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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-05-07
(45)【発行日】2024-05-15
(54)【発明の名称】Ｔ細胞受容体の定常ドメインを含むタンパク質
(51)【国際特許分類】
C07K 14/725 20060101AFI20240508BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20240508BHJP
C07K 16/28 20060101ALI20240508BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20240508BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20240508BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20240508BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20240508BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20240508BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20240508BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240508BHJP
【ＦＩ】
C07K14/725 ZNA
C07K19/00
C07K16/28
C12N15/13
C12N15/62 Z
C12N15/63 Z
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
【請求項の数】
29
(21)【出願番号】P 2022514718
(86)(22)【出願日】2020-09-02
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-11-14
(86)【国際出願番号】 US2020048979
(87)【国際公開番号】W WO2021046072
(87)【国際公開日】2021-03-11
【審査請求日】2022-03-04
(31)【優先権主張番号】62/896,958
(32)【優先日】2019-09-06
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(73)【特許権者】
【識別番号】594197872
【氏名又は名称】イーライ リリー アンド カンパニー
(73)【特許権者】
【識別番号】501345323
【氏名又は名称】ザ ユニバーシティ オブ ノース カロライナ アット チャペル ヒル
【氏名又は名称原語表記】ＴＨＥ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＯＦ ＮＯＲＴＨ ＣＡＲＯＬＩＮＡ ＡＴ ＣＨＡＰＥＬ ＨＩＬＬ
(74)【代理人】
【識別番号】100092783
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 浩
(74)【代理人】
【識別番号】100095360
【弁理士】
【氏名又は名称】片山 英二
(74)【代理人】
【識別番号】100120134
【弁理士】
【氏名又は名称】大森 規雄
(74)【代理人】
【識別番号】100196966
【弁理士】
【氏名又は名称】植田 渉
(72)【発明者】
【氏名】デマレスト，スティーブン ジェイ．
(72)【発明者】
【氏名】フロニング，カレン ジーン
(72)【発明者】
【氏名】クールマン，ブライアン アーサー
(72)【発明者】
【氏名】マグワイア，ジャック バートン
【審査官】太田 雄三
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１９／０６７８０５（ＷＯ，Ａ１）
【文献】Nature Communications，2020年05月11日，11:2330，p. 1-14，doi:10.1038/s41467-020-16231-7
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ０７Ｋ １４／７２５
Ｃ１２Ｎ １５／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
タンパク質であって、以下の残基：１３９位のフェニルアラニン、１５０位のイソロイシン、１９０位のスレオニン（Ｋａｂａｔ番号付けに従って番号付けされた残基）のうちの少なくとも１つを含むＴ細胞受容体（ＴＣＲ）アルファ定常ドメイン（Ｃα）を含む第１のポリペプチド、および／または
以下の残基：１３９位のアルギニン、１５５位のプロリン、１７０位のアスパラギン酸もしくはグルタミン酸（Ｋａｂａｔ番号付けに従って番号付けされた残基）のうちの少なくとも１つを含むＴＣＲベータ定常ドメイン（Ｃβ）を含む第２のポリペプチドを含み、
前記タンパク質は、参照ペプチドと比較して、より高いアンフォールディング温度（Ｔｍ）を有し、前記参照ペプチドは、
前記Ｃαドメインが１３９位のセリン、１５０位のスレオニン、および１９０位のアラニン（Ｋａｂａｔ番号付けに従って番号付けされた残基）を含むこと、および／または
前記Ｃβドメインが１３４位のグルタミン酸、１３９位のヒスチジン、１５５位のアスパラギン酸、および１７０位のセリン（Ｋａｂａｔ番号付けに従って番号付けされた残基）を含むこと
以外は前記タンパク質と同じアミノ酸配列を含む、タンパク質。
【請求項2】
前記第１のポリペプチドが、以下の残基：１３９位のフェニルアラニン、１５０位のイソロイシン、１９０位のスレオニン（Ｋａｂａｔ番号付けに従って番号付けされた残基）のうちの少なくとも１つを含むＣαを含み、前記第２のポリペプチドが、以下の残基：１３４位のリジン、１３９位のアルギニン、１５５位のプロリン、１７０位のアスパラギン酸またはグルタミン酸（Ｋａｂａｔ番号付けに従って番号付けされた残基）のうちの少なくとも１つを含むＣβを含む、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項3】
前記第１のポリペプチドが、以下の残基：１３９位のフェニルアラニン、１５０位のイソロイシン、１９０位のスレオニン（Ｋａｂａｔ番号付けに従って番号付けされた残基）を含むＣαドメインを含み、前記第２のポリペプチドが、以下の残基：１３４位のリジン、１３９位のアルギニン、１５５位のプロリン、１７０位のアスパラギン酸（Ｋａｂａｔ番号付けに従って番号付けされた残基）を含むＣβドメインを含む、請求項２に記載のタンパク質。
【請求項4】
前記第１のポリペプチドが、以下の残基：１３９位のフェニルアラニンおよび１９０位のスレオニン（Ｋａｂａｔ番号付けに従って番号付けされた残基）を含むＣαドメインを含み、前記第２のポリペプチドが、以下の残基：１３４位のリジン、１３９位のアルギニン、１５５位のプロリン、１７０位のアスパラギン酸（Ｋａｂａｔ番号付けに従って番号付けされた残基）を含むＣβドメインを含む、請求項２に記載のタンパク質。
【請求項5】
前記第１のポリペプチドが、鎖間ジスルフィド結合によって前記第２のポリペプチドに連結されている、請求項１～４のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項6】
前記Ｃαドメインが、１６６位のシステイン残基（Ｋａｂａｔ番号付けに従って番号付けされた残基）をさらに含み、前記Ｃβドメインが、１７３位のシステイン残基（Ｋａｂａｔ番号付けに従って番号付けされた残基）をさらに含み、
前記第１のポリペプチドおよび前記第２のポリペプチドが、Ｃαの前記１６６位のシステイン残基とＣβの前記１７３位のシステイン残基との間の鎖間ジスルフィド結合によって連結されている、請求項１～５のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項7】
前記Ｃαドメインが、配列番号５を含み、前記Ｃβドメインが、配列番号７を含む、請求項２～５のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項8】
前記Ｃαドメインが、配列番号５からなり、前記Ｃβドメインが、配列番号７からなる、請求項２～５のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項9】
前記Ｃαドメインが、配列番号６を含み、前記Ｃβドメインが、配列番号８を含む、請求項２～６のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項10】
前記Ｃαドメインが、配列番号６からなり、前記Ｃβドメインが、配列番号８からなる、請求項２～６のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項11】
前記第１のポリペプチドが、ＴＣＲアルファ可変ドメイン（Ｖα）をさらに含み、前記第２のポリペプチドが、ＴＣＲベータ可変ドメイン（Ｖβ）をさらに含み、
前記ＶαおよびＶβが、抗原に結合する抗原結合ドメインを形成する、請求項１～１０のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項12】
前記Ｖαが、ＣαのＮ末端に融合しており、前記Ｖβが、ＣβのＮ末端に融合している、請求項１１に記載のタンパク質。
【請求項13】
前記抗原が、腫瘍抗原またはウイルス抗原である、請求項１１に記載のタンパク質。
【請求項14】
前記タンパク質が、第２の抗原結合ドメインをさらに含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項15】
前記第２の抗原結合ドメインが、Ｔ細胞表面上の抗原に結合する、請求項１４に記載のタンパク質。
【請求項16】
前記第２の抗原結合ドメインが、ＣＤ３に結合する、請求項１４に記載のタンパク質。
【請求項17】
前記第２の抗原結合ドメインが、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、（Ｆａｂ’）２、単一ドメイン抗体、またはラクダＶＨＨドメインである、請求項１４～１６のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項18】
前記第２の抗原結合ドメインが、Ｆａｂである、請求項１４～１７のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項19】
前記Ｆａｂが、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）およびヒトＩｇＧ ＣＨ１ドメインを含むＦａｂ重鎖、ならびに軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）およびヒト軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）を含むＦａｂ軽鎖を含み、前記ＶＨおよびＶＬが、ＣＤ３に結合する前記第２の抗原結合ドメインを形成する、請求項１８に記載のタンパク質。
【請求項20】
前記タンパク質が、以下の３つのポリペプチド：Ｖα－Ｃα－リンカー－ＶＨ－ＣＨ１を含む第１のポリペプチド、
Ｖβ－Ｃβを含む第２のポリペプチド、および
ＶＬ－ＣＬを含む第３のポリペプチドを含み、
前記第２および第３のポリペプチドが、鎖間ジスルフィド結合によって前記第１のポリペプチドに連結されている、請求項１８または１９に記載のタンパク質。
【請求項21】
前記タンパク質が、ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域（Ｆｃ）をさらに含む、請求項１～２０のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項22】
前記ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域が、対応する野生型ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域と比較してエフェクター機能が低下した改変ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域である、請求項２１に記載のタンパク質。
【請求項23】
前記タンパク質が、以下の４つのポリペプチド：Ｖα－Ｃα－ヒンジ－第１のＦｃ領域を含む第１のポリペプチド、
Ｖβ－Ｃβを含む第２のポリペプチド、
ＶＬ－ＣＬを含む第３のポリペプチド、および
ＶＨ－ＣＨ１－ヒンジ－第２のＦｃ領域を含む第４のポリペプチドを含み、
前記第２および第４のポリペプチドが、鎖間ジスルフィド結合によって前記第１のポリペプチドに連結されており、前記第３のポリペプチドが、鎖間ジスルフィド結合によって前記第４のポリペプチドに連結されている、請求項１～１９、２１または２２のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項24】
前記タンパク質が、以下の４つのポリペプチド：Ｖα－Ｃα－リンカー－ＶＨ－ＣＨ１－ヒンジ－第１のＦｃ領域を含む第１のポリペプチド、
Ｖβ－Ｃβを含む第２のポリペプチド、
ＶＬ－ＣＬを含む第３のポリペプチド、
第２のＦｃ領域を含む第４のポリペプチドを含み、
前記第２、第３、および第４のポリペプチドが、鎖間ジスルフィド結合によって前記第１のポリペプチドに連結されている、請求項２１または２２に記載のタンパク質。
【請求項25】
前記リンカーが、配列番号４１～４６のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２０または２４に記載のタンパク質。
【請求項26】
前記ヒンジ領域が配列番号４７を含み、前記第１および第２のＦｃ領域が配列番号４８を含む、請求項２３または２４に記載のタンパク質。
【請求項27】
前記ヒンジ領域が配列番号４９を含み、前記第１および第２のＦｃ領域が配列番号５０を含む、請求項２３または２４に記載のタンパク質。
【請求項28】
前記第１および第２のＦｃ領域が、ＣＨ３ヘテロ二量体化変異のセットを含む、請求項２３または２４に記載のタンパク質。
【請求項29】
前記第１または第２のＦｃ領域のうちの一方が、残基４０７のアラニン、残基３９９のメチオニン、および残基３６０のアスパラギン酸を含むＣＨ３ドメインを含み、前記第１または第２のＦｃ領域の他方が、残基３６６のバリン、残基４０９のバリン、ならびに残基３４５および３４７のアルギニン（ＥＵインデックス番号付けに従って番号付けされた残基）を含むＣＨ３ドメインを含む、請求項２８に記載のタンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は、１つ以上の安定化変異を有するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の定常ドメインを含むタンパク質、そのようなタンパク質をコードする核酸、ならびにそのようなタンパク質を作製および使用する方法に関する。
【背景技術】
【0002】
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）は、「非自己」細胞内抗原を認識して排除するための適応免疫システムのツールである。これらの非自己抗原は、ウイルス感染または遺伝的変化から出現する可能性がある。遺伝的変化は異常な細胞機能の鍵であり、がんなどの疾患をもたらす可能性がある。ＴＣＲはα／βおよびγ／δの形態で存在し、これらは構造的には類似しているが、異なるＴ細胞で発現する。α／β ＴＣＲはＣＤ８＋エフェクターＴ細胞とＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞の両方で発現し、ＨＬＡ／ＭＨＣと複合体を形成する際に、感染／がん性細胞表面に表示されるプロテオソーム分解外来抗原を認識する（Ｄａｖｉｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９８８．３３４（６１８１）：３９５－４０２、Ｈｅｅｍｅｌｓ，ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ，１９９５．６４：４６３－９１）。ＣＤ８＋Ｔエフェクター細胞上で発現すると、α／β ＴＣＲはＩ型ＭＨＣ／ペプチド複合体と特異的に相互作用し、この相互作用はＴ細胞の活性化および認識可能な非自己抗原を示す細胞の排除を誘導する。
【0003】
構造的に、ネイティブα／β ＴＣＲの細胞外部分は、２つのポリペプチド、α鎖およびβ鎖からなり、それぞれが膜近位の定常ドメイン（ＣαまたはＣβドメイン）および膜遠位の可変ドメイン（ＶαまたはＶβ）を有する。定常ドメインおよび可変ドメインの各々は、鎖内ジスルフィド結合を含む。可変ドメインは、抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）に類似した非常に可変的なループを含有する。ＴＣＲのＣＤＲ３は、ＭＨＣ（主要組織適合遺伝子複合体）によって提示されるペプチドと相互作用し、ＣＤＲ１およびＣＤＲ２は、ペプチドおよびＭＨＣと相互作用する。ＴＣＲ配列の多様性は、連結される可変（Ｖ）、多様性（Ｄ）、結合（Ｊ）、および定常（Ｃ）遺伝子の体細胞組換えによって生成され、そのような再配列は信じられないほどの多様性を生み出し、これはＴＣＲがＭＨＣによって表示される多様なペプチド抗原を認識することを可能にする。
【0004】
治療用途のためにα／β ＴＣＲの絶妙な非自己認識特性を利用するために多くのアプローチが開発されてきた。組換えα／β ＴＣＲは、これらのＴ細胞が腫瘍関連抗原を標的とするように再方向付けする手段として、バルクナイーブＴ細胞に形質導入／トランスフェクトされている（Ｒｉｌｅｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ，２０１９．１８（３）：１７５－１９６、Ｐａｒｋｈｕｒｓｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，２０１７。２３（１０）：２４９１－２５０５）。あるいは、活性化Ｔ細胞受容体（通常はＣＤ３ε）に結合するｓｃＦｖに融合したＴＣＲの可溶性細胞外領域の使用が、内因性Ｔ細胞を標的腫瘍細胞に再方向付けするために使用されている（Ｌｉｄｄｙ、ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ，２０１２．１８（６）：９８０－７）。細胞表面で過剰発現した抗原の直接認識に依存する典型的なＢｉＴＥ様二重特異性抗体とは異なり（Ｂａｅｕｅｒｌｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，２００９．６９（１２）：４９４１－４）、ＴＣＲまたはＴＣＲ模倣二重特異性抗体は、細胞内および異常な腫瘍またはウイルス抗原のはるかに大きなサブセットを認識できるため、より広い潜在的な適用性を有する（Ｌｉｄｄｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ，２０１２．１８（６）：９８０－７）。
【0005】
しかしながら、ＴＣＲの組み立ておよび発現は困難である（Ｗｉｌｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ，１９９７．７（６）：８３９－４８）。研究および治療の両方の目的のために、可溶性α／β ＴＣＲ産生の一般的な方法は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）における封入体としての発現と、それに続く再可溶化、再フォールディング／アセンブリ／酸化、最終的には比較的低収率での精製を通してのものであった（ｖａｎ Ｂｏｘｅｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２００９．３５０（１－２）：１４－２１）。アセンブリピースを単純化するために、一部の研究者は、特定のＨＬＡ／ペプチド複合体を標的とするために、抗体単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）のような単鎖フォーマットまたはｓｃＴｖにおけるＴＣＲの可変ドメイン領域のみを使用することを試みてきた（Ｓｔｏｎｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ，２０１２．５０３：１８９－２２２）。ｓｃＦｖは不安定性、凝集、および低溶解性の傾向を示すが、ｓｃＴＣＲ可変ドメインは一般的に発現および安定性の問題が悪化している。治療および診断の用途のために、ｓｃＶα／Ｖβタンパク質を安定化するために多大な努力が払われてきた（Ｓｔｏｎｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ，２０１２．５０３：１８９－２２２）。残念ながら、Ｖα／Ｖβ生殖細胞系列の高い多様性（抗体のＶＨ／ＶＬ生殖細胞系列よりもはるかに高い）は、ｓｃＶα／Ｖβ内の安定化変異の各セットが、個々のＶα／Ｖβサブユニットに固有であり、複数のＴＣＲにわたる一般的な使用を見つける可能性を少なくする。
【0006】
ほとんどの細胞外タンパク質が複雑なジスルフィド対合で本質的にグリコシル化されていることを考えると、哺乳動物発現が可溶性ＴＣＲを生成するために使用される。工業用抗体の生産は、主に哺乳動物の発現システムに移行している（Ｓｈｕｋｌａ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｅｎｇ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ，２０１７．２（１）：５８－６９）。しかしながら、α／β ＴＣＲは、一般的に利用されているチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系で発現した場合、抗体よりも信頼性の低いアセンブリを伴い、発現が不十分である。可溶性α／β ＴＣＲ二重特異性に関連するものを含む多くの新規二重特異性抗体フォーマットは、適切な分子アセンブリのために抗体様レベルで発現するＴＣＲを必要とする場合があり、これはそれらの産生の障害である。可溶性ＴＣＲを抗体ｓｃＦｖに組換え融合する二重特異性ＩｍｍＴａｃ部分は、通常、細菌に不溶性の封入体として発現され、可溶化され、再フォールディングされ、低収率で組み立てられる（Ｌｉｄｄｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ，２０１２．１８（６）：９８０－７）。さらに、これらの部分は、リサイクルメカニズムを欠いているため、本質的に迅速な血清クリアランスを有する。
【0007】
様々なＴＣＲにわたって一般的な使用に適しており、良好な発現および／またはアセンブリレベルを備えた、ＴＣＲ安定化操作についての必要性が存在している。
【発明の概要】
【0008】
本明細書で提供されるのは、ＴＣＲ定常ドメインのアンフォールディング温度を上昇させ、ＴＣＲの発現および／またはアセンブリを改善する、ＴＣＲ定常ドメイン（Ｃα／Ｃβドメイン）における１つ以上の安定化変異を含むタンパク質である。本明細書で提供されるのは、１３９位のフェニルアラニン、１５０位のイソロイシン、１９０位のスレオニンの残基（Ｋａｂａｔ番号付けに従って番号付けされた残基）のうちの少なくとも１つを含むＴ細胞受容体（ＴＣＲ）アルファ定常ドメイン（Ｃα）を含む第１のポリペプチド、または１３４位のリジン、１３９位のアルギニン、１５５位のプロリン、１７０位のアスパラギン酸もしくはグルタミン酸の残基（Ｋａｂａｔ番号付けに従って番号付けされた残基）のうちの少なくとも１つを含むＴＣＲベータ定常ドメイン（Ｃβ）を含む第２のポリペプチドを含むタンパク質である。
【0009】
本明細書で使用されるＴＣＲ ＣαおよびＣβドメインのアミノ酸残基の番号付けは、図２に図示するように、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従う（Ｋａｂａｔ，ｅｔ ａｌ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ Ｖｏｌ．１ Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ １９９１ ＵＳ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，ＮＩＨ）。Ｋａｂａｔ番号付けに基づいて上記に列挙されたＴＣＲ Ｃα残基は、配列番号５または６（Ｃα）の以下の残基に対応し、Ｋａｂａｔ番号付けの１３９位は、配列番号５または６の２２位に対応し、Ｋａｂａｔ番号付けの１５０位は、配列番号５または６の３３位に対応し、Ｋａｂａｔ番号付けの１９０位は、配列番号５または６の７３位に対応する。Ｋａｂａｔ番号付けに基づいて上記に列挙されたＴＣＲ Ｃβ残基は、配列番号７または８（Ｃβ）の以下の残基に対応し、Ｋａｂａｔ番号付けの１３４位は、配列番号７または８の１８位に対応し、Ｋａｂａｔ番号付けの１３９位は配列番号７または８の２３位に対応し、Ｋａｂａｔ番号付けの１５５位は配列番号７または８の３９位に対応し、Ｋａｂａｔ番号付けの１７０位は、配列番号７または８の５４位に対応する。
【0010】
一態様では、本明細書で提供されるのは、１３９位のフェニルアラニン、１５０位のイソロイシン、１９０位のスレオニンの残基（Ｋａｂａｔ番号付けに従って番号付けされた残基）のうちの少なくとも１つを含むＴＣＲ Ｃαを含む第１のポリペプチド、および／または１３４位のリジン、１３９位のアルギニン、１５５位のプロリン、１７０位のアスパラギン酸もしくはグルタミン酸の残基（Ｋａｂａｔ番号付けに従って番号付けされた残基）のうちの少なくとも１つを含むＴＣＲ Ｃβを含む第２のポリペプチドを含むタンパク質である。
【0011】
別の態様において、本明細書に提供されるのは、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドを含むタンパク質であり、第１のポリペプチドは、１３９位のフェニルアラニン、１５０位のイソロイシン、１９０位のスレオニンの残基（Ｋａｂａｔ番号付けに従って番号付けされた残基）のうちの少なくとも１つ（例えば、１つ、２つ、または３つ）を含むＴＣＲ Ｃαを含み、かつ／または第２のポリペプチドは、１３４位のリジン、１３９位のアルギニン、１５５位のプロリン、１７０位のアスパラギン酸もしくはグルタミン酸の残基（Ｋａｂａｔ番号付けに従って番号付けされた残基）のうちの少なくとも１つ（例えば、１つ、２つ、３つ、または４つ）を含むＴＣＲ Ｃβを含む。いくつかの実施形態において、タンパク質は、上記の７つの残基のうちの任意の１つを含む。いくつかの実施形態において、タンパク質は、上記の７つの残基のうちの任意の２つを含む。いくつかの実施形態において、タンパク質は、上記の７つの残基のうちの任意の３つを含む。いくつかの実施形態において、タンパク質は、上記の７つの残基のうちの任意の４つを含む。いくつかの実施形態において、タンパク質は、上記の７つの残基のうちの任意の５つを含む。いくつかの実施形態において、タンパク質は、上記の７つの残基のうちの任意の６つを含む。いくつかの実施形態において、タンパク質は、上記の７つの残基すべてを含む。
【0012】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のタンパク質は、可溶性タンパク質である。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のタンパク質は、１３９位のセリン、１５０位のスレオニン、および１９０位のアラニン（Ｋａｂａｔ番号付けに従って番号付けされた残基）を含むＣαドメイン、ならびに１３４位のグルタミン酸、１３９位のヒスチジン、１５５位のアスパラギン酸、および１７０位のセリン（Ｋａｂａｔ番号付けに従って番号付けされた残基）を含むＣβドメインを除いて同じアミノ酸配列を含むタンパク質と比較した場合に、１つ以上の優れた特性、例えば、より高いアンフォールディング温度（Ｔｍ）、安定性の増加、同じ条件下で発現された場合の発現レベルの増加、または低下したグリコシル化レベルを有する。
【0013】
いくつかの実施形態において、第１のポリペプチドは、１３９位のフェニルアラニン（Ｋａｂａｔ番号付け）を含むＣαドメインを含む。いくつかの実施形態において、第１のポリペプチドは、１９０位のスレオニン（Ｋａｂａｔ番号付け）を含むＣαドメインを含む。いくつかの実施形態において、第１のポリペプチドは、１５０位のイソロイシン（Ｋａｂａｔ番号付け）を含むＣαドメインを含む。いくつかの実施形態において、第２のポリペプチドは、１５５位のプロリン（Ｋａｂａｔ番号付け）を含むＣβドメインを含む。いくつかの実施形態において、第２のポリペプチドは、１７０位のアスパラギン酸またはグルタミン酸（Ｋａｂａｔ番号付け）を含むＣβドメインを含む。いくつかの実施形態において、第２のポリペプチドは、１３４位のリジン（Ｋａｂａｔ番号付け）を含むＣβドメインを含む。いくつかの実施形態において、第２のポリペプチドは、１３９位のアルギニン（Ｋａｂａｔ番号付け）を含むＣβドメインを含む。
【0014】
いくつかの実施形態において、本明細書に提供されるのは、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドを含むタンパク質であり、第１のポリペプチドは、１３９位のフェニルアラニン、１５０位のイソロイシン、１９０位のスレオニンの残基（Ｋａｂａｔ番号付けに従って番号付けされた残基）を含むＴＣＲ Ｃαドメインを含み、第２のポリペプチドは、１３４位のリジン、１３９位のアルギニン、１５５位のプロリン、１７０位のアスパラギン酸の残基（Ｋａｂａｔ番号付けに従って番号付けされた残基）を含むＴＣＲ Ｃβドメインを含む。
【0015】
いくつかの実施形態において、本明細書に提供されるのは、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドを含むタンパク質であり、第１のポリペプチドは、１３９位のフェニルアラニンおよび１９０位のスレオニンの残基（Ｋａｂａｔ番号付けに従って番号付けされた残基）を含むＴＣＲ Ｃαドメインを含み、第２のポリペプチドは、１３４位のリジン、１３９位のアルギニン、１５５位のプロリン、１７０位のアスパラギン酸の残基（Ｋａｂａｔ番号付けに従って番号付けされた残基）を含むＴＣＲ Ｃβドメインを含む。
【0016】
いくつかの実施形態において、ＴＣＲ Ｃαドメインは、配列番号５を含む。ＴＣＲ Ｃβドメインは、配列番号７を含む。したがって、本明細書で提供されるのは、配列番号５を含むＣαドメインを含む第１のポリペプチド、および配列番号７を含むＣβドメインを含む第２のポリペプチドを含むタンパク質である。いくつかの実施形態において、Ｃαドメインは、配列番号５からなり、Ｃβドメインは配列番号７からなる。したがって、本明細書で提供されるのは、配列番号５からなるＣαドメインを含む第１のポリペプチド、および配列番号７からなるＣβドメインを含む第２のポリペプチドを含むタンパク質である。
【0017】
いくつかの実施形態において、第１のポリペプチドは、１つ以上の鎖間ジスルフィド結合によって第２のポリペプチドに連結されている。ジスルフィド結合は、ＴＣＲα鎖およびβ鎖の操作されたシステイン残基の対によって形成することができ、そのようなジスルフィド結合は、ＴＣＲα鎖およびβ鎖を一緒に連結する（ＷＯ０３／０２０７６３、ＷＯ２００４／０３３６８５、ＷＯ２００４／０７４３２２、Ｌｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００５，２３（３）：３４９－３５４、Ｂｏｕｌｔｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．２００３，１６（９）：７０７－１１を参照）。例えば、ジスルフィド結合は、ＴＣＲα鎖およびβ鎖の指定された残基にある次の操作されたシステインの対間で形成することができる：Ｔｈｒ４８Ｃｙｓ（α鎖）およびＳｅｒ５７Ｃｙｓ（β鎖）、Ｔｈｒ４５Ｃｙｓ（α鎖）およびＳｅｒ７７Ｃｙｓ（β鎖）、Ｔｙｒ１０Ｃｙｓ（α鎖）およびＳｅｒ１７Ｃｙｓ（β鎖）、Ｔｈｒ４５Ｃｙｓ（α鎖）およびＡｓｐ５９Ｃｙｓ（β鎖）、ならびにＳｅｒ１５Ｃｙｓ（α鎖）およびＧｌｕ１５Ｃｙｓ（β鎖）（ＷＯ０３／０２０７６３を参照）。
【0018】
いくつかの実施形態において、Ｃαドメインは、１６６位のシステイン残基（Ｋａｂａｔ番号付けに従って番号付けされた残基）をさらに含み、Ｃβドメインは、１７３位のシステイン残基（Ｋａｂａｔ番号付けに従って番号付けされた残基）をさらに含み、ここで、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドは、Ｃαの１６６位のシステイン残基とＣβの１７３位のシステイン残基との間の鎖間ジスルフィド結合によって連結されている。
【0019】
いくつかの実施形態において、ＴＣＲ Ｃαドメインは配列番号６を含む。ＴＣＲ Ｃβドメインは配列番号８を含む。したがって、本明細書で提供されるのは、配列番号６を含むＣαドメインを含む第１のポリペプチド、および配列番号８を含むＣβドメインを含む第２のポリペプチドを含むタンパク質である。いくつかの実施形態において、Ｃαドメインは、配列番号６からなり、Ｃβドメインは配列番号８からなる。したがって、本明細書で提供されるのは、配列番号６からなるＣαドメインを含む第１のポリペプチド、および配列番号８からなるＣβドメインを含む第２のポリペプチドを含むタンパク質である。
【0020】
いくつかの実施形態において、第１のポリペプチドは、ＴＣＲα鎖可変ドメイン（Ｖα）をさらに含み、第２のポリペプチドは、ＴＣＲβ鎖可変ドメイン（Ｖβ）をさらに含み、ここで、ＶαおよびＶβは、抗原、例えば、腫瘍抗原またはウイルス抗原に結合する抗原結合ドメインを形成する。いくつかの実施形態において、ＶαはＣαのＮ末端に融合され、Ｖα－Ｃαドメインを形成し、ＶβはＣβのＮ末端に融合され、Ｖβ－Ｃβドメインを形成する。
【0021】
ＴＣＲ可変領域（Ｖα／Ｖβ）は、ウイルス抗原、ネオ抗原（がん細胞でのみ発現され、正常細胞では発現されない抗原）、腫瘍関連抗原（正常細胞では低レベルで発現しているが、がん細胞では過剰発現しているタンパク質の処理された断片）、またはがん／精巣（ＣＴ）抗原（通常は生殖組織、例えば、精巣（ｔｅｓｔｅｓ）、胎児卵巣、胎盤によってのみ発現されるタンパク質に由来し、他のすべての成人組織では発現が制限されているか／発現していない）を含むが、これらに限定されない任意の腫瘍またはウイルス抗原に結合することができる（Ｐｒｉｔｃｈａｒｄ，ｅｔ ａｌ．，ＢｉｏＤｒｕｇｓ，２０１８，３２：９９－１０９を参照）。
【0022】
いくつかの実施形態において、ＴＣＲ可変領域（Ｖα／Ｖβ）は、以下のうちのいずれか１つから選択される抗原に結合する：ＥＲＢＢ２、ＣＤ１９、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＭＡＧＥ（例えば、ＭＡＧＥ－Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ａ６、Ａ１０、Ａ１２）、ｇｐ１００、ＭＡＲＴ－１／Ｍｅｌａｎ－Ａ、ｇｐ７５／ＴＲＰ－１、ＴＲＰ－２、チロシナーゼ、ＢＡＧＥ、ＣＡＭＥＬ、ＳＳＸ－２、β－カテニン、カスパーゼ－８、ＣＤＫ４、ＭＵＭ－２（ＴＲＡＰＰＣ１）、ＭＵＭ－３、ＭＡＲＴ－２、ＯＳ－９、ｐ１４ＡＲＦ（ＣＤＫＮ２Ａ）、ＧＡＳ７、ＧＡＰＤＨ、ＳＩＲＴ２、ＧＰＮＭＢ、ＳＮＲＰ１１６、ＲＢＡＦ６００、ＳＮＲＰＤ１、ＰＲＤＸ５、ＣＬＰＰ、ＰＰＰ１Ｒ３Ｂ、ＥＦ２（Ｐｒｉｔｃｈａｒｄ，ｅｔ ａｌ．，ＢｉｏＤｒｕｇｓ，２０１８，３２：９９－１０９、およびＷａｎｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１７，２７：１１－３７を参照）。
【0023】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のタンパク質は、第２の抗原結合ドメインをさらに含む。そのような第２の抗原結合ドメインは、Ｔ細胞表面上の抗原、例えば、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８に結合することができる。いくつかの実施形態において、第２の抗原結合ドメインは、ＣＤ３に結合する。
【0024】
いくつかの実施形態において、第２の抗原結合ドメインは、抗体または抗体断片、例えば、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、（Ｆａｂ’）２、単一ドメイン抗体、またはラクダＶＨＨドメインである。いくつかの実施形態において、第２の抗原結合ドメインはＦａｂである。いくつかの実施形態において、Ｆａｂは、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）およびヒトＩｇＧ ＣＨ１ドメインを含むＦａｂ重鎖、ならびに軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）およびヒト軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）を含むＦａｂ軽鎖を含み、ここで、ＶＨドメインおよびＶＬドメインは、Ｔ細胞表面上の抗原、例えば、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８に結合する第２の抗原結合ドメインを形成する。
【0025】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のタンパク質は、３つのポリペプチド、Ｖα－Ｃα－リンカー－ＶＨ－ＣＨ１を含む第１のポリペプチド、Ｖβ－Ｃβを含む第２のポリペプチド、およびＶＬ－ＣＬを含む第３のポリペプチドを含み、ここで、第２および第３のポリペプチドは、鎖間ジスルフィド結合によって第１のポリペプチドに連結されている。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のタンパク質は、ＴＣＲ－ＣＤ３ Ｆａｂフォーマットを有する。
【0026】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のタンパク質は、４つのポリペプチド、Ｖα－Ｃα－ヒンジ－第１のＦｃ領域を含む第１のポリペプチド、Ｖβ－Ｃβを含む第２のポリペプチド、ＶＬ－ＣＬを含む第３のポリペプチド、およびＶＨ－ＣＨ１－ヒンジ－第２のＦｃ領域を含む第４のポリペプチドを含み、ここで、第２および第４のポリペプチドは、鎖間ジスルフィド結合によって第１のポリペプチドに連結されており、第３のポリペプチドは、鎖間ジスルフィド結合によって第４のポリペプチドに連結されている。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のタンパク質は、ＩｇＧ様フォーマットまたはＴＣＲ－ＣＤ３ Ｆａｂ－Ｆｃ ＩｇＧフォーマットを有する。
【0027】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のタンパク質は、４つのポリペプチド、Ｖα－Ｃα－リンカーＶＨ－ＣＨ１－ヒンジ－第１のＦｃ領域を含む第１のポリペプチド、Ｖβ－Ｃβを含む第２のポリペプチド、ＶＬ－ＣＬを含む第３のポリペプチド、第２のＦｃ領域を含む第４のポリペプチドを含み、ここで、第２、第３、および第４のポリペプチドは、鎖間ジスルフィド結合によって第１のポリペプチドに連結されている。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のタンパク質は、ＴＣＲ－ＣＤ３ Ｆａｂ－Ｆｃタンデムフォーマットを有する。
【0028】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のタンパク質は、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に結合するＶＨＨドメインを含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のタンパク質は、３つのポリペプチド、Ｖα－Ｃα－リンカー－ＶＨ－ＣＨ１－ＶＨＨを含む第１のポリペプチド、Ｖβ－Ｃβを含む第２のポリペプチド、およびＶＬ－ＣＬを含む第３のポリペプチドを含み、ここで、第２および第３のポリペプチドは、鎖間ジスルフィド結合によって第１のポリペプチドに連結されている。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のタンパク質は、ＴＣＲ－ＣＤ３ Ｆａｂ－ＶＨＨフォーマットを有する。
【0029】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のタンパク質は、２つのＴＣＲ Ｖα－Ｃαドメインおよび２つのＴＣＲ Ｖβ－Ｃβドメインを含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のタンパク質は、２ｘＴＣＲ－ＣＤ３ Ｆａｂ－Ｆｃフォーマットを有する。
【0030】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のタンパク質は、配列番号４１～４６のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列を含むリンカーを含む。
【0031】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のタンパク質は、Ｆｃ領域、例えば、ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域、例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４ Ｆｃ領域を含む。いくつかの実施形態において、Ｆｃ領域は、対応する野生型ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域と比較してエフェクター機能が低下した改変ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域である。
【0032】
いくつかの実施形態において、Ｆｃ領域は、改変ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域である。ＩｇＧ１は、Ｆｃガンマ受容体ファミリー（ＦｃγＲ）、ならびにＣ１ｑのタンパク質に結合することが周知である。これらの受容体との相互作用は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）および補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を誘導し得る。したがって、免疫エフェクター機能を除去するために、特定のアミノ酸置換がヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域に導入される。いくつかの実施形態において、Ｆｃ領域は、以下の変異のうちの１つ以上を含む改変ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域である：Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｑ、Ｄ２６５Ａ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｃ２２６Ｓ、Ｃ２２９Ｓ、Ｐ２３８Ｓ、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ｖ、Ｐ２３８Ａ、Ａ３２７Ｑ、Ａ３２７Ｇ、Ｐ３２９Ａ、Ｋ３２２Ａ、Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３５Ｅ、Ｐ３３１Ｓ、Ｔ３９４Ｄ、Ａ３３０Ｌ、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ（ＥＵインデックス番号付けに従って番号付けされた残基）。いくつかの実施形態において、Ｆｃ領域は、以下の変異を含む改変ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域である：Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５ＡおよびＮ２９７Ｑ（ＥＵインデックス番号付けに従って番号付けされた残基）。いくつかの実施形態において、Ｆｃ領域は、配列番号４８を含む改変ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域である。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のタンパク質は、改変ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域のＮ末端に、ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域（例えば、配列番号４７）をさらに含む。
【0033】
いくつかの実施形態において、Ｆｃ領域は、以下の変異のうちの１つ以上を含む改変ヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域である：Ｅ２３３Ｐ、Ｆ２３４Ｖ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｅ３１８Ａ、Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３６Ｅ、Ｓ２４１Ｐ、Ｌ２４８Ｅ、Ｔ３９４Ｄ、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｑ（ＥＵインデックス番号付けに従って番号付けされた残基）。いくつかの実施形態において、Ｆｃ領域は、以下の変異を含む改変ヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域である：Ｆ２３４ＡおよびＬ２３５Ａ（ＥＵインデックス番号付けに従って番号付けされた残基）。いくつかの実施形態において、Ｆｃ領域は、配列番号５０を含む改変ヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域である。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のタンパク質は、改変ヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域のＮ末端に、Ｓ２２８Ｐ変異（ＥＵインデックス番号付けによる、例えば、配列番号４９）を含む改変ヒトＩｇＧ４ヒンジ領域をさらに含む。このような改変ヒトＩｇＧ４ヒンジ領域は、インビボでのＩｇＧ４ Ｆａｂアーム交換を低下させる（Ｌａｂｒｉｊｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２００９，２７（８）：７６７を参照）。
【0034】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のタンパク質は、配列番号４７または４９を含むヒンジ領域を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のタンパク質は、配列番号４８または５０を含むＦｃ領域を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のタンパク質は、配列番号４７を含むヒンジ領域、ならびに配列番号４８を含む第１および第２のＦｃ領域を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のタンパク質は、配列番号４９を含むヒンジ領域、ならびに配列番号５０を含む第１および第２のＦｃ領域を含む。
【0035】
いくつかの実施形態において、第１および第２のＦｃ領域は、一組のヘテロ二量体化変異、例えば、一組のＣＨ２および／またはＣＨ３ヘテロ二量体化変異を含む。いくつかの実施形態において、第１および第２のＦｃ領域は、一組のＣＨ３ヘテロ二量体化変異、例えば、ノブインホール（Ｒｉｄｇｗａｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．１９９６、９：６１７－６２１）、静電変異、およびＶｅｒｄｉｎｏ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ２０１８，１９：１０７－１２３、ＷＯ２０１６／１１８７４２、米国特許第９６０５０８４号、同第９７０１７５９号、同第１０１０６６２４号、米国特許出願第２０１８／０３６２６６８号に記載されている、他のＣＨ３二量体化変異を含む。
【0036】
いくつかの実施形態において、第１または第２のＦｃ領域のうちの１つは、残基４０７にアラニンを含むＣＨ３ドメインを含み、第１または第２のＦｃ領域の他方は、残基３６６にバリンまたはメチオニンを含み、残基４０９にバリン（ＥＵインデックス番号付けに従って番号付けされた残基）を含むＣＨ３ドメインを含む。いくつかの実施形態において、第１または第２のＦｃ領域のうちの１つは、残基４０７にアラニン、残基３９９にメチオニン、および残基３６０にアスパラギン酸を含むＣＨ３ドメインを含み、上記第１または第２のＦｃ領域の他方は、残基３６６のバリン、残基４０９のバリン、ならびに残基３４５および３４７のアルギニン（ＥＵインデックス番号付けに従って番号付けされた残基）を含むＣＨ３ドメインを含む。
【0037】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のタンパク質は、検出可能な標識に連結されている。いくつかの実施形態において、そのような検出可能な標識は、蛍光標識、放射性標識、化学発光標識、生物発光標識、常磁性標識、ＭＲＩ造影剤、有機色素、または量子ドットであり得る。
【0038】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のタンパク質は、治療薬、例えば、細胞毒性剤、抗炎症剤、または免疫刺激剤に連結されている。
【0039】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のタンパク質は、可溶性タンパク質である。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のタンパク質は、膜貫通タンパク質である。
【0040】
いくつかの実施形態において、タンパク質の第１のポリペプチドは、ＴＣＲα鎖の膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインをさらに含み、第２のポリペプチドは、ＴＣＲβ鎖の膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインをさらに含む。
【0041】
以下の残基のうちの少なくとも１つ（例えば、１つ、２つ、または３つ）：１３９位のフェニルアラニン、１５０位のイソロイシン、１９０位のスレオニン（Ｋａｂａｔ番号付けに従って番号付けされた残基）を含むＣαドメイン、および／または以下の残基のうちの少なくとも１つ（例えば、１つ、２つ、３つ、または４つ）：１３４位のリジン、１３９位のアルギニン、１５５位のプロリン、１７０位のアスパラギン酸もしくはグルタミン酸（Ｋａｂａｔ番号付けに従って番号付けされた残基）を含むＣβドメイン、を含むＴＣＲを含むＴ細胞も本明細書で提供される。そのようなＴＣＲはまた、抗原結合ドメイン、例えば、抗体断片またはＴＣＲ Ｖα／Ｖβドメインを含み得る。
【0042】
別の態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載のタンパク質のポリペプチドをコードする核酸である。そのような核酸は、以下の残基のうちの少なくとも１つ（例えば、１つ、２つ、または３つ）を含むＴＣＲ Ｃαドメインを含むポリペプチドをコードし得る：１３９位のフェニルアラニン、１５０位のイソロイシン、１９０位のスレオニン（Ｋａｂａｔ番号付けに従って番号付けされた残基）。そのような核酸は、以下の残基のうちの少なくとも１つ（例えば、１つ、２つ、３つ、または４つ）を含むＴＣＲ Ｃβドメインを含むポリペプチドをコードし得る：１３４位のリジン、１３９位のアルギニン、１５５位のプロリン、１７０位のアスパラギン酸またはグルタミン酸（Ｋａｂａｔ番号付けに従って番号付けされた残基）。いくつかの実施形態において、本明細書に提供されるのは、配列番号５または７を含むポリペプチドをコードする核酸である。いくつかの実施形態において、本明細書に提供されるのは、配列番号６または８を含むポリペプチドをコードする核酸である。
【0043】
別の態様において、本明細書で提供されるのは、本明細書に記載のタンパク質のポリペプチドをコードする核酸を含むベクターである。そのようなベクターは、本明細書に記載のタンパク質のポリペプチドをコードする核酸に作動可能に連結されている発現制御配列をさらに含み得る。作動可能に連結されている遺伝子の発現を方向付けることができる発現ベクターは、当該技術分野において周知である。発現ベクターは、宿主細胞からのポリペプチドの分泌を促進するシグナルペプチドをコードし得る。シグナルペプチドは、免疫グロブリンシグナルペプチドまたは異種性シグナルペプチドであり得る。発現ベクターは、典型的には、エピソーム、または宿主染色体ＤＮＡの一体化した部分のいずれかとして、宿主生物中で複製可能である。一般的に、発現ベクターは、所望のＤＮＡ配列で形質転換されたそれらの細胞の検出を可能にするために、選択マーカー、例えば、テトラサイクリン、ネオマイシン、およびジヒドロ葉酸レダクターゼを含有し得る。目的のポリヌクレオチド配列を含有するベクターは、細胞宿主のタイプに応じて変化する、周知の方法（例えば、安定的または一過性のトランスフェクション、形質転換、形質導入または感染）によって宿主細胞中に移入することができる。いくつかの実施形態において、本明細書に提供されるのは、配列番号５を含むポリペプチドをコードする核酸および配列番号６を含むポリペプチドをコードする核酸を含むベクターである。いくつかの実施形態において、本明細書に提供されるのは、配列番号７を含むポリペプチドをコードする核酸および配列番号８を含むポリペプチドをコードする核酸を含むベクターである。
【0044】
本明細書に提供されるのはまた、本明細書に記載の核酸またはベクターを含む宿主細胞、例えば哺乳動物細胞であり、そのような宿主細胞は、本明細書に記載のタンパク質を発現することができる。機能性タンパク質を発現することができることが知られている哺乳動物宿主細胞には、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ細胞、およびＮＳＯ細胞が含まれる。本開示はさらに、タンパク質が発現されるような条件下で上記の宿主細胞を培養し、発現されたタンパク質を回収することによって、本明細書に記載のタンパク質を産生するためのプロセスを提供する。
【0045】
別の態様において、本明細書で提供されるのは、本明細書に記載のタンパク質、核酸、ベクター、または細胞を含む医薬組成物である。そのような医薬組成物はまた、１つ以上の医薬的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤を含み得る。
【0046】
別の態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載のタンパク質、核酸、ベクター、細胞、または医薬組成物の治療有効量を対象に投与することによって、それを必要とする対象におけるがんまたは感染症を治療する方法である。
【0047】
療法における使用のための、本明細書に記載のタンパク質、核酸、ベクター、細胞、および医薬組成物も提供される。さらに、本開示はまた、がんまたは感染症の治療における使用のための、本明細書に記載のタンパク質、核酸、ベクター、細胞、または医薬組成物を提供する。さらに、本開示は、がんまたは感染症の治療のための薬剤の製造における本明細書に記載のタンパク質、核酸、ベクター、細胞、または医薬組成物の使用を提供する。
【0048】
本明細書で使用される場合、本発明の文脈で（特に特許請求の範囲の文脈で）使用される「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」という用語および同様の用語は、別段の定めがない限り、または文脈によって明らかに矛盾していない限り、単数形および複数形の両方をカバーすると解釈されるべきである。
【0049】
本明細書で使用される「抗体」という用語は、ジスルフィド結合によって相互接続された４つのポリペプチド鎖、２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖を含むモノクローナル免疫グロブリン分子を指す。各重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）および重鎖定常領域（ＣＨ）を含む。重鎖定常領域は、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３の３つのドメインを含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶＬ）および軽鎖定常領域（ＣＬ）から構成される。ＶＨ領域およびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存されている領域が散在する、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域にさらに細分され得る。各ＶＨおよびＶＬは、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲから構成されており、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順序でアミノ末端からカルボキシ末端へと配置される。ＶＨのＣＤＲ領域は、ＨＣＤＲｌ、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３と呼ばれる。ＶＬのＣＤＲ領域は、ＬＣＤＲｌ、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３と呼ばれる。ＣＤＲは、抗原との特異的相互作用を形成する残基の大部分を含有する。残基を様々なＣＤＲに割り当てることは、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、またはＮｏｒｔｈなどのアルゴリズムによって行うことができる。ＫａｂａｔのＣＤＲ定義（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，”Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１））は、抗体配列変異性に基づく。ＣｈｏｔｈｉａのＣＤＲの定義（Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，“Ｃａｎｏｎｉｃａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ”，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９６，９０１－９１７（１９８７）、Ａｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｔａｎｄａｒｄ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｃａｎｏｎｉｃａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ”，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２７３，９２７－９４８（１９９７））は、抗体の３次元構造およびＣＤＲループのトポロジーに基づく。ＮｏｒｔｈのＣＤＲの定義（Ｎｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ．，“Ａ Ｎｅｗ Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ＣＤＲ Ｌｏｏｐ Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ”，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４０６，２２８－２５６（２０１１））は、多数の結晶構造を有する親和性伝搬クラスター化（ａｆｆｉｎｉｔｙ ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ）に基づいている。
【0050】
「抗原結合ドメイン」または「抗体断片」という用語は、抗原のエピトープと特異的に相互作用する（例えば、結合、立体障害、安定化／不安定化、空間分布によって）能力を保持する抗体の部分を指す。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ断片、ｓｃＦｖ抗体断片、ジスルフィド結合Ｆｖｓ（ｓｄＦｖ）、ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、線形抗体（ｌｉｎｅａｒ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）、ｓｄＡｂ（ＶＬまたはＶＨのいずれか）などの単一ドメイン抗体、ラクダＶＨＨドメイン、ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片などの抗体断片から形成された多重特異性抗体、および単離されたＣＤＲまたは抗体の他のエピトープ結合断片が含まれるが、これらに限定されない。
【0051】
本明細書で使用される「結合する」という用語は、ある種の化学結合または別のタンパク質もしくは分子との引力相互作用を形成するタンパク質または分子の能力を意味し、当該分野において知られている一般的な方法によって決定されるように、２つのタンパク質または分子の密接な近接をもたらす。
【0052】
本明細書で使用される「Ｆｃ領域」という用語は、免疫グロブリン、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４の定常領域のＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含むポリペプチドを指す。任意選択により、Ｆｃ領域は、免疫グロブリン、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４のヒンジ領域の一部またはヒンジ領域全体を含み得る。いくつかの実施形態において、Ｆｃ領域は、ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域、例えば、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域、ＩｇＧ２ Ｆｃ領域、ＩｇＧ３ Ｆｃ領域またはＩｇＧ４ Ｆｃ領域である。いくつかの実施形態において、Ｆｃ領域は、対応する野生型ＩｇＧ Ｆｃ領域と比較してエフェクター機能が低下した改変ＩｇＧ Ｆｃ領域である。Ｆｃ領域の残基の番号付けは、Ｋａｂａｔと同様にＥＵインデックスに基づく。Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ：Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ（１９９１）。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は変化する可能性があり、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は通常、２３１位のアミノ酸残基（ＥＵインデックスによる）から、免疫グロブリンのカルボキシル末端までのストレッチとして定義される。
【0053】
本明細書で使用される「ポリペプチド分子」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを指す。この用語は、天然に存在するアミノ酸を含むポリマー、および１つ以上の非天然に存在するアミノ酸を含むポリマーに適用される。
【0054】
本明細書で使用される「治療有効量」という用語は、例えば、酵素もしくはタンパク質の活性の低下もしくは阻害、または症状を改善し、状態を緩和し、疾患の進行を減速もしくは遅延し、または疾患を予防するなど、対象の生物学的または医学的応答を誘発する、本発明のタンパク質または核酸またはベクターまたは細胞または組成物の量を指す。１つの非限定的な実施形態において、「治療有効量」という用語は、対象に投与されたときに、状態、または障害または疾患を少なくとも部分的に緩和、阻害、予防および／または改善するために有効である、本発明のタンパク質または核酸またはベクターまたは細胞または組成物の量を指す。
【0055】
本明細書で使用される場合、「治療」または「治療すること」は、本明細書に開示の障害の進行の減速、制御、遅延、または停止し得るすべてのプロセスを指すが、必ずしもすべての障害の症状の完全な消失を示すわけではない。治療は、患者、特にヒトの疾患または状態の治療のための本発明のタンパク質または核酸またはベクターまたは細胞または組成物の投与を含む。
【図面の簡単な説明】
【0056】
【図1A】図１Ａ－Ｄは、ＴＣＲ断片および安定化変異の特徴を示す。ＴＣＲ断片および安定化変異の特徴を示す。図１Ａは、組換えＴＣＲ（１Ｇ４＿１２２、▲）、α４２／β１１０操作ジスルフィド（ｄｓＦｖにおけるＶＨ４４／ＶＬ１００ジスルフィドと相同）を有する同じＴＣＲからのＶα／Ｖβ断片
【数1】
、ならびに標準のストークジスルフィドおよび安定化α１６６／β１７３ジスルフィドの両方を有するＣα／Ｃβ断片（●）を用いるＤＳＦ変性曲線を示す。
【数2】
または７（■）の安定化変異を伴うＣα／ＣβのＤＳＦ曲線を示す。
【図2】２つの異なるＴＣＲに基づくＴＣＲ ＣβおよびＣαドメインのＫａｂａｔ番号付けシステムを示す。上部のＣβおよびＣα配列は、Ｋａｂａｔらの最初のヒトＴリンパ球受容体ヒトＨＰＢ－ＭＬＴ配列に由来し（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ Ｖｏｌ．１ Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ １９９１ ＵＳ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，ＮＩＨ，１００４ページおよび１００５ページ）（ヒトＨＰＢ－ＭＬＴ Ｃβ、配列番号５１、ヒトＨＰＢ－ＭＬＴ Ｃα、配列番号５２）、下部の１Ｇ４＿１２２＿ＮＹＥＳＯ１ＣβおよびＣα配列（１Ｇ４＿１２２＿ＮＹＥＳＯ１Ｃβ、配列番号４、１Ｇ４＿１２２＿ＮＹＥＳＯ１Ｃα、配列番号３）は、２Ｆ５３ ｐｄｂ結晶構造に由来した（Ｄｕｎｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ ２００６．１５：７１０－２１）。ボックスを付した四角は、２Ｆ５３の定常ドメインとＨＰＢ－ＭＬＴネイティブ配列との間の違いを示す。２Ｆ５３配列のＣβ＿Ｓ１７３ＣおよびＣα＿Ｔ１６６Ｓは、安定化ジスルフィド結合を形成するシステインである（Ｂｏｕｌｔｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．２００３．１６：７０７－１１）。アラインメントの下の影付きの残基は、Ｃα／Ｃβサブユニットを劇的に安定化する本明細書に記載の安定化変異、および安定化Ｃα／Ｃβサブユニットを有する様々な全長ＴＣＲである。
【図3A】極性アミノ酸が関与する変異の構造的特徴を示す。各行は単一の変異を特徴としている。第１の（左）列は、Ｃα／Ｃβバックボーン構造の拡大された概略リボン図と、安定化変異を有するモデルの構造図を重ね合わせた、変異した元の残基のスティック描写である。第２（中央）の列は、同じ変異の結晶構造図に重ね合わせたＣα／Ｃβモデル図内の安定化変異の重ね合わせを示す。第３（右）の列は、それを安定させるその変異の特徴を強調している。
【図3B】疎水性アミノ酸を含む変異の構造的特徴を示す。各行は単一の変異を特徴としている。第１（左）の列は、Ｃα／Ｃβバックボーン構造の拡大された概略リボン図と、安定化変異を有するモデルの構造図を重ね合わせた、変異した元の残基のスティック描写である。第２（中央）の列は、同じ変異の結晶構造図に重ね合わせたＣα／Ｃβモデル図内の安定化変異の重ね合わせを示す。第３（右）の列は、それを安定させるその変異の特徴を強調している。第１の行の第３の列は、暗いボックスで表されたＣβ１５５のアスパラギン酸のラマチャンドランプロットに重ね合わせたプロリンのラマチャンドランプロットを示す。プロットは、Ｃβ Ｄ１５５がプロリンに対して好ましいバックボーンファイ／プサイ二面角を自然に採用することを示す。次の２行の第３の列は、変異が周囲の残基とどの程度良好に充填されているかを示す。Ｃα Ｔ１５０Ｉは少し暗く、見やすくなっている。
【図3C】７変異型ＴＣＲの結晶構造と、７変異型Ｃα／Ｃβ構造の骨格座標を与えられたアミノ酸側鎖のコンフォメーションを予測するために使用される場合のロゼッタの出力との比較を示す。
【図4A】図４Ａ－４Ｇは、安定化Ｃα／Ｃβサブユニットがある場合およびない場合の４つの多様な組換えα／β ＴＣＲの特性評価を示す。図４Ａは、α１６６／β１７３安定化ジスルフィドの非存在下でのゼロ（ＷＴ、点線）または７つ（実線）の安定化Ｃα／Ｃβ変異を伴う１Ｇ４＿１２２ ＴＣＲのＤＳＣ曲線を示す。
【図4E】図４Ｅは、重水素交換からのバックボーン保護の唯一の重要な領域がＣαに存在したことを示す。各ペプチド領域の下のヒートマップは、１０秒、３０秒、２分、１０分、１時間、および４時間で観察された保護のレベルを示す。ヒートマップの欠如は、この領域内で観察された重水素交換に有意差がないことを示す。
【図4G】図４Ｇは、Ｖα＿Ｎ６７Ｎ－結合型グリコシル化部位を含むペプチドの抽出イオンクロマトグラムを示す。１８．６分のペプチドはグリコシル化されていなかったが、１９．９分のピークは酵素的脱グリコシル化／Ａｓｐへの変換後に現れる。野生型ＴＣＲのペプチドは点線で、安定化ＴＣＲのペプチドは実線である。
【図5A-C】図５Ａ－５Ｅは安定化Ｃα／Ｃβサブユニットがある場合およびない場合の１Ｇ４＿１２２ ＴＣＲ内の安定化変異体および不安定化Ｖα／Ｖβ変異体の両方の特性を示す。図５Ａは、ラベンダーで示される様々なＶα／Ｖβ変異を伴う１Ｇ４＿１２２（ｐｄｂ ２Ｆ５３）の図案描写を示す。様々なＶα／Ｖβ変異体の組み合わせの存在下、ならびに安定化Ｃα／Ｃβサブユニットの非存在下（図５Ｂ）および存在下（図５Ｃ）での１Ｇ４＿１２２ ＴＣＲのＤＳＦ曲線。安定化Ｃα／Ｃβサブユニットの非存在下（●）および存在下
【数3】
での異なる可変ドメイン変異を伴う１Ｇ４＿１２２ ＴＣＲの正規化された発現レベル（図５Ｄ）および最低Ｔｍ（図５Ｅ）。
【図6C】図６Ｃは、野生型ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲおよび安定化ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲを使用するＴＣＲ／ＣＤ３ ＩｇＧ様ＢｓＡｂ、ならびに安定化ＮＹ－ＥＳＯ－１のみを使用するタンデムＦａｂ ＢｓＡｂの分析的ＳＥＣ特性評価を示す。
【図6D】図６Ｄは、ＮＹ－ＥＳＯ－１ペプチドでパルスされたＳａｏｓ－２（上）および６２４．３８（中央）ＨＬＡ－Ａ２＋腫瘍細胞ならびにＪｕｒｋａｔ（下）ＣＤ３＋細胞に対するＢｓＡｂ分子のフローサイトメトリー細胞結合滴定を示す。
【実施例】
【0057】
組換えＴＣＲを使用して、ナイーブＴ細胞を再方向付けし、ウイルス感染細胞またはがん性細胞を排除することができるが、しかしながら、これらは、安定性の低さおよび不均一な表現に悩まされている。分子モデリングを使用して、ＴＣＲ定常ドメイン（Ｃα／Ｃβサブユニット）の変異を特定し、Ｃα／Ｃβの安定性を改善し、Ｃα／Ｃβの発現を増加させ、Ｃα／Ｃβのアンフォールディング温度を上昇させる。これらの変異のうち７つをまとめてＣα／Ｃβサブユニットに加えると、熱アンフォールディングの中点が２０℃上昇することが観察される。安定化Ｃα／Ｃβサブユニットを追加することにより、４つの別々のα／β ＴＣＲの発現およびアセンブリが３～１０倍改善される。さらに、変異は、可変ドメインの不安定化変異を伴うＴＣＲの発現をレスキューした。興味深いことに、ＴＣＲの安定性およびフォールディングの改善は、グリコシル化の低下をもたらした。Ｃα／Ｃβバリアントは抗体のような発現を可能にし、抗ＣＤ３抗体と安定化ＴＣＲを組み合わせた新しいクラスの二重特異性分子の開発を可能にした。これらのＴＣＲ／ＣＤ３二重特異性タンパク質は、ＨＬＡ／ペプチド抗原を発現している腫瘍細胞を殺傷するためにＴ細胞を再方向付けすることができる。
【0058】
Ｃα／Ｃβサブユニットの一般的な安定化は、α／β ＴＣＲの全体的な安定性およびフォールディングを改善する可能性がある。最近の研究では、α／β ＴＣＲのサブユニット間に強力な熱力学的協同性が存在することが示されている。Ｃαは、抗体ＣＨ１／Ｃκサブユニットについて観察されたものと同様に、フォールディングのためにＥＲ中でＣβと対合する必要がある（Ｆｅｉｇｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ，２００９．３４（５）：５６９－７９、Ｔｏｕｇｈｉｒｉ，ｅｔ ａｌ．，ＭＡｂｓ，２０１６．８（７）：１２７６－１２８５）。さらに、多くのＶα／Ｖβサブユニットは本質的に単独でアンフォールドされ、適切なフォールディングのためにＣα／Ｃβサブユニットを必要とする（Ｆｅｉｇｅ，Ｍ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２０１５．２９０（４４）：ｐ．２６８２１－３１）。仮説を支持するために、Ｃα／Ｃβドメイン間にジスルフィドを追加すると、多くのα／β ＴＣＲにプラスの影響を与えることが示されている（Ｂｏｕｌｔｅｒ，Ｊ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ，２００３．１６（９）：ｐ．７０７－１１）。したがって、より堅牢なＣα／Ｃβサブユニットは、適切に組み立てられる抗体のようなレベルでＴＣＲを生成することを目的として、一般的なＴＣＲ安定化のために操作されている。安定化ＴＣＲは、薬物動態特性を強化するための抗体－Ｆｃ部分を含むものを含む、様々な形状の抗体への組換え融合のためのより適したビルディングブロックであるべきである。
【0059】
分子モデリングソフトウェアロゼッタ（Ｒｏｓｅｔｔａ）を用いてタンパク質シミュレーションを実行し、ＣαドメインおよびＣβドメインを安定化する変異を特定した（Ｌｅａｖｅｒ－Ｆａｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ，２０１１．４８７：５４５－７４）。タンパク質を安定化させる変異を見つけるための代替戦略は、タンパク質ファミリーのマルチプル配列アラインメント（ＭＳＡ）を組み立てて、目的のタンパク質に保存されていない高度に保存されたアミノ酸を検索することである（Ｍａｇｌｉｅｒｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ，２０１５．３３：１６１－８）。ここでは、ロゼッタの計算に基づいて変異を試験し、保存分析を使用してシミュレーションの結果をフィルタリングした。
【0060】
結果
Ｃα／Ｃβ ＴＣＲサブユニットの安定化
最初に、α／β ＴＣＲの熱力学的特性を、可溶型のα／β ＴＣＲ、１Ｇ４＿１２２、ならびにそのＶα／ＶβおよびＣα／Ｃβサブユニットを生成することによって調べ、１Ｇ４＿１２２はＮＹ－ＥＳＯ－１抗原に結合する（Ｌｉ、Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２００５．２３（３）：３４９－５４）。哺乳動物の発現系を使用して、ＶαをＶβに、またはＣαをＣβに連結するフレキシブル（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４リンカー（配列番号４３）の存在下または非存在下で、Ｖα／ＶβおよびＣα／Ｃβサブユニットの両方を生成した。サブユニットの発現およびアセンブリは、ドメイン間ジスルフィドの安定化のある場合とない場合とで試験された。単鎖バリアントを含め、ほとんどのＶα／ＶβおよびＣα／Ｃβ構築物は発現に失敗したか、組み立てに失敗した。最良のＶα／Ｖβサブユニット発現は、抗体可変ドメイン断片またはＦｖを安定化するために使用されるＶＨ４４／ＶＬ１００ジスルフィドに相同なＶα４４／Ｖβ１１０ジスルフィドを加えることによって得られ（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，１９９３．９０（１６）：７５３８－４２）、一方、ドメインのＣ末端のネイティブＣα／Ｃβジスルフィド（Ｃα２１３／Ｃβ２４７）の上に既知の安定化ジスルフィド（Ｃα１６６／Ｃβ１７３）を使用すると、最良のＣα／Ｃβ発現が得られた（Ｂｏｕｌｔｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ，２００３．１６（９）：７０７－１１）。示差走査熱量測定（ＤＳＣ）実験は、（Ｃα１６６／Ｃβ１７３）ジスルフィドが全長ＴＣＲ（両方のサブユニット）の熱アンフォールディングの中点（Ｔｍ）を８℃増加させることを示した。Ｖα／ＶβおよびＣα／Ｃβサブユニットのアンフォールディングを無傷の細胞外ＴＣＲドメインのアンフォールディングと比較すると、個々のサブユニットは互いに存在しない場合に明らかに両方とも不安定化され（図１Ａ）、以前に観察された熱力学的協同性と一致する（Ｆｅｉｇｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２０１５．２９０（４４）：２６８２１－３１）。
Ｃα／Ｃβ ＴＣＲサブユニットの安定化
最初に、α／β ＴＣＲの熱力学的特性を、可溶型のα／β ＴＣＲ、１Ｇ４＿１２２、ならびにそのＶα／ＶβおよびＣα／Ｃβサブユニットを生成することによって調べ、１Ｇ４＿１２２はＮＹ－ＥＳＯ－１抗原に結合する（Ｌｉ、Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２００５．２３（３）：３４９－５４）。哺乳動物の発現系を使用して、ＶαをＶβに、またはＣαをＣβに連結するフレキシブル（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４リンカー（配列番号４３）の存在下または非存在下で、Ｖα／ＶβおよびＣα／Ｃβサブユニットの両方を生成した。サブユニットの発現およびアセンブリは、ドメイン間ジスルフィドの安定化のある場合とない場合とで試験された。単鎖バリアントを含め、ほとんどのＶα／ＶβおよびＣα／Ｃβ構築物は発現に失敗したか、組み立てに失敗した。最良のＶα／Ｖβサブユニット発現は、抗体可変ドメイン断片またはＦｖを安定化するために使用されるＶＨ４４／ＶＬ１００ジスルフィドに相同なＶα４４／Ｖβ１１０ジスルフィドを加えることによって得られ（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，１９９３．９０（１６）：７５３８－４２）、一方、ドメインのＣ末端のネイティブＣα／Ｃβジスルフィド（Ｃα２１３／Ｃβ２４７）の上に既知の安定化ジスルフィド（Ｃα１６６／Ｃβ１７３）を使用すると、最良のＣα／Ｃβ発現が得られた（Ｂｏｕｌｔｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ，２００３．１６（９）：７０７－１１）。示差走査熱量測定（ＤＳＣ）実験は、（Ｃα１６６／Ｃβ１７３）ジスルフィドが全長ＴＣＲ（両方のサブユニット）の熱アンフォールディングの中点（Ｔｍ）を８℃増加させることを示した。Ｖα／ＶβおよびＣα／Ｃβサブユニットのアンフォールディングを無傷の細胞外ＴＣＲドメインのアンフォールディングと比較すると、個々のサブユニットは互いに存在しない場合に明らかに両方とも不安定化され（図１Ａ）、以前に観察された熱力学的協同性と一致する（Ｆｅｉｇｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２０１５．２９０（４４）：２６８２１－３１）。
【0061】
分子モデリングシミュレーションは、定常ドメインを安定させる変異を特定するためにも使用された。各シミュレーションについて、ＴＣＲは空間に固定され、変異に近接する残基のみが変異に対応するために小さな動き（「弛緩」）を行うことを許容された。これらの局所的な弛緩は、いかなる変異も伴わないネイティブ配列を使用して反復された。エネルギーの変化は、変異のロゼッタスコアをネイティブ配列のロゼッタスコアと比較することによって決定された。変異は２つのリスト、ＴＣＲのマルチプル配列アラインメント（ＭＳＡ）で観察される変異のリスト、およびＭＳＡに存在しない変異のリストに分けられた。両方のリストから最も良好に予測されたエネルギーを有する変異が、実験的スクリーニングのために選定された。
【0062】
Ｃα１６６／Ｃβ１７３ジスルフィド結合を含む単離されたＣα／Ｃβ断片（図１Ａ）を使用して、コンピュータで選択された単一の変異体のライブラリーが生成され、２つの別々のブロックで発現された。増加した発現レベルを盲目的に使用して、スケールアップ、精製、および示差走査熱量測定による特性評価のための変異体を選択した（ＤＳＦ、表１）。発現の増加はタンパク質の安定性とよく相関していた。発現に基づいてさらに評価するために選択された単一変異体の約半分は、野生型（ネイティブ）Ｃα／Ｃβタンパク質よりも安定性の有意な増加を示した（表１）。特定された７つの安定化変異体のＴｍは、図１Ｂに示され、野生型Ｃα／Ｃβよりも＋１～＋７℃の範囲である。これらの変異のうち５つは、ＴＣＲのマルチプル配列アラインメントで観察される置換であったが、Ｔｍで最大の増加を生じた２つの変異、Ｄ１５５Ｐ（＋７．１℃）およびＳ１３９Ｆ（＋４．４℃）は、マルチプル配列アラインメントでは観察されなかった。
【0063】
次に、安定化変異は、４つの変異を有するバリアント、および７つすべての変異を含むバリアントに組み合わせられた。モデリングの結果は、各変異が互いに互換性がある可能性が高いことを示唆していた（すなわち、互いに干渉する可能性は低い）。７つの安定化変異すべてを含めると、Ｃα１６６／Ｃβ１７３ジスルフィド（「野生型」と表示）のみを有するＣα／Ｃβサブユニットよりも発現が７倍に増加し、Ｔｍが２０℃増加した（表２、図１Ｃ）。野生型および変異型Ｃα／Ｃβサブユニットのアセンブリを非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルで調べた。ジスルフィドラダーの欠如から明らかなように、７つの変異を有するＣα／Ｃβバリアントは、より効率的に組み立てられ、より離散的にフォールディングされかつコンパクトな構造の維持を介して、おそらく疑似グリコシル化が少ないために（以下で詳細に説明する）、より小さく／よりコンパクトであった（図１Ｄ）。安定化バリアントについてさえ、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル（図１Ｄ）上で複数のバンドが明確であり、これは、Ｃαの３つのＮ－結合型グリコシル化部位とＣβの単一のＮ－結合型グリコシル化部位の部分的なグリカン占有を反映している可能性がある。
【0064】
各変異の正確な位置は、Ｋａｂａｔ表記による適切な番号付けの一次配列の描写とともに（Ｋａｂａｔ、ｅｔ ａｌ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ Ｖｏｌ．１ Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ １９９１ ＵＳ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，ＮＩＨ）図２に示す。
【表1-1】
【表1-2】
【0065】
最後に、ＴＣＲタンパク質の潜在的な免疫原性に対する変異の影響を評価した。ＥｐｉＶａｘサーバーを使用して、ＭＨＣ－ペプチド複合体の増加が各変異で起こりそうかどうかを調べた（Ｄｅ Ｇｒｏｏｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００９。１３１（２）：１８９－２０１）。全体として、ＥｐｉＭａｔｒｉｘスコアのわずかな増加がＣαおよびＣβの両方で観察された。増加が観察された場合、これらはベースラインスコアのわずかな増加である傾向があり、Ｅｐｉｂａｒによって説明されているように有意なＭＨＣ結合を誘発すると予測されるレベルに達していなかった。Ｅｐｉｂａｒがネイティブ配列で観察された場合、スコアに微妙な増加が見られたが、Ｅｐｉｂａｒがより高いリスクカテゴリーに移行する原因となったものはほとんどなかった。懸念される外れ値には、Ｃα＿Ｔ１５０Ｉバリアントが含まれ、このバリアントのＥｐｉＭａｔｒｉｘスコアは１つの９－ｍｅｒで大幅に上昇し、変異体にも存在する野生型Ｃαタンパク質の第２のペプチドにおいて強力な既存のＥｐｉＭａｔｒｉｘクラスターがある。野生型ペプチドを認識するＴＣＲは、免疫の発達と耐性との間に排除される可能性がある。この変異は、安定性への最小の寄与を提供する。Ｃβ＿Ｅ１３４Ｋ＿Ｈ１３９Ｒ変異体は複数の単一ペプチドで一緒に見出され、これら２つの残基についてＥｐｉＭａｔｒｉｘスコアのわずかな増加が存在している。この二重変異体のために導入されたＥｐｉｂａｒは、主に低リスクのカテゴリーにあり、高リスクのカテゴリーへの増加はない。興味深いことに、Ｔｍの観点から最も影響力のある２つの変異体であるＣβ＿Ｄ１５５ＰおよびＣβ＿Ｓ１７０Ｄバリアントは、野生型Ｃα／Ｃβに対して、全体的なＥｐｉＭａｔｒｉｘスコアを低下させる。
【表2】
【0066】
７つの安定化Ｃα／Ｃβ変異の構造的特徴。
次に、Ｃα／Ｃβサブユニットの野生型および安定化型の両方を結晶化する試みが実行された。タンパク質は、結晶化の前に酵素的に脱グリコシル化された。タンパク質を用いたＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルの結果（図１Ｄ）と一致して、安定化バージョンのみがタンパク質結晶を生成した。安定化Ｃα／Ｃβサブユニットの１．７６Åの結晶構造が観察された。７つの変異体すべての側鎖が構造内で分解され、変異がタンパク質をどのように安定化させているかを示す（図３Ａおよび図３Ｂ）。
次に、Ｃα／Ｃβサブユニットの野生型および安定化型の両方を結晶化する試みが実行された。タンパク質は、結晶化の前に酵素的に脱グリコシル化された。タンパク質を用いたＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルの結果（図１Ｄ）と一致して、安定化バージョンのみがタンパク質結晶を生成した。安定化Ｃα／Ｃβサブユニットの１．７６Åの結晶構造が観察された。７つの変異体すべての側鎖が構造内で分解され、変異がタンパク質をどのように安定化させているかを示す（図３Ａおよび図３Ｂ）。
【0067】
結晶構造およびロゼッタモデルにおいて、フェニルアラニン１３９（Ｃα Ｓ１３９Ｆ）が構造の部分的に埋め込まれた裂け目を埋め、Ｃα １２９Ｑの側鎖と緊密な充填相互作用を形成する。特に、相互作用の配向は、水と水素結合を形成するために、グルタミンの極性基が開いたままにする。溶媒にさらされているにもかかわらず、Ｃβ Ｄ１５５Ｐは７つの変異の中でタンパク質の安定性に最大の影響を及ぼす。残基はプロリンの閉環と互換性のあるバックボーンねじれ角（φ＝－７３．４°、ψ＝５２．３°）を有しているため、ロゼッタエネルギー計算はプロリンに好ましい。図３Ｂは、アスパラギン酸およびプロリンの両方の重複するラマチャンドランプロットを示し、Ｃβ １５５が両方のアミノ酸の許容領域にあることを強調している。しかしながら、プロリンに変異することの１つの利点は、ラマチャンドラン空間ではプロリンはアスパラギン酸よりも制限が強いため、タンパク質がフォールディングされたときに失われるエントロピーが少なくなることである。イソロイシン１５０（Ｃα Ｔ１５０Ｉ）は周囲の残基と密に詰まっており、スレオニンの除去は、水素結合パートナーを伴わない、いかなる埋もれた極性基も残さない。
【0068】
Ｃα Ａ１９０Ｔは、溶媒にさらされたループのターンの開始点にある。ロゼッタは、表面の溶解度を高めることに加えて、このスレオニンが、Ｃα １２９Ｑへの安定化水素結合を形成すると予測した。代わりに、結晶構造は、スレオニンが異なる回転異性体を採用して、ループのターンのもう一方の端にあるバックボーン（Ｃα １９３Ｎのバックボーン窒素）と水素結合を形成していることを示す。ロゼッタは、Ｃβ Ｓ１７０Ｄが、Ｃα １７１Ｒの側鎖との界面を横切って二座水素結合を形成すると予測した。結晶構造は、Ｃα １７１Ｒの主鎖窒素原子（これは以前には水素結合に関与していなかった）とのＣβ Ｓ１７０Ｄ水素結合を示し、これは、アルギニンの側鎖がより多くの溶媒にさらされるようになることを許容する。Ｃβ Ｈ１３９Ｒは、Ｃα １２４Ｄとの界面にまたがる水素結合を作製する。ロゼッタは、アルギニンおよびアスパラギン酸をモデル化して二座水素結合を形成したが、しかしながら、結晶構造は、アルギニンが隣接する残基とより良好に充填できるように、それらが１つの水素結合のみを形成することを示す。β鎖の残基１３４にある新しいリジン（Ｃβ Ｅ１３４Ｋ）は、ｂ因子が高く、近くのいくつかの負に帯電したアミノ酸と相互作用している可能性がある。
【0069】
ロゼッタが観察された側鎖コンフォメーションを予測しなかった理由を確認するために調査を行った。１つの可能性は、ロゼッタの側鎖およびバックボーンサンプリングプロトコルが、これらのコンフォメーションをサンプリングできなかったことである。あるいは、ロゼッタはそれらをサンプリングしたが、それらはエネルギーがより高いと予測した可能性がある。これらの仮説を試験するために、安定化変異体の結晶構造からのバックボーン座標を、固定バックボーン側鎖予測シミュレーションの開始点として使用した。新しい結晶構造のバックボーンコンフォメーションは、野生型タンパク質の結晶構造に似ているが、側鎖の配置および水素結合を形成する能力に影響を与える可能性のある小さな偏差がある。これは観察されたものであり、結晶構造のバックボーンが与えられると、ロゼッタは変異体のほとんどの側鎖コンフォメーションを正しく予測した（図３Ｃ）。この結果は、ロゼッタが結晶構造で観察された小さなバックボーン摂動をサンプリングまたは支持しなかったため、元のモデルでこれらの変異の側鎖コンフォメーションを正しく予測しなかったことを示唆している。
【0070】
全長ＴＣＲに対するＣα／Ｃβ変異の影響。
無関係の全長の可溶性ＴＣＲの発現および安定性に対するＣα／Ｃβ変異の影響を評価するために、１Ｇ４＿１２２抗ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲを新規Ｃα／Ｃβ変異がある場合とない場合とで生成した。ジスルフィドがない場合、１Ｇ４＿１２２ ＴＣＲは哺乳動物細胞で非常に不十分に発現したが、Ｃα／Ｃβ変異があると、発現は１０倍を超えて増加し、ＤＳＣで測定したＴｍは８℃高くなった（表２、図４Ａ）。安定化Ｃα／Ｃβ変異はまた、ＭＡＧＥ＿Ａ３（ｐｄｂ ５ＢＲＺ、ＮＣＢＩ：α＝ＡＢＹ７４３３７．１／β＝ＡＣＺ４８６９１．１、ＨＩＶ（ｐｄｂ ３ＶＸＴ、ＮＣＢＩ：α＝ＡＢＢ８９０５０．１／β＝ＡＣＹ７４６０７．１）、およびＷＴ－１抗原を標的とする追加のＴＣＲを含む４つの無関係な（および配列が多様な）α／β ＴＣＲにおけるＣαＴ１６６Ｃ／ＣβＳ１７３Ｃジスルフィドの存在下でも評価された（Ｒａｍａｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ｒｅｐ，２０１６．６：１８８５１、Ｓｈｉｍｉｚｕ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ｒｅｐ，２０１３．３：３０９７、Ｒｉｃｈｍａｎ，Ｓ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００９．４６（５）：９０２－１６）。ＣαＴ１６６Ｃ／ＣβＳ１７３Ｃジスルフィドの存在下でさえ、安定化Ｃα／Ｃβサブユニットの存在下で、各ＴＣＲは力価の約３倍の増加およびＤＳＣによる熱安定性の増加が見られた（表２、図４Ｂ）。興味深いことに、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析および分析サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ、図４Ｃ～４Ｄ）によって評価されるように、４つのＴＣＲすべてがよりコンパクトであった。
無関係の全長の可溶性ＴＣＲの発現および安定性に対するＣα／Ｃβ変異の影響を評価するために、１Ｇ４＿１２２抗ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲを新規Ｃα／Ｃβ変異がある場合とない場合とで生成した。ジスルフィドがない場合、１Ｇ４＿１２２ ＴＣＲは哺乳動物細胞で非常に不十分に発現したが、Ｃα／Ｃβ変異があると、発現は１０倍を超えて増加し、ＤＳＣで測定したＴｍは８℃高くなった（表２、図４Ａ）。安定化Ｃα／Ｃβ変異はまた、ＭＡＧＥ＿Ａ３（ｐｄｂ ５ＢＲＺ、ＮＣＢＩ：α＝ＡＢＹ７４３３７．１／β＝ＡＣＺ４８６９１．１、ＨＩＶ（ｐｄｂ ３ＶＸＴ、ＮＣＢＩ：α＝ＡＢＢ８９０５０．１／β＝ＡＣＹ７４６０７．１）、およびＷＴ－１抗原を標的とする追加のＴＣＲを含む４つの無関係な（および配列が多様な）α／β ＴＣＲにおけるＣαＴ１６６Ｃ／ＣβＳ１７３Ｃジスルフィドの存在下でも評価された（Ｒａｍａｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ｒｅｐ，２０１６．６：１８８５１、Ｓｈｉｍｉｚｕ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ｒｅｐ，２０１３．３：３０９７、Ｒｉｃｈｍａｎ，Ｓ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００９．４６（５）：９０２－１６）。ＣαＴ１６６Ｃ／ＣβＳ１７３Ｃジスルフィドの存在下でさえ、安定化Ｃα／Ｃβサブユニットの存在下で、各ＴＣＲは力価の約３倍の増加およびＤＳＣによる熱安定性の増加が見られた（表２、図４Ｂ）。興味深いことに、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析および分析サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ、図４Ｃ～４Ｄ）によって評価されるように、４つのＴＣＲすべてがよりコンパクトであった。
【0071】
Ｃα／Ｃβ変異の存在下でのＴＣＲのよりコンパクトな性質をさらに調査するために、水素重水素交換（ＨＤＸ）分析およびグリカン占有率研究の両方を、安定化Ｃα／Ｃβ変異がある場合とない場合とで、ＷＴ－１ ＴＣＲ（ＣＥ１０）を有するペプチド質量マッピングを使用して実行した。Ｃα／Ｃβ変異がある場合およびない場合のＣＥ１０ ＴＣＲのＨＤＸパターンは、Ｃα鎖の重要な領域を除いてほぼ同一であった（図４Ｅ）。安定化時のＣαドメインの存在下でのＨＤＸ保護は、変異の部位に局在していなかったが、Ｃ末端での保護を含め、Ｃαフォールドの様々な領域にさらに全体的に局在していた。野生型および安定化ＣＥ１０ ＴＣＲは、酵素によるＮ－結合型およびＯ－結合型脱グリコシル化の前後のＮ－結合型グリカンの存在／占有についてもまた評価した。単一のＮ－結合型グリコシル化モチーフがＶαドメインに存在し、３つがＣαドメインに、１つがＣβドメインに存在する。Ｃα／Ｃβの安定化は、Ｖα内を含むＣＥ１０ ＴＣＲ内のＮ－結合型グリコシル化の有意な減少をもたらし、安定化Ｃα／Ｃβ変異がＶα／Ｖβドメインも安定化することを示唆している（表３、図４Ｆ）。安定化変異を欠くＴＣＲにおいてはＣ末端ペプチドを分解できなかったため、ＣαのＣ末端でＯ－結合型グリコシル化が起こった可能性があった。この問題は、十分に分解されたＣ末端ペプチドを用いて、Ｃα／Ｃβ変異の存在下で解消された。ＣαのＣ末端領域は、様々なＴＣＲ結晶構造において様々に存在し、使用されているＮＹ－ＥＳＯ－１構造には存在しない。興味深いことに、Ｃβ Ｈ１３９Ｒ変異は、電荷－電荷相互作用、ならびにＣα Ｃ末端のコンフォメーションを安定化／ロックダウンする可能性のある潜在的なπスタッキング相互作用を形成し、これはまた、ＨＤＸからの保護の増強も示す。したがって、ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびＳＥＣによってすべての安定化ＴＣＲについて観察された流体力学的半径の普遍的な減少は、グリコシル化の低下として確認された。
【0072】
次に、ＴＣＲが可変ドメイン変異に耐えることを可能にするＣα／Ｃβ変異の能力を評価した。ロゼッタを使用して、ＶαドメインおよびＶβドメインの両方において限られた数の変異を選択した。最終的に、１つ（βＮ６６Ｅ）は安定であり、複数の変異は中性であり、１つは野生型１Ｇ４＿１２２抗ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲ内で有意に不安定（βＳ４９Ａ）であった（図５Ａ）。ＶαおよびＶβ変異が組み合わされ、ＴＣＲバリアントのこの小さなライブラリーは、Ｃα／Ｃβ安定化変異の非存在下および存在下で発現した。Ｃα／Ｃβ変異の非存在下での１Ｇ４＿１２２ ＴＣＲについてのＤＳＦにより、広範囲のＴｍが観察されたが、Ｃα／Ｃβ変異が存在する場合、１Ｇ４＿１２２バリアントの安定性は実質的に一定であった（図５Ｂ～５Ｃ）。上記のＴＣＲで観察されたように、１Ｇ４＿１２２バリアントのライブラリー全体が、存在するＣα／Ｃβ変異に伴って約３倍の力価の増加を達成した（図５Ｄ）。興味深いことに、１Ｇ４＿１２２バリアントのＴｍは４９～６５℃の範囲であったが、Ｃα／Ｃβ安定化ライブラリーはすべてＴｍが６２℃付近に高度にクラスター化しており（図５Ｅ）、可変ドメインの不安定性に影響されなかった。これらの結果は、Ｃα／Ｃβ変異が、低い固有の安定性を有するＴＣＲの発現および安定性をレスキューする可能性があることを示唆している。
【表3】
【0073】
Ｔ細胞を標的腫瘍細胞に再方向付けするための、十分に組み立てられた可溶性ＴＣＲ／ＣＤ３二重特異性の産生におけるＣα／Ｃβ変異の有用性。
α／β ＴＣＲを安定化することの主な利点は、可能にすることができる新しい形態の二重特異性である。第一世代のＴＣＲ二重特異性は、可溶性α／β ＴＣＲの特異性をＩｍｍＴａｃフォーマットの抗ＣＤ３ ｓｃＦｖと組み合わせる（Ｌｉｄｄｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ，２０１２。１８（６）：９８０－７）。このフォーマットは、絶妙な再方向付けされた溶解効力を可能にするが、しかしながら、低収量の細菌発現および再フォールディング、ならびにこのフォーマットの迅速な血清クリアランスは、インビボ投与を困難にする。Ｃα／Ｃβ変異によってもたらされる哺乳動物細胞におけるα／β ＴＣＲの発現の有意な増加および適切なフォールディングによって、薬物動態（ＰＫ）が強化された部分、ならびに腫瘍細胞への結合力を含む新しい二重特異性フォーマットがアクセス可能であるはずである。
α／β ＴＣＲを安定化することの主な利点は、可能にすることができる新しい形態の二重特異性である。第一世代のＴＣＲ二重特異性は、可溶性α／β ＴＣＲの特異性をＩｍｍＴａｃフォーマットの抗ＣＤ３ ｓｃＦｖと組み合わせる（Ｌｉｄｄｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ，２０１２。１８（６）：９８０－７）。このフォーマットは、絶妙な再方向付けされた溶解効力を可能にするが、しかしながら、低収量の細菌発現および再フォールディング、ならびにこのフォーマットの迅速な血清クリアランスは、インビボ投与を困難にする。Ｃα／Ｃβ変異によってもたらされる哺乳動物細胞におけるα／β ＴＣＲの発現の有意な増加および適切なフォールディングによって、薬物動態（ＰＫ）が強化された部分、ならびに腫瘍細胞への結合力を含む新しい二重特異性フォーマットがアクセス可能であるはずである。
【0074】
ＩｇＧ様およびタンデムＦａｂ様二重特異性抗体（ＢｓＡｂ）が生成された（図６Ａ）。ＢｓＡｂは、ＨＬＡ－Ａ２／ＮＹ－ＥＳＯ－１ペプチド複合体に結合する１Ｇ４＿１２２α／β ＴＣＲを利用し、高親和性（１ｎＭ）で結合するように操作されている（Ｌｉ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２００５．２３（３）：３４９－５４）。ＩｇＧ様フォーマットでは、適切な重鎖アセンブリを達成するために一組の抗体Ｆｃヘテロ二量体化変異を必要とする２本の重鎖の発現が必要である。以前に公開された７．８．６０ヘテロダイマー変異が選択された（Ｌｅａｖｅｒ－Ｆａｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，２０１６．２４（４）：６４１－６５１）。ＴＣＲ／ＣＤ３ ＩｇＧ様ＢｓＡｂは、Ｃα／Ｃβ変異のある場合とない場合とで発現させた。可溶性ＴＣＲを用いて観察されたように、安定化Ｃα／Ｃβ変異を含むＴＣＲ／ＣＤ３ ＩｇＧ様ＢｓＡｂは、Ｃα／Ｃβ変異を欠く構築物よりも２倍を超えて高く発現した。安定化変異を欠くＩｇＧ様ＢｓＡｂタンパク質はまた、ＴＣＲ／ＣＤ３ ＢｓＡｂおよび抗ＣＤ３半抗体の混合物であることも見出された。抗ＣＤ３半抗体は、ＩｇＧ－Ｆｃ親和性精製後の分析ＳＥＣにより、低分子量（ＬＭＷ）ピークとして観察された（図６Ｂ～６Ｃ）。安定化Ｃα／Ｃβ変異を有するＩｇＧ様ＢｓＡｂおよびタンデムＦａｂ様ＢｓＡｂは、単一の親和性クロマトグラフィーステップ後のプロファイルに基づいて、細胞培養から直接得られる＞９０％の単分散（すなわち純粋）タンパク質として分泌された（図６Ｂ～６Ｃ）。
【0075】
次に、ＴＣＲ／ＣＤ３ ＩｇＧ様ＢｓＡｂの薬物動態（ＰＫ）特性をマウスで評価した（タンデムＦａｂ様ＢｓＡｂは試験しなかった）。残留グリコシル化は、アシアログリカン受容体に結合することにより、ＴＣＲ／ＣＤ３部分の全身（特に肝臓）への取り込みをもたらす可能性がある（Ｓｅｔｈｕｒａｍａｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２００６．１７（４）：３４１－６、Ｌｅｐｅｎｉｅｓ，ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ，２０１３．６５（９）：１２７１－８１）。以前は、安定化されていないＣα／Ｃβを含む同様の構築物が実質的なα相クリアランスを示した。これは、アシアログリカン受容体の取り込みが原因である可能性がある（Ｗｕ，ｅｔ ａｌ．，ＭＡｂｓ，２０１５．７（２）：ｐ．３６４－３７６）。本明細書に記載のＣα／Ｃβ変異は、可溶性ＴＣＲのグリコシル化レベルを大幅に低下させるため、変異がＰＫ特性の改善をもたらす可能性がある。対照として、Ｃαドメイン内のＮ－結合型グリコシル化部位が以前に記載されたように変異した第２のＩｇＧ ＢｓＡｂが生成された（Ｗｕ，ｅｔ ａｌ．，ＭＡｂｓ，２０１５．７（２）：ｐ．３６４－７６）。興味深いことに、安定化されていないＣα／Ｃβサブユニット内でＮ－結合型グリコシル化部位が排除された場合、発現は１桁より多く減少した（Ｗｕ，ｅｔ ａｌ．，ＭＡｂｓ，２０１５．７（２）：ｐ．３６４－７６）。安定化Ｃα／Ｃβ構築物のＮ－結合型グリコシル化部位のノックアウトは、発現に影響を与えなかった（図７Ａ）。安定化および安定化／アグリコシルＴＣＲ／ＣＤ３ ＩｇＧ様ＢｓＡｂの両方を、ＢＡＬＢ／ｃマウスへの静脈内注射によってそれらのＰＫについて評価した（図７Ｂ）。ＩｇＧ様ＢｓＡｂは、フィットに含まれる時点に応じて、約３～８日のβ半減期を有するＢａｌｂ－ｃマウスにおいてほぼ同一のＰＫを示した。Ｆｃ－部分（ｍｏｅｉｔｙ）は明らかに長い抗体様血清半減期をもたらし、残留ＴＣＲグリコシル化の存在は、クリアランスに何ら大きな影響を与えない。このＰＫは、ＩｍｍＴａｃで予想されるよりもはるかに良好である。１週間の時点で、ＴＣＲ／ＣＤ３ ＩｇＧ様ＢｓＡｂの両方の分子濃度の非線形低下が観察された。濃度の低下は１０日でより劇的になり、１４日までにＢｓＡｂレベルは検出レベルを大幅に下回った（図７Ｂ）。血清はマウス抗薬物抗体（ＡＤＡ）の存在について試験され、７日目で低レベルが観察され、これは１０日目および１４日目で大幅に増加し、おそらく７日で始まるクリアランスの加速を説明している。早期発症ＡＤＡの背後にある理由は明らかではない。
【0076】
次に、ＴＣＲ／ＣＤ３ ＢｓＡｂは、それらの機能について評価した。フローサイトメトリーは、ＣＤ３結合を評価するためにＪｕｒｋａｔ細胞を使用して実行され、ＨＬＡ－Ａ２／ペプチド結合を評価するために６２４．３８およびＳａｏｓ－２腫瘍細胞を使用して実行された。ＩｇＧ様およびタンデムＦａｂ様ＢｓＡｂの両方が、ＣＤ３およびＨＬＡ－Ａ２／ペプチド細胞抗原の両方に結合することができた（図６Ｄ）。両方のＢｓＡｂは、結合力の喪失により、二価の抗ＣＤ３抗体と比較してＪｕｒｋａｔ細胞への結合力の１０～３０分の１の減少を示した。タンデムＦａｂ様ＢｓＡｂは、ＩｇＧ様ＢｓＡｂと比較して、２つの別々のＨＬＡ－Ａ２＋腫瘍細胞にわずかに良好に結合するように見えた。ＩｇＧ様ＢｓＡｂで観察された腫瘍細胞への結合が弱いことを考えると、ＩｇＧ ＢｓＡｂの２つのより高い効力のＴＣＲ（Ｌｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２００５，２３（３）：３４９－５４）バージョンが生成されて、効力の喪失を相殺した（図７Ａ）。１Ｇ４＿１０７ ＴＣＲバリアントは、フローサイトメトリーにより、１Ｇ４＿１２２バリアントよりも腫瘍細胞への結合力の改善を示した（図６Ｄ）。
【0077】
次に、ＢｓＡｂは、刺激されていない初代Ｔ細胞の存在下でペプチド標識腫瘍細胞に滴定された。腫瘍細胞の再方向付けされた弱いＴ細胞がＩｇＧ ＢｓＡｂのＳａｏｓ－２細胞株（図６Ｅ）で観察された。ＨＬＡ／ペプチド複合体に対する効力を増加させても、弱い活性は改善されなかった（図６Ｅ）。タンデムＦａｂ ＢｓＡｂは、Ｔ細胞を強力に再方向付けしてＳａｏｓ－２細胞を殺傷した。
【0078】
本明細書に提示されたデータに基づくと、新規のＣα／Ｃβ変異は、安定性の低い可変ドメインを有するものを含む、ほとんどの組換えＴＣＲの発現および安定性を改善する可能性がある。封入体での従来の細菌生産方法と比較して、可溶化、再フォールディング、および精製が続き（Ｗｉｌｓｏｎ，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ，１９９７．７（６）：８３９－４８）、本明細書に記載の完全に組み立てられた／酸化されたＴＣＲの哺乳動物の発現／分泌は、それらの生産の容易さを劇的に増加させるはずである。安定化変異は、安定化ジスルフィド結合の有無にかかわらず、抗体のような発現レベルをもたらし（Ｂｏｕｌｔｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．，２００３．１６（９）：ｐ．７０７－１１）、－単独ではジスルフィド結合によって提供されない成果であった。この発現の増加は、様々なＴＣＲ／抗体二機能性分子の強力な生産を可能にする。興味深い可能性のある応用は、初代Ｔ細胞内でトランスジェニックに誘導された全長ＴＣＲ内に安定化変異を含めることである。鎖の会合および発現の困難さは、ジスルフィド結合の導入、α／β鎖の発現の順序、または膜貫通領域での疎水性物質の導入によってわずかな改善が見られた（Ｊｉｎ，ｅｔ ａｌ．，ＪＣＩ Ｉｎｓｉｇｈｔ，２０１８．３（８）、Ｓｃｈｏｌｔｅｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｏｎｃｏｌ，２０１０．３２（１－２）：４３－５６）。本明細書に記載のＣα／Ｃβ変異が一般的に細胞ベースの治療アプローチの細胞表面ＴＣＲ発現を改善するかどうかを理解することは興味深い。
【0079】
安定化ＴＣＲはまた、安定化されていない対応物と比較して、全体的なグリコシル化（可変ドメインおよび定常ドメインの両方）の低下も示した。グリコシル化は、抗体Ｆｃ、および特定の場合には抗体Ｆａｂ部分を含む多くの異なるタンパク質を自然に安定化および可溶化することができる（Ｚｈｏｕ，Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ，２０１９．１０８（４）：１３６６－１３７７）。糖鎖工学は、タンパク質を安定化させたり、凝集／誤ったフォールディングの傾向を減らしたり、または溶解性を改善したりするためのアプローチとしても使用されている（Ｚｈｏｕ，Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ，２０１９）．１０８（４）：１３６６－１３７７）。Ｃαのグリコシル化が失われると、Ｃα／Ｃβサブユニットを含むＩｇＧ様タンパク質の発現が劇的に減少することが示された（Ｗｕ，ｅｔ ａｌ．，ＭＡｂｓ，２０１５．７（２）：３６４－７６）。したがって、安定化変異がＴＣＲ全体を通して部位あたり約５０％Ｎ－結合型グリコシル化を有意に減少させたことを見出すことは驚くべきことである。ＣαのＣ末端での推定上のＯ－結合型グリコシル化も、安定化形では存在しなかった。相互作用を安定化すると、フォールディング／フォールディングタンパク質内のこれらの部位のコンフォメーション変動が減少し、標準的なＮ結合型モチーフおよびＯ結合型部位を装飾する酵素のアクセスが減少すると仮定される。これには、Ｖα内のＮ結合型部位が含まれ、Ｃα／Ｃβ変異が一般にＴＣＲ全体を安定化させるというさらなる証拠を提供する。さらに、変異を介したＣα上のＮ－結合型グリカンの完全な除去は、安定化構築物内のタンパク質発現に影響を与えなかった。
【0080】
Ｔ細胞を腫瘍細胞を溶解するように再方向付けするＴＣＲ／ＣＤ３ ＢｓＡｂの能力には、明確な幾何学的制約が存在する。このような制約は、二重特異性抗体の再方向付けについて以前に実証されている（Ｂｌｕｅｍｅｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ，２０１０．５９（８）：１１９７－２０９、 Ｗｕ，ｅｔ ａｌ．，ＭＡｂｓ，２０１５．７（２）：３６４－７６、Ｌｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ，２０１７．３１（３）：３８３－３９５）。ＴＣＲベースの治療法について同様のデータは何ら示されていない。可溶性ＴＣＲおよび抗ＣＤ３ Ｆａｂサブユニットのフレキシビリティーおよび間隔は、同一の可溶性ＴＣＲおよび抗ＣＤ３アームを含むＩｇＧ様およびタンデムＦａｂ様ＢｓＡｂ間の全体的な活性および効力の実質的な違いを考慮すると、高い再方向付け溶解効力を達成するために重要であるようである。抗原および／または二重特異性構築物のサイズおよび免疫シナプス内に適合するそれらの能力に関する多くの議論が提起されている（Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００６，７（８）：８０３－９）。しかしながら、Ｔ細胞の非存在下では、ＩｇＧ様およびタンデムＦａｂ様のＢｓＡｂフォーマット間で腫瘍細胞への結合に違いが観察され、サイズ／免疫シナプスの解釈が複雑になる。これらのＢｓＡｂの場合、各細胞型への個々の結合特性がより大きな役割を果たす可能性がある。全体として、安定化Ｃα／Ｃβ変異によってもたらされる重要な利点は、可溶性ＴＣＲベースの治療だけでなく、細胞ベースの治療の一部としてＴＣＲを使用するシステムを含む細胞システムにおける組換えα／β ＴＣＲ発現を改善するためにも価値がある可能性がある。
【0081】
材料および方法
分子生物学
ＮＹ－ＥＳＯ－１ １Ｇ４＿１２２可溶性ＴＣＲ、および個々のＮＹ－ＥＳＯ－１Ｖα／ＶβおよびＣα／Ｃβサブユニットは、もともとｇＢｌｏｃｋｓ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＩＤＴ）を使用して生成され、リコンビナーゼクローニングを使用して（Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、哺乳動物発現ベクター（Ｌｏｎｚａ）にサブクローニングした。１Ｇ４＿１２２、１０７、および１１３の配列は、２Ｆ５３結晶構造を使用して導出した（Ｄｕｎｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ，２００６．１５（４）：７１０－２１）および他の場所で説明されているＣＤＲ（Ｌｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２００５．２３（３）：３４９－５４）。マウスカッパ軽鎖リーダー配列を使用して各タンパク質の分泌を促進し、８ｘＨｉｓタグをα鎖のＮ末端に組換え的に添加した。ＤＮＡ配列は、ＩＤＴに最適化されたコドンアルゴリズムを使用して導出した。
分子生物学
ＮＹ－ＥＳＯ－１ １Ｇ４＿１２２可溶性ＴＣＲ、および個々のＮＹ－ＥＳＯ－１Ｖα／ＶβおよびＣα／Ｃβサブユニットは、もともとｇＢｌｏｃｋｓ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＩＤＴ）を使用して生成され、リコンビナーゼクローニングを使用して（Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、哺乳動物発現ベクター（Ｌｏｎｚａ）にサブクローニングした。１Ｇ４＿１２２、１０７、および１１３の配列は、２Ｆ５３結晶構造を使用して導出した（Ｄｕｎｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ，２００６．１５（４）：７１０－２１）および他の場所で説明されているＣＤＲ（Ｌｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２００５．２３（３）：３４９－５４）。マウスカッパ軽鎖リーダー配列を使用して各タンパク質の分泌を促進し、８ｘＨｉｓタグをα鎖のＮ末端に組換え的に添加した。ＤＮＡ配列は、ＩＤＴに最適化されたコドンアルゴリズムを使用して導出した。
【0082】
単一変異体ライブラリーは、部位特異的変異誘発プロトコルを使用して作成した。簡単に説明すると、このプロトコルでは、スーパーコイル状の二本鎖ＤＮＡベクターと、所望の変異を含む２つの合成オリゴヌクレオチドプライマー（ＩＤＴで生成）を使用する。ベクターの反対側の鎖にそれぞれ相補的なオリゴヌクレオチドプライマーは、ＤＮＡポリメラーゼ（ＨｏｔＳｔａｒ ＨｉＦｉｄｅｌｉｔｙ Ｋｉｔ，Ｑｉａｇｅｎ）によって熱サイクリング中に伸長され、まったく新しい変異プラスミドを生成する。温度サイクル後、生成物をＤｐｎ Ｉ酵素で処理して、Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）を使用して調製したメチル化された非変異プラスミドを除去する。次に、新しく生成された各変異プラスミドは、トップ１０のＥ．ｃｏｌｉコンピテントセル（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に形質転換される。コロニーを選定し、培養し、ミニプレップし（Ｑｉａｇｅｎ）、配列を確認した。変異体の組み合わせは、一般的にｇＢｌｏｃｋとして合成した。
【0083】
ＴＣＲ／ＣＤ３構築物は、各断片のオーバーラップＰＣＲおよびリコンビナーゼクローニングを使用して作成された。キメラＳＰ－３４抗ＣＤ３重鎖および軽鎖配列は以前に公開されていた（Ｗｕ，ｅｔ ａｌ．，ＭＡｂｓ，２０１５．７（２）：３６４－７６）。
【0084】
タンパク質の発現および精製
以前に記載されているように、２４ウェルプレート（１ｍＬスケール）または個々のフラスコ（１００～２００ｍＬスケール）のいずれかで一過性発現のためにα／β構築物をコトランスフェクトした（Ｒａｊｅｎｄｒａ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｐｒｏｇ，２０１７．３３（２）：４６９－４７７）。以前に記載されたように、精製のために上清を回収した（Ｌｅｗｉｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２０１４．３２（２）：１９１－８、Ｆｒｏｎｉｎｇ、ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ，２０１７．２６（１０）：２０２１－２０３８）。ＴＣＲおよびＴＣＲ断片の小規模発現は、Ｏｃｔｅｔ ＲＥＤ３８４システム上でのＮｉ２＋－ＮＴＡチップ（Ｐａｌｌ Ｆｏｒｔｅ Ｂｉｏ）の読み取りを使用して定量化された。ＴＣＲ／ＴＣＲ断片Ｈｉｓタグタンパク質は、Ｎｉ２＋固定化レジン（ｃＯｍｐｌｅｔｅ（商標）Ｈｉｓ－Ｔａｇ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ）およびＡＫＴＡ Ｐｕｒｅシステム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して精製した。カラムは、少なくとも５カラム容量の結合バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０、０．５Ｍ ＮａＣｌ）を用いて、１ｍＬカラムの場合は１ｍＬ／分、５ｍＬカラムの場合は５ｍＬ／分の流速でそれぞれ平衡化した。ＣＨＯ発現上清をカラムに通してＨｉｓタグ化ＴＣＲまたはＴＣＲ断片を捕捉した後、ＴＣＲタンパク質を１０カラム容量の溶出バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０、０．５Ｍ ＮａＣｌ、２５０ｍＭイミダゾール）を用いて溶出した。イミダゾールは、タンパク質を分取サイズ排除カラム（ＳＲＴ－１０Ｃ ＳＥＣ３００）に通すか、１０，０００ＭＷカットオフのＶＩＶＡＳＰＩＮ６濃縮器を使用してｐＨ７．２～７．４のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に対して透析することにより除去された。ＩｇＧ－Ｆｃ含有タンパク質は、ｍＡｂＳｕｒｅレジン（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）および分取サイズ排除を使用して精製した。ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）は、製造元（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に従って４～１２％のＢｉｓ Ｔｒｉｓゲルを使用して実施した。還元およびアルキル化は、１ｍＭ ジチオスレイトール（ＤＴＴ）および１ｍＭ Ｎ－エチルマレイミド（ＮＥＭ）を使用して実行した。
以前に記載されているように、２４ウェルプレート（１ｍＬスケール）または個々のフラスコ（１００～２００ｍＬスケール）のいずれかで一過性発現のためにα／β構築物をコトランスフェクトした（Ｒａｊｅｎｄｒａ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｐｒｏｇ，２０１７．３３（２）：４６９－４７７）。以前に記載されたように、精製のために上清を回収した（Ｌｅｗｉｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２０１４．３２（２）：１９１－８、Ｆｒｏｎｉｎｇ、ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ，２０１７．２６（１０）：２０２１－２０３８）。ＴＣＲおよびＴＣＲ断片の小規模発現は、Ｏｃｔｅｔ ＲＥＤ３８４システム上でのＮｉ２＋－ＮＴＡチップ（Ｐａｌｌ Ｆｏｒｔｅ Ｂｉｏ）の読み取りを使用して定量化された。ＴＣＲ／ＴＣＲ断片Ｈｉｓタグタンパク質は、Ｎｉ２＋固定化レジン（ｃＯｍｐｌｅｔｅ（商標）Ｈｉｓ－Ｔａｇ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ）およびＡＫＴＡ Ｐｕｒｅシステム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して精製した。カラムは、少なくとも５カラム容量の結合バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０、０．５Ｍ ＮａＣｌ）を用いて、１ｍＬカラムの場合は１ｍＬ／分、５ｍＬカラムの場合は５ｍＬ／分の流速でそれぞれ平衡化した。ＣＨＯ発現上清をカラムに通してＨｉｓタグ化ＴＣＲまたはＴＣＲ断片を捕捉した後、ＴＣＲタンパク質を１０カラム容量の溶出バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０、０．５Ｍ ＮａＣｌ、２５０ｍＭイミダゾール）を用いて溶出した。イミダゾールは、タンパク質を分取サイズ排除カラム（ＳＲＴ－１０Ｃ ＳＥＣ３００）に通すか、１０，０００ＭＷカットオフのＶＩＶＡＳＰＩＮ６濃縮器を使用してｐＨ７．２～７．４のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に対して透析することにより除去された。ＩｇＧ－Ｆｃ含有タンパク質は、ｍＡｂＳｕｒｅレジン（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）および分取サイズ排除を使用して精製した。ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）は、製造元（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に従って４～１２％のＢｉｓ Ｔｒｉｓゲルを使用して実施した。還元およびアルキル化は、１ｍＭ ジチオスレイトール（ＤＴＴ）および１ｍＭ Ｎ－エチルマレイミド（ＮＥＭ）を使用して実行した。
【0085】
示差走査熱量測定および熱量測定（ＤＳＦおよびＤＳＣ）。
タンパク質のアンフォールディングは、ＳＹＰＲＯ Ｏｒａｎｇｅ色素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓ６６５１）を使用してＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ ４８０ＩＩ ＲＴ ＰＣＲマシン（Ｒｏｃｈｅ）上でモニターした。励起フィルターおよび発光フィルターは、それぞれ４６５ｎｍおよび５８０ｎｍに設定した。温度は１℃／ｓの速度で２５℃から９５℃まで上昇した。タンパク質のストック溶液をランニングバッファー中（１×ＰＢＳ ｐＨ７．４）に保存した。
タンパク質のアンフォールディングは、ＳＹＰＲＯ Ｏｒａｎｇｅ色素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓ６６５１）を使用してＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ ４８０ＩＩ ＲＴ ＰＣＲマシン（Ｒｏｃｈｅ）上でモニターした。励起フィルターおよび発光フィルターは、それぞれ４６５ｎｍおよび５８０ｎｍに設定した。温度は１℃／ｓの速度で２５℃から９５℃まで上昇した。タンパク質のストック溶液をランニングバッファー中（１×ＰＢＳ ｐＨ７．４）に保存した。
【0086】
最終的なアッセイ条件は、０．２ｍｇ／ｍＬのタンパク質およびランニングバッファー中５００倍のＳｙｐｒｏ希釈であった。実験は、タンパク質を０．４ｍｇ／ｍｌに希釈すること、Ｓｙｐｒｏを２５０倍に希釈すること、次いで９６ウェルプレートで希釈したタンパク質とＳｙｐｒｏを等量部で組み合わせることによって行った（最終容量：ウェルあたり３０μＬ）。サンプルは、３８４マルチウェルアッセイプレート（Ｒｏｃｈｅ、０４－７２９－７４９－００１）上、６μＬのトリプリケートに分割された。
【0087】
各タンパク質の熱アンフォールディング（Ｔｍ）中点の決定は、一次導関数を使用してＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｓｈｉｆｔ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｒｏｃｈｅ）で実行された。分析ソフトウェアは生の蛍光データを平滑化し、Ｔｍは、蛍光の上昇勾配が温度に対して最も急になる温度（すなわち、融解曲線の一次導関数が最大になる温度）を決定することによって収集した。
【0088】
ＤＳＣデータは、以前に記載されたように収集および分析された（Ｄｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２０１１．２８６（６）：４７０３－１７）。
【0089】
ロゼッタエネルギー予測。
ＰＤＢコード２Ｆ５３のＴＣＲ結晶構造を使用して、Ａ－Ｃ鎖を除去して、アルファ鎖およびベータ鎖のみを残した。残りの構造は、ロゼッタのＦａｓｔＲｅｌａｘプロトコルを使用して、すべての残基のＣＡ原子に座標制約（バックボーン原子が開始位置から外れると成長するエネルギーペナルティ）を使用して緩和された（Ｃｏｎｗａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ，２０１４．２３（１）：４７－５５）。ＦａｓｔＲｅｌａｘプロトコルを使用して、考えられるすべての変異（システインへの変異を除く）もシミュレートした。ＦａｓｔＲｅｌａｘは、２つのサブプロトコルで構成されている。（１）固定バックボーン回転異性体置換（すなわち、側鎖コンフォメーションサンプリング）および（２）バックボーンおよび側鎖ねじれ角の全原子最小化である。最初のサブプロトコルは、残基位置ごとに回転異性体ライブラリーを生成し、ユーザーが許可した位置で回転異性体を確率的にサンプリングする。このサンプリングが何度も繰り返された後（数十万）、回転子の最低エネルギーの組み合わせがタンパク質に割り当てられる。第２のサブプロトコルは、勾配ベースのねじれ角の最小化を使用して、構造をロゼッタエネルギー地形の極小値に緩和する。この研究では、エネルギー関数ＲＥＦ２０１５を使用した（Ｐａｒｋ，Ｊ Ｃｈｅｍ Ｔｈｅｏｒｙ Ｃｏｍｐｕｔ，２０１６、１２（１２）：６２０１－６２１２、Ｏ’Ｍｅａｒａ、ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｈｅｍ Ｔｈｅｏｒｙ Ｃｏｍｐｕｔ，２０１５．１１（２）：６０９－２２）。ロゼッタエネルギー予測でノイズを防ぐために、特定の考慮事項が作成された。ＦａｓｔＲｅｌａｘの最初のサブプロトコルでは、変異から１０Å以内の残基のみを使用して、代替の側鎖コンフォメーションをサンプリングした。バックボーンが開始構造から大きく変化するのを防ぐために、第２のサブプロトコルのすべての残基位置に座標制約が追加された。ＦａｓｔＲｅｌａｘが完了した後、座標制約なしで全原子最小化の最後の実行が１回実行され、タンパク質がその局所的な、制約のないエネルギー最小値にリラックスできるようにする。可能性があるすべての変異に対して１０個の独立した軌道が実行され、その変異の代表的なスコアとして、スコアが最も低い３つの軌道の平均スコアが使用された。ロゼッタバージョンのバージョン識別子（ｇｉｔ ｓｈａ１）は、２０１７年６月４日にリリースされた３６０ｄ０ｂ３ａ２ｂｃ３ｄ９ｅ０８４８９ｂｂ９ｃ２９２ｄ８５６８１ｂｂｃ０ｃｂｄであった。
ＰＤＢコード２Ｆ５３のＴＣＲ結晶構造を使用して、Ａ－Ｃ鎖を除去して、アルファ鎖およびベータ鎖のみを残した。残りの構造は、ロゼッタのＦａｓｔＲｅｌａｘプロトコルを使用して、すべての残基のＣＡ原子に座標制約（バックボーン原子が開始位置から外れると成長するエネルギーペナルティ）を使用して緩和された（Ｃｏｎｗａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ，２０１４．２３（１）：４７－５５）。ＦａｓｔＲｅｌａｘプロトコルを使用して、考えられるすべての変異（システインへの変異を除く）もシミュレートした。ＦａｓｔＲｅｌａｘは、２つのサブプロトコルで構成されている。（１）固定バックボーン回転異性体置換（すなわち、側鎖コンフォメーションサンプリング）および（２）バックボーンおよび側鎖ねじれ角の全原子最小化である。最初のサブプロトコルは、残基位置ごとに回転異性体ライブラリーを生成し、ユーザーが許可した位置で回転異性体を確率的にサンプリングする。このサンプリングが何度も繰り返された後（数十万）、回転子の最低エネルギーの組み合わせがタンパク質に割り当てられる。第２のサブプロトコルは、勾配ベースのねじれ角の最小化を使用して、構造をロゼッタエネルギー地形の極小値に緩和する。この研究では、エネルギー関数ＲＥＦ２０１５を使用した（Ｐａｒｋ，Ｊ Ｃｈｅｍ Ｔｈｅｏｒｙ Ｃｏｍｐｕｔ，２０１６、１２（１２）：６２０１－６２１２、Ｏ’Ｍｅａｒａ、ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｈｅｍ Ｔｈｅｏｒｙ Ｃｏｍｐｕｔ，２０１５．１１（２）：６０９－２２）。ロゼッタエネルギー予測でノイズを防ぐために、特定の考慮事項が作成された。ＦａｓｔＲｅｌａｘの最初のサブプロトコルでは、変異から１０Å以内の残基のみを使用して、代替の側鎖コンフォメーションをサンプリングした。バックボーンが開始構造から大きく変化するのを防ぐために、第２のサブプロトコルのすべての残基位置に座標制約が追加された。ＦａｓｔＲｅｌａｘが完了した後、座標制約なしで全原子最小化の最後の実行が１回実行され、タンパク質がその局所的な、制約のないエネルギー最小値にリラックスできるようにする。可能性があるすべての変異に対して１０個の独立した軌道が実行され、その変異の代表的なスコアとして、スコアが最も低い３つの軌道の平均スコアが使用された。ロゼッタバージョンのバージョン識別子（ｇｉｔ ｓｈａ１）は、２０１７年６月４日にリリースされた３６０ｄ０ｂ３ａ２ｂｃ３ｄ９ｅ０８４８９ｂｂ９ｃ２９２ｄ８５６８１ｂｂｃ０ｃｂｄであった。
【0090】
マルチプル配列アラインメント。
３９のＣＡ配列および５３のＣＢ配列のリストは、様々な生物からのＴＣＲ配列のマルチプル配列アラインメント（ＭＳＡ）を手動で監督することによって評価された。非冗長タンパク質配列のＮＣＢＩデータベース（データベース内の１６９，８５９，４１１配列）を使用して、２Ｆ５３構造のＣＡ鎖およびＣＢ鎖の配列をＢＬＡＳＴに渡すことにより、ＴＣＲ類似配列の２つのリストを作成した。両方のリストは、ＴＣＲであるとは思われない配列を手動で削除した。ロゼッタによって安定化すると見なされた変異のリストは、２つのリストに分割された：（１）ＭＳＡに存在する変異と（２）ＭＳＡに存在しない変異である。実験的試験のために、リスト１から３０の変異が選択され、リスト２から２５の変異が選択された。選考の決定は主にロゼッタスコアによって行われたが、多様性を高めるために一部の候補者は削除された。変異を２つのリストに分割することにより、ロゼッタによって下位層と見なされた変異は、Ｔ細胞受容体構造と互換性があることが示されている場合に促進できる。
３９のＣＡ配列および５３のＣＢ配列のリストは、様々な生物からのＴＣＲ配列のマルチプル配列アラインメント（ＭＳＡ）を手動で監督することによって評価された。非冗長タンパク質配列のＮＣＢＩデータベース（データベース内の１６９，８５９，４１１配列）を使用して、２Ｆ５３構造のＣＡ鎖およびＣＢ鎖の配列をＢＬＡＳＴに渡すことにより、ＴＣＲ類似配列の２つのリストを作成した。両方のリストは、ＴＣＲであるとは思われない配列を手動で削除した。ロゼッタによって安定化すると見なされた変異のリストは、２つのリストに分割された：（１）ＭＳＡに存在する変異と（２）ＭＳＡに存在しない変異である。実験的試験のために、リスト１から３０の変異が選択され、リスト２から２５の変異が選択された。選考の決定は主にロゼッタスコアによって行われたが、多様性を高めるために一部の候補者は削除された。変異を２つのリストに分割することにより、ロゼッタによって下位層と見なされた変異は、Ｔ細胞受容体構造と互換性があることが示されている場合に促進できる。
【0091】
Ｃα／Ｃβ変異体の組み合わせのモデリング。
最高のパフォーマンスの点変異が実験的に決定された後、ロゼッタシミュレーションを実行して、各変異が他のすべての変異と互換性があることを確認した。各変異は、事前に緩和された２Ｆ５３構造に別々に適用され、固定バックボーン側鎖の再充填を実行した。同じシミュレーションが変異のすべての対で実施され、ペアのロゼッタエネルギーが個々の変異のエネルギーの合計と異ならないことを確認した。
最高のパフォーマンスの点変異が実験的に決定された後、ロゼッタシミュレーションを実行して、各変異が他のすべての変異と互換性があることを確認した。各変異は、事前に緩和された２Ｆ５３構造に別々に適用され、固定バックボーン側鎖の再充填を実行した。同じシミュレーションが変異のすべての対で実施され、ペアのロゼッタエネルギーが個々の変異のエネルギーの合計と異ならないことを確認した。
【0092】
タンパク質の結晶化。
精製されたタンパク質は、シッティングドロップ蒸気拡散法を使用して８℃で結晶化された。結晶は、１５ｍｇ／ｍＬの１部のタンパク質溶液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．５、および１５０ｍＭ 塩化ナトリウム）を、２３％ＰＥＧ ４Ｋ、３００ｍＭ 硫酸マグネシウム、および１０％グリセロールを含む１部のリザーバー溶液と混合することによって得られた。液滴に、１５％ ＰＥＧ３３５０および１００ｍＭ ギ酸マグネシウムから成長した粉砕結晶を播種した。１週間以内に単一の板状結晶が観察された。これらを１５％グリセロールを含む一滴のリザーバー溶液に収集し、液体窒素で瞬間冷凍した。
精製されたタンパク質は、シッティングドロップ蒸気拡散法を使用して８℃で結晶化された。結晶は、１５ｍｇ／ｍＬの１部のタンパク質溶液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．５、および１５０ｍＭ 塩化ナトリウム）を、２３％ＰＥＧ ４Ｋ、３００ｍＭ 硫酸マグネシウム、および１０％グリセロールを含む１部のリザーバー溶液と混合することによって得られた。液滴に、１５％ ＰＥＧ３３５０および１００ｍＭ ギ酸マグネシウムから成長した粉砕結晶を播種した。１週間以内に単一の板状結晶が観察された。これらを１５％グリセロールを含む一滴のリザーバー溶液に収集し、液体窒素で瞬間冷凍した。
【0093】
Ｘ線データ収集および構造決定。
シンクロトロンＸ線回折データは、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｐｈｏｔｏｎ Ｓｏｕｒｃｅ ｏｎ ｂｅａｍｌｉｎｅ ３１－ＩＤ－Ｄ（ＬＲＬ－ＣＡＴ）の単結晶で収集された。得られたデータは、ａｕｔｏＰＲＯＣを使用して統合され（Ｖｏｎｒｈｅｉｎ，ｅｔ ａｌ．，Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ Ｂｉｏｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ，２０１１．６７（Ｐｔ ４）：２９３－３０２）、ＳＣＡＬＡとマージおよびスケーリングされた（Ｅｖａｎｓ，Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ Ｂｉｏｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ，２０１１．６７（Ｐｔ ４）：２８２－９２）。この構造は、Ｐｈａｓｅｒによる分子置換によって分解され（ＭｃＣｏｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ａｐｐｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ，２００７．４０（Ｐｔ ４）：６５８－６７４）、以前に分解されたＴＣＲ－ｐＭＨＣ複合体（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａｂａｎｋアクセッションコード２Ｆ５３）のＴＣＲ定常ドメインを検索モデルとして使用する（Ｄｕｎｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ，２００６．１５（４）：７１０－２１）。ＣＯＯＴ（Ｅｍｓｌｅｙ，ｅｔ ａｌ．，Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ Ｂｉｏｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ，２０１０． ６６（Ｐｔ ４）：４８６－５０１）およびＲＥＦＭＡＣ５（Ｍｕｒｓｈｕｄｏｖ，ｅｔ ａｌ．，Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ Ｂｉｏｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ，２０１１．６７（Ｐｔ ４）：ｐ．３５５－６７）を使用して、ＣＣＰ４ソフトウェアパッケージに実装されているように（Ｗｉｎｎ，ｅｔ ａｌ．，Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ Ｂｉｏｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ，２０１１．６７（Ｐｔ ４）：２３５－４２）、モデルの構築および改良を数回実施した。最終モデルはＭｏｌＰｒｏｂｉｔｙを用いて検証された（Ｗｉｌｌｉａｍｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ，２０１８．２７（１）：２９３－３１５）。追加のデータ収集および改良の詳細は、表４および表５に記載されている。
シンクロトロンＸ線回折データは、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｐｈｏｔｏｎ Ｓｏｕｒｃｅ ｏｎ ｂｅａｍｌｉｎｅ ３１－ＩＤ－Ｄ（ＬＲＬ－ＣＡＴ）の単結晶で収集された。得られたデータは、ａｕｔｏＰＲＯＣを使用して統合され（Ｖｏｎｒｈｅｉｎ，ｅｔ ａｌ．，Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ Ｂｉｏｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ，２０１１．６７（Ｐｔ ４）：２９３－３０２）、ＳＣＡＬＡとマージおよびスケーリングされた（Ｅｖａｎｓ，Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ Ｂｉｏｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ，２０１１．６７（Ｐｔ ４）：２８２－９２）。この構造は、Ｐｈａｓｅｒによる分子置換によって分解され（ＭｃＣｏｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ａｐｐｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ，２００７．４０（Ｐｔ ４）：６５８－６７４）、以前に分解されたＴＣＲ－ｐＭＨＣ複合体（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａｂａｎｋアクセッションコード２Ｆ５３）のＴＣＲ定常ドメインを検索モデルとして使用する（Ｄｕｎｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ，２００６．１５（４）：７１０－２１）。ＣＯＯＴ（Ｅｍｓｌｅｙ，ｅｔ ａｌ．，Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ Ｂｉｏｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ，２０１０． ６６（Ｐｔ ４）：４８６－５０１）およびＲＥＦＭＡＣ５（Ｍｕｒｓｈｕｄｏｖ，ｅｔ ａｌ．，Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ Ｂｉｏｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ，２０１１．６７（Ｐｔ ４）：ｐ．３５５－６７）を使用して、ＣＣＰ４ソフトウェアパッケージに実装されているように（Ｗｉｎｎ，ｅｔ ａｌ．，Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ Ｂｉｏｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ，２０１１．６７（Ｐｔ ４）：２３５－４２）、モデルの構築および改良を数回実施した。最終モデルはＭｏｌＰｒｏｂｉｔｙを用いて検証された（Ｗｉｌｌｉａｍｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ，２０１８．２７（１）：２９３－３１５）。追加のデータ収集および改良の詳細は、表４および表５に記載されている。
【表4】
【表5】
【0094】
ペプチドマッピング。
野生型および安定化ＣＥ１０ ＴＣＲは、分析のために変性、還元、システインアルキル化、および消化された。簡単に説明すると、１００μｇのＴＣＲバリアントを６Ｍグアニジンで変性させた後、１０ｍＭ ジチオスレイトールで３７℃にて３０分間還元した。次に、１５ｍＭ ヨードアセトアミドを添加し、暗所で４５分間反応を進行させた。次に、スピンフィルターを使用して、各サンプルを１０ｍＭ ＴＲＩＳ、ｐＨ７．５にバッファー交換した。５μｇのトリプシンを還元／アルキル化サンプルに添加し、３７℃にて４時間インキュベートした。トリプシン処理したサンプルを２つの等量部に分けた。最初のサンプルは、１μＬのＰＮＧａｓｅＦ（ＰｒｏＺｙｍｅ）および５ｕＬの１０ｘ消化バッファーを加えること、および室温で一晩インキュベートすることにより脱グリコシル化され、一方第２のサンプルは未処理のままにされた。
野生型および安定化ＣＥ１０ ＴＣＲは、分析のために変性、還元、システインアルキル化、および消化された。簡単に説明すると、１００μｇのＴＣＲバリアントを６Ｍグアニジンで変性させた後、１０ｍＭ ジチオスレイトールで３７℃にて３０分間還元した。次に、１５ｍＭ ヨードアセトアミドを添加し、暗所で４５分間反応を進行させた。次に、スピンフィルターを使用して、各サンプルを１０ｍＭ ＴＲＩＳ、ｐＨ７．５にバッファー交換した。５μｇのトリプシンを還元／アルキル化サンプルに添加し、３７℃にて４時間インキュベートした。トリプシン処理したサンプルを２つの等量部に分けた。最初のサンプルは、１μＬのＰＮＧａｓｅＦ（ＰｒｏＺｙｍｅ）および５ｕＬの１０ｘ消化バッファーを加えること、および室温で一晩インキュベートすることにより脱グリコシル化され、一方第２のサンプルは未処理のままにされた。
【0095】
グリカンの占有率を決定するために、ＰＮＧａｓｅ Ｆで処理したトリプシン消化物および未処理のトリプシン消化物のアリコートを、ペプチドマッピングおよび質量アラインメントのためにＡｇｉｌｅｎｔ ５２１０ ＱＴＯＦ質量分析計に接続したＡｇｉｌｅｎｔ １２９０ ＵＰＬＣに注入した。簡単に説明すると、５μｇのＴＣＲ消化物をＷａｔｅｒｓ １５０ｍｍ×２．１ｍｍ １．７μｍ Ｃ１８ ＣＳＨ ＵＰＬＣカラムに注入し、２％Ｂ（アセトニトリル中の０．１％ギ酸）から３５％Ｂまで３０分かけてグラジエント分離した。溶出ペプチドは、質量分析のために質量分析計に注入され、スキャン範囲は２００～２０００ｍ／ｚ、ソース温度は３５０℃、キャピラリー電圧は４ｋＶ、フラグメンターは２５０Ｖ、キャピラリー出口は７５Ｖ、ソースガス４０はＰＳＩ、およびコーンガスは１２ＰＳＩであった。ペプチドの質量スペクトルは、Ｍａｓｓ Ｈｕｎｔｅｒ／Ｂｉｏｃｏｎｆｉｒｍ ７．０ソフトウェアによって５ｐｐｍの質量精度でタンパク質配列にアラインメントされ、９０％を超える配列カバレッジが得られた。グリカンの占有率を測定するために、変数の改変としてＡｓｎの脱アミド化を追加し、５ｐｐｍの質量精度で抽出イオンクロマトグラム（ＥＩＣ）によって、予測される各グリカンを手動でチェックした。Ａｓｎ対Ａｓｐの比率は、ＥＩＣを使用して計算され、グリカン占有パーセントとして報告されたが、酵素的脱グリコシル化はＡｓｎをＡｓｐに変換するため、Ａｓｎは占有されておらず、Ａｓｐは占有されている。
【0096】
質量分析（ＨＤＸ－ＭＳ）と組み合わせた水素／重水素交換。
ＨＤＸ－ＭＳ実験は、ＨＤＸテクノロジーを用いるＷａｔｅｒｓ ｎａｎｏＡＣＱＵＩＴＹシステム上で実行され（Ｗａｌｅｓ，ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ，２００８．８０（１７）：６８１５－２０）、これはＬＥＡＰ ＨＤＸロボット液体処理システムを含む。重水素交換実験は、０．１×ＰＢＳを含む５５μＬのＤ２Ｏバッファーを５μｌの各タンパク質（濃度は２５μＭ）に１５℃で様々な時間（０秒、１０秒、１分、１０分、６０分、および２４０分）加えることによって開始した。等量の０．３２Ｍ ＴＣＥＰ、０．１Ｍリン酸塩ｐＨ２．５を使用して、１℃で２分間反応を停止させた。移動相として水中０．２％のギ酸を使用して、１００μＬ／分の流速で４分間、１４℃で５０μＬのクエンチした反応物をオンラインペプシンカラム（Ｗａｔｅｒｓ ＢＥＨ Ｅｎｚｙｍａｔｅ）に注入した。次いで、得られた消化性ペプチドを、５０μＬ／分の流速で１０分間にわたって、３～８５％のアセトニトリル（０．２％のギ酸を含有する）勾配を使用して、Ｖａｎｇｕａｒｄトラップカラムを備えるＣ１８カラム（Ｗａｔｅｒｓ，Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ｃ１８，１．７μｍ，１．０ｍｍ×５０ｍｍ）で分離する。分離されたペプチドは、Ｗａｔｅｒｓ Ｘｅｖｏ Ｇ２飛行時間型（ｑＴＯＦ）質量分析計に送られる。質量分析計は、ｍ／ｚ ２５５．００～１９５０．００の質量取得範囲において、スキャン時間０．５秒で、ＭＳＥ、ＥＳＩ＋モードでデータを収集するように設定されている。Ｘｅｖｏ Ｇ２は、使用前にＧｌｕ－フィブリノペプチドで較正されている。すべての取得データは、５０％ ＡＣＮ、５０％ Ｈ２Ｏ、および０．１％ ＦＡ中のＬｅｕＥｎｋの２μｇ／ｍｌ溶液を使用して、３０秒ごとに５μｌ／分の流量で質量補正される（ｍ／ｚは５５６．２７７１）。ペプチドは最初に、Ｗａｔｅｒｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌｙｎｘ Ｇｌｏｂａｌ Ｓｅｒｖｅｒ ３．０２によって同定される。処理パラメータは、１００．０カウントの低エネルギー閾値、５０．０カウントの高エネルギー閾値、および１５００．０カウントの強度閾値に設定されている。得られたペプチドのリストは、Ｗａｔｅｒｓ ＤｙｎａｍＸ ３．０ソフトウェアにインポートされ、閾値は５ｐｐｍの質量誤差であり、ペプチド長に基づくペプチドあたりの断片イオンは２０％であった。各ペプチドの相対的な重水素取り込みは、ＤｙｎａｍＸ３．０（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）の非重水素化対照とともに重水素化サンプルのＭＳデータを処理することによって決定される。
ＨＤＸ－ＭＳ実験は、ＨＤＸテクノロジーを用いるＷａｔｅｒｓ ｎａｎｏＡＣＱＵＩＴＹシステム上で実行され（Ｗａｌｅｓ，ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ，２００８．８０（１７）：６８１５－２０）、これはＬＥＡＰ ＨＤＸロボット液体処理システムを含む。重水素交換実験は、０．１×ＰＢＳを含む５５μＬのＤ２Ｏバッファーを５μｌの各タンパク質（濃度は２５μＭ）に１５℃で様々な時間（０秒、１０秒、１分、１０分、６０分、および２４０分）加えることによって開始した。等量の０．３２Ｍ ＴＣＥＰ、０．１Ｍリン酸塩ｐＨ２．５を使用して、１℃で２分間反応を停止させた。移動相として水中０．２％のギ酸を使用して、１００μＬ／分の流速で４分間、１４℃で５０μＬのクエンチした反応物をオンラインペプシンカラム（Ｗａｔｅｒｓ ＢＥＨ Ｅｎｚｙｍａｔｅ）に注入した。次いで、得られた消化性ペプチドを、５０μＬ／分の流速で１０分間にわたって、３～８５％のアセトニトリル（０．２％のギ酸を含有する）勾配を使用して、Ｖａｎｇｕａｒｄトラップカラムを備えるＣ１８カラム（Ｗａｔｅｒｓ，Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ｃ１８，１．７μｍ，１．０ｍｍ×５０ｍｍ）で分離する。分離されたペプチドは、Ｗａｔｅｒｓ Ｘｅｖｏ Ｇ２飛行時間型（ｑＴＯＦ）質量分析計に送られる。質量分析計は、ｍ／ｚ ２５５．００～１９５０．００の質量取得範囲において、スキャン時間０．５秒で、ＭＳＥ、ＥＳＩ＋モードでデータを収集するように設定されている。Ｘｅｖｏ Ｇ２は、使用前にＧｌｕ－フィブリノペプチドで較正されている。すべての取得データは、５０％ ＡＣＮ、５０％ Ｈ２Ｏ、および０．１％ ＦＡ中のＬｅｕＥｎｋの２μｇ／ｍｌ溶液を使用して、３０秒ごとに５μｌ／分の流量で質量補正される（ｍ／ｚは５５６．２７７１）。ペプチドは最初に、Ｗａｔｅｒｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌｙｎｘ Ｇｌｏｂａｌ Ｓｅｒｖｅｒ ３．０２によって同定される。処理パラメータは、１００．０カウントの低エネルギー閾値、５０．０カウントの高エネルギー閾値、および１５００．０カウントの強度閾値に設定されている。得られたペプチドのリストは、Ｗａｔｅｒｓ ＤｙｎａｍＸ ３．０ソフトウェアにインポートされ、閾値は５ｐｐｍの質量誤差であり、ペプチド長に基づくペプチドあたりの断片イオンは２０％であった。各ペプチドの相対的な重水素取り込みは、ＤｙｎａｍＸ３．０（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）の非重水素化対照とともに重水素化サンプルのＭＳデータを処理することによって決定される。
【0097】
薬物動態測定。
ＴＣＲ／ＣＤ３ ＩｇＧ様ＢｓＡｂｓの薬物動態測定は、以前に記載されたように実行された（Ｌｅｗｉｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２０１４．３２（２）：１９１－８）。ＢｓＡｂに対する抗薬物抗体がマウスにおいて生成されているかどうかを評価するために、５０ｍＭ 炭酸ナトリウム、ｐＨ９．３中の２μｇ／ｍＬ ＢｓＡｂで４℃にて一晩、Ｈｉｇｈ Ｂｉｎｄ Ｕウェル９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｍｉｃｒｏｌｏｎ）をコーティングすることによりＥＬＩＳＡを実施した。プレートをＰＢＳ＋０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳＴ）で洗浄し、室温（ＲＴ）でＰＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中のＢｌｏｃｋｅｒ（商標）カゼインで１時間ブロックし、ＰＢＳＴで洗浄した。ＰＢＳ中のＢｌｏｃｋｅｒ（商標）カゼインの１：３段階希釈で１：５０から開始するマウス血漿希釈液を、室温で１時間プレートに添加した。プレートをＰＢＳＴで洗浄し、１：１０００ヤギ抗マウスカッパ－ＡＰポリクローナル（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｃａｔ＃１０５０－０４）：Ｂｌｏｃｋｅｒ（商標）カゼイン一次抗体を添加し、１時間インキュベートした。検出試薬を洗い流した後、ＰＮＰＰ基質（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加した。比色読み取りは、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ１９０プレートリーダーで４５０ｎｍの吸光度を読み取ることによって実行した。
ＴＣＲ／ＣＤ３ ＩｇＧ様ＢｓＡｂｓの薬物動態測定は、以前に記載されたように実行された（Ｌｅｗｉｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２０１４．３２（２）：１９１－８）。ＢｓＡｂに対する抗薬物抗体がマウスにおいて生成されているかどうかを評価するために、５０ｍＭ 炭酸ナトリウム、ｐＨ９．３中の２μｇ／ｍＬ ＢｓＡｂで４℃にて一晩、Ｈｉｇｈ Ｂｉｎｄ Ｕウェル９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｍｉｃｒｏｌｏｎ）をコーティングすることによりＥＬＩＳＡを実施した。プレートをＰＢＳ＋０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳＴ）で洗浄し、室温（ＲＴ）でＰＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中のＢｌｏｃｋｅｒ（商標）カゼインで１時間ブロックし、ＰＢＳＴで洗浄した。ＰＢＳ中のＢｌｏｃｋｅｒ（商標）カゼインの１：３段階希釈で１：５０から開始するマウス血漿希釈液を、室温で１時間プレートに添加した。プレートをＰＢＳＴで洗浄し、１：１０００ヤギ抗マウスカッパ－ＡＰポリクローナル（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｃａｔ＃１０５０－０４）：Ｂｌｏｃｋｅｒ（商標）カゼイン一次抗体を添加し、１時間インキュベートした。検出試薬を洗い流した後、ＰＮＰＰ基質（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加した。比色読み取りは、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ１９０プレートリーダーで４５０ｎｍの吸光度を読み取ることによって実行した。
【0098】
Ｔ細胞再方向付け溶解アッセイ。
Ｓａｏｓ－２細胞はＡＴＣＣからのものであり、６２４．３８細胞はＮＣＩ／ＮＩＨ ＤＴＰ、ＤＣＴＤ腫瘍リポジトリからのものであり、両方ともＣｏｍｐｌｅｔｅ Ｍｅｄｉａ（ＲＰＭＩ １６４０、Ｃｏｒｎｉｎｇ）中で培養された。初代ナイーブＴ細胞は、ＡＬＬＣＥＬＬＳからのものであった。アッセイでは、Ａｃｃｕｔａｓｅを使用して腫瘍細胞を培養フラスコから取り出し、１２００ＲＰＭで１０分間スピンダウンした。腫瘍細胞をＣｏｍｐｌｅｔｅ Ｍｅｄｉａに再懸濁し、９６ウェルの黒色の透明なボトムプレート（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）に５０００細胞／ウェルで播種し、５％ＣＯ２インキュベーター中で１６～２４時間インキュベートした。次に、細胞に６μｇ／ｍＬのＳＬＬＭＷＩＴＱＣ（ＮＹ－ＥＳＯ－１）ペプチド（ＣＰＣ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃによって合成）、総量５０μＬを３時間パルスした。次に、ＴＣＲ／ＣＤ３二官能性物質を、１００ｎＭで開始し、０．００１ｎＭで終了する１０倍希釈液を３回（５０μＬ／サンプル）で３０分間使用して、細胞に滴定した。この期間中、初代Ｔ細胞を解凍し、完全培地およびゲンタマイシンで２回洗浄した。次に、Ｔ細胞（１００μＬ）を５０Ｋ細胞／ウェル（総量２００ｍＬ）で添加した。細胞を５％ ＣＯ２および３７℃で４８時間インキュベートした。４８時間後、プレートを無血清ＲＰＭＩ １６４０で穏やかに（２回）洗浄した。次に、１００μＬのＲＰＭＩ １６４０および１００μＬのＣｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を添加し、シェーカーで２分間混合し（ゆっくりと）、暗所で１０分間インキュベートした。最後に、発光をＥｎＶｉｓｉｏｎ２１３０マルチラベルリーダーで読み取った。
Ｓａｏｓ－２細胞はＡＴＣＣからのものであり、６２４．３８細胞はＮＣＩ／ＮＩＨ ＤＴＰ、ＤＣＴＤ腫瘍リポジトリからのものであり、両方ともＣｏｍｐｌｅｔｅ Ｍｅｄｉａ（ＲＰＭＩ １６４０、Ｃｏｒｎｉｎｇ）中で培養された。初代ナイーブＴ細胞は、ＡＬＬＣＥＬＬＳからのものであった。アッセイでは、Ａｃｃｕｔａｓｅを使用して腫瘍細胞を培養フラスコから取り出し、１２００ＲＰＭで１０分間スピンダウンした。腫瘍細胞をＣｏｍｐｌｅｔｅ Ｍｅｄｉａに再懸濁し、９６ウェルの黒色の透明なボトムプレート（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）に５０００細胞／ウェルで播種し、５％ＣＯ２インキュベーター中で１６～２４時間インキュベートした。次に、細胞に６μｇ／ｍＬのＳＬＬＭＷＩＴＱＣ（ＮＹ－ＥＳＯ－１）ペプチド（ＣＰＣ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃによって合成）、総量５０μＬを３時間パルスした。次に、ＴＣＲ／ＣＤ３二官能性物質を、１００ｎＭで開始し、０．００１ｎＭで終了する１０倍希釈液を３回（５０μＬ／サンプル）で３０分間使用して、細胞に滴定した。この期間中、初代Ｔ細胞を解凍し、完全培地およびゲンタマイシンで２回洗浄した。次に、Ｔ細胞（１００μＬ）を５０Ｋ細胞／ウェル（総量２００ｍＬ）で添加した。細胞を５％ ＣＯ２および３７℃で４８時間インキュベートした。４８時間後、プレートを無血清ＲＰＭＩ １６４０で穏やかに（２回）洗浄した。次に、１００μＬのＲＰＭＩ １６４０および１００μＬのＣｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を添加し、シェーカーで２分間混合し（ゆっくりと）、暗所で１０分間インキュベートした。最後に、発光をＥｎＶｉｓｉｏｎ２１３０マルチラベルリーダーで読み取った。
【0099】
フローサイトメトリー。
上記のように細胞培養を行った。フローサイトメトリーを実行する前日に、Ｔ２５フラスコにＪｕｒｋａｔ、Ｓａｏｓ－２、または６２４．３８細胞を増殖バッファー（ＲＰＭＩ／１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）／ゲンタマイシン－Ｇｉｂｃｏ）に播種した。腫瘍細胞については、翌朝、細胞を増殖バッファーで１回洗浄した。ペプチドを腫瘍細胞に（すなわち陰性対照としてではなく）６μｇ／ｍＬで３７℃、５％ ＣＯ２で３時間添加した。次に、過剰なペプチドを吸引除去し、細胞をＰＢＳバッファーで３回洗浄した。その後のすべてのステップは氷上で実行した。Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、腫瘍細胞をＴ２５フラスコから持ち上げた。ジャーカット細胞は浮遊状態で増殖する。細胞を遠心分離管に移し、１２００ＲＰＭで７分間の遠心分離によりペレット化した。以降、「洗浄バッファー」はＰＢＳ／２％ＦＢＳ／０．０５％ＮａＮ３であった。「ブロッキングバッファー」は、１０％正常ヤギ血清／１０％ＦＢＳ／ヒトＢＤ Ｆｃブロック（ＢＤ）を添加した洗浄バッファーであった。細胞をブロックバッファーに１５分間再懸濁し、ペレット化し、３回洗浄し、ブロックバッファーに再懸濁してから、５０μＬの細胞（０．２×１０６）を９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ ３７９９）に添加した。ＴＣＲ／ＣＤ３二官能性および対照ｍＡｂを３０、３、０．３、および０．０３μｇ／ｍＬでウェルに添加し、４５分間インキュベートした。細胞をペレット化し、洗浄し、上清を再度吸引した後、１００μＬの希釈Ｒ－フィコエリトリン結合ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗ヒトＩｇＧ－Ｆｃ（ジャクソン）または抗ヒトラムダＬＣ（ジャクソン）をブロックバッファー中で４５分間添加した。細胞をペレット化し、再度洗浄した。最後に、細胞を１：１０００ ＰＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を含むブロックバッファーに再懸濁し、ホイルで覆った。次に、Ｄｉｖａソフトウェア（ＢＤ）で取得したＦｏｒｔｅｓｓａ Ｈ６４７７８００００００６フローサイトメーターで細胞を選別し、ＦｌｏＪｏバージョン１０．０．０８を使用してデータを分析した。
上記のように細胞培養を行った。フローサイトメトリーを実行する前日に、Ｔ２５フラスコにＪｕｒｋａｔ、Ｓａｏｓ－２、または６２４．３８細胞を増殖バッファー（ＲＰＭＩ／１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）／ゲンタマイシン－Ｇｉｂｃｏ）に播種した。腫瘍細胞については、翌朝、細胞を増殖バッファーで１回洗浄した。ペプチドを腫瘍細胞に（すなわち陰性対照としてではなく）６μｇ／ｍＬで３７℃、５％ ＣＯ２で３時間添加した。次に、過剰なペプチドを吸引除去し、細胞をＰＢＳバッファーで３回洗浄した。その後のすべてのステップは氷上で実行した。Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、腫瘍細胞をＴ２５フラスコから持ち上げた。ジャーカット細胞は浮遊状態で増殖する。細胞を遠心分離管に移し、１２００ＲＰＭで７分間の遠心分離によりペレット化した。以降、「洗浄バッファー」はＰＢＳ／２％ＦＢＳ／０．０５％ＮａＮ３であった。「ブロッキングバッファー」は、１０％正常ヤギ血清／１０％ＦＢＳ／ヒトＢＤ Ｆｃブロック（ＢＤ）を添加した洗浄バッファーであった。細胞をブロックバッファーに１５分間再懸濁し、ペレット化し、３回洗浄し、ブロックバッファーに再懸濁してから、５０μＬの細胞（０．２×１０６）を９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ ３７９９）に添加した。ＴＣＲ／ＣＤ３二官能性および対照ｍＡｂを３０、３、０．３、および０．０３μｇ／ｍＬでウェルに添加し、４５分間インキュベートした。細胞をペレット化し、洗浄し、上清を再度吸引した後、１００μＬの希釈Ｒ－フィコエリトリン結合ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗ヒトＩｇＧ－Ｆｃ（ジャクソン）または抗ヒトラムダＬＣ（ジャクソン）をブロックバッファー中で４５分間添加した。細胞をペレット化し、再度洗浄した。最後に、細胞を１：１０００ ＰＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を含むブロックバッファーに再懸濁し、ホイルで覆った。次に、Ｄｉｖａソフトウェア（ＢＤ）で取得したＦｏｒｔｅｓｓａ Ｈ６４７７８００００００６フローサイトメーターで細胞を選別し、ＦｌｏＪｏバージョン１０．０．０８を使用してデータを分析した。
【0100】
データの可用性
ＴＣＲ定常ドメイン構造の座標、および対応する構造因子は、アクセッションコード６Ｕ０７でＰｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｃｓｂ．ｏｒｇ）に寄託されている。
本発明の様々な実施形態を以下に示す。
１．タンパク質であって、
以下の残基：１３９位のフェニルアラニン、１５０位のイソロイシン、１９０位のスレオニン（Ｋａｂａｔ番号付けに従って番号付けされた残基）のうちの少なくとも１つを含むＴ細胞受容体（ＴＣＲ）アルファ定常ドメイン（Ｃα）を含む第１のポリペプチド、および／または
以下の残基：１３４位のリジン、１３９位のアルギニン、１５５位のプロリン、１７０位のアスパラギン酸もしくはグルタミン酸（Ｋａｂａｔ番号付けに従って番号付けされた残基）のうちの少なくとも１つを含むＴＣＲベータ定常ドメイン（Ｃβ）を含む第２のポリペプチドを含む、タンパク質。
２．前記第１のポリペプチドが、以下の残基：１３９位のフェニルアラニン、１５０位のイソロイシン、１９０位のスレオニン（Ｋａｂａｔ番号付けに従って番号付けされた残基）のうちの少なくとも１つを含むＣαを含み、
前記第２のポリペプチドが、以下の残基：１３４位のリジン、１３９位のアルギニン、１５５位のプロリン、１７０位のアスパラギン酸またはグルタミン酸（Ｋａｂａｔ番号付けに従って番号付けされた残基）のうちの少なくとも１つを含むＣβを含む、上記１に記載のタンパク質。
３．前記第１のポリペプチドが、以下の残基：１３９位のフェニルアラニン、１５０位のイソロイシン、１９０位のスレオニン（Ｋａｂａｔ番号付けに従って番号付けされた残基）を含むＣαドメインを含み、
前記第２のポリペプチドが、以下の残基：１３４位のリジン、１３９位のアルギニン、１５５位のプロリン、１７０位のアスパラギン酸（Ｋａｂａｔ番号付けに従って番号付けされた残基）を含むＣβドメインを含む、上記１または２に記載のタンパク質。
４．前記第１のポリペプチドが、以下の残基：１３９位のフェニルアラニンおよび１９０位のスレオニン（Ｋａｂａｔ番号付けに従って番号付けされた残基）を含むＣαドメインを含み、
前記第２のポリペプチドが、以下の残基：１３４位のリジン、１３９位のアルギニン、１５５位のプロリン、１７０位のアスパラギン酸（Ｋａｂａｔ番号付けに従って番号付けされた残基）を含むＣβドメインを含む、上記１または２に記載のタンパク質。
５．前記第１のポリペプチドが、鎖間ジスルフィド結合によって前記第２のポリペプチドに連結されている、上記１～４のいずれかに記載のタンパク質。
６．前記Ｃαドメインが、１６６位のシステイン残基（Ｋａｂａｔ番号付けに従って番号付けされた残基）をさらに含み、
前記Ｃβドメインが、１７３位のシステイン残基（Ｋａｂａｔ番号付けに従って番号付けされた残基）をさらに含み、
前記第１のポリペプチドおよび前記第２のポリペプチドが、Ｃαの前記１６６位のシステイン残基とＣβの前記１７３位のシステイン残基との間の鎖間ジスルフィド結合によって連結されている、上記１～５のいずれかに記載のタンパク質。
７．前記Ｃαドメインが、配列番号５を含み、
前記Ｃβドメインが、配列番号７を含む、上記１～５のいずれかに記載のタンパク質。
８．前記Ｃαドメインが、配列番号５からなり、
前記Ｃβドメインが、配列番号７からなる、上記１～５のいずれかに記載のタンパク質。
９．前記Ｃαドメインが、配列番号６を含み、
前記Ｃβドメインが、配列番号８を含む、上記１～６のいずれかに記載のタンパク質。
１０．前記Ｃαドメインが、配列番号６からなり、
前記Ｃβドメインが、配列番号８からなる、上記１～６のいずれかに記載のタンパク質。
１１．前記第１のポリペプチドが、ＴＣＲアルファ可変ドメイン（Ｖα）をさらに含み、
前記第２のポリペプチドが、ＴＣＲベータ可変ドメイン（Ｖβ）をさらに含み、
前記ＶαおよびＶβが、抗原に結合する抗原結合ドメインを形成する、上記１～１０のいずれかに記載のタンパク質。
１２．前記Ｖαが、ＣαのＮ末端に融合しており、
前記Ｖβが、ＣβのＮ末端に融合している、上記１１に記載のタンパク質。
１３．前記抗原が、腫瘍抗原またはウイルス抗原である、上記１１に記載のタンパク質。
１４．前記タンパク質が、第２の抗原結合ドメインをさらに含む、上記１～１３のいずれかに記載のタンパク質。
１５．前記第２の抗原結合ドメインが、Ｔ細胞表面上の抗原に結合する、上記１４に記載のタンパク質。
１６．前記第２の抗原結合ドメインが、ＣＤ３に結合する、上記１４に記載のタンパク質。
１７．前記第２の抗原結合ドメインが、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、（Ｆａｂ’） ２ 、単一ドメイン抗体、またはラクダＶＨＨドメインである、上記１４～１６のいずれかに記載のタンパク質。
１８．前記第２の抗原結合ドメインが、Ｆａｂである、上記１４～１７のいずれかに記載のタンパク質。
１９．前記Ｆａｂが、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）およびヒトＩｇＧ ＣＨ１ドメインを含むＦａｂ重鎖、ならびに軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）およびヒト軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）を含むＦａｂ軽鎖を含み、前記ＶＨおよびＶＬが、ＣＤ３に結合する前記第２の抗原結合ドメインを形成する、上記１８に記載のタンパク質。
２０．前記タンパク質が、以下の３つのポリペプチド：
Ｖα－Ｃα－リンカー－ＶＨ－ＣＨ１を含む第１のポリペプチド、
Ｖβ－Ｃβを含む第２のポリペプチド、および
ＶＬ－ＣＬを含む第３のポリペプチドを含み、
前記第２および第３のポリペプチドが、鎖間ジスルフィド結合によって前記第１のポリペプチドに連結されている、上記１８または１９に記載のタンパク質。
２１．前記タンパク質が、ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域（Ｆｃ）をさらに含む、上記１～２０のいずれかに記載のタンパク質。
２２．前記ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域が、対応する野生型ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域と比較してエフェクター機能が低下した改変ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域である、上記２１に記載のタンパク質。
２３．前記タンパク質が、以下の４つのポリペプチド：
Ｖα－Ｃα－ヒンジ－第１のＦｃ領域を含む第１のポリペプチド、
Ｖβ－Ｃβを含む第２のポリペプチド、
ＶＬ－ＣＬを含む第３のポリペプチド、および
ＶＨ－ＣＨ１－ヒンジ－第２のＦｃ領域を含む第４のポリペプチドを含み、
前記第２および第４のポリペプチドが、鎖間ジスルフィド結合によって前記第１のポリペプチドに連結されており、前記第３のポリペプチドが、鎖間ジスルフィド結合によって前記第４のポリペプチドに連結されている、上記１～１９、２１または２２のいずれかに記載のタンパク質。
２４．前記タンパク質が、以下の４つのポリペプチド：
Ｖα－Ｃα－リンカー－ＶＨ－ＣＨ１－ヒンジ－第１のＦｃ領域を含む第１のポリペプチド、
Ｖβ－Ｃβを含む第２のポリペプチド、
ＶＬ－ＣＬを含む第３のポリペプチド、
第２のＦｃ領域を含む第４のポリペプチドを含み、
前記第２、第３、および第４のポリペプチドが、鎖間ジスルフィド結合によって前記第１のポリペプチドに連結されている、上記２１または２２に記載のタンパク質。
２５．前記リンカーが、配列番号４１～４６のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列を含む、上記２０または２４に記載のタンパク質。
２６．前記ヒンジ領域が配列番号４７を含み、前記第１および第２のＦｃ領域が配列番号４８を含む、上記２３または２４に記載のタンパク質。
２７．前記ヒンジ領域が配列番号４９を含み、前記第１および第２のＦｃ領域が配列番号５０を含む、上記２３または２４に記載のタンパク質。
２８．前記第１および第２のＦｃ領域が、ＣＨ３ヘテロ二量体化変異のセットを含む、上記２３または２４に記載のタンパク質。
２９．前記第１または第２のＦｃ領域のうちの一方が、残基４０７のアラニン、残基３９９のメチオニン、および残基３６０のアスパラギン酸を含むＣＨ３ドメインを含み、前記第１または第２のＦｃ領域の他方が、残基３６６のバリン、残基４０９のバリン、ならびに残基３４５および３４７のアルギニン（ＥＵインデックス番号付けに従って番号付けされた残基）を含むＣＨ３ドメインを含む、上記２８に記載のタンパク質。
３０．前記タンパク質が、可溶性タンパク質である、上記１～２９のいずれかに記載のタンパク質。
３１．前記タンパク質が、
前記Ｃαドメインが１３９位のセリン、１５０位のスレオニン、および１９０位のアラニン（Ｋａｂａｔ番号付けに従って番号付けされた残基）を含むこと、ならびに
前記Ｃβドメインが１３４位のグルタミン酸、１３９位のヒスチジン、１５５位のアスパラギン酸、および１７０位のセリン（Ｋａｂａｔ番号付けに従って番号付けされた残基）を含むこと以外は同じアミノ酸配列を含むタンパク質と比較して、より高いアンフォールディング温度（Ｔｍ）を有する、上記１～３０のいずれかに記載のタンパク質。
３２．前記タンパク質が、
前記Ｃαドメインが１３９位のセリン、１５０位のスレオニン、および１９０位のアラニン（Ｋａｂａｔ番号付けに従って番号付けされた残基）を含むこと、ならびに
前記Ｃβドメインが１３４位のグルタミン酸、１３９位のヒスチジン、１５５位のアスパラギン酸、および１７０位のセリン（Ｋａｂａｔ番号付けに従って番号付けされた残基）を含むこと以外は同じアミノ酸配列を含むタンパク質と比較して、増加した安定性を有する、上記１～３０のいずれかに記載のタンパク質。
３３．前記タンパク質が、同じ条件下で発現される場合、
前記Ｃαドメインが１３９位のセリン、１５０位のスレオニン、および１９０位のアラニン（Ｋａｂａｔ番号付けに従って番号付けされた残基）を含むこと、ならびに
前記Ｃβドメインが１３４位のグルタミン酸、１３９位のヒスチジン、１５５位のアスパラギン酸、および１７０位のセリン（Ｋａｂａｔ番号付けに従って番号付けされた残基）を含むこと以外は同じアミノ酸配列を含むタンパク質と比較して、増加した発現レベルを有する、上記１～３０のいずれかに記載のタンパク質。
３４．前記タンパク質が、
前記Ｃαドメインが１３９位のセリン、１５０位のスレオニン、および１９０位のアラニン（Ｋａｂａｔ番号付けに従って番号付けされた残基）を含むこと、ならびに
前記Ｃβドメインが１３４位のグルタミン酸、１３９位のヒスチジン、１５５位のアスパラギン酸、および１７０位のセリン（Ｋａｂａｔ番号付けに従って番号付けされた残基）を含むこと以外は同じアミノ酸配列を含むタンパク質と比較して、低下したグリコシル化レベルを有する、上記１～３０のいずれかに記載のタンパク質。
３５．（ａ）前記第１のポリペプチドが、ＴＣＲアルファ鎖の膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインをさらに含み、
（ｂ）前記第２のポリペプチドが、ＴＣＲベータ鎖の膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインをさらに含む、上記１～１３のいずれかに記載のタンパク質。
３６．前記タンパク質が、検出可能な標識に連結されている、上記１～３５のいずれかに記載のタンパク質。
３７．前記タンパク質が、治療剤に連結されている、上記１～３６のいずれかに記載のタンパク質。
３８．前記治療剤が、細胞毒性剤、抗炎症剤、または免疫刺激剤である、上記３７に記載のタンパク質。
３９．上記１～３８のいずれかに記載のタンパク質のポリペプチドをコードする核酸。
４０．上記３９に記載の核酸を含む、ベクター。
４１．上記３９に記載の核酸または上記４０に記載のベクターを含む、細胞。
４２．上記１～３８のいずれかに記載のタンパク質、上記３９に記載の核酸、上記４０に記載のベクター、または上記４１に記載の細胞を含む、医薬組成物。
４３．がんまたは感染症の治療を必要とする対象においてそれを行う方法であって、上記１～３８のいずれかに記載のタンパク質、上記３９に記載の核酸、上記４０に記載のベクター、上記４１に記載の細胞、または上記４２に記載の医薬組成物の治療有効量を、前記対象に投与することを含む、方法。
４４．がんまたは感染症の治療に使用するための、上記１～３８のいずれかに記載のタンパク質、上記３９に記載の核酸、上記４０に記載のベクター、上記４１に記載の細胞、または上記４２に記載の医薬組成物。
ＴＣＲ定常ドメイン構造の座標、および対応する構造因子は、アクセッションコード６Ｕ０７でＰｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｃｓｂ．ｏｒｇ）に寄託されている。
本発明の様々な実施形態を以下に示す。
１．タンパク質であって、
以下の残基：１３９位のフェニルアラニン、１５０位のイソロイシン、１９０位のスレオニン（Ｋａｂａｔ番号付けに従って番号付けされた残基）のうちの少なくとも１つを含むＴ細胞受容体（ＴＣＲ）アルファ定常ドメイン（Ｃα）を含む第１のポリペプチド、および／または
以下の残基：１３４位のリジン、１３９位のアルギニン、１５５位のプロリン、１７０位のアスパラギン酸もしくはグルタミン酸（Ｋａｂａｔ番号付けに従って番号付けされた残基）のうちの少なくとも１つを含むＴＣＲベータ定常ドメイン（Ｃβ）を含む第２のポリペプチドを含む、タンパク質。
２．前記第１のポリペプチドが、以下の残基：１３９位のフェニルアラニン、１５０位のイソロイシン、１９０位のスレオニン（Ｋａｂａｔ番号付けに従って番号付けされた残基）のうちの少なくとも１つを含むＣαを含み、
前記第２のポリペプチドが、以下の残基：１３４位のリジン、１３９位のアルギニン、１５５位のプロリン、１７０位のアスパラギン酸またはグルタミン酸（Ｋａｂａｔ番号付けに従って番号付けされた残基）のうちの少なくとも１つを含むＣβを含む、上記１に記載のタンパク質。
３．前記第１のポリペプチドが、以下の残基：１３９位のフェニルアラニン、１５０位のイソロイシン、１９０位のスレオニン（Ｋａｂａｔ番号付けに従って番号付けされた残基）を含むＣαドメインを含み、
前記第２のポリペプチドが、以下の残基：１３４位のリジン、１３９位のアルギニン、１５５位のプロリン、１７０位のアスパラギン酸（Ｋａｂａｔ番号付けに従って番号付けされた残基）を含むＣβドメインを含む、上記１または２に記載のタンパク質。
４．前記第１のポリペプチドが、以下の残基：１３９位のフェニルアラニンおよび１９０位のスレオニン（Ｋａｂａｔ番号付けに従って番号付けされた残基）を含むＣαドメインを含み、
前記第２のポリペプチドが、以下の残基：１３４位のリジン、１３９位のアルギニン、１５５位のプロリン、１７０位のアスパラギン酸（Ｋａｂａｔ番号付けに従って番号付けされた残基）を含むＣβドメインを含む、上記１または２に記載のタンパク質。
５．前記第１のポリペプチドが、鎖間ジスルフィド結合によって前記第２のポリペプチドに連結されている、上記１～４のいずれかに記載のタンパク質。
６．前記Ｃαドメインが、１６６位のシステイン残基（Ｋａｂａｔ番号付けに従って番号付けされた残基）をさらに含み、
前記Ｃβドメインが、１７３位のシステイン残基（Ｋａｂａｔ番号付けに従って番号付けされた残基）をさらに含み、
前記第１のポリペプチドおよび前記第２のポリペプチドが、Ｃαの前記１６６位のシステイン残基とＣβの前記１７３位のシステイン残基との間の鎖間ジスルフィド結合によって連結されている、上記１～５のいずれかに記載のタンパク質。
７．前記Ｃαドメインが、配列番号５を含み、
前記Ｃβドメインが、配列番号７を含む、上記１～５のいずれかに記載のタンパク質。
８．前記Ｃαドメインが、配列番号５からなり、
前記Ｃβドメインが、配列番号７からなる、上記１～５のいずれかに記載のタンパク質。
９．前記Ｃαドメインが、配列番号６を含み、
前記Ｃβドメインが、配列番号８を含む、上記１～６のいずれかに記載のタンパク質。
１０．前記Ｃαドメインが、配列番号６からなり、
前記Ｃβドメインが、配列番号８からなる、上記１～６のいずれかに記載のタンパク質。
１１．前記第１のポリペプチドが、ＴＣＲアルファ可変ドメイン（Ｖα）をさらに含み、
前記第２のポリペプチドが、ＴＣＲベータ可変ドメイン（Ｖβ）をさらに含み、
前記ＶαおよびＶβが、抗原に結合する抗原結合ドメインを形成する、上記１～１０のいずれかに記載のタンパク質。
１２．前記Ｖαが、ＣαのＮ末端に融合しており、
前記Ｖβが、ＣβのＮ末端に融合している、上記１１に記載のタンパク質。
１３．前記抗原が、腫瘍抗原またはウイルス抗原である、上記１１に記載のタンパク質。
１４．前記タンパク質が、第２の抗原結合ドメインをさらに含む、上記１～１３のいずれかに記載のタンパク質。
１５．前記第２の抗原結合ドメインが、Ｔ細胞表面上の抗原に結合する、上記１４に記載のタンパク質。
１６．前記第２の抗原結合ドメインが、ＣＤ３に結合する、上記１４に記載のタンパク質。
１７．前記第２の抗原結合ドメインが、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、（Ｆａｂ’） ２ 、単一ドメイン抗体、またはラクダＶＨＨドメインである、上記１４～１６のいずれかに記載のタンパク質。
１８．前記第２の抗原結合ドメインが、Ｆａｂである、上記１４～１７のいずれかに記載のタンパク質。
１９．前記Ｆａｂが、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）およびヒトＩｇＧ ＣＨ１ドメインを含むＦａｂ重鎖、ならびに軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）およびヒト軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）を含むＦａｂ軽鎖を含み、前記ＶＨおよびＶＬが、ＣＤ３に結合する前記第２の抗原結合ドメインを形成する、上記１８に記載のタンパク質。
２０．前記タンパク質が、以下の３つのポリペプチド：
Ｖα－Ｃα－リンカー－ＶＨ－ＣＨ１を含む第１のポリペプチド、
Ｖβ－Ｃβを含む第２のポリペプチド、および
ＶＬ－ＣＬを含む第３のポリペプチドを含み、
前記第２および第３のポリペプチドが、鎖間ジスルフィド結合によって前記第１のポリペプチドに連結されている、上記１８または１９に記載のタンパク質。
２１．前記タンパク質が、ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域（Ｆｃ）をさらに含む、上記１～２０のいずれかに記載のタンパク質。
２２．前記ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域が、対応する野生型ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域と比較してエフェクター機能が低下した改変ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域である、上記２１に記載のタンパク質。
２３．前記タンパク質が、以下の４つのポリペプチド：
Ｖα－Ｃα－ヒンジ－第１のＦｃ領域を含む第１のポリペプチド、
Ｖβ－Ｃβを含む第２のポリペプチド、
ＶＬ－ＣＬを含む第３のポリペプチド、および
ＶＨ－ＣＨ１－ヒンジ－第２のＦｃ領域を含む第４のポリペプチドを含み、
前記第２および第４のポリペプチドが、鎖間ジスルフィド結合によって前記第１のポリペプチドに連結されており、前記第３のポリペプチドが、鎖間ジスルフィド結合によって前記第４のポリペプチドに連結されている、上記１～１９、２１または２２のいずれかに記載のタンパク質。
２４．前記タンパク質が、以下の４つのポリペプチド：
Ｖα－Ｃα－リンカー－ＶＨ－ＣＨ１－ヒンジ－第１のＦｃ領域を含む第１のポリペプチド、
Ｖβ－Ｃβを含む第２のポリペプチド、
ＶＬ－ＣＬを含む第３のポリペプチド、
第２のＦｃ領域を含む第４のポリペプチドを含み、
前記第２、第３、および第４のポリペプチドが、鎖間ジスルフィド結合によって前記第１のポリペプチドに連結されている、上記２１または２２に記載のタンパク質。
２５．前記リンカーが、配列番号４１～４６のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列を含む、上記２０または２４に記載のタンパク質。
２６．前記ヒンジ領域が配列番号４７を含み、前記第１および第２のＦｃ領域が配列番号４８を含む、上記２３または２４に記載のタンパク質。
２７．前記ヒンジ領域が配列番号４９を含み、前記第１および第２のＦｃ領域が配列番号５０を含む、上記２３または２４に記載のタンパク質。
２８．前記第１および第２のＦｃ領域が、ＣＨ３ヘテロ二量体化変異のセットを含む、上記２３または２４に記載のタンパク質。
２９．前記第１または第２のＦｃ領域のうちの一方が、残基４０７のアラニン、残基３９９のメチオニン、および残基３６０のアスパラギン酸を含むＣＨ３ドメインを含み、前記第１または第２のＦｃ領域の他方が、残基３６６のバリン、残基４０９のバリン、ならびに残基３４５および３４７のアルギニン（ＥＵインデックス番号付けに従って番号付けされた残基）を含むＣＨ３ドメインを含む、上記２８に記載のタンパク質。
３０．前記タンパク質が、可溶性タンパク質である、上記１～２９のいずれかに記載のタンパク質。
３１．前記タンパク質が、
前記Ｃαドメインが１３９位のセリン、１５０位のスレオニン、および１９０位のアラニン（Ｋａｂａｔ番号付けに従って番号付けされた残基）を含むこと、ならびに
前記Ｃβドメインが１３４位のグルタミン酸、１３９位のヒスチジン、１５５位のアスパラギン酸、および１７０位のセリン（Ｋａｂａｔ番号付けに従って番号付けされた残基）を含むこと以外は同じアミノ酸配列を含むタンパク質と比較して、より高いアンフォールディング温度（Ｔｍ）を有する、上記１～３０のいずれかに記載のタンパク質。
３２．前記タンパク質が、
前記Ｃαドメインが１３９位のセリン、１５０位のスレオニン、および１９０位のアラニン（Ｋａｂａｔ番号付けに従って番号付けされた残基）を含むこと、ならびに
前記Ｃβドメインが１３４位のグルタミン酸、１３９位のヒスチジン、１５５位のアスパラギン酸、および１７０位のセリン（Ｋａｂａｔ番号付けに従って番号付けされた残基）を含むこと以外は同じアミノ酸配列を含むタンパク質と比較して、増加した安定性を有する、上記１～３０のいずれかに記載のタンパク質。
３３．前記タンパク質が、同じ条件下で発現される場合、
前記Ｃαドメインが１３９位のセリン、１５０位のスレオニン、および１９０位のアラニン（Ｋａｂａｔ番号付けに従って番号付けされた残基）を含むこと、ならびに
前記Ｃβドメインが１３４位のグルタミン酸、１３９位のヒスチジン、１５５位のアスパラギン酸、および１７０位のセリン（Ｋａｂａｔ番号付けに従って番号付けされた残基）を含むこと以外は同じアミノ酸配列を含むタンパク質と比較して、増加した発現レベルを有する、上記１～３０のいずれかに記載のタンパク質。
３４．前記タンパク質が、
前記Ｃαドメインが１３９位のセリン、１５０位のスレオニン、および１９０位のアラニン（Ｋａｂａｔ番号付けに従って番号付けされた残基）を含むこと、ならびに
前記Ｃβドメインが１３４位のグルタミン酸、１３９位のヒスチジン、１５５位のアスパラギン酸、および１７０位のセリン（Ｋａｂａｔ番号付けに従って番号付けされた残基）を含むこと以外は同じアミノ酸配列を含むタンパク質と比較して、低下したグリコシル化レベルを有する、上記１～３０のいずれかに記載のタンパク質。
３５．（ａ）前記第１のポリペプチドが、ＴＣＲアルファ鎖の膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインをさらに含み、
（ｂ）前記第２のポリペプチドが、ＴＣＲベータ鎖の膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインをさらに含む、上記１～１３のいずれかに記載のタンパク質。
３６．前記タンパク質が、検出可能な標識に連結されている、上記１～３５のいずれかに記載のタンパク質。
３７．前記タンパク質が、治療剤に連結されている、上記１～３６のいずれかに記載のタンパク質。
３８．前記治療剤が、細胞毒性剤、抗炎症剤、または免疫刺激剤である、上記３７に記載のタンパク質。
３９．上記１～３８のいずれかに記載のタンパク質のポリペプチドをコードする核酸。
４０．上記３９に記載の核酸を含む、ベクター。
４１．上記３９に記載の核酸または上記４０に記載のベクターを含む、細胞。
４２．上記１～３８のいずれかに記載のタンパク質、上記３９に記載の核酸、上記４０に記載のベクター、または上記４１に記載の細胞を含む、医薬組成物。
４３．がんまたは感染症の治療を必要とする対象においてそれを行う方法であって、上記１～３８のいずれかに記載のタンパク質、上記３９に記載の核酸、上記４０に記載のベクター、上記４１に記載の細胞、または上記４２に記載の医薬組成物の治療有効量を、前記対象に投与することを含む、方法。
４４．がんまたは感染症の治療に使用するための、上記１～３８のいずれかに記載のタンパク質、上記３９に記載の核酸、上記４０に記載のベクター、上記４１に記載の細胞、または上記４２に記載の医薬組成物。
【0101】
配列表
配列番号１ ＷＴ ＴＣＲα定常ドメイン（Ｃα）
[配列表１]
配列番号２ ＷＴ ＴＣＲβ定常ドメイン（Ｃβ）
[配列表２]
配列番号３ ジスルフィド変異を伴うＷＴ ＴＣＲα定常ドメイン（Ｃα）
[配列表３]
配列番号４ ジスルフィド変異を伴うＷＴ ＴＣＲβ定常ドメイン（Ｃβ）
[配列表４]
配列番号５ ジスルフィドを差し引いた３つの安定化変異を伴うＴＣＲのＣα
ジスルフィド＿Ｓ１３９Ｆ＿Ｔ１５０Ｉ＿Ａ１９０Ｔを差し引いたアルファ定常ドメイン
[配列表５]
配列番号６ ジスルフィド変異を伴う３つの安定化変異を伴うＴＣＲのＣα
ジスルフィド＿Ｓ１３９Ｆ＿Ｔ１５０Ｉ＿Ａ１９０Ｔを伴うアルファ定常ドメイン
[配列表６]
配列番号７ ジスルフィドを差し引いた４つの安定化変異を伴うＴＣＲのＣβ
ベータ定常Ｅ１３４Ｋ＿Ｈ１３９Ｒ＿Ｄ１５５Ｐ＿Ｓ１７０Ｄ
[配列表７]
配列番号８ ジスルフィド変異を伴う４つの安定化変異を伴うＴＣＲのＣβ
ベータ定常Ｅ１３４Ｋ＿Ｈ１３９Ｒ＿Ｄ１５５Ｐ＿Ｓ１７０Ｄ
[配列表８]
配列番号９ ジスルフィドを伴わないＮＹ－ＥＳＯ－１ Ｃα ＷＴ
[配列表９]
配列番号１０ ジスルフィドを伴うＮＹ－ＥＳＯ－１ Ｃα ＷＴ
[配列表１０]
配列番号１１ ジスルフィド＿Ｓ１３９Ｆ＿Ｔ１５０Ｉ＿Ａ１９０Ｔを伴うＮＹ－ＥＳＯ－１ Ｃα
[配列表１１]
配列番号１２ ジスルフィド＿Ｓ１３９Ｆ＿Ｔ１５０Ｉ＿Ａ１９０Ｔを伴わないＮＹ－ＥＳＯ－１ Ｃα
[配列表１２]
配列番号１３ ジスルフィドを伴わないＮＹ－ＥＳＯ－１ Ｃβ ＷＴ
[配列表１３]
配列番号１４ ジスルフィドを伴うＮＹ－ＥＳＯ－１ Ｃβ ＷＴ
[配列表１４]
配列番号１５ ジスルフィド＿Ｅ１３４Ｋ＿Ｈ１３９Ｒ＿Ｄ１５５Ｐ＿Ｓ１７０Ｄを伴うＮＹ－ＥＳＯ－１ Ｃβ
[配列表１５]
配列番号１６ ジスルフィド＿Ｅ１３４Ｋ＿Ｈ１３９Ｒ＿Ｄ１５５Ｐ＿Ｓ１７０Ｄを伴わないＮＹ－ＥＳＯ－１ Ｃβ
[配列表１６]
配列番号１７ ジスルフィドを伴うＣＥ１０ Ｃα ＷＴ
[配列表１７]
配列番号１８ ジスルフィド＿Ｓ１３９Ｆ＿Ｔ１５０Ｉ＿Ａ１９０Ｔを伴うＣＥ１０ Ｃα
[配列表１８]
配列番号１９ ジスルフィドを伴うＣＥ１０ Ｃβ ＷＴ
[配列表１９]
配列番号２０ ジスルフィド＿Ｅ１３４Ｋ＿Ｈ１３９Ｒ＿Ｄ１５５Ｐ＿Ｓ１７０Ｄを伴うＣＥ１０ Ｃβ
[配列表２０]
配列番号２１ ジスルフィドを伴う抗ＮＥＦ１３４－１０ ＨＩＶ ＴＣＲ Ｃα ＷＴ
[配列表２１]
配列番号２２ ジスルフィド＿Ｓ１３９Ｆ＿Ｔ１５０Ｉ＿Ａ１９０Ｔを伴う抗ＮＥＦ１３４－１０ ＨＩＶ ＴＣＲ Ｃα
[配列表２２]
配列番号２３ ジスルフィドを伴う抗ＮＥＦ１３４－１０ ＨＩＶ ＴＣＲ Ｃβ ＷＴ
[配列表２３]
配列番号２４ ジスルフィド＿Ｅ１３４Ｋ＿Ｈ１３９Ｒ＿Ｄ１５５Ｐ＿Ｓ１７０Ｄを伴う抗ＮＥＦ１３４－１０ ＨＩＶ ＴＣＲ Ｃβ
[配列表２４]
配列番号２５ ジスルフィドを伴うＭＡＧＥ－Ａ３ Ｃα ＷＴ
[配列表２５]
配列番号２６ ジスルフィド＿Ｓ１３９Ｆ＿Ｔ１５０Ｉ＿Ａ１９０Ｔを伴うＭＡＧＥ－Ａ３ Ｃα
[配列表２６]
配列番号２７ ジスルフィドを伴うＭＡＧＥ－Ａ３ Ｃβ ＷＴ
[配列表２７]
配列番号２８ ジスルフィド＿Ｅ１３４Ｋ＿Ｈ１３９Ｒ＿Ｄ１５５Ｐ＿Ｓ１７０Ｄを伴うＭＡＧＥ－Ａ３ Ｃβ
[配列表２８]
配列番号２９ ジスルフィドＦｃ７．８．６０Ａを伴うＩｇＧ１ＡＡ＿Ｎ２９７Ｑ ＮＹ－ＥＳＯ－１ＷＴ Ｃα
[配列表２９]
配列番号３０ ジスルフィドおよびＣＨ３ ７．８．６０Ａヘテロダイマー変異を伴うＩｇＧ１ＡＡ＿Ｎ２９７Ｑ ＮＹ－ＥＳＯ－１ Ｃα＿Ｓ１３９Ｆ＿Ｔ１５０Ｉ＿Ａ１９０Ｔ
[配列表３０]
配列番号３１ ７．８．６０Ｂヘテロダイマー変異を伴うＩｇＧ１ＡＡ＿Ｎ２９７Ｑ ＳＰ３４ ｍＶＨ
[配列表３１]
配列番号３２ Ｃｈ ＳＰ３４ ｍＶＬラムダ
[配列表３２]
配列番号３３ ジスルフィド＿（Ｇ４Ｓ）４リンカー＿Ｃｈ ＳＰ３４ｍＶＨタンデムＦＡｂを伴うＮＹ－ＥＳＯ－１ Ｃα＿Ｓ１３９Ｆ＿Ｔ１５０Ｉ＿Ａ１９０Ｔ
[配列表３３]
配列番号３４ ジスルフィド７．８．６０Ａで脱グリコシル化されたＩｇＧ１ＡＡ＿Ｎ２９７Ｑ ＮＹ－ＥＳＯ－１ Ｃα＿Ｓ１３９Ｆ＿Ｔ１５０Ｉ＿Ａ１９０Ｔ
[配列表３４]
配列番号３５ ジスルフィド７．８．６０Ａを伴うＩｇＧ１ＡＡ＿Ｎ２９７Ｑ ＮＹ－ＥＳＯ－１＃１０７ Ｃα＿Ｓ１３９Ｆ＿Ｔ１５０Ｉ＿Ａ１９０Ｔ
[配列表３５]
配列番号３６ ジスルフィド＿Ｅ１３４Ｋ＿Ｈ１３９Ｒ＿Ｄ１５５Ｐ＿Ｓ１７０Ｄを伴うＮＹ－ＥＳＯ－１＃１０７ Ｃβ
[配列表３６]
配列番号３７ ジスルフィド７．８．６０Ａを伴うＩｇＧ１ＡＡ＿Ｎ２９７Ｑ ＮＹ－ＥＳＯ－１＃１１３ Ｃα＿Ｓ１３９Ｆ＿Ｔ１５０Ｉ＿Ａ１９０Ｔ
[配列表３７]
配列番号３８ とジスルフィド＿Ｅ１３４Ｋ＿Ｈ１３９Ｒ＿Ｄ１５５Ｐ＿Ｓ１７０Ｄを伴うＮＹ－ＥＳＯ－１＃１１３ Ｃβ
[配列表３８]
配列番号３９ ジスルフィド＿３ＸＧ４Ｓ＿ＳＰ３４ｍＶＨ ７．８．６０Ｂを伴うＩｇＧ１ＡＡ＿Ｎ２９７Ｑ ＮＹ－ＥＳＯ－１ Ｃα＿Ｓ１３９Ｆ＿Ｔ１５０Ｉ＿Ａ１９０Ｔ
[配列表３９]
配列番号４０ ジスルフィド＿５ＸＧ４Ｓ＿Ｃｈ ＳＰ３４ ｍＶＨタンデムＦＡｂを伴うＮＹ－ＥＳＯ－１ Ｃα＿Ｓ１３９Ｆ＿Ｔ１５０Ｉ＿Ａ１９０Ｔ
[配列表４０]
配列番号４１ （Ｇ４Ｓ）３リンカー
[配列表４１]
配列番号４２ （Ｇ４Ｑ）３リンカー
[配列表４２]
配列番号４３ （Ｇ４Ｓ）４リンカー
[配列表４３]
配列番号４４ （Ｇ４Ｓ）５リンカー
[配列表４４]
配列番号４５ （Ｇ４Ｑ）４リンカー
[配列表４５]
配列番号４６ （Ｇ４Ｑ）５リンカー
[配列表４６]
配列番号４７ ＩｇＧ１ヒンジ領域
[配列表４７]
配列番号４８ Ｌ２３４Ａ＿Ｌ２３５Ａ＿Ｎ２９７Ｑを含むＩｇＧ１Ｆｃ領域
[配列表４８]
配列番号４９ ＩｇＧ４（ＳｔｏＰ）ヒンジ領域
[配列表４９]
配列番号５０ ＩｇＧ４ＡＡ Ｆｃ領域
[配列表５０]
配列番号５１ ヒトＨＰＢ－ＭＬＴ Ｃβ
[配列表５１]
配列番号５２ ヒトＨＰＢ－ＭＬＴ Ｃα
[配列表５２]
配列番号１ ＷＴ ＴＣＲα定常ドメイン（Ｃα）
[配列表１]
配列番号２ ＷＴ ＴＣＲβ定常ドメイン（Ｃβ）
[配列表２]
配列番号３ ジスルフィド変異を伴うＷＴ ＴＣＲα定常ドメイン（Ｃα）
[配列表３]
配列番号４ ジスルフィド変異を伴うＷＴ ＴＣＲβ定常ドメイン（Ｃβ）
[配列表４]
配列番号５ ジスルフィドを差し引いた３つの安定化変異を伴うＴＣＲのＣα
ジスルフィド＿Ｓ１３９Ｆ＿Ｔ１５０Ｉ＿Ａ１９０Ｔを差し引いたアルファ定常ドメイン
[配列表５]
配列番号６ ジスルフィド変異を伴う３つの安定化変異を伴うＴＣＲのＣα
ジスルフィド＿Ｓ１３９Ｆ＿Ｔ１５０Ｉ＿Ａ１９０Ｔを伴うアルファ定常ドメイン
[配列表６]
配列番号７ ジスルフィドを差し引いた４つの安定化変異を伴うＴＣＲのＣβ
ベータ定常Ｅ１３４Ｋ＿Ｈ１３９Ｒ＿Ｄ１５５Ｐ＿Ｓ１７０Ｄ
[配列表７]
配列番号８ ジスルフィド変異を伴う４つの安定化変異を伴うＴＣＲのＣβ
ベータ定常Ｅ１３４Ｋ＿Ｈ１３９Ｒ＿Ｄ１５５Ｐ＿Ｓ１７０Ｄ
[配列表８]
配列番号９ ジスルフィドを伴わないＮＹ－ＥＳＯ－１ Ｃα ＷＴ
[配列表９]
配列番号１０ ジスルフィドを伴うＮＹ－ＥＳＯ－１ Ｃα ＷＴ
[配列表１０]
配列番号１１ ジスルフィド＿Ｓ１３９Ｆ＿Ｔ１５０Ｉ＿Ａ１９０Ｔを伴うＮＹ－ＥＳＯ－１ Ｃα
[配列表１１]
配列番号１２ ジスルフィド＿Ｓ１３９Ｆ＿Ｔ１５０Ｉ＿Ａ１９０Ｔを伴わないＮＹ－ＥＳＯ－１ Ｃα
[配列表１２]
配列番号１３ ジスルフィドを伴わないＮＹ－ＥＳＯ－１ Ｃβ ＷＴ
[配列表１３]
配列番号１４ ジスルフィドを伴うＮＹ－ＥＳＯ－１ Ｃβ ＷＴ
[配列表１４]
配列番号１５ ジスルフィド＿Ｅ１３４Ｋ＿Ｈ１３９Ｒ＿Ｄ１５５Ｐ＿Ｓ１７０Ｄを伴うＮＹ－ＥＳＯ－１ Ｃβ
[配列表１５]
配列番号１６ ジスルフィド＿Ｅ１３４Ｋ＿Ｈ１３９Ｒ＿Ｄ１５５Ｐ＿Ｓ１７０Ｄを伴わないＮＹ－ＥＳＯ－１ Ｃβ
[配列表１６]
配列番号１７ ジスルフィドを伴うＣＥ１０ Ｃα ＷＴ
[配列表１７]
配列番号１８ ジスルフィド＿Ｓ１３９Ｆ＿Ｔ１５０Ｉ＿Ａ１９０Ｔを伴うＣＥ１０ Ｃα
[配列表１８]
配列番号１９ ジスルフィドを伴うＣＥ１０ Ｃβ ＷＴ
[配列表１９]
配列番号２０ ジスルフィド＿Ｅ１３４Ｋ＿Ｈ１３９Ｒ＿Ｄ１５５Ｐ＿Ｓ１７０Ｄを伴うＣＥ１０ Ｃβ
[配列表２０]
配列番号２１ ジスルフィドを伴う抗ＮＥＦ１３４－１０ ＨＩＶ ＴＣＲ Ｃα ＷＴ
[配列表２１]
配列番号２２ ジスルフィド＿Ｓ１３９Ｆ＿Ｔ１５０Ｉ＿Ａ１９０Ｔを伴う抗ＮＥＦ１３４－１０ ＨＩＶ ＴＣＲ Ｃα
[配列表２２]
配列番号２３ ジスルフィドを伴う抗ＮＥＦ１３４－１０ ＨＩＶ ＴＣＲ Ｃβ ＷＴ
[配列表２３]
配列番号２４ ジスルフィド＿Ｅ１３４Ｋ＿Ｈ１３９Ｒ＿Ｄ１５５Ｐ＿Ｓ１７０Ｄを伴う抗ＮＥＦ１３４－１０ ＨＩＶ ＴＣＲ Ｃβ
[配列表２４]
配列番号２５ ジスルフィドを伴うＭＡＧＥ－Ａ３ Ｃα ＷＴ
[配列表２５]
配列番号２６ ジスルフィド＿Ｓ１３９Ｆ＿Ｔ１５０Ｉ＿Ａ１９０Ｔを伴うＭＡＧＥ－Ａ３ Ｃα
[配列表２６]
配列番号２７ ジスルフィドを伴うＭＡＧＥ－Ａ３ Ｃβ ＷＴ
[配列表２７]
配列番号２８ ジスルフィド＿Ｅ１３４Ｋ＿Ｈ１３９Ｒ＿Ｄ１５５Ｐ＿Ｓ１７０Ｄを伴うＭＡＧＥ－Ａ３ Ｃβ
[配列表２８]
配列番号２９ ジスルフィドＦｃ７．８．６０Ａを伴うＩｇＧ１ＡＡ＿Ｎ２９７Ｑ ＮＹ－ＥＳＯ－１ＷＴ Ｃα
[配列表２９]
配列番号３０ ジスルフィドおよびＣＨ３ ７．８．６０Ａヘテロダイマー変異を伴うＩｇＧ１ＡＡ＿Ｎ２９７Ｑ ＮＹ－ＥＳＯ－１ Ｃα＿Ｓ１３９Ｆ＿Ｔ１５０Ｉ＿Ａ１９０Ｔ
[配列表３０]
配列番号３１ ７．８．６０Ｂヘテロダイマー変異を伴うＩｇＧ１ＡＡ＿Ｎ２９７Ｑ ＳＰ３４ ｍＶＨ
[配列表３１]
配列番号３２ Ｃｈ ＳＰ３４ ｍＶＬラムダ
[配列表３２]
配列番号３３ ジスルフィド＿（Ｇ４Ｓ）４リンカー＿Ｃｈ ＳＰ３４ｍＶＨタンデムＦＡｂを伴うＮＹ－ＥＳＯ－１ Ｃα＿Ｓ１３９Ｆ＿Ｔ１５０Ｉ＿Ａ１９０Ｔ
[配列表３３]
配列番号３４ ジスルフィド７．８．６０Ａで脱グリコシル化されたＩｇＧ１ＡＡ＿Ｎ２９７Ｑ ＮＹ－ＥＳＯ－１ Ｃα＿Ｓ１３９Ｆ＿Ｔ１５０Ｉ＿Ａ１９０Ｔ
[配列表３４]
配列番号３５ ジスルフィド７．８．６０Ａを伴うＩｇＧ１ＡＡ＿Ｎ２９７Ｑ ＮＹ－ＥＳＯ－１＃１０７ Ｃα＿Ｓ１３９Ｆ＿Ｔ１５０Ｉ＿Ａ１９０Ｔ
[配列表３５]
配列番号３６ ジスルフィド＿Ｅ１３４Ｋ＿Ｈ１３９Ｒ＿Ｄ１５５Ｐ＿Ｓ１７０Ｄを伴うＮＹ－ＥＳＯ－１＃１０７ Ｃβ
[配列表３６]
配列番号３７ ジスルフィド７．８．６０Ａを伴うＩｇＧ１ＡＡ＿Ｎ２９７Ｑ ＮＹ－ＥＳＯ－１＃１１３ Ｃα＿Ｓ１３９Ｆ＿Ｔ１５０Ｉ＿Ａ１９０Ｔ
[配列表３７]
配列番号３８ とジスルフィド＿Ｅ１３４Ｋ＿Ｈ１３９Ｒ＿Ｄ１５５Ｐ＿Ｓ１７０Ｄを伴うＮＹ－ＥＳＯ－１＃１１３ Ｃβ
[配列表３８]
配列番号３９ ジスルフィド＿３ＸＧ４Ｓ＿ＳＰ３４ｍＶＨ ７．８．６０Ｂを伴うＩｇＧ１ＡＡ＿Ｎ２９７Ｑ ＮＹ－ＥＳＯ－１ Ｃα＿Ｓ１３９Ｆ＿Ｔ１５０Ｉ＿Ａ１９０Ｔ
[配列表３９]
配列番号４０ ジスルフィド＿５ＸＧ４Ｓ＿Ｃｈ ＳＰ３４ ｍＶＨタンデムＦＡｂを伴うＮＹ－ＥＳＯ－１ Ｃα＿Ｓ１３９Ｆ＿Ｔ１５０Ｉ＿Ａ１９０Ｔ
[配列表４０]
配列番号４１ （Ｇ４Ｓ）３リンカー
[配列表４１]
配列番号４２ （Ｇ４Ｑ）３リンカー
[配列表４２]
配列番号４３ （Ｇ４Ｓ）４リンカー
[配列表４３]
配列番号４４ （Ｇ４Ｓ）５リンカー
[配列表４４]
配列番号４５ （Ｇ４Ｑ）４リンカー
[配列表４５]
配列番号４６ （Ｇ４Ｑ）５リンカー
[配列表４６]
配列番号４７ ＩｇＧ１ヒンジ領域
[配列表４７]
配列番号４８ Ｌ２３４Ａ＿Ｌ２３５Ａ＿Ｎ２９７Ｑを含むＩｇＧ１Ｆｃ領域
[配列表４８]
配列番号４９ ＩｇＧ４（ＳｔｏＰ）ヒンジ領域
[配列表４９]
配列番号５０ ＩｇＧ４ＡＡ Ｆｃ領域
[配列表５０]
配列番号５１ ヒトＨＰＢ－ＭＬＴ Ｃβ
[配列表５１]
配列番号５２ ヒトＨＰＢ－ＭＬＴ Ｃα
[配列表５２]
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図1D】
【図2】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図4D】
【図4E】
【図4F】
【図4G】
【図5A-C】
【図5D】
【図5E】
【図6A】
【図6B】
【図6C】
【図6D】
【図6E】
【図7A】
【図7B】
【配列表】