特許 7485311 がん細胞増殖抑制剤及びがん細胞増殖抑制効果増強剤

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-05-08

(45)【発行日】2024-05-16

(54)【発明の名称】がん細胞増殖抑制剤及びがん細胞増殖抑制効果増強剤

(51)【国際特許分類】

   A61K 39/395 20060101AFI20240509BHJP

   A61K 31/341 20060101ALI20240509BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240509BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240509BHJP

   A23L 33/10 20160101ALI20240509BHJP

【ＦＩ】

A61K39/395 N

A61K31/341

A61P35/00

A61P43/00 121

A23L33/10

【請求項の数】 4

(21)【出願番号】P 2022018618

(22)【出願日】2022-02-09

(65)【公開番号】P2023116063

(43)【公開日】2023-08-22

【審査請求日】2022-09-29

(73)【特許権者】

【識別番号】504145342

【氏名又は名称】国立大学法人九州大学

(73)【特許権者】

【識別番号】303044712

【氏名又は名称】三井農林株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100149799

【弁理士】

【氏名又は名称】上村 陽一郎

(72)【発明者】

【氏名】立花 宏文

(72)【発明者】

【氏名】高垣 晶子

【審査官】川合 理恵

(56)【参考文献】

【文献】特開２０１６－１６０２３８（ＪＰ，Ａ）

【文献】MELAIU O. et al.，Influence of the Tumor Microenvironment on NK Cell Function in Solid Tumors，frontiers in Immunology，2020年，Volume 10，Article 3038

【文献】日本内科学会雑誌，2021年，１１０巻３号，５２０－５２５

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ａ６１Ｋ ４５／００

Ａ６１Ｐ ３５／００

Ａ６１Ｐ ４３／００

Ａ６１Ｋ ３１／３４１

Ａ６１Ｋ ３９／３９５

Ａ２３Ｌ ３３／１０

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

免疫チェックポイント阻害剤と、下記式（Ｉ）で示される５－（３，５－ジヒドロキシフェニル）－γ－バレロラクトン、その化合物の塩及びその化合物の抱合体の少なくとも一種とを含み、前記免疫チェックポイント阻害剤が抗ＰＤ－１抗体または抗ＣＴＬＡ－４抗体である、がん細胞増殖抑制剤。

【化1】

【請求項2】

請求項１に記載のがん細胞増殖抑制剤を含有するがん細胞増殖抑制用医薬品。

【請求項3】

請求項１に記載のがん細胞増殖抑制剤を含有するがん細胞増殖抑制用サプリメント。

【請求項4】

免疫チェックポイント阻害剤のがん細胞増殖抑制効果を増強するためのがん細胞増殖抑制効果増強剤であって、下記式（Ｉ）で示される５－（３，５－ジヒドロキシフェニル）－γ－バレロラクトン、その化合物の塩及びその化合物の抱合体の少なくとも一種を含み、前記免疫チェックポイント阻害剤が抗ＰＤ－１抗体または抗ＣＴＬＡ－４抗体である、がん細胞増殖抑制効果増強剤。

【化2】

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

これまでの免疫療法は、免疫細胞の攻撃力を高める方法が中心だったが、近年、がん細胞表面にある免疫チェックポイントが免疫細胞にある受容体と結合することにより、免疫細胞の攻撃を阻止することができることがわかってきた。そこで、免疫チェックポイント阻害剤を使用して免疫細胞ががん細胞を攻撃する力を保つ方法の開発が注目されている。

【0002】

免疫チェックポイント阻害剤は、がん細胞を直接攻撃する従来の抗がん剤とは異なり、免疫チェックポイントと受容体の結合を遮断し、がんを攻撃する免疫細胞を活性化させて、間接的にがん細胞を攻撃する。そのため、体への負担が少なく、抗がん剤が効かなくなった進行がんでも治療効果が得られる場合がある。また、自己の免疫を活性化させるので、治療効果が持続する傾向があり、従来型の抗がん薬と比較して副作用は比較的少なめで安全性は高いのが特徴（非特許文献１参照）である。そのため、免疫療法によるがん治療は、外科療法、化学療法、放射線治療に続く第４の治療法として注目されており、さらなる拡大が見込まれている分野である。
代表的な免疫チェックポイント阻害剤としては抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤＬ－１抗体、抗ＣＴＬＡ－４抗体などがあり、特に、抗ＰＤ－１抗体が用いられることが多い。

【0003】

一方、免疫チェックポイント阻害剤単独での癌奏効率は２０％と報告されており、すべての患者に治療効果が期待出来るものではない。そのため、他の治療法との併用による癌奏効率の向上が期待されており、ワクチン療法などとの併用が検討されている（特許文献１、非特許文献２参照）。

【0004】

ところで、緑茶カテキン代謝物の免疫活性化作用については、免疫細胞の増殖促進作用（特許文献２）、ナチュラルキラー細胞の活性促進作用（特許文献３）などが知られている。その他、緑茶カテキン代謝物の抗癌作用としては、子宮頸癌細胞の増殖抑制作用が知られており（特許文献４）、また、フラバン－３－オール類との併用でガン細胞増殖阻害作用増強効果があることが記載されている（特許文献５）。しかしながら、緑茶カテキン代謝物の単独での抗癌作用は限定的である。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【文献】国際公開２０２０／０６７０８５号公報

【文献】特開２０１６－００３２００号公報

【文献】特開２０１６－１６０２３８号公報

【文献】特開２０１５－０３０７２４号公報

【文献】特開２０１５－２０９４１８号公報

【非特許文献】

【0006】

【文献】Ｌａｎｃｅｔ，２０１７，ｖｏｌ．３９０，ｐ．２４６１－２４７１

【文献】ＯｎｃｏＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２０２０，ｖｏｌ．９，ｐ．１７３４２６８

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

本発明の課題は、食品成分を由来とする安全性の高い成分を含み、単独での免疫チェックポイント阻害剤の抗がん効果よりも高い抗がん効果を有するがん細胞増殖抑制剤、及び免疫チェックポイント阻害剤のがん細胞増殖抑制効果を増強することができるがん細胞増殖抑制効果増強剤を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明者らは、主なカテキン類の代謝物として報告のある５－（３，５－ジヒドロキシフェニル）－γ－バレロラクトンの生理活性作用を検討した。その結果、このカテキン代謝物には、免疫チェックポイント阻害剤の抗がん効果を増強する作用があることを発見し、本発明の完成に至った。

【0009】

すなわち、本発明は、以下の通りである。
［１］ 免疫チェックポイント阻害剤と、下記式（Ｉ）で示される５－（３，５－ジヒドロキシフェニル）－γ－バレロラクトン、その化合物の塩及びその化合物の抱合体の少なくとも一種とを含む、がん細胞増殖抑制剤。

【化1】

［２］ 前記免疫チェックポイント阻害剤が、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＣＴＬＡ－４抗体、抗Ｂ７抗体、抗Ｃ２７抗体、抗ＫＩＲ抗体、ＩＤＯ阻害薬、抗ＣＤ１３７抗体、および抗ＴＩＭ３抗体から選択される一種または複数種である、［１］に記載のがん細胞増殖抑制剤。
［３］ 前記免疫チェックポイント阻害剤が抗ＰＤ－１抗体または抗ＣＴＬＡ－４抗体である［２］に記載のがん細胞増殖抑制剤。
［４］ ［１］乃至［３］のいずれか一項に記載のがん細胞増殖抑制剤を含有するがん細胞増殖抑制用医薬品。
［５］ ［１］乃至［３］のいずれか一項に記載のがん細胞増殖抑制剤を含有するがん細胞増殖抑制用サプリメント。
［６］ 免疫チェックポイント阻害剤と、下記式（Ｉ）で示される５－（３，５－ジヒドロキシフェニル）－γ－バレロラクトン、その化合物の塩及びその化合物の抱合体の少なくとも一種を有効成分とするがん細胞増殖抑制とを併用することによって、免疫チェックポイント阻害剤の抗がん効果を増強する、免疫チェックポイント阻害剤効果増強方法。

【化2】

［７］ 免疫チェックポイント阻害剤のがん細胞増殖抑制効果を増強するためのがん細胞増殖抑制効果増強剤であって、下記式（Ｉ）で示される５－（３，５－ジヒドロキシフェニル）－γ－バレロラクトン、その化合物の塩及びその化合物の抱合体の少なくとも一種を含む、がん細胞増殖抑制効果増強剤。

【化3】

【発明の効果】

【0010】

本発明は、免疫チェックポイント阻害剤と、５－（３，５－ジヒドロキシフェニル）－γ－バレロラクトン、またはその塩もしくは抱合体の少なくとも一種とを含むがん細胞増殖抑制剤である。５－（３，５－ジヒドロキシフェニル）－γ－バレロラクトンは、食品成分由来成分を有効成分とするため、安全性が高く、その効果は即効性を有する。また、本発明はサプリメント、医薬品などに幅広く応用出来る安全で汎用性の高いものである。本発明によれば、安全で優れたがん細胞増殖抑制効果を有する、安全性の高い機能性食品やサプリメント、または医薬品を提供することが出来る。また、５－（３，５－ジヒドロキシフェニル）－γ－バレロラクトン、またはその塩もしくは抱合体は、免疫チェックポイント阻害剤と併用することによって免疫チェックポイント阻害剤の抗がん効果を高める増強剤とすることが実現できる。

【図面の簡単な説明】

【0011】

【図1】図１は、実施例１において、マウス結腸がん細胞株ＭＣ３８細胞移植２０日目の腫瘍体積を示す。

【図2】図２は、実施例２において、マウス結腸がん細胞株ＭＣ３８細胞移植２４日目の腫瘍体積を示す。

【図3】図３は、実施例２において、マウス結腸がん細胞株ＭＣ３８細胞移植４日目から３８日目までの生存数の推移を示す。

【図4】図４は、実施例３において、マウス悪性胸膜中皮腫細胞株ＡＢ１移植２２日目の腫瘍体積を示す。

【図5】図５は、比較例において、マウス結腸癌細胞株ＭＣ３８細胞移植１６日目の腫瘍体積を示す。

【発明を実施するための最良の形態】

【0012】

以下、本発明について、より詳細に説明するが、本発明は以下の記載に限定されるものではなく、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で適宜変更することができるものである。
本発明の一つは、免疫チェックポイント阻害剤と下記式（Ｉ）で示される５－（３，５－ジヒドロキシフェニル）－γ－バレロラクトン、その化合物の塩及びその化合物の抱合体の少なくとも一種とを含むがん細胞増殖抑制剤である。

【0013】

本発明のがん細胞増殖抑制剤に含まれる化合物は、式（Ｉ）で示される５－（３，５－ジヒドロキシフェニル）－γ－バレロラクトンまたはその塩もしくはその抱合体である。

【0014】

式（Ｉ）の化合物について説明する。式（Ｉ）に示す５－（３，５－ジヒドロキシフェニル）－γ－バレロラクトンは、以下の通りである。

【0015】

【化4】

【0016】

式（Ｉ）中、波線は立体配置がＲ配置またはＳ配置であることを表す。したがって、式（Ｉ）の化合物は、Ｒ体、Ｓ体いずれも包含する。なお、Ｒ体であることが好ましい。式（Ｉ）の化合物は、エピガロカテキンまたはエピガロカテキンガレートを経口摂取したときに腸内で生成される茶カテキン類の代謝産物として知られている。製造方法についても、すでに公知であり、例えば、特開２０１１－８７４８６号公報には、エピガロカテキンからの微生物による化合物の製造方法、またはその培養菌体の調製物の存在下で行う化合物の製造方法が開示されている。その他、公知の有機化学合成法（ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，９，１５１２－１５２０，２０１０）などにより得ることもできる。

【0017】

５－（３，５－ジヒドロキシフェニル）－γ－バレロラクトンは、エピガロカテキン、エピガロカテキンガレート、ガロカテキン、ガロカテキンガレートの腸内細菌代謝物である。実際にマウスに５－（３，５－ジヒドロキシフェニル）－γ－バレロラクトンを経口投与した際の血清中には、５－（３，５－ジヒドロキシフェニル）－γ－バレロラクトンの化合物の硫酸抱合体とグルクロン酸抱合体の検出が報告されている（Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ，４２，２１２-２２１，２０１９）。このことから、５－（３，５－ジヒドロキシフェニル）－γ－バレロラクトンの経口投与後のマウス体内には、抱合体が吸収されていることが既に既知であり、経口投与後の生体機能性に抱合体が寄与している可能性が示唆されている。このため、本明細書中で示す生体での認知機能の改善作用についても、硫酸抱合体および／またはグルクロン酸抱合体等の抱合体も含めた５－（３，５－ジヒドロキシフェニル）－γ－バレロラクトンの効果も含まれるとみなす事が出来る。
即ち、本発明のがん細胞増殖抑制剤の有効成分としては、式（Ｉ）の化合物である５－（３，５－ジヒドロキシフェニル）－γ－バレロラクトンと、その化合物の塩及びその化合物の抱合体も含まれる。

【0018】

すなわち、５－（３，５－ジヒドロキシフェニル）－γ－バレロラクトンの硫酸抱合体とは、式（Ｉ）中のヒドロキシ基の少なくとも一つが硫酸基またはその塩に置換されたものをいう。硫酸基又はその塩は下記のいずれかの置換基である。

【化5】

【化6】

【0019】

置換基として、硫酸基またはその塩を少なくとも１つを含む化合物の例は水酸基の少なくとも一つをスルホン化することにより得ることができる。スルホン化は、三酸化硫黄ピリジンなどを使用することにより、調製することができる。

【0020】

５－（３，５－ジヒドロキシフェニル）－γ－バレロラクトンのグルクロン酸抱合体とは、式（Ｉ）中のヒドロキシ基の少なくとも一つが、グルクロン酸またはグルクロン酸塩を含む置換基に置換されたものをいう。グルクロン酸またはグルクロン酸塩を含む化合物は、下記のいずれかの置換基である

【化7】

【化8】

【0021】

式（Ｉ）中にグルクロン酸またはグルクロン酸塩を含む化合物の例は、エピガロカテキン等を経口摂取した時に尿から検出される茶カテキン類の代謝産物である。したがって、製造方法としては、例えば、ラットに、エピガロカテキンを投与して、尿を回収し、それをＨＰＬＣなどにより、分取する方法が挙げられる。

【0022】

式（Ｉ）の化合物を免疫チェックポイント阻害剤ともに投与することにより、免疫チェックポイント阻害剤の効果を増大させ、腫瘍体積を小さくすることができ、十分な細胞増殖抑制効果を奏することができる。

【0023】

本発明のがん細胞増殖抑制剤においては、式（Ｉ）の化合物の塩も同様のがん細胞増殖抑制効果を有し、式（Ｉ）の化合物の塩も有効成分として含有することができる。式（Ｉ）の化合物の塩としては、薬理学的に許容される塩が好ましく、このような塩としては、例えば、塩とはナトリウム、カリウムなどとのアルカリ金属塩、カルシウム、マグネシウムなどとのアルカリ土類金属塩、アンモニウム塩及びメチルアミン、エチルアミン、ブチルアミン、ジメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、トリブチルアミン、エタノールアミン、ピリジン、リジン、アルギニンなどの有機塩基との塩である。
これらの塩は、従来の方法の得ることができ、例えば、ナトリウム塩であれば、式（Ｉ）の化合物を水酸化ナトリウムと接触させることにより得ることができる。

【0024】

このように、式（Ｉ）の化合物は、エピガロカテキンから得ることができるか、またはエピガロカテキン、エピガロカテキンガレートもしくはガロカテキン、ガロカテキンガレートの代謝物または代謝物の誘導体である。カテキン類［エピガロカテキン（（－）－エピガロカテキン）、エピガロカテキンガレート（（－）－エピガロカテキンガレート、ガロカテキン（（－）－ガロカテキン、ガロカテキンガレート（（－）－ガロカテキンがレート））は、主に緑茶に含まれており、茶の葉、茎、木部、樹皮、根、実、種子やこれらの混合物もしくはそれらの粉砕物から水、熱水、有機溶媒、含水有機溶媒あるいはこれらの混合物等により抽出することにより得られ、抽出物自体の他に、その精製物等があり、形態的には液体、固体（粉末を含む）の別を問わない。

【0025】

本発明のがん細胞増殖抑制剤の効果があるがんとしては、特に限定されるものではないが、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、悪性リンパ腫、多発性骨髄腫、脳腫瘍・神経膠腫、下垂体腺腫、聴神経鞘腫、ぶどう膜悪性黒色腫、髄膜腫、咽頭がん、喉頭がん、舌がん、甲状腺がん、乳がん、肺がん、胸腺腫、胸腺がん、中皮腫、食道がん、胃がん、大腸がん、肝細胞がん、胆管がん、膵臓がん、腎細胞がん、膀胱がん、前立腺がん、腎盂・尿管がん、陰茎がん、精巣（睾丸）腫瘍、子宮がん、卵巣がん、外陰がん、皮膚がん、悪性黒色腫（皮膚）、基底細胞がん、皮膚がんの前駆症、表皮内がん、有棘細胞がん、菌状息肉症、悪性骨腫瘍（骨肉腫）、軟部肉腫、軟骨肉腫、悪性線維性組織球腫及びこれらの転移がんが挙げられ、特に大腸がんの一種である結腸がん、中皮腫の一種である悪性胸膜中皮腫に有効である。

【0026】

本発明のがん細胞増殖抑制剤は、上記式（Ｉ）の化合物を有効成分として含有するが、当該化合物の人体に投与する場合は、人体に悪影響がないように投与する。本発明において、式（Ｉ）の化合物のヒトへの投与量は、体重、性別、年齢またはその他の要因に従って適宜決定すればよい。例えば、経口投与の場合、成人一日当たり、好ましくは１０～５００ｍｇ／６０ｋｇ体重、より好ましくは２０～３００ｍｇ／６０ｋｇ体重、さらに好ましくは２０～１５０ｍｇ／６０ｋｇ体重である。これら用量を、例えば、１日１回～３回に分けて投与することが好ましい。

【0027】

本発明のがん細胞増殖抑制剤には、免疫チェックポイント阻害剤を含む。免疫チェックポイント阻害剤は単独でもがん細胞の増殖を抑制する作用があるが、式（Ｉ）で示される５－（３，５－ジヒドロキシフェニル）－γ－バレロラクトン、その化合物の塩及びその化合物の抱合体の少なくとも一種と併用することにより、がん細胞増殖抑制効果を高めることができる。

【0028】

本発明のがん細胞増殖抑制剤に含まれる免疫チェックポイント阻害剤は、特に限定されるものではないが、例えば抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＣＴＬＡ－４抗体、抗Ｂ７抗体、抗Ｃ２７抗体、抗ＫＩＲ抗体、ＩＤＯ阻害薬、抗ＣＤ１３７抗体、および抗ＴＩＭ３抗体が挙げられ、抗ＰＤ－１抗体、抗ＣＴＬＡ－４抗体が好ましい。

【0029】

本発明のがん細胞増殖抑制剤において、免疫チェックポイント阻害剤は式（Ｉ）で示される５－（３，５－ジヒドロキシフェニル）－γ－バレロラクトン、その化合物の塩またはその化合物の抱合体と併用して投与される。免疫チェックポイント阻害剤の投与量は併用時においても、単独の使用方法で有効とされている投与量と同様の範囲でよい。免疫チェックポイント阻害剤の有効投与量は一様ではないが、その割合として一例を挙げるとすれば、式（Ｉ）で示される５－（３，５－ジヒドロキシフェニル）－γ－バレロラクトン、その化合物の塩またはその化合物の抱合体に対して免疫チェックポイント阻害剤の割合の下限が、１０％以上、好ましくは２０％以上、より好ましくは５０％以上であり、上限は、５００％以下、好ましくは２００％以下、より好ましくは１００％以下である。ここでの％はいずれも質量％表記である。

【0030】

本発明は、免疫チェックポイント阻害剤と式（Ｉ）の化合物とを含有する医薬品やサプリメントとすることもできるし、別個の組成物からなる組合わせの医薬品としてもよいし、式（Ｉ）の化合物を免疫チェックポイント阻害剤の効果増強用の医薬品やサプリメントとしてもよい。医薬品やサプリメントにする場合の剤形は、投与目的や投与経路等に応じて、錠剤、カプセル剤、注射剤、点滴剤、散剤、座剤、顆粒剤、軟膏剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤、クリーム剤等にすることができる。

【0031】

また、当該医薬品に、一般に製剤に使用される結合剤、賦形剤、滑沢剤、崩壊剤、安定剤、乳化剤、緩衝剤等の添加物を含有させることができる。結合剤の好適な例としてはグアガム、アラビアゴム末などが挙げられる。賦形剤の好適な例としては、デンプン、トレハロース、デキストリンなどが挙げられる。滑沢剤の好適な例としては、ステアリン酸、タルク、ショ糖脂肪酸エステル、ポリエチレングリコールなどが挙げられる。崩壊剤の好適な例としてはデンプン、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチなどが挙げられる。安定剤の好適な例としては、油脂、プロピレングリコール、シクロデキストリンなどが挙げられる。乳化剤の好適な例としては、アニオン界面活性剤、非イオン性界面活性剤、ポリビニルアルコールなどが挙げられる。緩衝剤の好適な例としては、リン酸塩、炭酸塩、クエン酸塩などの緩衝液が挙げられる。

【0032】

式（Ｉ）で示される５－（３，５－ジヒドロキシフェニル）－γ－バレロラクトン、その化合物の塩及びその化合物の抱合体の少なくとも一種は、免疫チェックポイント阻害剤のがん細胞増殖抑制効果を増強するためのがん細胞増殖抑制効果増強剤に含まれる。５－（３，５－ジヒドロキシフェニル）－γ－バレロラクトン、その化合物の塩及びその化合物の抱合体の少なくとも一種を、がん細胞増殖抑制効果増強剤として用いる場合は、当該がん細胞増殖抑制効果増強剤に免疫チェックポイント阻害剤が含まれなくてもよい。すなわち、免疫チェックポイント阻害剤を投与してから、所定の時間経過後にがん細胞増殖抑制効果増強剤を投与してもよいし、がん細胞増殖抑制効果増強剤を投与してから、所定の時間経過後に免疫チェックポイント阻害剤を投与してもよい。免疫チェックポイント阻害剤はそれぞれ所定の用法に従えばよいが、一般的には数週間間隔で数カ月から１年程度投与される。がん細胞増殖抑制効果増強剤は免疫チェックポイント阻害剤の投与期間中は継続して投与するのが望ましく、好ましくは１～７日間に一度、より好ましくは毎日投与するのが好ましい。また、免疫チェックポイント阻害剤の投与期間の前後１週間から２カ月の間にも同様に継続して投与することが好ましい。このように併用して投与されることによって免疫チェックポイント阻害剤と相乗的に作用し、効果的にがん細胞の増殖を抑制することができる。

【実施例】

【0033】

以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、これらの実施例は、本発明を好適に説明するための例示に過ぎず、なんら本発明を限定するものではない。また、以下の製造例および実施例において、５－（３，５－ジヒドロキシフェニル）－γ－バレロラクトンをＥＧＣ－Ｍ５とも記載する。

【0034】

＜製造例１：（Ｒ）－５－（３，５－ジヒドロキシフェニル）－γ－バレロラクトンの製造＞
エガーテラ・レンタＪＣＭ９９７９株を３０ｍｌのＧＡＭブイヨンに植菌し、３７℃で４８時間嫌気培養し、前培養液とした。大腸菌Ｋ１２株及びユウバクテリウム・プラウティ（フラボニフラクター・プラウティ）ＡＴＣＣ２９８６３株は１０ｍｌのＧＡＭブイヨンで２４時間嫌気培養し、前培養液とした。（－）－エピガロカテキン２９０ｍｇを含む１００ｍｌのＧＡＭブイヨンにＪＣＭ９９７９株、大腸菌Ｋ１２株の前培養液を加え、３７℃で４８時間嫌気培養した。培養液１ｍｌをサンプリングして高速遠心分離（１５０００×ｇ、１０分）により菌体を除去し、上清をＬＣ／ＭＳ分析することで（Ｓ）－１－（３，５－ジヒドロキシフェニル）－３－（２，４，６－トリヒドロキシフェニル）－プロパン－２－オールの生成を確認した。この時のＬＣ／ＭＳ条件を以下に記載する。

【0035】

＜ＬＣ／ＭＳ条件＞
・カラム：ＣＡＰＣＥＬＬＰＡＫ Ｃ１８ ＭＧ（２．０ｉ．ｄ．×１００．０ｍｍ、５μｍ、（（株）資生堂製）、
・流速：０．２ｍｌ／分
・カラム温度：４０℃
・移動相：
溶媒Ａ：（水／アセトニトリル／酢酸＝１００：２．５：０．１、容量比（ｖ／ｖ／ｖ））
溶媒Ｂ：（水／アセトニトリル／メタノール／酢酸＝３５：２．５：６５：０．１、容量比（ｖ／ｖ／ｖ／ｖ））
グラジエント；０分：Ａ１００％ Ｂ０％、３分：Ａ１００％ Ｂ０％、２５分：Ａ０％ Ｂ１００％、２５．１分：Ａ１００％ Ｂ０％、３３分：Ａ１００％ Ｂ０％
・検出：ＵＶ２７０ｎｍ
・インターフェース：ＥＳＩ
・ポラリティ：ネガティブ

【0036】

次に、上記ＡＴＣＣ２９８６３株の前培養液を、（Ｓ）－１－（３，５－ジヒドロキシフェニル）－３－（２，４，６－トリヒドロキシフェニル）－プロパン－２－オールの生成を確認した前述の培養液に加えて３７℃で４８時間嫌気培養を行った。その後、培養液１ｍｌをサンプリングして高速遠心分離（１５０００×ｇ、１０分）に供し、得られた上清を上記のＬＣ／ＭＳ分析に供して（Ｒ）－５－（３，５－ジヒドロキシフェニル）－γ－バレロラクトン（ＥＧＣ－Ｍ５）の生成を確認した。

【0037】

（Ｒ）－５－（３，５－ジヒドロキシフェニル）－γ－バレロラクトンの生成を確認した培養液を高速遠心分離（１００００×ｇ、２０分間、１０℃）し、菌体を除去した。上清に塩酸を加えｐＨ３．５に調整した後、２００ｍｌの酢酸エチルで３回抽出した。この酢酸エチル層はエバポレーターにより濃縮乾固し、分取ＨＰＬＣに供した。分取ＨＰＬＣ条件は以下に記載する。

【0038】

＜分取ＨＰＬＣ条件＞
・カラム：ＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ ＭＧ（２０ｉ．ｄ．×１５０ｍｍ、５μｍ、（（株）資生堂製）
・流速１５ｍｌ／分
・カラム温度：４０℃
・移動相
溶媒Ａ：アセトニトリル：メタノール：水：酢酸（５：５：９０：０．３、容量比（ｖ／ｖ／ｖ））
溶媒Ｂ：アセトニトリル：メタノール：水：酢酸（５：６５：３０：０．５、容量比（ｖ／ｖ／ｖ））
グラジエント；０分：Ａ８０％ Ｂ２０％、５分：Ａ８０％ Ｂ２０％、２０分：Ａ１０％ Ｂ９０％、２５分：Ａ１％ Ｂ９０％、２６分：Ａ８０％ Ｂ２０％、３５分：Ａ８０％ Ｂ２０％
・検出：ＵＶ２７０ｎｍ

【0039】

分取後、上記ＬＣ／ＭＳ分析と同条件で分析し、目的とする代謝物の含まれる画分を確認後エバポレーターで濃縮乾固した。乾固物に５ｍｌの純水を加えて溶解し、再度減圧下で濃縮乾固した。この操作を３回繰り返すことで有機溶媒に含まれていた酸を完全に除去した。乾固物に少量の純水を加えて溶解して、凍結乾燥に供した。（Ｒ）－５－（３，５－ジヒドロキシフェニル）－γ－バレロラクトン（ＥＧＣ－Ｍ５）を４５．０ｍｇ得た。

【0040】

＜製造例２：（Ｒ）－５－（３－スルフォオキシ－５－ヒドロキシフェニル）－γ－バレロラクトンの製造＞
製造例１で得られた（Ｒ）－５－（３，５－ジヒドロキシフェニル）－γ－バレロラクトン１６３．１ｍｇ（０．７８ｍｍｏｌ）に、ピリジン１０ｍｌと硫酸ナトリウム５ｍｇを加え、室温で１０分間攪拌した。次に、三酸化硫黄ピリジンを７９０．４ｍｇ（４．６８ｍｍｏｌ）加え、室温で１時間攪拌させた。攪拌後、０．２Ｍリン酸二水素ナトリウムバッファー（ｐＨ７．２）を加えて反応停止させ、エバポレーターで減圧濃縮して得られた濃縮残渣を３ｍｌの水で溶解し分取ＨＰＬＣに供した。分取ＨＰＬＣ条件を以下に記載する。

【0041】

＜分取ＨＰＬＣ条件＞
・カラム：ＣＡＰＣＥＬＬＰＡＫ ＭＧ（２０ｉ．ｄ．×１５０ｍｍ、５μｍ、（株）資生堂製）
・流速：１９．０ｍｌ／分
・カラム温度：４０℃
・移動相：
溶媒Ａ：過塩素酸ナトリウム／水（１２２．４：５００、質量／容量比（ｗ／ｖ））
溶媒Ｂ：過塩素酸ナトリウム／アセトニトリル（１２２．４：５００、質量／容量比（ｗ／ｖ））
グラジエント；０分：Ａ１００％ Ｂ０％、３分：Ａ１００％ Ｂ０％、１５分：Ａ０％ Ｂ１００％、１６分：Ａ１００％ Ｂ０％、２０分：Ａ１００％ Ｂ０％
・検出：ＵＶ２８０ｎｍ

【0042】

分画したフラクションをエバポレーターで減圧濃縮することによりアセトニトリルを除去し、（Ｒ）－５－（３－スルフォオキシ－５－ヒドロキシフェニル）－γ－バレロラクトンの粗精製物を得た。得られた各粗精製物をＳＵＰＥＬＣＯ ＤＩＳＣＯＶＥＲＹ ＤＳＣ－１８カラムにＯＤＳ（Ｃｈｒｏｍａｔｏｒｅｘ １５－３０μｍ、１０ｃｍ^３）を追加充填したカラムにのせ、水１６０ｍｌで洗浄した後、アセトニトリル１７５ｍｌにて溶出した。得られたアセトニトリル溶出画分をそれぞれエバポレーターで減圧濃縮して凍結乾燥に供することにより、白色粉末状の（Ｒ）－５－（３－スルフォオキシ－５－ヒドロキシフェニル）－γ－バレロラクトン精製物を１２．５ｍｇ（０．０４ｍｍｏｌ、収率５．２％）得た。

【0043】

得られた精製物を１Ｈ－ＮＭＲで分析したところ以下のケミカルシフト値が得られ、目的の化合物であることを確認した。
（Ｒ）－５－（３－スルフォオキシ－５－ヒドロキシフェニル）－γ－バレロラクトン：１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，重水素化メタノール）：δ６．２４（２Ｈ，ｓ），６．１９（１Ｈ，ｓ），４．７９（１Ｈ，ｍ），２．９１（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），２．５５（１Ｈ，ｍ），２．４６（１Ｈ，ｍ），２．３３（１Ｈ，ｍ），２．００（１Ｈ，ｍ）

【0044】

＜製造例３：（Ｒ）－５－［３－（β―Ｄ－グルコピラヌロノシルオキシ－５－ヒドロキシ）フェニル］－γ－バレロラクトンの製造＞
８週齢のＷｉｓｔａｒ系ラット（雄性、日本チャールスリバー株式会社から購入）６匹を精製飼料で１週間予備飼育し、試験前日より絶食させて試験に用いた。投与サンプルは（－）－エピガロカテキンを生理食塩水に溶解させた溶液とし、各ラットに２０ｍｇ／１．７ｍＬずつ胃内強制投与した。投与は４日間反復して行い、それぞれ投与後６時間～２４時間の尿を回収した。

【0045】

回収した尿２５０ｍＬを合一し、エバポレーターで約４５ｍＬになるまで減圧濃縮した。次に、得られた濃縮液にメタノール２２５ｍＬを加えてよく混合した後、高速遠心分離（１００００×ｇ、１０分間、４℃）によりタンパク質沈殿物を除去した。得られた上清をエバポレーターで約４５ｍＬになるまで減圧濃縮し、水を加えて４５０ｍＬとした後、酢酸を加えてｐＨ３．０に調整した。０．１Ｍリン酸－クエン酸バッファーでｐＨ３．０に調整したＯａｓｉｓＨＬＢカートリッジ（Ｗａｔｅｒｓ社製、３５ｃｃ）に、上記調整した尿溶液を通液した後、水１７５ｍＬ、２０％メタノール水溶液１７５ｍＬの順で洗浄した後、４０％メタノール水溶液１７５ｍＬにて（Ｒ）－５－［３－（β－Ｄ－グルコピラヌロノシルオキシ－５－ヒドロキシ）フェニル］－γ－バレロラクトンを含む画分を溶出した。得られた４０％メタノール溶出画分をエバポレーターで減圧濃縮し、濃縮残渣に水５ｍＬを加えて分取ＨＰＬＣに供した。分取ＨＰＬＣ条件は以下に記載する。

【0046】

＜分取ＨＰＬＣ条件＞
・カラム：Ｍｉｇｈｔｙｓｉｌ ＲＰ１８ ＧＰ（２０ｉ．ｄ．×２５０ｍｍ、５μｍ、（関東化学（株）製）
・流速１５ｍｌ／分
・移動相：
溶媒Ａ：メタノール／水／酢酸（５／９５／０．２、容量比（ｖ／ｖ／ｖ））
溶媒Ｂ：メタノール／水／酢酸（６０／４０／０．２、容量比（ｖ／ｖ／ｖ））
グラジエント；０分：Ａ８０％ Ｂ２０％、５分：Ａ８０％ Ｂ２０％、１５分：Ａ０％ Ｂ１００％、１８分：Ａ０％ Ｂ１００％、１８．１分：Ａ８０％ Ｂ２０％、２５分：Ａ８０％ Ｂ２０％
・検出：ＵＶ２７０ｎｍ

【0047】

分取後、得られた分取液をＬＣ／ＭＳ分析（製造例１と同条件）に供して（Ｒ）－５－［３－（β―Ｄ－グルコピラヌロノシルオキシ－５－ヒドロキシ）フェニル］－γ－バレロラクトンが含まれることを確認した。

【0048】

さらに、（Ｒ）－５－［３－（β―Ｄ－グルコピラヌロノシルオキシ－５－ヒドロキシ）フェニル］－γ－バレロラクトンが含まれる画分をリサイクルＨＰＬＣに供し、精製を行った。リサイクルＨＰＬＣ条件は以下に記載する。

【0049】

＜リサイクルＨＰＬＣ条件＞
・カラム：Ｍｉｇｈｔｙｓｉｌ ＲＰ１８ ＧＰ（２０ｉ．ｄ．×２５０ｍｍ、５μｍ、（関東化学（株）製）
・流速１５ｍｌ／分
・移動相：アセトニトリル／水／酢酸（１５／８５／０．２、容量比（ｖ／ｖ／ｖ））
・検出：ＵＶ２７０ｎｍ

【0050】

分取後、上記のＬＣ／ＭＳ分析により、分画した画分に（Ｒ）－５－［３－（β―Ｄ－グルコピラヌロノシルオキシ－５－ヒドロキシ）フェニル］－γ－バレロラクトンが含まれていることを確認した。この（Ｒ）－５－［３－（β―Ｄ－グルコピラヌロノシルオキシ－５－ヒドロキシ）フェニル］－γ－バレロラクトンが含まれる画分をエバポレーターで濃縮乾固し、乾固物に５ｍｌの水を加えて溶解した後、再度減圧下で濃縮乾固した。この操作を３回繰り返すことで、有機溶媒に含まれていた酸を完全に除去した。最後に、乾固物に水２ｍＬを加えて溶解し、凍結乾燥に供することで（Ｒ）－５－［３－（β―Ｄ－グルコピラヌロノシルオキシ－５－ヒドロキシ）フェニル］－γ－バレロラクトンを２８．０ｍｇ得た。

【0051】

＜実施例１：ＥＧＣ－Ｍ５と抗ＣＴＬＡ－４抗体との併用投与が結腸がん細胞の増殖に与える効果＞
（ａ） 飼育方法および投与方法
６週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊ雄性マウスを予備飼育後、マウス結腸癌細胞株ＭＣ３８細胞を５．０×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍｉｃｅとなるように皮下移植した。各群を８匹として、抗ＣＴＬＡ－４抗体単独投与群については移植４日後から抗ＣＴＬＡ－４抗体（ＢｉｏＸ ｃｅｌｌ社製）を２．５ｍｇ／ｋｇ ｂ．ｗ．の投与量で７日ごとに腹腔内投与した。併用投与群については、移植４日後から抗ＣＴＬＡ－４抗体を２．５ｍｇ／ｋｇ ｂ．ｗ．の投与量で７日ごとに腹腔内投与し、ＥＧＣ－Ｍ５を１０ｍｇ／ｋｇ ｂ．ｗ．の投与量で毎日腹腔内投与した。被験物質は１０％ＤＭＳＯ含有ＰＢＳ緩衝液を溶媒として用い、抗ＣＴＬＡ－４抗体を投与しない対照群（Ｃｏｎｔｒｏｌ群）にはアイソタイプコントロール抗体（Ｉｓｏｔｙｐｅ ｃｏｎｔｒｏｌ抗体、ＢｉｏＸ ｃｅｌｌ社製）を投与した。腫瘍体積をノギスで測定し、腫瘍成長を評価した。

【0052】

（ｂ） 試験結果
図１に示したように、移植２０日目においてＣｏｎｔｒｏｌ群と併用投与群の間の腫瘍体積値に有意差が生じた。一方で抗ＣＴＬＡ－４抗体の単独投与群では腫瘍体積に有意な変化は見られなかった。さらに併用投与群では、屠殺時に腫瘍が根絶している寛解個体が二匹確認された。以上の結果から、ＥＧＣ－Ｍ５と抗ＣＴＬＡ－４抗体の併用投与は抗腫瘍効果を増強することが示された。

【0053】

（ｃ） 統計処理方法
得られた腫瘍体積の結果を平均値（Ｍｅａｎ）および標準誤差（Ｓ．Ｅ．）で示し、Ｔｕｋｅｙ’ｓ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｔｅｓｔにより有意差を調べた。有意水準は＊ｐ＜０．０５とした。

【0054】

＜実施例２：ＥＧＣ－Ｍ５と抗ＰＤ－１抗体の併用投与が結腸がん細胞の増殖に与える効果＞
（ａ） 飼育方法および投与方法
６週齢の雄性Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを予備飼育後、マウス結腸がん細胞株ＭＣ３８を５×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍｏｕｓｅとなるように皮下移植した。各群を１０匹として、抗ＰＤ－１抗体単独投与群については、移植４日後、７日後、１１日後、１４日後の４回にわたり抗ＰＤ－１抗体（ＢｉｏＸ ｃｅｌｌ社製）を５ｍｇ／ｋｇ ｂ．ｗ．の投与量で腹腔内投与した。併用投与群については、移植４日後、７日後、１１日後、１４日後の４回にわたり抗ＰＤ－１抗体５ｍｇ／ｋｇ ｂ．ｗ．を腹腔内投与し、移植４日後からＥＧＣ－Ｍ５を毎日１０ｍｇ／ｋｇ ｂ．ｗ．の投与量で腹腔内投与した。被験物質は１０％ＤＭＳＯ含有ＰＢＳ緩衝液を溶媒として用い、抗ＰＤ－１抗体を投与しない対照群（Ｃｏｎｔｒｏｌ群）にはアイソタイプコントロール抗体（Ｉｓｏｔｙｐｅ ｃｏｎｔｒｏｌ抗体、ＢｉｏＸ ｃｅｌｌ社製）を投与した。
２日置きにノギスで腫瘍体積を測定し、腫瘍成長を評価した。その後、腫瘍体積がエンドポイント（３０００ｍｍ^３）に達し次第、と殺を行い、生存率を評価した。

【0055】

（ｂ） 試験結果
図２、図３に示したように、ＥＧＣ－Ｍ５と抗ＰＤ－１抗体の併用投与群で、抗ＰＤ－１抗体単独投与群よりも、腫瘍成長が抑えられ、生存率が上昇した。
腫瘍体積測定の結果、腫瘍移植から２４日目において、ＥＧＣ－Ｍ５及び抗ＰＤ－１抗体の併用投与により有意に腫瘍成長を抑制することが認められた。また、生存率の評価を行った結果、腫瘍移植から３８日目において併用投与群において有意に生存率が上昇していた。この結果から、ＥＧＣ－Ｍ５は抗ＰＤ－１抗体の抗腫瘍作用を増強させることが明らかとなった。

【0056】

（ｃ） 統計処理方法
得られた腫瘍体積の結果を平均値（Ｍｅａｎ）および標準誤差（Ｓ．Ｅ．）で示し、Ｄｕｎｎｅｔｔ’ｓ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｔｅｓｔにより対照群との有意差を調べた。また、生存率の結果については、Ｌｏｇ－Ｒａｎｋ ｔｅｓｔにより対象群との有意差を調べた。有意水準は＊＊ｐ＜０．０１とした。

【0057】

＜実施例３：ＥＧＣ－Ｍ５と抗ＰＤ－１抗体の併用投与が悪性胸膜中皮腫細胞の増殖に与える効果＞
（ａ） 飼育方法および投与方法
６週齢の雄性Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを予備飼育後、マウス悪性胸膜中皮腫細胞株ＡＢ１を１．０×１０^７ｃｅｌｌｓ／ｍｏｕｓｅとなるように皮下移植した。各群を９匹として、抗ＰＤ－１抗体単独投与群については、移植４日後、７日後、１０日後、１４日後の４回にわたり抗ＰＤ－１抗体を５ｍｇ／ｋｇ ｂ．ｗ．の投与量で腹腔内投与した。併用投与群については、移植４日後、７日後、１０日後、１４日後の４回にわたり抗ＰＤ－１抗体（ＢｉｏＸ ｃｅｌｌ社製）を５ｍｇ／ｋｇ ｂ．ｗ．で腹腔内投与し、４日後からＥＧＣ－Ｍ５を毎日１０ｍｇ／ｋｇ ｂ．ｗ．の投与量で毎日腹腔内投与した。被験物質は１０％ＤＭＳＯ含有ＰＢＳ緩衝液を溶媒として用い、抗ＰＤ－１抗体を投与しない対照群（Ｃｏｎｔｒｏｌ群）にはアイソタイプコントロール抗体（Ｉｓｏｔｙｐｅ ｃｏｎｔｒｏｌ抗体、ＢｉｏＸ ｃｅｌｌ社製）を投与した。３日置きにノギスで腫瘍体積を測定し、腫瘍成長を評価した。

【0058】

（ｂ） 試験結果
図４に示したように、ＥＧＣ－Ｍ５及び抗ＰＤ－１抗体の併用投与により、Ｃｏｎｔｒｏｌ群と比較して有意に腫瘍成長が抑制されることが示された。また、２２日後の腫瘍寛解個体がＣｏｎｔｒｏｌ群で０匹、抗ＰＤ－１抗体単独投与群で４匹、併用投与群で６匹確認された。以上の結果より、ＥＧＣ－Ｍ５は抗ＰＤ－１抗体との併用により抗ＰＤ－１抗体の抗腫瘍効果を増強することが確認された。

【0059】

（ｃ） 統計処理方法
得られた腫瘍体積の結果を平均値（Ｍｅａｎ）および標準誤差（Ｓ．Ｅ．）で示し、Ｄｕｎｎｅｔｔ’ｓ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｔｅｓｔにより対照群との有意差を調べた。有意水準は、＊ｐ＜０．０５とした。

【0060】

＜比較例１：ＥＧＣ－Ｍ５単独投与が結腸がん細胞の増殖に与える効果＞
（ａ） 飼育方法および投与方法
６週齢の雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウスを予備飼育後、マウス結腸癌細胞株ＭＣ３８細胞を５×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍｉｃｅとなるように皮下移植を行った。各群を８匹として、腫瘍移植４日後からＥＧＣ－Ｍ５を、５ｍｇ、１０ｍｇ、２０ｍｇ、３０ｍｇ／ｋｇ ｂ．ｗ．の投与量になるように１０％ＤＭＳＯ含有ＰＢＳ緩衝液に溶解調製し、毎日２００μＬずつの容量で腹腔内に投与した。腫瘍体積をノギスで測定し、経時的に腫瘍成長を評価した。移植１６日後の腫瘍体積（自然対数）の平均値を図５に示す。

【0061】

（ｂ） 試験結果
移植から１６日目における対照群（Ｃｏｎｔｒｏｌ群）とＥＧＣ－Ｍ５投与群の腫瘍体積（自然対数）の平均値（Ｍｅａｎ）および標準誤差（Ｓ．Ｅ．）について、Ｔｕｋｅｙ’ｓ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｔｅｓｔにより有意差を確認した。その結果、両群の腫瘍体積値に有意な差は認められなかった。

【産業上の利用可能性】

【0062】

本発明は、カテキン代謝物として報告されている特定の化合物及びそれらの抱合体は、免疫チェックポイント阻害剤の効果を増強することができ、免疫チェックポイント阻害剤と式（Ｉ）の化合物とを含むがん細胞増殖抑制剤として提供する事が出来、また、当該定の化合物及びそれらの抱合体は、免疫チェックポイント阻害剤のがん細胞増殖抑制効果増強剤として提供することができる。本発明は、食品由来成分を有効成分とする、安全で摂取が可能なサプリメント、医薬品を提供するものである。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】