知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-05-13
(45)【発行日】2024-05-21
(54)【発明の名称】多発性硬化症を予防及び治療する方法並びに薬剤
(51)【国際特許分類】
A61K 38/48 20060101AFI20240514BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20240514BHJP
A61P 25/22 20060101ALI20240514BHJP
A61P 25/24 20060101ALI20240514BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240514BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20240514BHJP
A61K 35/12 20150101ALI20240514BHJP
A61K 39/395 20060101ALN20240514BHJP
A61K 38/36 20060101ALN20240514BHJP
A61K 38/43 20060101ALN20240514BHJP
A61K 38/55 20060101ALN20240514BHJP
【ＦＩ】
A61K38/48 100
A61P25/00
A61P25/22
A61P25/24
A61P43/00 105
A61P43/00 121
A61K45/00
A61K35/12
A61K39/395 D
A61K39/395 N
A61K39/395 P
A61K38/36
A61K38/43
A61K38/55
【請求項の数】
9
(21)【出願番号】P 2022545965
(86)(22)【出願日】2021-02-08
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2023-06-12
(86)【国際出願番号】 CN2021075921
(87)【国際公開番号】W WO2021155867
(87)【国際公開日】2021-08-12
【審査請求日】2022-09-15
(31)【優先権主張番号】202010081324.8
(32)【優先日】2020-02-06
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(73)【特許権者】
【識別番号】518217305
【氏名又は名称】タレンゲン インターナショナル リミテッド
【氏名又は名称原語表記】ＴＡＬＥＮＧＥＮ ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ ＬＩＭＩＴＥＤ
(74)【代理人】
【識別番号】110003007
【氏名又は名称】弁理士法人謝国際特許商標事務所
(72)【発明者】
【氏名】李季男
【審査官】濱田 光浩
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１９－５００４２４（ＪＰ，Ａ）
【文献】PLOS ONE，2015年04月27日，Vol. 10, No. 4, e0124510，p. 1-17，https://doi.org/10.1371/journal.pone.0124510
【文献】PNAS，Vol. 101, No. 17，2004年04月27日，p. 6698-6703，www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.0303859101
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｐ ２５／００
Ａ６１Ｋ ３８／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
プラスミノーゲンを含む、多発性硬化症を予防及び治療する医薬組成物。
【請求項2】
前記プラスミノーゲンが、神経ミエリンの再生を促進する活性、ミエリンタンパク質の発現を促進する活性、神経組織ＮＦＰの発現を促進する活性、神経線維の再生を促進する活性、神経組織ＮＦＰの発現を促進する活性、神経組織のＭＢＰレベルを上昇させる活性、神経組織のミクログリア数を増加させる活性、神経組織の炎症修復を促進する活性、神経組織のアストロサイトの活動を促進する活性、神経組織のＢＤＮＦのレベルを高める活性、神経組織のＧＦＡＰの発現を促進する活性、被験者の社会的行動能力を改善する活性、被験者の社会的記憶能力を改善する活性、被験者の抑うつ行動を緩和する活性、及び被験者の不安行動を緩和する活性から選択される１つまたは複数の活性を有する、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項3】
前記プラスミノーゲンが、配列２と少なくとも９０％の配列同一性を有し、且つプラスミノーゲンのタンパク質加水分解活性を有する、請求項１または２に記載の医薬組成物。
【請求項4】
前記プラスミノーゲンが、配列２のプラスミノーゲンの保存的置換変異体である、請求項１～３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項5】
前記プラスミノーゲンが、１つまたは複数の他の治療方法または薬剤と組み合わせて使用する、請求項１～４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項6】
前記他の治療方法が、外科的治療、細胞療法、及び物理的療法から選択される１つまたは複数である、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項7】
前記細胞療法が、幹細胞療法である、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項8】
前記他の薬剤が、ホルモン、免疫抑制剤、神経栄養薬、抗生物質、及び抗ウイルス薬から選択される１つまたは複数である、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項9】
前記プラスミノーゲンが、鼻吸入、エアロゾル吸入、点鼻薬、点眼薬、点耳薬、静脈内、腹腔内、皮下、頭蓋内、髄腔内、動脈内、及び筋肉内から選択される１つまたは複数の方法もしくは経路によって投与される、請求項１～８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、損傷した神経を修復し、臨床症状及び徴候を改善するために、被験者に有効量のプラスミノーゲン活性化経路の成分またはプラスミノーゲンなどの関連化合物を投与することを含む、多発性硬化症を予防または治療する方法に関する。
【背景技術】
【0002】
多発性硬化症（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，ＭＳ）は、中枢神経系の最も一般的な脱髄疾患であり、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）では、脳と脊髄に複数のプラーク様病変が見られる。この疾患の病因はまだ不明であり、遺伝的要因、ウイルス感染、及び自己免疫反応に関連している。この疾患の急性活動期では、中枢神経系の白質に複数の炎症性脱髄斑があり、古い病変はグリオーシスによる石灰化斑を形成し、複数の病巣、寛解、再発を特徴とし、視神経、脊髄、脳幹によく発生する。ホルモン療法、ベータインターフェロン、免疫抑制療法などの現在の治療法は理想的ではなく、他の治療法を見つける必要がある。
【発明の概要】
【0003】
本発明は研究によって、プラスミノーゲンが明らかに神経ミエリンの再生及び修復を促進し、多発性硬化症を予防及び治療できることを発見した。
【0004】
具体的には、本発明は下記のことに係る。
【0005】
１、一態様では、本願は、プラスミノーゲン活性化経路の成分、プラスミノーゲンを直接活性化し得るか、またはプラスミノーゲン活性化経路の上流成分を活性化することによって間接的にプラスミノーゲンを活性化し得る化合物、プラスミノーゲンまたはプラスミンの活性を模倣する化合物、プラスミノーゲンまたはプラスミノーゲン活性化剤の発現をアップレギュレートすることができる化合物、プラスミノーゲン類縁体、プラスミン類縁体、ｔＰＡまたはｕＰＡ類縁体及び線維素溶解阻害剤の拮抗剤から選択される１つ以上の治療有効量の化合物を被験者に投与することを含む、多発性硬化症を予防及び治療する方法に関する。
【0006】
一態様では、本願は、プラスミノーゲン活性化経路の成分、プラスミノーゲンを直接活性化し得るか、またはプラスミノーゲン活性化経路の上流成分を活性化することによって間接的にプラスミノーゲンを活性化し得る化合物、プラスミノーゲンまたはプラスミンの活性を模倣する化合物、プラスミノーゲンまたはプラスミノーゲン活性化剤の発現をアップレギュレートすることができる化合物、プラスミノーゲン類縁体、プラスミン類縁体、ｔＰＡまたはｕＰＡ類縁体及び線維素溶解阻害剤の拮抗剤から選択される１つ以上の化合物の、多発性硬化症を予防及び治療する薬剤の調製における使用に関する。
【0007】
一態様では、本願は、プラスミノーゲン活性化経路の成分、プラスミノーゲンを直接活性化し得るか、またはプラスミノーゲン活性化経路の上流成分を活性化することによって間接的にプラスミノーゲンを活性化し得る化合物、プラスミノーゲンまたはプラスミンの活性を模倣する化合物、プラスミノーゲンまたはプラスミノーゲン活性化剤の発現をアップレギュレートすることができる化合物、プラスミノーゲン類縁体、プラスミン類縁体、ｔＰＡまたはｕＰＡ類縁体及び線維素溶解阻害剤の拮抗剤から選択される１つ以上の化合物を含む、多発性硬化症を予防及び治療する薬剤に関する。
【0008】
一態様では、本願は、プラスミノーゲン活性化経路の成分、プラスミノーゲンを直接活性化し得るか、またはプラスミノーゲン活性化経路の上流成分を活性化することによって間接的にプラスミノーゲンを活性化し得る化合物、プラスミノーゲンまたはプラスミンの活性を模倣する化合物、プラスミノーゲンまたはプラスミノーゲン活性化剤の発現をアップレギュレートすることができる化合物、プラスミノーゲン類縁体、プラスミン類縁体、ｔＰＡまたはｕＰＡ類縁体及び線維素溶解阻害剤の拮抗剤から選択される１つ以上の化合物の、多発性硬化症の予防及び治療における使用に関する。
【0009】
２、前記プラスミノーゲン活性化経路の成分が、プラスミノーゲン、組換えヒトプラスミノーゲン、Ｌｙｓ－プラスミノーゲン、Ｇｌｕ－プラスミノーゲン、プラスミン、プラスミノーゲンとプラスミンの１つ以上のｋｒｉｎｇｌｅドメイン及びプロテアーゼドメインを含むプラスミノーゲン及びプラスミン変異体並びに類縁体、ミニプラスミノーゲン（ｍｉｎｉ－ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ）、ミニプラスミン（ｍｉｎｉ－ｐｌａｓｍｉｎ）、マイクロプラスミノーゲン（ｍｉｃｒｏ－ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ）、マイクロプラスミン（ｍｉｃｒｏ－ｐｌａｓｍｉｎ）、ｄｅｌｔａ－プラスミノーゲン、ｄｅｌｔａ－プラスミン（ｄｅｌｔａ－ｐｌａｓｍｉｎ）、プラスミノーゲン活性化剤、ｔＰＡ、及びｕＰＡから選択されるものである、項１に記載の方法、使用、または薬剤。
【0010】
３、前記線維素溶解阻害剤の拮抗剤が、ＰＡＩ－１、補体Ｃ１阻害剤、α２抗プラスミンまたはα２マクログロブリンの阻害剤、例えば、抗体である、項１に記載の方法、使用、または薬剤。
【0011】
４、前記化合物が、神経ミエリンの再生を促進する活性、ミエリンタンパク質の発現を促進する（例えば、ＰＬＰまたはＭＢＰタンパク質の発現を促進する）活性、神経組織ＮＦＰの発現を促進する活性、神経線維の再生を促進する活性、神経組織ＮＦＰの発現を促進する活性、神経組織のＭＢＰレベルを上昇させる活性、神経組織のミクログリア数を増加させる活性、神経組織の炎症修復を促進する活性、神経組織のアストロサイトの活動を促進する活性、神経組織のＢＤＮＦのレベルを高める活性、神経組織のＧＦＡＰの発現を促進する活性、被験者の社会的行動能力を改善する活性、被験者の社会的記憶能力を改善する活性、被験者の抑うつ行動を緩和する活性、及び被験者の不安行動を緩和する活性から選択される１つまたは複数の活性を有する、項１～３のいずれか一項に記載の方法、使用、または薬剤。
【0012】
５、前記プラスミノーゲンが、被験者の抑うつ症状または不安症状などの精神症状を軽減する、項１～４のいずれか一項に記載の方法、使用、または薬剤。
【0013】
６、前記化合物がプラスミノーゲン（フィブリノゲンとも呼ばれる）である、項１～５のいずれか一項に記載の方法、使用、または薬剤。
【0014】
７、前記プラスミノーゲンが、配列２と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有し、且つ依然としてプラスミノーゲン活性、例えば、タンパク質加水分解活性、またはリジン結合活性、またはタンパク質加水分解活性及びリジン結合活性を有する、項１～６のいずれか一項に記載の方法、使用、または薬剤。
【0015】
８、前記プラスミノーゲンが、配列１４に示されるプラスミノーゲン活性フラグメントと少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ依然としてプラスミノーゲンのタンパク質加水分解活性を有する、項１～６のいずれか一項に記載の方法、使用、または薬剤。
【0016】
いくつかの実施形態では、前記プラスミノーゲンは、配列２に記載のプラスミノーゲンの保存的置換変異体である。
【0017】
９、前記プラスミノーゲンがＧｌｕ－プラスミノーゲン、Ｌｙｓ－プラスミノーゲン、ミニプラスミノーゲン、マイクロプラスミノーゲン、ｄｅｌｔａ－プラスミノーゲンまたはそれらの、プラスミノーゲン活性を保持した変異体から選択されるものである、項１～６のいずれか一項に記載の方法、使用、または薬剤。
【0018】
１０、前記プラスミノーゲンが、天然または合成のヒトプラスミノーゲン、または依然としてプラスミノーゲン活性を保持した変異体若しくはフラグメントである、項１～６のいずれか一項に記載の方法、使用、または薬剤。
【0019】
１１、前記化合物が、１つまたは複数の他の治療方法または薬剤と組み合わせて使用する、項１～１０のいずれか一項に記載の方法、使用、または薬剤。
【0020】
１２、前記他の治療方法が、外科的治療、細胞療法（幹細胞療法を含む）、及び物理的療法（例えば、ヒューマンマシンインターフェース技術などの医療機器支援療法などの身体支援療法）を含む、項１１に記載の方法、使用、または薬剤。
【0021】
１３、前記他の薬剤が、ホルモン、免疫抑制剤、神経栄養薬、抗生物質、及び抗ウイルス薬を含む、項１１に記載の方法、使用、または薬剤。
【0022】
１４、前記化合物が、鼻吸入、エアロゾル吸入、点鼻薬、点眼薬、点耳薬、静脈内、腹腔内、皮下、頭蓋内、髄腔内、動脈内、及び筋肉内から選択される１つまたは複数の方法もしくは経路によって投与される、項１～１３のいずれか一項に記載の方法、使用、または薬剤。
【0023】
本願の上記いずれか１つの実施形態において、前記プラスミノゲンが配列２、６、８、１０または１２と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有し、且つ依然としてプラスミノーゲン活性、例えば、タンパク質加水分解活性、またはリジン結合活性、またはタンパク質加水分解活性及びリジン結合活性を有し得る。一部の実施形態において、前記プラスミノーゲンは、配列２、６、８、１０または１２に基づいて、１～１００、１～９０、１～８０、１～７０、１～６０、１～５０、１～４５、１～４０、１～３５、１～３０、１～２５、１～２０、１～１５、１～１０、１～５、１～４、１～３、１～２、１個のアミノ酸を追加、削除、及び／または置換され、かつ依然としてプラスミノーゲン活性、例えば、タンパク質加水分解活性、またはリジン結合活性、またはタンパク質加水分解活性及びリジン結合活性を有するタンパク質である。
【0024】
一部の実施形態において、前記プラスミノーゲンはプラスミノーゲン活性フラグメントを含み、且つ依然としてプラスミノーゲン活性を有するタンパク質である。一部の実施形態において、前記プラスミノーゲンは、Ｇｌｕ－プラスミノーゲン、Ｌｙｓ－プラスミノーゲン、ミニプラスミノーゲン、マイクロプラスミノーゲン、δ－プラスミノーゲンまたはそれらのプラスミノーゲン活性を保持した変異体である。上記実施形態において、前記プラスミノーゲンは、天然または合成のヒトプラスミノーゲン、または依然プラスミノーゲン活性を保持した変異体若しくはフラグメントである。一部の実施形態において、前記プラスミノーゲンは、霊長類動物またはげっ歯類動物に由来するヒトプラスミノーゲンのオルソログ、または依然プラスミノーゲン活性を保持した変異体若しくはフラグメントである。一部の実施形態において、前記プラスミノーゲンのアミノ酸は配列２、６、８、１０または１２に示される。一部の実施形態において、前記プラスミノーゲンはヒト天然プラスミノーゲンである。
【0025】
一部の実施形態において、前記被験者はヒトである。一部の実施形態において、前記被験者はプラスミノーゲンが不足、または欠乏している。一部の実施形態において、前記不足または欠乏は、先天的、継発的及び／または局所的である。
【0026】
いくつかの実施形態では、前記医薬組成物は、薬学的に許容される担体と、前述の方法で使用するプラスミノーゲンとを含む。いくつかの実施形態では、前記キットは、（ｉ）前述の方法で使用するプラスミノーゲン、及び（ｉｉ）前記プラスミノーゲンを前記被験者に送達するための部材（ｍｅａｎｓ）を含む、予防または治療キットであり得る。いくつかの実施形態では、前記部材は注射器またはバイアルである。いくつかの実施形態では、前記キットは、前述の方法のいずれかを実施するために前記プラスミノーゲンを前記被験者に投与することを指示するためのラベルまたはプロトコルをさらに含む。
【0027】
いくつかの実施形態では、前記製品は、ラベルを含む容器と、（ｉ）前述の方法で使用するためのプラスミノーゲンまたはプラスミノーゲンを含む医薬組成物とを含み、前記ラベルは、前述の方法のいずれかを実施するために前記プラスミノーゲンまたは組成物を前記被験者に投与することを指示する。
【0028】
いくつかの実施形態では、前記キットまたは製品は、他の薬剤を含む１つまたは複数の追加の部材または容器をさらに含む。
【0029】
前記方法の一部の実施形態において、前記プラスミノーゲンは全身または局所にて投与され、好ましくは、静脈内、筋肉内、皮下投与によってプラスミノーゲンを投与することで治療する。前記方法のいくつかの実施形態では、前記プラスミノーゲンは、適切なポリペプチド担体または安定剤と組み合わせて投与される。前記方法の一部の実施形態において、前記プラスミノゲンは毎日０．０００１～２０００ｍｇ／ｋｇ、０．００１～８００ｍｇ／ｋｇ、０．０１～６００ｍｇ／ｋｇ、０．１～４００ｍｇ／ｋｇ、１～２００ｍｇ／ｋｇ、１～１００ｍｇ／ｋｇ、１０～１００ｍｇ／ｋｇ（体重１キロあたりで計算）または０．０００１～２０００ｍｇ／ｃｍ２、０．００１～８００ｍｇ／ｃｍ２、０．０１～６００ｍｇ／ｃｍ２、０．１～４００ｍｇ／ｃｍ２、１～２００ｍｇ／ｃｍ２、１～１００ｍｇ／ｃｍ２、１０～１００ｍｇ／ｃｍ２（体表面積平方センチメートルあたりで計算）の用量で投与し、好ましくは一回以上繰り返し、好ましくは少なくとも毎日投与する。
【0030】
本発明は、本発明の実施形態に属する技術的特徴のすべての組み合わせを明確にカバーし、これらの組み合わせ後の技術構成は、上記の技術構成が別個に明確に開示されたのと同様に、本出願において明確に開示された。さらに、本発明はまた、各実施形態とそれらの要素との間の組み合わせを明確にカバーし、組み合わせ後の技術構成は、本明細書に明確に開示されている。
【図面の簡単な説明】
【0031】
【図1】図１Ａ～Ｄは、ヘキサノンオキサリルジヒドラゾン誘発脱髄モデルマウスにプラスミノーゲンを１４日間投与した後の脳梁のＬＦＢ染色結果を示す図である。Ａはブランク対照群、Ｂは溶媒ＰＢＳ投与対照群、Ｃはプラスミノーゲン投与群であり、Ｄは定量分析結果である。その結果、ブランク対照群の脳梁のミエリンは基本的に正常であり、プラスミノーゲン投与群の脳梁のミエリン鞘の陽性染色（矢印でマーク）は、溶媒ＰＢＳ投与対照群より有意に多く、しかもその差は統計的に有意であった（＊はＰ＜０．０５を表す）。これは、プラスミノーゲンが脳梁の脱髄を減少させ、ヘキサノオキサリルジヒドラゾン誘発脱髄モデルマウスにおけるミエリン損傷の修復を促進できることを示している。
【図2】図２Ａ～Ｃは、ヘキサノンオキサリルジヒドラゾン誘発脱髄モデルマウスにプラスミノーゲンを３日間投与した後の脳梁タンパク質リポタンパク質（ＰＬＰ）免疫染色の代表的な図である。Ａはブランク対照群、Ｂは溶媒ＰＢＳ投与対照群、Ｃはプラスミノーゲン投与群である。その結果、プラスミノーゲン投与群における脳梁ＰＬＰの発現（矢印でマーク）は、溶媒ＰＢＳ投与対照群より有意に高く、発現は、後者と比較してブランク対照群に近かった。これは、プラスミノーゲンが脳梁におけるＰＬＰの発現を促進し、ヘキサノオキサリルジヒドラゾン誘発脱髄モデルマウスにおけるミエリン再生を促進できることを示している。
【図3】図３Ａ～Ｄは、ヘキサノンオキサリルジヒドラゾン誘発脱髄モデルマウスにプラスミノーゲンを１４日間投与した後の脳ニューロフィラメントタンパク質（ＮＦＰ）の免疫染色観察結果を示す図である。Ａはブランク対照群、Ｂは溶媒ＰＢＳ投与対照群、Ｃはプラスミノーゲン投与群であり、Ｄは定量分析結果である。その結果、プラスミノーゲン投与群のマウスの脳梁におけるＮＦＰの発現(矢印でマーク)は、溶媒ＰＢＳ投与対照群よりも有意に高く、その差は統計的に有意であり（＊はＰ＜０．０５を表す）、溶媒ＰＢＳ投与対照群（本文中では単に溶媒群とも呼ばれる）と比較して、プラスミノーゲン投与群のＮＦＰの発現はブランク対照群のそれにより近かった。これは、プラスミノーゲンがＮＦＰの発現を促進し、それによって神経線維の再生を促進できることを示している。
【図4】図４は、多発性硬化症モデルマウスに３５日間プラスミノーゲンを投与した後の脳梁におけるＮＦＰの免疫組織化学染色結果を示す図である。Ａはブランク対照群、Ｂは溶媒ＰＢＳ投与対照群、Ｃはプラスミノーゲン投与群であり、Ｄは平均光学密度の定量分析結果である。その結果、ブランク対照群の脳梁は一定レベルのＮＦＰを発現し（矢印でマーク）、溶媒群マウスの脳梁におけるＮＦＰの発明は有意に減少し、プラスミノーゲン投与群（本文中では単に投与群ともいう）のマウスの脳梁におけるＮＦＰの発現レベルは溶媒群マウスよりも有意に高く、しかもその差は統計的に有意であった（＊はＰ＜０．０５を表す）。この結果は、プラスミノーゲンが多発性硬化症モデルマウスの脳梁におけるＮＦＰの発現を促進できることを示している。
【図5】図５Ａ～Ｃは、多発性硬化症モデルマウスにプラスミノーゲンを３５日間投与した後の脳梁におけるＰＬＰの免疫組織化学染色の結果を示す図である。Ａはブランク対照群、Ｂは溶媒ＰＢＳ投与対照群、Ｃはプラスミノーゲン投与群である。その結果、ブランク対照群の脳梁は一定レベルのＰＬＰを発現し（矢印でマーク）、溶媒群のマウスの脳梁におけるＰＬＰの発現は有意に減少し、投与群のマウスの脳梁におけるＰＬＰの発現レベルは溶媒群マウスのそれより有意に高かった。この結果は、プラスミノーゲンが多発性硬化症モデルマウスの脳梁におけるＰＬＰの発現を促進できることを示している。
【図6】図６Ａ～Ｄは、多発性硬化症モデルマウスにプラスミノーゲンを３５日間投与した後の脳梁におけるＭＢＰの免疫組織化学染色の結果を示す図である。Ａはブランク対照群、Ｂは溶媒ＰＢＳ投与対照群、Ｃはプラスミノーゲン投与群であり、Ｄは平均光学密度の定量分析結果である。その結果、ブランク対照群の脳梁は一定レベルのＭＢＰを発現し（矢印でマーク）、投与群のマウスの脳梁のＭＢＰは溶媒群のマウスよりも有意に高く、しかも統計学的な差は有意に近かった（Ｐ＝０．０６３）。この結果は、プラスミノーゲンが多発性硬化症モデルマウスの脳梁におけるＭＢＰレベルの上昇を促進できることを示している。
【図7】図７Ａ～Ｄは、多発性硬化症モデルマウスにプラスミノーゲンを３５日間投与した後の海馬におけるＩｂａ－１の免疫組織化学染色の結果を示す図である。Ａはブランク対照群、Ｂは溶媒ＰＢＳ投与対照群、Ｃはプラスミノーゲン投与群であり、Ｄは平均光学密度の定量分析結果である。その結果、ブランク対照群のマウスの海馬には一定量のミクログリアが存在し（矢印でマーク）、溶媒群のマウスの海馬のミクログリア量は有意に増加し、投与群のマウスの海馬におけるミクログリアの数は溶媒群よりも有意に高く、しかもその差は統計学的に有意であった（＊はＰ＜０．０５、＊＊＊はＰ＜０．００１を表す）。これは、プラスミノーゲンが、多発性硬化症モデルマウスの海馬損傷の炎症修復を促進できることを示している。
【図8】図８Ａ～Ｄは、多発性硬化症モデルマウスにプラスミノーゲンを３５日間投与した後の海馬におけるＢＤＮＦの免疫組織化学染色の結果を示す図である。Ａはブランク対照群、Ｂは溶媒ＰＢＳ投与対照群、Ｃはプラスミノーゲン投与群であり、Ｄは平均光学密度の定量分析結果である。その結果、ブランク対照群のマウスの海馬には一定レベルのＢＤＮＦがあり（矢印でマーク）、溶媒群のマウスの海馬のＢＤＮＦレベルは増加し、投与群のマウスの海馬におけるＢＤＮＦレベルは溶媒群よりも有意に高く、しかもその統計的な差は有意差に近かった（Ｐ＝０．０９５）。これは、プラスミノーゲンが、多発性硬化症モデルマウスの海馬におけるＢＤＮＦレベルの増加を促進できることを示している。
【図9】図９Ａ～Ｄは、多発性硬化症モデルマウスにプラスミノーゲンを３５日間投与した後の海馬におけるＧＦＡＰの免疫組織化学染色の結果を示す図である。Ａはブランク対照群、Ｂは溶媒ＰＢＳ投与対照群、Ｃはプラスミノーゲン投与群であり、Ｄは平均光学密度の定量分析結果である。その結果、ブランク対照群のマウスの海馬には一定レベルのＧＦＡＰ（矢印でマーク）を発現し、溶媒群のマウスの海馬のＧＦＡＰの発現は減少し、投与群のマウスの海馬におけるＧＦＡＰ発現レベルは溶媒群よりも有意に高く、しかもその統計的な差は有意差に近かった（Ｐ＝０．０５１）。これは、プラスミノーゲンが、多発性硬化症モデルマウスの海馬におけるＧＦＡＰの発現の増加を促進し、アストロサイト活性の上昇を促進できることを示している。
【図10】図１０は、プラスミノーゲン投与２８日後の、多発性硬化症モデルマウスのオープンフィールド試験における総移動距離の統計結果を示す図である。その結果、ブランク対照群のマウスには一定の総移動距離があり、溶媒群のマウスの総移動距離は有意に増加し、投与群のマウスの総移動距離は溶媒群のマウスよりも有意に小さく、その差は統計的に有意であり（＊はＰ＜０．０５を示す）、しかもブランク対照群に近かった。これは、プラスミノーゲンが多発性硬化症モデルマウスの抑うつ行動を緩和できることを示している。
【図11】図１１は、境界ゾーンでの休憩時間の割合（パーセンテージ）＝境界ゾーンでの休憩時間／総観察時間を示す図である。その結果、ブランク対照群のマウスが境界ゾーンで一定の休憩時間の割合（約５７．８％）を持っており、溶媒群のマウスの境界ゾーンでの休憩時間の割合は大幅に減少し、約４９．３％であり、投与群のマウスは境界ゾーンでの休憩時間の割合は約５８．４％であり、溶媒群よりも有意に大きく、その差は統計的に有意であり（＊はＰ＜０．０５を表す）、しかもブランク対照群に近かった。これは、プラスミノーゲンが多発性硬化症モデルマウスの抑うつ行動をある程度緩和できることを示している。
【図12】図１２は、プラスミノーゲン投与３４日後の多発性硬化症モデルマウスの３ボックス実験第２段階におけるストレンジャーマウス２の接触範囲内での休憩時間の割合の統計結果を示す図である。休憩時間の割合＝休憩時間／総観察時間である。３ボックス社会的試験実験の第２段階の結果により明らかに、ブランク対照群のマウスは、ストレンジャーマウス２の接触範囲内で一定の割合の休憩時間を持っており、約１３．７％であり、溶媒群では、約１０．６％と有意に減少し、投与群は約１６．１％であり、溶媒群よりも有意に高く、しかもその統計学的な差は有意に近かった（Ｐ＝０．０７５）。これは、プラスミノーゲンが多発性硬化症モデルマウスの社会的記憶を改善できることを示している。
【図13】図１３は、プラスミノーゲンを６日間投与した後の多発性硬化症モデルラットのオープンフィールド試験の境界ゾーンにおける移動距離の割合（パーセンテージ）の統計結果を示す図である。境界ゾーンの移動距離は、オープンフィールド実験の試験時間内における境界ゾーンの移動軌跡の長さである。その結果、ブランク対照群は境界ゾーンで一定の割合の移動距離を持っており、約９１．１％であり、溶媒群は約９３．６％と有意に増加し、投与群は約８８．１％であり、溶媒群よりも有意に低く、しかもその差は統計的に有意であった（＊はＰ＜０．０５を表す）。これは、プラスミノーゲンが多発性硬化症モデルマウスの抑うつ行動を緩和できることを示している。
【図14】プラスミノーゲンを６日間投与した後の多発性硬化症モデルラットのオープンフィールド試験における中心ゾーンの移動距離のパーセンテージの統計結果を示す図である。その結果、ブランク対照群は中心ゾーンで一定の割合の距離を持っており、約８．９％であり、溶媒群は約６．４％と有意に低下し、投与群は約１１．９％であり、溶媒群よりも有意に高く、しかもその差は統計的に有意であった（＊はＰ＜０．０５を表す）。これは、プラスミノーゲンが多発性硬化症モデルラットの不安行動を緩和できることを示している。
【図15】図１５は、プラスミノーゲンを２０日間投与した後の多発性硬化症モデルマウスの高架式十字迷路試験におけるオープンアームエントリ率の統計結果を示す図である。その結果、ブランク対照群のマウスは一定のオープンアームエントリ率を有し、約１４．９％であり、溶媒群のマウスのオープンアームエントリ率は、約２３．０％と有意に増加し、投与群のマウスのオープンアームエントリ率は約１４．５％であり、溶媒群よりも有意に少なく、その差は統計学的に有意であり（Ｐ＝０．０１５）、しかもブランク対照群に近かった。これは、プラスミノーゲンが多発性硬化症モデルマウスの不安行動をある程度緩和できることを示している。
【図16】図１６は、プラスミノーゲンを２０日間投与した後の多発性硬化症モデルマウスの高架式十字迷路試験におけるクローズアームエントリ率の統計結果を示す図である。その結果、ブランク対照群のマウスは一定のクローズアームエントリ率を有し、約３４．４％であり、溶媒群のマウスのクローズアームエントリ率は、約２８．１％と有意に低下し、投与群のマウスのクローズアームエントリ率は約３７．１％であり、溶媒群よりも有意に大きく、その差は統計学的に有意であり（Ｐ＝０．００７）、しかもブランク対照群に近かった。これは、プラスミノーゲンが多発性硬化症モデルマウスの不安や抑うつ行動をある程度緩和できることを示している。
【図17】図１７は、プラスミノーゲンを２７日間投与した後の多発性硬化症モデルマウスの高架式十字迷路試験におけるクローズアーム移動距離の統計結果を示す図である。クローズアームの移動の合計距離は、高架式十字迷路実験の試験時間中にマウスのクローズアームの移動の合計距離である。その結果、ブランク対照群のマウスは一定のクローズアーム移動の合計距離を有し、溶媒群のマウスのクローズアーム移動の合計距離が有意に増加し、投与群のマウスのクローズアーム移動の合計距離は溶媒群よりも有意に少なく、その差は統計学的に有意であり（＊はＰ＜０．０５を表す）、ブランク対照群に近かった。これは、プラスミノーゲンが多発性硬化症モデルマウスの不安や抑うつ行動をある程度緩和できることを示している。
【図18】図１８は、プラスミノーゲンを２７日間投与した後の多発性硬化症モデルマウスの高架式十字迷路試験におけるクローズアーム休憩時間の割合の統計結果を示す図である。その結果、ブランク対照群のマウスは一定のクローズアーム休憩時間の割合を有し、約５１．８％であり、溶媒群のマウスのクローズアーム休憩時間の割合は３６．８％と有意に低下し、投与群のマウスのクローズアーム休憩時間の割合は約５０．１％であり、溶媒群よりも有意に大きく、その差は統計学的に有意であり（＊はＰ＜０．０５を表す）、ブランク対照群に近かった。これは、プラスミノーゲンが多発性硬化症モデルマウスの不安や抑うつ行動をある程度緩和できることを示している。
【発明の詳細な説明】
【0032】
線維素溶解系（Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｔｉｃ ｓｙｓｔｅｍ）は、線溶系とも呼ばれ、線維素溶解の過程に関与する一連の化学物質からなる系であり、主にプラスミノーゲン（PLG）、プラスミン、プラスミノーゲン活性化因子、及び線維素溶解阻害剤を含む。プラスミノーゲン活性化因子には、組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔ－ＰＡ）、及びウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕ－ＰＡ）が含まれる。ｔ－ＰＡはセリンプロテアーゼであり、血管内皮細胞によって合成される。ｔ－ＰＡはプラスミノーゲンを活性化し、このプロセスは主にフィブリンで行われる。ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕ－ＰＡ）は、尿細管上皮細胞と血管内皮細胞によって産生され、補因子としてフィブリンを必要とすることなくプラスミノーゲンを直接活性化することができる。プラスミノーゲン（ＰＬＧ）は肝臓で合成される。血液が凝固すると、ＰＬＧはフィブリンネットに大量に吸着され、ｔ－ＰＡまたはｕ－ＰＡの作用によりプラスミンに活性化されて線維素溶解を促進する。プラスミナーゼ（ＰＬ）はセリンプロテアーゼであり、フィブリンとフィブリノーゲンを分解し、様々な凝固因子Ｖ、ＶＩＩＩ、Ｘ、ＶＩＩ、ＸＩ、ＩＩなどを加水分解し、プラスミノーゲンをプラスミンに変換し、補体を加水分解するなどの作用がある。線維素溶解阻害剤には、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤（ＰＡＩ）、及びα２－抗チプラスミン（α２－ＡＰ）が含まれる。ＰＡＩには主にＰＡＩ－１とＰＡＩ－２の２つの形態があり、ｔ－ＰＡに１：１の比率で特異的に結合し、それによってそれを不活性化すると同時にＰＬＧを活性化することができる。α２－ＡＰは肝臓で合成され、ＰＬと１：１の比率で結合して複合体を形成し、それによってＰＬ活性を阻害する。ＦＸＩＩＩはα２－ＡＰをフィブリンと共有結合させ、それによってＰＬに対するフィブリンの感受性を弱める。インビボでの線維素溶解系の活性を阻害する物質としては、ＰＡＩ－１、補体Ｃ１阻害剤、α２抗プラスミン、及びα２－マクログロブリンが挙げられる。
【0033】
本明細書で使用される「プラスミノーゲン活性化経路の成分」という用語は、
１、プラスミノーゲン、Ｌｙｓ－プラスミノーゲン、Ｇｌｕ－プラスミノーゲン、マイクロプラスミノーゲン（ｍｉｃｒｏ－ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ）、ｄｅｌｔａ－プラスミノーゲン、それらの変異体または類縁体；
２、プラスミン及びそれらの変異体または類縁体;及び
３、プラスミノーゲン活性化剤、例えば、ｔＰＡ及びｕＰＡ、ならびにｔＰＡまたはｕＰＡの１つ以上のドメイン（１つ以上のｋｒｉｎｇｌｅドメイン及びタンパク質加水分解ドメインなど）を含むｔＰＡまたはｕＰＡ変異体及び類縁体をカバーする。
１、プラスミノーゲン、Ｌｙｓ－プラスミノーゲン、Ｇｌｕ－プラスミノーゲン、マイクロプラスミノーゲン（ｍｉｃｒｏ－ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ）、ｄｅｌｔａ－プラスミノーゲン、それらの変異体または類縁体；
２、プラスミン及びそれらの変異体または類縁体;及び
３、プラスミノーゲン活性化剤、例えば、ｔＰＡ及びｕＰＡ、ならびにｔＰＡまたはｕＰＡの１つ以上のドメイン（１つ以上のｋｒｉｎｇｌｅドメイン及びタンパク質加水分解ドメインなど）を含むｔＰＡまたはｕＰＡ変異体及び類縁体をカバーする。
【0034】
上記プラスミノーゲン、プラスミン、ｔＰＡ及びｕＰＡの「変異体」は、すべての天然に存在するヒトの遺伝的変異体及びこれらのタンパク質の他の哺乳動物型、並びに、例えば、１～１００、１～９０、１～８０、１～７０、１～６０、１～５０、１～４５、１～４０、１～３５、１～３０、１～２５、１～２０、１～１５、１～１０、１～５、１～４、１～３、１～２、１個のアミノ酸を追加、削除、及び／または置換されてかつ依然としてプラスミノーゲン活性、プラスミン活性、ｔＰＡまたはｕＰＡ活性を有するタンパク質を含む。例えば、プラスミノーゲン活性、プラスミン活性、ｔＰＡまたはｕＰＡの「変異体」は、例えば、１～１００、１～９０、１～８０、１～７０、１～６０、１～５０、１～４５、１～４０、１～３５、１～３０、１～２５、１～２０、１～１５、１～１０、１～５、１～４、１～３、１～２、１個の保存的アミノ酸によって置換されて得られるこれらのタンパク質の突然変異体を含む。
【0035】
本発明の「プラスミノゲン変異体」は、配列２、６、８、１０または１２と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有し、且つ依然としてプラスミノーゲン活性を有するタンパク質をカバーする。例えば、本発明の「プラスミノーゲン変異体」は、配列２、６、８、１０または１２に基づいて、１～１００、１～９０、１～８０、１～７０、１～６０、１～５０、１～４５、１～４０、１～３５、１～３０、１～２５、１～２０、１～１５、１～１０、１～５、１～４、１～３、１～２、１個のアミノ酸を追加、削除、及び／または置換し、且つ依然としてプラスミノーゲン活性を有するタンパク質であり得る。具体的には、本発明のプラスミノーゲン変異体は、すべての天然に存在するヒトの遺伝的変異体及びこれらのタンパク質の他の哺乳動物型、並びに、例えば、１～１００、１～９０、１～８０、１～７０、１～６０、１～５０、１～４５、１～４０、１～３５、１～３０、１～２５、１～２０、１～１５、１～１０、１～５、１～４、１～３、１～２、１個のアミノ酸を保存的置換によって得られるこれらのタンパク質の突然変異体を含む。
【0036】
本発明のプラスミノーゲンは、霊長類動物またはげっ歯類動物に由来するヒトプラスミノーゲンのオルソログ、または依然プラスミノーゲン活性を保持した変異体、例えば、配列２、６、８、１０または１２に示されるプラスミノーゲン、例えば、配列２に示されるヒト天然プラスミノーゲンであり得る。
【0037】
上記プラスミノーゲン、プラスミン、ｔＰＡ及びｕＰＡの「類縁体」はそれぞれ、プラスミノーゲン、プラスミン、ｔＰＡまたはｕＰＡと実質的に同様の効果を与える化合物を含む。
【0038】
上記プラスミノーゲン、プラスミン、ｔＰＡ及びｕＰＡの「変異体」及び「類縁体」は、１つ以上のドメイン（例えば、１つ以上のｋｒｉｎｇｌｅドメイン及びタンパク質加水分解ドメイン）を含むプラスミノーゲン、プラスミン、ｔＰＡ及びｕＰＡの「変異体」及び「類縁体」をカバーする。例えば、プラスミノーゲンの「変異体」及び「類縁体」は、１つ以上のプラスミノーゲンドメイン（例えば、１つ以上のｋｒｉｎｇｌｅドメイン及びタンパク質加水分解ドメイン）を含むプラスミノーゲン変異体及び類縁体、例えば、ミニプラスミノーゲン（ｍｉｎｉ－ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ）をカバーする。プラスミンの「変異体」及び「類縁体」は、１つ以上のプラスミンドメイン（例えば、１つまたは複数のｋｒｉｎｇｌｅドメイン及びタンパク質加水分解ドメイン）を含むミニプラスミン（ｍｉｎｉ－ｐｌａｓｍｉｎ）やδ－プラスミン（ｄｅｌｔａ－ｐｌａｓｍｉｎ）などのプラスミンの「変異体」及び「類縁体」をカバーする。
【0039】
上記プラスミノーゲン、プラスミン、ｔＰＡまたはｕＰＡの「変異体」または「類縁体」がそれぞれプラスミノーゲン、プラスミン、ｔＰＡまたはｕＰＡの活性を有するかどうか、またはそれらがプラスミノーゲン、プラスミン、ｔＰＡまたはｕＰＡと実質的に同様の効果をそれぞれ与えるかどうかは、当技術分野で知られている方法、例えば、酵素記録法（ｅｎｚｙｍｏｇｒａｐｈｙ）、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）及びＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞ソーティング法）を使用して、活性化されたプラスミン活性のレベルによって測定できる。例えば、次の文献に記載されている方法を参照して測定することができる。Ｎｙ，Ａ．，Ｌｅｏｎａｒｄｓｓｏｎ，Ｇ．，Ｈａｇｇｌｕｎｄ，Ａ．Ｃ，Ｈａｇｇｌｏｆ，Ｐ．，Ｐｌｏｐｌｉｓ，Ｖ．Ａ．，Ｃａｒｍｅｌｉｅｔ，Ｐ． ａｎｄ Ｎｙ，Ｔ． （１９９９）． Ｏｖｕｌａｔｉｏｎ ｉｎｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ－ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｍｉｃｅ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １４０，５０３０－５０３５；Ｓｉｌｖｅｒｓｔｅｉｎ ＲＬ， Ｌｅｕｎｇ ＬＬ， Ｈａｒｐｅｌ ＰＣ， Ｎａｃｈｍａｎ ＲＬ （Ｎｏｖｅｍｂｅｒ １９８４）． “Ｃｏｍｐｌｅｘ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ ｗｉｔｈ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ． Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｂｙ ｔｉｓｓｕｅ ａｃｔｉｖａｔｏｒ”． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ７４ （５）： １６２５－３３；Ｇｒａｖａｎｉｓ Ｉ， Ｔｓｉｒｋａ ＳＥ （Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２００８）． “Ｔｉｓｓｕｅ－ｔｙｐｅ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ａｓ ａ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｔａｒｇｅｔ ｉｎ ｓｔｒｏｋｅ”． Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｏｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｔａｒｇｅｔｓ． １２ （２）： １５９－７０；Ｇｅｉｇｅｒ Ｍ， Ｈｕｂｅｒ Ｋ， Ｗｏｊｔａ Ｊ， Ｓｔｉｎｇｌ Ｌ， Ｅｓｐａｎａ Ｆ， Ｇｒｉｆｆｉｎ ＪＨ， Ｂｉｎｄｅｒ ＢＲ （Ａｕｇ １９８９）． “Ｃｏｍｐｌｅｘ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｕｒｏｋｉｎａｓｅ ａｎｄ ｐｌａｓｍａ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ”． Ｂｌｏｏｄ． ７４ （２）： ７２２－８。
【0040】
本発明の一部の実施形態において、本発明の「プラスミノーゲン活性化経路の成分」はプラスミノーゲンであり、Ｇｌｕ－プラスミノーゲン、Ｌｙｓ－プラスミノーゲン、ミニプラスミノーゲン、マイクロプラスミノーゲン、δ－プラスミノーゲンまたはそれらのプラスミノーゲン活性を保持した変異体である。一部の実施形態において、前記プラスミノーゲンは、天然または合成のヒトプラスミノーゲン、または依然プラスミノーゲン活性を保持した保存的突然変異体若しくはそのフラグメントである。一部の実施形態において、前記プラスミノーゲンは、霊長類動物またはげっ歯類動物に由来するヒトプラスミノーゲンのオルソログ、または依然プラスミノーゲン活性を保持した保存的突然変異体若しくはそのフラグメントである。一部の実施形態において、前記プラスミノーゲンのアミノ酸は配列２、６、８、１０または１２に示される。一部の実施形態において、前記プラスミノーゲンはヒト天然プラスミノーゲンである。一部の実施形態において、前記プラスミノーゲンは配列２に示されるヒト天然プラスミノーゲンである。
【0041】
「プラスミノーゲンを直接活性化できる、若しくはプラスミノーゲン活性化経路の上流成分を活性化することによってプラスミノーゲンを間接に活性化できる化合物」とは、プラスミノーゲンを直接活性化できる、若しくはプラスミノーゲン活性化経路の上流成分を活性化することによってプラスミノーゲンを間接に活性化できる任意の化合物を指し、例えば、ｔＰＡ、ｕＰＡ、ストレプトキナーゼ、サルプラーゼ、アルテプラーゼ、レテプラーゼ、テネクテプラーゼ、アニストレプラーゼ、モンテプラーゼ、ラノテプラーゼ、パミテプラーゼ、及びスタフィロキナーゼが挙げられる。
【0042】
本発明の「線維素溶解阻害剤の拮抗薬」は、線維素溶解阻害剤の作用に拮抗し、その作用を弱め、遮断し、阻止する化合物である。前記線維素溶解阻害剤は、例えば、ＰＡＩ－１、補体Ｃ１阻害剤、α２－抗プラスミン、及びα２－マクログロブリンである。前記拮抗剤は、ＰＡＩ－１、補体Ｃ１阻害剤、α２－抗プラスミンもしくはα２－マクログロブリンの抗体、または、例えばＰＡＩ－１、補体Ｃ１阻害剤、α２－抗プラスミンもしくはα２－マクログロブリンの発現を遮断またはダウンレギュレートするアンチセンスＲＮＡもしくはミニＲＮＡ、または、ＰＡＩ－１、補体Ｃ１阻害剤、α２－抗プラスミンまたはα２－マクログロブリンの結合部位を占めるが、ＰＡＩ－１、補体Ｃ１阻害剤、α２－抗プラスミンまたはα２－マクログロブリンの機能を持たない化合物、または、ＰＡＩ－１、補体Ｃ１阻害剤、α２－抗プラスミンもしくはα２－マクログロブリンの結合ドメイン及び／または活性ドメインをブロックする化合物である。
【0043】
プラスミンはプラスミノゲン活性化系（ＰＡ系）の重要な成分である。それは広スペクトルのプロテアーゼであり、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の幾つかの成分を加水分解することができ、これらの成分はフィブリン、ゼラチン、フィブロネクチン、ラミニン及びプロテオグリカンを含む。また、プラスミンは一部のプロマトリックスメタロプロテアーゼ（ｐｒｏ－ＭＭＰ）を活性化させて活性のあるマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）にすることができる。そのためプラスミンは細胞外タンパク加水分解作用の一つの重要な上流調節因子である。プラスミンはプラスミノゲンが二種類の生理性のＰＡ：組織型プラスミノゲン活性化剤（ｔＰＡ）またはウロキナーゼプラスミノゲン活性化剤（ｕＰＡ）のタンパク質加水分解により形成されるものである。プラスミノゲンは血漿及び他の体液中において、相対的レベルが比較的高く、従来的にはＰＡ系の調節は主にＰＡｓの合成及び活性レベルよって実現されると考えられている。ＰＡ系成分の合成は異なる要素によって厳格な調節を受け、例えばホルモン、成長因子及びサイトカインである。また、この他に、プラスミンとＰＡｓの特定の生理的阻害剤が存在する。プラスミンの主な阻害剤はα２－抗プラスミン（α２－ａｎｔｉｐｌａｓｍｉｎ）である。ＰＡｓの活性は、ｕＰＡとｔＰＡのプラスミノーゲン活性化剤阻害剤－１（ＰＡＩ－１）に同時に阻害され、ｕＰＡを主に阻害するプラスミノーゲン活性化剤阻害剤－２（ＰＡＩ－２）によって調節される。一部の細胞表面には直接加水分解する活性のあるｕＰＡ特異性細胞表面受容体（ｕＰＡＲ）がある。
【0044】
ヒトプラスミノゲンは単一鎖の糖タンパクであり、７９１個のアミノ酸からなり、分子量は約９２ｋＤａである。プラスミノゲンは主に肝臓で合成され、大量に細胞外液に存在している。血漿中に含まれるプラスミノゲンの含有量は約２μＭである。そのためプラスミノゲンは組織及び体液中のタンパク質加水分解活性の大きな潜在的な由来である。プラスミノゲンには二種類の分子の形が存在する：グルタミン酸－プラスミノゲン（Ｇｌｕ－ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ）及びリジン－プラスミノゲン（Ｌｙｓ－ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ）である。天然的に分泌され及び分解していない形のプラスミノゲンは一つのアミノ基末端（Ｎ－末端）グルタミン酸を有し、そのためグルタミン酸－プラスミノゲンと称される。しかし、プラスミンが存在する場合、グルタミン酸－プラスミノゲンはＬｙｓ７６－Ｌｙｓ７７においてリジン－プラスミノゲンに加水分解される。グルタミン酸－プラスミノゲンと比較して、リジン－プラスミノゲンはフィブリンとより高い親和力を有し、さらにより高い速度でＰＡｓによって活性化されることができる。この二種類の形のプラスミノゲンのＡｒｇ５６０－Ｖａｌ５６１ペプチド結合はｕＰＡまたはｔＰＡによって切断され、これによりジスルフィド結合によって連結された二重鎖プロテアーゼプラスミンの形成をもたらす。プラスミノゲンのアミノ基末端部分は五つの相同三環を含み、即ちいわゆるｋｒｉｎｇｌｅｓであり、カルボキシル基末端部分はプロテアーゼドメインを含む。一部のＫｒｉｎｇｌｅｓはプラスミノゲンとフィブリン及びその阻害剤α２－ＡＰの特異的相互作用を介在するリジン結合部位を含む。最も新しく発見されたのは３８ｋＤａのフィブリンプラスミノゲンフラグメントであり、ｋｒｉｎｇｌｅｌ－４を含み、血管生成の有効的な阻害剤である。このフラグメントはアンギオスタチン(Angiostatin)と命名され、幾つかのプロテアーゼ加水分解プラスミノゲンから生成される。
【0045】
プラスミンの主な基質はフィブリンであり、フィブリンの溶解は病理性血栓の形成を予防するキーポイントである。プラスミンはさらにＥＣＭの幾つかの成分に対する基質特異性を有し、これらはラミニン、フィブロネクチン、プロテオグリカン及びゼラチンを含み、これはプラスミンがＥＣＭ再建において重要な作用を有することを示している。間接的に、プラスミンはさらにＭＭＰ－１、ＭＭＰ－２、ＭＭＰ－３及びＭＭＰ－９を含むいくつかのプロテアーゼ前駆体を活性プロテアーゼに変換することによりＥＣＭのその他の成分を分解する。そのため、以下のように提唱する人がいる。プラスミンは細胞外タンパク加水分解の重要な上流調節因子である。また、プラスミンはいくつかの潜在的な形の成長因子を活性化させる能力を有する。体外において、プラスミンはさらに補体系の成分を加水分解させて走化性の補体フラグメントを放出することができる。
【0046】
「プラスミン」は血液中に存在する非常に重要な酵素であり、フィブリン凝塊をフィブリン分解生成物及びＤ－二量体に加水分解する。
【0047】
「プラスミノーゲン」はプラスミンの酵素前駆体の形であり、ｓｗｉｓｓ ｐｒｏｔ中の配列に基づいて、シグナルペプチドを含む天然ヒト由来プラスミノーゲンのアミノ酸配列（配列４）としての計算によれば８１０個のアミノ酸からなり、分子量は約９０ｋＤであり、主に肝臓において合成され且つ血液中で循環できる糖タンパク質であり、該アミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ配列は配列３に示される通りである。フルサイズのプラスミノーゲンは七つのドメインを含む：Ｃ末端に位置するセリンプロテアーゼドメイン、Ｎ末端に位置するＰａｎ Ａｐｐｌｅ（ＰＡｐ）ドメイン及び５つのＫｒｉｎｇｌｅドメイン（Ｋｒｉｎｇｌｅ１－５）を含む。ｓｗｉｓｓ ｐｒｏｔ中の配列を参照すれば、そのシグナルペプチドは残基Ｍｅｔ１－Ｇｌｙ１９を含み、ＰＡｐは残基Ｇｌｕ２０－Ｖａｌ９８を含み、Ｋｒｉｎｇｌｅ１は残基Ｃｙｓ１０３－Ｃｙｓ１８１を含み、Ｋｒｉｎｇｌｅ２は残基Ｇｌｕ１８４－Ｃｙｓ２６２を含み、Ｋｒｉｎｇｌｅ３は残基Ｃｙｓ２７５－Ｃｙｓ３５２を含み、Ｋｒｉｎｇｌｅ４は残基Ｃｙｓ３７７－Ｃｙｓ４５４を含み、Ｋｒｉｎｇｌｅ５は残基Ｃｙｓ４８１－Ｃｙｓ５６０を含む。ＮＣＢＩデータによれば、セリンプロテアーゼドメインは残基Ｖａｌ５８１－Ａｒｇ８０４を含む。
【0048】
Ｇｌｕ－プラスミノーゲンは人の天然のフルサイズのプラスミノーゲンであり、７９１個のアミノ酸からなる（１９個のアミノ酸からなるシグナルペプチドを含まない）。該配列をコードするｃＤＮＡ配列は配列１に示される通りであり、そのアミノ酸配列は配列２に示される通りである。体内において、さらにＧｌｕ－プラスミノーゲンの第７６－７７位のアミノ酸の位置で加水分解することにより形成されたＬｙｓ－プラスミノーゲンが存在し、例えば配列６に示されるものであり、該アミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ配列は配列５が示す通りである。Ｄｅｌｔａ－プラスミノーゲン（δ－ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ）はフルサイズのプラスミノーゲンにＫｒｉｎｇｌｅ２－Ｋｒｉｎｇｌｅ５構造の欠損が生じているフラグメントであり、Ｋｒｉｎｇｌｅ１及びセリンプロテアーゼドメインしか含有せず（プロテアーゼドメイン（ｐｒｏｔｅａｓｅ ｄｏｍａｉｎ、ＰＤ）とも呼ばれる）、δ－プラスミノーゲンのアミノ酸配列（配列８）を報告している文献があり、該アミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ配列は例えば配列７である。ミニプラスミノーゲン（Ｍｉｎｉ－ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ）はＫｒｉｎｇｌｅ５及びセリンプロテアーゼドメインからなり、残基Ｖａｌ４４３－Ａｓｎ７９１（シグナルペプチドを含まないＧｌｕ－プラスミノーゲン配列Ｇｌｕ残基を開始アミノ酸とする）について文献が報告しており、そのアミノ酸配列は配列１０に示される通りであり、該アミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ配列は配列９が示す通りである。しかしマイクロプラスミノーゲン（Ｍｉｃｒｏ－ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ）はセリンプロテアーゼドメインのみ含有し、そのアミノ酸配列は残基Ａｌａ５４３－Ａｓｎ７９１（シグナルペプチドを含まないＧｌｕ－プラスミノーゲン配列のＧｌｕ残基は開始アミノ酸である）と文献が報告し、特許文献ＣＮ１０２１５４２５３Ａはそれが残基Ｌｙｓ５３１－Ａｓｎ７９１を含むと開示し（シグナルペプチドを含まないＧｌｕ－プラスミノーゲン配列のＧｌｕ残基を開始アミノ酸とする）、本特許出願において、マイクロプラスミノーゲンの配列は特許文献ＣＮ１０２１５４２５３Ａを参照でき、そのアミノ酸配列は配列１２に示される通りであり、該アミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ配列は配列１１に示される通りである。
【0049】
全長プラスミノーゲンの構造は、Ａｉｓｉｎａらの論文にも記載されている（Ａｉｓｉｎａ Ｒ Ｂ，Ｍｕｋｈａｍｅｔｏｖａ Ｌ Ｉ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ／ｐｌａｓｍｉｎ ｓｙｓｔｅｍ［Ｊ］．Ｒｕｓｓｉａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１４，４０（６）：５９０－６０５）。Ａｉｓｉｎａらの前記文章によれば、プラスミノーゲンにはＫｒｉｎｇｌｅ １、２、３、４、５ドメインとセリンプロテアーゼドメイン（プロテアーゼドメイン（ｐｒｏｔｅａｓｅ ｄｏｍａｉｎ、ＰＤ）とも呼ばれる）が含まれ、Ｋｒｉｎｇｌｅｓは、プラスミノーゲンが低分子量及び高分子量のリガンドに結合する役割（すなわち、リジン結合活性）を担っており、その結果、プラスミノーゲンがよりオープンな構成に変換され、より活性化しやすくなり、プロテアーゼドメイン（ＰＤ）は、残基Ｖａｌ５６２－Ａｓｎ７９１であり、ｔＰＡとＵＰＡはプラスミノーゲンのＡｒｇ５６１－Ｖａｌ５６２位活性化結合を特異的に切断し、それによってプラスミノーゲンがプラスミンを形成できる。したがって、プロテアーゼドメイン（ＰＤ）は、プラスミノーゲンのタンパク質加水分解活性を付与する領域である。
【0050】
本発明の「プラスミン」と「フィブリンプラスミン」、「繊維タンパクプラスミン」は互いに置き換えて使用でき、その意味は同じである。「プラスミノーゲン」と「フィブリンプラスミノーゲン」、「繊維タンパクプラスミノーゲン」は互いに置き換えて使用でき、その意味は同じである。
【0051】
本願において、前記プラスミノーゲンの「欠乏」とは、被験者体内のプラスミノーゲンの含有量または活性が正常な人より低く、被験者の正常な生理学的機能に影響を及ぼすのに十分に低いことをいう。前記プラスミノーゲンの「欠乏」の意味は、被験者体内のプラスミノーゲンの含有量または活性が正常な人より明らかに低く、活性または発現が極微量であり、外部供給によってのみ正常な生理学的機能を維持できることである。
【0052】
当業者は以下のように理解できる。本発明のプラスミノーゲンのすべての技術構成はプラスミンに適用でき、そのため、本発明に記載の技術構成はプラスミノーゲン及びプラスミンをカバーするものである。循環プロセスにおいて、プラスミノーゲンは閉鎖した非活性コンフォメーションであるが、血栓または細胞表面に結合した際、プラスミノーゲン活性化剤（ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ，ＰＡ）の介在下において、開放性のコンフォメーションを有する活性プラスミンとなる。活性を有するプラスミンはさらにフィブリン凝塊をフィブリン分解生成物及びＤ－二量体に加水分解させ、これにより血栓を溶解させる。そのうちプラスミノーゲンのＰＡｐドメインはプラスミノーゲンを非活性閉鎖コンフォメーションにする重要なエピトープであり、しかしＫＲドメインは受容体及び基質上のリジン残基と結合できるものである。プラスミノーゲン活性化剤としての酵素は、既に複数種類知られ、組織プラスミノーゲン活性化剤（ｔＰＡ）、ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化剤（ｕＰＡ）、カリクレイン及び凝結因子ＸＩＩ（ハーゲマン因子）などを含む。
【0053】
「プラスミノーゲン活性フラグメント」とは、基質のターゲット配列中のリジンに結合する活性（リジン結合活性）フラグメント、またはタンパク質加水分解機能を発揮する活性（タンパク質加水分解活性）フラグメント、またはタンパク質加水分解活性とリジン結合活性との両方を有するフラグメントを指す。本発明のプラスミノーゲンに関する技術構成は、プラスミノーゲンをプラスミノーゲンの活性フラグメントに置き換えた技術構成を包含する。いくつかの実施形態では、本発明のプラスミノーゲン活性フラグメントは、プラスミノーゲンのセリンプロテアーゼドメインを含むか、またはプラスミノーゲンのセリンプロテアーゼドメインからなり、好ましくは、本発明のプラスミノーゲン活性フラグメントは、配列１４を含むか、または配列１４と少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、または配列１４と少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を有するアミノ酸配列からなる。一部の実施形態において、本発明のプラスミノーゲン活性フラグメントは、Ｋｒｉｎｇｌｅ １、Ｋｒｉｎｇｌｅ ２、Ｋｒｉｎｇｌｅ ３、Ｋｒｉｎｇｌｅ ４、及びＫｒｉｎｇｌｅ ５から選択される１つ以上のドメインを含むか、またはＫｒｉｎｇｌｅ １、Ｋｒｉｎｇｌｅ ２、Ｋｒｉｎｇｌｅ ３、Ｋｒｉｎｇｌｅ ４、及びＫｒｉｎｇｌｅ ５から選択される１つ以上のドメインからなる。いくつかの実施形態では、本発明のプラスミノーゲンは、上記のプラスミノーゲンの活性フラグメントを含むタンパク質を含む。
【0054】
現在、血液中のプラスミノーゲン及びその活性測定方法は組織プラスミノーゲン活性化剤の活性に対する測定（ｔ－ＰＡＡ）、血漿組織プラスミノーゲン活性化剤抗原に対する測定（ｔ－ＰＡＡｇ）、血漿組織プラスミノーゲン活性に対する測定（ｐｌｇＡ）、血漿組織プラスミノーゲン抗原に対する測定（ｐｌｇＡｇ）、血漿組織プラスミノーゲン活性化剤の阻害物活性に対する測定、血漿組織プラスミノーゲン活性化剤の阻害物抗原に対する測定、血漿プラスミン－抗プラスミン複合物に対する測定（ＰＡＰ）を含む。最もよく見られる測定方法は発色基質法である：測定対象(被験者)の血漿中にストレプトキナーゼ（ＳＫ）と発光基質を添加し、測定対象の血漿中のＰＬＧはＳＫの作用下においてＰＬＭとなり、後者は発光基質に作用し、それから分光光度計で測定し、吸光度の増加はプラスミノーゲンの活性と正比例の関係となる。この他にも免疫化学法、ゲル電気泳動法、免疫比濁法、放射免疫拡散法などを用いて血液中のプラスミノーゲン活性に対して測定を行うことができる。
【0055】
「オルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）」とは異なる種どうしのホモログであり、タンパク質の相同物もＤＮＡの相同物も含む。それは具体的に異なる種どうしの同じ祖先の遺伝子から進化して得られるタンパク質または遺伝子を言う。本発明のプラスミノーゲンはヒト天然プラスミノーゲンを含み、さらには異なる種に由来する、プラスミノーゲン活性を有するプラスミノーゲンオルソログを含む。
【0056】
「保存的置換バリアント」とはそのうちの一つの指定されたアミノ酸残基が改変されたがタンパク質または酵素の全体のコンフォメーション及び機能を変えないものであり、これは類似の特性（例えば酸性、アルカリ性、疎水性など）のアミノ酸で親タンパク質中のアミノ酸配列中のアミノ酸を置換するものを含むがこれらに限られない。類似の性質を有するアミノ酸は知られている通りである。例えば、アルギニン、ヒスチジン及びリジンは親水性のアルカリ性アミノ酸であり且つ互いに置き換えることができる。同じように、イソロイシンは疎水アミノ酸であり、ロイシン、メチオニンまたはバリンによって置換されることができる。そのため、機能の類似する二つのタンパク質またはアミノ酸配列の類似性は異なる可能性もある。例えば、ＭＥＧＡＬＩＧＮアルゴリズムに基づいて７０％～９９％の類似性（同一性）を有する。「保存的置換バリアント」はさらにＢＬＡＳＴまたはＦＡＳＴＡアルゴリズムに基づいて６０％以上のアミノ酸同一性を有するポリペプチドまたは酵素を含み、７５％以上に達すればさらによく、最も好ましくは８５％以上に達し、さらには９０％以上に達するのが最も好ましく、さらに天然または親タンパク質または酵素と比較して同じまたは基本的に類似する性質または機能を有する。
【0057】
「分離された」プラスミノーゲンとは天然環境から分離及び／または回収されたプラスミノーゲンタンパク質である。いくつかの実施形態において、前記プラスミノーゲンは（１）９０％を超える、９５％を超える、または９８％を超える純度（重量で計算した場合）になるまで精製し、例えばＬｏｗｒｙ法によって決まるもので、例えば９９％（重量で計算した場合）を超えるまで精製する、（２）少なくともスピニングカップ配列分析装置によりＮ末端または内部アミノ酸配列の少なくとも１５個の残基が得られる程度になるまで精製する、または（３）同質性になるまで精製する。該同質性はクマシーブリリアントブルーまたは銀染色により還元性または非還元性条件下のドデシル硫酸ナトリウムーポリアクリルアミノゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）によって決まるものである。分離されたプラスミノーゲンはバイオエンジニアリング技術により組み換え細胞から製造され、さらに少なくとも一つの精製ステップで分離されたプラスミノーゲンを含む。
【0058】
用語の「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」は本明細書において互いに置き換えて使用でき、いかなる長さのアミノ酸の重合体を指し、遺伝的にコードされた及び非遺伝的にコードされたアミノ酸、化学的または生化学的に修飾されまたは派生したアミノ酸、及び修飾されたペプチド主鎖を有するポリペプチドを含む。該用語は融合タンパク質を含み、異種性アミノ酸配列を有する融合タンパク質を含むがこれに限られず、異種性と同種性由来のリーダー配列（Ｎ端メチオニン残基を有するあるいは有しない）を含む融合物；等々である。
【0059】
参照ペプチド配列の「アミノ酸配列同一性パーセンテージ（％）」の定義は、必要に応じてギャップを導入することで最大のパーセンテージ配列の同一性を実現した後、如何なる保存的な置換も配列同一性の一部として見なさない場合、候補配列中における参照ポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同じアミノ酸残基のパーセンテージである。パーセンテージのアミノ酸配列の同一性を測定することを目的とした比較は本分野の技術範囲における複数種類の方式によって実現でき、例えば公衆が入手できるコンピュータソフトウエア、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウエアによって実現できる。当業者は配列をアライメントするための適切なパラメータを決めることができ、該パラメータが比較対象の配列のフルサイズに対して最大比較の要求を実現するための如何なるアルゴリズムも含む。しかし、本発明の目的のために、アミノ酸配列の同一性パーセンテージは配列比較コンピュータソフトウエアＡＬＩＧＮ－２により得られるものである。
【0060】
ＡＬＩＧＮ－２を用いることによりアミノ酸配列を比較する場合、所定のアミノ酸配列Ａの所定のアミノ酸配列Ｂに対するアミノ酸配列同一性％（または所定のアミノ酸配列Ｂに対して、と、またはについてのあるアミノ酸配列と同一性を有する又は含む所定のアミノ酸配列Ａともいう）は以下のように計算される：
分数Ｘ／Ｙ×１００
分数Ｘ／Ｙ×１００
【0061】
ここで、Ｘは配列アライメントプログラムＡＬＩＧＮ－２において該プログラムのＡ及びＢのアライメントにおいて同一でマッチングすると評価したアミノ酸残基の数であり、且つＹはＢにおけるアミノ酸残基の総数である。以下のように理解するべきである：アミノ酸配列Ａの長さとアミノ酸配列Ｂの長さが等しくない場合、ＡのＢに対するアミノ酸配列の同一性％は、ＢのＡに対するアミノ酸配列同一性％とは異なる。特に断りのない限り、本文中において使用するすべてのアミノ酸配列同一性値％は前記の段落に記載の通りであり、ＡＬＩＧＮ－２コンピュータプログラムによって得られるものである。
【0062】
本文において使用されているように、用語の「治療」は期待される薬理及び／または生理的効果が得られることを言う。前記効果は疾患またはその症状の発生、発症を完全または一部予防すること、あるいは疾患及び／またはその症状を一部または完全軽減すること、及び／または疾患及び／またはその症状を一部または完全に治癒するものとすることができる。さらに以下を含む：（ａ）疾患が被験者の体内で発生することを予防し、前記被験者は疾患の要因を持っているが、該疾患を有すると診断されていない状況であること；（ｂ）疾患を抑制し、その形成を阻害すること；及び（ｃ）疾患及び／またはその症状を減軽し、即ち疾患及び／またはその症状を減退させること。
【0063】
用語の「個体」、「被験者」及び「患者」は本明細書中において互いに置き換えて使用でき、哺乳動物を指し、ネズミ（ラット、マウス）、ヒト以外の霊長類、ヒト、イヌ、ネコ、有蹄動物（例えばウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ）などを含むがこれらに限られない。
【0064】
「治療上有効量」または「有効量」とは、哺乳動物またはその他の被験者に投与して疾患の治療に用いられる際に疾患の前記予防及び／または治療を実現できるプラスミノーゲン活性化経路の成分またはその関連化合物（例えば、プラスミノーゲン）の量である。「治療上有効量」は使用するプラスミノーゲン活性化経路の成分またはその関連化合物（例えば、プラスミノーゲン）、治療しようとする被験者の疾患及び／または症状の重症度及び年齢、体重などに従って変化するものである。
【0065】
本発明のプラスミノーゲンの調製
プラスミノーゲンは治療の用途に用いられるために、自然界から分離及び精製されるものでもよく、標準的な化学ペプチド合成技術によって合成することでもよい。化学的手法によりポリペプチドを合成する際、液相または固相で合成を行うことができる。固相ポリペプチド合成（ＳＰＰＳ）（配列のＣ末端アミノ酸を不溶性支持体に附着させ、順番に配列中の残りのアミノ酸を添加する）はプラスミノーゲンの化学的合成に適したものである。各種形式のＳＰＰＳ、例えばＦｍｏｃ及びＢｏｃは、プラスミノーゲンの合成に用いることができる。固相合成に用いられる技術は以下に記載されている：Ｂａｒａｎｙ及びＳｏｌｉｄ－Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ；３－２８４ページ、Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｂｉｏｌｏｇｙ．第二巻：Ｓｐｅｃｉａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｐａｒｔ Ａ．，Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，ｔら Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８５：２１４９－２１５６（１９６３）；Ｓｔｅｗａｒｔら，Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｎｄ ｅｄ．Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌ．（１９８４）；及びＧａｎｅｓａｎ Ａ．２００６Ｍｉｎｉ Ｒｅｖ．Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ．６：３－１０及びＣａｍａｒｅｒｏ ＪＡら ２００５Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｅｐｔ Ｌｅｔｔ．１２：７２３－８。簡単に言えば、その上にペプチド鎖が構築されている機能性ユニットにより小さい不溶性の多孔ビーズを処理する。カップリング／脱保護の繰り返し循環後に、附着した固相の遊離Ｎ末端アミンとＮ保護を受けている単一のアミノ酸ユニットをカップリングさせる。それから、該ユニットを脱保護し、他のアミノ酸と連結する新しいＮ末端アミンを露出させる。ペプチドを固相上に固定したままにし、それからそれを切除する。
プラスミノーゲンは治療の用途に用いられるために、自然界から分離及び精製されるものでもよく、標準的な化学ペプチド合成技術によって合成することでもよい。化学的手法によりポリペプチドを合成する際、液相または固相で合成を行うことができる。固相ポリペプチド合成（ＳＰＰＳ）（配列のＣ末端アミノ酸を不溶性支持体に附着させ、順番に配列中の残りのアミノ酸を添加する）はプラスミノーゲンの化学的合成に適したものである。各種形式のＳＰＰＳ、例えばＦｍｏｃ及びＢｏｃは、プラスミノーゲンの合成に用いることができる。固相合成に用いられる技術は以下に記載されている：Ｂａｒａｎｙ及びＳｏｌｉｄ－Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ；３－２８４ページ、Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｂｉｏｌｏｇｙ．第二巻：Ｓｐｅｃｉａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｐａｒｔ Ａ．，Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，ｔら Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８５：２１４９－２１５６（１９６３）；Ｓｔｅｗａｒｔら，Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｎｄ ｅｄ．Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌ．（１９８４）；及びＧａｎｅｓａｎ Ａ．２００６Ｍｉｎｉ Ｒｅｖ．Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ．６：３－１０及びＣａｍａｒｅｒｏ ＪＡら ２００５Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｅｐｔ Ｌｅｔｔ．１２：７２３－８。簡単に言えば、その上にペプチド鎖が構築されている機能性ユニットにより小さい不溶性の多孔ビーズを処理する。カップリング／脱保護の繰り返し循環後に、附着した固相の遊離Ｎ末端アミンとＮ保護を受けている単一のアミノ酸ユニットをカップリングさせる。それから、該ユニットを脱保護し、他のアミノ酸と連結する新しいＮ末端アミンを露出させる。ペプチドを固相上に固定したままにし、それからそれを切除する。
【0066】
標準的な組み換え方法により本発明のプラスミノーゲンを生産する。例えば、プラスミノーゲンをコードする核酸を発現ベクター中に挿入し、それと発現ベクター中の制御配列を操作可能に接続させる。発現制御配列はプロモーター（例えば天然に関連されているプロモーター、または異種由来のプロモーター）、シグナル配列、エンハンサーエレメント及び転写終了配列を含むが、これらに限られない。発現の制御はベクター中の真核プロモーターシステムとすることができ、前記ベクターは真核宿主細胞（例えばＣＯＳまたはＣＨＯ細胞）を形質転換またはトランスフェクションさせる。一旦ベクターを適切な宿主に導入すれば、ヌクレオチド配列の高レベル発現及びプラスミノーゲンの収集及び精製に適した条件下において宿主を維持する。
【0067】
適切な発現ベクターは通常宿主体内において附加体または宿主染色体ＤＮＡの整合部分として複製される。通常、発現ベクターは選択マーカー（例えばアンピシリン耐性、ハイグロマイシン耐性、テトラサイクリン耐性、カナマイシン耐性またはネオマイシン耐性）を含み、インビトロで所望のＤＮＡ配列によって形質転換されたそれらの細胞に対して測定を行うことに有用である。
【0068】
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）は目的抗体をコードするポリヌクレオチドをクローンする原核宿主細胞の例である。その他の使用に適した微生物宿主は桿菌を含み、例えばバチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）及びその他の腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、例えばサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、セラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、及び各種シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種である。これらの原核宿主において、発現ベクターを生成でき、通常は宿主細胞と相容する発現制御配列（例えば複製開始点）を含むものである。また、多くの公知のプロモーターが存在し、例えば乳糖プロモーターシステム、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーターシステム、β－ラクタマーゼプロモーターシステム、またはファージλ由来のプロモーターシステムである。プロモーターは一般的に発現を制御し、必要に応じて遺伝子配列を制御する場合に、転写及び翻訳を起動するために、さらにリボソームの結合位置配列などを有してもよい。
【0069】
その他の微生物、例えば酵母も発現に用いることができる。酵母（例えばサッカロミセス（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））及びピキア（Ｐｉｃｈｉａ）が適した酵母宿主細胞の例であり、そのうちの適切な担体は必要に応じて発現制御配列（例えばプロモーター）、複製開始点、終止配列など含む。典型的なプロモーターは３－ホスホグリセリン酸キナーゼ及びその他の糖分解酵素を含む。誘導型酵母プロモーターには特にアルコール脱水素酵素、イソチトクロムＣ、及びマルトースとガラクトースの利用のための酵素のプロモーターを含む。
【0070】
微生物以外に、哺乳動物細胞（例えばインビトロ細胞培養物中において培養された哺乳動物細胞）も本発明の抗－Ｔａｕ抗体（例えば目的抗－Ｔａｕ抗体をコードするポリヌクレオチド）の発現及び生成に用いることができる。例えばＷｉｎｎａｃｋｅｒ，Ｆｒｏｍ Ｇｅｎｅｓ ｔｏ Ｃｌｏｎｅｓ，ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎ．Ｙ．，Ｎ．Ｙ．（１９８７）参照。適した哺乳動物宿主細胞はＣＨＯ細胞系、各種Ｃｏｓ細胞系、ＨｅＬａ細胞、骨髄腫細胞系、及び形質転換されたＢ細胞またはハイブリドーマを含む。これらの細胞に用いられる発現ベクターは発現制御配列、例えば複製開始点、プロモーター、及びエンハンサー（Ｑｕｅｅｎら，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．８９：４９（１９８６））、及び必要とされる加工情報サイト、例えばリボソームの結合サイト、ＲＮＡの切断サイト、ポリアデノシン酸化サイト、及び転写ターミネーター配列を含むことができる。適切な発現制御配列の例はウサギ免疫グロブリン遺伝子、ＳＶ４０、アデノウイルス、ウシ乳頭腫ウィルス、サイトメガロウイルスなど由来のプロモーターである。Ｃｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１１４９（１９９２）を参照すること。
【0071】
一旦（化学または組み換え的に）合成されれば、本分野の標準的な手順、例えば硫酸アンモニウム沈殿、アフィニテイカラム、カラムクロマトグラフィー、高速液相クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、ゲル電気泳動などにより本発明に記載のプラスミノーゲンを精製することができる。該プラスミノーゲンは基本的に純粋なものであり、例えば少なくとも約８０％から８５％の純度で、少なくとも約８５％～９０％の純度で、少なくとも約９０％～９５％の純度で、または９８％～９９％の純度またはさらに純度が高いものであり、例えば汚染物を含まず、前記汚染物は例えば細胞砕片、目的抗体以外の大分子などである。
【0072】
薬物配合剤
所望の純度のプラスミノーゲン活性化経路の成分またはその関連化合物（例えば、プラスミノーゲン）と必要に応じた薬用担体、賦形剤、または安定化剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１６版，Ｏｓｏｌ，Ａ．ｅｄ．（１９８０））を混合して凍結乾燥製剤または水溶液を形成して治療用の配合剤を得る。許容可能な担体、賦形剤、安定化剤は所要の用量及び濃度下において被験者に対して毒性がなく、さらに例えばリン酸塩、クエン酸塩及びその他の有機酸などの緩衝剤を含む。抗酸化剤はアスコルビン酸和メチオニンを含む；防腐剤（例えばオクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；塩化ヘキサメチレンジアミン；塩化ベンザルコニウム（ｂｅｎｚａｌｋｏｎｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）、ベンゼトニウムクロリド；フェノール、ブタノールまたはベンジルアルコール；アルキルパラヒドロキシ安息香酸エステル、例えばメチルまたはプロピルパラヒドロキシ安息香酸エステル；ピロカテコール；レソルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；ｍ－クレゾール）；低分子量ポリペプチド（約１０個より少ない残基を有するもの）；タンパク質例えば血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン；親水性重合体、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン酸、ヒスチジン、アルギニンまたはリシンである；単糖、二糖及びその他の炭水化物はグルコース、マンノース、またはデキストリンを含む；キレート剤は例えばＥＤＴＡである；糖類は例えばショ糖、マンニトール、フコースまたはソルビトールである；塩形成対イオン、例えばナトリウム；金属複合体（例えば亜鉛－タンパク複合体）；及び／または非イオン界面活性剤、例えばＴＷＥＥＮＴＭ、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳＴＭまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。好ましい凍結乾燥された抗ＶＥＧＦ抗体製剤は、ＷＯ９７／０４８０１に記載されており、参照により本明細書に組み込まれる。
所望の純度のプラスミノーゲン活性化経路の成分またはその関連化合物（例えば、プラスミノーゲン）と必要に応じた薬用担体、賦形剤、または安定化剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１６版，Ｏｓｏｌ，Ａ．ｅｄ．（１９８０））を混合して凍結乾燥製剤または水溶液を形成して治療用の配合剤を得る。許容可能な担体、賦形剤、安定化剤は所要の用量及び濃度下において被験者に対して毒性がなく、さらに例えばリン酸塩、クエン酸塩及びその他の有機酸などの緩衝剤を含む。抗酸化剤はアスコルビン酸和メチオニンを含む；防腐剤（例えばオクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；塩化ヘキサメチレンジアミン；塩化ベンザルコニウム（ｂｅｎｚａｌｋｏｎｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）、ベンゼトニウムクロリド；フェノール、ブタノールまたはベンジルアルコール；アルキルパラヒドロキシ安息香酸エステル、例えばメチルまたはプロピルパラヒドロキシ安息香酸エステル；ピロカテコール；レソルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；ｍ－クレゾール）；低分子量ポリペプチド（約１０個より少ない残基を有するもの）；タンパク質例えば血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン；親水性重合体、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン酸、ヒスチジン、アルギニンまたはリシンである；単糖、二糖及びその他の炭水化物はグルコース、マンノース、またはデキストリンを含む；キレート剤は例えばＥＤＴＡである；糖類は例えばショ糖、マンニトール、フコースまたはソルビトールである；塩形成対イオン、例えばナトリウム；金属複合体（例えば亜鉛－タンパク複合体）；及び／または非イオン界面活性剤、例えばＴＷＥＥＮＴＭ、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳＴＭまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。好ましい凍結乾燥された抗ＶＥＧＦ抗体製剤は、ＷＯ９７／０４８０１に記載されており、参照により本明細書に組み込まれる。
【0073】
本発明の配合剤は治療を必要とする具体的な症状の必要とする一種類以上の活性化合物を含有してもよく、好ましくは活性が相補的で互いに副作用を有しないものである。
【0074】
本発明のプラスミノーゲンは例えば凝集技術または界面重合によって作られるマイクロカプセル中に内包ことができ、例えば、膠質薬物輸送系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン剤、ナノ粒子及びナノカプセル）中に入れまたは粗エマルジョン状液中のヒドロキシメチルセルロースまたはゲルーマイクロカプセル及びポリ―（メタアクリル酸メチル）マイクロカプセル中に入れることができる。これらの技術はＲｅｍｉｎｇｔｏｎ′ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０）に開示されている。
【0075】
体内に投与することに用いられる本発明のプラスミノーゲン活性化経路の成分またはその関連化合物（例えば、プラスミノーゲン）は必ず無菌である必要がある。これは凍結乾燥及び再度配合する前または後に除菌濾過膜で濾過することで容易に実現できる。
【0076】
本発明のプラスミノーゲン活性化経路の成分またはその関連化合物（例えば、プラスミノーゲン）は徐放製剤を調製できる。徐放製剤の適切な実例は一定の形状を有し且つ糖タンパクを含む固体の疎水性重合体の半透過マトリックスを含み、例えば膜またはマイクロカプセルである。徐放性マトリックスの実例はポリエステル、水性ゲル（例えばポリ（２－ヒドロキシエチル－メタアクリル酸エステル）（Ｌａｎｇｅｒら，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．，１５：１６７－２７７（１９８１）；Ｌａｎｇｅｒ，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．，１２：９８－１０５（１９８２））またはポリ（ビニールアルコール）、ポリラクチド（米国特許３７７３９１９，ＥＰ ５８，４８１）、Ｌ－グルタミン酸とエチル－Ｌ－グルタミン酸の共重合体（Ｓｉｄｍａｎ，ら，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ２２：５４７（１９８３）），分解できないエチレン－ビニルアセテート（ｅｔｈｙｌｅｎｅ－ｖｉｎｙｌ ａｃｅｔａｔｅ）（Ｌａｎｇｅｒ，ら，出所は前記と同じ）、または分解可能な乳酸－ヒドロキシ酢酸共重合体、例えばＬｕｐｒｏｎ ＤｅｐｏｔＴＭ（乳酸－ヒドロキシ酢酸共重合体及びリュープロレリン（ｌｅｕｐｒｏｌｉｄｅ）酢酸エステルからなる注射可能なミクロスフェア体）、及びポリＤ－（－）－３－ヒドロキシ酪酸を含む。重合体、例えばエチレン－酢酸エチル及び乳酸－ヒドロキシ酢酸は、持続的に分子を１００日間以上放出することができ、しかしいくつかの水性ゲルがタンパク質を放出する時間は比較的短い。関連のメカニズムに応じてタンパク質を安定化させる合理的なストラテジーにより設計できる。例えば、凝集のメカニズムが硫化ジスルフィド結合の交換によって分子間Ｓ－Ｓ結合を形成するであれば、メルカプト基残基を修飾することにより、酸性溶液中から凍結乾燥させ、湿度を制御し、適切な添加剤を用いて、及び特定の重合体基質組成物を開発することで安定化を実現できる。
【0077】
投与及び使用量
異なる方式、例えば鼻吸入、エアロゾル吸入、点鼻薬、点眼薬、点耳薬、静脈内、腹腔内、皮下、頭蓋内、髄腔内、動脈内（例えば、頸動脈を介して）、筋肉内、及び直腸内投与により本発明の薬物組成物の投与を実現できる。
異なる方式、例えば鼻吸入、エアロゾル吸入、点鼻薬、点眼薬、点耳薬、静脈内、腹腔内、皮下、頭蓋内、髄腔内、動脈内（例えば、頸動脈を介して）、筋肉内、及び直腸内投与により本発明の薬物組成物の投与を実現できる。
【0078】
胃腸外での投与に用いられる製造物は無菌水性または非水性溶液、懸濁液及び乳剤を含む。非水性溶媒の例はプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、例えばオリーブオイルのような植物油、及び注射可能な有機エステル、例えばオレイン酸エチルである。水性担体は水、アルコール性／水性溶液、乳剤または懸濁液を含み、食塩水及び緩衝媒介を含む。胃腸外媒介物は塩化ナトリウム溶液、リンガ―デキストロース、デキストロース及び塩化ナトリウム、または固定油である。静脈内媒介物は液体及び栄養補充物、電気分解補充物などを含む。されには防腐剤及びその他の添加剤、例えば抗微生物製剤、抗酸化剤、キレート剤、不活性ガスなども存在してもよい。
【0079】
医療関係者は各種臨床的要素により用量案を決めることができる。例えば医学分野で公知のように、任意の患者の用量は複数の要素によって決められ、これらの要素は患者の体型、体表面積、年齢、投与される具体的な化合物、性別、投与回数及び経路、全体の健康度、及び同時に投与するその他の薬物を含む。本発明のプラスミノーゲンを含有する薬物組成物の用量の範囲は例えば被験者体重に対して毎日約０．０００１～２０００ｍｇ／ｋｇであり、または約０．００１～５００ｍｇ／ｋｇ（例えば０．０２ｍｇ／ｋｇ，０．２５ｍｇ／ｋｇ，０．５ｍｇ／ｋｇ，０．７５ｍｇ／ｋｇ，１０ｍｇ／ｋｇ，５０ｍｇ／ｋｇなど）とすることができる。例えば、用量は１ｍｇ／ｋｇ体重または５０ｍｇ／ｋｇ体重または１－５０ｍｇ／ｋｇの範囲とすることができ、または少なくとも１ｍｇ／ｋｇである。この例示性の範囲より高いまたは低い用量もカバーされ、特に前記の要素を考慮した場合である。前記範囲中の中間用量も本発明の範囲内に含まれるものである。被験者は毎日、隔日、毎週または経験分析によって決められた任意のスケジュール表に従ってこのような用量を投与できる。例示的な用量のスケジュール表は連続数日０．０１～１００ｍｇ／ｋｇ投与することである。本発明の薬物の投与過程において治療効果及び安全性をリアルタイムに評価する必要がある。
【0080】
製品または薬物キット
本発明の一つの実施形態は、プラスミノーゲン活性化経路の成分またはその関連化合物（例えば、プラスミノーゲン）を含む製品または薬物キットに係るものである。前記製品は好ましく容器、ラベルまたはプロトールを含む。適切な容器はボトル、小瓶、注射器などである。容器は各種材料例えばガラスまたはプラスチックから作られることができる。前記容器は組成物を含有し、前記組成物は本発明の疾患または症状を有効に治療し且つ無菌の入口を有する（例えば前記容器は静脈輸液用パックまたはバイアルであり、皮下注射針によって貫通される栓を含む）。前記組成物中の少なくとも一種類の活性化剤がプラスミノーゲン活性化経路の成分またはその関連化合物（例えば、プラスミノーゲン）である。前記容器上にあるまたは添付されているラベルは前記組成物を本発明の病症の治療に用いられると説明するものである。前記製品はさらに薬用緩衝液を含有する第二容器を含み、前記薬用緩衝液は例えばリン酸塩緩衝の食塩水、リンガー溶液及びグルコース溶液を含む。さらには商業及び使用者の角度から見ると必要とされるその他の物質、即ちその他の緩衝液、希釈剤、濾過物、針及び注射器を含むことができる。また、前記製品は使用説明を有するプロトコルを含み、これは例えば前記組成物の使用者にプラスミノーゲン活性化経路の成分またはその関連化合物（例えば、プラスミノーゲン）の組成物及び疾患の治療に伴うその他の薬物を患者に投与することを指示するものである。
本発明の一つの実施形態は、プラスミノーゲン活性化経路の成分またはその関連化合物（例えば、プラスミノーゲン）を含む製品または薬物キットに係るものである。前記製品は好ましく容器、ラベルまたはプロトールを含む。適切な容器はボトル、小瓶、注射器などである。容器は各種材料例えばガラスまたはプラスチックから作られることができる。前記容器は組成物を含有し、前記組成物は本発明の疾患または症状を有効に治療し且つ無菌の入口を有する（例えば前記容器は静脈輸液用パックまたはバイアルであり、皮下注射針によって貫通される栓を含む）。前記組成物中の少なくとも一種類の活性化剤がプラスミノーゲン活性化経路の成分またはその関連化合物（例えば、プラスミノーゲン）である。前記容器上にあるまたは添付されているラベルは前記組成物を本発明の病症の治療に用いられると説明するものである。前記製品はさらに薬用緩衝液を含有する第二容器を含み、前記薬用緩衝液は例えばリン酸塩緩衝の食塩水、リンガー溶液及びグルコース溶液を含む。さらには商業及び使用者の角度から見ると必要とされるその他の物質、即ちその他の緩衝液、希釈剤、濾過物、針及び注射器を含むことができる。また、前記製品は使用説明を有するプロトコルを含み、これは例えば前記組成物の使用者にプラスミノーゲン活性化経路の成分またはその関連化合物（例えば、プラスミノーゲン）の組成物及び疾患の治療に伴うその他の薬物を患者に投与することを指示するものである。
【実施例】
【0081】
以下の実施例で使用されるヒトプラスミノーゲンは、ヒトドナーの血漿に由来し、以下の文書：ＫｅｎｎｅｔｈＣ Ｒｏｂｂｉｎｓ，Ｌｏｕｉｓ Ｓｕｍｍａｒｉａ，Ｄａｖｉｄ Ｅｌｗｙｎ ｅｔ ａｌ．Ｆｕｒｔｈｅｒ Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ｔｈｅ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｎｄ Ｐｌａｓｍｉｎ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９６５，２４０（１）：５４１－５５０；Ｓｕｍｍａｒｉａ Ｌ，Ｓｐｉｔｚ Ｆ，Ａｒｚａｄｏｎ Ｌ ｅｔ ａｌ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｆｏｒｍｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ Ｇｌｕ－ ａｎｄ Ｌｙｓ－ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎｓ ａｎｄ ｐｌａｓｍｉｎｓ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．１９７６ Ｊｕｎ ２５；２５１（１２）：３６９３－９；ＨＡＧＡＮ ＪＪ，ＡＢＬＯＮＤＩ ＦＢ，ＤＥ ＲＥＮＺＯ ＥＣ．Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．１９６０ Ａｐｒ；２３５：１００５－１０に記載された方法に基づき、プロセスを最適化し、ヒトドナー血漿から精製して得られた。ここでヒトプラスミノーゲン単体は９８％を上回った。
【実施例1】
【0082】
実施例１は、プラスミノーゲンがヘキサノキオキサリルジヒドラゾン誘発脱髄モデルマウスにおける脳梁ミエリンの再生を促進することに関するものである。
８週齢のＣ５７オスマウス２０匹を取り、ランダムに２つの群に分け、ブランク対照群で６匹、モデル群で１４匹とした。ブランク対照群のマウスに通常の維持食（北京科澳協力有限公司から購入）を与え、モデル群のマウスに０．２％ジシクロヘキサノンオキサリルジヒドラゾン(クプリゾン、ｃｕｐｒｉｚｏｎｅ)モデル飼料（南通トロフィー飼料科技有限公司）を６週間与え、脱髄モデルマウスを誘発した［１］。６週間後、モデル群のマウスを体重に応じて再びランダムにプラスミノーゲン投与群と溶媒ＰＢＳ投与対照群の２つの群に分け、各群で７匹とした。プラスミノーゲン投与群マウスに１ｍｇ／０．１ｍｌ／匹／日でプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒ＰＢＳ対照群マウスに同量のＰＢＳを同様に投与し、１４日間連続投与し、ブランク対照群のマウスには注射しなかった。投与期間中、すべてのマウスに通常の維持食を与えた。投与し始めた日を１日目とし、１５日目に、マウスを解剖し、脳を４％パラホルムアルデヒドで固定し、脱水させて包埋した。固定後の組織サンプルをアルコール勾配で脱水させ、キシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋した。脳組織の冠状切片の厚みは３μｍであり、脱パラフィンさせてさらに再水和し、ミエリン染色液を用いてＬＦＢ染色を行った。アルコール勾配で脱水させ、キシレンで透徹化処理した後に中性ゴムに封入させた。光学顕微鏡で観察し、写真を撮った。
その結果、ブランク対照群（図１Ａ）の脳梁のミエリンは基本的に正常であり、プラスミノーゲン投与群（図１Ｃ）の脳梁のミエリン鞘の陽性染色（矢印でマーク）は、溶媒ＰＢＳ投与対照群（図１Ｂ）より有意に多く、しかもその差は統計的に有意であった（図１Ｄ）（＊はＰ＜０．０５を表す）。これは、プラスミノーゲンがヘキサノオキサリルジヒドラゾン誘発脱髄モデルマウスにおけるミエリンの再生を促進できることを示している。
８週齢のＣ５７オスマウス２０匹を取り、ランダムに２つの群に分け、ブランク対照群で６匹、モデル群で１４匹とした。ブランク対照群のマウスに通常の維持食（北京科澳協力有限公司から購入）を与え、モデル群のマウスに０．２％ジシクロヘキサノンオキサリルジヒドラゾン(クプリゾン、ｃｕｐｒｉｚｏｎｅ)モデル飼料（南通トロフィー飼料科技有限公司）を６週間与え、脱髄モデルマウスを誘発した［１］。６週間後、モデル群のマウスを体重に応じて再びランダムにプラスミノーゲン投与群と溶媒ＰＢＳ投与対照群の２つの群に分け、各群で７匹とした。プラスミノーゲン投与群マウスに１ｍｇ／０．１ｍｌ／匹／日でプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒ＰＢＳ対照群マウスに同量のＰＢＳを同様に投与し、１４日間連続投与し、ブランク対照群のマウスには注射しなかった。投与期間中、すべてのマウスに通常の維持食を与えた。投与し始めた日を１日目とし、１５日目に、マウスを解剖し、脳を４％パラホルムアルデヒドで固定し、脱水させて包埋した。固定後の組織サンプルをアルコール勾配で脱水させ、キシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋した。脳組織の冠状切片の厚みは３μｍであり、脱パラフィンさせてさらに再水和し、ミエリン染色液を用いてＬＦＢ染色を行った。アルコール勾配で脱水させ、キシレンで透徹化処理した後に中性ゴムに封入させた。光学顕微鏡で観察し、写真を撮った。
その結果、ブランク対照群（図１Ａ）の脳梁のミエリンは基本的に正常であり、プラスミノーゲン投与群（図１Ｃ）の脳梁のミエリン鞘の陽性染色（矢印でマーク）は、溶媒ＰＢＳ投与対照群（図１Ｂ）より有意に多く、しかもその差は統計的に有意であった（図１Ｄ）（＊はＰ＜０．０５を表す）。これは、プラスミノーゲンがヘキサノオキサリルジヒドラゾン誘発脱髄モデルマウスにおけるミエリンの再生を促進できることを示している。
【実施例2】
【0083】
実施例２は、プラスミノーゲンがヘキサノキオキサリルジヒドラゾン誘発脱髄モデルマウスにおける脳梁ＰＬＰの発現を促進することに関するものである。
８週齢のＣ５７オスマウス２０匹を取り、ランダムに２つの群に分け、ブランク対照群で６匹、モデル群で１４匹とした。ブランク対照群のマウスに通常の維持食（北京科澳協力有限公司から購入）を与え、モデル群のマウスに０．２％ヘキサノンオキサリルジヒドラゾンモデル飼料（南通トロフィー飼料科技有限公司）を６週間与え、脱髄モデルマウスを誘発した［１］。６週間後、モデル群のマウスを体重に応じて再びランダムにプラスミノーゲン投与群と溶媒ＰＢＳ投与対照群の２つの群に分け、各群で７匹とした。プラスミノーゲン投与群マウスに１ｍｇ／０．１ｍｌ／匹／日でプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒ＰＢＳ対照群マウスに同量のＰＢＳを同様に投与し、３日間連続投与し、ブランク対照群のマウスには注射しなかった。投与期間中、すべてのマウスに通常の維持食を与えた。投与し始めた日を１日目とし、４日目に、マウスを解剖し、脳を４％パラホルムアルデヒドで固定し、脱水させて包埋した。固定後の組織サンプルをアルコール勾配で脱水させ、キシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋した。脳組織の冠状切片の厚みは３μｍであり、切片を脱パラフィンさせ再水和してから１回水で洗った。クエン酸で３０分間修復し、室温で１０分間冷却した後、水でやさしくすすいだ。３％過酸化水素水で１５分間インキュベーションし、ＰＡＰマーカーで組織を丸で囲んだ。１０％のヒツジ血清液（Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で１時間ブロッキングした。時間になった後、ヒツジ血清液を廃棄した。ウサギ抗プロテオリピドタンパク質（ｐｒｏｔｅｏｌｉｐｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎ，ＰＬＰ）抗体（Ａｂｃａｍ）を加えて４℃で一晩インキュベーションした後、ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＨＲＰ）抗体（Ａｂｃａｍ）の二次抗体を室温で１時間インキュベーションし、ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ＤＡＢキット（Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で呈色させ、水で３回洗浄した後にヘマトキシリンで３０秒複染色して、流水で５分間ブルーイングさせ、ＰＢＳで１回洗浄した。勾配で脱水させて透徹にして封入させ、切片を光学顕微鏡下で２００倍にて観察した。
プロテオリピドタンパク質（ｐｒｏｔｅｏｌｉｐｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎ，ＰＬＰ）は疎水性の高い膜タンパク質であり、中枢神経系で最も豊富なミエリンである［２］。
その結果、プラスミノーゲン投与群（図２Ｃ）における脳梁ＰＬＰの発現（矢印でマーク）は、溶媒ＰＢＳ投与対照群（図２Ｂ）より有意に高く、発現は、後者と比較してブランク対照群マウス（図２Ａ）に近かった。これは、プラスミノーゲンが脳梁におけるＰＬＰの発現を促進し、ヘキサノオキサリルジヒドラゾン誘発脱髄モデルマウスにおけるミエリン再生を促進できることを示している。
８週齢のＣ５７オスマウス２０匹を取り、ランダムに２つの群に分け、ブランク対照群で６匹、モデル群で１４匹とした。ブランク対照群のマウスに通常の維持食（北京科澳協力有限公司から購入）を与え、モデル群のマウスに０．２％ヘキサノンオキサリルジヒドラゾンモデル飼料（南通トロフィー飼料科技有限公司）を６週間与え、脱髄モデルマウスを誘発した［１］。６週間後、モデル群のマウスを体重に応じて再びランダムにプラスミノーゲン投与群と溶媒ＰＢＳ投与対照群の２つの群に分け、各群で７匹とした。プラスミノーゲン投与群マウスに１ｍｇ／０．１ｍｌ／匹／日でプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒ＰＢＳ対照群マウスに同量のＰＢＳを同様に投与し、３日間連続投与し、ブランク対照群のマウスには注射しなかった。投与期間中、すべてのマウスに通常の維持食を与えた。投与し始めた日を１日目とし、４日目に、マウスを解剖し、脳を４％パラホルムアルデヒドで固定し、脱水させて包埋した。固定後の組織サンプルをアルコール勾配で脱水させ、キシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋した。脳組織の冠状切片の厚みは３μｍであり、切片を脱パラフィンさせ再水和してから１回水で洗った。クエン酸で３０分間修復し、室温で１０分間冷却した後、水でやさしくすすいだ。３％過酸化水素水で１５分間インキュベーションし、ＰＡＰマーカーで組織を丸で囲んだ。１０％のヒツジ血清液（Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で１時間ブロッキングした。時間になった後、ヒツジ血清液を廃棄した。ウサギ抗プロテオリピドタンパク質（ｐｒｏｔｅｏｌｉｐｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎ，ＰＬＰ）抗体（Ａｂｃａｍ）を加えて４℃で一晩インキュベーションした後、ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＨＲＰ）抗体（Ａｂｃａｍ）の二次抗体を室温で１時間インキュベーションし、ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ＤＡＢキット（Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で呈色させ、水で３回洗浄した後にヘマトキシリンで３０秒複染色して、流水で５分間ブルーイングさせ、ＰＢＳで１回洗浄した。勾配で脱水させて透徹にして封入させ、切片を光学顕微鏡下で２００倍にて観察した。
プロテオリピドタンパク質（ｐｒｏｔｅｏｌｉｐｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎ，ＰＬＰ）は疎水性の高い膜タンパク質であり、中枢神経系で最も豊富なミエリンである［２］。
その結果、プラスミノーゲン投与群（図２Ｃ）における脳梁ＰＬＰの発現（矢印でマーク）は、溶媒ＰＢＳ投与対照群（図２Ｂ）より有意に高く、発現は、後者と比較してブランク対照群マウス（図２Ａ）に近かった。これは、プラスミノーゲンが脳梁におけるＰＬＰの発現を促進し、ヘキサノオキサリルジヒドラゾン誘発脱髄モデルマウスにおけるミエリン再生を促進できることを示している。
【実施例3】
【0084】
実施例３は、プラスミノーゲンがヘキサノキオキサリルジヒドラゾン誘発脱髄モデルマウスの脳梁におけるニューロフィラメントタンパク質（ＮＦＰ）の発現を促進することに関するものである。
８週齢のＣ５７オスマウス２０匹を取り、ランダムに２つの群に分け、ブランク対照群で６匹、モデル群で１４匹とした。ブランク対照群のマウスに通常の維持食（北京科澳協力有限公司から購入）を与え、モデル群のマウスに０．２％ヘキサノンオキサリルジヒドラゾンモデル飼料（南通トロフィー飼料科技有限公司）を６週間与え、脱髄モデルマウスを誘発した［１］。６週間後、モデル群のマウスを体重に応じて再びランダムにプラスミノーゲン投与群と溶媒ＰＢＳ投与対照群の２つの群に分け、各群で７匹とした。プラスミノーゲン投与群マウスに１ｍｇ／０．１ｍｌ／匹／日でプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒ＰＢＳ対照群マウスに同量のＰＢＳを同様に投与し、１４日間連続投与し、ブランク対照群のマウスには注射しなかった。投与期間中、すべてのマウスに通常の維持食を与えた。投与し始めた日を１日目とし、１５日目に、マウスを解剖し、脳を４％パラホルムアルデヒドで固定し、脱水させて包埋した。固定後の組織サンプルをアルコール勾配で脱水させ、キシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋した。脳組織の冠状切片の厚みは３μｍであり、切片を脱パラフィンさせ再水和してから１回水で洗った。クエン酸で３０分間修復し、室温で１０分間冷却した後、水でやさしくすすいだ。３％過酸化水素水で１５分間インキュベーションし、ＰＡＰマーカーで組織を丸で囲んだ。１０％のヒツジ血清液（Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で１時間ブロッキングした。時間になった後、ヒツジ血清液を廃棄した。ウサギ抗ＮＦ抗体（Ａｂｃａｍ、ａｂ２０７１７６）を加えて４℃で一晩インキュベーションした後、ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＨＲＰ）抗体（Ａｂｃａｍ）の二次抗体を室温で１時間インキュベーションし、ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ＤＡＢキット（Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で呈色させ、水で３回洗浄した後にヘマトキシリンで３０秒複染色して、流水で５分間ブルーイングさせ、ＰＢＳで１回洗浄した。勾配で脱水させて透徹にして封入させ、切片を光学顕微鏡下で２００倍にて観察した。
ニューロフィラメントタンパク質（Ｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ，ＮＦＰ）は、神経細胞軸索の中間フィラメントを構成するタンパク質である。その機能は、神経線維を容易に伸ばして破損を防ぐ弾力性を提供することであり、細胞骨格の維持、細胞形態の安定化、及び軸索輸送において非常に重要である［３］。
その結果、プラスミノーゲン投与群（図３Ｃ）のマウスの脳梁におけるＮＦＰの発現(矢印でマーク)は、溶媒ＰＢＳ投与対照群（図３Ｂ）よりも有意に高く、その差は統計的に有意であり（＊はＰ＜０．０５を表す）（図３Ｄ）、溶媒ＰＢＳ投与対照群と比較して、プラスミノーゲン投与群のＮＦＰの発現はブランク対照群（図３Ａ）のそれにより近かった。これは、プラスミノーゲンがＮＦＰの発現を促進し、それによって神経線維の再生を促進できることを示している。
８週齢のＣ５７オスマウス２０匹を取り、ランダムに２つの群に分け、ブランク対照群で６匹、モデル群で１４匹とした。ブランク対照群のマウスに通常の維持食（北京科澳協力有限公司から購入）を与え、モデル群のマウスに０．２％ヘキサノンオキサリルジヒドラゾンモデル飼料（南通トロフィー飼料科技有限公司）を６週間与え、脱髄モデルマウスを誘発した［１］。６週間後、モデル群のマウスを体重に応じて再びランダムにプラスミノーゲン投与群と溶媒ＰＢＳ投与対照群の２つの群に分け、各群で７匹とした。プラスミノーゲン投与群マウスに１ｍｇ／０．１ｍｌ／匹／日でプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒ＰＢＳ対照群マウスに同量のＰＢＳを同様に投与し、１４日間連続投与し、ブランク対照群のマウスには注射しなかった。投与期間中、すべてのマウスに通常の維持食を与えた。投与し始めた日を１日目とし、１５日目に、マウスを解剖し、脳を４％パラホルムアルデヒドで固定し、脱水させて包埋した。固定後の組織サンプルをアルコール勾配で脱水させ、キシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋した。脳組織の冠状切片の厚みは３μｍであり、切片を脱パラフィンさせ再水和してから１回水で洗った。クエン酸で３０分間修復し、室温で１０分間冷却した後、水でやさしくすすいだ。３％過酸化水素水で１５分間インキュベーションし、ＰＡＰマーカーで組織を丸で囲んだ。１０％のヒツジ血清液（Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で１時間ブロッキングした。時間になった後、ヒツジ血清液を廃棄した。ウサギ抗ＮＦ抗体（Ａｂｃａｍ、ａｂ２０７１７６）を加えて４℃で一晩インキュベーションした後、ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＨＲＰ）抗体（Ａｂｃａｍ）の二次抗体を室温で１時間インキュベーションし、ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ＤＡＢキット（Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で呈色させ、水で３回洗浄した後にヘマトキシリンで３０秒複染色して、流水で５分間ブルーイングさせ、ＰＢＳで１回洗浄した。勾配で脱水させて透徹にして封入させ、切片を光学顕微鏡下で２００倍にて観察した。
ニューロフィラメントタンパク質（Ｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ，ＮＦＰ）は、神経細胞軸索の中間フィラメントを構成するタンパク質である。その機能は、神経線維を容易に伸ばして破損を防ぐ弾力性を提供することであり、細胞骨格の維持、細胞形態の安定化、及び軸索輸送において非常に重要である［３］。
その結果、プラスミノーゲン投与群（図３Ｃ）のマウスの脳梁におけるＮＦＰの発現(矢印でマーク)は、溶媒ＰＢＳ投与対照群（図３Ｂ）よりも有意に高く、その差は統計的に有意であり（＊はＰ＜０．０５を表す）（図３Ｄ）、溶媒ＰＢＳ投与対照群と比較して、プラスミノーゲン投与群のＮＦＰの発現はブランク対照群（図３Ａ）のそれにより近かった。これは、プラスミノーゲンがＮＦＰの発現を促進し、それによって神経線維の再生を促進できることを示している。
【実施例4】
【0085】
実施例４は、プラスミノーゲンが多発性硬化症モデルマウスの脳梁におけるニューロフィラメントタンパク質（ＮＦＰ）発現の増加を促進することに関するものである。
Ｃ５７メスマウス３０匹を取り、モデリング前に体重を測定し、体重に応じて異常なマウスを除外した後、すべてのマウスをランダムに２つの群に分け、ブランク対照群で８匹、モデル群で２２匹とした。群分けが完了した後、ブランク対照群に通常の維持食（北京科澳協力有限公司から購入）を与え、モデル群のマウスに０．６％ジシクロヘキサノンオキサリルジヒドラゾン（ＣＰＺ）（製造元：上海源葉生物科技有限公司；カタログ番号：Ｓ３０３４９）のモデリング飼料を４２日間連続して与え、多発性硬化症モデルを誘発した［１］。モデリングが完了した後、すべてのマウスをオープンフィールドテストでテストし、モデル群のマウスをテスト結果に従って群分けし、溶媒群で１１匹、投与群で１１匹とした。群分けが完了した後、すべてのマウスに投与を開始し、これを投与の１日目として記録し、ブランク対照群マウス及び溶媒群マウスに０．１ｍｌ／匹／日で溶媒を尾静脈注射により投与し、投与群マウスに１ｍｇ／匹／日でプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、３５日間連続投与した。投与期間中、すべてのマウスに通常の維持食を与えた。３６日目に、マウスを殺処分し、脳組織を採取して１０％ホルムアルデヒド溶液で固定し、脱水させて包埋した。固定後の組織サンプルをアルコール勾配で脱水させ、キシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋した。脳組織の冠状切片の厚みは３μｍであり、切片を脱パラフィンさせ再水和してから１回水で洗った。クエン酸で３０分間修復し、室温で１０分間冷却した後、水でやさしくすすいだ。３％過酸化水素水で１５分間インキュベーションし、ＰＡＰマーカーで組織を丸で囲んだ。１０％のヒツジ血清液（Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で１時間ブロッキングした。時間になった後、ヒツジ血清液を廃棄した。ウサギ抗ＮＦＰ抗体（Ａｂｃａｍ、ａｂ２０７１７６）を加えて４℃で一晩インキュベーションした後、ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＨＲＰ）抗体（Ａｂｃａｍ）の二次抗体を室温で１時間インキュベーションし、ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ＤＡＢキット（Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で呈色させ、水で３回洗浄した後にヘマトキシリンで３０秒複染色して、流水で５分間ブルーイングさせ、ＰＢＳで１回洗浄した。勾配で脱水させて透徹にして封入させ、切片を光学顕微鏡下で１００倍にて観察した。
その結果、ブランク対照群（図４Ａ）の脳梁は一定レベルのＮＦＰを発現し（矢印でマーク）、溶媒群（図４Ｂ）マウスの脳梁におけるＮＦＰの発明は有意に減少し、投与群（図４Ｃ）のマウスの脳梁におけるＮＦＰの発現レベルは溶媒群マウスよりも有意に高く、しかもその差は統計的に有意であった（＊はＰ＜０．０５を表す）（図４Ｄ）。この結果は、プラスミノーゲンが多発性硬化症モデルマウスの脳梁におけるＮＦＰの発現を促進できることを示している。
Ｃ５７メスマウス３０匹を取り、モデリング前に体重を測定し、体重に応じて異常なマウスを除外した後、すべてのマウスをランダムに２つの群に分け、ブランク対照群で８匹、モデル群で２２匹とした。群分けが完了した後、ブランク対照群に通常の維持食（北京科澳協力有限公司から購入）を与え、モデル群のマウスに０．６％ジシクロヘキサノンオキサリルジヒドラゾン（ＣＰＺ）（製造元：上海源葉生物科技有限公司；カタログ番号：Ｓ３０３４９）のモデリング飼料を４２日間連続して与え、多発性硬化症モデルを誘発した［１］。モデリングが完了した後、すべてのマウスをオープンフィールドテストでテストし、モデル群のマウスをテスト結果に従って群分けし、溶媒群で１１匹、投与群で１１匹とした。群分けが完了した後、すべてのマウスに投与を開始し、これを投与の１日目として記録し、ブランク対照群マウス及び溶媒群マウスに０．１ｍｌ／匹／日で溶媒を尾静脈注射により投与し、投与群マウスに１ｍｇ／匹／日でプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、３５日間連続投与した。投与期間中、すべてのマウスに通常の維持食を与えた。３６日目に、マウスを殺処分し、脳組織を採取して１０％ホルムアルデヒド溶液で固定し、脱水させて包埋した。固定後の組織サンプルをアルコール勾配で脱水させ、キシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋した。脳組織の冠状切片の厚みは３μｍであり、切片を脱パラフィンさせ再水和してから１回水で洗った。クエン酸で３０分間修復し、室温で１０分間冷却した後、水でやさしくすすいだ。３％過酸化水素水で１５分間インキュベーションし、ＰＡＰマーカーで組織を丸で囲んだ。１０％のヒツジ血清液（Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で１時間ブロッキングした。時間になった後、ヒツジ血清液を廃棄した。ウサギ抗ＮＦＰ抗体（Ａｂｃａｍ、ａｂ２０７１７６）を加えて４℃で一晩インキュベーションした後、ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＨＲＰ）抗体（Ａｂｃａｍ）の二次抗体を室温で１時間インキュベーションし、ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ＤＡＢキット（Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で呈色させ、水で３回洗浄した後にヘマトキシリンで３０秒複染色して、流水で５分間ブルーイングさせ、ＰＢＳで１回洗浄した。勾配で脱水させて透徹にして封入させ、切片を光学顕微鏡下で１００倍にて観察した。
その結果、ブランク対照群（図４Ａ）の脳梁は一定レベルのＮＦＰを発現し（矢印でマーク）、溶媒群（図４Ｂ）マウスの脳梁におけるＮＦＰの発明は有意に減少し、投与群（図４Ｃ）のマウスの脳梁におけるＮＦＰの発現レベルは溶媒群マウスよりも有意に高く、しかもその差は統計的に有意であった（＊はＰ＜０．０５を表す）（図４Ｄ）。この結果は、プラスミノーゲンが多発性硬化症モデルマウスの脳梁におけるＮＦＰの発現を促進できることを示している。
【実施例5】
【0086】
実施例５は、プラスミノーゲンが多発性硬化症モデルマウスの脳梁におけるリポタンパク質レベルの上昇を促進することに関するものである。
Ｃ５７メスマウス３０匹を取り、モデリング前に体重を測定し、体重に応じて異常なマウスを除外した後、すべてのマウスをランダムに２つの群に分け、ブランク対照群で８匹、モデル群で２２匹とした。群分けが完了した後、ブランク対照群に通常の維持食を与え、モデル群のマウスに０．６％ジシクロヘキサノンオキサリルジヒドラゾン（ＣＰＺ）（製造元：上海源葉生物科技有限公司；カタログ番号：Ｓ３０３４９）のモデリング飼料を４２日間連続して与え、多発性硬化症モデルを誘発した［１］。モデリングが完了した後、すべてのマウスをオープンフィールドテストでテストし、モデル群のマウスをテスト結果に従って群分けし、溶媒群で１１匹、投与群で１１匹とした。群分けが完了した後、すべてのマウスに投与を開始し、これを投与の１日目として記録し、ブランク対照群マウス及び溶媒群マウスに０．１ｍｌ／匹／日で溶媒を尾静脈注射により投与し、投与群マウスに１ｍｇ／匹／日でプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、３５日間連続投与した。投与期間中、すべてのマウスに通常の維持食（北京科澳協力有限公司から購入）を与えた。３６日目に、マウスを殺処分し、脳組織を採取して１０％ホルムアルデヒド溶液で固定し、脱水させて包埋した。固定後の組織サンプルをアルコール勾配で脱水させ、キシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋した。脳組織の冠状切片の厚みは３μｍであり、切片を脱パラフィンさせ再水和てから１回水で洗った。クエン酸で３０分間修復し、室温で１０分間冷却した後、水でやさしくすすいだ。３％過酸化水素水で１５分間インキュベーションし、ＰＡＰマーカーで組織を丸で囲んだ。１０％のヒツジ血清液（Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で１時間ブロッキングした。時間になった後、ヒツジ血清液を廃棄した。ウサギ抗ＰＬＰ抗体（Ａｂｃａｍ）を加えて４℃で一晩インキュベーションした後、ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＨＲＰ）抗体（Ａｂｃａｍ）の二次抗体を室温で１時間インキュベーションし、ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ＤＡＢキット（Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で呈色させ、水で３回洗浄した後にヘマトキシリンで３０秒複染色して、流水で５分間ブルーイングさせ、ＰＢＳで１回洗浄した。勾配で脱水させて透徹にして封入させ、切片を光学顕微鏡下で１００倍にて観察した。
その結果、ブランク対照群（図５Ａ）の脳梁は一定レベルのＰＬＰを発現し（矢印でマーク）、溶媒群（図５Ｂ）のマウスの脳梁におけるＰＬＰの発現は有意に減少し、投与群（図５Ｃ）のマウスの脳梁におけるＰＬＰの発現レベルは溶媒群マウスのそれより有意に高かった。この結果は、プラスミノーゲンが多発性硬化症モデルマウスの脳梁におけるＰＬＰの発現を促進できることを示している。
Ｃ５７メスマウス３０匹を取り、モデリング前に体重を測定し、体重に応じて異常なマウスを除外した後、すべてのマウスをランダムに２つの群に分け、ブランク対照群で８匹、モデル群で２２匹とした。群分けが完了した後、ブランク対照群に通常の維持食を与え、モデル群のマウスに０．６％ジシクロヘキサノンオキサリルジヒドラゾン（ＣＰＺ）（製造元：上海源葉生物科技有限公司；カタログ番号：Ｓ３０３４９）のモデリング飼料を４２日間連続して与え、多発性硬化症モデルを誘発した［１］。モデリングが完了した後、すべてのマウスをオープンフィールドテストでテストし、モデル群のマウスをテスト結果に従って群分けし、溶媒群で１１匹、投与群で１１匹とした。群分けが完了した後、すべてのマウスに投与を開始し、これを投与の１日目として記録し、ブランク対照群マウス及び溶媒群マウスに０．１ｍｌ／匹／日で溶媒を尾静脈注射により投与し、投与群マウスに１ｍｇ／匹／日でプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、３５日間連続投与した。投与期間中、すべてのマウスに通常の維持食（北京科澳協力有限公司から購入）を与えた。３６日目に、マウスを殺処分し、脳組織を採取して１０％ホルムアルデヒド溶液で固定し、脱水させて包埋した。固定後の組織サンプルをアルコール勾配で脱水させ、キシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋した。脳組織の冠状切片の厚みは３μｍであり、切片を脱パラフィンさせ再水和てから１回水で洗った。クエン酸で３０分間修復し、室温で１０分間冷却した後、水でやさしくすすいだ。３％過酸化水素水で１５分間インキュベーションし、ＰＡＰマーカーで組織を丸で囲んだ。１０％のヒツジ血清液（Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で１時間ブロッキングした。時間になった後、ヒツジ血清液を廃棄した。ウサギ抗ＰＬＰ抗体（Ａｂｃａｍ）を加えて４℃で一晩インキュベーションした後、ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＨＲＰ）抗体（Ａｂｃａｍ）の二次抗体を室温で１時間インキュベーションし、ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ＤＡＢキット（Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で呈色させ、水で３回洗浄した後にヘマトキシリンで３０秒複染色して、流水で５分間ブルーイングさせ、ＰＢＳで１回洗浄した。勾配で脱水させて透徹にして封入させ、切片を光学顕微鏡下で１００倍にて観察した。
その結果、ブランク対照群（図５Ａ）の脳梁は一定レベルのＰＬＰを発現し（矢印でマーク）、溶媒群（図５Ｂ）のマウスの脳梁におけるＰＬＰの発現は有意に減少し、投与群（図５Ｃ）のマウスの脳梁におけるＰＬＰの発現レベルは溶媒群マウスのそれより有意に高かった。この結果は、プラスミノーゲンが多発性硬化症モデルマウスの脳梁におけるＰＬＰの発現を促進できることを示している。
【実施例6】
【0087】
実施例６は、プラスミノーゲンが多発性硬化症モデルマウスの脳梁におけるＭＢＰレベルの上昇を促進することに関するものである。
Ｃ５７メスマウス３０匹を取り、モデリング前に体重を測定し、体重に応じて異常なマウスを除外した後、すべてのマウスをランダムに２つの群に分け、ブランク対照群で８匹、モデル群で２２匹とした。群分けが完了した後、ブランク対照群に通常の維持食（北京科澳協力有限公司から購入）を与え、モデル群のマウスに０．６％ジシクロヘキサノンオキサリルジヒドラゾン（ＣＰＺ）（製造元：上海源葉生物科技有限公司；カタログ番号：Ｓ３０３４９）のモデリング飼料を４２日間連続して与え、多発性硬化症モデルを誘発した［１］。モデリングが完了した後、すべてのマウスをオープンフィールドテストでテストし、モデル群のマウスをテスト結果に従って群分けし、溶媒群で１１匹、投与群で１１匹とした。群分けが完了した後、すべてのマウスに投与を開始し、これを投与の１日目として記録し、ブランク対照群マウス及び溶媒群マウスに０．１ｍｌ／匹／日で溶媒を尾静脈注射により投与し、投与群マウスに１ｍｇ／匹／日でプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、３５日間連続投与した。投与期間中、すべてのマウスに通常の維持食を与えた。３６日目に、マウスを殺処分し、脳組織を採取して１０％ホルムアルデヒド溶液で固定し、脱水させて包埋した。固定後の組織サンプルをアルコール勾配で脱水させ、キシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋した。脳組織の冠状切片の厚みは３μｍであり、切片を脱パラフィンさせ再水和してから１回水で洗った。クエン酸で３０分間修復し、室温で１０分間冷却した後、水でやさしくすすいだ。３％過酸化水素水で１５分間インキュベーションし、ＰＡＰマーカーで組織を丸で囲んだ。１０％のヒツジ血清液（Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で１時間ブロッキングした。時間になった後、ヒツジ血清液を廃棄した。ウサギ抗ミエリン塩基性タンパク質（ｍｙｅｌｉｎ ｂａｓｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ，ＭＢＰ）抗体（Ａｂｃａｍ）を加えて４℃で一晩インキュベーションした後、ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＨＲＰ）抗体（Ａｂｃａｍ）の二次抗体を室温で１時間インキュベーションし、ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ＤＡＢキット（Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で呈色させ、水で３回洗浄した後にヘマトキシリンで３０秒複染色して、流水で５分間ブルーイングさせ、ＰＢＳで１回洗浄した。勾配で脱水させて透徹にして封入させ、切片を光学顕微鏡下で１００倍にて観察した。
ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）は、脊椎動物の中枢神経系のオリゴデンドロサイトと末梢神経系のシュワン細胞によって合成される強力な塩基性膜タンパク質であり、さまざまな塩基性アミノ酸を含んでいる。
その結果、ブランク対照群（図６Ａ）の脳梁は一定レベルのＭＢＰを発現し（矢印でマーク）、投与群（図６Ｃ）のマウスの脳梁のＭＢＰは溶媒群（図６Ｂ）のマウスよりも有意に高く、しかも統計学的な差は有意に近かった（Ｐ＝０．０６３）（図６Ｄ）。この結果は、プラスミノーゲンが多発性硬化症モデルマウスの脳梁におけるＭＢＰレベルの上昇を促進できることを示している。
Ｃ５７メスマウス３０匹を取り、モデリング前に体重を測定し、体重に応じて異常なマウスを除外した後、すべてのマウスをランダムに２つの群に分け、ブランク対照群で８匹、モデル群で２２匹とした。群分けが完了した後、ブランク対照群に通常の維持食（北京科澳協力有限公司から購入）を与え、モデル群のマウスに０．６％ジシクロヘキサノンオキサリルジヒドラゾン（ＣＰＺ）（製造元：上海源葉生物科技有限公司；カタログ番号：Ｓ３０３４９）のモデリング飼料を４２日間連続して与え、多発性硬化症モデルを誘発した［１］。モデリングが完了した後、すべてのマウスをオープンフィールドテストでテストし、モデル群のマウスをテスト結果に従って群分けし、溶媒群で１１匹、投与群で１１匹とした。群分けが完了した後、すべてのマウスに投与を開始し、これを投与の１日目として記録し、ブランク対照群マウス及び溶媒群マウスに０．１ｍｌ／匹／日で溶媒を尾静脈注射により投与し、投与群マウスに１ｍｇ／匹／日でプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、３５日間連続投与した。投与期間中、すべてのマウスに通常の維持食を与えた。３６日目に、マウスを殺処分し、脳組織を採取して１０％ホルムアルデヒド溶液で固定し、脱水させて包埋した。固定後の組織サンプルをアルコール勾配で脱水させ、キシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋した。脳組織の冠状切片の厚みは３μｍであり、切片を脱パラフィンさせ再水和してから１回水で洗った。クエン酸で３０分間修復し、室温で１０分間冷却した後、水でやさしくすすいだ。３％過酸化水素水で１５分間インキュベーションし、ＰＡＰマーカーで組織を丸で囲んだ。１０％のヒツジ血清液（Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で１時間ブロッキングした。時間になった後、ヒツジ血清液を廃棄した。ウサギ抗ミエリン塩基性タンパク質（ｍｙｅｌｉｎ ｂａｓｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ，ＭＢＰ）抗体（Ａｂｃａｍ）を加えて４℃で一晩インキュベーションした後、ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＨＲＰ）抗体（Ａｂｃａｍ）の二次抗体を室温で１時間インキュベーションし、ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ＤＡＢキット（Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で呈色させ、水で３回洗浄した後にヘマトキシリンで３０秒複染色して、流水で５分間ブルーイングさせ、ＰＢＳで１回洗浄した。勾配で脱水させて透徹にして封入させ、切片を光学顕微鏡下で１００倍にて観察した。
ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）は、脊椎動物の中枢神経系のオリゴデンドロサイトと末梢神経系のシュワン細胞によって合成される強力な塩基性膜タンパク質であり、さまざまな塩基性アミノ酸を含んでいる。
その結果、ブランク対照群（図６Ａ）の脳梁は一定レベルのＭＢＰを発現し（矢印でマーク）、投与群（図６Ｃ）のマウスの脳梁のＭＢＰは溶媒群（図６Ｂ）のマウスよりも有意に高く、しかも統計学的な差は有意に近かった（Ｐ＝０．０６３）（図６Ｄ）。この結果は、プラスミノーゲンが多発性硬化症モデルマウスの脳梁におけるＭＢＰレベルの上昇を促進できることを示している。
【実施例7】
【0088】
実施例７は、プラスミノーゲンが多発性硬化症モデルマウスの海馬損傷の炎症修復を促進することに関するものである。
Ｃ５７メスマウス３０匹を取り、モデリング前に体重を測定し、体重に応じて異常なマウスを除外した後、すべてのマウスをランダムに２つの群に分け、ブランク対照群で８匹、モデル群で２２匹とした。群分けが完了した後、ブランク対照群に通常の維持食（北京科澳協力有限公司から購入）を与え、モデル群のマウスに０．６％ジシクロヘキサノンオキサリルジヒドラゾン（ＣＰＺ）（製造元：上海源葉生物科技有限公司；カタログ番号：Ｓ３０３４９）のモデリング飼料を４２日間連続して与え、多発性硬化症モデルを誘発した［１］。モデリングが完了した後、すべてのマウスをオープンフィールドテストでテストし、モデル群のマウスをテスト結果に従って群分けし、溶媒群で１１匹、投与群で１１匹とした。群分けが完了した後、すべてのマウスに投与を開始し、これを投与の１日目として記録し、ブランク対照群マウス及び溶媒群マウスに０．１ｍｌ／匹／日で溶媒を尾静脈注射により投与し、投与群マウスに１ｍｇ／匹／日でプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、３５日間連続投与した。投与期間中、すべてのマウスに通常の維持食を与えた。３６日目に、マウスを殺処分し、脳組織を採取して１０％ホルムアルデヒド溶液で固定し、脱水させて包埋した。固定後の組織サンプルをアルコール勾配で脱水させ、キシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋した。脳組織の冠状切片の厚みは３μｍであり、切片を脱パラフィンさせ再水和てから１回水で洗った。クエン酸で３０分間修復し、室温で１０分間冷却した後、水でやさしくすすいだ。３％過酸化水素水で１５分間インキュベーションし、ＰＡＰマーカーで組織を丸で囲んだ。１０％のヒツジ血清液（Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で１時間ブロッキングした。時間になった後、ヒツジ血清液を廃棄した。ウサギ抗イオン化カルシウム結合アダプタータンパク質－１（Ｉｏｎｉｚｅｄ ｃａｌｃｉｕｍ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｄａｐｔｏｒ ｍｏｌｅｃｕｌｅ－１，Ｉｂａ－１）抗体（Ａｂｃａｍ、ａｂ１７８８４７）を加えて４℃で一晩インキュベーションした後、ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＨＲＰ）抗体（Ａｂｃａｍ）の二次抗体を室温で１時間インキュベーションし、ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ＤＡＢキット（Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で呈色させ、水で３回洗浄した後にヘマトキシリンで３０秒複染色して、流水で５分間ブルーイングさせ、ＰＢＳで１回洗浄した。勾配で脱水させて透徹にして封入させ、切片を光学顕微鏡下で２００倍にて観察して写真を撮った。撮った写真に対してＩｍａｇｉｎｇ－Ｐｒｏソフトウェアを使用して陽性染色デンシトメトリー分析をした。
イオン化カルシウム結合アダプタータンパク質－１（Ｉｏｎｉｚｅｄ ｃａｌｃｉｕｍ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｄａｐｔｏｒ ｍｏｌｅｃｕｌｅ－１，Ｉｂａ－１）は、中枢神経系のミクログリア表面マーカーである。中枢神経系の免疫細胞として、ミクログリアは、その病変または損傷時に神経障害を素早く感知して活性化される。活性化されたミクログリアは、数と形状が大幅に変化し、損傷部位に移動し、死細胞の食作用や炎症誘発性サイトカインの産生増加など、さまざまな機能を果たす［４］。
その結果、ブランク対照群（図７Ａ）のマウスの海馬には一定量のミクログリアが存在し（矢印でマーク）、溶媒群（図７Ｂ）のマウスの海馬のミクログリア量は有意に増加し、投与群のマウスの海馬におけるミクログリアの数は溶媒群（図７Ｃ）よりも有意に高く、しかもその差は統計学的に有意（図７Ｄ）であった（＊はＰ＜０．０５、＊＊＊はＰ＜０．００１を表す）。これは、プラスミノーゲンが、多発性硬化症モデルマウスの海馬損傷の炎症修復を促進できることを示している。
Ｃ５７メスマウス３０匹を取り、モデリング前に体重を測定し、体重に応じて異常なマウスを除外した後、すべてのマウスをランダムに２つの群に分け、ブランク対照群で８匹、モデル群で２２匹とした。群分けが完了した後、ブランク対照群に通常の維持食（北京科澳協力有限公司から購入）を与え、モデル群のマウスに０．６％ジシクロヘキサノンオキサリルジヒドラゾン（ＣＰＺ）（製造元：上海源葉生物科技有限公司；カタログ番号：Ｓ３０３４９）のモデリング飼料を４２日間連続して与え、多発性硬化症モデルを誘発した［１］。モデリングが完了した後、すべてのマウスをオープンフィールドテストでテストし、モデル群のマウスをテスト結果に従って群分けし、溶媒群で１１匹、投与群で１１匹とした。群分けが完了した後、すべてのマウスに投与を開始し、これを投与の１日目として記録し、ブランク対照群マウス及び溶媒群マウスに０．１ｍｌ／匹／日で溶媒を尾静脈注射により投与し、投与群マウスに１ｍｇ／匹／日でプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、３５日間連続投与した。投与期間中、すべてのマウスに通常の維持食を与えた。３６日目に、マウスを殺処分し、脳組織を採取して１０％ホルムアルデヒド溶液で固定し、脱水させて包埋した。固定後の組織サンプルをアルコール勾配で脱水させ、キシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋した。脳組織の冠状切片の厚みは３μｍであり、切片を脱パラフィンさせ再水和てから１回水で洗った。クエン酸で３０分間修復し、室温で１０分間冷却した後、水でやさしくすすいだ。３％過酸化水素水で１５分間インキュベーションし、ＰＡＰマーカーで組織を丸で囲んだ。１０％のヒツジ血清液（Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で１時間ブロッキングした。時間になった後、ヒツジ血清液を廃棄した。ウサギ抗イオン化カルシウム結合アダプタータンパク質－１（Ｉｏｎｉｚｅｄ ｃａｌｃｉｕｍ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｄａｐｔｏｒ ｍｏｌｅｃｕｌｅ－１，Ｉｂａ－１）抗体（Ａｂｃａｍ、ａｂ１７８８４７）を加えて４℃で一晩インキュベーションした後、ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＨＲＰ）抗体（Ａｂｃａｍ）の二次抗体を室温で１時間インキュベーションし、ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ＤＡＢキット（Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で呈色させ、水で３回洗浄した後にヘマトキシリンで３０秒複染色して、流水で５分間ブルーイングさせ、ＰＢＳで１回洗浄した。勾配で脱水させて透徹にして封入させ、切片を光学顕微鏡下で２００倍にて観察して写真を撮った。撮った写真に対してＩｍａｇｉｎｇ－Ｐｒｏソフトウェアを使用して陽性染色デンシトメトリー分析をした。
イオン化カルシウム結合アダプタータンパク質－１（Ｉｏｎｉｚｅｄ ｃａｌｃｉｕｍ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｄａｐｔｏｒ ｍｏｌｅｃｕｌｅ－１，Ｉｂａ－１）は、中枢神経系のミクログリア表面マーカーである。中枢神経系の免疫細胞として、ミクログリアは、その病変または損傷時に神経障害を素早く感知して活性化される。活性化されたミクログリアは、数と形状が大幅に変化し、損傷部位に移動し、死細胞の食作用や炎症誘発性サイトカインの産生増加など、さまざまな機能を果たす［４］。
その結果、ブランク対照群（図７Ａ）のマウスの海馬には一定量のミクログリアが存在し（矢印でマーク）、溶媒群（図７Ｂ）のマウスの海馬のミクログリア量は有意に増加し、投与群のマウスの海馬におけるミクログリアの数は溶媒群（図７Ｃ）よりも有意に高く、しかもその差は統計学的に有意（図７Ｄ）であった（＊はＰ＜０．０５、＊＊＊はＰ＜０．００１を表す）。これは、プラスミノーゲンが、多発性硬化症モデルマウスの海馬損傷の炎症修復を促進できることを示している。
【実施例8】
【0089】
実施例８は、プラスミノーゲンが多発性硬化症モデルマウスの海馬におけるＢＤＮＦレベルの上昇を促進することに関するものである。
Ｃ５７メスマウス３０匹を取り、モデリング前に体重を測定し、体重に応じて異常なマウスを除外した後、すべてのマウスをランダムに２つの群に分け、ブランク対照群で８匹、モデル群で２２匹とした。群分けが完了した後、ブランク対照群に通常の維持食（北京科澳協力有限公司から購入）を与え、モデル群のマウスに０．６％ジシクロヘキサノンオキサリルジヒドラゾン（ＣＰＺ）（製造元：上海源葉生物科技有限公司；カタログ番号：Ｓ３０３４９）のモデリング飼料を４２日間連続して与え、多発性硬化症モデルを誘発した［１］。モデリングが完了した後、すべてのマウスをオープンフィールドテストでテストし、モデル群のマウスをテスト結果に従って群分けし、溶媒群で１１匹、投与群で１１匹とした。群分けが完了した後、すべてのマウスに投与を開始し、これを投与の１日目として記録し、ブランク対照群マウス及び溶媒群マウスに０．１ｍｌ／匹／日で溶媒を尾静脈注射により投与し、投与群マウスに１ｍｇ／匹／日でプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、３５日間連続投与した。投与期間中、すべてのマウスに通常の維持食を与えた。３６日目に、マウスを殺処分し、脳組織を採取して１０％ホルムアルデヒド溶液で固定し、脱水させて包埋した。固定後の組織サンプルをアルコール勾配で脱水させ、キシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋した。脳組織の冠状切片の厚みは３μｍであり、切片を脱パラフィンさせ再水和してから１回水で洗った。クエン酸で３０分間修復し、室温で１０分間冷却した後、水でやさしくすすいだ。３％過酸化水素水で１５分間インキュベーションし、ＰＡＰマーカーで組織を丸で囲んだ。１０％のヒツジ血清液（Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で１時間ブロッキングした。時間になった後、ヒツジ血清液を廃棄した。ウサギ抗脳由来神経栄養因子（ｂｒａｉｎ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ，ＢＤＮＦ）抗体（ＢｏｓｔｅｒＢｉｏ，ＰＢ９０７５）を加えて４℃で一晩インキュベーションした後、ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＨＲＰ）抗体（Ａｂｃａｍ）の二次抗体を室温で１時間インキュベーションし、ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ＤＡＢキット（Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で呈色させ、水で３回洗浄した後にヘマトキシリンで３０秒複染色して、流水で５分間ブルーイングさせ、ＰＢＳで１回洗浄した。勾配で脱水させて透徹にして封入させ、切片を光学顕微鏡下で４００倍にて観察して写真を撮った。撮った写真に対してＩｍａｇｉｎｇ－Ｐｒｏソフトウェアを使用して陽性染色デンシトメトリー分析をした。
成熟した脳由来神経栄養因子（ｂｒａｉｎ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ，ＢＤＮＦ）及びその受容体は、中枢神経系に広く分布しており、中枢神経系の発達中のニューロンの生存、分化、成長、発達に重要な役割を果たし、ニューロンが損傷を受けて死滅することを防ぎ、ニューロンの病理学的状態を改善し、損傷したニューロンの再生や分化などの生物学的効果を促進することができ、成熟した中枢神経系および末梢神経系におけるニューロンの生存と正常な生理学的機能に必要である［５］。
その結果、ブランク対照群（図８Ａ）のマウスの海馬には一定レベルのＢＤＮＦがあり（矢印でマーク）、溶媒群（図８Ｂ）のマウスの海馬のＢＤＮＦレベルは増加し、投与群のマウスの海馬におけるＢＤＮＦレベルは溶媒群（図８Ｃ）よりも有意に高く、しかもその統計的な差は有意差に近かった（図８Ｄ）（Ｐ＝０．０９５）。これは、プラスミノーゲンが、多発性硬化症モデルマウスの海馬におけるＢＤＮＦレベルの上昇を促進できることを示している。
Ｃ５７メスマウス３０匹を取り、モデリング前に体重を測定し、体重に応じて異常なマウスを除外した後、すべてのマウスをランダムに２つの群に分け、ブランク対照群で８匹、モデル群で２２匹とした。群分けが完了した後、ブランク対照群に通常の維持食（北京科澳協力有限公司から購入）を与え、モデル群のマウスに０．６％ジシクロヘキサノンオキサリルジヒドラゾン（ＣＰＺ）（製造元：上海源葉生物科技有限公司；カタログ番号：Ｓ３０３４９）のモデリング飼料を４２日間連続して与え、多発性硬化症モデルを誘発した［１］。モデリングが完了した後、すべてのマウスをオープンフィールドテストでテストし、モデル群のマウスをテスト結果に従って群分けし、溶媒群で１１匹、投与群で１１匹とした。群分けが完了した後、すべてのマウスに投与を開始し、これを投与の１日目として記録し、ブランク対照群マウス及び溶媒群マウスに０．１ｍｌ／匹／日で溶媒を尾静脈注射により投与し、投与群マウスに１ｍｇ／匹／日でプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、３５日間連続投与した。投与期間中、すべてのマウスに通常の維持食を与えた。３６日目に、マウスを殺処分し、脳組織を採取して１０％ホルムアルデヒド溶液で固定し、脱水させて包埋した。固定後の組織サンプルをアルコール勾配で脱水させ、キシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋した。脳組織の冠状切片の厚みは３μｍであり、切片を脱パラフィンさせ再水和してから１回水で洗った。クエン酸で３０分間修復し、室温で１０分間冷却した後、水でやさしくすすいだ。３％過酸化水素水で１５分間インキュベーションし、ＰＡＰマーカーで組織を丸で囲んだ。１０％のヒツジ血清液（Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で１時間ブロッキングした。時間になった後、ヒツジ血清液を廃棄した。ウサギ抗脳由来神経栄養因子（ｂｒａｉｎ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ，ＢＤＮＦ）抗体（ＢｏｓｔｅｒＢｉｏ，ＰＢ９０７５）を加えて４℃で一晩インキュベーションした後、ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＨＲＰ）抗体（Ａｂｃａｍ）の二次抗体を室温で１時間インキュベーションし、ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ＤＡＢキット（Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で呈色させ、水で３回洗浄した後にヘマトキシリンで３０秒複染色して、流水で５分間ブルーイングさせ、ＰＢＳで１回洗浄した。勾配で脱水させて透徹にして封入させ、切片を光学顕微鏡下で４００倍にて観察して写真を撮った。撮った写真に対してＩｍａｇｉｎｇ－Ｐｒｏソフトウェアを使用して陽性染色デンシトメトリー分析をした。
成熟した脳由来神経栄養因子（ｂｒａｉｎ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ，ＢＤＮＦ）及びその受容体は、中枢神経系に広く分布しており、中枢神経系の発達中のニューロンの生存、分化、成長、発達に重要な役割を果たし、ニューロンが損傷を受けて死滅することを防ぎ、ニューロンの病理学的状態を改善し、損傷したニューロンの再生や分化などの生物学的効果を促進することができ、成熟した中枢神経系および末梢神経系におけるニューロンの生存と正常な生理学的機能に必要である［５］。
その結果、ブランク対照群（図８Ａ）のマウスの海馬には一定レベルのＢＤＮＦがあり（矢印でマーク）、溶媒群（図８Ｂ）のマウスの海馬のＢＤＮＦレベルは増加し、投与群のマウスの海馬におけるＢＤＮＦレベルは溶媒群（図８Ｃ）よりも有意に高く、しかもその統計的な差は有意差に近かった（図８Ｄ）（Ｐ＝０．０９５）。これは、プラスミノーゲンが、多発性硬化症モデルマウスの海馬におけるＢＤＮＦレベルの上昇を促進できることを示している。
【実施例9】
【0090】
実施例９は、プラスミノーゲンが多発性硬化症モデルマウスにおける海馬アストロサイトの活性増加を促進することに関するものである。
Ｃ５７メスマウス３０匹を取り、モデリング前に体重を測定し、体重に応じて異常なマウスを除外した後、すべてのマウスをランダムに２つの群に分け、ブランク対照群で８匹、モデル群で２２匹とした。群分けが完了した後、ブランク対照群に通常の維持食（北京科澳協力有限公司から購入）を与え、モデル群のマウスに０．６％ジシクロヘキサノンオキサリルジヒドラゾン（ＣＰＺ）（製造元：上海源葉生物科技有限公司；カタログ番号：Ｓ３０３４９）のモデリング飼料を４２日間連続して与え、多発性硬化症モデルを誘発した［１］。モデリングが完了した後、すべてのマウスをオープンフィールドテストでテストし、モデル群のマウスをテスト結果に従って群分けし、溶媒群で１１匹、投与群で１１匹とした。群分けが完了した後、すべてのマウスに投与を開始し、これを投与の１日目として記録し、ブランク対照群マウス及び溶媒群マウスに０．１ｍｌ／匹／日で溶媒を尾静脈注射により投与し、投与群マウスに１ｍｇ／匹／日でプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、３５日間連続投与した。投与期間中、すべてのマウスに通常の維持食を与えた。３６日目に、マウスを殺処分し、脳組織を採取して１０％ホルムアルデヒド溶液で固定し、脱水させて包埋した。固定後の組織サンプルをアルコール勾配で脱水させ、キシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋した。脳組織の冠状切片の厚みは３μｍであり、切片を脱パラフィンさせ再水和てから１回水で洗った。クエン酸で３０分間修復し、室温で１０分間冷却した後、水でやさしくすすいだ。３％過酸化水素水で１５分間インキュベーションし、ＰＡＰマーカーで組織を丸で囲んだ。１０％のヒツジ血清液（Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で１時間ブロッキングした。時間になった後、ヒツジ血清液を廃棄した。ウサギ抗グリア線維性酸性タンパク質（Ｇｌｉａｌ ｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ ａｃｉｄｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ，ＧＦＡＰ）抗体（Ａｂｃａｍ、ａｂ４６４８）を加えて４℃で一晩インキュベーションした後、ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＨＲＰ）抗体（Ａｂｃａｍ）の二次抗体を室温で１時間インキュベーションし、ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ＤＡＢキット（Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で呈色させ、水で３回洗浄した後にヘマトキシリンで３０秒複染色して、流水で５分間ブルーイングさせ、ＰＢＳで１回洗浄した。勾配で脱水させて透徹にして封入させ、切片を光学顕微鏡下で２００倍にて観察して写真を撮った。撮った写真に対してＩｍａｇｉｎｇ－Ｐｒｏソフトウェアを使用して陽性染色デンシトメトリー分析をした。
グリア線維性酸性タンパク質（Ｇｌｉａｌ ｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ ａｃｉｄｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ，ＧＦＡＰ）は、細胞骨格に関与し、その引張強度を維持するアストロサイトの特徴的な中間径フィラメントタンパク質である［６］。
その結果、ブランク対照群（図９Ａ）のマウスの海馬には一定レベルのＧＦＡＰがあり（矢印でマーク）、溶媒群（図９Ｂ）のマウスの海馬のＧＦＡＰの発現は減少し、投与群のマウスの海馬におけるＧＦＡＰレベルは溶媒群（図９Ｃ）よりも有意に高く、しかもその統計的な差は有意差に近かった（図９Ｄ）（Ｐ＝０．０５１）。これは、プラスミノーゲンが、多発性硬化症モデルマウスの海馬におけるＧＦＡＰの発現の増加を促進し、アストロサイト活性の上昇を促進できることを示している。
Ｃ５７メスマウス３０匹を取り、モデリング前に体重を測定し、体重に応じて異常なマウスを除外した後、すべてのマウスをランダムに２つの群に分け、ブランク対照群で８匹、モデル群で２２匹とした。群分けが完了した後、ブランク対照群に通常の維持食（北京科澳協力有限公司から購入）を与え、モデル群のマウスに０．６％ジシクロヘキサノンオキサリルジヒドラゾン（ＣＰＺ）（製造元：上海源葉生物科技有限公司；カタログ番号：Ｓ３０３４９）のモデリング飼料を４２日間連続して与え、多発性硬化症モデルを誘発した［１］。モデリングが完了した後、すべてのマウスをオープンフィールドテストでテストし、モデル群のマウスをテスト結果に従って群分けし、溶媒群で１１匹、投与群で１１匹とした。群分けが完了した後、すべてのマウスに投与を開始し、これを投与の１日目として記録し、ブランク対照群マウス及び溶媒群マウスに０．１ｍｌ／匹／日で溶媒を尾静脈注射により投与し、投与群マウスに１ｍｇ／匹／日でプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、３５日間連続投与した。投与期間中、すべてのマウスに通常の維持食を与えた。３６日目に、マウスを殺処分し、脳組織を採取して１０％ホルムアルデヒド溶液で固定し、脱水させて包埋した。固定後の組織サンプルをアルコール勾配で脱水させ、キシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋した。脳組織の冠状切片の厚みは３μｍであり、切片を脱パラフィンさせ再水和てから１回水で洗った。クエン酸で３０分間修復し、室温で１０分間冷却した後、水でやさしくすすいだ。３％過酸化水素水で１５分間インキュベーションし、ＰＡＰマーカーで組織を丸で囲んだ。１０％のヒツジ血清液（Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で１時間ブロッキングした。時間になった後、ヒツジ血清液を廃棄した。ウサギ抗グリア線維性酸性タンパク質（Ｇｌｉａｌ ｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ ａｃｉｄｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ，ＧＦＡＰ）抗体（Ａｂｃａｍ、ａｂ４６４８）を加えて４℃で一晩インキュベーションした後、ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＨＲＰ）抗体（Ａｂｃａｍ）の二次抗体を室温で１時間インキュベーションし、ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ＤＡＢキット（Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で呈色させ、水で３回洗浄した後にヘマトキシリンで３０秒複染色して、流水で５分間ブルーイングさせ、ＰＢＳで１回洗浄した。勾配で脱水させて透徹にして封入させ、切片を光学顕微鏡下で２００倍にて観察して写真を撮った。撮った写真に対してＩｍａｇｉｎｇ－Ｐｒｏソフトウェアを使用して陽性染色デンシトメトリー分析をした。
グリア線維性酸性タンパク質（Ｇｌｉａｌ ｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ ａｃｉｄｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ，ＧＦＡＰ）は、細胞骨格に関与し、その引張強度を維持するアストロサイトの特徴的な中間径フィラメントタンパク質である［６］。
その結果、ブランク対照群（図９Ａ）のマウスの海馬には一定レベルのＧＦＡＰがあり（矢印でマーク）、溶媒群（図９Ｂ）のマウスの海馬のＧＦＡＰの発現は減少し、投与群のマウスの海馬におけるＧＦＡＰレベルは溶媒群（図９Ｃ）よりも有意に高く、しかもその統計的な差は有意差に近かった（図９Ｄ）（Ｐ＝０．０５１）。これは、プラスミノーゲンが、多発性硬化症モデルマウスの海馬におけるＧＦＡＰの発現の増加を促進し、アストロサイト活性の上昇を促進できることを示している。
【実施例10】
【0091】
実施例１０は、プラスミノーゲンが多発性硬化症モデルマウスの抑うつ行動を緩和することに関するものである。
Ｃ５７メスマウス３０匹を取り、モデリング前に体重を測定し、体重に応じて異常なマウスを除外した後、すべてのマウスをランダムに２つの群に分け、ブランク対照群で８匹、モデル群で２２匹とした。群分けが完了した後、ブランク対照群に通常の維持食（北京科澳協力有限公司から購入）を与え、モデル群のマウスに０．６％ジシクロヘキサノンオキサリルジヒドラゾン（ＣＰＺ）（製造元：上海源葉生物科技有限公司；カタログ番号：Ｓ３０３４９）のモデリング飼料を４２日間連続して与え、多発性硬化症モデルを誘発した［１］。モデリングが完了した後、すべてのマウスをオープンフィールドテストでテストし、モデル群のマウスをテスト結果に従って群分けし、溶媒群で１１匹、投与群で１１匹とした。群分けが完了した後、すべてのマウスに投与を開始し、これを投与の１日目として記録し、ブランク対照群マウス及び溶媒群マウスに０．１ｍｌ／匹／日で溶媒を尾静脈注射により投与し、投与群マウスに１ｍｇ／匹／日でプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、２８日間連続投与した。投与期間中、すべてのマウスに通常の維持食を与えた。２９日目にオープンフィールド実験を行った。
多発性硬化症の患者には、精神医学的症状はよく見られ、主にうつ病、イライラ、癇癪として現れ、一部の患者は、多幸感や興奮のように見えるが、無関心、無気力、強い泣き笑い、無反応、知能の低下、言語の繰り返し、疑い、及び迫害の妄想などとして現れることもある。また、記憶喪失や注意力障害などの認知機能障害も発生する可能性がある［７］。
オープンフィールド実験
実験時、オープンフィールド（４０×４０×４０ｃｍ）の底面中央にマウスを置き、撮影と計時を同時に行い、持続して５分間観察し、各マウスは３回の実験を行った。Ｓｍａｒｔ Ｓｙｓｔｅｍは、実験動物の行動を評価するための完全な使いやすいビデオ追跡システムである。軌跡、アクティビティ、特定の動作（回転、ストレッチ、摂食など）およびイベントを記録し、さまざまな分析パラメーターの計算を実行できる。この実験では、Ｓｍａｒｔ３．０システムを使用して、マウスの動きを記録および分析した。パラメーターは、総移動距離、境界休憩時間率、中央ゾーンの平均移動速度、および境界の平均移動速度を含む。各実験では、匂いの好みを防ぐために７０％のアルコールを使用してボックスを拭いた［８］。
オープンフィールド実験の設計原理は、マウスの回避に基づいている。これは、マウスが開けた場所、未知の場所、潜在的に危険な場所を恐れているため、「壁に張り付く」性質を持っていることを指す。回避は、フィールドの周辺領域(４つのコーナーと４つの側面)でのマウスの活動によって評価された。回避を反映した周囲での活動時間から判断すると、時間が短縮することは、マウスがより「冒険的」な傾向にあることを示し、中央ゾーンでの活動時間が大幅に長くなることは、回避と不安(うつ病)のレベルが低いことを示す。
総移動距離は、オープンフィールド実験中の各領域でのマウスの総移動距離である。その結果、ブランク対照群のマウスには一定の総移動距離があり、溶媒群のマウスの総移動距離は有意に増加し、投与群のマウスの総移動距離は溶媒群のマウスよりも有意に小さく、その差は統計的に有意であり（＊はＰ＜０．０５を示す）（図１０）、しかもブランク対照群に近かった。これは、プラスミノーゲンが多発性硬化症モデルマウスの抑うつ行動を緩和できることを示している。
Ｃ５７メスマウス３０匹を取り、モデリング前に体重を測定し、体重に応じて異常なマウスを除外した後、すべてのマウスをランダムに２つの群に分け、ブランク対照群で８匹、モデル群で２２匹とした。群分けが完了した後、ブランク対照群に通常の維持食（北京科澳協力有限公司から購入）を与え、モデル群のマウスに０．６％ジシクロヘキサノンオキサリルジヒドラゾン（ＣＰＺ）（製造元：上海源葉生物科技有限公司；カタログ番号：Ｓ３０３４９）のモデリング飼料を４２日間連続して与え、多発性硬化症モデルを誘発した［１］。モデリングが完了した後、すべてのマウスをオープンフィールドテストでテストし、モデル群のマウスをテスト結果に従って群分けし、溶媒群で１１匹、投与群で１１匹とした。群分けが完了した後、すべてのマウスに投与を開始し、これを投与の１日目として記録し、ブランク対照群マウス及び溶媒群マウスに０．１ｍｌ／匹／日で溶媒を尾静脈注射により投与し、投与群マウスに１ｍｇ／匹／日でプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、２８日間連続投与した。投与期間中、すべてのマウスに通常の維持食を与えた。２９日目にオープンフィールド実験を行った。
多発性硬化症の患者には、精神医学的症状はよく見られ、主にうつ病、イライラ、癇癪として現れ、一部の患者は、多幸感や興奮のように見えるが、無関心、無気力、強い泣き笑い、無反応、知能の低下、言語の繰り返し、疑い、及び迫害の妄想などとして現れることもある。また、記憶喪失や注意力障害などの認知機能障害も発生する可能性がある［７］。
オープンフィールド実験
実験時、オープンフィールド（４０×４０×４０ｃｍ）の底面中央にマウスを置き、撮影と計時を同時に行い、持続して５分間観察し、各マウスは３回の実験を行った。Ｓｍａｒｔ Ｓｙｓｔｅｍは、実験動物の行動を評価するための完全な使いやすいビデオ追跡システムである。軌跡、アクティビティ、特定の動作（回転、ストレッチ、摂食など）およびイベントを記録し、さまざまな分析パラメーターの計算を実行できる。この実験では、Ｓｍａｒｔ３．０システムを使用して、マウスの動きを記録および分析した。パラメーターは、総移動距離、境界休憩時間率、中央ゾーンの平均移動速度、および境界の平均移動速度を含む。各実験では、匂いの好みを防ぐために７０％のアルコールを使用してボックスを拭いた［８］。
オープンフィールド実験の設計原理は、マウスの回避に基づいている。これは、マウスが開けた場所、未知の場所、潜在的に危険な場所を恐れているため、「壁に張り付く」性質を持っていることを指す。回避は、フィールドの周辺領域(４つのコーナーと４つの側面)でのマウスの活動によって評価された。回避を反映した周囲での活動時間から判断すると、時間が短縮することは、マウスがより「冒険的」な傾向にあることを示し、中央ゾーンでの活動時間が大幅に長くなることは、回避と不安(うつ病)のレベルが低いことを示す。
総移動距離は、オープンフィールド実験中の各領域でのマウスの総移動距離である。その結果、ブランク対照群のマウスには一定の総移動距離があり、溶媒群のマウスの総移動距離は有意に増加し、投与群のマウスの総移動距離は溶媒群のマウスよりも有意に小さく、その差は統計的に有意であり（＊はＰ＜０．０５を示す）（図１０）、しかもブランク対照群に近かった。これは、プラスミノーゲンが多発性硬化症モデルマウスの抑うつ行動を緩和できることを示している。
【実施例11】
【0092】
実施例１１は、プラスミノーゲンが多発性硬化症モデルマウスの抑うつ行動を緩和することに関するものである。
Ｃ５７メスマウス３０匹を取り、モデリング前に体重を測定し、体重に応じて異常なマウスを除外した後、すべてのマウスをランダムに２つの群に分け、ブランク対照群で８匹、モデル群で２２匹とした。群分けが完了した後、ブランク対照群に通常の維持食（北京科澳協力有限公司から購入）を与え、モデル群のマウスに０．６％ジシクロヘキサノンオキサリルジヒドラゾン（ＣＰＺ）（製造元：上海源葉生物科技有限公司；カタログ番号：Ｓ３０３４９）のモデリング飼料を４２日間連続して与え、多発性硬化症モデルを誘発した［１］。モデリングが完了した後、すべてのマウスをオープンフィールドテストでテストし、モデル群のマウスをテスト結果に従って群分けし、溶媒群で１１匹、投与群で１１匹とした。群分けが完了した後、すべてのマウスに投与を開始し、これを投与の１日目として記録し、ブランク対照群マウス及び溶媒群マウスに０．１ｍｌ／匹／日で溶媒を尾静脈注射により投与し、投与群マウスに１ｍｇ／匹／日でプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、２８日間連続投与した。投与期間中、すべてのマウスに通常の維持食を与えた。２９日目にオープンフィールド実験を行った。
境界ゾーンでの休憩時間の割合＝境界ゾーンでの休憩時間／総観察時間である。その結果、ブランク対照群のマウスが境界ゾーンで一定の休憩時間の割合（約５７．８％）を持っており、溶媒群のマウスの境界ゾーンでの休憩時間の割合は大幅に減少し、約４９．３％であり、投与群のマウスは境界ゾーンでの休憩時間の割合は約５８．４％であり、溶媒群よりも有意に大きく、その差は統計的に有意であり（＊はＰ＜０．０５を表す）（図１１）、しかもブランク対照群に近かった。これは、プラスミノーゲンが多発性硬化症モデルマウスの抑うつ行動をある程度緩和できることを示している。
Ｃ５７メスマウス３０匹を取り、モデリング前に体重を測定し、体重に応じて異常なマウスを除外した後、すべてのマウスをランダムに２つの群に分け、ブランク対照群で８匹、モデル群で２２匹とした。群分けが完了した後、ブランク対照群に通常の維持食（北京科澳協力有限公司から購入）を与え、モデル群のマウスに０．６％ジシクロヘキサノンオキサリルジヒドラゾン（ＣＰＺ）（製造元：上海源葉生物科技有限公司；カタログ番号：Ｓ３０３４９）のモデリング飼料を４２日間連続して与え、多発性硬化症モデルを誘発した［１］。モデリングが完了した後、すべてのマウスをオープンフィールドテストでテストし、モデル群のマウスをテスト結果に従って群分けし、溶媒群で１１匹、投与群で１１匹とした。群分けが完了した後、すべてのマウスに投与を開始し、これを投与の１日目として記録し、ブランク対照群マウス及び溶媒群マウスに０．１ｍｌ／匹／日で溶媒を尾静脈注射により投与し、投与群マウスに１ｍｇ／匹／日でプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、２８日間連続投与した。投与期間中、すべてのマウスに通常の維持食を与えた。２９日目にオープンフィールド実験を行った。
境界ゾーンでの休憩時間の割合＝境界ゾーンでの休憩時間／総観察時間である。その結果、ブランク対照群のマウスが境界ゾーンで一定の休憩時間の割合（約５７．８％）を持っており、溶媒群のマウスの境界ゾーンでの休憩時間の割合は大幅に減少し、約４９．３％であり、投与群のマウスは境界ゾーンでの休憩時間の割合は約５８．４％であり、溶媒群よりも有意に大きく、その差は統計的に有意であり（＊はＰ＜０．０５を表す）（図１１）、しかもブランク対照群に近かった。これは、プラスミノーゲンが多発性硬化症モデルマウスの抑うつ行動をある程度緩和できることを示している。
【実施例12】
【0093】
実施例１２は、プラスミノーゲンが多発性硬化症モデルマウスの社会的記憶を改善することに関するものである。
Ｃ５７メスマウス３０匹を取り、モデリング前に体重を測定し、体重に応じて異常なマウスを除外した後、すべてのマウスをランダムに２つの群に分け、ブランク対照群で８匹、モデル群で２２匹とした。群分けが完了した後、ブランク対照群に通常の維持食（北京科澳協力有限公司から購入）を与え、モデル群のマウスに０．６％ジシクロヘキサノンオキサリルジヒドラゾン（ＣＰＺ）（製造元：上海源葉生物科技有限公司；カタログ番号：Ｓ３０３４９）のモデリング飼料を４２日間連続して与え、多発性硬化症モデルを誘発した［１］。モデリングが完了した後、すべてのマウスをオープンフィールドテストでテストし、モデル群のマウスをテスト結果に従って群分けし、溶媒群で１１匹、投与群で１１匹とした。群分けが完了した後、すべてのマウスに投与を開始し、これを投与の１日目として記録し、ブランク対照群マウス及び溶媒群マウスに０．１ｍｌ／匹／日で溶媒を尾静脈注射により投与し、投与群マウスに１ｍｇ／匹／日でプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、３４日間連続投与した。投与期間中、すべてのマウスに通常の維持食を与えた。３５日目に３ボックスの社会的テスト実験を行った。
３ボックス実験の開始前に、環境に適応させるようにマウスを行動試験室に３０分間入れた。３つのボックスを透明なガラス樹脂板で隔て、試験マウスを中央のボックスに５分間入れて適応させ、ストレンジャーマウス１を左または右のボックスの金属製ケージにランダムに入れ、もう一方のボックスの金属ケージは空にした。ボックスを隔てるガラス樹脂板を取り外して、試験マウスが３つのボックス内で１０分間自由に移動できるようにした。すぐに撮影を開始し、関連するパラメーターを記録した。第１段階：１）実験マウスとストレンジャーマウス１または空の金属製ケージとの直接接触の回数及び持続時間を記録した。金属製ケージの周囲３～５ｃｍを接触範囲と定義する。２）実験マウスが各ボックスに入った回数及び持続期間を記録した。マウスは、頭と足がボックスに入ったときにそのボックスの中にいると見なされる。第２段階：第２段階の実験では、２番目のストレンジャーマウス（ストレンジャーマウス２）を空の金属ケージに入れ、１０分間記録し、実験マウスとストレンジャーマウス１及びストレンジャーマウス２との接触時間及び回数を記録した。正常なマウスは社会的行動を示し、１段階の実験では、正常なマウスは通常、ストレンジャーマウス１との接触の時間及び回数が、空の金属ケージとの接触の時間及び回数よりもはるかに多い。同時に、マウスは記憶力と「新しいものを喜び、古いものを嫌う」という特徴も持っているため、第２段階では、マウスは、１０分間交流したことのあるストレンジャーマウス１よりも、一度もあったことのないストレンジャーマウス１と交流することを好む。
休憩時間の割合＝休憩時間／総観察時間である。３ボックス社会的試験実験の第２段階の結果により明らかに、ブランク対照群のマウスは、ストレンジャーマウス２の接触範囲内で一定の割合の休憩時間を持っており、約１３．７％であり、溶媒群では、約１０．６％と有意に減少し、投与群は約１６．１％であり、溶媒群よりも有意に高く、しかもその統計学的な差は有意に近かった（Ｐ＝０．０７５）（図１２）。これは、プラスミノーゲンが多発性硬化症モデルマウスの社会的記憶を改善できることを示している。
Ｃ５７メスマウス３０匹を取り、モデリング前に体重を測定し、体重に応じて異常なマウスを除外した後、すべてのマウスをランダムに２つの群に分け、ブランク対照群で８匹、モデル群で２２匹とした。群分けが完了した後、ブランク対照群に通常の維持食（北京科澳協力有限公司から購入）を与え、モデル群のマウスに０．６％ジシクロヘキサノンオキサリルジヒドラゾン（ＣＰＺ）（製造元：上海源葉生物科技有限公司；カタログ番号：Ｓ３０３４９）のモデリング飼料を４２日間連続して与え、多発性硬化症モデルを誘発した［１］。モデリングが完了した後、すべてのマウスをオープンフィールドテストでテストし、モデル群のマウスをテスト結果に従って群分けし、溶媒群で１１匹、投与群で１１匹とした。群分けが完了した後、すべてのマウスに投与を開始し、これを投与の１日目として記録し、ブランク対照群マウス及び溶媒群マウスに０．１ｍｌ／匹／日で溶媒を尾静脈注射により投与し、投与群マウスに１ｍｇ／匹／日でプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、３４日間連続投与した。投与期間中、すべてのマウスに通常の維持食を与えた。３５日目に３ボックスの社会的テスト実験を行った。
３ボックス実験の開始前に、環境に適応させるようにマウスを行動試験室に３０分間入れた。３つのボックスを透明なガラス樹脂板で隔て、試験マウスを中央のボックスに５分間入れて適応させ、ストレンジャーマウス１を左または右のボックスの金属製ケージにランダムに入れ、もう一方のボックスの金属ケージは空にした。ボックスを隔てるガラス樹脂板を取り外して、試験マウスが３つのボックス内で１０分間自由に移動できるようにした。すぐに撮影を開始し、関連するパラメーターを記録した。第１段階：１）実験マウスとストレンジャーマウス１または空の金属製ケージとの直接接触の回数及び持続時間を記録した。金属製ケージの周囲３～５ｃｍを接触範囲と定義する。２）実験マウスが各ボックスに入った回数及び持続期間を記録した。マウスは、頭と足がボックスに入ったときにそのボックスの中にいると見なされる。第２段階：第２段階の実験では、２番目のストレンジャーマウス（ストレンジャーマウス２）を空の金属ケージに入れ、１０分間記録し、実験マウスとストレンジャーマウス１及びストレンジャーマウス２との接触時間及び回数を記録した。正常なマウスは社会的行動を示し、１段階の実験では、正常なマウスは通常、ストレンジャーマウス１との接触の時間及び回数が、空の金属ケージとの接触の時間及び回数よりもはるかに多い。同時に、マウスは記憶力と「新しいものを喜び、古いものを嫌う」という特徴も持っているため、第２段階では、マウスは、１０分間交流したことのあるストレンジャーマウス１よりも、一度もあったことのないストレンジャーマウス１と交流することを好む。
休憩時間の割合＝休憩時間／総観察時間である。３ボックス社会的試験実験の第２段階の結果により明らかに、ブランク対照群のマウスは、ストレンジャーマウス２の接触範囲内で一定の割合の休憩時間を持っており、約１３．７％であり、溶媒群では、約１０．６％と有意に減少し、投与群は約１６．１％であり、溶媒群よりも有意に高く、しかもその統計学的な差は有意に近かった（Ｐ＝０．０７５）（図１２）。これは、プラスミノーゲンが多発性硬化症モデルマウスの社会的記憶を改善できることを示している。
【実施例13】
【0094】
実施例１３は、プラスミノーゲンが多発性硬化症モデルラットの抑うつ行動を緩和することに関するものである。
３週齢のオスラット２６匹を取り、モデリング前に体重を測定し、体重に応じて異常なラットを除外した後、すべてのラットをランダムに２つの群に分け、ブランク対照群で８匹、モデル群で１８匹とした。群分けが完了した後、ブランク対照群に通常の維持食（北京科澳協力有限公司から購入）を与え、モデル群に０．６％ＣＰＺのモデリング飼料を与え、１４日間モデリングして多発性硬化症モデルを確立した［９］。同時に、すべてのラットに通常の維持食を与え始めた。モデリングが完了した後、すべてのラットをオープンフィールドテストでテストし、モデル群のラットをテスト結果に従って群分けし、溶媒群で７匹、投与群で８匹とした。群分けが完了した後、溶媒群及び投与群のラットに投与を開始し、これを投与の１日目として記録し、投与群のラットに３５ｍｇ／ｋｇでプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒群のラットに３．５ｍｌ／ｋｇで溶媒を尾静脈注射により投与し、６日間連続投与し、ブランク対照群のラットには投与しなかった。投与の７日目にオープンフィールド実験を行った。
境界ゾーンの移動距離は、オープンフィールド実験の試験時間内における境界ゾーンの移動軌跡の長さである。境界ゾーンの移動距離の割合＝境界ゾーンの移動距離／境界ゾーンと中央ゾーンの移動距離の合計である。その結果、ブランク対照群は境界ゾーンで一定の割合の移動距離を持っており、約９１．１％であり、溶媒群は約９３．６％と有意に増加し、投与群は約８８．１％であり、溶媒群よりも有意に低く、しかもその差は統計的に有意であった（＊はＰ＜０．０５を表す）（図１３）。これは、プラスミノーゲンが多発性硬化症モデルラットの抑うつ行動を緩和できることを示している。
３週齢のオスラット２６匹を取り、モデリング前に体重を測定し、体重に応じて異常なラットを除外した後、すべてのラットをランダムに２つの群に分け、ブランク対照群で８匹、モデル群で１８匹とした。群分けが完了した後、ブランク対照群に通常の維持食（北京科澳協力有限公司から購入）を与え、モデル群に０．６％ＣＰＺのモデリング飼料を与え、１４日間モデリングして多発性硬化症モデルを確立した［９］。同時に、すべてのラットに通常の維持食を与え始めた。モデリングが完了した後、すべてのラットをオープンフィールドテストでテストし、モデル群のラットをテスト結果に従って群分けし、溶媒群で７匹、投与群で８匹とした。群分けが完了した後、溶媒群及び投与群のラットに投与を開始し、これを投与の１日目として記録し、投与群のラットに３５ｍｇ／ｋｇでプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒群のラットに３．５ｍｌ／ｋｇで溶媒を尾静脈注射により投与し、６日間連続投与し、ブランク対照群のラットには投与しなかった。投与の７日目にオープンフィールド実験を行った。
境界ゾーンの移動距離は、オープンフィールド実験の試験時間内における境界ゾーンの移動軌跡の長さである。境界ゾーンの移動距離の割合＝境界ゾーンの移動距離／境界ゾーンと中央ゾーンの移動距離の合計である。その結果、ブランク対照群は境界ゾーンで一定の割合の移動距離を持っており、約９１．１％であり、溶媒群は約９３．６％と有意に増加し、投与群は約８８．１％であり、溶媒群よりも有意に低く、しかもその差は統計的に有意であった（＊はＰ＜０．０５を表す）（図１３）。これは、プラスミノーゲンが多発性硬化症モデルラットの抑うつ行動を緩和できることを示している。
【実施例14】
【0095】
実施例１４は、プラスミノーゲンが多発性硬化症モデルラットの不安行動を緩和することに関するものである。
３週齢のオスラット２６匹を取り、モデリング前に体重を測定し、体重に応じて異常なラットを除外した後、すべてのラットをランダムに２つの群に分け、ブランク対照群で８匹、モデル群で１８匹とした。群分けが完了した後、ブランク対照群に通常の維持食（北京科澳協力有限公司から購入）を与え、モデル群に０．６％ＣＰＺのモデリング飼料を与え、１４日間モデリングして多発性硬化症モデルを確立した［９］。同時に、すべてのラットに通常の維持食を与え始めた。モデリングが完了した後、すべてのラットをオープンフィールドテストでテストし、モデル群のラットをテスト結果に従って群分けし、溶媒群で７匹、投与群で８匹とした。群分けが完了した後、溶媒群及び投与群のラットに投与を開始し、これを投与の１日目として記録し、投与群のラットに３５ｍｇ／ｋｇでプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒群のラットに３．５ｍｌ／ｋｇで溶媒を尾静脈注射により投与し、６日間連続投与し、ブランク対照群のラットには投与しなかった。投与の７日目にオープンフィールド実験を行った。
中心ゾーンの移動距離は、オープンフィールド実験の試験時間内における中心ゾーンの移動軌跡の長さである。中心ゾーンの移動距離の割合＝中心ゾーンの移動距離／境界ゾーンと中央ゾーンの移動距離の合計である。その結果、ブランク対照群は中心ゾーンで一定の割合の距離を持っており、約８．９％であり、溶媒群は約６．４％と有意に低下し、投与群は約１１．９％であり、溶媒群よりも有意に高く、しかもその差は統計的に有意であった（＊はＰ＜０．０５を表す）（図１４）。これは、プラスミノーゲンが多発性硬化症モデルラットの不安行動を緩和できることを示している。
３週齢のオスラット２６匹を取り、モデリング前に体重を測定し、体重に応じて異常なラットを除外した後、すべてのラットをランダムに２つの群に分け、ブランク対照群で８匹、モデル群で１８匹とした。群分けが完了した後、ブランク対照群に通常の維持食（北京科澳協力有限公司から購入）を与え、モデル群に０．６％ＣＰＺのモデリング飼料を与え、１４日間モデリングして多発性硬化症モデルを確立した［９］。同時に、すべてのラットに通常の維持食を与え始めた。モデリングが完了した後、すべてのラットをオープンフィールドテストでテストし、モデル群のラットをテスト結果に従って群分けし、溶媒群で７匹、投与群で８匹とした。群分けが完了した後、溶媒群及び投与群のラットに投与を開始し、これを投与の１日目として記録し、投与群のラットに３５ｍｇ／ｋｇでプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒群のラットに３．５ｍｌ／ｋｇで溶媒を尾静脈注射により投与し、６日間連続投与し、ブランク対照群のラットには投与しなかった。投与の７日目にオープンフィールド実験を行った。
中心ゾーンの移動距離は、オープンフィールド実験の試験時間内における中心ゾーンの移動軌跡の長さである。中心ゾーンの移動距離の割合＝中心ゾーンの移動距離／境界ゾーンと中央ゾーンの移動距離の合計である。その結果、ブランク対照群は中心ゾーンで一定の割合の距離を持っており、約８．９％であり、溶媒群は約６．４％と有意に低下し、投与群は約１１．９％であり、溶媒群よりも有意に高く、しかもその差は統計的に有意であった（＊はＰ＜０．０５を表す）（図１４）。これは、プラスミノーゲンが多発性硬化症モデルラットの不安行動を緩和できることを示している。
【実施例15】
【0096】
実施例１５は、プラスミノーゲンが多発性硬化症モデルマウスの不安や抑うつ行動を緩和することに関するものである。
Ｃ５７メスマウス３０匹を取り、モデリング前に体重を測定し、体重に応じて異常なマウスを除外した後、すべてのマウスをランダムに２つの群に分け、ブランク対照群で８匹、モデル群で２２匹とした。群分けが完了した後、ブランク対照群に通常の維持食（北京科澳協力有限公司から購入）を与え、モデル群に０．６％ジシクロヘキサノンオキサリルジヒドラゾン（ＣＰＺ）（製造元：上海源葉生物科技有限公司；カタログ番号：Ｓ３０３４９）のモデリング飼料を４２日間連続して与え、多発性硬化症モデルを誘発した［１］。モデリングが完了した後、すべてのマウスをオープンフィールドテストでテストし、モデル群のマウスをテスト結果に従って群分けし、溶媒群で１１匹、投与群で１１匹とした。群分けが完了した後、すべてのマウスに投与を開始し、これを投与の１日目として記録し、ブランク対照群マウス及び溶媒群マウスに０．１ｍｌ／匹／日で溶媒を尾静脈注射により投与し、投与群マウスに１ｍｇ／匹／日でプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、２０日間連続投与した。投与期間中、すべてのマウスに通常の維持食を与えた。２１日目に高架式十字迷路実験を行った。
高架式十字迷路は、動物の新しい異なる環境の探索特性及び高くぶら下げるオープンアームへの恐怖を利用して相反する行動を形成し、動物の不安状態を調べる。高架十字迷路には１対のオープンアームと１対のクローズアームがある。齧歯類は暗所嗜好のためクローズアームで移動する傾向があるが、好奇心と探索のためにオープンアームで移動し、新しい刺激に直面すると、動物は探索する衝動と恐怖を同時に感じる。これは、探索と回避の相反する行動を引き起こし、結果として不安が生じる。抗不安薬は、オープンアームに入る回数と時間を大幅に増やすことができる。十字迷路は地面から高く、崖の上に立っているのと同じであるため、被験者に恐怖と不安を感じさせる。高架式十字迷路は、新薬の開発／スクリーニング／評価、薬理学、毒物学、予防医学、神経生物学、動物心理学、行動生物学などの複数の分野における科学研究およびコンピューター支援教育などの分野で広く使用されており、医学部や科学研究機関での行動研究、特に不安やうつ病の研究における古典的な実験である。
実験の開始時に、マウスをクローズアームに向かって中央のグリッドから迷路に入れ、５分間の活動を記録した。観察指標は、オープンアームエントリの回数(２つの前足がアームに入る必要がある)、オープンアームの滞留時間、クローズアームエントリの回数、およびクローズアームの滞留時間を含む。オープンアームの滞留時間の割合、オープンアームエントリ時間の割合、および高架式十字迷路のエントリの総数を計算した。実験が終わった後、マウスを取り出し、両腕をきれいにし、アルコールをスプレーして臭いを取り除いた。最後に、動物行動学ソフトウェアを使用してデータ分析を行った。
オープンアームエントリの割合＝オープンアームエントリの総数／オープンアームエントリとクローズアームエントリの合計である。その結果、ブランク対照群のマウスは一定のオープンアームエントリ率を有し、約１４．９％であり、溶媒群のマウスのオープンアームエントリ率は、約２３．０％と有意に増加し、投与群のマウスのオープンアームエントリ率は約１４．５％であり、溶媒群よりも有意に少なく、その差は統計学的に有意であり（Ｐ＝０．０１５）（図１５）、しかもブランク対照群に近かった。これは、プラスミノーゲンが多発性硬化症モデルマウスの不安行動をある程度緩和できることを示している。
Ｃ５７メスマウス３０匹を取り、モデリング前に体重を測定し、体重に応じて異常なマウスを除外した後、すべてのマウスをランダムに２つの群に分け、ブランク対照群で８匹、モデル群で２２匹とした。群分けが完了した後、ブランク対照群に通常の維持食（北京科澳協力有限公司から購入）を与え、モデル群に０．６％ジシクロヘキサノンオキサリルジヒドラゾン（ＣＰＺ）（製造元：上海源葉生物科技有限公司；カタログ番号：Ｓ３０３４９）のモデリング飼料を４２日間連続して与え、多発性硬化症モデルを誘発した［１］。モデリングが完了した後、すべてのマウスをオープンフィールドテストでテストし、モデル群のマウスをテスト結果に従って群分けし、溶媒群で１１匹、投与群で１１匹とした。群分けが完了した後、すべてのマウスに投与を開始し、これを投与の１日目として記録し、ブランク対照群マウス及び溶媒群マウスに０．１ｍｌ／匹／日で溶媒を尾静脈注射により投与し、投与群マウスに１ｍｇ／匹／日でプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、２０日間連続投与した。投与期間中、すべてのマウスに通常の維持食を与えた。２１日目に高架式十字迷路実験を行った。
高架式十字迷路は、動物の新しい異なる環境の探索特性及び高くぶら下げるオープンアームへの恐怖を利用して相反する行動を形成し、動物の不安状態を調べる。高架十字迷路には１対のオープンアームと１対のクローズアームがある。齧歯類は暗所嗜好のためクローズアームで移動する傾向があるが、好奇心と探索のためにオープンアームで移動し、新しい刺激に直面すると、動物は探索する衝動と恐怖を同時に感じる。これは、探索と回避の相反する行動を引き起こし、結果として不安が生じる。抗不安薬は、オープンアームに入る回数と時間を大幅に増やすことができる。十字迷路は地面から高く、崖の上に立っているのと同じであるため、被験者に恐怖と不安を感じさせる。高架式十字迷路は、新薬の開発／スクリーニング／評価、薬理学、毒物学、予防医学、神経生物学、動物心理学、行動生物学などの複数の分野における科学研究およびコンピューター支援教育などの分野で広く使用されており、医学部や科学研究機関での行動研究、特に不安やうつ病の研究における古典的な実験である。
実験の開始時に、マウスをクローズアームに向かって中央のグリッドから迷路に入れ、５分間の活動を記録した。観察指標は、オープンアームエントリの回数(２つの前足がアームに入る必要がある)、オープンアームの滞留時間、クローズアームエントリの回数、およびクローズアームの滞留時間を含む。オープンアームの滞留時間の割合、オープンアームエントリ時間の割合、および高架式十字迷路のエントリの総数を計算した。実験が終わった後、マウスを取り出し、両腕をきれいにし、アルコールをスプレーして臭いを取り除いた。最後に、動物行動学ソフトウェアを使用してデータ分析を行った。
オープンアームエントリの割合＝オープンアームエントリの総数／オープンアームエントリとクローズアームエントリの合計である。その結果、ブランク対照群のマウスは一定のオープンアームエントリ率を有し、約１４．９％であり、溶媒群のマウスのオープンアームエントリ率は、約２３．０％と有意に増加し、投与群のマウスのオープンアームエントリ率は約１４．５％であり、溶媒群よりも有意に少なく、その差は統計学的に有意であり（Ｐ＝０．０１５）（図１５）、しかもブランク対照群に近かった。これは、プラスミノーゲンが多発性硬化症モデルマウスの不安行動をある程度緩和できることを示している。
【実施例16】
【0097】
実施例１６は、プラスミノーゲンが多発性硬化症モデルマウスの不安行動を緩和することに関するものである。
Ｃ５７メスマウス３０匹を取り、モデリング前に体重を測定し、体重に応じて異常なマウスを除外した後、すべてのマウスをランダムに２つの群に分け、ブランク対照群で８匹、モデル群で２２匹とした。群分けが完了した後、ブランク対照群に通常の維持食を与え、モデル群に０．６％ジシクロヘキサノンオキサリルジヒドラゾン（ＣＰＺ）（製造元：上海源葉生物科技有限公司；カタログ番号：Ｓ３０３４９）のモデリング飼料を４２日間連続して与え、多発性硬化症モデルを誘発した［１］。モデリングが完了した後、すべてのマウスをオープンフィールドテストでテストし、モデル群のマウスをテスト結果に従って群分けし、溶媒群で１１匹、投与群で１１匹とした。群分けが完了した後、すべてのマウスに投与を開始し、これを投与の１日目として記録し、ブランク対照群マウス及び溶媒群マウスに０．１ｍｌ／匹／日で溶媒を尾静脈注射により投与し、投与群マウスに１ｍｇ／匹／日でプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、２０日間連続投与した。投与期間中、すべてのマウスに通常の維持食（北京科澳協力有限公司から購入）を与えた。２１日目に高架式十字迷路実験を行った。
クローズアームエントリの割合＝クローズアームエントリの総数／オープンアームエントリとクローズアームエントリの合計である。その結果、ブランク対照群のマウスは一定のクローズアームエントリ率を有し、約３４．４％であり、溶媒群のマウスのクローズアームエントリ率は、約２８．１％と有意に低下し、投与群のマウスのクローズアームエントリ率は約３７．１％であり、溶媒群よりも有意に大きく、その差は統計学的に有意であり（Ｐ＝０．００７）（図１６）、しかもブランク対照群に近かった。これは、プラスミノーゲンが多発性硬化症モデルマウスの不安や抑うつ行動をある程度緩和できることを示している。
Ｃ５７メスマウス３０匹を取り、モデリング前に体重を測定し、体重に応じて異常なマウスを除外した後、すべてのマウスをランダムに２つの群に分け、ブランク対照群で８匹、モデル群で２２匹とした。群分けが完了した後、ブランク対照群に通常の維持食を与え、モデル群に０．６％ジシクロヘキサノンオキサリルジヒドラゾン（ＣＰＺ）（製造元：上海源葉生物科技有限公司；カタログ番号：Ｓ３０３４９）のモデリング飼料を４２日間連続して与え、多発性硬化症モデルを誘発した［１］。モデリングが完了した後、すべてのマウスをオープンフィールドテストでテストし、モデル群のマウスをテスト結果に従って群分けし、溶媒群で１１匹、投与群で１１匹とした。群分けが完了した後、すべてのマウスに投与を開始し、これを投与の１日目として記録し、ブランク対照群マウス及び溶媒群マウスに０．１ｍｌ／匹／日で溶媒を尾静脈注射により投与し、投与群マウスに１ｍｇ／匹／日でプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、２０日間連続投与した。投与期間中、すべてのマウスに通常の維持食（北京科澳協力有限公司から購入）を与えた。２１日目に高架式十字迷路実験を行った。
クローズアームエントリの割合＝クローズアームエントリの総数／オープンアームエントリとクローズアームエントリの合計である。その結果、ブランク対照群のマウスは一定のクローズアームエントリ率を有し、約３４．４％であり、溶媒群のマウスのクローズアームエントリ率は、約２８．１％と有意に低下し、投与群のマウスのクローズアームエントリ率は約３７．１％であり、溶媒群よりも有意に大きく、その差は統計学的に有意であり（Ｐ＝０．００７）（図１６）、しかもブランク対照群に近かった。これは、プラスミノーゲンが多発性硬化症モデルマウスの不安や抑うつ行動をある程度緩和できることを示している。
【実施例17】
【0098】
実施例１７は、プラスミノーゲンが多発性硬化症モデルマウスの不安や抑うつ行動を緩和することに関するものである。
Ｃ５７メスマウス３０匹を取り、モデリング前に体重を測定し、体重に応じて異常なマウスを除外した後、すべてのマウスをランダムに２つの群に分け、ブランク対照群で８匹、モデル群で２２匹とした。群分けが完了した後、ブランク対照群に通常の維持食（北京科澳協力有限公司から購入）を与え、モデル群に０．６％ジシクロヘキサノンオキサリルジヒドラゾン（ＣＰＺ）（製造元：上海源葉生物科技有限公司；カタログ番号：Ｓ３０３４９）のモデリング飼料を４２日間連続して与え、多発性硬化症モデルを誘発した［１］。モデリングが完了した後、すべてのマウスをオープンフィールドテストでテストし、モデル群のマウスをテスト結果に従って群分けし、溶媒群で１１匹、投与群で１１匹とした。群分けが完了した後、すべてのマウスに投与を開始し、これを投与の１日目として記録し、ブランク対照群マウス及び溶媒群マウスに０．１ｍｌ／匹／日で溶媒を尾静脈注射により投与し、投与群マウスに１ｍｇ／匹／日でプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、２７日間連続投与した。投与期間中、すべてのマウスに通常の維持食を与えた。２８日目に高架式十字迷路実験を行った。
クローズアームの移動の合計距離は、高架式十字迷路実験の試験時間中にマウスのクローズアームの移動の合計距離である。その結果、ブランク対照群のマウスは一定のクローズアーム移動の合計距離を有し、溶媒群のマウスのクローズアーム移動の合計距離が有意に増加し、投与群のマウスのクローズアーム移動の合計距離は溶媒群よりも有意に少なく、その差は統計学的に有意であり（＊はＰ＜０．０５を表す）（図１７）、ブランク対照群に近かった。これは、プラスミノーゲンが多発性硬化症モデルマウスの不安や抑うつ行動をある程度緩和できることを示している。
Ｃ５７メスマウス３０匹を取り、モデリング前に体重を測定し、体重に応じて異常なマウスを除外した後、すべてのマウスをランダムに２つの群に分け、ブランク対照群で８匹、モデル群で２２匹とした。群分けが完了した後、ブランク対照群に通常の維持食（北京科澳協力有限公司から購入）を与え、モデル群に０．６％ジシクロヘキサノンオキサリルジヒドラゾン（ＣＰＺ）（製造元：上海源葉生物科技有限公司；カタログ番号：Ｓ３０３４９）のモデリング飼料を４２日間連続して与え、多発性硬化症モデルを誘発した［１］。モデリングが完了した後、すべてのマウスをオープンフィールドテストでテストし、モデル群のマウスをテスト結果に従って群分けし、溶媒群で１１匹、投与群で１１匹とした。群分けが完了した後、すべてのマウスに投与を開始し、これを投与の１日目として記録し、ブランク対照群マウス及び溶媒群マウスに０．１ｍｌ／匹／日で溶媒を尾静脈注射により投与し、投与群マウスに１ｍｇ／匹／日でプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、２７日間連続投与した。投与期間中、すべてのマウスに通常の維持食を与えた。２８日目に高架式十字迷路実験を行った。
クローズアームの移動の合計距離は、高架式十字迷路実験の試験時間中にマウスのクローズアームの移動の合計距離である。その結果、ブランク対照群のマウスは一定のクローズアーム移動の合計距離を有し、溶媒群のマウスのクローズアーム移動の合計距離が有意に増加し、投与群のマウスのクローズアーム移動の合計距離は溶媒群よりも有意に少なく、その差は統計学的に有意であり（＊はＰ＜０．０５を表す）（図１７）、ブランク対照群に近かった。これは、プラスミノーゲンが多発性硬化症モデルマウスの不安や抑うつ行動をある程度緩和できることを示している。
【実施例18】
【0099】
実施例１８は、プラスミノーゲンが多発性硬化症モデルマウスの不安や抑うつ行動を緩和することに関するものである。
Ｃ５７メスマウス３０匹を取り、モデリング前に体重を測定し、体重に応じて異常なマウスを除外した後、すべてのマウスをランダムに２つの群に分け、ブランク対照群で８匹、モデル群で２２匹とした。群分けが完了した後、ブランク対照群に通常の維持食（北京科澳協力有限公司から購入）を与え、モデル群に０．６％ジシクロヘキサノンオキサリルジヒドラゾン（ＣＰＺ）（製造元：上海源葉生物科技有限公司；カタログ番号：Ｓ３０３４９）のモデリング飼料を４２日間連続して与え、多発性硬化症モデルを誘発した［１］。モデリングが完了した後、すべてのマウスをオープンフィールドテストでテストし、モデル群のマウスをテスト結果に従って群分けし、溶媒群で１１匹、投与群で１１匹とした。群分けが完了した後、すべてのマウスに投与を開始し、これを投与の１日目として記録し、ブランク対照群マウス及び溶媒群マウスに０．１ｍｌ／匹／日で溶媒を尾静脈注射により投与し、投与群マウスに１ｍｇ／匹／日でプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、２７日間連続投与した。投与期間中、すべてのマウスに通常の維持食を与えた。２８日目に高架式十字迷路実験を行った。
クローズアーム休憩時間の割合＝クローズアーム休憩時間／クローズアーム移動時間とクローズアーム休憩時間の合計である。その結果、ブランク対照群のマウスは一定のクローズアーム休憩時間の割合を有し、約５１．８％であり、溶媒群のマウスのクローズアーム休憩時間の割合は３６．８％と有意に低下し、投与群のマウスのクローズアーム休憩時間の割合は約５０．１％であり、溶媒群よりも有意に大きく、その差は統計学的に有意であり（＊はＰ＜０．０５を表す）（図１８）、ブランク対照群に近かった。これは、プラスミノーゲンが多発性硬化症モデルマウスの不安や抑うつ行動をある程度緩和できることを示している。
参考文献：
1. M. Lindner, S. Heine, K. Haastert, Sequential myelin protein expression during remyelination reveals fast and efficient repair after central nervous system demyelination， Neuropathology and Applied Neurobiology (2008), 34, 105-114.
2. Tuohy VK1, Lu Z, Sobel RA, Laursen RA et al. Identification of an encephalitogenic determinant of myelin proteolipid protein for SJL mice. J Immunol. 1989 Mar 1;142(5):1523-7.
3. Gotow T.Neurofilaments in health and disease. Med Electron Microsc. 2000;33(4):173-99.
4. Ahmed Z , Shaw G , Sharma V P , et al. Actin-binding Proteins Coronin-1a and IBA-1 Are Effective Microglial Markers for Immunohistochemistry[J]. Journal of Histochemistry and Cytochemistry, 2007, 55(7):687-700.
5. Kowianski, Przemys?aw, Lietzau G , Czuba E , et al. BDNF: A Key Factor with Multipotent Impact on Brain Signaling and Synaptic Plasticity[J]. Cellular & Molecular Neurobiology, 2017.
6. Hol E M, Pekny M. Glial fibrillary acidic protein (GFAP) and the astrocyte intermediate filament system in diseases of the central nervous system.[J]. Current Opinion in Cell Biology, 2015, 32(1):121-130.
7. Murphy R, O'Donoghue S, Counihan T, McDonald C, Calabresi PA, Ahmed MA, Kaplin A, Hallahan B. Neuropsychiatric syndromes of multiple sclerosis. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 2017 Aug;88(8):697-708.
8. Hirahara Y , Matsuda K I , Yamada H , et al. G protein-coupled receptor 30 contributes to improved remyelination after cuprizone-induced demyelination[J]. Glia, 2013, 61(3):420-431.
9. Di Biase A , Salvati S , Di Benedetto R , et al. Eicosapentaenoic acid pre-treatment reduces biochemical changes induced in total brain and myelin of weanling Wistar rats by cuprizone feeding[J]. Prostaglandins, Leukotrienes and Essential Fatty Acids (PLEFA), 2014, 90(4):99-104.
58(1-2):40.
配列表
配列１：
ｇａｇｃｃｔｃｔｇｇａｔｇａｃｔａｔｇｔｇａａｔａｃｃｃａｇｇｇｇｇｃｔｔｃａｃｔｇｔｔｃａｇｔｇｔｃａｃｔａａｇａａｇｃａｇｃｔｇｇｇａｇｃａｇｇａａｇｔａｔａｇａａｇａａｔｇｔｇｃａｇｃａａａａｔｇｔｇａｇｇａｇｇａｃｇａａｇａａｔｔｃａｃｃｔｇｃａｇｇｇｃａｔｔｃｃａａｔａｔｃａｃａｇｔａａａｇａｇｃａａｃａａｔｇｔｇｔｇａｔａａｔｇｇｃｔｇａａａａｃａｇｇａａｇｔｃｃｔｃｃａｔａａｔｃａｔｔａｇｇａｔｇａｇａｇａｔｇｔａｇｔｔｔｔａｔｔｔｇａａａａｇａａａｇｔｇｔａｔｃｔｃｔｃａｇａｇｔｇｃａａｇａｃｔｇｇｇａａｔｇｇａａａｇａａｃｔａｃａｇａｇｇｇａｃｇａｔｇｔｃｃａａａａｃａａａａａａｔｇｇｃａｔｃａｃｃｔｇｔｃａａａａａｔｇｇａｇｔｔｃｃａｃｔｔｃｔｃｃｃｃａｃａｇａｃｃｔａｇａｔｔｃｔｃａｃｃｔｇｃｔａｃａｃａｃｃｃｃｔｃａｇａｇｇｇａｃｔｇｇａｇｇａｇａａｃｔａｃｔｇｃａｇｇａａｔｃｃａｇａｃａａｃｇａｔｃｃｇｃａｇｇｇｇｃｃｃｔｇｇｔｇｃｔａｔａｃｔａｃｔｇａｔｃｃａｇａａａａｇａｇａｔａｔｇａｃｔａｃｔｇｃｇａｃａｔｔｃｔｔｇａｇｔｇｔｇａａｇａｇｇａａｔｇｔａｔｇｃａｔｔｇｃａｇｔｇｇａｇａａａａｃｔａｔｇａｃｇｇｃａａａａｔｔｔｃｃａａｇａｃｃａｔｇｔｃｔｇｇａｃｔｇｇａａｔｇｃｃａｇｇｃｃｔｇｇｇａｃｔｃｔｃａｇａｇｃｃｃａｃａｃｇｃｔｃａｔｇｇａｔａｃａｔｔｃｃｔｔｃｃａａａｔｔｔｃｃａａａｃａａｇａａｃｃｔｇａａｇａａｇａａｔｔａｃｔｇｔｃｇｔａａｃｃｃｃｇａｔａｇｇｇａｇｃｔｇｃｇｇｃｃｔｔｇｇｔｇｔｔｔｃａｃｃａｃｃｇａｃｃｃｃａａｃａａｇｃｇｃｔｇｇｇａａｃｔｔｔｇｔｇａｃａｔｃｃｃｃｃｇｃｔｇｃａｃａａｃａｃｃｔｃｃａｃｃａｔｃｔｔｃｔｇｇｔｃｃｃａｃｃｔａｃｃａｇｔｇｔｃｔｇａａｇｇｇａａｃａｇｇｔｇａａａａｃｔａｔｃｇｃｇｇｇａａｔｇｔｇｇｃｔｇｔｔａｃｃｇｔｇｔｃｃｇｇｇｃａｃａｃｃｔｇｔｃａｇｃａｃｔｇｇａｇｔｇｃａｃａｇａｃｃｃｃｔｃａｃａｃａｃａｔａａｃａｇｇａｃａｃｃａｇａａａａｃｔｔｃｃｃｃｔｇｃａａａａａｔｔｔｇｇａｔｇａａａａｃｔａｃｔｇｃｃｇｃａａｔｃｃｔｇａｃｇｇａａａａａｇｇｇｃｃｃｃａｔｇｇｔｇｃｃａｔａｃａａｃｃａａｃａｇｃｃａａｇｔｇｃｇｇｔｇｇｇａｇｔａｃｔｇｔａａｇａｔａｃｃｇｔｃｃｔｇｔｇａｃｔｃｃｔｃｃｃｃａｇｔａｔｃｃａｃｇｇａａｃａａｔｔｇｇｃｔｃｃｃａｃａｇｃａｃｃａｃｃｔｇａｇｃｔａａｃｃｃｃｔｇｔｇｇｔｃｃａｇｇａｃｔｇｃｔａｃｃａｔｇｇｔｇａｔｇｇａｃａｇａｇｃｔａｃｃｇａｇｇｃａｃａｔｃｃｔｃｃａｃｃａｃｃａｃｃａｃａｇｇａａａｇａａｇｔｇｔｃａｇｔｃｔｔｇｇｔｃａｔｃｔａｔｇａｃａｃｃａｃａｃｃｇｇｃａｃｃａｇａａｇａｃｃｃｃａｇａａａａｃｔａｃｃｃａａａｔｇｃｔｇｇｃｃｔｇａｃａａｔｇａａｃｔａｃｔｇｃａｇｇａａｔｃｃａｇａｔｇｃｃｇａｔａａａｇｇｃｃｃｃｔｇｇｔｇｔｔｔｔａｃｃａｃａｇａｃｃｃｃａｇｃｇｔｃａｇｇｔｇｇｇａｇｔａｃｔｇｃａａｃｃｔｇａａａａａａｔｇｃｔｃａｇｇａａｃａｇａａｇｃｇａｇｔｇｔｔｇｔａｇｃａｃｃｔｃｃｇｃｃｔｇｔｔｇｔｃｃｔｇｃｔｔｃｃａｇａｔｇｔａｇａｇａｃｔｃｃｔｔｃｃｇａａｇａａｇａｃｔｇｔａｔｇｔｔｔｇｇｇａａｔｇｇｇａａａｇｇａｔａｃｃｇａｇｇｃａａｇａｇｇｇｃｇａｃｃａｃｔｇｔｔａｃｔｇｇｇａｃｇｃｃａｔｇｃｃａｇｇａｃｔｇｇｇｃｔｇｃｃｃａｇｇａｇｃｃｃｃａｔａｇａｃａｃａｇｃａｔｔｔｔｃａｃｔｃｃａｇａｇａｃａａａｔｃｃａｃｇｇｇｃｇｇｇｔｃｔｇｇａａａａａａａｔｔａｃｔｇｃｃｇｔａａｃｃｃｔｇａｔｇｇｔｇａｔｇｔａｇｇｔｇｇｔｃｃｃｔｇｇｔｇｃｔａｃａｃｇａｃａａａｔｃｃａａｇａａａａｃｔｔｔａｃｇａｃｔａｃｔｇｔｇａｔｇｔｃｃｃｔｃａｇｔｇｔｇｃｇｇｃｃｃｃｔｔｃａｔｔｔｇａｔｔｇｔｇｇｇａａｇｃｃｔｃａａｇｔｇｇａｇｃｃｇａａｇａａａｔｇｔｃｃｔｇｇａａｇｇｇｔｔｇｔａｇｇｇｇｇｇｔｇｔｇｔｇｇｃｃｃａｃｃｃａｃａｔｔｃｃｔｇｇｃｃｃｔｇｇｃａａｇｔｃａｇｔｃｔｔａｇａａｃａａｇｇｔｔｔｇｇａａｔｇｃａｃｔｔｃｔｇｔｇｇａｇｇｃａｃｃｔｔｇａｔａｔｃｃｃｃａｇａｇｔｇｇｇｔｇｔｔｇａｃｔｇｃｔｇｃｃｃａｃｔｇｃｔｔｇｇａｇａａｇｔｃｃｃｃａａｇｇｃｃｔｔｃａｔｃｃｔａｃａａｇｇｔｃａｔｃｃｔｇｇｇｔｇｃａｃａｃｃａａｇａａｇｔｇａａｔｃｔｃｇａａｃｃｇｃａｔｇｔｔｃａｇｇａａａｔａｇａａｇｔｇｔｃｔａｇｇｃｔｇｔｔｃｔｔｇｇａｇｃｃｃａｃａｃｇａａａａｇａｔａｔｔｇｃｃｔｔｇｃｔａａａｇｃｔａａｇｃａｇｔｃｃｔｇｃｃｇｔｃａｔｃａｃｔｇａｃａａａｇｔａａｔｃｃｃａｇｃｔｔｇｔｃｔｇｃｃａｔｃｃｃｃａａａｔｔａｔｇｔｇｇｔｃｇｃｔｇａｃｃｇｇａｃｃｇａａｔｇｔｔｔｃａｔｃａｃｔｇｇｃｔｇｇｇｇａｇａａａｃｃｃａａｇｇｔａｃｔｔｔｔｇｇａｇｃｔｇｇｃｃｔｔｃｔｃａａｇｇａａｇｃｃｃａｇｃｔｃｃｃｔｇｔｇａｔｔｇａｇａａｔａａａｇｔｇｔｇｃａａｔｃｇｃｔａｔｇａｇｔｔｔｃｔｇａａｔｇｇａａｇａｇｔｃｃａａｔｃｃａｃｃｇａａｃｔｃｔｇｔｇｃｔｇｇｇｃａｔｔｔｇｇｃｃｇｇａｇｇｃａｃｔｇａｃａｇｔｔｇｃｃａｇｇｇｔｇａｃａｇｔｇｇａｇｇｔｃｃｔｃｔｇｇｔｔｔｇｃｔｔｃｇａｇａａｇｇａｃａａａｔａｃａｔｔｔｔａｃａａｇｇａｇｔｃａｃｔｔｃｔｔｇｇｇｇｔｃｔｔｇｇｃｔｇｔｇｃａｃｇｃｃｃｃａａｔａａｇｃｃｔｇｇｔｇｔｃｔａｔｇｔｔｃｇｔｇｔｔｔｃａａｇｇｔｔｔｇｔｔａｃｔｔｇｇａｔｔｇａｇｇｇａｇｔｇａｔｇａｇａａａｔａａｔｔａａ
配列２：
ＥＰＬＤＤＹＶＮＴＱＧＡＳＬＦＳＶＴＫＫＱＬＧＡＧＳＩＥＥＣＡＡＫＣＥＥＤＥＥＦＴＣＲＡＦＱＹＨＳＫＥＱＱＣＶＩＭＡＥＮＲＫＳＳＩＩＩＲＭＲＤＶＶＬＦＥＫＫＶＹＬＳＥＣＫＴＧＮＧＫＮＹＲＧＴＭＳＫＴＫＮＧＩＴＣＱＫＷＳＳＴＳＰＨＲＰＲＦＳＰＡＴＨＰＳＥＧＬＥＥＮＹＣＲＮＰＤＮＤＰＱＧＰＷＣＹＴＴＤＰＥＫＲＹＤＹＣＤＩＬＥＣＥＥＥＣＭＨＣＳＧＥＮＹＤＧＫＩＳＫＴＭＳＧＬＥＣＱＡＷＤＳＱＳＰＨＡＨＧＹＩＰＳＫＦＰＮＫＮＬＫＫＮＹＣＲＮＰＤＲＥＬＲＰＷＣＦＴＴＤＰＮＫＲＷＥＬＣＤＩＰＲＣＴＴＰＰＰＳＳＧＰＴＹＱＣＬＫＧＴＧＥＮＹＲＧＮＶＡＶＴＶＳＧＨＴＣＱＨＷＳＡＱＴＰＨＴＨＮＲＴＰＥＮＦＰＣＫＮＬＤＥＮＹＣＲＮＰＤＧＫＲＡＰＷＣＨＴＴＮＳＱＶＲＷＥＹＣＫＩＰＳＣＤＳＳＰＶＳＴＥＱＬＡＰＴＡＰＰＥＬＴＰＶＶＱＤＣＹＨＧＤＧＱＳＹＲＧＴＳＳＴＴＴＴＧＫＫＣＱＳＷＳＳＭＴＰＨＲＨＱＫＴＰＥＮＹＰＮＡＧＬＴＭＮＹＣＲＮＰＤＡＤＫＧＰＷＣＦＴＴＤＰＳＶＲＷＥＹＣＮＬＫＫＣＳＧＴＥＡＳＶＶＡＰＰＰＶＶＬＬＰＤＶＥＴＰＳＥＥＤＣＭＦＧＮＧＫＧＹＲＧＫＲＡＴＴＶＴＧＴＰＣＱＤＷＡＡＱＥＰＨＲＨＳＩＦＴＰＥＴＮＰＲＡＧＬＥＫＮＹＣＲＮＰＤＧＤＶＧＧＰＷＣＹＴＴＮＰＲＫＬＹＤＹＣＤＶＰＱＣＡＡＰＳＦＤＣＧＫＰＱＶＥＰＫＫＣＰＧＲＶＶＧＧＣＶＡＨＰＨＳＷＰＷＱＶＳＬＲＴＲＦＧＭＨＦＣＧＧＴＬＩＳＰＥＷＶＬＴＡＡＨＣＬＥＫＳＰＲＰＳＳＹＫＶＩＬＧＡＨＱＥＶＮＬＥＰＨＶＱＥＩＥＶＳＲＬＦＬＥＰＴＲＫＤＩＡＬＬＫＬＳＳＰＡＶＩＴＤＫＶＩＰＡＣＬＰＳＰＮＹＶＶＡＤＲＴＥＣＦＩＴＧＷＧＥＴＱＧＴＦＧＡＧＬＬＫＥＡＱＬＰＶＩＥＮＫＶＣＮＲＹＥＦＬＮＧＲＶＱＳＴＥＬＣＡＧＨＬＡＧＧＴＤＳＣＱＧＤＳＧＧＰＬＶＣＦＥＫＤＫＹＩＬＱＧＶＴＳＷＧＬＧＣＡＲＰＮＫＰＧＶＹＶＲＶＳＲＦＶＴＷＩＥＧＶＭＲＮＮ
配列３：
ａｔｇｇａａｃａｔａａｇｇａａｇｔｇｇｔｔｃｔｔｃｔａｃｔｔｃｔｔｔｔａｔｔｔｃｔｇａａａｔｃａｇｇｔｃａａｇｇａｇａｇｃｃｔｃｔｇｇａｔｇａｃｔａｔｇｔｇａａｔａｃｃｃａｇｇｇｇｇｃｔｔｃａｃｔｇｔｔｃａｇｔｇｔｃａｃｔａａｇａａｇｃａｇｃｔｇｇｇａｇｃａｇｇａａｇｔａｔａｇａａｇａａｔｇｔｇｃａｇｃａａａａｔｇｔｇａｇｇａｇｇａｃｇａａｇａａｔｔｃａｃｃｔｇｃａｇｇｇｃａｔｔｃｃａａｔａｔｃａｃａｇｔａａａｇａｇｃａａｃａａｔｇｔｇｔｇａｔａａｔｇｇｃｔｇａａａａｃａｇｇａａｇｔｃｃｔｃｃａｔａａｔｃａｔｔａｇｇａｔｇａｇａｇａｔｇｔａｇｔｔｔｔａｔｔｔｇａａａａｇａａａｇｔｇｔａｔｃｔｃｔｃａｇａｇｔｇｃａａｇａｃｔｇｇｇａａｔｇｇａａａｇａａｃｔａｃａｇａｇｇｇａｃｇａｔｇｔｃｃａａａａｃａａａａａａｔｇｇｃａｔｃａｃｃｔｇｔｃａａａａａｔｇｇａｇｔｔｃｃａｃｔｔｃｔｃｃｃｃａｃａｇａｃｃｔａｇａｔｔｃｔｃａｃｃｔｇｃｔａｃａｃａｃｃｃｃｔｃａｇａｇｇｇａｃｔｇｇａｇｇａｇａａｃｔａｃｔｇｃａｇｇａａｔｃｃａｇａｃａａｃｇａｔｃｃｇｃａｇｇｇｇｃｃｃｔｇｇｔｇｃｔａｔａｃｔａｃｔｇａｔｃｃａｇａａａａｇａｇａｔａｔｇａｃｔａｃｔｇｃｇａｃａｔｔｃｔｔｇａｇｔｇｔｇａａｇａｇｇａａｔｇｔａｔｇｃａｔｔｇｃａｇｔｇｇａｇａａａａｃｔａｔｇａｃｇｇｃａａａａｔｔｔｃｃａａｇａｃｃａｔｇｔｃｔｇｇａｃｔｇｇａａｔｇｃｃａｇｇｃｃｔｇｇｇａｃｔｃｔｃａｇａｇｃｃｃａｃａｃｇｃｔｃａｔｇｇａｔａｃａｔｔｃｃｔｔｃｃａａａｔｔｔｃｃａａａｃａａｇａａｃｃｔｇａａｇａａｇａａｔｔａｃｔｇｔｃｇｔａａｃｃｃｃｇａｔａｇｇｇａｇｃｔｇｃｇｇｃｃｔｔｇｇｔｇｔｔｔｃａｃｃａｃｃｇａｃｃｃｃａａｃａａｇｃｇｃｔｇｇｇａａｃｔｔｔｇｔｇａｃａｔｃｃｃｃｃｇｃｔｇｃａｃａａｃａｃｃｔｃｃａｃｃａｔｃｔｔｃｔｇｇｔｃｃｃａｃｃｔａｃｃａｇｔｇｔｃｔｇａａｇｇｇａａｃａｇｇｔｇａａａａｃｔａｔｃｇｃｇｇｇａａｔｇｔｇｇｃｔｇｔｔａｃｃｇｔｇｔｃｃｇｇｇｃａｃａｃｃｔｇｔｃａｇｃａｃｔｇｇａｇｔｇｃａｃａｇａｃｃｃｃｔｃａｃａｃａｃａｔａａｃａｇｇａｃａｃｃａｇａａａａｃｔｔｃｃｃｃｔｇｃａａａａａｔｔｔｇｇａｔｇａａａａｃｔａｃｔｇｃｃｇｃａａｔｃｃｔｇａｃｇｇａａａａａｇｇｇｃｃｃｃａｔｇｇｔｇｃｃａｔａｃａａｃｃａａｃａｇｃｃａａｇｔｇｃｇｇｔｇｇｇａｇｔａｃｔｇｔａａｇａｔａｃｃｇｔｃｃｔｇｔｇａｃｔｃｃｔｃｃｃｃａｇｔａｔｃｃａｃｇｇａａｃａａｔｔｇｇｃｔｃｃｃａｃａｇｃａｃｃａｃｃｔｇａｇｃｔａａｃｃｃｃｔｇｔｇｇｔｃｃａｇｇａｃｔｇｃｔａｃｃａｔｇｇｔｇａｔｇｇａｃａｇａｇｃｔａｃｃｇａｇｇｃａｃａｔｃｃｔｃｃａｃｃａｃｃａｃｃａｃａｇｇａａａｇａａｇｔｇｔｃａｇｔｃｔｔｇｇｔｃａｔｃｔａｔｇａｃａｃｃａｃａｃｃｇｇｃａｃｃａｇａａｇａｃｃｃｃａｇａａａａｃｔａｃｃｃａａａｔｇｃｔｇｇｃｃｔｇａｃａａｔｇａａｃｔａｃｔｇｃａｇｇａａｔｃｃａｇａｔｇｃｃｇａｔａａａｇｇｃｃｃｃｔｇｇｔｇｔｔｔｔａｃｃａｃａｇａｃｃｃｃａｇｃｇｔｃａｇｇｔｇｇｇａｇｔａｃｔｇｃａａｃｃｔｇａａａａａａｔｇｃｔｃａｇｇａａｃａｇａａｇｃｇａｇｔｇｔｔｇｔａｇｃａｃｃｔｃｃｇｃｃｔｇｔｔｇｔｃｃｔｇｃｔｔｃｃａｇａｔｇｔａｇａｇａｃｔｃｃｔｔｃｃｇａａｇａａｇａｃｔｇｔａｔｇｔｔｔｇｇｇａａｔｇｇｇａａａｇｇａｔａｃｃｇａｇｇｃａａｇａｇｇｇｃｇａｃｃａｃｔｇｔｔａｃｔｇｇｇａｃｇｃｃａｔｇｃｃａｇｇａｃｔｇｇｇｃｔｇｃｃｃａｇｇａｇｃｃｃｃａｔａｇａｃａｃａｇｃａｔｔｔｔｃａｃｔｃｃａｇａｇａｃａａａｔｃｃａｃｇｇｇｃｇｇｇｔｃｔｇｇａａａａａａａｔｔａｃｔｇｃｃｇｔａａｃｃｃｔｇａｔｇｇｔｇａｔｇｔａｇｇｔｇｇｔｃｃｃｔｇｇｔｇｃｔａｃａｃｇａｃａａａｔｃｃａａｇａａａａｃｔｔｔａｃｇａｃｔａｃｔｇｔｇａｔｇｔｃｃｃｔｃａｇｔｇｔｇｃｇｇｃｃｃｃｔｔｃａｔｔｔｇａｔｔｇｔｇｇｇａａｇｃｃｔｃａａｇｔｇｇａｇｃｃｇａａｇａａａｔｇｔｃｃｔｇｇａａｇｇｇｔｔｇｔａｇｇｇｇｇｇｔｇｔｇｔｇｇｃｃｃａｃｃｃａｃａｔｔｃｃｔｇｇｃｃｃｔｇｇｃａａｇｔｃａｇｔｃｔｔａｇａａｃａａｇｇｔｔｔｇｇａａｔｇｃａｃｔｔｃｔｇｔｇｇａｇｇｃａｃｃｔｔｇａｔａｔｃｃｃｃａｇａｇｔｇｇｇｔｇｔｔｇａｃｔｇｃｔｇｃｃｃａｃｔｇｃｔｔｇｇａｇａａｇｔｃｃｃｃａａｇｇｃｃｔｔｃａｔｃｃｔａｃａａｇｇｔｃａｔｃｃｔｇｇｇｔｇｃａｃａｃｃａａｇａａｇｔｇａａｔｃｔｃｇａａｃｃｇｃａｔｇｔｔｃａｇｇａａａｔａｇａａｇｔｇｔｃｔａｇｇｃｔｇｔｔｃｔｔｇｇａｇｃｃｃａｃａｃｇａａａａｇａｔａｔｔｇｃｃｔｔｇｃｔａａａｇｃｔａａｇｃａｇｔｃｃｔｇｃｃｇｔｃａｔｃａｃｔｇａｃａａａｇｔａａｔｃｃｃａｇｃｔｔｇｔｃｔｇｃｃａｔｃｃｃｃａａａｔｔａｔｇｔｇｇｔｃｇｃｔｇａｃｃｇｇａｃｃｇａａｔｇｔｔｔｃａｔｃａｃｔｇｇｃｔｇｇｇｇａｇａａａｃｃｃａａｇｇｔａｃｔｔｔｔｇｇａｇｃｔｇｇｃｃｔｔｃｔｃａａｇｇａａｇｃｃｃａｇｃｔｃｃｃｔｇｔｇａｔｔｇａｇａａｔａａａｇｔｇｔｇｃａａｔｃｇｃｔａｔｇａｇｔｔｔｃｔｇａａｔｇｇａａｇａｇｔｃｃａａｔｃｃａｃｃｇａａｃｔｃｔｇｔｇｃｔｇｇｇｃａｔｔｔｇｇｃｃｇｇａｇｇｃａｃｔｇａｃａｇｔｔｇｃｃａｇｇｇｔｇａｃａｇｔｇｇａｇｇｔｃｃｔｃｔｇｇｔｔｔｇｃｔｔｃｇａｇａａｇｇａｃａａａｔａｃａｔｔｔｔａｃａａｇｇａｇｔｃａｃｔｔｃｔｔｇｇｇｇｔｃｔｔｇｇｃｔｇｔｇｃａｃｇｃｃｃｃａａｔａａｇｃｃｔｇｇｔｇｔｃｔａｔｇｔｔｃｇｔｇｔｔｔｃａａｇｇｔｔｔｇｔｔａｃｔｔｇｇａｔｔｇａｇｇｇａｇｔｇａｔｇａｇａａａｔａａｔｔａａ
配列４：
ＭＥＨＫＥＶＶＬＬＬＬＬＦＬＫＳＧＱＧＥＰＬＤＤＹＶＮＴＱＧＡＳＬＦＳＶＴＫＫＱＬＧＡＧＳＩＥＥＣＡＡＫＣＥＥＤＥＥＦＴＣＲＡＦＱＹＨＳＫＥＱＱＣＶＩＭＡＥＮＲＫＳＳＩＩＩＲＭＲＤＶＶＬＦＥＫＫＶＹＬＳＥＣＫＴＧＮＧＫＮＹＲＧＴＭＳＫＴＫＮＧＩＴＣＱＫＷＳＳＴＳＰＨＲＰＲＦＳＰＡＴＨＰＳＥＧＬＥＥＮＹＣＲＮＰＤＮＤＰＱＧＰＷＣＹＴＴＤＰＥＫＲＹＤＹＣＤＩＬＥＣＥＥＥＣＭＨＣＳＧＥＮＹＤＧＫＩＳＫＴＭＳＧＬＥＣＱＡＷＤＳＱＳＰＨＡＨＧＹＩＰＳＫＦＰＮＫＮＬＫＫＮＹＣＲＮＰＤＲＥＬＲＰＷＣＦＴＴＤＰＮＫＲＷＥＬＣＤＩＰＲＣＴＴＰＰＰＳＳＧＰＴＹＱＣＬＫＧＴＧＥＮＹＲＧＮＶＡＶＴＶＳＧＨＴＣＱＨＷＳＡＱＴＰＨＴＨＮＲＴＰＥＮＦＰＣＫＮＬＤＥＮＹＣＲＮＰＤＧＫＲＡＰＷＣＨＴＴＮＳＱＶＲＷＥＹＣＫＩＰＳＣＤＳＳＰＶＳＴＥＱＬＡＰＴＡＰＰＥＬＴＰＶＶＱＤＣＹＨＧＤＧＱＳＹＲＧＴＳＳＴＴＴＴＧＫＫＣＱＳＷＳＳＭＴＰＨＲＨＱＫＴＰＥＮＹＰＮＡＧＬＴＭＮＹＣＲＮＰＤＡＤＫＧＰＷＣＦＴＴＤＰＳＶＲＷＥＹＣＮＬＫＫＣＳＧＴＥＡＳＶＶＡＰＰＰＶＶＬＬＰＤＶＥＴＰＳＥＥＤＣＭＦＧＮＧＫＧＹＲＧＫＲＡＴＴＶＴＧＴＰＣＱＤＷＡＡＱＥＰＨＲＨＳＩＦＴＰＥＴＮＰＲＡＧＬＥＫＮＹＣＲＮＰＤＧＤＶＧＧＰＷＣＹＴＴＮＰＲＫＬＹＤＹＣＤＶＰＱＣＡＡＰＳＦＤＣＧＫＰＱＶＥＰＫＫＣＰＧＲＶＶＧＧＣＶＡＨＰＨＳＷＰＷＱＶＳＬＲＴＲＦＧＭＨＦＣＧＧＴＬＩＳＰＥＷＶＬＴＡＡＨＣＬＥＫＳＰＲＰＳＳＹＫＶＩＬＧＡＨＱＥＶＮＬＥＰＨＶＱＥＩＥＶＳＲＬＦＬＥＰＴＲＫＤＩＡＬＬＫＬＳＳＰＡＶＩＴＤＫＶＩＰＡＣＬＰＳＰＮＹＶＶＡＤＲＴＥＣＦＩＴＧＷＧＥＴＱＧＴＦＧＡＧＬＬＫＥＡＱＬＰＶＩＥＮＫＶＣＮＲＹＥＦＬＮＧＲＶＱＳＴＥＬＣＡＧＨＬＡＧＧＴＤＳＣＱＧＤＳＧＧＰＬＶＣＦＥＫＤＫＹＩＬＱＧＶＴＳＷＧＬＧＣＡＲＰＮＫＰＧＶＹＶＲＶＳＲＦＶＴＷＩＥＧＶＭＲＮＮ
配列５：
ａａａｇｔｇｔａｔｃｔｃｔｃａｇａｇｔｇｃａａｇａｃｔｇｇｇａａｔｇｇａａａｇａａｃｔａｃａｇａｇｇｇａｃｇａｔｇｔｃｃａａａａｃａａａａａａｔｇｇｃａｔｃａｃｃｔｇｔｃａａａａａｔｇｇａｇｔｔｃｃａｃｔｔｃｔｃｃｃｃａｃａｇａｃｃｔａｇａｔｔｃｔｃａｃｃｔｇｃｔａｃａｃａｃｃｃｃｔｃａｇａｇｇｇａｃｔｇｇａｇｇａｇａａｃｔａｃｔｇｃａｇｇａａｔｃｃａｇａｃａａｃｇａｔｃｃｇｃａｇｇｇｇｃｃｃｔｇｇｔｇｃｔａｔａｃｔａｃｔｇａｔｃｃａｇａａａａｇａｇａｔａｔｇａｃｔａｃｔｇｃｇａｃａｔｔｃｔｔｇａｇｔｇｔｇａａｇａｇｇａａｔｇｔａｔｇｃａｔｔｇｃａｇｔｇｇａｇａａａａｃｔａｔｇａｃｇｇｃａａａａｔｔｔｃｃａａｇａｃｃａｔｇｔｃｔｇｇａｃｔｇｇａａｔｇｃｃａｇｇｃｃｔｇｇｇａｃｔｃｔｃａｇａｇｃｃｃａｃａｃｇｃｔｃａｔｇｇａｔａｃａｔｔｃｃｔｔｃｃａａａｔｔｔｃｃａａａｃａａｇａａｃｃｔｇａａｇａａｇａａｔｔａｃｔｇｔｃｇｔａａｃｃｃｃｇａｔａｇｇｇａｇｃｔｇｃｇｇｃｃｔｔｇｇｔｇｔｔｔｃａｃｃａｃｃｇａｃｃｃｃａａｃａａｇｃｇｃｔｇｇｇａａｃｔｔｔｇｔｇａｃａｔｃｃｃｃｃｇｃｔｇｃａｃａａｃａｃｃｔｃｃａｃｃａｔｃｔｔｃｔｇｇｔｃｃｃａｃｃｔａｃｃａｇｔｇｔｃｔｇａａｇｇｇａａｃａｇｇｔｇａａａａｃｔａｔｃｇｃｇｇｇａａｔｇｔｇｇｃｔｇｔｔａｃｃｇｔｇｔｃｃｇｇｇｃａｃａｃｃｔｇｔｃａｇｃａｃｔｇｇａｇｔｇｃａｃａｇａｃｃｃｃｔｃａｃａｃａｃａｔａａｃａｇｇａｃａｃｃａｇａａａａｃｔｔｃｃｃｃｔｇｃａａａａａｔｔｔｇｇａｔｇａａａａｃｔａｃｔｇｃｃｇｃａａｔｃｃｔｇａｃｇｇａａａａａｇｇｇｃｃｃｃａｔｇｇｔｇｃｃａｔａｃａａｃｃａａｃａｇｃｃａａｇｔｇｃｇｇｔｇｇｇａｇｔａｃｔｇｔａａｇａｔａｃｃｇｔｃｃｔｇｔｇａｃｔｃｃｔｃｃｃｃａｇｔａｔｃｃａｃｇｇａａｃａａｔｔｇｇｃｔｃｃｃａｃａｇｃａｃｃａｃｃｔｇａｇｃｔａａｃｃｃｃｔｇｔｇｇｔｃｃａｇｇａｃｔｇｃｔａｃｃａｔｇｇｔｇａｔｇｇａｃａｇａｇｃｔａｃｃｇａｇｇｃａｃａｔｃｃｔｃｃａｃｃａｃｃａｃｃａｃａｇｇａａａｇａａｇｔｇｔｃａｇｔｃｔｔｇｇｔｃａｔｃｔａｔｇａｃａｃｃａｃａｃｃｇｇｃａｃｃａｇａａｇａｃｃｃｃａｇａａａａｃｔａｃｃｃａａａｔｇｃｔｇｇｃｃｔｇａｃａａｔｇａａｃｔａｃｔｇｃａｇｇａａｔｃｃａｇａｔｇｃｃｇａｔａａａｇｇｃｃｃｃｔｇｇｔｇｔｔｔｔａｃｃａｃａｇａｃｃｃｃａｇｃｇｔｃａｇｇｔｇｇｇａｇｔａｃｔｇｃａａｃｃｔｇａａａａａａｔｇｃｔｃａｇｇａａｃａｇａａｇｃｇａｇｔｇｔｔｇｔａｇｃａｃｃｔｃｃｇｃｃｔｇｔｔｇｔｃｃｔｇｃｔｔｃｃａｇａｔｇｔａｇａｇａｃｔｃｃｔｔｃｃｇａａｇａａｇａｃｔｇｔａｔｇｔｔｔｇｇｇａａｔｇｇｇａａａｇｇａｔａｃｃｇａｇｇｃａａｇａｇｇｇｃｇａｃｃａｃｔｇｔｔａｃｔｇｇｇａｃｇｃｃａｔｇｃｃａｇｇａｃｔｇｇｇｃｔｇｃｃｃａｇｇａｇｃｃｃｃａｔａｇａｃａｃａｇｃａｔｔｔｔｃａｃｔｃｃａｇａｇａｃａａａｔｃｃａｃｇｇｇｃｇｇｇｔｃｔｇｇａａａａａａａｔｔａｃｔｇｃｃｇｔａａｃｃｃｔｇａｔｇｇｔｇａｔｇｔａｇｇｔｇｇｔｃｃｃｔｇｇｔｇｃｔａｃａｃｇａｃａａａｔｃｃａａｇａａａａｃｔｔｔａｃｇａｃｔａｃｔｇｔｇａｔｇｔｃｃｃｔｃａｇｔｇｔｇｃｇｇｃｃｃｃｔｔｃａｔｔｔｇａｔｔｇｔｇｇｇａａｇｃｃｔｃａａｇｔｇｇａｇｃｃｇａａｇａａａｔｇｔｃｃｔｇｇａａｇｇｇｔｔｇｔａｇｇｇｇｇｇｔｇｔｇｔｇｇｃｃｃａｃｃｃａｃａｔｔｃｃｔｇｇｃｃｃｔｇｇｃａａｇｔｃａｇｔｃｔｔａｇａａｃａａｇｇｔｔｔｇｇａａｔｇｃａｃｔｔｃｔｇｔｇｇａｇｇｃａｃｃｔｔｇａｔａｔｃｃｃｃａｇａｇｔｇｇｇｔｇｔｔｇａｃｔｇｃｔｇｃｃｃａｃｔｇｃｔｔｇｇａｇａａｇｔｃｃｃｃａａｇｇｃｃｔｔｃａｔｃｃｔａｃａａｇｇｔｃａｔｃｃｔｇｇｇｔｇｃａｃａｃｃａａｇａａｇｔｇａａｔｃｔｃｇａａｃｃｇｃａｔｇｔｔｃａｇｇａａａｔａｇａａｇｔｇｔｃｔａｇｇｃｔｇｔｔｃｔｔｇｇａｇｃｃｃａｃａｃｇａａａａｇａｔａｔｔｇｃｃｔｔｇｃｔａａａｇｃｔａａｇｃａｇｔｃｃｔｇｃｃｇｔｃａｔｃａｃｔｇａｃａａａｇｔａａｔｃｃｃａｇｃｔｔｇｔｃｔｇｃｃａｔｃｃｃｃａａａｔｔａｔｇｔｇｇｔｃｇｃｔｇａｃｃｇｇａｃｃｇａａｔｇｔｔｔｃａｔｃａｃｔｇｇｃｔｇｇｇｇａｇａａａｃｃｃａａｇｇｔａｃｔｔｔｔｇｇａｇｃｔｇｇｃｃｔｔｃｔｃａａｇｇａａｇｃｃｃａｇｃｔｃｃｃｔｇｔｇａｔｔｇａｇａａｔａａａｇｔｇｔｇｃａａｔｃｇｃｔａｔｇａｇｔｔｔｃｔｇａａｔｇｇａａｇａｇｔｃｃａａｔｃｃａｃｃｇａａｃｔｃｔｇｔｇｃｔｇｇｇｃａｔｔｔｇｇｃｃｇｇａｇｇｃａｃｔｇａｃａｇｔｔｇｃｃａｇｇｇｔｇａｃａｇｔｇｇａｇｇｔｃｃｔｃｔｇｇｔｔｔｇｃｔｔｃｇａｇａａｇｇａｃａａａｔａｃａｔｔｔｔａｃａａｇｇａｇｔｃａｃｔｔｃｔｔｇｇｇｇｔｃｔｔｇｇｃｔｇｔｇｃａｃｇｃｃｃｃａａｔａａｇｃｃｔｇｇｔｇｔｃｔａｔｇｔｔｃｇｔｇｔｔｔｃａａｇｇｔｔｔｇｔｔａｃｔｔｇｇａｔｔｇａｇｇｇａｇｔｇａｔｇａｇａａａｔａａｔｔａａ
配列６：
ＫＶＹＬＳＥＣＫＴＧＮＧＫＮＹＲＧＴＭＳＫＴＫＮＧＩＴＣＱＫＷＳＳＴＳＰＨＲＰＲＦＳＰＡＴＨＰＳＥＧＬＥＥＮＹＣＲＮＰＤＮＤＰＱＧＰＷＣＹＴＴＤＰＥＫＲＹＤＹＣＤＩＬＥＣＥＥＥＣＭＨＣＳＧＥＮＹＤＧＫＩＳＫＴＭＳＧＬＥＣＱＡＷＤＳＱＳＰＨＡＨＧＹＩＰＳＫＦＰＮＫＮＬＫＫＮＹＣＲＮＰＤＲＥＬＲＰＷＣＦＴＴＤＰＮＫＲＷＥＬＣＤＩＰＲＣＴＴＰＰＰＳＳＧＰＴＹＱＣＬＫＧＴＧＥＮＹＲＧＮＶＡＶＴＶＳＧＨＴＣＱＨＷＳＡＱＴＰＨＴＨＮＲＴＰＥＮＦＰＣＫＮＬＤＥＮＹＣＲＮＰＤＧＫＲＡＰＷＣＨＴＴＮＳＱＶＲＷＥＹＣＫＩＰＳＣＤＳＳＰＶＳＴＥＱＬＡＰＴＡＰＰＥＬＴＰＶＶＱＤＣＹＨＧＤＧＱＳＹＲＧＴＳＳＴＴＴＴＧＫＫＣＱＳＷＳＳＭＴＰＨＲＨＱＫＴＰＥＮＹＰＮＡＧＬＴＭＮＹＣＲＮＰＤＡＤＫＧＰＷＣＦＴＴＤＰＳＶＲＷＥＹＣＮＬＫＫＣＳＧＴＥＡＳＶＶＡＰＰＰＶＶＬＬＰＤＶＥＴＰＳＥＥＤＣＭＦＧＮＧＫＧＹＲＧＫＲＡＴＴＶＴＧＴＰＣＱＤＷＡＡＱＥＰＨＲＨＳＩＦＴＰＥＴＮＰＲＡＧＬＥＫＮＹＣＲＮＰＤＧＤＶＧＧＰＷＣＹＴＴＮＰＲＫＬＹＤＹＣＤＶＰＱＣＡＡＰＳＦＤＣＧＫＰＱＶＥＰＫＫＣＰＧＲＶＶＧＧＣＶＡＨＰＨＳＷＰＷＱＶＳＬＲＴＲＦＧＭＨＦＣＧＧＴＬＩＳＰＥＷＶＬＴＡＡＨＣＬＥＫＳＰＲＰＳＳＹＫＶＩＬＧＡＨＱＥＶＮＬＥＰＨＶＱＥＩＥＶＳＲＬＦＬＥＰＴＲＫＤＩＡＬＬＫＬＳＳＰＡＶＩＴＤＫＶＩＰＡＣＬＰＳＰＮＹＶＶＡＤＲＴＥＣＦＩＴＧＷＧＥＴＱＧＴＦＧＡＧＬＬＫＥＡＱＬＰＶＩＥＮＫＶＣＮＲＹＥＦＬＮＧＲＶＱＳＴＥＬＣＡＧＨＬＡＧＧＴＤＳＣＱＧＤＳＧＧＰＬＶＣＦＥＫＤＫＹＩＬＱＧＶＴＳＷＧＬＧＣＡＲＰＮＫＰＧＶＹＶＲＶＳＲＦＶＴＷＩＥＧＶＭＲＮＮ
配列７：
ｇａｇｃｃｔｃｔｇｇａｔｇａｃｔａｔｇｔｇａａｔａｃｃｃａｇｇｇｇｇｃｔｔｃａｃｔｇｔｔｃａｇｔｇｔｃａｃｔａａｇａａｇｃａｇｃｔｇｇｇａｇｃａｇｇａａｇｔａｔａｇａａｇａａｔｇｔｇｃａｇｃａａａａｔｇｔｇａｇｇａｇｇａｃｇａａｇａａｔｔｃａｃｃｔｇｃａｇｇｇｃａｔｔｃｃａａｔａｔｃａｃａｇｔａａａｇａｇｃａａｃａａｔｇｔｇｔｇａｔａａｔｇｇｃｔｇａａａａｃａｇｇａａｇｔｃｃｔｃｃａｔａａｔｃａｔｔａｇｇａｔｇａｇａｇａｔｇｔａｇｔｔｔｔａｔｔｔｇａａａａｇａａａｇｔｇｔａｔｃｔｃｔｃａｇａｇｔｇｃａａｇａｃｔｇｇｇａａｔｇｇａａａｇａａｃｔａｃａｇａｇｇｇａｃｇａｔｇｔｃｃａａａａｃａａａａａａｔｇｇｃａｔｃａｃｃｔｇｔｃａａａａａｔｇｇａｇｔｔｃｃａｃｔｔｃｔｃｃｃｃａｃａｇａｃｃｔａｇａｔｔｃｔｃａｃｃｔｇｃｔａｃａｃａｃｃｃｃｔｃａｇａｇｇｇａｃｔｇｇａｇｇａｇａａｃｔａｃｔｇｃａｇｇａａｔｃｃａｇａｃａａｃｇａｔｃｃｇｃａｇｇｇｇｃｃｃｔｇｇｔｇｃｔａｔａｃｔａｃｔｇａｔｃｃａｇａａａａｇａｇａｔａｔｇａｃｔａｃｔｇｃｇａｃａｔｔｃｔｔｇａｇｔｇｔｇａａｇａｇｇｃｇｇｃｃｃｃｔｔｃａｔｔｔｇａｔｔｇｔｇｇｇａａｇｃｃｔｃａａｇｔｇｇａｇｃｃｇａａｇａａａｔｇｔｃｃｔｇｇａａｇｇｇｔｔｇｔａｇｇｇｇｇｇｔｇｔｇｔｇｇｃｃｃａｃｃｃａｃａｔｔｃｃｔｇｇｃｃｃｔｇｇｃａａｇｔｃａｇｔｃｔｔａｇａａｃａａｇｇｔｔｔｇｇａａｔｇｃａｃｔｔｃｔｇｔｇｇａｇｇｃａｃｃｔｔｇａｔａｔｃｃｃｃａｇａｇｔｇｇｇｔｇｔｔｇａｃｔｇｃｔｇｃｃｃａｃｔｇｃｔｔｇｇａｇａａｇｔｃｃｃｃａａｇｇｃｃｔｔｃａｔｃｃｔａｃａａｇｇｔｃａｔｃｃｔｇｇｇｔｇｃａｃａｃｃａａｇａａｇｔｇａａｔｃｔｃｇａａｃｃｇｃａｔｇｔｔｃａｇｇａａａｔａｇａａｇｔｇｔｃｔａｇｇｃｔｇｔｔｃｔｔｇｇａｇｃｃｃａｃａｃｇａａａａｇａｔａｔｔｇｃｃｔｔｇｃｔａａａｇｃｔａａｇｃａｇｔｃｃｔｇｃｃｇｔｃａｔｃａｃｔｇａｃａａａｇｔａａｔｃｃｃａｇｃｔｔｇｔｃｔｇｃｃａｔｃｃｃｃａａａｔｔａｔｇｔｇｇｔｃｇｃｔｇａｃｃｇｇａｃｃｇａａｔｇｔｔｔｃａｔｃａｃｔｇｇｃｔｇｇｇｇａｇａａａｃｃｃａａｇｇｔａｃｔｔｔｔｇｇａｇｃｔｇｇｃｃｔｔｃｔｃａａｇｇａａｇｃｃｃａｇｃｔｃｃｃｔｇｔｇａｔｔｇａｇａａｔａａａｇｔｇｔｇｃａａｔｃｇｃｔａｔｇａｇｔｔｔｃｔｇａａｔｇｇａａｇａｇｔｃｃａａｔｃｃａｃｃｇａａｃｔｃｔｇｔｇｃｔｇｇｇｃａｔｔｔｇｇｃｃｇｇａｇｇｃａｃｔｇａｃａｇｔｔｇｃｃａｇｇｇｔｇａｃａｇｔｇｇａｇｇｔｃｃｔｃｔｇｇｔｔｔｇｃｔｔｃｇａｇａａｇｇａｃａａａｔａｃａｔｔｔｔａｃａａｇｇａｇｔｃａｃｔｔｃｔｔｇｇｇｇｔｃｔｔｇｇｃｔｇｔｇｃａｃｇｃｃｃｃａａｔａａｇｃｃｔｇｇｔｇｔｃｔａｔｇｔｔｃｇｔｇｔｔｔｃａａｇｇｔｔｔｇｔｔａｃｔｔｇｇａｔｔｇａｇｇｇａｇｔｇａｔｇａｇａａａｔａａｔｔａａ
配列８：
ＥＰＬＤＤＹＶＮＴＱＧＡＳＬＦＳＶＴＫＫＱＬＧＡＧＳＩＥＥＣＡＡＫＣＥＥＤＥＥＦＴＣＲＡＦＱＹＨＳＫＥＱＱＣＶＩＭＡＥＮＲＫＳＳＩＩＩＲＭＲＤＶＶＬＦＥＫＫＶＹＬＳＥＣＫＴＧＮＧＫＮＹＲＧＴＭＳＫＴＫＮＧＩＴＣＱＫＷＳＳＴＳＰＨＲＰＲＦＳＰＡＴＨＰＳＥＧＬＥＥＮＹＣＲＮＰＤＮＤＰＱＧＰＷＣＹＴＴＤＰＥＫＲＹＤＹＣＤＩＬＥＣＥＥＡＡＰＳＦＤＣＧＫＰＱＶＥＰＫＫＣＰＧＲＶＶＧＧＣＶＡＨＰＨＳＷＰＷＱＶＳＬＲＴＲＦＧＭＨＦＣＧＧＴＬＩＳＰＥＷＶＬＴＡＡＨＣＬＥＫＳＰＲＰＳＳＹＫＶＩＬＧＡＨＱＥＶＮＬＥＰＨＶＱＥＩＥＶＳＲＬＦＬＥＰＴＲＫＤＩＡＬＬＫＬＳＳＰＡＶＩＴＤＫＶＩＰＡＣＬＰＳＰＮＹＶＶＡＤＲＴＥＣＦＩＴＧＷＧＥＴＱＧＴＦＧＡＧＬＬＫＥＡＱＬＰＶＩＥＮＫＶＣＮＲＹＥＦＬＮＧＲＶＱＳＴＥＬＣＡＧＨＬＡＧＧＴＤＳＣＱＧＤＳＧＧＰＬＶＣＦＥＫＤＫＹＩＬＱＧＶＴＳＷＧＬＧＣＡＲＰＮＫＰＧＶＹＶＲＶＳＲＦＶＴＷＩＥＧＶＭＲＮＮ
配列９：
ｇｔｃａｇｇｔｇｇｇａｇｔａｃｔｇｃａａｃｃｔｇａａａａａａｔｇｃｔｃａｇｇａａｃａｇａａｇｃｇａｇｔｇｔｔｇｔａｇｃａｃｃｔｃｃｇｃｃｔｇｔｔｇｔｃｃｔｇｃｔｔｃｃａｇａｔｇｔａｇａｇａｃｔｃｃｔｔｃｃｇａａｇａａｇａｃｔｇｔａｔｇｔｔｔｇｇｇａａｔｇｇｇａａａｇｇａｔａｃｃｇａｇｇｃａａｇａｇｇｇｃｇａｃｃａｃｔｇｔｔａｃｔｇｇｇａｃｇｃｃａｔｇｃｃａｇｇａｃｔｇｇｇｃｔｇｃｃｃａｇｇａｇｃｃｃｃａｔａｇａｃａｃａｇｃａｔｔｔｔｃａｃｔｃｃａｇａｇａｃａａａｔｃｃａｃｇｇｇｃｇｇｇｔｃｔｇｇａａａａａａａｔｔａｃｔｇｃｃｇｔａａｃｃｃｔｇａｔｇｇｔｇａｔｇｔａｇｇｔｇｇｔｃｃｃｔｇｇｔｇｃｔａｃａｃｇａｃａａａｔｃｃａａｇａａａａｃｔｔｔａｃｇａｃｔａｃｔｇｔｇａｔｇｔｃｃｃｔｃａｇｔｇｔｇｃｇｇｃｃｃｃｔｔｃａｔｔｔｇａｔｔｇｔｇｇｇａａｇｃｃｔｃａａｇｔｇｇａｇｃｃｇａａｇａａａｔｇｔｃｃｔｇｇａａｇｇｇｔｔｇｔａｇｇｇｇｇｇｔｇｔｇｔｇｇｃｃｃａｃｃｃａｃａｔｔｃｃｔｇｇｃｃｃｔｇｇｃａａｇｔｃａｇｔｃｔｔａｇａａｃａａｇｇｔｔｔｇｇａａｔｇｃａｃｔｔｃｔｇｔｇｇａｇｇｃａｃｃｔｔｇａｔａｔｃｃｃｃａｇａｇｔｇｇｇｔｇｔｔｇａｃｔｇｃｔｇｃｃｃａｃｔｇｃｔｔｇｇａｇａａｇｔｃｃｃｃａａｇｇｃｃｔｔｃａｔｃｃｔａｃａａｇｇｔｃａｔｃｃｔｇｇｇｔｇｃａｃａｃｃａａｇａａｇｔｇａａｔｃｔｃｇａａｃｃｇｃａｔｇｔｔｃａｇｇａａａｔａｇａａｇｔｇｔｃｔａｇｇｃｔｇｔｔｃｔｔｇｇａｇｃｃｃａｃａｃｇａａａａｇａｔａｔｔｇｃｃｔｔｇｃｔａａａｇｃｔａａｇｃａｇｔｃｃｔｇｃｃｇｔｃａｔｃａｃｔｇａｃａａａｇｔａａｔｃｃｃａｇｃｔｔｇｔｃｔｇｃｃａｔｃｃｃｃａａａｔｔａｔｇｔｇｇｔｃｇｃｔｇａｃｃｇｇａｃｃｇａａｔｇｔｔｔｃａｔｃａｃｔｇｇｃｔｇｇｇｇａｇａａａｃｃｃａａｇｇｔａｃｔｔｔｔｇｇａｇｃｔｇｇｃｃｔｔｃｔｃａａｇｇａａｇｃｃｃａｇｃｔｃｃｃｔｇｔｇａｔｔｇａｇａａｔａａａｇｔｇｔｇｃａａｔｃｇｃｔａｔｇａｇｔｔｔｃｔｇａａｔｇｇａａｇａｇｔｃｃａａｔｃｃａｃｃｇａａｃｔｃｔｇｔｇｃｔｇｇｇｃａｔｔｔｇｇｃｃｇｇａｇｇｃａｃｔｇａｃａｇｔｔｇｃｃａｇｇｇｔｇａｃａｇｔｇｇａｇｇｔｃｃｔｃｔｇｇｔｔｔｇｃｔｔｃｇａｇａａｇｇａｃａａａｔａｃａｔｔｔｔａｃａａｇｇａｇｔｃａｃｔｔｃｔｔｇｇｇｇｔｃｔｔｇｇｃｔｇｔｇｃａｃｇｃｃｃｃａａｔａａｇｃｃｔｇｇｔｇｔｃｔａｔｇｔｔｃｇｔｇｔｔｔｃａａｇｇｔｔｔｇｔｔａｃｔｔｇｇａｔｔｇａｇｇｇａｇｔｇａｔｇａｇａａａｔａａｔｔａａ
配列１０：
ＶＲＷＥＹＣＮＬＫＫＣＳＧＴＥＡＳＶＶＡＰＰＰＶＶＬＬＰＤＶＥＴＰＳＥＥＤＣＭＦＧＮＧＫＧＹＲＧＫＲＡＴＴＶＴＧＴＰＣＱＤＷＡＡＱＥＰＨＲＨＳＩＦＴＰＥＴＮＰＲＡＧＬＥＫＮＹＣＲＮＰＤＧＤＶＧＧＰＷＣＹＴＴＮＰＲＫＬＹＤＹＣＤＶＰＱＣＡＡＰＳＦＤＣＧＫＰＱＶＥＰＫＫＣＰＧＲＶＶＧＧＣＶＡＨＰＨＳＷＰＷＱＶＳＬＲＴＲＦＧＭＨＦＣＧＧＴＬＩＳＰＥＷＶＬＴＡＡＨＣＬＥＫＳＰＲＰＳＳＹＫＶＩＬＧＡＨＱＥＶＮＬＥＰＨＶＱＥＩＥＶＳＲＬＦＬＥＰＴＲＫＤＩＡＬＬＫＬＳＳＰＡＶＩＴＤＫＶＩＰＡＣＬＰＳＰＮＹＶＶＡＤＲＴＥＣＦＩＴＧＷＧＥＴＱＧＴＦＧＡＧＬＬＫＥＡＱＬＰＶＩＥＮＫＶＣＮＲＹＥＦＬＮＧＲＶＱＳＴＥＬＣＡＧＨＬＡＧＧＴＤＳＣＱＧＤＳＧＧＰＬＶＣＦＥＫＤＫＹＩＬＱＧＶＴＳＷＧＬＧＣＡＲＰＮＫＰＧＶＹＶＲＶＳＲＦＶＴＷＩＥＧＶＭＲＮＮ
配列１１：
ｇｃｃｃｃｔｔｃａｔｔｔｇａｔｔｇｔｇｇｇａａｇｃｃｔｃａａｇｔｇｇａｇｃｃｇａａｇａａａｔｇｔｃｃｔｇｇａａｇｇｇｔｔｇｔａｇｇｇｇｇｇｔｇｔｇｔｇｇｃｃｃａｃｃｃａｃａｔｔｃｃｔｇｇｃｃｃｔｇｇｃａａｇｔｃａｇｔｃｔｔａｇａａｃａａｇｇｔｔｔｇｇａａｔｇｃａｃｔｔｃｔｇｔｇｇａｇｇｃａｃｃｔｔｇａｔａｔｃｃｃｃａｇａｇｔｇｇｇｔｇｔｔｇａｃｔｇｃｔｇｃｃｃａｃｔｇｃｔｔｇｇａｇａａｇｔｃｃｃｃａａｇｇｃｃｔｔｃａｔｃｃｔａｃａａｇｇｔｃａｔｃｃｔｇｇｇｔｇｃａｃａｃｃａａｇａａｇｔｇａａｔｃｔｃｇａａｃｃｇｃａｔｇｔｔｃａｇｇａａａｔａｇａａｇｔｇｔｃｔａｇｇｃｔｇｔｔｃｔｔｇｇａｇｃｃｃａｃａｃｇａａａａｇａｔａｔｔｇｃｃｔｔｇｃｔａａａｇｃｔａａｇｃａｇｔｃｃｔｇｃｃｇｔｃａｔｃａｃｔｇａｃａａａｇｔａａｔｃｃｃａｇｃｔｔｇｔｃｔｇｃｃａｔｃｃｃｃａａａｔｔａｔｇｔｇｇｔｃｇｃｔｇａｃｃｇｇａｃｃｇａａｔｇｔｔｔｃａｔｃａｃｔｇｇｃｔｇｇｇｇａｇａａａｃｃｃａａｇｇｔａｃｔｔｔｔｇｇａｇｃｔｇｇｃｃｔｔｃｔｃａａｇｇａａｇｃｃｃａｇｃｔｃｃｃｔｇｔｇａｔｔｇａｇａａｔａａａｇｔｇｔｇｃａａｔｃｇｃｔａｔｇａｇｔｔｔｃｔｇａａｔｇｇａａｇａｇｔｃｃａａｔｃｃａｃｃｇａａｃｔｃｔｇｔｇｃｔｇｇｇｃａｔｔｔｇｇｃｃｇｇａｇｇｃａｃｔｇａｃａｇｔｔｇｃｃａｇｇｇｔｇａｃａｇｔｇｇａｇｇｔｃｃｔｃｔｇｇｔｔｔｇｃｔｔｃｇａｇａａｇｇａｃａａａｔａｃａｔｔｔｔａｃａａｇｇａｇｔｃａｃｔｔｃｔｔｇｇｇｇｔｃｔｔｇｇｃｔｇｔｇｃａｃｇｃｃｃｃａａｔａａｇｃｃｔｇｇｔｇｔｃｔａｔｇｔｔｃｇｔｇｔｔｔｃａａｇｇｔｔｔｇｔｔａｃｔｔｇｇａｔｔｇａｇｇｇａｇｔｇａｔｇａｇａａａｔａａｔｔａａ
配列１２：
ＡＰＳＦＤＣＧＫＰＱＶＥＰＫＫＣＰＧＲＶＶＧＧＣＶＡＨＰＨＳＷＰＷＱＶＳＬＲＴＲＦＧＭＨＦＣＧＧＴＬＩＳＰＥＷＶＬＴＡＡＨＣＬＥＫＳＰＲＰＳＳＹＫＶＩＬＧＡＨＱＥＶＮＬＥＰＨＶＱＥＩＥＶＳＲＬＦＬＥＰＴＲＫＤＩＡＬＬＫＬＳＳＰＡＶＩＴＤＫＶＩＰＡＣＬＰＳＰＮＹＶＶＡＤＲＴＥＣＦＩＴＧＷＧＥＴＱＧＴＦＧＡＧＬＬＫＥＡＱＬＰＶＩＥＮＫＶＣＮＲＹＥＦＬＮＧＲＶＱＳＴＥＬＣＡＧＨＬＡＧＧＴＤＳＣＱＧＤＳＧＧＰＬＶＣＦＥＫＤＫＹＩＬＱＧＶＴＳＷＧＬＧＣＡＲＰＮＫＰＧＶＹＶＲＶＳＲＦＶＴＷＩＥＧＶＭＲＮＮ
配列１３：
ｇｔｔｇｔａｇｇｇｇｇｇｔｇｔｇｔｇｇｃｃｃａｃｃｃａｃａｔｔｃｃｔｇｇｃｃｃｔｇｇｃａａｇｔｃａｇｔｃｔｔａｇａａｃａａｇｇｔｔｔｇｇａａｔｇｃａｃｔｔｃｔｇｔｇｇａｇｇｃａｃｃｔｔｇａｔａｔｃｃｃｃａｇａｇｔｇｇｇｔｇｔｔｇａｃｔｇｃｔｇｃｃｃａｃｔｇｃｔｔｇｇａｇａａｇｔｃｃｃｃａａｇｇｃｃｔｔｃａｔｃｃｔａｃａａｇｇｔｃａｔｃｃｔｇｇｇｔｇｃａｃａｃｃａａｇａａｇｔｇａａｔｃｔｃｇａａｃｃｇｃａｔｇｔｔｃａｇｇａａａｔａｇａａｇｔｇｔｃｔａｇｇｃｔｇｔｔｃｔｔｇｇａｇｃｃｃａｃａｃｇａａａａｇａｔａｔｔｇｃｃｔｔｇｃｔａａａｇｃｔａａｇｃａｇｔｃｃｔｇｃｃｇｔｃａｔｃａｃｔｇａｃａａａｇｔａａｔｃｃｃａｇｃｔｔｇｔｃｔｇｃｃａｔｃｃｃｃａａａｔｔａｔｇｔｇｇｔｃｇｃｔｇａｃｃｇｇａｃｃｇａａｔｇｔｔｔｃａｔｃａｃｔｇｇｃｔｇｇｇｇａｇａａａｃｃｃａａｇｇｔａｃｔｔｔｔｇｇａｇｃｔｇｇｃｃｔｔｃｔｃａａｇｇａａｇｃｃｃａｇｃｔｃｃｃｔｇｔｇａｔｔｇａｇａａｔａａａｇｔｇｔｇｃａａｔｃｇｃｔａｔｇａｇｔｔｔｃｔｇａａｔｇｇａａｇａｇｔｃｃａａｔｃｃａｃｃｇａａｃｔｃｔｇｔｇｃｔｇｇｇｃａｔｔｔｇｇｃｃｇｇａｇｇｃａｃｔｇａｃａｇｔｔｇｃｃａｇｇｇｔｇａｃａｇｔｇｇａｇｇｔｃｃｔｃｔｇｇｔｔｔｇｃｔｔｃｇａｇａａｇｇａｃａａａｔａｃａｔｔｔｔａｃａａｇｇａｇｔｃａｃｔｔｃｔｔｇｇｇｇｔｃｔｔｇｇｃｔｇｔｇｃａｃｇｃｃｃｃａａｔａａｇｃｃｔｇｇｔｇｔｃｔａｔｇｔｔｃｇｔｇｔｔｔｃａａｇｇｔｔｔｇｔｔａｃｔｔｇｇａｔｔｇａｇｇｇａｇｔｇａｔｇａｇａ
配列１４：
ＶＶＧＧＣＶＡＨＰＨＳＷＰＷＱＶＳＬＲＴＲＦＧＭＨＦＣＧＧＴＬＩＳＰＥＷＶＬＴＡＡＨＣＬＥＫＳＰＲＰＳＳＹＫＶＩＬＧＡＨＱＥＶＮＬＥＰＨＶＱＥＩＥＶＳＲＬＦＬＥＰＴＲＫＤＩＡＬＬＫＬＳＳＰＡＶＩＴＤＫＶＩＰＡＣＬＰＳＰＮＹＶＶＡＤＲＴＥＣＦＩＴＧＷＧＥＴＱＧＴＦＧＡＧＬＬＫＥＡＱＬＰＶＩＥＮＫＶＣＮＲＹＥＦＬＮＧＲＶＱＳＴＥＬＣＡＧＨＬＡＧＧＴＤＳＣＱＧＤＳＧＧＰＬＶＣＦＥＫＤＫＹＩＬＱＧＶＴＳＷＧＬＧＣＡＲＰＮＫＰＧＶＹＶＲＶＳＲＦＶＴＷＩＥＧＶＭＲ
Ｃ５７メスマウス３０匹を取り、モデリング前に体重を測定し、体重に応じて異常なマウスを除外した後、すべてのマウスをランダムに２つの群に分け、ブランク対照群で８匹、モデル群で２２匹とした。群分けが完了した後、ブランク対照群に通常の維持食（北京科澳協力有限公司から購入）を与え、モデル群に０．６％ジシクロヘキサノンオキサリルジヒドラゾン（ＣＰＺ）（製造元：上海源葉生物科技有限公司；カタログ番号：Ｓ３０３４９）のモデリング飼料を４２日間連続して与え、多発性硬化症モデルを誘発した［１］。モデリングが完了した後、すべてのマウスをオープンフィールドテストでテストし、モデル群のマウスをテスト結果に従って群分けし、溶媒群で１１匹、投与群で１１匹とした。群分けが完了した後、すべてのマウスに投与を開始し、これを投与の１日目として記録し、ブランク対照群マウス及び溶媒群マウスに０．１ｍｌ／匹／日で溶媒を尾静脈注射により投与し、投与群マウスに１ｍｇ／匹／日でプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、２７日間連続投与した。投与期間中、すべてのマウスに通常の維持食を与えた。２８日目に高架式十字迷路実験を行った。
クローズアーム休憩時間の割合＝クローズアーム休憩時間／クローズアーム移動時間とクローズアーム休憩時間の合計である。その結果、ブランク対照群のマウスは一定のクローズアーム休憩時間の割合を有し、約５１．８％であり、溶媒群のマウスのクローズアーム休憩時間の割合は３６．８％と有意に低下し、投与群のマウスのクローズアーム休憩時間の割合は約５０．１％であり、溶媒群よりも有意に大きく、その差は統計学的に有意であり（＊はＰ＜０．０５を表す）（図１８）、ブランク対照群に近かった。これは、プラスミノーゲンが多発性硬化症モデルマウスの不安や抑うつ行動をある程度緩和できることを示している。
参考文献：
1. M. Lindner, S. Heine, K. Haastert, Sequential myelin protein expression during remyelination reveals fast and efficient repair after central nervous system demyelination， Neuropathology and Applied Neurobiology (2008), 34, 105-114.
2. Tuohy VK1, Lu Z, Sobel RA, Laursen RA et al. Identification of an encephalitogenic determinant of myelin proteolipid protein for SJL mice. J Immunol. 1989 Mar 1;142(5):1523-7.
3. Gotow T.Neurofilaments in health and disease. Med Electron Microsc. 2000;33(4):173-99.
4. Ahmed Z , Shaw G , Sharma V P , et al. Actin-binding Proteins Coronin-1a and IBA-1 Are Effective Microglial Markers for Immunohistochemistry[J]. Journal of Histochemistry and Cytochemistry, 2007, 55(7):687-700.
5. Kowianski, Przemys?aw, Lietzau G , Czuba E , et al. BDNF: A Key Factor with Multipotent Impact on Brain Signaling and Synaptic Plasticity[J]. Cellular & Molecular Neurobiology, 2017.
6. Hol E M, Pekny M. Glial fibrillary acidic protein (GFAP) and the astrocyte intermediate filament system in diseases of the central nervous system.[J]. Current Opinion in Cell Biology, 2015, 32(1):121-130.
7. Murphy R, O'Donoghue S, Counihan T, McDonald C, Calabresi PA, Ahmed MA, Kaplin A, Hallahan B. Neuropsychiatric syndromes of multiple sclerosis. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 2017 Aug;88(8):697-708.
8. Hirahara Y , Matsuda K I , Yamada H , et al. G protein-coupled receptor 30 contributes to improved remyelination after cuprizone-induced demyelination[J]. Glia, 2013, 61(3):420-431.
9. Di Biase A , Salvati S , Di Benedetto R , et al. Eicosapentaenoic acid pre-treatment reduces biochemical changes induced in total brain and myelin of weanling Wistar rats by cuprizone feeding[J]. Prostaglandins, Leukotrienes and Essential Fatty Acids (PLEFA), 2014, 90(4):99-104.
58(1-2):40.
配列表
配列１：
ｇａｇｃｃｔｃｔｇｇａｔｇａｃｔａｔｇｔｇａａｔａｃｃｃａｇｇｇｇｇｃｔｔｃａｃｔｇｔｔｃａｇｔｇｔｃａｃｔａａｇａａｇｃａｇｃｔｇｇｇａｇｃａｇｇａａｇｔａｔａｇａａｇａａｔｇｔｇｃａｇｃａａａａｔｇｔｇａｇｇａｇｇａｃｇａａｇａａｔｔｃａｃｃｔｇｃａｇｇｇｃａｔｔｃｃａａｔａｔｃａｃａｇｔａａａｇａｇｃａａｃａａｔｇｔｇｔｇａｔａａｔｇｇｃｔｇａａａａｃａｇｇａａｇｔｃｃｔｃｃａｔａａｔｃａｔｔａｇｇａｔｇａｇａｇａｔｇｔａｇｔｔｔｔａｔｔｔｇａａａａｇａａａｇｔｇｔａｔｃｔｃｔｃａｇａｇｔｇｃａａｇａｃｔｇｇｇａａｔｇｇａａａｇａａｃｔａｃａｇａｇｇｇａｃｇａｔｇｔｃｃａａａａｃａａａａａａｔｇｇｃａｔｃａｃｃｔｇｔｃａａａａａｔｇｇａｇｔｔｃｃａｃｔｔｃｔｃｃｃｃａｃａｇａｃｃｔａｇａｔｔｃｔｃａｃｃｔｇｃｔａｃａｃａｃｃｃｃｔｃａｇａｇｇｇａｃｔｇｇａｇｇａｇａａｃｔａｃｔｇｃａｇｇａａｔｃｃａｇａｃａａｃｇａｔｃｃｇｃａｇｇｇｇｃｃｃｔｇｇｔｇｃｔａｔａｃｔａｃｔｇａｔｃｃａｇａａａａｇａｇａｔａｔｇａｃｔａｃｔｇｃｇａｃａｔｔｃｔｔｇａｇｔｇｔｇａａｇａｇｇａａｔｇｔａｔｇｃａｔｔｇｃａｇｔｇｇａｇａａａａｃｔａｔｇａｃｇｇｃａａａａｔｔｔｃｃａａｇａｃｃａｔｇｔｃｔｇｇａｃｔｇｇａａｔｇｃｃａｇｇｃｃｔｇｇｇａｃｔｃｔｃａｇａｇｃｃｃａｃａｃｇｃｔｃａｔｇｇａｔａｃａｔｔｃｃｔｔｃｃａａａｔｔｔｃｃａａａｃａａｇａａｃｃｔｇａａｇａａｇａａｔｔａｃｔｇｔｃｇｔａａｃｃｃｃｇａｔａｇｇｇａｇｃｔｇｃｇｇｃｃｔｔｇｇｔｇｔｔｔｃａｃｃａｃｃｇａｃｃｃｃａａｃａａｇｃｇｃｔｇｇｇａａｃｔｔｔｇｔｇａｃａｔｃｃｃｃｃｇｃｔｇｃａｃａａｃａｃｃｔｃｃａｃｃａｔｃｔｔｃｔｇｇｔｃｃｃａｃｃｔａｃｃａｇｔｇｔｃｔｇａａｇｇｇａａｃａｇｇｔｇａａａａｃｔａｔｃｇｃｇｇｇａａｔｇｔｇｇｃｔｇｔｔａｃｃｇｔｇｔｃｃｇｇｇｃａｃａｃｃｔｇｔｃａｇｃａｃｔｇｇａｇｔｇｃａｃａｇａｃｃｃｃｔｃａｃａｃａｃａｔａａｃａｇｇａｃａｃｃａｇａａａａｃｔｔｃｃｃｃｔｇｃａａａａａｔｔｔｇｇａｔｇａａａａｃｔａｃｔｇｃｃｇｃａａｔｃｃｔｇａｃｇｇａａａａａｇｇｇｃｃｃｃａｔｇｇｔｇｃｃａｔａｃａａｃｃａａｃａｇｃｃａａｇｔｇｃｇｇｔｇｇｇａｇｔａｃｔｇｔａａｇａｔａｃｃｇｔｃｃｔｇｔｇａｃｔｃｃｔｃｃｃｃａｇｔａｔｃｃａｃｇｇａａｃａａｔｔｇｇｃｔｃｃｃａｃａｇｃａｃｃａｃｃｔｇａｇｃｔａａｃｃｃｃｔｇｔｇｇｔｃｃａｇｇａｃｔｇｃｔａｃｃａｔｇｇｔｇａｔｇｇａｃａｇａｇｃｔａｃｃｇａｇｇｃａｃａｔｃｃｔｃｃａｃｃａｃｃａｃｃａｃａｇｇａａａｇａａｇｔｇｔｃａｇｔｃｔｔｇｇｔｃａｔｃｔａｔｇａｃａｃｃａｃａｃｃｇｇｃａｃｃａｇａａｇａｃｃｃｃａｇａａａａｃｔａｃｃｃａａａｔｇｃｔｇｇｃｃｔｇａｃａａｔｇａａｃｔａｃｔｇｃａｇｇａａｔｃｃａｇａｔｇｃｃｇａｔａａａｇｇｃｃｃｃｔｇｇｔｇｔｔｔｔａｃｃａｃａｇａｃｃｃｃａｇｃｇｔｃａｇｇｔｇｇｇａｇｔａｃｔｇｃａａｃｃｔｇａａａａａａｔｇｃｔｃａｇｇａａｃａｇａａｇｃｇａｇｔｇｔｔｇｔａｇｃａｃｃｔｃｃｇｃｃｔｇｔｔｇｔｃｃｔｇｃｔｔｃｃａｇａｔｇｔａｇａｇａｃｔｃｃｔｔｃｃｇａａｇａａｇａｃｔｇｔａｔｇｔｔｔｇｇｇａａｔｇｇｇａａａｇｇａｔａｃｃｇａｇｇｃａａｇａｇｇｇｃｇａｃｃａｃｔｇｔｔａｃｔｇｇｇａｃｇｃｃａｔｇｃｃａｇｇａｃｔｇｇｇｃｔｇｃｃｃａｇｇａｇｃｃｃｃａｔａｇａｃａｃａｇｃａｔｔｔｔｃａｃｔｃｃａｇａｇａｃａａａｔｃｃａｃｇｇｇｃｇｇｇｔｃｔｇｇａａａａａａａｔｔａｃｔｇｃｃｇｔａａｃｃｃｔｇａｔｇｇｔｇａｔｇｔａｇｇｔｇｇｔｃｃｃｔｇｇｔｇｃｔａｃａｃｇａｃａａａｔｃｃａａｇａａａａｃｔｔｔａｃｇａｃｔａｃｔｇｔｇａｔｇｔｃｃｃｔｃａｇｔｇｔｇｃｇｇｃｃｃｃｔｔｃａｔｔｔｇａｔｔｇｔｇｇｇａａｇｃｃｔｃａａｇｔｇｇａｇｃｃｇａａｇａａａｔｇｔｃｃｔｇｇａａｇｇｇｔｔｇｔａｇｇｇｇｇｇｔｇｔｇｔｇｇｃｃｃａｃｃｃａｃａｔｔｃｃｔｇｇｃｃｃｔｇｇｃａａｇｔｃａｇｔｃｔｔａｇａａｃａａｇｇｔｔｔｇｇａａｔｇｃａｃｔｔｃｔｇｔｇｇａｇｇｃａｃｃｔｔｇａｔａｔｃｃｃｃａｇａｇｔｇｇｇｔｇｔｔｇａｃｔｇｃｔｇｃｃｃａｃｔｇｃｔｔｇｇａｇａａｇｔｃｃｃｃａａｇｇｃｃｔｔｃａｔｃｃｔａｃａａｇｇｔｃａｔｃｃｔｇｇｇｔｇｃａｃａｃｃａａｇａａｇｔｇａａｔｃｔｃｇａａｃｃｇｃａｔｇｔｔｃａｇｇａａａｔａｇａａｇｔｇｔｃｔａｇｇｃｔｇｔｔｃｔｔｇｇａｇｃｃｃａｃａｃｇａａａａｇａｔａｔｔｇｃｃｔｔｇｃｔａａａｇｃｔａａｇｃａｇｔｃｃｔｇｃｃｇｔｃａｔｃａｃｔｇａｃａａａｇｔａａｔｃｃｃａｇｃｔｔｇｔｃｔｇｃｃａｔｃｃｃｃａａａｔｔａｔｇｔｇｇｔｃｇｃｔｇａｃｃｇｇａｃｃｇａａｔｇｔｔｔｃａｔｃａｃｔｇｇｃｔｇｇｇｇａｇａａａｃｃｃａａｇｇｔａｃｔｔｔｔｇｇａｇｃｔｇｇｃｃｔｔｃｔｃａａｇｇａａｇｃｃｃａｇｃｔｃｃｃｔｇｔｇａｔｔｇａｇａａｔａａａｇｔｇｔｇｃａａｔｃｇｃｔａｔｇａｇｔｔｔｃｔｇａａｔｇｇａａｇａｇｔｃｃａａｔｃｃａｃｃｇａａｃｔｃｔｇｔｇｃｔｇｇｇｃａｔｔｔｇｇｃｃｇｇａｇｇｃａｃｔｇａｃａｇｔｔｇｃｃａｇｇｇｔｇａｃａｇｔｇｇａｇｇｔｃｃｔｃｔｇｇｔｔｔｇｃｔｔｃｇａｇａａｇｇａｃａａａｔａｃａｔｔｔｔａｃａａｇｇａｇｔｃａｃｔｔｃｔｔｇｇｇｇｔｃｔｔｇｇｃｔｇｔｇｃａｃｇｃｃｃｃａａｔａａｇｃｃｔｇｇｔｇｔｃｔａｔｇｔｔｃｇｔｇｔｔｔｃａａｇｇｔｔｔｇｔｔａｃｔｔｇｇａｔｔｇａｇｇｇａｇｔｇａｔｇａｇａａａｔａａｔｔａａ
配列２：
ＥＰＬＤＤＹＶＮＴＱＧＡＳＬＦＳＶＴＫＫＱＬＧＡＧＳＩＥＥＣＡＡＫＣＥＥＤＥＥＦＴＣＲＡＦＱＹＨＳＫＥＱＱＣＶＩＭＡＥＮＲＫＳＳＩＩＩＲＭＲＤＶＶＬＦＥＫＫＶＹＬＳＥＣＫＴＧＮＧＫＮＹＲＧＴＭＳＫＴＫＮＧＩＴＣＱＫＷＳＳＴＳＰＨＲＰＲＦＳＰＡＴＨＰＳＥＧＬＥＥＮＹＣＲＮＰＤＮＤＰＱＧＰＷＣＹＴＴＤＰＥＫＲＹＤＹＣＤＩＬＥＣＥＥＥＣＭＨＣＳＧＥＮＹＤＧＫＩＳＫＴＭＳＧＬＥＣＱＡＷＤＳＱＳＰＨＡＨＧＹＩＰＳＫＦＰＮＫＮＬＫＫＮＹＣＲＮＰＤＲＥＬＲＰＷＣＦＴＴＤＰＮＫＲＷＥＬＣＤＩＰＲＣＴＴＰＰＰＳＳＧＰＴＹＱＣＬＫＧＴＧＥＮＹＲＧＮＶＡＶＴＶＳＧＨＴＣＱＨＷＳＡＱＴＰＨＴＨＮＲＴＰＥＮＦＰＣＫＮＬＤＥＮＹＣＲＮＰＤＧＫＲＡＰＷＣＨＴＴＮＳＱＶＲＷＥＹＣＫＩＰＳＣＤＳＳＰＶＳＴＥＱＬＡＰＴＡＰＰＥＬＴＰＶＶＱＤＣＹＨＧＤＧＱＳＹＲＧＴＳＳＴＴＴＴＧＫＫＣＱＳＷＳＳＭＴＰＨＲＨＱＫＴＰＥＮＹＰＮＡＧＬＴＭＮＹＣＲＮＰＤＡＤＫＧＰＷＣＦＴＴＤＰＳＶＲＷＥＹＣＮＬＫＫＣＳＧＴＥＡＳＶＶＡＰＰＰＶＶＬＬＰＤＶＥＴＰＳＥＥＤＣＭＦＧＮＧＫＧＹＲＧＫＲＡＴＴＶＴＧＴＰＣＱＤＷＡＡＱＥＰＨＲＨＳＩＦＴＰＥＴＮＰＲＡＧＬＥＫＮＹＣＲＮＰＤＧＤＶＧＧＰＷＣＹＴＴＮＰＲＫＬＹＤＹＣＤＶＰＱＣＡＡＰＳＦＤＣＧＫＰＱＶＥＰＫＫＣＰＧＲＶＶＧＧＣＶＡＨＰＨＳＷＰＷＱＶＳＬＲＴＲＦＧＭＨＦＣＧＧＴＬＩＳＰＥＷＶＬＴＡＡＨＣＬＥＫＳＰＲＰＳＳＹＫＶＩＬＧＡＨＱＥＶＮＬＥＰＨＶＱＥＩＥＶＳＲＬＦＬＥＰＴＲＫＤＩＡＬＬＫＬＳＳＰＡＶＩＴＤＫＶＩＰＡＣＬＰＳＰＮＹＶＶＡＤＲＴＥＣＦＩＴＧＷＧＥＴＱＧＴＦＧＡＧＬＬＫＥＡＱＬＰＶＩＥＮＫＶＣＮＲＹＥＦＬＮＧＲＶＱＳＴＥＬＣＡＧＨＬＡＧＧＴＤＳＣＱＧＤＳＧＧＰＬＶＣＦＥＫＤＫＹＩＬＱＧＶＴＳＷＧＬＧＣＡＲＰＮＫＰＧＶＹＶＲＶＳＲＦＶＴＷＩＥＧＶＭＲＮＮ
配列３：
ａｔｇｇａａｃａｔａａｇｇａａｇｔｇｇｔｔｃｔｔｃｔａｃｔｔｃｔｔｔｔａｔｔｔｃｔｇａａａｔｃａｇｇｔｃａａｇｇａｇａｇｃｃｔｃｔｇｇａｔｇａｃｔａｔｇｔｇａａｔａｃｃｃａｇｇｇｇｇｃｔｔｃａｃｔｇｔｔｃａｇｔｇｔｃａｃｔａａｇａａｇｃａｇｃｔｇｇｇａｇｃａｇｇａａｇｔａｔａｇａａｇａａｔｇｔｇｃａｇｃａａａａｔｇｔｇａｇｇａｇｇａｃｇａａｇａａｔｔｃａｃｃｔｇｃａｇｇｇｃａｔｔｃｃａａｔａｔｃａｃａｇｔａａａｇａｇｃａａｃａａｔｇｔｇｔｇａｔａａｔｇｇｃｔｇａａａａｃａｇｇａａｇｔｃｃｔｃｃａｔａａｔｃａｔｔａｇｇａｔｇａｇａｇａｔｇｔａｇｔｔｔｔａｔｔｔｇａａａａｇａａａｇｔｇｔａｔｃｔｃｔｃａｇａｇｔｇｃａａｇａｃｔｇｇｇａａｔｇｇａａａｇａａｃｔａｃａｇａｇｇｇａｃｇａｔｇｔｃｃａａａａｃａａａａａａｔｇｇｃａｔｃａｃｃｔｇｔｃａａａａａｔｇｇａｇｔｔｃｃａｃｔｔｃｔｃｃｃｃａｃａｇａｃｃｔａｇａｔｔｃｔｃａｃｃｔｇｃｔａｃａｃａｃｃｃｃｔｃａｇａｇｇｇａｃｔｇｇａｇｇａｇａａｃｔａｃｔｇｃａｇｇａａｔｃｃａｇａｃａａｃｇａｔｃｃｇｃａｇｇｇｇｃｃｃｔｇｇｔｇｃｔａｔａｃｔａｃｔｇａｔｃｃａｇａａａａｇａｇａｔａｔｇａｃｔａｃｔｇｃｇａｃａｔｔｃｔｔｇａｇｔｇｔｇａａｇａｇｇａａｔｇｔａｔｇｃａｔｔｇｃａｇｔｇｇａｇａａａａｃｔａｔｇａｃｇｇｃａａａａｔｔｔｃｃａａｇａｃｃａｔｇｔｃｔｇｇａｃｔｇｇａａｔｇｃｃａｇｇｃｃｔｇｇｇａｃｔｃｔｃａｇａｇｃｃｃａｃａｃｇｃｔｃａｔｇｇａｔａｃａｔｔｃｃｔｔｃｃａａａｔｔｔｃｃａａａｃａａｇａａｃｃｔｇａａｇａａｇａａｔｔａｃｔｇｔｃｇｔａａｃｃｃｃｇａｔａｇｇｇａｇｃｔｇｃｇｇｃｃｔｔｇｇｔｇｔｔｔｃａｃｃａｃｃｇａｃｃｃｃａａｃａａｇｃｇｃｔｇｇｇａａｃｔｔｔｇｔｇａｃａｔｃｃｃｃｃｇｃｔｇｃａｃａａｃａｃｃｔｃｃａｃｃａｔｃｔｔｃｔｇｇｔｃｃｃａｃｃｔａｃｃａｇｔｇｔｃｔｇａａｇｇｇａａｃａｇｇｔｇａａａａｃｔａｔｃｇｃｇｇｇａａｔｇｔｇｇｃｔｇｔｔａｃｃｇｔｇｔｃｃｇｇｇｃａｃａｃｃｔｇｔｃａｇｃａｃｔｇｇａｇｔｇｃａｃａｇａｃｃｃｃｔｃａｃａｃａｃａｔａａｃａｇｇａｃａｃｃａｇａａａａｃｔｔｃｃｃｃｔｇｃａａａａａｔｔｔｇｇａｔｇａａａａｃｔａｃｔｇｃｃｇｃａａｔｃｃｔｇａｃｇｇａａａａａｇｇｇｃｃｃｃａｔｇｇｔｇｃｃａｔａｃａａｃｃａａｃａｇｃｃａａｇｔｇｃｇｇｔｇｇｇａｇｔａｃｔｇｔａａｇａｔａｃｃｇｔｃｃｔｇｔｇａｃｔｃｃｔｃｃｃｃａｇｔａｔｃｃａｃｇｇａａｃａａｔｔｇｇｃｔｃｃｃａｃａｇｃａｃｃａｃｃｔｇａｇｃｔａａｃｃｃｃｔｇｔｇｇｔｃｃａｇｇａｃｔｇｃｔａｃｃａｔｇｇｔｇａｔｇｇａｃａｇａｇｃｔａｃｃｇａｇｇｃａｃａｔｃｃｔｃｃａｃｃａｃｃａｃｃａｃａｇｇａａａｇａａｇｔｇｔｃａｇｔｃｔｔｇｇｔｃａｔｃｔａｔｇａｃａｃｃａｃａｃｃｇｇｃａｃｃａｇａａｇａｃｃｃｃａｇａａａａｃｔａｃｃｃａａａｔｇｃｔｇｇｃｃｔｇａｃａａｔｇａａｃｔａｃｔｇｃａｇｇａａｔｃｃａｇａｔｇｃｃｇａｔａａａｇｇｃｃｃｃｔｇｇｔｇｔｔｔｔａｃｃａｃａｇａｃｃｃｃａｇｃｇｔｃａｇｇｔｇｇｇａｇｔａｃｔｇｃａａｃｃｔｇａａａａａａｔｇｃｔｃａｇｇａａｃａｇａａｇｃｇａｇｔｇｔｔｇｔａｇｃａｃｃｔｃｃｇｃｃｔｇｔｔｇｔｃｃｔｇｃｔｔｃｃａｇａｔｇｔａｇａｇａｃｔｃｃｔｔｃｃｇａａｇａａｇａｃｔｇｔａｔｇｔｔｔｇｇｇａａｔｇｇｇａａａｇｇａｔａｃｃｇａｇｇｃａａｇａｇｇｇｃｇａｃｃａｃｔｇｔｔａｃｔｇｇｇａｃｇｃｃａｔｇｃｃａｇｇａｃｔｇｇｇｃｔｇｃｃｃａｇｇａｇｃｃｃｃａｔａｇａｃａｃａｇｃａｔｔｔｔｃａｃｔｃｃａｇａｇａｃａａａｔｃｃａｃｇｇｇｃｇｇｇｔｃｔｇｇａａａａａａａｔｔａｃｔｇｃｃｇｔａａｃｃｃｔｇａｔｇｇｔｇａｔｇｔａｇｇｔｇｇｔｃｃｃｔｇｇｔｇｃｔａｃａｃｇａｃａａａｔｃｃａａｇａａａａｃｔｔｔａｃｇａｃｔａｃｔｇｔｇａｔｇｔｃｃｃｔｃａｇｔｇｔｇｃｇｇｃｃｃｃｔｔｃａｔｔｔｇａｔｔｇｔｇｇｇａａｇｃｃｔｃａａｇｔｇｇａｇｃｃｇａａｇａａａｔｇｔｃｃｔｇｇａａｇｇｇｔｔｇｔａｇｇｇｇｇｇｔｇｔｇｔｇｇｃｃｃａｃｃｃａｃａｔｔｃｃｔｇｇｃｃｃｔｇｇｃａａｇｔｃａｇｔｃｔｔａｇａａｃａａｇｇｔｔｔｇｇａａｔｇｃａｃｔｔｃｔｇｔｇｇａｇｇｃａｃｃｔｔｇａｔａｔｃｃｃｃａｇａｇｔｇｇｇｔｇｔｔｇａｃｔｇｃｔｇｃｃｃａｃｔｇｃｔｔｇｇａｇａａｇｔｃｃｃｃａａｇｇｃｃｔｔｃａｔｃｃｔａｃａａｇｇｔｃａｔｃｃｔｇｇｇｔｇｃａｃａｃｃａａｇａａｇｔｇａａｔｃｔｃｇａａｃｃｇｃａｔｇｔｔｃａｇｇａａａｔａｇａａｇｔｇｔｃｔａｇｇｃｔｇｔｔｃｔｔｇｇａｇｃｃｃａｃａｃｇａａａａｇａｔａｔｔｇｃｃｔｔｇｃｔａａａｇｃｔａａｇｃａｇｔｃｃｔｇｃｃｇｔｃａｔｃａｃｔｇａｃａａａｇｔａａｔｃｃｃａｇｃｔｔｇｔｃｔｇｃｃａｔｃｃｃｃａａａｔｔａｔｇｔｇｇｔｃｇｃｔｇａｃｃｇｇａｃｃｇａａｔｇｔｔｔｃａｔｃａｃｔｇｇｃｔｇｇｇｇａｇａａａｃｃｃａａｇｇｔａｃｔｔｔｔｇｇａｇｃｔｇｇｃｃｔｔｃｔｃａａｇｇａａｇｃｃｃａｇｃｔｃｃｃｔｇｔｇａｔｔｇａｇａａｔａａａｇｔｇｔｇｃａａｔｃｇｃｔａｔｇａｇｔｔｔｃｔｇａａｔｇｇａａｇａｇｔｃｃａａｔｃｃａｃｃｇａａｃｔｃｔｇｔｇｃｔｇｇｇｃａｔｔｔｇｇｃｃｇｇａｇｇｃａｃｔｇａｃａｇｔｔｇｃｃａｇｇｇｔｇａｃａｇｔｇｇａｇｇｔｃｃｔｃｔｇｇｔｔｔｇｃｔｔｃｇａｇａａｇｇａｃａａａｔａｃａｔｔｔｔａｃａａｇｇａｇｔｃａｃｔｔｃｔｔｇｇｇｇｔｃｔｔｇｇｃｔｇｔｇｃａｃｇｃｃｃｃａａｔａａｇｃｃｔｇｇｔｇｔｃｔａｔｇｔｔｃｇｔｇｔｔｔｃａａｇｇｔｔｔｇｔｔａｃｔｔｇｇａｔｔｇａｇｇｇａｇｔｇａｔｇａｇａａａｔａａｔｔａａ
配列４：
ＭＥＨＫＥＶＶＬＬＬＬＬＦＬＫＳＧＱＧＥＰＬＤＤＹＶＮＴＱＧＡＳＬＦＳＶＴＫＫＱＬＧＡＧＳＩＥＥＣＡＡＫＣＥＥＤＥＥＦＴＣＲＡＦＱＹＨＳＫＥＱＱＣＶＩＭＡＥＮＲＫＳＳＩＩＩＲＭＲＤＶＶＬＦＥＫＫＶＹＬＳＥＣＫＴＧＮＧＫＮＹＲＧＴＭＳＫＴＫＮＧＩＴＣＱＫＷＳＳＴＳＰＨＲＰＲＦＳＰＡＴＨＰＳＥＧＬＥＥＮＹＣＲＮＰＤＮＤＰＱＧＰＷＣＹＴＴＤＰＥＫＲＹＤＹＣＤＩＬＥＣＥＥＥＣＭＨＣＳＧＥＮＹＤＧＫＩＳＫＴＭＳＧＬＥＣＱＡＷＤＳＱＳＰＨＡＨＧＹＩＰＳＫＦＰＮＫＮＬＫＫＮＹＣＲＮＰＤＲＥＬＲＰＷＣＦＴＴＤＰＮＫＲＷＥＬＣＤＩＰＲＣＴＴＰＰＰＳＳＧＰＴＹＱＣＬＫＧＴＧＥＮＹＲＧＮＶＡＶＴＶＳＧＨＴＣＱＨＷＳＡＱＴＰＨＴＨＮＲＴＰＥＮＦＰＣＫＮＬＤＥＮＹＣＲＮＰＤＧＫＲＡＰＷＣＨＴＴＮＳＱＶＲＷＥＹＣＫＩＰＳＣＤＳＳＰＶＳＴＥＱＬＡＰＴＡＰＰＥＬＴＰＶＶＱＤＣＹＨＧＤＧＱＳＹＲＧＴＳＳＴＴＴＴＧＫＫＣＱＳＷＳＳＭＴＰＨＲＨＱＫＴＰＥＮＹＰＮＡＧＬＴＭＮＹＣＲＮＰＤＡＤＫＧＰＷＣＦＴＴＤＰＳＶＲＷＥＹＣＮＬＫＫＣＳＧＴＥＡＳＶＶＡＰＰＰＶＶＬＬＰＤＶＥＴＰＳＥＥＤＣＭＦＧＮＧＫＧＹＲＧＫＲＡＴＴＶＴＧＴＰＣＱＤＷＡＡＱＥＰＨＲＨＳＩＦＴＰＥＴＮＰＲＡＧＬＥＫＮＹＣＲＮＰＤＧＤＶＧＧＰＷＣＹＴＴＮＰＲＫＬＹＤＹＣＤＶＰＱＣＡＡＰＳＦＤＣＧＫＰＱＶＥＰＫＫＣＰＧＲＶＶＧＧＣＶＡＨＰＨＳＷＰＷＱＶＳＬＲＴＲＦＧＭＨＦＣＧＧＴＬＩＳＰＥＷＶＬＴＡＡＨＣＬＥＫＳＰＲＰＳＳＹＫＶＩＬＧＡＨＱＥＶＮＬＥＰＨＶＱＥＩＥＶＳＲＬＦＬＥＰＴＲＫＤＩＡＬＬＫＬＳＳＰＡＶＩＴＤＫＶＩＰＡＣＬＰＳＰＮＹＶＶＡＤＲＴＥＣＦＩＴＧＷＧＥＴＱＧＴＦＧＡＧＬＬＫＥＡＱＬＰＶＩＥＮＫＶＣＮＲＹＥＦＬＮＧＲＶＱＳＴＥＬＣＡＧＨＬＡＧＧＴＤＳＣＱＧＤＳＧＧＰＬＶＣＦＥＫＤＫＹＩＬＱＧＶＴＳＷＧＬＧＣＡＲＰＮＫＰＧＶＹＶＲＶＳＲＦＶＴＷＩＥＧＶＭＲＮＮ
配列５：
ａａａｇｔｇｔａｔｃｔｃｔｃａｇａｇｔｇｃａａｇａｃｔｇｇｇａａｔｇｇａａａｇａａｃｔａｃａｇａｇｇｇａｃｇａｔｇｔｃｃａａａａｃａａａａａａｔｇｇｃａｔｃａｃｃｔｇｔｃａａａａａｔｇｇａｇｔｔｃｃａｃｔｔｃｔｃｃｃｃａｃａｇａｃｃｔａｇａｔｔｃｔｃａｃｃｔｇｃｔａｃａｃａｃｃｃｃｔｃａｇａｇｇｇａｃｔｇｇａｇｇａｇａａｃｔａｃｔｇｃａｇｇａａｔｃｃａｇａｃａａｃｇａｔｃｃｇｃａｇｇｇｇｃｃｃｔｇｇｔｇｃｔａｔａｃｔａｃｔｇａｔｃｃａｇａａａａｇａｇａｔａｔｇａｃｔａｃｔｇｃｇａｃａｔｔｃｔｔｇａｇｔｇｔｇａａｇａｇｇａａｔｇｔａｔｇｃａｔｔｇｃａｇｔｇｇａｇａａａａｃｔａｔｇａｃｇｇｃａａａａｔｔｔｃｃａａｇａｃｃａｔｇｔｃｔｇｇａｃｔｇｇａａｔｇｃｃａｇｇｃｃｔｇｇｇａｃｔｃｔｃａｇａｇｃｃｃａｃａｃｇｃｔｃａｔｇｇａｔａｃａｔｔｃｃｔｔｃｃａａａｔｔｔｃｃａａａｃａａｇａａｃｃｔｇａａｇａａｇａａｔｔａｃｔｇｔｃｇｔａａｃｃｃｃｇａｔａｇｇｇａｇｃｔｇｃｇｇｃｃｔｔｇｇｔｇｔｔｔｃａｃｃａｃｃｇａｃｃｃｃａａｃａａｇｃｇｃｔｇｇｇａａｃｔｔｔｇｔｇａｃａｔｃｃｃｃｃｇｃｔｇｃａｃａａｃａｃｃｔｃｃａｃｃａｔｃｔｔｃｔｇｇｔｃｃｃａｃｃｔａｃｃａｇｔｇｔｃｔｇａａｇｇｇａａｃａｇｇｔｇａａａａｃｔａｔｃｇｃｇｇｇａａｔｇｔｇｇｃｔｇｔｔａｃｃｇｔｇｔｃｃｇｇｇｃａｃａｃｃｔｇｔｃａｇｃａｃｔｇｇａｇｔｇｃａｃａｇａｃｃｃｃｔｃａｃａｃａｃａｔａａｃａｇｇａｃａｃｃａｇａａａａｃｔｔｃｃｃｃｔｇｃａａａａａｔｔｔｇｇａｔｇａａａａｃｔａｃｔｇｃｃｇｃａａｔｃｃｔｇａｃｇｇａａａａａｇｇｇｃｃｃｃａｔｇｇｔｇｃｃａｔａｃａａｃｃａａｃａｇｃｃａａｇｔｇｃｇｇｔｇｇｇａｇｔａｃｔｇｔａａｇａｔａｃｃｇｔｃｃｔｇｔｇａｃｔｃｃｔｃｃｃｃａｇｔａｔｃｃａｃｇｇａａｃａａｔｔｇｇｃｔｃｃｃａｃａｇｃａｃｃａｃｃｔｇａｇｃｔａａｃｃｃｃｔｇｔｇｇｔｃｃａｇｇａｃｔｇｃｔａｃｃａｔｇｇｔｇａｔｇｇａｃａｇａｇｃｔａｃｃｇａｇｇｃａｃａｔｃｃｔｃｃａｃｃａｃｃａｃｃａｃａｇｇａａａｇａａｇｔｇｔｃａｇｔｃｔｔｇｇｔｃａｔｃｔａｔｇａｃａｃｃａｃａｃｃｇｇｃａｃｃａｇａａｇａｃｃｃｃａｇａａａａｃｔａｃｃｃａａａｔｇｃｔｇｇｃｃｔｇａｃａａｔｇａａｃｔａｃｔｇｃａｇｇａａｔｃｃａｇａｔｇｃｃｇａｔａａａｇｇｃｃｃｃｔｇｇｔｇｔｔｔｔａｃｃａｃａｇａｃｃｃｃａｇｃｇｔｃａｇｇｔｇｇｇａｇｔａｃｔｇｃａａｃｃｔｇａａａａａａｔｇｃｔｃａｇｇａａｃａｇａａｇｃｇａｇｔｇｔｔｇｔａｇｃａｃｃｔｃｃｇｃｃｔｇｔｔｇｔｃｃｔｇｃｔｔｃｃａｇａｔｇｔａｇａｇａｃｔｃｃｔｔｃｃｇａａｇａａｇａｃｔｇｔａｔｇｔｔｔｇｇｇａａｔｇｇｇａａａｇｇａｔａｃｃｇａｇｇｃａａｇａｇｇｇｃｇａｃｃａｃｔｇｔｔａｃｔｇｇｇａｃｇｃｃａｔｇｃｃａｇｇａｃｔｇｇｇｃｔｇｃｃｃａｇｇａｇｃｃｃｃａｔａｇａｃａｃａｇｃａｔｔｔｔｃａｃｔｃｃａｇａｇａｃａａａｔｃｃａｃｇｇｇｃｇｇｇｔｃｔｇｇａａａａａａａｔｔａｃｔｇｃｃｇｔａａｃｃｃｔｇａｔｇｇｔｇａｔｇｔａｇｇｔｇｇｔｃｃｃｔｇｇｔｇｃｔａｃａｃｇａｃａａａｔｃｃａａｇａａａａｃｔｔｔａｃｇａｃｔａｃｔｇｔｇａｔｇｔｃｃｃｔｃａｇｔｇｔｇｃｇｇｃｃｃｃｔｔｃａｔｔｔｇａｔｔｇｔｇｇｇａａｇｃｃｔｃａａｇｔｇｇａｇｃｃｇａａｇａａａｔｇｔｃｃｔｇｇａａｇｇｇｔｔｇｔａｇｇｇｇｇｇｔｇｔｇｔｇｇｃｃｃａｃｃｃａｃａｔｔｃｃｔｇｇｃｃｃｔｇｇｃａａｇｔｃａｇｔｃｔｔａｇａａｃａａｇｇｔｔｔｇｇａａｔｇｃａｃｔｔｃｔｇｔｇｇａｇｇｃａｃｃｔｔｇａｔａｔｃｃｃｃａｇａｇｔｇｇｇｔｇｔｔｇａｃｔｇｃｔｇｃｃｃａｃｔｇｃｔｔｇｇａｇａａｇｔｃｃｃｃａａｇｇｃｃｔｔｃａｔｃｃｔａｃａａｇｇｔｃａｔｃｃｔｇｇｇｔｇｃａｃａｃｃａａｇａａｇｔｇａａｔｃｔｃｇａａｃｃｇｃａｔｇｔｔｃａｇｇａａａｔａｇａａｇｔｇｔｃｔａｇｇｃｔｇｔｔｃｔｔｇｇａｇｃｃｃａｃａｃｇａａａａｇａｔａｔｔｇｃｃｔｔｇｃｔａａａｇｃｔａａｇｃａｇｔｃｃｔｇｃｃｇｔｃａｔｃａｃｔｇａｃａａａｇｔａａｔｃｃｃａｇｃｔｔｇｔｃｔｇｃｃａｔｃｃｃｃａａａｔｔａｔｇｔｇｇｔｃｇｃｔｇａｃｃｇｇａｃｃｇａａｔｇｔｔｔｃａｔｃａｃｔｇｇｃｔｇｇｇｇａｇａａａｃｃｃａａｇｇｔａｃｔｔｔｔｇｇａｇｃｔｇｇｃｃｔｔｃｔｃａａｇｇａａｇｃｃｃａｇｃｔｃｃｃｔｇｔｇａｔｔｇａｇａａｔａａａｇｔｇｔｇｃａａｔｃｇｃｔａｔｇａｇｔｔｔｃｔｇａａｔｇｇａａｇａｇｔｃｃａａｔｃｃａｃｃｇａａｃｔｃｔｇｔｇｃｔｇｇｇｃａｔｔｔｇｇｃｃｇｇａｇｇｃａｃｔｇａｃａｇｔｔｇｃｃａｇｇｇｔｇａｃａｇｔｇｇａｇｇｔｃｃｔｃｔｇｇｔｔｔｇｃｔｔｃｇａｇａａｇｇａｃａａａｔａｃａｔｔｔｔａｃａａｇｇａｇｔｃａｃｔｔｃｔｔｇｇｇｇｔｃｔｔｇｇｃｔｇｔｇｃａｃｇｃｃｃｃａａｔａａｇｃｃｔｇｇｔｇｔｃｔａｔｇｔｔｃｇｔｇｔｔｔｃａａｇｇｔｔｔｇｔｔａｃｔｔｇｇａｔｔｇａｇｇｇａｇｔｇａｔｇａｇａａａｔａａｔｔａａ
配列６：
ＫＶＹＬＳＥＣＫＴＧＮＧＫＮＹＲＧＴＭＳＫＴＫＮＧＩＴＣＱＫＷＳＳＴＳＰＨＲＰＲＦＳＰＡＴＨＰＳＥＧＬＥＥＮＹＣＲＮＰＤＮＤＰＱＧＰＷＣＹＴＴＤＰＥＫＲＹＤＹＣＤＩＬＥＣＥＥＥＣＭＨＣＳＧＥＮＹＤＧＫＩＳＫＴＭＳＧＬＥＣＱＡＷＤＳＱＳＰＨＡＨＧＹＩＰＳＫＦＰＮＫＮＬＫＫＮＹＣＲＮＰＤＲＥＬＲＰＷＣＦＴＴＤＰＮＫＲＷＥＬＣＤＩＰＲＣＴＴＰＰＰＳＳＧＰＴＹＱＣＬＫＧＴＧＥＮＹＲＧＮＶＡＶＴＶＳＧＨＴＣＱＨＷＳＡＱＴＰＨＴＨＮＲＴＰＥＮＦＰＣＫＮＬＤＥＮＹＣＲＮＰＤＧＫＲＡＰＷＣＨＴＴＮＳＱＶＲＷＥＹＣＫＩＰＳＣＤＳＳＰＶＳＴＥＱＬＡＰＴＡＰＰＥＬＴＰＶＶＱＤＣＹＨＧＤＧＱＳＹＲＧＴＳＳＴＴＴＴＧＫＫＣＱＳＷＳＳＭＴＰＨＲＨＱＫＴＰＥＮＹＰＮＡＧＬＴＭＮＹＣＲＮＰＤＡＤＫＧＰＷＣＦＴＴＤＰＳＶＲＷＥＹＣＮＬＫＫＣＳＧＴＥＡＳＶＶＡＰＰＰＶＶＬＬＰＤＶＥＴＰＳＥＥＤＣＭＦＧＮＧＫＧＹＲＧＫＲＡＴＴＶＴＧＴＰＣＱＤＷＡＡＱＥＰＨＲＨＳＩＦＴＰＥＴＮＰＲＡＧＬＥＫＮＹＣＲＮＰＤＧＤＶＧＧＰＷＣＹＴＴＮＰＲＫＬＹＤＹＣＤＶＰＱＣＡＡＰＳＦＤＣＧＫＰＱＶＥＰＫＫＣＰＧＲＶＶＧＧＣＶＡＨＰＨＳＷＰＷＱＶＳＬＲＴＲＦＧＭＨＦＣＧＧＴＬＩＳＰＥＷＶＬＴＡＡＨＣＬＥＫＳＰＲＰＳＳＹＫＶＩＬＧＡＨＱＥＶＮＬＥＰＨＶＱＥＩＥＶＳＲＬＦＬＥＰＴＲＫＤＩＡＬＬＫＬＳＳＰＡＶＩＴＤＫＶＩＰＡＣＬＰＳＰＮＹＶＶＡＤＲＴＥＣＦＩＴＧＷＧＥＴＱＧＴＦＧＡＧＬＬＫＥＡＱＬＰＶＩＥＮＫＶＣＮＲＹＥＦＬＮＧＲＶＱＳＴＥＬＣＡＧＨＬＡＧＧＴＤＳＣＱＧＤＳＧＧＰＬＶＣＦＥＫＤＫＹＩＬＱＧＶＴＳＷＧＬＧＣＡＲＰＮＫＰＧＶＹＶＲＶＳＲＦＶＴＷＩＥＧＶＭＲＮＮ
配列７：
ｇａｇｃｃｔｃｔｇｇａｔｇａｃｔａｔｇｔｇａａｔａｃｃｃａｇｇｇｇｇｃｔｔｃａｃｔｇｔｔｃａｇｔｇｔｃａｃｔａａｇａａｇｃａｇｃｔｇｇｇａｇｃａｇｇａａｇｔａｔａｇａａｇａａｔｇｔｇｃａｇｃａａａａｔｇｔｇａｇｇａｇｇａｃｇａａｇａａｔｔｃａｃｃｔｇｃａｇｇｇｃａｔｔｃｃａａｔａｔｃａｃａｇｔａａａｇａｇｃａａｃａａｔｇｔｇｔｇａｔａａｔｇｇｃｔｇａａａａｃａｇｇａａｇｔｃｃｔｃｃａｔａａｔｃａｔｔａｇｇａｔｇａｇａｇａｔｇｔａｇｔｔｔｔａｔｔｔｇａａａａｇａａａｇｔｇｔａｔｃｔｃｔｃａｇａｇｔｇｃａａｇａｃｔｇｇｇａａｔｇｇａａａｇａａｃｔａｃａｇａｇｇｇａｃｇａｔｇｔｃｃａａａａｃａａａａａａｔｇｇｃａｔｃａｃｃｔｇｔｃａａａａａｔｇｇａｇｔｔｃｃａｃｔｔｃｔｃｃｃｃａｃａｇａｃｃｔａｇａｔｔｃｔｃａｃｃｔｇｃｔａｃａｃａｃｃｃｃｔｃａｇａｇｇｇａｃｔｇｇａｇｇａｇａａｃｔａｃｔｇｃａｇｇａａｔｃｃａｇａｃａａｃｇａｔｃｃｇｃａｇｇｇｇｃｃｃｔｇｇｔｇｃｔａｔａｃｔａｃｔｇａｔｃｃａｇａａａａｇａｇａｔａｔｇａｃｔａｃｔｇｃｇａｃａｔｔｃｔｔｇａｇｔｇｔｇａａｇａｇｇｃｇｇｃｃｃｃｔｔｃａｔｔｔｇａｔｔｇｔｇｇｇａａｇｃｃｔｃａａｇｔｇｇａｇｃｃｇａａｇａａａｔｇｔｃｃｔｇｇａａｇｇｇｔｔｇｔａｇｇｇｇｇｇｔｇｔｇｔｇｇｃｃｃａｃｃｃａｃａｔｔｃｃｔｇｇｃｃｃｔｇｇｃａａｇｔｃａｇｔｃｔｔａｇａａｃａａｇｇｔｔｔｇｇａａｔｇｃａｃｔｔｃｔｇｔｇｇａｇｇｃａｃｃｔｔｇａｔａｔｃｃｃｃａｇａｇｔｇｇｇｔｇｔｔｇａｃｔｇｃｔｇｃｃｃａｃｔｇｃｔｔｇｇａｇａａｇｔｃｃｃｃａａｇｇｃｃｔｔｃａｔｃｃｔａｃａａｇｇｔｃａｔｃｃｔｇｇｇｔｇｃａｃａｃｃａａｇａａｇｔｇａａｔｃｔｃｇａａｃｃｇｃａｔｇｔｔｃａｇｇａａａｔａｇａａｇｔｇｔｃｔａｇｇｃｔｇｔｔｃｔｔｇｇａｇｃｃｃａｃａｃｇａａａａｇａｔａｔｔｇｃｃｔｔｇｃｔａａａｇｃｔａａｇｃａｇｔｃｃｔｇｃｃｇｔｃａｔｃａｃｔｇａｃａａａｇｔａａｔｃｃｃａｇｃｔｔｇｔｃｔｇｃｃａｔｃｃｃｃａａａｔｔａｔｇｔｇｇｔｃｇｃｔｇａｃｃｇｇａｃｃｇａａｔｇｔｔｔｃａｔｃａｃｔｇｇｃｔｇｇｇｇａｇａａａｃｃｃａａｇｇｔａｃｔｔｔｔｇｇａｇｃｔｇｇｃｃｔｔｃｔｃａａｇｇａａｇｃｃｃａｇｃｔｃｃｃｔｇｔｇａｔｔｇａｇａａｔａａａｇｔｇｔｇｃａａｔｃｇｃｔａｔｇａｇｔｔｔｃｔｇａａｔｇｇａａｇａｇｔｃｃａａｔｃｃａｃｃｇａａｃｔｃｔｇｔｇｃｔｇｇｇｃａｔｔｔｇｇｃｃｇｇａｇｇｃａｃｔｇａｃａｇｔｔｇｃｃａｇｇｇｔｇａｃａｇｔｇｇａｇｇｔｃｃｔｃｔｇｇｔｔｔｇｃｔｔｃｇａｇａａｇｇａｃａａａｔａｃａｔｔｔｔａｃａａｇｇａｇｔｃａｃｔｔｃｔｔｇｇｇｇｔｃｔｔｇｇｃｔｇｔｇｃａｃｇｃｃｃｃａａｔａａｇｃｃｔｇｇｔｇｔｃｔａｔｇｔｔｃｇｔｇｔｔｔｃａａｇｇｔｔｔｇｔｔａｃｔｔｇｇａｔｔｇａｇｇｇａｇｔｇａｔｇａｇａａａｔａａｔｔａａ
配列８：
ＥＰＬＤＤＹＶＮＴＱＧＡＳＬＦＳＶＴＫＫＱＬＧＡＧＳＩＥＥＣＡＡＫＣＥＥＤＥＥＦＴＣＲＡＦＱＹＨＳＫＥＱＱＣＶＩＭＡＥＮＲＫＳＳＩＩＩＲＭＲＤＶＶＬＦＥＫＫＶＹＬＳＥＣＫＴＧＮＧＫＮＹＲＧＴＭＳＫＴＫＮＧＩＴＣＱＫＷＳＳＴＳＰＨＲＰＲＦＳＰＡＴＨＰＳＥＧＬＥＥＮＹＣＲＮＰＤＮＤＰＱＧＰＷＣＹＴＴＤＰＥＫＲＹＤＹＣＤＩＬＥＣＥＥＡＡＰＳＦＤＣＧＫＰＱＶＥＰＫＫＣＰＧＲＶＶＧＧＣＶＡＨＰＨＳＷＰＷＱＶＳＬＲＴＲＦＧＭＨＦＣＧＧＴＬＩＳＰＥＷＶＬＴＡＡＨＣＬＥＫＳＰＲＰＳＳＹＫＶＩＬＧＡＨＱＥＶＮＬＥＰＨＶＱＥＩＥＶＳＲＬＦＬＥＰＴＲＫＤＩＡＬＬＫＬＳＳＰＡＶＩＴＤＫＶＩＰＡＣＬＰＳＰＮＹＶＶＡＤＲＴＥＣＦＩＴＧＷＧＥＴＱＧＴＦＧＡＧＬＬＫＥＡＱＬＰＶＩＥＮＫＶＣＮＲＹＥＦＬＮＧＲＶＱＳＴＥＬＣＡＧＨＬＡＧＧＴＤＳＣＱＧＤＳＧＧＰＬＶＣＦＥＫＤＫＹＩＬＱＧＶＴＳＷＧＬＧＣＡＲＰＮＫＰＧＶＹＶＲＶＳＲＦＶＴＷＩＥＧＶＭＲＮＮ
配列９：
ｇｔｃａｇｇｔｇｇｇａｇｔａｃｔｇｃａａｃｃｔｇａａａａａａｔｇｃｔｃａｇｇａａｃａｇａａｇｃｇａｇｔｇｔｔｇｔａｇｃａｃｃｔｃｃｇｃｃｔｇｔｔｇｔｃｃｔｇｃｔｔｃｃａｇａｔｇｔａｇａｇａｃｔｃｃｔｔｃｃｇａａｇａａｇａｃｔｇｔａｔｇｔｔｔｇｇｇａａｔｇｇｇａａａｇｇａｔａｃｃｇａｇｇｃａａｇａｇｇｇｃｇａｃｃａｃｔｇｔｔａｃｔｇｇｇａｃｇｃｃａｔｇｃｃａｇｇａｃｔｇｇｇｃｔｇｃｃｃａｇｇａｇｃｃｃｃａｔａｇａｃａｃａｇｃａｔｔｔｔｃａｃｔｃｃａｇａｇａｃａａａｔｃｃａｃｇｇｇｃｇｇｇｔｃｔｇｇａａａａａａａｔｔａｃｔｇｃｃｇｔａａｃｃｃｔｇａｔｇｇｔｇａｔｇｔａｇｇｔｇｇｔｃｃｃｔｇｇｔｇｃｔａｃａｃｇａｃａａａｔｃｃａａｇａａａａｃｔｔｔａｃｇａｃｔａｃｔｇｔｇａｔｇｔｃｃｃｔｃａｇｔｇｔｇｃｇｇｃｃｃｃｔｔｃａｔｔｔｇａｔｔｇｔｇｇｇａａｇｃｃｔｃａａｇｔｇｇａｇｃｃｇａａｇａａａｔｇｔｃｃｔｇｇａａｇｇｇｔｔｇｔａｇｇｇｇｇｇｔｇｔｇｔｇｇｃｃｃａｃｃｃａｃａｔｔｃｃｔｇｇｃｃｃｔｇｇｃａａｇｔｃａｇｔｃｔｔａｇａａｃａａｇｇｔｔｔｇｇａａｔｇｃａｃｔｔｃｔｇｔｇｇａｇｇｃａｃｃｔｔｇａｔａｔｃｃｃｃａｇａｇｔｇｇｇｔｇｔｔｇａｃｔｇｃｔｇｃｃｃａｃｔｇｃｔｔｇｇａｇａａｇｔｃｃｃｃａａｇｇｃｃｔｔｃａｔｃｃｔａｃａａｇｇｔｃａｔｃｃｔｇｇｇｔｇｃａｃａｃｃａａｇａａｇｔｇａａｔｃｔｃｇａａｃｃｇｃａｔｇｔｔｃａｇｇａａａｔａｇａａｇｔｇｔｃｔａｇｇｃｔｇｔｔｃｔｔｇｇａｇｃｃｃａｃａｃｇａａａａｇａｔａｔｔｇｃｃｔｔｇｃｔａａａｇｃｔａａｇｃａｇｔｃｃｔｇｃｃｇｔｃａｔｃａｃｔｇａｃａａａｇｔａａｔｃｃｃａｇｃｔｔｇｔｃｔｇｃｃａｔｃｃｃｃａａａｔｔａｔｇｔｇｇｔｃｇｃｔｇａｃｃｇｇａｃｃｇａａｔｇｔｔｔｃａｔｃａｃｔｇｇｃｔｇｇｇｇａｇａａａｃｃｃａａｇｇｔａｃｔｔｔｔｇｇａｇｃｔｇｇｃｃｔｔｃｔｃａａｇｇａａｇｃｃｃａｇｃｔｃｃｃｔｇｔｇａｔｔｇａｇａａｔａａａｇｔｇｔｇｃａａｔｃｇｃｔａｔｇａｇｔｔｔｃｔｇａａｔｇｇａａｇａｇｔｃｃａａｔｃｃａｃｃｇａａｃｔｃｔｇｔｇｃｔｇｇｇｃａｔｔｔｇｇｃｃｇｇａｇｇｃａｃｔｇａｃａｇｔｔｇｃｃａｇｇｇｔｇａｃａｇｔｇｇａｇｇｔｃｃｔｃｔｇｇｔｔｔｇｃｔｔｃｇａｇａａｇｇａｃａａａｔａｃａｔｔｔｔａｃａａｇｇａｇｔｃａｃｔｔｃｔｔｇｇｇｇｔｃｔｔｇｇｃｔｇｔｇｃａｃｇｃｃｃｃａａｔａａｇｃｃｔｇｇｔｇｔｃｔａｔｇｔｔｃｇｔｇｔｔｔｃａａｇｇｔｔｔｇｔｔａｃｔｔｇｇａｔｔｇａｇｇｇａｇｔｇａｔｇａｇａａａｔａａｔｔａａ
配列１０：
ＶＲＷＥＹＣＮＬＫＫＣＳＧＴＥＡＳＶＶＡＰＰＰＶＶＬＬＰＤＶＥＴＰＳＥＥＤＣＭＦＧＮＧＫＧＹＲＧＫＲＡＴＴＶＴＧＴＰＣＱＤＷＡＡＱＥＰＨＲＨＳＩＦＴＰＥＴＮＰＲＡＧＬＥＫＮＹＣＲＮＰＤＧＤＶＧＧＰＷＣＹＴＴＮＰＲＫＬＹＤＹＣＤＶＰＱＣＡＡＰＳＦＤＣＧＫＰＱＶＥＰＫＫＣＰＧＲＶＶＧＧＣＶＡＨＰＨＳＷＰＷＱＶＳＬＲＴＲＦＧＭＨＦＣＧＧＴＬＩＳＰＥＷＶＬＴＡＡＨＣＬＥＫＳＰＲＰＳＳＹＫＶＩＬＧＡＨＱＥＶＮＬＥＰＨＶＱＥＩＥＶＳＲＬＦＬＥＰＴＲＫＤＩＡＬＬＫＬＳＳＰＡＶＩＴＤＫＶＩＰＡＣＬＰＳＰＮＹＶＶＡＤＲＴＥＣＦＩＴＧＷＧＥＴＱＧＴＦＧＡＧＬＬＫＥＡＱＬＰＶＩＥＮＫＶＣＮＲＹＥＦＬＮＧＲＶＱＳＴＥＬＣＡＧＨＬＡＧＧＴＤＳＣＱＧＤＳＧＧＰＬＶＣＦＥＫＤＫＹＩＬＱＧＶＴＳＷＧＬＧＣＡＲＰＮＫＰＧＶＹＶＲＶＳＲＦＶＴＷＩＥＧＶＭＲＮＮ
配列１１：
ｇｃｃｃｃｔｔｃａｔｔｔｇａｔｔｇｔｇｇｇａａｇｃｃｔｃａａｇｔｇｇａｇｃｃｇａａｇａａａｔｇｔｃｃｔｇｇａａｇｇｇｔｔｇｔａｇｇｇｇｇｇｔｇｔｇｔｇｇｃｃｃａｃｃｃａｃａｔｔｃｃｔｇｇｃｃｃｔｇｇｃａａｇｔｃａｇｔｃｔｔａｇａａｃａａｇｇｔｔｔｇｇａａｔｇｃａｃｔｔｃｔｇｔｇｇａｇｇｃａｃｃｔｔｇａｔａｔｃｃｃｃａｇａｇｔｇｇｇｔｇｔｔｇａｃｔｇｃｔｇｃｃｃａｃｔｇｃｔｔｇｇａｇａａｇｔｃｃｃｃａａｇｇｃｃｔｔｃａｔｃｃｔａｃａａｇｇｔｃａｔｃｃｔｇｇｇｔｇｃａｃａｃｃａａｇａａｇｔｇａａｔｃｔｃｇａａｃｃｇｃａｔｇｔｔｃａｇｇａａａｔａｇａａｇｔｇｔｃｔａｇｇｃｔｇｔｔｃｔｔｇｇａｇｃｃｃａｃａｃｇａａａａｇａｔａｔｔｇｃｃｔｔｇｃｔａａａｇｃｔａａｇｃａｇｔｃｃｔｇｃｃｇｔｃａｔｃａｃｔｇａｃａａａｇｔａａｔｃｃｃａｇｃｔｔｇｔｃｔｇｃｃａｔｃｃｃｃａａａｔｔａｔｇｔｇｇｔｃｇｃｔｇａｃｃｇｇａｃｃｇａａｔｇｔｔｔｃａｔｃａｃｔｇｇｃｔｇｇｇｇａｇａａａｃｃｃａａｇｇｔａｃｔｔｔｔｇｇａｇｃｔｇｇｃｃｔｔｃｔｃａａｇｇａａｇｃｃｃａｇｃｔｃｃｃｔｇｔｇａｔｔｇａｇａａｔａａａｇｔｇｔｇｃａａｔｃｇｃｔａｔｇａｇｔｔｔｃｔｇａａｔｇｇａａｇａｇｔｃｃａａｔｃｃａｃｃｇａａｃｔｃｔｇｔｇｃｔｇｇｇｃａｔｔｔｇｇｃｃｇｇａｇｇｃａｃｔｇａｃａｇｔｔｇｃｃａｇｇｇｔｇａｃａｇｔｇｇａｇｇｔｃｃｔｃｔｇｇｔｔｔｇｃｔｔｃｇａｇａａｇｇａｃａａａｔａｃａｔｔｔｔａｃａａｇｇａｇｔｃａｃｔｔｃｔｔｇｇｇｇｔｃｔｔｇｇｃｔｇｔｇｃａｃｇｃｃｃｃａａｔａａｇｃｃｔｇｇｔｇｔｃｔａｔｇｔｔｃｇｔｇｔｔｔｃａａｇｇｔｔｔｇｔｔａｃｔｔｇｇａｔｔｇａｇｇｇａｇｔｇａｔｇａｇａａａｔａａｔｔａａ
配列１２：
ＡＰＳＦＤＣＧＫＰＱＶＥＰＫＫＣＰＧＲＶＶＧＧＣＶＡＨＰＨＳＷＰＷＱＶＳＬＲＴＲＦＧＭＨＦＣＧＧＴＬＩＳＰＥＷＶＬＴＡＡＨＣＬＥＫＳＰＲＰＳＳＹＫＶＩＬＧＡＨＱＥＶＮＬＥＰＨＶＱＥＩＥＶＳＲＬＦＬＥＰＴＲＫＤＩＡＬＬＫＬＳＳＰＡＶＩＴＤＫＶＩＰＡＣＬＰＳＰＮＹＶＶＡＤＲＴＥＣＦＩＴＧＷＧＥＴＱＧＴＦＧＡＧＬＬＫＥＡＱＬＰＶＩＥＮＫＶＣＮＲＹＥＦＬＮＧＲＶＱＳＴＥＬＣＡＧＨＬＡＧＧＴＤＳＣＱＧＤＳＧＧＰＬＶＣＦＥＫＤＫＹＩＬＱＧＶＴＳＷＧＬＧＣＡＲＰＮＫＰＧＶＹＶＲＶＳＲＦＶＴＷＩＥＧＶＭＲＮＮ
配列１３：
ｇｔｔｇｔａｇｇｇｇｇｇｔｇｔｇｔｇｇｃｃｃａｃｃｃａｃａｔｔｃｃｔｇｇｃｃｃｔｇｇｃａａｇｔｃａｇｔｃｔｔａｇａａｃａａｇｇｔｔｔｇｇａａｔｇｃａｃｔｔｃｔｇｔｇｇａｇｇｃａｃｃｔｔｇａｔａｔｃｃｃｃａｇａｇｔｇｇｇｔｇｔｔｇａｃｔｇｃｔｇｃｃｃａｃｔｇｃｔｔｇｇａｇａａｇｔｃｃｃｃａａｇｇｃｃｔｔｃａｔｃｃｔａｃａａｇｇｔｃａｔｃｃｔｇｇｇｔｇｃａｃａｃｃａａｇａａｇｔｇａａｔｃｔｃｇａａｃｃｇｃａｔｇｔｔｃａｇｇａａａｔａｇａａｇｔｇｔｃｔａｇｇｃｔｇｔｔｃｔｔｇｇａｇｃｃｃａｃａｃｇａａａａｇａｔａｔｔｇｃｃｔｔｇｃｔａａａｇｃｔａａｇｃａｇｔｃｃｔｇｃｃｇｔｃａｔｃａｃｔｇａｃａａａｇｔａａｔｃｃｃａｇｃｔｔｇｔｃｔｇｃｃａｔｃｃｃｃａａａｔｔａｔｇｔｇｇｔｃｇｃｔｇａｃｃｇｇａｃｃｇａａｔｇｔｔｔｃａｔｃａｃｔｇｇｃｔｇｇｇｇａｇａａａｃｃｃａａｇｇｔａｃｔｔｔｔｇｇａｇｃｔｇｇｃｃｔｔｃｔｃａａｇｇａａｇｃｃｃａｇｃｔｃｃｃｔｇｔｇａｔｔｇａｇａａｔａａａｇｔｇｔｇｃａａｔｃｇｃｔａｔｇａｇｔｔｔｃｔｇａａｔｇｇａａｇａｇｔｃｃａａｔｃｃａｃｃｇａａｃｔｃｔｇｔｇｃｔｇｇｇｃａｔｔｔｇｇｃｃｇｇａｇｇｃａｃｔｇａｃａｇｔｔｇｃｃａｇｇｇｔｇａｃａｇｔｇｇａｇｇｔｃｃｔｃｔｇｇｔｔｔｇｃｔｔｃｇａｇａａｇｇａｃａａａｔａｃａｔｔｔｔａｃａａｇｇａｇｔｃａｃｔｔｃｔｔｇｇｇｇｔｃｔｔｇｇｃｔｇｔｇｃａｃｇｃｃｃｃａａｔａａｇｃｃｔｇｇｔｇｔｃｔａｔｇｔｔｃｇｔｇｔｔｔｃａａｇｇｔｔｔｇｔｔａｃｔｔｇｇａｔｔｇａｇｇｇａｇｔｇａｔｇａｇａ
配列１４：
ＶＶＧＧＣＶＡＨＰＨＳＷＰＷＱＶＳＬＲＴＲＦＧＭＨＦＣＧＧＴＬＩＳＰＥＷＶＬＴＡＡＨＣＬＥＫＳＰＲＰＳＳＹＫＶＩＬＧＡＨＱＥＶＮＬＥＰＨＶＱＥＩＥＶＳＲＬＦＬＥＰＴＲＫＤＩＡＬＬＫＬＳＳＰＡＶＩＴＤＫＶＩＰＡＣＬＰＳＰＮＹＶＶＡＤＲＴＥＣＦＩＴＧＷＧＥＴＱＧＴＦＧＡＧＬＬＫＥＡＱＬＰＶＩＥＮＫＶＣＮＲＹＥＦＬＮＧＲＶＱＳＴＥＬＣＡＧＨＬＡＧＧＴＤＳＣＱＧＤＳＧＧＰＬＶＣＦＥＫＤＫＹＩＬＱＧＶＴＳＷＧＬＧＣＡＲＰＮＫＰＧＶＹＶＲＶＳＲＦＶＴＷＩＥＧＶＭＲ
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【配列表】