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特許7484028ＡＳＭタンパク質に特異的に結合する抗体を有効成分として含む脳疾患治療用医薬組成物
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B1)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-05-07
(45)【発行日】2024-05-15
(54)【発明の名称】ＡＳＭタンパク質に特異的に結合する抗体を有効成分として含む脳疾患治療用医薬組成物
(51)【国際特許分類】
A61K 39/395 20060101AFI20240508BHJP
A61P 25/28 20060101ALI20240508BHJP
C07K 16/40 20060101ALI20240508BHJP
A23L 35/00 20160101ALI20240508BHJP
【ＦＩ】
A61K39/395 P
A61P25/28
C07K16/40 ZNA
A23L35/00
【請求項の数】
6
(21)【出願番号】P 2023572865
(86)(22)【出願日】2022-05-26
(86)【国際出願番号】 KR2022007485
(87)【国際公開番号】W WO2022250470
(87)【国際公開日】2022-12-01
【審査請求日】2023-12-19
(31)【優先権主張番号】10-2021-0068628
(32)【優先日】2021-05-27
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(31)【優先権主張番号】10-2022-0057049
(32)【優先日】2022-05-10
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
【早期審査対象出願】
(73)【特許権者】
【識別番号】518148227
【氏名又は名称】アイエスユー アブクシス カンパニー，リミティッド
(73)【特許権者】
【識別番号】521026585
【氏名又は名称】キョンブク ナショナル ユニヴァーシティ インダストリー－アカデミック コオペレーション ファウンデーション
(74)【代理人】
【識別番号】110000729
【氏名又は名称】弁理士法人ユニアス国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】ホン、スン ボム
(72)【発明者】
【氏名】ペ、ジェ ソン
(72)【発明者】
【氏名】チン、ヒ ギョン
【審査官】藤山 純
(56)【参考文献】
【文献】米国特許出願公開第２０２０／０２５５８３９（ＵＳ，Ａ１）
【文献】米国特許出願公開第２０１６／０１０１０７０（ＵＳ，Ａ１）
【文献】PARK, M. H. et al.，Potential therapeutic target for aging and age-related neurodegenerative disease: the role of acid sphingomyelinase，Exp Mol Med，52，2020年03月13日，pp.380-389
【文献】ROUSSON, R et al.，Preparation of an anti-acid sphingomyelinase monoclonal antibody for the the quantitative determination and polypeptide analysis of lysosomal sphingomyelinase in fibroblasts from normal and Niemann-Pick type A patients，J Immunol Methods，160(2)，1993年04月02日，pp.199-206
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ ３９／３９５
Ａ６１Ｐ ２５／２８
Ｃ０７Ｋ １６／４０
Ａ２３Ｌ ３５／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ
ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＡＳＭ（ａｃｉｄ ｓｐｈｉｎｇｏｍｙｅｌｉｎａｓｅ）タンパク質に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片を有効成分として含み、
前記抗体または前記抗原結合断片が、
配列番号３１、３２、及び３３でそれぞれ示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに、
それぞれ配列番号４９、５０、及び５１でそれぞれ示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
を含む、アルツハイマー病の予防又は治療用の医薬組成物。
【請求項2】
前記ＡＳＭタンパク質は、哺乳動物に由来するものである、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項3】
前記ＡＳＭタンパク質は、配列番号６６又は６７で示されるアミノ酸配列で構成されるポリペプチドである、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項4】
ＡＳＭタンパク質に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片を有効成分として含み、前記抗体または前記抗原結合断片が、
それぞれ配列番号３１、３２、及び３３でそれぞれ示されるアミノ酸配列で構成される重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに、
それぞれ配列番号４９、５０、及び５１でそれぞれ示されるアミノ酸配列で構成される軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
を含む、アルツハイマー病の予防又は改善用の保健機能食品。
【請求項5】
脳疾患を治療するための医薬組成物の製造に使用するためのＡＳＭタンパク質に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片であって、
前記抗体またはその抗原結合断片が、
それぞれ配列番号３１、３２、及び３３でそれぞれ示されるアミノ酸配列で構成される重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに、
それぞれ配列番号４９、５０、及び５１でそれぞれ示されるアミノ酸配列で構成される軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、を含み、
前記脳疾患が、アルツハイマー病である、
抗体又はその抗原結合断片。
【請求項6】
脳疾患を改善するための保健機能食品の製造に使用するためのＡＳＭタンパク質に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片であって、
抗体または抗原結合断片が、
それぞれ配列番号３１、３２、及び３３でそれぞれ示されるアミノ酸配列で構成される重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに、
それぞれ配列番号４９、５０、及び５１でそれぞれ示されるアミノ酸配列で構成される軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、を含み、
前記脳疾患が、アルツハイマー病である、
抗体又はその抗原結合断片。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ＡＳＭ（ａｃｉｄ ｓｐｈｉｎｇｏｍｙｅｌｉｎａｓｅ）タンパク質に特異的に結合する抗体の用途に関する。
【背景技術】
【0002】
スフィンゴ脂質代謝は、正常な細胞のシグナル伝達を調節し、スフィンゴ脂質代謝の異常な変化は、アルツハイマー病を含む種々の神経変性疾患に影響を及ぼす。スフィンゴ脂質代謝を調節する酵素であるＡＳＭ（ａｃｉｄ ｓｐｈｉｎｇｏｍｙｅｌｉｎａｓｅ）タンパク質は、ほぼ全種類の細胞で発現されるタンパク質であり、スフィンゴ脂質代謝及び細胞膜のターンオーバー（ｔｕｒｎｏｖｅｒ）に重要な役割をする。
【0003】
アルツハイマー病のような神経変性疾患者の脳では、健常者に比べてＡＳＭタンパク質の活性が著しく増加されている。これと関連して、韓国特許登録第１０－１５２１１１７号には、過剰発現したＡＳＭタンパク質の活性を阻害したり、ＡＳＭタンパク質への発現を抑制することで、βアミロイドの蓄積が抑制され、学習能力や記憶力が改善され、神経変性疾患を治療できることが開示されている。また、近年、うつ病のような神経疾患においてもＡＳＭタンパク質の活性が増加されており、上記ＡＳＭタンパク質の発現又は活性を抑制することでうつ病を改善する効果があることが知られている。
【0004】
しかし、ＡＳＭタンパク質の発現又は活性を直接抑制する物質は開発されておらず、但し、ＡＳＭタンパク質の発現を間接的に抑制する数種類の抑制剤が同定されている。例えば、うつ病の治療に使用されている三環系抗うつ剤（ｔｒｉｃｙｃｌｉｃ ａｎｔｉｄｅｐｒｅｓｓａｎｔ）があり、これには、アミトリプチリン（ａｍｉｔｒｉｐｔｙｌｉｎｅ）、デシプラミン（ｄｅｓｉｐｒａｍｉｎｅ）、ミプラミン（ｍｉｐｒａｍｉｎｅ）などが含まれている。このような三環系抗うつ剤は、ＡＳＭタンパク質阻害剤として開発されたものではないが、種々の研究の結果から、ＡＳＭタンパク質阻害の効果を示すことが証明されている。三環系抗うつ剤の主な薬理機転は、神経細胞における神経伝達物質の再吸収を抑制し、これらの活性を増加させることであり、ＡＳＭ抑制剤としての作用は付随的な作用であると確認されている。しかし、三環系抗うつ剤は、神経系及び神経細胞に作用してカスミ目、光感受性増加、嘔吐などの副作用を誘発することがある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
本発明の目的は、ＡＳＭタンパク質に特異的に結合する抗体の用途を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0006】
上記のような目的を達成するため、本発明は、ＡＳＭ（ａｃｉｄ ｓｐｈｉｎｇｏｍｙｅｌｉｎａｓｅ）タンパク質に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片を有効成分として含む、脳疾患の予防又は治療用の医薬組成物を提供する。
【0007】
また、本発明は、ＡＳＭタンパク質に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片を有効成分として含む、脳疾患の予防又は改善用の保健機能食品を提供する。
【0008】
また、本発明は、ＡＳＭタンパク質に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片を個体に投与するステップを含む、脳疾患の予防、改善又は治療方法を提供する。
【0009】
さらに、本発明は、脳疾患の予防、改善又は治療のための薬剤の製造に使用するためのＡＳＭタンパク質に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片の用途を提供する。
【発明の効果】
【0010】
本発明に係る抗体又はその抗原結合断片は、ＡＳＭタンパク質に特異的に高結合力で結合し、細胞膜に存在するＡＳＭタンパク質の活性を有意に抑制することで、アルツハイマー病の動物モデルにおいて、毒性を示さず、かつ認知記憶力改善効果、ＡＳＭタンパク質活性抑制効果、アミロイドβ及びタウタンパク質蓄積抑制効果、及び神経炎症抑制効果を奏し、脳疾患の治療に有用に使用できる。
【図面の簡単な説明】
【0011】
【図1】本発明の一実施例で製造された抗体の重鎖及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列を示す模式図である。
【図2】本発明の一実施例で製造された抗体のＡＳＭタンパク質との結合をＥＬＩＳＡ分析方法で確認した結果を示すグラフである。
【図3】本発明の一実施例で製造された抗体が結合する抗原結合部位をＡＳＭタンパク質構造のモデルに表示した模式図である。
【図4】本発明の一実施例で製造された抗体によるＡＳＭタンパク質サポシン（ｓａｐｏｓｉｎ）ドメインにおける重水素置換のヒートマップの結果を示す図である。
【図5】本発明の一実施例で製造された抗体の、アルツハイマー病患者の細胞膜に位置するＡＳＭタンパク質の活性抑制を確認した結果を示すグラフである。
【図6】本発明の一実施例で製造された抗体がアルツハイマー病患者の細胞膜に位置するＡＳＭタンパク質の活性を濃度依存的に抑制することを確認した結果を示すグラフである。
【図7】本発明の一実施例で製造された抗体の、アルツハイマー病患者の細胞膜でのスフィンゴミエリン代謝の変化を確認した結果を示すグラフである。
【図8】本発明の一実施例で製造された抗体をアルツハイマー病の動物モデルに投与することを示す模式図である。
【図9】本発明の一実施例で製造された抗体を投与したアルツハイマー病の動物モデルの水迷路実験を行った結果を示すグラフである。
【図10】本発明の一実施例で製造された抗体を投与したアルツハイマー病の動物モデルの水泳経路を確認した結果を示す図である。
【図11】本発明の一実施例で製造された抗体を投与したアルツハイマー病の動物モデルが標的（Ａ０）又は非標的（Ａ１、Ａ２、Ａ３）の四分面上に留まる時間を確認した結果を示すグラフである。
【図12】本発明の一実施例で製造された抗体を投与したアルツハイマー病の動物モデルの水泳距離（Ａ）、水泳速度（Ｂ）及びプラットフォームがあった位置を通る回数（Ｃ）を確認した結果を示すグラフである。
【図13】本発明の一実施例で製造された抗体を投与したアルツハイマー病の動物モデルの文脈（Ａ）又は雰囲気（Ｂ）による恐怖条件付けテストを行った結果を示すグラフである。
【図14】本発明の一実施例で製造された抗体を投与したアルツハイマー病の動物モデルの血液プラズマにおけるＡＳＭの活性抑制を確認した結果を示すグラフである。
【図15】本発明の一実施例で製造された抗体を投与したアルツハイマー病の動物モデルの血液プラズマにおけるＡＳＭタンパク質のレベルを確認した結果を示すグラフである。
【図16】本発明の一実施例で製造された抗体を投与したアルツハイマー病の動物モデルの脳皮質又は海馬において高密度（ｄｅｎｓｅ－ｃｏｒｅ）アミロイドβプラークの発現を確認した結果を示す図である。
【図17】本発明の一実施例で製造された抗体を投与したアルツハイマー病の動物モデルの脳皮質又は海馬において高密度及び拡散型（ｄｉｆｆｕｓｅ）アミロイドβプラークの発現を確認した結果を示す図である。
【図18】本発明の一実施例で製造された抗体を投与したアルツハイマー病の動物モデルの脳皮質又は海馬においてアミロイドβ４０又はアミロイドβ４２の発現を確認した結果を示すグラフである。
【図19】本発明の一実施例で製造された抗体を投与したアルツハイマー病の動物モデルの脳皮質又は海馬においてタウタンパク質の発現を確認した結果を示す図である。
【図20】本発明の一実施例で製造された抗体を投与したアルツハイマー病の動物モデルの脳皮質又は海馬においてｌｂａ－１タンパク質の発現を確認した結果を示す図である。
【図21】本発明の一実施例で製造された抗体を投与したアルツハイマー病の動物モデルの脳皮質又は海馬においてＧＦＡＰタンパク質の発現を確認した結果を示す図である。
【図22】本発明の一実施例で製造された抗体を投与したアルツハイマー病の動物モデルの生存率（Ａ）及び体重変化（Ｂ）を確認した結果を示すグラフである。
【図23】本発明の一実施例で製造された抗体を投与したアルツハイマー病の動物モデルの臓器の毒性を確認した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0012】
以下、本発明について詳述する。
【0013】
本発明は、ＡＳＭ（ａｃｉｄ ｓｐｈｉｎｇｏｍｙｅｌｉｎａｓｅ）タンパク質に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片を有効成分として含む、脳疾患の予防又は治療用の医薬組成物を提供する。
【0014】
本明細書中の用語「ＡＳＭ（ａｃｉｄ ｓｐｈｉｎｇｏｍｙｅｌｉｎａｓｅ）タンパク質」とは、スフィンゴ脂質代謝を調節するＳＭａｓｅ（ｓｐｈｉｎｇｏｍｙｅｌｉｎａｓｅ）ファミリー中の一つである酵素を意味する。 上記ＡＳＭタンパク質は、スフィンゴミエリン（ｓｐｈｉｎｇｏｍｙｅｌｉｎ）をセラミド（ｃｅｒａｍｉｄｅ）及びホスホリルコリン（ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）に分解する過程を触媒し、最適な酵素活性を示すｐＨによって、アルカリ性、中性又は酸性に区分することができる。
【0015】
上記ＡＳＭタンパク質は、当該技術分野で周知のあらゆる種類のＡＳＭタンパク質を含むことができる。具体的には、上記ＡＳＭタンパク質は、哺乳動物に由来するものであり、より具体的には、人間、猿、ラット又はマウスに由来するものであり得る。また、上記ＡＳＭタンパク質は、当該技術分野においてＡＳＭタンパク質として知られた全てのアミノ酸配列を含むことができる。一例として、上記ＡＳＭタンパク質は、配列番号６６及び６７でそれぞれ示されるアミノ酸配列で構成されるポリペプチド、又はこれを暗号化する核酸であり得る。
【0016】
上記ＡＳＭタンパク質は、これと同一又は相応する生物学的活性を維持する限り、配列番号６６又は６７で示されるアミノ酸配列から一つ又はそれ以上のアミノ酸が付加、欠失又は置換されたものであってもよい。なお、アミノ酸の置換は、全タンパク質の電荷、即ち、極性又は疎水性への影響がないか影響が少ない範囲内で行われる保存的置換であってもよい。また、上記ＡＳＭタンパク質は、配列番号６６及び６７でそれぞれ示されるアミノ酸配列と、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上又は９９％以上の相同性を有することができる。また、上記ＡＳＭタンパク質は、これと同一又は相応する生物学的活性を維持する限り、ＡＳＭタンパク質の一部のみが含まれてもよい。
【0017】
本明細書中の用語「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）」とは、抗原と結合して抗原の作用を阻害したり抗原を除去したりする免疫タンパク質を意味する。上記抗体は、当該技術分野におけるあらゆる種類の抗体を含むことができる。具体的には、上記抗体は、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、及びＩｇＥを含むことができ、これらは、それぞれ、重鎖定常領域を暗号化する遺伝子である、μ、δ、γ、α、及びεからなる重鎖を含むことができる。抗体技術では、通常、主にＩｇＧが使用されるが、これは、また、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４の同種（ｉｓｏｔｙｐｅ）から構成され、これらのそれぞれの構造及び機能的特性は相違し得る。上記抗体は、非ヒト抗体に由来する最小の配列を含むヒト化抗体、ヒトに由来する配列で構成されたヒト抗体、又は異種由来の配列が混合されたキメラ抗体を全て含むことができる。
【0018】
上記ＩｇＧは、約５０ｋＤａの重鎖（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ）タンパク質２個と、約２５ｋＤａの軽鎖（ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ）タンパク質２個とからなるＹ字状の非常に安定した構造（約１５９ｋＤａ）を形成することができる。抗体を構成する軽鎖及び重鎖は、抗体間でアミノ酸配列が異なる可変領域（ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ）、及びアミノ酸配列が同一である定常領域（ｃｏｎｓｔａｎｔ ｒｅｇｉｏｎ）に分けられる。このとき、重鎖定常領域は、ＣＨ１、ヒンジ（ｈｉｎｇｅ、Ｈ）、ＣＨ２、及びＣＨ３ドメインを含み、各ドメインは、二つのβシート（β－ｓｈｅｅｔ）で構成され、分子内のジスルフィド結合（ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｂｏｎｄ）で連結され得る。また、軽鎖定常領域は、ＣＬドメインを含むことができる。なお、重鎖及び経鎖可変領域２つが合わさって抗原結合部位（ａｎｔｉｇｅｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ）が形成され、上記抗原結合部位は、Ｙ字型の２つの腕にそれぞれ１つずつ存在することができる。全長抗体において、抗原と結合できる領域をＦａｂ（ａｎｔｉｂｏｄｙ ｂｉｎｄｉｎｇ ｆｒａｇｍｅｎｔ）と、抗原と結合できない領域をＦｃ（ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ）と呼び、Ｆａｂ及びＦｃは、ヒンジを介して連結され得る。本発明の一実施例において、上記ＩｇＧは、マウス由来のＩｇＧであり、具体的には、配列番号７４で示されるアミノ酸配列で構成されるマウスのＩｇＧ重鎖定常領域、及び配列番号７６で示されるアミノ酸配列で構成されるマウスの軽鎖λ定常領域を含むことができる。また、上記マウス由来のＩｇＧは、配列番号７５で示される塩基配列で構成されるマウスのＩｇＧ重鎖定常領域、及び配列番号７７で示される塩基配列で構成されるマウスの軽鎖λ定常領域を含むことができる。
【0019】
本発明に係る抗体は、全長抗体だけでなく、その抗原結合断片を含むことができる。具体的には、上記抗原結合断片は、抗原との結合刺激を細胞や補体などに伝達する機能をするＦｃを除いた部分を意味することができる。一例として、抗体の抗原結合断片は、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ）２及びＦｖを含み、シングルドメイン抗体（ｓｉｎｇｌｅ ｄｏｍａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ）やミニボディー（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）などのような第３世代の抗体切片を含んでもよい。
【0020】
本発明の一側面において、上記抗体又は抗原結合断片は、ＡＳＭタンパク質のＮ末端から５３～７２番目のアミノ酸断片、１０１～１２３番目のアミノ酸断片、１３５～１５９番目のアミノ酸断片、１３５～１５５番目のアミノ酸断片、２１８～２２８番目のアミノ酸断片、及び２５９～２６９番目のアミノ酸断片からなる群から選択されるいずれか一つ以上のエピトープに結合することができる。このとき、上記ＡＳＭタンパク質は、上述のような特徴を有することができる。 本発明の一実施例において、上記ＡＳＭタンパク質のＮ末端から５３～７２番目のアミノ酸断片は、配列番号６８（TAINLGLKKEPNVARVGSVA）で示されるアミノ酸配列で構成されるポリペプチドであり、１０１～１２３番目のアミノ酸断片は、配列番号６９（VWRRSVLSPSEACGLLLGSTCGH）で示されるアミノ酸配列で構成されるポリペプチドであり、１３５～１５９番目のアミノ酸断片は、配列番号７０（PTVPKPPPKPPSPPAPGAPVSRILF）で示されるアミノ酸配列で構成されるポリペプチドであり、１３５～１５５番目のアミノ酸断片は、配列番号７１（PTVPKPPPKPPSPPAPGAPVS）で示されるポリペプチドであり、２１８～２２８番目のアミノ酸断片は、配列番号７２（SGLGPAGPFDM）で示されるアミノ酸配列で構成されるポリペプチドであり、２５９～２６９番目のアミノ酸断片は、配列番号７３（VRKFLGPVPVY）で示されるアミノ酸配列で構成されるポリペプチドであり得る。即ち、本発明の他の側面において、上記抗体又は抗原結合断片は、配列番号６８～７３でそれぞれ示されるポリペプチドからなる群から選択されるいずれか一つ以上のエピトープに結合することができる。
上記「エピトープ（ｅｐｉｔｏｐｅ）」とは、抗体が識別し得る抗原の特定部位のことであり、抗体が特異的に結合できる抗原決定基を意味する。上記エピトープは、抗原決定部位（ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ、ａｎｔｉｇｅｎｉｃ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ）と同じ意味で通用されている。上記エピトープは、化学的に活性を持つ表面分子群、例えば、アミノ酸又は糖側鎖で構成され、一般的に、特定の３次元の構造的特徴だけでなく、特定の電荷特性を有している。
上記「エピトープ（ｅｐｉｔｏｐｅ）」とは、抗体が識別し得る抗原の特定部位のことであり、抗体が特異的に結合できる抗原決定基を意味する。上記エピトープは、抗原決定部位（ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ、ａｎｔｉｇｅｎｉｃ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ）と同じ意味で通用されている。上記エピトープは、化学的に活性を持つ表面分子群、例えば、アミノ酸又は糖側鎖で構成され、一般的に、特定の３次元の構造的特徴だけでなく、特定の電荷特性を有している。
【0021】
本発明の一側面において、上記抗体又はその抗原結合断片は、配列番号６１で示されるアミノ酸配列で構成される重鎖ＣＤＲ１（Ｘ１ＹＸ２ＭＳ）、配列番号６２で示されるアミノ酸配列で構成される重鎖ＣＤＲ２（Ｘ３ＩＸ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０ＹＹＡＤＳＶＫＧ）、及び配列番号２７、３０、３３、３６、３９及び４２でそれぞれ示されるアミノ酸配列からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号６３で示されるアミノ酸配列で構成される軽鎖ＣＤＲ１（X１１ＧＳＳＳＮＩＧＸ１２ＮＸ１３ＶＸ１４）、配列番号６４で示されるアミノ酸配列で構成される軽鎖ＣＤＲ２（Ｘ１５Ｘ１６Ｘ１７Ｘ１８ＲＰＳ）、及び配列番号６５で示されるアミノ酸配列で構成される軽鎖ＣＤＲ３（Ｘ１９Ｘ２０ＷＤＸ２１ＳＬＸ２２Ｘ２３ＹＶ）を含む軽鎖可変領域を含むことができる。
【0022】
上記「ＣＤＲ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ）」とは、抗体の重鎖及び軽鎖可変領域内に抗体ごとに異なるアミノ酸配列を有する部位である超可変領域（ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ）であり、実際に抗原と結合する部位を意味する。抗体の立体構造において、ＣＤＲは、環状（ｌｏｏｐ）で抗体の表面に位置し、環の下にはこれを構造的に支持するＦＲ（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｇｉｏｎ）が存在することができる。重鎖及び軽鎖は、それぞれ３つずつ環構造が存在し、これら６つの環構造が合わさって抗原に直接接触することができる。 上記６つの環構造を有する抗原結合部位であるＣＤＲを、それぞれ、便宜上、重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２、重鎖ＣＤＲ３、軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２、軽鎖ＣＤＲ３と指称する。
【0023】
一例として、上記配列番号６１で示されるアミノ酸配列で構成される重鎖ＣＤＲ１（Ｘ１ＹＸ２ＭＳ）中、Ｘ１及びＸ２は、それぞれ、酸性及び中性アミノ酸から選択され得る。具体的には、上記Ｘ１は、酸性又は中性アミノ酸であり、Ｘ２は、中性アミノ酸であり得る。 例えば、上記Ｘ１及びＸ２は、それぞれ、アスパラギン（ａｓｐａｒａｇｉｎｅ、Ａｓｎ）、グリシン（ｇｌｙｃｉｎｅ、Ｇｌｙ）、セリン（ｓｅｒｉｎｅ、Ｓｅｒ）、アスパラギン酸（ａｓｐａｒｔｉｃ ａｃｄ、Ａｓｐ）、アラニン（ａｌａｎｉｎｅ、Ａｌａ）、及びチロシン（ｔｙｒｏｓｉｎｅ、Ｔｙｒ）からなる群から選択され得る。具体的には、上記Ｘ１は、アスパラギン、グリシン、セリン又はアスパラギン酸であり、Ｘ２は、アラニン又はチロシンであり得る。本発明の一実施例において、上記重鎖ＣＤＲ１は、配列番号２５、２８、３１、３４、３７又は４０で示されるアミノ酸配列で構成され得る。
【0024】
また、上記配列番号６２で示されるアミノ酸配列で構成される重鎖ＣＤＲ２（Ｘ３ＩＸ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０ＹＹＡＤＳＶＫＧ）中、Ｘ３～Ｘ１０は、それぞれ中性及び塩基性アミノ酸から選択され得る。具体的には、上記Ｘ３及びＸ４～Ｘ９は、それぞれ中性アミノ酸であり、Ｘ１０は、中性又は塩基性アミノ酸であり得る。例えば、上記Ｘ３～Ｘ１0は、それぞれ、グリシン、ロイシン（ｌｅｕｃｉｎｅ、Ｌｅｕ）、アラニン、セリン、チロシン、プロリン（ｐｒｏｌｉｎｅ、Ｐｒｏ）、アスパラギン、リシン（ｌｙｓｉｎｅ、Ｌｙｓ）及びイソロイシン（ｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅ、Ｉｌｅ）からなる群から選択され得る。具体的には、上記Ｘ３は、グリシン、ロイシン、アラニン又はセリンであり、Ｘ４は、チロシン又はセリンであり、Ｘ５は、プロリン又はチロシンであり、Ｘ６は、アスパラギン又はグリシンであり、Ｘ７及びＸ８は、それぞれ、グリシン又はセリンであり、Ｘ９は、アスパラギン又はセリンであり、Ｘ１０は、リシン又はイソロイシンであり得る。本発明の一実施例において、上記重鎖ＣＤＲ２は、配列番号２６、２９、３２、３５、３８又は４１で示されるアミノ酸配列で構成され得る。
【0025】
また、上記配列番号６３で示されるアミノ酸配列で構成される軽鎖ＣＤＲ１（X１１ＧＳＳＳＮＩＧＸ１２ＮＸ１３ＶＸ１４）中、Ｘ１１～Ｘ１４は、それぞれ、中性アミノ酸から選択され得る。例えば、上記Ｘ１１～Ｘ１４は、それぞれ、トレオニン（ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ、Ｔｈｒ）、セリン、アスパラギン、アラニン、プロリン、及びチロシンからなる群から選択され得る。具体的には、上記Ｘ１１は、トレオニン又はセリンであり、Ｘ１２は、アスパラギン又はセリンであり、Ｘ１３は、アラニン、プロリン、トレオニン又はチロシンであり、Ｘ１４は、アスパラギン、チロシン又はセリンであり得る。 本発明の一実施例において、上記軽鎖ＣＤＲ１は、配列番号４３、４６、４９、５２、５５又は５８で示されるアミノ酸配列で構成され得る。
【0026】
また、上記配列番号６４で示されるアミノ酸配列で構成される軽鎖ＣＤＲ２（Ｘ１５Ｘ１６Ｘ１７Ｘ１８ＲＰＳ）中、Ｘ１５～Ｘ１８は、それぞれ、酸性、塩基性及び中性アミノ酸から選択され得る。具体的には、上記Ｘ１５及びＸ１６は、それぞれ、酸性又は中性アミノ酸であり、Ｘ１７は、中性アミノ酸であり、Ｘ１８は、塩基性又は中性アミノ酸であり得る。例えば、上記Ｘ１５～Ｘ１８は、それぞれ、チロシン、アラニン、アスパラギン酸、セリン、アスパラギン、ヒスチジン（ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ、Ｈｉｓ）、グルタミン（ｇｌｕｔａｍｉｎｅ、Ｇｌｎ）、及びリシンからなる群から選択され得る。具体的には、Ｘ１５は、チロシン、アラニン、アスパラギン酸又はセリンであり、Ｘ１６は、アスパラギン酸又はアスパラギンであり、Ｘ１７は、セリン又はアスパラギンであり、Ｘ１８は、ヒスチジン、グルタミン又はリシンであり得る。本発明の一実施例において、上記軽鎖ＣＤＲ２は、配列番号４４、４７、５０，５３、５６又は５９で示されるアミノ酸配列で構成され得る。
【0027】
また、上記配列番号６５で示されるアミノ酸配列で構成される軽鎖ＣＤＲ３（Ｘ１９Ｘ２０ＷＤＸ２１ＳＬＸ２２Ｘ２３ＹＶ）中、Ｘ１９～Ｘ２３は、それぞれ、中性アミノ酸から選択され得る。例えば、上記Ｘ１９～Ｘ２３は、グリシン、アラニン、セリン、トレオニン、チロシン、アスパラギン酸及びアスパラギンからなる群から選択され得る。具体的には、Ｘ１９は、グリシン又はアラニンであり、Ｘ２０は、アラニン、セリン又はトレオニンであり、Ｘ２１は、チロシン、セリン、アラニン又はアスパラギン酸であり、Ｘ２２は、セリン又はアスパラギンであり、Ｘ２３は、アラニン又はグリシンであり得る。本発明の一実施例において、上記軽鎖ＣＤＲ３は、配列番号４５、４８、５１，５４、５７又は６０で示されるアミノ酸配列で構成され得る。
【0028】
本発明の他の側面において、上記抗体又はその抗原結合断片は、配列番号２５、２８、３１、３４、３７及び４０で示されるアミノ酸配列からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ１、配列番号２６、２９、３２、３５、３８及び４１でそれぞれ示されるアミノ酸配列からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ２、及び、配列番号２７、３０、３３、３６、３９及び４２でそれぞれ示されるアミノ酸配列からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに、配列番号４３、４６、４９、５２、５５及び５８でそれぞれ示されるアミノ酸配列からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ１、配列番号４４、４７、５０、５３、５６及び５９でそれぞれ示されるアミノ酸配列からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ２、及び、配列番号４５、４８、５１、５４、５７及び６０でそれぞれ示されるアミノ酸配列からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含むことができる。
【0029】
また、上記抗体又はその抗原結合断片は、配列番号２５、２６及び２７でそれぞれ示されるアミノ酸配列で構成される重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、配列番号２８、２９及び３０でそれぞれ示されるアミノ酸配列で構成される重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、配列番号３１、３２及び３３でそれぞれ示されるアミノ酸配列で構成される重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、配列番号３４、３５及び３６でそれぞれ示されるアミノ酸配列で構成される重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、配列番号３７、３８及び３９でそれぞれ示されるアミノ酸配列で構成される重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、及び、配列番号４０、４１及び４２でそれぞれ示されるアミノ酸配列で構成される重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む重鎖可変領域からなる群から選択される重鎖可変領域、並びに、配列番号４３、４４、及び４５でそれぞれ示されるアミノ酸配列で構成される軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、配列番号４６、４７及び４８でそれぞれ示されるアミノ酸配列で構成される軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、配列番号４９、５０及び５１でそれぞれ示されるアミノ酸配列で構成される軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、配列番号５２、５３及び５４でそれぞれ示されるアミノ酸配列で構成される軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、配列番号５５、５６及び５７でそれぞれ示されるアミノ酸配列で構成される軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、及び、配列番号５８、５９及び６０でそれぞれ示されるアミノ酸配列で構成される軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域からなる群から選択される軽鎖可変領域を含むことができる。
【0030】
さらに、上記抗体又はその抗原結合断片は、配列番号２５、２６及び２７でそれぞれ示されるアミノ酸配列で構成される重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに、配列番号４３、４４及び４５でそれぞれ示されるアミノ酸配列で構成される軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；配列番号２８、２９及び３０でそれぞれ示されるアミノ酸配列で構成される重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに、配列番号４６、４７及び４８でそれぞれ示されるアミノ酸配列で構成される軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；配列番号３１、３２及び３３でそれぞれ示されるアミノ酸配列で構成される重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに、配列番号４９、５０及び５１でそれぞれ示されるアミノ酸配列で構成される軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域； 配列番号３４、３５及び３６でそれぞれ示されるアミノ酸配列で構成される重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに、配列番号５２、５３及び５４でそれぞれ示されるアミノ酸配列で構成される軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；配列番号３７、３８及び３９でそれぞれ示されるアミノ酸配列で構成される重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに、配列番号５５、５６及び５７でそれぞれ示されるアミノ酸配列で構成される軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；又は、配列番号４０、４１及び４２でそれぞれ示されるアミノ酸配列で構成される重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに、配列番号５８、５９及び６０でそれぞれ示されるアミノ酸配列で構成される軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；を含むことができる。
【0031】
一例として、上記重鎖可変領域は、配列番号１、３、５、７、９又は１１で示されるアミノ酸配列で構成されるポリペプチドであり、上記軽鎖可変領域は、配列番号１３、１５、１７、１９、２１又は２３で示されるアミノ酸配列で構成されるポリペプチドであり得る。
【0032】
また、本発明に係る抗体又はその抗原結合断片は、必要に応じて変形したものであり得る。具体的には、上記抗体又はその抗原結合断片は、接合（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）、糖化（ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）、標識付け又はこれらの組み合わせで変形してもよい。具体的には、上記抗体又はその抗原結合断片は、ＨＲＰ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）、アルカリフォスファターゼ、ハプテン（ｈａｐｔｅｎ）、ビオチン、ストレプトアビジン、蛍光物質、放射性物質、量子ドット、ＰＥＧ（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）、ヒスチジン標識などに変形し得る。さらに、上記抗体又はその抗原結合断片は、必要に応じて他の薬物が接合されてもよい。
【0033】
上記抗体又はその抗原結合断片は、当該技術分野で周知の単一クローン抗体の製造方法により製造することができ、上記製造方法は、当業者によって適宜変形可能である。一例として、上記抗体は、抗原で免疫化された動物から得られたＢリンパ球を用いてハイブリドーマを製造することで、又は、ファージディスプレイ法を用いて製造することで得ることができる。
【0034】
本発明の他の側面において、本発明に係る医薬組成物に含まれる抗体又はその抗原結合断片は、上記抗体又はその抗原結合断片を暗号化する核酸を含むことができる。上記抗体又はその抗原結合断片を構成するアミノ酸配列は公知であるところ、これを暗号化する核酸配列は、当業者にとって自明である。また、上記核酸配列は、これから翻訳される抗体又はその抗原結合断片の活性を維持する限り、１つまたはそれ以上の塩基が付加、欠失又は置換されたものであり得る。
【0035】
本発明のまた他の側面において、本発明に係る医薬組成物は、上記抗体又はその抗原結合断片を暗号化する核酸を含む発現ベクターを含むことができる。上記「発現ベクター（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ）」は、宿主細胞で目的遺伝子を発現させるための手段であって、プラスミドベクター、コスミドベクター、バクテリオファージベクター、ウイルスベクターなどが挙げられる。上記発現ベクターは、これに含まれる核酸からペプチドを生成するために必要な要素を含むことができる。具体的には、上記発現ベクターは、シグナル配列、複製起点、マーカー遺伝子、プロモーター、転写終結配列などを含むことができる。このとき、本発明に係る抗体又はその抗原結合断片を暗号化した核酸は、プロモーターと作動可能に連結され得る。
【0036】
一例として、原核細胞用発現ベクターは、転写を行うプロモーター、解毒の開始のためのリボソーム結合位置、及び転写と解毒の終結配列を含むことができる。なお、真核細胞用発現ベクターは、哺乳動物又は哺乳動物ウイルスに由来するプロモーター、及びポリアデニル化配列を含むことができる。
【0037】
また、上記発現ベクターに含まれるマーカー遺伝子としては、当該技術分野で公知のものであれば、いずれも使用可能であり、具体的には、抗生物質耐性遺伝子が挙げられる。具体的に、上記抗生物質耐性遺伝子は、アンピシリン、ゲンタマイシン、カベニシリン、クロラムフェニコール、ストレプトマイシン、カナマイシン、ネオマイシン、テトラサイクリンなどのような、抗生物質に対して耐性を示す遺伝子であり得る。
【0038】
本発明のまた他の側面において、本発明に係る医薬組成物は、上述のような核酸又は発現ベクターを含む宿主細胞を有効成分として含むことができる。上記宿主細胞としては、当該技術分野において抗体又はその抗原結合断片を生産するために使用可能なものとして知られたあらゆる種類の細胞を使用することができる。具体的には、上記宿主細胞は、原核細胞、酵母又は真核細胞であり得る。上記原核細胞としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、バチルス属菌株、ストレプトマイセス属菌株、シュードモナス属菌株、スタフィロコッカス属菌株などが挙げられ、上記酵母としては、サッカロマイセス・セレビシエなどが挙げられる。なお、上記真核細胞としては、ＣＯＳ－７、ＢＨＫ、ＣＨＯ、ＣＨＯＫ１、ＤＸＢ－１１、ＤＧ－４４、ＣＨＯ／－ＤＨＦＲ、ＣＶ１、ＨＥＫ２９３、ＴＭ４、ＶＥＲＯ、ＨＥＬＡ、ＭＤＣＫ、ＢＲＬ ３Ａ、Ｗ１３８、Ｈｅｐ Ｇ２、ＳＫ－Ｈｅｐ、ＭＭＴ、ＴＲＩ、ＭＲＣ ５、ＦＳ４、３Ｔ３、ＲＩＮ、Ａ５４９、ＰＣ１２、Ｋ５６２、ＰＥＲＣ６、ＳＰ２／０、ＮＳ－０、Ｕ２０Ｓ、及びＨＴ１０８０などが挙げられる。
【0039】
また、上記宿主細胞は、当該技術分野における常法に従って上述のような核酸又は発現ベクターが形質注入されたものであり得る。具体的には、上記形質注入は、一過性トランスフェクション（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）、微細針、形質導入（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）、細胞融合、リン酸カルシウム沈殿法、リポソーム仲介性トランスフェクション（ｌｉｐｏｓｏｍｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）、ＤＥＡＥデキストラン仲介性トランスフェクション（ＤＥＡＥ ｄｅｘｔｒａｎ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｓｆｅｃｔｉｏｎ）、ポリブレン仲介性トランスフェクション（ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｓｆｅｃｔｉｏｎ）、電気穿孔法、遺伝子銃（ｇｅｎｅ ｇｕｎ）などの方法で行うことができる。なお、上記のような方法は、当業者によって適宜変形可能である。
【0040】
上記脳疾患としては、当該技術分野で周知のあらゆる種類の脳疾患が挙げられ、具体的には、上記脳疾患は、退行性脳障害であり得る。一例として、上記退行性脳障害は、アミロイドβの発現又は凝集のレベルが正常より高いか、高くなる危険がある疾患であり得る。例えば、上記退行性脳障害は、認知症、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、軽度認知障害、大脳アミロイド血管症、ダウン症候群、アミロイド性脳卒中、全身性アミロイド病、Ｄｕｔｃｈ型アミロイド症、ニーマン・ピック病、老人性認知症、筋萎縮性側索硬化症（ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ ｌａｔｅｒａｌ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、脊髄小脳性運動失調症（ｓｐｉｎｏｃｅｒｅｂｅｌｌａｒ ａｔｒｏｐｈｙ）、トゥレット症候群（Ｔｏｕｒｅｔｔｅ’ｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、フリードリヒ運動失調症（Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈ’ｓ Ａｔａｘｉａ）、マシャド・ジョセフ病（Ｍａｃｈａｄｏ－Ｊｏｓｅｐｈ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、レビー小体型認知症、筋緊張異常（ｄｙｓｔｏｎｉａ）、進行性核上性麻痺（ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ ｓｕｐｒａｎｕｃｌｅａｒ ｐａｌｓｙ）又は前頭側頭葉認知症が挙げられる。
【0041】
本発明に係る医薬組成物は、組成物の全重量に対して、有効成分であるＡＳＭタンパク質に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片を、１０～９５重量%で含むことができる。また、本発明の医薬組成物は、上述した有効成分の他に、同一又は類似の機能を示す有効成分を１種以上さらに含んでもよい。
【0042】
本発明の医薬組成物は、生物学的製剤に通常使用される担体、希釈剤、賦形剤又はその混合物を含むことができる。薬学的に許容可能な担体としては、組成物を生体内に伝達するのに適したものであれば、いずれも使用可能である。具体的には、上記担体は、Ｍｅｒｅｋ Ｉｎｄｅｘ、１３ｔｈ ｅｄ．、Ｍｅｒｅｋ＆Ｃｏ．Ｉｎｃ．に記載の化合物、食塩水、滅菌水、点滴液、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノール又はその混合物であり得る。また、必要に応じて、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤などのような通常の添加剤を添加してもよい。
【0043】
上記組成物を製剤化する場合、通常使用される充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤などの希釈剤又は賦形剤を添加してもよい。
【0044】
本発明の組成物は、経口用製剤又は非経口用製剤として製剤化することができる。経口用製剤としては、固形製剤及び液状製剤が挙げられる。上記固形製剤は、錠剤、環剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤又はトローチ剤であってもよく、このような固形製剤は、上記組成物に少なくとも一つ以上の賦形剤を添加して調製することができる。上記賦形剤は、デンプン、炭酸カルシウム、スクロース、ラクトース、ゼラチン又はその混合物であり得る。また、上記固形製剤は、潤滑剤を含んでもよく、例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルクなどが挙げられる。また、上記液状製剤は、懸濁剤、内用液剤、乳剤又はシロップ剤であってもよい。なお、上記液状製剤には、湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などの賦形剤が含まれてもよい。
【0045】
上記非経口用製剤としては、注射剤、座剤、呼吸器吸入用粉末、スプレー用エアロゾル剤、パウダー及びクリームなどが挙げられる。上記注射剤には、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁溶剤、乳剤などが含まれてもよい。このとき、非水性溶剤又は懸濁溶剤としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物性油や、オレイン酸エチルのように注射可能なエステルなどを使用することができる。
【0046】
また、本発明は、ＡＳＭタンパク質に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片を有効成分として含む脳疾患の予防又は改善用の保健機能食品を提供する。
【0047】
本発明に係る保健機能食品に有効成分として含まれるＡＳＭタンパク質に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片は、上述のような特徴を有することができる。
【0048】
本発明のＡＳＭタンパク質に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片は、食品にそのまま添加したり、他の食品又は食品成分と共に使用することができる。このとき、添加される有効成分の含有量は、目的によって異なるが、一般的には、食品の全重量の０．０１～９０重量部であり得る。
【0049】
保健機能食品の形態及び種類は、特に制限されない。具体的には、上記保健機能食品は、錠剤、カプセル、粉末、顆粒、液状、及び丸剤の形態であってもよい。上記保健機能食品は、追加成分として様々な香味剤、甘味剤又は天然炭水化物を含んでもよい。上記甘味剤は、天然又は合成の甘味剤であり、天然甘味剤としては、例えば、タウマチン、ステビア抽出物などが挙げられる。また、合成甘味剤としては、例えば、サッカリン、アスパルタムなどが挙げられる。また、上記天然炭水化物としては、モノサッカライド、ジサッカライド、ポリサッカライド、オリゴ糖、及び糖アルコールなどが挙げられる。
【0050】
本発明の保健機能食品は、上述した追加成分の他に、栄養剤、ビタミン、電解質、風味剤、着色剤、ペクチン酸及びその塩、アルギン酸及びその塩、有機酸，保護コロイド増粘剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコールなどをさらに含んでもよい。これらの成分は、単独で又は組み合わせて使用してもよい。上記添加剤の割合は、本発明による組成物の１００重量部当たり０．０１～０．１重量部の範囲で使用することができる。
【0051】
また、本発明は、ＡＳＭタンパク質に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片を個体に投与するステップを含む脳疾患の予防、改善又は治療方法を提供する。
【0052】
本発明に係る脳疾患の予防、改善又は治療方法に使用されるＡＳＭタンパク質に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片は、上述のような特徴を有することができる。
【0053】
上記個体は、哺乳動物であり、具体的には、ヒトであり得る。
【0054】
上記投与は、目的の方法によって、経口又は非経口投与することができる。非経口投与は、腹腔内、直腸内、皮下、静脈、筋肉内、又は胸部内注射の方式で行うことができる。
【0055】
また、上記投与は、薬学的に有効な量で投与することができる。これは、疾患の種類、重症度、薬物の活性、薬物に対する患者の敏感度、投与時間、投与経路、治療期間、同時に使用される薬物などによって変化する。なお、目的の効果を得るためには、本発明に係る医薬組成物に含まれる有効成分の含有量は、０．０００１～１，０００ｍｇ／ｋｇ、具体的には、０．００１～５００ｍｇ／ｋｇの範囲であり得る。上記投与は、一日一回、又は数回に分けて行うことができる。
【0056】
上記投与は、単独又は他の治療剤と併用して投与することができる。併用投与は、順次又は同時投与してもよい。
【0057】
さらに、本発明は、脳疾患の予防、改善又は治療のための薬剤の製造に使用するためのＡＳＭタンパク質に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片の用途を提供する。
【0058】
本発明に係る脳疾患の予防、改善又は治療のための薬剤の製造に使用されるＡＳＭタンパク質に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片は、上述のような特徴を有することができる。
【実施例】
【0059】
［発明の実施のための形態］
以下、本発明を後述の実施例に基づいて詳述する。但し、後述の実施例は、本発明の例示に過ぎず、本発明は、これらの実施例によって制限されない。本発明の特許請求の範囲に記載の技術的思想と実質的に同様な構成を有し、同様な作用効果を示すものであれば、いずれも本発明の技術的範囲に含まれる。
以下、本発明を後述の実施例に基づいて詳述する。但し、後述の実施例は、本発明の例示に過ぎず、本発明は、これらの実施例によって制限されない。本発明の特許請求の範囲に記載の技術的思想と実質的に同様な構成を有し、同様な作用効果を示すものであれば、いずれも本発明の技術的範囲に含まれる。
【0060】
［実施例１：ＡＳＭ（ａｃｉｄ ｓｐｈｉｎｇｏｍｙｅｌｉｎａｓｅ）タンパク質に特異的に結合する抗体の作製］
ヒトＡＳＭタンパク質（配列番号６６）及びマウスＡＳＭタンパク質（配列番号６７）に特異的に結合する抗体を、次のような方法で製造した。
ヒトＡＳＭタンパク質（配列番号６６）及びマウスＡＳＭタンパク質（配列番号６７）に特異的に結合する抗体を、次のような方法で製造した。
【0061】
具体的には、組換えヒト及びマウスＡＳＭタンパク質、及びヒト合成ｓｃＦＶファージライブラリを用いて常法に従ってパンニング（ｐａｎｎｉｎｇ）を行い、ヒトＡＳＭタンパク質又はマウスＡＳＭタンパク質に特異的に結合するｓｃＦｖを有するファージを選別した。選別されたｓｃＦｖを暗号化する核酸配列を分析し、これから生成されるアミノ酸配列を確認した。確認されたｓｃＦｖ配列の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のそれぞれのカルボキシ末端（ｃａｒｂｏｘｙ ｔｅｒｍｉｎｕｓ）に、配列番号７５及び７７でそれぞれ示される塩基配列で構成されるマウス重鎖定常領域（ｃｏｎｓｔａｎｔ ｒｅｇｉｏｎ）及びマウス軽鎖λ定常領域が連結された形態で発現されるように発現ベクターを製造した。このとき、製造された発現ベクターに含まれたｓｃＦｖを構成する重鎖可変領域のアミノ酸配列及び核酸配列を下記表１に、軽鎖可変領域のアミノ酸配列及び核酸配列を下記表２に示す。
【0062】
【表1】
【0063】
【表2】
【0064】
このとき、発現ベクターとしては、哺乳類発現ベクター（ｍａｍｍａｌｉａｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ）を使用した。製造された発現ベクターをＣＨＯ又はＨＥＫ２９３細胞株に形質転換させてヒトＡＳＭタンパク質に結合し、又はヒト及びマウスのＡＳＭタンパク質に全て結合する全長の抗体を製造した。
【0065】
［実施例２：相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ、ＣＤＲ）の決定］
上記で製造されたｓｃＦＶにおいて相補性決定領域を常法に従って確認し、その結果を、重鎖可変領域のＣＤＲ配列を表３に、軽鎖可変領域のＣＤＲ配列を表４に示す。
上記で製造されたｓｃＦＶにおいて相補性決定領域を常法に従って確認し、その結果を、重鎖可変領域のＣＤＲ配列を表３に、軽鎖可変領域のＣＤＲ配列を表４に示す。
【0066】
【表3】
【0067】
【表4】
【0068】
（実験例１：ＡＳＭタンパク質との結合の確認）
上記で製造されたＡＳＭタンパク質に特異的に結合する抗体のＡＳＭタンパク質との結合をＥＬＩＳＡ分析方法で確認した。
上記で製造されたＡＳＭタンパク質に特異的に結合する抗体のＡＳＭタンパク質との結合をＥＬＩＳＡ分析方法で確認した。
【0069】
まず、マルチアレイ９６ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に、１μｇ／ｍｌの組換えヒトＡＳＭタンパク質（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）を１００μｌ添加し、４℃で１６時間放置し、プレートをコーティングした。コーティングされたプレートに、５％ＢＳＡが含まれた２００μｌのＰＢＳを添加し、３７℃で２時間反応させて前処理した後、０．０５％のツイーン２０（Ｔｗｅｅｎ２０）が含まれたＰＢＳでこれを３回洗浄した。ここに、０．０００１、０．００１、０．０１、０．１、１、１０又は１００ｎＭの抗ＡＳＭ抗体を処理し、３７℃で１時間反応させた。反応後、プレートを０．０５％のツイーンが含まれたＰＢＳで３回洗浄し、二次抗体として１００μｌのヤギ抗マウスＩｇＧ－ＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）抗体を添加した。これを３７℃でさらに１時間反応させ、０．０５％のツイーンが含まれたＰＢＳで３回洗浄した。ここに、１００μｌのＴＭＢ基質（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）を添加し、さらに常温で５分間反応させた後、１００μｌの２Ｎ硫酸溶液で反応を停止し、４５０ｎｍの波長で吸光度を測定した。その結果を、測定された吸光度を図２に、吸光度値から計算された抗体のＥＣ５０値を表５に示す。
【0070】
【表5】
【0071】
図２に示されるように、上記で製造された５種類の抗体が全て濃度依存的にＡＳＭタンパク質に結合している。特に、表５に示されるように、＃９１０１抗体が最も低いＥＣ５０値を示し、ＡＳＭタンパク質に対する結合力が最も高かった。
【0072】
（実験例２：ＡＳＭタンパク質との結合親和性の確認）
上記で製造されたＡＳＭタンパク質に特異的に結合する抗体のＡＳＭタンパク質との結合親和性及び相互作用動力学を、Ｏｃｔｅｔ（商標）ＱＫ３８４システム（Ｐａｌｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて測定した。
上記で製造されたＡＳＭタンパク質に特異的に結合する抗体のＡＳＭタンパク質との結合親和性及び相互作用動力学を、Ｏｃｔｅｔ（商標）ＱＫ３８４システム（Ｐａｌｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて測定した。
【0073】
まず、ＡＲ２Ｇセンサー（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）に、２０ｍＭの１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及び４０ｎＭのＮ－ヒドロキシスルホスクシンイミド（スルホ－ＮＨＳ）溶液を処理してカルボキシ基を活性化させた。なお、１０μｇ／ｍｌの組換えヒトＡＳＭタンパク質又は２．５μｇ／ｍｌの組換えマウスＡＳＭタンパク質は、１０ｎＭのナトリウムアセテート（ｐH５．０）（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）溶液に希釈して準備した。上記ＡＳＭタンパク質が希釈された溶液を、カルボキシ基が活性化されたＡＲ２Ｇセンサーに加え、組換えヒト又はマウスＡＳＭタンパク質が固定されたＡＲ２Ｇセンサーを得た。得られたＡＳＭタンパク質が固定されたセンサーに、１Ｍのエタノールアミン（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を添加し、未反応の残存カルボキシ基を不活性化させた。ここに、０．４、２又は１０ｎＭ濃度の実施例１で製造された抗体を添加し、約９００秒間反応物の結合相を観察した。次に、１×動力学緩衝液（ｋｉｎｅｔｉｃｓ ｂｕｆｆｅｒ）（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を添加し、約１，２００秒間反応物の分離相を観察した。Ｏｃｔｅｔ（商標）分析ソフトウェア（Ｐａｌｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、各抗体に対する結合定数（ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｃｏｎｓｔａｎｔ：Ｋｏｎ）、解離定数（ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｃｏｎｓｔａｎｔ：Ｋｄｉｓ）及び平衡解離定数（ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｃｏｎｓｔａｎｔ：ＫＤ）を決定した。その結果を、組換えヒトＡＳＭタンパク質に対する分析結果を表６に、組換えマウスＡＳＭタンパク質に対する分析結果を表７に示す。
【0074】
【表6】
【0075】
【表7】
【0076】
表６に示されるように、実施例１で製造された５種類の抗体が、１０－１０～１０－９Ｍレベルの結合力でヒトＡＳＭタンパク質に結合している。なお、表７に示されるように、マウスＡＳＭタンパク質に対しては、＃９１０２、＃９１０４又は＃９１０８の抗体だけが、１０－１０～１０－９Ｍレベルの結合力を示している。
【0077】
（実験例３：ＡＳＭタンパク質の抗原決定部位の確認）
本発明に係る抗体がＡＳＭタンパク質に結合する部位である抗原決定部位をＨＤＸ－ＭＳ（ｈｙｄｒｏｇｅｎ ｄｅｕｔｅｒｉｕｍ ｅｘｃｈａｎｇｅ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）方法で確認した。
本発明に係る抗体がＡＳＭタンパク質に結合する部位である抗原決定部位をＨＤＸ－ＭＳ（ｈｙｄｒｏｇｅｎ ｄｅｕｔｅｒｉｕｍ ｅｘｃｈａｎｇｅ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）方法で確認した。
【0078】
まず、１，０００μｇ／ｍｌのＡＳＭタンパク質、１，０００μｇ／ｍｌの＃９１０１ｍＩｇＧ１，１，２５０μｇ／ｍｌの＃９１０２ｍＩｇＧ２、１，０００μｇ／ｍｌの＃９１０４ｍＩｇＧ４、１，０００μｇ／ｍｌの＃９１０８ｍＩｇＧ１、３，３００μｇ／ｍｌの＃９１１３ｍＩｇＧ１、又は２，９３２μｇ／ｍｌの＃９１２３ｍＩｇＧ１抗体を連続して２倍数ずつ希釈し、１２８倍の希釈液まで準備した。準備された希釈液を１μｌずつ取り、同量の１０ｍｇ／ｍｌのシナピン酸マトリックス（Ｋ２００ ＭＡＬＤＩ ｋｉｔ、ＣｏｖａｌＸ）と混合し、上記混合物の１μｌをＳＣＯＵＴ３８４ ＭＡＬＤＩプレートに分注し、常温で結晶化させた。次に、上記結晶を、ＭＡＬＤＩ質量分析器（ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ）を用いて測定した。一方、非共有結合相互作用の分析のためのクロスリンク（ｃｒｏｓｓ－ｌｉｎｋ）データのため、１μｌの１２８倍希釈液を、同量の２ｍｇ／ｍｌのＫ２００安定化溶液（Ｋ２００ ｓｔａｂｉｌｉｚｅｒ ｒｅａｇｅｎｔ、Ｋ２００ ＭＡＬＤＩ Ｋｉｔ、ＣｏｖａｌＸ）と混合し、これを３時間常温で反応させた。反応終了後、１μｌの混合液を用いて、上記と同様にＭＡＬＤＩ質量分析器で測定し、測定結果は、ハイマスＭＡＬＤＩ ＭＳ（ｈｉｇｈ－ｍａｓｓ ＭＡＬＤＩ ＭＳ）モードで分析した。その結果を、ＡＳＭタンパク質内重水素挿入による顕著な差が確認された部位のアミノ酸配列を下記表８に、ヒトＡＳＭタンパク質構造モデルに各抗体の結合位置を表示した結果を図３に示す。また、ＡＳＭタンパク質のうちサポシン（ｓａｐｏｓｉｎ）ドメインにおける各抗体の重水素置換率のヒートマップを図４に示す。
【0079】
【表8】
【0080】
表８及び図３に示されるように、本発明による抗体は、ＡＳＭタンパク質のＮ末端から５３～７２番目のアミノ酸断片（配列番号６８：TAINLGLKKEPNVARVGSVA）、１０１～１２３番目のアミノ酸断片（配列番号６９：VWRRSVLSPSEACGLLLGSTCGH）、１３５~１５９番目のアミノ酸断片（配列番号７０：PTVPKPPPKPPSPPAPGAPVSRILF）、１３５~１５５番目のアミノ酸断片（配列番号７１：PTVPKPPPKPPSPPAPGAPVS）、２１８～２２８番目のアミノ酸断片（配列番号７２：SGLGPAGPFDM）又は２５９～２６９番目のアミノ酸断片（配列番号７３：VRKFLGPVPVY）に結合している。特に、図４に示されるように、本発明による抗体は、サポシンドメインにおけるαヘリックス１及びαヘリックス２の部位に主に結合している。
【0081】
（実験例４：ＡＳＭタンパク質活性抑制の確認）
４－１：ＡＳＭタンパク質活性抑制の確認
上記で製造されたＡＳＭタンパク質に特異的に結合する抗体が、細胞膜に位置するＡＳＭタンパク質の活性を抑制するかを確認した。
４－１：ＡＳＭタンパク質活性抑制の確認
上記で製造されたＡＳＭタンパク質に特異的に結合する抗体が、細胞膜に位置するＡＳＭタンパク質の活性を抑制するかを確認した。
【0082】
まず、アルツハイマー病患者の線維芽細胞（ｃｏｒｉｅｌｌ ｉｎｓｔｉｔｕｅ）に、実施例１で製造された抗体を３μｇ／ｍｌの濃度で処理し、３７℃で２４時間反応させた。次に、細胞を集めてＭｅｍ－ＰＥＲＴＭプラスメンブレンタンパク質抽出キット（Ｍｅｍ－ＰＥＲＴＭＰｌｕｓ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ、Ｔｈｅｒｍｏ）を用いて、メーカーのプロトコルに従って細胞膜を分離し、タンパク質を抽出した。抽出されたタンパク質を試料として使用してＵＰＬＣ用注入口（ｉｎｓｅｒｔ）に入れ、常法に従ってＵＰＬＣ分析（Ｗａｔｅｒｓ、１８６００４８００）を行い、その結果を図５に示す。このとき、対照群としては、ＡＳＭタンパク質に結合していないものと確認された＃９１０５抗体を使用した。
【0083】
図５に示されるように、実施例１で製造された６種類の抗体のうち、＃９１０４抗体が、アルツハイマー病患者の細胞膜で増加したＡＳＭタンパク質の活性を有意に抑制している。
【0084】
４－２：抗ＡＳＭ抗体の処理濃度によるＡＳＭタンパク質活性抑制の確認
実施例１で製造された＃９１０４抗体を、０．０３、０．３、３、３０、３００、又は３，０００ｎｇ／ｍｌの濃度で処理した以外は、上記実験例４－１と同様にして細胞膜に位置するＡＳＭタンパク質の活性変化を確認した。その結果、分析されたＡＳＭタンパク質の活性抑制率（％）を図６及び表９に示す。このとき、対照群としては、＃９１０５抗体を使用した。
実施例１で製造された＃９１０４抗体を、０．０３、０．３、３、３０、３００、又は３，０００ｎｇ／ｍｌの濃度で処理した以外は、上記実験例４－１と同様にして細胞膜に位置するＡＳＭタンパク質の活性変化を確認した。その結果、分析されたＡＳＭタンパク質の活性抑制率（％）を図６及び表９に示す。このとき、対照群としては、＃９１０５抗体を使用した。
【0085】
【表9】
【0086】
図６及び表９に示されるように、本発明による＃９１０４抗体は、処理濃度依存的に細胞膜に位置するＡＳＭタンパク質の活性を有意に抑制している。これに対し、対照群として使用された＃９１０５抗体は、３，０００ｎｇ／ｍｌ以上の濃度で処理した場合においてのみ、細胞膜に位置するＡＳＭタンパク質の活性をやや抑制している。
【0087】
（実験例５：スフィンゴ脂質代謝変化の確認）
実験例４－１に示されたように、３μｇ／ｍｌの＃９１０４抗体が処理された細胞の細胞膜におけるスフィンゴ脂質代謝の変化を、スフィンゴミエリン（ｓｐｈｉｎｇｏｍｙｅｌｉｎ）及びセラミド（ｃｅｒａｍｉｄｅ）の含有量変化に基づいて確認した。実験は、常法に従って行われ、測定されたスフィンゴミエリン及びセラミドの含有量を図７に示す。
実験例４－１に示されたように、３μｇ／ｍｌの＃９１０４抗体が処理された細胞の細胞膜におけるスフィンゴ脂質代謝の変化を、スフィンゴミエリン（ｓｐｈｉｎｇｏｍｙｅｌｉｎ）及びセラミド（ｃｅｒａｍｉｄｅ）の含有量変化に基づいて確認した。実験は、常法に従って行われ、測定されたスフィンゴミエリン及びセラミドの含有量を図７に示す。
【0088】
図７に示されるように、＃９１０４抗体の処理により、アルツハイマー病患者の線維芽細胞膜に存在するセラミドの含有量が有意に減少しているが、スフィンゴミエリンの含有量には大きな変化がなかった。
【0089】
従って、上記のような点から、本発明に係る抗体が、ＡＳＭタンパク質によるスフィンゴミエリンの分解を抑制することが分かった。
【0090】
（実験例６：認知記憶力改善の確認）
アルツハイマー病の動物モデルであるＡＰＰ／ＰＳ１マウスに、＃９１０４抗体を投与し、上記マウスの認知記憶力の変化を確認した。
アルツハイマー病の動物モデルであるＡＰＰ／ＰＳ１マウスに、＃９１０４抗体を投与し、上記マウスの認知記憶力の変化を確認した。
【0091】
６－１：抗ＡＳＭ抗体の投与
７ヶ月齢のＡＰＰ／ＰＳ１マウスに、５０ｍｇ／ｋｇの投与量で、３２４μｌの＃９１０４抗体を８週間腹腔投与した。投与は、１週間に２回（3日おきに）行われ、＃９１０４抗体は、計１６回投与された（図８）。このとき、Ｃ５７ＢＬ／６マウス及びＡＰＰ／ＰＳ１マウスの交配で産まれた子孫に何も処理しなかったものを無処理対照群とし、ＡＰＰ／ＰＳ１マウスに３２４μｌのＰＢＳ処理を施したものを陰性対照群とした。
７ヶ月齢のＡＰＰ／ＰＳ１マウスに、５０ｍｇ／ｋｇの投与量で、３２４μｌの＃９１０４抗体を８週間腹腔投与した。投与は、１週間に２回（3日おきに）行われ、＃９１０４抗体は、計１６回投与された（図８）。このとき、Ｃ５７ＢＬ／６マウス及びＡＰＰ／ＰＳ１マウスの交配で産まれた子孫に何も処理しなかったものを無処理対照群とし、ＡＰＰ／ＰＳ１マウスに３２４μｌのＰＢＳ処理を施したものを陰性対照群とした。
【0092】
６－２：認知記憶力改善の確認－（１）
＃９１０４抗体の投与４１日目から最終日まで行為機能検査を行い、抗体の投与による認知記憶力の変化を確認した。
＃９１０４抗体の投与４１日目から最終日まで行為機能検査を行い、抗体の投与による認知記憶力の変化を確認した。
【0093】
まず、投与４１日目から５分間、全てのマウスの尻尾を握って試験者の腕及び手の甲に乗せるのを繰り返すことで試験者に対するマウスの抵抗感をなくし、次に、３０分間、水に適応させて水に対する抵抗感をなくした後、実験に供した。一方、水槽は、４面上に手がかり（ｃｕｅ）を取り除いた状態でプラットフォーム（ｐｌａｔｆｏｒｍ）を設置し、これを中心に三角形状の小さな水槽を配設した。上記マウスを水槽に入れ、水泳訓練及びプラットホームに上がる訓練を１０回実施した。このとき、水泳訓練後、１０秒後、プラットフォームに上がる度に１０秒ずつ留まることができるようにし、１０秒後、マウスを水に再び入れるようにした。これを１０回繰り返し、繰り返す間にプラットフォームに対して接近方向を変化させ、様々な方向からプラットフォームに上がることができるように教育した。翌日の投与４２日目から５１日まで水迷路実験（ｍｏｒｒｉｓ ｗａｔｅｒ ｍａｚｅ ｔｅｓｔ）を行った。具体的には、水槽の４面上に手がかりを設け、毎日同じ時間に各マウス当たり４回実験を行い（１回当たり６０秒間に時間制限）、これを計１０回繰り返してプラットフォームに上がるまでかかる時間を記録した。また、投与から５２日目にはプローブテスト（ｐｒｏｂｅ ｔｅｓｔ）を行い、プラットフォームを取り除いた水槽において、プラットフォームがあった位置及び他の四分面上を通って水泳する距離及び速度などを記録した。その結果を、水迷路実験結果を図９に、プローブテスト結果を図１０～１２に示す。
【0094】
図９に示されるように、試験を繰り返すにつれて＃９１０４抗体を投与したマウスは、エスケープ待ち時間（ｅｓｃａｐｅ ｌａｔｅｎｃｙ ｔｉｍｅ）が有意に減少している。一方、陰性対照群のマウスは、平均して３０秒間のエスケープ待ち時間がかかり、認知機能が低下しており、無処理対照群のマウスは、試験が繰り返されるにつれてエスケープ待ち時間が減少している。具体的には、＃９１０４抗体を投与した群では、陰性対照群のマウスと比べて、エスケープ待ち時間が、９回目に３１．５％、及び１０回目に３０．８％減少している。
【0095】
また、図１０及び１１に示されるように、＃９１０４抗体を投与したマウスは、標的四分面に留まる時間が、非標的四分面に留まる時間に比べて有意に増加している。これは、無処理対照群と類似しており、標的四分面及び非標的四分面に留まる時間の差が殆どなかった陰性対照群とは差があった。
【0096】
なお、図１２Ｃに示されるように、プラットフォームがあった位置を通る回数（ｃｒｏｓｓｉｎｇ ｐｌａｔｆｏｒｍ）については、＃９１０４抗体を投与した群では有意に増加しているが、これに対し、陰性対照群では、減少することが確認された。一方、図１２Ａ及び１２Ｂに示されるように、全てのマウス群において、水泳距離及び速度は類似していることが確認され、＃９１４０抗体の投与が運動力には影響を与えないことが分かった。
【0097】
６－３：.認知記憶力改善の確認－（２）
アルツハイマー病の動物モデルであるＡＰＰ／ＰＳ１マウスに、＃９１０４抗体を５０ｍｇ／ｋｇの投与量で投与し、上記マウスの認知記憶力の変化を確認した。実験は、上記実験例６－１と同様にして＃９１０４抗体を投与し、常法に従って文脈及び手がかり恐怖条件付けテスト（ｃｏｎｔｅｘｔｕａｌ ａｎｄ ｃｕｅｄ ｆｅａｒ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ ｔｅｓｔ）を行った後、その結果を図１３に示す。
アルツハイマー病の動物モデルであるＡＰＰ／ＰＳ１マウスに、＃９１０４抗体を５０ｍｇ／ｋｇの投与量で投与し、上記マウスの認知記憶力の変化を確認した。実験は、上記実験例６－１と同様にして＃９１０４抗体を投与し、常法に従って文脈及び手がかり恐怖条件付けテスト（ｃｏｎｔｅｘｔｕａｌ ａｎｄ ｃｕｅｄ ｆｅａｒ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ ｔｅｓｔ）を行った後、その結果を図１３に示す。
【0098】
図１３に示されるように、＃９１０４抗体を投与したマウスは、文脈（ｃｏｎｔｅｘｔｕａｌ）や雰囲気（ｔｏｎｅ）によってフリージング（ｆｒｅｅｚｉｎｇ）が有意に増加しているが、これに対し、陰性対照群のマウスは、フリージング程度が減少している。
【0099】
従って、上記のような結果から、本発明に係る抗体が、アルツハイマー病の動物モデルの認知記憶力を有意に改善させることが確認された。
【0100】
（実験例７：ＡＳＭタンパク質活性の確認）
７－１：ＡＳＭタンパク質活性の確認
上記実験例６において認知記憶力の改善が確認された動物モデルの血液及び脳組織に存在するＡＳＭタンパク質の活性を確認した。具体的には、実験は、マウスの血液プラズマ（ｐｌａｓｍａ）からタンパク質を常法に従って取得し、得られたタンパク質を試料として実験例４－１と同様にしてＵＰＬＣを行った。陰性対照群マウスのＡＳＭタンパク質活性を基準にして、無処理対照群マウス及び＃９１０４を投与したマウス群のＡＳＭ活性（％）を計算した結果を図１４に示す。
７－１：ＡＳＭタンパク質活性の確認
上記実験例６において認知記憶力の改善が確認された動物モデルの血液及び脳組織に存在するＡＳＭタンパク質の活性を確認した。具体的には、実験は、マウスの血液プラズマ（ｐｌａｓｍａ）からタンパク質を常法に従って取得し、得られたタンパク質を試料として実験例４－１と同様にしてＵＰＬＣを行った。陰性対照群マウスのＡＳＭタンパク質活性を基準にして、無処理対照群マウス及び＃９１０４を投与したマウス群のＡＳＭ活性（％）を計算した結果を図１４に示す。
【0101】
図１４に示されるように、＃９１０４抗体の投与により、血液プラズマに存在するＡＳＭタンパク質の活性が、約６４％抑制されている。
【0102】
７－２：ＡＳＭタンパク質濃度の確認
実験例７－１において確認されたＡＳＭタンパク質の活性抑制が、タンパク質の発現レベルの低下によるものかどうかを確認するため、ＥＬＩＳＡ分析を行った。実験は、実験例７－１で得られた血液プラズマ組織を試料として使用し、マウスＡＳＭのＥＬＩＳＡキット（Ｍｙｂｉｏｓｏｕｒｃｅ）を用いて、メーカーのプロトコルに従って分析を行った後、その結果を図１５に示す。
実験例７－１において確認されたＡＳＭタンパク質の活性抑制が、タンパク質の発現レベルの低下によるものかどうかを確認するため、ＥＬＩＳＡ分析を行った。実験は、実験例７－１で得られた血液プラズマ組織を試料として使用し、マウスＡＳＭのＥＬＩＳＡキット（Ｍｙｂｉｏｓｏｕｒｃｅ）を用いて、メーカーのプロトコルに従って分析を行った後、その結果を図１５に示す。
【0103】
図１５に示されるように、＃９１０４抗体を投与したマウスにおいて、無処理対照群又は陰性対照群よりＡＳＭタンパク質の濃度が有意に増加している。
【0104】
従って、上記のような結果から、本発明による抗体は、ＡＳＭタンパク質の濃度には影響を及ぼさず、その活性を有意に抑制していることが分かった。
【0105】
（実験例８：アミロイドβ（Aβ）蓄積抑制の確認）
上記実験例６において認知記憶力の改善が確認された動物モデルの脳組織に存在するアミロイドβの蓄積を、チオフラビン－Ｓ（ｔｉｏｆｌａｖｉｎ－Ｓ）染色及び６Ｅ１０抗体を用いたウエスタンブロッティングとＥＬＩＳＡ分析方法により、次のように確認した。
上記実験例６において認知記憶力の改善が確認された動物モデルの脳組織に存在するアミロイドβの蓄積を、チオフラビン－Ｓ（ｔｉｏｆｌａｖｉｎ－Ｓ）染色及び６Ｅ１０抗体を用いたウエスタンブロッティングとＥＬＩＳＡ分析方法により、次のように確認した。
【0106】
８－１：Ａβ蓄積抑制の確認－（１）
実験例６の動物モデルを、２．５％アバチン（ａｖｅｒｔｉｎ）で麻酔し、胸腔を開腹し、１ｃｃ注射器を用いて心臓から血液を得た。血液を得た後、２０ｍｌのＰＢＳで灌流（ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ）を行い、さらに２０～３０ｍｌの４％ＰＦＡ（パラホルムアルデヒド）で灌流を行った。上記マウスの脳を摘出し、４％ＰＦＡ溶液に入れて一晩放置し、ビブラトーム（ｖｉｂｒａｔｏｍｅ）を用いて、上記組織を３０μｍの厚さに切片化した。得られた脳組織切片を、１２ウェルプレートに入れた後、１ｍｌのＰＢＳ溶液を添加し、室温で３３ｒｐｍの条件で５分間撹拌した。ＰＢＳ溶液を除去し、エタノールに希釈された５００μｌの０．５％チオフラビン－Ｓ試薬処理を行い、Ａβのプラーク（ｐｌａｑｕｅ）を１０分間染色した。次に、上記切片を、５０％エタノールで２回洗浄し、１ｍｌのＰＢＳ溶液で１回洗浄した。ここに、ＤＡＰＩが含まれたマウント培地を添加し、マウンティングした。
実験例６の動物モデルを、２．５％アバチン（ａｖｅｒｔｉｎ）で麻酔し、胸腔を開腹し、１ｃｃ注射器を用いて心臓から血液を得た。血液を得た後、２０ｍｌのＰＢＳで灌流（ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ）を行い、さらに２０～３０ｍｌの４％ＰＦＡ（パラホルムアルデヒド）で灌流を行った。上記マウスの脳を摘出し、４％ＰＦＡ溶液に入れて一晩放置し、ビブラトーム（ｖｉｂｒａｔｏｍｅ）を用いて、上記組織を３０μｍの厚さに切片化した。得られた脳組織切片を、１２ウェルプレートに入れた後、１ｍｌのＰＢＳ溶液を添加し、室温で３３ｒｐｍの条件で５分間撹拌した。ＰＢＳ溶液を除去し、エタノールに希釈された５００μｌの０．５％チオフラビン－Ｓ試薬処理を行い、Ａβのプラーク（ｐｌａｑｕｅ）を１０分間染色した。次に、上記切片を、５０％エタノールで２回洗浄し、１ｍｌのＰＢＳ溶液で１回洗浄した。ここに、ＤＡＰＩが含まれたマウント培地を添加し、マウンティングした。
【0107】
なお、あらゆる形態のＡβタンパク質を染色するために上記脳組織切片を１２ウェルプレートに入れた後、１ｍｌのＰＢＳ溶液を添加し、室温で３３ｒｐｍの条件で５分間撹拌し、ＰＢＳ溶液を除去した。ここに、１ｍｌの０．２％のトリトンＸ－１００が含まれたＰＢＳ溶液を添加し、３３ｒｐｍの条件で１時間撹拌した。撹拌後、トリトンＸ－１００が含まれたＰＢＳ溶液を除去し、０．０５％のトリトンＸ－１００が含まれたＰＢＳ溶液で１時間前処理した。前処理された脳組織切片に、６Ｅ１０抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を０．０５％のトリトンＸ－１００が含まれたＰＢＳ溶液と１：１の体積比で混合し、５００μｌの量で添加した。これを４℃で一晩撹拌しながら反応させ、トリトンＸ－１００が含まれたＰＢＳ溶液で３回洗浄した。ここに、マウス４８８の二次抗体を処理し、室温で２時間反応させた後、さらにトリトンＸ－１００が含まれたＰＢＳ溶液で３回洗浄した。ここに、ＤＡＰＩが含まれたマウント培地を添加し、マウンティングした。
【0108】
染色された脳組織切断は、共焦点レーザー走査型顕微鏡（ＦＶ３０００、Ｏｌｙｍｐｕｓ）を用いて２０倍の倍率で撮影し、メタモルフソフトウェア（ＭｅｔａＭｏｒｐｈ ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて染色面積を分析し、分析結果を図１６及び１７に示す。
【0109】
図１６及び１７に示されるように、脳の皮質及び海馬に存在する高密度（ｄｅｎｓｅ－ｃｏｒｅ）及び拡散型（ｄｉｆｆｕｓｅ）アミロイドβプラークが、＃９１０４抗体の処理により有意に減少している。
【0110】
８－２：Ａβ蓄積抑制の確認－（２）
上記で得られた脳組織を皮質及び海馬に分離し、１００ｍＭ ＰＭＳＦ及び１％プロテアーゼ阻害剤が含まれたＲＩＰＡ緩衝液を添加し、組織を均質化させた。均質化された組織を４℃及び１３，０００ｒｐｍの条件下で１０分間遠心分離し、上層液を取得した。得られた上層液を同一の条件で３０分間さらに遠心分離して上層液を取得し、これを試料としてアミロイドβ４０ＥＬＩＳＡキット（ＫＨＢ３４８１、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びアミロイドβ４２ＥＬＩＳＡキット（ＫＨＢ３４４１、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でＡβのレベルを測定した。得られた結果を図１８に示す。
上記で得られた脳組織を皮質及び海馬に分離し、１００ｍＭ ＰＭＳＦ及び１％プロテアーゼ阻害剤が含まれたＲＩＰＡ緩衝液を添加し、組織を均質化させた。均質化された組織を４℃及び１３，０００ｒｐｍの条件下で１０分間遠心分離し、上層液を取得した。得られた上層液を同一の条件で３０分間さらに遠心分離して上層液を取得し、これを試料としてアミロイドβ４０ＥＬＩＳＡキット（ＫＨＢ３４８１、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びアミロイドβ４２ＥＬＩＳＡキット（ＫＨＢ３４４１、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でＡβのレベルを測定した。得られた結果を図１８に示す。
【0111】
図１８に示されるように、脳の皮質及び海馬に存在するＡβ４０は、＃９１０４抗体によりそれぞれ３０．９％及び３０．９％に減少し、陰性対照群と比較して有意に減少している。Ａβ４２においても、陰性対照群と比較して＃９１０４4抗体の投与により有意に減少している。
【0112】
（実験例９：タウ（ｔａｕ）蓄積の確認）
上記実験例８で得られた脳組織切片を用いて、タウ蓄積の変化をタウタンパク質を染色して確認した。具体的には、実験は、一次抗体として抗ＡＴ８抗体（サーモフィッシャーサイエンティフィック、ＭＮ１０２０）を使用した以外は、実験例８－１と同様にして実施し、分析結果を図１９に示す。
上記実験例８で得られた脳組織切片を用いて、タウ蓄積の変化をタウタンパク質を染色して確認した。具体的には、実験は、一次抗体として抗ＡＴ８抗体（サーモフィッシャーサイエンティフィック、ＭＮ１０２０）を使用した以外は、実験例８－１と同様にして実施し、分析結果を図１９に示す。
【0113】
図１９に示されるように、脳の皮質及び海馬に存在するタウタンパク質が、＃９１０４抗体の処理により有意に減少している。
【0114】
（実験例１０：神経炎症改善の確認）
上記実験例６において認知記憶力の改善が確認された動物モデルの脳組織において、＃９１０４抗体による神経炎症改善効果を、小膠細胞（ｍｉｃｒｏｇｌｉａ）及び星状膠細胞（ａｓｔｒｏｃｙｔｅ）活性化によって確認した。実験は、一次抗体として抗ｌｂａ－１抗体（Ｗａｋｏ、０１９－１９９４１）又は抗ＧＦＡＰ抗体（Ｄａｋｏ、Ｎ１５０６）を使用し、二次抗体としてウサギ４８８の二次抗体を使用した以外は、実験例８－１と同様にして実施し、分析結果を図２０及び２１に示す。
上記実験例６において認知記憶力の改善が確認された動物モデルの脳組織において、＃９１０４抗体による神経炎症改善効果を、小膠細胞（ｍｉｃｒｏｇｌｉａ）及び星状膠細胞（ａｓｔｒｏｃｙｔｅ）活性化によって確認した。実験は、一次抗体として抗ｌｂａ－１抗体（Ｗａｋｏ、０１９－１９９４１）又は抗ＧＦＡＰ抗体（Ｄａｋｏ、Ｎ１５０６）を使用し、二次抗体としてウサギ４８８の二次抗体を使用した以外は、実験例８－１と同様にして実施し、分析結果を図２０及び２１に示す。
【0115】
図２０及び２１に示されるように、脳の皮質及び海馬に存在するｌｂａ－１及びＧＦＡＰタンパク質の発現が有意に減少することで、＃９１０４抗体により、脳組織内の小膠細胞及び星状膠細胞の活性が抑制されていることが確認された。
【0116】
従って、上記のような結果から、本発明による抗体は、脳神経炎症を改善する効果があることが分かった。
【0117】
（実験例１１：毒性の確認）
＃９１０４抗体の毒性を次のような方法で確認した。
＃９１０４抗体の毒性を次のような方法で確認した。
【0118】
実験は、上記実験例６において＃９１０４抗体を投与しながら実施した。具体的には、毎週２回マウスの動き及び異常症状を肉眼で観察して生存率を評価し、毎週１回同じ曜日及び時間に、マウスの体重を測定した。また、投与済みのマウスを常法に従って解剖して臓器を観察することで、＃９１０４抗体による臓器の毒性が示されるかどうかを確認した。その結果を、マウスの生存率及び体重変化を図２２に、臓器の毒性の確認結果を図２３に示す。
【0119】
図２２及び２３に示されるように、＃９１０４抗体の処理により生存率及び体重は有意に変化せず、臓器も正常な状態であることが確認された。
【0120】
従って、上記のような結果から、本発明による抗体は、毒性がなく、アルツハイマー病のような脳障害の治療に有意に使用できることが分かった。
【要約】
本発明は、ＡＳＭ（ａｃｉｄ ｓｐｈｉｎｇｏｍｙｅｌｉｎａｓｅ）タンパク質に特異的に結合する抗体の用途に関する。具体的には、本発明に係る抗体又はその抗原結合断片は、ＡＳＭタンパク質に特異的に高結合力で結合し、細胞膜に存在するＡＳＭタンパク質の活性を有意に抑制し、アルツハイマー病の動物モデルにおいて、毒性を示ず、かつ認知記憶力改善効果、ＡＳＭタンパク質活性抑制効果、アミロイドβ及びタウタンパク質蓄積抑制効果、及び神経炎症抑制効果を示し、脳疾患の治療に有用に使用できる。
【選択図】図１
【選択図】図１
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【配列表】