充填済み洗浄シリンジ、Ｔ字形コネクタ延長セット、２２Ｇ×５インチ脊椎穿刺針、任意選択の１８Ｇ×３．５インチ誘導針を備えた、共軸挿入法のための任意選択の誘導針を含む脳槽内送達用の機器の画像である。

【図8】Ａは、Ｂ～Ｄの核酸配列によってコードされるｖｐ１カプシド配列のアミノ酸配列を示したアラインメントを示す。アラインメントには、ＡＡＶｈｕ６８［配列番号８］のｖｐ１タンパク質がＡＡＶ９［配列番号１６］、ＡＡＶｈｕ３１（アラインメント中でｈｕ．３１と標記した）［配列番号１８］及びＡＡＶｈｕ３２（アラインメント中でｈｕ．３２と標記した）［配列番号１９］と共に含まれている。ＡＡＶ９、ＡＡＶｈｕ３１及びＡＡＶｈｕ３２に比べてＡＡＶｈｕ６８では２つの突然変異（Ａ６７Ｅ及びＡ１５７Ｖ）が必須であることが見出され、図中で丸で囲まれている。Ｂ～Ｄは、ＡＡＶ９［配列番号２２］、ＡＡＶｈｕ３１［配列番号２０］及びＡＡＶｈｕ３２［配列番号２１］と共に、ＡＡＶｈｕ６８［配列番号７］のｖｐ１カプシドをコードする核酸配列のアラインメントを示す。

【図9】Ａ～Ｂは、様々な用量（１×１０^９ＧＣ、ＷＴ，ｎ＝７、ＫＯ，ｎ＝１；３×１０^９ＧＣ、ＷＴ，ｎ＝７、ＫＯ，ｎ＝１；１×１０^１０ＧＣ、ＷＴ，ｎ＝３、ＫＯ，ｎ＝５；３×１０^１０ＧＣ、ＷＴ，ｎ＝１、ＫＯ，ｎ＝１；または７×１０^１０ＧＣ、ＷＴ，ｎ＝５、ＫＯ，ｎ＝３）のＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＳＭＮ１．ＲＢＧでＩＣＶ処置した成体野生型マウス（ＨＥＴ／ＷＴ、Ａ）またはＳＭＮΔ７マウス（ＫＯ、Ｂ）の体重追跡評価結果を示すグラフである。ＰＢＳ注射動物（ＷＴ，ｎ＝３；ＫＯ，ｎ＝４）を対照として提供した。

【図10】Ａ～Ｂは、様々な用量（１×１０^９ＧＣ、ＷＴ，ｎ＝７、ＫＯ，ｎ＝１；３×１０^９ＧＣ、ＷＴ，ｎ＝７、ＫＯ，ｎ＝１；１×１０^１０ＧＣ、ＷＴ，ｎ＝３、ＫＯ，ｎ＝５；３×１０^１０ＧＣ、ＷＴ，ｎ＝１、ＫＯ，ｎ＝１；または７×１０^１０ＧＣ、ＷＴ，ｎ＝５、ＫＯ，ｎ＝３）のＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＳＭＮ１．ＲＢＧでＩＣＶ処置した成体野生型マウス（ＨＥＴ／ＷＴ、Ａ）またはＳＭＮΔ７マウス（ＫＯ、Ｂ）の立直り反射結果を示すグラフである。ＰＢＳ注射動物（ＷＴ，ｎ＝３；ＫＯ，ｎ＝５）を対照として提供した。

【図11】Ａ～Ｈは、実施例１０に記載のとおりにＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＳＭＮ１ｃｏ．ＲＢＧでクモ膜下腔内に処置した成体アカゲザルの臨床病理学、ＣＳＦ化学及びＣＳＦ細胞学を示すグラフである。

【図12】Ａ～Ｂは、実施例１０に記載のとおりにＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＳＭＮ１．ＲＢＧでクモ膜下腔内に処置した成体アカゲザルにおけるＩＳＨ（Ａ）及びＩＨＣ（Ｂ）による運動ニューロン形質導入の定量を示す。Ｘ線透視による誘導及び造影剤材料を使用して、針が大槽の中（大槽内、ＩＣＭ）または腰椎槽（腰椎穿刺孔、ＬＰ）の中に配置されたことを確認した。総注射体積は、ＩＣＭ群（ｎ＝３）では１．０ｍＬであり、ＬＰ群では２．５ｍＬ（ｎ＝４）または５．０ｍＬ（ｎ＝４）であった。注射から１ヶ月後に動物を屠殺し、脊髄切片において導入遺伝子ｍＲＮＡについてのｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）及びヒトＳＭＮタンパク質についての免疫組織化学（ＩＨＣ）によって運動ニューロン形質導入を定量した。

【図13】実施例１０に記載のとおりにＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＳＭＮ１．ＲＢＧでクモ膜下腔内に処置した成体アカゲザルにおける生体内分布を示す。

【図14】Ａ～Ｂは、実施例９に記載のとおりにＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＳＭＮ１ｃｏ．ＲＢＧでＩＣＶに処置した成体Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの体重追跡評価結果を示す。Ａは、雌対象の体重追跡評価結果を示す。Ｂは、雄対象の体重追跡評価結果を示す。

【図15】Ａ～Ｂは、ＡＡＶｈｕ６８．ＳＭＮベクターの製造流れ図である。

【図16】Ａ～Ｅは、ヒトＳＭＮを発現するＡＡＶベクターを非ヒト霊長類に静脈内投与した後の急性トランスアミナーゼ上昇を示すグラフである。Ａは、実施例１４に記載の試験設計を示す。Ｂは、血清ＡＬＴのプロットである。Ｃは、血清ＡＳＴのプロットを示す。Ｄは、血清アルカリホスファターゼのプロットを示す。Ｅは、血清総ビリルビンのプロットを示す。安楽死を必要とする急性肝不全を動物１６Ｃ１７６が発症した後の試験５日目に全動物に対して予定外の実験室評価を実施した。動物１６Ｃ１１６及び１６Ｃ２１５に対しては試験５日目にＡＳＴを実施しなかった。破線は実験室基準範囲を示す。

【図17】Ａ～Ｄは、動物１６Ｃ１７６についての肝臓組織病理学的所見を示している代表的なＩＨＣ画像を示す。門脈における類洞フィブリン沈着（Ｂ、矢尻）及び急性フィブリン血栓（Ｃ）を伴う広範囲にわたる急性肝細胞壊死（Ａ）（ヘマトキシリン及びエオジン；スケールバー＝１０μｍ（Ａ及びＣ）、５０μｍ（Ｂ））。フィブリノゲンについての免疫組織化学は顕著な門脈周囲性類洞フィブリン沈着（Ｄ）を描写している（フィブリノゲンＩＨＣ、スケールバーは１００μｍを表す（Ｄ））。

【図18】Ａ～Ｄは、注射後２８日目にヒトＳＭＮを発現しているＡＡＶｈｕ６８で静脈内（ＩＶ）に処置した乳児ＮＨＰにおける代表的な神経系組織病理学的所見を示す。どちらの動物も脊髄の背側白質路の軸索変性症を有していた（Ａ）。背側軸索変性症は典型的には両側性であり、骨髄マクロファージを有する及び有さない膨張した髄鞘によって特徴付けられ、軸索変性との一貫性を有していた。脊髄の後根神経節（Ｂ）は、神経細胞体を取り囲み侵襲する中心性色質融解、衛星病変及び単核細胞浸潤によって特徴付けられる最小限～軽度の神経細胞体変性（神経細胞侵食）を呈していた。同様の軸索変性症は後肢（坐骨神経、Ｃ）及び前肢（正中神経、Ｄ）の末梢神経に認められた。急性肝不全のために５日目に安楽死させた動物（１６Ｃ１７６）では神経系に何ら所見はなかった（ヘマトキシリン及びエオジン染色；スケールバー＝２００μｍ（Ａ）、１００μｍ（Ｂ～Ｄ））。

【図19】アカゲザルにおけるベクターの生体内分布を示す。肝不全及びショックを発症しベクター投与後５日目に安楽死させた動物１６Ｃ１７６は除いて、静脈内へのＡＡＶｈｕ６８発現ヒトＳＭＮで処置したアカゲザルを注射後２８日目に安楽死させた。定量的ＰＣＲによって組織ＤＮＡ試料中にベクターゲノムが検出された。値は宿主二倍体ゲノム１つあたりのベクターゲノムコピー（ＧＣ）として表す。ＤＲＧ＝後根神経節。４つの肝葉（尾状葉、左葉、中葉及び右葉）についてデータを示す。

【図20】Ａ～Ｇは、アカゲザルにおけるＳＭＮ発現を示し、肝臓におけるＩＳＨによってヒトＳＭＮ ＲＮＡが検出された（Ａ）。肝臓をアルブミン（Ｂ）及びＧＦＰ（Ｃ）に対する対照プローブで染色した。脊髄におけるＩＳＨによってＳＭＮ発現細胞が同定された（Ｄ）。運動ニューロンはＣｈＡＴ ＩＳＨによって同定した（Ｅ）。脳におけるＳＭＮ ＩＳＨによって、形質導入されたニューロンの稀な区画が検出された（Ｆ、ＤＡＰＩ核染色）。脊髄の各高度で形質導入されたＣｈＡＴ＋の運動ニューロンの百分率を定量した（Ｇ）。エラーバー＝ＳＥＭ。

【図21】Ａ～Ｄは、７及び３０日齢の時に静脈内へのＡＡＶｈｕ６８発現ヒトＳＭＮで処置した仔ブタの代表的な組織病理学的所見を示す。両群の全体にわたって脊髄の背側白質路の軸索変性症が認められた（Ａ）。背側軸索変性症は両側性であり、骨髄マクロファージを有する及び有さない膨張した髄鞘によって特徴付けられ、軸索変性との一貫性を有していた。脊髄の後根神経節（Ｂ）は、神経細胞体を取り囲み侵襲する中心性色質融解、衛星病変及び単核細胞浸潤によって特徴付けられる様々な度合いの神経細胞体変性（神経細胞侵食）を呈していた。同様の軸索変性症は、大部分の仔ブタにおいて後肢（坐骨神経、Ｃ）及び前肢（正中神経、Ｄ）の末梢神経に様々な度合いで認められた。（ヘマトキシリン及びエオジン；スケールバー＝２００μｍ（Ａ）、１００μｍ（Ｂ～Ｄ））。

【図22】仔ブタにおけるベクターの生体内分布を示す。静脈内へのＡＡＶｈｕ６８発現ヒトＳＭＮで処置した新生仔ブタを、注射後１３～１４日目に安楽死させた。定量的ＰＣＲによって組織ＤＮＡ試料中にベクターゲノムが検出された。値は宿主二倍体ゲノム１つあたりのベクターゲノムコピー（ＧＣ）として表す。ＤＲＧ＝後根神経節。４つの肝葉（尾状葉、左葉、中葉及び右葉）についてデータを示す。

【図23】Ａ～Ｆは、子豚の脊髄におけるＳＭＮ発現を示している代表的画像を示す。ＩＳＨによって頚髄（Ａ）、胸髄（Ｂ）及び腰髄（Ｃ）区域にヒトＳＭＮのＲＮＡが検出された。ＣｈＡＴ ＩＳＨによって、対応する区域で運動ニューロンが同定された（Ｄ～Ｆ）。代表的な画像を示す。

【発明を実施するための形態】

【0013】

ＡＡＶｈｕ６８カプシドと、それを必要とする患者における運動神経細胞生存（ＳＭＮ）遺伝子の発現を促す調節配列の制御下にある当該遺伝子をコードする核酸とを有する、組換えＡＡＶｈｕ６８ベクターを本明細書に提供する。ｒＡＡＶｈｕ６８カプシドは、配列番号７から産生されるアミノ酸配列及び／または配列番号８のアミノ酸配列を独立して有するタンパク質を含有する。これらのベクターを含有する組成物、ならびにＳＭＡ患者の治療のための組成物中のこれらのベクターの用途を提供する。例はＳＭＡ３（クーゲルベルグ・ウェランダー病と呼ぶことがある）に焦点を当てているが、１、２または４型ＳＭＡにおいてこれらのｒＡＡＶベクターを単独で、または他の共療法と組み合わせて使用することは企図される。ＳＭＡは、５番染色体上のＳＭＮ１遺伝子の欠失突然変異に関する血液検査を用いて診断され得る。さらに筋電図または筋生検などの筋肉検査を用いて診断に役立ててもよい。

【0014】

Ｉ．ＡＡＶ
本明細書中で使用する、ＡＡＶの群に関する「クレード」という用語は、ＡＡＶ ｖｐ１アミノ酸配列のアラインメントに基づいて（少なくとも１０００個の複製物の）少なくとも７５％のブートストラップ値及び０．０５以下のポアソン補正距離測定値による近接結合アルゴリズムを用いて判定した場合に系統学的に互いに関連し合っているＡＡＶの群を指す。近接結合アルゴリズムは文献に記載されている。例えば、Ｍ．Ｎｅｉ ａｎｄ Ｓ．Ｋｕｍａｒ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｓ（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２０００）を参照されたい。このアルゴリズムを実行するために使用することができるコンピュータプログラムは入手可能である。例えば、ＭＥＧＡ ｖ２．１プログラムは改変Ｎｅｉ－Ｇｏｊｏｂｏｒｉ法を実装している。これらの技術及びコンピュータプログラムならびにＡＡＶ ｖｐ１カプシドタンパク質の配列を用いて当業者は、選択されたＡＡＶが本明細書で特定されるクレードの１つに含まれているか、別のクレードに含まれているか、またはこれらのクレードから外れるかについて容易に判定することができる。例えば、クレードＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ及びＦを同定し新規ＡＡＶ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ５３０５５３～ＡＹ５３０６２９の核酸配列を提供しているＧ Ｇａｏ，ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｖｉｒｏｌ，２００４ Ｊｕｎ；７８（１０：６３８１－６３８８を参照されたい。また、ＷＯ２００５／０３３３２１も参照されたい。

【0015】

本明細書中で使用する場合、「ＡＡＶ９カプシド」は、複数のＡＡＶ９ ｖｐタンパク質からなる自己組織化ＡＡＶカプシドである。ＡＡＶ９ ｖｐタンパク質は典型的には、配列番号２２の核酸配列、またはそれに対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％であり配列番号１６（ＧｅｎＢａｎｋ受託：ＡＡＳ９９２６４）のｖｐ１アミノ酸配列をコードする配列によってコードされる、代替スプライシング変異型として発現する。これらのスプライシング変異型は、配列番号１６の様々な長さのタンパク質となる。特定の実施形態では、「ＡＡＶ９カプシド」は、ＡＡＳ９９２６４と９
９％同一であるかまたは配列番号１６と９９％同一であるアミノ酸配列を有するＡＡＶを含む。ＵＳ７９０６１１１及びＷＯ２００５／０３３３２１も参照されたい。本明細書中で使用する「ＡＡＶ９変異型」には、ＷＯ２０１６／０４９２３０、ＵＳ８，９２７，５１４、ＵＳ２０１５／０３４４９１１及びＵＳ８，７３４，８０９に記載されているものが含まれる。

【0016】

ｒＡＡＶｈｕ６８はＡＡＶｈｕ６８カプシド及びベクターゲノムからなる。ＡＡＶｈｕ６８カプシドは、ｖｐ１の異種集団、ｖｐ２の異種集団及びｖｐ３タンパク質の異種集団の集合体である。本明細書中で使用する「異種」という用語またはその任意の文法的変化形は、ｖｐカプシドタンパク質に言及するために使用される場合、同じでない要素、例えば、異なる修飾アミノ酸配列を有するｖｐ１、ｖｐ２またはｖｐ３単量体（タンパク質）を有している要素からなる集団を指す。配列番号８は、コードされているＡＡＶｈｕ６８
ｖｐ１タンパク質のアミノ酸配列を提供する。各々「Ｎｏｖｅｌ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ（ＡＡＶ）Ｃｌａｄｅ Ｆ Ｖｅｃｔｏｒ ａｎｄ Ｕｓｅｓ Ｔｈｅｒｅｆｏｒ」と題された米国仮特許出願第６２／６１４，００２号、第６２／５９１，００２号及び第６２／４６４，７４８号も参照されたく、参照によりこれらの全体を本明細書に援用する。

【0017】

ＡＡＶｈｕ６８カプシドは、配列番号８の予測アミノ酸残基からの修飾を有するｖｐ１タンパク質内、ｖｐ２タンパク質内及びｖｐ３タンパク質内の亜集団を含有する。これらの亜集団は、最低でも、特定の脱アミド化アスパラギン（ＮまたはＡｓｎ）残基を含む。例えば、特定の亜集団は少なくとも１つ、２つ、３つまたは４つの高度に脱アミド化されたアスパラギン（Ｎ）位置を配列番号８のアスパラギン－グリシン対に含んでおり、場合によってはさらに他の脱アミド化アミノ酸を含んでおり、脱アミド化がアミノ酸変化及びその他の任意選択の修飾をもたらしている。配列番号２６は改変型ＡＡＶｈｕ６８カプシドのアミノ酸配列を示し、脱アミド化あるいは修飾され得る残基位置を例示する。

【0018】

本明細書中で使用する場合、ｖｐタンパク質の「亜集団」は、特に明記しない限り、共通して少なくとも１つの定義された特質を有しかつ、基準となる群の少なくとも１つの群メンバー～全メンバー未満からなる、ｖｐタンパク質の群を指す。例えば、ｖｐ１タンパク質の「亜集団」は、特に明記しない限り、組織化ＡＡＶカプシド中の少なくとも１つのｖｐ１タンパク質でありかつ全ｖｐ１タンパク質未満である。ｖｐ３タンパク質の「亜集団」は、特に明記しない限り、組織化ＡＡＶカプシド中の１つのｖｐ３タンパク質～全ｖｐ３タンパク質未満であり得る。例えば、ｖｐ１タンパク質はｖｐタンパク質の亜集団であり得、ｖｐ２タンパク質はｖｐタンパク質の別の亜集団であり得、ｖｐ３は組織化ＡＡＶカプシド中のｖｐタンパク質のさらに別の亜集団である。別の例では、ｖｐ１、ｖｐ２及びｖｐ３タンパク質は、異なる修飾、例えば、少なくとも１つ、２つ、３つまたは４つの高度に脱アミド化されたアスパラギン、例えばアスパラギン－グリシン対を有する亜集団を含有し得る。

【0019】

特に明記しない限り、高度に脱アミド化されているとは、基準アミノ酸位置の予測アミノ酸配列と比較して基準アミノ酸位置において少なくとも４５％脱アミド化されていること、少なくとも５０％脱アミド化されていること、少なくとも６０％脱アミド化されていること、少なくとも６５％脱アミド化されていること、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、９７％、９９％、約１００％以下が脱アミド化されていることを指す（例えば、全ｖｐ１タンパク質を基準として配列番号８のアミノ酸５７のアスパラギンの少なくとも８０％が脱アミド化されていてもよいし、またはｖｐ１、ｖｐ２及びｖｐ３タンパク質の全てを基準として配列番号８のアミノ酸４０９のアスパラギンの２０％が脱アミド化されていてもよい）。そのような百分率は、２Ｄゲル、質量分析技術または他の好適な技術を用いて決定
され得る。

【0020】

理論に拘泥することは望まないが、少なくとも、ＡＡＶｈｕ６８カプシド中のｖｐタンパク質中の高度に脱アミド化された残基の脱アミド化は、選択されたアスパラギン残基の脱アミド化及びより低い程度でのグルタミン残基の脱アミド化をするカプシドタンパク質中の官能基によって引き起こされるため、主として非酵素的な性質のものであると考えられる。大半の脱アミド化ｖｐ１タンパク質の効率的なカプシド組織化は、これらの事象がカプシド組織化の後に起こるか、または個々の単量体（ｖｐ１、ｖｐ２またはｖｐ３）での脱アミド化が構造的に十分な耐性を有しかつ組織化動態に概して影響を及ぼさないかのどちらかであることを暗示する。細胞進入前には内部に位置していると一般に考えられているＶＰ１固有（ＶＰ１－ｕ）領域（約ａａ１～１３７）での広範囲に及ぶ脱アミド化は、ＶＰ脱アミド化がカプシド組織化に先立って起こっている可能性があることを示唆している。

【0021】

理論に拘泥することは望まないが、Ｎの脱アミド化は、そのＣ末端残基の主鎖窒素原子がＡｓｎの側鎖アミド基炭素原子に求核攻撃を行うことによって起こり得る。中間体の閉環スクシンイミド残基が形成すると考えられている。スクシンイミド残基はその後、速い加水分解を行って最終生成物であるアスパラギン酸（Ａｓｐ）またはイソアスパラギン酸（ＩｓｏＡｓｐ）をもたらす。したがって、特定の実施形態では、アスパラギン（ＮまたはＡｓｎ）の脱アミド化はＡｓｐまたはＩｓｏＡｓｐをもたらすが、これらはスクシンイミド中間体を介して例えば以下に例示するように相互変換され得る。

【化1】

【0022】

本明細書中で提供する場合、配列番号８の各脱アミド化Ｎは、独立してアスパラギン酸（Ａｓｐ）、イソアスパラギン酸（ｉｓｏＡｓｐ）、アスパルテート及び／または、ＡｓｐとｉｓｏＡｓｐとの相互変換ブレンド、またはそれらの組み合わせであり得る。α－及びイソアスパラギン酸がいかなる好適な比で存在していてもよい。例えば、特定の実施形態では、比は１０：１～１：１０のアスパラギン酸対イソアスパラギン酸、約５０：５０のアスパラギン酸：イソアスパラギン酸、または約１：３のアスパラギン酸：イソアスパラギン酸、または別の選択された比であり得る。

【0023】

特定の実施形態では、配列番号８中の１つ以上のグルタミン（Ｑ）は脱アミド化してグルタミン酸（Ｇｌｕ）、すなわち、α－グルタミン酸、γ－グルタミン酸（Ｇｌｕ）または、共通のグルタルイミド（ｇｌｕｔａｒｉｎｉｍｉｄｅ）中間体を介して相互変換され得るα－及びγ－グルタミン酸のブレンドとなる。α－及びγ－グルタミン酸はいかなる好適な比で存在していてもよい。例えば、特定の実施形態では、比は１０：１～１：１０
のα対γ、約５０：５０のα：γ、または約１：３のα：γ、または別の選択された比であり得る。

【化2】

【0024】

したがって、ｒＡＡＶｈｕ６８は、脱アミド化アミノ酸を有するｖｐ１、ｖｐ２及び／またはｖｐ３タンパク質の、ｒＡＡＶｈｕ６８カプシドの中の亜集団を含み、これは、最低でも、少なくとも１つの高度に脱アミド化されたアスパラギンを含んでいる少なくとも１つの亜集団を含む。加えて、他の修飾は異性化を含み得、詳しくは、選択されたアスパラギン酸（ＤまたはＡｓｐ）残基位置に含み得る。さらに他の実施形態では、修飾はＡｓｐ位置でのアミド化を含み得る。

【0025】

特定の実施形態では、ＡＡＶｈｕ６８カプシドは、少なくとも４個～少なくとも約２５個の脱アミド化アミノ酸残基位置を有するｖｐ１、ｖｐ２及びｖｐ３の亜集団を含有しているが、このうちの少なくとも１～１０％が、コードされる配列番号８のアミノ酸配列と比較して脱アミド化されている。これらの大部分はＮ残基であり得る。しかしながら、Ｑ残基も脱アミド化されていることがある。

【0026】

特定の実施形態では、ＡＡＶ６８カプシドは、下記のうちの１つ以上によってさらに特徴付けられる。ＡＡＶｈｕ６８カプシドタンパク質は、配列番号８の１～７３６の予測アミノ酸配列をコードする核酸配列からの発現によって産生されるＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ１タンパク質、配列番号７から産生されるｖｐ１タンパク質、もしくは配列番号８の１～７３６の予測アミノ酸配列をコードし配列番号７と少なくとも７０％同一である核酸配列から産生されるｖｐ１タンパク質；配列番号８の少なくとも約アミノ酸１３８～７３６の予測アミノ酸配列をコードする核酸配列からの発現によって産生されるＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ２タンパク質、配列番号７の少なくともヌクレオチド４１２～２２１１を含む配列から産生されるｖｐ２タンパク質、もしくは配列番号８の少なくとも約アミノ酸１３８～７３６の予測アミノ酸配列をコードし配列番号７の少なくともヌクレオチド４１２～２２１１と少なくとも７０％同一である核酸配列から産生されるｖｐ２タンパク質、及び／または、配列番号８の少なくとも約アミノ酸２０３～７３６の予測アミノ酸配列をコードする核酸配列からの発現によって産生されるＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ３タンパク質、配列番号７の少なくともヌクレオチド６０７～２２１１を含む配列から産生されるｖｐ３タンパク質、もしくは配列番号８の少なくとも約アミノ酸２０３～７３６の予測アミノ酸配列をコード
し配列番号７の少なくともヌクレオチド６０７～２２１１と少なくとも７０％同一である核酸配列から産生されるｖｐ３タンパク質を含む。

【0027】

さらに、またはあるいは、ｖｐ１タンパク質の異種集団、位置１５７にバリンを場合によって含んでいるｖｐ２タンパク質の異種集団、及びｖｐ３タンパク質の異種集団を含み、少なくともｖｐ１及びｖｐ２タンパク質の亜集団が、配列番号８のｖｐ１カプシドの付番に基づく位置１５７にバリンを含むものでありかつ場合によってはさらに位置６７にグルタミン酸を含むものである、ＡＡＶカプシドを提供する。さらに、またはあるいは、配列番号８のアミノ酸配列をコードする核酸配列の産物であるｖｐ１タンパク質の異種集団、配列番号８の少なくとも約アミノ酸１３８～７３６のアミノ酸配列をコードする核酸配列の産物であるｖｐ２タンパク質の異種集団、及び配列番号８の少なくともアミノ酸２０３～７３６をコードする核酸配列の産物であるｖｐ３タンパク質の異種集団を含み、ｖｐ１、ｖｐ２及びｖｐ３タンパク質が、アミノ酸修飾を有する亜集団を含有するものである、ＡＡＶｈｕ６８カプシドを提供する。

【0028】

ＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ１、ｖｐ２及びｖｐ３タンパク質は典型的には、配列番号８の完全長ｖｐ１アミノ酸配列（アミノ酸１～７３６）をコードする同じ核酸配列によってコードされる代替スプライシング変異型として発現する。場合によってｖｐ１コード配列は、ｖｐ１、ｖｐ２及びｖｐ３タンパク質を発現すべく単独で使用される。あるいは、この配列と、ｖｐ１固有領域（約ａａ１～約ａａ１３７）及び／またはｖｐ２固有領域（約ａａ１～約ａａ２０２）を含まずに配列番号８のＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ３アミノ酸配列（約ａａ２０３～７３６）をコードする核酸配列もしくはそれに相補的な鎖、対応するｍＲＮＡもしくはｔＲＮＡ（配列番号７の約ｎｔ６０７～約ｎｔ２２１１）、または配列番号８のａａ２０３～７３６をコードし配列番号７と少なくとも７０％～少なくとも９９％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％）同一である配列のうちの１つ以上とを共発現させてもよい。さらに、またはあるいは、ｖｐ１コード及び／またはｖｐ２コード配列と、ｖｐ１固有領域（約ａａ１～約ａａ１３７）を含まずに配列番号８のＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ２アミノ酸配列（約ａａ１３８～７３６）をコードする核酸配列もしくはそれに相補的な鎖、対応するｍＲＮＡもしくはｔＲＮＡ（配列番号７のｎｔ４１２～２２１１）、または配列番号８の約ａａ１３８～７３６をコードし配列番号７と少なくとも７０％～少なくとも９９％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％）同一である配列とを共発現させてもよい。

【0029】

本明細書中に記載するように、ｒＡＡＶｈｕ６８は、配列番号８のｖｐ１アミノ酸配列をコードするＡＡＶｈｕ６８核酸から、及び場合によっては例えばｖｐ１及び／またはｖｐ２固有領域を含まずにｖｐ３タンパク質をコードする追加の核酸配列からカプシドを発現する産生システムで産生される、ｒＡＡＶｈｕ６８カプシドを有する。単一の核酸配列ｖｐ１を使用した産生の結果として得られるｒＡＡＶｈｕ６８は、ｖｐ１タンパク質、ｖｐ２タンパク質及びｖｐ３タンパク質の異種集団を産生する。より詳しくは、ＡＡＶｈｕ６８カプシドは、配列番号８の予測アミノ酸残基からの修飾を有するｖｐ１タンパク質内、ｖｐ２タンパク質内及びｖｐ３タンパク質内の亜集団を含有する。これらの亜集団は最低でも脱アミド化アスパラギン（ＮまたはＡｓｎ）残基を含む。例えば、アスパラギン－グリシン対のアスパラギンが高度に脱アミド化されている。

【0030】

一実施形態において、ＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ１核酸配列は、配列番号７の配列またはそれに相補的な鎖、例えば対応するｍＲＮＡまたはｔＲＮＡを有する。さらに、またはあるいは、特定の実施形態ではｖｐ２及び／またはｖｐ３タンパク質をｖｐ１とは異なる核酸配列から発現させて例えば選択された発現系におけるｖｐタンパク質の比を変化させても
よい。特定の実施形態ではさらに、ｖｐ１固有領域（約ａａ１～約ａａ１３７）及び／またはｖｐ２固有領域（約ａａ１～約ａａ２０２）を含まずに配列番号８のＡＡＶｈｕ６８
ｖｐ３アミノ酸配列（約ａａ２０３～７３６）をコードする核酸配列またはそれに相補的な鎖、対応するｍＲＮＡまたはｔＲＮＡ（配列番号７の約ｎｔ６０７～約ｎｔ２２１１）も提供される。特定の実施形態ではさらに、ｖｐ１固有領域（約ａａ１～約ａａ１３７）を含まずに配列番号８のＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ２アミノ酸配列（約ａａ１３８～７３６）をコードする核酸配列またはそれに相補的な鎖、対応するｍＲＮＡまたはｔＲＮＡ（配列番号７のｎｔ４１２～２２１１）も提供される。

【0031】

しかしながら、配列番号８のアミノ酸配列をコードする他の核酸配列を、ｒＡＡＶｈｕ６８カプシドの生産に使用するために選択してもよい。特定の実施形態では、核酸配列は、配列番号７の核酸配列、または配列番号８をコードする配列番号７と少なくとも７０％～９９％同一である、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％同一である配列を有する。特定の実施形態では、核酸配列は、配列番号７の約ｎｔ４１２～約ｎｔ２２１１の核酸配列、または配列番号８のｖｐ２カプシドタンパク質（約ａａ１３８～７３６）をコードする配列番号７の約ｎｔ４１２～約ｎｔ２２１１と少なくとも７０％～９９％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％同一である配列を有する。特定の実施形態では、核酸配列は、配列番号７の約ｎｔ６０７～約ｎｔ２２１１の核酸配列、または配列番号８のｖｐ３カプシドタンパク質（約ａａ２０３～７３６）をコードする配列番号７の約ｎｔ６０７～約ｎｔ２２１１と少なくとも７０％～９９％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％同一である配列を有する。

【0032】

このＡＡＶｈｕ６８カプシドをコードするＤＮＡ（ゲノムまたはｃＤＮＡ）またはＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）を含めた核酸配列を設計することは当技術分野における技量の範囲内である。特定の実施形態では、ＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ１カプシドタンパク質をコードする核酸配列は配列番号７に示される。図８Ｂ～Ｄも参照されたい。他の実施形態では、ＡＡＶｈｕ６８カプシドタンパク質を発現させるために配列番号７との７０～９９．９％の同一性を有する核酸配列が選択され得る。他の特定の実施形態では、核酸配列は配列番号７と少なくとも約７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％同一、または少なくとも９９％～９９．９％同一である。そのような核酸配列は、選択されたシステム（例えば細胞種）における発現のためにコドン最適化されてもよく、様々な方法によって設計され得る。この最適化は、オンライン入手可能な方法（例えばＧｅｎｅＡｒｔ）、公開されている方法、またはコドン最適化サービスを提供する会社、例えばＤＮＡ２．０（Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ，ＣＡ）を用いて実施され得る。１つのコドン最適化方法は例えば米国の国際特許公開第ＷＯ２０１５／０１２９２４号に記載されており、参照によりこの全体を本明細書に援用する。また、例えば米国特許公開第２０１４／００３２１８６号及び米国特許公開第２００６／０１３６１８４号も参照されたい。産物のためのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の完全長を改変することが好適である。しかしながら、いくつかの実施形態ではＯＲＦの一部のみが変更されていてもよい。これらの方法のうちの１つを用いることによって、頻度を任意の所与のポリペプチド配列に適用することができ、ポリペプチドをコードするコドン最適化コード領域の核酸断片を産生させることができる。コドンに対する実際の変更を実施するためまたは本明細書に記載されているとおりに設計されたコドン最適化コード領域を合成するために、多くの選択肢が利用可能である。そのような改変または合成は、当業者によく知られている標準的及び慣例的な分子生物学的操作を用いて実施され得る。１つの手法では、長さが各々８０～９０ヌクレオチドであり所望の配列の長さにまたがる一連の相補的オリゴヌクレオチド対は、標準的な方法によって合成される。これらのオリ
ゴヌクレオチド対は、それらがアニーリング時に付着末端を含有する８０～９０塩基対の二本鎖断片を形成するように合成され、例えば、対の各オリゴヌクレオチドは、対のもう一方のオリゴヌクレオチドに相補的な領域を越えて３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれより多い塩基を延出させるように合成される。各対のオリゴヌクレオチドの一本鎖端部は、別の対のオリゴヌクレオチドの一本鎖端部とアニーリングするように設計される。オリゴヌクレオチド対をアニーリングさせ、その後、これらの二本鎖断片のおよそ５～６個を付着一本鎖端部を介してアニーリングさせ、その後、それらをライゲートし合わせ、標準的な細菌クローニングベクター、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆから入手することができるＴＯＰＯ（登録商標）ベクターにクローニングする。その後、構築物の配列決定を標準的な方法で行う。ライゲートされ合った５～６断片の８０～９０塩基対断片、すなわち約５００塩基対の断片からなるこれらの構築物のいくつかは、所望の配列の全体が一連のプラスミド構築物として表されるように作製される。その後、これらのプラスミドのインサートを適切な制限酵素で切断し、ライゲートし合わせて最終構築物を形成する。その後、最終構築物を標準的な細菌クローニングベクターにクローニングし、配列決定する。さらなる方法は当業者であればすぐに分かるであろう。加えて、遺伝子合成は商業的に容易に入手することができる。

【0033】

特定の実施形態では、ＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ１、ｖｐ２及びｖｐ３タンパク質中のＮ－Ｇ対のアスパラギン（Ｎ）が高度に脱アミド化されている。特定の実施形態では、ＡＡＶｈｕ６８カプシドは、ＡＡＶｈｕ６８カプシドタンパク質中の高度に脱アミド化された少なくとも４つのアスパラギン（Ｎ）位置を有するＡＡＶ ｖｐ１、ｖｐ２及び／またはｖｐ３カプシドタンパク質の亜集団を含有する。特定の実施形態では、Ｎ－Ｎ対（Ｎ－Ｎ－Ｎ三つ組を除く）の約２０～５０％は脱アミド化を示す。特定の実施形態では、最初のＮが脱アミド化されている。特定の実施形態では、２つ目のＮが脱アミド化されている。特定の実施形態では、脱アミド化は約１５％～約２５％の脱アミド化である。配列番号８の位置２５９にあるＱにおける脱アミド化は、ＡＡＶｈｕ６８タンパク質のＡＡＶｈｕ６８
ｖｐ１、ｖｐ２及びｖｐ３カプシドタンパク質の約８％～約４２％である。

【0034】

特定の実施形態では、ｒＡＡＶｈｕ６８カプシドは、ｖｐ１、ｖｐ２及びｖｐ３タンパク質のＤ２９７におけるアミド化によってさらに特徴付けられる。特定の実施形態では、配列番号８の付番に基づいて、ＡＡＶｈｕ６８カプシド中のｖｐ１、ｖｐ２及び／またはｖｐ３タンパク質の位置２９７にあるＤの約７０％～約７５％がアミド化されている。

【0035】

特定の実施形態では、カプシドのｖｐ１、ｖｐ２及び／またはｖｐ３において少なくとも１つのＡｓｐがＤ－Ａｓｐに異性化している。そのような異性体は通常、配列番号８の付番に基づく残基位置９７、１０７、３８４のうちの１つ以上にあるＡｓｐの約１％未満の量で存在する。

【0036】

特定の実施形態では、ｒＡＡＶｈｕ６８は、以下の表に示す位置にある２つ、３つ、４つまたはそれ以上の脱アミド化残基の組み合わせを含む亜集団を有するｖｐ１、ｖｐ２及びｖｐ３タンパク質を有しているＡＡＶｈｕ６８カプシドを有する。ｒＡＡＶにおける脱アミド化は、２Ｄゲル電気泳動及び／または質量分析及び／またはタンパク質モデリング技術を用いて決定され得る。Ａｃｃｌａｉｍ ＰｅｐＭａｐカラム、及びＮａｎｏＦｌｅｘソースを備えたＱ Ｅｘａｃｔｉｖｅ ＨＦ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と連結したＴｈｅｒｍｏ ＵｌｔｉＭａｔｅ３０００ＲＳＬＣシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてオンラインクロマトグラフィーを実施してもよい。ＭＳデータは、検査スキャン（２００～２０００ｍ／ｚ）から最も豊富な配列未決定の前駆体イオンを動的に選択する、Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅ ＨＦのためのデータ依存的上位２０位法を用いて取得される。配列決定は、予測自動ゲイン制御
を用いて決定される目標値を１ｅ５イオンとする高エネルギー衝突解離フラグメンテーションによって実施し、前駆体の単離は余裕枠を４ｍ／ｚとして実施した。検査スキャンは、ｍ／ｚ２００で１２０，０００の分解能で取得した。ＨＣＤスペクトルの分解能は、最大イオン注入時間を５０ｍｓとし正規化衝突エネルギーを３０としてｍ／ｚ２００で３０，０００に設定され得る。Ｓ－レンズＲＦレベルは、消化物からのペプチドが占有するｍ／ｚ領域の透過を最適化するために５０に設定され得る。前駆体イオンは、単一の未帰属の、または６つ以上の荷電状態によってフラグメンテーション選択から除外され得る。取得したデータの解析のためにＢｉｉｏＰｈａｒｍａ Ｆｉｎｄｅｒ １．０ソフトウェア（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）が使用され得る。ペプチドマッピングのためには単一入力タンパク質ＦＡＳＴＡデータベースを使用し、カルバミドメチル化を固定の修飾に設定し、酸化、脱アミド化及びリン酸化を可変の修飾に設定し、質量精度を１０ｐｐｍとし、高いプロテアーゼ特異性とし、信頼度レベルをＭＳ／ＭＳスペクトルのために０．８として、検索を実施する。好適なプロテアーゼの例には、例えばトリプシンまたはキモトリプシンが含まれ得る。脱アミド化は未処理の分子の質量に＋０．９８４Ｄａ（－ＯＨ基と－ＮＨ_２基との質量差）だけ足すので、質量分析による脱アミド化ペプチドの同定は比較的平易である。特定のペプチドの脱アミド化パーセントは、脱アミド化ペプチドの決定された質量面積を脱アミド化ペプチドと元のペプチドとの合計面積で割ったものである。脱アミド化可能な部位の数を考える場合、異なる部位で脱アミド化されている同重体種同士は、寄り合って１本のピークとなり得る。結果として、複数の潜在的脱アミド化部位を有するペプチドから発生するフラグメントイオンを用いて脱アミド化の複数の部位を突き止める、または区別することができる。これらの場合には、観察された同位体パターンの相対強度を用いて種々の脱アミド化ペプチド異性体の相対存在量を具体的に決定することができる。この方法は、全ての異性体種についてフラグメンテーション効率が同じであり脱アミド化の部位に無関係であることを仮定している。当業者であれば、これらの例示的方法に対する多くの変更を用いることができることを理解するであろう。例えば、好適な質量分析装置としては、Ｗａｔｅｒｓ ＸｅｖｏもしくはＡｇｉｌｅｎｔ ６５３０などの四重極型飛行時間質量分析装置（ＱＴＯＦ）または、Ｏｒｂｉｔｒａｐ ＦｕｓｉｏｎもしくはＯｒｂｉｔｒａｐ Ｖｅｌｏｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）などのオービトラップ型装置が挙げられ得る。好適な液体クロマトグラフィーシステムとしては、例えば、ＷａｔｅｒｓからのＡｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣシステム、またはＡｇｉｌｅｎｔシステム（シリーズ１１００または１２００）が挙げられる。好適なデータ解析ソフトウェアは、例えば、ＭａｓｓＬｙｎｘ（Ｗａｔｅｒｓ）、Ｐｉｎｐｏｉｎｔ
ａｎｄ Ｐｅｐｆｉｎｄｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、Ｍａｓｃｏｔ（Ｍａｔｒｉｘ Ｓｃｉｅｎｃｅ）、Ｐｅａｋｓ ＤＢ（Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）を含み得る。さらに他の技術は、例えば、２０１７年６月１６日にオンライン公開されたＸ．Ｊｉｎ ｅｔ ａｌ，Ｈｕ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｖｏｌ．２８，Ｎｏ．５，ｐｐ．２５５－２６７に記載されている可能性がある。

【表1-1】

【表1-2】

【0037】

特定の実施形態では、ＡＡＶｈｕ６８カプシドは、配列番号８のアミノ酸配列の付番に基づく位置Ｎ５７、Ｎ３２９、Ｎ４５２及び／またはＮ５１２のうちの少なくとも１つにおいてＮ残基の少なくとも４５％が脱アミド化されているカプシドタンパク質を有することによって特徴付けられる。特定の実施形態では、これらのＮ－Ｇ位置（すなわち、配列番号８のアミノ酸配列の付番に基づいてＮ５７、Ｎ３２９、Ｎ４５２及び／またはＮ５１２）のうちの１つ以上にあるＮ残基の少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％または少なくとも９０％が脱アミド化されている。これら及びその他の実施形態では、ＡＡＶｈｕ６８カプシドは、配列番号８のアミノ酸配列の付番に基づく位置Ｎ９４、Ｎ２５３、Ｎ２７０、Ｎ３０４、Ｎ４０９、Ｎ４７７及び／またはＱ５９９のうちの１つ以上においてＮ残基の約１％～約２０％が脱アミド化を有しているタンパク質の集団を有することによってさらに特徴付けられる。特定の実施形態では、ＡＡＶｈｕ６８は少なくとも、配列番号８のアミノ酸配列の付番に基づく位置Ｎ３５、Ｎ５７、Ｎ６６、Ｎ９４、Ｎ１１３、Ｎ２５２、Ｎ２５３、Ｑ２５９、Ｎ２７０、Ｎ３０３、Ｎ３０４、Ｎ３０５、Ｎ３１９、Ｎ３２８、Ｎ３２９、Ｎ３３６、Ｎ４０９、Ｎ４１０、Ｎ４５２、Ｎ４７７、Ｎ５１５、Ｎ５９８、Ｑ５９９、Ｎ６２８、Ｎ６５１、Ｎ６６３、Ｎ７０９、Ｎ７３５のうちの１つ以上またはその組み合わせにおいて脱アミド化されているｖｐ１、ｖｐ２及び／またはｖｐ３タンパク質の亜集団を含む。特定の実施形態では、カプシドタンパク質は１つ以上のアミド化アミノ酸を有し得る。

【0038】

さらに他の修飾が認められるが、そのほとんどは、あるアミノ酸から別のアミノ酸残基への変換をもたらさない。場合によってはカプシドのｖｐ１、ｖｐ２及びｖｐ３の少なくとも１つのＬｙｓがアセチル化されている。場合によってはカプシドのｖｐ１、ｖｐ２及び／またはｖｐ３の少なくとも１つのＡｓｐがＤ－Ａｓｐに異性化している。場合によってはカプシドのｖｐ１、ｖｐ２及び／またはｖｐ３の少なくとも１つのＳ（Ｓｅｒ、セリン）がリン酸化されている。場合によってはカプシドのｖｐ１、ｖｐ２及び／またはｖｐ３の少なくとも１つのＴ（Ｔｈｒ、スレオニン）がリン酸化されている。場合によってはカプシドのｖｐ１、ｖｐ２及び／またはｖｐ３の少なくとも１つのＷ（ｔｒｐ、トリプトファン）が酸化されている。場合によってはカプシドのｖｐ１、ｖｐ２及び／またはｖｐ３の少なくとも１つのＭ（Ｍｅｔ、メチオニン）が酸化されている。特定の実施形態では、カプシドタンパク質は１つ以上のリン酸化を有する。例えば、特定のｖｐ１カプシドタ
ンパク質が位置１４９においてリン酸化されている場合がある。

【0039】

特定の実施形態では、ＡＡＶｈｕ６８カプシドは、配列番号８のアミノ酸配列をコードする核酸配列の産物であるｖｐ１タンパク質であって位置６７のグルタミン酸（Ｇｌｕ）及び／または位置１５７のバリン（Ｖａｌ）を含んでいる当該ｖｐ１タンパク質の異種集団；位置１５７に場合によってバリン（Ｖａｌ）を含んでいるｖｐ２タンパク質の異種集団；ならびにｖｐ３タンパク質の異種集団を含む。ＡＡＶｈｕ６８カプシドは、配列番号８のアミノ酸配列の残基付番に基づいてｖｐ１タンパク質の位置５７に位置するアスパラギン－グリシン対のアスパラギン（Ｎ）の少なくとも６５％、ならびにｖｐ１、ｖ２及びｖｐ３タンパク質の位置３２９、４５２及び／または５１２にあるアスパラギン－グリシン対のアスパラギン（Ｎ）の少なくとも７０％が脱アミド化されており、脱アミド化がアミノ酸変化をもたらしている、少なくとも１つの亜集団を含有する。本明細書中でより詳しく述べるように、脱アミド化アスパラギンは、脱アミド化されてアスパラギン酸、イソアスパラギン酸、相互変換されるアスパラギン酸／イソアスパラギン酸対、またはそれらの組み合わせとなったものであり得る。特定の実施形態では、ｒＡＡＶｈｕ６８は、（ａ）ｖｐ２タンパク質の各々が独立して、少なくとも配列番号８のｖｐ２タンパク質をコードする核酸配列の産物であること；（ｂ）ｖｐ３タンパク質の各々が独立して、少なくとも配列番号８のｖｐ３タンパク質をコードする核酸配列の産物であること；（ｃ）ｖｐ１タンパク質をコードする核酸配列が配列番号７、または配列番号８のアミノ酸配列をコードし配列番号７と少なくとも７０％～少なくとも９９％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％）同一である配列であることのうちの１つ以上によってさらに特徴付けられる。場合によってはその配列を単独で使用してｖｐ１、ｖｐ２及びｖｐ３タンパク質を発現させる。あるいは、この配列と、ｖｐ１固有領域（約ａａ１～約ａａ１３７）及び／またはｖｐ２固有領域（約ａａ１～約ａａ２０２）を含まずに配列番号８のＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ３アミノ酸配列（約ａａ２０３～７３６）をコードする核酸配列もしくはそれに相補的な鎖、対応するｍＲＮＡもしくはｔＲＮＡ（配列番号７の約ｎｔ６０７～約ｎｔ２２１１）、または配列番号８のａａ２０３～７３６をコードし配列番号７と少なくとも７０％～少なくとも９９％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％）同一である配列のうちの１つ以上とを共発現させてもよい。さらに、またはあるいは、ｖｐ１コード及び／またはｖｐ２コード配列と、ｖｐ１固有領域（約ａａ１～約ａａ１３７）を含まずに配列番号８のＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ２アミノ酸配列（約ａａ１３８～７３６）をコードする核酸配列もしくはそれに相補的な鎖、対応するｍＲＮＡもしくはｔＲＮＡ（配列番号７のｎｔ４１２～２２１１）、または配列番号８の約ａａ１３８～７３６をコードし配列番号７と少なくとも７０％～少なくとも９９％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％）同一である配列とを共発現させてもよい。

【0040】

さらに、またはあるいは、ｒＡＡＶｈｕ６８カプシドは少なくとも、配列番号８の付番に基づく位置Ｎ５７、Ｎ６６、Ｎ９４、Ｎ１１３、Ｎ２５２、Ｎ２５３、Ｑ２５９、Ｎ２７０、Ｎ３０３、Ｎ３０４、Ｎ３０５、Ｎ３１９、Ｎ３２８、Ｎ３２９、Ｎ３３６、Ｎ４０９、Ｎ４１０、Ｎ４５２、Ｎ４７７、Ｎ５１２、Ｎ５１５、Ｎ５９８、Ｑ５９９、Ｎ６２８、Ｎ６５１、Ｎ６６３、Ｎ７０９のうちの１つ以上またはその組み合わせにおいて脱アミド化されているｖｐ１、ｖｐ２及び／またはｖｐ３タンパク質の亜集団を含む；（ｅ）ｒＡＡＶｈｕ６８カプシドは、配列番号８の付番に基づく位置Ｎ６６、Ｎ９４、Ｎ１１３、Ｎ２５２、Ｎ２５３、Ｑ２５９、Ｎ２７０、Ｎ３０３、Ｎ３０４、Ｎ３０５、Ｎ３１９、Ｎ３２８、Ｎ３３６、Ｎ４０９、Ｎ４１０、Ｎ４７７、Ｎ５１５、Ｎ５９８、Ｑ５９９、Ｎ６２８、Ｎ６５１、Ｎ６６３、Ｎ７０９のうちの１つ以上またはその組み合わせにおいて１～２０％の脱アミド化を含むｖｐ１、ｖｐ２及び／またはｖｐ３タンパク質の亜
集団を含む；（ｆ）ｒＡＡＶｈｕ６８カプシドは、配列番号８の付番に基づいてｖｐ１タンパク質の位置５７にあるＮの６５～１００％が脱アミド化されているｖｐ１の亜集団を含む；（ｇ）ｒＡＡＶｈｕ６８カプシドは、ｖｐ１タンパク質の位置５７にあるＮの７５～１００％が脱アミド化されているｖｐ１タンパク質の亜集団を含む；（ｈ）ｒＡＡＶｈｕ６８カプシドは、配列番号８の付番に基づく位置３２９にあるＮの８０～１００％が脱アミド化されているｖｐ１タンパク質、ｖｐ２タンパク質及び／またはｖｐ３タンパク質の亜集団を含む；（ｉ）ｒＡＡＶｈｕ６８カプシドは、配列番号８の付番に基づく位置４５２にあるＮの８０～１００％が脱アミド化されているｖｐ１タンパク質、ｖｐ２タンパク質及び／またはｖｐ３タンパク質の亜集団を含む；（ｊ）ｒＡＡＶｈｕ６８カプシドは、配列番号８の付番に基づく位置５１２にあるＮの８０～１００％が脱アミド化されているｖｐ１タンパク質、ｖｐ２タンパク質及び／またはｖｐ３タンパク質の亜集団を含む；（ｋ）ｒＡＡＶは、合計約６０個のカプシドタンパク質をｖｐ１対ｖｐ２対ｖｐ３タンパク質の約１対約１～１．５対３～１０の比で含む；（ｌ）ｒＡＡＶは、合計約６０個のカプシドタンパク質をｖｐ１対ｖｐ２対ｖｐ３タンパク質の約１対約１対３～９の比で含む。

【0041】

特定の実施形態では、ＡＡＶｈｕ６８は、脱アミド化を減少させるべくアスパラギン－グリシン対のグリシンを変化させるように改変される。他の実施形態では、アスパラギンを、より遅い速度で脱アミド化される別のアミノ酸、例えばグルタミン；またはアミド基（例えば、グルタミン及びアスパラギンはアミド基を含有する）を欠くアミノ酸；及び／またはアミン基（例えば、リジン、アルギニン及びヒスチジンはアミド基を含有する）を欠くアミノ酸に変化させる。本明細書中で使用する場合、アミドまたはアミン側基を欠くアミノ酸は、例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン、シスチン、フェニルアラニン、チロシンまたはトリプトファン及び／またはプロリンを指す。記載しているような改変は、コードされるＡＡＶｈｕ６８アミノ酸配列にみられるアスパラギン－グリシン対のうちの１つ、２つまたは３つにおいてなされ得る。特定の実施形態では、４つ全てのアスパラギン－グリシン対においてそのような改変がなされるわけではない。このように、脱アミド化速度がより低い、ＡＡＶｈｕ６８及び／または操作型ＡＡＶｈｕ６８変異型の脱アミド化を減少させる方法。さらに、またはあるいは、他の１つ以上のアミドアミノ酸を非アミドアミノ酸に変えてＡＡＶｈｕ６８の脱アミド化を減少させてもよい。

【0042】

これらのアミノ酸修飾は従来の遺伝子操作技術によってなされ得る。例えば、配列番号８の位置５８、３３０、４５３及び／または５１３においてグリシン（アルギニン－グリシン対）をコードするコドンの１つ～３つが改変されてグリシン以外のアミノ酸をコードしている改変されたＡＡＶｈｕ６８ ｖｐコドンを含有する核酸配列が生み出され得る。特定の実施形態では、改変されたアルギニンコドンを含有する核酸配列は、配列番号８の位置５７、３２９、４５２及び／または５１２に位置するアルギニン－グリシン対の１つ～３つにおいて、改変されたコドンがアルギニン以外のアミノ酸をコードするように操作されていてもよい。改変された各コドンは、異なるアミノ酸をコードしていてもよい。あるいは、変更したコドンの１つ以上が同じアミノ酸をコードしていてもよい。特定の実施形態では、これらの改変型ＡＡＶｈｕ６８核酸配列は、天然ｈｕ６８カプシドよりも低い脱アミド化を有するカプシドを有している突然変異ｒＡＡＶｈｕ６８を生み出すために使用され得る。そのような突然変異ｒＡＡＶｈｕ６８は、低減された免疫原性を有し得、及び／または貯蔵時、特に懸濁液形態での貯蔵時の安定性を向上させ得る。本明細書中で使用する場合、「コドン」は、配列中のアミノ酸をコードする３つのヌクレオチドを指す。

【0043】

一実施形態では、（Ａ）（１）配列番号８の１～７３６の予測アミノ酸配列をコードする核酸配列からの発現によって産生されるＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ１タンパク質、配列番号７から産生されるｖｐ１タンパク質、または配列番号８の１～７３６の予測アミノ酸配列
をコードし配列番号７と少なくとも７０％同一である核酸配列から産生されるｖｐ１タンパク質、配列番号８の少なくとも約アミノ酸１３８～７３６の予測アミノ酸配列をコードする核酸配列からの発現によって産生されるＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ２タンパク質、配列番号７の少なくともヌクレオチド４１２～２２１１を含む配列から産生されるｖｐ２タンパク質、または配列番号８の少なくとも約アミノ酸１３８～７３６の予測アミノ酸配列をコードし配列番号７の少なくともヌクレオチド４１２～２２１１と少なくとも７０％同一である核酸配列から産生されるｖｐ２タンパク質、配列番号８の少なくとも約アミノ酸２０３～７３６の予測アミノ酸配列をコードする核酸配列からの発現によって産生されるＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ３タンパク質、配列番号７の少なくともヌクレオチド６０７～２２１１を含む配列から産生されるｖｐ３タンパク質、または配列番号８の少なくとも約アミノ酸２０３～７３６の予測アミノ酸配列をコードし配列番号７の少なくともヌクレオチド６０７～２２１１と少なくとも７０％同一である核酸配列から産生されるｖｐ３タンパク質を含む、ＡＡＶｈｕ６８カプシドタンパク質；及び／または（２）位置１５７のバリン及び／または位置６７のグルタミン酸を場合によって含んでいるｖｐ１タンパク質の異種集団、位置１５７に場合によってバリンを含んでいるｖｐ２タンパク質の異種集団、及びｖｐ３タンパク質の異種集団を含み、少なくともｖｐ１及びｖｐ２タンパク質の亜集団が、配列番号８のｖｐ１カプシドの付番に基づく位置１５７にバリンを含むものでありかつ場合によってはさらに位置６７にグルタミン酸（ｇｌｕｔａｍｉｃ）を含むものである、ＡＡＶカプシドタンパク質；及び／または（３）配列番号８のアミノ酸配列をコードする核酸配列の産物であるｖｐ１タンパク質の異種集団、配列番号８の少なくとも約アミノ酸１３８～７３６のアミノ酸配列をコードする核酸配列の産物であるｖｐ２タンパク質の異種集団、及び配列番号８の少なくともアミノ酸２０３～７３６をコードする核酸配列の産物であるｖｐ３タンパク質の異種集団のうちの、１つ以上を含み、ｖｐ１、ｖｐ２及びｖｐ３タンパク質が、配列番号８のアスパラギン－グリシン対において少なくとも２つの高度に脱アミド化されたアスパラギン（Ｎ）を含むアミノ酸修飾を有する亜集団を含有するものでありかつ場合によっては他の脱アミド化アミノ酸を含む亜集団をさらに含むものであり、脱アミド化がアミノ酸変化をもたらしている、ＡＡＶ６８カプシド；ならびに（Ｂ）ＡＡＶｈｕ６８カプシド内のベクターゲノムであって、ＡＡＶ末端逆位反復配列と、宿主における産物の発現を促す配列に機能可能に繋げられた産物をコードする非ＡＡＶ核酸配列とを含む核酸分子を含んでいる当該ベクターゲノムを含む、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）が提供される。例えば、４つの残基（Ｎ５７、Ｎ３２９、Ｎ４５２、Ｎ５１２）は通例、高レベルの脱アミド化を呈する。さらなる残基（Ｎ９４、Ｎ２５３、Ｎ２７０、Ｎ３０４、Ｎ４０９、Ｎ４７７及びＱ５９９）も様々なロットにわたって約２０％以下の脱アミド化レベルを呈する。

【0044】

特定の実施形態では、脱アミド化アスパラギンは、脱アミド化されてアスパラギン酸、イソアスパラギン酸、相互変換されるアスパラギン酸／イソアスパラギン酸対、またはそれらの組み合わせとなっている。特定の実施形態では、脱アミド化グルタミン（複数可）は、脱アミド化されて（α）－グルタミン酸、γ－グルタミン酸、相互変換される（α）－グルタミン酸／γ－グルタミン酸対、またはそれらの組み合わせになっている。

【0045】

特定の実施形態では、ＡＡＶｈｕ６８カプシドは、（ａ）配列番号８の付番に基づいてｖｐ１タンパク質の位置５７に位置するアスパラギン－グリシン対のアスパラギン（Ｎ）の少なくとも６５％が脱アミド化されていること；（ｂ）配列番号８のアミノ酸配列の残基付番に基づいてｖｐ１、ｖ２及びｖｐ３タンパク質の位置３２９にあるアスパラギン－グリシン対のＮの少なくとも７５％が脱アミド化されていること；（ｃ）配列番号８のアミノ酸配列の残基付番に基づいてｖｐ１、ｖ２及びｖｐ３タンパク質の位置４５２にあるアスパラギン－グリシン対のＮの少なくとも５０％が脱アミド化されていること；及び／または（ｄ）配列番号８のアミノ酸配列の残基付番に基づいてｖｐ１、ｖ２及びｖｐ３タンパク質の位置５１２にあるアスパラギン－グリシン対のＮの少なくとも７５％が脱アミ
ド化されていることのうちの１つ以上を有する亜集団を含む。特定の実施形態では、ｈｕ６８カプシドは、質量分析を用いて決定した場合にｖｐ１タンパク質の位置５７にあるＮの７５～１００％が脱アミド化されているｖｐ１の亜集団を含む。特定の実施形態では、ＡＡＶｈｕ６８カプシドは、質量分析を用いて決定した場合に配列番号８の付番に基づく位置３２９にあるＮの７５～１００％が脱アミド化されているｖｐ１タンパク質、ｖｐ２タンパク質及び／またはｖｐ３タンパク質の亜集団を含む。特定の実施形態では、ｈｕ６８カプシドは、質量分析を用いて決定した場合に配列番号８の付番に基づく位置４５２にあるＮの７５～１００％が脱アミド化されているｖｐ１タンパク質、ｖｐ２タンパク質及び／またはｖｐ３タンパク質の亜集団を含む。特定の実施形態では、ｈｕ６８カプシドは、配列番号８の付番に基づく位置５１２にあるＮの７５～１００％が脱アミド化されているｖｐ１タンパク質、ｖｐ２タンパク質及び／またはｖｐ３タンパク質の亜集団を含む。特定の実施形態では、タンパク質をコードする核酸配列は、配列番号７、または配列番号８のアミノ酸配列をコードし配列番号７と少なくとも８０％～少なくとも９９％同一である配列である。特定の実施形態では、配列は配列番号７と少なくとも８０％～９７％同一である。特定の実施形態では、ｒＡＡＶｈｕ６８カプシドは少なくとも、Ｎ５７、３２９、４５２、５１２またはそれらの組み合わせのうちの１つ以上から選択される少なくとも４つの位置における少なくとも約５０～１００％の脱アミド化を含む配列番号８からのアミノ酸修飾を有しているｖｐ１、ｖｐ２及び／またはｖｐ３タンパク質の亜集団をさらに含む。特定の実施形態では、ＡＡＶｈｕ６８カプシドは、位置Ｎ９４、Ｎ１１３、Ｎ２５２、Ｎ２５３、Ｑ２５９、Ｎ２７０、Ｎ３０３、Ｎ３０４、Ｎ３０５、Ｎ３１９、Ｎ３２８、Ｎ３３６、Ｎ４０９、Ｎ４１０、Ｎ４７７、Ｎ５１５、Ｎ５９８、Ｑ５９９、Ｎ６２８、Ｎ６５１、Ｎ６６３、Ｎ７０９またはそれらの組み合わせのうちの少なくとも１つ以上における１％～約４０％の脱アミド化をさらに含むｖｐ１、ｖｐ２及び／またはｖｐ３タンパク質の亜集団を含む。特定の実施形態では、ｈｕ６８カプシドは、以下のうちの１つ以上における１つ以上の修飾から選択される１つ以上の修飾をさらに含むｖｐ１、ｖｐ２及び／またはｖｐ３タンパク質の亜集団を含む：アセチル化リジン、リン酸化セリン及び／またはスレオニン、異性化アスパラギン酸、酸化トリプトファン及び／またはメチオニン、またはアミド化アミノ酸。特定の実施形態では、ｒＡＡＶｈｕ６８は、合計約６０個のカプシドタンパク質をｖｐ１対ｖｐ２対ｖｐ３タンパク質の約１対約１～１．５対３～１０の比で含む。特定の実施形態では、ＡＡＶｈｕ６８カプシドは、合計約６０個のカプシドタンパク質のｖｐ１対ｖｐ２対ｖｐ３タンパク質の比が約１対約１対３～９である。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、ＡＡＶｈｕ６８以外のＡＡＶ源からのＡＡＶ
ＩＴＲ配列を含む。

【0046】

特定の実施形態では、組換えアデノ随伴ウイルスｈｕ６８（ｒＡＡＶｈｕ６８）の混合集団を含む組成物が提供され、当該ｒＡＡＶｈｕ６８の各々は独立して、本明細書に記載のｒＡＡＶｈｕ６８から選択されるものである。特定の実施形態では、平均的なＡＡＶｈｕ６８カプシドは、合計約６０個のカプシドタンパク質をｖｐ１対ｖｐ２対ｖｐ３タンパク質の約１対約１～１．５対３～１０の比で含む。特定の実施形態では、平均的なＡＡＶｈｕ６８カプシドは、合計約６０個のカプシドタンパク質をｖｐ１対ｖｐ２対ｖｐ３タンパク質の約１対約１対３～６の比で含む。特定の実施形態では、組成物は静脈内送達のために製剤化される。特定の実施形態では、組成物は鼻腔内または筋肉内送達のために製剤化される。特定の実施形態では、組成物は少なくとも、ｒＡＡＶｈｕ６８ベクター材料ならびに、任意選択の担体、賦形剤及び／または保存剤を含む。

【0047】

組換えＡＡＶｈｕ６８を産生させるために有用となるいかなる好適なｒＡＡＶ産生システムを使用してもよい。例えば、そのような産生システムは、（ａ）配列番号８のアミノ酸配列をコードするＡＡＶｈｕ６８カプシド核酸配列；（ｂ）ＡＡＶｈｕ６８カプシド内へのパッケージングに適した核酸分子であって、少なくとも１つのＡＡＶ末端逆位反復配列（ＩＴＲ）と、宿主細胞における産物の発現を促す配列に機能可能に繋げられた遺伝子
産物をコードする非ＡＡＶ核酸配列とを含む当該核酸分子；ならびに（ｃ）組換えＡＡＶｈｕ６８カプシド内への核酸分子のパッケージングを可能にするに足るＡＡＶ ｒｅｐ機能及びヘルパー機能を含み得る。特定の実施形態では、（ａ）の核酸配列は少なくとも、配列番号７、または配列番号８のアミノ酸配列をコードし配列番号７と少なくとも７０％～少なくとも９９％同一である配列を含む。特定の実施形態では、システムは場合によってさらに、配列番号８の約ａａ２０３～約アミノ酸７３６のＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ３をコードする配列番号７の約ｎｔ６０７～約ｎｔ２２１１の核酸配列を含む。特定の実施形態では、システムは、ヒト胚性腎臓２９３細胞またはバキュロウイルスシステムを含む。

【0048】

特定の実施形態では、ＡＡＶｈｕ６８カプシドの脱アミド化を減少させる方法が提供される。方法は、改変されたＡＡＶｈｕ６８ ｖｐコドンを含有する核酸配列からＡＡＶｈｕ６８カプシドを産生させることを含み、当該核酸配列は、配列番号８の位置５８、３３０、４５３及び／または５１３に位置するアルギニン－グリシン対の１つ～３つにおいて独立して、グリシン以外のアミノ酸をコードするような改変されたグリシンコドンを含むものである。特定の実施形態では、方法は、改変されたＡＡＶｈｕ６８ ｖｐコドンを含有する核酸配列からＡＡＶｈｕ６８カプシドを産生させることを含み、当該核酸配列は、配列番号８の位置５７、３２９、４５２及び／または５１２に位置するアルギニン－グリシン対の１つ～３つにおいて独立して、グリシン以外のアミノ酸をコードするような改変されたアルギニンコドンを含むものである。特定の実施形態では、改変された各コドンは異なるアミノ酸をコードする。特定の実施形態では、改変された２つ以上のコドンが同じアミノ酸をコードする。特定の実施形態では、本明細書に記載の突然変異ＡＡＶｈｕ６８カプシドは、アルギニン－グリシン対において、グリシンがアラニンまたはセリンに変化しているような突然変異を含有する。突然変異ＡＡＶｈｕ６８カプシドは、基準ＡＡＶｈｕ６８が本来４つのＮＧ対を含有するものである場合、１つ、２つまたは３つの突然変異体を含有し得る。特定の実施形態では、突然変異ＡＡＶｈｕ６８カプシドは、ＮＧ対における突然変異をたった１つだけ含有する。特定の実施形態では、突然変異ＡＡＶｈｕ６８カプシドは、２つの異なるＮＧ対において突然変異を含有する。特定の実施形態では、突然変異ＡＡＶｈｕ６８カプシドは、ＡＡＶｈｕ６８カプシド中の構造的に離れた場所に位置する２つの異なるＮＧ対において突然変異を含有する。特定の実施形態では、突然変異はＶＰ１固有領域の中にはない。特定の実施形態では、突然変異の１つがＶＰ１固有領域の中にある。場合によって、突然変異ＡＡＶｈｕ６８カプシドは、ＮＧ対には修飾を含有していないが、ＮＧ対の外側に位置する１つ以上のアスパラギンまたはグルタミンにおいて脱アミド化を最小限にするかまたはなくす突然変異を含有している。

【0049】

本明細書中で使用する場合、「コードされるアミノ酸配列」とは、アミノ酸に翻訳される基準核酸配列の既知ＤＮＡコドンの翻訳に基づいて予測されるアミノ酸を指す。以下の表はＤＮＡコドン及び２０個の一般的なアミノ酸を示し、一文字コード（ＳＬＣ）及び三文字コード（３ＬＣ）を両方とも示す。

【表2】

【0050】

カプシドを生み出す方法、そのためのコード配列、及びｒＡＡＶウイルスベクターを生産する方法については教示がなされている。例えば、Ｇａｏ，ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１００（１０），６０８１－６０８６（２００３）及びＵＳ２０１３／００４５１８６Ａ１を参照されたい。その他のカプシド、例えば、ＷＯ２００３／０４２３９７、ＷＯ２００５／０３３３２１、ＷＯ２００６／１１０６８９、ＵＳ７５８８７７２Ｂ２に記載されているもの（参照によりこれらを本明細書に援用する）をヒト対象に使用してもよい。一実施形態において、本発明は、ＡＡＶｈｕ６８
ｖｐ１コード配列とＡＡＶｈｕ６８ ｒｅｐコード配列との間にスペーサー配列を含む操作された分子を提供する。

【0051】

上に示したとおり、ＡＡＶｈｕ６８配列及びタンパク質は、ｒＡＡＶの生産に有用である。以下の例は、ＡＡＶｈｕ６８を有するｒＡＡＶベクターまたはＡＡＶ９ベクターの生産について記載している。しかしながら、他の実施形態では別のＡＡＶカプシドが選択される。組織特異性はカプシドの種類によって決まる。例えば、ＡＡＶｈｕ６８を有するウイルスベクターは、鼻腔上皮細胞に形質導入するために有用であることが以下の例で示される。ＡＡＶｈｕ６８の配列は本明細書に記載されている。さらに、ＡＡＶ９カプシドを
有するベクター、及びＡＡＶ９に由来するキメラカプシドを生み出す方法については教示がなされている。例えばＵＳ７，９０６，１１１（参照によりこれを本明細書に援用する）を参照されたい。鼻腔細胞または別の好適な標的（例えば筋肉または肺）に形質導入する他のＡＡＶ血清型、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ６４Ｒ１、ＡＡＶｒｈ６４Ｒ２、ｒｈ８（例えば、米国公開特許出願第２００７－００３６７６０－Ａ１号、米国公開特許出願第２００９－０１９７３３８－Ａ１号及びＥＰ１３１０５７１を参照のこと）をＡＡＶウイルスベクター（ＤＮアーゼ耐性ウイルス粒子）のカプシドの供給源として選択してもよい。また、ＷＯ２００３／０４２３９７（ＡＡＶ７及び他のサルＡＡＶ）、米国特許第７７９０４４９号及び米国特許第７２８２１９９号（ＡＡＶ８）、ＷＯ２００５／０３３３２１（ＡＡＶ９）及びＷＯ２００６／１１０６８９も参照されたく、または未だ発見されていないかもしくはそれに基づく組換えＡＡＶをＡＡＶカプシドの供給源として使用してもよい。これらの文献は、ＡＡＶを生み出すために選択され得る他のＡＡＶも教示しており、参照により援用される。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターに使用するためのＡＡＶカプシド（ｃａｐ）を上記ＡＡＶ ｃａｐまたはそのコード核酸の１つの突然変異誘発によって（つまり、挿入、欠失または置換によって）生み出すことができる。いくつかの実施形態では、ＡＡＶカプシドは、上記ＡＡＶカプシドタンパク質のうちの２つまたは３つまたは４つまたはそれ以上からのドメインを含むキメラである。いくつかの実施形態では、ＡＡＶカプシドは、２つまたは３つの異なるＡＡＶまたは組換えＡＡＶからのｖｐ１、ｖｐ２及びｖｐ３単量体のモザイクである。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ組成物は上記ｃａｐを１つより多く含む。

【0052】

ＡＡＶｈｕ６８カプシドは特定の実施形態に有用であり得る。例えば、そのようなカプシドは、モノクローナル抗体を生成する際、及び／または遺伝子療法患者のＡＡＶｈｕ６８濃度レベルを追跡評価するためのアッセイにおいて有用となる試薬を生成する際に使用され得る。有用な抗ＡＡＶｈｕ６８抗体を生み出す技術、そのような抗体または空のカプシドの標識付け、及び好適なアッセイ構成は当業者に知られている。

【0053】

より典型的には、本明細書に提供するＡＡＶｈｕ６８カプシドは、ＡＡＶｈｕ６８カプシド内に操作型核酸配列がパッケージングされている組換えＡＡＶベクターを生み出すのに有用である。「ｒＡＡＶｈｕ６８」または「ｒＡＡＶｈｕ６８ベクター」と呼称するこれらの組換えＡＡＶベクター、及びそれらの用途については本願の別の節でより詳しく述べる。これらのｒＡＡＶｈｕ６８ベクターは、良好な収率及び／またはパッケージング効率をもたらす組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターを生み出すためならびに多様な細胞種及び組織種に形質導入するのに有用なｒＡＡＶベクターを提供するために有用である。そのような細胞種及び組織種としては、限定されないが、肺、心臓、筋肉、肝臓、膵臓、腎臓、脳、海馬、運動野、小脳、鼻腔上皮細胞、心臓筋肉細胞すなわち心筋細胞、肝細胞、肺内皮細胞、筋細胞、肺上皮細胞、膵島細胞、腺房細胞、腎細胞及び／または運動ニューロンが挙げられる。

【0054】

特定の実施形態では、ＡＡＶｈｕ６８カプシドを有するベクターは、ＡＡＶ９に基づくベクターと比較して、パッケージングされたベクターの収率の少なくとも１５％の増加をもたらす。ＡＡＶｈｕ６８とＡＡＶｒｈ１０とを比較した場合、脳室内投与後に低用量（例えば約１×１０^９）でＡＡＶｈｕ６８はＡＡＶｒｈ１０よりも良好な形質導入効率をもたらすことが見出された。さらにＡＡＶｈｕ６８とＡＡＶ９とを比較した場合、脳室内投与後に小脳、運動野及び脳の海馬において（例えば約１×１０^１１ＧＣで）ＡＡＶｈｕ６８はＡＡＶ９よりも良好な形質導入効率をもたらすことが見出された。

【0055】

「組換えＡＡＶ」または「ｒＡＡＶ」は、ＡＡＶカプシドと、ＡＡＶカプシド内にパッケージングされた非ＡＡＶコード配列を少なくとも含有するベクターゲノムとの２つの要
素を含有するＤＮアーゼ耐性ウイルス粒子である。特定の実施形態では、カプシドは、ｖｐ１タンパク質、ｖｐ２タンパク質及びｖｐ３タンパク質からなる約６０個のタンパク質を含有するが、これらは自己組織化してカプシドを形成するものである。特に明記しない限り、「組換えＡＡＶ」または「ｒＡＡＶ」は、「ｒＡＡＶベクター」という語句と交換可能に使用され得る。ｒＡＡＶは、いかなる機能性ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子または機能性ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子も欠き、子孫を生み出すことができないことから、「増殖能欠損型ウイルス」または「ウイルスベクター」である。特定の実施形態では、ＡＡＶ末端逆位反復配列（ＩＴＲ）が唯一のＡＡＶ配列であり、これは、ＩＴＲ間に位置する遺伝子及び調節配列をＡＡＶカプシド内にパッケージングするのを可能にするためにベクターゲノムの最遠の５’及び３’端部に位置していることが典型的である。

【0056】

一般に、「ヌクレアーゼ耐性」という用語は、ＡＡＶカプシドが、遺伝子を宿主細胞に送達するように設計された発現カセットの周囲で組織化し、生産プロセスゆえに存在する可能性がある汚染核酸を除去することを意図したヌクレアーゼインキュベーションステップの間これらのパッケージングされたゲノム配列を分解（消化）から保護する、ということを示す。

【0057】

特定の実施形態では、ｒＡＡＶの製造に使用する非ウイルス性の遺伝要素をベクター（例えば生産ベクター）と呼ぶことにする。特定の実施形態ではこれらのベクターがプラスミドであるが、他の好適な遺伝要素の使用は企図される。そのような生産プラスミドは、ｒＡＡＶの中にパッケージングされないｒＡＡＶ生産中に発現する配列、例えばｒＡＡＶの生産に必要とされるＡＡＶカプシドまたはｒｅｐタンパク質をコードし得る。あるいは、ｒＡＡＶの中にパッケージングされるベクターゲノムをそのような生産プラスミドが保有していてもよい。

【0058】

本明細書中で使用する場合、「ベクターゲノム」は、ウイルス粒子を形成するｒＡＡＶカプシドの内部にパッケージングされる核酸配列を指す。そのような核酸配列は、ＡＡＶ末端逆位反復配列（ＩＴＲ）を含有する。本明細書中の例では、ベクターゲノムは、５’から３’へと、最低でもＡＡＶ ５’ＩＴＲ、コード配列（複数可）及びＡＡＶ ３’ＩＴＲを含有する。カプシドとは異なるＡＡＶ源であるＡＡＶ２からのＩＴＲを選択してもよいし、または完全長ＩＴＲ以外のＩＴＲを選択してもよい。特定の実施形態では、ＩＴＲは、生産中にｒｅｐ機能を提供するＡＡＶまたは相互補完的なＡＡＶと同じＡＡＶ源からのものである。さらに、他のＩＴＲを使用してもよい。さらに、ベクターゲノムは、遺伝子産物の発現を促す調節配列を含有する。ベクターゲノムの好適な構成要素については本明細書中でより詳しく述べる。

【0059】

特定の実施形態では、「発現カセット」という用語は、ｈＳＭＮ配列及びそのための調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、ポリＡ）を含む核酸分子を指し、当該カセットは、ウイルスベクター（例えばウイルス粒子）のカプシドの中にパッケージングされ得るものである。典型的には、ウイルスベクターを生み出すためのそのような発現カセットは、本明細書に記載のｈＳＭＮ配列を、ウイルスゲノムのパッケージングシグナル及びその他の発現制御配列、例えば本明細書に記載されているものに隣接した状態で含有する。例えば、ＡＡＶウイルスベクターの場合、パッケージングシグナルは５’末端逆位反復配列（ＩＴＲ）及び３’ＩＴＲである。特定の実施形態では、「導入遺伝子」という用語は、「発現カセット」と交換可能に使用され得る。他の実施形態では、「導入遺伝子」という用語は、選択された遺伝子、例えば「ｈＳＭＮ１」のためのコード配列だけを指す。

【0060】

本明細書中で使用する場合、「ＳＭＮ」という用語には、本明細書中に提供されている組成物または方法を送達した場合に所望の機能を回復させるか症候を軽減するかまたは別
の生理学的転帰をもたらす、ＳＭＮの任意のアイソフォームが含まれる。本明細書中に提供されている例は、最長のアイソフォームであるアイソフォームＤを利用するが、これは、ＳＭＮ欠乏症または欠損症に罹患していない患者の遺伝子によって産生される主たる転写産物であると考えられている。アイソフォームＤは２９４アミノ酸のタンパク質をもたらし［例えば、ＮＣＢＩ受託ＮＭ＿０００３３４／ＮＰ＿０００３３５、ＥＮＳＥＭＢＬ
ＩＤ ＥＮＳＴ０００００３８０７０７を参照のこと］、タンパク質配列は配列番号２で再現され、コード配列は配列番号３で再現される。しかしながら、別のアイソフォームを選択してもよい。例えば、アイソフォームＢは、３’コード配列中に代替インフレームエクソンを有し、その結果、長さがアイソフォームＤよりも短い（２６２アミノ酸）がそのアイソフォームと同じＮ末端及びＣ末端を有しているタンパク質をもたらす。ＮＣＢＩ受託番号ＮＭ＿０２２８７４／ＮＰ＿０７５０１２、ＥＮＳＥＭＢＬ ＩＤ ＥＮＳＴ０００００５０３０７９を参照されたい。アイソフォームＢのコード配列及びタンパク質配列はそれぞれ配列番号１１及び配列番号１２で再現される。アイソフォームＡは、アイソフォームＤと比較して、代替翻訳終止コドンとなる最後から２番目のエクソンを欠く。このため、アイソフォームＤに比べてアイソフォームＡはより短く（２８２アミノ酸）、異なるＣ末端を有する。ＮＣＢＩ受託番号ＮＭ＿００１２９７７１５／ＮＰ＿００１２８４６４４、ＥＮＳＥＭＢＬ ＩＤ ＥＮＳＴＬ０００００５０６１６３を参照されたい。アイソフォームＡのコード配列及びタンパク質配列はそれぞれ配列番号１３及び配列番号１４で再現される。

【0061】

特定の実施形態では、操作型ヒト（ｈ）運動神経細胞生存（ＳＭＮ）ｃＤＮＡを本明細書に提供するが、これは、天然ｈＳＭＮ配列（配列番号３）に比べて翻訳を最大限にするように設計されたものである。ｍＲＮＡの５’キャップ形成及び安定性を改善するためにコード配列の上流にイントロンが組み込まれ得る。例えば配列番号１５及び配列番号２５を参照されたい。これらの構成物は、脊髄性筋萎縮症を治療する方法に使用され得る。比較目的のために天然ヒトＳＭＮコード配列と操作型ｃＤＮＡとのアラインメントを図１Ｂ～Ｃに示す。

【0062】

本明細書に記載のｈＳＭＮ ｃＤＮＡ配列は、試験管内で、または合成で、または当技術分野でよく知られている技術を用いる他の任意の好適な方法で生み出され得る。例えば、Ｘｉｏｎｇ ｅｔ ａｌ，ＰＣＲ－ｂａｓｅｄ ａｃｃｕｒａｔｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｌｏｎｇ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ，Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ
１，７９１－７９７（２００６）で記載されている、長鎖ＤＮＡ配列のＰＣＲに基づく精密合成（ＰＡＳ）の方法を利用してもよい。二重非対称ＰＣＲ法とオーバーラップ伸張ＰＣＲ法とを組み合わせた方法はＹｏｕｎｇ ａｎｄ Ｄｏｎｇ，Ｔｗｏ－ｓｔｅｐ ｔｏｔａｌ ｇｅｎｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｍｅｔｈｏｄ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．２００４；３２（７）：ｅ５９に記載されている。また、Ｇｏｒｄｅｅｖａ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ＰＣＲ－ｂａｓｅｄ ｇｅｎｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ ｉｔｓ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ ｔｈｅ Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ ｐｈｙｔａｓｅ ｇｅｎｅ ｃｏｄｏｎ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ．２０１０ Ｍａｙ；８１（２）：１４７－５２．Ｅｐｕｂ ２０１０ Ｍａｒ １０も参照されたく、また、オリゴヌクレオチド合成及び遺伝子合成についての以下の特許、Ｇｅｎｅ Ｓｅｑ．２０１２ Ａｐｒ；６（１）：１０－２１、ＵＳ８００８００５、及びＵＳ７９８５５６５も参照されたい。参照によりこれらの文献の各々を本明細書に援用する。さらに、ＰＣＲによってＤＮＡを生成するためのキット及びプロトコールは市販されている。これらは、ポリメラーゼ、例えば、限定されないが、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｏｎｅ Ｔａｑ（登録商標）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、Ｑ５（登録商標）高忠実度ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、及びＧｏＴａｑ（登録商標）Ｇ２ポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用することを含む。本明細書に記載のｈＯＴＣ配列を含有
するプラスミドをトランスフェクトした細胞からＤＮＡを生成することもできる。キット及びプロトコールは既知であり、市販されており、これには、限定されないがＱＩＡＧＥＮプラスミドキット、Ｃｈａｒｇｅｓｗｉｔｃｈ（登録商標）Ｐｒｏ Ｆｉｌｔｅｒプラスミドキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、及びＧｅｎＥｌｕｔｅ（商標）プラスミドキット（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）が含まれる。本発明に有用な他の技術としては、熱サイクルの必要性をなくす配列特異的等温増幅法が挙げられる。熱の代わりに、これらの方法は、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ，Ｌａｒｇｅ Ｆｒａｇｍｅｎｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）のような鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼを採用して二本鎖ＤＮＡを分離させることが典型的である。また、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼである逆転写酵素（ＲＴ）の使用による増幅によってＲＮＡ分子からＤＮＡを生成してもよい。ＲＴは、ｃＤＮＡと呼称され元のＲＮＡ鋳型に相補的なＤＮＡの鎖の重合を行う。その後、上に概説したＰＣＲまたは等温法によってこのｃＤＮＡをさらに増幅することができる。限定されないがＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、ＧＥＮＥＷＩＺ（登録商標）、ＧｅｎｅＡｒｔ（登録商標）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及びＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓを含めた会社から商業的にあつらえのＤＮＡを生成することもできる。

【0063】

本明細書ではさらに、操作型ｈＳＭＮ配列を含むウイルスベクターを提供する。一実施形態において、ｒＡＡＶｈｕ６８．ＳＭＮは、外部の構成要素と内部のＤＮＡゲノムとからなるウイルスベクターである。外部ベクター構成要素は、本明細書において明示されるＡＡＶｈｕ６８カプシドである。カプシド内には、２つのＡＡＶ末端逆位反復配列（ＩＴＲ）に挟まれたヒト運動神経細胞生存（ｈＳＭＮ）導入遺伝子からなる一本鎖ＤＮＡゲノムがパッケージングされている。エンハンサー、プロモーター、イントロン、ｈＳＭＮ１コード配列及び（ポリＡ）シグナルがｈＳＭＮ導入遺伝子を構成している。ＩＴＲは、ベクター生産中にゲノムの複製及びパッケージングを担う遺伝要素であり、ｒＡＡＶを生成するのに必要とされる唯一のウイルスシスエレメントである。ｈＳＭＮコード配列の発現は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）即時早期エンハンサー（Ｃ４）とニワトリベータアクチンプロモーターとのハイブリッドであるＣＢ７プロモーターによって促される。このプロモーターからの転写はＣＩの存在によって増進される。ヒトｈＳＭＮ ｍＲＮＡ転写産物の終結を媒介するためにｒＢＧポリＡシグナルが含められる。特定の実施形態では、「ｈＳＭＮ」はｈＳＭＮ１である。

【0064】

一態様では、機能性ＳＭＮタンパク質をコードするコード配列が提供される。「機能性ｈＳＭＮ」は、元の運動神経細胞生存タンパク質または疾患に関連しないその天然の変異型もしくは多型の生物学的活性レベルを少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または１００％近く示す、もしくは１００％より高く示すＳＭＮタンパク質をコードする遺伝子を意味する。加えて、ＳＭＮ１相同体であるＳＭＮ２もＳＭＮタンパク質をコードするが、より低い効率で機能性タンパク質をプロセシングする。機能性ｈＳＭＮ遺伝子を欠く対象は、ＳＭＮ２の複製数に基づいて様々な度合いでＳＭＡを示す。このため、ある対象にとってはＳＭＮタンパク質が天然ＳＭＮタンパク質の生物学的活性の１００％未満を示すことが望ましい場合がある。特定の実施形態では、「ｈＳＭＮ１」、「ｈＳＭＮ」及び「機能性ｈＳＭＮ」という用語は交換可能に使用される。

【0065】

ＳＭＮの発現及び活性レベルを試験管内で測定するための様々なアッセイが存在する。例えば、上に引用したＴａｎｇｕｙ ｅｔ ａｌ，２０１５を参照されたい。本明細書に記載の方法はＳＭＡまたはその症候を治療するための他の任意の療法と組み合わせることができる。特定の実施形態では、ＦＤＡ及びＥＭＡによって承認された、ＳＭＮ２伝令リボ核酸（ｍＲＮＡ）前駆体を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）であるヌシネルセン［スピンラザ（商標）、Ｂｉｏｇｅｎ］が標準的医療に含まれ得る。例え
ば、米国特許第６，１６６，１９７号、ＵＳ６，２１０，８９２、ＵＳ７，１０１，９９３、ＵＳ７，８３８，６５７、ＵＳ８，１１０，５６０、ＵＳ８，３６１，９７７、ＵＳ８，９８０，８５３を参照されたい。これは、クモ膜下腔内に投与されＳＭＮ２を指向するアンチセンスオリゴヌクレオチドである。推奨用量は１２ｍｇ（投与１回あたり５ｍＬ）である。処置は４負荷用量から開始するが、最初の３負荷用量は１４日間隔で投与し、第４負荷用量は第３用量の３０日後に投与し、さらにその後には維持用量を４ヶ月に１回投与する。

【0066】

一実施形態において、機能性ＳＭＮのアミノ酸配列は、配列番号２のアミノ酸配列、またはそれとの９５％の同一性を共有している配列である。一実施形態では改変型ｈＳＭＮコード配列が提供される。好ましくは、改変型ｈＳＭＮコード配列は、完全長の天然ｈＳＭＮコード配列との約８０％未満の同一性、好ましくは約７５％以下の同一性を有する（図１Ｂ～Ｃ、配列番号３）。一実施形態において、改変型ｈＳＭＮコード配列は、ＡＡＶ（例えばｒＡＡＶ）によって媒介される送達に続く翻訳の速度が天然ｈＳＭＮに比べて改善されていることによって特徴付けられる。一実施形態において、改変型ｈＳＭＮコード配列は、完全長の天然ｈＳＭＮコード配列との約８０％、７９％、７８％、７７％、７６％、７５％、７４％、７３％、７２％、７１％、７０％、６９％、６８％、６７％、６６％、６５％、６４％、６３％、６２％、６１％またはそれ未満よりも低い同一性を共有している。一実施形態において、改変型ｈＳＭＮコード配列は、配列番号１または、配列番号１との７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくはそれ以上の同一性を共有する配列である。他の実施形態では、異なるＳＭＮコード配列が選択される。

【0067】

さらに他の実施形態では、アイソフォームＤ以外のＳＭＮアイソフォームのコード配列が選択される。さらに、またはあるいは、本明細書において提供される構成物または治療計画は、アイソフォームＤのＳＭＮタンパク質をコードするＡＡＶｈｕ６８．ＳＭＮ材料と、異なるＳＭＮタンパク質をコードするベクター材料とを組み合わせて使用する処置を組み合わせてもよい。このベクター材料はＡＡＶｈｕ６８カプシドを有していてもよいし、または異なるカプシドを有していてもよい。

【0068】

核酸配列に関する「同一性パーセント（％）」、「配列同一性」、「配列同一性パーセント」または「パーセント同一」という用語は、対応させるためにアラインメントしたときに同一である、２つの配列の中の残基を指す。配列同一性比較の長さは、ゲノムの完全長、遺伝子コード配列の完全長に及び得、または少なくとも約５００～５０００ヌクレオチドの断片が望まれる。しかしながら、より小さい、例えば少なくとも約９ヌクレオチド、通常少なくとも約２０～２４ヌクレオチド、少なくとも約２８～３２ヌクレオチド、少なくとも約３６またはそれより多いヌクレオチドの断片の同一性が望まれることもある。

【0069】

アミノ酸配列の同一性パーセントは、タンパク質の完全長、ポリペプチド、約３２アミノ酸、約３３０アミノ酸、またはそのペプチド断片、または対応する核酸配列コード配列にわたって容易に決定され得る。好適なアミノ酸断片は長さが少なくとも約８アミノ酸であり得、約７００アミノ酸以下であり得る。一般に、２つの異なる配列同士の「同一性」、「相同性」または「類似性」に言及する場合、「同一性」、「相同性」または「類似性」は、「アラインメントされた」配列に関して決定される。「アラインメントされた」配列、または「アラインメント」とは、基準配列に比べて欠落しているかまたは追加されている塩基またはアミノ酸の補正をしばしば含有する複数の核酸配列またはタンパク質（アミノ酸）配列を指す。

【0070】

同一性は、配列のアラインメントを用意することによって、ならびに当技術分野で知られているかまたは市販されている様々なアルゴリズム及び／またはコンピュータプログラム［例えば、ＢＬＡＳＴ、ＥｘＰＡＳｙ、ＣｌｕｓｔａｌＯ、ＦＡＳＴＡ；例えば、Ｎｅ
ｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム、Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを使用］の使用によって、決定され得る。アラインメントは、公的または商業的に入手することができる様々な多重配列アラインメントプログラムのいずれかを使用して実施される。配列アラインメントプログラム、例えば、「Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ」、「Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ」、「ＭＡＰ」、「ＰＩＭＡ」、「ＭＳＡ」、「ＢＬＯＣＫＭＡＫＥＲ」、「ＭＥＭＥ」及び「Ｍａｔｃｈ－Ｂｏｘ」プログラムがアミノ酸配列に対して利用可能である。一般的にはこれらのプログラムのいずれかをデフォルト設定で使用するが、当業者であればこれらの設定を必要に応じて変更することができる。あるいは、当業者であれば、もたらされる同一性またはアラインメントのレベルが基準アルゴリズム及びプログラムによってもたらされるそのレベルと少なくとも同程度である別のアルゴリズムまたはコンピュータプログラムを利用することができる。例えば、Ｊ．Ｄ．Ｔｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，“Ａ ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ”，２７（１３）：２６８２－２６９０（１９９９）を参照されたい。

【0071】

多重配列アラインメントプログラムは核酸配列に対しても利用可能である。そのようなプログラムの例としては、「Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ」、「Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ」、「ＣＡＰ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｓｓｅｍｂｌｙ」、「ＢＬＡＳＴ」、「ＭＡＰ」及び「ＭＥＭＥ」が挙げられ、これらはインターネット上のウェブサービスを通じて入手可能である。そのようなプログラムの他の提供元は当業者に知られている。あるいは、ベクターＮＴＩユーティリティーも使用される。また、上記プログラムの中に含まれているものを含めて、ヌクレオチド配列同一性を測定するために使用することができる当技術分野で知られている多くのアルゴリズムが存在する。別の例として、ＧＣＧ バージョン６．１の中のプログラムであるＦａｓｔａ（商標）を使用してポリヌクレオチド配列を比較することができる。Ｆａｓｔａ（商標）は、クエリー配列と検索配列との間で最もよく重複している領域のアラインメント及び配列同一性パーセントを提供する。例えば、参照により本明細書に援用するＧＣＧ バージョン６．１において提供されるようなデフォルトパラメータ（６のワードサイズ、スコア行列のためのＮＯＰＡＭ係数）でＦａｓｔａ（商標）を使用して核酸配列同士の配列同一性パーセントを決定することができる。

【0072】

ＩＩ．発現カセット及びベクター
一実施形態では、ウイルスベクターの生成及び／または宿主細胞への送達のために有用であり搭載ｈＳＭＮ１配列を移入させる好適な遺伝要素（ベクター）、例えば、裸のＤＮＡ、ファージ、トランスポゾン、コスミド、エピソームなどの中に本明細書に記載のｈＳＭＮ遺伝子を組み込む操作をする。選択したベクターをいかなる好適な方法で送達してもよく、当該方法には、トランスフェクション、電気穿孔、リポソーム送達、膜融合技術、高速ＤＮＡ被覆ペレット、ウイルス感染、及びプロトプラスト融合が含まれる。そのような構築物を作るために用いられる方法は、核酸操作の技量を有する者に知られており、遺伝子操作、組換操作、及び合成技術を含む。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹを参照されたい。一態様では、ｈＳＭＮ核酸配列を含む発現カセットが提供される。

【0073】

このように、一態様では、ＡＡＶカプシドと少なくとも１つの発現カセットとを含むアデノ随伴ウイルスベクターが提供され、当該少なくとも１つの発現カセットは、ＳＭＮ及び宿主細胞におけるＳＭＮ配列の発現を促す発現制御配列をコードする核酸配列を含むものである。ＡＡＶベクターはさらに、ＡＡＶ ＩＴＲ配列も含む。一実施形態において、ＩＴＲは、カプシドを供給しているものとは異なったＡＡＶからのものである。好ましい実施形態では、簡便さのため及び規制上の承認を促進するためにＡＡＶ２からのＩＴＲ配
列、またはその欠失形態（ΔＩＴＲ）が使用され得る。しかしながら、他のＡＡＶ源からのＩＴＲを選択してもよい。ＩＴＲの供給源がＡＡＶ２でありＡＡＶカプシドが別のＡＡＶ源からのものである場合、結果として得られるベクターは偽型と呼ばれ得る。典型的にはＡＡＶベクターゲノムは、ＡＡＶ５’ＩＴＲ、ｈＳＭＮコード配列及び任意の調節配列、ならびにＡＡＶ３’ＩＴＲを含む。しかしながら、これらの要素のその他の構成が適することもある。Ｄ配列及び末端分解部位（ｔｒｓ）を欠失させたΔＩＴＲと呼ばれる５’ＩＴＲの短縮形態について教示がなされている。他の実施形態では、完全長ＡＡＶ５’及び３’ＩＴＲが使用される。

【0074】

一態様では、ウイルスベクターを生み出すために有用な、ＤＮＡ分子（例えばプラスミド）である構築物が提供される。発現カセットは典型的には、例えば選択された５’ＩＴＲ配列とｈＳＭＮコード配列との間に位置する発現制御配列の一部としてプロモーター配列を含有する。本明細書に記載の例示的なプラスミド及びベクターは、遍在的ニワトリβ－アクチンプロモーター（ＣＢ）をＣＭＶ即時早期エンハンサー（ＣＭＶ ＩＥ）と共に使用する。あるいは、神経特異的プロモーターを使用してもよい［例えば、ｃｈｉｎｏｏｋ．ｕｏｒｅｇｏｎ．ｅｄｕ／ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ．ｈｔｍｌでアクセスされるＬｏｃｋｅｒｙ Ｌａｂ ｎｅｕｒｏｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ ｄａｔａｂａｓｅを参照のこと］。そのような神経特異的プロモーターとしては、限定されないが例えば、シナプシンＩ（ＳＹＮ）、カルシウム／カルモジュリン依存性タンパク質キナーゼＩＩ、チューブリンアルファＩ、神経特異エノラーゼ、及び血小板由来増殖因子ベータ鎖プロモーターが挙げられる。参照により本明細書に援用されるＨｉｏｋｉ ｅｔ ａｌ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｊｕｎｅ ２００７，１４（１１）：８７２－８２を参照されたい。他の神経特異的プロモーターとしては、６７ｋＤａのグルタミン酸脱炭酸酵素（ＧＡＤ６７）、ホメオボックスＤｌｘ５／６、グルタメート受容体１（ＧｌｕＲ１）、プレプロタキキニン１（Ｔａｃ１）プロモーター、神経特異エノラーゼ（ＮＳＥ）及びドパミン作用性受容体１（Ｄｒｄ１ａ）プロモーターが挙げられる。例えば、Ｄｅｌｚｏｒ ｅｔ ａｌ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ａｕｇｕｓｔ ２０１２，２３（４）：２４２－２５４を参照されたい。別の実施形態では、プロモーターはＧＵＳｂプロモーター ｗｗｗ．ｊｃｉ．ｏｒｇ／ａｒｔｉｃｌｅｓ／ｖｉｅｗ／４１６１５＃Ｂ３０である。

【0075】

他のプロモーター、例えば、恒常的プロモーター、調節可能なプロモーター［例えば、ＷＯ２０１１／１２６８０８及びＷＯ２０１３／０４９４３を参照のこと］、または生理学的合図に応答するプロモーターを本明細書に記載のベクターに使用、利用してもよい。プロモーター（複数可）は種々の供給源、例えば、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）即時早期エンハンサー／プロモーター、ＳＶ４０早期エンハンサー／プロモーター、ＪＣポリオーマウイルス（ｐｏｌｙｍｏｖｉｒｕｓ）プロモーター、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）またはグリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ－１）潜伏関連プロモーター（ＬＡＰ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）長鎖末端反復配列（ＬＴＲ）プロモーター、神経特異的プロモーター（ＮＳＥ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）プロモーター、ｈＳＹＮ、メラニン凝集ホルモン（ＭＣＨ）プロモーター、ＣＢＡ、マトリックスメタロプロテインプロモーター（ＭＰＰ）及びニワトリβ－アクチンプロモーターから選択することができる。

【0076】

プロモーターに加えて、発現カセット及び／またはベクターは、１つ以上の他の適切な転写開始、転写終結、エンハンサー配列、効率的ＲＮＡプロセシングシグナル、例えば、スプライシング及びポリアデニル化（ポリＡ）シグナル；細胞質ｍＲＮＡを安定化させる配列、例えばＷＰＲＥ；翻訳効率を向上させる配列（すなわち、コザック共通配列）；タンパク質安定性を向上させる配列；ならびに、所望により、コード配列の分泌を増進する配列を含有していてもよい。好適なポリＡ配列の例としては、例えば、ＳＶ４０、ＳＶ５
０、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）、ヒト成長ホルモン、及び合成ポリＡが挙げられる。好適なエンハンサーの一例はＣＭＶエンハンサーである。その他の好適なエンハンサーには、ＣＮＳ症状に適するものが含まれる。一実施形態では、発現カセットは１つ以上の発現エンハンサーを含む。一実施形態では、発現カセットは２つ以上の発現エンハンサーを含む。これらのエンハンサーは、同じであってもよいし、または互いに異なっていてもよい。例えば、エンハンサーはＣＭＶ即時早期エンハンサーを含み得る。このエンハンサーは、互いに隣接して位置する２コピーとして存在していてもよい。あるいは、エンハンサーの二重コピーは１つ以上の配列によって互いに隔てられていてもよい。さらに別の実施形態では、発現カセットはさらにイントロン、例えばニワトリベータアクチンイントロンを含有する。他の好適なイントロンとしては、当技術分野で知られているもの、例えば、ＷＯ２０１１／１２６８０８に記載されているものなどが挙げられる。場合によって、ｍＲＮＡを安定化させるために１つ以上の配列を選択してもよい。そのような配列の一例は改変型ＷＰＲＥ配列であるが、これは、ポリＡ配列の上流及びコード配列の下流において操作されたものであり得る［例えば、ＭＡ Ｚａｎｔａ－Ｂｏｕｓｓｉｆ，ｅｔ ａｌ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（２００９）１６：６０５－６１９を参照のこと］。

【0077】

これらの制御配列はｈＳＭＮ遺伝子配列に「機能可能に繋げられている」。本明細書中で使用する場合、「機能可能に繋げられている」という用語は、関心対象の遺伝子と連続している発現制御配列を指すだけでなく、トランスで、または遠くで作用して関心対象の遺伝子を制御する発現制御配列も指す。

【0078】

一実施形態では、自己相補性ＡＡＶが提供される。これに関して「ｓｃ」という略語は自己相補性を指す。「自己相補性ＡＡＶ」は、組換えＡＡＶ核酸配列が有するコード領域が分子内二本鎖ＤＮＡ鋳型を形成するように設計されている構築物を指す。感染時には、第２の鎖の細胞媒介合成を待つことなくｓｃＡＡＶの相補的な両半分が会合して、即時複製及び転写の準備が整った１つの二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）単位を形成することになる。例えば、Ｄ Ｍ ＭｃＣａｒｔｙ ｅｔ ａｌ，“Ｓｅｌｆ－ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ（ｓｃＡＡＶ）ｖｅｃｔｏｒｓ ｐｒｏｍｏｔｅ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ ｏｆ ＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，（Ａｕｇｕｓｔ ２００１），Ｖｏｌ ８，Ｎｕｍｂｅｒ １６，Ｐａｇｅｓ １２４８－１２５４を参照されたい。自己相補性ＡＡＶは、例えば、米国特許第６，５９６，５３５号、第７，１２５，７１７号及び第７，４５６，６８３号に記載されており、参照によりこれらの各々の全体を本明細書に援用する。

【0079】

対象への送達に適するＡＡＶウイルスベクターを生成及び単離する方法は当技術分野で知られている。例えば、米国公開特許出願第２００７／００３６７６０号（２００７年２月１５日）、米国特許第７７９０４４９号、米国特許第７２８２１９９号、ＷＯ２００３／０４２３９７、ＷＯ２００５／０３３３２１、ＷＯ２００６／１１０６８９、及びＵＳ７５８８７７２Ｂ２］を参照されたい。あるシステムにおいて、ＩＴＲに挟まれた導入遺伝子をコードする構築物ならびに、ｒｅｐ及びｃａｐをコードする構築物（複数可）を生産装置細胞株に一過的にトランスフェクトする。別のシステムにおいて、ｒｅｐ及びｃａｐを安定供給するパッケージング細胞株に、ＩＴＲに挟まれた導入遺伝子をコードする構築物をトランスフェクトする。これらのシステムの各々において、ＡＡＶビリオンはヘルパーアデノウイルスまたはヘルペスウイルスへの感染に応答して産生され、結果としてｒＡＡＶを汚染ウイルスから分離することが必要となる。より最近では、ＡＡＶを回収するのにヘルパーウイルスへの感染を必要としないシステムが開発された－必要とされるトランスのヘルパー機能（すなわち、アデノウイルスＥ１
Ｅ２ａ、ＶＡ及びＥ４、またはヘルペスウイルスＵＬ５、ＵＬ８、ＵＬ５２及びＵＬ２９、及びヘルペスウイルスポリメラーゼ）もトランスでシステムによって供給される。これ
らのより新しいシステムでは、必要とされるヘルパー機能をコードする構築物による細胞の一過的トランスフェクションによってヘルパー機能を供給することができ、または、転写もしくは転写後レベルで発現を制御されることができるヘルパー機能をコードする遺伝子を安定的に含有するように細胞を操作することができる。さらに別のシステムでは、バキュロウイルス系ベクターへの感染によって、ＩＴＲに挟まれた導入遺伝子、及びｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子を昆虫細胞内に導入する。これらの産生システムに関する総説については、例えば、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００９，“Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ－ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｈｙｂｒｉｄ ｆｏｒ ｌａｒｇｅ－ｓｃａｌｅ
ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，”Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２０：９２２－９２９を全体的に参照されたく、参照によりこれらの各々の内容全体を本明細書に援用する。これら及びその他のＡＡＶ産生システムは以下の米国特許にも記載されており、参照によりこれらの各々の内容全体を本明細書に援用する：第５，１３９，９４１号、第５，７４１，６８３号、第６，０５７，１５２号、第６，２０４，０５９号、第６，２６８，２１３号、第６，４９１，９０７号、第６，６６０，５１４号、第６，９５１，７５３号、第７，０９４，６０４号、第７，１７２，８９３号、第７，２０１，８９８号、第７，２２９，８２３号及び第７，４３９，０６５号。

【0080】

場合によって、本明細書に記載のｈＳＭＮ遺伝子を、ｒＡＡＶ以外のウイルスベクターを含めた他の送達システムの中に組み込む操作をしてもよい。そのような他のウイルスベクターには、用いられ得る遺伝子療法に適した任意のウイルス、例えば、限定しないが、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、ボカウイルスなどが含まれ得る。これら他ベクターのうちの１つを生み出す場合、増殖能欠損型ウイルスベクターとしてそれを生産することが好適である。

【0081】

特定の実施形態では、操作型ＡＡＶｈｕ６８．ＳＭＮベクターが提供される。一実施形態において、ｒＡＡＶｈｕ６８ＳＭＮのベクターゲノムは配列番号１５の配列を有する。別の実施形態では、ｒＡＡＶｈｕ６８ＳＭＮのベクターゲノムは配列番号２５の配列を有する。特定の実施形態では、「ｒＡＡＶｈｕ６８．ＳＭＮ１」及び「ｒＡＡＶｈｕ６８．ＳＭＮ」という用語は交換可能に使用される。

【0082】

ＩＩＩ．組成物及び用途
本明細書ではさらに医薬組成物も提供する。本明細書に記載の医薬組成物は、それを必要とする対象への任意の好適な経路または異なる経路の併用による送達のために設計される。

【0083】

これらの送達手段は、本明細書に記載のＡＡＶ構成物（複数可）を含有する懸濁液の直接的な全身送達を回避するように設計される。好適なこととして、これは、全身投与に比べて用量を低減する、毒性を低減する及び／または、ＡＡＶ及び／または導入遺伝子産物に対する望ましくない免疫応答を軽減する利点を有し得る。

【0084】

あるいは、他の投与経路（例えば、経口、吸入、鼻腔内、気管内、動脈内、眼内、静脈内、筋肉内及び他の非経口経路）を選択してもよい。

【0085】

場合によって、必要のある対象に免疫抑制共療法を用いてもよい。そのような共療法のための免疫抑制剤としては、限定されないが、グルココルチコイド、ステロイド、代謝拮抗薬、Ｔ細胞抑制薬、マクロライド（例えば、ラパマイシンまたはラパログ）、及び細胞増殖抑制剤、例えば、アルキル化剤、代謝拮抗薬、細胞毒性抗生物質、抗体、またはイムノフィリンへの活性を有する薬剤が挙げられる。免疫抑制剤は、ナイトロジェンマスタード、ニトロソウレア、白金化合物、メトトレキサート、アザチオプリン、メルカプトプリ
ン、フルオロウラシル、ダクチノマイシン、アントラサイクリン、マイトマイシンＣ、ブレオマイシン、ミトラマイシン、ＩＬ－２受容体指向性（ＣＤ２５指向性）もしくはＣＤ３指向性抗体、抗ＩＬ－２抗体、シクロスポリン、タクロリムス、シロリムス、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、オピオイド、またはＴＮＦ－α（腫瘍壊死因子－アルファ）結合剤を含むこともある。特定の実施形態では、免疫抑制療法は、遺伝子療法施与よりも０、１、２、３、４、５、６、７日またはそれより多い日数分だけ前または後に開始され得る。そのような免疫抑制療法は、１つ、２つまたはそれより多い薬物（例えば、グルココルチコイド、プレドニゾロン（ｐｒｅｄｎｅｌｉｓｏｎｅ）、ミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ）及び／またはシロリムス（すなわちラパマイシン））の投与を伴い得る。そのような免疫抑制剤は、必要のある対象に１回、２回またはより多い回数が同じ用量または調節された用量で投与され得る。そのような療法は、２つ以上の薬物（例えば、プレドニゾロン（ｐｒｅｄｎｅｌｉｓｏｎｅ）、ミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ）及び／またはシロリムス（すなわちラパマイシン））を同じ日に共投与することを伴い得る。これらの薬物のうちの１つ以上は同じ用量または調節された用量で遺伝子療法施与後も継続され得る。そのような療法は必要に応じて約１週間（７日間）、約６０日間、またはそれより長く行われ得る。特定の実施形態では、タクロリムスを含まない投薬計画を選択する。

【0086】

本明細書に記載のｒＡＡＶｈｕ６８．ｈＳＭＮベクターは、単一の組成物または複数の組成物の中に入った状態で投薬され得る。場合によっては２つ以上の異なるｒＡＡＶが送達され得る［例えば、ＷＯ２０１１／１２６８０８及びＷＯ２０１３／０４９４９３を参照のこと］。別の実施形態では、そのような複数のウイルスは異なる増殖能欠損型ウイルス（例えば、ＡＡＶ、アデノウイルス及び／またはレンチウイルス）を含有し得る。あるいは、送達は、例えばミセル、リポソーム、カチオン性脂質－核酸構成物、ポリグリカン構成物及びその他のポリマー、脂質系及び／またはコレステロール系核酸複合体、ならびに本明細書中に記載されているような他の構築物を含めた様々な送達構成物及び粒子に連結された非ウイルス構築物、例えば「裸のＤＮＡ」、「裸のプラスミドＤＮＡ」、ＲＮＡ及びｍＲＮＡによって媒介され得る。例えば、Ｘ．Ｓｕ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，２０１１，８（３），ｐｐ７７４－７８７；ウェブ公開：２０１１年３月２１日、ＷＯ２０１３／１８２６８３、ＷＯ２０１０／０５３５７２、及びＷＯ２０１２／１７０９３０を参照されたく、参照によりこれらのどれもが本明細書に援用される。そのような非ウイルス性のｈＳＭＮ送達構築物は、先に記載した経路によって投与され得る。ウイルスベクター、または非ウイルス性のＤＮＡもしくはＲＮＡ移入部分を、遺伝子移入及び遺伝子療法の用途に使用するための生理学的に許容できる担体と共に製剤化することができる。

【0087】

特定の実施形態では、保存及び／または対象への送達のための製剤化に先立ってｒＡＡＶｈｕ６８．ＳＭＡを、生産に関係したいかなる汚染物質からも精製する。多くの好適な精製方法が選択され得る。好適な精製方法の例は、例えば、２０１６年１２月９日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６５９７０号ならびにその優先権書類である２０１６年４月１３日に出願された米国特許出願第６２／３２２，０７１号及び「Ｓｃａｌａｂｌｅ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ＡＡＶ９」と題して２０１５年１２月１１日に出願された米国特許出願第６２／２２６，３５７号に記載されており、参照によりこれを本明細書に援用する。ＡＡＶ８の精製方法については、２０１６年１２月９日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６５９７６号ならびにその優先権書類である２０１６年４月１３日に出願された米国特許出願第６２／３２２，０９８号及び２０１５年１２月１１日に出願された米国特許出願第６２／２６６，３４１号に記載されており、ｒｈ１０については、２０１６年１２月９日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ１６／６６０１３号ならびにその優先権書類である２０１６年４月１３日に出願された米国特許出願第６２／３２２，０５５号及び「Ｓｃａｌａｂｌｅ
Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ＡＡＶｒｈ１０」と題しさらに２
０１５年１２月１１日に出願された米国特許出願第６２／２６６，３４７号に記載されており、ＡＡＶ１については、２０１６年１２月９日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６５９７４号ならびにその優先権書類である２０１６年４月１３日に出願された米国特許出願第６２／３２２，０８３号及び２０１５年１２月１１日に出願された「Ｓｃａｌａｂｌｅ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ＡＡＶ１」の米国特許出願第６２／２６，３５１号に記載されており、参照により全てを本明細書に援用する。

【0088】

本明細書に記載のｒＡＡＶｈｕ６８．ＳＭＮ１ベクターについては、製剤中に含まれている用量の測定単位としてゲノムコピー（「ＧＣ」）の定量が用いられ得る。当技術分野で知られている任意の方法を用いて本発明の増殖能欠損型ウイルス構成物のゲノムコピー（ＧＣ）数を決定することができる。ＡＡＶ ＧＣ数力価測定を実施する１つの方法は、以下のとおりである：精製ＡＡＶベクター試料をまずＤＮアーゼで処理して汚染宿主ＤＮＡを生産プロセスから除去する。その後、ＤＮアーゼ耐性粒子を熱処理に供してゲノムをカプシドから放出させる。その後、放出されたゲノムを、ウイルスゲノムの特異的領域（例えばポリＡシグナル）を指向するプライマー／プローブセットを使用するリアルタイムＰＣＲによって定量する。ゲノムコピーを決定するための別の好適な方法は、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）、詳しくは、最適化ｑＰＣＲまたは液滴デジタルＰＣＲ［編集前に２０１３年１２月１３日にオンライン公開されたＬｏｃｋ Ｍａｒｔｉｎ，ｅｔ ａｌ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ａｐｒｉｌ ２０１４，２５（２）：１１５－１２５．ｄｏｉ：１０．１０８９／ｈｇｔｂ．２０１３．１３１］である。あるいは、ＶｉｒｏＣｙｔ３１００を粒子定量またはフローサイトメトリーのために使用することができる。

【0089】

ｒＡＡＶｈｕ６８．ＳＭＮ１構成物は、（例えば約２．５ｋｇ～約７０ｋｇの体重を基準として）約１．０×１０^９ＧＣ～約９×１０^１５ＧＣの範囲内のあらゆる整数または分数量を含めて当該範囲内に入る量、好ましくは１．０×１０^１２～１．０×１０^１４ＧＣの範囲内に入る量のｒＡＡＶを含有する投薬量単位でヒト患者のために製剤化され得る。一実施形態では、構成物は、範囲内のあらゆる整数または分数量を含めて少なくとも１×１０^９、２×１０^９、３×１０^９、４×１０^９、５×１０^９、６×１０^９、７×１０^９、８×１０^９または９×１０^９ＧＣを１用量あたりに含有するように製剤化される。別の実施形態では、構成物は、範囲内のあらゆる整数または分数量を含めて少なくとも１×１０^１０、２×１０^１０、３×１０^１０、４×１０^１０、５×１０^１０、６×１０^１０、７×１０^１０、８×１０^１０または９×１０^１０ＧＣを１用量あたりに含有するように製剤化される。別の実施形態では、構成物は、範囲内のあらゆる整数または分数量を含めて少なくとも１×１０^１１、２×１０^１１、３×１０^１１、４×１０^１１、５×１０^１１、６×１０^１１、７×１０^１１、８×１０^１１または９×１０^１１ＧＣを１用量あたりに含有するように製剤化される。別の実施形態では、構成物は、範囲内のあらゆる整数または分数量を含めて少なくとも１×１０^１２、２×１０^１２、３×１０^１２、４×１０^１２、５×１０^１２、６×１０^１２、７×１０^１２、８×１０^１２または９×１０^１２ＧＣを１用量あたりに含有するように製剤化される。別の実施形態では、構成物は、範囲内のあらゆる整数または分数量を含めて少なくとも１×１０^１３、２×１０^１３、３×１０^１３、４×１０^１３、５×１０^１３、６×１０^１３、７×１０^１３、８×１０^１３または９×１０^１３ＧＣを１用量あたりに含有するように製剤化される。別の実施形態では、構成物は、範囲内のあらゆる整数または分数量を含めて少なくとも１×１０^１４、２×１０^１４、３×１０^１４、４×１０^１４、５×１０^１４、６×１０^１４、７×１０^１４、８×１０^１４または９×１０^１４ＧＣを１用量あたりに含有するように製剤化される。別の実施形態では、構成物は、範囲内のあらゆる整数または分数量を含めて少なくとも１×１０^１５、２×１０^１５、３×１０^１５、４×１０^１５、５×１０^１５、６×１０^１５、７×１０^１５、８×１０^１５または９×１０^１５ＧＣを１用量あたりに含有するように製剤化される。一
実施形態において、ヒトに適用する場合、用量の範囲は、範囲内のあらゆる整数または分数量を含めて１×１０^１０～約１×１０^１５ＧＣであり得る。

【0090】

特定の実施形態では、用量は約１×１０^９ＧＣ／ｇ脳質量～約１×１０^１２ＧＣ／ｇ脳質量の範囲内であり得る。特定の実施形態では、用量は約３×１０^１０ＧＣ／ｇ脳質量～約３×１０^１１ＧＣ／ｇ脳質量の範囲内であり得る。特定の実施形態では、用量は約５×１０^１０ＧＣ／ｇ脳質量～約１．８５×１０^１１ＧＣ／ｇ脳質量の範囲内であり得る。

【0091】

一実施形態では、ｒＡＡＶｈｕ６８．ＳＭＮ１は、少なくとも約１×１０^９ＧＣ～約１×１０^１５、または約１×１０^１１～５×１０^１３ＧＣの用量で送達され得る。これらの用量及び濃度を送達するのに適する体積は当業者によって決定され得る。例えば、約１μＬ～１５０ｍＬの体積が選択され得、成人に対しては高い方の体積が選択される。典型的には、新生児に適する体積は約０．５ｍＬ～約１０ｍＬであり、より高い年齢の乳児に対しては約０．５ｍＬ～約１５ｍＬが選択され得る。幼児に対しては約０．５ｍＬ～約２０ｍＬの体積が選択され得る。子供に対しては約３０ｍＬ以下の体積が選択され得る。プレティーン及びティーンエイジャーに対しては約５０ｍＬ以下の体積が選択され得る。さらに他の実施形態では、患者のクモ膜下腔内に約５ｍＬ～約１５ｍＬ、または約７．５ｍＬ～約１０ｍＬの体積の投与が与えられ得る。その他の好適な体積及び投薬量を決めてもよい。投薬量は、治療的利益と任意の副作用との釣り合いをとるように調節されることになり、そのような投薬量は、組換えベクターを採用する治療用途によって様々であり得る。

【0092】

上記ｒＡＡＶｈｕ６８．ＳＭＮ１は、公開されている方法に従って宿主細胞に送達され得る。特定の実施形態では、ヒト患者への投与のために、生理食塩水、界面活性剤、及び生理学的に適合する塩または塩の混合物を含有する水溶液の中にｒＡＡＶを懸濁させることが好適である。製剤は、生理学的に許容できるｐＨ、例えばｐＨ６～９またはｐＨ６．５～７．５、ｐＨ７．０～７．７またはｐＨ７．２～７．８の範囲に調節されていることが好適である。脳脊髄液のｐＨは約７．２８～約７．３２であることから、クモ膜下腔内送達のためにはこの範囲に入るｐＨが望まれ得る一方、静脈内送達のためには６．８～約７．２のｐＨが望まれ得る。しかしながら、最も広い範囲及びこれらの小範囲の中に入る他のｐＨを他の送達経路のために選択してもよい。

【0093】

好適な界面活性剤または界面活性剤の組み合わせは非毒性の非イオン性界面活性剤の中から選択され得る。一実施形態では、第一級ヒドロキシル基で終結している二官能性ブロックコポリマー界面活性剤、例えば、中性ｐＨを有しており平均分子量が８４００であるポロキサマー１８８としても知られるプルロニック（登録商標）Ｆ６８［ＢＡＳＦ］などが選択される。他の界面活性剤及び他のポロキサマー、すなわち、２つのポリオキシエチレン（ポリ（エチレンオキシド））の親水性鎖に挟まれた中央のポリオキシプロピレン（ポリ（プロピレンオキシド））の疎水性鎖からなる非イオン性トリブロックコポリマー、ＳＯＬＵＴＯＬ ＨＳ １５（Ｍａｃｒｏｇｏｌ－１５ヒドロキシステアレート）、ＬＡＢＲＡＳＯＬ（ポリオキシカプリル酸グリセリド）、ポリオキシ１０オレイルエーテル、ＴＷＥＥＮ（ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル）、エタノール及びポリエチレングリコールを選択してもよい。一実施形態では、製剤はポロキサマーを含有する。これらのコポリマーには共通して（ポロキサマーの）「Ｐ」の文字とそれに続く３つの数字で名前が付けられ、最初の２つの数字に１００を掛けるとポリオキシプロピレンコアのおおよその分子量が得られ、最後の数字に１０を掛けると百分率で表したポリオキシエチレン含有量が得られる。一実施形態ではポロキサマー１８８が選択される。界面活性剤は最大で懸濁液の約０．０００５％～約０．００１％の量で存在し得る。

【0094】

一例において、製剤は、例えば、塩化ナトリウム、重炭酸ナトリウム、デキストロース、硫酸マグネシウム（例えば、硫酸マグネシウム・７Ｈ_２Ｏ）、塩化カリウム、塩化カル
シウム（例えば、塩化カルシウム・２Ｈ_２Ｏ）、二塩基性リン酸ナトリウム及びそれらの混合物のうちの１つ以上を水中に含む緩衝生理食塩水溶液を含有し得る。クモ膜下腔内送達のためには浸透圧が、脳脊髄液に適合する範囲に入っていることが好適であり（例えば約２７５～約２９０）、例えば、ｅｍｅｄｉｃｉｎｅ．ｍｅｄｓｃａｐｅ．ｃｏｍ／－ａｒｔｉｃｌｅ／２０９３３１６－ｏｖｅｒｖｉｅｗを参照されたい。場合によっては、クモ膜下腔内送達のために市販の希釈剤を懸濁化剤として、または別の懸濁化剤及びその他の任意選択の賦形剤と組み合わせて使用してもよい。例えば、エリオットＢ（登録商標）溶液［Ｌｕｋａｒｅ Ｍｅｄｉｃａｌ］を参照されたい。各１０ｍＬのエリオットＢ溶液は、
塩化ナトリウム，ＵＳＰ ７３ｍｇ
重炭酸ナトリウム，ＵＳＰ １９ｍｇ
デキストロース，ＵＳＰ ８ｍｇ
硫酸マグネシウム・７Ｈ２Ｏ，ＵＳＰ ３ｍｇ
塩化カリウム，ＵＳＰ ３ｍｇ
塩化カルシウム・２Ｈ２Ｏ，ＵＳＰ ２ｍｇ
リン酸ナトリウム二塩基性・７Ｈ２Ｏ，ＵＳＰ ２ｍｇ
注射用水，ＵＳＰ 適量１０ｍＬ
を含有する。
電解質の濃度は、
ナトリウム １４９ｍＥｑ／リットル 重炭酸塩 ２２．６ｍＥｑ／リットル
カリウム ４．０ｍＥｑ／リットル 塩化物 １３２ｍＥｑ／リットル
カルシウム ２．７ｍＥｑ／リットル 硫酸塩 ２．４ｍＥｑ／リットル
マグネシウム ２．４ｍＥｑ／リットル リン酸塩 １．５ｍＥｑ／リットル
である。
原料の式及び分子量は次のとおりである。

【表3】

【0095】

エリオットＢ溶液のｐＨは６～７．５であり、浸透圧は１リットルあたり２８８ｍＯｓｍｏｌ（計算値）である。特定の実施形態では、ｒＡＡＶｈｕ６８．ＳＭＮ１遺伝子を含有する組成物を６．８～８、または７．２～７．８、または７．５～８の範囲のｐＨで送達する。クモ膜下腔内送達のためには、７．５より高いｐＨ、例えば、７．５～８、または７．８が望まれ得る。

【0096】

特定の実施形態では、製剤は、重炭酸ナトリウムを含んでいない緩衝生理食塩水溶液を含有し得る。そのような製剤は、リン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム及びそれらの混合物のうちの１つ以上を水中に含む緩衝
生理食塩水溶液、例えばハーバード緩衝液（Ｈａｒｖａｒｄ’ｓ ｂｕｆｆｅｒ）を含有し得る。水溶液はさらに、ＢＡＳＦから市販されており以前にＬｕｔｒｏｌ（登録商標）Ｆ６８の商標名で販売されていたポロキサマーであるＫｏｌｌｉｐｈｏｒ（登録商標）Ｐ１８８を含有し得る。水溶液のｐＨは７．２であり得る。

【0097】

別の実施形態では、製剤は、１ｍＭのリン酸ナトリウム（Ｎａ_３ＰＯ_４）、１５０ｍＭの塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、３ｍＭの塩化カリウム（ＫＣｌ）、１．４ｍＭの塩化カルシウム（ＣａＣｌ_２）、０．８ｍＭの塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ_２）及び０．００１％のＫｏｌｌｉｐｈｏｒ（登録商標）１８８を含む緩衝生理食塩水溶液を含有し得る。例えば、ｈａｒｖａｒｄａｐｐａｒａｔｕｓ．ｃｏｍ／ｈａｒｖａｒｄ－ａｐｐａｒａｔｕｓ－ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ－ｆｌｕｉｄ．ｈｔｍｌを参照されたい。特定の実施形態では、ハーバード緩衝液についてより良好なｐＨ安定性が認められることからハーバード緩衝液が好ましい。以下の表は、ハーバード緩衝液とエリオットＢ緩衝液との比較を示す。

【表4】

【0098】

他の実施形態では、製剤は、１つ以上の浸透促進剤を含有し得る。好適な浸透促進剤の例には、例えば、マンニトール、グリココール酸ナトリウム、タウロコール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、サリチル酸ナトリウム、カプリル酸ナトリウム、カプリン酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレン－９－ラウリルエーテル
、またはＥＤＴＡが含まれ得る。

【0099】

別の実施形態では、組成物は担体、希釈剤、賦形剤及び／または佐剤を含む。当業者であれば、移入ウイルスが対象としている適応症を考慮して好適な担体を容易に選択し得る。例えば、ある好適な担体は生理食塩水を含み、これは様々な緩衝溶液（例えばリン酸緩衝生理食塩水）と共に製剤化され得る。他の例示的な担体としては、無菌生理食塩水、ラクトース、スクロース、リン酸カルシウム、ゼラチン、デキストラン、寒天、ペクチン、ピーナッツ油、ゴマ油及び水が挙げられる。緩衝液／担体は、ｒＡＡＶが輸注管類に付着するのを防止するが生体内でのｒＡＡＶ結合活性を妨害しない成分を含むべきである。

【0100】

場合によって本発明の組成物は、ｒＡＡＶ及び担体（複数可）以外にも他の一般的な医薬原料、例えば保存剤または化学安定剤を含有し得る。好適な保存剤の例としては、クロロブタノール、ソルビン酸カリウム、ソルビン酸、二酸化硫黄、没食子酸プロピル、パラベン、エチルバニリン、グリセリン、フェノール及びパラクロロフェノールが挙げられる。好適な化学安定剤としてはゼラチン及びアルブミンが挙げられる。

【0101】

本発明に係る組成物は、上に定義したものなどの薬学的に許容できる担体を含み得る。本明細書に記載の組成物は、薬学的に適する担体の中に懸濁させた、及び／または注射、浸透ポンプ、クモ膜下腔内カテーテルによる対象への送達のためまたは別の装置もしくは経路による送達のために設計された好適な賦形剤と混合した、１つ以上のＡＡＶを有効量含むことが好適である。一例において、組成物は、クモ膜下腔内送達のために製剤化される。一実施形態において、クモ膜下腔内送達は、脊柱管内、例えばクモ膜下腔内への注射を包含する。

【0102】

本明細書に記載のウイルスベクターは、ｈＳＭＮをそれを必要とする対象（例えばヒト患者）に送達するための、機能性ＳＭＮを対象に供給するための、及び／または脊髄性筋萎縮症を治療するための医薬を調製する際に使用され得る。処置過程には同じウイルスベクター（例えばＡＡＶｈｕ６８ベクター）または異なるウイルスベクター（例えばＡＡＶｈｕ６８とＡＡＶｒｈ１０）の反復投与を伴うことが場合によってある。本明細書に記載のウイルスベクター及び非ウイルス性送達システムを使用するさらに他の組み合わせを選択してもよい。

【0103】

本明細書中で使用する場合、「クモ膜下腔内送達」または「クモ膜下腔内投与」という用語は、薬物が脳脊髄液（ＣＳＦ）に到達するようにそれを脊柱管内、より具体的にはクモ膜下腔内への注射によって投与する経路を指す。クモ膜下腔内送達は腰椎穿刺、脳室内（ｉｎｔｒａｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ）（脳室内（ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒｏｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ）（ＩＣＶ）を含む）、後頭下／脳槽内、及び／またはＣ１－２穿刺を含み得る。例えば、材料を腰椎穿刺によってクモ膜下腔全体にわたる拡散のために導入してもよい。別の例では大槽内に注射を行ってもよい。

【0104】

本明細書中で使用する場合、「大槽内送達」または「大槽内投与」という用語は、大槽小脳延髄槽の脳脊髄液の中に、より具体的には後頭下穿刺によって、または大槽内への直接注射によって、または永久配置された管を介して、薬物を直接投与する経路を指す。

【0105】

一実施形態では、送達は、本明細書に記載の装置を使用して実施され得る。

【0106】

ＩＶ．脳脊髄液中への医薬組成物の送達のための機器及び方法
一態様において、本明細書に提供するベクターは、この節において提供され実施例及び図７においてさらに説明される方法及び／または装置によってクモ膜下腔内に投与され得る。あるいは、他の装置及び方法を選択してもよい。方法は、患者の大槽の中へと脊椎穿
刺針を前進させるステップと、ある長さの可撓性管類を脊椎穿刺針の近位ハブに連結し、可撓性管類の近位端に弁の排出ポートを連結するステップと、上記前進及び連結ステップの後であって管類を患者の脳脊髄液で初回自給させた後に、ある量の等張溶液が入った第１容器を弁の洗浄入口ポートに連結し、その後、ある量の医薬組成物が入った第２容器を弁のベクター入口ポートに連結するステップとを含む。第１及び第２容器を弁に連結した後、ベクター入口ポートと弁の出口ポートとの間の流体流路を開き、医薬組成物を脊椎穿刺針に通して患者の中へと注入し、医薬組成物の注入後、洗浄入口ポートと弁の出口ポートとを通る流体流路を開き、等張溶液を脊椎穿刺針内へ注入して医薬組成物を患者の中に流し込む。

【0107】

別の態様では、医薬組成物の脳槽内送達のための装置が提供される。装置は、ある量の医薬組成物が入った第１容器、等張溶液が入った第２容器及び、装置から患者の大槽内の脳脊髄液中へと直接吐出され得る医薬組成物が通る脊椎穿刺針を含む。装置はさらに、第１容器に相互連結された第１入口ポートと、第２容器に相互連結された第２入口ポートと、脊椎穿刺針に相互連結された出口ポートと、脊髄穿刺針を通る医薬組成物及び等張溶液の流れを制御するためのルアーロックとを有する弁を含む。

【0108】

本明細書中で使用する場合、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）という用語は、軸に沿って作られた一連の平面断面画像からコンピュータによって身体構造の三次元画像を構築するＸ線撮影を指す。

【0109】

図７に示す機器または医療装置１０は、弁１６を介して相互連結した１つ以上の容器１２及び１４を備える。容器１２及び１４はそれぞれ、医薬組成物、薬物、ベクターまたは類似する物質の新鮮な供給源、及び生理食塩水などの等張溶液の新鮮な供給源を提供する。容器１２及び１４は、患者の中への流体の注入を可能にするいかなる形態であってもよい。

【0110】

例として、各容器１２及び１４は、シリンジ、カニューレまたは類似するものの形態で提供され得る。例えば、図示されている実施形態において容器１２は、ある量の医薬組成物が入った別個のシリンジとして提供されており、本明細書中では「ベクターシリンジ」と呼ばれる。単に例示のために記すが、容器１２には、医薬組成物または類似するものが約１０ｃｃ収容され得る。

【0111】

同様に、容器１４は、ある量の生理食塩水溶液が入った別個のシリンジ、カニューレまたは類似するものの形態で提供され得、「洗浄シリンジ」と呼ばれ得る。単に例示のために記すが、容器１４には約１０ｃｃの生理食塩水溶液が収容され得る。

【0112】

代わりに、容器１２及び１４をシリンジ以外の形態で提供してもよく、単一の装置の中に組み込んでもよく、例えば一体化医療用注射装置は一対の別々になったチャンバを有し、１つは医薬組成物のためのものであり、１つは生理食塩水溶液のためのものである。さらに、チャンバまたは容器の大きさは、流体の所望の量を収容する必要に応じて提供され得る。

【0113】

図示されている実施形態において、弁１６は、スイベル式オスルアーロック１８を有する四方活栓として提供されている。弁１６は、容器１２と容器１４と（すなわち、図示されている実施形態のベクターシリンジと洗浄シリンジと）を相互連結させ、スイベル式オスルアーロックは弁１６の中を通る通路を容器１２及び１４の各々に対して開閉することを可能にする。このようにして、弁１６の中を通る通路をベクターシリンジ及び洗浄シリンジに対して閉じてもよいし、またはベクターシリンジ及び洗浄シリンジのうち選択された１つに対して開いてもよい。四方活栓の代わりに弁は三方活栓であってもよいし、また
は流体制御装置であってもよい。

【0114】

図示されている実施形態において、弁１６は、延長管類２０または類似する流体用導管の長さの一端に連結されている。管類２０は、所望の長さまたは内部容積に基づいて選択され得る。単に例として記すが、管類の長さは約６～７インチであり得る。

【0115】

図示されている実施形態において、管類１２の反対側の端部２２はＴ字形コネクタ延長セット２４に連結されており、これが今度は脊髄穿刺針２６に連結されている。例として、針２６は、５インチ、２２または２５ゲージの脊椎穿刺針であり得る。さらに、任意選択で、脊椎穿刺針２６を誘導針２８、例えば３．５インチ、１８ゲージの誘導針に連結してもよい。

【0116】

使用時、脊椎穿刺針２６及び／または任意選択の誘導針２８を患者の中へ大槽に向かって前進させ得る。針を前進させた後、針２６及び／または２８ならびに関係する軟組織（例えば、傍脊柱筋、骨、脳幹及び脊髄）の可視化を可能にするコンピュータ断層撮影（ＣＴ）画像が取得され得る。針の正確な配置は針ハブ内の脳脊髄液（ＣＳＦ）の観察及び大槽内の針先端部の可視化によって確認される。その後、挿入された脊椎穿刺針２６に比較的短い延長管類２０が取り付けられ得、その後、管類２０の反対側の端部に四方活栓が取り付けられ得る。

【0117】

上記組立体を患者のＣＳＦで「初回自給」させる。その後、充填済み生理食塩水洗浄シリンジ１４を四方活栓１６の洗浄入口ポートに取り付け、その後、医薬組成物が入ったベクターシリンジ１２を四方活栓１６のベクター入口ポートに取り付ける。その後、活栓１６の排出ポートをベクターシリンジ１２に対して開き、ベクターシリンジの内容物は、弁１６及び組立済み機器を通り抜けて患者の中へとある期間を掛けてゆっくりと注入され得る。単に例示のために記すが、この期間はおよそ１～２分及び／またはその他の任意の所望の時間であり得る。

【0118】

ベクターシリンジ１２の内容物を注入した後、取り付けられている充填済み洗浄シリンジ１４を使用して活栓１６及び針組立体を所望の量の生理食塩水で洗浄することができるように活栓１６上のスイベル式ロック１８を第２位置まで回す。単なる例を記せば１～２ｃｃの生理食塩水が使用され得るが、より多いまたはより少ない量を必要に応じて用いてもよい。生理食塩水は、医薬組成物の全てまたはほとんどが組立済み装置を通り抜けて患者の中へと注入されるように促されその結果として医薬組成物が組立済み装置内にほとんどまたは全く残らないことを確保する。

【0119】

組立済み装置に生理食塩水を流した後、組立済み装置は針（複数可）、延長管類、活栓及びシリンジを含むその全体がゆっくりと対象から取り外されてバイオハザード廃棄物用の入れ物または（例えば針（複数可）のための）硬質容器の中への破棄のために外科用トレイ上に置かれる。

【0120】

最終的に脳槽内（ＩＣ）手技に至り得るスクリーニングプロセスは、研究責任者によって引き受けられ得る。研究責任者は、対象（または指名された介護人）に十分な情報を与えるべくプロセス、手技、投与手順自体、及び起こり得るあらゆる安全性リスクについて説明し得る。医療歴、併用薬、身体検査、バイタルサイン、心電図（ＥＣＧ）、及び実験室検査結果が得られ、または実施され、そしてＩＣ手技のための対象の適格性のスクリーニング評価のために神経放射線科医、神経外科医及び麻酔専門医に提供される。

【0121】

適格性を再検討する十分な時間を可能にするために、第１スクリーニング訪問から試験訪問の１週間前までの任意の時に以下の手順が実施され得る。例えば、「０日目」には、
ガドリニウム（すなわち、ｅＧＦＲ＞３０ｍＬ／分／１／７３ｍ２）を伴うかまたは伴わずに頭部／頚部磁気共鳴画像（ＭＲＩ）が取得され得る。頭部／頚部ＭＲＩに加えて研究者は屈曲／伸張試験によって頚部に関する将来の何らかの評価の必要性を判断し得る。ＭＲＩプロトコールは、Ｔ１、Ｔ２、ＤＴＩ、ＦＬＡＩＲ及びＣＩＮＥプロトコール画像を含み得る。

【0122】

さらに、ＣＳＦ流の十分な評価、及びあり得るＣＳＦ空間同士の連通の遮断または欠如の同定を可能にする頭部／頚部ＭＲＡ／ ＭＲＶが、施設プロトコールに従って取得され得る（つまり、硬膜内／経硬膜手術歴を有する対象は除外され得るかまたはさらなる検査（例えば放射性ヌクレオチド脳槽造影）が必要とされ得る）。

【0123】

神経放射線科医、神経外科医及び麻酔専門医は、利用可能なあらゆる情報（スキャン、医療歴、身体検査、研究など）に基づいてＩＣ手技に対する各対象の適格性を最終的に議論及び判断する。ＭＰＳ対象の特別な生理学的必要性を念頭に置いて、「－２８日目」～「１日目」まで、気道、（短い／厚い）頚部、及び頭部可動域（頚部屈曲の度合い）の詳細な評価を提供する麻酔の術前評価も取得され得る。

【0124】

ＩＣ手技に先立って、ＣＴ室に以下の装備及び医薬が存在することを確認することになる：別個の薬事マニュアルに従って作製されＣＴ／手術室（ＯＲ）に搬入される、成人用腰椎穿刺（ＬＰ）キット（施設によって供給される）；ＢＤ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）２２または２５ゲージ×３～７インチ脊椎穿刺針（Ｑｕｉｎｃｋｅ ｂｅｖｅｌ）；介入施与者の裁量で（脊椎穿刺針の導入のために）使用される共軸誘導針；スイベル（スピン）式オスルアーロックを備えた四方小孔活栓；メスルアーロックアダプタを備えた長さおよそ６．７インチのＴ字形コネクタ延長セット（管類）；クモ膜下腔内投与のためのＯｍｎｉｐａｑｕｅ１８０；静脈内（ＩＶ）投与のためのヨウ素化造影剤；（成人用ＬＰキットに備わっていない場合の）注射用１％リドカイン溶液；充填済み１０ｃｃ生理食塩水（無菌）洗浄シリンジ；放射線不透過性マーカー（複数可）；外科準備用装備／剃毛用カミソリ；挿管される対象の適切な配置を可能にする枕／支持台；気管内挿管用装備、全身麻酔機及び機械式人工呼吸器；術中神経生理学的モニタリング（ＩＯＮＭ）装備（及び必要な人員）；ならびにベクター入り１０ｃｃシリンジ。

【0125】

手技のためのインフォームドコンセントを確認し、医療記録及び／または研究ファイルに載録する。放射線科及び麻酔学従事者による手技についての別個の同意を施設の要件に従って取得する。対象は、施設ガイドラインに従って適切な病院介護室内で静脈内へのアクセスが配備される（例えば、２つのＩＶアクセス部位）。静脈内用流体は麻酔専門医の裁量で投与される。麻酔専門医の裁量で、及び施設ガイドラインに従って、適切な患者介護室、待機場または外科／ＣＴ手技室の中で一般的な麻酔の施与と共に気管内挿管が対象に導入及び施与され得る。

【0126】

腰椎穿刺を実施して、まず５ｃｃの脳脊髄液（ＣＳＦ）を除去し、次いで、大槽の可視化に役立つ造影剤（Ｏｍｎｉｐａｑｕｅ １８０）をクモ膜下腔内に注射する。大槽内への造影剤の拡散を促進するために適切な対象配置操作が実施され得る。

【0127】

術中神経生理学的モニタリング（ＩＯＮＭ）装備を対象に取り付ける。対象をＣＴスキャナ台上に腹臥位または側臥位で配置する。搬送中及び配置中の対象の安全性を保障するためには適任の従事者が存在していなければならない。適切とみなされる場合には対象を、配置後に正常な神経モニタリング信号が記録され術前評価中に安全であると判断される程度に頚部屈曲をもたらすように配置してもよい。

【0128】

以下の従事者の存在が確認され得、現場で識別され得る：手技を実施する介入施与者／
神経外科医；麻酔専門医及び呼吸器専門技術者（複数可）；看護師及び医師助手；ＣＴ（またはＯＲ）技術者；神経生理学専門技術者；及び現場取りまとめ役。正確な対象、手順、部位、配置、及び室内で必要となる全ての装備の存在を確認するための「タイムアウト」が合同審査会／院内プロトコールに従って完遂され得る。その後、先導現場研究者は従事者と共に、彼／彼女が対象の準備を進めてもよいことを確認し得る。

【0129】

対象の頭蓋骨より下の皮膚を適切に剃毛する。標的位置を突き止め脈管構造を撮像する必要があると介入施与者によってみなされる場合には、ＣＴスカウト像を実施し、続いて、ＩＶ用造影剤によるＣＴを計画する前手順を実施する。標的部位（大槽）が特定され針軌道が計画された後、施設ガイドラインに従って無菌技術を用いて皮膚の準備を整え覆布を掛ける。介入施与者が指示するとおりに放射線不透過性マーカーを標的皮膚位置に配置する。マーカーの下の皮膚に、１％リドカインの浸潤によって麻酔を掛ける。その後、共軸誘導針を場合によって使用して２２Ｇまたは２５Ｇの脊椎穿刺針を大槽に向かって前進させる。

【0130】

針前進後、施設装備を使用して実現可能な最も薄いＣＴスライス厚み（理想的には２．５ｍｍ以下）を用いてＣＴ画像を取得する。針及び関係する軟組織（例えば、傍脊柱筋、骨、脳幹及び脊髄）の十分な可視化の余地がある可能な最低放射線線量を用いて連続ＣＴ画像を取得する。針の正確な配置は、針ハブ内のＣＳＦの観察及び大槽内の針先端部の可視化によって確認される。

【0131】

介入施与者は、ベクターシリンジが無菌場の近くにではあるがその外側に配置されていることを確認する。ベクターシリンジ内の医薬組成物の取扱いまたは投与に先立ってグローブ、マスク及び目保護が無菌場内での手技を手伝う従事者によってなされる。

【0132】

挿入された脊椎穿刺針に延長管類を取り付け、次いでそれに四方活栓を取り付ける。機器が対象のＣＳＦで「初回自給」された時点で１０ｃｃ予備充填生理食塩水洗浄シリンジを四方活栓の洗浄入口ポートに取り付ける。その後、ベクターシリンジが介入施与者に提供され、四方活栓のベクター入口ポートに取り付けられる。

【0133】

活栓のスイベル式ロックを第１位置に配置することによって活栓の出口ポートをベクターシリンジに対して開いた後、注入中にシリンジのプランジャに過度の力が印加されないように配慮しながらベクターシリンジの内容物をゆっくりと（およそ１～２分掛けて）注入する。ベクターシリンジの内容物が注入された後、取り付けられている充填済み洗浄シリンジを使用して１～２ｃｃの生理食塩水で活栓及び針組立体を洗浄することができるように活栓のスイベル式ロックを第２位置まで回す。

【0134】

準備が整うと介入施与者は次に従事者に彼／彼女が機器を対象から除去することを通告する。１回の動作で針、延長管類、活栓及びシリンジを対象からゆっくりと取り外し、バイオハザード廃棄物用の入れ物または（例えば針（複数可）のための）硬質容器の中への破棄のために外科用トレイ上に置く。

【0135】

針挿入部位に出血またはＣＳＦ漏出の兆候がないかを調べ、研究者に指示されたとおりに処置する。ガーゼ、外科用テープ及び／またはテガダーム被覆材を指示されるとおりに使用して部位を保護する。その後、対象をＣＴスキャナから移動させて担架に載せる。搬送中及び配置中の対象の安全性を保障するために適任の従事者が存在する。

【0136】

麻酔を中止し、対象を麻酔後介護についての以下の施設ガイドラインのために介護する。神経監視装置を対象から取り外す。回復の間、対象が横たわっている担架の頭側はわずかに（おおよそ３０度）高くするべきである。施設ガイドラインに従って対象を好適な麻
酔後介護室へ搬送する。対象は、意識が十分に回復して安定な状態になった後、プロトコールが定める評価のための適切な階／部屋に受け入れられることになる。神経学的評価はプロトコールに従って見守られることになり、主任研究者は病院及び研究の従事者と協力して対象の介護を監督する。

【0137】

一実施形態では、本明細書において提供される組成物を送達する方法は、患者の大槽の中へと脊椎穿刺針を前進させるステップと、ある長さの可撓性管類を脊椎穿刺針の近位ハブに連結し、可撓性管類の近位端に弁の排出ポートを連結するステップと、上記前進及び連結ステップの後であって管類を患者の脳脊髄液で初回自給させた後に、ある量の等張溶液が入った第１容器を弁の洗浄入口ポートに連結し、その後、ある量の医薬組成物が入った第２容器を弁のベクター入口ポートに連結するステップと、上記第１及び第２容器を弁に連結した後、ベクター入口ポートと弁の出口ポートとの間の流体流路を開き、医薬組成物を脊椎穿刺針に通して患者の中へと注入するステップと、医薬組成物の注入後、洗浄入口ポートと弁の出口ポートとを通る流体流路を開き、等張溶液を脊椎穿刺針内へ注入して医薬組成物を患者の中に流し込むステップとを含む。特定の実施形態では、方法はさらに、管類及び弁を脊椎穿刺針のハブに連結する前に脊椎穿刺針の遠位先端部の大槽内での適切な配置を確認することを含む。特定の実施形態では、確認ステップは、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）を行うことによって大槽内の脊椎穿刺針の遠位先端部を可視化することを含む。特定の実施形態では、確認ステップは、脊椎穿刺針のハブ内での患者の脳脊髄液の存在を観察することを含む。

【0138】

上記方法において、弁は、スイベルで第１位置まで回転してベクター入口ポートから出口ポートへの流れを可能にすると同時に洗浄入口ポートを通る流れを遮断すること、及びスイベルで第２位置まで回転して洗浄入口ポートから出口ポートへの流れを可能にすると同時にベクター入口ポートを通る流れを遮断することに適合したスイベル式ルアーロックを備えた活栓であり得、スイベル式ルアーロックは、上記医薬組成物を患者に注射するときには上記第１位置に配置され、上記医薬組成物を等張溶液で上記患者の中に流し込んでいるときには上記第２位置に配置される。特定の実施形態では、等張溶液を脊椎穿刺針の中に注入して医薬組成物を患者の中に流し込んだ後、脊椎穿刺針をそれが組立体として管類、弁ならびに第１及び第２容器に連結されている状態で患者から引き抜く。特定の実施形態では、弁は、スイベル式オスルアーロックを備えた四方活栓である。特定の実施形態では、第１及び第２容器は別個のシリンジである。特定の実施形態では、Ｔ字形コネクタは、脊椎穿刺針のハブに配置され、管類と脊椎穿刺針とを相互連結させる。場合によって脊椎穿刺針は脊椎穿刺針の遠位端に誘導針を含む。脊椎穿刺針は５インチ、２２または２４ゲージの脊椎穿刺針であり得る。特定の実施形態では、誘導針は３．５インチ、１８ゲージの誘導針である。

【0139】

特定の態様では、方法は、最低でも、ある量の医薬組成物を収容するための第１容器；等張溶液を収容するための第２容器；医薬組成物が装置から直接患者の大槽内の脳脊髄液中へと吐出され得るときに通る脊椎穿刺針；ならびに第１容器に相互連結された第１入口ポートと、第２容器に相互連結された第２入口ポートと、脊椎穿刺針に相互連結された出口ポートと、脊髄穿刺針を通る医薬組成物及び等張溶液の流れを制御するためのルアーロックとを有する弁からなる装置を利用する。特定の実施形態では、弁は、スイベルで第１位置まで回転して第１入口ポートから出口ポートへの流れを可能にすると同時に第２入口ポートを通る流れを遮断すること、及びスイベルで第２位置まで回転して第２入口ポートから出口ポートへの流れを可能にすると同時に第１入口ポートを通る流れを遮断することに適合したスイベル式ルアーロックを備えた活栓である。場合によって、弁は、スイベル式オスルアーロックを備えた四方活栓である。特定の実施形態では、第１及び第２容器は別個のシリンジである。特定の実施形態では、脊椎穿刺針は、ある長さの可撓性管類を介して弁に相互連結される。Ｔ字形コネクタは管類と脊椎穿刺針とを相互連結させ得る。特
定の実施形態では、脊椎穿刺針は５インチ、２２または２４ゲージの脊椎穿刺針であり得る。特定の実施形態では、装置はさらに、脊椎穿刺針の遠位端に連結された誘導針を含む。場合によって誘導針は３．５インチ、１８ゲージの誘導針である。

【0140】

この方法及びこの装置は各々場合によって、本明細書において提供される組成物のクモ膜下腔内送達のために用いられ得る。あるいは、他の方法及び装置をそのようなクモ膜下腔内送達のために用いてもよい。

【0141】

一実施形態では、本明細書において提供されるＡＡＶｈｕ６８．ＳＭＡの単回用量を、遺伝学的に確認される５ｑＳＭＡ及び／または３型ＳＭＡの臨床履歴を有する成人（少なくとも１８歳（１８歳以上）の年齢）に投与する。他の実施形態では、患者がより若くてもよい（例えば、１２～１８歳、６～１２歳、３～６歳、１８ヶ月～３歳、６ヶ月～１８ヶ月、新生児）。患者は歩行不可能であってもよいし、または歩行可能であってもよい。投薬はＩＣＭ（大槽内）注射による単回用量のベクターによって行われ得る。一実施形態において、用量は、約３×１０^１３ＧＣから高用量の１×１０^１４ＧＣまでの範囲である。但し、他の好適な範囲は本明細書において提供されている。有効性評価は、運動神経評価、例えば、６分間歩行試験（６ＭＷＴ）、１０メートル歩行時間、ＲＵＬＭスコア、４段階段昇り、ナインホールペグテスト；肺機能試験、例えば、努力性肺活量（ＦＶＣ）、最大呼気圧（ＭＥＰ）及び最大吸気圧（ＭＩＰ）；呼吸機能の測定量、ＰｅｄｓＱＬ（倦怠感尺度）、ＳＭＡ－ＦＲＳ（機能評価尺度）、電気生理学、例えば、神経伝導検査、ＣＭＡＰ（例えば、尺骨及び腓骨のＣＭＡＰ振幅）、及び知覚検査のうちの１つ以上を含み得、ＣＳＦ中のＳＭＮタンパク質の濃度及び他の診査上のバイオマーカーが評価されることになる。

【0142】

一実施形態では、適切な濃度のベクターが入ったシリンジを使用する。ベクター投与前に腰椎穿刺を実施して所定体積のＣＳＦを抜き取り、その後、大槽の関連解剖学的構造の可視化に役立てるためにヨウ素化造影剤をクモ膜下腔内（ＩＣ）に注射する。クモ膜下腔内用造影剤の代わりに静脈内（ＩＶ）用造影剤を針の挿入前または挿入中に投与してもよい。ＩＶ用造影剤を使用するのかＩＣ用造影剤を使用するのかについての判断は介入施与者の裁量に委ねられる。患者は麻酔を掛けられ、挿管され、手技台上に配置される。術中神経生理学的モニタリング（ＩＯＮＭ）装備を参加者に取り付ける。無菌技術を用いて注射部位の準備を整え覆布を掛ける。脊椎穿刺針（２２～２５Ｇ）をＸ線透視による誘導の下で大槽内へと前進させる。針配置を支援するためにより大きい誘導針を使用する。針配置の確認の後、脊椎穿刺針に延長セットを取り付け、患者のＣＳＦで満たされるようにする。介入施与者の裁量により、造影剤材料が入ったシリンジが延長セットに連結され得、大槽内における針の配置を確認するために少量が注入され得る。ＣＴ誘導による＋／－造影剤注入によって針配置を確認した後、ベクターが入ったシリンジ（例えば５．６ｍＬ）を延長セットに連結する。シリンジ内容物を１～２分掛けてゆっくりと注入して約５ｍＬの体積を送達する。針を患者からゆっくりと取り出す。

【0143】

本明細書中で使用する場合、「対象」は、哺乳動物、例えば、ヒト、マウス、ラット、モルモット、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタまたは非ヒト霊長類、例えば、サル、チンパンジー、ヒヒもしくはゴリラである。一実施形態において、対象は、ＳＭＡを有するヒト患者である。

【0144】

国際ＳＭＡ協会分類は、ＳＭＡ表現型の重症度のいくつかの度合いを発症年齢及び運動発達マイルストーンに応じて定義している。ＳＭＡ０は、出生前発症及び重度関節拘縮、両側顔面神経麻痺ならびに呼吸不全を表すために提案される呼称である。Ｉ型ＳＭＡであるウェルドニッヒ・ホフマンＩ病は、出生から６ヶ月以内に発症する最重度の生後形態である。患者は、起立することができず、重篤な呼吸不全を有する。ＩＩ型ＳＭＡは、最初
の２年以内に発症する中間形態であり、子供は起立はできるが歩行はできない。臨床経過は変化しやすい。ＩＩＩ型（クーゲルベルグ・ウェランダー病とも呼ぶ）は２歳よりも後に始まり、大抵は慢性的発展をする。子供は少なくとも幼年期には介護なしで起立及び歩行ができる。成人形態（ＩＶ型）は最軽度であり、３０歳よりも後に発症し、症例が報告されたことはほとんどなく、その有病率は正確には知られていない。

【0145】

ある場合においては、ＳＭＡは妊娠３０～３６週目あたりの胎児において検出される。この状況では、分娩後に新生児を可能な限り早く治療することが望ましい。子宮内で胎児を治療することが望ましいこともある。かくして、ＳＭＡを有する新生仔対象を救済及び／または治療する方法であって、ｈＳＮＭ１遺伝子を新生対象（例えば、ヒト患者）の神経細胞に送達するステップを含む、当該方法が提供される。ＳＭＡを有する胎仔を救済及び／または治療する方法であって、ｈＳＭＮ遺伝子を子宮内で胎仔の神経細胞に送達するステップを含む、当該方法が提供される。一実施形態において、遺伝子は、本明細書に記載の組成物の中に入った状態でクモ膜下腔内注射によって送達される。この方法は、本明細書に記載のコドン最適化ｈＳＭＮであろうと、天然ｈＳＭＮであろうと、「野生型」タンパク質に比べて増強された活性を有するｈＳＭＮ対立遺伝子であろうと、またはそれらの組み合わせであろうと、機能性ｈＳＭＮタンパク質をコードするいかなる核酸配列を利用するものであってもよい。一実施形態では、子宮内での処置は、胎仔におけるＳＭＡを検出した後に本明細書に記載のｈＳＭＮ構築物を投与することとして定義される。例えば、Ｄａｖｉｄ ｅｔ ａｌ，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｎ ｕｔｅｒｏ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｇｉｖｅｓ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｔｒａｎｓｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｓｈｅｅｐ，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２０１１ Ａｐｒ；２２（４）：４１９－２６．ｄｏｉ：１０．１０８９／ｈｕｍ．２０１０．００７．Ｅｐｕｂ ２０１１ Ｆｅｂ ２を参照されたく、参照によりこれを本明細書に援用する。

【0146】

一実施形態において、新生仔治療は、分娩から８時間以内、最初の１２時間以内、最初の２４時間以内または最初の４８時間以内に本明細書に記載のｈＳＭＮ構築物が投与されることとして定義される。別の実施形態では、とりわけ霊長類（ヒトまたは非ヒト）において、新生仔への送達は約１２時間～約１週間、２週間、３週間もしくは約１ヶ月の期間以内、または約２４時間後～約４８時間後である。別の実施形態では、遅発型ＳＭＡの場合、症候の発症後に組成物を送達する。一実施形態において、患者の処置（例えば、最初の注射）は、１歳になる前に開始される。特定の実施形態では、例えば乳児に関して、構築物は例えば１歳になった後に再投与される。場合によっては１回より多い再投与が許容される。そのような再投与は、同じタイプのベクター、異なるウイルスベクター、または本明細書に記載の非ウイルス送達を使用して行われ得る。別の実施形態では、処置を最初の１歳になった後または２～３歳になった後、５歳になった後、１１歳になった後、またはより高い年齢の時に開始する。

【0147】

本発明によれば、本明細書に記載のＡＡＶ．ｈＳＭＮの「治療有効量」は、所望の転帰、すなわちＳＭＡまたはその１つ以上の症候の治療をもたらすために送達される。他の望まれる転帰としては、筋力低下の軽減、筋力及び筋緊張の増加、側弯症の防止もしくは軽減、または呼吸器健康の維持もしくは増進、または振戦もしくは単収縮の軽減が挙げられる。他の望まれる評価項目は医師によって決定され得る。

【0148】

特定の実施形態では、本明細書において提供されるＡＡＶ．ｈＳＭＮを含有する組成物の治療有効性は、以下のパラメータの１つ以上によって評価され得る。そのようなスコアは、５２週目、またはより長いもしくはより短い間隔、例えば８週、１２週、３６週、４８週もしくはそれらの間の時間でのものであり得る。投薬から所定時間後におけるＲＵＬＭスコアをベースラインスコアと比較する。運動機能は、歩行可能な対象における６ＭＷ
Ｔ試験及び１０メートル歩行時間によって測定され得る。運動機能をナインホールペグテスト（歩行可能及び歩行不可能な場合）及び４段階段昇り試験（歩行可能な場合のみ）によって測定してもよい。肺機能は、努力性肺活量（ＦＶＣ）、最大呼気圧（ＭＥＰ）、最大吸気圧（ＭＩＰ）によって測定され得る。尺骨及び腓骨のＣＭＡＰ振幅のベースラインからの変化を評価してもよい。ＰｅｄＱＬ Ｖｅｒｓｉｏｎ３．０ 多次元倦怠感尺度，成人用レポートモジュールを評価してもよい。ＳＭＡ－ＦＲＳ（機能評価尺度）を評価してもよい。ＤＮＡ中のベクター及び他のＡＡＶに基づく薬物成分のＣＳＦ、血清及び尿における薬理動態を測定してもよい。

【0149】

本明細書中で使用する場合、６ＭＷＴとは、歩行可能な対象が６ＭＷＴにおいて踏破した可能な距離の測定量のことである。６ＭＷＴは、屋内に配設された長く人通りの少ない真っ直ぐな廊下で実施されることになる。３０メートルの距離は両端が橙色のコーンで標示されることになる。開始線は明るい色のテープで標示されることになる。

【0150】

ＲＵＬＭ：上肢モジュール改訂版は、対象によって選択される片方の上肢で実施される２０種の運動課題からなる。各課題における成績は評価者によって０～２の等級で評価される。

【0151】

ナインホールペグテスト：９－ＨＰＴは、上肢機能に関する手短で標準化された定量的試験である。利き手及び利き手でない方の両方の手を２回試験する。対象は、９本のピンが入った小さい浅型容器と、９つの穴が空いた木製またはプラスチック製の角材とを備えたテーブルの席に着く。ストップウォッチを開始する時の開始の命令で対象は可能な限り速く９本のピンを１本ずつ拾ってそれらを９つの穴に入れ、一旦それらが穴に入ったならばそれらを再び可能な限り速く１本ずつ取り除いてそれらを浅型容器の中へ戻す。課題を完遂するまでの合計時間を記録する。利き手による２回の連続試行に続いてすぐに、利き手でない方の手による２回の連続試行を行う。９－ＨＰＴのスコアは４回の試行の平均である。各手での２回の試行を平均し、各手についての平均時間の逆数に変換し、その後、２つの逆数を平均する。

【0152】

１０メートル歩行時間：１０メートル歩行時間は、１０メートルを歩行するのに要する時間の測定量である。試験は、屋内に配設された長く人通りの少ない真っ直ぐな廊下で実施されることになる。１０メートルの距離は両端が橙色のコーンで標示されることになる。開始線は明るい色のテープで標示されることになる。

【0153】

４段階段昇り：４段階段昇り試験評価は、対象が階段を４段昇降するのに要する時間を評価する。課題は、対象が安全に課題を完遂することができることを確保する訓練された評価者によって実施されることになる。階段は１６～２０ｃｍの蹴上げ、及び手摺りを有していなければならない。対象は、可能な限り速く安全に昇降するように指示される。課題を完遂するのに要した時間と、手摺りを使用する必要との両方が記録されることになる。

【0154】

電気生理学試験は運動単位の機能を評価するために実施する。ＣＭＡＰ：尺骨神経の運動神経状態試験は右腕に対して優先的に実施することになるが、但し、この肢の試験を回避すべきやむを得ない理由（例えば、病前の神経損傷の重なり）がある場合は別である。これには、神経に電流を供給すること及び筋肉の運動応答を記録することを伴う。この応答は、複合筋活動電位と呼ばれる。ＣＭＡＰの高さ及び面積（振幅及びＡＵＣ）が両方とも測定され得る。

【0155】

機能及び倦怠感評価尺度は次のとおりである：
ＰｅｄｓＱＬ倦怠感尺度，成人用レポート：ＰｅｄｓＱＬ多次元倦怠感尺度は、全身
倦怠感（６項目）、睡眠及び休息（６項目）ならびに認知的倦怠感（６項目）を評価する１８項目の質問票である。
ＳＭＡ－ＦＲＳ：ＳＭＡ－ＦＲＳは、日常生活の約１０個の活動態様に基づいて簡単に実施される序数的評価尺度である。対象または介護士は最高スコアを５０として各サブセットを０（完全に依存的）から５（完全に非依存的）まで採点する。

【0156】

一実施形態において、患者に対する一連の評価は以下の順序で実施される：ＰｅｄｓＱＬ（倦怠感尺度）、ＳＭＡ－ＦＲＳ（機能評価尺度）、６ＭＷＴ、１５分休憩（最小）、ＲＵＬＭ、ナインホールペグテスト、１０メートル歩行、１５分休憩（最小）、４段階段昇り、ＰＦＴ^＊、ならびに尺骨及び腓骨のＣＭＡＰ^＊。^＊は任意の順序で実施され得る。患者が安全に実施することができない試験は省略されることになる。

【0157】

治療前にＳＭＡ患者は、ｈＳＭＮ－１遺伝子を送達するために使用するｒＡＡＶベクターのカプシドに対する中和抗体（Ｎａｂ）について評価され得る。そのようなＮａｂは形質導入効率に干渉し得、治療有効性を低下させ得る。ベースライン血清Ｎａｂ力価が≦１：５～≦１：２０または≦１：２．５～≦１：１０であるＳＭＡ患者はｒＡＡＶ．ｈＳＭＮ１遺伝子療法プロトコールによる治療の良好な候補者である。血清Ｎａｂの力価が＞１：５であるＳＭＡ患者の治療は、併用療法、例えば、ｒＡＡＶ．ｈＳＭＮベクター送達による処置の前及び／または間での免疫抑制剤による一時的共処置を必要とする場合がある。場合によっては、ＡＡＶベクターカプシド及び／または製剤のその他の成分に対する中和抗体の評価を伴わずして免疫抑制共療法を予防手段として用いてもよい。特定の実施形態では、予備免疫抑制療法は、特にＳＭＮ活性レベルを事実上有さず導入遺伝子産物が「異物」とみなされ得る患者において、ｈＳＭＮ導入遺伝子産物に対する潜在的な有害免疫反応を防止する上で望ましい場合がある。

【0158】

そのような共療法のための免疫抑制剤としては、限定されないが、グルココルチコイド、ステロイド、代謝拮抗薬、Ｔ細胞阻害薬、マクロライド（例えばラパマイシンまたはラパログ）、及び細胞増殖抑制剤、例えば、アルキル化剤、代謝拮抗薬、細胞毒性抗生物質、抗体、またはイムノフィリンへの活性を有する薬剤が挙げられる。免疫抑制剤は、ナイトロジェンマスタード、ニトロソウレア、白金化合物、メトトレキサート、アザチオプリン、メルカプトプリン、フルオロウラシル、ダクチノマイシン、アントラサイクリン、マイトマイシンＣ、ブレオマイシン、ミトラマイシン、ＩＬ－２受容体指向性（ＣＤ２５指向性）もしくはＣＤ３指向性抗体、抗ＩＬ－２抗体、シクロスポリン、タクロリムス、シロリムス、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、オピオイド、またはＴＮＦ－α（腫瘍壊死因子－アルファ）結合剤を含むこともある。特定の実施形態では、免疫抑制療法は、遺伝子療法施与よりも前に開始され得る。そのような療法は、同じ日に２つまたはそれより多い薬物（例えば、プレドニゾロン（ｐｒｅｄｎｅｌｉｓｏｎｅ）、ミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ）及び／またはシロリムス（すなわちラパマイシン））を共投与することを伴い得る。これらの薬物のうちの１つ以上は同じ用量または調節された用量で遺伝子療法施与後も継続され得る。そのような療法は必要に応じて約１週間、約１５日間、約３０日間、約４５日間、６０日間、またはそれより長く行われ得る。特定の実施形態では、本明細書に記載のｒＡＡＶｈｕ６８．ＳＭＡ遺伝子療法を受けている患者は、ヌシネルセンによる前処置を受けた者である。他の実施形態では、患者は、ヌシネルセンによる継続的処置を受け、遺伝子療法後にそのようなヌシネルセン処置の必要性の低下または消失について追跡評価される。ｒＡＡＶｈｕ６８．ＳＭＡを受けている患者は、他の療法、限定されないが例えば、ピリドスチグミン［ＵＭＣ Ｕｌｔｒｅｃｈｔ］、ＲＯ７０３４０６７［Ｈｏｆｆｍａｎ－ＬａＲｏｃｈｅ］、セレコキシブ、ＣＫ－２１２７１０７［Ａｓｔｅｌｌａｓ
Ｐｈａｒｍａ］を受けてもよい。特定の実施形態では、ｒＡＡＶｈｕ６８．ＳＭＡの有効性をそのような共療法の頻度及び／または用量の減少によって測定する。特定の実施形態では、ＡＡＶｈｕ６８－ＳＭＮ１療法は、長持ちはするものの、選択された患者に望ま
れる程高い矯正をもたらさないことがあり、それゆえ早くもＡＡＶｈｕ６８－ＳＭＮ１処置の６ヶ月後にヌシネルセン（スピンラザ（商標））への転換が望まれることがあることから、患者へのヌシネルセン（スピンラザ（商標））の投与を２つの薬剤の共投与とみなすことができよう。ＳＭＡに対する現在の標準的医療についての議論を提供しているＷａｎｇ ｅｔ ａｌ，Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ Ｓｔａｔｅｍｅｎｔ ｆｏｒ Ｓｔａｎｄａｒｄ ｏｆ Ｃａｒｅ ｉｎ Ｓｐｉｎａｌ Ｍｕｓｃｕｌａｒ Ａｔｒｏｐｙ、及びｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｏｏｋｓ／ＮＢＫ１３５２／も参照されたい。

【0159】

例えば、ＳＭＡにおいて栄養が懸念事項である場合、胃瘻チューブを設置することが適切である。呼吸機能が悪化するときは気管切開または非侵襲的呼吸支援が提案される。睡眠を障害する呼吸は、夜間に持続的気道陽圧を用いることによって処置され得る。ＳＭＡ
ＩＩ及びＳＭＡ ＩＩＩを有する個人の側弯症のための手術は、努力性肺活量が３０％～４０％より大きい場合に安全に行われ得る。電動車椅子及びその他の装備は生活の質を向上させ得る。米国特許第８２１１６３１号も参照されたく、参照によりこれを本明細書に援用する。

【0160】

「ａ」または「ａｎ」という用語が１つ以上を指すことに留意されたい。したがって、「ａ」（または「ａｎ」）、「１つ以上」及び「少なくとも１つ」という用語は本明細書中で交換可能に使用される。

【0161】

「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」及び「含んでいる」という語は、排他的にではなく包括的に解釈されるべきである。「からなる」、「からなっている」という語及びその変化形は、包括的にではなく排他的に解釈されるべきである。明細書中の様々な実施形態が「含んでいる」表現を用いて表されているが、他の状況の下では関係する実施形態が「からなる」または「から本質的になる」表現を用いて解釈及び説明されることも意図される。

【0162】

本明細書中で使用する場合、「約」という用語は、特に指定がない限り、所与の基準からの１０％（±１０％）の変動を意味する。

【0163】

本明細書中で使用する場合、「疾患」、「障害」及び「症状」は、対象の異常な状態を指して交換可能に使用される。

【0164】

「発現」という用語は、本明細書中ではその最も広い意味で使用され、ＲＮＡの産生、またはＲＮＡとタンパク質との産生を含む。ＲＮＡに関して「発現」または「翻訳」という用語は、詳しくは、ペプチドまたはタンパク質の産生に関する。発現は一過的である場合もあるし、または安定的である場合もある。

【0165】

「翻訳」という用語は、ｍＲＮＡ鎖がアミノ酸配列の組立を制御してタンパク質またはペプチドを生成する、リボソームにおけるプロセスに関する。

【0166】

本明細書中で特に定義していない限り、本明細書中で使用する科学技術用語は、当業者によって、及び本願で使用する用語の多くに対する一般的手引きを当業者に提供するものである公開文を参照することによって通常理解されるのと同じ意味を有する。

【0167】

以下の実施例は例示に過ぎず、本発明を限定することは意図されない。

【実施例】

【0168】

実施例１－新規クレードＦ ＡＡＶ － ＡＡＶｈｕ６８
以下の改変を伴ってＱＩＡａｍｐカラム（Ｑｉａｇｅｎ）を製造者の推奨に従って使用してヒト組織試料からＰＣＲ鋳型としての組織ＤＮＡを抽出した。Ｇａｏ，ｅｔ ａｌ［Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，２００２ Ｓｅｐ ３，９９（１８）：１１８５４－１１８５９（電子公開２００２年８月２１日）］によって記載されているようにＱ５ＤＮＡポリメラーゼ（Ｑ５（登録商標）Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ２Ｘ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ，ＮＥＢ）を、試料中の潜在的ＡＡＶの完全長ＶＰ１遺伝子を回収するその高い忠実度及び堅牢な効率ゆえに選択し、以下のとおりに改変されたプライマー組を使用した：ＡＶ１ＮＳの代わりにプライマーｐｒｍ５０４［ＧＣＴＧＣＧＴＣＡＡＣＴＧＧＡＣＣＡＡＴＧＡＧＡＡＣ、配列番号２３］を使用し、逆方向プライマーＡＶ２ＣＡＳの代わりにｐｒｍ５０５［ＣＧＣＡＧＡＧＡＣＣＡＡＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＡＡＡＣＧＡ、配列番号２４］を使用した。ＰＣＲ条件を以下のとおりに改変した。

【表5】

ＰＣＲプログラム

【表6】

【0169】

ＰＣＲからの約３ｋｂのバンドをゲルから切り出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してＤＮＡを抽出し、Ｚｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ（登録商標）ＴＯＰＯ（登録商標）ＰＣＲクローニングキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にクローニングした。プラスミドを配列決定してＡＡＶ ＶＰ１遺伝子の完全長を得た。試料の大部分について少なくとも３つのプラスミドが完全に配列決定され、その試料の最終ＡＡＶ配列としての共通配列が導き出された。

【0170】

取得した、ＡＡＶｈｕ６８のｖｐ１カプシドタンパク質をコードする核酸配列を配列番号７に示す。図８Ｂ～Ｄも参照されたい。ＡＡＶｈｕ６８のｖｐ１アミノ酸配列を図８Ａ及び配列番号８に示す。ＡＡＶ９、ＡＡＶｈｕ３１及びＡＡＶｈｕ３２と比較してＡＡＶｈｕ６８では２つの突然変異（Ａ６７Ｅ及びＡ１５７Ｖ）が必須であると同定された（図８Ａ中に丸で囲って示す）。

【0171】

その後、パッケージング効率、収率及び形質導入特性を評価するために、ｐＡＡＶ２／９主鎖のＡＡＶ９ ＶＰ１遺伝子の場所にｈｕ６８のＶＰ１遺伝子を搭載することによってｐＡＡＶ２／ｈｕ６８トランスプラスミドを作った。ｐＡＡＶ２／９プラスミドは、カプシド遺伝子を挟んでＡＡＶ２の５’及び３’ＩＴＲを含有し、Ｐｅｎｎ Ｖｅｃｔｏｒ
Ｃｏｒｅ［Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ，Ｐｈｉｌａ，Ｐ
Ａ ＵＳ，ｐｅｎｎｖｅｃｔｏｒｃｏｒｅ．ｍｅｄ．ｕｐｅｎｎ．ｅｄｕ］から入手することができる。

【0172】

実施例２－ＡＡＶｈｕ６８ベクター
ＧＦＰ及びＬａｃＺなどの様々なタグを保有しているＡＡＶｈｕ６８及びＡＡＶ９ベクターを生成及び評価した。Ｇａｏ ｅｔ ａｌ［Ｇａｏ，Ｇｕａｎｇ－Ｐｉｎｇ，ｅｔ ａｌ．“Ｎｏｖｅｌ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓｅｓ ｆｒｏｍ ｒｈｅｓｕｓ ｍｏｎｋｅｙｓ ａｓ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｈｕｍａｎ ｇｅｎｅ
ｔｈｅｒａｐｙ．”Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ９９．１８（２００２）：１１８５４－１１８５９］によって記載されているように２９３細胞において三重トランスフェクション技術を用いてベクターの各々を生成した。

【0173】

１．ｐＡＡＶｈｕ６８トランスプラスミドの生産
ｖｐ１カプシドタンパク質をコードする核酸配列を配列番号７に示す。

【0174】

パッケージング効率、収率及び形質導入特性を評価するために、ｐＡＡＶ２／９主鎖のＡＡＶ９ ＶＰ１遺伝子の場所にｈｕ６８のＶＰ１遺伝子を搭載することによってｐＡＡＶ２／ｈｕ６８トランスプラスミドを作った。ｐＡＡＶ２／９プラスミドは、カプシド遺伝子を挟んでＡＡＶ２の５’及び３’ＩＴＲを含有し、Ｐｅｎｎ Ｖｅｃｔｏｒ Ｃｏｒｅ［Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ，Ｐｈｉｌａ，ＰＡ ＵＳ，ｐｅｎｎｖｅｃｔｏｒｃｏｒｅ．ｍｅｄ．ｕｐｅｎｎ．ｅｄｕ］から入手することができる。

【0175】

２．ＡＡＶｈｕ６８ベクターの収率
１０％のウシ胎仔血清を補充し４．５ｇ／Ｌのグルコース、Ｌ－グルタミン及びピルビン酸ナトリウムを含む１ＸのＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）中で２９３細胞を５％のＣＯ_２の雰囲気下、３７℃で培養及び維持した。トランスフェクションは、ベクタープラスミドをｐＡＡＶ２／ｈｕ６８またはｐＡＡＶ２／９で置き換えてＧａｏ ｅｔ ａｌ［Ｇａｏ，Ｇｕａｎｇ－Ｐｉｎｇ，ｅｔ ａｌ．“Ｎｏｖｅｌ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓｅｓ ｆｒｏｍ ｒｈｅｓｕｓ ｍｏｎｋｅｙｓ ａｓ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｈｕｍａｎ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ．”Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ９９．１８（２００２）：１１８５４－１１８５９］によって記載されているように実施された。利用した導入遺伝子カセットはＣＢ７．ＣＩ．ｆｆＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ．ＲＢＧであった。トランスフェクトした細胞をさらに６ウェルプレートで培養した。Ｇａｏ ｅｔ ａｌ［Ｇａｏ，Ｇｕａｎｇｐｉｎｇ，ｅｔ ａｌ．“Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ ｂｙ ｃｏｌｕｍｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ａｎｄ ｉｔｓ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｉｎ ｖｉｖｏ．”Ｈｕｍａｎ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ １１．１５（２０００）：２０７９－２０９１．］に記載されているように導入遺伝子カセットのウサギベータ－グロビンポリＡ領域を標的とするプローブ及びプライマーを使用することによるＴａｑＭａｎ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）分析によってウイルス定量を行うために、細胞の全溶解物及び上清を回収した。上清の力価と全溶解物の力価との両方に関して６つのｐＡＡＶ２／９プラスミド及び６つのｐＡＡＶ２／ｈｕ．６８プラスミドの収率を６ウェルプレートで直接比較した。各プラスミドは個々の細菌コロニーから得たものであった。

【0176】

全溶解物に関してＡＡＶｈｕ６８の収率は、ＡＡＶ９のそれと類似していることが分かった。しかしながら、上清ではＡＡＶｈｕ６８の収率がＡＡＶ９のそれよりも有意に高か
った。したがって、生産の観点からＡＡＶｈｕ６８はＡＡＶ９に比べてより良好なベクターであることが実証された、というのも、大規模ウイルス生産には上清が好まれるからである。

【0177】

３．ＡＡＶｈｕ６８．ＬａｃＺの生体内形質導入
導入遺伝子として核局在性細菌β－ガラクトシダーゼ（ｎＬａｃＺ）をコードする配列を挿入することによってＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ｎＬａｃＺ（ＡＡＶｈｕ６８．ＬａｃＺとも呼ぶ）を生成し、その後、上記のように生産した。パッケージング効率、収率、形質導入特性、形質導入効率、及びＡＡＶｈｕ６８の生体内での向性を評価するために、様々な投与方法、例えば、静脈内、筋肉内及び鼻腔内投与によってマウスに５×１０^１１ゲノムコピーのＡＡＶｈｕ６８．ＬａｃＺベクターを注入した。ベクター投与から２週間後にマウスを屠殺した後、筋肉、肺、肝臓及び心臓を採取した。各臓器の凍結切片を作製し、加工し、ＬａｃＺ遺伝子発現を検出する従来のプロトコールとして分析した［Ｂｅｌｌ，Ｐｅｔｅｒ，ｅｔ ａｌ．“Ａｎ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｅ．ｃｏｌｉ β－ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ ｉｎ ｌｕｎｇ ｔｉｓｓｕｅ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ．”Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ ｃｅｌｌ ｂｉｏｌｏｇｙ １２４．１（２００５）：７７－８５．］。これらの結果から、ＡＡＶｈｕ６８が高い形質導入効率及び広い組織／臓器向性を実証したことが明らかになった。

【0178】

４．ＡＡＶ９．ＧＦＰと比較されるＡＡＶｈｕ６８．ＧＦＰの生体内形質導入
導入遺伝子として緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする遺伝子を挿入することによってＡＡＶｈｕ６８．ＧＦＰ及びＡＡＶ９．ＧＦＰを生成し、その後、上記のように生産した。パッケージング効率、収率、形質導入特性、形質導入効率、及びＡＡＶｈｕ６８及びＡＡＶ９の生体内での向性を評価するために、マウスに１×１０^１０ＧＣまたは１×１０^１１ＧＣの用量でＡＡＶｈｕ６８．ＧＦＰまたはＡＡＶ９．ＧＦＰを投与した。ベクターを脳室内に投与されたマウスの様々な脳領域（海馬、運動野及び小脳）からの切片を調査した。１×１０^１０ＧＣのＡＡＶ９．ＧＦＰを注射されたマウスからのものを除いて、試験した全ての海馬試料においてＡＡＶベクターの形質導入が認められた。運動野では、ＡＡＶｈｕ６８．ＧＦＰの形質導入がＡＡＶ９のそれよりも良好であることが認められた。さらに、小脳におけるＡＡＶｈｕ６８．ＧＦＰの形質導入は、マウスに１×１０^１１ＧＣのベクターを注射した場合にのみ認められた。これらのマウスでは、ＡＡＶｈｕ６８はＡＡＶ９に比べてより高い形質導入効率及びより広い向性を脳において呈した。

【0179】

さらなる実験では、ＡＡＶｈｕ６８．ＧＦＰを静脈内に投与されたマウスからの様々な臓器、例えば、肝臓、腎臓、心臓及び膵臓を準備し、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ［Ｗａｎｇ Ｌ，Ｃａｌｃｅｄｏ Ｒ，Ｂｅｌｌ Ｐ，Ｌｉｎ Ｊ，Ｇｒａｎｔ ＲＬ，Ｓｉｅｇｅｌ
ＤＬ，Ｗｉｌｓｏｎ ＪＭ，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２０１１ Ｎｏｖ；２２（１１）：１３８９－４０１、Ｗａｎｇ Ｌ，Ｃａｌｃｅｄｏ Ｒ，Ｗａｎｇ Ｈ，Ｂｅｌｌ Ｐ，Ｇｒａｎｔ Ｒ，Ｖａｎｄｅｎｂｅｒｇｈｅ ＬＨ，Ｓａｎｍｉｇｕｅｌ Ｊ，Ｍｏｒｉｚｏｎｏ Ｈ，Ｂａｔｓｈａｗ ＭＬ，Ｗｉｌｓｏｎ ＪＭ，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１０ Ｊａｎ；１８（１）：１２６－３４］によって記載されているように加工した。肝臓では強い陽性信号が観察されたが、腎臓、心臓及び膵臓はベクターの形質導入も示し、ＡＡＶｈｕ６８ベクターの広い組織／臓器向性が示された。

【0180】

実施例３－ｈＳＭＮを含有するＡＡＶベクター
ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＳＭＮ１ｃｏ．ＲＢＧは外部の構成要素と内部のＤＮＡゲノムとからなる。外部ベクター構成要素は、およそ１：１：８～１０の比でＶＰ１とＶＰ２とＶＰ３との３つのＡＡＶウイルスタンパク質の６０コピーからなる血清型ｈｕ６８、Ｔ＝１の二十面体カプシドである。カプシドは、２つのＡＡＶ末端逆位反復配列（
ＩＴＲ）に挟まれたヒト運動神経細胞生存１（ｈＳＭＮ１）導入遺伝子からなる一本鎖ＤＮＡゲノムを含有する。エンハンサー、プロモーター、イントロン、ｈＳＭＮ１コード配列及びポリアデニル化（ポリＡ）シグナルがヒトＳＭＮ１導入遺伝子を構成している。ＩＴＲは、ベクター生産中にゲノムの複製及びパッケージングを担う遺伝要素であり、ｒＡＡＶを生成するのに必要とされる唯一のウイルスシスエレメントである。ｈＳＭＮコード配列の発現は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）即時早期エンハンサー（Ｃ４）とニワトリベータアクチンプロモーターとのハイブリッドであるＣＢ７プロモーターによって促される。このプロモーターからの転写はニワトリベータアクチンイントロン（ＣＩ）の存在によって増進される。ｈＳＭＮ１ ｍＲＮＡ転写産物の終結を媒介するためにウサギベータグロビンポリＡシグナルが含められる。ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＳＭＮ１ｃｏ．ＲＢＧベクターゲノムの模式図を図１Ａに示す。

【0181】

配列エレメントの説明：
１．末端逆位反復配列（ＩＴＲ）：ＡＡＶ ＩＴＲ（ＧｅｎＢａｎｋ＃ＮＣ００１４０１）は、両端が同一であるが反対向きになっている配列である。ＡＡＶ及びアデノウイルスヘルパー機能がトランスで提供されるのに対し、ＡＡＶ２ ＩＴＲ配列はベクターＤＮＡ複製起点としてもベクターゲノムのパッケージングシグナルとしても機能する。このように、ＩＴＲ配列はベクターゲノムの複製及びパッケージングに必要とされる唯一のシス配列に相当する。
２．ＣＭＶ即時早期エンハンサー（３８２ｂｐ、ＧｅｎＢａｎｋ＃Ｋ０３１０４．１）。
３．ニワトリβ－アクチンプロモーター（２８２ｂｐ、ＧｅｎＢａｎｋ＃Ｘ００１８２．１）は、プロモーターであり、高レベルのヒト運動神経細胞生存１（ｈＳＭＮ１）発現を促すために使用される。
４．ニワトリβ－アクチンイントロン：ニワトリβ－アクチン遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ＃Ｘ００１８２．１）からの９７３ｂｐのイントロンはベクター発現カセット内に存在する。イントロンは転写されるが、スプライシングによって成熟ｍＲＮＡから除去され、結果としてその両側にある配列がまとめ合わされる。発現カセットにおけるイントロンの存在は、核から細胞質へのｍＲＮＡの輸送を容易にしてそれゆえに翻訳のためのｍＲＮＡの定常レベルの蓄積を増進することが示された。これは、遺伝子発現のレベルを向上させるために意図される遺伝子ベクターの一般的特徴である。
５．コード配列：ヒトＳＭＮ１配列（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｕｃｃｏｒｅ／ＮＭ＿０００３４４．３）はコドン最適化及び合成された（ＵＰｅｎｎ）。脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）は、テロメア側にある遺伝子である運動神経細胞生存１（ＳＭＮ１）における突然変異によって引き起こされる。ＳＭＮ１における突然変異は下位運動ニューロンに対する選択的毒性を生じさせ、結果として進行性のニューロン喪失及び関連する筋肉の筋力低下及び変性を招く。本発明者らが使用する導入遺伝子はＳＭＮ１のアイソフォームＤである。アイソフォームＤは最長のアイソフォームをコードし、この変異型は、ＣＮＳにおいてだけでなく遍在的にもＳＭＮ１によって産生する主たる転写産物／アイソフォームであると考えられる。
６．ポリアデニル化シグナル：１２７ｂｐのウサギβ－グロビンポリアデニル化シグナル（ＧｅｎＢａｎｋ＃Ｖ００８８２．１）は、抗体ｍＲＮＡの効率的なポリアデニル化のためのシス配列を提供する。このエレメントは、転写終結、新生転写産物の３’端部における特異的切断事象、及び長鎖ポリアデニル尾部の追加のためのシグナルとして機能する。

【0182】

［Ｍｉｚｕｋａｍｉ，Ｈｉｒｏａｋｉ，ｅｔ ａｌ．Ａ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｆｏｒ ＡＡＶ ｖｅｃｔｏｒ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｄｉｓｓ．Ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ ＭｏｌｅｃｕｌａｒＭｅｄｉｃｉｎｅ，１９９８．］に記載されている
ように２９３細胞において従来の三重トランスフェクション技術を用いてベクターを作製した。全てのベクターは、以前に教示されているようにペンシルバニア大学のＶｅｃｔｏｒ Ｃｏｒｅによって生産された［Ｌｏｃｋ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ，２１：１２５９－１２７１（２０１０）］。

【0183】

ＡＡＶベクターのゲノムコピー（ＧＣ）力価を決定するために、以前（Ｌｏｃｋ，Ｍａｒｔｉｎ，ｅｔ ａｌ．“Ａｂｓｏｌｕｔｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ ａｎｄ ｓｅｌｆ－ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ ｇｅｎｏｍｅ ｔｉｔｅｒｓ
ｂｙ ｄｒｏｐｌｅｔ ｄｉｇｉｔａｌ ＰＣＲ．”Ｈｕｍａｎ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｍｅｔｈｏｄｓ ２５．２（２０１３）：１１５－１２５）に教示されているようにデジタル液滴ポリメラーゼ連鎖反応（ｄｄＰＣＲ）に基づく技術を実施した。方法は実用的であり、ｑＰＣＲと同等またはそれより良好な力価を報告し、プラスミド標準曲線を必要としない。利用したアッセイは、ＤＮアーゼＩによる消化と、それに続くカプセル化ベクターゲノムコピーを測定するためのデジタルＰＣＲ分析とを含むものであった。ＤＮＡ検出は、ポリＡ領域を標的とする配列特異的なプライマー、及びこれと同じ領域にハイブリダイズする蛍光標識プローブを併用して成し遂げられた。

【0184】

実施例４－ＳＭＡのモデルの中のＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＳＭＮ．ＲＢＧ
全ての動物について手順はペンシルバニア大学の動物実験委員会（ＩＡＣＵＣ）によって承認されたプロトコールに従って実施した。全てのマウスはペンシルバニア大学のトランスレーショナル研究所の動物施設で飼った。

【0185】

マウスの中にはヒトＳＭＮ１（ｈＳＭＮ１）と等価な１つのＳＭＮ遺伝子が存在している。この遺伝子の完全喪失は胚致死的な表現型をもたらす（Ｍｏｎａｎｉ ＵＲ，Ｓｅｎｄｔｎｅｒ Ｍ，Ｃｏｏｖｅｒｔ ＤＤ ｅｔ ａｌ）。ヒトのセントロメア側にある運動神経細胞生存遺伝子（ＳＭＮ２）は、Ｓｍｎ（－／－）マウスの胚致死性を救済し、脊髄性筋萎縮症を有するマウスをもたらす。Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ ２０００；９：３３３－９、Ｓｃｈｒａｎｋ Ｂ，Ｇｏｔｚ Ｒ，Ｇｕｎｎｅｒｓｅｎ ＪＭ ｅｔ ａｌ．Ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｍｏｔｏｒ ｎｅｕｒｏｎ ｇｅｎｅ，ａ ｃａｎｄｉｄａｔｅ ｇｅｎｅ ｆｏｒ ｈｕｍａｎ ｓｐｉｎａｌ ｍｕｓｃｕｌａｒ ａｔｒｏｐｈｙ，ｌｅａｄｓ ｔｏ ｍａｓｓｉｖｅ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ｉｎ ｅａｒｌｙ ｍｏｕｓｅ ｅｍｂｒｙｏｓ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ
Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １９９７；９４：９９２０－５）。治療薬を評価するために最も一般的に使用されるＳＭＡの前臨床モデルの１つは、ＳＭＮΔ７マウスモデルである。ＳＭＮΔ７マウスモデルは、ＦＶＢ背景において開発され、２コピーのヒトＳＭＮ２（ｈＳＭＮ２）と、エクソン７を除去された２コピーのｈＳＭＮ２とを有する遺伝子導入マウス（ＳＭＮΔ７）である。野生型（ＷＴ）ＳＭＮΔ７マウスは２コピーのマウスＳＭＮ（ｍＳＭＮ）を内包し、ヘテロ接合体（ＨＥＴ）マウスは１コピーのｍＳＭＮを有し、ノックアウト（ＫＯ）ＳＭＮΔ７マウスにはｍＳＭＮがない。ＫＯ ＳＭＮΔ７マウスは平均寿命が１３～１５日であり、脊髄における運動ニューロン数の減少、筋線維径の減少、体重減少、立直り及び歩行の悪化、ならびに神経分布が部分的であるかまたは全くない筋接合部の数の増加を呈する。ＳＭＮΔ７マウスモデルの主要な利点は、治療介入が疾患減弱に影響を与えているか否かを速やかに判別するのに十分な重度の表現型を呈しながらも、およそ５日の平均寿命を有する重度ＳＭＡモデルに比べて治療機会が増加することである。Ｌｅ ＴＴ，Ｐｈａｍ ＬＴ，Ｂｕｔｃｈｂａｃｈ ＭＥ ｅｔ ａｌ．ＳＭＮＤｅｌｔａ７，ｔｈｅ ｍａｊｏｒ ｐｒｏｄｕｃｔ ｏｆ ｔｈｅ ｃｅｎｔｒｏｍｅｒｉｃ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｍｏｔｏｒ ｎｅｕｒｏｎ（ＳＭＮ２） ｇｅｎｅ，ｅｘｔｅｎｄｓ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｉｎ ｍｉｃｅ ｗｉｔｈ ｓｐｉｎａｌ ｍｕｓｃｕｌａｒ ａｔｒｏｐｈｙ ａｎｄ ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ｗｉｔｈ ｆｕｌｌ－ｌｅｎｇｔ
ｈ ＳＭＮ．Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ ２００５；１４：８４５－５７を参照されたい。

【0186】

実施例４では、ｍＳＭＮ－／－ｈＳＭＮ２＋／＋ＳＭＮΔ７＋／＋（ＫＯ ＳＭＮΔ７、以下の実施例ではＳＭＮΔ７とも記される）マウスを利用した。ＳＭＮについての免疫組織化学によって、ＳＭＮΔ７仔が皮質、小脳及び脊髄においてＳＭＮ１の発現を呈しなかったことが実証された（図２）。ＳＭＮΔ７仔、野生型及びヘテロ接合体の同腹仔は出生時の３×１０^１０ＧＣのＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＳＭＮ１．ＲＢＧベクターの注射から２３日後にＳＭＮの発現の増加が認められた。投与は左側脳室内への脳室内注射によって実施した。

【0187】

試験ベクターのウイルス形質導入をさらに、ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＳＭＮ１ｃｏ．ＲＢＧ処置動物の皮質の中のコドン最適化ｈＳＭＮ１リボ核酸（ＲＮＡ）のｉｎ－ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）によって評価した。野生型及びＳＭＮΔ７動物を対照として提供した。図２の下パネルに示す結果は、試験用量での高い形質導入率を実証している。

【0188】

免疫組織化学によって運動ニューロン形質導入の百分率を決定する分析を実施する。脳及び脊髄の両方からのホモジネートのＳＭＮ発現を検出するためにウェスタンブロットによるさらなる分析を実施する。

【0189】

実施例５－ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＳＭＮ１．ＲＢＧはＳＭＡの齧歯動物モデルの生存率を向上させる
新生ｍＳＭＮ１^－／－ｈＳＭＮ２^＋／＋ＳＭＮΔ７^＋／＋（ＳＭＮΔ７）、ヘテロ接合体同腹仔（ＨＥＴ）及び野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ（ＷＴ）仔においてＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＳＭＮ１．ＲＢＧの脳室内注射の有効性を評価した。試験マウスの左側脳室の中に３×１０^１０ＧＣか８．７６×１０^１０ＧＣかのどちらかのＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＳＭＮ１ｃｏ．ＲＢＧの単回の脳室内（ＩＣＶ）注射を生後２４時間以内にリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）と共に与えた。ＰＢＳを注射した仔を対照として役立てた（図３Ａ）。マウスを毎日監視した。安楽死基準（前回の体重測定からの２０％の体重減少、または指の壊死）を満たすかまたは離乳前の死亡が認められたいかなるマウスについても遺伝子型判定を行い、また、離乳まで生存した全てのマウスについて遺伝子型判定を行った。

【0190】

２ヶ月の観察期間中、ＰＢＳを注射した野生型、ヘテロ接合体仔と、ベクターを注射したヘテロ接合体仔とでは生存率が類似しており、ベクターまたは投与経路に関して毒性がないことが示された（図３Ａ）。ＰＢＳ処置ＷＴ動物と、３×１０^１０ＧＣか約９×１０^１０ＧＣかのどちらかのＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＳＭＮ１ｃｏ．ＲＢＧで処置したＷＴマウスとの間に立直り反射の有意差は認められなかった（図３Ａ）。ＰＢＳのみを注射したＳＭＮΔ７仔（ｎ＝８）の生存期間中央値は１５日であった。他方、低い方の用量のベクター（３×１０^１０ＧＣ／１．５ｇ仔）で処置したところ、生存期間中央値は有意に３７日にまで増加した（ｎ＝７）。ベクターの用量を仔１匹あたり８．７６×１０^１０ＧＣに上げた場合（ｎ＝１０）生存期間中央値は２３日であった（図３Ｂ）。この結果は、出生時におけるどちらの用量のＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＳＭＮ１．ＲＢＧの脳室内注射も毒性の検出が最小限でありながらＳＭＮΔ７仔の生存期間を好結果に改善したことを示した。

【0191】

実施例６－ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＳＭＮ１．ＲＢＧはＳＭＡの齧歯動物モデルの成長を促進する
生後日数（ＰＮＤ）３日目から開始してマウスが安楽死基準を満たすかまたは死亡が認
められるまでマウスの体重測定を２日ごとに行い、結果を図４Ａにプロットした。全ての時間点にわたる変数の全体的変化をどの２群間においても比較した。

【0192】

低用量及び高用量の両方のＰＢＳまたはベクターで処置した野生型及びヘテロ接合体仔は類似した成長曲線を示し、ベクターまたは投与経路に関して毒性がないことが示された。ＰＢＳで処置したＳＭＮΔ７仔は進行性の体重減少及び１５日の生存期間中央値を呈した。他方、ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＳＭＮ１ｃｏ．ＲＢＧベクターを注射した場合、仔の体重は生後ゆっくりではあるが着実に増加した。生後日数１５日目（Ｐ１５）では、３つ全ての群からの野生型仔は体重が同程度であったが、ベクターで救済したＳＭＮΔ７仔はＰＢＳのみの群よりも有意に重かった（図４Ｂ）。生後日数３０日目（Ｐ３０）では、ＳＭＮΔ７仔及び野生型／ヘテロ接合体同腹仔はどちらも、ベクター処置の高用量と低用量との間には体重の差異がないことを実証した（図４Ｃ）。

【0193】

「ｎｌｍｅ」パッケージ内の機能「ｌｍｅ」を使用するＲプログラム（バージョン３．３．１、ｃｒａｎ．ｒ－ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ）内の線形混合効果モデリングを用いてさらなる比較を行った。性別は共変量として解析に含めた。線形混合効果モデルは、異なる時間点にわたって観察結果の依存関係を説明するものであり、経時的データの解析にとって好ましい方法である。ＰＢＳ処置ＷＴ動物と、３×１０^１０ＧＣか約９×１０^１０ＧＣかのどちらかのＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＳＭＮ１ｃｏ．ＲＢＧで処置したＷＴマウスとの間に体重の有意差は認められず（図４Ｄ及び図４Ｅ）、ベクターまたは投与経路に関して毒性がないことが示された。健常同腹仔と比較してＳＭＮΔ７仔は体重の増加速度がより遅いことを実証したが（図４Ｆ）、ＳＭＮΔ７仔における３×１０^１０ＧＣ／仔または８．７６×１０^１０ＧＣ／仔のＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＳＭＮ１ｃｏ．ＲＢＧによる処置は体重増加を有意に増進した（図４Ｉ及び図４Ｊ）。

【0194】

これらの結果は、ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＳＭＮ１ｃｏ．ＲＢＧが体重によって示されるＳＭＮΔ７仔の成長を改善したことを示唆した。

【0195】

実施例７－機能評価はＳＭＡの齧歯動物モデルにおけるＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＳＭＮ１．ＲＢＧの望ましい効果を明らかにする
後肢懸垂試験と立直り反射試験との２つの機能評価を実施して、本明細書に記載のベクターの処置に関するＳＭＡの発展及び進行を評価した。

【0196】

ＳＭＡの新生仔マウスモデルにおいて近位後肢筋力及び疲労を評価するために、後肢懸垂試験のプロトコールを採用し、Ｂｅｈａｖｉｏｒ Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ ｆｏｒ ｎｅｏｎａｔｅｓ：Ｈｉｎｄ Ｌｉｍｂ Ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ Ｔｅｓｔ（ａ．ｋ．ａ．Ｔｕｂｅ Ｔｅｓｔ），ＳＯＰ＃ＳＭＡ＿Ｍ．２．２．００１ ｆｒｏｍ ＴＲＥＡＴ－ＮＭＤ（Ｅｌ－Ｋｈｏｄｏｒ ｅｔ ａｌ．）から最適化した。後肢筋力及び疲労を測定するパラメータとして後肢懸垂（ＨＬＳ）スコア及び垂下時間（ＴＳＨ）を含めた。試験は生後２日ごとに２連続試行で実施した。各試行を続けるのは最長６０秒までとした。ＨＬＳ及びＴＳＨの両方を同じ試行で測定した。最初の１５秒はＨＬＳスコアを決定するために使用した。ＴＳＨについては、動物が落下するまで計り続けた時間か、６０秒に達した時間かのどちらか早い方とした。さらに、栄養摂取競争による偏りを避けるために、動物が１０匹よりも多い同腹仔はこの試験から除外した。仔が５匹未満である同腹仔はこの試験から除外した、というのも、母性的養育の増加はより軽度の表現型をもたらし得、試験の偏りを招くからである。

【0197】

ＰＢＳまたはベクターで処置した野生型またはヘテロ接合体仔では成長によってＨＬＳスコアの上昇が観察された代わりに、ＰＢＳを注射したＳＭＮΔ７仔は、後肢筋力の低下を示唆してＨＬＳスコアの低下を呈した（図５Ｂ）。しかしながら、仔１匹あたり３×１
０^１０ＧＣのＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＳＭＮ１．ＲＢＧを単回注射した場合、ＨＬＳスコアはＳＭＮΔ７仔の発育の間安定したままであった。さらに、用量を仔１匹あたり８．７６×１０^１０ＧＣに増やすと、時間どおりにＨＬＳスコアのわずかな上昇が認められた。それらの結果は、ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＳＭＮ１ｃｏ．ＲＢＧベクターがＳＭＮΔ７仔の機能発達を改善したことを示す。

【0198】

垂下時間（ＴＳＨ）を上記のとおりに記録し、落下までの潜時の指標として役立てたが、ＳＭＮΔ７仔とその健常同腹仔とで差異は認められなかった。この結果は、ＴＳＨがＳＭＮΔ７モデルにおいて筋機能の低下を明らかにすることができなかったことを示唆しており、このためさらなる評価からは除外した。

【0199】

ＳＭＡの新生仔マウスモデルにおいて移動能力を試験し筋力を評価するために、立直り反射試験のプロトコールを採用し、Ｂｅｈａｖｉｏｒ Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ ｆｏｒ ｎｅｏｎａｔｅｓ：Ｒｉｇｈｔｉｎｇ Ｒｅｆｌｅｘ，ＳＯＰ＃ＭＤ＿Ｍ．２．２．００２
ｆｒｏｍ ＴＲＥＡＴ－ＮＭＤ（Ｄｉｄｏｎａｔｏ ｅｔ ａｌ．）から最適化した。それは、筋力低下及び／または全身的不健康によって影響を受け得る全身体力を、マウスがその正常な立ち位置から外された時に体を向きを正す能力を測定することによって検査するものであった。個々の動物をその飼育カゴから取り出し、４本の手足が全て上を向くように仰向け位置に配置した。反転位置にある動物を安定化させるために指を胸の上に配置した。その後、指を除けてタイマーを開始した。動物が腹這いに向き直ってそれが立っている面に４本の手足を全て置いた時点でタイマーを止めた。各試行の後に動物をその飼育カゴへ戻し、５分間休憩させた。

【0200】

ＳＭＮΔ７仔を生後日数７日目から生後日数１７日目まで２日ごとに試験した。各試行は最長で６０秒とした。この期間内で動物が正常な位置に戻るのに要した時間を用いて筋力を定量した。動物が所与時間以内に立ち直ることができなかった場合には試行を終了し、立直りまでの時間を６０秒として記録した。

【0201】

さらに、栄養摂取競争による偏りを避けるために、動物が１０匹より多い同腹仔はこの試験から除外した。仔が５匹未満である同腹仔はこの試験から除外した、というのも、母性的養育の増加はより軽度の表現型をもたらし得、試験の偏りを招くからである。立直り反射試験を後肢懸垂試験と一緒に同じ日に用いたときは、動物の筋肉が疲弊するのを防ぐためにそれを常に最初に行った。

【0202】

群間の詳細な比較を提供するため及び性別を原因とする変動を減らすために、さらなる解析を実施した。全時間点にわたる変数の全体的変化をどの２群間においても比較した。比較は「ｎｌｍｅ」パッケージ内の機能「ｌｍｅ」を使用するＲプログラム（バージョン３．３．１、ｃｒａｎ．ｒ－ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ）内の線形混合効果モデリングを用いて行った。性別は共変量として解析に含めた。動物が直立位置に戻るのに要した記録時間を性別ごとに正規化し、データを図６Ｄ～Ｊにプロットした。ＰＢＳ処置ＷＴ動物と、３×１０^１０ＧＣか約９×１０^１０ＧＣかのどちらかのＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＳＭＮ１ｃｏ．ＲＢＧで処置したＷＴマウスとの間に立直り反射の有意差は認められなかった（図６Ｄ及び図６Ｅ）。

【0203】

結果は、野生型またはヘテロ接合体仔が直立位置に戻るのに有限時間を要し、この期間が成長によって減少した一方、ＳＭＮΔ７仔は所与時間の間にその向きを正すことができなかった、ということを実証した（図６）。出生時に仔１匹あたり３×１０^１０ＧＣまたは仔１匹あたり８．７６×１０^１０ＧＣのＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＳＭＮ１．ＲＢＧを注射することによって、ＳＭＮΔ７仔において位置を正すために費やされた時間は有意に減少し、生後日数１７日目には野生型及びヘテロ接合体仔が示す正常レベルに戻
り、ＳＭＡの齧歯動物モデルにおいてＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＳＭＮ１．ＲＢＧが機能発達を好結果に改善したことが示された。

【0204】

興味深いことに、ＫＯでは、生存期間及び体重増加の中央値が用量依存的に改善されなかったが、立直り反射は用量依存的に改善された。これらのデータに基づけば、ＳＭＮΔ７ ＫＯにおいて３×１０^１０ＧＣ及び約９×１０^１０ＧＣのＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＳＭＮ１ｃｏ．ＲＢＧは最小有効用量（ＭＥＤ）を上回っていると結論付けられる。

【0205】

結論を述べると、ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＳＭＮ１．ＲＢＧの単回脳室内注射は、新生ＳＭＮΔ７マウスのクモ膜下腔内（脳室内）に投与された場合に実質的な運動ニューロン形質導入及びそれに付随する機能矯正をもたらした。

【0206】

実施例８－組織学的分析はＳＭＡの齧歯動物モデルにおけるＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＳＭＮ１．ＲＢＧの望ましい効果を明らかにする
ＳＭＡモデルにおける筋線維の組織学的及び形態学的弱化、ならびにＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＳＭＮ１．ＲＢＧの注射による回復を評価するためにさらなる試験を実施する。ヘマトキシリン及びエオジン染色ならびにα－ジストロフィンに対する免疫組織化学染色によって前脛骨筋中、大腿四頭筋中、横隔膜中、肋間筋中、頭最長筋中及び舌中の筋線維を見えるようにする。断面積（ＣＳＡ）、線維径及び中心核形成線維（ＣＮＦ）の百分率をパラメータとして利用する。ＣＳＡ決定には、円形または多角形の線維のみを考慮に入れた。

【0207】

実施例９－野生型及びＳＭＮΔ７マウスでのＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＳＭＮ１．ＲＢＧの用量範囲及び形質導入効率
最高用量の潜在的毒性、ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＳＭＮ１ｃｏ．ＲＢＧの用量依存的発現を決定するため、及びＳＭＮΔ７マウスでのＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＳＭＮ１ｃｏ．ＲＢＧの最小有効用量（ＭＥＤ）を決定するために、ＨＥＴ／ＨＥＴ交配から生産された同腹仔全体に左側脳室の中（脳室内）（ＩＣＶ）へのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、マウス１匹あたり１×１０^９ＧＣ、３×１０^９ＧＣ、１×１０^１０ＧＣ、３×１０^１０ＧＣまたは７×１０^１０ＧＣのＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＳＭＮ１ｃｏ．ＲＢＧの注射を生後２４時間以内に施した。マウスは試験全体にわたって毎日監視した。安楽死基準（前回の体重測定からの１５％の体重減少、または哺乳不能）を満たすいかなるマウスも安楽死させた。死亡が認められたかまたは試験１３日目より前に安楽死させたマウスは剖検しなかった。

【0208】

試験の３、５、７、９、１１及び１３日目にマウスの体重を測った。試験３日目にマウスに入れ墨し、遺伝子型判定を行った。試験７日目及び１３日目にマウスを３回の立直り反射検査に供した。均一な同腹仔サイズを維持するために試験９日目に同腹仔を間引いた。同腹仔サイズが動物４匹に等しくなるように全てのＫＯならびに対応する数のＨＥＴ及びＷＴを含むように同腹仔を間引いた。運動ニューロン形質導入及び筋線維径の分析のために試験１３日目に動物を安楽死させ剖検した。

【0209】

ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＳＭＮ１ｃｏ．ＲＢＧのどの用量も、ＨＥＴ／ＷＴ及びＫＯ ＳＭＮΔ７マウスの両方において十分に忍容された。図９Ａ中及び図９Ｂ中のデータは１用量あたりたったの２リットルしか表していないことから、１×１０^９ＧＣで処置したＨＥＴ／ＷＴ動物において有意に減少した体重は、母親及び同腹仔サイズの変動性が原因であると考えられた（図９Ｂ）。さらに、１×１０^９ＧＣ群内の１匹のＫＯは１５％より大きく体重が減少したために試験９日目に安楽死せねばならなかった。より高い用量のＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＳＭＮ１ｃｏ．ＲＢＧは、ＨＥＴ／ＷＴ動物の
体重を変化させず、ＰＢＳ処置ＫＯ対照に比べてＫＯ動物の体重増加を増進した（図９Ａ及び図９Ｂ）。これらのデータに基づけば、ＳＭＮΔ７マウスにおいて１×１０^１０ＧＣはＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＳＭＮ１ｃｏ．ＲＢＧのＭＥＤを表すと結論付けられる。

【0210】

立直り反射については、試験７日目において様々な用量群のＨＥＴ／ＷＴ動物間にかなりの変動があった（図１０Ａ）。しかし、試験１３日目までに全ての用量群のＨＥＴ／ＷＴ動物は平均立直り時間がおよそ１秒となった（図１０Ａ）。この試験７日目での変動は、母親及び同腹仔サイズの変動性が原因であると考えられた。体重追跡評価データに類似して１×１０^１０ＧＣ以上の用量では、ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＳＭＮ１ｃｏ．ＲＢＧを処置されたＫＯは試験１３日目においてＰＢＳ処置ＫＯ対照に比べて立直り時間の有意な改善を呈した（図１０Ｂ）。

【0211】

したがって、生存中における体重追跡評価と立直り反射との測定に基づけば、ＳＭＮΔ７マウスにおけるＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＳＭＮ１ｃｏ．ＲＢＧの現行のＭＥＤは１×１０^１０ＧＣであると結論付けられた。

【0212】

運動ニューロン形質導入及び筋線維径の組織学的測定結果を評価する。追加の同腹仔を上の実施例９で記載される実験に参加させる。

【0213】

さらに、参加させた同腹仔ではベクターのどの用量に関しても急性毒性の兆候は観察されず、１３日間の試験期間にわたってベクターに関係する毒性の兆候がなかった。

【0214】

ＩＣＶ投与後の成体マウスにおけるＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＳＭＮ１ｃｏ．ＲＢＧの潜在的毒性及び忍容性をさらに評価するために、雄及び雌の成体Ｃ５７ＢＬ／６Ｊのクモ膜下腔内にＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＳＭＮ１ｃｏ．ＲＢＧを注射した。この試験で用いた総用量は上記新生仔実験で用いたものと同等であったが、脳１グラムあたりの用量は、新生マウスの推定脳質量が０．２ｇであるのに比べて成体マウスの推定脳質量が０．４ｇであることため、２倍異なっていた。試験１４日目の時点では全ての用量を含めたが、試験２８日目の時点ではビヒクル及び７×１０^１０ＧＣのみを反復試行した。

【0215】

適用可能な場合での試験０日目、７日目、１４日目、２１日目及び２８日目に体重を追跡評価した。剖検で採取した血清に対して臨床化学を実施する（適用可能な場合での試験１４日目または試験２８日目）。脳、脊髄、心臓、肺、肝臓、脾臓、腎臓、坐骨神経及び大腿四頭筋を微細組織病理学的評価のために採取した。全てのパラメータをビヒクル処置動物と比較した。

【0216】

試験１４日目を経ると罹患または死亡はどの群にもなかった。性別一致ビヒクル処置対照と比較して、ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＳＭＮ１ｃｏ．ＲＢＧのどの用量も体重軌跡に影響を与えなかった（図１４Ａ～Ｂ）。

【0217】

上記実施例９でのモデルにおける筋線維の組織学的及び形態学的弱化、ならびにＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＳＭＮ１．ＲＢＧの注射による回復を評価するためにさらなる試験を実施する。ヘマトキシリン及びエオジン染色ならびにα－ジストロフィンに対する免疫組織化学染色によって前脛骨筋中、大腿四頭筋中、横隔膜中、肋間筋中、頭最長筋中及び舌中の筋線維を見えるようにする。断面積（ＣＳＡ）、線維径及び中心核形成線維（ＣＮＦ）の百分率をパラメータとして利用する。ＣＳＡ決定には、円形または多角形の線維のみを考慮に入れた。

【0218】

実施例１０－アカゲザル中のｈＳＭＮ１含有ＡＡＶベクター
この試験の目的は、アカゲザルにおいて種々のクモ膜下腔内経路での投与を評価してどの経路が最も堅牢な脊髄運動ニューロン形質導入をもたらすかを判定すること、及びアカゲザルにおけるＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＳＭＮ１ｃｏ．ＲＢＧの薬理動態プロファイル及び安全性を評価することであった。アカゲザルは、その大きさ及び中枢神経系解剖学的構造がヒトの近似としてマウスよりもはるかに良好に役立つためにこの試験に使用された。

【0219】

Ｘ線透視による誘導及び造影剤材料を使用して、針が大槽の中（大槽内）（ＩＣＭ）、または腰椎槽（腰椎穿刺孔）（ＬＰ）の中のＬ４とＬ５との間の椎間空間内に配置されたことを確認した。群は、１．０ｍＬのＩＣＭ（ｎ＝３）では、２．５ｍＬのＬＰ（ｎ＝４）、及び５．０ｍＬのＬＰ（ｎ＝４）であった。各群は、ＡＡＶ９に対する中和抗体（ＮＡｂ）力価を検出不可能から１：２０超までの範囲で有する動物を含有していた。全ての群は３．３×１０^１１ＧＣ／ｇ脳（合計３×１０^１３ＧＣ）のＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＳＭＮ１ｃｏ．ＲＢＧを受けた。この試験にはビヒクル対照群を含めなかった。

【0220】

試験中、専門員は毎日動物に異常行動及び苦痛の兆候がないかどうか観察した。ベースラインのＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＳＭＮ１ｃｏ．ＲＢＧ投与日（試験０日目）、試験３日目、試験７日目に、及びそれ以降毎週、臨床病理学を試験終了まで実施した。試験０日目、試験７日目に、及びそれ以降毎週、ＣＳＦ化学及び細胞学を試験終了まで実施した。脊髄における運動ニューロン形質導入、生体内分布の組織学的評価、及び予備的な組織病理学的評価のために試験２８日目に動物を安楽死させ剖検した。

【0221】

試験の過程全体を通して、異常行動または苦痛の兆候を呈した動物はいなかった。１匹の動物（ＲＡ１８７１）は試験０日目から試験２１日目までの間にＡＬＴレベルが５５Ｕ／Ｌから８０Ｕ／Ｌまで上昇したが、これはいかなる臨床兆候にも対応していなかった（図１１Ｂ）。ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＳＭＮ１ｃｏ．ＲＢＧ投与の後にＡＬＴ（図１１Ｂ）、ＡＳＴ（図１１Ａ）、リンパ球（図１１Ｃ）または単球（図１１Ｄ）の上昇の傾向を呈した動物は他にはいなかった。

【0222】

試験全体を通して、どの動物にもＣＳＦタンパク質またはグルコースの変化の傾向は見受けられなかった（図１１Ｅ～Ｈ）。１匹の動物（ＲＡ１３２７）においては試験２８日目にＣＳＦ中で１７白血球／μＬであった（図１１Ｅ）。巨視的に見て当該ＣＳＦは血液汚染があるとは見受けられなかったが、２５０赤血球／μＬを含有していた。これが真の細胞増多であるのかまたは不浄なＣＳＦ排出であるのかは不明である。先のクモ膜下腔内試験からのＣＳＦ細胞学は数週間の間に一桁から二桁へとＣＳＦ白血球数の漸増を示し（データ示さず）、この（試験２１日目の０白血球／μＬからの）試験２８日目の１７白血球／μＬの単発の原因は真の細胞増多ではなく不浄なＣＳＦ排出である可能性があるという結論に至った。

【0223】

剖検に際して各脊髄を頚部、胸部及び腰部切片に分割した。続いて、各脊髄高度を４片に分割した。１片は生体内分布のために瞬間冷凍し、１片は組織病理学的評価のためにホルマリン中に入れ、残りの２片は運動ニューロン形質導入の評価のためにホルマリン中に入れた。

【0224】

運動ニューロン形質導入はコドン最適化ｈＳＭＮ１リボ核酸（ＲＮＡ）についてのＩＳＨ（６スライド／脊髄高度／動物に等しい３スライド／脊髄高度片／動物）、及びｈＳＭＮ１タンパク質についてのＩＨＣ（４スライド／脊髄高度／動物に等しい２スライド／脊髄高度片／動物）によって測定した。運動ニューロンをＮｉｓｓｌ染色剤で標識して、形質導入された運動ニューロンのパーセントを決定した。全ての脊髄高度において、ＩＳＨ
及びＩＨＣの両方によって測定した運動ニューロン形質導入は、ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＳＭＮ１ｃｏ．ＲＢＧのＩＣＭ投与の方がＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＳＭＮ１ｃｏ．ＲＢＧのＬＰ投与よりも有意に高くなった（図１２Ａ及び図１２Ｂ）。各群内でＩＳＨとＩＨＣとは形質導入効率が一致していたが、形質導入された運動ニューロンのパーセントはＩＨＣによって測定したときの方が高かった（図１２Ａ及び図１２Ｂ）。抗体とアカゲザルＳＭＮタンパク質との交差反応性が生じる可能性はあるが、ＩＳＨのために使用したＲＮＡプローブは、ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＳＭＮ１ｃｏ．ＲＢＧからのコドン最適化ｈＳＭＮ１ ＲＮＡに対して特異的であり、アカゲザルＳＭＮ ＲＮＡとの交差反応性の可能性が排除されていた。公開データと一致して、形質導入された運動ニューロンのパーセントはどの群においても尾側及び吻側（頚部及び腰部）のパターンで増加した（Ｈｉｎｄｅｒｅｒ Ｃ，Ｂｅｌｌ Ｐ，Ｖｉｔｅ ＣＨ ｅｔ ａｌ．Ｗｉｄｅｓｐｒｅａｄ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎ ｔｈｅ ｃｅｎｔｒａｌ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ ｏｆ ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ ｍａｃａｑｕｅｓ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ＡＡＶ９ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｃｉｓｔｅｒｎａ ｍａｇｎａ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｈｅｒａｐｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ ＆ｃｌｉｎｉｃａｌ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ２０１４；１：１４０５１）（図１２Ａ及び図１２Ｂ）。

【0225】

クモ膜下腔内へのＡＡＶ送達はＣＳＦアクセスのための様々な経路を用いて実施することができる。腰椎穿刺はＣＳＦを評価するための最も一般的な方法であり、それゆえ非ヒト霊長類におけるＡＡＶ投与のための経路として評価された。注目すべきことに、腰椎穿刺によるＣＳＦ内へのＡＡＶ９ベクターの送達は、より高い大槽の高度でのベクターの注射に比べて脳及び脊髄の細胞への形質導入効率が多くても１０分の１であることが見出された［Ｈｉｎｄｅｒｅｒ Ｃ，ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｗｉｄｅｓｐｒｅａｄ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎ ｔｈｅ ｃｅｎｔｒａｌ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ
ｏｆ ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ ｍａｃａｑｕｅｓ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ＡＡＶ９ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｃｉｓｔｅｒｎａ ｍａｇｎａ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ １：１４０５１］。この知見は、ＡＡＶｈｕ６８－ＳＭＮ１ベクターを使用してＮＨＰ試験において確認された。大槽内への後頭下穿刺によって臨床候補ベクターを注射した成体アカゲザル（ｎ＝３）は、導入遺伝子ｍＲＮＡについてのｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）及びヒトＳＭＮタンパク質についての免疫組織化学染色（ＩＨＣ）によって示されるとおり脊髄のどの高度においても運動ニューロン形質導入を呈した。対照的に、腰椎穿刺によってベクター注射を受けている動物は、吻側分布を促進するために注射体積を５ｍＬ－動物のＣＳＦ体積のおよそ４０％－に増やした場合でさえ、脊髄のどの高度においてもよりかなり低い形質導入を示した。この試験は、大槽の高度でベクターを送達する必要性を例証し、臨床投与経路としての後頭下穿刺の選択を支持した。

【0226】

種々のクモ膜下腔内経路での投与の後の形質導入を判定する試験からの選定組織に対して生体内分布を実施した。先の試験におけるベクターのＩＣＭ及びＬＰ投与後に脳と脊髄とで形質導入にかなり差があるのは、ＬＰのために利用する体積が小さいからである可能性がある（Ｈｉｎｄｅｒｅｒ Ｃ，Ｂｅｌｌ Ｐ，Ｖｉｔｅ ＣＨ ｅｔ ａｌ．Ｗｉｄｅｓｐｒｅａｄ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎ ｔｈｅ ｃｅｎｔｒａｌ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ ｏｆ ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ ｍａｃａｑｕｅｓ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ＡＡＶ９ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｃｉｓｔｅｒｎａ ｍａｇｎａ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｈｅｒａｐｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ ＆ｃｌｉｎｉｃａｌ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ２０１４；１：１４０５１）。本試験では、ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＳＭＮ１ｃｏ．ＲＢＧのＩＣＭ及びＬＰ投与後に脳と脊髄とで形質導入が同等であった（図１３）。

【0227】

興味深いことに、ＮＡｂは末梢器官の形質導入に影響を及ぼすことが見受けられた。各群においてＮＡｂを１：２０より多く有する動物は心臓、肝臓及び脾臓における形質導入が最も少なかった（図１３）。

【0228】

予備的な組織病理学的評価を脳、脊髄、後根神経節（ＤＲＧ）、坐骨神経及び肝臓に対して実施した。脳での主要な所見は最小限～軽度の単核球浸潤及びグリオーシスであった。これらの所見は全ての群内で等しく分布していた。脊髄では、主としてＩＣＭ群に所見が存在しており、腰髄で所見の頻度が増加した。最も一般的な所見は後索における最小限～軽度の軸索変性及び最小限～軽度の単核球及び組織球浸潤であった。頚部、胸部及び腰部のＤＲＧでの主要な所見は最小限～軽度の単核球浸潤、最小限～軽度の神経細胞空胞化、及び最小限～軽度の軸索変性であった。これらの所見は、両ＬＰ群に比べてＩＣＭ群においてより高い有病率で存在していた。坐骨神経では、最小限～軽度の軸索変性、及び最小限のマクロファージ浸潤があった。これらの所見は主としてＩＣＭ群に存在していた。肝臓では、全ての群において最小限～軽度の単核球浸潤、及び最小限の小肉芽腫があった。

【0229】

さらに、副腎、上行大動脈、骨髄、脳、盲腸、頚部 副睾丸、食道、眼、胆嚢、心臓、腎臓、大腸、肺、涙腺、リンパ節、筋肉、卵巣、膵臓、前立腺、直腸、唾液腺、精嚢、皮膚、小腸、脊髄、脾臓、胃、精巣、膀胱、子宮、脳下垂体、胸腺、甲状腺、気管、膣、及び（あれば）肉眼的病変を組織病理学的分析のために採取した。組織をヘマトキシリン及びエオジン（Ｈ＆Ｅ）及び／またはその他の免疫組織化学染色によって染色して組織学的特徴部を同定／明瞭化する。

【0230】

実施例１１－ｈＳＭＮ１を含有するＡＡＶベクターのアカゲザルにおける毒性及び生体内分布試験
ＩＣＭ後のＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＳＭＮ１ｃｏ．ＲＢＧの薬理学及び毒性学を研究するためにアカゲザルで１８０日ＧＬＰ試験を行う。アカゲザルに１．８５×１０^１０ＧＣ／ｇ脳、５．５６×１０^１０ＧＣ／ｇ脳もしくは１．８５×１０^１１ＧＣ／ｇ脳の３つの用量のうちの１つ（ｎ＝３／群／時点－両方の性別）、またはビヒクル（エリオット製剤化用緩衝液、ＥＦＢ）（ｎ＝１／群／時点－一方の性別）を与える。ベースライン臨床病理学（鑑別を伴う細胞数算定、臨床化学、及び凝固パネル）、ＣＳＦ化学及びＣＳＦ細胞学を実施する。ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＳＭＮ１ｃｏ．ＲＢＧまたはビヒクルの投与後、動物を苦痛の兆候及び異常行動について毎日追跡評価する。ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＳＭＮ１ｃｏ．ＲＢＧまたはビヒクルを投与した後、臨床病理学を週ベースで実施する。ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＳＭＮ１ｃｏ．ＲＢＧまたはビヒクルを投与した後、最初の３０日間は週ベース、それ以降は月ベースでＣＳＦ化学及び細胞学を実施する。ベースライン及びそれ以降の月ベースで、ＡＡＶｈｕ６８に対する中和抗体、ならびにＡＡＶｈｕ６８及びｈＳＭＮ１導入遺伝子に対する細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答をＩＦＮ－γＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって評価する。

【0231】

ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＳＭＮ１ｃｏ．ＲＢＧまたはビヒクルの投与から１４日後、９０日後及び１８０日後に動物を安楽死させ、総合的な微細組織病理学的検査のために組織を採取する。組織病理学的検査はとりわけ中枢神経系組織（脳、脊髄及び後根神経節）に焦点を当てる、というのもそれらはＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＳＭＮ１ｃｏ．ＲＢＧのクモ膜下腔内投与後に最も強く形質導入されるからである。さらに、剖検時にリンパ球を肝臓、脾臓及び骨髄から採集してこれらの臓器におけるＣＴＬの存在を調べる。

【0232】

３０頭の非ヒト霊長類においてＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＳＭＮ１ｃｏ．ＲＢＧのＩＣＭ投与を用いて実施したＧＬＰ毒性学試験によって、ベクター投与後の１／３０
頭の動物に一過的な神経障害が同定されたが、これは、手技中に麻酔下の動物の自発的移動によって引き起こされた脳幹の直接穿刺を原因とするものであった。この試験では１８０日の追跡期間にわたって他に臨床的有害事象はなく、試験全体を通して実施された標準化神経学的試験では異常は同定されなかった。組織病理学からは、臨床的続発症と関連がない用量依存的な知覚ニューロン軸索変性が明らかになった。脊髄運動ニューロン形質導入の定量は、ＳＭＮΔ７マウスモデルの運動機能の改善に関連する形質導入レベルであるＸ％の脊髄運動ニューロンの形質導入がＸＧＣの用量によって達成されたことを指し示した。したがって、この用量をＭＥＤとして選択した（最終的な毒性結果によって更新する）。

【0233】

若年アカゲザルの非臨床試験では、極端に高い用量（２×１０^１４ＧＣ／ｋｇ）でのＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＳＭＮ１ｃｏ．ＲＢＧの静脈内投与は３／３頭の動物に急性肝毒性を招き、１頭の動物はベクター投与から５日後に安楽死を必要とした。類似した毒性は、クモ膜下腔内注射による処置をこの投与経路を用いて評価された最高用量である３×１０^１３ＧＣ以下の用量で施した９頭の成体及び５頭の若年のアカゲザル、またはＧＬＰ毒性学試験においてＩＣＭ注射によってＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＳＭＮ１ｃｏ．ＲＢＧで処置した２７頭の成体アカゲザルには認められなかった。

【0234】

実施例１２－臨床試験
Ａ．新生児
ヒトでは合計約５×１０^１３ＧＣに換算され、実施例１１に示す毒性学試験で提案される低用量よりも３倍高いがなおも高用量の３分の１未満である５×１０^１０ＧＣ／ｇ脳質量のＭＥＤ用量に対応して、初のヒトにおける試験を開始する（Ｄｅｋａｂａｎ ＡＳ．Ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｂｒａｉｎ ｗｅｉｇｈｔｓ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ｓｐａｎ
ｏｆ ｈｕｍａｎ ｌｉｆｅ：ｒｅｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｒａｉｎ ｗｅｉｇｈｔｓ
ｔｏ ｂｏｄｙ ｈｅｉｇｈｔｓ ａｎｄ ｂｏｄｙ ｗｅｉｇｈｔｓ．Ａｎｎ Ｎｅｕｒｏｌ １９７８；４：３４５－５６）。初のヒトにおける試験で投与する最大用量は、実施例１１に記載する毒性学試験での最高用量であり合計１．８５×１０^１４ＧＣに対応する１．８５×１０^１１ＧＣ／ｇ脳に等しいであろう。

【0235】

ＤＮＡによって証明された脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）を有する参加者におけるＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＳＭＮ１ｃｏ．ＲＢＧの２つの用量の安全性を判定するために、薬学的に好適な担体／溶液の中の上記ＡＡＶベクターの２つの異なる単回用量の投与を調査した。

【0236】

後の開発には、拡大した集団群、及び効果的な用量を確立する用量が含まれる。

【0237】

第一の目的は、任意の試験関連等級ＩＩＩ以上の処置関連毒性の評価である。

【0238】

第二の目的には、
・有害事象（ＡＥ）及び／または重篤な有害事象（ＳＡＥ）の発生率
・ハマースミス乳児神経学的検査（ＨＩＮＥ）運動発達マイルストーンの達成の評価
・フィラデルフィア小児病院乳児神経筋疾患検査（ＣＨＯＰ－ＩＮＴＥＮＤ）の運動機能尺度のベースラインからの変化
・臨床的に顕在化した脊髄性筋萎縮症を発症している参加者の百分率
・記された時点において生存している参加者の百分率
・身体測定結果：
年齢／身長に対する体重；頭囲、胸囲及び腕囲、頭囲対胸囲比率
のベースラインからの変化
・安静時バイタルサイン：
脈拍、血圧、呼吸、体温、パルスオキシメトリー及び経皮二酸化炭素
のベースラインからの変化
・以下の実験室試験によって評価される臨床実験室パラメータ：
血液学：赤血球、ヘモグロビン、ヘマトクリット、血小板、白血球、白血球鑑別、血液化学：総タンパク質、アルブミン、クレアチニン、シスタチンＣ、クレアチンホスホキナーゼ、血中尿素窒素、総ビリルビン（直接及び間接）、アルカリホスファターゼ、アラニンアミノトランスフェラーゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、グルコース、カルシウム、リン、塩化物、ナトリウム、カリウム。尿検査：比重、ｐＨ、タンパク質、グルコース、ケトン、ビリルビン、赤血球、白血球、上皮細胞、細菌、円柱細胞、結晶
のベースラインからの変化
・尺骨の複合筋活動電位（ＣＭＡＰ）のベースラインの変化
・脳脊髄液（ＣＳＦ）及び血清中ＳＭＮタンパク質濃度
が含まれる。

【0239】

対象となる集団は、発症前でありＳＭＡ及び２コピーの運動神経細胞生存２（ＳＭＮ２）遺伝子が遺伝学的に証明されている６週齢未満の乳児である。
包含基準を以下に列挙する。
１．生後週齢が６週間未満、一人っ子誕生の在胎期間が３７～４２週間、双子の在胎期間が３４～４２週間である。
２．発症前ＳＭＡであり、５ｑ脊髄運動神経細胞１（ＳＭＮ１）ホモ接合型遺伝子欠失または突然変異または複合ヘテロ接合型突然変異が遺伝学的に証明されている。
３．遺伝学的に２コピーの運動神経細胞生存２（ＳＭＮ２）が証明されている。
４．ＳＭＡ試験経験を有する神経学者による術後追跡。
除外基準を以下に列挙する。
１．ＳＭＡのために与えられた何らかの市販薬もしくは治験薬、バイオ薬剤または装置による処置、例えば、遺伝子療法、以前のアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）処置または細胞移植の履歴
２．研究者の意見によればＳＭＡが強く示唆される、スクリーニング時または初回投薬（１日目）の直前における何らかの臨床兆候または症候
３．臨床的に有意であるとみなされる異常な実験室値（ＧＧＴ＞３ＸＵＬＮ、ビリルビン≧［Ｘ］ｍｇ／ｄＬ、クレアチニン≧［Ｙ］ｍｇ／ｄＬ、Ｈｇｂ＜［Ｚ］または［Ａ］ｇ／Ｄｌ；ＷＢＣ＞１ｃｍｍあたりの［Ｂ］）
４．重大な内科的疾患
５．研究者の意見によれば遺伝子移入にとって不要なリスクを生む併発疾患
６．家族が掛かり付け医及びその他の医療提供者と共に患者の試験参加を開示したがらない

【0240】

２つの用量のＡＡＶベクターを試験することとし、各投薬コホートは６名の参加者を含むこととする。
・コホート１：低用量：３×１０^１３ＧＣ
・コホート２：高用量：１×１０^１４ＧＣ

【0241】

６名の参加者を低用量コホート（３×１０^１３ＧＣ）に登録する。参加者投薬は各参加者の登録間に４週間の安全性観察期間を設けながら連続的に行う。安全性は国内の安全委員会（ＩＳＣ）によって評価された。安全性再検討誘因（ＳＲＴ）がないと認められる場合には低用量コホート内の６人目の参加者への投薬から４週間後、高用量コホート２の登録へと進む前に全ての利用可能な安全性データが独立データモニタリング委員会（ＩＤＭＣ）によって評価される。

【0242】

一実施形態では、５．６ｍＬの適切な濃度のベクターが入ったシリンジを手技室へ送る
ことになる。試験薬投与のために以下の人員が存在している：手技を実施する介入施与者；麻酔専門医及び呼吸器専門技術者（複数可）；看護師及び医師助手；ＣＴ（または手術室）技術者；神経生理学専門技術者；現場試験取りまとめ役。

【0243】

試験薬投与前に腰椎穿刺を実施して所定体積のＣＳＦを抜き取り、その後、大槽の関連解剖学的構造の可視化に役立てるためにヨウ素化造影剤をクモ膜下腔内（ＩＣ）に注射する。クモ膜下腔内用造影剤の代わりに静脈内（ＩＶ）用造影剤を針の挿入前または挿入中に投与してもよい。ＩＶ用造影剤を使用するのかＩＣ用造影剤を使用するのかについての判断は介入施与者の裁量に委ねられる。患者は麻酔を掛けられ、挿管され、手技台上に配置される。術中神経生理学的モニタリング（ＩＯＮＭ）装備を参加者に取り付ける。無菌技術を用いて注射部位の準備を整え覆布を掛ける。脊椎穿刺針（２２～２５Ｇ）をＸ線透視による誘導の下で大槽内へと前進させる。針配置を支援するためにより大きい誘導針を使用してもよい。針配置の確認の後、脊椎穿刺針に延長セットを取り付け、患者のＣＳＦで満たされるようにする。介入施与者の裁量により、造影剤材料が入ったシリンジが延長セットに連結され得、大槽内における針の配置を確認するために少量が注入され得る。ＣＴ誘導による＋／－造影剤注入によって針配置を確認した後、５．６ｍＬのＧＴＰ－２０１が入ったシリンジを延長セットに連結する。シリンジ内容物を１～２分掛けてゆっくりと注入して５．０ｍＬの体積を送達する。針を患者からゆっくりと取り出す。

【0244】

試験薬投与後、施設ガイドラインに従って参加者を好適な麻酔後介護室へ搬送する。参加者は、意識が十分に回復して安定な状態になった後、プロトコールが定める臨床追跡評価のための適切な部屋に受け入れられることになる。手技直後から３時間にわたる１５分ごとの評価及びその後の２４時間にわたる１時間ごとの評価を含めてバイタルサイン及び神経学的機能が頻繁に追跡評価される。手技後期間の最初の２４時間の後は評価を２日間にわたって毎日実施し、その後、参加者は退院し、４週間にわたって毎週戻り、その後４週間ごとにさらに２回訪問し、続いて２４週目に主要評価項目の評価のために訪問する。

【0245】

安全性検査のために血液を抜き取り、参加者を臨床的に評価する。炎症の兆候について追跡評価するためならびに４、１２及び２４週目の投薬時にバイオマーカーを測定するために、参加者を胸椎穿刺に供してＣＳＦを採取する。追跡期間の間、参加者は手技から１年後まで３ヶ月ごとに評価される。参加者は全体で５年間にわたって毎年の訪問を続ける。ベクター投与から３ヶ月後及び６ヶ月後に参加者を再度のＭＲＩ及びＣＳＦ採取に供する。

【0246】

有核細胞数算定及び鑑別ならびに総タンパク質を含めてＡＡＶベクター投与後のＣＮＳ炎症の証拠をＣＳＦ試料で標準的技術を用いて評価する。処置関連炎症の診査手段としては、炎症マーカーについてのＣＳＦの多重サイトカイン分析が挙げられる。

【0247】

ＣＳＦのＳＭＮタンパク質レベルがＡＡＶｈＳＭＮ１ベクターの形質導入の成功のバイオマーカーとして妥当であることを立証すべく、提案される第１／２相介入試験のためのアッセイが開発中である。

【0248】

複合筋活動電位（ＣＭＡＰ）は、末梢神経の最大上刺激後の筋肉からの電気生理学的出力を表し、運動ニューロンの健康の客観的な高感度指標として役立つ（Ｇａｒｃｉａ Ａ，Ｃａｌｌｅｊａ Ｊ，Ａｎｔｏｌｉｎ ＦＭ，Ｂｅｒｃｉａｎｏ Ｊ．Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｍｏｔｏｒ ａｎｄ ｓｅｎｓｏｒｙ ｎｅｒｖｅ ｃｏｎｄｕｃｔｉｏｎ ｓｔｕｄｉｅｓ ｉｎ ｎｏｒｍａｌ ｉｎｆａｎｔｓ ａｎｄ ｃｈｉｌｄｒｅｎ．Ｃｌｉｎ Ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｏｌ ２０００；１１１：５１３－２０）。詳しくは、Ｉ型ＳＭＡを有する患者における自然歴研究は、ＣＭＡＰ振幅が異常に低く、症候発症後に改善しないことを示している（Ｆｉｎｋｅｌ ＲＳ，ＭｃＤｅｒｍｏｔｔ ＭＰ，Ｋａｕｆ
ｍａｎｎ Ｐ ｅｔ ａｌ．Ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎａｌ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｓｐｉｎａｌ ｍｕｓｃｕｌａｒ ａｔｒｏｐｈｙ ｔｙｐｅ Ｉ ａｎｄ ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｒｉａｌｓ．Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ２０１４；８３：８１０－７、Ｓｗｏｂｏｄａ ＫＪ，Ｐｒｉｏｒ ＴＷ，Ｓｃｏｔｔ ＣＢ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒａｌ ｈｉｓｔｏｒｙ ｏｆ ｄｅｎｅｒｖａｔｉｏｎ ｉｎ ＳＭＡ：ｒｅｌａｔｉｏｎ ｔｏ ａｇｅ，ＳＭＮ２ ｃｏｐｙ ｎｕｍｂｅｒ，ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ａｎｎ Ｎｅｕｒｏｌ ２００５；５７：７０４－１２、及びＦｉｎｋｅｌ ＲＳ．Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ ｍｏｔｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｓｃａｌｅ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｉｎ ａ ｐｒｅ－ｓｙｍｐｔｏｍａｔｉｃ ｉｎｆａｎｔ ｗｉｔｈ ｓｐｉｎａｌ ｍｕｓｃｕｌａｒ ａｔｒｏｐｈｙ ｔｙｐｅ Ｉ．Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌ Ｄｉｓｏｒｄ ２０１３；２３：１１２－５）。さらに、ＳＭＡ患者に類似する電気生理学的所見を呈するブタノックアウトモデルでのＳＭＡの研究は、発症前動物におけるＳＭＮの早期回復がＣＭＡＰ矯正をもたらしたことを示した（Ｄｕｑｕｅ ＳＩ，Ａｒｎｏｌｄ ＷＤ，Ｏｄｅｒｍａｔｔ Ｐ ｅｔ ａｌ．Ａ ｌａｒｇｅ ａｎｉｍａｌ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｓｐｉｎａｌ ｍｕｓｃｕｌａｒ
ａｔｒｏｐｈｙ ａｎｄ ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ．Ａｎｎ
Ｎｅｕｒｏｌ ２０１５；７７：３９９－４１４）。上記理由から、ＣＭＡＰを診査上のバイオマーカーとして調査する。

【0249】

試験中止基準に対して適格となる事象には、
・治験薬との関係が可能性としてある、まず確実である、または明らかである任意の死亡
・肝機能検査の上昇
・基準範囲上限よりも３倍高いＡＬＴまたはＡＳＴ
・（この試験のための年齢群での）レベルとして定義される関連する総血清ビリルビンの上昇
・治験薬または注射手技との関係が可能性としてある、まず確実である、または明らかである等級３以上のＡＥを、１名より多い参加者が被っている
・治験薬または注射手技との関係が可能性としてある、まず確実である、または明らかであるＣＮＳ出血、発作または急性麻痺
が含まれる。

【0250】

肝機能異常は、基準範囲上限（ＵＬＮ）よりも３倍高いアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）またはアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）の任意の増加として定義される。並行する所見は、単回採血、または互いに８日以内である別個の採血に由来するものである。治験現場による追跡研究及び質問をすぐさま開始して、所見に再現性があるか否か及び／または、疾患（例えば、胆石症、及び胆嚢膨張による胆管閉塞）または治験薬以外の薬剤との因果関係を明確に支持する客観的証拠があるか否かを判定する。

【0251】

Ｂ．成人
この非盲検第１／２相用量漸増臨床試験は、遺伝学的に確認される５ｑＳＭＡを有する、及び３型ＳＭＡの臨床履歴を有する成人におけるＡＡＶｈｕ６８．ＳＭＡの単回投与の安全性を評価する。この試験には歩行不可能患者も歩行可能患者も登録する。対象に単回用量のＡＡＶｈｕ６８．ＳＭＡをＩＣＭ（大槽内）注射によって与える。コホート１（ｎ＝３、低用量、３×１０^１３ＧＣ）またはコホート２（ｎ＝６、高用量、１×１０^１４ＧＣ）。この試験で評価した２つの用量は非臨床的な薬理学及び毒性学試験に基づいて選択した。この試験で評価するどちらの用量も、非ヒト霊長類では良好に忍容され、マウス疾患モデルにおいて運動欠陥を改善するのに十分な脊髄運動ニューロンＳＭＮ発現のレベルを実現し、したがって、ヒトにおいて安全であることが予期される。加えて、用量は試験
参加者に利益を提供する可能性を有する。最初の３名の適格な対象はコホート１に登録されることになる。各対象の投薬の後には、次の対象への投薬に先立って国内の安全委員会が安全性データを再検討する４週間の観察期間がある。コホート１内の３人目の参加者について４週間の観察期間内に安全性再検討誘因（ＳＲＴ）がないと認められる場合、コホート２の登録へと進む前に全ての利用可能な安全性データがデータ安全性モニタリング委員会（ＤＳＭＢ）によって評価される。安全性ＳＲＴがないと認められる場合には、コホート２内の３人目の参加者への投薬から４週間後、コホート２の残りの３名の患者の登録へと進む前に全ての利用可能な安全性データがＤＳＭＢによって評価される。

【0252】

対象を投薬前の－３５日目から－１日目までスクリーニングする。選抜基準を満たす者を注射日（１日目）に病院に受け入れる。ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＳＭＮ１ｃｏ．ｒＢＧのＩＣＭ注射を与えた後に対象を２日間にわたって入院患者として追跡評価する。一箇所の外来患者の追跡及び電話評価は、５２週の一次評価期間の残りの指定の時点で起こる。

【0253】

ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＳＭＮ１ｃｏ．ｒＢＧの安全性及び忍容性をＡＥ及びＳＡＥの発生率、臨床及び実験室評価、身体測定ならびにバイタルサインに基づいて評価する。ベクター及び導入遺伝子産物の免疫原性についても評価する。

【0254】

有効性評価は６ＭＷＴ、１０メートル歩行時間、ＲＵＬＭスコア、４段階段昇り、ナインホールペグテスト、肺機能の測定量、ＰｅｄｓＱＬ（倦怠感尺度）、ＳＭＡ－ＦＲＳ（機能評価尺度）、ならびに尺骨及び腓骨のＣＭＡＰ振幅を含む。ＣＳＦ中のＳＭＮタンパク質濃度及び他の診査上のバイオマーカーが評価される。

【0255】

包含基準
・１８歳以上の男性または女性である。
・スクリーニング時に５ｑＳＭＡホモ接合型遺伝子欠失または突然変異または複合ヘテロ接合型突然変異、及び少なくとも２コピーのＳＭＮ２が遺伝学的に証明されている。
・３型ＳＭＡの臨床履歴。
・書面で署名したインフォームドコンセントを提供することを望んでおり、かつそれが可能である
・対象の解剖学的及び身体的状態が治験薬の投与を妨げないであろうという、神経学介入施与者及び現場主任研究者の国内チームによる評価。
歩行不可能な対象
・支援なしで１５フィート以上歩くことができない。
・スクリーニング時にＲＵＬＭスコアが５～３０である。
歩行可能な対象
・歩行可能（支援なしで１５フィート以上歩くことができる）。
・５３０ｍ以下の６ＭＷ距離の６ＭＷＴを安全に実施することができる。
除外基準
・ＩＣＭ注射に対して禁忌がある。
・腰椎穿刺に対して何らかの禁忌がある。
・遺伝子療法の履歴、以前のＡＳＯ処置、または他の任意の治験薬もしくは療法の試験での細胞移植（ＯＲ）参加を含めて、ＳＭＡに対する何らかの市販薬もしくは治験薬またはバイオ薬剤による処置をスクリーニング前３ヶ月以内に受けたことがある。
・スクリーニング時の２４時間の期間の間、８時間超にわたる侵襲性または非侵襲性の換気の医学的必要性によって定義される、呼吸不全。
・研究者によれば試験の実行及び評価に干渉するかまたは遺伝子移入にとって不必要なリスクを生むであろう合併性の疾患。
・異常な凝固状態（プロトロンビン時間（ＰＴ）＞１．５×正常値、部分トロンボプラ
スチン時間（ａＰＴＴ）＞１．５×正常値）がある。
・血小板減少症（例えば血小板計数＜１５０）を有する。
・肝臓異常（ビリルビン＞１．５×ＵＬＮ、ＡＬＴ、ＡＳＴ、及びアルカリホスファターゼ＞２．０×ＵＬＮ）を有する。
・コントロール不良の高血圧（収縮期血圧［ＳＢＰ］＞１８０ｍｍＨｇ、拡張期血圧［ＤＢＰ］＞１００ｍｍＨｇ）を有する。
・研究者の意見によれば対象の安全性を損なうであろう臨床的に重大なＥＣＧ異常を有する。
・固形臓器移植または長期免疫抑制の履歴。
・研究者の意見によれば対象の安全性または試験での好結果な参加または試験結果の解釈を危うくするあろう重篤な、または不安定な医学的または生理学的症状を有する。
・スクリーニング前３０日以内での、リルゾール、バルプロ酸、ヒドロキシ尿素、フェニル酪酸ナトリウム、酪酸誘導体、クレアチン、カルニチン、成長ホルモン、蛋白同化ステロイド、プロベネシドを含めたＳＭＡの処置を意図した医薬の使用、登録時のコルチコステロイド、筋力を増加または減少させることが予測される薬剤、またはヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）阻害が既知であるかまたは予想される薬剤の経口的または非経口的使用。ステロイドのネブライザーまたは吸入器を使用する対象は試験に受け入れるが、ステロイドの経口的使用は禁止する。サルブタモールの経口的使用は下記制限付きで許容される：対象は治験に組み込まれる前の少なくとも６ヶ月間サルブタモールを良好な忍容性で使用していなければならない。治験の継続期間中、サルブタモールの用量は一定であり続けなければならない。吸入用ベータ作動薬の（例えば喘息発作の処置のための）使用は許可する。

【0256】

主要試験評価項目
この試験の主要評価項目は５２週にわたるＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＳＭＮ１ｃｏ．ｒＢＧ安全性及び忍容性である。これらの評価項目は、試験薬投与後５２週にわたって、ＡＥ及びＳＡＥの頻度ならびに、バイタルサインの何らかの変化、身体測定または臨床的に重要とみなされる臨床的実験室評価に基づいて評価されることになる。

【0257】

副次試験評価項目
・歩行不可能対象のＲＵＬＭによって測定される運動機能に対してＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＳＭＮ１ｃｏ．ｒＢＧが及ぼす影響を評価すること
・ＲＵＬＭスコアは試験薬投与後５２週にわたってベースラインスコアと比較されることになる。
・歩行可能対象において６ＭＷＴ試験及び１０メートル歩行時間によって測定される運動機能に対してＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＳＭＮ１ｃｏ．ｒＢＧが及ぼす影響を評価すること
・６ＭＷＴ及び１０メートル歩行時間は試験薬投与後５２週にわたってベースラインスコアと比較されることになる。

【0258】

診査上の評価項目
・ナインホールペグテスト（歩行可能者及び歩行不可能者）及び４段階段昇り試験（歩行可能者のみ）によって測定される運動機能に対してＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＳＭＮ１ｃｏ．ｒＢＧが及ぼす影響を評価すること
・ナインホールペグテスト及び４段階段昇り試験のスコアは試験薬投与後５２週にわたってベースラインスコアと比較されることになる。
・努力性肺活量（ＦＶＣ）、最大呼気圧（ＭＥＰ）、最大吸気圧（ＭＩＰ）によって測定される肺機能に製品が及ぼす影響を評価すること
・尺骨及び腓骨のＣＭＡＰ振幅のベースラインからの変化
・ＰｅｄＱＬ バージョン３．０ 多次元倦怠感尺度，成人用レポートモジュール
・ＳＭＡ－ＦＲＳ（機能評価尺度）
・ＤＮＡ中のベクター及びその他のＡＡＶ系薬物成分のＣＳＦ、血清及び尿における薬理動態

【0259】

実施例１３－製造
ＡＡＶｈｕ６８．ＳＭＮベクターは、１）ベクターゲノムプラスミド、２）ＡＡＶ ｒｅｐ２及びｃａｐ ｈｕ６８野生型（ＷＴ）遺伝子を含有するｐＡＡＶｈｕ６８．ＫａｎＲと呼称されるＡＡＶヘルパープラスミド、及び３）ｐＡｄΔＦ６（Ｋａｎ）と呼称されるヘルパーアデノウイルスプラスミドを使用してヒトＨＥＫ２９３細胞の三重プラスミドトランスフェクションによって生産される。ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＳＭＮ１ｃｏ．ｒＢＧによってパッケージングされたベクターゲノムの大きさは３２５７ｂｐである。

【0260】

１．ＡＡＶベクターゲノムプラスミド：ｐＥＮＮ．ＡＡＶ．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＳＭＮｃｏ．ｒＢＧ．ＫａｎＲ（ｐ４３４２）
ＡＡＶ－ｈＳＭＮ１ベクターゲノムプラスミドｐＥＮＮ．ＡＡＶ．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＳＭＮ１ｃｏ．ｒＢＧ（ｐ３２４６）は大きさが６０７７ｂｐである。このプラスミドに由来するベクターゲノムは、ＡＡＶ由来ＩＴＲがｈＳＭＮ１発現カセットの両側を挟んでいる一本鎖ＤＮＡゲノムである。導入遺伝子カセットからの発現は、ＣＭＶ即時早期エンハンサー（Ｃ４）とニワトリベータアクチンプロモーターとのハイブリッドであるＣＢ７プロモーターによって促される一方、このプロモーターからの転写はＣＩの存在によって増進される。発現カセットのためのポリＡシグナルはｒＢＧポリＡである。プラスミドは、ｈＳＭＮ１配列をコドン最適化及び合成すること（ＧｅｎｅＡｒｔ）によって構築され、結果として得た構築物を、ＣＢ７、ＣＩ及びｒＢＧ発現エレメントを含有しＡＡＶ２ ＩＴＲで両側を挟まれた発現カセットであるプラスミドｐＥＮＮ．ＡＡＶ．ＣＢ７．ＣＩ．ｒＢＧ（ｐ１０４４）にクローニングしてｐＡＡＶ．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＳＭＮ１ｃｏ．ｒＢＧ．（ｐ３２４６）を得た。ＫａｎＲプラスミドはｐＥＮＮ．ＡＡＶ．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＳＭＮ１ｃｏ．ｒＢＧ．ＫａｎＲ（ｐ４３４２）である。ｐ４３４２は、２つのＰａｃＩ部位においてｐＡＡＶ．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＳＭＮ１ｃｏ．ｒＢＧ．（ｐ３２４６）中のアンピシリン耐性主鎖をｐＥＮＮ．ＡＡＶ．ＴＢＧ．ＰＩ．ｈＬＤＬｒ．ｒＢＧ．ＫａｎＲ（ｐ２０１７）からのカナマイシン耐性主鎖で交換することによって構築された。

【0261】

配列エレメントの説明：
・ＩＴＲ：ＡＡＶ ＩＴＲ（ＧｅｎＢａｎｋ＃ＮＣ００１４０１）は、両端が同一であるが反対向きになっている配列である。ＡＡＶ及びアデノウイルスヘルパー機能がトランスで提供されるのに対し、ＡＡＶ２ ＩＴＲ配列はベクターＤＮＡ複製起点としてもベクターゲノムのパッケージングシグナルとしても機能する。このように、ＩＴＲ配列はベクターゲノムの複製及びパッケージングに必要とされる唯一のシス配列に相当する。
・ＣＭＶ即時早期エンハンサー（３８２ｂｐ、ＧｅｎＢａｎｋ＃Ｋ０３１０４．１）。
・ニワトリβ－アクチンプロモーター（２８２ｂｐ、ＧｅｎＢａｎｋ＃Ｘ００１８２．１）は、高レベルのｈＳＭＮ１発現を促すために使用される。
・ニワトリβ－アクチンイントロン：ニワトリβ－アクチン遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ＃Ｘ００１８２．１）からの９７３ｂｐのイントロンはベクター発現カセット内に存在する。イントロンは転写されるが、スプライシングによって成熟ｍＲＮＡから除去され、結果としてその両側にある配列がまとめ合わされる。発現カセットにおけるイントロンの存在は、核から細胞質へのｍＲＮＡの輸送を容易にしてそれゆえに翻訳のためのｍＲＮＡの定常レベルの蓄積を増進することが示された。
・コード配列：ｈＳＭＮ１配列：
（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｕｃｃｏｒｅ／ＮＭ＿０００３４４．３）はコドン最適化及び合成された。ＳＭＡは、テロメア側にある遺伝子であるＳＭＮ１
における突然変異によって引き起こされる。ＳＭＮ１における突然変異は下位運動ニューロンに対する選択的毒性を生じさせ、結果として進行性のニューロン喪失及び関連する筋肉の筋力低下及び変性を招く。導入遺伝子はＳＭＮ１のアイソフォームＤである。アイソフォームＤは最長のアイソフォームをコードし、この変異型は、ＣＮＳにおいてだけでなく遍在的にもＳＭＮ１によって産生する主たる転写産物／アイソフォームであると考えられる。
・ポリアデニル化シグナル：１２７ｂｐのウサギβ－グロビンポリアデニル化シグナル（ＧｅｎＢａｎｋ＃Ｖ００８８２．１）は、抗体ｍＲＮＡの効率的なポリアデニル化のためのシス配列を提供する。このエレメントは、転写終結、新生転写産物の３’端部における特異的切断事象、及び長鎖ポリアデニル尾部の追加のためのシグナルとして機能する。

【0262】

２．ＡＡＶｈｕ６８ヘルパープラスミド：ｐＡＡＶ２／ｈｕ６８ｎ．ＫａｎＲ（ｐ００６８）
ＡＡＶ２／ｈｕ６８ヘルパープラスミドｐＡＡＶ２／ｈｕ．６８（ロット＃ｐ００６５；７３２９ｂｐ）は、ＡＡＶ血清型ｈｕ６８からの４つのＷＴ ＡＡＶ２ ｒｅｐタンパク質及び３つのＷＴ ＡＡＶ ＶＰカプシドタンパク質をコードするＡＡＶヘルパープラスミドである。ヒト心臓組織ＤＮＡから新規ＡＡＶ配列が得られ、ＡＡＶ血清型ｈｕ６８と名付けた。キメラパッケージング構築物を作出するために、野生型ＡＡＶ２ｒｅｐ及びＡＡＶ９ ｃａｐ遺伝子を含有する、プラスミドｐＡＡＶ２／９ｎ（ｐ００６１－２）由来のＡＡＶ２ ｃａｐ遺伝子を除去し、ＡＡＶｈｕ６８ ｃａｐ遺伝子プラスミドｐＡＡＶ２／ｈｕ６８（ｐ００６５）の断片で置き換えた。通常はｒｅｐ発現を促すものであるＡＡＶ ｐ５プロモーターをこの構築物内でｒｅｐの５’端部からｃａｐの３’端部へと移動させる。この配置は、プロモーターとｒｅｐ遺伝子（すなわちプラスミド主鎖）との間にスペーサーを導入すること、ｒｅｐの発現を下方制御すること、及びベクター産生を支援する能力を高めることのために役立つ。ｐＡＡＶ２／９ｎのプラスミド主鎖はｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳからのものである。プラスミドの全ての構成部分は直接配列決定によって証明された。その後、アンピシリン耐性遺伝子をカナマイシン耐性遺伝子で置き換えてｐＡＡＶ２／ｈｕ６８ｎ．ＫａｎＲ（ｐ００６８）を得た。

【0263】

３．ｐＡｄＤｅｌｔａＦ６（Ｋａｎ）アデノウイルスヘルパープラスミド
プラスミドｐＡｄＤｅｌｔａＦ６（Ｋａｎ）は大きさが１５，７７４ｂｐである。当該プラスミドは、ＡＡＶ複製にとって重要なアデノウイルスゲノムの領域、すなわちＥ２Ａ、Ｅ４及びＶＡ ＲＮＡ（アデノウイルスＥ１の機能は２９３細胞によって提供される）を含有するが、その他のアデノウイルス複製または構造遺伝子を含有しない。プラスミドは、複製に必須なシスエレメント、例えばアデノウイルス末端逆位反復配列を含有せず、したがって、感染性アデノウイルスは生成しないと推測される。それはＡｄ５のＥ１、Ｅ３を欠失させた分子クローン（ｐＢＲ３２２系プラスミドであるｐＢＨＧ１０）から得られた。欠失は、不必要なアデノウイルス遺伝子の発現を除去するため及びアデノウイルスＤＮＡの量を３２Ｋｂから１２ｋｂに減らすためにＡｄ５ ＤＮＡ中に導入された。最後に、アンピシリン耐性遺伝子をカナマイシン耐性遺伝子で置き換えてｐＡｄｅｌｔａＦ６（Ｋａｎ）を得た。このプラスミドの中に残っているＥ２、Ｅ４及びＶＡＩアデノウイルス遺伝子は、ＨＥＫ２９３細胞内に存在するＥ１と共に、ＡＡＶベクター産生のために必要なものである。

【0264】

４．マスターセルバンク
ＨＥＫ２９３細胞は元来、［Ｇｒａｈａｍ ＦＬ，ｅｔ ａｌ，（１９７７）Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ａ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｂｙ ＤＮＡ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ５．Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ ３６（１）：５９－７４］によって記載されているように共通のアデノウイルス５型ＤＮＡでＨＥＫ細胞を形質転換することによって生成された。当
該細胞は、高力価ｒＡＡＶ産生のために必要とされるＥ１Ａ及びＥ１Ｂ遺伝子産物を発現する。ＨＥＫ２９３細胞は付着性でありトランスフェクト能が高く、ＤＮＡプラスミドトランスフェクションによって高力価のｒＡＡＶを産する。細菌マスターセルバンク（ＢＭＣＢ）グリセロール原液は、プラスミドＤＮＡ増幅のために使用する終夜細胞培養物１Ｌのうちの１ｍＬを等体積の無菌５０％グリセロールと混合することによって作られる。混合物から構築物１つにつきＢＭＣＢグリセロール原液の２つの０．５ｍＬアリコートを調製し、Ｎａｌｇｅｎｅ冷凍用バイアルの中で－８０℃で保存する。ＢＭＣＢグリセロール原液の検証を行うために増幅プラスミドＤＮＡを、制限酵素消化に続くゲル電気泳動を含む社内での構造解析、及びＱｉａｇｅｎでのサンガー配列決定による完全プラスミド配列解析に供する。プラスミドＤＮＡ製造者（Ｐｕｒｅｓｙｎ Ｉｎｃ．）へ出荷するための細菌ワーキングセルバンク（ＢＷＣＢ）グリセロール原液アリコートを調製するために、ＢＭＣＢグリセロール原液からの３ｍＬの培養物を接種し、一晩生育させる。終夜培養物１ｍＬを使用して上記のようなＢＷＣＢグリセロール原液アリコートを調製する。

【0265】

５．製造プロセスの概説
ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＳＭＮ１ｃｏ．ｒＢＧベクター生産プロセスを図１５Ａ～Ｂの製造プロセスフロー図に示す。生成物の配合物の中に入れる主な試薬を図の左側に示し、工程内品質評価を図の右側に描写する。各生産及び精製ステップの描写も提供されている。製品製造は直線的ユニット操作フローに従って行い、特に指定しない限り使い捨てのバイオ処理閉鎖系を利用する。細胞播種から上清採集までの細胞培養を伴う生産プロセスの全ステップは、滅菌された単回使用管類及びバッグ組立体を使用して無菌的に実施される。Ｃｏｒｎｉｎｇ １０層型ＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）（ＣＳ－１０）及びＨＳ－３６において全て開放型操作で細胞を培養する。精製プロセスは可能な場合には閉鎖系で実施するが、カラムクロマトグラフィー操作は衛生的操作であると考えられ、完全に閉鎖系であるとはみなされない。

【0266】

６．製造プロセスの説明
ａ．細胞播種
適格なＨＥＫ２９３細胞株を生産プロセスに使用する。ＷＣＢは、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ研究所にて５．２．６に記載のＭＣＢ－２から生産されたものであり、ＩＮＤ申請において特徴付けられることになる。ベクター生産のために用いる細胞培養を、一度解凍したＷＣＢバイアルから開始し、マスターバッチレコード書類（ＭＢＲ）に従って増殖させることになる。Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｔ－フラスコ及びＣＳ－１０を使用して、細胞を５×１０^９～５×１０^１０細胞にまで増殖させるが、これは、ＢＳＤバッチ１回あたりベクター生産のために４８ＨＳ－３６まで播種するのに十分な細胞量を生成することを可能にする。ガンマ線照射され米国またはニュージーランドから提供される１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）からなる培地中で細胞を培養する。細胞は固定化依存性であり、細胞解離は、動物産物を含まない細胞解離用試薬であるＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｓｅｌｅｃｔを使用して成し遂げられることになる。細胞播種は、無菌の単回使用バイオ処理バッグ及び管類のセットを使用して成し遂げられることになる。細胞は５％（±０．５％）ＣＯ_２雰囲気下で３７℃（±２℃）で維持されることになる。

【0267】

ｂ．一過的トランスフェクション
およそ３日間の増殖（ＤＭＥＭ培地＋１０％ＦＢＳ）の後、ＨＳ－３６細胞培養培地を新鮮な無血清ＤＭＥＭ培地で交換し、トランスフェクション方法に基づいて最適化ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を使用して３つの生産プラスミドをトランスフェクトすることになる。ＢＳＣにおいて十分なプラスミドＤＮＡトランスフェクション複合体を作製して（ＢＤＳバッチ１回あたり）４８ＨＳ－３６にトランスフェクトすることになる。まず、シス（ベクターゲノム）プラスミド、トランス（カプシド及びｒｅｐ遺伝子）プラスミド及
びヘルパー（Ａｄ）プラスミドを０．１：１：２の比で含有しＧＭＰグレードのＰＥＩ（ＰＥＩＰｒｏ、ＰｏｌｙＰｌｕｓ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ＳＡ）を含有するＤＮＡ／ＰＥＩ混合物を調製することになる。このプラスミド比は、小規模最適化試験においてＡＡＶ産生にとって最適となるように決定されたものである。ウェルを混合した後、溶液を室温で２５分間静置し、その後、反応を停止させるために無血清培地に加え、最後にＨＳ－３６に加えることになる。トランスフェクション混合物はＨＳ－３６の３６層全てにおいて等しくされることになり、細胞は５％（±０．５％）ＣＯ_２雰囲気下で５日間３７℃（±２℃）でインキュベートされることになる。

【0268】

ｃ．細胞培地採集
培地をユニットから無菌的に排出させることによって、使い捨てバイオ処理バッグを使用して各ＨＳ－３６からトランスフェクトした細胞及び培地を採集することになる。培地採集後、およそ２００リットルの体積にＭｇＣｌ_２（ベンゾナーゼの補助因子）を２ｍＭの終濃度になるまで補充し、ベンゾナーゼヌクレアーゼを２５ユニット／ｍＬの終濃度になるまで添加することになる。インキュベータ内で（使い捨てバイオ処理バッグに入った）産物を３７℃で２時間インキュベートして、トランスフェクション手順の結果としての採集物の中に残存する細胞ＤＮＡ及びプラスミドＤＮＡの酵素的消化のために十分な時間を提供することになる。このステップは、最終ベクターＤＰの中に残存するＤＮＡの量を最小限に抑えるために実施される。インキュベート後、濾過及び下流でのタンジェンシャルフロー濾過の間の産物回収に役立てるためにＮａＣｌを５００ｍＭの終濃度になるまで添加することになる。

【0269】

ｄ．清澄化
細胞及び細胞残屑は、蠕動ポンプによって駆動される無菌閉鎖型管類及びバッグのセットとして直列で連結されたデプスフィルターカプセル（１．２／０．２２μｍ）を使用して産物から除去されることになる。清澄化は、下流のフィルター及びクロマトグラフィーカラムが汚染から保護されることを保障し、生物汚染軽減濾過は、上流での生産プロセスの間に取り込まれたいかなる生物汚染も下流での精製よりも前の一連の濾過の最後に除去されていることを保障する。採集材料はＳａｒｔｏｒｉｕｓ Ｓａｒｔｏｇｕａｒｄ ＰＥＳカプセルフィルター（１．２／０．２２μｍ）（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｓｔｅｄｉｍ
Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ．）に通されることになる。

【0270】

ｅ．大規模タンジェンシャルフロー濾過
清澄化した生成物の体積の低減（１０分の１）は、あつらえの無菌閉鎖型バイオ処理管類、バッグ及び膜のセットを使用してタンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）によって実現されることになる。ＴＦＦの原理は、圧力下で溶液を好適な多孔度の膜（１００ｋＤａ）に平行に流すことである。圧力差分は、膜孔よりも大きい分子を保持しつつ、より小さい径の分子を膜中へ、そして効果的に排液流中へと送り込む。溶液を再循環させることによって、平行流は膜表面をかっさらい、膜孔の詰まり、及び膜への結合による生成物の逸失を防止する。適切な膜孔径及び表面積を選択することによって、液体試料の体積が急速に低減され得る一方で所望の分子が保持及び濃縮され得る。ＴＦＦ用途における透析濾過には、液体が膜を通り抜けて排流へと流れるのと同じ速度で再循環している試料に新鮮な緩衝液を添加することを伴う。透析濾過の体積が増加するにつれて、ますます多くの量の小分子が再循環試料から除去される。これによって清澄化生成物は適度に精製されるだけでなく、次の親和性カラムクロマトグラフィーステップに適合する緩衝液交換も成し遂げられる。したがって、本発明者らは、濃縮のために１００ｋＤａのＰＥＳ膜を利用し、そうしてｐＨ７．５の２０ｍＭのトリスと４００ｍＭのＮａＣｌとからなる最低４ダイア容積の緩衝液で透析濾過する。透析濾過生成物は、４℃で一晩保存され、その後、いかなる析出物質も除去すべく１．２／０．２２μｍデプスフィルターカプセルでさらに清澄化されることになる。

【0271】

ｆ．親和性クロマトグラフィー
ＡＡＶｈｕ６８血清型を効率的に捕捉するＰｏｒｏｓ ＴＭ Ｃａｐｔｕｒｅ ＳｅｌｅｃｔＴＭ ＡＡＶ９親和性樹脂（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に対して透析濾過生成物を使用することになる。これらのイオン性条件下では、残存する細胞ＤＮＡ及びタンパク質はかなりの割合でカラムを通り抜けて流れる一方、ＡＡＶ粒子は効率的に捕捉される。使用後、カラムを５体積の低塩ベンゾナーゼ溶液（２５００Ｕ／ｍＬのベンゾナーゼ、ｐＨ７．５の２０ｍＭのトリス、及び４０ｍＭのＮａＣｌ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ_２）で処理して、残存するいかなる宿主細胞及びプラスミド核酸も除去する。カラムを洗浄して追加給液不純物を除去し、続いて、１／１０の体積の中和用緩衝液（ｐＨ１０．２の２００ｍＭのビストリスプロパン）中への回収によって速やかに中和される低ｐＨステップ溶離（４００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ２．５の２０ｍＭのクエン酸ナトリウム）を行う。

【0272】

ｇ．アニオン交換クロマトグラフィー
空のＡＡＶ粒子を含めた工程内不純物のさらなる低減を実現するために、Ｐｏｒｏｓ－ＡＡＶ９溶離プールを５０倍に希釈（２０ｍＭのビストリスプロパン、ｐＨ１０．２の０．００１％のプルロニックＦ６８）してイオン強度を下げ、ＣＩＭｕｌｔｕｓ（商標）ＱＡモノリスマトリックス（ＢＩＡ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ）への結合を可能にする。低塩洗浄に続いて、６０カラム容積（ＣＶ）のＮａＣｌ線形塩勾配（１０～１８０ｍＭのＮａＣｌ）を用いてベクター産物を溶離させる。この緩やかな塩勾配は、ベクターゲノムを含有する粒子（充満粒子）から、ベクターゲノムを有さないカプシド粒子（空の粒子）を効果的に分離し、完全カプシドが濃縮された配合物をもたらす。画分は、１／１００の体積の０．１％プルロニックＦ６８及び１／２７の体積のビストリスｐＨ６．３がそれぞれチューブとの非特異的結合及び高ｐＨへの長い曝露を最小限に抑えるために入っているチューブの中へと回収されることになる。プールした充満粒子ピーク画分を２０ｍＭのビストリスプロパン、ｐＨ１０．２の０．００１％のプルロニックＦ６８で２０倍に希釈し、洗浄して準備しておいた同じカラムに対して再び使用する。１０～１８０ｍＭのＮａＣｌ塩勾配を再び用い、適切な充満粒子ピーク画分が回収されることになる。ピーク面積を評価し、適切なベクター収率の決定のために以前のデータと比較する。

【0273】

ｈ．最終製剤、及びＢＤＳを得るための生物汚染軽減濾過
プールしたアニオン交換（ＡＥＸ）画分に対してＴＦＦを用いて１００ｋＤａの膜によって最終製剤を得る。これは最終製剤用緩衝液の透析濾過によって成し遂げられることになり、濃縮されて所望の目標濃度のＢＤＳを産することになる。ＢＤＳ検査（以下の節で説明する）のために試料を抜き取ることになる。ＢＤＳを無菌濾過（０．２２μｍ）し、無菌ポリプロピレンチューブの中に保存し、最終充填のための取出し時まで、隔離された場所に－６０℃以下で冷凍する。

【0274】

ｉ．最終充填
凍結ＢＤＳを解凍し、プールし、最終製剤用緩衝液を使用して目標濃度に調節（ＴＦＦによる希釈または濃縮ステップ）することになる。その後、最終的に生成物を０．２２μｍフィルターに通し、無菌のＷｅｓｔ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ’ｓ Ｃｒｙｓｔａｌ Ｚｅｎｉｔｈ（ポリマー製）バイアルに充填し、決定される全体容積のところにかしめシール付き栓をすることになる。個々のバイアルに、以下の規格に従ったラベルを付けることになる。ラベルを付けたバイアルは－６０℃以下で保管する。
ｊ．ベクターゲノム同定：ＤＮＡ及びＮＧＳ配列決定
ウイルスベクターゲノムＤＮＡを単離し、プライマーウォーキングを用いて２倍配列決定対象範囲によって配列決定する。配列アラインメントを実施し、予測配列と比較する。特定の実施形態では、例えばＩｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）機械を使用して、次世代配列
決定（高処理量配列決定としても知られる）を実施する。

【0275】

ｋ．ベクターカプシド同定：ＶＰ１のＡＡＶカプシド質量分析
ベクターのＡＡＶｈｕ６８血清型の確認は、ＡＡＶカプシドタンパク質のペプチドの分析に基づいて開発されたアッセイによって成し遂げられる。方法は、ＶＰのトリプシン消化、及びそれに続くカプシドタンパク質ペプチドを配列決定するためのＱ－Ｅｘａｃｔｉｖｅ Ｏｒｂｉｔｒａｐ質量分析計でのタンデム質量分析による特性評価を含む。配列決定されたタンデム質量分析スペクトルからスペクトルライブラリー、及び指向的質量分析法を用いて、特定のＡＡＶウイルス粒子血清型を独自に同定することができるシグネチャペプチドについてアッセイする。８つのＡＡＶ（ＡＡＶｈｕ６８、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｈｕ３７）に特有のシグネチャペプチドのバンクを、試験物品の消化によって得られるタンデム質量分析スペクトルに照らしてスクリーニングする。明確な同定のために、単一の血清型のみからのシグネチャペプチド（複数可）が検出されることになる。

【0276】

１．遺伝子コピー力価
ＡＡＶベクターのＧＣ力価を決定するための、デジタル液滴ポリメラーゼ連鎖反応（ｄｄＰＣＲ）に基づく技術が近年開発された［Ｌｏｃｋ Ｍ，Ａｌｖｉｒａ ＭＲ，Ｃｈｅｎ ＳＪ，＆Ｗｉｌｓｏｎ ＪＭ（２０１４） Ａｂｓｏｌｕｔｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ ａｎｄ ｓｅｌｆ－ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ ｇｅｎｏｍｅ ｔｉｔｅｒｓ ｂｙ ｄｒｏｐｌｅｔ ｄｉｇｉｔａｌ ＰＣＲ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２５（２）：１１５－１２５］。方法は実用的であり、ｑＰＣＲと同等またはそれより良好な力価を報告し、プラスミド標準曲線を必要としない。利用したアッセイは、ＤＮアーゼＩによる消化と、それに続くカプセル化ベクターゲノムコピーを測定するためのデジタルＰＣＲ分析とを含むものであった。ＤＮＡ検出は、ポリＡ領域を標的とする配列特異的なプライマー、及びこれと同じ領域にハイブリダイズする蛍光標識プローブを併用して成し遂げられた。多くの標準、検証用試料及び（バックグラウンド及びＤＮＡ汚染のための）対照をアッセイに取り入れた。

【0277】

ｍ．感染単位力価
感染単位（ＩＵ）アッセイを用いて、ＲＣ３２細胞（ｒｅｐ２発現ＨｅＬａ細胞）におけるｒＡＡＶの生産的取込み及び複製を決定する。以前に公開されているものに類似する９６ウェルエンドポイントフォーマットを採用した。手短に述べると、ｒＡＡＶの希釈ごとに複製を１２回とするｒＡＡＶ ＢＤＳの段階希釈液及びＡｄ５の均一希釈液にＲＣ３２細胞を共感染させる。感染から７２時間後に細胞を溶解させ、ｑＰＣＲを実施して投入量を上回るｒＡＡＶベクター増幅を検出する。エンドポイント希釈物の５０％組織培養感染量（ＴＣＩＤ５０）計算（Ｓｐｅａｒｍａｎ－Ｋａｒｂｅｒ）を実施して、ＩＵ／ｍＬとして表される複製力価を決定する。「感染性」の値は、粒子の細胞との接触、受容体結合、内在化、核への輸送、及びゲノム複製に依存するため、アッセイ構成、ならびに使用細胞株における適切な受容体及び結合後経路の存在によって影響を受ける。受容体及び結合後経路は通常、固定化細胞株の中に維持されておらず、したがって感染性アッセイ力価は、存在している「感染性」粒子の数の絶対的尺度ではない。それにもかかわらず、「感染単位」に対するカプシド化ＧＣの比率（ＧＣ／ＩＵ比率として表される）はロット間の製品一貫性の尺度として用いられ得る。

【0278】

ｎ．充満粒子に対する空粒子の比率
分析的超遠心分離機（ＡＵＣ）で測定される沈降速度は、凝集物、その他の少量成分を検出することができるだけでなく、異なる粒子種の相対量の良好な定量をそれらの異なる沈降係数に基づいて提供することもできる。これは、長さ及び時間の基本的単位に基づく
絶対的方法であり、基準としての標準分子を必要としない。１２ｍｍの光路長を有する２流路型ｃｈａｒｃｏａｌ－ｅｐｏｎ ｃｅｎｔｅｒｐｉｅｃｅを備えたセルの中にベクター試料を装填する。供給される希釈用緩衝液を各セルの基準流路内に装填する。その後、装填されたセルをＡＮ－６０Ｔｉ分析ローター内に配置し、吸光度及びＲＩの両方の検出器を備えたＢｅｃｋｍａｎ－Ｃｏｕｌｔｅｒ ＰｒｏｔｅｏｍｅＬａｂ ＸＬ－Ｉ分析的超遠心分離機内に入れる。温度が完全に２０℃の平衡に達した後、ローターを１２，０００ｒｐｍの最終回転速度にする。２８０ｎｍでの吸光度のスキャンをおよそ５．５時間にわたっておよそ３分ごとに記録する（試料１つにつき合計１１０回のスキャン）。解析プログラムＳＥＤＦＩＴ内に実装されているｃ（ｓ）法を使用して生データを解析する。結果として得られる粒径分布をグラフ化し、ピークを積分する。各ピークに関連する百分率値は全ピーク下の総面積に占めるピーク面積の分率を表し、２８０ｎｍで生成された生データに基づく。多くの実験室はこれらの値を使用して空粒子：充満粒子の比を算出する。しかしながら、空粒子及び充満粒子はこの波長において異なる消光係数を有するため、生データは適宜調節され得る。消光係数調節の前と後との両方における空粒子と充満単量体ピーク値との比を使用して空－充満粒子比率を決定し、両比率を解析の証明書に記録する。

【0279】

ｏ．宿主細胞ＤＮＡ
ｑＰＣＲアッセイを用いて残存ヒト２９３ＤＮＡを検出する。「非関連ＤＮＡ」をスパイクした後、全ての（非関連の、ベクターの、及び残存ゲノムの）ＤＮＡをおよそ１ｍＬの生成物から抽出する。１８Ｓ ｒＤＮＡ遺伝子を標的とするｑＰＣＲを用いて宿主細胞ＤＮＡを定量する。検出されたＤＮＡの量を、スパイクした非関連ＤＮＡの回収に基づいて正規化する。３つの異なるアンプリコンサイズを試験して残存宿主細胞ＤＮＡのサイズ範囲を確立する。

【0280】

ｐ．宿主細胞タンパク質
ＥＬＩＳＡを実施して汚染宿主ＨＥＫ２９３細胞タンパク質のレベルを測定する。Ｃｙｇｎｕｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＨＥＫ２９３宿主細胞タンパク質第２世代ＥＬＩＳＡキットを販売者によって提供される指示に従って使用する。

【0281】

ｑ．複製可能ＡＡＶアッセイ
生産プロセス中に潜在的に生じ得る複製可能ＡＡＶ／ｈｕ６８（ｒｃＡＡＶ）が存在しているかどうか試料を分析する。細胞に基づく増幅及び継代ならびにそれに続くリアルタイムｑＰＣＲによるｒｃＡＡＶ ＤＮＡ（ｃａｐｈｕ６８標的）の検出からなる３回継代アッセイを開発した。細胞に基づく構成部分は、ＨＥＫ２９３細胞（Ｐ１）の単層を試験試料の希釈物及びＷＴヒトアデノウイルス５型（Ａｄ５）と共に接種することからなる。試験する産物は最大量を１×１０^１０ＧＣのベクター産物とすることになる。アデノウイルスが存在するためにｒｃＡＡＶは細胞培養中に増幅することになる。２日後に細胞溶解物を生成し、Ａｄ５を加熱によって失活させる。その後、清澄化した溶解物を（再びＡｄ５の存在下で）２回目の細胞で継代（Ｐ２）して感度を増強させる。２日後、細胞溶解物を生成し、Ａｄ５を加熱によって失活させる。その後、清澄化した溶解物を（再びＡｄ５の存在下で）３回目の細胞で継代（Ｐ３）して感度を最大にする。２日後、細胞を溶解させてＤＮＡを遊離させ、次いでこれをｑＰＣＲに供してＡＡＶｈｕ６８ ｃａｐ配列を検出する。Ａｄ５依存的な方法でのＡＡＶｕ６８ ｃａｐ配列の増幅はｒｃＡＡＶの存在を示唆する。ＡＡＶ２ ｒｅｐ及びＡＡＶｈｕ６８ ｃａｐ遺伝子を含有するＡＡＶ２／ｈｕ６８代用陽性対照の使用は、アッセイの検出限界（ＬＯＤ）（０．１、１、１０及び１００ＩＵ）を決定することを可能にし、ｒＡＡＶ（１×１０^１０、１×１０^９、１×１０^８、及び１×１０^７ＧＣ）の段階希釈を用いて、試験試料中に存在するｒｃＡＡＶのおよそのレベルを定量することができる。

【0282】

ｒ．試験管内での有効性
ｑＰＣＲでのＧＣ力価を遺伝子発現と関連付けるために、試験管内でのバイオアッセイを実施する。手短に述べると、細胞を９６ウェルプレートのウェルごとに播種し、３７℃／５％ＣＯ_２で一晩インキュベートする。翌日、細胞を段階希釈ＡＡＶベクターに感染させ、３７℃／５％ＣＯ_２で２日間インキュベートする。その後、細胞を４％のパラホルムアルデヒドで固定し、続いて０．１％のＴｒｉｔｏｎ－１００を含有するＰＢＳで洗浄し、その後、ブロッキング用緩衝液と共にインキュベートする。ブロッキング後、細胞を一次抗体（ＧｅｎＴｅｘ モノクローナルα－Ｓｍｎ１、カタログ番号ＧＴＸ６０４５１）の１：２００希釈液と共にインキュベートし、洗浄し、１：５００のα－マウス－４８８（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）と共にインキュベートする。撮像前に、ＤＡＰＩを含有するＰＢＳで細胞を処理して核を可視化する。Ｃｅｌｌ Ｉｎｓｉｇｈｔ Ｃｘ５ ｈｉｇｈ ｃｏｎｔｅｎｔ撮像装置（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用してプレートを撮像する。データキャプチャのための現在の方法は、ウェル１つあたり２，５００個の物体（例えば細胞）をスクリーニングすること、及び改変型ＳｐｏｔＩＤプロトコールを使用して核１つあたりのカハール体の対の数を数えることである。核におけるカハール体の対の形成は機能性Ｓｍｎ１タンパク質に依存する。ｙ軸上の計器読み値に対してＬｏｇベクターＭＯＩをｘ軸上にプロットする。アッセイの最適化は現在進行中である。

【0283】

ｓ．総タンパク質、カプシドタンパク質、タンパク質純度、及びカプシドタンパク質比率
まず、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）アッセイを用いてウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）タンパク質標準曲線に照らしてベクター試料の総タンパク質を定量する。決定は、試料とキット内に提供されているＭｉｃｒｏ－ＢＣＡ試薬とを等しい部で混合することによって行う。同じ手順をＢＳＡ標準の希釈に適用する。混合物を６０℃でインキュベートし、５６２ｎｍでの吸光度を測定する。４係数近似を用いて既知濃度の標準吸光度から標準曲線を生成する。未知試料を４係数回帰によって定量する。ｒＡＡＶ純度の半定量的決定をもたらすために、試料をゲノム力価に対して正規化し、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）ゲル上で５×１０^９ＧＣを還元条件下で分離するすることになる。その後、ゲルをＳＹＰＲＯ Ｒｕｂｙ色素で染色する。いかなる不純物バンドも濃度測定によって定量する。３つのＡＡＶ特有のタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３の他に現れる染色バンドはタンパク質不純物であると考えられる。不純物の質量パーセント及び汚染バンドのおよその分子量を報告する。ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルは、ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３タンパク質を定量しそれらの比率を決定するためにも用いられる。

【0284】

ｔ．ＢＳＡタンパク質
このアッセイは、Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから得られるウシアルブミンＥＬＩＳＡキットを使用してアッセイキット共に提供されるプロトコールに従って実施される。

【0285】

ｕ．ベンゾナーゼエンドヌクレアーゼ
プロセス不純物に相当する核酸を分解してベクター精製を容易にするために、生産プロセスにおいてベンゾナーゼを使用する。商用ＥＬＩＳＡ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して残存ベンゾナーゼの濃度を測定する。ベンゾナーゼの量はあるとすれば痕跡量である可能性があるため、１ｎｇ／ｍＬ未満の濃度を含む様々な標準を使用してＥＬＩＳＡを実施する必要がある。

【0286】

ｖ．ＩＵに対するＧＣの比率
ＧＣ／ＩＵ比率は製品一貫性の尺度である。ｄｄＰＣＲ力価（ＧＣ／ｍＬ）を「感染単位（ＩＵ／ｍＬ）」で割って算出されたＧＣ／ＩＵ比率が得られる。

【0287】

ｗ．浸透圧、ｐＨ及び外観検査
浸透圧及びｐＨをそれぞれＵＳＰ＜７８５＞及びＵＳＰ＜７９１＞に従って決定する。製品の外観を目視点検によって透明性、色、及び異物粒子の非存在／存在について判定する。白色及び黒色の背景に対して製品を点検する。

【0288】

実施例１４－ヒトＳＭＮを発現するＡＡＶベクターの高用量静脈内投与後の非ヒト霊長類及び仔ブタにおける重度の毒性
向神経性ＡＡＶ血清型、例えばＡＡＶ９は、高用量で静脈内投与された場合に脊髄アルファ運動ニューロンに形質導入することが実証されている。この観察結果は、下位運動ニューロンの選択的な死によって特徴付けられる運動神経細胞生存（ＳＭＮ）タンパク質の遺伝性欠乏症である脊髄性筋萎縮症を有する乳児の治療への近年における静脈内ＡＡＶ９送達の応用の成功につながった。

【0289】

この手法を用いる運動ニューロン形質導入の効率を評価するために、ヒトＳＭＮ発現カセットを保有しＡＡＶ血清型９との密接な関連があるヒトＳＭＮ導入遺伝子を保有するＡＡＶベクター（ＡＡＶｈｕ６８）をＳＭＡ臨床試験で採用したのと同様の用量で静脈内注射することによって３頭の若年非ヒト霊長類（ＮＨＰ、１３～１４月齢）及び３匹の新生仔ブタ（７～３０日齢）を処置した。動物を脊髄運動ニューロンの形質導入及び毒性の証拠について評価した。体重１キログラムあたり２×１０^１４ゲノムコピーの投与の結果、どちらの種においても脊髄運動ニューロンが広範に形質導入された。しかしながら、ＮＨＰ及び仔ブタの両方に重度の毒性が生じた。３頭全てのＮＨＰが顕著なトランスアミナーゼ上昇を呈し、１頭の動物は急性肝不全及びショックの臨床的及び組織学的兆候のために注射後５日目に安楽死させた。後根神経節（ＤＲＧ）知覚ニューロンの変性も観察され、しかしながらＮＨＰは臨床的に明らかな感覚障害を呈しなかった。ＮＨＰにおいて、臨床所見と、ベクターカプシドまたは導入遺伝子産物に対するＴ細胞応答との間に相関はなかった。仔ブタは、肝臓毒性の証拠を示さなかったものの、ベクター注射後１４日以内に３匹全ての動物が、歩行能を大いに低下させ安楽死を必要にする自己受容器感覚障害及び運動失調を呈した。これらの臨床所見は、ＮＨＰで認められたものよりも高い重度のＤＲＧ感覚ニューロン病変と相関していた。これらの種における肝臓及び感覚ニューロンの所見はカプシドまたは導入遺伝子産物に対する免疫応答とは無関係なＡＡＶ形質導入の直接的転帰であると見受けられる。ＡＡＶベクターへの高い全身曝露を伴う前臨床及び臨床試験は、類似する毒性に対する慎重な監視を含むべきである。

【0290】

Ａ．結果：
１．非ヒト霊長類試験：
ニワトリベータアクチンプロモーター及びサイトメガロウイルス即時早期エンハンサーの制御下でヒトＳＭＮを発現するＡＡＶｈｕ６８ベクターの２×１０^１４ＧＣ／ｋｇの静脈内（ＩＶ）用量を３頭の１３～１４月齢アカゲザルに投与した（表１）。

【表7】

【0291】

全ての動物は、ベクター点滴中に安定した生命徴候を呈し、麻酔から問題なく回復した。試験５日目に動物１６Ｃ１７６は急性的に非応答になった。身体検査から、蒼白粘膜、ベクター投与時からの１５％の体重減少、肝腫大、及び触知できる腹水波動が明らかになった。血液検査における異常は、２２％の血球容積、２０ｍｇ／ｄＬ未満のグルコース、７５ｍｇ／ｄＬのＢＵＮ、及び２ｍｇ／ｄＬのクレアチニンを含んでいた。この動物の容態は急速に悪化し、後にそれを安楽死させた。全面的な剖検を実施した。

【0292】

安楽死の時に血液を採取し、全血清化学パネルを実施した。注目すべき所見には、低タンパク血症、目立って高い肝臓酵素（ＡＳＴ、ＡＬＴ、ＧＧＴＰ、ＡＬＰ）、高ビリルビン血症、血中尿素窒素（ＢＵＮ）の増加、ＢＵＮ／クレアチニン比率の上昇、高リン血症、低血糖症、低カルシウム血症、低塩素血症、低コレステロール血症、高トリグリセライド血症、及びクレアチニンホスホキナーゼ（ＣＰＫ）の上昇が含まれた（図１６Ａ～Ｅ）。これらの所見は、おそらく低灌流による二次性の腎不全を伴った肝不全を示唆していた。剖検に際して採取された試料は溶血が甚だしく、このため全血球計算（ＣＢＣ）及び凝固パネルの報告はなされなかった。

【0293】

剖検時、腹腔はおよそ４４ｍＬの赤色の漿液性流体を含有していた。腹水の細胞学的評価は、急性出血による滲出物との一貫性を有していた。肝臓は散在拡大して硬く黄褐色～赤色のまだらになっていたが、これは組織学的には肝実質の約９５％に対して及ぼしている大量の肝細胞壊死及び変性に対応し、比較的正常な肝細胞の塊がごく稀に残っていた（図１７Ａ～Ｄ）。小葉中心領域～中間帯領域は肝細胞喪失、変性及び壊死によって激しく充血していた。さらに、類洞内に栓子を頻繁に形成し門脈の管腔に充満しているフィブリンの小さい病変部があった（フィブリン血栓）。

【0294】

フィブリノゲンの免疫組織化学（ＩＨＣ）から、類洞フィブリン栓子の存在が確認された。フィブリノゲン染色は門脈周辺～中間帯領域内で陽性が強かったが、これは、残存する肝実質内の急性肝細胞壊死の領域であった。フィブリノゲン染色はこれらの領域では類洞を強調することが多かった。壊死肝細胞及び関連残屑も陽性が強かった。

【0295】

脾臓は散在拡大して硬く充血していた。充血は組織学的に確認され、白脾髄内の胚細胞中心はリンパ球が枯渇しており広範囲にわたる細胞残屑（リンパ球溶解）があり、顕著で時折ヒアリン化している高内皮静脈（ＨＥＶ）を有していた。同様に、胸腺の皮質は軽度のリンパ球溶解を呈し、可染体マクロファージが目立っていた。

【0296】

巨視的に見て、腸間膜リンパ節は散在拡大し充血していた。組織学的には濾胞はリンパ球溶解による胚細胞中心枯渇を呈していた。同様の組織学的所見が、他の（顎下、直腸）リンパ節、肺の気管支関連リンパ組織（ＢＡＬＴ）ならびに結腸及び盲腸の腸関連リンパ組織（ＧＡＬＴ）を含めた他のリンパ組織に認められた。直腸に関連するリンパ節は、想定上の腸管リンパ節であるが、被膜下及び髄洞赤血球増加を有し、赤血球の排出との一貫性を有していた。リンパ嚢胞内の組織学的所見は、重度の全身性ストレスを示唆していた。

【0297】

組織学的に、急性出血及び浮腫は肺、胆嚢の外膜、心臓、直腸周囲脂肪組織及び乳腺付近の皮下組織において明らかであった。小腸、盲腸及び直腸の表層粘膜は、時節発生する出血、及び血鉄素を含むマクロファージの表在凝固物のために充血していた。肺、消化管及び肝臓における出血及び浮腫の存在は、これらが非ヒト霊長類の既知のショック臓器であることからショックを示唆している。膵臓における腺房細胞変性が認められたが、これも非ヒト霊長類におけるショックの事例で報告されている（Ｋｈａｎ，Ｎ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．Ｍｉｔｉｇａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｅｐｔｉｃ ｓｈｏｃｋ ｉｎ ｍｉｃｅ ａｎｄ ｒｈｅｓｕｓ ｍｏｎｋｅｙｓ ｂｙ ｈｕｍａｎ ｃｈｏｒｉｏｎｉｃ ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｈｉｎ－ｒｅｌａｔｅｄ ｏｌｉｇｏｐｅｐｔｉｄｅｓ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ
ａｎｄ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １６０，４６６－４７８（２０１０））。最小限の副腎皮質単細胞変性及び壊死が副腎の束状帯に存在しており、これも全身性疾患、例えば、全身性ストレス、虚血、出血及び炎症の原因である可能性があった。組織学的所見はこの動物の脳、脊髄、脳神経及び末梢神経には認められなかった。腎臓には重要な所見が認められなかった。

【0298】

残り２頭の霊長類（１６Ｃ１１６及び１６Ｃ２１５）は試験全体を通して臨床的に正常であり、２８日目に計画通りに剖検した。試験全体を通して指定の時点に実施した血液検査から、５日目の劇的なトランスアミナーゼ上昇が明らかになり、これは７日目には低下して１４日目には正常になった（図１６Ａ～Ｅ）。残り２頭の霊長類のうちの１頭は５日目に一過性の血小板減少症（血小板数２４，０００／μＬ）を呈した。血小板は、他の動物では凝集のために定量することができなかったが、末梢血スメアでは数が正常であると見受けられた。血液検査はそれ以外では試験全体を通して目立ったところはなかった。剖検時、１頭の動物（１６Ｃ１１６）の肝臓は小葉の模様を際立たせて黄褐色～赤色のまだらになっていた。これら２頭の霊長類のどちらにおいても他に異常は認められなかった。

【0299】

組織学的には、両方の霊長類の肝臓は最小限の多巣性単肝細胞壊死を呈し、これは門脈周囲領域において最も顕著であった（図１７Ａ～Ｄ）。加えて、動物１６Ｃ２１５は、細胞質性好塩基球増加症によって不規則に並んだ肝細胞の多巣性凝固物、胞状の核、及び再生を指し示す有糸分裂像を有していた。これらの肝細胞の塊は、散在する単核細胞浸潤物及び増殖している線維芽細胞と共に大抵門脈領域を囲んでいた（線維増殖症）。

【0300】

２頭の最後に剖検した霊長類（１６Ｃ２１５及び１６Ｃ１１６）における組織学的所見は、神経系、主に脊髄、三叉神経節及び後根神経節、ならびに末梢神経、例えば正中神経、橈骨神経、坐骨神経、脛骨神経及び腓骨神経において認められた（図１８Ａ～Ｄ、表２～４）。中枢神経系及び末梢神経系の組織学的病変部は変化しやすく同じセグメント内の組織切片同士ならびに同じ動物の脊髄及び末梢神経のセグメント同士で重症度が異なっていることが多い。後根神経節（ＤＲＧ）は、中心性色質融解、及び神経細胞体を囲んでいる（衛星病変）及びそれに浸潤している（神経細胞侵食）単核細胞浸潤物によって特徴付けられる、最小限～軽度の神経細胞体変性を呈した。免疫組織化学（ＩＨＣ）に基づくと単核細胞浸潤物はＣＤ３陽性Ｔ細胞とわずかなＣＤ２０陽性Ｂ細胞とからなっていた。どちらの霊長類においても頚髄、胸髄及び腰髄の背側白質路は、骨髄マクロファージを有する及び有さない膨張した髄鞘によって特徴付けられる両側性の最小限～軽度の軸索変性症
を呈し、軸索変性症を示唆していた。神経後根に最小限～顕著な軸索変性症が時折認められた。末梢神経（正中、橈骨、坐骨、腓骨及び脛骨）は、変化しやすい単核細胞浸潤物及び軸索周囲線維症と共に、軽度から顕著な程度までに及ぶ同様の軸索変性症を呈した。末梢軸索変性症は両側性であることが認められたが、重症度は切片同士で、さらにはいくつかの神経切片内において、様々であった。

【表8】

【表9】

【表10】

【0301】

ベクターの生体分布の分析は、脳及び脊髄を含めた全ての評価組織への遺伝子移入を実
証した（図１９）。注目すべきことに、多くの試料において後根神経節（ＤＲＧ）に対して強く指向され、細胞１個あたりベクター１０個であった。極めて高い肝臓形質導入も明らかになり、細胞１個あたり１０００ベクターゲノムコピー（ＧＣ）であった。５日目に剖検した動物では、２８日目に剖検した動物に比べてベクターゲノムコピーがより高いレベルで検出され、注射後すぐに組織で検出されたベクターゲノムのいくつかは安定した形質導入を表さないことが示唆された。

【0302】

ＳＭＮ発現をｉｎ－ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって評価した（図２０Ａ～Ｇ）。５日目に剖検した動物の肝臓にはヒトＳＭＮ ｍＲＮＡが際立って発現していたが、脊髄または脳では検出可能な発現はなかった。ベクター注射後２８日目に剖検した２頭の動物は脊髄運動ニューロンにおける堅牢なＳＭＮ発現を呈し、評価した脊髄の各高度において平均で細胞のおよそ３０～９０％が形質導入された。脳には、形質導入されたニューロン及び上衣細胞の散在区画もあった。

【0303】

ベクターカプシド及びヒトＳＭＮ導入遺伝子産物に対するＴ細胞応答をインターフェロンガンマＥＬＩＳＰＯＴによって評価した（表５）。３頭全ての動物について、ベクター投与前、及び剖検時に末梢血単核細胞をＥＬＩＳＰＯＴ分析のために採取した。剖検時に肝臓からも単核細胞を採取した。ＰＨＡ刺激に対して何ら応答を呈さず後の分析から除外された動物１６Ｃ２１５から採取された肝臓リンパ球を除いて、全ての試料はＰＨＡによる陽性対照刺激に対する堅牢なインターフェロンガンマ応答を呈した。動物１６Ｃ１７６または１６Ｃ２１５について、どの時点においても、ＡＡＶｈｕ６８カプシドまたはｈＳＭＮに対するＴ細胞応答は検出可能でなかった。動物１６Ｃ１１６は、どの時点においてもＰＢＭＣにおいてＴ細胞応答を呈しなかったが、ベクターカプシド及び導入遺伝子産物の両方に対するインターフェロンガンマ応答が剖検時に検出可能であった。

【表11】

【0304】

２．仔ブタ試験
３匹のユカタンマイクロ仔ブタに２×１０^１４ＧＣ／ｋｇのＡＡＶｈｕ６８．ｈＳＭＮの静脈内用量を７日齢（ｎ＝１、仔ブタＡ）または３０日齢（ｎ＝２、仔ブタＢ及びＣ）の時に投与した（表６）。全ての動物はベクター投与後に問題なく回復した。ベクター投与後の試験１４日目に仔ブタＡは後肢運動失調を発症した。運動失調は、間欠性ナックリング及び後肢の交差を伴う酩酊歩行を特徴としていた。後肢をその背面を下にして置いた場合、仔ブタは蹄を配置し直すことができず（配置試験）、自己受容器感覚の意識に障害があることが示唆された。この運動失調は６時間の間に前肢にまで発展した。この仔ブタは呼吸困難も発症したが、全ての肺野の聴診は正常な限界内であった。臨床兆候の進行を考慮して仔ブタをベクター投与後１４日目に安楽死させて全体的な剖検を実施した。

【表12】

【0305】

ベクター投与後１３日目に、３０日齢で注射した仔ブタはより低い重症度ながら同様の神経学的兆候を発症した。これらの動物では呼吸困難は認められなかった。仔ブタを安楽死させ、全体的な剖検を実施した。

【0306】

どちらの年齢群の仔ブタでも、目立った巨視的異常は認められなかった。７日齢で注射した仔ブタは剖検時に栄養状態が中程度～不良であり、試験７日目に下痢の臨床歴を有していたがこれは筋肉内（ＩＭ）セフチオフルによる処置の後の試験９日目に消散した。３０日齢で注射した仔ブタは十分な栄養状態にあった。７日齢で注射した仔ブタ（仔ブタＡ）において安楽死前に採取した血液からの全血球計算（ＣＢＣ）から、顕著な好中球増加（２２，４６８個／μＬ、基準範囲：２，３００～１１，９００個／μｌ）が明らかになった。血液検査において他に目立った異常は認められなかった。好中球増加は細菌性気管支肺炎の組織学的証拠に対応している可能性があった。３０日齢で注射した仔ブタでは血液検査において異常は認められなかった。

【0307】

全ての動物からの頚部、胸部及び腰部背根神経節（ＤＲＧ）は、単核細胞浸潤物を伴って中程度～顕著な神経細胞体変性を呈した（図２１Ａ～Ｄ、表２～４）。神経変性の組織学的病変部は、明るい好酸性細胞質小球を伴う細胞質性好酸球増加及び中心性色質融解から、浸潤性単核細胞を伴う完全消滅（神経細胞侵食）までに及んでいた。重症度はより低いが類似している病変部は全動物の三叉神経節にも認められ、最小限から軽度までに及んでいた。全ての仔ブタにおいて頚髄、胸髄及び腰髄の背側白質路は、骨髄マクロファージを有する及び有さない膨張した髄鞘によって特徴付けられる最小限～軽度の軸索変性症を呈し、軸索変性との一貫性を有していた。これらの病変部の発生率は全ての動物にわたって同じであったが、重症度は３０日齢で注射した仔ブタ（仔ブタＣ）の１匹ではわずかに低下していた。

【0308】

７日齢で注射した仔ブタ（仔ブタＡ）では、末梢神経（正中、橈骨、坐骨、腓骨及び脛骨）は脊髄に類似する軽度～重度の両側性の軸索変性症を含んでいた。興味深いことに、後肢の末梢神経における軸索変性症（軽度～顕著）は前肢（軽度）よりも重症であった。３０日齢で注射した仔ブタでは、たった１匹の動物（仔ブタＢ）だけが、腓骨神経を除く大半の神経において最小限の末梢軸索変性症を有していた。他の３０日齢で注射した仔ブタ（仔ブタＣ）の末梢神経は組織学的に目立ったところがなかった。中枢系及び末梢神経系内の組織学的病変部は変化しやすいことが多く、重症度は組織切片同士及び同じ動物の組織切片内、ならびに脊髄の異なるセグメント同士で異なっていることが多かった。脳または肝臓では組織学的異常は認められなかった。

【0309】

概して、末梢神経病変部の発生率及び重症度は、３０日齢で注射した仔ブタでは７日齢で注射した仔ブタに比べて低下し、これは、より高齢の動物に認められる生前兆候のより
低い重症度と合致していた。加えて、脊髄病変部の重症度及び末梢神経病変部の発生率は３０日齢で注射した仔ブタ（仔ブタＣ）の１匹において最も低く、これはまた、両方の日齢群において仔ブタの神経学的兆候の重症度が最も低かった。

【0310】

脳及び脊髄を含めて分析した全ての組織においてベクターゲノムは検出可能であった（図２２）。ＤＲＧへ遺伝子移入は脊髄へのそれに比べて概してより多く、しばしば宿主二倍体ゲノム（ｄｇ）１つあたり１ベクターＧＣよりも多かった。最も高いベクターゲノムコピー数は肝臓において見出され、３匹全ての動物からの肝臓試料においておよそ２００ＧＣ／ｄｇであった。評価組織への遺伝子移入効率の注射時日齢による明らかな影響はなかった。

【0311】

３匹全ての動物の脊髄全体にわたって運動ニューロンにおけるヒトＳＭＮ ｍＲＮＡの発現をＩＳＨによって検出した（図２３Ａ～図２３）。全ての動物において、大部分の運動ニューロンは形質導入されたようであり、７日齢の仔ブタと３０日齢の仔ブタとの間に形質導入の明らかな差異はなかった。

【0312】

Ｂ．考察：
この実施例では、ヒトＳＭＮを発現するＡＡＶベクターの高用量での静脈内投与は仔ブタ及び若年ＮＨＰに予想外の毒性を招いた。肝臓毒性はＮＨＰに限られていたが、知覚神経変性はどちらの種においても生じた。同じベクター用量で処置された仔ブタにおける肝臓へのおよそ５分の１未満の遺伝子移入は、この種におけるＡＡＶの肝臓へのより低い向性を示唆しており、ＮＨＰに認められた肝臓毒性の欠如の説明となり得る。３頭全てのＮＨＰはベクター投与後に肝臓酵素及びビリルビンの急速な上昇に発展した。トランスアミナーゼ上昇が最も顕著であった動物は、凝固障害の証拠も肝臓における広範なフィブリン沈着、広域にわたる出血、及び明白な自発的腹腔内出血と共に呈したが、剖検時に凝固試験を実施することができなかったためこれらの所見の解釈には限界がある。広域にわたる出血と関連付けられる肝臓におけるフィブリン沈着の存在は播種性血管内凝固（ＤＩＣ）を示唆していた。但し、フィブリン沈着は肝臓の外側では認められず、真のＤＩＣとの一貫性がなかった。所見は、アセトアミノフェン毒性を原因とする急性肝不全において記述されている所見に類似していると見受けられるが、これは、急性肝細胞変性、及び肝臓内凝固を招く肝臓での組織因子提示によって特徴付けられるものである。例えば、Ｇａｎｅｙ，Ｐ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ．Ｒｏｌｅ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｉｎ ａｃｅｔａｍｉｎｏｐｈｅｎ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｈｅｐａｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｉｎ ｍｉｃｅ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ４６，１１７７－１１８６（２００７）、Ｋｅｒｒ，Ｒ．Ｎｅｗ ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｉｎｔｏ ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ ｉｎ ｌｉｖｅｒ ｆａｉｌｕｒｅ．Ｂｌｏｏｄ ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ ＆ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ：ａｎ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ｉｎ ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ ａｎｄ ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ １４ Ｓｕｐｐｌ １，Ｓ４３－４５（２００３）、Ｐａｙｅｎ，Ｃ．，Ｄａｃｈｒａｏｕｉ，Ａ．，Ｐｕｌｃｅ，Ｃ．＆Ｄｅｓｃｏｔｅｓ，Ｊ．Ｐｒｏｔｈｒｏｍｂｉｎ ｔｉｍｅ ｐｒｏｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｉｎ ｐａｒａｃｅｔａｍｏｌ ｐｏｉｓｏｎｉｎｇ：ａ ｒｅｌｅｖａｎｔ ｍａｒｋｅｒ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｃ ｆａｉｌｕｒｅ？ Ｈｕｍａｎ ＆ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ ２２，６１７－６２１（２００３）、及びＪａｍｅｓ，Ｌ．Ｐ．，Ｗｅｌｌｓ，Ｅ．，Ｂｅａｒｄ，Ｒ．Ｈ．＆Ｆａｒｒａｒ，Ｈ．Ｃ．Ｐｒｅｄｉｃｔｏｒｓ ｏｆ ｏｕｔｃｏｍｅ ａｆｔｅｒ ａｃｅｔａｍｉｎｏｐｈｅｎ ｐｏｉｓｏｎｉｎｇ ｉｎ ｃｈｉｌｄｒｅｎ ａｎｄ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｓ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ １４０，５２２－５２６（２００２）を参照されたい。これは、肝臓内凝固を原因とする凝固因子消費、肝不全による凝固因子合成の減少またはこれらの組み合わせに関係し得るものである凝固障害との関連を有していることが多い。上に引用したＧａｎｅｙ ｅｔ ａｌ，２００７、及びＫｅｒｒ，２００３を
参照されたい。５日目の１匹の動物における一過性の血小板減少症も肝臓内凝固に関係している可能性がある。別の可能な説明として、高用量ＡＡＶによる全身性炎症応答の活性化ならびに副次的転帰としての血小板活性化、血管内凝固、ショック及び肝機能不全の可能性がある。後者ではないが前者の症例ではＡＡＶベクターの肝臓向性を低減する試みが有益となり得ることから、肝臓損傷がこのカスケードの最初の原因であるのかまたは副次的転帰であるのかを判定する研究を実施した。これらの可能性を区別するために利用することができるこの実施例からのデータは不十分であり、ＡＡＶベクターへの高い全身曝露の後の肝臓毒性の病態生理学を完全に解明するための追加試験は研究中である。

【0313】

ＡＡＶ投与後のＤＲＧ変性は報告されたことがないが、ＤＲＧへの強い向性はいくつかの試験において記されている。例えば、Ｇｒａｙ，Ｓ．Ｊ．，Ｋａｌｂｕｒｇｉ，Ｓ．Ｎ．，ＭｃＣｏｗｎ，Ｔ．Ｊ．＆Ｓａｍｕｌｓｋｉ，Ｒ．Ｊ．Ｇｌｏｂａｌ ＣＮＳ ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ａｎｄ ｅｖａｓｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉ－ＡＡＶ－ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｂｙ ｉｎｔｒａｔｈｅｃａｌ ＡＡＶ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｎｏｎ－ｈｕｍａｎ ｐｒｉｍａｔｅｓ．Ｇｅｎｅ
ｔｈｅｒａｐｙ ２０，４５０－４５９（２０１３）を参照されたい。本実施例において認められた病変部は、ＤＲＧ知覚ニューロン細胞体ならびにそれらの中枢性及び末梢性の軸索の変性からなっていた。これらの病変部は遺伝子導入後５日目よりも後に現れる可能性がある、というのも、処置後５日目に屠殺したＮＨＰにはそれが存在しておらず仔ブタではベクター投与から１３～１４日後に最初に臨床兆候が現れたからである。ＤＲＧ病変部はＮＨＰよりも仔ブタの方がわずかに重症であったが、ＮＨＰに比べて仔ブタでは脊髄及び末梢神経における知覚軸索の変性が類似していたかまたはよりいっそう軽度であり、これは、ブタの剖検時点が早めであり、死滅しつつある細胞に関連する全ての軸索に変性の余裕がなかった可能性があることによって説明され得る所見であった。知覚障害はブタにおいて明らかであったが、ＮＨＰでは明らかでなく、ＮＨＰにおいてＤＲＧ病変部の程度が臨床兆候出現の閾値未満であったことを示唆していた。影響を受けた知覚線維のタイプはどちらの種においても特徴付けられなかった。自己受容器感覚は仔ブタに認められた障害に基づいて影響を受けているようであった。他の知覚線維に対する影響は不明であり、後の試験においてさらに特徴付けられる。

【0314】

新生抗原に対するＴ細胞応答は、動物モデルへの異種ヒト導入遺伝子の送達を評価するいかなる試験においても、または劣性遺伝病に対する遺伝子療法の臨床試験において、毒性の理論上の原因である。加えて、形質導入細胞によってＭＨＣクラスＩ上に交差提示されたカプシド由来ペプチドは、ＡＡＶによって媒介される遺伝子移入の後の細胞傷害性Ｔ細胞応答の潜在的標的として同定されている。例えば、Ｍａｎｎｏ，Ｃ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．Ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｖｅｒ ｉｎ ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ ｂｙ ＡＡＶ－Ｆａｃｔｏｒ ＩＸ ａｎｄ ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎｓ ｉｍｐｏｓｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｈｏｓｔ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ．Ｎａｔ Ｍｅｄ １２，３４２－３４７（２００６）、及びＭａｒｔｉｎｏ，Ａ．Ｔ．，ｅｔ
ａｌ．Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ＡＡＶ ｖｅｃｔｏｒ ｍｉｎｉｍｉｚｅｓ ｉｎ ｖｉｖｏ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ ｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ ｂｙ ｃａｐｓｉｄ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＣＤ８＋ Ｔ ｃｅｌｌｓ．Ｂｌｏｏｄ １２１，２２２４－２２３３（２０１３）を参照されたい。この後者の機序は、全身ＡＡＶ送達のいくつかの臨床試験において認められたトランスアミナーゼ上昇の原因であると提唱されており、このリスクを緩和するためにＴ細胞応答を抑制するグルココルチコイドの投与が採用されている。例えば、上に引用したＭａｎｎｏ ｅｔ ａｌ，２００６、及びＧｅｏｒｇｅ，Ｌ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．Ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ Ｂ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｗｉｔｈ ａ Ｈｉｇｈ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ－Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｆａｃｔｏｒ ＩＸ Ｖａｒｉａｎｔ．Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ３７７，２２１５－２２２７（２０１７）を参照されたい。この実施例では、ＮＨ
Ｐにおけるトランスアミナーゼ上昇はカプシドまたは導入遺伝子産物に対するＴ細胞応答との相関を有していないと見受けられた。ベクターカプシド及び導入遺伝子産物に対するＴ細胞応答は、肝臓から採取したリンパ球において検出されたが、１匹の動物の末梢血には検出されず、両方の抗原に対して応答が生じ得ること、及び末梢血において測定された応答が必ずしも標的臓器内で生じている応答を反映していない場合があることを実証していた。しかしながら、毒性が最も重症であった動物は末梢血においても肝臓リンパ球においても検出可能なＴ細胞応答を有しておらず、顕著なトランスアミナーゼ上昇を呈している別の動物は末梢血においてＴ細胞応答を呈しなかった。しかも、肝臓毒性の急速な（５日未満での）発症は、ナイーブ宿主におけるＴ細胞応答との一貫性を有していない。Ｔ細胞応答の非存在下での肝臓毒性の所見は、肝臓損傷の原因が別の機序であることを示唆している。可能性には、エンドソーム経路内でのベクターカプシドの大量蓄積を原因とする毒性、大量のベクターゲノムの送達によるＤＮＡ損傷応答の誘発、極めて高いレベルで発現する導入遺伝子産物の毒性、または高レベルの導入遺伝子発現による宿主遺伝子の正常な転写及び翻訳の減少が含まれ得る。この毒性がＳＭＮ導入遺伝子に特有のものであるか否かは前臨床試験で容易に試験することができるが、他の可能性の評価にはより大がかりな研究が必要である。緑色蛍光タンパク質導入遺伝子を保有する異なるＡＡＶ血清型の同じ用量で処置した成体ＮＨＰにおいて重度の肝臓毒性、凝固異常、血小板減少症及びショックが認められ、これらの所見がＡＡＶｈｕ６８ベクター固有のものでもＳＭＮ導入遺伝子固有のものでもないことが実証された（データ示さず）。重要なこととして、ヒトにおいて生じる肝臓毒性の非免疫媒介性の機序があるならば、臨床試験に現在取り入れられているグルココルチコイド投与プロトコールはこのリスクを緩和するのに有効でない可能性がある。

【0315】

ＡＡＶ遺伝子療法の分野に対する重要な疑問は、この試験で認められる毒性がヒトに通じるのか、そしてもしそうならばどの動物モデルが毒性を十分に予測して有益な前臨床安全性試験を可能にするか、ということである。密接に関連するＡＡＶ９ベクターを同程度の用量で処置されたＳＭＡ患者は顕著な肝臓毒性を呈さなかったことから、本試験における肝臓所見がヒトに適用可能となり得ること、及びサルが予測モデルになり得ることが示唆された。本実施例で認められたＤＲＧ毒性がヒトに通じるものであるか否かを判定することはより困難である。ＳＭＡ臨床試験において知覚症候は報告されたことがないが、ＮＨＰの場合と類似する前臨床病変部は慣習的な評価において記されない可能性がある。

【0316】

本所見は、極めて高い用量でのＡＡＶベクターの全身投与の安全性に関する重要な疑問を生む。本実施例で示された結果は、下位運動ニューロンなどの重要な標的細胞を効果的に形質導入する高用量ＡＡＶの潜在能力を支持するが、必要とされる用量が重大な毒性に関連している可能性があることを実証する。ＡＡＶ９ベクターの用量が１０分の１である成体ＮＨＰの処置が以前になされたが、著しい運動ニューロン形質導入も毒性も認められず、運動ニューロンを指向する全身的ＡＡＶの治療指数が極めて狭い可能性があることが実証された。例えば、Ｈｉｎｄｅｒｅｒ，Ｃ．，ｅｔ ａｌ．Ｗｉｄｅｓｐｒｅａｄ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎ ｔｈｅ ｃｅｎｔｒａｌ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ ｏｆ ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ ｍａｃａｑｕｅｓ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ＡＡＶ９ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｃｉｓｔｅｒｎａ ｍａｇｎａ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ＆ｃｌｉｎｉｃａｌ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １，１４０５１（２０１４）を参照されたい。ＳＭＡ臨床試験において報告されたトランスアミナーゼ上昇に類似して、本試験において同じベクター用量で処置したＮＨＰは、肝臓毒性の重症度の対象間変動を呈し、２／３のＮＨＰは、実験上の非症候的異常があるだけで遺伝子移入が効果的であったことを実証した。これは、高用量の全身的ＡＡＶが何名かの患者において安全かつ有効であり得ることを示唆しているが、狭い治療指数、及びそこから外れたときの所見の重症度は、より多い数の患者を処置するときに毒性が重症な事例が出現することを意味している可能性がある。

【0317】

試験は本実施例で認められた肝臓及び知覚ニューロンにおける毒性の機序ならびに各々とヒトとの関連性を理解すべく研究中である。現在のところ、非ヒト霊長類での実験は、高用量全身的ＡＡＶ投与に関連する肝臓毒性及び神経学的毒性を評価する上で誘掖であり得、これらの試験は臨床へと進む前に実施されなければならない。臨床試験では、肝臓毒性は知覚神経症の症候と同じく慎重に評価されなければならない。体性感覚誘発電位及び神経伝導試験を含めた知覚ニューロンに対する毒性の客観的評価も価値があり得る。ＡＡＶ臨床試験においてトランスアミナーゼ上昇またはその他の毒性兆候に遭遇するときには研究者は、免疫機序及び非免疫機序の両方が原因となっている可能性があるため広く様々な診断を維持するべきである。

【0318】

Ｃ．材料及び方法：
動物に対する手技：全ての動物に対する手技は、ペンシルバニア大学の動物実験委員会によって承認された。静脈内ベクター投与のために、ベクターを無菌リン酸緩衝生理食塩水で希釈し、伏在静脈を介して（ＮＨＰ）または耳静脈（仔ブタ）を介して１０分掛けて点滴した。安楽死はペントバルビタール過剰投薬によって実施した。

【0319】

組織学：組織は従来のプロトコールに従ってホルマリンに固定し、パラフィン包埋し、切断し、ヘマトキシリン及びエオジンで染色した。フィブリノゲンＩＨＣも従来の方法に従って実施した。

【0320】

ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）はＶｉｅｗＲＮＡ ＩＳＨ組織アッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して製造者のプロトコールに従って２４時間の固定時間を超えることなくホルマリン固定パラフィン包埋組織に対して実施した。Ｚ字形プローブ対からなるプローブはキット製造者によって合成された。コドン最適化ヒトＳＭＮに対して特異的なプローブを単独で、あるいは運動ニューロンのマーカーとしてのアカゲザルもしくはブタＣＨＡＴのプローブと組み合わせて使用した。結合したＳＭＮプローブを、ローダミンフィルターセットで造影されるＦａｓｔ Ｒｅｄ沈殿の形成によって検出した。ＣＨＡＴプローブを、キット製造者の仕様書に従って作ったカスタムフィルターセット（ＡＶＲ Ｏｐｔｉｃｓ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）によって造影されるＦａｓｔ Ｂｌｕｅ沈殿物によって検出した。核を示すためにＤＡＰＩで切片を対比染色した。

【0321】

ベクター生産：付着性ＨＥＫ２９３細胞の三重トランスフェクションによってＡＡＶｈｕ６８ベクターを生産した。ＰＯＲＯＳ（商標）ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＡＡＶ９樹脂を使用する親和性クロマトグラフィー及びそれに続くアニオン交換クロマトグラフィーによってベクターを細胞上清から精製して空のカプシド及びその他の不純物を除去した。

【0322】

ベクター生体内分布：剖検時にベクター生体分布分析のために組織をドライアイス上で凍結させた。ＤＮＡを抽出し、以前に教示されているようにＴａｑＭａｎ ＰＣＲによってベクターゲノムを定量した。Ｗａｎｇ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ．Ｉｍｐａｃｔ ｏｆ ｐｒｅ－ｅｘｉｓｔｉｎｇ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｏｎ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｔｏ ｎｏｎｈｕｍａｎ ｐｒｉｍａｔｅ ｌｉｖｅｒ ｗｉｔｈ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ８ ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｈｕｍａｎ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ２２，１３８９－１４０１（２０１１）を参照されたい。

【0323】

ＥＬＩＳＰＯＴ：以前に教示されているようにインターフェロンガンマＥＬＩＳＰＯＴを実施した。Ｂｒａｎｔｌｙ，Ｍ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ｔｒａｎｓｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｄｅｓｐｉｔｅ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｒｅｓ
ｐｏｎｓｅｓ ｉｎ ａ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｒｉａｌ ｏｆ ｒＡＡＶ１－ＡＡＴ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ
Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ １０６，１６３６３－１６３６８（２００９）を参照されたい。ヒトＳＭＮ及びＡＡＶｈｕ６８ ＶＰ１ペプチドライブラリーは、２つの（ＳＭＮ）プールまたは３つの（ＡＡＶｈｕ６８）プールに分かれた、５アミノ酸分だけ重複する１５ｍｅｒペプチドからなっていた

【0324】

本明細書中で引用する全ての公開文書、ならびに２０１８年１月１７日に出願された米国仮特許出願第６２／６１８，４３７号、２０１７年６月６日に出願された米国仮特許出願第６２／５１５，９０２号、及び２０１７年２月２８日に出願された米国仮特許出願第６２／４６４，７５６号を参照により本明細書に援用する。同様に、本明細書中で言及し別記の配列表（ファイル名は１７－７９８８ＰＣＴ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ）の中に現れる配列番号を参照により援用する。本発明を特定の実施形態に関して記載してきたが、本発明の趣旨から逸脱することなく改変を行うことができることは明らかであろう。そのような改変は別記の請求項の範囲に入ることが意図される。

【0325】

（配列表フリーテキスト）
以下の情報は多くの識別子＜２２３＞の下でフリーテキストを含んでいる配列のために提供される。

【表13-1】

【表13-2】

【表13-3】

【表13-4】

【表13-5】

【表13-6】

【表13-7】

【表13-8】

【表13-9】

【表13-10】

【表13-11】

【表13-12】

【図1-1】

【図1-2】

【図2】

【図3】

【図4-1】

【図4-2】

【図4-3】

【図4-4】

【図4-5】

【図5】

【図6-1】

【図6-2】

【図6-3】

【図7】

【図8A】

【図8B】

【図8C】

【図8D】

【図9】

【図10】

【図11-1】

【図11-2】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15A】

【図15B】

【図16-1】

【図16-2】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【配列表】

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