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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-05-07
(45)【発行日】2024-05-15
(54)【発明の名称】ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１の抗感染作用及びその応用
(51)【国際特許分類】
A61K 38/17 20060101AFI20240508BHJP
A61P 31/20 20060101ALI20240508BHJP
A61K 31/7088 20060101ALI20240508BHJP
A61K 9/127 20060101ALI20240508BHJP
A61P 1/04 20060101ALI20240508BHJP
A61P 31/10 20060101ALI20240508BHJP
A61P 31/12 20060101ALI20240508BHJP
A61P 31/22 20060101ALI20240508BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20240508BHJP
A61P 31/06 20060101ALI20240508BHJP
A61P 37/02 20060101ALI20240508BHJP
C12Q 1/02 20060101ALI20240508BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20240508BHJP
【ＦＩ】
A61K38/17 ZNA
A61P31/20
A61K31/7088
A61K9/127
A61P1/04
A61P31/10
A61P31/12
A61P31/22
A61P29/00
A61P31/06
A61P37/02
C12Q1/02
C12N15/63 Z
【請求項の数】
8
(21)【出願番号】P 2022502388
(86)(22)【出願日】2019-07-17
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-09-21
(86)【国際出願番号】 CN2019096303
(87)【国際公開番号】W WO2021007800
(87)【国際公開日】2021-01-21
【審査請求日】2022-03-11
【前置審査】
(73)【特許権者】
【識別番号】506032129
【氏名又は名称】中国医学科学院基礎医学研究所
(74)【代理人】
【識別番号】100107766
【弁理士】
【氏名又は名称】伊東 忠重
(74)【代理人】
【識別番号】100229448
【弁理士】
【氏名又は名称】中槇 利明
(72)【発明者】
【氏名】曹 雪涛
(72)【発明者】
【氏名】王 蕾
(72)【発明者】
【氏名】温 明岳
【審査官】渡邉 潤也
(56)【参考文献】
【文献】Journal of Virology，2011年，85(21)，pp.10976-10988
【文献】PLoS One，2017年，12(11)，e0188214, pp.1-15
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ
Ｃ１２Ｎ
Ｃ０７Ｋ
Ｃ１２Ｑ
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＤＮＡウイルスの感染性疾患及び／又はＤＮＡウイルスの感染に関与する疾患及び／又は症状を予防及び／又は治療するための医薬品組成物又はキットの調製における異種核リボ核タンパク質Ａ２Ｂ１（ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１）、当該タンパク質をコードする核酸分子、及び／又は当該タンパク質及び当該核酸分子の促進剤の使用であり、上記の促進剤は、ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１又はｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１をコードする配列の過剰発現ベクター；外来ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１；ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１をコードする配列の裸のＤＮＡ；ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１をコードする配列のリポソームに封入されたＤＮＡ；インビボでｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１に変換することができるｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１前駆体タンパク質又はコンジュゲート又はコンプレックスから選択される、使用。
【請求項2】
上記のｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１は、以下から選択される：（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示されたアミノ酸配列を有するポリペプチド；又は
（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示されたアミノ酸配列であるか、又は前記アミノ酸配列に対し８０％以上の配列同一性を有し、かつＤＮＡウイルスの感染を抑制する活性を有するタンパク質又はポリペプチド；及び／又は
上記の核酸分子は、以下から選択される：
（ｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示されたヌクレオチド配列を有する核酸分子；又は
（ｉｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示されたヌクレオチド配列であるか、又は前記ヌクレオチド配列に対し８０％以上の配列同一性を有し、かつＤＮＡウイルスの感染性疾患及び／又はＤＮＡウイルスの感染に関与する疾患及び／又は症状を予防及び／又は治療する活性を有するタンパク質又はポリペプチドをコードする核酸分子；ことを特徴とする請求項１に記載された使用。
【請求項3】
上記のＤＮＡウイルスの感染は、単純ヘルペスウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、アデノウイルス、ポックスウイルス、小ＤＮＡウイルス、アデノ随伴ウイルスの一種類又は複数種類のウイルスによる感染から選択される感染であることを特徴とする請求項１に記載された使用。
【請求項4】
上記の感染に関与する疾患及び／又は症状は、感染による病理学的損傷；感染後のサイトカイン（例えばインターフェロン）の不十分または過剰な産生；内毒素性ショックまたは死；臓器への炎症性損傷；多臓器不全、例えば、上記の臓器は、肝臓、脾臓、脳、腎臓、心臓、肺、胃、腸から選択される；ウイルス感染による慢性炎症性疾患（例えば、炎症性腸疾患、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、慢性腎炎、結核、慢性胃腸疾患などの自己免疫疾患）から選択される一つ又は複数であることを特徴とする請求項１に記載された使用。
【請求項5】
上記の医薬品組成物又はキットは、その形式は、注射（例えば裸のＤＮＡまたはタンパク質の直接注入、リポソームに封入されたＤＮＡ又はタンパク質の注入）、金でコーティングされた遺伝子銃の爆撃、プラスミドＤＮＡを運ぶ生殖欠損菌、標的ＤＮＡを運ぶ複製欠損アデノウイルス、又は目的遺伝子がコードするタンパク質、エレクトロポレーション、経鼻投与、肺投与、経皮投与、腫瘍内投与から選択される医薬品組成物又はキットによる投与に適した形式形態であることを特徴とする請求項１に記載された使用。
【請求項6】
上記の医薬品組成物又はキットは、さらに、感染性疾患及び／又は感染に関与する疾患及び／又は症状を予防及び／又は治療するための他の物質を含み、他の活性物質は、例えば、β－ラクタム系抗生物質（ペニシリンとセファロスポリン）、アミノグリコシド系抗生物質、テトラサイクリン系抗生物質、クロラムフェニコール系抗生物質、マクロライド系抗生物質、抗真菌性抗生物質、抗結核系抗生物質など、臨床用抗生物質；臨床抗ウイルス薬（三環式アミン、ピロリン酸塩、プロテアーゼ阻害剤、ヌクレオシド薬とインターフェロン、アンチセンスオリゴヌクレオチドなど）；臨床免疫抑制剤（グルココルチコイド、シクロホスファミド、クロロキン、シクロスポリンＡ、トリプテリギウムウィルフォルディ、漢方薬、抗ＴＮＦモノクローナル抗体を含む）から選択される一つ又は複数を含むことを特徴とする請求項１に記載された使用。
【請求項7】
（Ａ）治療又は予防有効量のｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１、当該タンパク質をコードする核酸分子、及び／又は前記タンパク質又は前記核酸分子の促進剤、ただし、上記の促進剤は、ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１又はｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１をコードする配列の過剰発現ベクター；外来ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１；ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１をコードする配列の裸のＤＮＡ；ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１をコードする配列のリポソームに封入されたＤＮＡ；インビボでｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１に変換することができるｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１前駆体タンパク質又はコンジュゲート又はコンプレックスから選択される；（Ｂ）薬学的または免疫学的に許容できるキャリア又は賦形剤；及び
（Ｃ）任意的に、感染性疾患及び関連する疾患及び／又は症状を予防又は治療する一つ又は複数の他の活性物質；を含む、ＤＮＡウイルスの感染性疾患及び／又はＤＮＡウイルスの感染に関与する疾患及び／又は症状を予防及び／又は治療するための医薬品組成物又はキット。
【請求項8】
（Ａ）ＤＮＡウイルスに感染された細胞、組織または人間以外の動物を候補物質によって処理すること；（Ｂ）上記の細胞、組織または人間以外の動物中のｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１または当該タンパク質をコードする核酸分子のレベルを検出すること；及び
（Ｃ）ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１又は当該タンパク質をコードする核酸分子の上記レベルが、候補物質によって処理される前のレベル、又は正常な対照中のレベルより高い場合に、上記の候補物質がｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１を促進することで感染に抵抗する作用を有することを判明すること；を含む、ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１を促進することでＤＮＡウイルスの感染性疾患及び／又はＤＮＡウイルスの感染に関与する疾患及び／又は症状を予防及び／又は治療するための医薬品をスクリーニングする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は、生物技術と医学分野に関する。具体的に、本開示は、感染に関与する疾患又は症状の予防又は治療、感染による損傷の制御における核タンパク質ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１（即ち、異種核リボ核タンパク質Ａ２Ｂ１、ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ ｎｕｃｌｅａｒ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ Ａ２Ｂ１）の効果、作用機構、実施方法と用途に関する。
【背景技術】
【0002】
感染、特にウイルス感染は、大きな害を伴うよくある臨床疾患である。当初、ウイルス感染に対する身体の抵抗性の分子メカニズムは、完全には理解されなかったが、サイトカインクラスであるインターフェロンの発見により、ウイルス感染に反応して体が産生する自然免疫細胞と、二次獲得免疫細胞と、それらの機能の分子生物学的基礎は、徐々に認識されてきた。
【0003】
インターフェロン（ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ、ＩＦＮ）は、強力な抗ウイルス機能を持つサイトカインファミリーの総称である。１９５７年、Ａｌｉｃｋ Ｉｓａａｃｓ教授とＪｅａｎ Ｌｉｎｄｅｎｍａｎｎ教授は、ニワトリ胚のインフルエンザウイルス感染を研究する過程である成分を発見し、この成分は、インフルエンザウイルスの増殖を大幅に防ぐことができ、インターフェロンと名付けた（Ｉｓａａｃｓ，Ａ．ら、Ｐｒｏｃ Ｒ Ｓｏｃ Ｌｏｎｄ Ｂ Ｂｉｏｌ Ｓｃｉ． １９５７；９２７：２５８－２６７．）。それ以来、インターフェロンファミリーのサイトカインは、非常に広範囲で効果的な抗ウイルス効果を有することが連続的に見出されてきた。現在、インターフェロンは、臨床にウイルス感染に対する防御と、ウイルス感染による様々な疾患の治療に広く利用される。
【0004】
体に感染するさまざまな病原体は、一般に、類似の構造的または分子的特徴を有し、こんな特徴は、ウイルスの比較的保存された配列特徴や、病原性微生物によって共有される構成的発現分子などを含む。これらの類似した構造や特徴は、まとめて、病原体関連分子パターン（Ｐａｔｈｏｇｅｎ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐａｔｔｅｒｎｓ、ＰＡＭＰｓ）と呼ばれるが、それと相互に認識する細胞表面受容体はパターン認識受容体（Ｐａｔｔｅｒｎ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ、ＰＲＲｓ）と呼ばれる。例えば、ＲＮＡウイルスを特異的に認識するＰＰＲには、主に、細胞に感染するＲＮＡウイルスのＡＴエレメントが豊富な部分を認識するＲＮＡヘリカーゼレチノイン酸誘導遺伝子Ｉ（ＲＮＡ ｈｅｌｉｃａｓｅｓ ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ－ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｇｅｎｅ Ｉ、ＲＩＧ－Ｉ、ＤＤＸ５８とも言う）とメラノーマ分化関連遺伝子５（ｍｅｌａｎｏｍａ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ ５、ＭＤＡ５、ＩＦＩＨ１とも言う）などがある。
【0005】
通常、ＤＮＡウイルスが、宿主細胞に侵入すると、宿主細胞の核内でゲノムＤＮＡを放出して複製する。ただし、核内の病原体由来ＤＮＡの認識メカニズムは不明である。現在まで、１つのタンパク質であるγ－インターフェロン誘導性タンパク質１６（ｇａｍｍａ－ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎ １６、ＩＦＩ１６）のみが、核内のウイルスＤＮＡを認識し、ＩＦＮ－Ｉ産生および炎症反応を活性化することができると考えられた。
【0006】
ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ、ＩＦＩ１６、ＤＡＩ、ＬＲＲＦＩＰ１、ＬＳｍ１４Ａ、ＭＲＥ１１、ＤＮＡ－ＰＫ、ＨＭＧＢｓ、ＤＤＸ４１とサイクリックＧＭＰ－ＡＭＰ（ｃＧＡＭＰ）シンターゼ（ｃＧＡＳ）などのウイルスＤＮＡを認識し、ＩＦＮ－α／β産生を誘導する多数のタンパク質が同定されてきた（Ｇｏｕｂａｕ，Ｄ．ら；Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，２０１３；３８， ８５５－８６９．）。これらのＰＰＲがウイルスを認識した後、宿主の免疫応答シグナル伝達経路を刺激することにより、大量のＩ型インターフェロンの産生を誘導し、それによって感染に対する体の最初の防御線を迅速に確立し、病原体感染に抵抗する。しかし、マウスでのｉｎ ｖｉｖｏ実験では、細胞質内のｃＧＡＳとＤＮＡ－ＰＫのみがＤＮＡ認識受容体として確認される。いくつかのタンパク質（ＡＩＭ２、ＩＦＩ１６、Ｒａｄ５０とＳｏｘ２を含む）もＤＮＡウイルス誘導性の炎症反応に関与する。したがって、ＤＮＡウイルスに対する自然免疫応答を完全かつ明確に理解するために、特に核内の外来ＤＮＡの認識と核外の自然免疫シグナル伝達の活性化を結びつけるメカニズムを探すために、核内のＤＮＡ認識に関するさらなる研究が緊急に必要とされる。
【0007】
異種核リボ核タンパク質Ａ２Ｂ１（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ ｎｕｃｌｅａｒ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ Ａ２Ｂ１、ｈｎＲＮＰ－Ａ２Ｂ１）は、ｈｎＲＮＰファミリーに属し、少なくとも２０種類の豊富に発現するタンパク質と、その他のあまり豊富でないタンパク質を含み、ＲＮＡ結合タンパク質（ＲＮＡ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ、ＲＢＰ）でもある。 これらの分子は、ｍＲＮＡのスプライシング、輸送、その他のｍＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ関連のプロセスに関与する。 ｈｎＲＮＰ－Ａ２Ｂ１は、Ｎ末端に２つのタンデムＲＮＡ／ＤＮＡ認識モチーフ（ＲＮＡ／ＤＮＡ－ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｍｏｔｉｆｓ、ＲＲＭ）を含み、そのＤＮＡ結合能力を示す。現在の研究では、多くの生命活動におけるｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１の重要な機能が発見される。たとえば、ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１は、ｍｉＲＮＡプライマリボディ（ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ）と直接結合し、ｍｉＲＮＡマイクロプロセッシングタンパク質複合体の１つであるＤＧＣＲ８と一緒に、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ成熟ボディのプロセシングを促進することができる。さらに、ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１は、肺がん（Ｆｉｅｌｄｉｎｇ Ｐ．ら、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． １９９９ Ｄｅｃ；５（１２）：４０４８－５２）、乳がん（Ｃｕｉ Ｈ．ら、Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ Ｔｒｅａｔ． ２００１ Ａｐｒ；６６（３）：２１７－２４．）、肝細胞がん（Ｚｈｏｕ Ｊ．ら、ＢＭＣ Ｃａｎｃｅｒ． ２０１０ Ｊｕｌ ６；１０：３５６．）など、さまざまな腫瘍の疾患進行に関連する。ただし、これまでのところ、免疫応答と抗ウイルス感染におけるｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１タンパク質の役割は不明である。
【0008】
つまり、当技術分野において、核内のウイルスＤＮＡを認識でき、インターフェロンの産生を開始し、抗ウイルス効果を向上し、ウイルス感染に効果的に抵抗し、ウイルス感染による損傷を制御する免疫学的に活性な物質を開発することが緊急に必要とされる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0009】
本開示の主な目的の一つは、抗感染におけるｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１、当該タンパク質をコードする核酸分子、その促進剤又はその阻害剤の用途を提供し、かつさらに、感染性疾患及び関連する疾患又は症状の治療又は予防におけるそれらの用途も提供する。本開示の医薬品、医薬品組成物又はキットは、感染を効果的に抵抗し、感染性疾患の発生を制御することに用いられる。
【課題を解決するための手段】
【0010】
本開示のいくつかの態様において、感染性疾患及び／又は感染に関与する疾患及び／又は症状を予防及び／又は治療する製品の調製における異種核リボ核タンパク質Ａ２Ｂ１ （ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１）、当該タンパク質をコードする核酸分子、その促進剤又はその阻害剤の用途を提供する。
【0011】
本開示のいくつかの態様において、さらに、感染性疾患及び／又は感染に関与する疾患及び／又は症状を予防及び／又は治療する方法も提供し、上記の方法は、必要が有る対象に、予防及び／又は治療有効量の異種核リボ核タンパク質Ａ２Ｂ１ （ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１）、当該タンパク質をコードする核酸分子、その促進剤又はその阻害剤を投与することを含む。
【0012】
本開示のいくつかの態様において、感染性疾患及び／又は感染に関与する疾患及び／又は症状を予防及び／又は治療することに用いられる異種核リボ核タンパク質Ａ２Ｂ１ （ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１）、当該タンパク質をコードする核酸分子、その促進剤又はその阻害剤を提供する。
【0013】
本開示のいくつかの態様において、インターフェロン（例えばＩ型インターフェロン、例えばＩＦＮ－α及び／又はＩＦＮ－β）レベルの向上における異種核リボ核タンパク質Ａ２Ｂ１ （ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１）、当該タンパク質をコードする核酸分子、その促進剤の用途を提供する。一部の実施形態において、ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１、当該タンパク質をコードする核酸分子又はその促進剤は、感染を予防及び／又は治療するために、免疫反応を促進することに用いられる。
【0014】
本開示のいくつかの態様において、インターフェロン（例えばＩ型インターフェロン、例えばＩＦＮ－α及び／又はＩＦＮ－β）レベルの低下における異種核リボ核タンパク質Ａ２Ｂ１ （ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１）の阻害剤又は当該タンパク質をコードする核酸分子の阻害剤の用途を提供する。本開示のいくつかの態様において、ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１の阻害剤又はｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１タンパク質をコードする核酸分子の阻害剤は、過剰な免疫反応を抑制することに用いられる。本開示のいくつかの態様において、ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１又はｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１コード配列の阻害剤が、ウイルス感染に抵抗する細胞の能力を抑制し、細胞内でのウイルス複製を促進する。
【0015】
一部の実施形態において、上記のｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１は、以下から選べられる：
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示されたアミノ酸配列を有するポリペプチド；又は
（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示されたアミノ酸配列と相同であるか、又は配列同一性を有し（例えば８０％以上の相同性、又は８０％以上の配列同一性を有し、例えば８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％であり）、かつ感染を抑制する活性を有するタンパク質又はポリペプチド；又は
（ｃ）（ａ）又は（ｂ）のアミノ酸配列に、一つ又は複数のアミノ酸が置換、欠失又は付加されており、かつ感染性疾患及び／又は感染に関与する疾患及び／又は症状を予防及び／又は治療する活性を有する、（ａ）又は（ｂ）から誘導されるタンパク質又はポリペプチド。
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示されたアミノ酸配列を有するポリペプチド；又は
（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示されたアミノ酸配列と相同であるか、又は配列同一性を有し（例えば８０％以上の相同性、又は８０％以上の配列同一性を有し、例えば８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％であり）、かつ感染を抑制する活性を有するタンパク質又はポリペプチド；又は
（ｃ）（ａ）又は（ｂ）のアミノ酸配列に、一つ又は複数のアミノ酸が置換、欠失又は付加されており、かつ感染性疾患及び／又は感染に関与する疾患及び／又は症状を予防及び／又は治療する活性を有する、（ａ）又は（ｂ）から誘導されるタンパク質又はポリペプチド。
【0016】
一部の実施形態において、ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１は、自然に精製されたタンパク質、化学的に合成された産物、又は組換え技術で原核又は真核宿主から生産されるものである。上記の宿主は、バクテリア、酵母、高等動物および哺乳類細胞から選べられる。好ましくは、ヒトｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１である。
【0017】
一部の実施形態において、ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示されたアミノ酸配列のポリペプチドである。
【0018】
一部の実施形態において、ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１をコードする核酸分子は、以下から選べられる：
（ｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３に示されたヌクレオチド配列を有する核酸分子；又は
（ｉｉ） ストリンジェントな条件下で、（ｉ）に限定されるヌクレオチド配列とハイブリダイズする分子；
（ｉｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示されたヌクレオチド配列と相同であるか、又は配列同一性を有し（例えば８０％以上の相同性、又は８０％以上の配列同一性を有し、例えば８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％であり）、かつ感染性疾患及び／又は感染に関与する疾患及び／又は症状を予防及び／又は治療する活性を有するタンパク質又はポリペプチドをコードする核酸分子；
（ｉｖ）（ｉ）又は（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）のヌクレオチド配列から、一つ又は複数のヌクレオチドが置換、欠失又は付加されており、かつ感染性疾患及び／又は感染に関与する疾患及び／又は症状を予防及び／又は治療する活性を有するタンパク質又はポリペプチドをコードする核酸分子。
（ｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３に示されたヌクレオチド配列を有する核酸分子；又は
（ｉｉ） ストリンジェントな条件下で、（ｉ）に限定されるヌクレオチド配列とハイブリダイズする分子；
（ｉｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示されたヌクレオチド配列と相同であるか、又は配列同一性を有し（例えば８０％以上の相同性、又は８０％以上の配列同一性を有し、例えば８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％であり）、かつ感染性疾患及び／又は感染に関与する疾患及び／又は症状を予防及び／又は治療する活性を有するタンパク質又はポリペプチドをコードする核酸分子；
（ｉｖ）（ｉ）又は（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）のヌクレオチド配列から、一つ又は複数のヌクレオチドが置換、欠失又は付加されており、かつ感染性疾患及び／又は感染に関与する疾患及び／又は症状を予防及び／又は治療する活性を有するタンパク質又はポリペプチドをコードする核酸分子。
【0019】
一部の実施形態において、ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１をコードする核酸分子のヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１又は３に示される。
【0020】
一部の実施形態において、促進剤は、ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１タンパク質レベルを向上又はｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１機能を促進する物質であり、例えばｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１又はｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１をコードする配列の過剰発現ベクター；外来ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１；ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１をコードする配列の裸のＤＮＡ；ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１をコードする配列のリポソームに封入されたＤＮＡ；インビボでｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１に変換することができるｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１前駆体タンパク質又はコンジュゲート又はコンプレックスから選べられる。
一部の実施形態において、阻害剤は、ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１又は当該タンパク質をコードする核酸分子に対する抗体、ｓｉＲＮＡ （例えば、配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５－８のいずれか一つに示されたｓｉＲＮＡ）、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アンタゴニスト、ブロッカーから選べられる。
一部の実施形態において、阻害剤は、ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１又は当該タンパク質をコードする核酸分子に対する抗体、ｓｉＲＮＡ （例えば、配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５－８のいずれか一つに示されたｓｉＲＮＡ）、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アンタゴニスト、ブロッカーから選べられる。
【0021】
一部の実施形態において、上記の感染は、ＤＮＡが関与及び／又は仲介する感染である。
【0022】
一部の実施形態において、上記の感染は、ウイルス感染又は、バクテリア、真菌などのＤＮＡが関与する感染又はその組み合わせに引かられる感染、例えば、単純ヘルペスウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、アデノビルス、ポックスウイルス、小ＤＮＡウイルス、アデノ随伴ウイルスの一種類又は複数種類のウイルスに引かれる感染から選べられるＤＮＡウイルス感染である。
【0023】
一部の実施形態において、上記の感染に関与する疾患及び／又は症状は、以下から選べられる一つ又は複数である：感染による病理学的損傷；感染後のインターフェロンなどのサイトカインの不十分または過剰な産生；内毒素性ショックまたは死；臓器への炎症性損傷；多臓器不全、例えば、上記の臓器は、肝臓、脾臓、脳、腎臓、心臓、肺、胃、腸から選べられる；ウイルス感染による慢性炎症性疾患（例えば、炎症性腸疾患、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、慢性腎炎、結核、慢性胃腸疾患などの自己免疫疾患）。好ましくは、上記のウイルス感染による慢性炎症性疾患及び／又はその症状は、炎症性腸疾患、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、慢性腎炎、結核、慢性胃腸疾患などの自己免疫疾患を含む。
【0024】
一部の実施形態において、上記の製品は、医薬品組成物又はキットであり、例えば、その形式は、以下から選べられる医薬品組成物又はキットによる投与に適した形式形態である：経口、注射（例えば裸のＤＮＡまたはタンパク質の直接注入、リポソームに封入されたＤＮＡ又はタンパク質の注入）、金でコーティングされた遺伝子銃の爆撃、生殖欠損菌を含むプラスミドＤＮＡの持ち、標的ＤＮＡを運ぶ複製欠損アデノウイルス、又は目的遺伝子がコードするタンパク質、エレクトロポレーション、経鼻投与、肺投与、経口投与、経皮投与、腫瘍内投与。
【0025】
一部の実施形態において、上記の製品は、さらに、感染性疾患及び／又は感染に関与する疾患及び／又は症状を予防及び／又は治療するための他の物質を含み、例えば臨床によく使われる抗生物質（β－ラクタム（ペニシリンとセファロスポリン）、アミノグリコシド、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、マクロライド、抗真菌性抗生物質、抗結核性抗生物質を含む）の一つ又は複数。
【0026】
本開示のいくつかの態様において、以下を含む製品（例えば、医薬品組成物又はキット）を提供する：
（Ａ）治療又は予防有効量の本開示のｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１、当該タンパク質をコードする核酸分子、その促進剤及び／又はその阻害剤；
（Ｂ）薬学的または免疫学的に許容できるキャリア又は賦形剤；
（Ｃ）任意的に、感染性疾患及び関連する疾患及び／又は症状を予防又は治療する一つ又は複数の他の活性物質。
（Ａ）治療又は予防有効量の本開示のｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１、当該タンパク質をコードする核酸分子、その促進剤及び／又はその阻害剤；
（Ｂ）薬学的または免疫学的に許容できるキャリア又は賦形剤；
（Ｃ）任意的に、感染性疾患及び関連する疾患及び／又は症状を予防又は治療する一つ又は複数の他の活性物質。
【0027】
一部の実施形態において、上記の製品に、ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１又はｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１をコードする核酸分子、その促進剤又はその阻害剤は、上記の製品の総重量の０．００１～９９．９ｗｔ％に占める。
【0028】
一部の実施形態において、上記の製品に、ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１又はｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１をコードする核酸分子、その促進剤又はその阻害剤は、上記の製品の総重量の１～９５ｗｔ％、好ましくは５～９０ｗｔ％、より好ましくは１０～８０ｗｔ％に占める。残部は、薬学的に許容できるキャリア及びその添加剤などの物質である。
【0029】
一部の実施形態において、本開示の製品を投与する前、同時又は後に、抗ウイルス感染を調節する他の活性物質を投与する。上記の他の活性物質は、ウイルス感染に関与する疾患、感染による損傷、感染による慢性炎症性疾患及び／又はそれらの症状を予防又は治療する活性を有する。上記のウイルス感染は、単純ヘルペスウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、アデノウイルス、ポックスウイルスから選べられるの一つ又は２種以上である。
【0030】
一部の実施形態において、他の活性物質は、以下から選べられる一つ又は複数を含むが、それらに限定されない：β－ラクタム系抗生物質（ペニシリンとセファロスポリン）、アミノグリコシド系抗生物質、テトラサイクリン系抗生物質、クロラムフェニコール系抗生物質、マクロライド系抗生物質、抗真菌性抗生物質、抗結核系抗生物質など、一般的に使用される臨床用抗生物質；一般的に使用される臨床抗ウイルス薬（三環式アミン、ピロリン酸塩、プロテアーゼ阻害剤、ヌクレオシド薬とインターフェロン、アンチセンスオリゴヌクレオチドなど）；一般的に使用される臨床免疫抑制剤（グルココルチコイド、シクロホスファミド、クロロキン、シクロスポリンＡ、トリプテリギウムウィルフォルディ、漢方薬、抗ＴＮＦモノクローナル抗体を含む）。
【0031】
本開示のいくつかの態様において、ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１を促進することで感染を抵抗する医薬品をスクリーニングする方法を提供し、当該方法は、以下を含む：
（Ａ）感染された細胞、組織または動物を候補物質によって処理すること；
（Ｂ）上記の細胞、組織または動物中のｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１または当該タンパク質をコードする核酸分子のレベルを検出すること；及び
（Ｃ）ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１又は当該タンパク質をコードする核酸分子のレベルは、候補物質に処理された前のレベル、又は正常な対照中のレベルより高いと、上記の候補物質は、ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１を促進することで感染を抵抗する作用を有することを判明すること。
（Ａ）感染された細胞、組織または動物を候補物質によって処理すること；
（Ｂ）上記の細胞、組織または動物中のｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１または当該タンパク質をコードする核酸分子のレベルを検出すること；及び
（Ｃ）ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１又は当該タンパク質をコードする核酸分子のレベルは、候補物質に処理された前のレベル、又は正常な対照中のレベルより高いと、上記の候補物質は、ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１を促進することで感染を抵抗する作用を有することを判明すること。
【0032】
当業者は、本開示の本発明の概念および保護範囲から逸脱することなく、前述の技術的解決策および技術的特徴を任意に組み合わせることができる。本開示の他の内容に基づき、当業者にとって、本発明の他の面は自明なものである。
【図面の簡単な説明】
【0033】
本開示は、添付の図面を参照して以下でさらに説明され、これらの表現は、本開示の実施形態を説明することのみを意図しており、本開示の範囲を限定することを意図しない。
【図1】マウスの初代腹膜マクロファージをＨＳＶ－１で感染した後、ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１は、ＨＳＶ－１ ＤＮＡを直接認識して結合した；図は、ＰＣＲ後の核酸電気泳動によるＨＳＶ－１ＤＮＡの検出を示した。
【図2】ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１に対する干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）によるマウスマクロファージのトランスフェクションは、ＨＳＶ－１感染後のＩ型インターフェロンの転写レベルを低下した。図は、蛍光定量ＰＣＲで検出されたＩＦＮ－α（Ｉｆｎａ４）とＩＦＮ－β（Ｉｆｎｂ１）のｍＲＮＡレベルを示した（＊＊＊、Ｐ ＜０．００１； ＊＊、Ｐ ＜０．０１）。ＵＩ：感染していない；刺激されていないグループ。
【図3】ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１に対する干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）によるマウスマクロファージのトランスフェクションは、ＨＳＶ－１感染後のＩＦＮ－βタンパク質の転写レベルを低下した。図は、ＥＬＩＳＡ分析を示した（＊＊＊、Ｐ ＜０．００１）。ＵＩ：感染していない；刺激されていないグループ。
【図4】ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１に対する干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）によるヒトＴＨＰ１細胞のトランスフェクションは、ＨＳＶ－１感染後のＩ型インターフェロンの転写レベルを低下した。図は、蛍光定量ＰＣＲで検出されたＩＦＮ－α（Ｉｆｎａ４）とＩＦＮ－β（Ｉｆｎｂ１）のｍＲＮＡレベルを示した（＊＊＊、Ｐ ＜０．００１）。ＵＩ：感染していない；刺激されていないグループ。
【図5】マウスマクロファージでのｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１の過剰発現は、ＨＳＶ－１感染後のＩＦＮ－βタンパク質レベルの分泌を促進した。図は、ＥＬＩＳＡ分析を示した（＊＊＊、Ｐ ＜０．００１）。
【図6】野生型マウスと骨髄性細胞特異的ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１ノックアウト（Ｈｎｒｎｐａ２ｂ１ ｃＫＯ）マウスを、７×１０８プラーク形成単位（ＰＦＵ）のＨＳＶ－１で腹腔内感染した；６時間後、ＥＬＩＳＡにより血清ＩＦＮ－βレベルを検出した結果は、ｈｎＲＮＰ－Ａ２Ｂ１ノックアウトマウスの血清ＩＦＮ－βレベルは野生型マウスよりも有意に低かった（＊＊＊、Ｐ ＜０．００１）。
【図7】野生型マウスと骨髄性細胞特異的ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１ノックアウト（Ｈｎｒｎｐａ２ｂ１ ｃＫＯ）マウスを、７×１０８プラーク形成単位（ＰＦＵ）のＨＳＶ－１で腹腔内感染した；４日後にプラークアッセイによって脳ウイルス力価を検出した結果は、ｈｎＲＮＰ－Ａ２Ｂ１ノックアウトマウスの脳ウイルス力価は、野生型マウスよりも有意に低かった（＊＊＊、Ｐ ＜０．００１）。
【図8】野生型マウスと骨髄性細胞特異的ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１ノックアウト（Ｈｎｒｎｐａ２ｂ１ ｃＫＯ）マウスを、７×１０８プラーク形成単位（ＰＦＵ）のＨＳＶ－１で腹腔内感染した；ｈｎＲＮＰ－Ａ２Ｂ１ノックアウトマウスの生存率は有意に低下した（Ｐ ＜０．００１）。
【図9】ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１発現のノックダウンにより、ＡｄＶ感染後のＩ型インターフェロンの転写レベルが低下した。図は、蛍光定量ＰＣＲで検出されたＩＦＮ－βのｍＲＮＡレベルを示した（＊＊、Ｐ ＜０．０１）。ＵＩ：感染していない；刺激されていないグループ。
【発明を実施するための形態】
【0034】
本願では、多数の研究と動物モデルのテストを通じて、感染性疾患において、ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１がウイルス感染を効果的に抑制し、臓器の機能状態を改善し、患者の生存率を改善できることがわかった。これに基づき、本開示を完成した。
【0035】
本開示は、抗感染における新規免疫調節分子ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１の機能および効果を研究し、感染した動物に対する当該分子の治療的および保護的効果を検証する。実験によると、１）ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１は、ウイルス感染後にウイルスＤＮＡに結合できる；２）ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１の発現を妨害すると、ウイルス感染後のＩ型インターフェロンの産生を阻害する；３）ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１ノックアウトは、マウス脳のＨＳＶ－１感染を増加させ、死亡率を増加させる；４）ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１の過剰発現は、ウイルス感染後のＩ型インターフェロンの産生を促進できる；を証明した。これらの実験結果は、ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１が、ＤＮＡが関与及び／又は仲介する感染（例えば、ＨＳＶ－１、ＡｄＶ感染症などのウイルス感染性）の治療に応用できる可能性があることを示唆した。したがって、本開示は、感染の抑制に用いられる、または感染性疾患の予防と治療に（特にウイルス感染による肝障害などのウイルス感染の制御に）用いられる抗感染分子ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１の応用方法および応用戦略を提供する。
【0036】
ここで提供されるすべての数値範囲は、範囲の端点とその間の数値範囲の間にあるすべての数値を明示的に含むことを意図する。本開示で言及される特徴または実施例で言及される特徴は、組み合わせることができる。本明細書に開示されるすべての特徴は、任意の構成形態と組み合わせて使用することができ、明細書に開示されている各特徴は、同じ、等しい、または同様の目的を提供できる任意の代替機能に置き換えることができる。したがって、特に明記されていない限り、開示されている特徴は、同等または類似の機能の一般的な例にすぎない。
【0037】
本明細書で使用される場合、「含む」、「含有する」、「有する」という用語は、「含む」、「主に～構成する」、「基本的に～からなる」および「からなる」を含む；「主に～構成する」、「基本的に～からなる」および「からなる」は、「含む」、「含有する」、「有する」の従属概念である。
【0038】
［ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１タンパク質（ポリペプチド）］
本明細書で使用される場合、用語「ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１タンパク質（ポリペプチド）」、「ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１」は、互換可能に使用され、異種核リボ核タンパク質Ａ２Ｂ１を指す。本開示のｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の配列（ヒトｃＤＮＡ全長配列）又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３（マウスＣＤＳ配列）がコードするタンパク質、又はこれらのタンパク質のインターフェロンの発現を促進する作用を有する相同配列（例えば、本分野に既知されたデータベース又はアライメントソフトウェアで得られるｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１の相同配列）、変異体又は修飾形式であっても良い。例えば、上記のｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１タンパク質は、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４に示されたアミノ酸配列；又は（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列に、一つ又は複数のアミノ酸が置換、欠失又は付加されており、かつインターフェロンの発現を促進する活性を有する、（ａ）から誘導されるタンパク質又はポリペプチド；から選べられる。
本明細書で使用される場合、用語「ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１タンパク質（ポリペプチド）」、「ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１」は、互換可能に使用され、異種核リボ核タンパク質Ａ２Ｂ１を指す。本開示のｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の配列（ヒトｃＤＮＡ全長配列）又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３（マウスＣＤＳ配列）がコードするタンパク質、又はこれらのタンパク質のインターフェロンの発現を促進する作用を有する相同配列（例えば、本分野に既知されたデータベース又はアライメントソフトウェアで得られるｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１の相同配列）、変異体又は修飾形式であっても良い。例えば、上記のｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１タンパク質は、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４に示されたアミノ酸配列；又は（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列に、一つ又は複数のアミノ酸が置換、欠失又は付加されており、かつインターフェロンの発現を促進する活性を有する、（ａ）から誘導されるタンパク質又はポリペプチド；から選べられる。
【0039】
本開示のタンパク質またはポリペプチドは、自然に精製された産物、または化学的に合成された産物であり、或いは組換え技術で原核又は真核宿主（例えば、バクテリア、酵母、高等動物、昆虫と哺乳類細胞）から産生されるものである。本開示中のｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１タンパク質又はポリペプチドは、好ましくは、ヒトｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１遺伝子又はそれと相同する遺伝子又はファミリー遺伝子によってコードされる。
【0040】
本開示のタンパク質又はポリペプチドの変異形式は、一つ又は複数（一般的に、１－５０個、好ましくは、１－３０個、より好ましくは、１－２０個、最も好ましくは、１－１０個、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個）のアミノ酸的欠失、插入及び／又は置換、及びＣ末端及び／又はＮ末端における一つ又は複数（一般的に、２０個以下、好ましくは、１０個以下、より好ましくは、５個以下）のアミノ酸の付加を含むが、これらに限定されない。例えば、本分野中、類似の特性のアミノ酸による置換は、一般に、タンパク質またはポリペプチドの機能を変化させない。なお、Ｃ末端及び／又はＮ末端における一つ又は複数のアミノ酸の付加は、一般的に、タンパク質又はポリペプチドの機能を変化させなく、例えば、本開示のｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１タンパク質又はポリペプチドは、最初のメチオニン残基を含み得る場合も含まない場合もあり、それでも感染抑制活性を有する。
【0041】
ランダム突然変異誘発は、照射または突然変異誘発物質への曝露によって生成することができ、上記（ｂ）のタンパク質またはポリペプチドは、部位特異的突然変異誘発法または他の既知の分子生物学技術によっても得られる。タンパク質またはポリペプチドをコードするコード配列を使用し、トランスジェニック動物を構築することができ、得られたタンパク質またはポリペプチドは、トランスジェニック動物がウイルス感染に耐性があるかどうか、またはウイルス耐性が改善されるかどうかを観察することによってスクリーニングおよび同定することができる。
【0042】
組換え生産プロトコルで使用される宿主に応じて、本開示のタンパク質またはポリペプチドは、グリコシル化され得るか、または非グリコシル化され得る。この用語には、ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１タンパク質の活性フラグメントおよび活性誘導体も含む。
【0043】
ポリペプチドの変異形式には、相同配列、保存的変異体、対立遺伝子変異体、天然突然変異体、誘発突然変異体、および高ストリンジェンシーまたは低ストリンジェンシー条件下でｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１タンパク質をコードする配列とハイブリダイズできる配列によってコードされるタンパク質、およびｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１タンパク質に対する抗血清を使用して得られたポリペプチドまたはタンパク質を含む。ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１タンパク質またはそのフラグメントを含む融合タンパク質などの他のポリペプチドもまた、本開示に使用され得る。ほぼ完全長のポリペプチドに加えて、本開示は、また、ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１タンパク質の可溶性フラグメントを含む。一般的に、当該フラグメントは、ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１タンパク質配列の少なくとも約１０個の連続したアミノ酸、通常、少なくとも約３０個の連続したアミノ酸、好ましくは少なくとも約５０個の連続したアミノ酸、より好ましくは少なくとも約８０個の連続したアミノ酸、最も好ましくは少なくとも約１００個の連続したアミノ酸を有する。
【0044】
［ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１をコードする核酸分子］
本明細書で使用される場合、用語「ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１遺伝子」、「ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１コード遺伝子」、「ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１タンパク質コード遺伝子」又は「ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１をコードする核酸分子」は、互換可能に使用され、いずれも本開示に記載されたｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１タンパク質又はポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を指し、例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１ （ヒトＣＤＳ）配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３ （マウスＣＤＳ）配列に示されたヌクレオチド配列、ストリンジェントな条件下でこれらの配列とハイブリダイズする分子、又は上記の分子と高度的に相同するファミリー遺伝子分子であり、上記の遺伝子の発現は、インターフェロンの産生と影響に一定の促進効果をもたらす。ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１遺伝子は、ヒトとマウスで高度に保存される。ヒトのＧｅｎｅ ＩＤは３１８１で、マウスのＧｅｎｅ ＩＤは５３３７９である。
本明細書で使用される場合、用語「ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１遺伝子」、「ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１コード遺伝子」、「ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１タンパク質コード遺伝子」又は「ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１をコードする核酸分子」は、互換可能に使用され、いずれも本開示に記載されたｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１タンパク質又はポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を指し、例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１ （ヒトＣＤＳ）配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３ （マウスＣＤＳ）配列に示されたヌクレオチド配列、ストリンジェントな条件下でこれらの配列とハイブリダイズする分子、又は上記の分子と高度的に相同するファミリー遺伝子分子であり、上記の遺伝子の発現は、インターフェロンの産生と影響に一定の促進効果をもたらす。ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１遺伝子は、ヒトとマウスで高度に保存される。ヒトのＧｅｎｅ ＩＤは３１８１で、マウスのＧｅｎｅ ＩＤは５３３７９である。
【0045】
本開示のｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１遺伝子は、（ｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３；または（ｉｉ）ストリンジェントな条件下で（ｉ）に限定された配列とハイブリダイズし、インターフェロン産生を促進する分子；から選べられる。
【0046】
本明細書で使用される場合、用語「ストリンジェントな条件」とは、（１）より低いイオン強度とより高い温度でのハイブリダイゼーションと溶出、例えば０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６０℃；又は（２）ハイブリダイゼーション中に変性剤の添加、例えば５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド、０．１％子牛血清／０．１％Ｆｉｃｏｌｌ、４２℃など；又は（３）ハイブリダイゼーションは、２つの配列が少なくとも５０％、好ましくは５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上又は９０％以上、より好ましくは９５％同一である場合にのみ発生すること；を指す。例えば、上記の配列は、（ａ）で定義された配列の相補配列であっても良い。
【0047】
本開示のｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１遺伝子の全長ヌクレオチド配列またはそのフラグメントは、通常、ＰＣＲ増幅法、組換え法または人工合成法によって得ることができる。ＰＣＲ増幅法に対して、本文に開示されたヌクレオチド配列、特にオープンリーディングフレーム配列に従ってプライマーを設計し、市販のｃＤＮＡライブラリー又は本分野の当業者が既知の一般的な方法で作成するｃＤＮＡライブラリーをテンプレートとし、増幅で関連する配列を得られる。配列が長い場合、２回又は複数回のＰＣＲ増幅を実行し、増幅されたフラグメントを正しい順序でつなぎ合わせることがよくある。
【0048】
本開示のｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１遺伝子は、好ましくはヒトから得られるが、ヒトｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１遺伝子と高度に相同する（例えば、５０％以上、好ましくは５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、より好ましくは８５％以上、例えば８５％、９０％、９５％、９８％、ひいては９９％以上の配列同一性） 他の動物から得られる他の遺伝子も本開示によって好ましくは企図される同等性の範囲内であることが理解されるべきである。配列同一性をアラインメントさせるための方法およびツール（ＢＬＡＳＴなど）もまた、当技術分野でよく知られている。
【0049】
［ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１又はｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１のコード配列の促進剤と阻害剤］
本開示には、さらにｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１又はｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１のコード配列の「促進剤」に関する。用語「促進剤」又は「ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１又はそのコード配列の促進剤」は、互換可能に使用され、ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１又はそれをコードする核酸分子のレベル又は活性を向上できる物質を指す。本開示に用いられる促進剤は、ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１発現ベクター、外来ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１、ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１又はそのコード配列の裸のＤＮＡ、ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１又はそれをコードする配列のリポソームに封入されたＤＮＡ、ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１タンパク質を含むが、これらに限定されない。
本開示には、さらにｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１又はｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１のコード配列の「促進剤」に関する。用語「促進剤」又は「ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１又はそのコード配列の促進剤」は、互換可能に使用され、ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１又はそれをコードする核酸分子のレベル又は活性を向上できる物質を指す。本開示に用いられる促進剤は、ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１発現ベクター、外来ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１、ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１又はそのコード配列の裸のＤＮＡ、ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１又はそれをコードする配列のリポソームに封入されたＤＮＡ、ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１タンパク質を含むが、これらに限定されない。
【0050】
本開示のｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１又はｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１コード配列又はその促進剤は、ウイルス感染を抑制でき、そして、さらに、ウイルス感染に関連する疾患、及び／又はウイルス感染による関連症状、及び感染による慢性炎症性疾患、及び／又はそれらの症状を予防又は治療することに用いられる。
【0051】
本開示には、さらにｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１又はｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１のコード配列の「阻害剤」に関する。用語「阻害剤」又は「ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１又はそれをコードする核酸分子の阻害剤」は、互換可能に使用され、ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１又はそれをコードする核酸分子のレベル又は活性を低下できる物質を指す。本開示に用いられる阻害剤は、ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１又は当該タンパク質をコードする核酸分子に対する抗体、ｓｉＲＮＡ （例えば、配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５－８のいずれか一つに示されたｓｉＲＮＡ）、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アンタゴニスト、ブロッカーを含むが、これらに限定されない。
【0052】
本開示の阻害剤は、過剰な抗感染反応（例えば、インターフェロンの産生）を抑制でき、そして、さらに、感染に関連する疾患及び／又は関連症状、例えば感染による慢性炎症性疾患（例えば、炎症性腸疾患、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、慢性腎炎、結核、慢性胃腸疾患などの自己免疫疾患）を予防又は治療することに用いられる。
【0053】
［ベクター、宿主及びトランスジェニック動物］
本開示は、さらにｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１遺伝子を含むベクター、及び当該ベクターにより遺伝子工程で産生された宿主細胞、及びトランスジェニックで得られたｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１高発現トランスジェニック動物を含む。
本開示は、さらにｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１遺伝子を含むベクター、及び当該ベクターにより遺伝子工程で産生された宿主細胞、及びトランスジェニックで得られたｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１高発現トランスジェニック動物を含む。
【0054】
一般的な組換えＤＮＡ技術（Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９８４；２２４：１４３１）によって、本開示のコード配列は、組換えのｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１タンパク質の発現又は生産に用いられる。一般的に、以下のステップを含む：
（１）本開示のｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１タンパク質をコードするポリヌクレオチド（又は変異体）で、又は当該ポリヌクレオチドを含有する組え発現ベクターで、適当な宿主細胞を形質転換または形質導入する；
（２）適当な培地で宿主細胞を培養する；
（３）培地又は細胞からタンパク質又はポリペプチドを単離、精製する。
（１）本開示のｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１タンパク質をコードするポリヌクレオチド（又は変異体）で、又は当該ポリヌクレオチドを含有する組え発現ベクターで、適当な宿主細胞を形質転換または形質導入する；
（２）適当な培地で宿主細胞を培養する；
（３）培地又は細胞からタンパク質又はポリペプチドを単離、精製する。
【0055】
本開示では、用語「ベクター」と「組換え発現ベクター」は、互換可能に使用され、本分野によく知られるバクテリアプラスミド、バクテリオファージ、酵母プラスミド、動物細胞ウイルス、哺乳動物細胞ウイルス又は他のベクターを指す。つまり、宿主内で複製可能で安定している限り、任意のプラスミドとベクターを使用することができる。発現ベクターの重要な特徴の一つは、通常に、複製起点、プロモーター、マーカー遺伝子、および翻訳制御要素を含むことである。
【0056】
当業者に周知の方法を使用し、ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１コード配列および適切な転写／翻訳制御シグナルを含む発現ベクターを構築することができる。これらの方法には、インビトロ組換えＤＮＡ技術、ＤＮＡ合成技術、インビボ組換え技術などを含む。ＤＮＡ配列は、発現ベクター内の適切なプロモーターに作動可能に連結して、ｍＲＮＡ合成を指導することができる。発現ベクターは、さらに、翻訳開始用のリボソーム結合部位と転写ターミネーターを含む。本開示では、ｐｃＤＮＡ３．１ベクター発現システムを、好ましく使用する。
【0057】
また、発現ベクターは、好ましくは、形質転換された宿主細胞の選択のための表現型形質を提供するために、１つ以上の選択的なマーカー遺伝子を含み、例えば、真核細胞培養用のジヒドロ葉酸レダクターゼ、ネオマイシン耐性、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、または大腸菌用のテトラサイクリンまたはアンピシリン耐性などがある。
【0058】
上記の適切なＤＮＡ配列を適切なプロモーターまたは制御配列と共に含むベクターは、タンパク質またはポリペプチドを発現できるように適切な宿主細胞の形質転換に用いられる。宿主細胞は、細菌細胞のような原核細胞であっても良く、または酵母細胞のような下等真核細胞であっても良く、または動物細胞のような高等真核細胞であっても良い。代表的な例は、大腸菌、ストレプトマイセス、アグロバクテリウム、酵母などの真菌細胞、動物細胞などである。本開示には、好ましくは、大腸菌細菌細胞、ヒト肝細胞を宿主細胞として使用する。
【0059】
本開示のポリヌクレオチドが、高等真核細胞で発現される場合、エンハンサー配列がベクターに挿入されれば、転写が増強される。エンハンサーは、ＤＮＡのシス作用エレメントであり、通常に、長さが約１０～３００塩基対であり、プロモーターに作用して遺伝子の転写を増強する。当業者は、適切なベクター、プロモーター、エンハンサーおよび宿主細胞をどのように選択することを了解する。
【0060】
本開示において、「トランスジェニック動物」または「形質転換動物」という用語は、互換可能に使用され、本開示のｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１遺伝子が導入され、ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１タンパク質またはポリペプチドを高レベルで安定して発現する従来のトランスジェニック方法によって得られた細胞、臓器、組織または個体を指す。
【0061】
上記の方法における組換えポリペプチドは、細胞内または細胞膜上で発現されるか、または細胞外に分泌され得る。必要に応じて、その物理・化学・他の特性を利用し、様々な分離方法で、組換えタンパク質を分離や精製しても良い。それらの方法は、当業者がよく知られるものである。それらの方法の例は、通常のリフォールディング処理、タンパク質沈殿剤での処理（塩析方法）、遠心分離、浸透での細胞破壊、超音波処理、超遠心分離、モレキュラーシーブクロマトグラフィー（ゲル濾過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィーと他の各液体クロマトグラフィー技術及びそれらの方法の組み合わせを含むが、それらに限定されない。
【0062】
［製品］
本開示は、例えば医薬品、医薬品組成物又はキット／キットである製品、を提供し、ただし、有効量の本開示のｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１又はｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１をコードする核酸分子、その促進剤又はその阻害剤、及び薬学的または免疫学的に許容できるキャリアを含む。本明細書で使用される場合、「活性物質」又は「本開示の活性物質」という用語は、互換可能に使用され、ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１又はｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１コード配列、その促進剤又はその阻害剤を指す。
本開示は、例えば医薬品、医薬品組成物又はキット／キットである製品、を提供し、ただし、有効量の本開示のｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１又はｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１をコードする核酸分子、その促進剤又はその阻害剤、及び薬学的または免疫学的に許容できるキャリアを含む。本明細書で使用される場合、「活性物質」又は「本開示の活性物質」という用語は、互換可能に使用され、ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１又はｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１コード配列、その促進剤又はその阻害剤を指す。
【0063】
好ましい実施方案において、上記の製品は、ウ居留守感染と関連する疾患、ウイルス感染による慢性炎症性疾患、及び／又はそれらの症状を予防又は治療することに用いられる；例えば、本開示の医薬品組成物は、先行技術に既知の治療又は予防可能なウイルス感染性疾患を予防又は治療することに用いられ、例えばウイルス感染に引かれる組織損傷；器官的炎性損傷；多器官機能衰竭。
【0064】
本明細書で使用されるように、用語「含む」または「有する」は、「含む」、「基本的に～からなる」および「からなる」を含む。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される」成分は、ヒト及び／又は動物に適用、過度の有害反応（例えば毒性、刺激とアレルギー反応）がないもので、すなわち合理な利益／リスク比がある物質である。本明細書で使用されるように、用語「有効量」とは、人及び／又は動物に、機能できる又は活性を有する、かつ人及び／又は動物に許容される量である。
【0065】
本明細書で使用される場合、上記の「薬学的に許容されるキャリア」という用語は、治療剤の投薬に用いられるキャリアを指し、各種な賦形剤と希釈剤を含む。当該用語が、それ自体が必須の有効成分ではないが、投与後に過度に毒性がないいくつかの医薬品キャリアを指す。適切なキャリアは当業者によく知られており、薬学的に許容される賦形剤の完全な議論は、《レミントン製薬科学》（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂ． Ｃｏ．，Ｎ．Ｊ． １９９１）に見出すことができる。
【0066】
組成物には、薬学的に許容されるキャリアが、液体、例えば水、塩水、グリセロールとエタノールを含んでも良い。さらに、これらのキャリアはまた、補助物質、例えば充填剤、崩壊剤、潤滑剤、流動促進剤、沸騰剤、湿潤剤または乳化剤、香味料、ｐＨ緩衝物質などを含んでも良い。一般に、これらの物質は、非毒性で、不活性で、薬学的に許容される水性キャリア媒体中で、通常、約５～８のｐＨ、好ましくは約６～８のｐＨで処方することができる。
【0067】
本開示の製品中の活性物質は、組成物の総重量の０．００１～９９．９重量％；好ましくは、組成物の総重量の１～９５重量％、より好ましくは５～９０重量％、さらに好ましくは１０～８０重量％を占める。残部は、薬学的に許容できるキャリア及びその添加剤などの物質である。
【0068】
本明細書で使用される場合、「単位剤形」という用語は、投与を容易にするために単回投与に必要な剤形への本開示の製品の調製を指し、さまざまな固体剤（錠剤など）、液体剤、カプセル剤、および徐放剤を含むが、これらに限定されない。
【0069】
本開示のもう一つの好ましい実施形態において、上記の製品は、単位剤形又は多剤形であり、かつその中の活性物質の含有量は、０．０１～２０００ｍｇ／剤、好ましくは０．１～１５００ｍｇ／剤、より好ましくは１～１０００ｍｇ／剤である。本開示の別の好ましい実施形態において、毎日、本開示の組成物を１～６剤、好ましくは１～３剤投与する；最も好ましくは、毎日投与される用量は、１剤である。
【0070】
使用されるｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１タンパク質またはそのコード配列などの活性物質の有効用量は、投与または治療される対象の重症度に応じて、変化し得ることが理解される。特定の状況は、熟練した医師の判断の範囲内である、対象の個々の状態（例えば、対象の体重、年齢、体調、および所望の効果）に従って決定される。
【0071】
本開示の製品は、固体（例えば、顆粒、錠剤、凍結乾燥粉末、坐剤、カプセル、舌下錠剤）または液体（例えば、経口液体）または他の適切な形状であっても良い。投与経路としては、以下を採用できる：（１）裸のＤＮＡまたはタンパク質を直接注入する；（２）ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１のｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、およびタンパク質を、トランスフェリン／ポリ－Ｌ－リジン複合体に結合して、その生物学的効果を高める；（３）ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、およびタンパク質は、正に帯電した脂質と複合体を形成し、リン酸骨格の負の電荷による細胞膜の通過の困難を克服する；（４）ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、およびタンパク質をリポソームで封入した後、それによって細胞への侵入を仲介することで、高分子のスムーズな侵入を促進するだけでなく、さまざまな細胞外酵素による加水分解を防ぐ；（５）ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、およびタンパク質がコレステロールに結合し、その細胞質の保持時間が１０倍に増加する；（６）免疫リポソームでｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、およびタンパク質を送達することにより、標的組織および標的細胞への特異的な送達が可能になる；（７）トランスフェクトされた細胞（例えば線維芽細胞）へのｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、およびタンパク質のインビトロトランスフェクションは、ＨＮＲＮＰＡ２Ｂ１関連薬物を標的細胞により良くロードすることもできる；（８）電流による標的細胞へのｃＤＮＡ、ｍＲＮＡおよびタンパク質の導入、すなわちエレクトロポレーション（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）。
【0072】
なお、本開示の製品は、さらにウイルス感染性疾患を改善と治療することに用いられる他の活性物質を含有しても良く、上記の他の活性物質は、臨床によく使われる抗生物質（β－ラクタム（ペニシリンとセファロスポリン）、アミノグリコシド、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、マクロライド、抗真菌性抗生物質、抗結核性抗生物質を含む）の一つ又は複数から選べられる。
【0073】
バクテリア性感染疾患の予防と治療のために、本開示のｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１関連ヌクレオチドとタンパク質医薬品は、相互に併用されてもよく、他の医薬品と治療手段と併用されてもよい。
【0074】
［実施例］
以下、具体的な実施例を参照して、本開示をさらに説明する。これらの実施例は、本開示の範囲を限定するものではなく、本開示の単なる例示であることが理解されるべく。当業者は、本開示に対して適切な修正および変形を行うことができ、これらの修正および変形はすべて、本開示の範囲内である。
以下、具体的な実施例を参照して、本開示をさらに説明する。これらの実施例は、本開示の範囲を限定するものではなく、本開示の単なる例示であることが理解されるべく。当業者は、本開示に対して適切な修正および変形を行うことができ、これらの修正および変形はすべて、本開示の範囲内である。
【0075】
以下の例で特定の条件を指定しない実験方法については、例えば《分子クローニング実験ガイド》を（第３版、ニューヨーク、コールドスプリングハーバーラボラトリープレス、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８９）参照するか、供給業者が提案する条件に従うなど、現場での従来の方法を使用することができる。ＤＮＡシーケンス法は、当技術分野では一般的な方法であり、試験は商業会社によって提供することもできる。
【0076】
特に断らない限り、百分率および部は重量を指す。別途に定義しない限り、本明細書で使用される全ての専門的および科学的用語は当業者に公知された意味と一致する。さらに、記載された内容と類似または同等の任意の方法および材料を本開示の方法に適用することができる。本明細書に記載される好ましい実施の形態および材料は、例示のみのためである。
【0077】
実施例１：ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１は核内病原体由来のＤＮＡを直接認識する
マウスの初代腹膜マクロファージの取得：Ｃ５７ＢＬ／６マウス（６－８週齢、メス、上海必凱実験動物株式会社から購入）を採用し、３％チオグリコレート（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ会社から購入）溶液２ｍｌを１回腹腔内注射し、３日後、マウスを頸椎脱臼により殺し、腹腔を無血清培地で洗浄し、吸引後の遠心分離により細胞を得た。
マウスの初代腹膜マクロファージの取得：Ｃ５７ＢＬ／６マウス（６－８週齢、メス、上海必凱実験動物株式会社から購入）を採用し、３％チオグリコレート（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ会社から購入）溶液２ｍｌを１回腹腔内注射し、３日後、マウスを頸椎脱臼により殺し、腹腔を無血清培地で洗浄し、吸引後の遠心分離により細胞を得た。
【0078】
初代腹膜マクロファージをＤＭＥＭ培地で培養し、ＨＳＶ－１（Ｆ株、ＡＴＣＣから購入）で２時間感染した後に、核タンパク質を単離し、抗ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚから購入）または対照抗体（ＩｇＧ、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚから購入）で免疫沈降し、ＨＳＶ－１ＤＮＡをＰＣＲで検出した。
【0079】
図１は、ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１のＨＳＶ－１ＤＮＡへの結合を示した。
【0080】
結果は、抗ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１抗体によって沈降したｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１タンパク質が、２時間感染した後に、ＨＳＶ－１ＤＮＡに結合したことを示した。
【0081】
この結果は、感染期間に、ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１がＨＳＶ－１ＤＮＡに結合することを示唆した。
【0082】
実施例２：ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１の発現を妨害すると、ＨＳＶ－１感染によって誘導されるＩ型インターフェロンに抑制効果がある
初代腹腔マクロファージを、ＤＭＥＭ培地で培養し、ヒトＴＨＰ１細胞（ＡＴＣＣから購入）を、１６４０培地で培養した。細胞に、ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１に対する低分子干渉ＲＮＡ（ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１ ｓｉＲＮＡ）およびモックコントロール（対照ｓｉＲＮＡ）をトランスフェクトした（トランスフェクション試薬ＩＮＴＥＲＦＥＲｉｎは、Ｐｏｌｙｐｌｕｓ会社から購入した）。
初代腹腔マクロファージを、ＤＭＥＭ培地で培養し、ヒトＴＨＰ１細胞（ＡＴＣＣから購入）を、１６４０培地で培養した。細胞に、ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１に対する低分子干渉ＲＮＡ（ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１ ｓｉＲＮＡ）およびモックコントロール（対照ｓｉＲＮＡ）をトランスフェクトした（トランスフェクション試薬ＩＮＴＥＲＦＥＲｉｎは、Ｐｏｌｙｐｌｕｓ会社から購入した）。
【0083】
ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１に対する低分子干渉ＲＮＡ（ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１ ｓｉＲＮＡ）およびモックコントロール（対照ｓｉＲＮＡ）は、Ｇｅｎｅｐｈａｍａから購入した。マウスｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１ ｓｉＲＮＡの配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に示され、ヒトｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１ ｓｉＲＮＡの配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示され、対照ｓｉＲＮＡの配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に示され、合成の際に、３′に２つのｄＴを増加することで配列をより安定化させた。具体的な配列は次のとおり：
ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１ ｓｉＲＮＡ配列：
マウスｈｎＲＮＰＡＢ１ ｓｉＲＮＡ：
５′－ＧＡＧＧＡＡＡＵＵＡＵＧＧＡＡＧＵＧＧＴＴ－３′（センス、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）；
５′－ＣＣＡＣＵＵＣＣＡＵＡＡＵＵＵＣＣＵＣＣＴ－３′（アンチセンス、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）。
ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１ ｓｉＲＮＡ配列：
マウスｈｎＲＮＰＡＢ１ ｓｉＲＮＡ：
５′－ＧＡＧＧＡＡＡＵＵＡＵＧＧＡＡＧＵＧＧＴＴ－３′（センス、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）；
５′－ＣＣＡＣＵＵＣＣＡＵＡＡＵＵＵＣＣＵＣＣＴ－３′（アンチセンス、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）。
【0084】
ヒトｈｎＲＮＰＡＢ１ ｓｉＲＮＡ：
５′－ＣＵＵＵＧＧＵＧＧＵＡＧＣＡＧＧＡＡＣＴＴ－３′（センス、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）；
５′－ＧＵＵＣＣＵＧＣＵＡＣＣＡＣＣＡＡＡＧＴＴ－３′（アンチセンス、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）。
５′－ＣＵＵＵＧＧＵＧＧＵＡＧＣＡＧＧＡＡＣＴＴ－３′（センス、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）；
５′－ＧＵＵＣＣＵＧＣＵＡＣＣＡＣＣＡＡＡＧＴＴ－３′（アンチセンス、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）。
【0085】
対照ｓｉＲＮＡ配列：
５′－ＵＵＣＵＣＣＧＡＡＣＧＵＧＵＣＡＣＧＵＴＴ－３′（センス、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）；
５′－ＡＣＧＵＧＡＣＡＣＧＵＵＣＧＧＡＧＡＡＴＴ－３′（アンチセンス、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）。
５′－ＵＵＣＵＣＣＧＡＡＣＧＵＧＵＣＡＣＧＵＴＴ－３′（センス、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）；
５′－ＡＣＧＵＧＡＣＡＣＧＵＵＣＧＧＡＧＡＡＴＴ－３′（アンチセンス、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）。
【0086】
トランスフェクションの４８時間後、マウス腹腔マクロファージ（２×１０５細胞／ウェル）と、ヒトＴＨＰ１細胞（１×１０６細胞／ウェル）を、ＨＳＶ－１（ＭＯＩ、１０）で刺激し、感染の７時間後に付着細胞を回収し、細胞から総ＲＮＡを抽出し、リアルタイム蛍光定量ＰＣＲ法で、Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β）の転写レベルを検出した；感染の１８時間後に細胞培養上清を収集し、ＥＬＩＳＡで、ＩＦＮ－βタンパク質レベルを検出した。
【0087】
Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β）の転写レベルを図２および図４に示し、ＩＦＮ－βのタンパク質レベルを図３に示した。その中で、図２と図３では、マウス細胞に対して、マウスｈｎＲＮＰＡＢ１ ｓｉＲＮＡを使用した；図４では、ヒト細胞に対して、ヒトｈｎＲＮＰＡＢ１ ｓｉＲＮＡを使用した。
【0088】
結果は、ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１に対する低分子干渉ＲＮＡによるマウスマクロファージのトランスフェクションが、ＨＳＶ－１感染によって誘導されるＩ型インターフェロンの産生を有意に阻害することができることを示した。
【0089】
結果は、ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１の発現を妨害すると、ＨＳＶ－１感染によって誘導されるＩ型インターフェロンが減少することを示し、ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１が抗感染に重要な役割を果たす可能性があることを示唆した。
【0090】
実施例３：ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１の過剰発現が、細胞のＩＦＮ－β分泌を抑制する
まず、従来の方法に従って、ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１のｃＤＮＡ（ＮＭ＿１８２６５０）を、真核生物の発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１プラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅから購入）に導入し、ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１発現ベクターを構築した。
まず、従来の方法に従って、ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１のｃＤＮＡ（ＮＭ＿１８２６５０）を、真核生物の発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１プラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅから購入）に導入し、ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１発現ベクターを構築した。
【0091】
ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１発現ベクターを、１μｇ／ｍｌの密度で、マウス腹腔マクロファージにトランスフェクトし、４８時間後に新鮮なＤＭＥＭ培地を交換した。
【0092】
４×１０５細胞／ｍｌ、ＨＳＶ－１（ＭＯＩ、１０）で細胞を感染し、１２時間後に、細胞培養上清を回収し、細胞培養上清中のＩＦＮ－βレベルをＥＬＩＳＡキットで検出した。
ＩＦＮ－βの分泌状況を図５に示した。
ＩＦＮ－βの分泌状況を図５に示した。
【0093】
結果は、ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１プラスミドでトランスフェクトされた細胞が、ＨＳＶ－１によって誘導されたＩＦＮ－βの産生を促進できることを示した。
【0094】
結果は、ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１の過剰発現が、ＨＳＶ－１感染によって誘導されたＩＦＮ－β産生を促進することを示し、ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１が抗感染に重要な役割を果たす可能性があることを示唆した。
【0095】
実施例４：ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１のノックダウンが、インビボでＨＳＶ－１感染によって誘導された血清ＩＦＮ－βレベルを抑制する
ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１骨髄性細胞の条件付きノックアウトマウス（上海南方モデル生物テクノロジー株式会社から購入し、工法は、Ｊｎｙｎｅｒ ＡＬ． Ｇｅｎｅ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ．１９９４を参照）を構築し、ＣＲＥエンドヌクレアーゼによって特異的に認識できるｌｏｘＰ配列を、Ｈｎｒｎｐａ２ｂ１遺伝子のエクソン２～６に付加した。Ｈｎｒｎｐａ２ｂ１ｆｌ／ｆｌマウスを、Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンドに戻し交配し、次にＬｙｚ２－Ｃｒｅマウスと交雑し、骨髄性細胞にＨｎｒｎｐａ２ｂ１遺伝子のエクソン２～６の特異的なノックアウトを達成した。Ｈｎｒｎｐａ２ｂ１ｆｌ／ｆｌＬｙｚ２－Ｃｒｅ＋／－マウスとＨｎｒｎｐａ２ｂ１ｆｌ／ｆｌＬｙｚ２－Ｃｒｅ－／－マウスの交配により、骨髄性細胞特異的なｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１ノックアウト（Ｈｎｒｎｐａ２ｂ１ ｃＫＯ）マウスと同腹仔対照野生型マウスが得られ、これらのマウスは、特殊病原体フリー（ＳＰＦ）環境で飼育された。
ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１骨髄性細胞の条件付きノックアウトマウス（上海南方モデル生物テクノロジー株式会社から購入し、工法は、Ｊｎｙｎｅｒ ＡＬ． Ｇｅｎｅ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ．１９９４を参照）を構築し、ＣＲＥエンドヌクレアーゼによって特異的に認識できるｌｏｘＰ配列を、Ｈｎｒｎｐａ２ｂ１遺伝子のエクソン２～６に付加した。Ｈｎｒｎｐａ２ｂ１ｆｌ／ｆｌマウスを、Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンドに戻し交配し、次にＬｙｚ２－Ｃｒｅマウスと交雑し、骨髄性細胞にＨｎｒｎｐａ２ｂ１遺伝子のエクソン２～６の特異的なノックアウトを達成した。Ｈｎｒｎｐａ２ｂ１ｆｌ／ｆｌＬｙｚ２－Ｃｒｅ＋／－マウスとＨｎｒｎｐａ２ｂ１ｆｌ／ｆｌＬｙｚ２－Ｃｒｅ－／－マウスの交配により、骨髄性細胞特異的なｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１ノックアウト（Ｈｎｒｎｐａ２ｂ１ ｃＫＯ）マウスと同腹仔対照野生型マウスが得られ、これらのマウスは、特殊病原体フリー（ＳＰＦ）環境で飼育された。
【0096】
野生型マウスと骨髄性細胞特異的なｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１ノックアウト（Ｈｎｒｎｐａ２ｂ１ ｃＫＯ）マウスを、７×１０８プラーク形成単位（ＰＦＵ）のＨＳＶ－１に腹腔内感染させ、６時間後に採血し、血清を分離し、ＥＬＩＳＡで血清ＩＦＮ－βレベルを検出した。検出結果は、図６に示された。
【0097】
結果は、ｈｎＲＮＰ－Ａ２Ｂ１ノックアウトマウスの血清ＩＦＮ－βレベルが、野生型マウスよりも有意に低かった（＊＊＊、Ｐ ＜０．００１）ことを示した。
【0098】
結果は、ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１のノックアウトが、ＨＳＶ－１ウイルス感染によって誘導されたＩＦＮ－β産生を抑制することを示し、ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１が抗感染に重要な役割を果たす可能性があることを示唆した。
【0099】
実施例５：ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１のノックアウトが、マウスの脳におけるＨＳＶ－１の複製を促進する
ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１骨髄性細胞の条件付きノックアウトマウスを構築した（実施例４と同じ）。野生型マウスと骨髄性細胞特異的なｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１ノックアウト（Ｈｎｒｎｐａ２ｂ１ ｃＫＯ）マウスを、７×１０８プラーク形成単位（ＰＦＵ）のＨＳＶ－１に腹腔内感染させ、４日後に、プラークアッセイで脳ウイルス力価を検出した。
ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１骨髄性細胞の条件付きノックアウトマウスを構築した（実施例４と同じ）。野生型マウスと骨髄性細胞特異的なｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１ノックアウト（Ｈｎｒｎｐａ２ｂ１ ｃＫＯ）マウスを、７×１０８プラーク形成単位（ＰＦＵ）のＨＳＶ－１に腹腔内感染させ、４日後に、プラークアッセイで脳ウイルス力価を検出した。
【0100】
マウス脳におけるＨＳＶ－１複製の検出の結果を図７に示した。
【0101】
結果は、ｈｎＲＮＰ－Ａ２Ｂ１ノックアウトマウスの脳におけるウイルス力価が、野生型マウスよりも有意に高かった（＊＊＊、Ｐ ＜０．００１）ことを示した。
結果は、ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１のノックアウトが、インビボでＨＳＶ－１ウイルスの複製を促進することを示し、ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１が抗感染に重要な役割を果たす可能性があることを示唆した。
結果は、ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１のノックアウトが、インビボでＨＳＶ－１ウイルスの複製を促進することを示し、ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１が抗感染に重要な役割を果たす可能性があることを示唆した。
【0102】
実施例６：ｈｎＲＮＰＡ２Ｂのノックアウトは、ウイルス感染による死亡率を増加させる
ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１骨髄性細胞の条件付きノックアウトマウスを構築した（実施例３と同じ）。野生型マウスと骨髄性細胞特異的ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１ノックアウト（Ｈｎｒｎｐａ２ｂ１ ｃＫＯ）マウスを、７×１０８プラーク形成単位（ＰＦＵ）のＨＳＶ－１で腹腔内感染し、マウスの死亡を継続的に観察した。結果は、図８に示された。
ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１骨髄性細胞の条件付きノックアウトマウスを構築した（実施例３と同じ）。野生型マウスと骨髄性細胞特異的ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１ノックアウト（Ｈｎｒｎｐａ２ｂ１ ｃＫＯ）マウスを、７×１０８プラーク形成単位（ＰＦＵ）のＨＳＶ－１で腹腔内感染し、マウスの死亡を継続的に観察した。結果は、図８に示された。
【0103】
結果は、ｈｎＲＮＰ－Ａ２Ｂ１ノックアウトマウスの生存率が有意に低下した（＊＊＊、Ｐ ＜０．００１）ことを示した。
【0104】
結果は、ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１のノックアウトが、ＨＳＶ－１ウイルス感染による死亡率を増加させたことを示し、ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１が抗感染に重要な役割を果たす可能性があることを示唆した。
【0105】
実施例７：ｈｎＲＮＰＡ２Ｂのノックアウトは、アデノウイルス（ＡｄＶ）感染によって誘導されたＩ型インターフェロンを抑制する
ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１遺伝子エクソン２を、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９テクノロジーによって削除し、ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１をノックアウトしたＲＡＷ２６４．７細胞株を構築した。対照のＲＡＷ２６４．７細胞（ＡＴＣＣから購入）と、ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１をノックアウトしたＲＡＷ２６４．７細胞とを、ＡｄＶ（ＭＯＩ、１０；Ａｄ５タイプ、漢恒バイオテクノロジー（上海）株式会社から購入）に感染させ、感染の７時間後に、付着細胞を回収し、細胞の総ＲＮＡを抽出し、リアルタイム蛍光定量ＰＣＲでＩＦＮ－βのｍＲＮＡの発現レベルを検出した。
ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１遺伝子エクソン２を、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９テクノロジーによって削除し、ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１をノックアウトしたＲＡＷ２６４．７細胞株を構築した。対照のＲＡＷ２６４．７細胞（ＡＴＣＣから購入）と、ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１をノックアウトしたＲＡＷ２６４．７細胞とを、ＡｄＶ（ＭＯＩ、１０；Ａｄ５タイプ、漢恒バイオテクノロジー（上海）株式会社から購入）に感染させ、感染の７時間後に、付着細胞を回収し、細胞の総ＲＮＡを抽出し、リアルタイム蛍光定量ＰＣＲでＩＦＮ－βのｍＲＮＡの発現レベルを検出した。
【0106】
ＩＦＮ－βｍＲＮＡの発現レベルを図９に示した。
【0107】
結果は、ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１のノックアウトが、ＡｄＶ感染によって誘導されたＩＦＮ－βの産生を、有意に抑制できることを示した。
【0108】
結果は、ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１のノックアウトが、ＡｄＶ感染によって誘導されたＩ型インターフェロンを減少させ、ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１が抗感染に重要な役割を果たす可能性があることを示唆した。
【0109】
本開示に言及されている全ての参考文献は、参照として単独に引用されるように、本出願に引用されて、参照になる。理解すべきなのは、本開示の上記の開示に基づき、当業者は、本開示を様々な変更または修正を行っても良い、これらの同等の形態も本出願に添付された請求の範囲に規定される範囲内に含まれる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【配列表】