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特許7485273抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体による癌に対する治療応答性を予測又は決定するための方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-05-08
(45)【発行日】2024-05-16
(54)【発明の名称】抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体による癌に対する治療応答性を予測又は決定するための方法
(51)【国際特許分類】
G01N 33/574 20060101AFI20240509BHJP
G01N 33/543 20060101ALI20240509BHJP
G01N 21/64 20060101ALI20240509BHJP
C07K 16/22 20060101ALI20240509BHJP
【ＦＩ】
G01N33/574 A
G01N33/543 501A
G01N33/543 541B
G01N33/543 545A
G01N33/543 575
G01N21/64 F
C07K16/22 ZNA
【請求項の数】
17
(21)【出願番号】P 2020109239
(22)【出願日】2020-06-25
(65)【公開番号】P2022006774
(43)【公開日】2022-01-13
【審査請求日】2023-05-12
(73)【特許権者】
【識別番号】504258527
【氏名又は名称】国立大学法人 鹿児島大学
(73)【特許権者】
【識別番号】000131474
【氏名又は名称】株式会社シノテスト
(74)【代理人】
【識別番号】110002572
【氏名又は名称】弁理士法人平木国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】橋口 照人
(72)【発明者】
【氏名】井本 浩
(72)【発明者】
【氏名】山口 宗一
(72)【発明者】
【氏名】竹之内 和則
(72)【発明者】
【氏名】アリアル ビベック
(72)【発明者】
【氏名】上田 英昭
(72)【発明者】
【氏名】大川 政士
(72)【発明者】
【氏名】山田 晋吾
(72)【発明者】
【氏名】井上 恵一
(72)【発明者】
【氏名】日暮 和彦
【審査官】北条 弥作子
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１３－５３４３０５（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１３－５３４３０６（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２００１／０３６９７２（ＷＯ，Ａ２）
【文献】特表２０１９－５２８０７４（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１７／１１９４３４（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１１／０３６２５６（ＷＯ，Ａ１）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｇ０１Ｎ ３３／５７４
Ｇ０１Ｎ ３３／５３
Ａ６１Ｋ ３９／３９５
Ｃ０７Ｋ １６／２２
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体による治療を受ける又は受けた癌患者における治療応答性をｉｎ ｖｉｔｒｏで予測又は決定するための方法であって、前記患者の抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体投与前及び投与後の血清検体中の全ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦ－Ａ１２１濃度及び／又はＶＥＧＦ－Ａ１６５濃度をそれぞれ、抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体、抗ＶＥＧＦ－Ａ１２１抗体及び／又は抗ＶＥＧＦ－Ａ１６５抗体を用いて測定し、
決定された濃度に基づいて、ＶＥＧＦアイソフォームインデックスを投与前の血清中ＶＥＧＦ-Ａ１６５濃度／血清中ＶＥＧＦ－Ａ１２１の変化率と定義し、ここで血清中ＶＥＧＦ－Ａ１２１の変化率を(投与後ＶＥＧＦ－Ａ１２１濃度－投与前ＶＥＧＦ－Ａ１２１濃度)／投与前ＶＥＧＦ－Ａ１２１濃度と定義するとき、ＶＥＧＦアイソフォームインデックスが１０００を超えない場合、或いは、ＶＥＧＦ－Ａ濃度が６０００ｐｇ／ｍＬを超えない場合、ＶＥＧＦ－Ａ１２１濃度が１０００ｐｇ／ｍＬを超えない場合、ＶＥＧＦ－Ａ１６５濃度が８００ｐｇ／ｍＬを超えない場合、又はＶＥＧＦ－Ａ１２１濃度で(投与後ＶＥＧＦ－Ａ１２１濃度／投与前ＶＥＧＦ－Ａ１２１濃度)が２を超える場合、前記患者の抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体に対する治療応答性又は治療応答性の可能性が示されることを含む、前記方法。
【請求項2】
抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体による治療を受ける又は受けた癌患者における治療応答性をｉｎ ｖｉｔｒｏで予測又は決定するための方法であって、下記の工程（１）～（４）、（１）前記患者の抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体投与前及び投与後の血清検体と、固相化した抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体とを接触させて、前記検体中のＶＥＧＦ－Ａ１２１及び／又はＶＥＧＦ－Ａ１６５を前記抗体と結合させる工程、
（２）前記工程（１）の固相を、ラベル化した抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体、ラベル化した抗ＶＥＧＦ－Ａ１２１抗体、及び／又はラベル化した抗ＶＥＧＦ－Ａ１６５抗体と接触させる工程であって、ただし、前記抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体はすべてのＶＥＧＦ－Ａに結合する抗体であり、前記抗ＶＥＧＦ－Ａ１２１抗体はＶＥＧＦ－Ａ１２１と特異的に結合する抗体であり、及び前記抗ＶＥＧＦ－Ａ１６５抗体はＶＥＧＦ－Ａ１６５と特異的に結合する抗体である、前記工程、
（３）前記工程（２）の固相を洗浄し、及び、前記ラベルからのシグナルを測定して、前記検体中の全ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦ－Ａ１２１、及び／又はＶＥＧＦ－Ａ１６５の各濃度を決定する工程、並びに、
（４）前記工程（３）で決定された濃度に基づいて、ＶＥＧＦアイソフォームインデックスを投与前の血清中ＶＥＧＦ-Ａ１６５濃度／血清中ＶＥＧＦ－Ａ１２１の変化率と定義し、ここで血清中ＶＥＧＦ－Ａ１２１の変化率を(投与後ＶＥＧＦ－Ａ１２１濃度－投与前ＶＥＧＦ－Ａ１２１濃度)／投与前ＶＥＧＦ－Ａ１２１濃度と定義するとき、ＶＥＧＦアイソフォームインデックスが１０００を超えない場合、或いは、ＶＥＧＦ－Ａ濃度が６０００ｐｇ／ｍＬを超えない場合、ＶＥＧＦ－Ａ１２１濃度が１０００ｐｇ／ｍＬを超えない場合、ＶＥＧＦ－Ａ１６５濃度が８００ｐｇ／ｍＬを超えない場合、又はＶＥＧＦ－Ａ１２１濃度で(投与後ＶＥＧＦ－Ａ１２１濃度／投与前ＶＥＧＦ－Ａ１２１濃度)が２を超える場合、前記患者の抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体に対する治療応答性又は治療応答性の可能性が示される工程、
を含む、前記方法。
【請求項3】
抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体による治療を受ける又は受けた癌患者における治療効果をｉｎ ｖｉｔｒｏで予測又は決定するための方法であって、下記の工程（１’）～（４’）、（１’）上記患者の抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体投与前及び投与後の血清検体と、固相化した、抗ＶＥＧＦ－Ａ１２１抗体及び／又は抗ＶＥＧＦ-Ａ１６５抗体とを接触させて、上記検体中のＶＥＧＦ－Ａ１２１又はＶＥＧＦ－Ａ１６５を上記抗体と結合させる工程であって、ただし、上記抗ＶＥＧＦ－Ａ１２１抗体はＶＥＧＦ－Ａ１２１と特異的に結合する抗体であり、かつ抗ＶＥＧＦ－Ａ１６５抗体はＶＥＧＦ－Ａ１６５と特異的に結合する抗体である、上記工程、
（２’）上記工程（１’）の固相を、ラベル化した抗ＶＥＧＦ-Ａ抗体と接触させる工程、
（３’）上記工程（２’）の固相を洗浄し、及び、上記ラベルからのシグナルを測定して、上記検体中の全ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦ－Ａ１２１及び／又はＶＥＧＦ－Ａ１６５の各濃度を決定する工程、並びに、
（４’）前記工程（３’）で決定された濃度に基づいて、ＶＥＧＦアイソフォームインデックスを投与前の血清中ＶＥＧＦ-Ａ１６５濃度／血清中ＶＥＧＦ－Ａ１２１の変化率と定義し、ここで血清中ＶＥＧＦ－Ａ１２１の変化率を(投与後ＶＥＧＦ－Ａ１２１濃度－投与前ＶＥＧＦ－Ａ１２１濃度）／投与前ＶＥＧＦ－Ａ１２１濃度と定義するとき、ＶＥＧＦアイソフォームインデックスが１０００を超えない場合、或いは、ＶＥＧＦ－Ａ濃度が６０００ｐｇ／ｍＬを超えない場合、ＶＥＧＦ－Ａ１２１濃度が１０００ｐｇ／ｍＬを超えない場合、ＶＥＧＦ－Ａ１６５濃度が８００ｐｇ／ｍＬを超えない場合、又はＶＥＧＦ－Ａ１２１濃度で(投与後ＶＥＧＦ－Ａ１２１濃度／投与前ＶＥＧＦ－Ａ１２１濃度)が２を超える場合、上記患者の抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体に対する治療応答性又は治療応答性の可能性が示される工程、
を含む、上記方法。
【請求項4】
前記ラベルが、蛍光ラベル、放射性同位体ラベル、化学発光、及び酵素ラベルからなる群から選択される、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項5】
前記濃度の決定を、免疫学的アッセイによって行う、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項6】
前記抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体が、ベバシズマブである、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項7】
前記癌が、結腸直腸癌、大腸癌、乳癌、肺癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、子宮頸癌及び悪性神経膠腫からなる群から選択される、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項8】
前記ラベル化した抗ＶＥＧＦ－Ａ１２１抗体及びラベル化した抗ＶＥＧＦ－Ａ１６５抗体のラベルが、互いに波長域の異なる蛍光ラベルである、請求項２～７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項9】
前記抗ＶＥＧＦ－Ａ１２１抗体が、下記の（ａ）～（ｃ）に示す抗体からなる群から選択される抗体である、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。（ａ）重鎖可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）の配列として、配列番号１（ＣＤＲ１）、配列番号２（ＣＤＲ２）及び配列番号３（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列、並びに、軽鎖可変領域のＣＤＲ配列として、配列番号４（ＣＤＲ１）、配列番号５（ＣＤＲ２）及び配列番号６（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列をそれぞれ含む抗体
（ｂ）配列番号７の重鎖可変領域のアミノ酸配列、及び、配列番号８の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を含む抗体
（ｃ）配列番号９のヌクレオチド配列によってコードされる重鎖可変領域、及び配列番号１０のヌクレオチド配列によってコードされる軽鎖可変領域を含む抗体
【請求項10】
前記抗ＶＥＧＦ－Ａ１６５抗体が、下記の（ｄ）～（ｆ）に示す抗体からなる群から選択される抗体である、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。（ｄ）重鎖可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）の配列として、配列番号１１（ＣＤＲ１）、配列番号１２（ＣＤＲ２）及び配列番号１３（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列、並びに、軽鎖可変領域のＣＤＲ配列として、配列番号４（ＣＤＲ１）、配列番号５（ＣＤＲ２）及び配列番号１４（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列をそれぞれ含む抗体
（ｅ）配列番号１５の重鎖可変領域のアミノ酸配列、及び、配列番号１６の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を含む抗体
（ｆ）配列番号１７のヌクレオチド配列によってコードされる重鎖可変領域、及び配列番号１８のヌクレオチド配列によってコードされる軽鎖可変領域を含む抗体
【請求項11】
請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法で使用するためのキットであって、固相化したＶＥＧＦポリクローナル抗体及び／又は抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体、ラベル化した抗ＶＥＧＦ－Ａ１２１抗体、及びラベル化した抗ＶＥＧＦ－Ａ１６５抗体を含む前記キット。
【請求項12】
前記方法のための使用説明書をさらに含む、請求項１１に記載のキット。
【請求項13】
前記ラベルが、蛍光ラベル、放射性同位体ラベル、化学発光、又は酵素ラベルである、請求項１１又は１２に記載のキット。
【請求項14】
前記酵素ラベルが、ペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼである、請求項１３に記載のキット。
【請求項15】
前記抗ＶＥＧＦ－Ａ１２１抗体が、下記の（ａ）～（ｃ）に示す抗体からなる群から選択される抗体である、請求項１１～１４のいずれか１項に記載のキット。（ａ）重鎖可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）の配列として、配列番号１（ＣＤＲ１）、配列番号２（ＣＤＲ２）及び配列番号３（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列、並びに、軽鎖可変領域のＣＤＲ配列として、配列番号４（ＣＤＲ１）、配列番号５（ＣＤＲ２）及び配列番号６（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列をそれぞれ含む抗体
（ｂ）配列番号７の重鎖可変領域のアミノ酸配列、及び、配列番号８の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を含む抗体
（ｃ）配列番号９のヌクレオチド配列によってコードされる重鎖可変領域、及び配列番号１０のヌクレオチド配列によってコードされる軽鎖可変領域を含む抗体
【請求項16】
前記抗ＶＥＧＦ－Ａ１６５抗体が、下記の（ｄ）～（ｆ）に示す抗体からなる群から選択される抗体である、請求項１１～１４のいずれか１項に記載のキット。（ｄ）重鎖可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）の配列として、配列番号１１（ＣＤＲ１）、配列番号１２（ＣＤＲ２）及び配列番号１３（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列、並びに、軽鎖可変領域のＣＤＲ配列として、配列番号４（ＣＤＲ１）、配列番号５（ＣＤＲ２）及び配列番号１４（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列をそれぞれ含む抗体
（ｅ）配列番号１５の重鎖可変領域のアミノ酸配列、及び、配列番号１６の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を含む抗体
（ｆ）配列番号１７のヌクレオチド配列によってコードされる重鎖可変領域、及び配列番号１８のヌクレオチド配列によってコードされる軽鎖可変領域を含む抗体
【請求項17】
前記方法が、免疫学的アッセイを使用するものである、請求項１１～１６のいずれか１項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体による治療を受ける又は受けた癌患者における治療応答性（もしくは、治療効果）をｉｎ ｖｉｔｒｏで予測又は決定するための方法を提供する。
【0002】
本発明はまた、上記方法で使用するためのキット、並びに、抗体を提供する。
【背景技術】
【0003】
近年、抗癌剤の開発は目覚ましく、従来の抗癌剤に加えて、癌免疫療法の進歩、分子標的薬の開発によって、多くの癌においてその治療成績は向上してきた。一方、癌の早期診断、進展度判定などに必要なバイオマーカーの開発も盛んに行われるようになっており、分子標的薬を併用した抗癌剤による治療効果を判別できるバイオマーカーの開発が望まれている。
【0004】
血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ；Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ）は、個体の発生、成長時の心血管系・リンパ管の発達に重要な役割を果たす因子の一つであり、ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦ－Ｂ、ＶＥＧＦ－Ｃ、ＶＥＧＦ－ＤのＶＥＧＦファミリーが知られている。ＶＥＧＦは、血管損傷時の血管再生や、糖尿病など病的血管新生、腫瘍血管新生にも中心的な働きをもつ。ＶＥＧＦを標的とする抗ＶＥＧＦ抗体は、現在、癌や加齢黄班変性などの疾患の治療薬として使用されている。
【0005】
一方、抗ＶＥＧＦ抗体は、癌患者によって不応答な場合もあるため、当該抗体による治療前に治療効果を予測することが望まれており、それに関連した多数の特許出願が存在する（特許文献１～１３）。さらにＶＥＧＦをＥＬＩＳＡ等のアッセイ法で検出する方法が特許文献１４、１５などに開示されている。
【0006】
しかしながら、抗ＶＥＧＦ抗体による腫瘍治療応答を予測するバイオマーカーの有効性は検証されていないし（非特許文献１）、また、公知の抗体を用いて抗ＶＥＧＦ抗体の存在下でＶＥＧＦ－Ａレベルを測定することは難しい（特許文献１５）、と云われてきた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0007】
【文献】特表2009-512860号公報
【文献】特表2012-532628号公報
【文献】特表2013-534305号公報
【文献】特表2013-534306号公報
【文献】特表2013-534307号公報
【文献】特表2013-537522号公報
【文献】特表2013-538338号公報
【文献】特表2015-502543号公報
【文献】特開2015-180879号公報
【文献】特開2016-014670号公報
【文献】特開2016-026290号公報
【文献】特表2017-535548号公報
【文献】特開2017-099389号公報
【文献】特表2003-515136号公報
【文献】特表2019-523404号公報
【非特許文献】
【0008】
【文献】M. Canavese et al., Int. J. Cancer 2017;140:2183-2191
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0009】
ＶＥＧＦ－Ａ１２１とＶＥＧＦ－Ａ１６５は、ＶＥＧＦ－Ａの主要な２つのアイソフォーム（すなわち、バリアント）である。ベバシズマブなどの抗ＶＥＧＦ抗体は、当該アイソフォームを認識して中和抗体として作用するが、抗癌剤による治療を行った臨床検体でＶＥＧＦ－Ａ１２１やＶＥＧＦ－Ａ１６５を詳細に検討した報告は少ない。さらにまた、従来のＶＥＧＦ－Ａアッセイ用ＥＬＩＳＡキットは主にＶＥＧＦ－Ａ１２１とＶＥＧＦ－Ａ１６５を一括して測定するものであり、また、市販のＶＥＧＦ－Ａ１２１アッセイ用ＥＬＩＳＡキットは、ＶＥＧＦ－Ａ１６５との交差性に問題があった。このため、抗ＶＥＧＦ抗体による抗腫瘍治療の効果（すなわち、治療応答性）の判定を精確に行うことが妨げられてきた。
【課題を解決するための手段】
【0010】
本発明者らは、上記課題に対し、ＶＥＧＦ－Ａ１２１及びＶＥＧＦ－Ａ１６５のそれぞれと特異的に結合可能な抗体を作製し、それらのラベル化抗体を第二抗体とするサンドイッチアッセイを用いることによって、癌患者の血漿ではなく血清検体中のＶＥＧＦ－Ａ１２１及びＶＥＧＦ－Ａ１６５の各々を精確に測定し得ること、並びに、その測定結果を抗ＶＥＧＦ抗体（例えばベバシズマブ）の治療応答性（もしくは、治療効果）の予測又は決定（もしくは、判定支援）に使用できることを見出した。また、この研究において、血清検体を用いる限り全ＶＥＧＦ－Ａでも治療応答性の予測又は決定に用いることができることを見出した。さらに、血清検体中のＶＥＧＦ－Ａ１２１及びＶＥＧＦ－Ａ１６５の測り分けの有用性を明確にするために、ＶＥＧＦアイソフォームインデックス(ＶＥＧＦ ｉｓｏｆｏｒｍ Ｉｎｄｅｘ)を定義し、それが抗ＶＥＧＦ抗体（例えばベバシズマブ）の治療応答性の予測又は決定に使用できることを見出し、本発明を完成した。
【0011】
本発明の特徴は、以下のとおりである。
[１]抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体による治療を受ける又は受けた癌患者における治療応答性をｉｎ ｖｉｔｒｏで予測又は決定するための方法であって、上記患者の抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体投与前及び投与後の血清検体中の全ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦ－Ａ１２１濃度及び／又はＶＥＧＦ－Ａ１６５濃度をそれぞれ、抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体、抗ＶＥＧＦ－Ａ１２１抗体及び／又は抗ＶＥＧＦ－Ａ１６５抗体を用いて測定し、決定された濃度に基づいて、ＶＥＧＦアイソフォームインデックスを投与前の血清中ＶＥＧＦ-Ａ１６５濃度／血清中ＶＥＧＦ－Ａ１２１の変化率と定義し、ここで血清中ＶＥＧＦ－Ａ１２１の変化率を(投与後ＶＥＧＦ－Ａ１２１濃度－投与前ＶＥＧＦ－Ａ１２１濃度)／投与前ＶＥＧＦ－Ａ１２１濃度と定義するとき、ＶＥＧＦアイソフォームインデックスが１０００を超えないとき、或いは、ＶＥＧＦ－Ａ濃度が６０００ｐｇ／ｍＬを超えないとき、ＶＥＧＦ－Ａ１２１濃度が１０００ｐｇ／ｍＬを超えないとき、ＶＥＧＦ－Ａ１６５濃度が８００ｐｇ／ｍＬを超えないとき、又はＶＥＧＦ－Ａ１２１濃度で(投与後ＶＥＧＦ－Ａ１２１濃度／投与前ＶＥＧＦ－Ａ１２１濃度)が２を超えるとき、前記患者は、抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体に対し治療応答性があると予測又は決定することを含む、上記方法。
[１]抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体による治療を受ける又は受けた癌患者における治療応答性をｉｎ ｖｉｔｒｏで予測又は決定するための方法であって、上記患者の抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体投与前及び投与後の血清検体中の全ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦ－Ａ１２１濃度及び／又はＶＥＧＦ－Ａ１６５濃度をそれぞれ、抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体、抗ＶＥＧＦ－Ａ１２１抗体及び／又は抗ＶＥＧＦ－Ａ１６５抗体を用いて測定し、決定された濃度に基づいて、ＶＥＧＦアイソフォームインデックスを投与前の血清中ＶＥＧＦ-Ａ１６５濃度／血清中ＶＥＧＦ－Ａ１２１の変化率と定義し、ここで血清中ＶＥＧＦ－Ａ１２１の変化率を(投与後ＶＥＧＦ－Ａ１２１濃度－投与前ＶＥＧＦ－Ａ１２１濃度)／投与前ＶＥＧＦ－Ａ１２１濃度と定義するとき、ＶＥＧＦアイソフォームインデックスが１０００を超えないとき、或いは、ＶＥＧＦ－Ａ濃度が６０００ｐｇ／ｍＬを超えないとき、ＶＥＧＦ－Ａ１２１濃度が１０００ｐｇ／ｍＬを超えないとき、ＶＥＧＦ－Ａ１６５濃度が８００ｐｇ／ｍＬを超えないとき、又はＶＥＧＦ－Ａ１２１濃度で(投与後ＶＥＧＦ－Ａ１２１濃度／投与前ＶＥＧＦ－Ａ１２１濃度)が２を超えるとき、前記患者は、抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体に対し治療応答性があると予測又は決定することを含む、上記方法。
【0012】
[２]抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体による治療を受ける又は受けた癌患者における治療応答性をｉｎ ｖｉｔｒｏで予測又は決定するための方法であって、下記の工程（１）～（４）、
（１）上記患者の抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体投与前及び投与後の血清検体と、固相化した抗ＶＥＧＦポリクローナル抗体及び／又は抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体とを接触させて、上記検体中のＶＥＧＦ－Ａ１２１及び／又はＶＥＧＦ－Ａ１６５を上記抗体と結合させる工程、
（２）上記工程（１）の固相を、ラベル化した抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体、ラベル化した抗ＶＥＧＦ－Ａ１２１抗体、及び／又はラベル化した抗ＶＥＧＦ－Ａ１６５抗体と接触させる工程であって、ただし、上記抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体はすべてのＶＥＧＦ－Ａに結合する抗体であり、上記抗ＶＥＧＦ－Ａ１２１抗体はＶＥＧＦ－Ａ１２１と特異的に結合する抗体であり、及び抗ＶＥＧＦ－Ａ１６５抗体はＶＥＧＦ－Ａ１６５と特異的に結合する抗体である、上記工程、
（３）上記工程（２）の固相を洗浄し、及び、上記ラベルからのシグナルを測定して、上記検体中の全ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦ－Ａ１２１、及び／又はＶＥＧＦ－Ａ１６５の各濃度を決定する工程、並びに、
（４）上記工程（３）で決定された濃度に基づいて、ＶＥＧＦアイソフォームインデックスを投与前の血清中ＶＥＧＦ-Ａ１６５濃度／血清中ＶＥＧＦ－Ａ１２１の変化率と定義し、ここで血清中ＶＥＧＦ－Ａ１２１の変化率を(投与後ＶＥＧＦ－Ａ１２１濃度－投与前ＶＥＧＦ－Ａ１２１濃度)／投与前ＶＥＧＦ－Ａ１２１濃度と定義するとき、ＶＥＧＦアイソフォームインデックスが１０００を超えないとき、或いは、ＶＥＧＦ－Ａ濃度が６０００ｐｇ／ｍＬを超えないとき、ＶＥＧＦ－Ａ１２１濃度が１０００ｐｇ／ｍＬを超えないとき、ＶＥＧＦ－Ａ１６５濃度が８００ｐｇ／ｍＬを超えないとき、又はＶＥＧＦ－Ａ１２１濃度で(投与後ＶＥＧＦ－Ａ１２１濃度／投与前ＶＥＧＦ－Ａ１２１濃度)が２を超えるとき、上記患者は、抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体に対し治療応答性があると予測又は決定する工程を含む、上記方法。
（１）上記患者の抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体投与前及び投与後の血清検体と、固相化した抗ＶＥＧＦポリクローナル抗体及び／又は抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体とを接触させて、上記検体中のＶＥＧＦ－Ａ１２１及び／又はＶＥＧＦ－Ａ１６５を上記抗体と結合させる工程、
（２）上記工程（１）の固相を、ラベル化した抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体、ラベル化した抗ＶＥＧＦ－Ａ１２１抗体、及び／又はラベル化した抗ＶＥＧＦ－Ａ１６５抗体と接触させる工程であって、ただし、上記抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体はすべてのＶＥＧＦ－Ａに結合する抗体であり、上記抗ＶＥＧＦ－Ａ１２１抗体はＶＥＧＦ－Ａ１２１と特異的に結合する抗体であり、及び抗ＶＥＧＦ－Ａ１６５抗体はＶＥＧＦ－Ａ１６５と特異的に結合する抗体である、上記工程、
（３）上記工程（２）の固相を洗浄し、及び、上記ラベルからのシグナルを測定して、上記検体中の全ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦ－Ａ１２１、及び／又はＶＥＧＦ－Ａ１６５の各濃度を決定する工程、並びに、
（４）上記工程（３）で決定された濃度に基づいて、ＶＥＧＦアイソフォームインデックスを投与前の血清中ＶＥＧＦ-Ａ１６５濃度／血清中ＶＥＧＦ－Ａ１２１の変化率と定義し、ここで血清中ＶＥＧＦ－Ａ１２１の変化率を(投与後ＶＥＧＦ－Ａ１２１濃度－投与前ＶＥＧＦ－Ａ１２１濃度)／投与前ＶＥＧＦ－Ａ１２１濃度と定義するとき、ＶＥＧＦアイソフォームインデックスが１０００を超えないとき、或いは、ＶＥＧＦ－Ａ濃度が６０００ｐｇ／ｍＬを超えないとき、ＶＥＧＦ－Ａ１２１濃度が１０００ｐｇ／ｍＬを超えないとき、ＶＥＧＦ－Ａ１６５濃度が８００ｐｇ／ｍＬを超えないとき、又はＶＥＧＦ－Ａ１２１濃度で(投与後ＶＥＧＦ－Ａ１２１濃度／投与前ＶＥＧＦ－Ａ１２１濃度)が２を超えるとき、上記患者は、抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体に対し治療応答性があると予測又は決定する工程を含む、上記方法。
【0013】
[３]抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体による治療を受ける又は受けた癌患者における治療効果をｉｎ ｖｉｔｒｏで予測又は決定するための方法であって、下記の工程（１’）～（４’）、
（１’）上記患者の抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体投与前及び投与後の血清検体と、固相化した抗ＶＥＧＦ－Ａ１２１抗体、及び／又は抗ＶＥＧＦ-Ａ１６５抗体とを接触させて、上記検体中のＶＥＧＦ－Ａ１２１又はＶＥＧＦ－Ａ１６５を上記抗体と結合させる工程であって、ただし、上記抗ＶＥＧＦ－Ａ１２１抗体はＶＥＧＦ－Ａ１２１と特異的に結合する抗体であり、かつ抗ＶＥＧＦ－Ａ１６５抗体はＶＥＧＦ－Ａ１６５と特異的に結合する抗体である、上記工程、
（２’）上記工程（１’）の固相を、ラベル化した抗ＶＥＧＦ-Ａ抗体と接触させる工程、
（３’）上記工程（２’）の固相を洗浄し、及び、上記ラベルからのシグナルを測定して、上記検体中の全ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦ－Ａ１２１及び／又はＶＥＧＦ－Ａ１６５の各濃度を決定する工程、並びに、
（４’）上記工程（３’）で決定された濃度に基づいて、ＶＥＧＦアイソフォームインデックスを投与前の血清中ＶＥＧＦ-Ａ１６５濃度／血清中ＶＥＧＦ－Ａ１２１の変化率と定義し、ここで血清中ＶＥＧＦ－Ａ１２１の変化率を(投与後ＶＥＧＦ－Ａ１２１濃度－投与前ＶＥＧＦ－Ａ１２１濃度）／投与前ＶＥＧＦ－Ａ１２１濃度と定義するとき、ＶＥＧＦアイソフォームインデックスが１０００を超えないとき、或いは、ＶＥＧＦ－Ａ濃度が６０００ｐｇ／ｍＬを超えないとき、ＶＥＧＦ－Ａ１２１濃度が１０００ｐｇ／ｍＬを超えないとき、ＶＥＧＦ－Ａ１６５濃度が８００ｐｇ／ｍＬを超えないとき、又はＶＥＧＦ－Ａ１２１濃度で(投与後ＶＥＧＦ－Ａ１２１濃度／投与前ＶＥＧＦ－Ａ１２１濃度)が２を超えるとき、上記患者は、抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体に対し治療応答性があると予測又は決定する工程、
を含む、上記方法。
（１’）上記患者の抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体投与前及び投与後の血清検体と、固相化した抗ＶＥＧＦ－Ａ１２１抗体、及び／又は抗ＶＥＧＦ-Ａ１６５抗体とを接触させて、上記検体中のＶＥＧＦ－Ａ１２１又はＶＥＧＦ－Ａ１６５を上記抗体と結合させる工程であって、ただし、上記抗ＶＥＧＦ－Ａ１２１抗体はＶＥＧＦ－Ａ１２１と特異的に結合する抗体であり、かつ抗ＶＥＧＦ－Ａ１６５抗体はＶＥＧＦ－Ａ１６５と特異的に結合する抗体である、上記工程、
（２’）上記工程（１’）の固相を、ラベル化した抗ＶＥＧＦ-Ａ抗体と接触させる工程、
（３’）上記工程（２’）の固相を洗浄し、及び、上記ラベルからのシグナルを測定して、上記検体中の全ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦ－Ａ１２１及び／又はＶＥＧＦ－Ａ１６５の各濃度を決定する工程、並びに、
（４’）上記工程（３’）で決定された濃度に基づいて、ＶＥＧＦアイソフォームインデックスを投与前の血清中ＶＥＧＦ-Ａ１６５濃度／血清中ＶＥＧＦ－Ａ１２１の変化率と定義し、ここで血清中ＶＥＧＦ－Ａ１２１の変化率を(投与後ＶＥＧＦ－Ａ１２１濃度－投与前ＶＥＧＦ－Ａ１２１濃度）／投与前ＶＥＧＦ－Ａ１２１濃度と定義するとき、ＶＥＧＦアイソフォームインデックスが１０００を超えないとき、或いは、ＶＥＧＦ－Ａ濃度が６０００ｐｇ／ｍＬを超えないとき、ＶＥＧＦ－Ａ１２１濃度が１０００ｐｇ／ｍＬを超えないとき、ＶＥＧＦ－Ａ１６５濃度が８００ｐｇ／ｍＬを超えないとき、又はＶＥＧＦ－Ａ１２１濃度で(投与後ＶＥＧＦ－Ａ１２１濃度／投与前ＶＥＧＦ－Ａ１２１濃度)が２を超えるとき、上記患者は、抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体に対し治療応答性があると予測又は決定する工程、
を含む、上記方法。
【0014】
[４]上記ラベルが、蛍光ラベル、放射性同位体ラベル、化学発光、及び酵素ラベルからなる群から選択される、上記[２]又は[３]に記載の方法。
[５]上記濃度の決定を、免疫学的アッセイによって行う、上記[１]～[４]のいずれかに記載の方法。
[６]上記抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体が、ベバシズマブである、上記[１]～[５]のいずれかに記載の方法。
[７]上記癌が、結腸直腸癌、大腸癌、乳癌、肺癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、子宮頸癌及び悪性神経膠腫からなる群から選択される、上記[１]～[６]のいずれかに記載の方法。
[８]上記ラベル化した抗ＶＥＧＦ－Ａ１２１抗体及びラベル化した抗ＶＥＧＦ－Ａ１６５抗体のラベルが、互いに波長域の異なる蛍光ラベルである、上記[２]～[７]のいずれかに記載の方法。
[９]上記抗ＶＥＧＦ－Ａ１２１抗体が、下記の（ａ）～（ｃ）に示す抗体からなる群から選択される抗体である、[１]～[８]のいずれかに記載の方法。
（ａ）重鎖可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）の配列として、配列番号１（ＣＤＲ１）、配列番号２（ＣＤＲ２）及び配列番号３（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列、並びに、軽鎖可変領域のＣＤＲ配列として、配列番号４（ＣＤＲ１）、配列番号５（ＣＤＲ２）及び配列番号６（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列をそれぞれ含む抗体
（ｂ）配列番号７の重鎖可変領域のアミノ酸配列、及び、配列番号８の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を含む抗体
（ｃ）配列番号９のヌクレオチド配列によってコードされる重鎖可変領域、及び配列番号１０のヌクレオチド配列によってコードされる軽鎖可変領域を含む抗体
[１０]上記抗ＶＥＧＦ－Ａ１６５抗体が、下記の（ｄ）～（ｆ）に示す抗体からなる群から選択される抗体である、[１]～[８]のいずれかに記載の方法。
（ｄ）重鎖可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）の配列として、配列番号１１（ＣＤＲ１）、配列番号１２（ＣＤＲ２）及び配列番号１３（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列、並びに、軽鎖可変領域のＣＤＲ配列として、配列番号４（ＣＤＲ１）、配列番号５（ＣＤＲ２）及び配列番号１４（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列をそれぞれ含む抗体
（ｅ）配列番号１５の重鎖可変領域のアミノ酸配列、及び、配列番号１６の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を含む抗体
（ｆ）配列番号１７のヌクレオチド配列によってコードされる重鎖可変領域、及び配列番号１８のヌクレオチド配列によってコードされる軽鎖可変領域を含む抗体
[５]上記濃度の決定を、免疫学的アッセイによって行う、上記[１]～[４]のいずれかに記載の方法。
[６]上記抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体が、ベバシズマブである、上記[１]～[５]のいずれかに記載の方法。
[７]上記癌が、結腸直腸癌、大腸癌、乳癌、肺癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、子宮頸癌及び悪性神経膠腫からなる群から選択される、上記[１]～[６]のいずれかに記載の方法。
[８]上記ラベル化した抗ＶＥＧＦ－Ａ１２１抗体及びラベル化した抗ＶＥＧＦ－Ａ１６５抗体のラベルが、互いに波長域の異なる蛍光ラベルである、上記[２]～[７]のいずれかに記載の方法。
[９]上記抗ＶＥＧＦ－Ａ１２１抗体が、下記の（ａ）～（ｃ）に示す抗体からなる群から選択される抗体である、[１]～[８]のいずれかに記載の方法。
（ａ）重鎖可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）の配列として、配列番号１（ＣＤＲ１）、配列番号２（ＣＤＲ２）及び配列番号３（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列、並びに、軽鎖可変領域のＣＤＲ配列として、配列番号４（ＣＤＲ１）、配列番号５（ＣＤＲ２）及び配列番号６（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列をそれぞれ含む抗体
（ｂ）配列番号７の重鎖可変領域のアミノ酸配列、及び、配列番号８の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を含む抗体
（ｃ）配列番号９のヌクレオチド配列によってコードされる重鎖可変領域、及び配列番号１０のヌクレオチド配列によってコードされる軽鎖可変領域を含む抗体
[１０]上記抗ＶＥＧＦ－Ａ１６５抗体が、下記の（ｄ）～（ｆ）に示す抗体からなる群から選択される抗体である、[１]～[８]のいずれかに記載の方法。
（ｄ）重鎖可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）の配列として、配列番号１１（ＣＤＲ１）、配列番号１２（ＣＤＲ２）及び配列番号１３（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列、並びに、軽鎖可変領域のＣＤＲ配列として、配列番号４（ＣＤＲ１）、配列番号５（ＣＤＲ２）及び配列番号１４（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列をそれぞれ含む抗体
（ｅ）配列番号１５の重鎖可変領域のアミノ酸配列、及び、配列番号１６の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を含む抗体
（ｆ）配列番号１７のヌクレオチド配列によってコードされる重鎖可変領域、及び配列番号１８のヌクレオチド配列によってコードされる軽鎖可変領域を含む抗体
【0015】
[１１]上記[１]～[１０]のいずれかに記載の方法で使用するためのキットであって、固相化したＶＥＧＦポリクローナル抗体及び／又は抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体、ラベル化した抗ＶＥＧＦ－Ａ１２１抗体、及びラベル化した抗ＶＥＧＦ－Ａ１６５抗体を含む上記キット。
[１２]上記方法のための使用説明書をさらに含む、上記[１１]に記載のキット。
[１３]上記ラベルが、蛍光ラベル、放射性同位体ラベル、化学発光、又は酵素ラベルである、上記[１１]又は[１２]に記載のキット。
[１４]上記酵素ラベルが、ペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼである、上記[１３]に記載のキット。
[１５]上記抗ＶＥＧＦ－Ａ１２１抗体が、下記の（ａ）～（ｃ）に示す抗体からなる群から選択される抗体である、上記[１１]～[１４]のいずれかに記載のキット。
（ａ）重鎖可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）の配列として、配列番号１（ＣＤＲ１）、配列番号２（ＣＤＲ２）及び配列番号３（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列、並びに、軽鎖可変領域のＣＤＲ配列として、配列番号４（ＣＤＲ１）、配列番号５（ＣＤＲ２）及び配列番号６（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列をそれぞれ含む抗体
（ｂ）配列番号７の重鎖可変領域のアミノ酸配列、及び、配列番号８の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を含む抗体
（ｃ）配列番号９のヌクレオチド配列によってコードされる重鎖可変領域、及び配列番号１０のヌクレオチド配列によってコードされる軽鎖可変領域を含む抗体
[１６]上記抗ＶＥＧＦ－Ａ１６５抗体が、下記の（ｄ）～（ｆ）に示す抗体からなる群から選択される抗体である、[１１]～[１４]のいずれかに記載のキット。
（ｄ）重鎖可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）の配列として、配列番号１１（ＣＤＲ１）、配列番号１２（ＣＤＲ２）及び配列番号１３（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列、並びに、軽鎖可変領域のＣＤＲ配列として、配列番号４（ＣＤＲ１）、配列番号５（ＣＤＲ２）及び配列番号１４（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列をそれぞれ含む抗体
（ｅ）配列番号１５の重鎖可変領域のアミノ酸配列、及び、配列番号１６の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を含む抗体
（ｆ）配列番号１７のヌクレオチド配列によってコードされる重鎖可変領域、及び配列番号１８のヌクレオチド配列によってコードされる軽鎖可変領域を含む抗体
[１７]上記方法が、免疫学的アッセイを使用するものである、上記[１１]～[１６]のいずれかに記載のキット。
[１２]上記方法のための使用説明書をさらに含む、上記[１１]に記載のキット。
[１３]上記ラベルが、蛍光ラベル、放射性同位体ラベル、化学発光、又は酵素ラベルである、上記[１１]又は[１２]に記載のキット。
[１４]上記酵素ラベルが、ペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼである、上記[１３]に記載のキット。
[１５]上記抗ＶＥＧＦ－Ａ１２１抗体が、下記の（ａ）～（ｃ）に示す抗体からなる群から選択される抗体である、上記[１１]～[１４]のいずれかに記載のキット。
（ａ）重鎖可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）の配列として、配列番号１（ＣＤＲ１）、配列番号２（ＣＤＲ２）及び配列番号３（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列、並びに、軽鎖可変領域のＣＤＲ配列として、配列番号４（ＣＤＲ１）、配列番号５（ＣＤＲ２）及び配列番号６（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列をそれぞれ含む抗体
（ｂ）配列番号７の重鎖可変領域のアミノ酸配列、及び、配列番号８の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を含む抗体
（ｃ）配列番号９のヌクレオチド配列によってコードされる重鎖可変領域、及び配列番号１０のヌクレオチド配列によってコードされる軽鎖可変領域を含む抗体
[１６]上記抗ＶＥＧＦ－Ａ１６５抗体が、下記の（ｄ）～（ｆ）に示す抗体からなる群から選択される抗体である、[１１]～[１４]のいずれかに記載のキット。
（ｄ）重鎖可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）の配列として、配列番号１１（ＣＤＲ１）、配列番号１２（ＣＤＲ２）及び配列番号１３（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列、並びに、軽鎖可変領域のＣＤＲ配列として、配列番号４（ＣＤＲ１）、配列番号５（ＣＤＲ２）及び配列番号１４（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列をそれぞれ含む抗体
（ｅ）配列番号１５の重鎖可変領域のアミノ酸配列、及び、配列番号１６の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を含む抗体
（ｆ）配列番号１７のヌクレオチド配列によってコードされる重鎖可変領域、及び配列番号１８のヌクレオチド配列によってコードされる軽鎖可変領域を含む抗体
[１７]上記方法が、免疫学的アッセイを使用するものである、上記[１１]～[１６]のいずれかに記載のキット。
【0016】
[１８]下記の（ａ）～（ｃ）に示す抗体からなる群から選択される抗ＶＥＧＦ－Ａ１２１抗体。
（ａ）重鎖可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）の配列として、配列番号１（ＣＤＲ１）、配列番号２（ＣＤＲ２）及び配列番号３（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列、並びに、軽鎖可変領域のＣＤＲ配列として、配列番号４（ＣＤＲ１）、配列番号５（ＣＤＲ２）及び配列番号６（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列をそれぞれ含む抗体
（ｂ）配列番号７の重鎖可変領域のアミノ酸配列、及び、配列番号８の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を含む抗体
（ｃ）配列番号９のヌクレオチド配列によってコードされる重鎖可変領域、及び配列番号１０のヌクレオチド配列によってコードされる軽鎖可変領域を含む抗体
[１９]下記の（ｄ）～（ｆ）に示す抗体からなる群から選択される抗ＶＥＧＦ－Ａ１６５抗体。
（ｄ）重鎖可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）の配列として、配列番号１１（ＣＤＲ１）、配列番号１２（ＣＤＲ２）及び配列番号１３（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列、並びに、軽鎖可変領域のＣＤＲ配列として、配列番号４（ＣＤＲ１）、配列番号５（ＣＤＲ２）及び配列番号１４（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列をそれぞれ含む抗体
（ｅ）配列番号１５の重鎖可変領域のアミノ酸配列、及び、配列番号１６の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を含む抗体
（ｆ）配列番号１７のヌクレオチド配列によってコードされる重鎖可変領域、及び配列番号１８のヌクレオチド配列によってコードされる軽鎖可変領域を含む抗体
[２０]ラベル化されている、上記[１８]又は[１９]に記載の抗体。
[２１]上記ラベルが、蛍光ラベル、放射性同位体ラベル、化学発光、又は酵素ラベルである、上記[２０]に記載の抗体。
（ａ）重鎖可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）の配列として、配列番号１（ＣＤＲ１）、配列番号２（ＣＤＲ２）及び配列番号３（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列、並びに、軽鎖可変領域のＣＤＲ配列として、配列番号４（ＣＤＲ１）、配列番号５（ＣＤＲ２）及び配列番号６（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列をそれぞれ含む抗体
（ｂ）配列番号７の重鎖可変領域のアミノ酸配列、及び、配列番号８の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を含む抗体
（ｃ）配列番号９のヌクレオチド配列によってコードされる重鎖可変領域、及び配列番号１０のヌクレオチド配列によってコードされる軽鎖可変領域を含む抗体
[１９]下記の（ｄ）～（ｆ）に示す抗体からなる群から選択される抗ＶＥＧＦ－Ａ１６５抗体。
（ｄ）重鎖可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）の配列として、配列番号１１（ＣＤＲ１）、配列番号１２（ＣＤＲ２）及び配列番号１３（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列、並びに、軽鎖可変領域のＣＤＲ配列として、配列番号４（ＣＤＲ１）、配列番号５（ＣＤＲ２）及び配列番号１４（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列をそれぞれ含む抗体
（ｅ）配列番号１５の重鎖可変領域のアミノ酸配列、及び、配列番号１６の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を含む抗体
（ｆ）配列番号１７のヌクレオチド配列によってコードされる重鎖可変領域、及び配列番号１８のヌクレオチド配列によってコードされる軽鎖可変領域を含む抗体
[２０]ラベル化されている、上記[１８]又は[１９]に記載の抗体。
[２１]上記ラベルが、蛍光ラベル、放射性同位体ラベル、化学発光、又は酵素ラベルである、上記[２０]に記載の抗体。
【発明の効果】
【0017】
本発明により、抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体治療を受ける又は受けた癌患者の血清検体中の全ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦ－Ａ１２１及びＶＥＧＦ－Ａ１６５の各々を精確に測定し得ること、並びに、その測定結果を抗ＶＥＧＦ抗体（例えばベバシズマブ）の治療応答性（もしくは、治療効果）の予測又は決定（もしくは、判定支援）に使用できる。
【図面の簡単な説明】
【0018】
【図1】この図は、抗ＶＥＧＦ－Ａ１６５モノクローナル抗体「クローン名:４Ｆ９Ａ９Ｇ９」（ａｎｔｉ－ＶＥＧＦ－Ａ１６５ｍＡｂ）及び抗ＶＥＧＦ－Ａ１２１モノクローナル抗体「クローン名:５Ａ６Ｇ４Ｃ８」（ａｎｔｉ－ＶＥＧＦ－Ａ１２１ｍＡｂ）の、組換えヒトＶＥＧＦ－Ａ１６５「ｒｈ１６５」又は組換えヒトＶＥＧＦ－Ａ１２１「ｒｈ１２１」に対する交差反応性の結果（それぞれ、図１Ａ、図１Ｂ）を示す。
【図2A】この図は、ベバシズマブによる抗癌治療を受けた、進行性大腸癌と診断された患者１２例について、抗ＶＥＧＦ－Ａモノクローナル抗体、抗ＶＥＧＦ－Ａ１２１モノクローナル抗体「クローン名:５Ａ６Ｇ４Ｃ８」及び抗ＶＥＧＦ－Ａ１６５モノクローナル抗体「クローン名:４Ｆ９Ａ９Ｇ９」を用いて、ベバシズマブ投与前（Ｔ０）と投与後（Ｔ１；投与開始後２週間目）の上記患者の血清中の全ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦ－Ａ１２１及びＶＥＧＦ－Ａ１６５を測定した結果を示す。図中、ＰＤは治療予後不良症例（ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ ｄｉｓｅａｓｅ）を表し、ｎｏｎ－ＰＤは治療予後良好症例（ｎｏｎ－ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ ｄｉｓｅａｓｅ）を表す。
【図2B】この図は、ベバシズマブによる抗癌治療を受けた進行性大腸癌患者１２例について、抗ＶＥＧＦ－Ａモノクローナル抗体、抗ＶＥＧＦ－Ａ１２１モノクローナル抗体「クローン名:５Ａ６Ｇ４Ｃ８」及び抗ＶＥＧＦ－Ａ１６５モノクローナル抗体「クローン名:４Ｆ９Ａ９Ｇ９」を用いて、ベバシズマブ投与前と投与後（投与開始後２週間目）の上記患者の血漿中の全ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦ－Ａ１２１及びＶＥＧＦ－Ａ１６５を測定した結果を示す。図中、ＰＤ及びｎｏｎ－ＰＤはそれぞれ治療予後不良症例、治療予後良好症例を表す。
【図3】この図は、ＶＥＧＦアイソフォームインデックスを示す。図中、ＰＤ及びｎｏｎ－ＰＤはそれぞれ治療予後不良症例、治療予後良好症例を表す。図中、バーはそれぞれＰＤ及びｎｏｎ－ＰＤの場合の測定値の平均を表す。
【発明を実施するための形態】
【0019】
本発明をさらに詳細に説明する。
【0020】
１．治療応答性の予測又は決定方法
本発明は、第一の態様により、抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体による治療を受ける又は受けた癌患者における治療応答性をｉｎ ｖｉｔｒｏで予測又は決定（もしくは、判定支援）するための方法であって、上記患者の抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体投与前及び投与後の血清検体中の全ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦ－Ａ１２１濃度及び／又はＶＥＧＦ－Ａ１６５濃度をそれぞれ、抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体、抗ＶＥＧＦ－Ａ１２１抗体及び／又は抗ＶＥＧＦ－Ａ１６５抗体を用いて測定し、決定された濃度に基づいて、ＶＥＧＦアイソフォームインデックスを投与前の血清中ＶＥＧＦ-Ａ１６５濃度／血清中ＶＥＧＦ－Ａ１２１の変化率と定義し、ここで血清中ＶＥＧＦ－Ａ１２１の変化率を(投与後ＶＥＧＦ－Ａ１２１濃度－投与前ＶＥＧＦ－Ａ１２１濃度)／投与前ＶＥＧＦ－Ａ１２１濃度と定義するとき、ＶＥＧＦアイソフォームインデックスが１０００を超えないとき、ＶＥＧＦ－Ａ濃度が６０００ｐｇ／ｍＬを超えないとき、ＶＥＧＦ－Ａ１２１濃度が１０００ｐｇ／ｍＬを超えないとき、或いは、ＶＥＧＦ－Ａ１６５濃度が８００ｐｇ／ｍＬを超えないとき、又はＶＥＧＦ－Ａ１２１濃度で(投与後ＶＥＧＦ－Ａ１２１濃度／投与前ＶＥＧＦ－Ａ１２１濃度)が２を超えるとき、上記患者は、抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体に対し治療応答性があると予測又は決定することを含む、上記方法。
本発明は、第一の態様により、抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体による治療を受ける又は受けた癌患者における治療応答性をｉｎ ｖｉｔｒｏで予測又は決定（もしくは、判定支援）するための方法であって、上記患者の抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体投与前及び投与後の血清検体中の全ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦ－Ａ１２１濃度及び／又はＶＥＧＦ－Ａ１６５濃度をそれぞれ、抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体、抗ＶＥＧＦ－Ａ１２１抗体及び／又は抗ＶＥＧＦ－Ａ１６５抗体を用いて測定し、決定された濃度に基づいて、ＶＥＧＦアイソフォームインデックスを投与前の血清中ＶＥＧＦ-Ａ１６５濃度／血清中ＶＥＧＦ－Ａ１２１の変化率と定義し、ここで血清中ＶＥＧＦ－Ａ１２１の変化率を(投与後ＶＥＧＦ－Ａ１２１濃度－投与前ＶＥＧＦ－Ａ１２１濃度)／投与前ＶＥＧＦ－Ａ１２１濃度と定義するとき、ＶＥＧＦアイソフォームインデックスが１０００を超えないとき、ＶＥＧＦ－Ａ濃度が６０００ｐｇ／ｍＬを超えないとき、ＶＥＧＦ－Ａ１２１濃度が１０００ｐｇ／ｍＬを超えないとき、或いは、ＶＥＧＦ－Ａ１６５濃度が８００ｐｇ／ｍＬを超えないとき、又はＶＥＧＦ－Ａ１２１濃度で(投与後ＶＥＧＦ－Ａ１２１濃度／投与前ＶＥＧＦ－Ａ１２１濃度)が２を超えるとき、上記患者は、抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体に対し治療応答性があると予測又は決定することを含む、上記方法。
【0021】
本発明は、第二の態様により、抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体による治療を受ける又は受けた癌患者における治療効果をｉｎ ｖｉｔｒｏで予測又は決定（もしくは、判定支援）するための方法であって、下記の工程（１）～（４）、すなわち、
（１）上記患者の抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体投与前及び投与後の血清検体と、固相化した抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体とを接触させて、上記検体中のＶＥＧＦ－Ａ１２１及び／又はＶＥＧＦ－Ａ１６５を上記抗体と結合させる工程、
（２）上記工程（１）の固相を、ラベル化した抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体、ラベル化した抗ＶＥＧＦ－Ａ１２１抗体、及び／又はラベル化した抗ＶＥＧＦ－Ａ１６５抗体と接触させる工程であって、ただし、上記抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体はすべてのＶＥＧＦ－Ａに結合する抗体であり、抗ＶＥＧＦ－Ａ１２１抗体はＶＥＧＦ－Ａ１２１と特異的に結合する抗体であり、かつ抗ＶＥＧＦ－Ａ１６５抗体はＶＥＧＦ－Ａ１６５と特異的に結合する抗体である、上記工程、
（３）上記工程（２）の固相を洗浄し、及び、上記ラベルからのシグナルを測定して、上記検体中の全ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦ－Ａ１２１、及び／又はＶＥＧＦ－Ａ１６５の各濃度を決定する工程、並びに、
（４）上記工程（３）で決定された濃度に基づいて、ＶＥＧＦアイソフォームインデックスを投与前の血清中ＶＥＧＦ－Ａ１６５濃度／血清中ＶＥＧＦ－Ａ１２１の変化率と定義し、及び、血清中ＶＥＧＦ－Ａ１２１の変化率を（投与後ＶＥＧＦ－Ａ１２１濃度－投与前ＶＥＧＦ－Ａ１２１濃度）／投与前ＶＥＧＦ－Ａ１２１濃度と定義するとき、ＶＥＧＦアイソフォームインデックスが１０００を超えないとき、或いは、ＶＥＧＦ－Ａ濃度が６０００ｐｇ／ｍＬを超えないとき、ＶＥＧＦ－Ａ１２１濃度が１０００ｐｇ／ｍＬを超えないとき、ＶＥＧＦ－Ａ１６５濃度が８００ｐｇ／ｍＬを超えないとき、又はＶＥＧＦ－Ａ１２１濃度で(投与後ＶＥＧＦ－Ａ１２１濃度／投与前ＶＥＧＦ－Ａ１２１濃度)が２を超えるとき、上記患者は、抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体に対し治療応答性があると予測又は決定する工程、
を含む、上記方法を提供する。
（１）上記患者の抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体投与前及び投与後の血清検体と、固相化した抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体とを接触させて、上記検体中のＶＥＧＦ－Ａ１２１及び／又はＶＥＧＦ－Ａ１６５を上記抗体と結合させる工程、
（２）上記工程（１）の固相を、ラベル化した抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体、ラベル化した抗ＶＥＧＦ－Ａ１２１抗体、及び／又はラベル化した抗ＶＥＧＦ－Ａ１６５抗体と接触させる工程であって、ただし、上記抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体はすべてのＶＥＧＦ－Ａに結合する抗体であり、抗ＶＥＧＦ－Ａ１２１抗体はＶＥＧＦ－Ａ１２１と特異的に結合する抗体であり、かつ抗ＶＥＧＦ－Ａ１６５抗体はＶＥＧＦ－Ａ１６５と特異的に結合する抗体である、上記工程、
（３）上記工程（２）の固相を洗浄し、及び、上記ラベルからのシグナルを測定して、上記検体中の全ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦ－Ａ１２１、及び／又はＶＥＧＦ－Ａ１６５の各濃度を決定する工程、並びに、
（４）上記工程（３）で決定された濃度に基づいて、ＶＥＧＦアイソフォームインデックスを投与前の血清中ＶＥＧＦ－Ａ１６５濃度／血清中ＶＥＧＦ－Ａ１２１の変化率と定義し、及び、血清中ＶＥＧＦ－Ａ１２１の変化率を（投与後ＶＥＧＦ－Ａ１２１濃度－投与前ＶＥＧＦ－Ａ１２１濃度）／投与前ＶＥＧＦ－Ａ１２１濃度と定義するとき、ＶＥＧＦアイソフォームインデックスが１０００を超えないとき、或いは、ＶＥＧＦ－Ａ濃度が６０００ｐｇ／ｍＬを超えないとき、ＶＥＧＦ－Ａ１２１濃度が１０００ｐｇ／ｍＬを超えないとき、ＶＥＧＦ－Ａ１６５濃度が８００ｐｇ／ｍＬを超えないとき、又はＶＥＧＦ－Ａ１２１濃度で(投与後ＶＥＧＦ－Ａ１２１濃度／投与前ＶＥＧＦ－Ａ１２１濃度)が２を超えるとき、上記患者は、抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体に対し治療応答性があると予測又は決定する工程、
を含む、上記方法を提供する。
【0022】
本発明は、第三の態様により、抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体による治療を受ける又は受けた癌患者における治療効果をｉｎ ｖｉｔｒｏで予測又は決定（もしくは、判定支援）するための方法であって、下記の工程（１’）～（４’）、すなわち、
（１’）上記患者の抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体投与前及び投与後の血清検体と、固相化した抗ＶＥＧＦ－Ａ１２１抗体及び／又は抗ＶＥＧＦ-Ａ１６５抗体とを接触させて、上記検体中のＶＥＧＦ－Ａ１２１又はＶＥＧＦ－Ａ１６５を上記抗体と結合させる工程であって、ただし、上記抗ＶＥＧＦ－Ａ１２１抗体はＶＥＧＦ－Ａ１２１と特異的に結合する抗体であり、かつ抗ＶＥＧＦ－Ａ１６５抗体はＶＥＧＦ－Ａ１６５と特異的に結合する抗体である、上記工程、
（２’）上記工程（１’）の固相を、ラベル化した抗ＶＥＧＦ-Ａ抗体と接触させる工程、
（３’）上記工程（２’）の固相を洗浄し、及び、上記ラベルからのシグナルを測定して、上記検体中の全ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦ－Ａ１２１及び／又はＶＥＧＦ－Ａ１６５の各濃度を決定する工程、並びに、
（４’）上記工程（３’）で決定された濃度に基づいて、ＶＥＧＦアイソフォームインデックスを投与前の血清中ＶＥＧＦ-Ａ１６５濃度／血清中ＶＥＧＦ－Ａ１２１の変化率と定義し、ここで血清中ＶＥＧＦ－Ａ１２１の変化率を(投与後ＶＥＧＦ－Ａ１２１濃度－投与前ＶＥＧＦ－Ａ１２１濃度）／投与前ＶＥＧＦ－Ａ１２１濃度と定義するとき、ＶＥＧＦアイソフォームインデックスが１０００を超えないとき、或いは、ＶＥＧＦ－Ａ濃度が６０００ｐｇ／ｍＬを超えないとき、ＶＥＧＦ－Ａ１２１濃度が１０００ｐｇ／ｍＬを超えないとき、ＶＥＧＦ－Ａ１６５濃度が８００ｐｇ／ｍＬを超えないとき、又はＶＥＧＦ－Ａ１２１濃度で(投与後ＶＥＧＦ－Ａ１２１濃度/投与前ＶＥＧＦ－Ａ１２１濃度)が２を超えるとき、上記患者は、抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体に対し治療応答性があると予測又は決定する工程、
を含む、上記方法を提供する。
（１’）上記患者の抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体投与前及び投与後の血清検体と、固相化した抗ＶＥＧＦ－Ａ１２１抗体及び／又は抗ＶＥＧＦ-Ａ１６５抗体とを接触させて、上記検体中のＶＥＧＦ－Ａ１２１又はＶＥＧＦ－Ａ１６５を上記抗体と結合させる工程であって、ただし、上記抗ＶＥＧＦ－Ａ１２１抗体はＶＥＧＦ－Ａ１２１と特異的に結合する抗体であり、かつ抗ＶＥＧＦ－Ａ１６５抗体はＶＥＧＦ－Ａ１６５と特異的に結合する抗体である、上記工程、
（２’）上記工程（１’）の固相を、ラベル化した抗ＶＥＧＦ-Ａ抗体と接触させる工程、
（３’）上記工程（２’）の固相を洗浄し、及び、上記ラベルからのシグナルを測定して、上記検体中の全ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦ－Ａ１２１及び／又はＶＥＧＦ－Ａ１６５の各濃度を決定する工程、並びに、
（４’）上記工程（３’）で決定された濃度に基づいて、ＶＥＧＦアイソフォームインデックスを投与前の血清中ＶＥＧＦ-Ａ１６５濃度／血清中ＶＥＧＦ－Ａ１２１の変化率と定義し、ここで血清中ＶＥＧＦ－Ａ１２１の変化率を(投与後ＶＥＧＦ－Ａ１２１濃度－投与前ＶＥＧＦ－Ａ１２１濃度）／投与前ＶＥＧＦ－Ａ１２１濃度と定義するとき、ＶＥＧＦアイソフォームインデックスが１０００を超えないとき、或いは、ＶＥＧＦ－Ａ濃度が６０００ｐｇ／ｍＬを超えないとき、ＶＥＧＦ－Ａ１２１濃度が１０００ｐｇ／ｍＬを超えないとき、ＶＥＧＦ－Ａ１６５濃度が８００ｐｇ／ｍＬを超えないとき、又はＶＥＧＦ－Ａ１２１濃度で(投与後ＶＥＧＦ－Ａ１２１濃度/投与前ＶＥＧＦ－Ａ１２１濃度)が２を超えるとき、上記患者は、抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体に対し治療応答性があると予測又は決定する工程、
を含む、上記方法を提供する。
【0023】
本明細書における「治療を受ける又は受けた」という用語は、抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体を投与する治療を受ける前と、当該治療を受けた後のいずれかを指し、いずれの場合にも治療効果が不明である。
【0024】
本明細書における「癌」（もしくは「がん」）という用語は、抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体によって腫瘍組織の血管新生が抑制又は阻害される傾向を示す、悪性、進行性もしくは再発性の、癌、腫瘍及びカルシノーマを指す。癌には、非限定的に、例えば結腸直腸癌、大腸癌、肺癌、非小細胞肺癌、膵臓癌、胃癌、卵巣癌、子宮頸癌、乳癌、脳腫瘍、（悪性）神経膠腫、神経膠芽腫、腎細胞癌、卵管癌、原発性腹膜癌などが含まれる。
【0025】
本明細書における「ＶＥＧＦ」という用語は、ヒトを含む哺乳動物由来の血管内皮増殖因子（もしくは、「血管内皮成長因子」ともいう。）を指し、ＶＥＧＦファミリーにはＶＥＧＦ－Ａ、－Ｂ、－Ｃ、－Ｄ、－Ｅなどがある。ＶＥＧＦは、ＶＥＧＦ受容体に結合し、シグナル伝達を介して血管内皮細胞の増殖、血管及び脈管形成、内皮細胞の生存、血管透過性及び血管拡張、単球走化性及びカルシウム流入、等の生物学的機能に関与している。
【0026】
ＶＥＧＦファミリーのうち、「ＶＥＧＦ－Ａ」は、特に血管新生の促進に関与しており、従って、ＶＥＧＦ－Ａは癌治療の標的となり得る。ＶＥＧＦ－Ａには、転写によるｍＲＮＡの生成の際に生じるスプライング・バリアントが存在し、バリアントには、例えばＶＥＧＦ－Ａ１１１、ＶＥＧＦ－Ａ１２１、ＶＥＧＦ－Ａ１４５、ＶＥＧＦ－Ａ１６５、ＶＥＧＦ－Ａ１８９、ＶＥＧＦ－Ａ２０６などが知られている（Ｃ．Ｊ． Ｐｅａｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ． Ｊ． Ｍｏｌ． Ｓｃｉ．２０１８，１９，１２６４；ｄｏｉ：１０．３３９０／ｉｊｍｓ１９０４１２６４）。これらのバリアントの作用は明確ではないが、バリアントによってマウスでの血管形成像が異なる、組織や生体内の微小環境によって発現量や作用が異なることなどが報告されている。本発明に関わるバリアントは、ＶＥＧＦ－Ａ１２１及びＶＥＧＦ－Ａ１６５であり、これらのバリアントはさらに、エキソン８がエキソン８ａであるＶＥＧＦ－Ａ１２１ａ、ＶＥＧＦ－Ａ１６５ａ、或いは、エキソン８がエキソン８ｂであるＶＥＧＦ－Ａ１２１ｂ、ＶＥＧＦ－Ａ１６５ｂに分類されるが、本明細書では一括して「ＶＥＧＦ－Ａ１２１」、「ＶＥＧＦ－Ａ１６５」と称する。ＶＥＧＦ－Ａ１２１及びＶＥＧＦ－Ａ１６５タンパク質は、天然タンパク質であってもよいし、或いは組換えタンパク質であってもよい。組換えヒトタンパク質は、例えばＮＣＢＩ（米国）登録番号ＮＭ＿００１０２５３６６、ＮＭ＿００１０２５３７０、ＮＭ＿００１１７１６２６、ＡＦ４８６８３７などに示されるヌクレオチド配列に基づいて公知の遺伝子組換え技術によって作製することができる（Ｇｒｅｅｎ，Ｍ．Ｒ． ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，４ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（２０１２））。本明細書における「治療効果」又は「治療応答性」という用語は、患者において、抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体による治療が癌の退縮、症状軽減、又は寛解を生じさせることを指す。
【0027】
本明細書における「判定」という用語は、医師による直接的な判断ではなく、上記方法を実施することによって得られた測定結果に基づいて「治療効果」又は「治療応答性」の判定を支援又は補助することを意味する。
【0028】
本明細書における「予後不良」という用語は、治療後の癌又はその症状の見通しが悪いことを意味し、例えば癌患者において転移が生じることにより生存率（例えばカプランマイヤー検定）が（著しく）低下する状態をいう。
【0029】
上記３つの方法について、上記工程（１）～工程（４）を参照しながら以下に説明する。
【0030】
＜工程（１）＞
この工程では、癌患者の抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体投与前及び投与後（例えば投与開始後２週間目）の血清検体と、固相化した抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体とを接触させて、上記検体中の全ＶＥＧＦ－Ａを上記抗体と結合させる。
この工程では、癌患者の抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体投与前及び投与後（例えば投与開始後２週間目）の血清検体と、固相化した抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体とを接触させて、上記検体中の全ＶＥＧＦ－Ａを上記抗体と結合させる。
【0031】
本明細書における「抗体」という用語は、非限定的に、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、その抗体フラグメント、組換え抗体、単鎖抗体、キメラ抗体、ラクダ抗体、ラベル化抗体などを包含する。これらの抗体類は、公知の方法によって作製することができる。
【0032】
ＶＥＧＦ－Ａポリクローナル抗体の作製は、例えばヒトＶＥＧＦ－Ａタンパク質を異種動物（例えば、ヤギ、ウサギなど）の皮下に投与し、抗血清を取り出すことを含む方法によって得ることができる。好ましくは、抗血清はさらに、例えばヒトＶＥＧＦ－Ａタンパク質を結合したカラム担体（例えばアガロース、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）など）に結合したアフィニティカラム、プロテインＡ／Ｇカラムなどを使用して、ヒトＶＥＧＦタンパク質に対する抗体を精製してもよい。或いは、抗ＶＥＧＦ－Ａポリクローナル抗体は、市販のものを使用してもよい。
【0033】
モノクローナル抗体は、例えば次のようにして作成することができる。ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦ－Ａ１２１タンパク質又はＶＥＧＦ－Ａ１６５タンパク質を異種動物（例えばマウス、ラットなど）の皮下に免疫してＶＥＧＦに対する抗体を形成させたのち、脾臓細胞を取り出し、この細胞をミエローマ細胞と融合し、抗ＶＥＧＦ抗体を産生する融合細胞を培養して目的のモノクローナル抗体を産生、回収することを含む方法によって行うことができる。
【0034】
抗体の固相化は、例えばポリ塩化ビニル製やポリスチレン製のマイクロタイタープレートなどの固相に、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、炭酸／炭酸水素ナトリウムバッファなどのバッファ中、補足抗体である抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体を結合（もしくは付着）することによって行うことができる。抗体の濃度は、例えば０．１～１０μｇ／ｍＬであり、温度は、４℃又は５℃の低温がよく、例えば一晩インキュベーションする。
【0035】
固相はさらに、補足抗体を含む溶液を取り除き、抗体が結合していない表面をカゼインなどのタンパク質（ブロッキング剤）でブロックする。ブロッキング剤の濃度は、例えば０．５～３％（ｗ／ｖ）であり、バッファとして例えば塩化ナトリウム、カゼイン及び／又はウシアルブミンなどを含有するＴｒｉｓバッファ及び／又はリン酸バッファなどが使用される。温度は、例えば室温～３７℃であり、ブロッキングを例えば約１～２時間行うことができる。
【0036】
ブロッキング後、例えば界面活性剤（例えばＴｗｅｅｎ（ＴＭ）（例、Ｔｗｅｅｎ２０））含有ＰＢＳを用いて数回固相を洗浄する。
【0037】
次に、上記固相を、例えば塩化ナトリウム、カゼイン及び／又はウシアルブミン、血清などを含有するＴｒｉｓバッファ及び／又はリン酸バッファ中で、癌患者の血清又は血漿検体と一緒にインキュベーションする。インキュベーションは、例えば２５℃一晩、或いは３７℃１．５～２時間行うことができる。癌患者の血清又は血漿検体には、ＶＥＧＦ－Ａ１２１、ＶＥＧＦ－Ａ１６５又はその両方のタンパク質が含有していると想定され、これらのタンパク質は、固相化した抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体と結合する。
【0038】
＜工程（２）＞
この工程では、上記工程（１）の固相を、ラベル化した抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体、ラベル化した抗ＶＥＧＦ－Ａ１２１抗体又はラベル化した抗ＶＥＧＦ－Ａ１６５抗体と接触させる。
この工程では、上記工程（１）の固相を、ラベル化した抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体、ラベル化した抗ＶＥＧＦ－Ａ１２１抗体又はラベル化した抗ＶＥＧＦ－Ａ１６５抗体と接触させる。
【0039】
上記抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体はすべてのＶＥＧＦ－Ａと特異的に結合するポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体である。抗ＶＥＧＦ－Ａ１２１抗体は、ＶＥＧＦ－Ａ１２１と特異的に結合するモノクローナル抗体であり、かつ抗ＶＥＧＦ－Ａ１６５抗体はＶＥＧＦ－Ａ１６５と特異的に結合するモノクローナル抗体である。このことは、抗ＶＥＧＦ－Ａ１２１抗体はＶＥＧＦ－Ａ１６５と結合しない又は結合し難いこと、並びに、抗ＶＥＧＦ－Ａ１６５抗体はＶＥＧＦ－Ａ１２１と結合しない又は結合し難いことを意味する。
【0040】
抗ＶＥＧＦ－Ａ１２１抗体の例は、非限定的に以下の抗体（例、モノクローナル抗体、ｓｃＦＶ、キメラ抗体、組換え抗体など）を挙げることができる。
（ａ）重鎖可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）の配列として、配列番号１（ＣＤＲ１）、配列番号２（ＣＤＲ２）及び配列番号３（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列、並びに、軽鎖可変領域のＣＤＲ配列として、配列番号４（ＣＤＲ１）、配列番号５（ＣＤＲ２）及び配列番号６（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列をそれぞれ含む抗体。
（ｂ）配列番号７の重鎖可変領域のアミノ酸配列、及び、配列番号８の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を含む抗体。
（ｃ）配列番号９のヌクレオチド配列によってコードされる重鎖可変領域、及び配列番号１０のヌクレオチド配列によってコードされる軽鎖可変領域を含む抗体。
（ａ）重鎖可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）の配列として、配列番号１（ＣＤＲ１）、配列番号２（ＣＤＲ２）及び配列番号３（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列、並びに、軽鎖可変領域のＣＤＲ配列として、配列番号４（ＣＤＲ１）、配列番号５（ＣＤＲ２）及び配列番号６（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列をそれぞれ含む抗体。
（ｂ）配列番号７の重鎖可変領域のアミノ酸配列、及び、配列番号８の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を含む抗体。
（ｃ）配列番号９のヌクレオチド配列によってコードされる重鎖可変領域、及び配列番号１０のヌクレオチド配列によってコードされる軽鎖可変領域を含む抗体。
【0041】
抗ＶＥＧＦ－Ａ１６５抗体の例は、非限定的に以下の抗体を挙げることができる。
（ｄ）重鎖可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）の配列として、配列番号１１（ＣＤＲ１）、配列番号１２（ＣＤＲ２）及び配列番号１３（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列、並びに、軽鎖可変領域のＣＤＲ配列として、配列番号４（ＣＤＲ１）、配列番号５（ＣＤＲ２）及び配列番号１４（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列をそれぞれ含む抗体。
（ｅ）配列番号１５の重鎖可変領域のアミノ酸配列、及び、配列番号１６の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を含む工程。
（ｆ）配列番号１７のヌクレオチド配列によってコードされる重鎖可変領域、及び配列番号１８のヌクレオチド配列によってコードされる軽鎖可変領域を含む抗体。
（ｄ）重鎖可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）の配列として、配列番号１１（ＣＤＲ１）、配列番号１２（ＣＤＲ２）及び配列番号１３（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列、並びに、軽鎖可変領域のＣＤＲ配列として、配列番号４（ＣＤＲ１）、配列番号５（ＣＤＲ２）及び配列番号１４（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列をそれぞれ含む抗体。
（ｅ）配列番号１５の重鎖可変領域のアミノ酸配列、及び、配列番号１６の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を含む工程。
（ｆ）配列番号１７のヌクレオチド配列によってコードされる重鎖可変領域、及び配列番号１８のヌクレオチド配列によってコードされる軽鎖可変領域を含む抗体。
【0042】
抗ＶＥＧＦ－Ａポリクローナル抗体は、上記のとおり、公知のポリクローナル抗体作製法によって作製してもよいし、市販のポリクローナル抗体を使用してもよい。
【0043】
また、抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体、抗ＶＥＧＦ－Ａ１２１抗体又は抗ＶＥＧＦ－Ａ１６５抗体は、公知のモノクローナル抗体作製法（岩崎辰夫ら、単クローン抗体－ハイブリドーマとＥＬＩＳＡ、１９８３年、講談社サイエンティフィック）によって作製してもよいし、或いは、市販のモノクローナル抗体を使用してもよい。
【0044】
例えば上記工程（２）の場合、固相を、ラベル化した抗ＶＥＧＦ－Ａポリクローナル抗体又はラベル化した抗ＶＥＧＦ－Ａモノクローナル抗体と接触させる。
【0045】
上記抗体のラベル化は、例えば蛍光ラベル、放射性同位体ラベル、化学発光、又は酵素ラベルによって行うことができる。ラベルの種類の違いによってアッセイ法は、蛍光抗体法、放射免疫測定法、化学発光法、酵素抗体法（例えばＥＬＩＳＡ、サンドイッチＥＬＩＳＡなど）などと称する。
【0046】
蛍光ラベルには、蛍光タンパク質（例えばＧＦＰ、ＲＦＰ、ＹＦＰ、ＥＧＦＰ、Ｖｅｎｕｓ、ＤｓＲｅｄなど）や蛍光色素分子（例えばクマリン、ローダミン、ユーロピウム錯体、ボロンジピロメチン、ダンシル、ベンゾフラザン、フルオレセイン、ＦＩＴＣ、アクリジン、ビマン、トリアザペンタレン、ピレンなど）など、放射性同位体ラベルには、例えば放射性のヨウ素、テクネチウムなど、化学発光のラベルには、例えばアクリジニウムエステルなど、酵素ラベルには、例えばペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）（例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、リコンビナントペルオキシダーゼなど）、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）などが例示される。
【0047】
上記抗体には、抗体タンパク質のアミノ基、カルボキシル基、水酸基、メルカプト（－ＳＨ）基などの官能基を介して上記ラベルを結合するための反応性基を導入することができるし、或いは、上記ラベルに抗体と結合するための反応性基を導入してもよい。反応性基の例として、ビオチンとアビジンなどが挙げられる。
【0048】
上記固相への上記ラベル化抗体の結合は、例えば塩化ナトリウム、カゼイン及び／又はウシアルブミン、血清などを含有するＴｒｉｓバッファ及び／又はリン酸バッファ中で、例えば室温（例えば２５℃）で１～２時間インキュベーションすることによって行うことができる。
【0049】
インキュベーション後、上記固相を、例えば界面活性剤（例えばＴｗｅｅｎ（ＴＭ）（例、Ｔｗｅｅｎ２０））含有ＰＢＳを用いて数回固相を洗浄する。
【0050】
＜工程（３）＞
この工程では、上記工程（２）の固相を洗浄し、及び、上記ラベルからのシグナルを測定して、上記検体中の全ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦ－Ａ１２１及び／又はＶＥＧＦ－Ａ１６５の各濃度を決定する。
この工程では、上記工程（２）の固相を洗浄し、及び、上記ラベルからのシグナルを測定して、上記検体中の全ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦ－Ａ１２１及び／又はＶＥＧＦ－Ａ１６５の各濃度を決定する。
【0051】
ラベルによってシグナルの検出方法は異なる。
【0052】
蛍光シグナルは、蛍光ラベルが発する最適の励起波長と蛍光波長を用いて、分光蛍光光度計で測定することができる。
【0053】
ラベル化した抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体、ラベル化した抗ＶＥＧＦ－Ａ１２１抗体又はラベル化した抗ＶＥＧＦ－Ａ１６５抗体の蛍光ラベルの種類を互いに蛍光波長域の異なるラベルとするときには、ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦ－Ａ１２１及び／又はＶＥＧＦ－Ａ１６５の各濃度を同時に測定することが可能である。蛍光ラベルの例は、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）とＲＦＰ（赤色蛍光タンパク質）である。
【0054】
放射能シグナルは、例えば液体シンチレーションカウンターを用いて、放射能を測定することができる。
【0055】
酵素ラベルの場合には、酵素に適した発色性基質を使用することができる。例えばペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）（例えばＨＲＰ）の場合、基質として、ＴＭＢ（３，３’，５，５’－ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）、ＯＰＤ（ｏ－ｐｈｅｎｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、ＡＢＴＳ（２，２’－ａｚｉｎｏ－ｄｉ－［３－ｅｔｈｙｌ－ｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌｉｎｅ－６ ｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ］ ｄｉａｍｍｏｎｉｕｍ ｓａｌｔ）などを使用することができる。
【0056】
ＴＭＢの場合、例えば1５～３０分インキュベートし、等量の２Ｍ硫酸を加えて反応を停止させ、４５０ｎｍの吸光度を測定する。
【0057】
ＯＰＤの場合、４９２ｎｍの吸光度を測定する。
【0058】
ＡＢＴＳの場合、４１６ｎｍの吸光度を測定する。
【0059】
或いは、例えばアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）の場合、基質として、ｐＮＰＰ（ｐ－Ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）を使用することができる。室温で約１５～３０分インキュベートすることによってニトロフェノール生成により黄色に発色するため４０５ｎｍの吸光度を測定する。反応停止は０．７５Ｍ水酸化ナトリウム溶液を等量加えて行うことができる。
【0060】
上記濃度の好ましい測定法は、サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイであるが抗原と抗体との反応を利用した免疫学的測定方法ならば実施可能である。
【0061】
精確な定量のために、標準試薬であるＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦ－Ａ１２１又はＶＥＧＦ－Ａ１６５の濃度を横軸に、本発明方法のアッセイシステムで測定したシグナル値を縦軸にプロットして検量線を作成する。この検量線を用いて、上記検体中の全ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦ－Ａ１２１又はＶＥＧＦ－Ａ１６５の濃度を実測することが好ましい。
【0062】
＜工程（４）＞
この工程では、上記工程（３）で決定された抗ＶＥＧＦ抗体による治療前後の血清中の全ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦ－Ａ１２１又はＶＥＧＦ－Ａ１６５の濃度に基づいて、上記癌患者の、抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体に対する治療応答性を決定する。
この工程では、上記工程（３）で決定された抗ＶＥＧＦ抗体による治療前後の血清中の全ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦ－Ａ１２１又はＶＥＧＦ－Ａ１６５の濃度に基づいて、上記癌患者の、抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体に対する治療応答性を決定する。
【0063】
抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体は、例えばベバシズマブである。
【0064】
ベバシズマブは、商品名「アバスチン（登録商標）」であり、上記例示の癌の治療のために臨床使用されている。
【0065】
後述の実施例での測定により次の結果が得られた。
（１）ベバシズマブ治療後は、血清中の全ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦ－Ａ１６５は低下し、一方、ＶＥＧＦ－Ａ１２１は上昇する。
（２）ベバシズマブ治療後は、血清又は血漿中のＶＥＧＦ－Ａ１２１が上昇する。
（３）ベバシズマブ治療予後不良症例（ＰＤ）では、ベバシズマブ治療予後良好症例（ｎｏｎ－ＰＤ）と比較して、ベバシズマブ治療前の血清において全ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦ－Ａ１２１、ＶＥＧＦ－Ａ１６５は高値である。この現象は血漿では確認できない。つまり血清中のＶＥＧＦ－Ａを測定することが非常に重要であることが明らかとなった。
（４）ベバシズマブ治療予後不良症例（ＰＤ）では、ベバシズマブ治療予後良好症例（ｎｏｎ－ＰＤ）と比較して、ベバシズマブ治療後の血清中ＶＥＧＦ－Ａ１２１濃度がベバシズマブ治療前の血清中ＶＥＧＦ－Ａ１２１濃度からの上昇の程度が小さい。
（５）ベバシズマブ治療予後不良症例（ＰＤ；患者３，８）では、ＶＥＧＦアイソフォームインデックスが１０００を超えて大きいが、一方、ベバシズマブ治療予後良好症例（ｎｏｎ－ＰＤ）では、ＶＥＧＦアイソフォームインデックスが１０００を超えず小さい。
（６）上記の知見から、ＶＥＧＦアイソフォームインデックスは投与前の血清中ＶＥＧＦ-Ａ１６５濃度／血清中ＶＥＧＦ－Ａ１２１の変化率と定義するとき、ここで血清中ＶＥＧＦ－Ａ１２１の変化率を(投与後ＶＥＧＦ－Ａ１２１濃度－投与前ＶＥＧＦ－Ａ１２１濃度)／投与前ＶＥＧＦ－Ａ１２１濃度と定義するとき、ＶＥＧＦアイソフォームインデックスが１０００を超えないとき、或いは、ＶＥＧＦ－Ａ濃度が６０００ｐｇ／ｍＬを超えないとき、ＶＥＧＦ－Ａ１２１濃度が１０００ｐｇ／ｍＬを超えないとき、ＶＥＧＦ－Ａ１６５濃度が８００ｐｇ／ｍＬを超えないとき、又はＶＥＧＦ－Ａ１２１濃度で(投与後ＶＥＧＦ－Ａ１２１濃度/投与前ＶＥＧＦ－Ａ１２１濃度)が２を超えるとき、上記患者は、抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体に対し治療応答性（もしくは、治療効果）があると予測又は決定（もしくは、判定支援）することができる。
（１）ベバシズマブ治療後は、血清中の全ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦ－Ａ１６５は低下し、一方、ＶＥＧＦ－Ａ１２１は上昇する。
（２）ベバシズマブ治療後は、血清又は血漿中のＶＥＧＦ－Ａ１２１が上昇する。
（３）ベバシズマブ治療予後不良症例（ＰＤ）では、ベバシズマブ治療予後良好症例（ｎｏｎ－ＰＤ）と比較して、ベバシズマブ治療前の血清において全ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦ－Ａ１２１、ＶＥＧＦ－Ａ１６５は高値である。この現象は血漿では確認できない。つまり血清中のＶＥＧＦ－Ａを測定することが非常に重要であることが明らかとなった。
（４）ベバシズマブ治療予後不良症例（ＰＤ）では、ベバシズマブ治療予後良好症例（ｎｏｎ－ＰＤ）と比較して、ベバシズマブ治療後の血清中ＶＥＧＦ－Ａ１２１濃度がベバシズマブ治療前の血清中ＶＥＧＦ－Ａ１２１濃度からの上昇の程度が小さい。
（５）ベバシズマブ治療予後不良症例（ＰＤ；患者３，８）では、ＶＥＧＦアイソフォームインデックスが１０００を超えて大きいが、一方、ベバシズマブ治療予後良好症例（ｎｏｎ－ＰＤ）では、ＶＥＧＦアイソフォームインデックスが１０００を超えず小さい。
（６）上記の知見から、ＶＥＧＦアイソフォームインデックスは投与前の血清中ＶＥＧＦ-Ａ１６５濃度／血清中ＶＥＧＦ－Ａ１２１の変化率と定義するとき、ここで血清中ＶＥＧＦ－Ａ１２１の変化率を(投与後ＶＥＧＦ－Ａ１２１濃度－投与前ＶＥＧＦ－Ａ１２１濃度)／投与前ＶＥＧＦ－Ａ１２１濃度と定義するとき、ＶＥＧＦアイソフォームインデックスが１０００を超えないとき、或いは、ＶＥＧＦ－Ａ濃度が６０００ｐｇ／ｍＬを超えないとき、ＶＥＧＦ－Ａ１２１濃度が１０００ｐｇ／ｍＬを超えないとき、ＶＥＧＦ－Ａ１６５濃度が８００ｐｇ／ｍＬを超えないとき、又はＶＥＧＦ－Ａ１２１濃度で(投与後ＶＥＧＦ－Ａ１２１濃度/投与前ＶＥＧＦ－Ａ１２１濃度)が２を超えるとき、上記患者は、抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体に対し治療応答性（もしくは、治療効果）があると予測又は決定（もしくは、判定支援）することができる。
【0066】
２．キット
本発明は、第四の態様により、上記１に記載の方法で使用するためのキットであって、（好ましくは固相化した）ＶＥＧＦポリクローナル抗体、抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体、抗ＶＥＧＦ－Ａ１２１抗体、及び抗ＶＥＧＦ－Ａ１６５抗体を含むキットを提供する。これらの抗体は、必要に応じてラベル化されていてもよい。
本発明は、第四の態様により、上記１に記載の方法で使用するためのキットであって、（好ましくは固相化した）ＶＥＧＦポリクローナル抗体、抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体、抗ＶＥＧＦ－Ａ１２１抗体、及び抗ＶＥＧＦ－Ａ１６５抗体を含むキットを提供する。これらの抗体は、必要に応じてラベル化されていてもよい。
【0067】
ラベルは、上記例示のものが含まれるが、そのうち、好ましいラベルは、蛍光ラベル又は酵素ラベルである。
【0068】
上記方法が、免疫学的アッセイ（例えばサンドイッチアッセイ、ＥＬＩＳＡアッセイなど）を使用するときには、例えばペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼなどの酵素ラベルが好ましい。
【0069】
抗ＶＥＧＦ－Ａ１２１抗体及び抗ＶＥＧＦ－Ａ１６５抗体に関して、非限定的に、上記抗ＶＥＧＦ－Ａ１２１抗体が、例えば、以下の抗体を含む。
（ａ）重鎖可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）の配列として、配列番号１（ＣＤＲ１）、配列番号２（ＣＤＲ２）及び配列番号３（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列、並びに、軽鎖可変領域のＣＤＲ配列として、配列番号４（ＣＤＲ１）、配列番号５（ＣＤＲ２）及び配列番号６（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列をそれぞれ含む抗体。
（ｂ）配列番号７の重鎖可変領域のアミノ酸配列、及び、配列番号８の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を含む抗体。
（ｃ）配列番号９のヌクレオチド配列によってコードされる重鎖可変領域、及び配列番号１０のヌクレオチド配列によってコードされる軽鎖可変領域を含む抗体。
（ａ）重鎖可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）の配列として、配列番号１（ＣＤＲ１）、配列番号２（ＣＤＲ２）及び配列番号３（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列、並びに、軽鎖可変領域のＣＤＲ配列として、配列番号４（ＣＤＲ１）、配列番号５（ＣＤＲ２）及び配列番号６（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列をそれぞれ含む抗体。
（ｂ）配列番号７の重鎖可変領域のアミノ酸配列、及び、配列番号８の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を含む抗体。
（ｃ）配列番号９のヌクレオチド配列によってコードされる重鎖可変領域、及び配列番号１０のヌクレオチド配列によってコードされる軽鎖可変領域を含む抗体。
【0070】
上記抗ＶＥＧＦ－Ａ１６５抗体は、例えば以下の抗体を含む。
（ｄ）重鎖可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）の配列として、配列番号１１（ＣＤＲ１）、配列番号１２（ＣＤＲ２）及び配列番号１３（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列、並びに、軽鎖可変領域のＣＤＲ配列として、配列番号４（ＣＤＲ１）、配列番号５（ＣＤＲ２）及び配列番号１４（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列をそれぞれ含む抗体。
（ｅ）配列番号１５の重鎖可変領域のアミノ酸配列、及び、配列番号１６の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を含む抗体。
（ｆ）配列番号１７のヌクレオチド配列によってコードされる重鎖可変領域、及び配列番号１８のヌクレオチド配列によってコードされる軽鎖可変領域を含む抗体。
（ｄ）重鎖可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）の配列として、配列番号１１（ＣＤＲ１）、配列番号１２（ＣＤＲ２）及び配列番号１３（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列、並びに、軽鎖可変領域のＣＤＲ配列として、配列番号４（ＣＤＲ１）、配列番号５（ＣＤＲ２）及び配列番号１４（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列をそれぞれ含む抗体。
（ｅ）配列番号１５の重鎖可変領域のアミノ酸配列、及び、配列番号１６の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を含む抗体。
（ｆ）配列番号１７のヌクレオチド配列によってコードされる重鎖可変領域、及び配列番号１８のヌクレオチド配列によってコードされる軽鎖可変領域を含む抗体。
【0071】
キットにはさらに、上記方法のための使用説明書をさらに含んでもよい。
【0072】
本発明はさらに、第五の態様により、上記（ａ）～（ｃ）の抗体からなる群から選択される抗ＶＥＧＦ－Ａ１２１抗体、並びに、上記（ｄ）～（ｆ）の抗体からなる群から選択される抗ＶＥＧＦ－Ａ１６５抗体を含む。
【0073】
上記抗体は、ラベル化されていてもよい。このとき、ラベルは、例えば、蛍光ラベル、放射性同位体ラベル、化学発光、及び酵素ラベルからなる群から選択しうる。
【0074】
これらの抗体は、上記１節に記載した方法によって作製可能である。
【実施例】
【0075】
本発明を以下の実施例を参照しながらさらに具体的に説明するが、本発明は当該実施例によって制限されないものとする。
【0076】
[実施例１]
＜進行性大腸癌患者における分子標的薬（抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体であるベバシズマブ）による治療応答性の判別＞
[１]測定
ベバシズマブによる抗癌治療を受けた進行性大腸癌患者１２例について、当該患者からの薬剤投与前及び投与後（投与開始後２週間目）の血清及び血漿中の全ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦ－Ａ１２１及びＶＥＧＦ－Ａ１６５の各濃度を、抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体、抗ＶＥＧＦ－Ａ１２１モノクローナル抗体「５Ａ６Ｇ４Ｃ８」及び抗ＶＥＧＦ－Ａ１６５モノクローナル抗体「４Ｆ９Ａ９Ｇ９」を使用するサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイ手順に従って測定した。
＜進行性大腸癌患者における分子標的薬（抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体であるベバシズマブ）による治療応答性の判別＞
[１]測定
ベバシズマブによる抗癌治療を受けた進行性大腸癌患者１２例について、当該患者からの薬剤投与前及び投与後（投与開始後２週間目）の血清及び血漿中の全ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦ－Ａ１２１及びＶＥＧＦ－Ａ１６５の各濃度を、抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体、抗ＶＥＧＦ－Ａ１２１モノクローナル抗体「５Ａ６Ｇ４Ｃ８」及び抗ＶＥＧＦ－Ａ１６５モノクローナル抗体「４Ｆ９Ａ９Ｇ９」を使用するサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイ手順に従って測定した。
【0077】
具体的な手順は以下のとおりである。
【0078】
工程１（抗体の固相化）：
ヤギ抗ヒトＶＥＧＦポリクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ社）１００μＬ（１μｇ／ｍＬ－ＰＢＳ）を５℃で一晩、固相（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）に結合させた。
ヤギ抗ヒトＶＥＧＦポリクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ社）１００μＬ（１μｇ／ｍＬ－ＰＢＳ）を５℃で一晩、固相（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）に結合させた。
【0079】
工程２（ブロッキング）：
上記固相に、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０Ｍ ＮａＣｌ、０．５％カゼイン、を含むブロッキング溶液１００μＬを重層し、３７℃で２時間静置しブロッキングしたのち、ＰＢＳＴ（Ｔｗｅｅｎ－２０を含むリン酸緩衝生理食塩水）で５回洗浄した。
上記固相に、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０Ｍ ＮａＣｌ、０．５％カゼイン、を含むブロッキング溶液１００μＬを重層し、３７℃で２時間静置しブロッキングしたのち、ＰＢＳＴ（Ｔｗｅｅｎ－２０を含むリン酸緩衝生理食塩水）で５回洗浄した。
【0080】
工程３（試料添加）：
患者から採血し遠心分離（３５００ｒｐｍ）等によって処理して得られた血清及び血漿試料５０μＬ及びバッファ５０μＬ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．５％カゼイン）を上記固相に添加し、２５℃で一晩インキュベーションし、その後、ＰＢＳＴで５回洗浄した。
患者から採血し遠心分離（３５００ｒｐｍ）等によって処理して得られた血清及び血漿試料５０μＬ及びバッファ５０μＬ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．５％カゼイン）を上記固相に添加し、２５℃で一晩インキュベーションし、その後、ＰＢＳＴで５回洗浄した。
【0081】
工程４（標識抗体の結合）：
ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）標識抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体、ＰＯＤ標識抗ＶＥＧＦ－Ａ１２１モノクローナル抗体「５Ａ６Ｇ４Ｃ８」又はＰＯＤ標識抗ＶＥＧＦ－Ａ１６５モノクローナル抗体「４Ｆ９Ａ９Ｇ９」の各々１００μＬ（ＰＯＤ標識抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体濃度０．０１６μｇ／ｍＬ－バッファ、ＰＯＤ標識モノクローナル抗体「５Ａ６Ｇ４Ｃ８」及び「４Ｆ９Ａ９Ｇ９」の各濃度０．２５／ｍＬ－バッファ）（バッファ：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．５％カゼイン）を二次抗体として上記固相に添加し、２５℃で２時間インキュベーションしたのち、ＰＢＳＴで５回洗浄した。
ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）標識抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体、ＰＯＤ標識抗ＶＥＧＦ－Ａ１２１モノクローナル抗体「５Ａ６Ｇ４Ｃ８」又はＰＯＤ標識抗ＶＥＧＦ－Ａ１６５モノクローナル抗体「４Ｆ９Ａ９Ｇ９」の各々１００μＬ（ＰＯＤ標識抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体濃度０．０１６μｇ／ｍＬ－バッファ、ＰＯＤ標識モノクローナル抗体「５Ａ６Ｇ４Ｃ８」及び「４Ｆ９Ａ９Ｇ９」の各濃度０．２５／ｍＬ－バッファ）（バッファ：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．５％カゼイン）を二次抗体として上記固相に添加し、２５℃で２時間インキュベーションしたのち、ＰＢＳＴで５回洗浄した。
【0082】
工程５（発色）：
ペルオキシダーゼ用発色基質ＴＭＢＺ（３，３’，５，５’－Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ；同仁化学）１００μＬを上記固相に添加して室温で３０分間静置した。
ペルオキシダーゼ用発色基質ＴＭＢＺ（３，３’，５，５’－Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ；同仁化学）１００μＬを上記固相に添加して室温で３０分間静置した。
【0083】
工程６（発色反応の停止）：
工程５の上記固相に硫酸（０．１Ｍ）１００μＬを添加して発色反応を停止した。
工程５の上記固相に硫酸（０．１Ｍ）１００μＬを添加して発色反応を停止した。
【0084】
工程７（吸光度測定）：
工程６の発色を、吸光光度計（バイオラッド社）を用いて４５０ｎｍ／５７０ｎｍで測定した。
工程６の発色を、吸光光度計（バイオラッド社）を用いて４５０ｎｍ／５７０ｎｍで測定した。
【0085】
[２]抗体
上記工程４で使用した抗ＶＥＧＦ－Ａ１２１モノクローナル抗体「５Ａ６Ｇ４Ｃ８」又は抗ＶＥＧＦ－Ａ１６５モノクローナル抗体「４Ｆ９Ａ９Ｇ９」は、マウスよって作製された。
上記工程４で使用した抗ＶＥＧＦ－Ａ１２１モノクローナル抗体「５Ａ６Ｇ４Ｃ８」又は抗ＶＥＧＦ－Ａ１６５モノクローナル抗体「４Ｆ９Ａ９Ｇ９」は、マウスよって作製された。
【0086】
抗ＶＥＧＦ－Ａ１２１モノクローナル抗体「５Ａ６Ｇ４Ｃ８」は、配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
【0087】
抗ＶＥＧＦ－Ａ１６５モノクローナル抗体「４Ｆ９Ａ９Ｇ９」は、配列番号１５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
【0088】
上記工程４で使用した抗ＶＥＧＦ－Ａ１２１モノクローナル抗体「５Ａ６Ｇ４Ｃ８」又は抗ＶＥＧＦ－Ａ１６５モノクローナル抗体「４Ｆ９Ａ９Ｇ９」の抗原結合特異性を評価するために、抗ＶＥＧＦ－Ａ１２１モノクローナル抗体「５Ａ６Ｇ４Ｃ８」（ａｎｔｉ－ＶＥＧＦ－Ａ１２１ｍＡｂ）及び抗ＶＥＧＦ－Ａ１６５モノクローナル抗体「４Ｆ９Ａ９Ｇ９」（ａｎｔｉ－ＶＥＧＦ－Ａ１６５ｍＡｂ）の、組換えヒトＶＥＧＦ－Ａ１２１「ｒｈ１２１」又はＶＥＧＦ－Ａ１６５「ｒｈ１６５」に対する交差反応性を調べた結果をそれぞれ図１のＡ及びＢに示した。図１から、抗ＶＥＧＦ－Ａ１２１モノクローナル抗体「５Ａ６Ｇ４Ｃ８」及び抗ＶＥＧＦ－Ａ１６５モノクローナル抗体「４Ｆ９Ａ９Ｇ９」はそれぞれ、ＶＥＧＦ－Ａ１２１、ＶＥＧＦ－Ａ１６５を特異的に認識する抗体であることが判明した。
【0089】
[３]結果
進行性大腸癌と診断されベバシズマブ投与を受けた患者１２例における投与前（Ｔ０）と投与後（Ｔ１；投与開始後２週間目）の血清及び血漿中のＶＥＧＦ－Ａ１２１、ＶＥＧＦ－Ａ１６５及び全ＶＥＧＦ－ＡをＥＬＩＳＡにより測定した結果を図２Ａ（血清）及び図２Ｂ（血漿）に示した。
進行性大腸癌と診断されベバシズマブ投与を受けた患者１２例における投与前（Ｔ０）と投与後（Ｔ１；投与開始後２週間目）の血清及び血漿中のＶＥＧＦ－Ａ１２１、ＶＥＧＦ－Ａ１６５及び全ＶＥＧＦ－ＡをＥＬＩＳＡにより測定した結果を図２Ａ（血清）及び図２Ｂ（血漿）に示した。
【0090】
図２Ａ及び図２Ｂから、次のことが分かった。
（１）ベバシズマブ治療後は、血清中の全ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦ－Ａ１６５は低下し、一方、ＶＥＧＦ－Ａ１２１は上昇した（図２Ａ）。
（２）ベバシズマブ治療後は、血清又は血漿中のＶＥＧＦ－Ａ１２１が上昇した（図２Ａ、図２Ｂ）。
（３）ベバシズマブ治療予後不良症例（ＰＤ；患者３，８）では、ベバシズマブ治療予後良好症例（ｎｏｎ－ＰＤ）と比較して、ベバシズマブ治療前の血清において全ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦ－Ａ１２１、ＶＥＧＦ－Ａ１６５は高値である。この現象は血漿では確認できない。つまり血清中のＶＥＧＦ－Ａを測定することが非常に重要であることが明らかとなった（表１～表３、図２Ａ、図２Ｂ）。
（４）ベバシズマブ治療予後不良症例（ＰＤ；患者３，８）では、ベバシズマブ治療予後良好症例（ｎｏｎ－ＰＤ）と比べて、ベバシズマブ治療後の血清中ＶＥＧＦ－Ａ１２１濃度がベバシズマブ治療前の血清中ＶＥＧＦ－Ａ１２１濃度からの上昇の程度が小さかった（表１、図２Ａ）。
（５）ベバシズマブ治療予後不良症例（ＰＤ；患者３，８）では、ＶＥＧＦアイソフォームインデックスが１０００を超えて大きくなるが、一方、ベバシズマブ治療予後良好症例（ｎｏｎ－ＰＤ）では、ＶＥＧＦアイソフォームインデックスが１０００を超えず小さくなった（図３）。
（１）ベバシズマブ治療後は、血清中の全ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦ－Ａ１６５は低下し、一方、ＶＥＧＦ－Ａ１２１は上昇した（図２Ａ）。
（２）ベバシズマブ治療後は、血清又は血漿中のＶＥＧＦ－Ａ１２１が上昇した（図２Ａ、図２Ｂ）。
（３）ベバシズマブ治療予後不良症例（ＰＤ；患者３，８）では、ベバシズマブ治療予後良好症例（ｎｏｎ－ＰＤ）と比較して、ベバシズマブ治療前の血清において全ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦ－Ａ１２１、ＶＥＧＦ－Ａ１６５は高値である。この現象は血漿では確認できない。つまり血清中のＶＥＧＦ－Ａを測定することが非常に重要であることが明らかとなった（表１～表３、図２Ａ、図２Ｂ）。
（４）ベバシズマブ治療予後不良症例（ＰＤ；患者３，８）では、ベバシズマブ治療予後良好症例（ｎｏｎ－ＰＤ）と比べて、ベバシズマブ治療後の血清中ＶＥＧＦ－Ａ１２１濃度がベバシズマブ治療前の血清中ＶＥＧＦ－Ａ１２１濃度からの上昇の程度が小さかった（表１、図２Ａ）。
（５）ベバシズマブ治療予後不良症例（ＰＤ；患者３，８）では、ＶＥＧＦアイソフォームインデックスが１０００を超えて大きくなるが、一方、ベバシズマブ治療予後良好症例（ｎｏｎ－ＰＤ）では、ＶＥＧＦアイソフォームインデックスが１０００を超えず小さくなった（図３）。
【0091】
上記の知見から、ＶＥＧＦアイソフォームインデックスを投与前の血清中ＶＥＧＦ-Ａ１６５濃度／血清中ＶＥＧＦ－Ａ１２１の変化率と定義し、ここで血清中ＶＥＧＦ－Ａ１２１の変化率を(投与後ＶＥＧＦ－Ａ１２１濃度－投与前ＶＥＧＦ－Ａ１２１濃度)／投与前ＶＥＧＦ－Ａ１２１濃度と定義するとき、ＶＥＧＦアイソフォームインデックスが１０００を超えないとき、或いは、ＶＥＧＦ－Ａ濃度が６０００ｐｇ／ｍＬを超えないとき、ＶＥＧＦ－Ａ１２１濃度が１０００ｐｇ／ｍＬを超えないとき、ＶＥＧＦ－Ａ１６５濃度が８００ｐｇ／ｍＬを超えないとき、又はＶＥＧＦ－Ａ１２１濃度で(投与後ＶＥＧＦ－Ａ１２１濃度/投与前ＶＥＧＦ－Ａ１２１濃度)が２を超えるとき、上記患者は、抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体に対し治療応答性がある(治療効果がある)と決定することができた（図３）。
【0092】
【表1】
【0093】
【表2】
【0094】
【表3】
【産業上の利用可能性】
【0095】
本発明により、抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体による治療を受ける又は受けた癌患者における治療応答性（もしくは、治療効果）を判定することができるため、患者の治療を効率的かつ経済的に行うことを可能にする。
【図1】
【図2A】
【図2B】
【図3】
【配列表】