特許 7487220 カスパーゼ活性を誘導するためのポリエチレングリコール誘導体

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-05-10

(45)【発行日】2024-05-20

(54)【発明の名称】カスパーゼ活性を誘導するためのポリエチレングリコール誘導体

(51)【国際特許分類】

   A61K 31/77 20060101AFI20240513BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240513BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240513BHJP

【ＦＩ】

A61K31/77

A61P35/00

A61P43/00 105

【請求項の数】 3

(21)【出願番号】P 2021551904

(86)(22)【出願日】2020-02-26

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2022-04-19

(86)【国際出願番号】 US2020019869

(87)【国際公開番号】W WO2020180555

(87)【国際公開日】2020-09-10

【審査請求日】2023-02-10

(31)【優先権主張番号】62/813,834

(32)【優先日】2019-03-05

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】502141050

【氏名又は名称】ダウ グローバル テクノロジーズ エルエルシー

(74)【代理人】

【識別番号】100099759

【弁理士】

【氏名又は名称】青木 篤

(74)【代理人】

【識別番号】100123582

【弁理士】

【氏名又は名称】三橋 真二

(74)【代理人】

【識別番号】100128495

【弁理士】

【氏名又は名称】出野 知

(74)【代理人】

【識別番号】100208225

【弁理士】

【氏名又は名称】青木 修二郎

(74)【代理人】

【識別番号】100144417

【弁理士】

【氏名又は名称】堂垣 泰雄

(74)【代理人】

【識別番号】100147212

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 直樹

(72)【発明者】

【氏名】ウォルフル－グプタ、キャロライン

(72)【発明者】

【氏名】スコット、アンドリュー

(72)【発明者】

【氏名】レバロン、マシュー

(72)【発明者】

【氏名】ウィルソン、ダニエル

(72)【発明者】

【氏名】ジョーダン、スーザン エル．

(72)【発明者】

【氏名】シュミット、ロバート エル．

(72)【発明者】

【氏名】セティヴァリ、ラジャ

【審査官】田澤 俊樹

(56)【参考文献】

【文献】米国特許出願公開第２００１／００５１６５９（ＵＳ，Ａ１）

【文献】特表２０１４－５１３１０３（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ａ６１Ｋ ３１／００－３３／４４

Ａ６１Ｐ １／００－４３／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

癌の治療方法に用いられるための調製物であって、以下の式Ｉまたは式ＩＩによって表される化合物と、生理食塩水と、を含み、

【化1】

式中、ｎは４～４６，０００である、調製物。

【請求項2】

前記化合物が、２００～２０，０００，０００ｇ／ｍｏｌの数平均分子量を有する、請求項１に記載の調製物。

【請求項3】

前記癌が結腸直腸癌である、請求項１または請求項２に記載の調製物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本開示の実施形態は、カスパーゼ活性を誘導する方法を対象とする。

【背景技術】

【0002】

癌は、異常な細胞増殖を伴う一群の疾患である。結腸癌または腸癌と呼ばれることがある結腸直腸癌は、結腸または直腸における制御されていない細胞増殖からの癌である。

【0003】

結腸直腸癌は、一般的に診断される悪性腫瘍である。結腸直腸癌の治療には、手術、放射線療法、および／または化学療法を含むことができる。しかしながら、治療に利用され得る新しい方法および／または新しい組成物の必要性が依然としてある。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

本開示は、カスパーゼ活性を誘導する方法であって、細胞を以下の式によって表される処理化合物と接触させることを含み、

【化1】

式中、Ｒ^１は、水素または１～約１６個の炭素原子を有するアルキル基から選択され、Ｒ^２は、ヒドロキシル基、トシレート基、式ＯＲ^３（式中、Ｒ^３は１～約１６個の炭素原子を有するアルキル基から選択される）のアルコキシ基、または式ＯＣＯＲ^４（式中、Ｒ^４は１～約１６個の炭素原子を有するアルキル基である）のエステル基から選択され、ｎは４～４６，０００であり、ただし、Ｒ^１が水素であり、Ｒ^２がヒドロキシ基である場合、処理化合物は、１０，１００～２，０００，００００ｇ／ｍｏｌの数平均分子量を有する、方法を提供する。

【0005】

本開示の上記概要は、開示された各実施形態または本開示のすべての実現形態を説明することを意図するものではない。以下の説明は、例示的な実施形態をより具体的に例示するものである。本出願全体にわたるいくつかの場所では、例のリストを通じて指針が提供され、これらの例は、様々な組み合わせで使用することができる。どの場合も、列挙されたリストは、代表的なグループとしてのみ機能し、排他的なリストとして解釈されるべきではない。

【発明を実施するための形態】

【0006】

理論に拘束されることを意図していないが、結腸直腸癌の発症に関与するメカニズムの１つは、ＡＰＣ（Ａｄｅｎｏｍａｔｏｕｓ Ｐｏｌｙｐｏｓｉｓ Ｃｏｌｉ）タンパク質を産生するＡＰＣ遺伝子の変異である。ＡＰＣタンパク質は、細胞内のβ－カテニンタンパク質の蓄積を防ぐのに役立つタンパク質ベースの破壊複合体の一部である。ＡＰＣタンパク質およびβ－カテニンタンパク質は、細胞表面受容体を介して細胞にシグナルを渡すＷＮＴ（Ｗｉｎｇｌｅｓｓ／Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ）シグナル伝達経路の１つである。一般に、細胞がＷＮＴによって刺激されると、破壊複合体が非活性化され、β－カテニンタンパク質が核に入り、遺伝情報の転写を制御する転写因子（ＴＣＦ）に結合する。通常の細胞の進行に関与する遺伝子が活性化され、これは調節されたプロセスである。ＡＰＣタンパク質がないと、β－カテニンタンパク質は継続的に高レベルに蓄積して核に移行し、ＴＣＦに結合し、ＴＣＦはＤＮＡに結合して、癌原遺伝子の転写を活性化する。癌原遺伝子が高レベルで不適切に発現されると、それらは癌遺伝子になる可能性がある。活性化された癌遺伝子は、アポトーシスに指定された細胞を生存させ、代わりに増殖させる可能性があり、それは個体の結腸直腸癌の発症につながる可能性があり得る。

【0007】

カスパーゼ活性を誘導する方法が、本明細書に開示されている。有利なことに、カスパーゼ活性を誘導することは、アポトーシスを誘導することができ、すなわち細胞死を誘導することができる。多くの用途では、壊死と比較してアポトーシスが望ましい。カスパーゼ活性を誘導すると、多くの細胞内タンパク質が分解されて細胞死を引き起こす可能性がある。アポトーシスによる細胞死は、例えば、結腸直腸癌細胞に望ましい影響を与える可能性がある。

【0008】

本明細書で使用される場合、「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」、「少なくとも１つ」、「多数の」、および「１つ以上」は、別段の指示がない限り、交換可能に使用することができる。「および／または」という用語は、列挙された項目のうちの１つ、１つ以上、またはすべてを意味する。終端点（ｅｎｄｐｏｉｎｔ）による数値範囲の列挙には、その範囲内に包含されるすべての数値が含まれ、例えば、１～５には１、１．５、２、２．７５、３、３．８０、４、５などが含まれる。

【0009】

本明細書に開示されるように、カスパーゼ活性を誘導する方法は、細胞、例えば、複数の細胞を処理化合物と接触させることを含む。本明細書で使用される場合、「処理化合物」は、以下の式Ｉによって表され得る化合物を指し、

【化2】

式中、Ｒ^１は、水素または１～約１６個の炭素原子を有するアルキル基から選択され、Ｒ^２は、ヒドロキシル基、トシレート基、式ＯＲ^３（式中、Ｒ^３は１～約１６個の炭素原子を有するアルキル基から選択される）のアルコキシ基、または式ＯＣＯＲ^４（式中、Ｒ^４は１～約１６個の炭素原子を有するアルキル基である）のエステル基から選択され、ｎは４～４６，０００であり、ただし、Ｒ^１が水素であり、Ｒ^２がヒドロキシ基である場合、処理化合物は、１０，１００～２，０００，００００ｇ／ｍｏｌの数平均分子量を有する。

【0010】

前述のように、Ｒ^１、Ｒ^３、およびＲ^４のそれぞれは、１～約１６個の炭素原子を有するアルキル基であり得る。例えば、Ｒ^１、Ｒ^３、およびＲ^４のアルキル基は、それぞれ独立して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６個の炭素原子を含み得る。Ｒ^１、Ｒ^３、およびＲ^４のアルキル基は、それぞれ独立して、飽和または不飽和のアルキル基であり得る。Ｒ^１、Ｒ^３、およびＲ^４のアルキル基は、それぞれ独立して、線状または分枝状のアルキル基であり得る。

【0011】

本開示の１つ以上の実施形態は、処理化合物が以下の式ＩＩによって表され得ることを規定し、

【化3】

式中、ｎは４～４６，０００である。式ＩＩで表される処理化合物は、ポリ（エチレングリコール）メチルエーテルと呼ばれることがある。

【0012】

本開示の１つ以上の実施形態は、治療化合物が以下の式ＩＩＩによって表され得ることを規定し、

【化4】

式中、ｎは４～４６，０００である。式ＩＩＩで表される処理化合物は、ポリ（エチレングリコール）メチルエーテルトシレートと呼ばれ得る。

【0013】

本開示の実施形態は、処理化合物が、２００～２０，０００，０００ｇ／ｍｏｌの数平均分子量（Ｍｎ）を有することを規定する。２００～２，０００，００００ｇ／ｍｏｌのすべての個々の値およびサブ範囲が含まれ、例えば、処理化合物は、２００、３００、４００、または５００ｇ／ｍｏｌの下限から２，０００，００００、１，７５０，００００、１，５００，００００、１，２５０，００００、または１，０００，００００ｇ／ｍｏｌの上限までのＭｎを有することができる。

【0014】

本開示の実施形態は、Ｒ^１が水素であり、Ｒ^２が式Ｉで表される処理化合物のヒドロキシ基である場合、処理化合物は、１０，１００～２０，０００，００００ｇ／ｍｏｌの数平均分子量を有することを規定する。１０，１００～２，０００，００００ｇ／ｍｏｌのすべての個々の値およびサブ範囲が含まれ、例えば、Ｒ^１が水素であり、Ｒ^２が式Ｉで表される処理化合物のヒドロキシ基である場合、処理化合物は、１０，１００、１０，５００、１１，０００、１５，０００、２０，０００、３５，０００、５０，０００、７５，０００、または１００，０００ｇ／ｍｏｌの下限から、２，０００，００００、１，７５０，００００、１，５００，００００、１，２５０，００００、または１，０００，００００ｇ／ｍｏｌの上限までのＭｎを有することができる。

【0015】

処理化合物は、既知の方法、機器、および／または条件を使用して調製することができ、これらは、異なる用途によって異なる可能性がある。処理化合物は商業的に入手することができる。

【0016】

前述のように、本明細書に開示されるように、カスパーゼ活性を誘導する方法は、細胞を処理化合物と接触させることを含む。本開示の１つ以上の実施形態は、細胞と処理化合物との接触がインビボで起こることを規定する。本開示の１つ以上の実施形態は、細胞と処理化合物との接触がインビトロで起こることを規定する。細胞は、多数の異なる既知の方法、機器、および／または条件を利用することによって、処理化合物と接触させることができる。様々な方法、機器、および／または条件を異なる用途に利用することができる。

【0017】

処理化合物は、既知の処理培地と共に利用することができる。例えば、処理化合物は、細胞に接触する前に、既知の処理培地に溶解して、有効量を提供することができる。１つ以上の実施形態は、処理化合物および処理培地を組み合わせて溶液を形成することができることを規定する。溶液は均質な溶液であり得る。処理培地の例には、とりわけ、ＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）、ＲＰＭＩ １６４０、およびＭｃＣｏｙ’ｓ ５Ａ、ならびにそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。多くの処理培地が市販されている。

【0018】

処理化合物は、処理培地中に０．００１ミリモル（ｍＭ）～７５ｍＭの濃度を有することができる。０．００１～７５ｍＭのすべての個々の値およびサブ範囲が含まれ、例えば、有効濃度は、処理培地中の処理化合物の０．００１、０．００５、０．０１、０．１または１．０ｍＭの下限から７５、７２、７０、６８、または６５ｍＭの上限までであり得る。

【0019】

細胞は、有効量の処理化合物と接触させることができる。本明細書で使用される場合、「治療有効量」および／または「治療量」と交換可能に使用され得る「有効量」という用語は、意図された用途を提供する、例えばカスパーゼ活性を誘導するのに十分な治療化合物の量を指す。細胞を有効量の処理化合物と接触させることは、望ましくは、疾患治療、例えば、望ましくない細胞がカスパーゼ活性の誘導に起因するアポトーシスによる細胞死に供される結腸直腸癌治療を提供し得る。有効量は、特定の用途、例えば、他の考慮事項の中で、インビトロまたはインビボ、治療される対象、例えば、対象の体重および年齢、病状の重症度、ならびに／または投与方法に応じて変動し得、それらは当業者によって容易に決定することができる。本明細書で使用される場合、治療される「対象」は、動物界の任意のメンバー、例えば、ヒトを含む哺乳動物を指す。

【0020】

本開示の実施形態は、特定の用量が、利用される特定の治療化合物、従うべき投与計画、投与のタイミング、および／または治療化合物が運ばれる物理的送達システムに応じて変動し得ることを規定する。例えば、有効量の治療化合物は、単回投与または複数回投与によって細胞と接触させることができる。

【0021】

本開示の実施形態は、処理化合物と接触する細胞が癌性細胞であることを規定する。例えば、細胞は結腸直腸癌細胞であり得る。結腸直腸癌細胞はまた、結腸癌細胞、腸癌細胞、および／または結腸直腸腺癌細胞と呼ばれることもある。本開示の１つ以上の実施形態は、追加の細胞、すなわち非癌性細胞を処理化合物と接触させることができることを規定する。

【0022】

理論に拘束されることを意図していないが、システイン－アスパラギン酸プロテアーゼと呼ばれ得るカスパーゼは、アポトーシスに関与するシステインプロテアーゼのファミリーである。カスパーゼには、カスパーゼ２、８、９、１０、１１、１２を含むイニシエーターカスパーゼ、およびカスパーゼ３、６、７を含むエフェクターカスパーゼの２種類がある。本開示の１つ以上の実施形態は、細胞を処理化合物と接触させることにより、エフェクターカスパーゼ活性が誘導されることを規定する。本開示の１つ以上の実施形態は、カスパーゼが、カスパーゼ３、カスパーゼ６、カスパーゼ７、またはそれらの組み合わせから選択されることを規定する。

【0023】

前述のように、カスパーゼ活性を誘導すると、アポトーシスを有利に誘導することができる。誘導されたカスパーゼ活性は、多数の異なる既知の方法、機器、および／または条件によって決定され得る。例えば、誘導されたカスパーゼ活性は、例えば、Ｃａｓｐａｓｅ－Ｇｌｏ ３／７ Ａｓｓａｙ ４．Ｂによって決定されるように、１を超える平均相対的カスパーゼ活性によって証明され得る。Ｐｒｏｍｅｇａから入手可能な９６ウェルプレートでの細胞の標準プロトコル。本明細書で使用される場合、「相対的カスパーゼ活性」は、相対的アポトーシスと交換可能に利用することができる。

【0024】

本明細書で論じられるように、処理化合物を利用することは、癌治療に利用される他のいくつかのポリマー化合物と比較して、改善された、すなわち低減された緩下（ｌａｘａｔｉｖｅ）効果を有利に提供し得る。この減少した緩下効果は、比較的大きな緩下効果に関連する他のいくつかのポリマー化合物と比較して、患者のコンプライアンスに望ましい増加を提供するのに役立つ可能性がある。

【0025】

本開示の１つ以上の実施形態は、結腸直腸癌を治療する方法を提供する。この方法は、結腸直腸癌細胞を処理化合物と接触させることを含むことができる。

【0026】

本開示の１つ以上の実施形態は、癌を治療する方法を提供する。この方法は、治療化合物を哺乳動物に投与することを含むことができる。

【実施例】

【0027】

実施例では、例えば、以下を含む、材料に関する様々な用語および名称を使用する。

【0028】

ポリ（エチレングリコール）メチルエーテル（Ｍｎ２０００ｇ／ｍｏｌ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから入手）、

【0029】

ポリ（エチレングリコール）メチルエーテル（Ｍｎ５０００ｇ／ｍｏｌ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから入手）、

【0030】

ポリ（エチレングリコール）メチルエーテルトシレート（Ｍｎ２０００ｇ／ｍｏｌ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから入手）、

【0031】

ポリ（エチレングリコール）メチルエーテルトシレート（Ｍｎ５０００ｇ／ｍｏｌ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから入手）、

【0032】

ＰＯＬＹＯＸ Ｎ１２Ｋ（ポリエチレングリコール、Ｍｎ１，０００，０００ｇ／ｍｏｌ、Ｄｕｐｏｎｔから入手）、

【0033】

ＰＯＬＹＯＸ ＶＳＲ Ｎ７５０（ポリエチレングリコール、Ｍｎ３００，０００ｇ／ｍｏｌ、Ｄｕｐｏｎｔから入手）、

【0034】

ＰＯＬＹＯＸ ＶＳＲ Ｎ３０００（ポリエチレングリコール、Ｍｎ４００，０００ｇ／ｍｏｌ、Ｄｕｐｏｎｔから入手）、

【0035】

細胞（ヒト結腸；結腸直腸腺癌；ＨＴ－２９（ＡＴＣＣ（登録商標）ＨＴＢ－３）、ＡＴＣＣから入手）、

【0036】

ＭｃＣｏｙ’ｓ ５Ａ（増殖培地、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃから入手）、

【0037】

ウシ胎児血清（ＡＴＣＣから入手）、

【0038】

ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＧＩＢＣＯ１４１９０－１４４、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから入手）、

【0039】

完全増殖培地（ＡＴＣＣ（登録商標）３０－２００７、ＡＴＣＣから入手）、

【0040】

トリプシン－ＥＤＴＡ（ＧＩＢＣＯトリプシン－ＥＤＴＡ（０．２５％）、カタログ番号２５２０００５６、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから入手）、

【0041】

チアゾリルブルーテトラゾリウムブロミド（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから入手）、

【0042】

カルシウムおよびマグネシウムを含むダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＧＩＢＣＯ１４０４０－１３３、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから入手）、

【0043】

Ｃａｓｐａｓｅ－Ｇｌｏ ３／７ Ａｓｓａｙ（発光アッセイ、カタログ番号Ｇ８０９３、Ｐｒｏｍｅｇａから入手）、

【0044】

ジメチルスルホキシド（カタログ番号２７６８５５、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから入手）。

【0045】

培養の開始および維持
培養の開始および維持は以下のように行った。培養の開始および維持は、「Ｔｈａｗｉｎｇ，Ｐｒｏｐａｇａｔｉｎｇ，ａｎｄ Ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ」ＮＣＩ－ＰＢＣＦ－ＨＴＢ３８（ＨＴ－２９）Ｃｏｌｏｎ Ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＨＴＢ－３８（商標））、２０１２年２月２７日、バージョン１．６に従って行った。

【0046】

ＨＴ－２９（ＡＴＣＣ（登録商標）ＨＴＢ－３８（商標））細胞（１ｍＬあたり約１×１０^６細胞を含む）を開始し、ＭｃＣｏｙ’ｓ ５Ａおよびウシ胎児血清（１０％（ｖ／ｖ））を含むＴ－２５フラスコに播種した。次に、ＡＴＣＣ（登録商標）３０－２００７（３７℃の水浴で少なくとも１５分間加温）を使用して、ＨＴ－２９細胞を増殖させた。細胞は、３７℃および５％ＣＯ_２に維持された加湿インキュベーター（ＳＡＮＹＯ ＩＮＣＴ－１６－ＣＭＴ、ＭＣＯ－１９ＡＩＣ（ＵＶ））で増殖させた。次に、細胞を１Ｘダルベッコリン酸緩衝生理食塩水ですすぎ、１Ｘトリプシン－ＥＤＴＡを使用してＴ－７５フラスコで週に１～３回継代培養し、５分未満適用した。トリプシン－ＥＤＴＡの酵素作用は、分離した細胞に完全増殖培地を加えることによって停止した。次に、８０～９０％のコンフルエンシーに達したら、細胞を次の分割比の範囲１：５～１：１６に分割した。継代数、コンフルエンシー％、生存率％（実験設定日のみ）、およびすべてのフェーズでの細胞形態など、継代培養および増殖拡大活性を記録した。細胞は対数増殖期に維持された。

【0047】

細胞培養プレーティング（０日目）
細胞培養プレーティングは以下のように行った。単一の８０～９０％コンフルエントなＴ－７５フラスコからの細胞懸濁液を、トリプシン－ＥＤＴＡおよび完全増殖培地で回収した。細胞濃度および生存率を得るために、ＣＯＵＮＴＥＳＳ自動セルカウンター（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ Ｃ１０２２７、ＣＮＴＲ－７－ＣＭＴ）を使用して細胞数を得た。このカウンターでは、各スライドの２つのチャンバーに１：１の０．４％トリパンブルー色素（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ Ｔ１０２８２）および細胞懸濁液をそれぞれ１０μＬずつ供給した。細胞数および生存率は、１枚のスライドの両方のチャンバーから平均化した。次に、完全増殖培地を含む生細胞（生存率≧ ９０％以上として定義）を、マルチチャネルピペットを使用して、滅菌９６ウェルプレートにプレーティングした。細胞密度あたり、５０００～６０００個の細胞／ウェル（４０，０００～４８，０００個の細胞／ｍＬ）を、「生理食塩水のみ」の、細胞コントロールウェルなしとして使用したウェルを除いて、各ウェルに追加し、プレート上のＡ列からＨ列まで、ウェルごとに１２５μＬの細胞懸濁液をそれぞれ等量加えた。アポトーシスおよび細胞毒性の２つのエンドポイントのそれぞれに使用されたプレートは、それぞれ固体の白いプレートおよび透明なプレートであった。細胞を２４±２時間インキュベートして付着させた。

【0048】

ポリ（エチレングリコール）メチルエーテル／ポリ（エチレングリコール）メチルエーテルトシレート／ポリエチレングリコールストック調製物
ストック溶液は、滅菌生理食塩水でポリ（エチレングリコール）メチルエーテル、ポリ（エチレングリコール）メチルエーテルトシレート、およびポリエチレングリコールの目標濃度に調製した。アッセイでは、高分子量による溶解限度に基づいて、必要に応じて溶液またはピペッタブル懸濁液のいずれかを作製するための低ストック濃度調製物（ｗ／ｖ）の調整を行うか、またはアッセイで使用する前に生理食塩水を少しずつ添加、連続混合、ボルテックス、超音波処理、または攪拌によって可溶化した。可溶化に必要な場合、生理食塩水を３７℃に予熱してから、ポリ（エチレングリコール）メチルエーテル、ポリ（エチレングリコール）メチルエーテルトシレート、および／またはポリエチレングリコールと混合した。細胞懸濁液プレーティングの日（０日目）に、試験物質ごとに総量１０ｍＬを調製した。

【0049】

細胞毒性試薬の調製
チアゾリルブルーテトラゾリウムブロミドは、カルシウムおよびマグネシウムを含むダルベッコリン酸緩衝生理食塩水で５ｍｇ／ｍＬで調製した。セットアップ日（０日目）ごとに総量３０ｍＬを調製し（ｗ／ｖ）、使用するまで４℃で保存した。

【0050】

投薬溶液の調製（０日目）
各試験物質ストックの投与溶液／懸濁液は、ＭｃＣｏｙ’ｓ ５Ａおよび１％ウシ胎児血清のそれぞれ合計１５ｍＬで調製した。０．００１５～６０ｍＭの投与溶液／懸濁液を達成するために、様々な量の投与ストックを利用した。投与溶液／懸濁液は滅菌リザーバーで調製し、目に見える均一性が達成されるまでピペットで繰り返し混合した。２ｍＬの容量の滅菌９６ディープウェルブロックを使用して、２ｍＬの投与溶液／懸濁液を、治療群の６つの複製ウェルのそれぞれに、ならびに生理食塩水のみの細胞コントロールおよび生理食塩水のみの「細胞なし」バックグラウンド補正コントロールの１２個のウェルのそれぞれに追加した。プレートは、半ランダム化された統計的設計に従って確立した。各試験物質は、処理するウェルを特定するために使用されるカラーコードを介して数値的に特定した。ブロックをシーリングテープ、プレートの蓋で覆い、４℃のラボ用冷蔵庫（Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、１３５Ｂ１、ＲＦＲ－２２－ＣＭＴ）に一晩入れた。

【0051】

処理（１日目）
投与溶液／懸濁液を含むすべての９６ディープウェルブロックを冷蔵庫から取り出し、３７℃のビーズバスに最低３０分間入れた。プレーティングの約２４時間後、ウェルプレートをインキュベーターから取り出し、一度に１つずつ処理した。セルプレートのすべてのウェルは、Ａ列から始まりＨ列までの６ウェル吸引装置を使用して吸引した。マルチチャネルピペットを使用して、各１００μＬの投与溶液／懸濁液（ブロックから）を９６ウェル細胞処理プレートの各ウェルにＡ列から始まりＨ列まで加えた（同じ順序）。ウェルの乾燥を防ぎ、細胞接着および生存率を維持するために、すべてのウェルを一度に２列ずつ吸引して処理した。ピペットチップは行ごとに変更した。すべてのプレートをインキュベーターに入れ、回収前に２４±２時間または４８±２時間処理した。

【0052】

回収（２日目および３日目）
アポトーシス
アポトーシスの評価は以下のように行った。「Ｃａｓｐａｓｅ－Ｇｌｏ ３／７ Ａｓｓａｙ」４．Ｂに従ってアポトーシスを行った。９６ウェルプレート（Ｐｒｏｍｅｇａ）での細胞の標準プロトコル。Ｃａｓｐａｓｅ－Ｇｌｏ ３／７ Ａｓｓａｙ成分は、室温まで約６０分間予熱した。白いプレートをインキュベーターから（一度に１つずつ）取り出し、処理培地を吸引した。マルチチャネルピペットを使用して、１００μＬの１Ｘダルベッコリン酸緩衝生理食塩水を９６ウェルプレートの各ウェルに添加した。アッセイ試薬（バッファーおよび基質）を手動で混合し、試薬リザーバーに添加した。マルチチャネルピペットを使用して、１００μＬのアッセイ試薬混合物を９６ウェルプレートの各ウェルに添加した。プレート（光からホイルで保護されている）をプレートシェーカー上に置き、室温で約８００ｒｐｍで５分間回転させた。次に、分析前にプレートを室温でさらに２５分間インキュベートした。発光は、ＦＬＵＯｓｔａｒ Ｏｍｅｇａ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ上で各プレートについて相対光単位（ＲＬＵ）で記録した。

【0053】

細胞毒性
細胞毒性の評価は以下のように行った。前述のように、細胞毒性試薬（５ｍｇ／ｍＬ）を室温まで約３０分間予熱した後、カルシウムおよびマグネシウムを含む１Ｘダルベッコリン酸緩衝生理食塩水で希釈して０．６７５ｍｇ／ｍＬの濃度（最終）にした。透明なプレートをインキュベーターから（一度に１つずつ）取り出し、処理培地を吸引した。マルチチャネルピペットを使用して、２００μＬの細胞毒性試薬（最終）を９６ウェルプレートの各ウェルに添加し、次いでプレートをシーリングテープで覆い、加湿した３７℃のインキュベーターで４時間インキュベートした。インキュベーション後、上清を吸引し、ジメチルスルホキシド（２００μＬ）を各ウェルに加えた。ピペッティングを繰り返して完全に混合した後、細胞溶解物を新しい透明な９６ウェルプレートに移し、ＦＬＵＯｓｔａｒ Ｏｍｅｇａ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒで６００および６３０ｎｍの吸光度を定量した。

【0054】

分析
相対的なカスパーゼ活性（これの定義を提供してください）

【0055】

相対的なカスパーゼ活性は次のように計算した。（ＲＬＵ_{フォアグラウンド}）－（ＲＬＵ_{生理食塩水のみの「細胞なし」コントロール}）＝（ＲＬＵ_{バックグラウンド補正済み}）、

【0056】

（ウェルを含む各試験物質の（ＲＬＵ_{バックグラウンド補正済み}））／（１２個の生理食塩水のみのコントロールウェルの平均（ＲＬＵ_{フォアグラウンド}））＝相対的カスパーゼ活性（式中、ＲＬＵ＝相対的光単位）。

【0057】

ウェルを含む各試験物質の相対的カスパーゼ活性／６回の反復＝平均相対的カスパーゼ活性。結果は、様々な利用濃度について表１、３、５、７、９、１１、および１３に報告されている。

【0058】

細胞生存率は次のように計算した。

【0059】

（Ａｂｓ_{６００フォアグラウンド}）－（Ａｂｓ_{６００生理食塩水のみ「細胞なし」コントロール}）＝（Ａｂｓ_{６００バックグラウンド補正済み}）

【0060】

（Ａｂｓ_{６３０フォアグラウンド}）－（Ａｂｓ_{６３０生理食塩水のみ「相棒なし」コントロール}）＝（Ａｂｓ_{６３０バックグラウンド補正済み}）

【0061】

（Ａｂｓ_{６００バックグラウンド補正済み}）－（Ａｂｓ_{６３０バックグラウンド補正済み}）＝（Ａｂｓ_{６００～６３０}）

【0062】

（ウェルを含む各試験物質の（Ａｂｓ_{６００～６３０}））／（１２個の生理食塩水のみのコントロールウェルの平均（Ａｂｓ_{６００～６３０}））＝％細胞生存率

【0063】

ウェルを含む各試験物質の％細胞生存率／６回の反復＝平均％細胞生存率。結果は、様々な使用濃度について表２、４、６、８、１０、１２、および１４に報告されている。

【表1】

【0064】

表１のデータは、それぞれの平均相対的カスパーゼ活性（実行１、２、３）値によって示されるように、細胞が、２０００ｇ／ｍｏｌのＭｎを有する１５、３０、および６０ｍＭ濃度のポリ（エチレングリコール）メチルエーテルに曝露されたときに、有利な相対的カスパーゼ活性、すなわち＞１の平均相対的カスパーゼ活性が提供されたことを証明している。

【表2】

【0065】

表２のデータは、細胞が２０００ｇ／ｍｏｌのＭｎを有する１５、３０、および６０ｍＭの濃度のポリ（エチレングリコール）メチルエーテルに曝露された２４時間後に、十分な生存率、すなわち平均生存率％について７０％以上の平均生存率％（実行１、２、３）が提供されたことを証明している。

【表3】

【0066】

表３のデータは、それぞれの平均相対的カスパーゼ活性（実行１、２）値によって示されるように、細胞が、５０００ｇ／ｍｏｌのＭｎを有する１．５、３および６ｍＭ濃度のポリ（エチレングリコール）メチルエーテルに曝露されたときに、有利な相対的カスパーゼ活性、すなわち＞１の平均相対的カスパーゼ活性が提供されたことを証明している。

【表4】

【0067】

表４のデータは、細胞が５０００ｇ／ｍｏｌのＭｎを有する１．５、３および６ｍＭの濃度のポリ（エチレングリコール）メチルエーテルに曝露された２４時間後に、十分な生存率、すなわち平均生存率％について７０％以上の平均生存率％（実行１、２）が提供されたことを証明している。

【表5】

【0068】

表５のデータは、それぞれの平均相対的カスパーゼ活性（実行１、２、３、４）値によって示されるように、細胞が、２０００ｇ／ｍｏｌのＭｎを有する１５および３０ｍＭ濃度のポリ（エチレングリコール）メチルエーテルトシレートに曝露されたときに、有利な相対的カスパーゼ活性、すなわち＞１の平均相対的カスパーゼ活性が提供されたことを証明している。

【表6】

【0069】

表６のデータは、細胞が２０００ｇ／ｍｏｌのＭｎを有する１５および３０ｍＭの濃度のポリ（エチレングリコール）メチルエーテルトシレートに曝露された２４時間後に、十分な生存率、すなわち平均生存率％について７０％以上の平均生存率％（実行１、２、３、４）が提供されたことを証明している。

【表7】

【0070】

表７のデータは、それぞれの平均相対的カスパーゼ活性（実行１、２）値によって示されるように、細胞が、５０００ｇ／ｍｏｌのＭｎを有する１．５、３および６ｍＭ濃度のポリ（エチレングリコール）メチルエーテルトシレートに曝露されたときに、有利な相対的カスパーゼ活性、すなわち＞１の平均相対的カスパーゼ活性が提供されたことを証明している。

【表8】

【0071】

表８のデータは、細胞が５０００ｇ／ｍｏｌのＭｎを有する１．５、３、および６ｍＭの濃度のポリ（エチレングリコール）メチルエーテルトシレートに曝露された２４時間後に、十分な生存率、すなわち平均生存率％について７０％以上の平均生存率％（実行１、２）が提供されたことを証明している。

【表9】

【0072】

表９のデータは、それぞれの平均相対的カスパーゼ活性（実行１）値によって示されるように、細胞が、１，０００，０００ｇ／ｍｏｌのＭｎを有する０．００１５、０．００３および０．００６ｍＭ濃度のポリエチレングリコールに曝露されたときに、有利な相対的カスパーゼ活性、すなわち＞１の平均相対的カスパーゼ活性が提供されたことを証明している。

【表10】

【0073】

表１０のデータは、細胞が１，０００，０００ｇ／ｍｏｌのＭｎを有する０．００１５、０．００３および０．００６ｍＭの濃度のポリエチレングリコールに曝露された２４時間後に、十分な生存率、すなわち平均生存率％について７０％以上の平均生存率％（実行１）が提供されたことを証明している。

【表11】

【0074】

表１１のデータは、それぞれの平均相対的カスパーゼ活性（実行１）値によって示されるように、細胞が、３００，０００ｇ／ｍｏｌのＭｎを有する０．００３および０．００６ｍＭ濃度のポリエチレングリコールに曝露されたときに、有利な相対的カスパーゼ活性、すなわち＞１の平均相対的カスパーゼ活性が提供されたことを証明している。

【表12】

【0075】

表１２のデータは、細胞が３００，０００ｇ／ｍｏｌのＭｎを有する０．００３および０．００６ｍＭの濃度のポリエチレングリコールに曝露された２４時間後に、十分な生存率、すなわち平均生存率％について７０％以上の平均生存率％（実行１）が提供されたことを証明している。

【表13】

【0076】

表１３のデータは、それぞれの平均相対的カスパーゼ活性（実行１）値によって示されるように、細胞が、４００，０００ｇ／ｍｏｌのＭｎを有する０．００１５および０．００６ｍＭ濃度のポリエチレングリコールに曝露されたときに、有利な相対的カスパーゼ活性、すなわち平均相対的カスパーゼ活性が提供されたことを証明している。

【表14】

【0077】

表１４のデータは、細胞が０．００１５および０．００６ｍＭ濃度の４００，０００ｇ／ｍｏｌのＭｎを有するポリエチレングリコールに曝露された２４時間後に、十分な生存率、すなわち平均生存率％について７０％以上の平均生存率％（実行１）が提供されたことを証明している。
（態様）
（態様１）
カスパーゼ活性を誘導する方法であって、前記方法は、細胞を以下の式によって表される処理化合物と接触させることを含み、

【化1】

式中、Ｒ ^１ は、水素または１～約１６個の炭素原子を有するアルキル基から選択され、Ｒ ^２ は、ヒドロキシル基、トシレート基、式ＯＲ ^３ （式中、Ｒ ^３ は１～約１６個の炭素原子を有するアルキル基から選択される）のアルコキシ基、または式ＯＣＯＲ ^４ （式中、Ｒ ^４ は１～約１６個の炭素原子を有するアルキル基である）のエステル基から選択され、ｎは４～４６，０００であり、ただし、Ｒ ^１ が水素であり、Ｒ ^２ がヒドロキシ基である場合、前記処理化合物は、１０，１００～２，０００，００００ｇ／ｍｏｌの数平均分子量を有する、方法。
（態様２）
前記処理化合物が、２００～２０，０００，０００ｇ／ｍｏｌの数平均分子量を有する、態様１に記載の方法。
（態様３）
前記処理化合物が、処理培地において０．００１ミリモル～７５ミリモルの濃度を有する、態様１に記載の方法。
（態様４）
前記細胞が癌性細胞である、態様１に記載の方法。
（態様５）
前記カスパーゼがエフェクターカスパーゼである、態様１に記載の方法。
（態様６）
前記カスパーゼが、カスパーゼ３、カスパーゼ６、カスパーゼ７、またはそれらの組み合わせから選択される、態様１に記載の方法。
（態様７）
アポトーシスを誘発することをさらに含む、態様１に記載の方法。