特許 7487298 液体又は液体含有サンプルの光化学測定を行うための装置

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-05-10

(45)【発行日】2024-05-20

(54)【発明の名称】液体又は液体含有サンプルの光化学測定を行うための装置

(51)【国際特許分類】

   G01N 21/64 20060101AFI20240513BHJP

   G01N 21/65 20060101ALI20240513BHJP

   G01N 21/05 20060101ALI20240513BHJP

   G01N 21/27 20060101ALI20240513BHJP

【ＦＩ】

G01N21/64 B

G01N21/65

G01N21/05

G01N21/27 E

【請求項の数】 15

(21)【出願番号】P 2022523910

(86)(22)【出願日】2020-07-31

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2022-12-28

(86)【国際出願番号】 EP2020071659

(87)【国際公開番号】W WO2021078419

(87)【国際公開日】2021-04-29

【審査請求日】2023-04-26

(31)【優先権主張番号】19306385.6

(32)【優先日】2019-10-24

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(73)【特許権者】

【識別番号】311016455

【氏名又は名称】サントル ナシオナル ドゥ ラ ルシェルシェ シアンティフィク

【氏名又は名称原語表記】ＣＥＮＴＲＥ ＮＡＴＩＯＮＡＬ ＤＥ ＬＡ ＲＥＣＨＥＲＣＨＥ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＱＵＥ

(73)【特許権者】

【識別番号】516149907

【氏名又は名称】エコール・ノルマル・シュペリウール・ドゥ・パリ

(73)【特許権者】

【識別番号】518170446

【氏名又は名称】ソルボンヌ ウニベルシテ

(74)【代理人】

【識別番号】110001173

【氏名又は名称】弁理士法人川口國際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】シュケ，ラジャ

(72)【発明者】

【氏名】エスパーニュ，アガット

(72)【発明者】

【氏名】ジュリアン，リュドビック

(72)【発明者】

【氏名】ルマルシャン，アニー

(72)【発明者】

【氏名】ル・ソー，トマ

(72)【発明者】

【氏名】ペリシエ－タノン，アニエス

(72)【発明者】

【氏名】シニヨン・コロンナ・ボッツィ，ロランス

(72)【発明者】

【氏名】ジャン，ルイカン

【審査官】伊藤 裕美

(56)【参考文献】

【文献】特表２０１２－５１９２７８（ＪＰ，Ａ）

【文献】米国特許出願公開第２０１９／０２１２２６８（ＵＳ，Ａ１）

【文献】特開２００７－２７１５２９（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２０１９／０５８１５２（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特表２００７－５３０９１６（ＪＰ，Ａ）

【文献】特許第６４９９３６３（ＪＰ，Ｂ１）

【文献】RUIKANG ZHANG; ET AL，SIMPLE IMAGING PROTOCOL FOR AUTOFLUORESCENCE ELIMINATION AND OPTICAL SECTIONING IN FLUORESCENCE ENDOMICROSCOPY，OPTICA，2019年07月30日，VOL:6, NO:8，PAGE(S):972-980，https://opg.optica.org/directpdfaccess/b8a2aec2-15c4-4e8e-bb26cf364e2add89_416230/optica-6-8-972.pdf?da=1&id=416230&seq=0&mobile=no

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｇ０１Ｎ ２１／００ ー Ｇ０１Ｎ ２１／８３

Ｇ０１Ｎ ３３／４８ ー Ｇ０１Ｎ ３３／９８

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

液体又は液体含有サンプル（ＬＳ）の光化学測定を行うための装置であって、光生成システム（ＬＧＳ）と、前記光生成システムからの光を前記サンプルに向けるように構成された光学システム（ＯＳ、ＯＳ’）と、前記サンプルを所定の照明シーケンスにより照明するために光強度値を変調することによって前記光生成システムを制御するように構成又はプログラムされたプロセッサ（ＰＲ）と、前記サンプルの少なくとも１つの光学特性を測定するための検知システム（ＳＳ、ＳＳ’）と、を含み、
－ 前記光生成システムは、少なくとも３桁、好ましくは少なくとも５桁にわたる範囲内で調整可能な強度レベルを有する少なくとも１つの波長の光を生成するように構成されることと、
－ 前記光学システムは、前記サンプルの照射領域の円柱領域内で、プラス又はマイナス３０％、好ましくはプラス又はマイナス２０％、さらにより好ましくはプラス又はマイナス１０％の公差の均一な光強度レベルを生じさせるように、前記光生成システムからの光を前記サンプルに向けるように構成され、前記半径は少なくとも３μｍであり、前記円柱領域が、前記円柱領域の半径の５倍よりも高いかそれと等しい高さを有し、
前記照明シーケンスは複数のサブシーケンスを含み、各サブシーケンスは、前記サブシーケンスの少なくとも一部において、前記サンプルを第一の波長で一定の強度で照明することを含み、前記第一の波長での強度値は、１つのサブシーケンスから次へと変化すること
を特徴とする、装置。

【請求項2】

前記光生成システムは、同じ波長（λ_１）で、それぞれ第一の強度範囲内及び第二の強度範囲内で調整可能な強度レベルの光を生成するように構成された少なくとも１つの第一の光源と１つの第二の光源を含み、前記第一の強度範囲は前記第二の強度範囲のそれらより高い強度レベルを含み、前記第一及び前記第二の強度範囲の合算は、少なくとも３桁、好ましくは少なくとも５桁の範囲に及ぶ、請求項１に記載の装置。

【請求項3】

異なる波長（λ_１、λ_２）の光を生成するように構成された少なくとも２つの第一の光源と、少なくとも２つのそれぞれの第二の光源であって、各々が、１つの対応する第一の光源によって生成された光の同じ波長（λ_１、λ_２）の光を生成するように構成される第二の光源と、を含み、生成された光の波長は、少なくとも２つのそれぞれの第二の光源間で異なり、少なくとも２つの前記第一の光源により発せられた光ビームを結合するための少なくとも１つの第一のダイクロイックミラーと少なくとも２つの前記第二の光源により発せられた光ビームを結合するための第二のダイクロイックミラーとをさらに含む、請求項２に記載の装置。

【請求項4】

前記第二の光源又は少なくとも１つの前記第二の光源は、発光ダイオードである、請求項２又は３に記載の装置。

【請求項5】

前記第一の光源又は少なくとも１つの前記第一の光源は、レーザである、請求項２～４の何れか１項に記載の装置。

【請求項6】

前記光学システム（ＯＳ）は、
－ 前記１つ又は複数のレーザにより発せられるレーザ光ビームを拡大するためのビームエキスパンダ（ＢＥＸ１、ＢＥＸ２）と、
－ 前記拡大されたレーザ光ビームの中央部を選択するためのダイアフラム（ＤＧＭ１）と、
－ 前記ダイアフラムの実像を形成するためのレンズ（Ｌ１）と、
－ 前焦点面（ＦＦＰ）と後焦点面を有する対物レンズ（ＯＢＪ）であって、前記ダイアフラムの実像は前記前焦点面にある対物レンズ（ＯＢＪ）と、
を含む、請求項５に記載の装置。

【請求項7】

前記光学システム（ＯＳ’）は、
－ 前焦点面（ＦＦＰ）を有する対物レンズ（ＯＢＪ’）と、
－ 前記１つ又は複数のレーザにより発せられたレーザ光を均一に拡散させるための光拡散装置（ＤＩＦ）と、
－ 前記拡散されたレーザ光ビームにより照明されるように配置される第一のレンズ（Ｌ１’）と、
－ 前記光拡散装置と対向する前記第一のレンズの焦点面の像を前記対物レンズの前記前焦点面上に形成する第二のレンズ（Ｌ２’）と、
を含む、請求項５に記載の装置。

【請求項8】

前記液体又は液体含有サンプルを収容するのに適した、少なくとも１つの透明壁（ＴＷ）を有する流体セル（ＦＣ）をさらに含み、前記光学システム（ＯＳ、ＯＳ’）は、前記光生成システムからの光を前記１つ又は複数の透明壁を通じて前記流体セルの中へと向け、前記流体セル内に含まれる前記円柱領域内で前記均一な光強度レベルを生成するように構成される、請求項１～７の何れか１項に記載の装置。

【請求項9】

前記検知システムは、前記サンプルからの蛍光発光を検出するように構成された光検出器を含む、請求項１～８の何れか１項に記載の装置。

【請求項10】

前記光検出器はカメラ（ＣＡＭ）を含む、請求項９に記載の装置。

【請求項11】

前記光検出器は光電子増倍管（ＰＭＴ）とマルチピクセルフォトンカウンタ（ＭＰＰＣ）の少なくとも一方を含む、請求項９又は１０に記載の装置。

【請求項12】

前記光生成システムは、前記生成された光の前記強度レベルがその中で調整可能な範囲が少なくとも１００ｅｉｎ・ｍ^－２ｓ^－１の上限まで延長されるように構成される、請求項１～１１の何れか１項に記載の装置。

【請求項13】

前記プロセッサは、前記サンプル内の光化学反応の時間的発展を表す少なくとも１つのパラメータを計算するために、前記検知システムからの少なくとも１つの時間的連続の測定を処理するようにさらに構成される、請求項１～１２の何れか１項に記載の装置。

【請求項14】

－ 各サブシーケンスは、すべてのサブシーケンス中に第一の波長において一定の強度で、それと同時に、前記第一の波長とは異なる第二の波長において、第一の一定値（Ｉ）と第二の、それより大きい一定値（ＩＩ）との交互の強度で、前記サンプルを照明することを含み、
－ 前記プロセッサは、前記第二の波長での前記強度値が前記第一の一定値と等しい間に行われる前記サンプルの前記光学特性の第一の一連の測定（ＦＳ１）から光化学反応の時間的発展を表す少なくとも１つの第一のパラメータと、前記第二の波長での前記強度値が前記第二の一定値と等しい間に行われる前記サンプルの前記光学特性の第二の一連の測定（ＦＳ２）から少なくとも１つの第二の時間定数を決定するように構成される、
請求項３に従属する場合の請求項１３に記載の装置。

【請求項15】

－ 各サブシーケンスは、前記サンプルが一定の強度（Ｉ）で照明される第一の時間ウィンドウと、それと交互の、増加する持続時間の、前記サンプルが照明されない第二の時間ウィンドウ（０）との連続を含み、前記一定強度は１つのサブシーケンスから次へと変化し、
－ 前記プロセッサは、少なくとも１つの第一の時間ウィンドウ中に行われる前記サンプルの前記光学特性の第一の一連の測定（ＦＳ１’）から光化学反応の時間的発展を表す少なくとも１つの第一のパラメータと、複数の連続する第一の時間ウィンドウの開始時に行われる前記サンプルの前記光学特性の第二の一連の測定（ＦＳ２’）から前記光化学反応の時間的発展を表す少なくとも１つの第二のパラメータとを決定するように構成される、
請求項１３に記載の装置。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、液体又は液体含有サンプルの光化学測定を行うための装置に関する。より詳しくは、本発明はサンプル中に含まれる少なくとも１つの化学種がかかわる光化学反応の少なくとも速度論的パラメータを異なる照明条件下で測定するための装置に関する。速度論的パラメータは、例えば、反応の、又はそのステップの量子収量又は緩和時間であり得る。

【背景技術】

【0002】

本発明は例えば、蛍光分子、特に蛍光タンパク質（ＦＰ：ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ）及び可逆的光スイッチ型蛍光タンパク質（ＲＳＦＰ：ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｙ ｐｈｏｔｏｓｗｉｔｃｈａｂｌｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ）等の光活性化化学種の緩和時間の測定に適用される。本発明は蛍光分子の場合に限定されず、光の影響下で少なくとも１つの光学特性（蛍光発光、吸収率、吸収スペクトル、ラマン散乱等）において変化を示すあらゆる光活性化化学種に適用される。また、本発明は、緩和時間の測定に限定されず、光学特性等に影響を与える光化学反応の時間的発展（速度論）を説明する様々なパラメータを測定できる。

【0003】

「化学種」という用語は、分子、分子イオン、又は化合物を意味すると理解されたい。

【0004】

「光活性化化学種」とは、光の影響下で化学的転移を起こす化学種である。

【0005】

「可逆的光スイッチ型」分子は、異なる光学（例えば、蛍光）特性を有する少なくとも２つの異なる状態を有し、光の影響下で１つの状態から他の状態に可逆的に移行し得る特定の分類の光活性化種（例えば、タンパク質）である。蛍光可逆的光スイッチ型種の例は、「Ｄｒｏｎｐａ」及び化合物の「Ｓｐｉｎａｃｈ－ＤＦＨＢＩ」（「Ｓｐｉｎａｃｈ」はＲＮＡアプタマであり、ＤＦＨＢＩは発蛍光プローブである）である。これらの種は特に標識又はマーカとして使用され得る。

【0006】

蛍光イメージング及び特に蛍光顕微鏡法は、蛍光標識の高い感度と汎用性から、生物学にとってきわめて重要となっている。蛍光標識を同定し、識別するための一般的な方法は、スペクトルドメインで蛍光信号を読み出すことである。しかしながら、スペクトル識別には高度な多項目観察について限界が見られる。光源、色収差が補正された光学系、ダイクロイックミラー、光フィルタ等の豊富なハードウェアがあっても、重なった吸収及び発光バンドのスペクトル解析では最大でも４つの標識しか識別できないのが普通である。最新技術のスペクトル特性分離（ｓｐｅｃｔｒａｌ ｕｎｍｉｘｉｎｇ）を用いれば、この数は６に増え、そのうちの５つは遺伝的にコード化されている（［Ｖａｌｍ ２０１７］）が、必要な光子量（ｐｈｏｔｏｎ ｂｕｄｇｅｔ）と計算時間の点でコストが高い。これは新規な遺伝子工学戦略の識別力を大きく制限している。

【0007】

蛍光体の最適化（光吸収のための断面積、発光の量子収量、吸収／発光バンドの半値幅）は基本的にその物理的限界まで行われており、蛍光は引き続き生体細胞の画像形成のために非常に有利な観察可能物であるはずであるため、蛍光体をさらに識別するために、スペクトル次元を１つ又は複数の追加の次元で補うことがきわめて望ましい。そして実際に、蛍光体を、その吸収－蛍光発光の光サイクルを特徴付ける動力学的な、すなわち時間的な情報を使って識別するための幾つかの技術が開発されている。

【0008】

例えば、蛍光寿命顕微鏡法（ＦＬＩＭ：Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｌｉｆｅｔｉｍｅ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）では、励起状態の寿命を利用して蛍光体が識別される（［Ｌａｋｏｗｉｃｚ １９９２］）。しかしながら、高度な器具と高速の電子機器が必要となること以上に、この方法は、現在蛍光イメージングで使用されている明るい蛍光体の寿命のばらつきの範囲が狭い（１桁未満）ことにより限定される。したがって、多重蛍光寿命イメージングには、デコンボリューション（時間がかかる）又は減算方式（ロバスト性を欠き、信号対ノイズ比が下がる）の適用が必要である。

【0009】

可逆的光スイッチ型蛍光体（ＲＳＦであり、ＲＳＦＰはその一部）にはこのような欠点がない。これらの標識は、吸収－蛍光発光の光サイクルをはるかに超える豊富な光化学反応から利益を受ける。可逆的光スイッチ型蛍光体では、照明が光化学的及び熱工程を含む幾つかの光サイクルを駆動し、これらは広い範囲の緩和時間（μ秒～秒）にわたって干渉し、生物学的現象のリアルタイムの観察と両立する時間スケールでの識別が容易となる。したがって、幾つかのプロトコルでは、デコンボリューションにも減算方式にも依存せずに、分光的に類似したＲＳＦの画像を形成するために光の変化に対する蛍光の時間応答を利用している（「ダイナミックコントラスト」）。例えば、［Ｍａｒｒｉｏｔｔ ２００８］に記載されているＯＬＩＤ（Ｏｐｔｉｃａｌ Ｌｏｃｋ－Ｉｎ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）、［Ｗｉｄｅｎｇｒｅｎ ２０１０］に記載されているＴＲＡＳＴ（Ｔａｒｎｓｉｅｎｔ Ｓｔａｔｅ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）、［Ｒｉｃｈａｒｄｓ ２０１０］に記載されているＳＡＦＩＲｅ（Ｓｙｎｃｈｒｏｎｏｕｓｌｙ Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｉｍａｇｅ Ｒｅｃｏｖｅｒｙ）、［Ｑｕｅｒａｒｄ ２０１５］及び国際公開第２０１５０７５２０９号パンフレットに記載されているＯＰＩＯＭ（Ｏｕｔ－ｏｆ－Ｐｈａｓｅ Ｉｍａｇｉｎｇ ａｆｔｅｒ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ）、並びに［Ｑｕｅｒａｒｄ ２０１７］及び国際公開第２０１８／０４１５８８号パンフレットに記載されている、Ｓｐｅｅｄ ＯＰＩＯＭが挙げられ得る。

【0010】

これらのプロトコルを実装する前に、標識を、１つ又は複数の励起波長についてのその緩和時間を測定することによって特徴付けることが必要である（ＯＬＩＤ、ＳＡＰＨＩＲｅ、及びＳｐｅｅｄ ＯＰＩＯＭは２色照明に依拠する）。さらに、場合により、緩和時間は照明強度に依存し得る（これは特に、検出が依拠する光化学反応の速度が熱により誘導されるステップではなく光により誘導されるステップにより限定される場合に起こる）。光強度が光化学反応速度論に与える影響もまた特徴付ける必要がある。

【0011】

しかしながら、このような特徴付けは非常に面倒である可能性がある。第一に、現時点では、１つの測定装置で関係するすべての強度範囲を調査することは不可能であり、この範囲は蛍光顕微鏡法の種類に応じて５桁、或いはさらにそれ以上にも及び得る（広視野顕微鏡法の１０^－１－１０^１Ｗ／ｃｍ^２から共焦点顕微鏡の１０^４－１０^６Ｗ／ｃｍ^２）。第二に、液体又は液体含有サンプルに対して行われる測定は拡散効果の影響を受けやすく、それは、新しい基底状態の、照明される分子が連続的に検出領域にそれぞれ供給され、そこから出るからである。言うまでもなく、拡散により、測定される信号から関係する光化学情報を抽出することがより難しくなる一方で、測定間にサンプルが継続的に刷新されることで、本来であれば信号の消光につながり得る退色の悪影響が軽減されるという有利な効果もある。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0012】

【文献】国際公開第２０１５／０７５２０９号

【文献】国際公開第２０１８／０４１５８８号

【非特許文献】

【0013】

【文献】［Ｖａｌｍ ２０１７］

【文献】［Ｌａｋｏｗｉｃｚ １９９２］

【文献】Ｇ．Ｍａｒｒｉｏｔｔ，Ｓ．Ｍａｏ，Ｔ．Ｓａｋａｔａ，Ｊ．Ｒａｎ，Ｄ．Ｋ．Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｃ．Ｐｅｔｃｈｐｒａｙｏｏｎ，Ｔ．Ｊ．Ｇｏｍｅｚ，Ｅ．Ｗａｒｐ，Ｏ．Ｔｕｌｙａｔｈａｎ，Ｈ．Ｌ．Ａａｒｏｎ，Ｅ．Ｙ．Ｉｓａｃｏｆｆ，ａｎｄ Ｙ．Ｙａｎ．Ｏｐｔｉｃａｌ ｌｏｃｋ－ｉｎ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｉｍａｇｉｎｇ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ｆｏｒ ｃｏｎｔｒａｓｔ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｉｍａｇｉｎｇ ｉｎ ｌｉｖｉｎｇ ｃｅｌｌｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，１０５：１７７８９－１７７９４，２００８

【文献】Ｊ．Ｗｉｄｅｎｇｒｅｎ．Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ－ｂａｓｅｄ ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｓｔａｔｅ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｆｏｒ ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ ａｎｄ ｉｍａｇｉｎｇ．Ｊ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ，７：１１３５－１１４４，２０１０

【文献】Ｃ．Ｉ．Ｒｉｃｈａｒｄｓ，Ｊ．－Ｃ．Ｈｓｉａｎｇ，ａｎｄ Ｒ．Ｍ．Ｄｉｃｋｓｏｎ．Ｓｙｎｃｈｒｏｎｏｕｓｌｙ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｍａｇｅ ｒｅｃｏｖｅｒｙ（ＳＡＦＩＲｅ）．Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ｂ，１１４：６６０－６６５，２０１０

【文献】Ｊ．Ｑｕｅｒａｒｄ，Ｔ．－Ｚ．Ｍａｒｋｕｓ，Ｍ．－Ａ．Ｐｌａｍｏｎｔ，Ｃ．Ｇａｕｒｏｎ，Ｐ．Ｗａｎｇ，Ａ．Ｅｓｐａｇｎｅ，Ｍ．Ｖｏｌｏｖｉｔｃｈ，Ｓ．Ｖｒｉｚ，Ｖ．Ｃｒｏｑｕｅｔｔｅ，Ａ．Ｇａｕｔｉｅｒ，Ｔ．Ｌｅ Ｓａｕｘ，ａｎｄ Ｌ．Ｊｕｌｌｉｅｎ．Ｐｈｏｔｏｓｗｉｔｃｈｉｎｇ ｋｉｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ ｐｈａｓｅ－ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｄｄ ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｖｅ ｄｉｍｅｎｓｉｏｎｓ ｆｏｒ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｍａｇｉｎｇ．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．，１２７：２６７１－２６７５，２０１５

【文献】Ｊ．Ｑｕｅｒａｒｄ，Ｒ．Ｚｈａｎｇ，Ｚ．Ｋｅｌｅｍｅｎ，Ｍ．－Ａ．Ｐｌａｍｏｎｔ，Ｘ．Ｘｉｅ，Ｒ．Ｃｈｏｕｋｅｔ，Ｉ．Ｒｏｅｍｇｅｎｓ，Ｙ．Ｋｏｒｅｐｉｎａ，Ｓ．Ａｌｂｒｉｇｈｔ，Ｅ．Ｉｐｅｎｄｅｙ，Ｍ．Ｖｏｌｏｖｉｔｃｈ，Ｈ．Ｌ．Ｓｌａｄｉｔｓｃｈｅｋ，Ｐ．Ｎｅｖｅｕ，Ｌ．Ｇｉｓｓｏｔ，Ａ．Ｇａｕｔｉｅｒ，Ｊ．－Ｄ．Ｆａｕｒｅ，Ｖ．Ｃｒｏｑｕｅｔｔｅ，Ｔ．Ｌｅ Ｓａｕｘ，ａｎｄ Ｌ．Ｊｕｌｌｉｅｎ．Ｒｅｓｏｎａｎｔ ｏｕｔ－ｏｆ－ｐｈａｓｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ａｎｄ ｒｅｍｏｔｅ ｉｍａｇｉｎｇ ｏｖｅｒｃｏｍｅ ｓｐｅｃｔｒａｌ ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎｓ．Ｎａｔ．Ｃｏｍｍ．，８：９６９，２０１７

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0014】

したがって、広い範囲の強度にわたり、拡散の影響を無視できる程度に保持することによって、液体又は液体含有サンプルに対して光化学反応速度論的測定を行うことのできる装置が求められている。

【課題を解決するための手段】

【0015】

本発明によれば、この目標は、特許請求項１に記載の、液体又は液体含有サンプルの光化学測定を行うための装置により達成され、これは、光生成システムと、光生成システムからの光をサンプルに向けるように構成された光学システムと、サンプルを所定の照明シーケンスにより照明するために光強度値を変調することによって光生成システムを制御するように構成又はプログラムされたプロセッサ（ＰＲ）と、サンプルの少なくとも１つの光学特性を測定するための検知システムと、を含み、
－ 光生成システムは、少なくとも３桁、好ましくは少なくとも５桁にわたる範囲内で調整可能な強度レベルを有する少なくとも１つの波長の光を生成するように構成されることと、
－ 光学システムは、半径の５倍より高いかそれと等しい高さを有するサンプルの円柱領域内で、プラス又はマイナス３０％、好ましくはプラス又はマイナス２０％、さらにより好ましくはプラス又はマイナス１０％の公差の均一な光強度レベルを生じさせるように、光生成システムからの光をサンプルに向けるように構成され、前記範囲は少なくとも３μｍであること
を特徴とする。

【0016】

有利な点として、光生成システムは、同じ波長（すなわち、少なくとも部分的に重複するスペクトルを有する）で、それぞれ第一の強度範囲内及び第二の強度範囲内で調整可能な強度レベルの光を生成するように構成された少なくとも第一及び第二の光源を含み得て、第一の強度範囲は第二の強度範囲のそれらより高い強度レベルを含み、第一及び第二の強度範囲の合算は、少なくとも３桁、好ましくは少なくとも５桁の範囲に及ぶ。

【0017】

さらに、有利な点として、装置は、異なる波長の光を生成するように構成された複数の第一の光源と、複数のそれぞれの第二の光源であって、その各々は、対応する第一の光源に比べて同じ波長の光を生成する（すなわち、少なくとも部分的に重複するスペクトルを有する）ように構成される第二の光源と、を含み得て、装置は、少なくとも第一の光源により発せられた光ビームを結合するための第一のダイクロイックミラーと第二の光源により発せられた光ビームを結合するための第二のダイクロイックミラーとをさらに含む。

【0018】

装置の特定の実施形態は、特許請求の範囲の従属項の主旨を構成する。

【0019】

本発明のその他の特徴と利点は、下記のような添付の図面とともに後述の説明を読むことにより明らかとなるであろう。

【図面の簡単な説明】

【0020】

【図1】レーザ源とＬＥＤ源を含む本発明の第一の実施形態による装置を表す。

【図2A】図１の装置のＬＥＤ源により生成される照明プロファイルを示す。

【図2B】図１の装置のＬＥＤ源により生成される照明プロファイルを示す。

【図3A】図１の装置のレーザ源により生成される照明プロファイルを示す。

【図3B】図１の装置のレーザ源により生成される照明プロファイルを示す。

【図3C】図１の装置のレーザ源により生成される照明プロファイルを示す。

【図3D】図１の装置のレーザ源により生成される照明プロファイルを示す。

【図4】同じくレーザ源とＬＥＤ源を含む本発明の第二の実施形態による装置を表す。

【図5A】図４の装置のレーザ源により生成される照明プロファイルを示す。

【図5B】図４の装置のレーザ源により生成される照明プロファイルを示す。

【図5C】図４の装置のレーザ源により生成される照明プロファイルを示す。

【図5D】図４の装置のレーザ源により生成される照明プロファイルを示す。

【図6A】「球形」照明形状を用いて行われる緩和時間測定に対する拡散の影響を示す。

【図6B】「球形」照明形状を用いて行われる緩和時間測定に対する拡散の影響を示す。

【図6C】「球形」照明形状を用いて行われる緩和時間測定に対する拡散の影響を示す。

【図7A】「球形」照明形状を用いて行われる緩和時間測定に対する拡散の影響を示す。

【図7B】「球形」照明形状を用いて行われる緩和時間測定に対する拡散の影響を示す。

【図7C】「球形」照明形状を用いて行われる緩和時間測定に対する拡散の影響を示す。

【図7D】「球形」照明形状を用いて行われる緩和時間測定に対する拡散の影響を示す。

【図8】本発明による「円柱形」照明形状を用いて行われる緩和時間測定に対する拡散の影響を示す。

【図9A】本発明による装置を用いて特徴付けるのに適した仮定上のＲＳＦＰのエネルギー準位スキームとこれらのエネルギー準位間の遷移である。

【図9B】疑似定常状態近似を通じて得られる低減エネルギー準位スキームである。

【図10A】図９Ａ及び９ＢのＲＳＦＰを特徴付けるために使用するのに適した照明及び測定シーケンスを示す。

【図10B】図９Ａ及び９ＢのＲＳＦＰを特徴付けるために使用するのに適した照明及び測定シーケンスを示す。

【図11】本発明による装置を用いて特徴付けるのに適した仮定上のＦＰのエネルギー準位スキームとこれらのエネルギー準位間の遷移である。

【図12A】図１１のＦＰを特徴付けるために使用するのに適した照明及び測定シーケンスを示す。

【図12B】図１１のＦＰを特徴付けるために使用するのに適した照明及び測定シーケンスを示す。

【図13A】ドロンパで標識した大腸菌のイメージングへの本発明の第二の実施形態による装置の応用を示す。

【図13B】ドロンパで標識した大腸菌のイメージングへの本発明の第二の実施形態による装置の応用を示す。

【図13C】ドロンパで標識した大腸菌のイメージングへの本発明の第二の実施形態による装置の応用を示す。

【発明を実施するための形態】

【0021】

図１は、本発明の第一の実施形態による装置を示す。装置は、５桁にわたる（例えば、０．５Ｗ．ｃｍ^－２～５０ｋＷ．ｃｍ^２）光強度の２種類の波長の光を生成するための光生成システムＬＧＳを含む。装置はまた、少なくとも透明壁ＴＷを有する、液体サンプルを収容するための流体セルＦＣと、光生成システムからの光を透明壁を通して流体セルへと向け、サンプルから発せられた蛍光信号を収集するように構成された光学システムＯＳと、前記蛍光信号を測定するための検知システムＳＳと、を含む。

【0022】

流体セルＦＣは単純に、数～数十マイクロメートル（例えば、５０μｍ）だけスペーサにより離間して保持される２枚のガラス板（例えば、厚さ１５０μｍ）により形成され得る。他の実施形態では、例えばマイクロ流体回路を含む、より複雑な流体セルが使用され得る。

【0023】

光生成システムＬＧＳは、「低強度」モードのための発光ダイオード（ＬＥＤ）ステージと、「高強度」モードのためのレーザダイオードステージを含む。好ましくは、「高」強度及び「低」強度モードはわずかに重複するか、又はそれらの間にごく小さいギャップ（低強度モードの上限の１０％未満）を有し、それらの合算は少なくとも３桁、好ましくは少なくとも５桁にわたる。

【0024】

ＬＥＤステージは、光源としてλ_１＝４８０±２０ｎｍ（ＦＦ０１－４８０－４０，Ｓｅｍｒｏｃｋ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）でフィルタ処理される青色発光ダイオードＬＥＤ１（Ｍ４７０Ｌ４，Ｔｈｏｒｌａｂｓ，ＮＪ）と、λ_２＝４０５±２０ｎｍ（ＥＴ ４０５／２０ｘ，Ｃｈｒｏｍａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｂｅｌｌｏｗｓ Ｆａｌｌｓ，ＶＴ）でフィルタ処理されるＵＶ発光ダイオードＬＥＤ２（Ｍ４０５Ｌ３，Ｔｈｏｒｌａｂｓ，ＮＪ）を含む。各ＬＥＤを駆動する電流はＬＥＤドライバＤＲＶ（ＤＣ ４１０４，Ｔｈｏｒｌａｂｓ，ＮＪ）によって調整され、これは外部制御モードで動作し、データ取得又は波形発生器ＷＦＧのために使用されるＡＤＣカード（ｕｓｂ－１６０４ｈｓ－２ａｏ，Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ，Ｎｏｒｔｏｎ，ＭＡ）の２つのアナログ出力により駆動される。

【0025】

レーザダイオードステージは、λ_１＝４８８ｎｍの第一のレーザダイオードＬＤ１（ＬＢＸシリーズ、Ｏｘｘｉｕｓ，Ｌａｎｎｉｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ）とλ_２＝４０５ｎｍの第二のレーザダイオードＬＤ２（０６－０１シリーズ、Ｃｏｂｏｌｔ，Ｓｏｌｎａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を含み、どちらも波形発生器ＷＦＧにより駆動される。

【0026】

光学システムＯＳは、光生成システムのＬＥＤステージと接する第一の区間と、光生成システムのレーザダイオードステージと接する第二の区間と、流体セルと接する、対物レンズＯＢＪを含む第三の区間と、検知システムＳＳと接する第四の区間を含む。

【0027】

光学システムの第一の区間は、ＬＥＤ１及びＬＥＤ２の各々の直後に設置され、光をコリメートする２つの集光装置ＬＣ１、ＬＣ２（ＡＣＬ２５４１６Ｕ，Ｔｈｏｒｌａｂｓ，Ｎｅｗｔｏｎ，ＮＪ，ｆ＝１６ｍｍ）と、ＬＥＤ１及びＬＥＤ２により発せられた光ビームを偏向させるための、レーザダイオードの動作時は光路から外される可動式ダイクロイックミラーＭ３（Ｔ４２５ＬＰＸＲ，Ｃｈｒｏｍａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｂｅｌｌｏｗｓ Ｆａｌｌｓ，ＶＴ）と、光を対物レンズＯＢＪの前焦点面ＦＦＰに集束させるために使用されるレンズＬ２（ｆ＝１００ｍｍ）を含む。

【0028】

光学システムの第二の区間は、ＬＤ２から発せられた光ビームの経路上の第一のビームエキスパンダＢＥＸ１（ＬＡ１２１３－Ａ，Ｔｈｏｒｌａｂｓ，ＮＪ，ｆ＝５０ｍｍ及びＬＡ１２８９－Ａ，Ｔｈｏｒｌａｂｓ，ＮＪ ｆ＝３０ｍｍの２つのレンズからなるアフォーカルレンズ）と、ＬＤ１から発せられた光ビームを偏向させるためのミラーＭ１と、２つの光ビームを結合するためのダイクロイックミラーＤＭ２と、２つの色消しレンズ（ＡＣ２５４－１００－Ａ，Ｔｈｏｒｌａｂｓ，Ｎｅｗｔｏｎ，ＮＪ，ｆ＝１００ｍｍ及びＡＣ２５４－０５０－Ａ，Ｔｈｏｒｌａｂｓ，Ｎｅｗｔｏｎ，ＮＪ ｆ＝５０ｍｍ）を含む第二のビームエキスパンダＢＥＸ２と、結合され、拡大されたビームの中央部を選択するダイアフラムＤＧＭ１、より正確には絞り（ＳＭ１Ｄ１２ＣＺ，Ｔｈｏｒｌａｂｓ，ＮＪ，ＵＳ）と、これらを対物レンズの後焦点面に集束させるための色消しレンズＬ１（ＡＣ２５４－２００－Ａ，ｆ＝２００ｍｍ，Ｔｈｏｒｌａｂｓ，ＮＪ，ＵＳ）を含む。絞りは対物レンズの前焦点面ＦＦＰと共役であるため、照明領域の大きさは絞りの開口を調節することによって調整できる。さらに、後述するように、レーザ光ビームの中央部を選択することは、高い光強度でサンプルをほぼ均等に照明することを確実にするのに役立つ。

【0029】

幾つかの他の実施形態において、第一のビームエキスパンダは、ＬＤ２の特性に応じて任意選択的とされ得る。

【0030】

光学システムの第三の区間は、前述のように、流体セルＦＣの内部にある、好ましくはその中心にある焦点ＦＰＴを含む前焦点面ＦＦＰを有する５０×対物レンズＯＢＪ（ＭＰＬＦＬＮ，ＮＡ ０．８、オリンパス株式会社、東京、日本）を含む。

【0031】

光学システムの第四の区間は、レーザビームからの、ダイクロイックミラーＭ３を通過した（外されていない場合）、対物レンズＯＢＪにより収集された蛍光を分離するためのダイクロイックミラーＭ４と、前記蛍光を偏向させるためのミラーＭ２を含む。ビームスプリッタ及び集光レンズの集合によって、蛍光の一部を光電子増倍管ＰＭＴに、その一部をマルチピクセルフォトンカウンタＭＰＰＣに、その一部をカメラＣＡＭに向けることができる。光電子増倍管ＰＭＴから、及びマルチピクセルフォトンカウンタＭＰＰＣから発せられる信号は、アナログ－デジタル変換器ＡＤＣによりデジタルフォーマットに変換され、カメラＣＡＭからの信号も受信するコンピュータ等のデータプロセッサＰＲに供給される。データプロセッサは、光電子増倍管ＰＭＴから、及びマルチピクセルフォトンカウンタからの測定値を処理して、少なくともサンプル内の光化学反応を表す時間定数を計算する。これはまた、波形発生器ＷＦＧも駆動し、したがってそのオンオフを切り替えることによって、及び後述の例のような（図１０Ａ、１０Ｂ、１２Ａ、１２Ｂ参照）所定の照明シーケンスにしたがって流体セル内のサンプルを照明するためにそれらの強度値を設定することによって光源を制御する。

【0032】

検知システムＳＳは、カメラＣＡＭ、光電子増倍管ＰＭＴ、及びマルチピクセルフォトンカウンタＭＰＰＣを含む。カメラはサンプルの蛍光画像を取得するために使用され、光電子増倍管ＰＭＴとマルチピクセルフォトンカウンタＭＰＰＣは信号を取得するために使用され、そこから緩和時間が計算される。マルチピクセルフォトンカウンタＭＰＰＣは好ましくはＬＥＤと共に使用される。

【0033】

ＬＥＤからの照明プロファイルを、λ_１及びλ_２で、厚さ３ｍｍのアガロースゲルに埋め込んだｐＨ７．４のＰＢＳバッファ中のフルオレセイン溶液５μＭを２４ｍｍの対物レンズを使って画像化することによって特徴付けた。図２Ａ及び２Ｂは、ＬＥＤ照明プロファイルが、半径０．５ｍｍの円柱のｚ軸（光軸に平行な高さ）に沿って２ｍｍにわたり均一であることを示している。

【0034】

レーザダイオードからの照明プロファイルは、λ_１及びλ_２で、ｐＨ７．４のＰＢＳバッファ中のフルオレセイン溶液１０μＭの薄層（厚さ５μｍの２枚のガラス板間に挟まれた）を、０～１２５μｍの範囲の軸上の異なる位置において、２０×対物レンズ、チューブレンズ、発光フィルタ、及びカメラで構成される顕微鏡によって画像化することによって特徴付けた。軸上の各位置について、照明領域の直径を測定した。図１に示される装置に関して、図３Ａ（λ_１）及び３Ｂ（λ_２）は、照明領域が０μｍにおいてほぼ均一であることを示している。さらに、図３Ｃ、３Ｄに示される０及び１２５μｍでのλ_１及びλ_２の照明プロファイルは、両方の波長でのレーザ照明が高さｈ＝１２５μｍ、半径ｒ_０＝１０μｍの円柱形プロファイルに沿って実質的に均一であることを示唆している。高強度モードで、光子束は３００ｅｉｎ・ｍ^－２ｓ^－１を実現し、これはここで考慮される波長において約１０^４Ｗ・ｃｍ^－２に対応する。調査対象の光化学系に応じて、高強度モードはこれよりわずかに低い光子束、例えば１００ｅｉｎ・ｍ^－２ｓ^－１にも対応し得る。

【0035】

図４は、本発明の第二の実施形態による装置を示す。図１のそれと比較して、図４の装置は画像化により適しており、これは、それがより広い視野のために有利でありながら、それによって実現される最大光強度が若干低いからである。装置１の装置と比較して、図４のそれは、カメラＣＡＭのみを含む、より単純な検知システムＳＳ’と、異なる第二の（レーザダイオード）区間を持つ光学システムＯＳ’を含んでいる。

【0036】

光学システムＯＳ’の第二の区間は以下を含む：
－ ２つのレーザダイオードにより発せられる結合ビームを収縮させるための２つの色消しレンズ（ＡＣ２５４－１００－Ａ，Ｔｈｏｒｌａｂｓ，Ｎｅｗｔｏｎ，ＮＪ，ｆ＝１００ｍｍ及びＡＣ２５４－０５０－Ａ，Ｔｈｏｒｌａｂｓ，Ｎｅｗｔｏｎ，ＮＪ，ｆ＝５０ｍｍ）からなる、逆向きのビームエキスパンダとして機能するアフォーカルシステムＢＥＸ２（他の幾つかの実施形態において、これはレーザダイオードの特性に応じて任意選択的であり得る）。
－ 収縮したレーザビームを立体角５°以内で均一に拡散させるための光拡散装置ＤＩＦ（ＥＤＣ－５，ＲＰＣ ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＵＳ）。
－ 拡散したレーザ光ビームをコリメートするための第一の色消しレンズＬ１’（ＡＣ２５４－０３０－Ａ，Ｔｈｏｒｌａｂｓ，Ｎｅｗｔｏｎ，ＮＪ）。したがって、拡散ビームはレンズのフーリエ平面に投射され、そこで空間均一性が実現される。
－ 光拡散装置と対向する第一のレンズの焦点面の画像を対物レンズＯＢＪ’の後焦点面上に形成するための第二の色消しレンズＬ２’（ＡＣ２５４－２００－Ａ，ｆ＝２００ｍｍ，Ｔｈｏｒｌａｂｓ，ＮＪ，ＵＳ）。これはまた、図１の装置のそれと異なり、６０×対物レンズ（ＵＰＬＳＡＰＯ６０ＸＷ，ＮＡ１．２、オリンパス株式会社、東京、日本）である。

【0037】

ＬＥＤからの照明プロファイルは、図１の装置のそれと同じであり、図２Ａ及び２Ｂに関してすでに説明した。

【0038】

レーザダイオードからの照明プロファイルは、λ_１＝４８８ｎｍ（図５Ａ ＬＤ１）及びλ_２＝４０５ｎｍ（図５Ｂ ＬＤ２）で、ｐＨ７．４のＰＢＳバッファ中のフルオレセイン溶液５μＭの厚さ８０μｍの層からの蛍光発光を、対物レンズの焦点面ＦＦＰにマッピングすることにより画像化されている。図５Ｃ及び５Ｄは、それぞれ図５Ａ及び５Ｂの画像のピクセルにおける正規化光強度の分布を示すヒストグラムである。これらのヒストグラムは、どちらの光分布も、焦点面における直径３６μｍのディスク上で変動が２０％未満の優れた空間均一性を示すことを示している。

【0039】

両方の実施形態について、光強度の較正は、よく知られた光化学的方法により行われ得る。

【0040】

図１及び４は、非限定的な例として提供されているにすぎず、幾つもの異なる実施形態が可能である。

【0041】

例えば、光生成システムは１つの波長のみの光でも、逆に３つ以上の波長の光でも生成し得る。使用可能な光源はＬＥＤ及びレーザダイオードに限定されず、例えばその代わりにフィルタ付き放電ランプ、固体又はガスレーザ等が使用されてよく、また、（例えば、膨張を通じて）強力に減衰されたレーザビームが低強度モードで使用されてよく、この場合、各強度モードのための別の光源は不要となり得る。検知システムでは異なる光センサもまた使用され得る。また、蛍光発光は探査され得る唯一の光学特性ではなく、吸収、ラマン散乱、及び屈折率の変化もまた測定され得る。光学システムのための幾つかの異なるレイアウトもまた考案され得るが、光学システムが必要な強度範囲全体にわたり、ほぼ均一な光強度レベル（プラス又はマイナス３０％、好ましくはプラス又はマイナス２０％、及びさらにより好ましくはプラス又はマイナス１０％の公差）をその半径より大きい、又はそれと等しい高さを有する流体セルの円柱形領域（以下、「円柱形照明」）内で生成するのに適していることが条件となる。好ましくは、半径は少なくとも３μｍ、さらにより好ましくは少なくとも１０μｍとなる。

【0042】

ここで、分子の拡散に対する影響を軽減するために、小さく焦点を絞った光による照明の第一の近似モデルである「球形」照明ではなく、円柱形照明を得ることの重要性について、光化学反応の２状態モデルを用いて説明する。

【0043】

Ｃ_１及びＣ_２は、例えば蛍光輝度等の異なる光学特性を有する同じ化学種の２つの異なる状態であるものとし、例えば、Ｃ_１は、λ_１で照明されたときに輝度Ｑで蛍光を発し、Ｃ_２は無視できる程度の輝度を示すと仮定する。状態Ｃ_１は、（光強度依存）速度定数

【数1】

で状態Ｃ_２に光化学的に変換され、状態Ｃ_２は、光化学及び熱による寄与を含め、速度定数

【数2】

で緩和して状態Ｃ_１に戻る。見かけ上の熱力学定数

【数3】

もまた定義される。

【0044】

指数「ｉ」は異なる照明条件を指す。より具体的には、ｉ＝Ｉはλ_１のみでの照明に対応し、ｉ＝ＩＩはλ_１及びλ_２の両方での照明に対応する。拡散が蛍光信号に与える影響を評価するためには、タイプＩの照明の場合だけを考慮するが、タイプＩＩの照明もまた後述の照明シーケンスの中で使用される。

【0045】

化学反応速度式を解くことにより、強度Ｉ_１でのタイプＩの照明では、濃度

【数4】

及び

【数5】

は次式に従うことを証明でき、

【数6】

ただし、Ｃ_ｔｏｔは全濃度であり、

【数7】

は何度も到達する安定濃度であり、

【数8】

は２つの種Ｃ_１及びＣ_２の光化学変換の緩和時間を示す。蛍光発光強度（Ｃ_１のみによると仮定する）は次式

【数9】

及び

【数10】

により与えられ、ただし、

【数11】

は初期蛍光強度である。

【0046】

δ_１２，１を波長λ_１により駆動される光異化性Ｃ_１→Ｃ_２の場合の分子断面積、δ_２１，１を波長λ_１により駆動される光異化性Ｃ_２→Ｃ_１の場合の分子断面積、

【数12】

をＣ_２→Ｃ_１の速度定数の熱部であるとする。すると速度定数は、

【数13】

のように表すことができ、したがって、

【数14】

となり、ただし、Σ_１＝δ_１２，１＋δ_２１，１である。すると、１／τ_１がＩ_１への線形依存性を示すことがわかる。

【0047】

次に、球形照明の場合を考える。照明は半径ｒ_０＝０．３μｍの球内で均一であり、その後、当初、濃度Ｃ_ｔｏｔの種Ｃ_１の溶液を収容する半径Ｒ＝２．２μｍの球形容器内で消失すると仮定する。種Ｃ_１及びＣ_２は同じ拡散係数Ｄで拡散すると仮定され、したがってそれらの濃度はどこでもＣ_１＋Ｃ_２＝Ｃ_ｔｏｔとなる。

【0048】

拡散がなく（Ｄ＝０）、照明されると、Ｃ_１は定常値

【数15】

へと指数関数的に減衰し、この値にはｋ_１２とｋ_２１の関数である時間τ^∞の１％以内に到達する。球の外では、照明が行われず、Ｃ_１はＣ_ｔｏｔと等しいままである。拡散を考慮すると、Ｃ_１の変化のダイナミクスは

【数16】

に即したものとなる。

【0049】

この式を、ｋ_２１＝１ｓ^－１、Ｄ＝１００μｍ^２ｓ^－１、及びｋ_１２の３つの値ｋ_１２＝１０ｓ^－１、１０^３ｓ^－１、１０^５ｓ^－１について数値的に解いた。数値積分の結果をＣ_ｔｏｔにわたり正規化したものが図６Ａ（ｋ_１２＝１０ｓ^－１）、６Ｂ（ｋ_１２＝１０^３ｓ^－１）、及び６Ｃ（ｋ_１２＝１０^５ｓ^－１）において点線で表され、Ｄ＝０（階段状の一定濃度）の場合の結果が実線で表されている。図７Ａ、７Ｂ、及び７Ｃは、拡散がない場合（実線）とある場合（点線）の蛍光強度の時間発展を示す。

【0050】

拡散がある場合とない場合の結果の差はｋ_１２に強く依存しており、より正確には、それはｋ_１２が減少すると増大する。高い値のｋ_１２、例えばｋ_１２＝１０^５ｓ^－１の場合、この効果は、信号対ノイズ比が十分であることを条件として（半径の半分のみで積分した場合、体積は８分の１に縮小し、その結果、信号対ノイズ比はほぼ１桁低下する点に留意されたい）、球の内側部分、例えばｒ＝０とｒ＝ｒ_０／２の間（図７Ｄに示される）の蛍光強度を積分することによって軽減できる。しかしながら、これはｋ_１２の値がより低い、例えばｋ_１２≦１０^３ｓ^－１の場合は不十分である。

【0051】

拡散がある場合とない場合の結果の相違のより定量的な評価は、拡散がある場合の信号と、拡散がない場合に得られる指数関数的に減衰する解

【数17】

との差を、次式にしたがって計算することにより得られ得る：

【数18】

ただし、

【数19】

であり、Ｖは照明領域の体積、ｄｖは体積の差、Ｃ_１は式（８）の解である。

【0052】

偏差Ｊは、速度定数ｋ_１２が典型的な周波数Ｄ／ｒ_０ ^２と比較して小さい場合に１となる傾向があり、ｋ_１２が十分に大きい値であると消失する。想定通り、Ｊはより小さく、結果は拡散係数の値が小さいほど改善される。興味深いことに、Ｊは速度定数ｋ_２１には高い感度で依存しない。計算は、拡散がない場合の指数関数的減衰を用いた緩和時間の決定が、光化学的ステップの速度定数ｋ_１２が１０^７ｓ^－１より大きいか、それと等しい場合にのみ、ｒ_０＝０．３μｍ、Ｄ＝１００μｍ^２ｓ^－１の球形反応器の中で数パーセント以内で有効であることを示しており、これは非常に制限的である。より一般的には、カットオフ速度定数

【数20】

を導入できる。

【0053】

拡散は、

【数21】

であれば、球形形状内において数パーセント以内までは無視できる。半径ｒ_０＝１０μｍのより大きいセルであっても、条件はｋ_１２≧１０^４ｓ^－１となり、依然として制限的である。

【0054】

同様の計算を、高さｈ＝８０μｍ、半径ｒ_０＝０．３μｍ及びＲ＝２．２μｍの円柱内の均一な照明を考慮して行った。図８は、拡散がある場合（Ｄ＝１００μｍ^２ｓ^－１）の蛍光信号の時間発展が、たとえｋ_１２の値が非常に小さく（ｋ_１２＝１０ｓ^－１）、且つセルの半径がｒ_０＝０．３μｍと非常に小さくても、拡散がない場合に得られるものと区別できない（拡散がある場合のデータを表す点線が拡散のない場合に対応する実線と重複する）ことを示している。より一般的には、円柱形状において、カットオフ速度定数（それを超えると拡散が無視できる程度になる）は次式

【数22】

により与えられ、これは球形形状で得られる結果よりはるかに（１０^４の係数だけ）好ましい。これらの結果はｈ＝８０μｍについて得られたものであり、これは円柱の半径及び球形容器のそれと比較して「無限」と考えることができる（そして実際、数的計算ではｈの無限値が使用された）が、これらはｈがｒ_０より十分に大きい場合は常に、特にｈ≧５・ｒ_０の場合、さらにはｈ≧１０・ｒ_０の場合にもほぼ当てはまる。

【0055】

ここで、サンプル内の光化学反応を表す時間定数を決定するために図１及び４の装置を使用することについて、２つの例を用いて説明する。第一の例は、可逆的光スイッチ型蛍光タンパク質（ＲＳＦＰ）における緩和時間の測定に関し、図９Ａ、９Ｂ、１０Ａ、及び１０Ｂに示されている。第二の例は、蛍光タンパク質（ＦＰ）における緩和時間の測定に関し、図１１、１２Ａ、及び１２Ｂに示されている。

【0056】

仮定上のＲＳＦＰは、そのエネルギー準位は図９Ａに示されるとおりであり、Ａ、Ａ’、Ｂ、及びＢ’により指定される４種類の構成をとることができ、その各々が基底状態又は励起状態Ａ^＊、Ａ’^＊、Ｂ^＊、Ｂ’^＊の何れかで存在する。状態Ａ^＊及びＡ’^＊は蛍光であり、単純にするために、これらは同じ輝度と同じ吸収及び蛍光スペクトルを有すると考える。状態Ｂ^＊及びＢ’^＊は蛍光性がないか、Ａ^＊及びＡ’^＊よりはるかに低い輝度を有する。

【0057】

波長λ_１での光子の吸収により、状態ＡからＡ^＊に、及び状態Ａ’からＡ’^＊に、波長λ_１での光強度Ｉ_１に比例する速度定数ｋ_Ａ（Ｉ_１）で励起される。放射崩壊は非常に速く、光強度に依存しない速度定数ｋ_－１で発生する。さらに、状態Ａ^＊には、熱（すなわち、光強度に依存しない）速度定数ｋ_Ａ＊で状態Ａ’への非放射崩壊が生じる可能性あり、Ａ’には比較的小さい熱速度ｋ_Ａ’で状態Ｂへの非放射崩壊が生じる可能性がある。光化学ステップ（Ａ→Ａ^＊）及び２つの熱的ステップ（Ａ^＊→Ａ’はかなり速く、Ａ’→Ｂは遅い）を通じた状態ＡからＢへの分子の変換の結果、蛍光強度が漸減する。

【0058】

波長λ_２での光子の吸収により、状態ＢからＢ^＊に、及び状態Ｂ’からＢ’^＊に、波長λ_２での光強度Ｉ_２に比例する速度定数ｋ_Ｂ（Ｉ_２）で励起される。非放射崩壊は非常に速く、光強度に依存しない速度ｋ_－２で発生する。さらに、状態Ｂ^＊には、熱（すなわち、光強度に依存しない）速度ｋ_Ｂ＊で状態Ｂ’へのより低速な非放射崩壊が生じる可能性あり、Ｂ’には比較的小さい熱速度ｋ_Ｂ’で状態Ａへの非放射崩壊が生じる可能性がある。光化学ステップ（Ｂ→Ｂ^＊）及び２つの熱的ステップ（Ｂ^＊→Ｂ’、Ｂ’→Ａ）を通じた状態ＢからＡへの分子の変換の結果、蛍光が徐々に回復する。

【0059】

現実的な光強度の場合、状態Ａ^＊は破壊速度定数（ｋ_－１＋ｋ_Ａ＊）よりはるかに低い速度定数（ｋ_Ａ）で作られ、したがって準安定状態が素早く達成される。同じことが、状態Ａ’^＊、Ｂ^＊、及びＢ’^＊に当てはまる。これによって、状態Ａ、Ａ’、Ｂ、及びＢ’のみを含む図９Ｂの簡略化された光サイクルが得られる。蛍光発光は、ＡとＡ’の濃度の合計（これらの状態の輝度が異なる場合は加重和）に比例する。

【0060】

明るい状態Ａは暗い状態Ｂへと第一の反応Ｒ_１を通じて変換され、これは、ｋ_Ａ、ｋ_－１、及びｋ_Ａ＊の関数であり、ｋ_Ａを通じてＩ_１に依存する速度定数ｋ_１での光化学的ステップＰＡＳ_１ Ａ→Ａ’と、強度に依存しない速度定数ｋ_Ａ’での熱的ステップＴＡＳ_１ Ａ’→Ｂを含む（単純化するための、ＡとＡ’が同じ輝度であるとの仮定の下では、第一のステップだけでは蛍光信号に影響を与えない点に留意されたい）。暗い状態Ｂは、明るい状態Ａに第二の反応Ｒ_２を通じて再び変換され、これは、ｋ_Ｂ、ｋ_－２、及びｋ_Ｂ＊の関数であり、ｋ_Ｂを通じてＩ_２に依存する速度定数ｋ_２での光化学的ステップＰＡＳ_２ Ｂ→Ｂ’と、強度に依存しない速度定数ｋ_Ｂ’での熱的ステップＴＡＳ_２ Ｂ’→Ａを含む（ＢとＢ’はどちらも暗いため、第一のステップだけでは蛍光信号に影響を与えない点に留意されたい）。

【0061】

ＲＳＦＰを波長λ_１で照明することにより（照明タイプＩ）、時間に伴う蛍光信号の減少が誘導される。「低い」Ｉ_１の値（すなわち、λ_１での光強度）では、蛍光信号の減衰速度は基本的に光化学的ステップＰＡＳ_１により決まり、他方で、「高い」Ｉ_１の値では、これは基本的に熱的ステップＴＡＳ_１により決まる。したがって、波長λ_１の異なる光強度（Ｉ_ｌｏｗ及びＩ_ｈｉｇｈの条件）での測定により、ＲＳＦＰダイナミクスに関する非冗長的な情報が提供される。

【0062】

蛍光信号が消失するか、又は少なくとも平坦域に到達すると、波長λ_２及びλ_１の両方でＲＳＦＰを照明することにより（照明タイプＩＩ）、蛍光信号の回復が誘導される。回復はλ_２での光子により誘導される光化学反応によるが、λ_１での光子は、ＡとＡ’を励起させ、消滅しない蛍光発光を生じさせるために必要である。「低い」Ｉ_２の値（すなわち、λ_２での光強度）では、蛍光信号の回復速度は基本的に光化学的ステップＰＡＳ_２により決まり、他方で、「高い」Ｉ_２の値では、これは基本的に熱的ステップＴＡＳ_２により決まる。したがって、波長λ_２の異なる光強度（Ｉ_ｌｏｗ及びＩ_ｈｉｇｈの条件）での測定により、ＲＳＦＰダイナミクスに関する追加の非冗長的な情報が提供される。全体として、ＲＳＦＰは、異なる照明条件で行われる４つの測定から得られた４つの緩和時間により同定できる。その応用の興味深いものとしては、次元が緩和時間の関数（例えば対数）である４次元空間内でのＲＳＦＰの識別を可能にすることである。

【0063】

ＲＳＦＰを特徴付ける緩和時間を測定するために、データプロセッサは装置の光源を駆動して、複数のサブシーケンスにより構成される照明シーケンスにしたがってサンプルを照明する。各サブシーケンスは、タイプＩ照明の時間ウィンドウとタイプＩＩ照明の時間ウィンドウからなる期間の連続であり、これは図１０Ａ及び１０Ｂに示されている。

【0064】

より正確には、サブシーケンスの第一の集合（図１０Ａ）で、λ_１での光強度は、その集合の中の１つのサブシーケンスから他のサブシーケンスまでの広い範囲（装置により可能な限りの広さ）にわたり一定であり、徐々に増大又は低下し、他方でλ_２での光強度はゼロと一定値とが交互である。（減少する）蛍光信号の第一の一連の測定ＦＳ１は、サブシーケンスのタイプＩ時間ウィンドウ中に行われる。適当なデータ処理、例えば指数関数フィッティングにより、Ｉ_１に応じた蛍光信号の減少速度定数を決定できる。この速度定数は、消失するほど低い光強度の場合（反応の光化学的ステップが熱的ステップより低速であり、したがって速度論の主要部を占めるとき）はｋ_１に向かい、非常に高い強度の場合（熱的ステップが光化学的ステップより低速であり、したがって速度論の主要部を占めるとき）はｋ_Ａ’に向かう。

【0065】

サブシーケンスの第二の集合（図１０Ｂ）において、λ_２での光強度は、その集合の中の１つのサブシーケンスから他のサブシーケンスまでの広い範囲（装置により可能な限りの広さ）にわたって、ゼロと徐々に増大又は減少する一定の値とが交互であり、λ_１での光強度は一定の値に保持される。（増大する）蛍光信号の第二の一連の測定ＦＳ２は、サブシーケンスのタイプＩＩ時間ウィンドウ中に行われる。適当なデータ処理、例えば指数関数フィットにより、Ｉ_２に応じた蛍光信号の回復速度定数を決定できる。この速度定数は、消失するほど低い光強度の場合（反応の光化学的ステップが熱的ステップより低速であり、したがって速度論の主要部を占めるとき）はｋ_２に向かい、非常に高い強度の場合（熱的ステップが光化学的ステップより低速であり、したがって速度論の主要部を占めるとき）はｋ_Ｂ’に向かう。

【0066】

図１０Ａ及び１０Ｂの例では、各サブシーケンスは３つの期間を含み、ＦＳ１測定は第二の期間のタイプＩウィンドウ中に行われ、ＦＳ２測定は第一の期間のタイプＩＩウィンドウ中に行われ、第三の期間は退色の効果を評価するために使用される。代替的に、ＦＳ１測定は第一の期間の第一のタイプＩウィンドウ中に行われ得て、この時間ウィンドウ中の化学的ダイナミクスは特異である。しかしながら、単純な指数から抽出された緩和時間は第二の期間のタイプＩウィンドウから抽出されたものと同様であることが実験的にわかっている。第一のタイプＩウィンドウを使用する利点は、信号の変化の振幅がより大きいことである。

【0067】

時間ウィンドウの適当な持続時間を決定するために、予備ステップとして、強力なＬＥＤ光を使ってタイプＩ及びタイプＩＩ照明を交互に適用し、教師なし双指数関数フィッティングを用いて遷移時の蛍光変化を分析し、「高速」及び「低速」緩和時間を得る。時間ウィンドウの持続時間は、このようにして決定された高速緩和時間の桁の数倍より大きくなるように設定され、選択される。例えば、本発明のある実施形態において、半期間（すなわち、時間ウィンドウの持続時間）はＬＥＤ照明について５ｓに設定され、レーザ照明については、拡散の影響を最小化するために、半期間は光強度（図１０Ａの測定中はＩ_１、図１０Ｂの測定中はＩ_２）に反比例するように選択された。

【0068】

図１１は、暗い、より低次の三重項状態を有する蛍光タンパク質（ＦＰｓ）のエネルギー準位と遷移を示している。波長λ_１での光子の吸収により、光強度Ｉ_１に比例する速度定数ｋ_Ａ（Ｉ_１）で基底状態ＡがＡ^＊へと励起される。放射崩壊は、光強度に依存しない速度定数ｋ_－１で非常に速く発生する。さらに、状態Ａ^＊にはまた、はるかに低い熱（すなわち、光強度に依存しない）速度定数ｋ_Ａ＊での暗い三重項状態Ｔへの非放射崩壊も生じる可能性がある。すると、三重項状態Ｔは熱速度定数ｋ_Ｔで基底状態Ａに戻る。

【0069】

ＦＰを特徴付ける緩和時間を測定するために、データプロセッサは装置の光源を駆動して、複数のサブシーケンスにより構成される照明シーケンスにしたがってサンプルを照明する。各サブシーケンスは、サンプルがλ_１での一定の強度で照明される（タイプＩ照明）時間ウィンドウと、サンプルが照明されない、増大する（より一般的には変動する）持続時間の第二の時間ウィンドウ０との交互の連続を含む。タイプＩ照明の一定の強度は、１つのサブシーケンスから次へと増大する。図１２Ａは、あるサブシーケンスの最初の３つの時間ウィンドウの拡大図を示し、図１２Ｂは、暗い、固定された光強度Ｉ_１での可変的な時間減衰ｔ_ｄの適用と、第二の照明の開始時と第一の照明の終了時の定常状態との間の信号差を使って回復された信号Ｉ_Ｆ ^Ｒの再構成を表示している。

【0070】

（減少する）蛍光信号の第一の一連の測定ＦＳ１’は、各サブシーケンスの少なくとも１つのタイプＩ照明時間ウィンドウ中に行われる（図１２Ａ）。指数関数フィッティング等の適当なデータ処理によって、ｋ_Ａを表す、Ｉ_１の関数としての蛍光信号の減少速度を決定できる。時間ウィンドウは、それが終了する前に蛍光信号がそれ以上は大きく変化しないことが確実になるのに十分に長いと仮定される。

【0071】

第二の一連の測定ＦＳ２’は、タイプＩ照明時間ウィンドウの開始時に行われ（同じ測定は第一及び第二の一連の測定の両方に属し得る点に留意されたい）、これは図１２Ｂの左側に示されている。各測定により、「暗い」ウィンドウ０_１、０_２、０_３の変化する持続時間ｔ_ｄ，１、ｔ_ｄ，２、ｔ_ｄ，３．．．（この例のように必ずしも単調に増大するとはかぎらない）中に蛍光信号の回復に関する情報が提供される。これらの測定により、蛍光回復信号を再構成できる（図１２Ｂの右側）。指数関数フィッティング等の適当なデータ処理により、ｋ_Ｔを表す、Ｉ_１の関数としての蛍光信号の回復速度を決定できる。

【0072】

ＲＳＦＰ、ＦＰを特徴付けるために、別の照明及び測定シーケンスが使用され得ると理解すべきである。例えば、あるサブシーケンス中に、光強度はオンとオフに切り替えられるのではなく連続的に変調されても、又は２つ非ゼロ値間で切り替えられてもよい（例えば、図１０Ａ及び１０Ｂの「タイプＩ」時間ウィンドウ中に波長λ_２での小さいが消失しない強度が保持されてもよい）。

【0073】

また、その他の蛍光体及び、より一般的にはその他の、必ずしも蛍光でない、光化学的に活性なサンプルも特徴付けられ得る。

【0074】

サンプルは、流体セル内に収容された均質液体である必要はない。例えば、サンプルは懸濁液、ゲル、エマルジョン、液体充填小孔を有する多孔質物質、区画化された液体（例えば、細胞又は生体組織内の細胞質）等であり得るか、又はこれらを含み得る。さらに、本発明の装置は、分子拡散が重要である液体又は液体含有サンプルを扱うために最適化されているものの、結晶又は非晶体等、照明領域の規模では分子拡散を全く、又はほとんど示さないサンプルの分析にも使用できる。

【0075】

図１３Ａは、図４による画像形成装置を用いて得られた、ドロンパで標識した大腸菌の蛍光画像を示す。図１３Ｂは、λ_１＝４８８ｎｍで強度Ｉ_１＝２ｅｉｎ．ｍ^－２．ｓ^－１の連続照明及びλ_２＝４０５ｎｍで強度Ｉ_２＝０．２ｅｉｎ．ｍ^－２．ｓ^－１の方形波照明でのこれらの細菌の蛍光強度の時間発展のプロットであり、蛍光減衰に一次指数フィッティングを適用して、「低強度」減衰時間定数τ^１ _ｌｏｗを抽出した。同様の取得が、λ_１＝４８８ｎｍで強度Ｉ_１＝５０ｅｉｎ．ｍ^－２．ｓ^－１の連続照明及びλ_２＝４０５ｎｍで強度Ｉ_２＝２０ｅｉｎ．ｍ^－２．ｓ^－１の方形波照明で実行され、一次指数フィッティングによって「高強度」減衰時間定数τ^１ _ｈｉｇｈを得た。図１３Ｃは、ドロンパで標識した大腸菌の２Ｄ空間での表現である（Ｉ_１＝ｌｏｇ_１０τ^１ _ｌｏｗ、Ｉ_３＝ｌｏｇ_１０τ^１ _ｈｉｇｈ）。

【0076】

参考文献
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【図1】

【図2A】

【図2B】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図3D】

【図4】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図5D】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図7A】

【図7B】

【図7C】

【図7D】

【図8】

【図9A】

【図9B】

【図10A】

【図10B】

【図11】

【図12A】

【図12B】

【図13A】

【図13B】

【図13C】