(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-05-09
(45)【発行日】2024-05-17
(54)【発明の名称】電気回転デバイス及びこれを備えた細胞評価システム
(51)【国際特許分類】
C12M 1/34 20060101AFI20240510BHJP
C12M 1/00 20060101ALI20240510BHJP
C12Q 1/06 20060101ALI20240510BHJP
【ＦＩ】
C12M1/34 B
C12M1/00 A
C12Q1/06
【請求項の数】
7
(21)【出願番号】P 2020093819
(22)【出願日】2020-05-29
(65)【公開番号】P2021185813
(43)【公開日】2021-12-13
【審査請求日】2023-04-13
(73)【特許権者】
【識別番号】513099603
【氏名又は名称】兵庫県公立大学法人
(74)【代理人】
【識別番号】110000556
【氏名又は名称】弁理士法人有古特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】鈴木 雅登
(72)【発明者】
【氏名】河合 志希保
(72)【発明者】
【氏名】安川 智之
【審査官】松原 寛子
(56)【参考文献】
【文献】Biophys.J.，1999年，76，3307-3314
【文献】IEEE Computer Society，2018年，20，136-139
【文献】Transducers 2019-EUROSENSORS XXXIII，2019年，213-216，TSA.005
【文献】生体医工学，2019年，Annual 57巻, Abstract号，S273_2
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｍ １／３４
Ｃ１２Ｍ １／００
Ｃ１２Ｑ １／０６
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
絶縁性基板と、前記絶縁性基板上に設けられた第１の絶縁層と、
前記第１の絶縁層を貫通するように設けられ、単一の細胞を保持するための複数の貫通孔と、
前記絶縁性基板と前記第１の絶縁層との間に縞状に設けられた複数の第１の導体部と、
前記第１の絶縁層上に縞状に設けられ、平面視において前記第１の導体部と交差するように配置された複数の第２の導体部と、
前記第２の導体部を被覆する第２の絶縁層と、
を有する電極デバイスを備えるとともに、
前記第１の導体部及び前記第２の導体部の各々に電圧を供給する電圧供給部を備え、
各々の前記貫通孔は、平面視において、互いに隣り合う前記第１の導体部の間に配置されるとともに互いに隣り合う前記第２の導体部の間に配置されており、
前記互いに隣り合う前記第１の導体部は、各々の一部が前記貫通孔に露出して対向する２つの第１の電極となるよう構成され、
前記互いに隣り合う前記第２の導体部は、平面視において前記貫通孔を介して対向する各々の一部が前記第２の絶縁層から露出して対向する２つの第２の電極となるよう構成され、
前記電圧供給部は、
各々の前記貫通孔内に回転電場を発生させるために前記２つの第１の電極および前記２つの第２の電極からなる４つの電極のそれぞれに９０度ずつ位相をずらした交流電圧が印加されるように、前記第１の導体部及び前記第２の導体部の各々に交流電圧を供給するよう構成された、
電気回転デバイス。
【請求項2】
平面視において、前記貫通孔が行列状に配置されるとともに、前記第１の導体部と前記第２の導体部とが直交するように配置された、請求項１に記載の電気回転デバイス。
【請求項3】
平面視において、前記貫通孔が長方形状である、請求項１または２に記載の電気回転デバイス。
【請求項4】
請求項１～３のいずれかに記載の電気回転デバイスと、前記電気回転デバイスの電極デバイス上に溶液を供給する送液ユニットと、
前記電極デバイス上の細胞の運動を撮影する撮影装置と、
前記電気回転デバイスの電圧供給部、前記送液ユニットおよび前記撮影装置を制御する制御装置と、
を備え、
前記制御装置は、
前記電極デバイス上に細胞を含む溶液が供給され前記電極デバイスの複数の貫通孔に細胞が保持された状態で、各々の前記貫通孔内に回転電場を発生させるために前記電圧供給部に交流電圧の供給を開始させるとともに、前記撮影装置に撮影を開始させる第１の処理と、
前記第１の処理の後に、前記撮影装置によって撮影された動画情報に基づいて各々の前記貫通孔内の細胞の回転速度情報を算出する第２の処理と、
前記第２の処理の後に、前記送液ユニットに薬剤を含む溶液を前記電極デバイス上に供給させる第３の処理と、
前記薬剤を含む溶液が前記電極デバイス上に供給された後に前記撮影装置によって撮影された動画情報に基づいて各々の前記貫通孔内の細胞の回転速度情報を算出する第４の処理と、
各々の前記貫通孔内の細胞について、前記第２の処理で算出した回転速度情報と前記第４の処理で算出した回転速度情報とを比較する第５の処理と、を行うよう構成された、
細胞評価システム。
【請求項5】
前記制御装置によって制御され、前記貫通孔内の細胞を捕捉し、細胞保持プレート上に放出するための単一細胞捕捉装置をさらに備え、前記制御装置は、
前記第５の処理による比較結果に基づいて回収する細胞を決定する第６の処理と、
前記単一細胞捕捉装置に前記決定した回収する細胞を捕捉させ、前記細胞保持プレート上に放出させる第７の処理と、をさらに行うよう構成された、
請求項４に記載の細胞評価システム。
【請求項6】
前記制御装置によって制御され、前記第５の処理による比較結果を表示する表示装置をさらに備えた、請求項４または５に記載の細胞評価システム。
【請求項7】
前記制御装置は、前記電圧供給部が供給する交流電圧の周波数を、理論計算に基づいて前記薬剤を含む溶液が前記電極デバイス上に供給される前の細胞の回転速度が最大となる周波数に決定するよう構成された、
請求項４～６のいずれかに記載の細胞評価システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、回転電場を形成して細胞を回転させる電気回転デバイス及びこれを備えた細胞評価システムに関する。
【背景技術】
【0002】
細胞の電気特性（細胞膜容量，細胞質導電率，細胞膜電位）は、細胞膜の形状，表面積，細胞膜のイオン透過性によって変化するパラメータであり、細胞の種類，細胞の分化度，細胞の興奮（脱分極，過分極）状態の評価などに利用される。１９７６年にＮｅｈｅｒとＳａｋｍａｎによって開発されたパッチクランプ法は、細胞電気特性の１つである膜電位計測のゴールドスタンダードな方法であり、細胞の様々な電気生理現象の解明に貢献してきた。パッチクランプ法は、イオンチャネルの開閉といった動的な変化の検出に最適な手法だが、単一細胞に対してガラスキャピラリを接触させる必要があり、スループットが悪く、高度な実験スキルが必要である。
【0003】
一方で誘電泳動や電気回転といった細胞の電気動力学現象は、細胞膜表面の電気的な状態と外部電場との静電相互の結果、細胞に力が作用する現象である。そのため、細胞の電気動力学挙動を解析することによって、パッチクランプとは異なり、細胞に対して非侵襲的に細胞の電気特性を決定することができる。特に電気回転法は、外部回転電場と細胞の分極電荷の相互作用によって細胞が回転する現象であり、回転速度の計測から細胞の電気特性を求めることができる。
【0004】
細胞の電気回転を誘導させるためには、回転電場を形成する必要がある。図２３～図２６は、それぞれ従来例の回転電場を形成する電気回転デバイスの要部の構成を説明するための図である。図２３～図２６において、それぞれ、（Ａ）は各電極の配置を示す斜視図であり、（Ｂ）は各電極に印加する交流電圧の位相差を示す図であり、（Ｃ）は（Ａ）のある部分の断面模式図である。
【0005】
第１従来例の電気回転デバイスは、図２３に示すように、基板ＳＢ１上にある中心点に対して４つの電極Ｄ１１～Ｄ１４を点対象に配置させたPolynomial型電極を備えている（非特許文献１，２参照）。そして、周波数と大きさが同じで位相が９０°ずつ異なるサイン波交流電圧をそれぞれ４つの電極Ｄ１１～Ｄ１４に印加すると、中心部に回転電場が誘起され、細胞に電気回転が作用する。中心部に配置された細胞は、安定した電気回転を示すため、印加する周波数を数ｋＨｚ～数十ＭＨｚの領域で変化させると、それぞれの周波数における細胞の電気回転速度を計測することができる。
【0006】
ここで、細胞の電気回転速度Ωは、次の（１）式に示すように、Clausius-Mossotti因子（ＣＭ(ω)）の虚部（Ｉｍ［ＣＭ］）に比例する。
【0007】
【数1】
【0008】
ε１：細胞外液の誘電率
η：細胞外液の粘度
Ｅ：電場
また、Clausius-Mossotti因子（ＣＭ(ω)）は、次の（２）式で示すことができる。
η：細胞外液の粘度
Ｅ：電場
また、Clausius-Mossotti因子（ＣＭ(ω)）は、次の（２）式で示すことができる。
【0009】
【数2】
【0010】
ω：角周波数（ω＝２πｆ、ｆは印加周波数）
τm＝(ＣｍＲ)／σi
τi＝εi／σi
τ1＝ε1／σ1
τm'＝(ＣｍＲ)／σ1
Ｃｍ：細胞膜容量
Ｒ：細胞の半径
σｉ：細胞質導電率
εｉ：細胞質誘電率
σ１：細胞外液の導電率
ε１：細胞外液の誘電率
細胞外液の導電率（σ１）および誘電率（ε１）は実験的に調製することが可能であり、細胞質誘電率（εｉ）は細胞間でほとんど差がない。各周波数における細胞の電気回転速度の計測結果に対して、（１）式及び（２）式により算出した電気回転速度Ωをフィッティングさせることで、細胞膜容量（Ｃｍ）と細胞質導電率（σｉ）という細胞の電気特性を求めることができる。
τm＝(ＣｍＲ)／σi
τi＝εi／σi
τ1＝ε1／σ1
τm'＝(ＣｍＲ)／σ1
Ｃｍ：細胞膜容量
Ｒ：細胞の半径
σｉ：細胞質導電率
εｉ：細胞質誘電率
σ１：細胞外液の導電率
ε１：細胞外液の誘電率
細胞外液の導電率（σ１）および誘電率（ε１）は実験的に調製することが可能であり、細胞質誘電率（εｉ）は細胞間でほとんど差がない。各周波数における細胞の電気回転速度の計測結果に対して、（１）式及び（２）式により算出した電気回転速度Ωをフィッティングさせることで、細胞膜容量（Ｃｍ）と細胞質導電率（σｉ）という細胞の電気特性を求めることができる。
【0011】
このようにしてPolynomial型電極を用いて、形状が類似したＢ細胞，Ｔ細胞，単球の電気回転速度の計測結果からそれぞれの細胞質導電率や細胞膜容量の同定法が開示されている（非特許文献３参照）。他にも、Ｔ細胞に対して細胞分裂刺激剤を添加し、２４時間後，４８時間後の細胞膜容量を計測する方法が開示されている（非特許文献４参照）。
【0012】
次に、第２従来例の電気回転デバイスは、図２４に示すように、基板ＳＢ２上に細胞を取り囲む４つの導電性のポールからなる電極Ｄ２１～Ｄ２４を備えている（非特許文献５，６参照）。非特許文献５では、基板ＳＢ２上に電極の配線を作製し、一部の電極を残して絶縁被膜を形成させる。絶縁されていない電極を用いて電極上に銅メッキし、導電性のポールが作製されている。また、非特許文献６では、基板ＳＢ２上にＳＵ－８のような厚膜の絶縁性レジストを用いて絶縁性のポールを作製し、その周りに白金や金をスパッタ蒸着することによって導電性のポールが作製されている。
【0013】
次に、第３従来例の電気回転デバイスは、図２５に示すように、２枚の交互くし形電極基板ＳＢ３１，ＳＢ３２を、平面視においてそれぞれのバンド電極が直交するようにスペーサを介して配置した構成である（非特許文献７，８参照）。この場合、上下２本、合計４本のバンド電極Ｄ３１～Ｄ３４で囲われたマイクログリッドが形成される。２枚の交互くし形電極基板の間に細胞懸濁液を導入し、それぞれのバンド電極Ｄ３１～Ｄ３４に９０°ずつ位相をずらしたサイン波交流電圧を印加することによって、マイクログリッド内に回転電場を誘起させることができる。このデバイスでは、交互くし形電極基板のバンド電極の本数を増やすだけで、マイクログリッドの数を増やすことができ、１回の実験で複数の単一細胞の電気回転を行うことができる。
【0014】
次に、第４従来例の電気回転デバイスは、図２６に示すように、基板ＳＢ４上に４つの電極Ｄ４１～Ｄ４４が形成され、この各々の上に厚膜の絶縁膜Ｇ１が形成され、各絶縁膜Ｇ１の上に電極Ｄ５１～Ｄ５４が形成された構成である（非特許文献９参照）。結果として、厚膜の絶縁膜Ｇ１を介して２組のPolynomial型電極が３次元的に配置された構成である。基板ＳＢ４上のPolynomial型電極（Ｄ４１～Ｄ４４）および厚膜の絶縁膜Ｇ１上のPolynomial型電極（Ｄ５１～Ｄ５４）の合計８つの電極に対して交流電圧を印加することにより、中心部に配置される細胞の電気回転を行うことができる。なお、電極Ｄ４１～Ｄ４４および電極Ｄ５１～Ｄ５４は、図２３（Ａ）に示す電極Ｄ１１～Ｄ１４のような形状であってもよい。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0015】
【文献】W．M．Arnold，U．Zimmermann 「Measurements of dielectric properties of single cells or other particles using direct observation of electro-rotation」 Proceedings of The First International Conference on Low Cost Experiments in Biophysics 1989，1-13
【文献】Alun W．Griffith，Jonathan M． Cooper 「Single-Cell Measurements of Human Neutrophil Activation Using Electrorotation」 Anal．Chem．1998,70,2607
【文献】J. Yang, Y. Huang, X. Wang, X.-B. Wang, F. F. Becker and P. R. C. Gascoyne, 「Dielectric Properties of Human Leukocyte Subpopulations Determined by Electrorotation as a Cell Separation Criterion」Biophys. J., 1999, 76, 3307-3314
【文献】Ying Huang，Xiao-Bo Wang, Peter R．C．Gascoyne, Frederick F． Becker 「Membrane Dielectric Responses of human T-lymphocytes following mitogenic stimulation」Biochimica et Biophysica Acta,1999,1417,51-62
【文献】M. Eguchi, K. Horio, F. Kuroki, H. Imasato and T. Yamakawa 「Development of Pillar Electrode Array for Electrorotation Analysis of Single Cells」in World Automation Congress Proceedings, IEEE Computer Society, 2018, vol. 2018-June, pp. 136-139.
【文献】K. Keim, M. Z. Rashed, S. C. Kilchenmann, A. Delattre, A. F. Goncalves, P. Ery and C. Guiducci 「On-chip Technology for Single-Cell Arraying, Electrorotation-based Analysis and Selective Release」 Electrophoresis, 2019, 40, 1830-1838.
【文献】K. Ino, A. Ishida, K. Y. Inoue, M. Suzuki, M. Koide, T. Yasukawa, H. Shiku and T. Matsue 「Electrorotation Chip Consisting of Three-Dimensional Interdigitated Array Electrodes」Sensors Actuators B Chem., 2011, 153, 468-473.
【文献】河合志希保、有本 聡、是永継博、鈴木雅登、安川智之「細胞の一括電気回転計測で同定した膜容量に基づく細胞種の識別」Proceedings of the 66th Chemical Sensor Symposium，2019，35,118－120
【文献】Y. Okamoto, T. Tsuchiya, C. Moslonka, Y. S. Lin, S. Tsang, F. Marty, A. Mizushima, C. L. Sun, H. Y. Wang, A. Tixier-Mita, O. Francais, B. Le Pioufle and Y. Mita 「Z-Axis Controllable Mille-Feuille Electrode Electrorotation Device Utilizing Levitation Effect」, in 2019 20th International Conference on Solid-State Sensors, Actuators and Microsystems and Eurosensors XXXIII, TRANSDUCERS 2019 and EUROSENSORS XXXIII, Institute of Electrical and Electronics Engineers Inc., 2019, pp. 213-216.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0016】
図２３に示されるような非特許文献１，２の構成では、一回の実験で１つの細胞しか評価できず、実験のスループットが悪い。また、電極Ｄ１１～Ｄ１４が底面に集約されているため、電極中心部からわずかでも外れた細胞は誘電泳動の作用により、下の電極への吸着や電極からの浮上による散失という課題を有している。また、細胞を中心部に捕捉するための保持力がないため、溶液の流れなどによって電気回転中の細胞が電極中心部から散失してしまい、同一細胞の電気回転速度の経時変化を計測することができない。
【0017】
また、図２４に示されるような非特許文献５の構成では、電極Ｄ２１～Ｄ２４となる導電性のポールが細胞毒性を有する銅で構成されるため、細胞の評価に用いることができない。また、非特許文献６の構成では、電極Ｄ２１～Ｄ２４となる導電性のポールが、絶縁性のポールに金属を蒸着することにより形成されているため、金属の均一なコーティングが難しくポール間で導電性が異なる。そのため、導電性のポールをアレイ化し、一度に多数の単一細胞の電気回転を行うデバイスの作製が困難である。
【0018】
また、図２５に示されるような非特許文献７，８の構成では、上面が交互くし形電極基板ＳＢ３２で密閉されているため、細胞をマイクログリッドに保持した状態で溶液を交換することができない。そのため、溶液に溶解させた薬剤による刺激に伴う電気回転速度の経時変化を計測することができない。
【0019】
また、図２６に示されるような非特許文献９の構成は、Polynomial型電極構造の延長線上の構造であり、一回の実験で１つの細胞しか評価できず、実験のスループットが悪い。
【0020】
本発明は上記のような課題を解決するためになされたもので、複数の単一細胞の電気特性の経時変化を一括して計測することができる電気回転デバイス及びこれを備えた細胞評価システムを提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【0021】
上記目的を達成するために、本発明のある態様に係る電気回転デバイスは、絶縁性基板と、前記絶縁性基板上に設けられた第１の絶縁層と、前記第１の絶縁層を貫通するように設けられ、単一の細胞を保持するための複数の貫通孔と、前記絶縁性基板と前記第１の絶縁層との間に縞状に設けられた複数の第１の導体部と、前記第１の絶縁層上に縞状に設けられ、平面視において前記第１の導体部と交差するように配置された複数の第２の導体部と、前記第２の導体部を被覆する第２の絶縁層と、を有する電極デバイスを備えるとともに、前記第１の導体部及び前記第２の導体部の各々に電圧を供給する電圧供給部を備え、各々の前記貫通孔は、平面視において、互いに隣り合う前記第１の導体部の間に配置されるとともに互いに隣り合う前記第２の導体部の間に配置されており、前記互いに隣り合う前記第１の導体部は、各々の一部が前記貫通孔に露出して対向する２つの第１の電極となるよう構成され、前記互いに隣り合う前記第２の導体部は、平面視において前記貫通孔を介して対向する各々の一部が前記第２の絶縁層から露出して対向する２つの第２の電極となるよう構成され、前記電圧供給部は、各々の前記貫通孔内に回転電場を発生させるために前記２つの第１の電極および前記２つの第２の電極からなる４つの電極のそれぞれに９０度ずつ位相をずらした交流電圧が印加されるように、前記第１の導体部及び前記第２の導体部の各々に交流電圧を供給するよう構成されている。
【0022】
この構成によれば、複数の貫通孔の各々に単一の細胞を保持した状態で交流電圧が第１の電極および第２の電極に印加されることにより、細胞は貫通孔内に保持された状態で回転を続けることができる。よって、複数の貫通孔に保持された各細胞の回転速度の経時変化を計測することが可能となり、複数の単一細胞の電気特性の経時変化を一括して計測することが可能になる。
【0023】
上記電気回転デバイスにおいて、平面視において、前記貫通孔が行列状に配置されるとともに、前記第１の導体部と前記第２の導体部とが直交するように配置されていてもよい。
【0024】
上記電気回転デバイスにおいて、平面視において、前記貫通孔が長方形状であってもよい。
【0025】
また、本発明のある態様に係る細胞評価システムは、上記に記載の電気回転デバイスと、前記電気回転デバイスの電極デバイス上に溶液を供給する送液ユニットと、前記電極デバイス上の細胞の運動を撮影する撮影装置と、前記電気回転デバイスの電圧供給部、前記送液ユニットおよび前記撮影装置を制御する制御装置と、を備え、前記制御装置は、前記電極デバイス上に細胞を含む溶液が供給され前記電極デバイスの複数の貫通孔に細胞が保持された状態で、各々の前記貫通孔内に回転電場を発生させるために前記電圧供給部に交流電圧の供給を開始させるとともに、前記撮影装置に撮影を開始させる第１の処理と、前記第１の処理の後に、前記撮影装置によって撮影された動画情報に基づいて各々の前記貫通孔内の細胞の回転速度情報を算出する第２の処理と、前記第２の処理の後に、前記送液ユニットに薬剤を含む溶液を前記電極デバイス上に供給させる第３の処理と、前記薬剤を含む溶液が前記電極デバイス上に供給された後に前記撮影装置によって撮影された動画情報に基づいて各々の前記貫通孔内の細胞の回転速度情報を算出する第４の処理と、各々の前記貫通孔内の細胞について、前記第２の処理で算出した回転速度情報と前記第４の処理で算出した回転速度情報とを比較する第５の処理と、を行うよう構成されている。
【0026】
この構成によれば、複数の貫通孔の各々に単一の細胞を保持した状態で交流電圧が第１の電極および第２の電極に印加されることにより、細胞は貫通孔内に保持された状態で回転を続けることができる。このため、電極デバイス上に供給される溶液を薬剤を含まない溶液から薬剤を含む溶液に入れ替えても、細胞は散失することなく貫通孔内に保持された状態で回転を続け、複数の各細胞について、第２の処理によって薬剤刺激前の細胞の回転速度情報を算出し、第４の処理によって薬剤刺激後の細胞の回転速度情報を算出し、これらを比較することで、複数の各細胞に対する薬剤の効果を評価することができる。よって、複数の単一細胞の電気特性の経時変化を一括して計測し、細胞に対する薬剤の効果を評価することが可能になる。
【0027】
上記細胞評価システムにおいて、前記制御装置によって制御され、前記貫通孔内の細胞を捕捉し、細胞保持プレート上に放出するための単一細胞捕捉装置をさらに備え、前記制御装置は、前記第５の処理による比較結果に基づいて回収する細胞を決定する第６の処理と、前記単一細胞捕捉装置に前記決定した回収する細胞を捕捉させ、前記細胞保持プレート上に放出させる第７の処理と、をさらに行うよう構成されていてもよい。
【0028】
この構成によれば、例えば、第５の処理による比較結果が回収条件を満足する細胞を、細胞保持プレート上に放出させて回収することができる。
【0029】
上記細胞評価システムにおいて、前記制御装置によって制御され、前記第５の処理による比較結果を表示する表示装置をさらに備えていてもよい。
【0030】
上記細胞評価システムにおいて、前記制御装置は、前記電圧供給部が供給する交流電圧の周波数を、理論計算に基づいて前記薬剤を含む溶液が前記電極デバイス上に供給される前の細胞の回転速度が最大となる周波数に決定するよう構成されていてもよい。
【0031】
この構成によれば、薬剤を含まない溶液中における細胞の回転速度が最大となる周波数に決定することにより、薬剤による刺激にともなう回転速度の変化を顕著に検出することが可能になる。この場合、Clausius-Mossotti因子（ＣＭ(ω)）を用いた理論計算に基づいて周波数を決定することができる。
【発明の効果】
【0032】
本発明は、以上に説明した構成を有し、複数の単一細胞の電気特性の経時変化を一括して計測することができる電気回転デバイス及びこれを備えた細胞評価システムを提供することができるという効果を奏する。
【0033】
本発明の上記目的、他の目的、特徴、及び利点は、添付図面参照の下、以下の好適な実施態様の詳細な説明から明らかにされる。
【図面の簡単な説明】
【0034】
【図20】図２０（Ａ）は、細胞膜容量が１１ｍＦ／ｍ２のときのClausius-Mossotti因子の実部と虚部の周波数依存性を示すグラフであり、図２０（Ｂ）は、細胞膜容量が２３．６ｍＦ／ｍ２のときのClausius-Mossotti因子の実部と虚部の周波数依存性を示すグラフである。
【図23】第１従来例の電気回転デバイスの要部の構成を説明するための図である。
【図24】第２従来例の電気回転デバイスの要部の構成を説明するための図である。
【図25】第３従来例の電気回転デバイスの要部の構成を説明するための図である。
【図26】第４従来例の電気回転デバイスの要部の構成を説明するための図である。
【発明を実施するための形態】
【0035】
以下、本発明の好ましい実施の形態を、図面を参照しながら説明する。なお、以下では全ての図面を通じて同一又は相当する要素には同一の参照符号を付して、その重複する説明を省略する。また、理解しやすくするためにそれぞれの構成要素を模式的に示した図面では、形状及び寸法比等については正確な表示ではない場合がある。また、本発明は、以下の実施形態に限定されない。
【0036】
【0037】
本実施形態の細胞評価システム３００は、電気回転デバイス３１０、送液ユニット３２０、撮影システム３３０、制御装置３４０、操作入力装置３４１（図２）、表示装置３４２、単一細胞捕捉装置３５０及び細胞保持プレート３６０を備えている。
【0038】
〔電気回転デバイス〕
電気回転デバイス３１０は、電極デバイス３１１、配線ユニット３１２及び任意波形発生装置３１３を備えている。
電気回転デバイス３１０は、電極デバイス３１１、配線ユニット３１２及び任意波形発生装置３１３を備えている。
【0039】
【0040】
電極デバイス３１１は、中央部に設けられたウエル型電気回転アレイ部２００と、ウエル型電気回転アレイ部２００に接続された配線群ＬＡ，ＬＢ，ＬＣ，ＬＤとを備えている。
【0041】
図４（Ａ）は、ウエル型電気回転アレイ部２００の要部の構成を示す概略平面図であり、図４（Ｂ）は、図４（Ａ）におけるａ－ａ’線断面図であり、図４（Ｃ）は、図４（Ａ）におけるｂ－ｂ’線断面図である。また、図５（Ａ）～（Ｃ）は、ウエル型電気回転アレイ部２００の製造工程を示す概略平面図である。
【0042】
ウエル型電気回転アレイ部２００の製造工程を説明する。まず、図５（Ａ）に示すように、絶縁性基板２０１上に複数の帯状の第１のマイクロバンド電極２０２（２０２Ａ，２０２Ｂ）を所定の間隔をあけて縞状に並べて形成する。
【0043】
次に、図５（Ｂ）に示すように、全面に第１の絶縁層２０３を形成した後、第１の絶縁層２０３を貫通する複数のウエル２０６を形成する。このとき、複数のウエル２０６は、平面視において、長方形状であり、行列状に配置される。また、各ウエル２０６において、第１のマイクロバンド電極２０２Ａ，２０２Ｂが同一面積露出するように各ウエル２０６を形成する。ウエル２０６は、第１の絶縁層２０３を貫通する貫通孔であり、この中に単一の細胞を捕捉（保持）することができる。
【0044】
次に、図５（Ｃ）に示すように、第１の絶縁層２０３上に、複数の帯状の第２のマイクロバンド電極２０４（２０４Ａ，２０４Ｂ）を所定の間隔をあけて縞状に並べて形成する。このとき、平面視において、第２のマイクロバンド電極２０４が第１のマイクロバンド電極２０２と直交するように形成する。また、各ウエル２０６を挟んで隣り合う部分の第２のマイクロバンド電極２０４の間隔が、ウエル２０６を挟んで隣り合う部分の第１のマイクロバンド電極２０２の間隔と等しくなるように、第２のマイクロバンド電極２０４を形成する。
【0045】
次に、図４（Ａ）～（Ｃ）に示すように、ウエル２０６の近傍の一部を除いて第２のマイクロバンド電極２０４を被覆するように第２の絶縁層２０５を形成する。
【0046】
なお、絶縁性基板２０１の材料は、通常の半導体プロセスで利用される絶縁性の材料であれば制限はなく、ガラス，石英，ＳｉＯ２，ＰＥＴフィルムなどの高分子材料などが利用できる。ウエル２０６に捕捉された細胞の視認性を高めるために絶縁性基板２０１の材料は透明であることが好ましく、加工の容易性やコストを考えると絶縁性基板２０１としてガラス基板を好適に用いることができる。
【0047】
また、第１，第２のマイクロバンド電極２０２，２０４は、導電性があり、細胞毒性がない材料に限定される。例えば、金，白金，ＩＴＯ（Ｉｎｄｉｕｍ－Ｔｉｎ－Ｏｘｉｄｅ），導電性高分子（ポリピロール，ＰＥＤＯＴ（Ｐｏｌｙ（３，４－ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉｏｘｙｔｈｉｏｐｈｅｎｅ）））などは積極的な細胞毒性は報告されておらず、使用することができる。特に、ウエル２０６に捕捉された細胞の電気回転運動の視認性向上のために透明の導電性材料を用いることが好ましく、第１，第２のマイクロバンド電極２０２，２０４としてＩＴＯ電極を好適に用いることができる。一方、銀、水銀、銅、コバルト、亜鉛などの金属は細胞毒性が報告されているため、第１，第２のマイクロバンド電極２０２，２０４に使用することができない。
【0048】
また、第１の絶縁層２０３の材料は、絶縁性基板２０１上に厚膜に塗布できフォトリソグラフィによって加工できる絶縁性材料が好ましく、ＳＵ－８が好適である。また、第２の絶縁層２０５の材料としてもＳＵ－８を好適に用いることができる。
【0049】
上記のように製造されたウエル型電気回転アレイ部２００は、絶縁性基板２０１と、絶縁性基板２０１上に設けられた第１の絶縁層２０３と、第１の絶縁層２０３を貫通するように設けられ、単一の細胞を保持するための複数のウエル２０６と、絶縁性基板２０１と第１の絶縁層２０３との間に縞状に設けられた複数の第１のマイクロバンド電極（第１の導電体）２０２と、第１の絶縁層２０３上に縞状に設けられ、平面視において第１のマイクロバンド電極２０２と交差するように配置された複数の第２のマイクロバンド電極（第２の導電体）２０４と、第２のマイクロバンド電極２０４を被覆する第２の絶縁層２０５と、を有する。
【0050】
そして、各々のウエル２０６は、平面視において、互いに隣り合う第１のマイクロバンド電極２０２の間に配置されるとともに互いに隣り合う第２のマイクロバンド電極２０４の間に配置されている。また、互いに隣り合う第１のマイクロバンド電極２０２（２０２Ａ，２０２Ｂ）は、各々の一部がウエル２０６に露出して対向する２つの電極（第１の電極）Ｄａ，Ｄｃとなるよう構成される。また、互いに隣り合う第２のマイクロバンド電極２０４（２０４Ａ，２０４Ｂ）は、平面視においてウエル２０６を介して対向する各々の一部が第２の絶縁層２０５から露出して対向する２つの電極（第２の電極）Ｄｂ，Ｄｄとなるよう構成される。平面視において細長い長方形状の４つの電極Ｄａ，Ｄｂ，Ｄｃ，Ｄｄが各ウエル２０６に対して設けられている。
【0051】
また、本例では、各ウエル２０６に対して設けられる第１のマイクロバンド電極２０２Ａ，２０２Ｂからなる電極Ｄａ，Ｄｃは、平面視において、長方形状のウエル２０６の中心に対して対称に設けられている。また、第２のマイクロバンド電極２０４Ａ，２０４Ｂからなる電極Ｄｂ，Ｄｄは、平面視において、長方形状のウエル２０６の中心に対して対称に設けられている。また、４つの電極Ｄａ～Ｄｄの形状および大きさが等しく、２つのＤａ，Ｄｃ間の間隔と、２つの電極Ｄｂ，Ｄｄ間の間隔とが等しいことが好ましい。
【0052】
また、単一細胞を保持するためのウエル２０６の縦横の寸法は、細胞の直径と同じ長さから細胞の直径の２倍の間の長さであることが好ましい。また、ウエル２０６の高さは、薬剤を含む溶液の流れによる細胞の散失を防ぐ上で重要なパラメータである。細胞に対してウエル２０６の高さが不十分の場合、溶液の流れによって細胞がウエル２０６から散失してしまい、逆にウエル２０６の高さが細胞に対して高すぎる場合、ウエル２０６内の溶液交換が難しくさらにウエル２０６から細胞を取り出すことも難しい。ウエル２０６の高さは、捕捉する細胞の直径の半分の高さから細胞の直径の２倍程度の高さであることが好ましい。
【0053】
ウエル型電気回転アレイ部２００の絶縁性基板２０１は、図３（Ａ）に示す電極デバイス３１１の全体の基板として用いられており、各々の第１のマイクロバンド電極２０２Ａは配線群ＬＣの各配線と接続され、各々の第１のマイクロバンド電極２０２Ｂは配線群ＬＤの各配線と接続されている。また、各々の第２のマイクロバンド電極２０４Ａは配線群ＬＡの各配線と接続され、各々の第２のマイクロバンド電極２０４Ｂは配線群ＬＢの各配線と接続されている。
【0054】
電極デバイス３１１の配線群ＬＡ，ＬＢ，ＬＣ，ＬＤは配線ユニット３１２に接続され、配線ユニット３１２を介して任意波形発生装置３１３から発生する電圧が電極デバイス３１１のマイクロバンド電極２０２，２０４に供給される。
【0055】
任意波形発生装置３１３は、電圧供給部であり、本例では制御装置３４０によって制御され、例えば交流電圧を電極デバイス３１１に供給する場合には、電極デバイス３１１に供給するタイミング、交流電圧の周波数および位相等が制御装置３４０によって制御される。
【0056】
任意波形発生装置３１３は、細胞の電気回転を誘導させるために、位相を９０°ずつ、ずらした４種類のサイン波の交流電圧を出力する機能を有する。４種類のサイン波の周波数と電圧の範囲は同じであり、それぞれ、周波数は１ｋＨｚ～１００ＭＨｚの範囲、電圧は０～２０Ｖｐｐの範囲が好ましく、より好ましくは、１０ｋＨｚ～１０ＭＨｚ、１～５Ｖｐｐの範囲である。４種類のサイン波は必ずしも１つの装置から出力される必要はなく、複数の任意波形発生装置を用いてもよい。任意波形発生装置３１３の出力の制御や波形の制御は、必ずしも制御装置３４０で行う必要はなく、任意波形発生装置３１３で行っても構わない。
【0057】
〔送液ユニット〕
送液ユニット３２０は、送液ポンプ３２１、送液スイッチャー３２２、送液用の容器３２３～３２５、廃液用容器３２６、送液チューブ３２７、廃液チューブ３２８及び電極デバイス３１１上に設置される溶液保持部５０３（図３（Ａ），（Ｂ））を備えている。
送液ユニット３２０は、送液ポンプ３２１、送液スイッチャー３２２、送液用の容器３２３～３２５、廃液用容器３２６、送液チューブ３２７、廃液チューブ３２８及び電極デバイス３１１上に設置される溶液保持部５０３（図３（Ａ），（Ｂ））を備えている。
【0058】
送液ポンプ３２１には、送液チューブ３２７と廃液チューブ３２８の２種類のチューブを接続することができ、各チューブ内に含まれる溶液を同じ方向へ同じ速度で送液することができる送液ポンプを使用する。送液ポンプ３２１は、制御装置３４０によって、流す溶液の流量や作動タイミングが制御される。
【0059】
送液スイッチャー３２２は、各容器３２３～３２５とチューブで接続されているとともに、送液チューブ３２７の一端が接続されている。送液スイッチャー３２２は、制御装置３４０の制御（指示）によって、送液チューブ３２７へ送出する溶液を３つの容器３２３～３２５に入った各溶液に切り替えることができる。
【0060】
送液チューブ３２７の他端は、電極デバイス３１１上に設置される溶液保持部５０３の流入口５０４（図３（Ａ），（Ｂ））に接続されている。
【0061】
溶液保持部５０３は、図３（Ａ），（Ｂ）に示すように、樹脂製の本体５０３Ａと、本体５０３Ａに取付部５０６によって装着された流入口５０４と、本体５０３Ａに取付部５０７によって装着された流出口５０５とを備えている。また、本体５０３Ａは、電極デバイス３１１上に溶液を保持するための大きな開口部５０３ａと、溶液を流出させるための流出口５０５が挿入される小さな開口部５０３ｂと、２つの開口部５０３ａ，５０３ｂをつなぐ溝部５０３ｃとを有している。
【0062】
溶液保持部５０３の流出口５０５には、廃液チューブ３２８の一端が接続され、廃液チューブ３２８の他端は廃液用容器３２６に接続されている。
【0063】
送液チューブ３２７と廃液チューブ３２８との各々の途中が送液ポンプ３２１に接続されており、送液ポンプ３２１が作動すると、送液スイッチャー３２２で選択されるいずれか１つの容器（３２３～３２５）から送液スイッチャー３２２及び送液チューブ３２７を通って溶液保持部５０３に導入される溶液の速度と、廃液チューブ３２８から吸引される溶液の速度とが等しくなり、溶液保持部５０３内は安定した潅流状態が維持される。廃液チューブ３２８から吸引される溶液は廃液用容器３２６へ廃棄される。
【0064】
本例では、容器３２３には、細胞懸濁液が入れられる。また、容器３２４には、浸透圧と導電率が調製された溶液で、細胞に対して損傷を与えない組成で構成された潅流液（第１の潅流液）が入れられる。また、容器３２５には、薬剤を含む潅流液（第２の潅流液）が入れられる。この薬剤を含む潅流液は、評価したい薬剤が懸濁された溶液であり、導電率と浸透圧は前述の第１の潅流液と同等になるように調製されている。
【0065】
〔撮影システム〕
撮影システム３３０は、ウエル型電気回転アレイ部２００上で回転する細胞の運動を撮影し記録することができればよく、ここでは、照明装置３３１、撮影装置３３２、および対物レンズ３３３から構成される。撮影装置３３２は、対物レンズ３３３で結像された像を撮影し記録することができる。撮影方式に制限はなく、例えばＣＣＤカメラ、ＣＭＯＳカメラなどが使用できる。
撮影システム３３０は、ウエル型電気回転アレイ部２００上で回転する細胞の運動を撮影し記録することができればよく、ここでは、照明装置３３１、撮影装置３３２、および対物レンズ３３３から構成される。撮影装置３３２は、対物レンズ３３３で結像された像を撮影し記録することができる。撮影方式に制限はなく、例えばＣＣＤカメラ、ＣＭＯＳカメラなどが使用できる。
【0066】
〔単一細胞捕捉装置等〕
単一細胞捕捉装置３５０は、ウエル型電気回転アレイ部２００の任意のウエル２０６内の単一細胞を捕捉して、細胞保持プレート３６０の任意の細胞保持部３６１へ吐出することができればよく、その機構に制限はない。細胞保持プレート３６０には、細胞を保持するために複数の細胞保持部３６１が設けられ、各細胞保持部３６１に単一の細胞が保持される。
単一細胞捕捉装置３５０は、ウエル型電気回転アレイ部２００の任意のウエル２０６内の単一細胞を捕捉して、細胞保持プレート３６０の任意の細胞保持部３６１へ吐出することができればよく、その機構に制限はない。細胞保持プレート３６０には、細胞を保持するために複数の細胞保持部３６１が設けられ、各細胞保持部３６１に単一の細胞が保持される。
【0067】
本例では、単一細胞捕捉装置３５０は、単一細胞捕捉部３５０ａと、単一細胞捕捉部３５０ａを三次元的に移動させることができる移動機構（図示せず）とを備えている。
【0068】
単一細胞捕捉部３５０ａは、例えば、ガラスキャピラリを用いて構成することができる。この場合、例えば、ポンプを用いてガラスキャピラリ内の圧力が陰圧となるように制御し、細胞の吸引（捕捉）を行い、ガラスキャピラリ内の圧力が陽圧となるように制御し、捕捉した細胞の吐出を行うように構成してもよい。
【0069】
また、単一細胞捕捉部３５０ａは、ガラスキャピラリ内に２本の電極を挿入し、この２本の電極間へ交流電圧を印加する構成としてもよい。この場合、２本の電極間への交流電圧の印加によってガラスキャピラリ先端に電場強度の強い領域が形成される。細胞を捕捉する際は、印加する周波数を細胞に対して正の誘電泳動が作用する周波数にする。そして、ガラスキャピラリ先端がウエル２０６内の細胞に近接すると、細胞に正の誘電泳動が作用し、細胞がガラスキャピラリ先端に誘導され細胞を捕捉することができる。一方、細胞を吐出する際は、負の誘電泳動を用いる。つまり、印加する周波数を細胞に対して負の誘電泳動が作用する周波数に切り替えることにより、ガラスキャピラリ先端に捕捉された細胞に負の誘電泳動が作用し、細胞がキャピラリ先端から開放（吐出）される。
【0070】
なお、本例では、移動機構によって単一細胞捕捉部３５０ａを三次元的に移動させるように構成したが、単一細胞捕捉部３５０ａを固定しておいて、電極デバイス３１１および細胞保持プレート３６０等を移動ステージ上に設置し、移動ステージが三次元的に移動するように構成されていてもよい。
【0071】
〔制御装置等〕
制御装置３４０は、ＣＰＵ等の演算処理部と、ＲＯＭ、ＲＡＭ等の記憶部とを有している。記憶部には、制御プログラムが予め記憶されており、演算処理部が制御プログラムを実行することにより、任意波形発生装置３１３、送液ポンプ３２１、送液スイッチャー３２２、照明装置３３１、撮影装置３３２および単一細胞捕捉装置３５０を制御する。本例では、記憶部には、制御装置３４０が動作する上で必要な情報の他、制御装置３４０が記憶する全ての情報（例えば撮影装置３３２で撮影される画像等）が記憶されるものとする。なお、制御装置３４０は、集中制御する単独の制御装置によって構成されていてもよいし、互いに協働して分散制御する複数の制御装置によって構成されていてもよい。
制御装置３４０は、ＣＰＵ等の演算処理部と、ＲＯＭ、ＲＡＭ等の記憶部とを有している。記憶部には、制御プログラムが予め記憶されており、演算処理部が制御プログラムを実行することにより、任意波形発生装置３１３、送液ポンプ３２１、送液スイッチャー３２２、照明装置３３１、撮影装置３３２および単一細胞捕捉装置３５０を制御する。本例では、記憶部には、制御装置３４０が動作する上で必要な情報の他、制御装置３４０が記憶する全ての情報（例えば撮影装置３３２で撮影される画像等）が記憶されるものとする。なお、制御装置３４０は、集中制御する単独の制御装置によって構成されていてもよいし、互いに協働して分散制御する複数の制御装置によって構成されていてもよい。
【0072】
また、制御装置３４０は、ユーザの操作による操作入力装置３４１からの入力信号を入力するとともに、表示装置３４２へ表示させる情報等を出力する。操作入力装置３４１は、例えば、キーボード、マウス等で構成される。表示装置３４２は、例えば、液晶ディスプレイ等で構成される。
【0073】
制御装置３４０は、例えば、送液ポンプ３２１の流量等の制御、送液スイッチャー３２２の切り替え制御、撮影装置３３２の撮影時間の制御、任意波形発生装置３１３から出力する電圧の制御等を行う。
【0074】
また、制御装置３４０は、細胞懸濁液の導電率、細胞の細胞膜容量及び細胞質導電率等に基づく任意波形発生装置３１３から印加する交流電圧の周波数の算出、撮影装置３３２から得られた画像から細胞の回転速度の算出や複数の回転速度の比較演算、といった演算処理も行う。
【0075】
また、制御装置３４０は、細胞特性データベースを記憶している。この細胞特性データベースには、複数の細胞種について、前述の（２）式で示されるClausius-Mossotti因子（ＣＭ(ω)）を算出するために必要な細胞情報が登録されている。すなわち、複数の各々の細胞種について、細胞情報（細胞質導電率、細胞質誘電率、細胞膜容量、細胞の半径）が登録されている。例えば、制御装置３４０は、細胞種の情報（名称）と、細胞外液（細胞懸濁液）の導電率と、細胞外液の誘電率と、細胞に電気回転を行わせるための交流電圧の印加周波数とが与えられると、与えられた細胞種についての上記細胞情報と、細胞外液（細胞懸濁液）の導電率と、細胞外液の誘電率と、印加周波数とを用いて、（２）式で示されるClausius-Mossotti因子（ＣＭ(ω)）を算出することができ、Clausius-Mossotti因子の虚部（Ｉｍ［ＣＭ］）および実部（Ｒｅ［ＣＭ］）を求めることができる。なお、細胞外液（細胞懸濁液）の誘電率は、ほぼ一定であり、本実施形態では、細胞外液（細胞懸濁液）の誘電率として、予め定められた所定値が制御装置３４０に記憶されている。
【0076】
次に、本実施形態の細胞評価システム３００を用いて、細胞に対する薬剤の影響を評価する方法等の一例を図６～図１０を参照して説明する。図６～図１０は、細胞評価システム３００による細胞に対する薬剤の影響の評価方法の手順の一例を示すフローチャートである。この図６～図１０に示す手順の処理は、制御装置３４０の制御によって実行される。なお、送液ユニット３２０の容器３２３～３２５に入れる溶液の種類及び送液ポンプ３２１の流量は、予めユーザが操作入力装置３４１を操作して制御装置３４０に入力され記憶されている。
【0077】
まず、図６のステップＳ１では、ユーザによって操作入力装置３４１に所定の操作が行われると、制御装置３４０は、表示装置３４２に薬剤評価モード画面を表示させる。この画面には、細胞懸濁液の細胞種、細胞懸濁液の導電率および細胞懸濁液の細胞濃度を入力する入力ボックスが表示される。
【0078】
ユーザが操作入力装置３４１を操作して、使用する細胞懸濁液の細胞種、細胞懸濁液の導電率σｓ、細胞懸濁液の細胞濃度Ｃｃｅｌｌを入力ボックスに入力すると、これらが制御装置３４０に入力される（ステップＳ２）。
【0079】
制御装置３４０は、入力された細胞懸濁液の導電率σｓ、及び細胞懸濁液の細胞濃度Ｃｃｅｌｌの情報が適正であるか否かを判定し（ステップＳ３、Ｓ４）、適正ではないと判定したときには、細胞懸濁液の再調製の指示を表示装置３４２に表示させる（ステップＳ５）。
【0080】
ここで、制御装置３４０には、予め細胞腫ごとに決められた細胞懸濁液の導電率の適正範囲（Ｎ１）が記憶されている。ステップＳ３では、ステップＳ２で入力された細胞懸濁液の導電率σｓが適正範囲（Ｎ１）内であれば適正であると判定しステップＳ４へ進み、適正範囲（Ｎ１）外であれば適正ではないと判定し、その旨と細胞懸濁液の再調製の指示を表示装置３４２に表示させる（ステップＳ５）。
【0081】
ここで、適正範囲（Ｎ１）は細胞の電気回転現象を誘導させるために適正な導電率の範囲として設定されており、細胞懸濁液の導電率σｓが適正範囲（Ｎ１）より大きいもしくは小さい場合、電気回転現象を誘導させることができないため、ユーザに対して細胞懸濁液の再調製の指示が表示される。導電率の適正範囲（Ｎ１）は、細胞の種類や電極の寸法に応じて変化するが、例えば、１～１０００ｍＳ／ｍの範囲、または、５～５００ｍＳ／ｍの範囲等に設定することが好ましい。
【0082】
図１１（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）は、ある細胞を懸濁した細胞懸濁液の導電率σｓが５ｍＳ／ｍ、５０ｍＳ／ｍ、５００ｍＳ／ｍにおける、－Ｉｍ［ＣＭ］の周波数依存性を前述の（２）式を用いて計算した結果を示すグラフである。横軸が印加周波数、縦軸が－Ｉｍ［ＣＭ］を示す。－Ｉｍ［ＣＭ］は、Clausius-Mossotti因子の虚部のマイナス値であり、電気回転速度の大きさと向きを示す値であり、－Ｉｍ［ＣＭ］が負の値の場合は、細胞は電場の回転方向とは逆向きに回転することを表す。また、－Ｉｍ［ＣＭ］の絶対値の大きさが回転速度の大きさを表す。なお、細胞懸濁液の導電率σｓは、前述の（２）式におけるτ1，τm'に関わる細胞外液の導電率σ1 に相当する。
【0083】
図１１（Ａ）に示すように、細胞懸濁液の導電率σｓが５ｍＳ／ｍのとき、細胞の電気回転速度は印加周波数２０ｋＨｚで最大を示し、２０ｋＨｚより大きな周波数を印加すると回転速度は減少することがわかる。細胞懸濁液の導電率σｓをさらに小さくすると、電気回転速度が最大となる周波数（最大回転周波数）は低周波数側に移動する。１０ｋＨｚ以下の周波数の交流電圧を印加した場合、デバイス上の電極と溶液（水溶液）の間で水の電気分解反応が生じ電極が腐食する可能性がある。そのため、細胞懸濁液の導電率σｓは５ｍＳ／ｍ以上が好ましい。
【0084】
図１１（Ｂ）、（Ｃ）に示すように、細胞懸濁液の導電率σｓを５０ｍＳ／ｍ、５００ｍＳ／ｍと大きくすると、最大回転周波数は、２００ｋＨｚ、１０５０ｋＨｚと高周波数側へ移動する。また、最大回転周波数における－Ｉｍ［ＣＭ］の絶対値は、細胞懸濁液の導電率σｓの増加に伴い減少し、回転速度が減少する。特に５００ｍＳ／ｍより大きな導電率では細胞はほとんど回転しない。よって、この場合、細胞懸濁液の導電率σｓの適正範囲（Ｎ１）を、５ｍＳ／ｍから５００ｍＳ／ｍの範囲とし、この範囲内で調製されることが好ましい。
【0085】
制御装置３４０は、細胞懸濁液の細胞濃度の閾値濃度Ｃ１を予め記憶している。そして、ステップＳ３で細胞懸濁液の導電率σｓは適正であると判定した場合、ステップＳ４では、ステップＳ２で入力された細胞懸濁液の細胞濃度Ｃｃｅｌｌが閾値濃度Ｃ１以下であれば適正であると判定し、閾値濃度Ｃ１よりも大きければ適正ではないと判定し、その旨と細胞懸濁液の再調製の指示を表示装置３４２に表示させる（ステップＳ５）。
【0086】
細胞濃度Ｃｃｅｌｌが閾値濃度Ｃ１よりも大きい場合、電気回転アレイ部２００のウエル２０６の個数に対して細胞数が大きくなり、ウエル２０６内に単一細胞の状態で捕捉される割合が減少する。その結果、電気回転計測を行うことができなくなる。閾値濃度Ｃ１は、電気回転アレイ部２００のウエル２０６の個数や電極デバイス３１１上に設置する溶液保持部５０３の溶液保持容積に応じて決められている。
【0087】
制御装置３４０は、細胞懸濁液の導電率σｓおよび細胞濃度Ｃｃｅｌｌが適正であれば、細胞懸濁液の導入処理を行う（ステップＳ６）。なお、ここでは、ユーザは、ステップＳ２で、使用する細胞懸濁液の細胞種、細胞懸濁液の導電率σｓ、細胞懸濁液の細胞濃度Ｃｃｅｌｌを入力する際に、容器３２３に使用する細胞懸濁液を入れている。また、ユーザは、予め、容器３２４には薬剤を含まない第１の潅流液を入れ、容器３２５には薬剤を含む第２の潅流液を入れている。
【0088】
このステップＳ６の詳細を図７に示す。制御装置３４０は、送液ユニット３２０に対して細胞懸濁液の送液を指示する（ステップＳ６１）とともに、電極デバイス３１１（ウエル型電気回転アレイ部２００）への細胞懸濁液の導入を確認するための電圧の印加を任意波形発生装置３１３に指示する（ステップＳ６２）。ステップＳ６１の指示によって、送液スイッチャー３２２は、送液チューブ３２７へ送出する溶液が容器３２３内の細胞懸濁液となるように設定され、送液ポンプ３２１が所定時間作動されることにより、所定量の細胞懸濁液が電極デバイス３１１上の溶液保持部５０３へ導入される。
【0089】
また、ステップＳ６２の指示によって、任意波形発生装置３１３は、ウエル型電気回転アレイ部２００の予め決められた２つ以上のマイクロバンド電極間に電圧を印加し、この電圧を印加したマイクロバンド電極間の抵抗値Ｒを制御装置３４０が取得する（ステップＳ６３）。ここで、電圧が印加されるマイクロバンド電極は、任意の１つの第１のマイクロバンド電極２０２と任意の１つの第２のマイクロバンド電極２０４でも構わないし、任意の２つの第１のマイクロバンド電極２０２、もしくは、任意の２つの第２のマクロバンド電極２０４でも構わない。また、マイクロバンド電極間の抵抗値を算出することができればよく、印加する電圧の種類は制限されず、直流電圧および交流電圧のどちらでも構わない。直流電圧の場合、電極表面上で水の電気分解反応が起こる電圧よりも低い電圧を用いる必要がある。
【0090】
例えば、任意波形発生装置３１３は、所定の２つのマイクロバンド電極間に電圧を印加したときに、その２つのマイクロバンド電極間に流れる電流値を検出できるように構成されている。この電流値と印加電圧とから抵抗値Ｒを算出するが、この算出を任意波形発生装置３１３で行い、算出した抵抗値Ｒを制御装置３４０へ送信するようにしてもよいし、制御装置３４０が任意波形発生装置３１３から電流値と印加電圧を取得して抵抗値Ｒを算出するようにしてもよい。算出された抵抗値Ｒは制御装置３４０に保存（記憶）される。
【0091】
制御装置３４０は、取得した抵抗値Ｒが予め記憶している閾値抵抗Ｒｔ以下であるか否かを判定し（ステップＳ６４）、抵抗値Ｒが閾値抵抗Ｒｔよりも大きい場合には（ステップＳ６４でＮｏ）、細胞懸濁液がウエル型電気回転アレイ部２００に到達していないと判断し、再度、送液ユニット３２０に対して細胞懸濁液の送液を指示する（ステップＳ６５）。閾値抵抗Ｒｔはウエル型電気回転アレイ部２００の電極の寸法やウエル２０６の個数等に基づいて予め決められ、制御装置３４０に記憶されている。
【0092】
一方、制御装置３４０は、抵抗値Ｒが閾値抵抗Ｒｔ以下である場合には（ステップＳ６４でＹｅｓ）、細胞懸濁液がウエル型電気回転アレイ部２００（電極デバイス３１１）に導入されたと判断し、任意波形発生装置３１３に電圧の印加の終了を指示する（ステップＳ６６）。この指示により、任意波形発生装置３１３は、ステップＳ６２の指示による電圧の印加を終了する。
【0093】
上記のように、制御装置３４０は、ウエル型電気回転アレイ部２００への細胞懸濁液の導入処理（ステップＳ６）を行った後、ウエル２０６での細胞捕捉処理を行う（ステップＳ７）。
【0094】
このステップＳ７の詳細を図８に示す。制御装置３４０は、ウエル２０６へ細胞を捕捉させるための交流電圧の印加を任意波形発生装置３１３に指示する（ステップＳ７１）。このステップＳ７１の指示によって、任意波形発生装置３１３は、全てのウエル２０６の底面に電極Ｄａ，Ｄｃとして一部が露出された第１のマイクロバンド電極２０２Ａ，２０２Ｂ間に細胞捕捉用の周波数Ｆ１の交流電圧を印加する。この交流電圧の印加により、ウエル２０６の底面に電場強度の強い領域が形成され、細胞に正の誘電泳動が作用するように周波数Ｆ１が決められており、細胞はウエル２０６の底面に引き付けられる。
【0095】
正の誘電泳動を作用させるために印加する交流電圧の周波数Ｆ１は、細胞懸濁液の導電率σｓに依存する。
【0096】
図１２（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）は、ある細胞を懸濁した細胞懸濁液の導電率σｓが５ｍＳ／ｍ、５０ｍＳ／ｍ、５００ｍＳ／ｍにおけるＲｅ［ＣＭ］の周波数依存性を前述の（２）式を用いて計算した結果を示すグラフである。横軸が印加周波数、縦軸がＲｅ［ＣＭ］を示す。Ｒｅ［ＣＭ］は、Clausius-Mossotti因子の実部であり、誘電泳動力の大きさと向きを示す値である。Ｒｅ［ＣＭ］の値が正の場合、正の誘電泳動が細胞に作用し、電極近傍に細胞が引き寄せられる。一方、Ｒｅ［ＣＭ］の値が負の場合、負の誘電泳動が細胞に作用し、電極近傍からの反発力が細胞に作用する。
【0097】
図１２（Ａ）に示すように、細胞懸濁液の導電率σｓが５ｍＳ／ｍの場合、約２０ｋＨｚを境にしてＲｅ［ＣＭ］の正と負が切り替わる。約２０ｋＨｚより大きな周波数では、Ｒｅ［ＣＭ］が正となり、正の誘電泳動が細胞に作用する。約２０ｋＨｚより小さな周波数では、負の誘電泳動が細胞に作用する。
【0098】
また、図１２（Ｂ）、（Ｃ）に示すように、細胞懸濁液の導電率が５０ｍＳ／ｍ、５００ｍＳ／ｍと大きくなるにつれて、Ｒｅ［ＣＭ］の正と負が切り替わる周波数が、約２００ｋＨｚ、約２ＭＨｚと高周波数側に移動する。
【0099】
細胞に正の誘電泳動を作用させる交流電圧の周波数Ｆ１は、細胞特性データベースからステップＳ２で入力された細胞種の細胞情報（細胞質導電率、細胞質誘電率、細胞膜容量、細胞の半径）を参照し、さらにステップＳ２で入力された細胞懸濁液（細胞外液）の導電率も参照して（細胞懸濁液の誘電率は所定値）、前述の（２）式を用いて計算されるClausius-Mossotti因子（ＣＭ(ω)）の実部（Ｒｅ［ＣＭ］）の値が正になる周波数として定めるようにしてもよい。または、どのような細胞懸濁液の導電率σｓにおいても正の誘電泳動が作用する５ＭＨｚ以上の予め定められた周波数を印加周波数Ｆ１として用いてもよい。印加電圧はウエル型電気回転アレイ部２００の各マイクロバンド電極２０２やウエル２０６の寸法に応じて変更される。
【0100】
制御装置３４０は、ステップＳ７１の次に、ウエル２０６への細胞の捕捉を確認するために、撮影装置３３２に動画の撮影の開始を指示する（ステップＳ７２）。この指示に従い、撮影装置３３２は動画の撮影を開始する。撮影された動画は順次、撮影装置３３２から制御装置３４０に送信されて保存される。
【0101】
制御装置３４０は、保存される動画ファイルを利用して所定個数以上のウエル２０６に細胞が捕捉（保持）されたか否かの判定を行う（ステップＳ７３）。この際、制御装置３４０は、動画ファイルからウエル２０６の領域内の光強度の変化などに基づいて、細胞が捕捉されたウエル２０６を識別して、この細胞が捕捉されたウエル２０６の個数を算出し、この個数が所定個数以上になると（ステップＳ７３でＹｅｓ）、細胞捕捉用の交流電圧の印加の終了を任意波形発生装置３１３に指示する（ステップＳ７４）。同時に撮影装置３３２に動画の撮影停止を指示する（ステップＳ７５）。これらの指示に従って、任意波形発生装置３１３は細胞捕捉用の交流電圧の印加を終了し、撮影装置３３２は動画の撮影を停止する。なお、ステップＳ７３の「所定個数」は、ユーザが任意に設定するようにしてもよいし、予め制御装置３４０に記憶されていても構わない。
【0102】
上記の例では、細胞捕捉用の交流電圧を印加するようにしたが、細胞懸濁液を導入後、電極デバイス３１１の静置により、細胞自身の自重によって細胞をウエル２０６へ捕捉させるようにしてもよい。この場合、ステップＳ７１及びステップＳ７４を省略できる。しかしながら、細胞の自重によるウエル２０６への捕捉は長時間を要する。そのため、上記の例のように細胞捕捉用の交流電圧を印加することにより、細胞を迅速にウエル２０６へ捕捉させることができる。
【0103】
上記のように、制御装置３４０は、ウエル２０６での細胞捕捉処理（ステップＳ７）を行った後、細胞への薬剤の影響の導出処理を行う（ステップＳ８）。
【0104】
このステップＳ８の詳細を図９に示す。制御装置３４０は、まず、細胞の電気回転用の交流電圧の印加周波数Ｆ２を決定する（ステップＳ８１）。この周波数Ｆ２は、細胞を電気回転することができれば予め定められた所定の周波数でもよい。より好ましくは、薬剤による刺激にともなう回転速度の変化を顕著に検出するために、薬剤で刺激する前の細胞の回転速度が最大となる周波数を用いる。本例では、周波数Ｆ２として、薬剤で刺激する前の細胞の回転速度が最大となる周波数を用いる。この周波数Ｆ２の決定方法の手順（本例でのステップＳ８１の詳細）を図１０に示す。
【0105】
制御装置３４０は、ステップＳ２で入力された細胞種の名称（細胞種の情報）を参照して、予め記憶している細胞特性データベースとの照合を行う（ステップＳ１０１）。
【0106】
そして、上記入力された細胞種が細胞特性データベースに含まれる場合（ステップＳ１０２でＹｅｓ）には、制御装置３４０は、細胞特性データベースから上記入力された細胞種の細胞情報（細胞質導電率、細胞質誘電率、細胞膜容量、細胞の半径）を参照し（ステップＳ１０３）、さらにステップＳ２で入力された細胞懸濁液（細胞外液）の導電率も参照して（細胞懸濁液の誘電率は所定値）、前述の（２）式を用いて計算されるClausius-Mossotti因子（ＣＭ(ω)）の虚部のマイナスの値（－Ｉｍ［ＣＭ］）の絶対値が最大となる周波数（すなわち、細胞の回転速度が最大となる周波数）を算出し、これを印加周波数Ｆ２に決定する（ステップＳ１０４）。
【0107】
一方、ステップＳ２で入力された細胞種が細胞特性データベースに含まれていない場合（ステップＳ１０２でＮｏ）には、制御装置３４０は、例えば、表示装置３４２に、ユーザに他の細胞種の細胞情報の使用の有無を問い合わせる問合せ画面を表示させる。そして、ユーザが、操作入力装置３４１を操作して、他の細胞種の細胞情報の使用の指示を行うと、その旨の信号が入力される（ステップＳ１０５でＹｅｓ）。すると、制御装置３４０は、表示装置３４２に、細胞特性データベースに登録された全ての細胞種の一覧表を表示させる（ステップＳ１０６）。そして、ユーザが、操作入力装置３４１を操作して、細胞種の一覧表の中から１つの細胞種を選択すると、制御装置３４０は、細胞特性データベースから上記選択された細胞種の細胞情報（細胞質導電率、細胞質誘電率、細胞膜容量、細胞の半径）を参照し（ステップＳ１０７）、さらにステップＳ２で入力された細胞懸濁液（細胞外液）の導電率も参照して、印加周波数Ｆ２を決定する（ステップＳ１０４）。
【0108】
また、制御装置３４０は、表示装置３４２に上記の問合せ画面を表示させたときに、ユーザが、操作入力装置３４１を操作して、他の細胞種の細胞情報の不使用の指示を行うと、その旨の信号が入力される（ステップＳ１０５でＮｏ）。すると、制御装置３４０は、表示装置３４２に細胞情報の入力画面を表示させる。そして、ユーザの操作入力装置３４１の操作によって、細胞情報（細胞質導電率、細胞質誘電率、細胞膜容量、細胞の半径）が入力され（ステップＳ１０８）、さらにステップＳ２で入力された細胞懸濁液（細胞外液）の導電率も参照して、印加周波数Ｆ２を決定する（ステップＳ１０４）。
【0109】
上記のようにして図９のステップＳ８１における、細胞の電気回転に用いる好ましい周波数Ｆ２を決定することができる。
【0110】
次に、制御装置３４０は、任意波形発生装置３１３にステップＳ８１で決定した周波数Ｆ２で電気回転用の交流電圧の印加を指示し（ステップＳ８２）、撮影装置３３２に動画の撮影開始を指示し（ステップＳ８３）、送液ユニット３２０に薬剤を含まない潅流液（第１の潅流液）の送液の開始を指示する（ステップＳ８４）。ステップＳ８２の指示によって任意波形発生装置３１３は電気回転用の交流電圧を電極デバイス３１１へ印加し、ステップＳ８３の指示によって撮影装置３３２は動画の撮影を開始する。また、ステップＳ８４の指示によって、送液スイッチャー３２２は、送液チューブ３２７へ送出する溶液が容器３２４内の第１の潅流液となるように設定され、送液ポンプ３２１は作動を開始する。
【0111】
上記のステップＳ８２の指示による任意波形発生装置３１３の電極デバイス３１１への交流電圧の印加方法について説明する。
【0112】
各ウエル２０６に捕捉された細胞に対して電気回転を誘導させるために、各ウエル２０６に対して取り囲むように配線された４本のマイクロバンド電極２０２Ａ，２０２Ｂ，２０４Ａ，２０４Ｂに対して、周波数Ｆ２のサイン波の交流電圧を、位相を９０°ずつずらして印加する。これにより、各ウエル２０６内に回転電場が形成される。
【0113】
図１３は、各ウエル２０６内に形成される回転電場の方向を示す概略平面図である。各ウエル２０６は、４つの電極Ｄａ，Ｄｂ，Ｄｃ，Ｄｄで囲われている。任意波形発生装置３１３は、それぞれの電極Ｄａ，Ｄｂ，Ｄｃ，Ｄｄに、この順番に、ａｓｉｎ（ωｔ），ａｓｉｎ（ωｔ＋π／２），ａｓｉｎ（ωｔ＋π），ａｓｉｎ（ωｔ＋３π／２）のサイン波交流電圧（ａは振幅）が印加されるように、マイクロバンド電極２０２，２０４にサイン波交流電圧を供給する。
【0114】
すると、ウエル２０６内に、図１３中の矢印の方向に変位する回転電場が形成される。ウエル２０６内の細胞の電気回転の回転方向は、－Ｉｍ［ＣＭ］の値で決まり、－Ｉｍ［ＣＭ］が負の値の場合には、回転電場と逆方向に回転する。本例では、隣接するウエル２０６の間では、ウエル２０６内に形成される回転電場の向きが逆方向になるため、隣接するウエル２０６内の各細胞の回転方向は逆方向になる。
【0115】
ステップＳ８１，Ｓ８２，Ｓ８３の手順の実行によって、第１の潅流液が送液された状態でウエル２０６内に捕捉された細胞の電気回転の動画の撮影が行われる。撮影された動画データは撮影装置３３２から制御装置３４０へ送信されて、制御装置３４０に保存される。
【0116】
制御装置３４０は、保存された動画データから各ウエル２０６内の細胞の回転速度を算出し、この回転速度を薬剤刺激前の回転速度Ｖ０として記憶する（ステップＳ８５）。ここで、各ウエル２０６には予め識別番号が付されており、制御装置３４０は、ウエル２０６の識別番号ととともに、同ウエル２０６内の細胞の回転速度Ｖ０を記憶する。
【0117】
ここで、細胞の回転速度の算出方法の一例を、図１４を用いて説明するが、必ずしもこの方法に限定される必要はない。
【0118】
図１４（Ａ）に示すように、細胞の中心を原点としたｘ，ｙ座標系を設定し、画像における細胞の周辺部分における１つの特徴点を検出し、その座標をｄｘ，ｄｙとする。画像における特徴点の検出は、公知の検出技術を用いた画像処理によって行うことができる。
【0119】
そして、所定時間（Δｔ）内のｘ座標ｄｘの経時変化を記録すると、図１４（Ｂ）に示すように、サイン関数で近似が可能な周期性を有した変位を示すグラフが得られる。この得られたグラフと、ｄｘ＝Ａｓｉｎ（Ｂｔ＋Ｃ）の関数（Ａは細胞の半径）とを最小二乗法を用いてフィッティングを行い、定数Ｂ，Ｃを決定する。定数Ｂが角速度に相当する。よって、薬剤刺激前の回転速度Ｖ０は、Ｂ／２πとして算出される。
【0120】
次に、制御装置３４０は、ウエル２０６内の細胞を薬剤で刺激するために、送液ユニット３２０に薬剤を含む第２の潅流液への送液の切り替えを指示する（ステップＳ８６）。この指示によって、送液スイッチャー３２２は、送液チューブ３２７へ送出する溶液を、容器３２４内の第１の潅流液から容器３２５内の薬剤を含む第２の潅流液に切り替える。潅流液が交換されている間も、任意波形発生装置３１３からの交流電圧の印加と撮影装置３３２による画像の撮影は継続される。そして、第２の潅流液が送液された状態で撮影された動画データは撮影装置３３２から制御装置３４０へ送信されて、制御装置３４０に保存される。
【0121】
次に、制御装置３４０は、第２の潅流液が送液された状態で撮影された動画データから各ウエル２０６内の細胞の回転速度を算出し、この回転速度を薬剤刺激後の回転速度Ｖ１として記憶する（ステップＳ８７）。ここでも、制御装置３４０は、ウエル２０６の識別番号ととともに、同ウエル２０６内の細胞の回転速度Ｖ１を記憶する。薬剤刺激後の回転速度Ｖ１の算出方法は、薬剤刺激前の回転速度Ｖ０の算出方法と同様であり、角速度を算出して求めることができる。
【0122】
【0123】
制御装置３４０は、第１の潅流液の送出を開始してから所定時間後の時刻ｔ０を中央とする所定時間Δｔ内、すなわち、ｔ０－（Δｔ／２）からｔ０＋（Δｔ／２）までの間の細胞の特徴点のｘ座標ｄｘの経時変化のグラフを用いて、薬剤刺激前の回転速度Ｖ０を算出する。
【0124】
また、制御装置３４０は、第２の潅流液を潅流する際の流量、送液チューブ３２７の長さから電極デバイス３１１上のウエル２０６に捕捉された細胞に薬剤を含む第２の潅流液が到達する時刻ｔｓ１を算出し、この時刻ｔｓ１からｘ秒後（ｘは所定値）の時刻（ｔｓ１＋ｘ）を中央とする所定時間Δｔ内、すなわち、（ｔｓ１＋ｘ）－（Δｔ／２）から（ｔｓ１＋ｘ）＋（Δｔ／２）までの間の細胞の特徴点のｘ座標ｄｘの経時変化のグラフを用いて薬剤刺激後の回転速度Ｖ１を算出する。
【0125】
次に、制御装置３４０は、送液ユニット３２０に送液の終了を指示し、撮影装置３３２に動画の撮影停止を指示し、任意波形発生装置３１３に交流電圧の印加の終了を指示する（ステップＳ８８）。これらの指示に従って、送液ユニット３２０の送液ポンプ３２１は作動を停止し、撮影装置３３２は動画の撮影を終了し、任意波形発生装置３１３は電気回転用の交流電圧の印加を終了する。
【0126】
次に、制御装置３４０は、計測結果として、各々のウエル２０６内の細胞について、ステップＳ８５で記憶された回転速度Ｖ０とステップＳ８７で記憶された回転速度Ｖ１との比較結果を算出し、各細胞の回転速度Ｖ０，Ｖ１の比較結果を各細胞が存在するウエル２０６の識別番号とともに表示装置３４２に表示させる（ステップＳ８９）。ここで、回転速度Ｖ０とＶ１の比較結果の算出方法は、Ｖ０とＶ１の差、Ｖ０とＶ１の比、もしくはＶ１／（Ｖ１－Ｖ０）など、Ｖ０とＶ１の違いを表現できる方法であればよく、特に限定されない。
【0127】
なお、評価する薬剤が複数ある場合には、予め、各薬剤を含む溶液（第２の潅流液）の入った複数の容器３２５を送液スイッチャー３２２に接続できる構成とし、ステップＳ８４～Ｓ８７の手順を繰り返すようにしてもよい。そして、この手順が繰り返されるときの各ステップＳ８６において、異なる薬剤を含む第２の潅流液の容器３２５が選択されるように送液スイッチャー３２２を切り替えるようにすればよい。
【0128】
上記のように、制御装置３４０は、細胞への薬剤の影響の導出処理（ステップＳ８）を行った後、細胞回収処理を行う（ステップＳ９）。
【0129】
この細胞回収処理では、例えば、前述のステップＳ８９で表示装置３４２に表示された回転速度の比較結果の表示画面において、ユーザが操作入力装置３４１を操作して回収したい細胞が存在するウエル２０６の識別番号を選択し、回収指示の入力操作を行うと、このウエル２０６の識別番号と回収指示とが制御装置３４０に入力される。
【0130】
制御装置３４０は、上記入力されたウエル２０６の識別番号と回収指示を単一細胞捕捉装置３５０へ出力する。すると、単一細胞捕捉装置３５０は、入力された識別番号のウエル２０６の直上に単一細胞捕捉部３５０ａを移動させた後、降下させて、単一細胞捕捉部３５０ａにウエル２０６内の細胞を捕捉させる。このとき、撮影装置３３２で撮影を行い、単一細胞捕捉部３５０ａに細胞が捕捉されたこと（ウエル２０６内の細胞が無くなったこと）を確認するようにしてもよい。
【0131】
この後、単一細胞捕捉部３５０ａを上昇させた後、細胞保持プレート３６０の所定の細胞保持部３６１の直上へ移動させ、さらに降下させて、単一細胞捕捉部３５０ａに細胞を細胞保持部３６１へ吐出させる。単一細胞捕捉装置３５０は、制御装置３４０から入力されたウエル２０６の識別番号が複数ある場合には、上記の動作を繰り返し行い、これにより、各ウエル２０６内の細胞は、細胞保持プレート３６０の各細胞保持部３６１に回収される。なお、各細胞保持部３６１は、回収される細胞を受け取る順序が予め定められている。
【0132】
上記では、回収する細胞をユーザが選択（決定）するようにしたが、制御装置３４０がステップＳ８９で算出した回転速度の比較結果が所定の回収条件を満足する細胞を、回収する細胞に決定するようにしてもよい。
【0133】
本実施形態では、ウエル型電気回転アレイ部２００を有する電極デバイス３１１を備えており、複数のウエル２０６の各々に単一の細胞を保持した状態で電気回転用の交流電圧を印加し、薬剤を含まない溶液（第１の潅流液）から薬剤を含む溶液（第２の潅流液）に入れ替えても、細胞は散失することなくウエル２０６内に保持された状態で回転を続けることができる。したがって、複数の細胞について、薬剤刺激前と薬剤刺激後の細胞の回転速度（電気回転速度）Ｖ０，Ｖ１をリアルタイムに計測することができ、これらの比較結果を算出することができる。同一細胞についての薬剤刺激前と薬剤刺激後の電気回転速度Ｖ０，Ｖ１の比較結果に基づいて細胞への薬剤の効果を評価することができ、細胞膜容量に影響を与える薬剤を特定することができる。よって、複数の単一細胞の電気特性の経時変化を一括して計測し、細胞に対する薬剤の効果を評価することができる。また、蛍光染色を行わないので細胞に対して非侵襲的に、単一細胞レベルでの薬剤の効果を調べることができる。
【0134】
なお、本実施形態では、薬剤刺激前と薬剤刺激後の細胞の回転速度情報として、回転速度Ｖ０，Ｖ１を用いたが、角速度を用いるようにしてもよい。
【0135】
また、本実施形態では、単一細胞捕捉装置３５０によって、特定の応答を示した単一細胞のみを回収することができる。これはＴ細胞の集団の中から、特定の抗原に対して強く応答する、免疫活性が高いＴ細胞の選別に応用することができる。他にも、がん細胞の集団に対して抗がん剤を添加し、抗がん剤の作用が小さかった単一細胞を回収し遺伝子発現を調べることで抗がん作用を示した原因遺伝子やタンパク質を特定することができる。そのため、免疫細胞移植医療、抗体医薬、または抗がん剤の開発などへ貢献可能な技術である。
【0136】
〔ウエル型電気回転アレイ部の変形例〕
上記例では、ウエル型電気回転アレイ部２００は、平面視において、行方向に並んだ下層の複数のマイクロバンド電極２０２と、列方向に並んだ上層の複数のマイクロバンド電極２０４とで囲まれる複数の領域（電極包囲領域）の全てに対してウエル２０６が形成されることで、行列状に配置された複数の電極包囲領域の全てに対してウエル２０６が配置されているが、この構成に限られない。上記例のように、複数の電極包囲領域の全てに対してウエル２０６が配置されることで、細胞を捕捉（保持）するウエル２０６の個数を多くすることができるが、例えば、行列状に配置された電極包囲領域において、１行飛ばしまたは１列飛ばしにウエル２０６が配置されるようにしてもよい。また、千鳥状にウエル２０６を配置することも可能である。
上記例では、ウエル型電気回転アレイ部２００は、平面視において、行方向に並んだ下層の複数のマイクロバンド電極２０２と、列方向に並んだ上層の複数のマイクロバンド電極２０４とで囲まれる複数の領域（電極包囲領域）の全てに対してウエル２０６が形成されることで、行列状に配置された複数の電極包囲領域の全てに対してウエル２０６が配置されているが、この構成に限られない。上記例のように、複数の電極包囲領域の全てに対してウエル２０６が配置されることで、細胞を捕捉（保持）するウエル２０６の個数を多くすることができるが、例えば、行列状に配置された電極包囲領域において、１行飛ばしまたは１列飛ばしにウエル２０６が配置されるようにしてもよい。また、千鳥状にウエル２０６を配置することも可能である。
【0137】
また、上記例では、平面視において、下層の複数のマイクロバンド電極２０２と、上層の複数のマイクロバンド電極２０４とが直交（９０度に交差）するように配置されているが、９０度以外の所定角度（例えば８０度等）で交差するように配置されていてもよい。この場合、平面視において略平行四辺形になる各電極包囲領域において、上記例のように、平面視において長方形状のウエル２０６を形成し、ウエル２０６に対して図４（Ａ）と同形状の電極Ｄａ～Ｄｄが露出するように、マイクロバンド電極２０２，２０４等の形状を変更すればよい。この場合も複数の電極包囲領域の全てに対してウエル２０６が配置されるとは限られない。なお、上記例の方が、マイクロバンド電極２０２，２０４等の設計が容易であり、また、細胞を捕捉するウエル２０６の個数を多くすることができる。
【0138】
なお、本実施形態の細胞評価システム３００において、送液ユニット３２０および単一細胞捕捉装置３５０のいずれか一方または両方を備えていない構成とすることも可能である。
【0139】
【0140】
図１６（Ａ），（Ｂ）に示すように、送液ユニット３２０を備えていない場合、電極デバイス３１１上に、送液ユニット３２０の溶液保持部５０３に代えて、リング状の溶液保持部５０１を設置し、ユーザがマイクロピペット等を用いて細胞懸濁液等の所望の溶液を溶液保持部５０１内に供給し、また、マイクロピペット等を用いて溶液保持部５０１内の溶液を排出するようにすればよい。
【0141】
また、単一細胞捕捉装置３５０を備えていない場合、ユーザがマイクロピペット等を用いて所望する細胞を回収するようにしてもよい。
【0142】
〔実施例〕
本実施例で用いた細胞評価システム３００では、送液ユニット３２０及び単一細胞捕捉装置３５０を備えていない。
本実施例で用いた細胞評価システム３００では、送液ユニット３２０及び単一細胞捕捉装置３５０を備えていない。
【0143】
図１７は、本実施例におけるウエル型電気回転アレイ部２００の光学顕微鏡写真を示す図である。図１８（Ａ）は、図１７に示すウエル型電気回転アレイ部２００における１つのウエル２０６及びその近傍領域の光学顕微鏡写真を示し、図１８（Ｂ）は、図１８（Ａ）に示す領域の模式図である。
【0144】
この実施例では、ウエル型電気回転アレイ部２００において、絶縁性基板２０１としてガラス基板を用いた。
【0145】
このガラス基板上に第１のマイクロバンド電極２０２（２０２Ａ，２０２Ｂ）として、所定幅のＩＴＯ製マイクロバンド電極を２０μｍ間隔で行方向（横方向）に１６本並べて配置した。さらに、この上に第１の絶縁層２０３としてネガ型の厚膜フォトレジストであるＳＵ－８を厚さが２０μｍとなるように塗布し、第１の絶縁層２０３を貫通するように横３０μｍ，縦２０μｍのウエル２０６を行列状（１５行、１５列）に２２５個形成した。
【0146】
各ウエル２０６の中心は隣り合う２本の第１のマイクロバンド電極２０２間の中心に配置され、各ウエル２０６の底面に２本の第１のマイクロバンド電極２０２の一部が露出して電極Ｄａ，Ｄｃが配置される。第１のマイクロバンド電極２０２の厚みは２００ｎｍである。
【0147】
第１の絶縁層２０３上に第２のマイクロバンド電極２０４（２０４Ａ，２０４Ｂ）として、２５μｍの幅を有するＴｉ／Ａｕ製マイクロバンド電極を４０μｍ間隔で列方向（縦方向）に１６本並べて配置した。第２のマイクロバンド電極２０４の厚みは２００ｎｍである。
【0148】
最後に、第２の絶縁層２０５として、ＳＵ－８の薄膜（厚み２μｍ）を用い、第２のマイクロバンド電極２０４を被膜した。
【0149】
図１７において、ｉは、第１のマイクロバンド電極２０２Ａおよびその位置を示し、iiは、第１のマイクロバンド電極２０２Ｂおよびその位置を示す。また、Ａは、第２のマイクロバンド電極２０４Ａおよびその位置を示し、Ｂは、第２のマイクロバンド電極２０４Ｂおよびその位置を示す。
【0150】
図１８に示すように、第１のマイクロバンド電極２０２は、ウエル２０６の横方向の両端から５μｍの位置まで、ウエル２０６の底面に露出して電極Ｄａ，Ｄｃが配置するように形成されている。一方、第２のマイクロバンド電極２０４は、帯状のパターンの一部を幅方向に延ばして、ウエル２０６の縦方向の両端側の第１の絶縁層２０３上に、横２０μｍ，縦５μｍの電極Ｄｂ，Ｄｄが露出するように形成されている。
【0151】
このように、各ウエル２０６に対して、同じ電極面積を有する４つのマイクロ電極Ｄａ～Ｄｄが配置される。すなわち、各ウエル２０６に対して、ウエル２０６の左右底面に縦２０μｍ，幅５μｍの２つの電極Ｄａ，Ｄｃが配置され、第１の絶縁層２０３上に横２０μｍ，縦５μｍの２つの電極Ｄｂ，Ｄｄが配置される。この４つの電極Ｄａ，Ｄｂ，Ｄｃ，Ｄｄへ、この順番に位相を９０oずつずらしたサイン波交流電圧を印加することによってウエル２０６内に回転電場を発生させることができる。
【0152】
上記のように作製されたウエル型電気回転アレイ部２００を有する電極デバイス３１１を用いて、Ｊｕｒｋａｔ細胞を電気回転させる実験を行った。
【0153】
細胞懸濁液として、ＲＰＭＩ１６４０培地で培養したＪｕｒｋａｔ細胞を回収し、Ｊｕｒｋａｔ細胞を遠心分離（８００ｍｉｎ-1，５分）して電気回転溶液（導電率７４ｍＳ／ｍ）に懸濁した懸濁液を作成した。電気回転溶液は２５０ｍＭマンニトール水溶液によって５％（ｖ／ｖ）まで希釈されたＲＰＭＩ１６４０培地を用いた。細胞濃度は１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように調製された。尚、単位に用いているＬ，Ｍは、Ｌ＝１０００ｃｍ３、Ｍ＝ｍｏｌ／ｄｍ３である。
【0154】
ここでは、電極デバイス３１１上に図１６に示す溶液保持部５０１を設置（載置）した。溶液保持部５０１として、ＰＤＭＳ（Polydimethylsiloxane）で作製されたリング状部材（外径１０ｍｍ，内径８ｍｍ，高さ６ｍｍ，体積３００μＬ）を用い、これを酸素プラズマ処理（２００Ｗ，６０秒，ＹＡＮＡＣＯ ＬＴＡ－３０２, ヤナコテクニカルサイエンス株式会社）し、酸素プラズマ処理後、速やかに電極デバイス３１１の中央部に設置（載置）した。
【0155】
そして、Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎを濃度が１０ｍｇ／ｍＬになるように電気回転溶液に溶解させ、この溶液をマイクロピペットで電極デバイス３１１上に設置した溶液保持部５０１に供給し、２時間室温に静置した。この操作は電極（Ｄａ～Ｄｄ）表面への細胞の非特異的な吸着を抑制するためである。
【0156】
この後、溶液保持部５０１から電気回転溶液をマイクロピペットで吸い出した後、前述のＪｕｒｋａｔ細胞の懸濁液をマイクロピペットで溶液保持部５０１に３００μＬ供給した。この後、１０分程度静置し、細胞を自重で沈降させてウエル２０６に捕捉させた。
【0157】
【0158】
この状態で、任意波形発生装置３１３によって、図１７に示される電極Ａ，ｉ，Ｂ，iiの順番（すなわち、マイクロバンド電極２０４Ａ，２０２Ａ，２０４Ｂ，２０２Ｂの順番）に、９０°ずつ位相をずらしたサイン波交流電圧（３００ｋＨｚ，２Ｖｐｐ）を印加した。その結果、ウエル２０６に捕捉された細胞は回転を始めた。それぞれの細胞の回転方向は形成された回転電場と反対方向であった。
【0159】
ここで、周波数を種々変更して交流電圧を印加したところ、ウエル２０６内に捕捉された細胞は、周波数が２００～４００ｋＨｚの交流電圧の印加によって電気回転した。
【0160】
一方、周波数が４００ｋＨｚ～８００ｋＨｚの交流電圧を印加すると、細胞は電極側へ誘導され、細胞が電極に接触した瞬間に破裂する様子が観察された。この現象は、細胞に正の誘電泳動が作用したためと考えられる。
【0161】
そこで、細胞の挙動の周波数依存性を把握するために電気回転溶液中におけるＪｕｒｋａｔ細胞のClausius-Mossotti因子の実部（Ｒｅ［ＣＭ］）と虚部（Ｉｍ［ＣＭ］）の周波数依存性を計算した。その結果のグラフを図２０（Ａ）に示す。図２０（Ａ）に示すグラフの横軸は周波数（Ｈｚ）である。なお、Ｊｕｒｋａｔ細胞の細胞膜容量は、文献（Ross P E., et al., Biophys. J., 1994, 66, 169）によって開示されている１１ｍＦ／ｍ２を用いて計算した。
【0162】
Clausius-Mossotti因子は細胞の分極の程度を表し、Clausius-Mossotti因子の実部（Ｒｅ［ＣＭ］）は誘電泳動の方向を示す。Ｒｅ［ＣＭ］が正の場合、正の誘電泳動が作用し電場の強い方向への引力が細胞に作用する。理論計算から２５０ｋＨｚ付近以上の周波数で正の誘電泳動が作用することが判明した。これは実験結果の周波数とほぼ一致した。
【0163】
一方、Clausius-Mossotti因子の虚部（Ｉｍ［ＣＭ］）は電気回転速度の大きさと向きを表す。特に回転速度の最大をとるピーク周波数はＪｕｒｋａｔ細胞の場合、３００ｋＨｚであることが判明した。
【0164】
そこで、次に、最大回転速度を示す３００ｋＨｚの周波数の交流電圧を印加し、細胞を電気回転させた状態で、薬剤刺激の影響を調べた。
【0165】
前述のように、Ｊｕｒｋａｔ細胞をウエル２０６に捕捉した状態で、任意波形発生装置３１３によって３００ｋＨｚ，２Ｖｐｐの交流電圧を印加し、各ウエル２０６内で細胞を回転させた。
【0166】
そして、細胞を回転させてから１０秒後に、１００μＭに調製したイオノマイシン溶液３μＬを溶液保持部５０１に静かに添加し、イオノマイシンの終濃度が１μＭになるようにした。
【0167】
図２１の「実施例」に細胞の特徴点のｘ座標ｄｘ（図１４（Ａ）参照）の経時変化を示した。図２１の「実施例」に示すように、細胞の特徴点のｘ座標が周期的に変化しており、細胞が回転していることを示している。この周期から細胞の回転速度を算出するために、３秒間ごとに回転速度を算出した。その結果を図２２に「実施例」として示した。計測開始１０秒後にイオノマイシン溶液を添加した（図２１，図２２中の矢印の時点）。図２２の縦軸は、計測開始時の回転速度を基準にした相対回転速度を示す。
【0168】
イオノマイシン溶液の３μＬの添加によって溶液全体に緩やかな流れが生じ、ウエル２０６に捕捉されていない細胞や溶液中に漂っていた細胞は、流れの影響を受けてランダムな動きを示した。一方、ウエル２０６に捕捉されて回転している細胞は、溶液の流れの影響を受けずに、ウエル２０６の中で回転運動を継続した。イオノマイシン溶液を添加してから６秒後から回転速度の減少が観察され、添加してから２４秒後には、添加前の８０％の回転速度にまで回転速度が減少した。また、回転していた細胞の一部は、イオノマイシン溶液の添加によって正の誘電泳動の挙動が確認され、各ウエル２０６に設置された４つの電極のいずれかに泳動される様子が観察された。
【0169】
イオノマイシン溶液添加後の細胞膜容量の算出を行った。図２２より、イオノマイシン溶液の添加によって３００ｋＨｚにおける回転速度が添加前の回転速度の８０％に減少した。そこで、前述の（１）式及び（２）式に基づいて、３００ｋＨｚにおける回転速度が添加前の８０％になる細胞膜容量を算出した結果、細胞膜容量が２３．６ｍＦ／ｍ２のときに、３００ｋＨｚにおける回転速度が添加前の８０％に相当する回転速度になることが判明した（図２０（Ｂ）参照）。また、この細胞膜容量のとき、Ｒｅ［ＣＭ］は大きな正の値を示すことから、正の誘電泳動が作用する。回転電場の中心に配置された細胞は、各電極（Ｄａ～Ｄｄ）から等しい力の正の誘電泳動が作用するため、その場に留まり回転運動を継続する。一方、回転電場の中心から外れた細胞は、その細胞の位置から最も近い電極からの正の誘電泳動を強く受けるため、一つの電極に引き寄せられる。
【0170】
また、比較例として、イオノマイシン溶液を３μＬ添加する代わりに、イオノマイシンを含まない溶液を３μＬ添加した実験を行った。その結果を図２１および図２２に「比較例」として示した。なお、図２１および図２２では、比較例における溶液の添加タイミングが、実施例におけるイオノマイシン溶液の添加タイミングと同じになるように示している。比較例では、溶液の添加前後において、細胞の電気回転速度の変化は観察されなかった。よって、比較例では、溶液交換による溶液の流れの影響は細胞の電気回転速度に影響を与えないことがわかった。つまり、実施例のように細胞膜容量に影響を与える薬剤が添加されたときにのみ、電気回転速度の変化が観察される。
【0171】
上記実施例のように、ウエル型電気回転アレイ部２００を有する電極デバイス３１１の利用によって、外部より薬剤を含む溶液を添加し、添加前後の細胞の電気回転速度の変化量をリアルタイムに計測することができる。そして、同一細胞の薬剤を含む溶液の添加前後の電気回転速度の変化量を計測することにより、細胞膜容量に影響を与える薬剤を識別することができる。
【0172】
上記説明から、当業者にとっては、本発明の多くの改良や他の実施形態が明らかである。従って、上記説明は、例示としてのみ解釈されるべきであり、本発明を実行する最良の態様を当業者に教示する目的で提供されたものである。本発明の精神を逸脱することなく、その構造及び／又は機能の詳細を実質的に変更できる。
【産業上の利用可能性】
【0173】
本発明は、複数の単一細胞の電気特性の経時変化を一括して計測することができる電気回転デバイス及びこれを備えた細胞評価システム等として有用である。
【符号の説明】
【0174】
２０１ 絶縁性基板
２０２ 第１のマイクロバンド電極
２０３ 第１の絶縁層
２０４ 第２のマイクロバンド電極
２０５ 第２の絶縁層
２０６ ウエル
３１０ 電気回転デバイス
３１１ 電極デバイス
３１３ 任意波形発生装置
３２０ 送液ユニット
３３１ 撮影装置
３４０ 制御装置
３４２ 表示装置
３５０ 単一細胞捕捉装置
３６０ 細胞保持プレート
２０２ 第１のマイクロバンド電極
２０３ 第１の絶縁層
２０４ 第２のマイクロバンド電極
２０５ 第２の絶縁層
２０６ ウエル
３１０ 電気回転デバイス
３１１ 電極デバイス
３１３ 任意波形発生装置
３２０ 送液ユニット
３３１ 撮影装置
３４０ 制御装置
３４２ 表示装置
３５０ 単一細胞捕捉装置
３６０ 細胞保持プレート
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
