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▶ ティーエス セル バイオ カンパニー，リミテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-05-09
(45)【発行日】2024-05-17
(54)【発明の名称】胎盤由来の細胞外小胞の抗炎症及び抗ウイルス効果組成物
(51)【国際特許分類】
A61K 35/28 20150101AFI20240510BHJP
A61K 35/50 20150101ALI20240510BHJP
A61P 31/12 20060101ALI20240510BHJP
A61P 31/14 20060101ALI20240510BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20240510BHJP
A61K 31/7105 20060101ALI20240510BHJP
C12N 15/113 20100101ALI20240510BHJP
C12N 5/0775 20100101ALI20240510BHJP
A23L 33/10 20160101ALI20240510BHJP
【ＦＩ】
A61K35/28
A61K35/50 ZNA
A61P31/12
A61P31/14
A61P29/00
A61K31/7105
C12N15/113 100Z
C12N5/0775
A23L33/10
【請求項の数】
7
(21)【出願番号】P 2021561799
(86)(22)【出願日】2020-06-25
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-08-04
(86)【国際出願番号】 KR2020008277
(87)【国際公開番号】W WO2021225214
(87)【国際公開日】2021-11-11
【審査請求日】2021-10-14
(31)【優先権主張番号】10-2020-0053200
(32)【優先日】2020-05-04
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(31)【優先権主張番号】10-2020-0074860
(32)【優先日】2020-06-19
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(73)【特許権者】
【識別番号】521453301
【氏名又は名称】ティーエス セル バイオ カンパニー，リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】110001519
【氏名又は名称】弁理士法人太陽国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】ムン、チ ソク
【審査官】横田 倫子
(56)【参考文献】
【文献】Int J Mol.Sci., 2019, Vol.20, Article.5299
【文献】Biochimie, 2018, Vol.155, p.109-118
【文献】Placenta, 2014, Vol.35, p.S69-S73
【文献】Placenta, 2016, Vol.47, p.86-95
【文献】Placenta, 2018, Vol.61, p.33-38
【文献】Pharmaceutics, 2020.4.11, Vol.12 No.4, Article.347(p.1-17)
【文献】ScientificReports，2014年，Vol.4 No.5915，p.1-9，DOI 10.1038/srep05915
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ ３５／００
Ａ６１Ｐ
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
無細胞組成物（ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）を含む、抗ウイルス組成物であって、前記ウイルスは、コロナウイルスであり、
前記無細胞組成物は、少なくとも１つの担体、賦形剤又は希釈剤と共に、胎盤から抽出した生体分子を含み、
前記生体分子は、胎盤由来の間葉幹細胞（ｐＭＳＣ）の細胞外小胞（ＥＶ）と、前記細胞外小胞（ＥＶ）に含まれるｍｉＲＮＡと、を含み、
前記ｍｉＲＮＡは、少なくともｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０３ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８１ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２６ａ－５ｐ及びｈｓａ－ｍｉＲ－２３ａ－３ｐを含む、抗ウイルス組成物。
【請求項2】
前記ｍｉＲＮＡは、少なくともｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－９２ｂ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８１ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２６ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２３ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２５ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２５ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０３ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２２３－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２５－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２６ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９３ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１３０７－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５５－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８５－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４２４－３ｐ及びｈｓａ－ｍｉＲ－２３ｂ－３ｐを含む、請求項１に記載の抗ウイルス組成物。
【請求項3】
前記ｍｉＲＮＡは、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９７－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－９２ｂ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９９ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８１ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８１ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１３０７－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１３９－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２５ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１００－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２６ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｉ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４２－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４５－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－７－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４８４、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２８－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２２－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２４－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－７４４－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４５１ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４２３－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４２３－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９３ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３６１５、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｃ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２４－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２７ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２３ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５０－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－９９ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２５ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２６ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４９－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０３ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－９９ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｃ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５５－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８５－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２４９－３ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４２５－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４２５－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９１－５ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｇ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５７４－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４３－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３７８ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４６ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９６ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２５－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－９３－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２９ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ｄ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２０４－５ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｆ－５ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｄ－５ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｄ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２３ｂ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２７ｂ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９９ｂ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２６－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２２１－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２２２－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５３２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２２３－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－６５２－３ｐ及びｈｓａ－ｍｉＲ－４２４－３ｐを含む、請求項１又は請求項２に記載の抗ウイルス組成物。
【請求項4】
前記コロナウイルスは、コロナ１９ウイルス（ＮＭＣ－ｎＣｏＶ０２）またはＳＡＲＳコロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）である、請求項１～請求項３のいずれか一項に記載の抗ウイルス組成物。
【請求項5】
請求項１～請求項４のいずれか一項に記載の抗ウイルス組成物を含む、ウイルス感染症の予防又は治療用薬学的組成物。
【請求項6】
請求項１～請求項４のいずれか一項に記載の抗ウイルス組成物を含む、ウイルス感染症の予防又は改善用食品組成物。
【請求項7】
無細胞組成物を含む、抗炎症用組成物であって、前記炎症は、コロナウイルス感染に伴う炎症であり、
前記無細胞組成物は、少なくとも１つの担体、賦形剤又は希釈剤と共に、胎盤から抽出した生体分子を含み、
前記生体分子は、胎盤由来の間葉幹細胞（ｐＭＳＣ）の細胞外小胞（ＥＶ）と、前記細胞外小胞（ＥＶ）に含まれるｍｉＲＮＡと、を含み、
前記ｍｉＲＮＡは、少なくともｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０３ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８１ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２６ａ－５ｐ及びｈｓａ－ｍｉＲ－２３ａ－３ｐを含む、抗炎症用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、胎盤に由来する各種物質の種類及び効果に関し、より詳細には、胎盤、へその緒、臍帯血、胎盤由来の細胞外小胞（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｖｅｓｉｃｌｅ、ＥＶ）、及び胎盤、へその緒、臍帯血、胎盤由来の間葉幹細胞（ｐｌａｃｅｎｔａｌ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ、ｐＭＳＣ）及びこれらに由来する細胞外小胞（ＥＶ）と、前記ＥＶに含まれたｍｉＲＮＡ及びｃａｒｇｏを始めとする各種生体分子の種類及び効果に関するもので、前記ＥＶに含まれたｍｉＲＮＡが、コロナウイルスのＲＮＡゲノムを効率的に分解して直接的な抗ウイルス効果を示すだけでなく、ＥＶ自体が保有した各種生体分子の抗炎症効果による間接的な様々なウイルス感染症の予防及び治療効果を確認することによってなされたものである。
【背景技術】
【0002】
胎盤、へその緒、及び臍帯血は、出産時に得ることができる胎児由来の組織及び幹細胞であり、特に、胎盤は、母体の子宮から脱落して生じる副産物であって、胎児と母体をつなぐ役割を行う。
【0003】
胎盤、へその緒及び臍帯血は、最近まで、出産後に廃棄される一時的な器官として認識されてきた。しかし、最近になって胎盤の部位別に間葉細胞、脱落膜（ｄｅｃｉｄｕａ）細胞、羊膜（ａｍｎｉｏｎ）、上皮細胞（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ）などの様々な細胞が存在することが明らかになっている。
【0004】
胎盤、へその緒、及び臍帯血には、必須アミノ酸、メラトニン、ＲＮＡ及びＤＮＡなどの核酸成分、抗酸化酵素であるＳＯＤ（ｓｕｐｅｒ ｏｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔａｓｅ）、ヒアルロン酸（ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、抗酸化剤、サイトカイン、インスリン様成長因子（ｉｎｓｕｌｉｎ－ｌｉｋｅ－ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）、表皮成長促進因子（ＥＧＦ、ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）及び老化細胞活性因子（ＳＣＡＦ、ｓｅｎｅｓｃｅｎｔ ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ）が存在すると知られている。
【0005】
胎盤、へその緒、及び臍帯血は、胎児に伝える栄養分が豊富であり、母体の兔疫体系が胎児を攻撃することを防ぐ免疫抑制機能を有していることが知られている。
【0006】
一般に、胎盤、へその緒及び臍帯血は、母体あるいは胎児に対する診断に用いられた後に廃棄されるが、前記の胎盤の特性を医療分野で用いるために様々な方面で研究が進められている。
【0007】
韓医学では、昔から胎盤を‘紫河車（しかしゃ）’という名称で呼んでおり、身体が衰弱したときに胎盤を蒸して食べさせる処方があり、胎盤の豊富な栄養を用いるために、動物の胎盤から栄養を抽出して作った胎盤化粧品や、同様に動物の胎盤から栄養分を抽出して作った胎盤栄養剤などが現在商用化されている。
【0008】
医療分野では、ヒト胎盤を加水分解して作った薬剤が注射アンプルの形態で販売されているなど、胎盤の栄養分に焦点を合わせて様々な製品が開発されているが、胎盤に由来する細胞外小胞（ＥＶ）、及びその中に存在する様々な生体分子、特にｍｉＲＮＡの観点では研究が不十分である。
【0009】
一方、現在まで行われた臨床試験において、従来のウイルス治療剤は、副作用が強いため軽症患者に処方し難いか、またはその効果が現れる程度まで高用量の抗ウイルス薬物を治療し難いという限界点が存在した。
【0010】
これによって、既存の抗ウイルス剤の副作用を克服し、さらに多くのウイルス特異的薬物を開発する必要性が台頭している実情である。
【0011】
この論文は、科学技術情報通信部の財源で韓国研究財団のバイオ及び医療技術開発事業の支援を受けて行われた研究である（Ｎｏ．２０１９Ｍ３Ａ９Ｈ１１０３７６５）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0012】
【文献】韓国登録特許第１０－１５５５９８１号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0013】
本発明は、前述した従来技術の問題点を解決するために、胎盤、へその緒、臍帯血、胎盤由来の細胞外小胞（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｖｅｓｉｃｌｅ、以下、ＥＶ）、及び胎盤、へその緒、臍帯血、胎盤由来の間葉幹細胞（ｐＭＳＣ）及びこれらに由来する細胞外小胞（ＥＶ）と、前記ＥＶに含まれたｍｉＲＮＡを始めとする各種生体分子（ｃａｒｇｏｅｓ）を特定及び分析することによって、抗炎症及び抗ウイルス効果を示す組成物を提供することに目的がある。
【0014】
本発明の他の目的は、コロナウイルスの遺伝体において突然変異が少ない３’ＵＴＲ部分に結合することによって、頻繁な変異を引き起こすコロナウイルスの予防又は治療のための組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0015】
本発明の一態様は、少なくとも１つの担体、賦形剤又は希釈剤と共に、胎盤、へその緒又は臍帯血から抽出した生体分子を含む、無細胞組成物（ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）を提供する。
【0016】
本発明において、前記生体分子は、タンパク質、ペプチド、抗原、抗体、タンパク質断片、ＤＮＡ、ＲＮＡ、細胞、微小小胞体及びその他の生体粒子から選択されるいずれか１つ以上を意味するもので、細胞外小胞及びｍｉＲＮＡを含むことが好ましいが、これに制限されるものではない。
【0017】
本発明において、前記担体、賦形剤及び希釈剤としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、澱粉、アカシアゴム、アルジネート、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、ステアリン酸マグネシウム及び鉱物油が挙げられる。
【0018】
本発明の組成物は、細胞がないことを特徴とするところ、幹細胞を静脈内投与すると、塞栓症、血液の凝集及び免疫反応を誘発し得るので、このような観点で利点を有する。
【0019】
具体的には、前記生体分子は、胎盤、へその緒、臍帯血から直接的に得られたＥＶ、及び胎盤、へその緒、臍帯血由来の間葉幹細胞（ｐｌａｃｅｎｔａｌ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ、ｐＭＳＣ）に由来する細胞外小胞（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｖｅｓｉｃｌｅ、ＥＶ）であってもよく、又は、前記生体分子は、組織由来のＥＶ、組織抽出物由来のＥＶ、及びｐＭＳＣ－ＥＶに含まれた７７個のｍｉＲＮＡとして、ｍｉＲ－９２ａ－３ｐ、ｍｉＲ－２６ａ－５ｐ、ｍｉＲ－２３ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１０３ａ－３ｐ及びｍｉＲ－１８１ａ－５ｐなどで構成された群から１つ以上選択されたものであってもよいが、これに制限されるものではない。
【0020】
具体的には、前記７７個のｍｉＲＮＡは、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９７－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－９２ｂ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９９ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８１ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８１ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１３０７－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１３９－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２５ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１００－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２６ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｉ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４２－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４５－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－７－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４８４、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２８－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２２－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２４－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－７４４－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４５１ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４２３－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４２３－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９３ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３６１５、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｃ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２４－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２７ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２３ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５０－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－９９ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２５ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２６ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４９－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０３ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－９９ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｃ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５５－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８５－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２４９－３ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４２５－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４２５－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９１－５ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｇ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５７４－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４３－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３７８ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４６ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９６ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２５－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－９３－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２９ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ｄ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２０４－５ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｆ－５ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｄ－５ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｄ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２３ｂ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２７ｂ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９９ｂ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２６－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２２１－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２２２－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５３２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２２３－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－６５２－３ｐ及びｈｓａ－ｍｉＲ－４２４－３ｐである。
【0021】
また、本発明の無細胞組成物は、前記生体分子として、細胞外小胞及び／又は前記７７個種のｍｉＲＮＡのうちの１種以上を含むものであってもよいが、これに制限されない。
【0022】
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、塩基配列の長さ１８～２５個のヌクレオシド（Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）からなる小さなサイズの非コードＲＮＡであって、ｍｉＲＮＡがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＮＡゲノムを効率的に分解することによってウイルスを抑制できることを確認した。
【0023】
本発明者は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の３’ＵＴＲと直接的に相互作用し、組織－ＥＶ（ｔｉｓｓｕｅ－ＥＶ）、組織抽出物のＥＶ（ｔｉｓｓｕｅ ｅｘｔｒａｃｔ ＥＶ）、ＭＳＣ－ＥＶに存在する７７個のｍｉＲＮＡを確認し、その中でＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の３’ＵＴＲに結合する１８個のｍｉＲＮＡを選定し、その中でも発現レベルが高く、さらに強い結合を示す上位５個のｍｉＲＮＡを選定した。
【0024】
具体的には、前記１８個のｍｉＲＮＡは、ｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－９２ｂ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８１ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２６ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２３ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２５ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２５ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０３ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２２３－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２５－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２６ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９３ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１３０７－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５５－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８５－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４２４－３ｐ及びｈｓａ－ｍｉＲ－２３ｂ－３ｐであり、その中から選定された前記５個のｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ－９２ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１０３ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１８１ａ－５ｐ、ｍｉＲ－２６ａ－５ｐ及びｍｉＲ－２３ａ－３ｐである。
【0025】
本発明の実施例では、これらの５個のｍｉＲＮＡがいずれも、組織－ＥＶ（ｔｉｓｓｕｅ－ＥＶ）、組織抽出物のＥＶ（ｔｉｓｓｕｅ ｅｘｔｒａｃｔ ＥＶ）から発現されてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を成功裏に抑制することを確認した。
【0026】
また、組織－ＥＶ（ｔｉｓｓｕｅ－ＥＶ）、組織抽出物のＥＶ（ｔｉｓｓｕｅ ｅｘｔｒａｃｔ ＥＶ）、及びＭＳＣ－ＥＶに存在する中胚葉由来の細胞外小胞（ｐＭＳＣ－ＥＶ）は、致命的なサイトカインストームを予防し、優れた再生効果を有すると知られている多くの抗炎症因子を含んでおり、実験の結果、ＥＶが、ＡＣＥ２受容体を発現すると知られている幾つかの宿主細胞で炎症性環境を調節して炎症反応を抑制することを確認した。
【0027】
本発明の他の態様は、前記無細胞組成物を含む、抗ウイルス組成物を提供する。
【0028】
具体的には、前記ウイルスは、コロナウイルス、ＨＩＶ、インフルエンザ、エンテロウイルス、ブタ生殖器呼吸器症候群ウイルス（Ｐｏｒｃｉｎｅ ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ａｎｄ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｖｉｒｕｓ）、Ｃ型肝炎ウイルス及びウシウイルス性下痢ウイルス（Ｂｏｖｉｎｅ ｖｉｒａｌ ｄｉａｒｒｈｅａ ｖｉｒｕｓ）からなる群から１つ以上選択されたものであってもよく、より具体的には、コロナ１９ウイルス（ＮＭＣ－ｎＣｏＶ０２）またはＳＡＲＳコロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）であってもよいが、これに制限されない。
【0029】
本発明の更に他の態様は、前記抗ウイルス組成物を含む、ウイルス感染症の予防又は治療用薬学的組成物を提供する。
【0030】
具体的に、前記ウイルスはコロナウイルスであってもよいが、これに制限されない。
【0031】
前記薬学的組成物は、通常の薬学的組成物の調製に用いられる担体、賦形剤及び希釈剤をさらに含むことができる。
【0032】
前記担体、賦形剤及び希釈剤としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、澱粉、アカシアゴム、アルジネート、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、ステアリン酸マグネシウム、または鉱物油が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【0033】
また、前記組成物は、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン、シロップ、エアゾールなどの経口型剤形、又は、注射液、鼻噴霧（ｎａｓａｌ ｓｐｒａｙ）、吸入液体、クリーム（ｃｒｅａｍ）、ゲル、軟膏（ｏｉｎｔｍｅｎｔ）、坐薬、またはローション（ｌｏｔｉｏｎ）の形態の非経口型剤形に製剤化して使用することができる。
【0034】
前記経口投与のための固形製剤には、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが含まれ、このような固形製剤は、前記ｍｉＲＮＡ組成物及びその分画物に少なくとも１つ以上の賦形剤、例えば、澱粉、炭酸カルシウム、スクロース、ラクトース、またはゼラチンなどを混合して調製することができる。前記賦形剤以外に、ステアリン酸マグネシウム、タルクのような潤滑剤が使用されてもよい。
【0035】
前記経口投与のための液状製剤としては、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤などが使用されてもよく、単純希釈剤である水、リキッドパラフィン以外に、様々な賦形剤、例えば、湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などが含まれてもよい。
【0036】
前記非経口投与のための製剤としては、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤、坐剤が使用されてもよい。前記非水性溶剤、懸濁剤としては、プロピレングリコール（ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物性油、オレイン酸エチルのような注射可能なエステルが使用されてもよい。前記坐剤の基剤としては、ウィテップゾール（ｗｉｔｅｐｓｏｌ）、マクロゴール、ツイン（ｔｗｅｅｎ）６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチンが使用されてもよい。
【0037】
前記抗ウイルス組成物を含む薬学的組成物は、薬剤学的に有効な量が対象体に投与され得る。前記“薬剤学的に有効な量”は、医学的治療に適用可能な合理的な利益／リスク比で、疾患を治療するのに十分な量を意味し、有効用量のレベルは、患者の疾患の種類、重症度、薬物の活性、薬物に対する敏感度、投与時間、投与経路、排出割合、治療期間、同時に使用される薬物を含む要素、及びその他の医学分野でよく知られている要素によって決定され得る。
【0038】
前記薬学的組成物は、個別治療剤として投与されてもよく、他の治療剤と併用して投与されてもよく、従来の治療剤と順次又は同時に投与されてもよく、単一又は多重投与されてもよい。前記要素を全て考慮して、副作用なしに最小限の量で最大の効果を得ることができる量を投与することが好ましく、これは、当業者によって容易に決定され得る。
【0039】
本発明の治療用組成物の好ましい投与量は、患者の状態及び体重、疾病の程度、薬物の形態、投与の経路及び期間によって異なるが、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者によって適宜選択され得る。好ましくは、本発明の治療用組成物は、ＥＶの量を基準とする場合、１日投与を基準としてＥＶの数が１０２～１０１６個、より好ましくはＥＶの数が１０５～１０１２個となるように投与することができるが、これに制限されない。
【0040】
また、ｍｉＲＮＡの量を基準とする場合、１日０．０００１～１０００ｍｇ／ｋｇで、より効果的であるためには０．０１～１００ｍｇ／ｋｇで投与することが好ましい。投与は、一日に１回投与してもよく、数回に分けて投与してもよい。前記投与量及び投与回数は、いずれの面においても本発明の範囲を限定するものではない。
【0041】
本発明の他の態様は、前記抗ウイルス組成物を含む、ウイルス感染症の予防又は改善用食品組成物を提供する。
【0042】
本発明の抗ウイルス組成物は細胞外小胞（ＥＶ）を含むので、口腔で摂取しても体内にＥＶ及びｍｉＲＮＡが伝達され得るので、優れたウイルス感染症の予防及び治療効果を示すことができることを特徴とする。
【0043】
本発明において、食品とは、栄養素を１種又はそれ以上含有している天然物又は加工品を意味し、好ましくは、ある程度の加工工程を経て人又は動物が直接食べることができる状態になったものを意味し、通常の意味として、飲料、食品添加剤及び飲料添加剤を全て含むことを意図する。
【0044】
本発明の食品は、例えば、各種食品類、飲料、ガム、茶などがある。前記食品、飲料、食品添加剤及び飲料添加剤は、通常の製造方法により製造されてもよい。
【0045】
本発明において、飲料とは、渇きを解消したり、味を楽しんだりするために飲むものの総称であり、健康機能飲料を含むことを意図する。前記飲料は、指示された割合で必須成分として本発明の組成物を有効成分として含むこと以外に、他の成分には特に制限がなく、通常の飲料のように様々な香味剤又は天然炭水化物などを追加成分として含有することができる。
【0046】
前記の天然炭水化物の例は、モノサッカライド、例えば、ブドウ糖、果糖など、ジサッカライド、例えば、マルトース、スクロースなど、及びポリサッカライド、例えば、デキストリン、シクロデキストリンなどのような通常の糖、及びキシリトール、ソルビトール、エリトリトールなどの糖アルコールである。上述したもの以外の香味剤として、天然香味剤（タウマチン、ステビア抽出物（例えば、レバウディオサイドＡ、グリシルリジンなど））及び合成香味剤（サッカリン、アスパルテームなど）を有利に使用することができる。前記天然炭水化物の比率は、本発明の組成物１００ｍｌ当たり、一般に約１～２０ｇ、好ましくは５～１２ｇであってもよい。その他に、本発明の組成物は、天然果物ジュース、果物ジュース飲料、野菜飲料の製造のための果肉をさらに含有することができる。
【0047】
前記以外に、本発明の食品組成物は、様々な栄養剤、ビタミン、鉱物（電解質）、合成風味剤及び天然風味剤などの風味剤、着色剤及び増進剤（チーズ、チョコレートなど）、ペクチン酸及びその塩、アルギン酸及びその塩、有機酸、保護性コロイド増粘剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料に使用される炭酸化剤などを含有することができる。このような成分を独立して又は組み合わせて使用することができる。
【発明の効果】
【0048】
本発明は、胎盤、へその緒、臍帯血由来のＥＶ、及び胎盤、へその緒、臍帯血、胎盤由来の間葉幹細胞（ｐＭＳＣ）及びこれらに由来する細胞外小胞（ＥＶ）と、前記ＥＶに内在されたｍｉＲＮＡ及びこれを含む組成物を提供し、これを使用してコロナウイルスの予防又は治療剤を開発する場合、１）本発明のｍｉＲＮＡがコロナウイルスゲノムの３’ＵＴＲと高い特異度で結合するので、正常な組織及び臓器に及ぼす副作用がほとんどないと予想され、２）ウイルス遺伝体の３’ＵＴＲは、突然変異がほとんどなく、高い割合で保存される部位であるので、突然変異が頻繁なＲＮＡウイルスでも突然変異に影響をあまり受けないので、ＲＮＡウイルスに普遍的に使用可能であり、３）ＥＶに存在する様々な生体分子が、損傷した組織の再生及び免疫調節などの追加的な効果を示すので、これを用いた治療剤の効果が非常に優れると期待される。
【0049】
また、本発明の組成物は、前記の直接的な抗ウイルス効果以外にも、ＥＶの内部に、炎症と関連する遺伝子との相互作用を通じて炎症を抑制する各種生体物質及びｍｉＲＮＡを含むことができるので、ウイルス感染による症状を緩和させることができる間接的な効果を示すことができる。
【0050】
すなわち、本発明の組成物は、直接的なウイルス抑制効果と、ウイルス感染による炎症及びサイトカインストームを抑制できる間接的な治療効果との両方を示すことができることを特徴とし、ウイルス感染予防剤として使用可能である。
【0051】
本発明の効果は、上記の効果に限定されるものではなく、本発明の詳細な説明又は特許請求の範囲に記載された発明の構成から推論可能なすべての効果を含むものと理解されなければならない。
【図面の簡単な説明】
【0052】
【図1】ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに対する組織－ＥＶ（ｔｉｓｓｕｅ－ＥＶ）、組織抽出物のＥＶ（ｔｉｓｓｕｅ ｅｘｔｒａｃｔ ＥＶ）、ＭＳＣ－ＥＶ及びこれに含まれたｍｉＲＮＡの抗ウイルス効果の作用メカニズムに関し、直接的な抗ウイルス効果は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の３’ＵＴＲ、５’ＵＴＲまたはコーディング配列のような領域にｍｉＲＮＡが直接結合することによって、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＮＡの下向き調節をもたらす。間接的な抗ウイルス効果としては、ＥＶに内在されたｍｉＲＮＡ及びタンパク質を介して炎症性ｍＲＮＡの発現を調節し、これを通じて、損傷した組織を再生し、それらのｍｉＲＮＡ及びタンパク質を介して前炎症性環境を調節してサイトカインストームを抑制できることを確認した。
【図2】ｐＭＳＣ－ＥＶの特性を観察した結果を示した図である（Ａ：ｐＭＳＣ－ＥＶは、蛍光顕微鏡により測定されたＣＤ６３陽性。Ｂ：ｐＭＳＣ－ＥＶの平均サイズは、１ｍｌの抽出物において直径が１２１．８ｎｍである。Ｃ：代表的なＴＥＭイメージ。Ｄ：ＣＤ８１、ＣＤ９、アネキシン（ａｎｎｅｘｉｎ）Ａ２及びＨＳＰ７０に対するｐＭＳＣ－ＥＶのウエスタンブロットの結果）
【図3】本発明のｍｉＲＮＡがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の３’ＵＴＲに結合できる潜在的な結合サイトを示した図である。
【図4】本発明のｍｉＲＮＡがＥＶに存在するか否かを確認するためにｑＰＣＲ分析を行った結果を示した図である。
【図5】本発明のＥＶの直接的な抗ウイルス効果を確認するためにルシフェラーゼ分析を行った結果を示した図である（Ａ：ＰＣＲ断片をルシフェラーゼＯＲＦと合成ポリ（Ａ）配列との間のルシフェラーゼレポータープラスミドにクローニングして製造した組換えプラスミド。Ｂ：組換えプラスミドで形質感染されたＳＫ－Ｎ－ＢＥ（２）Ｃ細胞での相対ルシフェラーゼ活性。）。
【図6】様々なコロナウイルスに本発明のｍｉＲＮＡが効果を示すかを確認した結果を示した図である（Ａ：５個のコロナウイルスの３’ＵＴＲ及びｍｉＲＮＡの結合部位。Ｂ：本発明のｍｉＲＮＡと他のウイルスとの相互作用。）。
【図7】ＥＶ及びｍｉＲＮＡの間接的な抗ウイルス効果を確認するための実験方法を簡略に示した図である。
【図8】ＢＥＡＳ－２Ｂ（胃腸管の上皮細胞）にＥＶ及びｍｉＲＮＡを処理した後の効果を確認した結果を示した図である（Ａ：ＥＶ、Ｂ：ｍｉＲＮＡ）。
【図9】ＬＬ－２４にＥＶ及びｍｉＲＮＡを処理する場合の保護及び回復効果を確認した結果を示した図である（Ａ：ＥＶ、Ｂ：ｍｉＲＮＡ）。
【図11】ニューロン細胞であるＭ２にＥＶを処理した後の炎症関連因子の発現レベルを確認した結果を示した図である。
【図12】ＰＫＨ２６で標識したＥＶを前記各細胞株に処理する前後の様子を撮影した図である。
【図13】本発明のＥＶ及びｍｉＲＮＡが直接及び間接的な経路をいずれも用いてウイルス及びウイルス感染症状を治療又は改善する過程を概念図で示したものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【0053】
以下、本発明を実施例によって詳細に説明する。ただし、下記の実施例は本発明を例示するものに過ぎず、本発明が下記の実施例によって限定されるものではない。
【0054】
実験方法及び材料
胎盤抽出物及びＥＶの収得
内科、産科または外科合併症の症状を示さないヒト胎盤を収得した。それぞれの胎盤を慎重に切開し、ＰＢＳで数回洗浄した後、機械的に粉砕し、３７℃で３０分間、０．５％コラゲナーゼＩＶ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ ＭＯ，ＵＳＡ）で分解（ｄｉｇｅｓｔ）して胎盤抽出物を獲得し、ＥＶを収得した。
胎盤抽出物及びＥＶの収得
内科、産科または外科合併症の症状を示さないヒト胎盤を収得した。それぞれの胎盤を慎重に切開し、ＰＢＳで数回洗浄した後、機械的に粉砕し、３７℃で３０分間、０．５％コラゲナーゼＩＶ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ ＭＯ，ＵＳＡ）で分解（ｄｉｇｅｓｔ）して胎盤抽出物を獲得し、ＥＶを収得した。
【0055】
細胞株及びウイルス
アフリカミドリザルの腎臓上皮細胞の細胞株であるベロ細胞（Ｖｅｒｏ ｃｅｌｌ）が用いられた。細胞は、ＤＭＥＭ培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ，Ｇｉｂｃｏ，ＵＳＡ）で培養された。
アフリカミドリザルの腎臓上皮細胞の細胞株であるベロ細胞（Ｖｅｒｏ ｃｅｌｌ）が用いられた。細胞は、ＤＭＥＭ培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ，Ｇｉｂｃｏ，ＵＳＡ）で培養された。
【0056】
２０２０年２月初めにコロナ１９の韓国内感染患者の呼吸器検体から分離したコロナ１９ウイルス（ＮＭＣ－ｎＣｏＶ０２）及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスをベロＥ６細胞に感染させ、ウイルス力価（ｔｉｔｅｒ）は、細胞変性効果（Ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃ ｅｆｆｅｃｔ、ＣＰＥ）に基づいて５０％組織培養感染用量（ＴＣＩＤ５０）によって確認した。また、ウイルスに関する全ての実験は、生物安全レベル－３（ＢＬＳ－３）実験室で行われた。
【0057】
細胞毒性分析
ベロ細胞に対するＥＶの細胞毒性効果は、ＭＴＴ－ａｓｓａｙによって評価された。
ベロ細胞に対するＥＶの細胞毒性効果は、ＭＴＴ－ａｓｓａｙによって評価された。
【0058】
具体的には、９６ウェルプレートにて、ベロ細胞の単層はリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄され、連続的な量のＥＶが処理された。ベロ細胞の１×１０４は、５％のＣＯ２と、３７℃で９６ウェルプレートにて２４時間培養し、吸光度は、プレートリーダーを用いて５００ｎｍから６００ｎｍまでの波長で測定された。
【0059】
細胞変性効果（ＣＰＥ）の抑制効果の分析
ベロ細胞１×１０４を９６ウェルにそれぞれ注入し、ＥＶを含む培養溶液５０μＬ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスを含む５０μＬを３７℃で７２時間処理した。ウイルスで接種された細胞は対照群として用いられた。感染した細胞は、顕微鏡下で１００％ＣＰＥで観察された。細胞は、１％クリスタルバイオレットで染色された。ＥＶ処理された細胞でＣＰＥの百分率を計算し（陽性ウェル／総ウェル）、その結果を撮影した。
ベロ細胞１×１０４を９６ウェルにそれぞれ注入し、ＥＶを含む培養溶液５０μＬ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスを含む５０μＬを３７℃で７２時間処理した。ウイルスで接種された細胞は対照群として用いられた。感染した細胞は、顕微鏡下で１００％ＣＰＥで観察された。細胞は、１％クリスタルバイオレットで染色された。ＥＶ処理された細胞でＣＰＥの百分率を計算し（陽性ウェル／総ウェル）、その結果を撮影した。
【0060】
ナノ粒子トラッキング分析
ＥＶは、牛胎児血清（ＰＢＳ）で最終１ｍＬで希釈され、ＺｅｔａＶｉｅｗナノ粒子トラッキングビデオ顕微鏡（Ｐａｒｔｉｃｅｌ Ｍｅｔｒｉｘ，Ｉｎｎｉｎｇ、ドイツ）で検査された。ＥＶ又はナノ粒子に対するソフトウェア製造メーカーの基本設定を選択し、各測定に対して、３回スキャンした。
ＥＶは、牛胎児血清（ＰＢＳ）で最終１ｍＬで希釈され、ＺｅｔａＶｉｅｗナノ粒子トラッキングビデオ顕微鏡（Ｐａｒｔｉｃｅｌ Ｍｅｔｒｉｘ，Ｉｎｎｉｎｇ、ドイツ）で検査された。ＥＶ又はナノ粒子に対するソフトウェア製造メーカーの基本設定を選択し、各測定に対して、３回スキャンした。
【0061】
ＥＶの蛍光イメージング方法
ＥＶは、ＥＺ－Ｌｉｎｋ Ｓｕｌｆｏ－ＮＨＳ－ＬＣ ＬＣ－Ｂｉｏｔｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）を用いてビオチン化（ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ）された。
ＥＶは、ＥＺ－Ｌｉｎｋ Ｓｕｌｆｏ－ＮＨＳ－ＬＣ ＬＣ－Ｂｉｏｔｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）を用いてビオチン化（ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ）された。
【0062】
ビオチン化されたＥＶは、Ｚｅｂａ ｓｐｉｎ ｄｅｓａｌｔｉｎｇ ｃｏｌｕｍｎｓ ７ Ｋ ＭＷＣＯ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にロードされて残りの自由ビオチンを除去した。
【0063】
染色のために、２０μＬのビオチン化されたＥＶが、ストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）でコーティングされたガラススライド（Ａｒｒａｙｉｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）に描かれた円に加えられ、３０分後、ＥＶは、ＢＤ Ｆｉｘ Ｐｅｒｍ（ＢＤバイオサイエンス）で固定処理し、０．２％のＢＳＡ－ＰＢＳでブロックした。
【0064】
ＥＶの免疫蛍光染色を、抗ヒトＣＤ６３（１：１００；米国テキサス州ダラス所在のサンタクルーズバイオテクノロジー（ＳＣ－５２７５））を用いて室温で２時間行い、次いで、室温で１時間、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８－接合された二次抗体と共にインキュベーションした。
【0065】
透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）イメージング方法
０．５μｇのタンパク質を含有する希釈されたサンプルの５ｍｌの分取量を、親水性グリッド上に滴下した。数分後、グリッドを蒸留水で洗浄し、２％酢酸ウラニルと２０秒間対照した。８０ｋＶで作動するＪＥＭ－１０１０顕微鏡（ＪＥＯＬ）からイメージを取得した。
０．５μｇのタンパク質を含有する希釈されたサンプルの５ｍｌの分取量を、親水性グリッド上に滴下した。数分後、グリッドを蒸留水で洗浄し、２％酢酸ウラニルと２０秒間対照した。８０ｋＶで作動するＪＥＭ－１０１０顕微鏡（ＪＥＯＬ）からイメージを取得した。
【0066】
ウエスタンブロッティング
ＥＶを、プロテアーゼカクテル錠剤（Ｒｏｃｈｅ）及びホスファターゼ抑制剤ＩＩ及びＩＩＩ（Ｓｉｇｍａ）を含有する１０×ＲＩＰＡ緩衝液に溶解させた。ＢＣＡ分析法（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてタンパク質の濃度を測定した。各サンプルの３０μｇの分取量に１０％ＳＤＳ－ＰＡＧＥを行った後、ウエスタンブロッティングを行った。
ＥＶを、プロテアーゼカクテル錠剤（Ｒｏｃｈｅ）及びホスファターゼ抑制剤ＩＩ及びＩＩＩ（Ｓｉｇｍａ）を含有する１０×ＲＩＰＡ緩衝液に溶解させた。ＢＣＡ分析法（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてタンパク質の濃度を測定した。各サンプルの３０μｇの分取量に１０％ＳＤＳ－ＰＡＧＥを行った後、ウエスタンブロッティングを行った。
【0067】
ＴＢＳ－Ｔ中の１０％脱脂乳で１時間ブロッティングをブロックした。次のような供給メーカーから、次のタンパク質に対する抗体を収得した：ＣＤ８１（１：１，０００，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、Ａｌｉｘ（１：１，０００，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ＣＤ９（１：５００，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）、及びＧＡＰＤＨ（１：１０，０００，ｓｃ－３２２３３，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）。
【0068】
１次抗体をＴＢＳ－Ｔに希釈し、４℃で一晩中、ブロットと共にインキュベートした後、２次抗体と共に１時間インキュベーションした。強化化学発光ＨＲＰ基質（ｅｎｈａｎｃｅｄ ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ ＨＲＰ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて免疫反応性を検出した。
【0069】
細胞の培養
ヒト肝癌細胞株ＨｅｐＧ２及びマウスミクログリア細胞株ＢＶ２は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）から購入した。両細胞株ともに、１０％胎児牛血清（ＦＢＳ、Ｇｉｂｃｏ）及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）が補充された成長培地（ＤＭＥＭ；Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）で、５％ＣＯ２中で３７℃で培養された。両細胞株ともに２～４日毎に継代された。
ヒト肝癌細胞株ＨｅｐＧ２及びマウスミクログリア細胞株ＢＶ２は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）から購入した。両細胞株ともに、１０％胎児牛血清（ＦＢＳ、Ｇｉｂｃｏ）及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）が補充された成長培地（ＤＭＥＭ；Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）で、５％ＣＯ２中で３７℃で培養された。両細胞株ともに２～４日毎に継代された。
【0070】
正常肺細胞株ＬＬ２４もＡＴＣＣから収得した。ＬＬ２４細胞は、１０％ＦＢＳ及び１％Ｐ／Ｓが補充されたＲＰＭＩ－１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＵＳＡ，ＮＹ，ＵＳＡ）で、５％ＣＯ２の加湿雰囲気で３７℃で成長させた。継代は３日毎に行われた。
【0071】
ＭＥＦ細胞を１３．５日目のマウス胚から単離した。ＭＥＦ細胞を１０％ＦＢＳ、１％抗生剤抗真菌剤（２５０ｎｇ／ｍＬアムホテリシン、１００Ｕ／ｍＬペニシリン及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン）、８μｇ／ｍｌチロシン（Ｓｉｇｍａ）及び１５μｇ／ｍＬゲンタマイシン（Ｇｉｂｃｏ）が補充されたＤＭＥＭ培地で、５％ＣＯ２、３７℃で培養した。ＭＥＦ細胞は３日毎に継代され、継代２～５で用いられた。
【0072】
形質転換されたヒト気管支上皮細胞株ＢＥＡＳ－２Ｂを、５μｇ／ｍＬのゲンタマイシン（Ｇｉｂｃｏ）と無血清１Ｘ定義されたケラチノサイトＳＦＭ（Ｇｉｂｃｏ）で、５％ＣＯ２、３７℃で培養した。培地は、２～３日毎に交換し、細胞は４～５日毎に継代した。
【0073】
ニューロンは、妊娠週数１０週、１２週、及び１４週で母親の同意の下にヒト胎児組織から隔離された。ニューロンは、Ｂ２７補充剤（Ｇｉｂｃｏ）５０μｇ／ｍＬ、ゲンタマイシン（Ｇｉｂｃｏ）、ヒトｂＦＧＦ、ヒトＥＧＦ２０ｎｇ／ｍＬ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、トコフェロール及び酢酸トコフェロール１μｇ／ｍＬ（Ｓｉｇｍａ ａｌｄｒｉｃｈ）が補充されたＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ）培地で、３７℃、５％ＣＯ２及び３％Ｏ２で培養した。
【0074】
ＥＶにＰＫＨ２６標識処理
ＥＶは、一般的な細胞膜のためのＰＫＨ２６赤色蛍光細胞リンカーキット（ＰＫＨ２６ Ｒｅｄ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｋｅｒ Ｋｉｔ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｃｅｌｌ Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で標識された。
ＥＶは、一般的な細胞膜のためのＰＫＨ２６赤色蛍光細胞リンカーキット（ＰＫＨ２６ Ｒｅｄ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｋｅｒ Ｋｉｔ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｃｅｌｌ Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で標識された。
【0075】
具体的には、ＥＶペレットを希釈剤Ｃに２００μｇ／ｍＬで再懸濁させた後、染料溶液（２μＬのＰＫＨ２６エタノール染料及び５００μＬの希釈剤Ｃ）と１：１で５分間混合した。次に、同じ体積の１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を添加して過量の染料を結合させ、生成された溶液に７Ｋ ＭＷＣＯ Ｚｅｂａスピン脱塩カラム（７Ｋ ＭＷＣＯ Ｚｅｂａ Ｓｐｉｎ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ Ｃｏｌｕｍｎｓ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて過量の染料を除去した。以降、サンプルを－８０℃で貯蔵した。
【0076】
ＬＰＳ及びＥＶの処理
実験のために、細胞は９６ウェル又は６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ，Ｒｏｓｋｉｌｄｅ，Ｄｅｎｍａｒｋ）のウェルに同等の密度でシードされた。回復効果を決定するために、細胞は、ＬＰＳ（ＭＥＦｓ及びＢＶ２：０．５～２μｇ／ｍＬ、ＨｅｐＧ２及びＬＬ２４：２又は４μｇ／ｍＬ）で刺激させた後、ＥＶで２４時間処理した。
実験のために、細胞は９６ウェル又は６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ，Ｒｏｓｋｉｌｄｅ，Ｄｅｎｍａｒｋ）のウェルに同等の密度でシードされた。回復効果を決定するために、細胞は、ＬＰＳ（ＭＥＦｓ及びＢＶ２：０．５～２μｇ／ｍＬ、ＨｅｐＧ２及びＬＬ２４：２又は４μｇ／ｍＬ）で刺激させた後、ＥＶで２４時間処理した。
【0077】
保護効果を決定するために、細胞は、ＥＶで２４時間前処理された後、ＬＰＳで２４時間刺激した。２４時間インキュベーションした後、細胞をＭＴＴ分析又はＲＮＡの抽出に適用した。
【0078】
ｍｉＲＮＡ形質感染（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）
ｍｉＲＮＡを形質感染させるために、６×１０４～２×１０５の細胞を２４ウェルプレートにシードし、２０ｎＭのｍｉＲＮＡ（ｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２６ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２３ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０３－３ｐ、及びｈｓａ－ｍｉＲ－１８１－５ｐ）（バイオニア）で感染させ、Ｐｒｅ－ｍｉＲ ｍｉＲＮＡ陰性対照群は、リポフェクタミン３０００を代わりに使用した。
ｍｉＲＮＡを形質感染させるために、６×１０４～２×１０５の細胞を２４ウェルプレートにシードし、２０ｎＭのｍｉＲＮＡ（ｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２６ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２３ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０３－３ｐ、及びｈｓａ－ｍｉＲ－１８１－５ｐ）（バイオニア）で感染させ、Ｐｒｅ－ｍｉＲ ｍｉＲＮＡ陰性対照群は、リポフェクタミン３０００を代わりに使用した。
【0079】
ＭＴＴ分析
ＥＶの細胞毒性は、ＭＴＴ分析によって評価された。簡略に、細胞を９６ウェルプレートにシードし、指示された濃度のＥＶで処理し、ＬＰＳで２４時間刺激した。培養上清液を除去した後、生成された暗青色の結晶をＤＭＳＯで溶解させた。５７０ｎｍで吸光度を測定した。
ＥＶの細胞毒性は、ＭＴＴ分析によって評価された。簡略に、細胞を９６ウェルプレートにシードし、指示された濃度のＥＶで処理し、ＬＰＳで２４時間刺激した。培養上清液を除去した後、生成された暗青色の結晶をＤＭＳＯで溶解させた。５７０ｎｍで吸光度を測定した。
【0080】
ＲＮＡの抽出及び定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）
ｑＰＣＲのための全（ｔｏｔａｌ）ＲＮＡをＢＶ２、ＭＥＦ、ＨｅｐＧ２、ＬＬ２４、ＢＥＡＳ－２Ｂ及びニューロン細胞から抽出し、ｍｉＲＮＡをＥＶから抽出した。ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて全ＲＮＡの抽出を行った。
ｑＰＣＲのための全（ｔｏｔａｌ）ＲＮＡをＢＶ２、ＭＥＦ、ＨｅｐＧ２、ＬＬ２４、ＢＥＡＳ－２Ｂ及びニューロン細胞から抽出し、ｍｉＲＮＡをＥＶから抽出した。ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて全ＲＮＡの抽出を行った。
【0081】
ｃＤＮＡキット（ｉＮｔＲＯＮ）を用いて１μｇの全ＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。トータルエクソソームＲＮＡ及びタンパク質分離キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてｍｉＲＮＡを抽出した後、ｍｉＳｃｒｉｐｔ ＩＩ ＲＴ（Ｑｉｇｅｎ）を用いて逆転写させた。
【0082】
ＰＣＲ及びｑＰＣＲのために、炎症と関連する遺伝子のプライマーを設計した。反応混合物（総体積２０μＬ）は、１０μＭのプライマー混合物、低いＲＯＸを有するＳＹＢＲ－グリーン（Ｅｎｚｙｎｏｍｉｃｓ）、ヌクレアーゼがない水（アンビオン）及び２μＬのｃＤＮＡを含有した。条件は、次の通りであった。９５℃で１０分の変性／活性化段階に続いて、９５℃で１５秒、５６℃で３０秒、７２℃で２０秒のサイクルを４０回繰り返した。ＳｔｅｐＯｎｅ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ機器（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で反応を行った。遺伝子発現の定量化は、それぞれのサンプルに対するＣＴ値に基づいた。
【0083】
形質感染及びレポーター分析
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムの３’ＵＴＲの２０８ｂｐ断片は、バイオニクスによって合成された。３’ＵＴＲ断片をＸｂａ Ｉで分解し、ｐＧＬ３－対照群（Ｐｒｏｍｅｇａ）においてホタルルシフェラーゼ遺伝子の下流に挿入してｐＧＬ３ｃｏｖｉ－３ＵＴＲ＿Ｌｕｃを収得した。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムの３’ＵＴＲの２０８ｂｐ断片は、バイオニクスによって合成された。３’ＵＴＲ断片をＸｂａ Ｉで分解し、ｐＧＬ３－対照群（Ｐｒｏｍｅｇａ）においてホタルルシフェラーゼ遺伝子の下流に挿入してｐＧＬ３ｃｏｖｉ－３ＵＴＲ＿Ｌｕｃを収得した。
【0084】
全ての構築物はシーケンシングによって確認された。ヒト神経芽細胞腫ＳＫ－Ｎ－ＢＥ（２）Ｃ細胞を、１０％ＦＢＳが補充されたＤＭＥＭで維持させた。全ての培養培地は、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン及び１００ｍｇ／ｍＬのストレプトマイシンを含有した。形質感染のために、細胞を形質感染１日前に抗生剤非含有のＤＭＥＭで２４ウェルプレートに１．２×１０５細胞／ウェルでプレーティングした。リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で形質感染を行った。ＤＮＡの総量は、ウェル当たり０．５μｇであり、内部対照群として０．２μｇのｐＧＬ３ｃｏｖｉ－３ＵＴＲ＿Ｌｕｃ及び０．３μｇのｐＲＳＶ βｇａｌで構成された。それぞれの形質感染はまた、標識されたｍｉＲＮＡを含有した。形質感染後、２４時間後、各ウェルからの細胞を、１００μＬの溶解緩衝剤（２５ｍＭの三リン酸［ｐＨ７．８］、２ｍＭのＤＴＴ、２ｍＭのＣＤＴＡ［１，２－ジアミノシクロヘキサン－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラ酢酸］、１０％グリセロール及び１％トリトンＸ－１００）で溶解させた。同じ体積のホタルルシフェラーゼ基質を添加し、ルシフェラーゼの活性をルミノメータープレートリーダーで測定し、βガラクトシダーゼ活性に対して正規化した。
【0085】
ＲＮＡシーケンシング及びデータ処理
ｓｍａｌｌ ＲＮＡ配列分析は、８種の異なる条件のｈｐＭＳＣ培地及び２つの胎盤組織抽出物から収得された細胞外小胞（ＥＶ）を用いて行った。シーケンシングは、北京遺伝体研究所（ＢＧＩ，Ｓｈｅｎｚｈｅｎ，Ｃｈｉｎａ）のＢＧＩＳｅｑ－５００で行われた。サブリードアライナ（ｓｕｂｒｅａｄ ａｌｉｇｎｅｒ）を用いてリードをヒト参照ゲノム（ＧＲＣｈ３８）に整列させ、ｍｉＲＮＡリードカウントを得るために、ｆｅａｔｕｒｅＣｏｕｎｔｓツールを用いた。ｍｉＲＮＡリード回数を標準化し、低発現ｍｉＲＮＡをｅｄｇｅＲ Ｒパッケージを用いて濾過した。それぞれのｍｉＲＮＡの発現をＣＰＭ（ｃｏｕｎｔｓ ｐｅｒ ｍｉｌｌｉｏｎ）で変形させた。ｑｒｑｃ Ｒパッケージを用いてリードの品質管理を行い、ｓＲＮＡｔｏｏｌｂｏｘを用いてｓｍａｌｌ ＲＮＡ頻度の分布を収得した。
ｓｍａｌｌ ＲＮＡ配列分析は、８種の異なる条件のｈｐＭＳＣ培地及び２つの胎盤組織抽出物から収得された細胞外小胞（ＥＶ）を用いて行った。シーケンシングは、北京遺伝体研究所（ＢＧＩ，Ｓｈｅｎｚｈｅｎ，Ｃｈｉｎａ）のＢＧＩＳｅｑ－５００で行われた。サブリードアライナ（ｓｕｂｒｅａｄ ａｌｉｇｎｅｒ）を用いてリードをヒト参照ゲノム（ＧＲＣｈ３８）に整列させ、ｍｉＲＮＡリードカウントを得るために、ｆｅａｔｕｒｅＣｏｕｎｔｓツールを用いた。ｍｉＲＮＡリード回数を標準化し、低発現ｍｉＲＮＡをｅｄｇｅＲ Ｒパッケージを用いて濾過した。それぞれのｍｉＲＮＡの発現をＣＰＭ（ｃｏｕｎｔｓ ｐｅｒ ｍｉｌｌｉｏｎ）で変形させた。ｑｒｑｃ Ｒパッケージを用いてリードの品質管理を行い、ｓＲＮＡｔｏｏｌｂｏｘを用いてｓｍａｌｌ ＲＮＡ頻度の分布を収得した。
【0086】
ｍｉＲＮＡ標的予測及び機能の分析
３’ＵＴＲでｍｉＲＮＡのバインディングサイトに対する調査のために、ＰＩＴＡツール（Ｋｅｒｔｅｓｚ外。２００７）を用いた。
３’ＵＴＲでｍｉＲＮＡのバインディングサイトに対する調査のために、ＰＩＴＡツール（Ｋｅｒｔｅｓｚ外。２００７）を用いた。
【0087】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２完全ゲノム配列（ＮＣ＿０４５５１２．２）は、ＮＣＢＩ基準配列のデータベース（Ｏ’ＬｅａｒｙＯ’Ｌｅａｒｙ ｅｔ ａｌ，２０１６）から収得し、３’ＵＴＲ配列は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２完全ゲノムから抽出された。
【0088】
我々は、ｍｉＲＮＡのバインディングサイトを予測するために、基本設定値のＰＩＴＡツールを用いた。
【0089】
新しいｍｉＲＮＡ結合サイトは、ｍｉＲＤＢユーザ指定予測ツール（Ｃｈｅｎ ａｎｄ Ｘｉａｏｗｅｉ，２０２０）によって予測された。
【0090】
ｍｉＲＮＡｓの生物学的機能を決定するために、ｍｉＲＴａｒＢａｓｅ（Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．２０２０）からｍｉＲＮＡｓの実験的に検証された標的を得、１％未満の小さな割合を構成するｍｉＲＮＡは分析から除外した。
【0091】
ｍｉＲＮＡの生物学的機能を調べるために、ＤＡＶＩＤ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ ６．８（Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００９）を用いてＧＯ ｔｅｒｍ及びＫＥＧＧ ｐａｔｈｗａｙ分析を行った。
【0092】
機能の分析結果は、Ｃｙｔｏｓｃａｐｅ ３．８及びＰａｔｈｖｉｅｗ Ｒパッケージを用いて視覚化した。
【0093】
ＡＣＥ２発現の分析
ヒト組織及び細胞株の発現データは、ヒトタンパク質アトラスデータベース（Ｈｕｍａｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｔｌａｓ ｄａｔａｂａｓｅ）から収得された（Ｕｈｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。発現データを用いて、各細胞又は組織類型のＡＣＥ２発現を調べた。
ヒト組織及び細胞株の発現データは、ヒトタンパク質アトラスデータベース（Ｈｕｍａｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｔｌａｓ ｄａｔａｂａｓｅ）から収得された（Ｕｈｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。発現データを用いて、各細胞又は組織類型のＡＣＥ２発現を調べた。
【0094】
保存されたｍｉＲＮＡ結合部位の分析
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２においてｍｉＲＮＡ結合部位の保存された領域を調べるために、ＮＣＢＩ参照配列データベースから３’ＵＴＲ配列を収得し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２と関連するウイルスの３’ＵＴＲ配列を用いた。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２においてｍｉＲＮＡ結合部位の保存された領域を調べるために、ＮＣＢＩ参照配列データベースから３’ＵＴＲ配列を収得し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２と関連するウイルスの３’ＵＴＲ配列を用いた。
【0095】
具体的には、ＳＡＲＳコロナウイルス（ＮＣ＿００４７１８．３）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＮＣ＿０４５５１２．２）、ＳＡＲＳコロナウイルスＢＪ０１（ＡＹ２７８４８８．２）、コウモリＳＡＲＳコロナウイルスＨＫＵ３－１（ＤＱ０２２３０５．２）、コウモリＳＡＲＳ類似コロナウイルスＳＬ－ＣｏＶＺＣ４５（ＭＧ７７２９３３．１）及びコウモリＳＡＲＳ類似コロナウイルスＳＬ－ＣｏＶＺＸＣ２１（ＭＧ７７２９３４．１）が用いられた。
【0096】
コロナウイルスの３’ＵＴＲシーケンスは、ＭＵＳＣＬＥツール（Ｅｄｇａｒ ｅｔ ａｌ．，２００４）を用いて整列され、ＭＵＳＣＬＥの分析に基本値が用いられた。
【0097】
統計分析
統計分析は、ＡＮＯＶＡに続いて、ＲでＴｕｋｅｙのＨＳＤ事後テストを用いて行われた。ヒートマップは、ｈｐＭＳＣ－ＥＶでｍｉＲＮＡのｌｏｇ２－ＣＰＭを発現し、ｇｐｌｏｔｓ Ｒパッケージを用いて生成された（Ｗａｒｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。ＧＯ用語分析及びＫＥＧＧ経路分析のＰ値は、Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ－Ｈｏｃｈｂｅｒｇ方法を用いた多重比較のために修正された。データは、平均の平均±標準誤差として提示され、ｐ値又は調整されたｐ値＜０．０５は有意のものと見なされた。
統計分析は、ＡＮＯＶＡに続いて、ＲでＴｕｋｅｙのＨＳＤ事後テストを用いて行われた。ヒートマップは、ｈｐＭＳＣ－ＥＶでｍｉＲＮＡのｌｏｇ２－ＣＰＭを発現し、ｇｐｌｏｔｓ Ｒパッケージを用いて生成された（Ｗａｒｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。ＧＯ用語分析及びＫＥＧＧ経路分析のＰ値は、Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ－Ｈｏｃｈｂｅｒｇ方法を用いた多重比較のために修正された。データは、平均の平均±標準誤差として提示され、ｐ値又は調整されたｐ値＜０．０５は有意のものと見なされた。
【0098】
以下では、前記の実験方法によって確認した本発明の効果について図面と共に詳細に説明する。ただし、このような説明は、本発明の理解を助けるためのもので、本発明が下記の実施例によって限定されるものではない。
【0099】
実施例１．ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに対する胎盤－ＥＶのｍｉＲＮＡのウイルス抑制のメカニズム
図１は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに対する胎盤－ＥＶのｍｉＲＮＡの抗ウイルス効果の作用メカニズムを示したものである。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する直接的な抗ウイルスメカニズムは、ｍｉＲＮＡがウイルスの３’ＵＴＲ、５’ＵＴＲまたはコーディング区域に直接結合することによって、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＮＡの下向き調節を誘導してなされる。また、間接的な治療効果として、サイトカインストームを抑制するために、炎症性ｍＲＮＡｓの発現の調節を含む。
図１は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに対する胎盤－ＥＶのｍｉＲＮＡの抗ウイルス効果の作用メカニズムを示したものである。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する直接的な抗ウイルスメカニズムは、ｍｉＲＮＡがウイルスの３’ＵＴＲ、５’ＵＴＲまたはコーディング区域に直接結合することによって、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＮＡの下向き調節を誘導してなされる。また、間接的な治療効果として、サイトカインストームを抑制するために、炎症性ｍＲＮＡｓの発現の調節を含む。
【0100】
すなわち、本発明では、間葉幹細胞（ＭＳＣ）由来のＥＶ及びこれに含まれたｍｉＲＮＡとタンパク質分子が、損傷した組織を再生し、ｍｉＲＮＡｓ及び抗炎症性環境を調節することを確認した。
【0101】
ｐＭＳＣから分離されたＥＶは、一般的なＥＶマーカーであるＣＤ６３に対して陽性であった（図２のＡ）。ＥＶのサイズは、ナノ粒子トラッキング分析（ＮＴＡ）及び透過電子顕微鏡検査法（ＴＥＭ）によって分析された。
【0102】
ナノ粒子トラッキング分析（ＮＴＡ）によって測定されたエクソソームの流体力学的直径は１２１．８ｎｍ（図２のＢ）であり、代表的なＴＥＭイメージは図２のＣに示した。ＥＶマーカーのウエスタンブロッティングによって分離されたＥＶの追加の特性は、ＣＤ８１、ＣＤ９、ａｎｎｅｘｉｎ Ａ２及びＨＳＰ７０のような典型的なＥＶマーカーを示した（図２のＤ）。
【0103】
実施例２．ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスと結合するｍｉＲＮＡの選別
ウイルスのゲノムがヒトｍｉＲＮＡによって標的とすることができるという事実に基づいて、本発明者は、ＥＶにあるｍｉＲＮＡがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の３’ＵＴＲと相互作用できるか否かを確認した。
ウイルスのゲノムがヒトｍｉＲＮＡによって標的とすることができるという事実に基づいて、本発明者は、ＥＶにあるｍｉＲＮＡがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の３’ＵＴＲと相互作用できるか否かを確認した。
【0104】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２の３’ＵＴＲには、ｍｉＲ－９２ａ－３ｐ、ｍｉＲ－２６ａ－５ｐ、ｍｉＲ－２３ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１０３ａ－３ｐ及びｍｉＲ－１８１ａ－５ｐに対するバインディングサイトが含まれている。
【0105】
具体的には、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２の３’ＵＴＲシーケンスを整列し、ＭｉｃｒｏＩｎｓｐｅｃｔｏｒソフトウェアを用いて配列を分析した。その結果、ＰＩＴＡソフトウェアによって総１８個のｍｉＲＮＡがＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２の３’ＵＴＲをターゲットとし（表１）、２７個のｍｉＲＮＡがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの全ゲノム部位に結合されると予測された（表２）。
【0106】
【表1】
【0107】
前記表１は、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２の３’ＵＴＲをターゲットとする１８個のｍｉＲＮＡの目録を示した。
【0108】
【表2】
【0109】
表２は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの全ゲノム部位に結合されると予測される２７個のｍｉＲＮＡの目録を示したものである。前記表２において、発現度（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ％）は、当該ｍｉＲＮＡ ＣＰＭ／総ｍｉＲＮＡ ＣＰＭで計算し、点数（ｓｃｏｒｅ）が高いほど結合可能性が高くなり、参考文献によれば、８０点以上の点数を示すと、実際に結合することができる。
【0110】
下記の表３では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のゲノム内の結合部位に関する情報及び結合予測の結果を示した。５個のｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ－９２ａ－３ｐ、ｍｉＲ－２６ａ－５ｐ、ｍｉＲ－２３ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１０３ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１８１ａ－５ｐ）は、熱力学エネルギーの点数とＰＩＴＡ及びｍｉＲＤＢの２つの予測ツールの高い点数に基づいて選択された。
【0111】
【表3】
【0112】
ＰＩＴＡを用いて、最終的に選定された５個のｍｉＲＮＡであるｍｉＲ－９２ａ－３ｐ、ｍｉＲ－２６ａ－５ｐ、ｍｉＲ－２３ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１０３ａ－３ｐ及びｍｉＲ－１８１ａ－５ｐがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の３’ＵＴＲに結合できる潜在的な結合サイトを予測した（図３のＡ及びＢ）。ＰＩＴＡを用いて、このようなｍｉＲＮＡｓのそれぞれの総自由エネルギーを得た。例えば、３‘ＵＴＲに対するｍｉＲ－１８１ａ－５ｐの結合エネルギーは、ｍｉｃｒｏＲＮＡ標的混成化エネルギーで－１８．７ｋｃａｌ／ｍｏｌであり、これは、ｍｉＲＮＡと３’ＵＴＲの結合が自発的に進行することを示唆する。低い結合熱力学エネルギー（ｋｃａｌ／ｍｏｌ）は、さらに強い結合を示す。
【0113】
次に、前記５個のｍｉＲＮＡがＥＶに存在するかを確認するために、ｑＰＣＲ分析を行った（図４）。その結果、ＥＶでのｍｉＲＮＡがｍｉＲ－９２ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１８１ａ－５ｐ、ｍｉＲ－２６ａ－５ｐ、ｍｉＲ－２３ａ－３ｐ及びｍｉＲ－１０３ａ－３ｐの順に高く発現されたことを確認した。すなわち、ｍｉＲ－９２ａ－３ｐ及びｍｉＲ－１８１ａ－５ｐの発現は、予測値と同じ順序で有意にさらに高かった。このような結果は、ＥＶが５個のｍｉＲＮＡを含んでいるので、それ自体でもＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する治療剤として使用できることを示唆するものである。
【0114】
実施例３．ＥＶ及びｍｉＲＮＡの直接的な抗ウイルス効果の確認
前記実施例２で選定したそれぞれの個別の特定のｍｉＲＮＡ又は５個のｍｉＲＮＡｓが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のゲノムと直接的に相互作用できるか否かを確認するために、ルシフェラーゼ分析を行った。
前記実施例２で選定したそれぞれの個別の特定のｍｉＲＮＡ又は５個のｍｉＲＮＡｓが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のゲノムと直接的に相互作用できるか否かを確認するために、ルシフェラーゼ分析を行った。
【0115】
ルシフェラーゼ－レポーター分析を行って、個別の特異的ｍｉＲＮＡ又は５個のｍｉＲＮＡのそれぞれがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のゲノムと直接的に相互作用できるかを確認した。
【0116】
ＰＣＲ断片をルシフェラーゼＯＲＦと合成ポリ（Ａ）配列との間のルシフェラーゼレポータープラスミドにクローニングした。組換えプラスミドは、ｐＧＬ３ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－３’－ＵＴＲ＿Ｌｕｃと命名された（図５のＡ）。次いで、組換えプラスミドをヒト神経芽細胞腫ＳＫ－Ｎ－ＢＥ（２）Ｃ細胞に形質感染させ、形質感染４８時間後にルシフェラーゼ活性を測定した。
【0117】
図５Ｂに示されたように、組換えプラスミドで形質感染されたＳＫ－Ｎ－ＢＥ（２）Ｃ細胞での相対的なルシフェラーゼ活性は、空のｐｓｉ－ｃｏｎｔｒｏｌベクターで形質感染された細胞のものに比べて非常に減少した（ｐｓ＜０．０００１）。
【0118】
具体的には、相対的なルシフェラーゼ活性は、コロナウイルスの３’ＵＴＲが５個のｍｉＲＮＡ又は５個のｍｉＲＮＡのそれぞれの発現ベクターでＤＦ－１細胞に同時形質感染されたとき、下向き調節された。このような結果から、ｐｓｉ－５９ＵＴＲのルシフェラーゼ活性の著しい減少を確認した。
【0119】
前記実験の結果は、ｍｉＲ－９２ａ－３ｐ、ｍｉＲ－２６ａ－５ｐ、ｍｉＲ－２３ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１０３ａ－３ｐ及びｍｉＲ－１８１ａ－５ｐが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の３’ＵＴＲに結合して有意なサイレンシングを誘発することを意味する。
【0120】
このような結果に基づいて、５個のｍｉＲＮＡは、いずれも、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の３’ＵＴＲに直接結合することを確認し、ｍｉＲ－９２ａ－３ｐ、ｍｉＲ－２６ａ－５ｐ、ｍｉＲ－２３ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１０３ａ－３ｐ及びｍｉＲ－１８１ａ－５ｐで構成された群から１つ以上選択されたｍｉＲＮＡは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスゲノムを分解できるので、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の感染を抑制することを確認した。
【0121】
実施例４．様々なコロナウイルス及び他のウイルスに対する直接的な抗ウイルス能の確認
コロナウイルスのファミリーにわたって３’ＵＴＲ配列が保存され、ｍｉＲＮＡ標的部位が全てのコロナウイルスにわたって保存されるという仮説を確認するために、５個のコロナウイルスを無作為に選択し、３’ＵＴＲ領域のシーケンスをＭＵＳＣＬＥツールを用いて比較した。
コロナウイルスのファミリーにわたって３’ＵＴＲ配列が保存され、ｍｉＲＮＡ標的部位が全てのコロナウイルスにわたって保存されるという仮説を確認するために、５個のコロナウイルスを無作為に選択し、３’ＵＴＲ領域のシーケンスをＭＵＳＣＬＥツールを用いて比較した。
【0122】
図６のＡに示されたように、５個のコロナウイルスの３’ＵＴＲは、ほとんど保存されて変異の程度が大きくなく、特に、５個のｍｉＲＮＡｓと結合すると予想される結合部位（赤いボックスで表示）も非常に良好に保存されたことを確認した。
【0123】
すなわち、様々なコロナウイルスの３’ＵＴＲを確認した結果、３’ＵＴＲには突然変異がほとんど発生せず、ｍｉＲＮＡの結合率が高いという点を勘案すると、５個の選択されたｍｉＲＮＡは、突然変異によって新たに生成されたウイルスにも適用され得る普遍的なウイルス抑制能力を有するようになると思われる。
【0124】
また、ＥＶの様々なｍｉＲＮＡは、既に他のウイルスと相互作用することが知られている（図６のＢ）。
【0125】
具体的には、ｍｉＲ－１５０－５ｐ、ｍｉＲ－２２３－３ｐ及びｍｉＲ－２９－３ｐは、ＨＩＶと相互作用することによって、ウイルス翻訳及び最後のレイテンシーＴ細胞を抑制することが立証された。
【0126】
ｍｉＲ－２３ｂ－３ｐは、エンテロウイルス７１の翻訳をブロックし、Ｌｅｔ－７ｃ－５ｐは、インフルエンザウイルスに重要なマトリックスタンパク質を減少させることが知られている。
【0127】
ｍｉＲ－１８１ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１８１ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－２３ａ－３ｐ、ｍｉＲ－２３ｂ－３ｐ及びｍｉＲ－３７８ａ－３ｐは、ブタ生殖器呼吸器症候群ウイルスを分解する。
【0128】
ｍｉＲ－１２２－５ｐ及びｌｅｔ－７ｃ－５ｐは、それぞれ、Ｃ型肝炎ウイルス及びウシウイルス性下痢ウイルスを抑制する。
【0129】
すなわち、ＥＶ及びＥＶに含まれた様々なｍｉＲＮＡは、様々なウイルス及び突然変異の頻度が低い３’ＵＴＲに結合することによって抑制効果を示すところ、このような結果は、ＥＶが様々なウイルス感染に対する一般的な治療及び予防治療剤として使用され得ることを示唆するものである。
【0130】
実施例５．ＥＶ及びｍｉＲＮＡの間接的な抗ウイルス効果の確認
コロナウイルスを始めとする呼吸器システムを感染させるウイルスは、ＡＣＥ２受容体を発現する細胞に浸透して細胞損傷を引き起こし得る。
コロナウイルスを始めとする呼吸器システムを感染させるウイルスは、ＡＣＥ２受容体を発現する細胞に浸透して細胞損傷を引き起こし得る。
【0131】
ＡＣＥ２受容体は、主に肝、腎臓、男性生殖組織、筋肉組織、そして、胃腸管に存在するため、このような対象臓器がウイルスによって損傷し得る。最近、臨床研究において、多数の患者が肝損傷や器官損傷が多く発生していることから見て、このような主張を裏付ける。
【0132】
中国の武漢の子供病院の重患者室で治療中のＣＯＶＩＤ－１９患者８名のうち６名は、Ｃ反応性タンパク質、プロカルシトニン及び脱水素酵素が増加した。そして、８名のうち４名が異常な肝機能を示した。これらの患者のうち３名からは、サイトカインストームが発見され、重症患者でさらに深刻なものと示された。
【0133】
他の研究は、６５１名の患者のうち７４名（１１．４％、平均年齢４６．１４才）が、吐き気、嘔吐または下痢のような少なくとも１つの胃腸管（ＧＩ）症状を示し、１０．８％は、肝疾患を患っていることが確認された。
【0134】
また、７４名のＣＯＶＩＤ－１９患者のうち２９名（３９．１９％）が高熱（３８．５℃）、２３名（３１．０８％）が疲労、８名（１０．８１％）が呼吸困難、１６名（２１．６２％）が頭痛を訴えた。
【0135】
このような結果から推察できるように、ＡＣＥ２受容体は、ＬＬ２４（肺線維芽細胞）、ＢＥＡＳ－２Ｂ細胞（ＧＩ上皮細胞）及び肝細胞から発現された。また、Ｂｒａｉｎ Ａｔｌａｓデータベースによって明らかになったように、脳でのＡＣＥ２の発現レベルについては十分に研究されておらず、実際にその発現レベルが低くても、前記臨床結果に基づいて考慮すると、脳がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の標的器官である可能性が高いと予想した。これと類似に、脳腫瘍細胞ではＡＣＥ２が高く発現されるので、このような点は、脳細胞がウイルスのターゲットとなり得ることを示唆する。
【0136】
したがって、様々なＥＶ由来のｍｉＲＮＡの間接的な抗ウイルス効果を確認するために、肝細胞、ＧＩ細胞及び脳細胞のようなＳＡＲＳ－ＣＯＶ２による過免疫反応を経ると予想される細胞を対象として実験を行った。
【0137】
具体的な実験方法及び細胞培養方法などは、前述した通りであり、簡略に説明すると、細胞株にＥＶ及びｍｉＲＮＡを処理した後、２４時間後にＬＰＳを処理して、ＥＶ及びｍｉＲＮＡの保護効果を確認し、逆に、ＬＰＳを先に処理した後、２４時間後にＥＶ及びｍｉＲＮＡを処理することによって回復効果を確認した（図７）。
【0138】
実施例６．ＥＶ及びｍｉＲＮＡの抗炎症及びサイトカインストーム抑制効果
ＢＥＡＳ－２Ｂ（胃腸管の上皮細胞）、ＬＬ２４（肺細胞株）、ＨｅｐＧ２（肝癌細胞株）、ＭＥＦ（線維芽細胞）、ＢＶ２（ミクログリア細胞株）及びＭ２（ニューロン細胞）を対象として、ＬＰＳ及びＥＶの処理の有無を異ならせて、ＥＶ及びｍｉＲＮＡの抗炎症及びサイトカインストーム抑制効果を実験し、その結果を図８乃至図１２に示した。
ＢＥＡＳ－２Ｂ（胃腸管の上皮細胞）、ＬＬ２４（肺細胞株）、ＨｅｐＧ２（肝癌細胞株）、ＭＥＦ（線維芽細胞）、ＢＶ２（ミクログリア細胞株）及びＭ２（ニューロン細胞）を対象として、ＬＰＳ及びＥＶの処理の有無を異ならせて、ＥＶ及びｍｉＲＮＡの抗炎症及びサイトカインストーム抑制効果を実験し、その結果を図８乃至図１２に示した。
【0139】
ＢＥＡＳ－２Ｂ（胃腸管の上皮細胞）にＥＶを処理した後、ＬＰＳを処理して保護効果を確認した結果を図８のＡに示した。その結果、炎症性因子であるＩＬ－１、ＩＬ－６、ＩＬ－８及びＴＮＦ－ａはいずれも、ＥＶを処理していない場合と比較して、相対的発現が著しく減少することを確認した。
【0140】
また、図８のＢに示されたように、５個のｍｉＲＮＡをそれぞれ処理した後にＬＰＳを処理して保護効果を確認した。その結果、ｍｉＲＮＡ １８１ａを処理した場合、ＩＬ－１、ＩＬ－６及びＩＬ－８の発現が著しく減少することを確認した。
【0141】
ＬＬ－２４にＥＶを処理する場合の保護及び回復効果を確認した結果を図９のＡに示した。その結果、ＥＶを処理する場合、炎症性因子であるＩＬ－１、ＩＬ－６及びＩＬ－８はいずれも、その発現が著しく減少して、保護及び回復効果がいずれも優れることを確認した。特に回復効果が非常に優れることを確認した。
【0142】
また、図９のＢに示されたように、５個のｍｉＲＮＡをそれぞれＬＬ－２４に処理した後、ＬＰＳを処理して保護効果を確認した。その結果、ｍｉＲＮＡ－１８１ａを処理した場合、ＩＬ－６の発現が対照群と同じレベルに著しく減少することを確認した。
【0143】
ＭＥＦ（線維芽細胞）及びＢＶ２（ミクログリア細胞株）の保護及び回復効果を確認した結果を、図１０のＡ及びＢにそれぞれ示した。ＭＥＦ及びＢＶ２の両方とも、ＥＶ処理によって、炎症因子であるＩＬ－１、ＩＬ－６及びＴＮＦ－ａが著しく減少することを確認した。
【0144】
ニューロン細胞であるＭ２にＥＶを処理した後の炎症関連因子の発現レベルを確認した結果を図１１に示した。その結果、ＩＬ－１のみが著しい効果を示すことを確認した。
【0145】
図１２は、ＰＫＨ２６で標識したＥＶを前記各細胞株に処理する前後の様子を撮影したもので、ＥＶが各細胞と成功裏に結合（ｆｕｓｉｏｎ）された様子を確認した。
【0146】
すなわち、前記の結果を総合してみると、本発明のＥＶ及びＥＶに含まれたｍｉＲＮＡは、それぞれ又はすべてが共に炎症性因子の発現を抑制する効果を示すので、抗炎効果を示すだけでなく、過剰免疫反応であるサイトカインストームを抑制できる効果を有することを確認した。
【0147】
実施例７．ＥＶ及びｍｉＲＮＡのウイルス感染症の治療効果
本発明のＥＶ及びｍｉＲＮＡは、直接及び間接的な経路をいずれも用いてウイルス及びウイルス感染症状を治療又は改善することができる（図１３）。
本発明のＥＶ及びｍｉＲＮＡは、直接及び間接的な経路をいずれも用いてウイルス及びウイルス感染症状を治療又は改善することができる（図１３）。
【0148】
本発明者らは、前記の各種実験を通じて、胎盤、へその緒、臍帯血、胎盤由来のＥＶ、及びこれらの組織から得られた幹細胞（ｐＭＳＣ）及びこれらに由来するＥＶが、肺の病理学的損傷だけでなく、他の類型の肺炎及びウイルス感染症を大きく改善できることを確認した。
【0149】
特に、ＥＶは、幹細胞の再生効果因子を含有しているので、肺炎の治療において間葉幹細胞と類似の治療メカニズムを発揮するが、遥かに安全であると見なされる。
【0150】
具体的には、間葉幹細胞を静脈内投与すると、塞栓症、血液の凝集を誘発し得るが、ＥＶは、２００ｎｍ～１０８ｎｍのサイズにより、幹細胞よりも非常に安全であり、ＥＶ自体が幹細胞よりもさらに安定的であり、貯蔵しやすく、悪性又は有害細胞に転換されず、免疫反応を引き起こす可能性が少ないという利点がある。
【0151】
また、本発明の実験結果を通じて、組織－ＥＶ（ｔｉｓｓｕｅ－ＥＶ）、組織抽出物のＥＶ（ｔｉｓｓｕｅ ｅｘｔｒａｃｔ ＥＶ）及びｐＭＳＣ－ＥＶに含まれたｍｉＲＮＡがウイルスゲノムに直接結合してＲＮＡウイルスの転写を抑制することによって、増殖を抑制できるということを確認した。
【0152】
ＥＶのｍｉＲＮＡの他の重要な機能として、様々なＥＶに存在する７７個のｍｉＲＮＡは、免疫反応を刺激するｍＲＮＡを標的とするため、ウイルスによって転写されるＲＮＡ（Ｖｉｒａｌ ＲＮＡｓ）を除去する効果を示すことができ、直接的な抗ウイルス効果のみならず、間接的な効果も非常に強力である。
【0153】
また、本発明のｍｉＲＮＡは、Ｖｉｒａｌ ＲＮＡと結合するだけでなく、前炎症性遺伝子と相互作用することによって、炎症性因子の発現を著しく抑制することによってサイトカインストームを解決することができる。
【0154】
また、本発明のｍｉＲＮＡは、ＩＦＮ－α／βのレベルを上向き調節できる効果を示すので、ＩＦＮ－α／β信号経路を抑制してホスト免疫反応を回避するウイルスの感染を抑制することができる。
【0155】
そして、様々なＥＶのｍｉＲＮＡ１８個は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の３’ＵＴＲと直接的に相互作用し、ＥＶに由来する１５個の主要なｍｉＲＮＡがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を成功裏に抑制するということを立証した。
【0156】
コロナウイルスに感染した何人かの患者は、呼吸器関連の主要な現象以外に、肝損傷及び胃腸損傷が現れた。武漢にあるＪｉｎｙｉｎｔａｎ病院にいる９９名の患者のうち４３名は肝機能が損傷し、その中で１名は、肝が非常にひどく損傷した。軽症患者の肝機能の損傷は明らかでないが、重症患者では、主要な肝数値であるアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アスパルテートアミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の数値が悪化した。
【0157】
したがって、直接的なウイルスの抑制能だけでなく、胎盤、へその緒、臍帯血由来のＥＶが保有している抗炎症などの効果がシナジー効果を発揮することができるため、胎盤由来のＥＶをコロナウイルスの治療剤として使用すれば、著しく優れた治療効果を示すものと期待される。
【0158】
前述した本発明の説明は例示のためのものであり、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者は、本発明の技術的思想や必須の特徴を変更せずに他の具体的な形態に容易に変形可能であるということを理解できるであろう。したがって、以上で記述した実施例は、すべての面で例示的なものであり、限定的なものではないと理解しなければならない。例えば、単一型で説明されている各構成要素は分散して実施されてもよく、同様に、分散したものと説明されている構成要素も結合された形態で実施されてもよい。
【0159】
本発明の範囲は、後述する特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲の意味及び範囲、そしてその等価概念から導かれるすべての変更又は変形された形態が本発明の範囲に含まれるものと解釈しなければならない。
＜付記＞
本発明は以下の態様を含む。
＜項１＞
少なくとも１つの担体、賦形剤又は希釈剤と共に、胎盤、へその緒又は臍帯血から抽出した生体分子を含む、無細胞組成物（ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）。
＜項２＞
前記生体分子は、胎盤及び胎盤由来の間葉幹細胞（ｐｌａｃｅｎｔａｌ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ、ｐＭＳＣ）に由来する細胞外小胞（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｖｅｓｉｃｌｅ、ＥＶ）である、項１に記載の無細胞組成物。
＜項３＞
前記生体分子は、胎盤由来の間葉幹細胞（ｐＭＳＣ）の細胞外小胞（ＥＶ）に含まれたｍｉＲＮＡである、項１に記載の無細胞組成物。
＜項４＞
前記ｍｉＲＮＡは、ｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－９２ｂ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８１ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２６ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２３ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２５ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２５ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０３ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２２３－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２５－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２６ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９３ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１３０７－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５５－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８５－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４２４－３ｐ及びｈｓａ－ｍｉＲ－２３ｂ－３ｐで構成された群から１つ以上選択されたものである、項３に記載の無細胞組成物。
＜項５＞
前記無細胞組成物に含まれる生体分子は、前記細胞外小胞及び前記ｍｉＲＮＡから１つ以上選択されたものである、項３に記載の無細胞組成物。
＜項６＞
項１～５のいずれか一項に記載の無細胞組成物を含む、抗ウイルス組成物。
＜項７＞
前記ウイルスは、コロナウイルス、ＨＩＶ、インフルエンザ、エンテロウイルス、ブタ生殖器呼吸器症候群ウイルス（Ｐｏｒｃｉｎｅ ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ａｎｄ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｖｉｒｕｓ）、Ｃ型肝炎ウイルス及びウシウイルス性下痢ウイルス（Ｂｏｖｉｎｅ ｖｉｒａｌ ｄｉａｒｒｈｅａ ｖｉｒｕｓ）からなる群から１つ以上選択されたものである、項６に記載の抗ウイルス組成物。
＜項８＞
前記コロナウイルスは、コロナ１９ウイルス（ＮＭＣ－ｎＣｏＶ０２）またはＳＡＲＳコロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）である、項７に記載の抗ウイルス組成物。
＜項９＞
項６に記載の抗ウイルス組成物を含む、ウイルス感染症の予防又は治療用薬学的組成物。
＜項１０＞
前記ウイルス感染症はコロナウイルス感染によるものである、項９に記載のウイルス感染症の予防又は治療用薬学的組成物。
＜項１１＞
項６に記載の抗ウイルス組成物を含む、ウイルス感染症の予防又は改善用食品組成物。
＜項１２＞
項１～３のいずれか一項に記載の無細胞組成物を含む、抗炎症用組成物。
＜付記＞
本発明は以下の態様を含む。
＜項１＞
少なくとも１つの担体、賦形剤又は希釈剤と共に、胎盤、へその緒又は臍帯血から抽出した生体分子を含む、無細胞組成物（ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）。
＜項２＞
前記生体分子は、胎盤及び胎盤由来の間葉幹細胞（ｐｌａｃｅｎｔａｌ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ、ｐＭＳＣ）に由来する細胞外小胞（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｖｅｓｉｃｌｅ、ＥＶ）である、項１に記載の無細胞組成物。
＜項３＞
前記生体分子は、胎盤由来の間葉幹細胞（ｐＭＳＣ）の細胞外小胞（ＥＶ）に含まれたｍｉＲＮＡである、項１に記載の無細胞組成物。
＜項４＞
前記ｍｉＲＮＡは、ｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－９２ｂ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８１ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２６ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２３ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２５ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２５ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０３ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２２３－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２５－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２６ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９３ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１３０７－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５５－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８５－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４２４－３ｐ及びｈｓａ－ｍｉＲ－２３ｂ－３ｐで構成された群から１つ以上選択されたものである、項３に記載の無細胞組成物。
＜項５＞
前記無細胞組成物に含まれる生体分子は、前記細胞外小胞及び前記ｍｉＲＮＡから１つ以上選択されたものである、項３に記載の無細胞組成物。
＜項６＞
項１～５のいずれか一項に記載の無細胞組成物を含む、抗ウイルス組成物。
＜項７＞
前記ウイルスは、コロナウイルス、ＨＩＶ、インフルエンザ、エンテロウイルス、ブタ生殖器呼吸器症候群ウイルス（Ｐｏｒｃｉｎｅ ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ａｎｄ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｖｉｒｕｓ）、Ｃ型肝炎ウイルス及びウシウイルス性下痢ウイルス（Ｂｏｖｉｎｅ ｖｉｒａｌ ｄｉａｒｒｈｅａ ｖｉｒｕｓ）からなる群から１つ以上選択されたものである、項６に記載の抗ウイルス組成物。
＜項８＞
前記コロナウイルスは、コロナ１９ウイルス（ＮＭＣ－ｎＣｏＶ０２）またはＳＡＲＳコロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）である、項７に記載の抗ウイルス組成物。
＜項９＞
項６に記載の抗ウイルス組成物を含む、ウイルス感染症の予防又は治療用薬学的組成物。
＜項１０＞
前記ウイルス感染症はコロナウイルス感染によるものである、項９に記載のウイルス感染症の予防又は治療用薬学的組成物。
＜項１１＞
項６に記載の抗ウイルス組成物を含む、ウイルス感染症の予防又は改善用食品組成物。
＜項１２＞
項１～３のいずれか一項に記載の無細胞組成物を含む、抗炎症用組成物。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
