特許 7486987 ニトロ化タンパク質分解剤

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-05-10

(45)【発行日】2024-05-20

(54)【発明の名称】ニトロ化タンパク質分解剤

(51)【国際特許分類】

   A61K 36/185 20060101AFI20240513BHJP

   A23L 33/105 20160101ALI20240513BHJP

   A61K 8/9789 20170101ALI20240513BHJP

   A61P 9/10 20060101ALI20240513BHJP

   A61P 17/00 20060101ALI20240513BHJP

   A61P 17/16 20060101ALI20240513BHJP

   A61P 39/02 20060101ALI20240513BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240513BHJP

   A61Q 19/02 20060101ALI20240513BHJP

   A61Q 19/08 20060101ALI20240513BHJP

【ＦＩ】

A61K36/185

A23L33/105

A61K8/9789

A61P9/10

A61P9/10 101

A61P17/00

A61P17/16

A61P39/02

A61P43/00 111

A61Q19/02

A61Q19/08

【請求項の数】 2

(21)【出願番号】P 2020046373

(22)【出願日】2020-03-17

(65)【公開番号】P2021147335

(43)【公開日】2021-09-27

【審査請求日】2022-09-27

(73)【特許権者】

【識別番号】591230619

【氏名又は名称】株式会社ナリス化粧品

(72)【発明者】

【氏名】齊藤 奈緒美

【審査官】菊池 美香

(56)【参考文献】

【文献】中国特許出願公開第１０４１１６６６８（ＣＮ，Ａ）

【文献】特開２００３－１９２６０１（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２００６－１３７６９６（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２００６－１０４３９６（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２０１８－１９３４０７（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２０１３－１３３３０３（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２０２１－１３０６２５（ＪＰ，Ａ）

【文献】Nigerian Journal of Physiological Sciences，2017年，32(1)，pp. 97-104

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ａ６１Ｋ ３６／１８５

Ａ２３Ｌ ３３／１０５

Ａ６１Ｋ ８／９７８９

Ａ６１Ｐ ９／１０

Ａ６１Ｐ １７／００

Ａ６１Ｐ １７／１６

Ａ６１Ｐ ３９／０２

Ａ６１Ｐ ４３／００

Ａ６１Ｑ １９／０２

Ａ６１Ｑ １９／０８

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＮＡＰＲＡＬＥＲＴ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ハイビスカス（学名：Ｈｉｂｉｓｃｕｓ ｓａｂｄａｒｉｆｆａ Ｌ．）抽出物を含有するニトロ化タンパク質分解剤（但し、脳虚血疾患に対する保護剤、およびアテローム性動脈硬化症予防剤を除く）。

【請求項2】

ハイビスカス（学名：Ｈｉｂｉｓｃｕｓ ｓａｂｄａｒｉｆｆａ Ｌ．）抽出物を含有するニトロチロシン分解剤（但し、脳虚血疾患に対する保護剤、およびアテローム性動脈硬化症予防剤を除く）。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ニトロ化タンパク質分解に関し、更に詳しくはハイビスカス抽出物を含有するニトロ化タンパク質分解剤、ニトロチロシン分解剤、黄くすみ改善剤に関する。

【背景技術】

【0002】

タンパク質のニトロ化とは、生体内で発生した活性窒素種によって生じるタンパク質翻訳後修飾のひとつであり、タンパク質を構成する芳香族アミノ酸のチロシン、トリプトファンの残基中のベンゼン環にニトロ基が付与されたものである。ニトロ化反応はアミノ酸中のベンゼン環が、活性窒素種により形成されるニトロニウムイオン（ＮＯ^２＋）や二酸化窒素ラジカルなどと求電子置換反応をおこすことで生じる（非特許文献１）。生体内に存在する多くのタンパク質中のトリプトファンの含有率はチロシンのそれよりもはるかに小さく、タンパク質のニトロ化反応は主にチロシン残基に生じると考えられている（非特許文献２）。タンパク質のニトロ化が起きると、酵素やチロシンキナーゼ型受容体の機能低下を引き起こすことで、細胞機能に影響を及ぼすことが知られる（非特許文献３）。また、タンパク質中のニトロチロシンは加齢に伴う数々の疾患（動脈硬化や脳虚血疾患など）で蓄積することが知られており、これらの疾患に関与することが報告されている（非特許文献４）。

【0003】

皮膚では加齢に伴い、シワ、たるみ、シミ、くすみ等の変化が生じる。くすみにはさまざまな種類があり、透明感の減少によるくすみ（皮膚表面の凹凸による影によるもの、角層肥厚による光透過性の低下によるもの、皮膚表面での乱反射によるつやの低下によるものなど）、皮膚の赤みの低下によるくすみ（血行不良による）、皮膚の色ムラによるくすみ（メラニンの不均一性）、加齢に伴う皮膚の黄みの増加によるくすみなどがある（非特許文献５）。中でも加齢に伴う皮膚色の黄み（ｂ＊）の増加は、黄ぐすみとして知られ、老化に伴う特徴的な皮膚の色調変化である。従来、黄ぐすみの主な原因は、真皮中に存在するエラスチンやコラーゲン等のタンパク質の糖化物（特許文献１）やタンパク質のカルボニル化物（特許文献２）であると考えられていたが、本願発明者は真皮中タンパク質だけではなく、角層中に存在するタンパク質を構成するアミノ酸がニトロ化されることによって生じるニトロ化タンパク質も大きな原因であることを解明した（特許文献３、非特許文献６）。これら糖化、カルボニル化、ニトロ化等、タンパク質の翻訳後修飾はすべてその生成および分解機序が異なるため、効果的に黄ぐすみを改善するためにはそれぞれの要因に対処する必要がある。

【0004】

なかでも、ニトロ化タンパク質に対しては、ニトロ化タンパク質の生成に伴う各種疾患を改善するため、ペルオキシナイトライトを消去する効果成分の提案や（特許文献４）や、チオール基をもつ物質によるペルオキシナイトライト補足する効果成分の提案（特許文献５）がなされてきた。しかしながら、これらはすべて専らニトロ化タンパク質の生成を抑制するのみであり、出来てしまったニトロ化タンパク質に対しては何らの改善もされておらず、ニトロ化タンパク質の生成に伴う各種疾患の根本的な解決に至っていなかった。そのような状況の中、本願発明者は碁石茶（登録商標）抽出物にニトロ化タンパク質分解効果を見出し、これを肌に適用することでニトロ化タンパク質の存在に伴う黄ぐすみを改善できることを見出した（特許文献３、非特許文献６）。

【0005】

一方、ハイビスカスはアオイ科フヨウ属の植物であり、この抽出物には抗酸化作用のほか、糖化物生成抑制作用（特許文献６）、カルボニル化物生成抑制作用（特許文献７）等が知られているが、既に生成してしまったこれらタンパク質の翻訳語修飾を分解する効果については報告されておらず、ましてやニトロ化タンパクの分解効果については全く知られていなかった。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0006】

【文献】Ｃｈｅｍ Ｒｅｓ Ｔｏｘｉｃｏｌ．、２２（５）：８９４－８９８、２００９

【文献】Ｆｒｏｎｔ Ｃｈｅｍ．、３：７０、２０１６

【文献】Ｄｉａｂｅｔｅｓ、５７（４）：８８９－９８、２００８

【文献】Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９０（５４９３）：９８５－９、２０００

【文献】日本化粧品工業連合会技術資料、１０１、１４８、１９９５

【文献】ＦＲＡＧＲＡＮＣＥ ＪＯＵＲＮＡＬ、ｖｏｌ．４５／Ｎｏ．８、２０１７

【特許文献】

【0007】

【文献】特開２０１３－１３３３０３号

【文献】特開２０１２－３２２８７号

【文献】特開２０１７－１８１４２３号

【文献】特開２００２－３２６９２２号

【文献】特開２００５－１７０８４９号

【文献】特開平１１－１０６３３６号

【文献】特開２００６－１６０６３０号

【発明の概要】

【0008】

本願発明者は、ニトロ化タンパク質の生成に伴う各種疾患を根本的に解決するには、単にその生成を抑制するのではなく、出来てしまったニトロ化タンパク質を分解することこそが、効果的な解決につながるとの結論に至った。更にはハイビスカス抽出物によって当該ニトロ化タンパク質を直接的に分解できることを突き止め、発明完成に至った。

【発明が解決しようとする課題】

【0009】

本発明は、既に生成してしまったニトロ化タンパク質を直接的に分解する優れた成分を提供することを課題とする。

【課題を解決するための手段】

【0010】

本発明者は、ハイビスカス抽出物を用いることで上記課題を解決した。

【発明の効果】

【0011】

本願発明によれば、既に生成してしまったニトロ化タンパク質を直接的に分解することが出来、ニトロ化タンパク質に起因する動脈硬化や脳虚血疾患、細胞機能低下、黄ぐすみ等の各種症状を改善することが出来る。

【発明を実施するための形態】

【0012】

本発明で使用するハイビスカスは、アオイ科フヨウ属の植物（学名：Ｈｉｂｉｓｃｕｓ ｓａｂｄａｒｉｆｆａ Ｌ．）であれば特に限定はされない。例えばローゼル（Ｈｉｂｉｓｃｕｓ ｓａｂｄａｒｉｆｆａ Ｌ．）、ムクゲ（Ｈｉｂｉｓｃｕｓ ｓｙｒｉａｃｕｓ）、フヨウ（Ｈｉｂｉｓｃｕｓ ｍｕｔａｂｉｌｌｓ）、モミジアオイ（Ｈｉｂｉｓｃｕｓ ｃｏｃｃｉｎｅｕｓ）、オオハマボウ（Ｈｉｂｉｓｃｕｓ ｔｉｌｉａｃｅｕｓ）、ブッソウゲ（Ｈｉｂｉｓｃｕｓ ｓｃｈｉｚｏｐｅｔａｌｕｓ）などが挙げられる。使用する部位は、特に限定されない。例えば、花弁、子実、茎、葉、根又は全草を用いることができる。

【0013】

ここで前記抽出物を得る方法としては公知の方法が利用できる。抽出物の調製は特に限定されないが、例えば植物抽出物は上記ハイビスカスを、好ましくは乾燥末化したものを種々の適当な有機溶媒を用いて、低温下から加温下で抽出される。抽出溶媒としては、例えば、水；メチルアルコール、エチルアルコール等の低級１価アルコール；グリセリン、プロピレングリコール、１，３－ブチレングリコール等の液状多価アルコール；アセトン、メチルエチルケトン等のケトン；酢酸エチルなどのアルキルエステル；ベンゼン、ヘキサン等の炭化水素；ジエチルエーテル等のエーテル類；ジクロルメタン、クロロホルム等のハロゲン化アルカン等の１種または２種以上を用いることが出来る。就中、水、エチルアルコール、１，３－ブチレングリコールの１種または２種以上の混合溶媒が特に好適である。

【0014】

本発明に用いることのできるハイビスカス抽出物の抽出方法は特に限定されない。ハイビスカスの任意の部位をそのまま、又は予め裁断して小片状で、乾燥後粉砕して粉末状にしてから抽出することができる。例えば乾燥したものであれば重量比で１～１０００倍量、特に１０～１００倍量の溶媒を用い、常温抽出の場合には、０℃以上、特に２０℃～４０℃で１時間以上、特に３～７日間行うのが好ましい。また、６０～１００℃で１時間、加熱抽出しても良い。また、１０℃以下の抽出溶媒が凍結しない程度の温度で、１時間以上、特に１～７日間抽出を行なっても良い。

【0015】

上記の如く得られたハイビスカス抽出物は、必要に応じて活性炭又は活性白土、スチレン－ジビニルベンゼン系合成吸着剤（ＨＰ－２０：三菱化成社製）やオクタデシルシラン処理シリカ（Ｃｈｒｏｍａｔｏｒｅｘ ＯＤＳ：富士シリシア化学製）等により精製することができ、濃縮、粉末化したものを適宜使い分けて用いることが出来る。配合量は目的に応じ、乾燥重量に換算して０．０００１重量％～１００重量％を任意に使用することができる。好ましい配合量としては、０．０１重量％～１０重量％、更に好ましい配合量としては、０．０５重量％～５重量％である。

【0016】

本発明の各剤は、本発明の効果を損なわない範囲で、その他成分を併用することができる。

【実施例】

【0017】

以下、本発明を実施例について具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。また、特記しない限り配合量は質量％で示す。また、特記しない限りエタノールは試薬特級（９９．５％）を用いた。

【0018】

＜被験物質の調製＞
乾燥植物原体に１０倍の重量の３０（ｖ／ｖ）％エタノール水溶液を加えて６０℃、８時間加熱抽出した。抽出物の乾燥残分に対して、エタノール、水を重量比で１：２５：７４となるように加えて希釈したものを被験物質とした。なお用いた植物原体は、碁石茶（登録商標）、ハイビスカス花弁、ローズマリー葉、レモングラス茎、トルメンチラ根茎、スイカズラ花弁である。対照物質には、植物原体の溶解溶媒のみを用いた。

【0019】

＜ニトロ化タンパク質分解活性試験＞
ニトロ化タンパク質の構成アミノ酸である３－ニトロチロシンをＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）に溶解し、５０ｍｇ／Ｌ濃度の溶液を調製した。ＰＢＳまたは３－ニトロチロシン溶液を９６ｗｅｌｌ－ｐｌａｔｅに２５０μＬずつ分注し、被験物質および対照物質を各ｗｅｌｌに終濃度が１００ｐｐｍになるよう添加した。３７℃で７２時間インキュベートしたのち、プレートリーダーにて４５０ｎｍの吸光度を測定した。

【0020】

【数1】

【0021】

【表1】

【0022】

表１より、既にニトロ化タンパク質分解作用が確認されている碁石茶の抽出物では、ニトロ化タンパク質の構成アミノ酸であるニトロチロシンの分解率は１４％程度であったのに対し、ローズマリー、レモングラス、トルメンチラの抽出物では０～１％程度、スイカズラの抽出物では６％程度にとどまった。一方、ハイビスカス抽出物では、ニトロチロシンの分解率は３０％程度であった。以上の結果より、ハイビスカス抽出物はニトロチロシンおよびニトロ化タンパク質を直接的に分解する特に優れた効果を有することが示された。またニトロ化タンパク質は黄ぐすみの原因であることから、ニトロ化タンパク質を直接分解できるハイビスカス抽出物にはより優れた黄ぐすみの改善効果が期待できる。

【0023】

＜抗酸化効果試験＞
ＤＰＰＨ試験にて評価した。
＜ＤＰＰＨ溶液の調製＞ＤＰＰＨ溶液は、以下に示す各成分を、（Ａ）：（Ｂ）：（Ｃ）＝１：４：３容量の割合で混合し調製した。
（Ａ）ＭＥＳ（２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸）５．５２ｇを水１００ｍＬに溶かし、１Ｎ ＮａＯＨでｐＨ６．１に調製する。
（Ｂ）ＤＰＰＨ（１，１－ジフェニルー２－ピクリルヒドラジル）１５．７ｍｇをエタノール１００ｍＬに溶解する。
（Ｃ）精製水
＜Ｔｒｏｌｏｘ溶液の調製＞ Ｔｒｏｌｏｘ ２５ｍｇをＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）１０ｍＬに溶解し、１０ｍＭ Ｔｒｏｌｏｘ溶液を作成した。
＜ＤＰＰＨ試験＞１０μＬの被験物質またはＴｒｏｌｏｘ溶液を９６ｗｅｌｌ－ｐｌａｔｅの各ｗｅｌｌ中に加え、次いでＤＰＰＨ溶液１９０μＬを迅速に加え混合する。１０分後、各ｗｅｌｌの吸光度を５４０ｎｍで測定する。Ｔｒｏｌｏｘ濃度と５４０ｎｍの吸光度値の検量線を作成し、被験物質の５４０ｎｍの吸光度から被験物質のＴｒｏｌｏｘ当量を算出した。

【0024】

【表2】

【0025】

表２より、各被験物質の抗酸化力（Ｔｒｏｌｏｘ等量）は、碁石茶抽出物が８ｍＭ程度、トルメンチラ抽出物が１０ｍＭ程度、スイカズラ抽出物が６ｍＭ程度、その他ハイビスカス、ローズマリー、レモングラス抽出物は１ｍＭ以下であった。表１および表２の結果を鑑みると、ニトロ化タンパク質構成アミノ酸であるニトロチロシン分解作用と抗酸化力には関係がないことが示唆された。

【0026】

＜糖化物分解効果試験＞
以下の通り行った。
＜反応溶液の調製＞反応溶液は、以下に示す各成分を、（Ａ）：（Ｂ）：（Ｃ）＝５：１：４容量の割合で混合し調製した。
（Ａ）被験物質
（Ｂ）１０ｍＭ １－Ｐｈｅｎｙｌ－１，２－Ｐｒｏｐａｎｅｄｉｏｎｅ（ＰＰＤ）
（Ｃ）２００ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）
＜糖化物分解試験＞混合した反応溶液を３７℃で８時間反応させたのち、反応溶液の１／５重量の２Ｍ 塩酸水溶液を加え、反応を終了させた。反応溶液を３，０００×ｇで１０分間遠心分離し、上清中の安息香酸量をＨＰＬＣで測定した。
＜分析条件＞
分析カラム：Ｃｈｅｍｃｏｂｏｎｄ ５－ＯＤＳ－Ｗ（１５０×６ｍｍ）
検出波長：２５４ｎｍ
移動相：２ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ－０．２％酢酸／アセトニトリル（７０／３０）
カラム温度：４０℃
流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ

【0027】

【数2】

【0028】

【表3】

【0029】

表３より、各被験物質の糖化物架橋切断率はローズマリー抽出物が最も高く、次いで碁石茶抽出物およびトルメンチラ抽出物、スイカズラ抽出物、レモングラス抽出物、ハイビスカス抽出物の順であった。表１および表３の結果を鑑みると、ニトロチロシン分解作用と糖化物分解作用には関係がないことが示唆された。

【0030】

以下、本発明における各剤の処方例を示す。なお、含有量は質量％である。製法は、常法による。なお、処方は代表例であり、これに限定されない。また、処方例中のハイビスカス抽出物の濃度は乾燥残分としての濃度である。

【0031】

＜処方例１：軟膏＞
ハイビスカス花弁抽出物（１，３ブチレングリコール５０（ｖ／ｖ）％溶媒・６０℃・４時間抽出） ０．１
レゾルシン ０．５
パラジメチルアミノ安息香酸オクチル ４．０
ブチルメトキシベンゾイルメタン ４．０
ステアリルアルコール １８．０
モクロウ ２０．０
グリセリンモノステアリン酸エステル ０．３
ワセリン ３３．０
香料 適 量
防腐剤・酸化防止剤 適 量
精製水 残 部
合計 １００．０

【0032】

＜処方例２：錠剤＞
ハイビスカス葉抽出物 （エタノール５０（ｖ／ｖ）％水溶液溶媒・２５℃・３日抽出） ５．０
卵殻カルシウム １０．０
乳糖 ２０．０
澱粉 ７．０
デキストリン ８．０
硬化油 ５．０
セルロース 残部
合計 １００．０

【0033】

＜処方例３：栄養ドリンク＞
ハイビスカス花弁抽出物（水・６０℃・４時間抽出） １．０
タウリン ３．０
ピリドキシン塩酸塩 ０．０２
チアミン硫化物 ０．０１
リボフラビン ０．００３
無水カフェイン ０．０５
精製白糖 ５．０
Ｄ－ソルビトール液 ２．０
クエン酸無水物 ０．２
香料 適量
精製水 残部
合計 １００．０

【0034】

＜処方例４：化粧水＞
ハイビスカス茎抽出物（水溶媒・６０℃・３時間抽出・ＨＰ－２０精製） ０．０１
ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（２０Ｅ．Ｏ．） １．５
１，３－ブチレングリコール ４．５
グリセリン ３．０
エタノール ２．０
ヒアルロン酸ナトリウム（１％水溶液） ５．０
エデト酸三ナトリウム ０．１
防腐剤 適量
ｐＨ調整剤 適量
精製水 残部
合計 １００．０

【0035】

＜処方例５：ファンデーション＞
ハイビスカス子実抽出物（エタノール溶媒・２５℃・１日抽出） ０．０５
タルク ５．０
セリサイト ８．０
酸化チタン ５．０
色顔料 適 量
モノイソステアリン酸ポリグリセリル ３．０
ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油 １．５
イソノナン酸イソトリデシル １０．０
１，３－ブチレングリコール ５．０
酸化防止剤 適 量
防腐剤 適 量
精製水 残 部
合計 １００．０

【産業上の利用可能性】

【0036】

本発明によれば、ハイビスカス抽出物を用いることで、ニトロ化タンパク質およびニトロチロシンを分解することが出来るため、これらの生成に起因する各種症状を改善することが期待出来る。