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▶ オンコシミス バイオテック プライベート リミテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-05-13
(45)【発行日】2024-05-21
(54)【発明の名称】細菌による組換えＧＬＰ－１ペプチドの連続生産方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/70 20060101AFI20240514BHJP
C12P 21/02 20060101ALI20240514BHJP
C12N 15/12 20060101ALN20240514BHJP
【ＦＩ】
C12N15/70 Z
C12P21/02 Z ZNA
C12N15/12
【請求項の数】
4
(21)【出願番号】P 2021549208
(86)(22)【出願日】2020-02-24
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-04-15
(86)【国際出願番号】 IB2020051550
(87)【国際公開番号】W WO2020170228
(87)【国際公開日】2020-08-27
【審査請求日】2023-02-15
(31)【優先権主張番号】201941007166
(32)【優先日】2019-02-24
(33)【優先権主張国・地域又は機関】IN
(73)【特許権者】
【識別番号】521315766
【氏名又は名称】オンコシミス バイオテック プライベート リミテッド
【氏名又は名称原語表記】ＯＮＣＯＳＩＭＩＳ ＢＩＯＴＥＣＨ ＰＲＩＶＡＴＥ ＬＩＭＩＴＥＤ
(74)【代理人】
【識別番号】100109793
【弁理士】
【氏名又は名称】神谷 惠理子
(72)【発明者】
【氏名】ロキレディ，サダーサナレディ
(72)【発明者】
【氏名】コナ，ベンカタ スリ クリシュナ
【審査官】上條 のぶよ
(56)【参考文献】
【文献】特開２００７－２５２３６７（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２００５－５１５１６７（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２００９－５１０１７３（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２００６－５１２９０７（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１０－５１７５３２（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２００８－５０９６８２（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１４－５１２８１４（ＪＰ，Ａ）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｐ ２１／０２
Ｃ１２Ｎ １５／７０
Ｃ１２Ｎ １５／１２
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
大腸菌による組換えＧＬＰ－１ペプチドの連続生産および分泌のための方法であって、ａ）組換えＧＬＰ－１ペプチドをコードする発現ベクターで大腸菌を形質転換して組換え大腸菌を調製する工程；
ｂ）スターター培養の増殖培地３７℃、２２５ｒｐｍで１２時間培養して、培養物のＯＤ600が５．０－６．０に達するようにした、組換え大腸菌のスターター培養物を調製する工程；
ｃ）１０ｇ／Ｌの濃度のグルコース／デキストロースを含み、ｐＨを６．９に維持する発酵槽に開始バッチ培地を添加することにより、潅流型発酵システムを調製する工程；
ｄ）前記スターター培養物を前記発酵槽に加え、最初の１時間は３ＮのＮａＯＨを使用し、この１時間後には、４Ｍの液体アンモニアを使用してｐＨを６．９に維持する工程；
ｅ）前記開始バッチ培地の残留グルコース／デキストロース濃度が約５ｇ／Ｌに減少したときに、ラクトースまたはラクトース類似体であるｌａｃオペロン誘導剤を前記発酵槽に添加して、前記組換え大腸菌から組換えＧＬＰ－１ペプチドの産生および分泌を誘導する工程；及び
ｆ）前記誘導から３０～４０分後に、前記潅流型発酵システムを開始して、分泌された組換えＧＬＰ－１ペプチドを含む使用済み培地を透過液として、組換え大腸菌を保持液（retantate）として分離し、
前記透過液から組換えＧＬＰ－１ペプチドを採集し、
前記発酵槽に新鮮な灌流培地および前記組換え大腸菌保持液（retantate）を再供給して、組換えＧＬＰ－１ペプチドを連続的に産生および分泌する工程；
を含み、
前記組換えＧＬＰ－１をコードするＤＮＡ配列は配列ＩＤ１であり、
遺伝子ｏｍｐｆのシグナルペプチド及びキャリアペプチドとしての切断型ｙｅｂｆペプチド（配列ＩＤ５）をコードするＤＮＡ配列（配列ＩＤ３）の組み合わせを含む分泌シグナル配列は、前記配列ＩＤ１に連結していて、
前記組換え発現ベクターは、前記分泌シグナルに連結した配列ＩＤ１を含んだ、配列ＩＤ６で表され、
配列ＩＤ６の組換え発現ベクターを用いた前記潅流型発酵システムにより、１～１．２ｇ／Ｌ／ｈｒの範囲で組換えＧＬＰ－１ペプチドを分泌する、
組換えＧＬＰ―１ペプチドを連続生産及び分泌する方法。
【請求項2】
前記開始バッチ培地は、１３９ｍＭグルコース／デキストロース；
３０．２ｍＭ窒素源；
安定化剤として５４．２９ｍＭグリセロール；
８．８４ｍＭクエン酸；
必須アミノ酸として１ｍＭグリシン；
正に帯電したアミノ酸としての１ｍＭアルギニン；
０．０６ｍＭチアミン；
５ｍＭ硫酸マグネシウム七水和物；
９７．７３ｍＭリン酸二水素カリウム；
２．１３ｍＭ塩化ナトリウム；
０．０９ｍＭ塩化カルシウム；及び
微量元素の塩として、１～５ｇ／Ｌのクエン酸鉄（III）、０．１～２ｇ／ＬのＣｏＣｌ２－６Ｈ２Ｏ、０．５～５ｇ／ＬのＭｎＣｌ２－４Ｈ２Ｏ、０．０１～１ｇ／ＬのＣｕＣｌ２－２Ｈ２Ｏ、０．１～１ｇ／ＬのＨ３ＢＯ３、０．０１～１ｇ／ＬのＮａ２ＭｏＯ４－２Ｈ２Ｏ、０．５～５ｇ／Ｌの酢酸亜鉛－２Ｈ２Ｏ；及び
キレート剤として０．０１－５ｇ／ＬのＥＤＴＡ
を含む化学的に規定された培地である、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記灌流培地は、１３．９ｍＭのグルコース／デキストロース；
３０．２ｍＭ窒素源；
安定化剤として５４．２９ｍＭグリセロール；
８．８４ｍＭクエン酸；
必須アミノ酸として１ｍＭグリシン；
正に帯電したアミノ酸としての１ｍＭアルギニン；
０．０６ｍＭチアミン；
１ｍＭ硫酸マグネシウム七水和物；
９７．７３ｍＭリン酸二水素カリウム；
２．１３ｍＭ塩化ナトリウム；
０．０９ｍＭ塩化カルシウム；及び
微量元素の塩として、１～５ｇ／Ｌのクエン酸鉄（III）、０．１～２ｇ／ＬのＣｏＣｌ２－６Ｈ２Ｏ、０．５～５ｇ／ＬのＭｎＣｌ２－４Ｈ２Ｏ、０．０１～１ｇ／ＬのＣｕＣｌ２－２Ｈ２Ｏ、０．１～１ｇ／ＬのＨ３ＢＯ３、０．０１～１ｇ／ＬのＮａ２ＭｏＯ４－２Ｈ２Ｏ、０．５～５ｇ／Ｌの酢酸亜鉛－２Ｈ２Ｏ；及び
キレート剤として０．０１－５ｇ／ＬのＥＤＴＡ
を含む化学的に規定された培地である、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
前記潅流型発酵システムは、供給タンク、フィードポンプ、レベルセンサー、モーター、発酵槽、磁気浮上ポンプ、分離モジュール、収穫用ポンプ、および収穫用タンクを含み、
前記分離モジュールは、培養培地から分泌された組換えタンパク質の分離に適した中空糸膜のフィルターモジュールを含み、
前記フィルターモジュールは、０．４μｍから０．１μｍの間の多孔度を有する、ポリスルホン製中空糸膜、及びメチルエステルまたはセルロースエステル製中空糸膜のフィルターモジュールであり、
前記中空糸膜のカットオフポアサイズは５００ｋＤａであり、
前記潅流型発酵システムは、組換え大腸菌を含む培養培地（組換え大腸菌培養培地）を、交互のタンジェント流で分離系内を循環し、
前記分離系は、前記組換え大腸菌培養培地から、組換えＧＬＰ―１ペプチドを含む使用済み培地を含む濾液を分離し、前記組換え大腸菌培養培地に前記組換え大腸菌を保持するものである請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、細菌、より具体的には大腸菌による組換えグルカゴン様ペプチド－１（ＧＬＰ－１）の連続生産および分泌方法に関する。
【背景技術】
【0002】
グルカゴン様ペプチド1（ＧＬＰ－１）は、回腸遠位部及び結腸のＬ細胞で産生される３１アミノ酸の強力な内分泌ホルモンである。Ｌ細胞では、ＧＬＰ－１はプログルカゴン遺伝子の組織特異的な翻訳後プロセシングによって生成される。ブドウ糖、脂肪酸、食物繊維などの栄養素は、いずれも、ＧＬＰ－１をコードする遺伝子の転写をアップレギュレートすることが知られており、このホルモンの放出を刺激することができる。
【0003】
初期生成物としてのＧＬＰ－１（１－３７）は、アミド化とタンパク質分解による切断を受けやすく、生物活性が等しい２つの切断型のＧＬＰ－１（７－３６）アミドとＧＬＰ－１（７－３７）を生じる。
【0004】
ＧＬＰ－１はインクレチンであり、インスリン分泌促進効果を示す。つまり、インスリンの分泌を促進することにより、グルコース依存的に血糖値を低下させる効能がある。インシュリントロピック効果に加えて、ＧＬＰ－１は多様なレギュレーション、効用効能に関係している。ＧＬＰ－１が２型糖尿病の患者にも有用であることが知られていることから、ＧＬＰ－１をベースとする治療法の開発として、実質的な製薬研究が行われるようになってきた。ＧＬＰ－１は、肥満などの代謝障害の管理関連の治療薬候補にも関係している。
【0005】
したがって、ＧＬＰ－１の生産は重要であり、組換え細菌、より具体的には産生効率が高い大腸菌を使用して組換えＧＬＰ－１ペプチドを生産する方法が必要であり、かかる技術的課題が存在する。
【発明の目的】
【0006】
本発明の主な目的は、細菌、より具体的には大腸菌による組換えＧＬＰ－１ペプチドの連続的な生産および分泌方法を提供することである。ここで、組換えＧＬＰ－１は、新規の細菌発現ベクターを使用することによって細菌により産生され、潅流型発酵システムを用いて化学的に規定された培地で細菌を培養することにより、ＧＬＰ－１ペプチドを細胞外に分泌する。
【0007】
本発明の別の目的は、ＧＬＰ－１ペプチドをコードするＤＮＡ配列（配列ＩＤ１）を含む新規の細菌発現ベクターを使用することによって、組換えＧＬＰ－１の分泌を増強する方法を提供することである。少なくとも１つの分泌シグナル配列（ＤＮＡ配列）、並びにＧＬＰ－１ペプチドの精製を可能にする少なくとも１つのアフィニティータグ配列も提供する。
【0008】
本発明のさらに別の目的は、化学的に規定された培地を用いて容易に精製される組換えＧＬＰ－１を製造する方法を提供することにある。
【0009】
本発明のさらに別の目的は、培養懸濁液から分泌された組換えＧＬＰ－１を継続的に分離するためのタンジェント濾過流が交互に流通するようにカスタマイズされた分離系を用いて、細菌における組換えＧＬＰ－１の生産および分泌を増強するためのシステムおよび方法を提供することである。
【発明の概要】
【0010】
本発明は、細菌を使用して組換えＧＬＰ－１を生産する方法に関する。より具体的には、本発明は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）による組換えＧＬＰ－１の生産および分泌に関する。
【0011】
主な実施形態において、本発明は、細菌、より具体的には、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）においてＧＬＰ－１を生産する方法を提供する。当該方法は、少なくとも1つの分泌シグナル配列と結合したＧＬＰ－１をコードするＤＮＡ配列（配列ＩＤ１）を有する細菌発現ベクター（配列ＩＤ６）で大腸菌を形質転換する工程；
スターター培養用増殖培地にて３７℃で２２５ｒｐｍで１２時間培養して、培養物のＯＤ600が５．０－６．０に達するまで増殖させる、組換え大腸菌のスターター培養物を調製する工程；
１０ｇ／Ｌの濃度のグルコース／デキストロースを含む発酵槽に開始バッチ培地を添加し、ｐＨを６．９に維持することにより、潅流型発酵槽システムを調製する工程；
前記スターター培養物を発酵槽に加え、最初の１時間は３ＮのＮａＯＨを使用し、その１時間後に４Ｍ液体アンモニアを使用してｐＨを６．９に維持する工程；
前記開始バッチ培地の残留グルコース／デキストロース濃度が約５ｇ／Ｌに減少したときに、ラクトースまたはラクトース類似体などのｌａｃオペロン誘導剤を前記発酵槽に添加し、組換え大腸菌から組換えＧＬＰ－１ペプチドの産生および分泌を誘導する工程；
誘導後、３０～４０分経過後に、前記潅流型発酵システムを開始して、分泌された組換えＧＬＰ－１ペプチドを含む使用済み培地を透過液として、組換え大腸菌を保持液（retantate）として分離し、前記透過液から組換えＧＬＰ－１ペプチドを回収し、前記発酵槽に新鮮な灌流培地および前記組換え大腸菌の保持液を再供給して、組換えＧＬＰ－１ペプチドの継続的な産生および分泌する工程を含む。
スターター培養用増殖培地にて３７℃で２２５ｒｐｍで１２時間培養して、培養物のＯＤ600が５．０－６．０に達するまで増殖させる、組換え大腸菌のスターター培養物を調製する工程；
１０ｇ／Ｌの濃度のグルコース／デキストロースを含む発酵槽に開始バッチ培地を添加し、ｐＨを６．９に維持することにより、潅流型発酵槽システムを調製する工程；
前記スターター培養物を発酵槽に加え、最初の１時間は３ＮのＮａＯＨを使用し、その１時間後に４Ｍ液体アンモニアを使用してｐＨを６．９に維持する工程；
前記開始バッチ培地の残留グルコース／デキストロース濃度が約５ｇ／Ｌに減少したときに、ラクトースまたはラクトース類似体などのｌａｃオペロン誘導剤を前記発酵槽に添加し、組換え大腸菌から組換えＧＬＰ－１ペプチドの産生および分泌を誘導する工程；
誘導後、３０～４０分経過後に、前記潅流型発酵システムを開始して、分泌された組換えＧＬＰ－１ペプチドを含む使用済み培地を透過液として、組換え大腸菌を保持液（retantate）として分離し、前記透過液から組換えＧＬＰ－１ペプチドを回収し、前記発酵槽に新鮮な灌流培地および前記組換え大腸菌の保持液を再供給して、組換えＧＬＰ－１ペプチドの継続的な産生および分泌する工程を含む。
【0012】
さらに別の実施形態では、配列ＩＤ６の組換え発現ベクターを、前記潅流型発酵システムにて使用することで、１～１．２ｇ／Ｌ／ｈｒの範囲で組換えＧＬＰ－１ペプチドを分泌する。
【0013】
別の実施形態では、本発明は、表２に記載の組成を有する化学的に規定された培地であるスターター培養用培地、開始バッチ培地、および灌流培地を提供する。
【0014】
さらに別の実施形態では、本発明は、組換え大腸菌を含む培養培地が交互のタンジェント流で分離系内での循環を可能にする潅流型発酵システムを提供する。この分離系は、培地から、組換えＧＬＰ－１ペプチドを含む使用済み培地を含む濾液を分離除去し、連続生産用の培養培地に組換え大腸菌を保持する。
【0015】
さらに別の実施形態では、本発明は、新規な細菌発現ベクターを提供する。当該発現ベクターは、以下のＤＮＡ配列を含む。
１）ＧＬＰ－１ペプチドをコードするＩＤ１のＤＮＡ配列；
２）ａ）ｐｅｌＢ、ｏｍｐＡ、ｙｅｂＦ、およびｏｍｐＦからなる群から選択される遺伝子のシグナル配列をコードする少なくとも１つのＤＮＡ配列、および、ｂ）キャリアペプチドをコードする少なくとも１つのＤＮＡ配列（好ましくは、配列ＩＤ４またはＩＤ５の切断型ｙｅｂＦをコードするＤＮＡ配列ＩＤ２またはＩＤ３）の組み合わせである少なくとも１つの分泌シグナル配列；
３）少なくとも１つの遺伝子発現カセットであって、少なくとも１つの誘導性プロモーター、ＲＢＳ、組換えＧＬＰ－１ペプチドをコードするＤＮＡ配列、アフィニティータグをコードするＤＮＡ配列、および少なくとも１つの遺伝子ターミネーターを含み、前記アフィニティータグのＤＮＡ配列は、前記分泌シグナル配列とともに、前記組換えＧＬＰ－１ペプチドのＤＮＡ配列に作動可能に連結されている遺伝子発現カセット；
４）宿主細菌細胞におけるベクターの複製のための少なくとも1つの細菌ｏｒｉ遺伝子配列；
５）選択可能なマーカーをコードするための少なくとも１つのＤＮＡ配列であって、当該選択可能なマーカーのＤＮＡ配列に隣接する遺伝子ターミネーター配列と適切なプロモーターを伴っているＤＮＡ配列。
１）ＧＬＰ－１ペプチドをコードするＩＤ１のＤＮＡ配列；
２）ａ）ｐｅｌＢ、ｏｍｐＡ、ｙｅｂＦ、およびｏｍｐＦからなる群から選択される遺伝子のシグナル配列をコードする少なくとも１つのＤＮＡ配列、および、ｂ）キャリアペプチドをコードする少なくとも１つのＤＮＡ配列（好ましくは、配列ＩＤ４またはＩＤ５の切断型ｙｅｂＦをコードするＤＮＡ配列ＩＤ２またはＩＤ３）の組み合わせである少なくとも１つの分泌シグナル配列；
３）少なくとも１つの遺伝子発現カセットであって、少なくとも１つの誘導性プロモーター、ＲＢＳ、組換えＧＬＰ－１ペプチドをコードするＤＮＡ配列、アフィニティータグをコードするＤＮＡ配列、および少なくとも１つの遺伝子ターミネーターを含み、前記アフィニティータグのＤＮＡ配列は、前記分泌シグナル配列とともに、前記組換えＧＬＰ－１ペプチドのＤＮＡ配列に作動可能に連結されている遺伝子発現カセット；
４）宿主細菌細胞におけるベクターの複製のための少なくとも1つの細菌ｏｒｉ遺伝子配列；
５）選択可能なマーカーをコードするための少なくとも１つのＤＮＡ配列であって、当該選択可能なマーカーのＤＮＡ配列に隣接する遺伝子ターミネーター配列と適切なプロモーターを伴っているＤＮＡ配列。
【0016】
本発明はさらに、組換えＧＬＰ－１をコードするＤＮＡ配列（配列ＩＤ１）を提供する。
【0017】
本発明はまた、大腸菌における組換えＧＬＰ－１ペプチドの産生および分泌のための発現ベクターのＤＮＡ配列（配列ＩＤ６）を提供する。
【0018】
本発明はまた、潅流型発酵システムに関する。この潅流型発酵システムは、供給タンク、フィードポンプ、レベルセンサー、モーター、発酵槽、磁気浮上ポンプ、分離モジュール、収穫ポンプ、および収穫タンクを備えている。前記分離モジュールの中空糸カラムはフィルターモジュールを備えていて、該フィルターモジュールは、培養培地から分泌された組換えタンパク質を分離するのに適した中空糸膜のフィルターモジュールである。前記分離モジュールは、中空糸（例えば、多孔度が０．４μｍから０．１μｍ、例えば０．２μｍの気孔率のポリスルホン製中空糸、メチルエステルまたはセルロースエステル製中空糸）フィルターのモジュールを含む。前記分離モジュールは、５００ｋＤａの分子量カットオフ細孔サイズの中空糸膜を含むフィルターモジュールをさらに含む。
【図面の簡単な説明】
【0019】
本発明のシステムおよび方法は、以下の図を参照することによって理解できる。
【0020】
【図1】大腸菌から組換えＧＬＰ－１ペプチドをコードおよび分泌するための細菌発現ベクターの概略図である。
【図2】潅流型発酵システムの概略図である。
【図3a】発現ベクター（配列ＩＤ６）で形質転換された組換え大腸菌及び組換えＧＬＰ－１ペプチド分泌の、バッチ発酵プロセスにおける経時的な増殖動態のグラフである。
【図3b】発現ベクター（配列ＩＤ６）で形質転換された組換え大腸菌細胞のライセートと、培養培地とを比較した、０．２５ｍＭ ＩＰＴＧによる誘導後の経過時間に対する組換えＧＬＰ－１ペプチドを検出するＳＤＳ－ＰＡＧＥの代表的な画像である。
【図4】バッチ発酵プロセスにおける発現ベクター（配列ＩＤ６）で形質転換された組換え大腸菌の増殖動態および経時的なグルコース消費を表すグラフである。
【図5】発現ベクター（配列ＩＤ６）で形質転換された組換え大腸菌、バッチ発酵プロセスの培地、Ｈｉｓを用いて精製した精製物、及びエンテロキナーゼで消化された消化物における組換えＧＬＰ－１ペプチドのＳＤＳ－ＰＡＧＥの代表的な画像である。
【図6a】潅流型発酵プロセスにおける、発現ベクター（配列ＩＤ６）で形質転換された組換え大腸菌の増殖動態および経時的なグルコースの消費を表すグラフである。
【図6b】１０ｋＤａ ＧＬＰ－１ペプチド分泌のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析の代表的な画像である。０．２５ｍＭ ＩＰＴＧによる誘導後、０時間、２時間、４時間、および６時間後に培地サンプルを採取して分析した。
【図6c】潅流型発酵システム（１０時間）の１時間ごとの組換えＧＬＰ－１ペプチドの生産速度を表すグラフである。
【発明の詳細な説明】
【0021】
使用した略号は以下のとおり。
ｐｅｌＢ：pectatelyase ＢのＮ末端アミノ酸残基をコードするリーダーＤＮＡ配列。
ｏｍｐＡ：外膜タンパク質Ａのアミノ酸残基をコードするリーダーＤＮＡ配列。
ｏｍｐＦ：外膜タンパク質Ｆのアミノ酸残基をコードするリーダーＤＮＡ配列。
ｙｅｂＦ：タンパク質ｙｅｂＦのアミノ酸残基をコードするリーダーＤＮＡ配列。
ＡｍｐＲ：アンピシリン耐性遺伝子をコードするＤＮＡ配列。
Ｆ１ Ｏｒｉ：複製起点。
ＩＰＴＧ：イソプロピルβ－ｄ－１－チオガラクトピラノシド。
ＬａｃまたはＬａｃ１：ｌａｃリプレッサーをコードするＤＮＡ配列。
ＲＢＳ：リボソーム結合部位。
ｐｅｌＢ：pectatelyase ＢのＮ末端アミノ酸残基をコードするリーダーＤＮＡ配列。
ｏｍｐＡ：外膜タンパク質Ａのアミノ酸残基をコードするリーダーＤＮＡ配列。
ｏｍｐＦ：外膜タンパク質Ｆのアミノ酸残基をコードするリーダーＤＮＡ配列。
ｙｅｂＦ：タンパク質ｙｅｂＦのアミノ酸残基をコードするリーダーＤＮＡ配列。
ＡｍｐＲ：アンピシリン耐性遺伝子をコードするＤＮＡ配列。
Ｆ１ Ｏｒｉ：複製起点。
ＩＰＴＧ：イソプロピルβ－ｄ－１－チオガラクトピラノシド。
ＬａｃまたはＬａｃ１：ｌａｃリプレッサーをコードするＤＮＡ配列。
ＲＢＳ：リボソーム結合部位。
【0022】
以下、本発明を詳細な説明を参照して説明する。詳細な説明には、本発明のいくつかの実施形態が示されているが、全ての実施形態は示されていない。実際、本発明は、多くの異なる形態で実施することができ、本明細書に記載された実施形態に限定されるように解釈されるべきではなく、むしろ、これらの実施形態は、本開示が適用可能な法的要件を満たすように提供される。同じ番号は、全体を通して同じ要素を指す。本発明は、非限定的な実施形態および例示的な実験を用いて本明細書に完全に記載される。
【0023】
本発明は、大腸菌による組換えＧＬＰ－１ペプチドの産生および分泌に関する。より具体的には、本発明は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）によるＧＬＰ－１の産生および分泌、その後の潅流型発酵システムを使用した、組み換えＧＬＰ－１ペプチドの分離に関する。
【0024】
主な実施形態において、図１に記載されるように、本発明は、組換えＧＬＰ－１ペプチドを産生および分泌するための、特に大腸菌のための細菌発現ベクター１００を提供する。発現ベクターは、ＧＬＰ－１ペプチド１０３をコードするＤＮＡ配列、並びに下記ａ）とｂ）との組み合わせである少なくとも１つの分泌シグナル配列とを含む。
ａ）ｐｅｌＢ、ｏｍｐＡ、ｙｅｂＦ、およびｏｍｐＦからなる群から選択される遺伝子１０１のシグナル配列をコードする少なくとも１つのＤＮＡ配列、
ｂ）キャリアペプチド１０２をコードする少なくとも１つのＤＮＡ配列で、好ましくは、配列ＩＤ４の切断型ｙｅｂＦをコードするＤＮＡ配列ＩＤ２、または配列ＩＤ５の切断型ｙｅｂＦをコードするＤＮＡ配列ＩＤ３。
前記発現ベクターは、ＧＬＰ－１ペプチド１０３をコードするＤＮＡ配列が作動可能であるように連結された少なくとも１つの遺伝子発現カセットを、さらに含む。この遺伝子発現カセットは、誘導性プロモーター１０４、ＲＢＳ１０５、アフィニティータグのＤＮＡ配列および少なくとも１つの遺伝子ターミネーター１０６を含む。前記分泌シグナル配列１０１および１０２、ならびにアフィニティータグのＤＮＡ配列は、組換えＧＬＰ－１ペプチド１０３のＤＮＡ配列に作動可能に連結されている。さらに、前記発現ベクターは、宿主細胞中での前記ベクターの複製のための少なくとも１つの細菌ｏｒｉ遺伝子配列１１０；少なくとも１つの抗生物質抵抗性遺伝子１０９（遺伝子プロモーター１０８により制御されている），及び少なくとも１つの追加的選択マーカー１１２（遺伝子プロモーター１１３により制御されている）を含む。当該発現ベクターは、追加的に、Ｆ１バクテリアファージシステム内に組換えＧＬＰ－１ペプチドのパッケージングを可能にするための少なくとも１つのｆ１ ｏｒｉ配列１１１を含む。
ａ）ｐｅｌＢ、ｏｍｐＡ、ｙｅｂＦ、およびｏｍｐＦからなる群から選択される遺伝子１０１のシグナル配列をコードする少なくとも１つのＤＮＡ配列、
ｂ）キャリアペプチド１０２をコードする少なくとも１つのＤＮＡ配列で、好ましくは、配列ＩＤ４の切断型ｙｅｂＦをコードするＤＮＡ配列ＩＤ２、または配列ＩＤ５の切断型ｙｅｂＦをコードするＤＮＡ配列ＩＤ３。
前記発現ベクターは、ＧＬＰ－１ペプチド１０３をコードするＤＮＡ配列が作動可能であるように連結された少なくとも１つの遺伝子発現カセットを、さらに含む。この遺伝子発現カセットは、誘導性プロモーター１０４、ＲＢＳ１０５、アフィニティータグのＤＮＡ配列および少なくとも１つの遺伝子ターミネーター１０６を含む。前記分泌シグナル配列１０１および１０２、ならびにアフィニティータグのＤＮＡ配列は、組換えＧＬＰ－１ペプチド１０３のＤＮＡ配列に作動可能に連結されている。さらに、前記発現ベクターは、宿主細胞中での前記ベクターの複製のための少なくとも１つの細菌ｏｒｉ遺伝子配列１１０；少なくとも１つの抗生物質抵抗性遺伝子１０９（遺伝子プロモーター１０８により制御されている），及び少なくとも１つの追加的選択マーカー１１２（遺伝子プロモーター１１３により制御されている）を含む。当該発現ベクターは、追加的に、Ｆ１バクテリアファージシステム内に組換えＧＬＰ－１ペプチドのパッケージングを可能にするための少なくとも１つのｆ１ ｏｒｉ配列１１１を含む。
【0025】
アフィニティータグ配列は、組換えＧＬＰ－１ペプチドの精製を可能にするためのものである。
【0026】
さらに、組換えＧＬＰ－１ペプチドをコードするＤＮＡ配列は、エンテロキナーゼ認識配列（ＤＤＤＤＫ）によって分泌シグナル配列から分離され、組換えＧＬＰ－１ペプチドの採取後に、分泌シグナル配列から組換えＧＬＰ－１ペプチドを分離することを可能にする。
【0027】
ＧＬＰ－１ペプチドは、配列ＩＤ１によってコードされるヒトＧＬＰ－１タンパク質の７～３７アミノ酸ストレッチ（ＮＣＢＩ参照番号ＡＡＰ３５４５９）で構成されている。表1は、細菌発現ベクターで使用されるＤＮＡ配列およびペプチド配列を示している。
【0028】
表1はＤＮＡ配列およびペプチド配列を提供する。
【表1】
【0029】
配列ＩＤ２は、配列ＩＤ４で表される３３アミノ酸キャリアペプチドである切断型ｙｅｂｆペプチドのコードＤＮＡ配列である。配列ＩＤ３は、配列ＩＤ５で表されるペプチドのコードＤＮＡ配列である。配列ＩＤ３は、配列ＩＤ２の４０位置のＧＣＧコドンをＴＧＣに変異させることによって合成される。これにより、配列ＩＤ４の１４位置のＣｙｓが配列ＩＤ５の１４位置ではＡｌａに変異している。
【0030】
別の実施形態において、本発明は、遺伝子ｏｍｐｆのシグナルペプチドと配列ＩＤ５の切断型ｙｅｂｆペプチドをコードする配列ＩＤ３のキャリアペプチドＤＮＡ配列との組み合わせを含む分泌シグナル配列と結合して、組換えＧＬＰ－１ペプチドのコードＤＮＡ（配列ＩＤ１）を含む発現ベクターのＤＮＡ配列を表す配列ＩＤ６を提供する。
【0031】
さらに別の実施形態では、表２に記載されるように、本発明は、組換えＧＬＰ－１ペプチドをコードするＤＮＡ配列を有する細菌発現ベクターで形質転換された細菌を増殖および培養するための化学的に規定された培地を提供する。当該培地は、分泌された組換えタンパク質の培地への溶解度を低下させ、精製された組換えタンパク質の最終量を減少させる傾向がある複雑な不明の材料は含んでいない。培地は、少なくとも１つの炭素源（より具体的には、グルコース／デキストロース）、及び安定化剤としてのグリセロールを含む。グルコース／デキストロースとグリセロールとの比は、１：０．２５から１：１の間であり、好ましくは１：０．５である。培地中にグリセロールが存在すると、剪断力が過大になることを防止し、細菌を損傷から保護し、組換えタンパク質の変性を低減することができる。培地は、少なくとも１つの窒素源（アンモニウム塩）をさらに含む。さらに、培地は５～２５ｍＭのクエン酸を含む。上記のように化学的に規定された培地におけるクエン酸の作用により、バクテリオファージにより大腸菌が感染することを防止することができる。バクテリオファージが大腸菌に感染すると、培養中の生細胞の数が減少するという、細菌培養における一般的な問題は、組換えタンパク質の産生に悪影響を及ぼし、組み換えタンパク質の産生を減少させることになる。メカニズム上、バクテリオファージはクエン酸に非常に敏感であり、クエン酸の存在下では、細菌に感染できない。組換えタンパク質の生産に一般に使用されるＬＢブロスはクエン酸を含んでおらず、大腸菌のバクテリオファージ感染を防ぐのに効果的ではない。培地はまた、マグネシウム、カリウム、リン、およびナトリウムの塩を含み、限定しないけれども、鉄、コバルト、マンガン、銅、ホウ素、モリブデン、および亜鉛の群から選択される微量元素の塩も含む。さらに、培地はグリシンを含む。グリシンは、細菌細胞の膜電位の維持に重要な役割を果たし、タンパク質分泌を増強する。さらに培地は、アルギニンを含む。アルギニンは、シャペロン分子として作用し、細胞内での組換えタンパク質の折り畳みを増強する。これにより、封入体または凝集体の形成を減少させ、折り畳まれた組換えタンパク質を細胞外に分泌することを促進する。グリシンは分泌を促進し、アルギニンは分泌前のタンパク質の折り畳みを助ける。グリシンとアルギニンとが共同して、組換えタンパク質の分泌を助ける。さらに、培地は、少なくとも１つのキレート剤、例えば限定しないがエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含でもよい。また、少なくとも１種のビタミン、より具体的にはチアミンを含んでもよい。
【0032】
表２：スターター培養培地、開始バッチ培地、および灌流培地の化学的に規定された組成。
【表2】
【0033】
別の実施形態において、本発明は、分泌された組換えＧＬＰ－１ペプチドの連続的産生および分離のための潅流型発酵システムを用いた、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）による組換えＧＬＰ－１の産生および分泌のための方法を提供する。 この方法は、以下の工程を含む。
ａ）組換えＧＬＰ－１ペプチドをコードする発現ベクターで大腸菌を形質転換して、組換え大腸菌を生産する工程；
ｂ）スターター培養の増殖培地３７℃で２２５ｒｐｍで１２時間、培養して、培養物のＯＤ600を５．０－６．０に達するまで増殖させる、組換え大腸菌のスターター培養物を調製する工程；
ｃ）グルコース／デキストロースを１０ｇ／Ｌの濃度で含み、ｐＨを６．９に維持している発酵槽に、開始バッチ培地を添加して、潅流型発酵システムを調製する工程；
ｄ）前記スターター培養物を前記発酵槽に加え、最初の１時間は３ＮのＮａＯＨでｐＨを６．９に維持し、その後は、４Ｍ液体アンモニアを用いてｐＨを６．９に維持する工程；
ｅ）前記開始バッチ培地の残留グルコース／デキストロース濃度が約５ｇ／Ｌに減少したときに、ラクトースまたはラクトース類似体などのｌａｃオペロン誘導剤を前記発酵槽に添加して、大腸菌から組換えＧＬＰ－１ペプチドの産生および分泌を誘導する工程；
ｆ）誘導から３０～４０分後に前記潅流型発酵システムを開始し、分泌された組換えＧＬＰ－１ペプチドを含む使用済み培地を透過液として、組換え大腸菌を保持液（retantate）として分離し、前記透過液から組換えＧＬＰ－１ペプチドを収穫し、前記発酵槽に新鮮な灌流培地と前記組換え大腸菌保持液（retantate）を再供給して、組換えＧＬＰ－１ペプチドを連続的に産生及び分泌する工程。
ａ）組換えＧＬＰ－１ペプチドをコードする発現ベクターで大腸菌を形質転換して、組換え大腸菌を生産する工程；
ｂ）スターター培養の増殖培地３７℃で２２５ｒｐｍで１２時間、培養して、培養物のＯＤ600を５．０－６．０に達するまで増殖させる、組換え大腸菌のスターター培養物を調製する工程；
ｃ）グルコース／デキストロースを１０ｇ／Ｌの濃度で含み、ｐＨを６．９に維持している発酵槽に、開始バッチ培地を添加して、潅流型発酵システムを調製する工程；
ｄ）前記スターター培養物を前記発酵槽に加え、最初の１時間は３ＮのＮａＯＨでｐＨを６．９に維持し、その後は、４Ｍ液体アンモニアを用いてｐＨを６．９に維持する工程；
ｅ）前記開始バッチ培地の残留グルコース／デキストロース濃度が約５ｇ／Ｌに減少したときに、ラクトースまたはラクトース類似体などのｌａｃオペロン誘導剤を前記発酵槽に添加して、大腸菌から組換えＧＬＰ－１ペプチドの産生および分泌を誘導する工程；
ｆ）誘導から３０～４０分後に前記潅流型発酵システムを開始し、分泌された組換えＧＬＰ－１ペプチドを含む使用済み培地を透過液として、組換え大腸菌を保持液（retantate）として分離し、前記透過液から組換えＧＬＰ－１ペプチドを収穫し、前記発酵槽に新鮮な灌流培地と前記組換え大腸菌保持液（retantate）を再供給して、組換えＧＬＰ－１ペプチドを連続的に産生及び分泌する工程。
【0034】
灌流システムは、灌流懸濁培養で組換え大腸菌を増殖させることを含み、細菌を含む培養培地は、交互のタンジェント流で分離系内を循環し、当該分離系は、組換えＧＬＰ－１ペプチドを含む使用済み培地を含む濾液を分離除去し、培養培地に細菌を保持することで、組換えＧＬＰ－１ペプチドを連続生産できる。
【0035】
図２は、潅流型発酵および分離系の概略図を説明している。このシステムは、供給タンク（２０１）、フィードポンプ（２０２）、レベルセンサー（２０３）、モーター（２０４）、発酵槽（２０５）、磁気浮上ポンプ（２０６）、分離モジュール（２０７）、収穫用ポンプ（２０８）、および収穫用タンク（２０９）を備えている。ここで、分離モジュール（２０７）の中空糸カラムは、培養培地から分泌された組換えＧＬＰ－１ペプチドの分離に適した中空糸膜のフィルターモジュールを含む。
【0036】
供給タンク（２０１）は培地を貯蔵していて、当該培地は、供給ポンプ（２０２）により発酵槽（２０５）に送られる。発酵槽（２０５）には大腸菌スターター培養物と培地とからなる培養懸濁液が保持されていて、モーター（２０４）で攪拌されている。発酵槽（２０５）内の培養懸濁液は、磁気浮上ポンプ（２０６）により連続的または断続的に排出される。培地濃度は、レベルセンサー（２０３）により維持される。排出された液体は、中空糸膜を含むフィルターモジュールをさらに通過する。発酵槽（２０５）内の培養懸濁液は、交互のタンジェント方向濾過流で分離系内を循環する。分離モジュール（２０７）は、組換え大腸菌を保持液（retantate）として、組換えＧＬＰ－１ペプチドを含む使用済み培地を透過液として分離される。中空糸膜を含むフィルターモジュールにより濾過された懸濁液は、使用済み培養培地から組換えＧＬＰ－１を適切に分離する。分離後の大腸菌保持液（retantate）は、発酵槽に再供給される。使用済み培地は、収穫用ポンプ（２０８）により収穫用タンク（２０９）に送られる。
【0037】
好ましい発明の一実施形態では、分離系は、中空糸（例えば、多孔度が０．４μｍから０．１μｍのポリスルホン製中空糸、メチルエステルまたはセルロースエステル製中空糸）フィルターのモジュールを含む。例えば、分泌された組換えＧＬＰ－１ペプチドを、使用済み培地から分離するための０．２μｍの多孔度の中空糸が挙げられる。
【0038】
さらに別の実施形態では、分離系は、５００ｋＤａの分子量カットオフ細孔サイズを有する膜を含むフィルターモジュールを含む。
【0039】
〔実施例１〕
大腸菌の培養と形質転換
以下のすべての実施例において、ＤＮＡ配列（配列ＩＤ６）の発現ベクターを使用した。この発現ベクターは、組換えＧＬＰ－１ペプチドのコードＤＮＡ配列（配列ＩＤ１）を含む。前記配列ＩＤ１は、切断型ｙｅｂｆペプチド（配列ＩＤ５）をコードするキャリアペプチド（配列ＩＤ３）のＤＮＡ配列とシグナルペプチドの遺伝子ｏｍｐｆとの組み合わせを有する分泌シグナル配列と結合している。
大腸菌の培養と形質転換
以下のすべての実施例において、ＤＮＡ配列（配列ＩＤ６）の発現ベクターを使用した。この発現ベクターは、組換えＧＬＰ－１ペプチドのコードＤＮＡ配列（配列ＩＤ１）を含む。前記配列ＩＤ１は、切断型ｙｅｂｆペプチド（配列ＩＤ５）をコードするキャリアペプチド（配列ＩＤ３）のＤＮＡ配列とシグナルペプチドの遺伝子ｏｍｐｆとの組み合わせを有する分泌シグナル配列と結合している。
【0040】
Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）株を発現系として選択した。この発現系は、１００ｎｇの組換え用ベクター（配列ＩＤ６）を用いて化学的形質転換法（すなわちＣａＣｌ２）により形質転換される。－８０℃の冷凍庫から取り出して解凍した後、化学コンピテントセル（すなわちＢ２１（ＤＥ３））を４℃でインキュベートした。解凍後、４℃に維持されている細胞にベクターを加え、４℃を維持しながら１５分間インキュベートした。その後、細胞を４２℃に約1分間さらすことにより、細胞にインキュベーションヒートショックを与えた。ヒートショックを与えた後、形質転換した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞を４℃で約１５分間維持した。そこで、Luriaブロス（ＬＢ）培地を、４０分間かけて添加することにより細胞を増殖させた。その後増殖した細胞を、適切な抗生物質選択基準を用いたＬＢ寒天培地に広げた。
【0041】
〔実施例２〕
バッチ発酵および潅流型発酵
ａ）スターター培養物の調製
表３に記載の組成のオートクレーブ処理したスターター培養培地を使用して流加発酵を実施するために、適切な量のプレ培養物を調製した。通常、３００ｍｌの増殖培地を２リットルのフラスコに取り、形質転換プレートから無菌的に単一コロニー形成単位を接種し、３７℃に維持された回転式インキュベーター内で、２２５ｒｐｍで１２時間インキュベートする。チアミンなどのフィルター滅菌済み培地成分、微量元素はスターター培養のセットアップ中に再構成され、１２時間のインキュベーション終了時には、ＯＤ600は約５．０に達した。
バッチ発酵および潅流型発酵
ａ）スターター培養物の調製
表３に記載の組成のオートクレーブ処理したスターター培養培地を使用して流加発酵を実施するために、適切な量のプレ培養物を調製した。通常、３００ｍｌの増殖培地を２リットルのフラスコに取り、形質転換プレートから無菌的に単一コロニー形成単位を接種し、３７℃に維持された回転式インキュベーター内で、２２５ｒｐｍで１２時間インキュベートする。チアミンなどのフィルター滅菌済み培地成分、微量元素はスターター培養のセットアップ中に再構成され、１２時間のインキュベーション終了時には、ＯＤ600は約５．０に達した。
【0042】
ｂ）バッチ発酵プロセス
表3に記載されている開始バッチ培地の組成を有する増殖培地を備えたバイオリアクターは、４５分の保持時間で、１２１℃でオートクレーブ処理され、その後、組み立てられたバイオリアクター全体が、ＳＣＡＤＡソフトウェアを備えたコントロールタワーによる制御により、３７℃に下げられる。バイオリアクターのパッキングでは、必要なすべてのもの、すなわち吸気口および排気ユニット用の投与チューブ０．２ミクロン疎水性フィルター、溶存酸素プローブ、ｐＨプローブ、バッフル、Ｌ／Ｄ比が１：１のインペラーブレードが取り付けられる。
表3に記載されている開始バッチ培地の組成を有する増殖培地を備えたバイオリアクターは、４５分の保持時間で、１２１℃でオートクレーブ処理され、その後、組み立てられたバイオリアクター全体が、ＳＣＡＤＡソフトウェアを備えたコントロールタワーによる制御により、３７℃に下げられる。バイオリアクターのパッキングでは、必要なすべてのもの、すなわち吸気口および排気ユニット用の投与チューブ０．２ミクロン疎水性フィルター、溶存酸素プローブ、ｐＨプローブ、バッフル、Ｌ／Ｄ比が１：１のインペラーブレードが取り付けられる。
【0043】
発酵プロセスは、ｐＨ６．９０、温度３７℃などの必要な物理的条件を維持することによって開始された。 曝気などの増殖プロファイル変数パラメータに基づいて、攪拌はコントロールユニットによって自動的に制御された。 無菌的にスターター培養物をバイオリアクターに移す。チアミン、微量元素などのフィルター滅菌された培地成分が注入ポートからバイオリアクターに無菌的に供給されて培地成分が再構成された。発酵の開始時に、デキストロースを添加して、最終濃度が１０ｇ／Ｌになるようにした。ＭｇＳＯ４原液は、培地の沈殿を防ぐために補足的な形式で供給される。ｐＨは、発酵プロセスが終了するまで、最初の１時間は３ＮのＮａＯＨにより、次いで４Ｎアンモニアにより維持された。細胞は最大増殖速度約０．６／時間で増殖した。
【0044】
１時間ごとに、バイオリアクターからサンプルを無菌的に採取し、細胞密度を、ブランク培地に対して６００ｎｍに設定された分光光度計を用いて測定した。同サンプルの残留グルコースは、デジタル血糖計を用いて測定された。３時間の発酵後、指数関数的に栄養摂取が行われる。ＯＤ600が約４０に達した後、残留グルコースが約５ｇ／Ｌであることを確認して、ＩＰＴＧ約０．２５ｍＭで培養物を誘導した。
【0045】
誘導後は、４Ｎアンモニアのみにより、ｐＨ６．９０に維持された。発酵プロセス全体を通じて、酸は使用されない。グリシン、アルギニン、グルタミン酸を含む培養液に補助的成分を加え、それぞれ最終濃度が２ｍＭになるようにした。１時間ごとにサンプルを採取して遠心分離し、細胞と培地とを分離し、その後、ＰＡＧＥを使用して分析し、細胞内の組換えタンパク質発現の存在と培地中の分泌量を検出した。６時間の誘導培養が終了した後、遠心分離して、細胞と培地とを分離した。
【0046】
ｃ）潅流型発酵プロトコル
適切なプラスミドを有するＢＬ２１（ＤＥ３）の形質転換細胞を調製する。当該調製は、ヒートショックを与え、選択用抗生物質を含有したＬＢ寒天プレートに広げ、３７℃のインキュベーターで１２時間インキュベートすることにより行われる。培地成分を取り、脱イオン水に溶解し、５ＮのＮａＯＨを使用してｐＨ６．９０に調整することにより、増殖培地を調製した。スターター培養物の培地は、オートクレーブで４５分間保持しながら１２１℃で滅菌する。熱に弱い他のすべての培地成分は、フィルター滅菌された。すなわち、チアミン、カナマイシン、微量元素、デキストロース、ＭｇＳ０４・７Ｈ２Ｏは別々にオートクレーブ処理された。スターター培養物は、ＬＢ寒天プレートから振とうフラスコにコロニーを接種することによって調製される。フィルター滅菌培地成分、すなわちチアミン、カナマイシン５０ｍｇ／リットル、微量元素１０００ｘを、１％デキストロース、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（５ｍＭ）、酵母エキス（０．２％）とともに添加した。フラスコを振盪型インキュベーター内で３７℃、２２５ｒｐｍで一晩インキュベートした。
適切なプラスミドを有するＢＬ２１（ＤＥ３）の形質転換細胞を調製する。当該調製は、ヒートショックを与え、選択用抗生物質を含有したＬＢ寒天プレートに広げ、３７℃のインキュベーターで１２時間インキュベートすることにより行われる。培地成分を取り、脱イオン水に溶解し、５ＮのＮａＯＨを使用してｐＨ６．９０に調整することにより、増殖培地を調製した。スターター培養物の培地は、オートクレーブで４５分間保持しながら１２１℃で滅菌する。熱に弱い他のすべての培地成分は、フィルター滅菌された。すなわち、チアミン、カナマイシン、微量元素、デキストロース、ＭｇＳ０４・７Ｈ２Ｏは別々にオートクレーブ処理された。スターター培養物は、ＬＢ寒天プレートから振とうフラスコにコロニーを接種することによって調製される。フィルター滅菌培地成分、すなわちチアミン、カナマイシン５０ｍｇ／リットル、微量元素１０００ｘを、１％デキストロース、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（５ｍＭ）、酵母エキス（０．２％）とともに添加した。フラスコを振盪型インキュベーター内で３７℃、２２５ｒｐｍで一晩インキュベートした。
【0047】
バイオリアクター容器には、予め較正されたｐＨプローブ、およびオキシライト（Oxylyte）を補充した後の溶存酸素（ＤＯ）プローブにフィットさせた新しいメンブレンに沿って取り付けられた消泡センサー、スパージャーパイプおよび排気パイプ（各々、０．２μの疎水性ベントフィルター、バッフルを具備）が取り付けられている。表３に記載されている開始バッチ培地は、再構成可能な培地成分に対応する容量を除いて、発酵槽に注がれる。発酵槽は１２１℃、保持時間４５分、１５ｐｓｉでオートクレーブ処理され、その後室温まで冷却され、コントロールユニットに取り付けられる。発酵槽は、ＤＯプローブの分極のために、０．１標準リットル／分（ＳＬＰＭ）の空気で一晩パージされ、ＤＯは、スターター培養物を追加する直前に較正された。培地の再構成は、スターター培養物を追加する前に行われた。投与ボトルが取り付けられ、チューブに注入された。すべてのパラメータはコントロールユニットで設定された。つまり、ｐＨは０．１％デッドバンドで６．９０に設定され、ＤＯはカスケードモードで３０％に設定され、酸／塩基は自動モードで、消泡センサーは０．１％Ｓｉｇｍａ Ａｎｔｉｆｏａｍ ２０４で、３７℃の温度に設定された。ＤＯは、攪拌、１分あたりのガス流量、純酸素パージの％に基づき、カスケードモードで制御された。初期ＲＰＭは２００に設定された。プレ培養物は、発酵させていないバイオリアクターに移された。最初の１時間のｐＨは、３ＮのＮａＯＨを投与ボトルに取り付けることによって維持された。その後のバッチのｐＨは、４Ｍ液体アンモニアによって維持された。ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏは、発酵の０時間目から３回の投与で発酵せずに再構成される。毎時サンプリングを行い、ＵＶ／Ｖｉｓ分光光度計で細胞密度をチェックし、血糖値計で残留グルコースをチェックした。０．２ｍＭ ＩＰＴＧで培養を誘導する理想的な時点は、５時間後すなわち残留グルコースが約５ｇ／Ｌのバッチである。滅菌した５００ｋＤａ中空糸が灌流装置に接続され、滅菌した開始バッチ培地で平衡化され、その後、チューブをバイオリアクターに接続した。誘導後３０分経過後に、灌流が開始された。ここで中空糸を透過する培養物はポンプによって自動的にバイオリアクターから引き出され、組換え大腸菌細胞を含む中空糸の保持液は、バイオリアクターに送り返される。収穫物は、ポンプ速度を約１６．６ｍｌ／分に設定することによって中空糸の透過端から収集され、同時に同じ流量の灌流媒体が発酵槽に追加される。灌流培地が完了するまでの間、ずっと発酵は実行される。灌流培地の供給が完了した後、透過液の１／３を吸引することにより培養物をバッチ量の２／３に濃縮し、バッチを終了した。誘導後１時間ごとにサンプルを採取して、組換えＧＬＰ－１ペプチドの発現と分泌をチェックした。中空糸は０．５ＮのＮａＯＨで消毒され、０．１ＮのＮａＯＨ中に保存される。
【0048】
表３：培地の構成
【表3】
【0049】
〔実施例３〕
組換え細菌の増殖効率および組換えＧＬＰ－１ペプチドの分泌効率
培養培地における増殖動態、グルコース消費、および組換えタンパク質の産生と分泌を、バッチ発酵プロセス法にて別々の時間で測定した。
組換え細菌の増殖効率および組換えＧＬＰ－１ペプチドの分泌効率
培養培地における増殖動態、グルコース消費、および組換えタンパク質の産生と分泌を、バッチ発酵プロセス法にて別々の時間で測定した。
【0050】
図３ａは、分泌シグナル配列とアフィニティータグに連結した１０ｋＤａの組換えＧＬＰ－１ペプチドの産生及び組換え大腸菌の増殖を、時間毎に表した線グラフである。当該グラフは、細菌が安定的に増殖していること、及び培地中への組換えタンパク質の分泌が増加していることを示している。しかしながら、バッチ法では、４時間のバッチ発酵プロセスでの生成量は、２．５ｇ／Ｌ未満であった。
【0051】
さらに、ＩＰＴＧを用いて誘導した後、所定時間経過毎に、発酵中の培養上清５μリットル及び組換え大腸菌細胞溶解物（ライセート）を採取し、還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析して比較した。図３ｂに示すように、誘導から１時間以内に、組換えＧＬＰ－１ペプチドが細菌によって産生および分泌され始めた。産生分泌量は時間とともに明らかに増加していた。さらに、細胞溶解物中には組換えＧＬＰ－１ペプチドはほとんど存在せず、組換え細菌で効率的に分泌されたことを示している。このことは、化学的に規定されたバッチ培地組成物によって可能になる組換えＧＬＰ－１ペプチドの分泌に関してベクター（配列ＩＤ６）が有効であることを示唆した。
【0052】
発酵プロセス中のグルコース消費量も分析した。図４に示すように、潅流型発酵プロセスへのスターター培養物の接種１時間後すぐに、グルコース消費が、最適速度で始まった。増殖段階を開始する前に、最大増殖速度を達成するために必要なグルコース添加量の標準化を確立した。これにより、まもなく適切な細胞密度が達成された。従来の細胞増殖技術と比較して、グルコース１グラム当たりの収量を最適に保つことが、この方法を経済的かつ信頼できるものにする。開始バッチ培地は１０ｇ／Ｌのグルコース／デキストロース濃度であり、残留グルコース／デキストロース濃度が約５ｇ／Ｌに達したときに誘導が行われる。したがって、化学的に規定されたバッチ培地とともに配列ＩＤ６のベクターを使用することは、組換えＧＬＰ－１ペプチドの増殖および分泌に最適である。
【0053】
〔実施例４〕
組換えＧＬＰ－１ペプチドのエンテロキナーゼ消化
組換えＧＬＰ－１ペプチドをコードするＤＮＡ配列は、エンテロキナーゼ認識配列（ＤＤＤＤＫ）によって分泌シグナル配列から分離され、組換えＧＬＰ－１ペプチドを収穫した後、分泌シグナル配列から組換えＧＬＰ－１ペプチドを分離することを可能にする。ＧＬＰ－１ペプチドは、精製プロセス用のＨｉｓタグと連結している。
組換えＧＬＰ－１ペプチドのエンテロキナーゼ消化
組換えＧＬＰ－１ペプチドをコードするＤＮＡ配列は、エンテロキナーゼ認識配列（ＤＤＤＤＫ）によって分泌シグナル配列から分離され、組換えＧＬＰ－１ペプチドを収穫した後、分泌シグナル配列から組換えＧＬＰ－１ペプチドを分離することを可能にする。ＧＬＰ－１ペプチドは、精製プロセス用のＨｉｓタグと連結している。
【0054】
図５に示すように、組換えＧＬＰ－１ペプチドは培地に分泌され、Ｈｉｓアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製した後、１回エンテロキナーゼで消化すると、分泌シグナル配列の分離を示唆する小さなバンドが生成された。
【0055】
〔実施例５〕
潅流型発酵による組換えＧＬＰ－１ペプチド生産
潅流型発酵プロセスは、実施例２ｃで説明したように、配列ＩＤ６で形質転換された組換え大腸菌を用いて実施された。発酵槽は常時、発酵用の培地１リットルを保持し、培地は、組換え細菌と分泌された組換えＧＬＰ－１ペプチドを含む使用済み培地とを回収するためにろ過された。分泌された組換えタンパク質は、使用済み培地を分離することにより、１Ｌ／時間の速度で連続的に収穫された。この使用済み培地を分離した後、発酵槽に等量の新鮮な灌流培地を再供給し、大腸菌を保持液（retantate）とする連続発酵を行った。定量化と分析のために、１時間ごとに少量のサンプルを収集した。１つの連続バッチの灌流発酵では、合計１０Ｌの培地が１０時間発酵される。
潅流型発酵による組換えＧＬＰ－１ペプチド生産
潅流型発酵プロセスは、実施例２ｃで説明したように、配列ＩＤ６で形質転換された組換え大腸菌を用いて実施された。発酵槽は常時、発酵用の培地１リットルを保持し、培地は、組換え細菌と分泌された組換えＧＬＰ－１ペプチドを含む使用済み培地とを回収するためにろ過された。分泌された組換えタンパク質は、使用済み培地を分離することにより、１Ｌ／時間の速度で連続的に収穫された。この使用済み培地を分離した後、発酵槽に等量の新鮮な灌流培地を再供給し、大腸菌を保持液（retantate）とする連続発酵を行った。定量化と分析のために、１時間ごとに少量のサンプルを収集した。１つの連続バッチの灌流発酵では、合計１０Ｌの培地が１０時間発酵される。
【0056】
図６ａは、潅流型発酵システムで発酵させた細菌細胞の増殖曲線を示している。５時間後、または残留グルコースが約５ｇ／Ｌのバッチについて、ＩＰＴＧを用いて誘導を開始した。誘導から１時間後、細胞増殖を最小限の速度に保ち、規定している栄養素を補うために灌流を開始した。図６ａに示すように、Ｅ．ｃｏｌｉのＯＤ600は８～１０の間に維持された。また、ほとんどの時間は、細菌数の増加ではなく、組換えタンパク質の生産に費やされた。
【0057】
培地サンプルを収集し、灌流法で０．２５ｍＭ ＩＰＴＧを用いて誘導した後、０時間、２時間、４時間および６時間経過後に分析し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析のために組換えタンパク質を含む合計９リットルの培地を収集した。図６ｂに示すように、ＩＰＴＧによる誘導後の２時間で１０ｋＤａの組換えＧＬＰ－１ペプチド分泌が見られ、組換えＧＬＰ－１ペプチドの分泌量は、６時間後でもほぼ同じである。これは、潅流型発酵法では、組換えＧＬＰ－１ペプチドの連続生産が長時間にわたって一貫して見られることを明確に示している。
【0058】
図６ｃに示すように、１時間以内に組換えＧＬＰ－１ペプチドの生産は１ｇ／Ｌに達し、１０時間後でも生産速度は約１ｇ／Ｌであった。このことは、化学的に規定された培地で配列ＩＤ６を用いて潅流型発酵法を行うことにより、１ｇ／Ｌ／ｈｒの速度で組換えＧＬＰ－１ペプチドを安定して生産できることを示唆している。
【0059】
特定の例示的な実施形態が添付の図面に記載および示されているが、そのような実施形態は単なる例示であり、広範な発明を限定するものではない。以上に記載された態様に、他の様々な変更、組み合わせ、省略、修正および置換が可能であるから、本発明は、示される特定の構造および配置に限定されないことを理解されたい。当業者は、本発明の範囲および精神から逸脱することなく、今説明した実施形態の様々な適合および修正を構成できることを理解するであろう。
【図1】
【図2】
【図3a】
【図3b】
【図4】
【図5】
【図6a】
【図6b】
【図6c】
【配列表】