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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-05-14
(45)【発行日】2024-05-22
(54)【発明の名称】急性脳損傷の治療のための化合物
(51)【国際特許分類】
C07C 59/54 20060101AFI20240515BHJP
C07C 59/56 20060101ALI20240515BHJP
C07C 69/757 20060101ALI20240515BHJP
C07C 69/708 20060101ALI20240515BHJP
A61K 31/192 20060101ALI20240515BHJP
A61K 31/22 20060101ALI20240515BHJP
A61K 31/215 20060101ALI20240515BHJP
A61K 31/198 20060101ALI20240515BHJP
A61K 31/196 20060101ALI20240515BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20240515BHJP
C07C 235/40 20060101ALI20240515BHJP
【ＦＩ】
C07C59/54 CSP
C07C59/56
C07C69/757 Z
C07C69/708 Z
A61K31/192
A61K31/22
A61K31/215
A61K31/198
A61K31/196
A61P25/00
C07C235/40
【請求項の数】
14
(21)【出願番号】P 2020542088
(86)(22)【出願日】2019-02-01
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2021-05-27
(86)【国際出願番号】 DK2019050041
(87)【国際公開番号】W WO2019149329
(87)【国際公開日】2019-08-08
【審査請求日】2022-01-31
(31)【優先権主張番号】PA201870067
(32)【優先日】2018-02-02
(33)【優先権主張国・地域又は機関】DK
【前置審査】
(73)【特許権者】
【識別番号】520281963
【氏名又は名称】コペンハーゲン大学
(73)【特許権者】
【識別番号】510244891
【氏名又は名称】オタゴ イノベーション リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100114775
【弁理士】
【氏名又は名称】高岡 亮一
(74)【代理人】
【識別番号】100121511
【弁理士】
【氏名又は名称】小田 直
(74)【代理人】
【識別番号】100202751
【弁理士】
【氏名又は名称】岩堀 明代
(74)【代理人】
【識別番号】100208580
【弁理士】
【氏名又は名称】三好 玲奈
(74)【代理人】
【識別番号】100191086
【弁理士】
【氏名又は名称】高橋 香元
(72)【発明者】
【氏名】クライン，アンダース ブエ
(72)【発明者】
【氏名】クラークソン，アンドリュー ネイル
(72)【発明者】
【氏名】ホールトン，ジョシュア マクドナルド
(72)【発明者】
【氏名】レウルス，ウルリケ
(72)【発明者】
【氏名】クラウセン，ラスマス プレトリウス
(72)【発明者】
【氏名】フロルンド，ベンテ
(72)【発明者】
【氏名】ウェレンドルフ，ペトリン
【審査官】高橋 直子
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１０－５００３５１（ＪＰ，Ａ）
【文献】米国特許第０５４６６７１５（ＵＳ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１３／０２４０２８（ＷＯ，Ａ１）
【文献】REGISTRY(STN)[online]，検索日2023年2月6日:2015.06.15 RN:1780717-73-8
【文献】SYNTHETIC COMMUNICATIONS，1980年，10(2)，119-125
【文献】New. J. Chem.，1992年，16，95-98
【文献】FONTENEAU L; ET AL，CHEMOENZYMATIC SYNTHESIS OF ENANTIOPURE ISOPROPYL (3R)-AND (3S)-3-HYDROXYCYCLOHEX-以下備考，TETRAHEDRON:ASYMMETRY，英国，2002年04月19日，VOL:13, NR:6，PAGE(S):579 - 585，http://dx.doi.org/10.1016/S0957-4166(02)00152-0，1-ENE-1-CARBOXYLATES AND THEIR REDUCTION TO ISOMERS OF ISOPROPYL 3-HYDROXY-以下省略
【文献】SUN H; ET AL，A NEW ROUTE INTO HEXAHYDRO-CYCLOPENTA[B]PYRROLE-CIS-3A,6-DIOLS. SYNTHESIS OF 以下備考，TETRAHEDRON，NL，2005年10月31日，VOL:61, NR:44，PAGE(S):10462 - 10469，https://doi.org/10.1016/j.tet.2005.08.055，CONSTRAINED BICYCLIC ANALOGUES OF PYRROLIDINE AZASUGARS
【文献】Green Chem.，2017年，19，5112-5130
【文献】PHIL HO LEE; ET AL，FREE RADICAL-MEDIATED RING EXPANSION REACTIONS: ENDOCYCLIC CLEAVAGE OF CYCLOPROPYLCARBINYL RADICALS，BULL. KOREAN CHEM. SOC，2000年，VOL:21, NR:6，PAGE(S):595 - 603，https://www.koreascience.or.kr/article/JAKO200013464476906.page1ff8
【文献】YIMON AYE; ET AL，PARALLEL KINETIC RESOLUTION OF TERT-BUTYL (RS)-3-OXY-SUBSTITUTED CYCLOPENT-1-ENE-以下備考，ORGANIC & BIOMOLECULAR CHEMISTRY，2008年，VOL:6, NR:12，PAGE(S):2195 - 2203，http://dx.doi.org/10.1039/b802428f，CARBOXYLATES FOR THE ASYMMETRIC SYNTHESIS OF 3-OXY-SUBSTITUTED CISPENTACIN AND 以下省略
【文献】J. Med. Chem.，2017年，60，9032-9039
【文献】J. Label Compd. Radiopharm，2016年，59，476-483
【文献】Bioorg. Med. Chem.，2014年，22，5313-5620
【文献】REGISTRY(STN)[online]，検索日2023年2月6日:2011.01.27RN:1260881-11-5
【文献】J. Med. Chem.，1983年，26，1353-1360
【文献】STINE B VOGENSEN; ET AL，NEW SYNTHESIS AND TRITIUM LABELING OF A SELECTIVE LIGAND FOR STUDYING HIGH-AFFINITY 以下備考，JOURNAL OF MEDICINAL CHEMISTRY，米国，2013年10月04日，VOL:56, NR:20，PAGE(S):8201 - 8205，http://dx.doi.org/10.1021/jm4011719，[GAMMA]-HYDROXYBUTYRATE (GHB) BINDING SITES
【文献】BAY TINA; ET AL，GHB RECEPTOR TARGETS IN THE CNS: FOCUS ON HIGH-AFFINITY BINDING SITES，BIOCHEMICAL PHARMACOLOGY，米国，ELSEVIER，2013年11月20日，VOL:87, NR:2，PAGE(S):220 - 228，http://dx.doi.org/10.1016/j.bcp.2013.10.028
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ０７Ｃ ５９／５６
Ａ６１Ｋ ３１／１９２
Ａ６１Ｋ ３１／２２
Ａ６１Ｋ ３１／２１５
Ａ６１Ｋ ３１／１９８
Ａ６１Ｋ ３１／１９６
Ａ６１Ｐ ２５／００
Ｃ０７Ｃ ５９／５４
Ｃ０７Ｃ ６９／７５７
Ｃ０７Ｃ ６９／７０８
Ｃ０７Ｃ ２３５／４０
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
式Ｉ【化1】
式中、Ｒ５がＨであり、かつＲ１とＲ２が環系を形成し、前記化合物が以下の式ＩＩの化合物であり、
【化2】
【表1】
Ｒ２がＨであり、かつＲ１とＲ５が環系を形成し、前記化合物が式ＩＩＩ
【化3】
ここで、式ＩＩＩの前記化合物が式ＩＩＩａ、式ＩＩＩｂ、及び式ＩＩＩｃからなる群から選択され、
【化4】
ｎが、０または１であり；
Ｘが、ＯまたはＮＨであり、
ｍが、０または１であり；
Ｒ３が、Ｈ；－Ｍｅ、－Ｅｔ、－Ｐｒ、－ｉＰｒ、－Ｂｕ、－ｔＢｕ、－ｉＢｕ、ペンチル、イソペンチル、ヘキシルであってもよい直鎖もしくは分岐鎖Ｃ１～Ｃ６－アルキル；－ベンジル、ポリエチレングリコリル（ＰＥＧ）、または
【化5】
Ｒ４が、Ｈ；－Ｃ（＝Ｏ）－Ｍｅ、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｅｔ、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｐｒ、－Ｃ（＝Ｏ）－ｉＰｒ、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｂｕ、－Ｃ（＝Ｏ）－ｔＢｕであってもよい－Ｃ（＝Ｏ）－Ｃ１～Ｃ６－アルキル；－Ｃ（＝Ｏ）－ベンジル、ポリエチレングリコリル（ＰＥＧ）、または
【化6】
Ｒ１３が、Ｈ、Ｆ、Ｂｒ、アリール、直鎖または分岐鎖Ｃ１～８アルキル、－ＣＨ２（ＣＨ２）ｐ－アリール、－ＣＨ＝ＣＨ－アリール、ＮＨ２、ＮＯ２、ＯＨ、ＳＨ、直鎖または分岐鎖－Ｓ－Ｃ１～８アルキル、直鎖または分岐鎖－ＮＨ－Ｃ１～８アルキル、－Ｏ－アリール、－Ｓ－アリール、および－ＮＨ－アリールから選択され、アリールが、Ｏ、Ｎ、およびＳから選択される１つまたは複数のヘテロ原子を有するアリールを含み、かつｐが、０または１であり；
Ｒ１４が、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、アリール、直鎖または分岐鎖Ｃ１～８アルキル、－ＣＨ２（ＣＨ２）ｐ－アリール、－ＣＨ＝ＣＨ－アリール、ＮＨ２、ＯＨ、ＳＨ、直鎖または分岐鎖－Ｏ－Ｃ１～８アルキル、直鎖または分岐鎖－Ｓ－Ｃ１～８アルキル、直鎖または分岐鎖－ＮＨ－Ｃ１～８アルキル、－Ｏ－アリール、－Ｓ－アリール、および－ＮＨ－アリールから選択され、アリールが、Ｏ、Ｎ、およびＳから選択される１つまたは複数のヘテロ原子を有するアリールを含み、かつｐが、０または１であり；
ただし、以下の：
【化7】
化合物あるいはその薬学的に許容される塩。
【請求項2】
式ＩＩＩを有し、かつｎが０である、
請求項１に記載の化合物あるいはその薬学的に許容される塩。
【請求項3】
式ＩＩＩを有し、Ｒ１３が、ＨでありかつＲ１４が、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、アリール、直鎖もしくは分岐鎖Ｃ１～８アルキル、－ＣＨ２（ＣＨ２）ｐ－アリール、および－ＣＨ＝ＣＨ－アリールから選択されるか、または
Ｒ１４が、ＨでありかつＲ１３が、Ｈ、Ｆ、Ｂｒ、アリール、直鎖もしくは分岐鎖Ｃ１～８アルキル、－ＣＨ２（ＣＨ２）ｐ－アリール、および－ＣＨ＝ＣＨ－アリールから選択される、
請求項１および２のいずれか１項に記載の化合物あるいはその薬学的に許容される塩。
【請求項4】
式ＩＩＩを有し、Ｒ１３が、ＨでありかつＲ１４が、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｐｈ、および－ＣＨ＝ＣＨ－アリールから選択されるか、または
Ｒ１４が、ＨでありかつＲ１３が、Ｈ、Ｆ、Ｂｒ、Ｐｈ、および－ＣＨ＝ＣＨ－アリールから選択される、
請求項１～３のいずれか１項に記載の化合物あるいはその薬学的に許容される塩。
【請求項5】
式ＩＩＩを有し、ｎ＝０であり、Ｒ３が、Ｈ、－Ｍｅ、－Ｅｔ、－Ｐｒ、－ｉＰｒ、－Ｂｕ、および－ｔＢｕから選択され；Ｘが、Ｏであり、Ｒ４が、Ｈであり、Ｒ１３が、Ｈ、Ｆ、Ｂｒ、フェニル、およびメチルから選択されかつＲ１４が、Ｈであるか、または
ｎ＝０であり、Ｒ３が、Ｈであり、Ｘが、Ｏであり、Ｒ４が、Ｈであり、Ｒ１４が、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、フェニル、およびメチルから選択されかつＲ１３が、Ｈである、
請求項１に記載の化合物あるいはその薬学的に許容される塩。
【請求項6】
前記化合物が、式ＩＩＩａの化合物である、請求項１および５のいずれか１項に記載の化合物あるいはその薬学的に許容される塩。
【請求項7】
以下の構造：【表2】
【請求項8】
急性脳損傷の治療剤であって、
前記治療剤は、式Ｉ
【化8】
Ｒ５が、Ｈであり、かつＲ１とＲ２が環系を形成し、前記化合物が、以下の式ＩＩおよび式ＩＶ
【化9】
ｎが、０または１であり；
Ｘが、ＯおよびＮＨから選択され、
Ｙが、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、またはＣＨ２であり、
Ｒ３が、Ｈ；－Ｍｅ、－Ｅｔ、－Ｐｒ、－ｉＰｒ、－Ｂｕ、－ｔＢｕ、－ｉＢｕ、ペンチル、ネオペンチル、ヘキシルであってもよい直鎖もしくは分岐鎖Ｃ１～Ｃ６－アルキル；－ベンジル、ポリエチレングリコリル（ＰＥＧ）、または
【化10】
Ｒ４が、Ｈ；－Ｃ（＝Ｏ）－Ｍｅ、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｅｔ、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｐｒ、－Ｃ（＝Ｏ）－ｉＰｒ、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｂｕ、－Ｃ（＝Ｏ）－ｔＢｕであってもよい－Ｃ（＝Ｏ）－Ｃ１～Ｃ６－アルキル；－Ｃ（＝Ｏ）－ベンジル、ポリエチレングリコリル（ＰＥＧ）、または
【化11】
Ｒ６およびＲ７が互いに独立に、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、アリール、直鎖または分岐鎖Ｃ１～８アルキル、－ＣＨ２（ＣＨ２）ｐ－アリール、－ＣＨ＝ＣＨ－アリール、ＮＨ２、ＮＯ２、ＯＨ、ＳＨ、直鎖または分岐鎖－Ｏ－Ｃ１～８アルキル、直鎖または分岐鎖－Ｓ－Ｃ１～８アルキル、直鎖または分岐鎖－ＮＨ－Ｃ１～８アルキル、－Ｏ－アリール、－Ｓ－アリール、および－ＮＨ－アリールから選択され、アリールが、Ｏ、Ｎ、およびＳから選択される１つまたは複数のヘテロ原子を有するアリールを含み、かつｐが、０または１であるか；
前記化合物が式ＩＶから選択される場合、前記化合物は構造（Ｃ）を有し、
【化12】
Ｒ２がＨであり、かつＲ１とＲ５が環系を形成し、前記化合物が式ＩＩＩ
【化13】
ｎが、０または１であり；
Ｘが、ＯまたはＮＨであり、
ｍが、０または１であり；
Ｒ３が、Ｈ；－Ｍｅ、－Ｅｔ、－Ｐｒ、－ｉＰｒ、－Ｂｕ、－ｔＢｕ、－ｉＢｕ、ペンチル、イソペンチル、ヘキシルであってもよい直鎖もしくは分岐鎖Ｃ１～Ｃ６－アルキル；－ベンジル、ポリエチレングリコリル（ＰＥＧ）、または
【化14】
Ｒ４が、Ｈ；－Ｃ（＝Ｏ）－Ｍｅ、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｅｔ、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｐｒ、－Ｃ（＝Ｏ）－ｉＰｒ、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｂｕ、－Ｃ（＝Ｏ）－ｔＢｕであってもよい－Ｃ（＝Ｏ）－Ｃ１～Ｃ６－アルキル；－Ｃ（＝Ｏ）－ベンジル、ポリエチレングリコリル（ＰＥＧ）、または
【化15】
Ｒ１３およびＲ１４が互いに独立に、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、アリール、直鎖または分岐鎖Ｃ１～８アルキル、－ＣＨ２（ＣＨ２）ｐ－アリール、－ＣＨ＝ＣＨ－アリール、ＮＨ２、ＮＯ２、ＯＨ、ＳＨ、直鎖または分岐鎖－Ｏ－Ｃ１～８アルキル、直鎖または分岐鎖－Ｓ－Ｃ１～８アルキル、直鎖または分岐鎖－ＮＨ－Ｃ１～８アルキル、－Ｏ－アリール、－Ｓ－アリール、および－ＮＨ－アリールから選択され、アリールが、Ｏ、Ｎ、およびＳから選択される１つまたは複数のヘテロ原子を有するアリールを含み、かつｐが、０または１である、
化合物あるいはその薬学的に許容される塩を含む急性脳損傷の治療剤。
【請求項9】
前記化合物が、式ＩＩＩａ、式ＩＩＩｂ、式ＩＩＩｃ、または式ＩＩＩｄの構造を有する、請求項８に記載の急性脳損傷の治療剤。【化16】
【請求項10】
前記化合物が、式ＩＩもしくは式ＩＩＩの構造を有し、かつｎが０である、請求項８に記載の急性脳損傷の治療剤。
【請求項11】
前記化合物が、式ＩＩＩの構造を有し、Ｒ１３およびＲ１４の一方が、Ｈでありかつ他方が、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、アリール、直鎖もしくは分岐鎖Ｃ１～８アルキル、－ＣＨ２（ＣＨ２）ｐ－アリール、および－ＣＨ＝ＣＨ－アリールから選択される、請求項８および１０のいずれか１項に記載の急性脳損傷の治療剤。
【請求項12】
Ｒ３が、【化17】
【化18】
【請求項13】
前記化合物が、式ＩＩＩの構造を有し、ｎ＝０であり、Ｒ３が、Ｈ、－Ｍｅ、－Ｅｔ、－Ｐｒ、－ｉＰｒ、－Ｂｕ、および－ｔＢｕから選択され；Ｘが、Ｏであり、Ｒ４が、ＨでありかつＲ１３が、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、フェニル、およびメチルから選択されかつＲ１３が、１位または２位にあり、かつＲ１４が、Ｈである、請求項８に記載の急性脳損傷の治療剤。
【請求項14】
前記化合物が、以下の構造：【表3】
の１つを有する、請求項８に記載の急性脳損傷の治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、急性脳損傷の治療で使用するのに適した化合物に関する。本発明はまた、急性脳損傷の治療で使用される化合物Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤなどの既知の化合物の使用に関する。
【背景技術】
【0002】
（本発明に関する緒言）
脳卒中、外傷、または神経変性障害などの血流低下のエピソードにより脳または脊髄（中枢神経系、ＣＮＳと呼ぶ）が損傷すると、行動機能が喪失し、回復が制限される。機能の喪失は一般に、２つの方法で起こる。第一に、損傷が傷害の中心部分で全面的な損傷を引き起こし、それにより、運動、感覚、記憶、または言語などの身体機能を制御する神経回路が損傷する。第二に、損傷が損傷部位に隣接する神経回路（梗塞周囲皮質と呼ぶ）に部分的損傷を引き起こし、これらの回路の機能を損なわせる。
脳卒中、外傷、または神経変性障害などの血流低下のエピソードにより脳または脊髄（中枢神経系、ＣＮＳと呼ぶ）が損傷すると、行動機能が喪失し、回復が制限される。機能の喪失は一般に、２つの方法で起こる。第一に、損傷が傷害の中心部分で全面的な損傷を引き起こし、それにより、運動、感覚、記憶、または言語などの身体機能を制御する神経回路が損傷する。第二に、損傷が損傷部位に隣接する神経回路（梗塞周囲皮質と呼ぶ）に部分的損傷を引き起こし、これらの回路の機能を損なわせる。
【0003】
脳卒中は、性質のうえでは虚血性または出血性のいずれかであり得、世界的に主要な健康問題であり、多くの場合、長期間にわたる身体障害を来す。人口が高齢化するにつれて、脳卒中患者の数が増加し、社会にとって大きな社会的および経済的負担の原因となる。現時点で唯一利用可能な医学療法は、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）の投与、すなわち血栓溶解法であり、これは脳卒中発症後４．５時間以内に与えられなければならない。このため、脳虚血の初期相で神経細胞死を食い止めることができる神経保護化合物に対する大きな満たされていない必要性が存在する。
【0004】
（最新技術）
薬理学的な脳卒中治療法における最新技術は、血栓溶解剤ｔＰＡの急性静脈内投与に限られている。ｔＰＡは、血栓を溶かし、脳の血管を広げることによって効果を発揮する。したがって、ｔＰＡは、急性損傷後の脳に血流を回復させ、虚血性細胞死の拡大を予防することによって効果を発揮することから、「神経保護的」療法剤である。ｔＰＡは、機能回復に中程度の行動上の利益をもたらすが、治療域が極めて狭い。ｔＰＡは、患者に脳卒中が発症してから４．５時間以内に送達されなければならず、さもなければ、ｔＰＡ投与によるリスクが潜在的利益を上回る。現時点では、この時間枠により、脳卒中患者全体の約９０％にはｔＰＡ投与ができない。さらに、この治療は、一部の脳卒中患者に限り効果的である。例えば、ｔＰＡは出血性脳卒中後の適切な治療選択肢ではなく、なぜならｔＰＡの「血栓を散らす」特徴がこのタイプの脳卒中で出血を悪化させることがあるためである。したがって、狭い治療域を拡大し、かつ神経機能の改善を促進する化合物を有することが大いに必要とされている。
薬理学的な脳卒中治療法における最新技術は、血栓溶解剤ｔＰＡの急性静脈内投与に限られている。ｔＰＡは、血栓を溶かし、脳の血管を広げることによって効果を発揮する。したがって、ｔＰＡは、急性損傷後の脳に血流を回復させ、虚血性細胞死の拡大を予防することによって効果を発揮することから、「神経保護的」療法剤である。ｔＰＡは、機能回復に中程度の行動上の利益をもたらすが、治療域が極めて狭い。ｔＰＡは、患者に脳卒中が発症してから４．５時間以内に送達されなければならず、さもなければ、ｔＰＡ投与によるリスクが潜在的利益を上回る。現時点では、この時間枠により、脳卒中患者全体の約９０％にはｔＰＡ投与ができない。さらに、この治療は、一部の脳卒中患者に限り効果的である。例えば、ｔＰＡは出血性脳卒中後の適切な治療選択肢ではなく、なぜならｔＰＡの「血栓を散らす」特徴がこのタイプの脳卒中で出血を悪化させることがあるためである。したがって、狭い治療域を拡大し、かつ神経機能の改善を促進する化合物を有することが大いに必要とされている。
【発明の概要】
【0005】
（発明の説明）
局所的な脳低灌流または全体的な低灌流（例えば、脳卒中、心停止による血流ショック、心不全、または外科手術時）による外傷および病態を原因とする神経変性または損傷からＣＮＳを保護する薬剤に対する大きな満たされていない必要性が、研究者に新薬開発につながる新たな標的の探索を促してきた。Ｎ－メチル－Ｄ－アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）受容体を標的とする、かつ／または抗炎症特性を有する化合物が、前臨床モデルで有望な結果を示しており、詳細な臨床試験につながった。残念ながら、これらの化合物のほぼ全部が臨床試験に失敗しており、血栓溶解剤が未だに唯一の承認された薬理学的治療である。様々なｔＰＡ治療の欠点としては、脳卒中後４．５時間以内である、かなり限られた治療域および出血性の形成異常の可能性が挙げられる。虚血性脳卒中の発症と治療の間の典型的な遅延により、このタイプの治療は禁忌とされることが多い。したがって、虚血性脳卒中後に臨床的に適切な時間枠内で神経細胞死を食い止め予防するために、他の化合物が必要とされている。
局所的な脳低灌流または全体的な低灌流（例えば、脳卒中、心停止による血流ショック、心不全、または外科手術時）による外傷および病態を原因とする神経変性または損傷からＣＮＳを保護する薬剤に対する大きな満たされていない必要性が、研究者に新薬開発につながる新たな標的の探索を促してきた。Ｎ－メチル－Ｄ－アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）受容体を標的とする、かつ／または抗炎症特性を有する化合物が、前臨床モデルで有望な結果を示しており、詳細な臨床試験につながった。残念ながら、これらの化合物のほぼ全部が臨床試験に失敗しており、血栓溶解剤が未だに唯一の承認された薬理学的治療である。様々なｔＰＡ治療の欠点としては、脳卒中後４．５時間以内である、かなり限られた治療域および出血性の形成異常の可能性が挙げられる。虚血性脳卒中の発症と治療の間の典型的な遅延により、このタイプの治療は禁忌とされることが多い。したがって、虚血性脳卒中後に臨床的に適切な時間枠内で神経細胞死を食い止め予防するために、他の化合物が必要とされている。
【0006】
ＧＨＢ（γ－ヒドロキシ酪酸）は、哺乳動物の脳にマイクロモルの濃度で存在する、天然に存在するＧＡＢＡ（γ－アミノ酪酸）代謝産物であり神経調節物質である。ＧＨＢ（ナトリウムオキシベート）は、ナルコレプシーの処方薬として臨床的にも、および娯楽薬（例えば、Ｆａｎｔａｓｙ）としても使用されている。ＧＨＢは、ＧＡＢＡＢ受容体に対する低親和性結合およびニューロンの特定のタンパク質に対する高親和性（ナノモル～マイクロモル）の両方を示す。ＧＡＢＡＢ受容体を介する、十分に確立されたＧＨＢの薬理効果の１つは、体温の低下である（Ｋａｕｐｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，２００３）。これとは対照的に、高親和性結合部位と関係のある神経生理学的効果および神経薬理学的効果は、この結合部位の正確な分子的素性が捉えどころのないものであるため、未だ明らかにされていない。
【0007】
本発明は、以下の一般式（式Ｉ）：
を有し、式中、Ｒ５がＨであり、Ｒ１とＲ２が環系を形成する場合、上記化合物が、以下の式ＩＩまたは式ＩＶ
の化合物から選択され、式中、
ｎが、０または１であり；
Ｘが、ＯまたはＮＨから選択され、
Ｙが、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＣＨ２であり、
Ｒ３が、Ｈ、－Ｍｅ、－Ｅｔ、－Ｐｒ、－ｉＰｒ、－Ｂｕ、－ｉＢｕ、－ｔＢｕ、ペンチル、ネオペンチル、ヘキシル、分岐鎖ヘキシルを含む直鎖もしくは分岐鎖Ｃ１～Ｃ６－アルキル；－ベンジル、ポリエチレングリコリル（ＰＥＧ）、または
などの基から選択され、式中、Ｒ９およびＲ１０が互いに独立に、Ｍｅ、－Ｅｔ、－Ｐｒ、－ｉＰｒ、－Ｂｕ、－ｉＢｕ、－ｔＢｕ、ペンチル、ネオペンチル、またはヘキシルを含む直鎖または分岐鎖Ｃ１～Ｃ６－アルキルから選択され；特に、Ｒ１０がＨ、－Ｍｅ、－Ｅｔ、－ｉＰｒから選択され；
Ｒ４が、Ｈ、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｃ１～Ｃ６－アルキルから選択され、式中、アルキルが、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｍｅ、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｅｔ、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｐｒ、－Ｃ（＝Ｏ）－ｉＰｒ、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｂｕ、－Ｃ（＝Ｏ）－ｔＢｕを含む直鎖もしくは分岐鎖；－Ｃ（＝Ｏ）－ベンジル、ポリエチレングリコリル（ＰＥＧ）、または
などの基であり、式中、Ｒ１１およびＲ１２が互いに独立に、－Ｍｅ、－Ｅｔ、－Ｐｒ、－ｉＰｒ、－Ｂｕ、－ｉＢｕ、－ｔＢｕ、ペンチル、ネオペンチル、またはヘキシルを含む直鎖または分岐鎖Ｃ１～Ｃ６－アルキルから選択され；特に、Ｒ１２が、Ｈ、－Ｍｅ、－Ｅｔ、－ｉＰｒ、－ｉＢｕから選択され；
Ｒ６およびＲ７が互いに独立に、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、アリール、直鎖または分岐鎖Ｃ１～８アルキル、－ＣＨ２（ＣＨ２）ｐ－アリール、－ＣＨ＝ＣＨ－アリール、ＮＨ２、ＮＯ２、ＯＨ、ＳＨ、直鎖または分岐鎖－Ｏ－Ｃ１～８アルキル、直鎖または分岐鎖－Ｓ－Ｃ１～８アルキル、直鎖または分岐鎖－ＮＨ－Ｃ１～８アルキル、－Ｏ－アリール、－Ｓ－アリール、－ＮＨ－アリールから選択され、アリールが、Ｏ、Ｎ、またはＳから選択される１つまたは複数のヘテロ原子を有するアリールを含み、ｐが、０または１であり；Ｃ１～８アルキルが、直鎖または分岐鎖であるＭｅ、Ｅｔ、Ｐｒ、Ｂｕ、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル－アルキルを含むか、あるいは
Ｒ２がＨであり、Ｒ１とＲ５が環系を形成する場合、上記化合物が式ＩＩＩ
を有し、式中、
ｎが、０または１であり；
Ｘが、ＯまたはＮＨであり、
ｍが、０または１であり；
Ｒ３が、Ｈ、－Ｍｅ、－Ｅｔ、－Ｐｒ、－ｉＰｒ、－Ｂｕ、－ｉＢｕ、－ｔＢｕ、ペンチル、ネオペンチル、ヘキシル、分岐鎖ヘキシルを含む直鎖もしくは分岐鎖Ｃ１～Ｃ６－アルキル；ベンジル、ポリエチレングリコリル（ＰＥＧ）、または
などの基から選択され、式中、Ｒ９およびＲ１０が互いに独立に、－Ｍｅ、－Ｅｔ、－Ｐｒ、－ｉＰｒ、－Ｂｕ、－ｉＢｕ、－ｔＢｕ、ペンチル、ネオペンチル、またはヘキシルを含む直鎖または分岐鎖Ｃ１～Ｃ６－アルキルから選択され；特に、Ｒ１０が、Ｈ、－Ｍｅ、－Ｅｔ、－ｉＰｒから選択され；
Ｒ４が、Ｈ、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｃ１～Ｃ６－アルキルから選択され、アルキルが、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｍｅ、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｅｔ、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｐｒ、－Ｃ（＝Ｏ）－ｉＰｒ、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｂｕ、－Ｃ（＝Ｏ）－ｔＢｕを含む直鎖もしくは分岐鎖、－Ｃ（＝Ｏ）－ベンジル、ポリエチレングリコリル（ＰＥＧ）、または
などの基であり、式中、Ｒ１１およびＲ１２が互いに独立に、－Ｍｅ、－Ｅｔ、－Ｐｒ、－ｉＰｒ、－Ｂｕ、－ｉＢｕ、－ｔＢｕ、ペンチル、ネオペンチル、またはヘキシルを含む直鎖または分岐鎖Ｃ１～Ｃ６－アルキルから選択され；特に、Ｒ１２が、Ｈ、－Ｍｅ、－Ｅｔ、－ｉＰｒから選択され；
Ｒ１３およびＲ１４が互いに独立に、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、アリール、直鎖または分岐鎖Ｃ１～８アルキル、－ＣＨ２（ＣＨ２）ｐ－アリール、－ＣＨ＝ＣＨ－アリール、ＮＨ２、ＮＯ２、ＯＨ、ＳＨ、直鎖または分岐鎖－Ｏ－Ｃ１～８アルキル、直鎖または分岐鎖－Ｓ－Ｃ１～８アルキル、直鎖または分岐鎖－ＮＨ－Ｃ１～８アルキル、－Ｏ－アリール、－Ｓ－アリール、－ＮＨ－アリールから選択され、アリールが、Ｏ、Ｎ、またはＳから選択される１つまたは複数のヘテロ原子を有するアリールを含み、ｐが、０または１であり；Ｃ１～８アルキルが、直鎖または分岐鎖であるＭｅ、Ｅｔ、Ｐｒ、Ｂｕ、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル－アルキルを含み、
ただし、以下のもの：
［式中、Ｒ’がＣＯＯＨであり、Ｒ’’がＨであり、Ｒ’’’がＯＣＨ３であるか、または
式中、Ｒ’がＣＯＯＨであり、Ｒ’’がＣＨ３であり、Ｒ’’’がＯＨである］
の１つではない、
化合物あるいはその薬学的に許容される塩を提供する。
【化1】
【化2】
ｎが、０または１であり；
Ｘが、ＯまたはＮＨから選択され、
Ｙが、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＣＨ２であり、
Ｒ３が、Ｈ、－Ｍｅ、－Ｅｔ、－Ｐｒ、－ｉＰｒ、－Ｂｕ、－ｉＢｕ、－ｔＢｕ、ペンチル、ネオペンチル、ヘキシル、分岐鎖ヘキシルを含む直鎖もしくは分岐鎖Ｃ１～Ｃ６－アルキル；－ベンジル、ポリエチレングリコリル（ＰＥＧ）、または
【化3】
Ｒ４が、Ｈ、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｃ１～Ｃ６－アルキルから選択され、式中、アルキルが、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｍｅ、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｅｔ、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｐｒ、－Ｃ（＝Ｏ）－ｉＰｒ、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｂｕ、－Ｃ（＝Ｏ）－ｔＢｕを含む直鎖もしくは分岐鎖；－Ｃ（＝Ｏ）－ベンジル、ポリエチレングリコリル（ＰＥＧ）、または
【化4】
Ｒ６およびＲ７が互いに独立に、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、アリール、直鎖または分岐鎖Ｃ１～８アルキル、－ＣＨ２（ＣＨ２）ｐ－アリール、－ＣＨ＝ＣＨ－アリール、ＮＨ２、ＮＯ２、ＯＨ、ＳＨ、直鎖または分岐鎖－Ｏ－Ｃ１～８アルキル、直鎖または分岐鎖－Ｓ－Ｃ１～８アルキル、直鎖または分岐鎖－ＮＨ－Ｃ１～８アルキル、－Ｏ－アリール、－Ｓ－アリール、－ＮＨ－アリールから選択され、アリールが、Ｏ、Ｎ、またはＳから選択される１つまたは複数のヘテロ原子を有するアリールを含み、ｐが、０または１であり；Ｃ１～８アルキルが、直鎖または分岐鎖であるＭｅ、Ｅｔ、Ｐｒ、Ｂｕ、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル－アルキルを含むか、あるいは
Ｒ２がＨであり、Ｒ１とＲ５が環系を形成する場合、上記化合物が式ＩＩＩ
【化5】
ｎが、０または１であり；
Ｘが、ＯまたはＮＨであり、
ｍが、０または１であり；
Ｒ３が、Ｈ、－Ｍｅ、－Ｅｔ、－Ｐｒ、－ｉＰｒ、－Ｂｕ、－ｉＢｕ、－ｔＢｕ、ペンチル、ネオペンチル、ヘキシル、分岐鎖ヘキシルを含む直鎖もしくは分岐鎖Ｃ１～Ｃ６－アルキル；ベンジル、ポリエチレングリコリル（ＰＥＧ）、または
【化6】
Ｒ４が、Ｈ、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｃ１～Ｃ６－アルキルから選択され、アルキルが、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｍｅ、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｅｔ、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｐｒ、－Ｃ（＝Ｏ）－ｉＰｒ、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｂｕ、－Ｃ（＝Ｏ）－ｔＢｕを含む直鎖もしくは分岐鎖、－Ｃ（＝Ｏ）－ベンジル、ポリエチレングリコリル（ＰＥＧ）、または
【化7】
Ｒ１３およびＲ１４が互いに独立に、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、アリール、直鎖または分岐鎖Ｃ１～８アルキル、－ＣＨ２（ＣＨ２）ｐ－アリール、－ＣＨ＝ＣＨ－アリール、ＮＨ２、ＮＯ２、ＯＨ、ＳＨ、直鎖または分岐鎖－Ｏ－Ｃ１～８アルキル、直鎖または分岐鎖－Ｓ－Ｃ１～８アルキル、直鎖または分岐鎖－ＮＨ－Ｃ１～８アルキル、－Ｏ－アリール、－Ｓ－アリール、－ＮＨ－アリールから選択され、アリールが、Ｏ、Ｎ、またはＳから選択される１つまたは複数のヘテロ原子を有するアリールを含み、ｐが、０または１であり；Ｃ１～８アルキルが、直鎖または分岐鎖であるＭｅ、Ｅｔ、Ｐｒ、Ｂｕ、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル－アルキルを含み、
ただし、以下のもの：
【化8】
式中、Ｒ’がＣＯＯＨであり、Ｒ’’がＣＨ３であり、Ｒ’’’がＯＨである］
の１つではない、
化合物あるいはその薬学的に許容される塩を提供する。
【0008】
本発明の範囲内には、異性体、互変異性体、鏡像異性体、ラセミ体、またはその混合物、および重水素化誘導体が含まれる。したがって、例えば、式Ｉの化合物は、Ｒ型またはＳ型で存在し得るものであり、このような形態はいずれも、ラセミ混合物と同様に本発明の範囲内に含まれる。
【0009】
この文脈では、直鎖または分岐鎖Ｃ１～Ｃ６－アルキルという用語は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔブチル、ペンチル、ネオペンチル、ならびにその他の分岐鎖ペンチルヘキシルおよび分岐鎖ヘキシルを含む。直鎖または分岐鎖Ｃ１～Ｃ８－アルキルという用語は、上記の直鎖または分岐鎖Ｃ１～Ｃ６－アルキル、ならびにヘプチル、分岐鎖ヘプチル、オクチル、および分岐鎖オクチルを含む。
【0010】
特に目的とする化合物は以下のものである：
ｉ）化合物が式ＩＩまたはＩＩＩを有し、式中、ｎが０である；
ｉｉ）化合物が式ＩＶを有し、ｎが１である；
ｉｉｉ）Ｒ３およびＲ４の一方がＨである；
ｉｖ）Ｒ３およびＲ４がともにＨである；
ｖ）化合物が式ＩＩＩを有し、Ｒ１３がＨであり、Ｒ１４が、１位または２位にある；
ｖｉ）化合物が式ＩＩＩを有し、Ｒ１３がＨであり、Ｒ１４が、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、アリール、直鎖もしくは分岐鎖Ｃ１～８アルキル、－ＣＨ２（ＣＨ２）ｐ－アリール、または－ＣＨ＝ＣＨ－アリールから選択される；
ｖｉｉ）化合物が式ＩＩＩを有し、Ｒ１３がＨであり、Ｒ１４が、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｐｈ、または－ＣＨ＝ＣＨ－アリールから選択される；
ｖｉｉｉ）化合物が式ＩＩＩを有し、式中、Ｒ１３がＨであり、Ｒ１４が、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｐｈ、または－ＣＨ＝ＣＨ－フェニルから選択される；
ｉｘ）Ｒ３が、
から選択されるか、または
Ｒ４が、
から選択される：
ｘ）Ｒ３が
である
ｘｉ）化合物が式ＩＩを有し、Ｒ４がＨであり、Ｒ３が
である；
ｘｉｉ）化合物が式ＩＩＩを有し、式中、ｎ＝０であり、Ｒ３がＨであり、ＸがＯであり、Ｒ４がＨであり、Ｒ１３が、Ｈ、ハロゲン、フェニル、メチルから選択され、Ｒ１３が、１位または２位にあり、Ｒ１４がＨである。
ｘｉｉ）化合物が式ＩＩＩを有し、式中、ｎ＝０であり、Ｒ３が、Ｈ、－Ｍｅ、－Ｅｔ、－Ｐｒ、－ｉＰｒ、－Ｂｕ、－ｔＢｕ、およびＰｈから選択され；ＸがＯであり、Ｒ４がＨであり、Ｒ１３が、Ｈ、ハロゲン、フェニル、メチルから選択され、Ｒ１３が、１位または２位にあり、Ｒ１４がＨである。
ｘｖｖ）化合物が、以下の構造の１つを有する：
＊これらの化合物の医学的使用だけが本発明の範囲内に含まれる。
ｉ）化合物が式ＩＩまたはＩＩＩを有し、式中、ｎが０である；
ｉｉ）化合物が式ＩＶを有し、ｎが１である；
ｉｉｉ）Ｒ３およびＲ４の一方がＨである；
ｉｖ）Ｒ３およびＲ４がともにＨである；
ｖ）化合物が式ＩＩＩを有し、Ｒ１３がＨであり、Ｒ１４が、１位または２位にある；
ｖｉ）化合物が式ＩＩＩを有し、Ｒ１３がＨであり、Ｒ１４が、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、アリール、直鎖もしくは分岐鎖Ｃ１～８アルキル、－ＣＨ２（ＣＨ２）ｐ－アリール、または－ＣＨ＝ＣＨ－アリールから選択される；
ｖｉｉ）化合物が式ＩＩＩを有し、Ｒ１３がＨであり、Ｒ１４が、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｐｈ、または－ＣＨ＝ＣＨ－アリールから選択される；
ｖｉｉｉ）化合物が式ＩＩＩを有し、式中、Ｒ１３がＨであり、Ｒ１４が、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｐｈ、または－ＣＨ＝ＣＨ－フェニルから選択される；
ｉｘ）Ｒ３が、
【化9】
Ｒ４が、
【化10】
ｘ）Ｒ３が
【化11】
ｘｉ）化合物が式ＩＩを有し、Ｒ４がＨであり、Ｒ３が
【化12】
ｘｉｉ）化合物が式ＩＩＩを有し、式中、ｎ＝０であり、Ｒ３がＨであり、ＸがＯであり、Ｒ４がＨであり、Ｒ１３が、Ｈ、ハロゲン、フェニル、メチルから選択され、Ｒ１３が、１位または２位にあり、Ｒ１４がＨである。
ｘｉｉ）化合物が式ＩＩＩを有し、式中、ｎ＝０であり、Ｒ３が、Ｈ、－Ｍｅ、－Ｅｔ、－Ｐｒ、－ｉＰｒ、－Ｂｕ、－ｔＢｕ、およびＰｈから選択され；ＸがＯであり、Ｒ４がＨであり、Ｒ１３が、Ｈ、ハロゲン、フェニル、メチルから選択され、Ｒ１３が、１位または２位にあり、Ｒ１４がＨである。
ｘｖｖ）化合物が、以下の構造の１つを有する：
【表1】
【0011】
本発明はまた、医薬で使用するための式（Ｉ）の化合物に関する。
【0012】
必要に応じて、化合物Ａ、Ｂ、Ｃ、および／またはＤについては医学的使用を除外する。
【0013】
より具体的には、本発明は、本明細書で定義される急性脳損傷の治療で使用するための式（Ｉ）の化合物に関する。
【0014】
本発明は、社内で開発したＧＨＢの類似体、３－ヒドロキシシクロペント－１－エンカルボン酸（Ａ）（Ｗｅｌｌｅｎｄｏｒｐｈ ｅｔ ａｌ．，２００５）が急性脳損傷に対する神経保護特性を有することを開示する。式（Ｉ）の化合物は同様の神経保護特性を有すると考えられる。一方、ＡはＧＨＢとは対照的に、ＧＡＢＡＢ結合部位に対して親和性を示さず（Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１６；Ｗｅｌｌｅｎｄｏｒｐｈ ｅｔ ａｌ．，２００５）、そのため、ＧＨＢで問題となる鎮静作用がない。Ａは、「捉えどころのない」高親和性部位にのみ結合する。この結合部位は、３Ｈ－Ｂと呼ばれる放射標識型の（Ｅ，ＲＳ）－６，７，８，９－テトラヒドロ－５－ヒドロキシ－５Ｈ－ベンゾシクロヘプト－６－イリデン酢酸（ＮＣＳ－３８２、Ｂ）を用いて探索された。ごく最近、本発明者らは、放射標識型のＡ（３Ｈ－Ａ）を開発し（Ｖｏｇｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ，２０１３）、これを用いて、３Ｈ－Ａの結合がマウス、ラット、およびブタでは主として皮質および海馬脳領域に限られることを特徴付け、明らかにした（Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。本発明者らは、Ａのナトリウム塩が末梢投与後に容易に脳内に侵入し（Ｔｈｉｅｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１５）、ｉｎ ｖｉｖｏで高親和性標的に特異的を有して結合し、げっ歯類に５００ｍｇ／ｋｇもの高用量で投与しても、明らかな急性毒性および鎮静作用は観察されないことを明らかにした。
【0015】
本発明はさらに、社内で開発した新規なＢの類似体、（Ｅ）－２－（５－ヒドロキシ－２－フェニル－５，７，８，９－テトラヒドロ－６Ｈ－ベンゾ［７］アヌレン－６－イリデン）酢酸（２）が急性脳損傷に対する神経保護特性を有することを開示する。本発明者らはさらに、２および関連する類似体１、３～１０が、３Ｈ－Ａおよび３Ｈ－Ｂによって探索された「捉えどころのない」高親和性部位に結合し、細胞膜を通過することを明らかにした。
【0016】
本発明者らは、Ａが脳卒中後の細胞損傷の程度を最小限に抑え、機能回復を改善するのに有意な効果を発揮することを明らかにした。具体的には、Ａの投与は、梗塞誘発後３～７日の梗塞の大きさの減少および運動機能の用量依存性な改善を生じた。本明細書の実施例では、運動皮質に局所性脳卒中を誘発してから３０分後、３時間後、６時間後、または１２時間後にＡを投与した。驚くべきことであると同時に、急性脳損傷治療へのＡの臨床使用に極めて重要なことに、Ａは、梗塞誘発から１２時間後に投与しても、梗塞の大きさおよび運動能力の両方に有意な効果を示す。同様に、２は、損傷誘発後３時間または６時間にナトリウム塩として末梢投与すると、有意な神経保護作用を発揮する。
【0017】
Ａおよび２の神経保護能の基礎となる機序は未だ推測の域を出ていない。ＧＨＢが体温を低下させ、ニューロンでの酸素およびグルコース消費を低下させることはよく知られている。この機序はまた、臨床試験で脳卒中後の治療として有用であることが示されている。しかし、軽度の低体温応答を示し、顕著な保護をもたらすことが報告されているクロメチアゾールなどのＧＡＢＡモジュレーターは、細胞死を引き起こす事象のカスケードを遅らせるだけであって、それを防ぐことはないことに留意するべきである。このことは、薬物誘発性の低体温をモニターし、そのような応答を誘発する可能性のある薬物または受容体系、例えばＧＡＢＡＢ受容体などを除外する必要性を強調する。ＧＨＢによる体温制御は、ＧＡＢＡＢ受容体により介在されることが明らかにされており（Ｋａｕｐｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，２００３）、ＡはＧＨＢとは異なり、ＧＡＢＡＢ受容体に結合しない（Ｗｅｌｌｅｎｄｏｒｐｈ ｅｔ ａｌ．，２００５）。これと一致して、本発明者らは、Ａが高用量でもマウスの体温を低下させないことを示し、低体温がＡの神経保護活性に関与しないことを強調する。一方、中枢神経全体のグルコース代謝率の低下は、非ＧＡＢＡＢ介在性の作用であると思われる。化合物２は、同じ高親和性結合部位に結合できることを考慮すれば、同様の機序によって作用すると考えられる。
【0018】
脳卒中を標的とする薬物開発プログラムでよく研究されてきた方法の１つは、免疫調節化合物の使用である。蓄積しつつある証拠は、炎症誘発応答の活性化と梗塞の大きさの間のつながりを裏付ける。同様に、血液脳関門（ＢＢＢ）の破壊は、おそらくリンパ球および好中球が浸潤しやすくなることにより、虚血性脳卒中後の転帰を悪化させることがわかっている。Ａが脳虚血のこれらの有害な結果を減少させることができるかどうかを検討するため、本発明者らは、選択した炎症マーカーおよびＢＢＢ破壊物質であり、よく知られた脳卒中研究の薬物標的である細胞外プロテイナーゼＭＭＰ９の発現レベルに注目した。ＭＭＰ９が脳卒中後（１２時間および７２時間）に著しくアップレギュレートされるというこれまでの知見を裏付け、本発明者らは、Ａがこのアップレギュレーションを有意に低下させることを観察した。さらに、虚血性脳卒中後の炎症マーカーの発現をＡによる治療と組み合わせて検討したところ、脳卒中の過程で起こる脳損傷が持続的な炎症性応答を引き起こし、Ａはこれを低下させることができることが確認できた。
【0019】
本発明者らは最近、ＧＨＢ、Ａ、Ｂ、ならびに既知の化合物２－（（２，６－ジクロロフェニル）アミノ）－５－ヒドロキシフェニル酢酸（Ｃ）、および新規な化合物１および２を含むＧＨＢ関連類似体の高親和性結合部位の分子的性状がカルシウム／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼＩＩアルファ（ＣＡＭＫ２Ａ）であることを確認した。ＣＡＭＫ２Ａは、十量体の酵素であり、シナプス後膜肥厚中に最も大量に存在するタンパク質の１つである（タンパク質全体の２～６％）。ＣＡＭＫ２Ａは、リン酸化およびシナプス活性の調節を含む多数の作用に関与し、長期増強および記憶形成に極めて重要な役割を果たしている。さらに、ＣＡＭＫ２Ａタンパク質発現は、虚血性脳卒中後に梗塞周囲領域でアップレギュレートされる。ＣＡＭＫ２Ａは、α－アミノ－３－ヒドロキシ－５－メチルイソオキサゾール－４－プロピオン酸（ＡＭＰＡ）およびＮＭＤＡ受容体をともにリン酸化することが知られており、それが虚血性脳卒中に関与することを考慮すると、ＣＡＭＫ２Ａは有望な薬物標的となる（Ｃｏｕｌｔｒａｐ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。脳卒中および全脳虚血の前臨床モデルでＣＡＭＫ２Ａ活性を直接調節することは、顕著な神経保護効果をもたらした。阻害ペプチドＴａｔ－ＣＮ２１を用いたＣＡＭＫ２Ａの調節は脳卒中後の治療に有望であることが明らかにされており（Ｖｅｓｔ ｅｔ ａｌ．，２００７）、ＣＮ２１は、キナーゼのＴｈｒ２８６（ｐＴｈｒ２８６）残基の自己リン酸化の虚血誘発性の増大を防ぐことが明らかにされている（Ａｈｍｅｄ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。しかし、ペプチドの使用全般に関連する安定性および細胞浸透性ならびにバイオアベイラビリティの潜在的問題に加えて、Ｔａｔ－ペプチドはさらに、高血圧を引き起こすことが知られている。脳虚血の標的としてＣＡＭＫ２Ａを調節することは瑣末なことではないことは明らかである（Ｃｏｕｌｔｒａｐ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。例えば、ノックアウトマウスモデルでのＣＡＭＫ２Ａの完全な消失は、虚血性脳卒中後の脳損傷を悪化させるように思われた（Ｗａｘｈａｍ ｅｔ ａｌ．，１９９６）。本発明者らは、Ａ由来の機能の機序がＣＡＭＫ２Ａ活性とのその直接的な相互作用および調節、例えば、ＣＮ２１にみられるように、虚血後のｐＴｈｒ２８６自己リン酸化の阻害、から生じるという仮説を立てている。しかし、本発明者らが得たデータは、Ａ、２、およびＣＮ２１の結合部位の間に大きな差があることを示している。ＣＮ２１はＣＡＭＫ２ＡのＴ部位と直接、相互作用することが知られている（Ｖｅｓｔ ｅｔ ａｌ．，２００７）が、化合物Ａおよび関連するＧＨＢ類似体は、ＣＡＭＫ２Ａのキナーゼドメイン、調節ドメイン、またはｈｕｂドメインのいずれかに結合すると考えられる。ＣＡＭＫ２Ａに選択的な小分子の非ペプチドリガンドが存在しないことを考慮すると、提示される化合物はまた新規な作用機序を示すと思われる。
【0020】
Ａおよび関連する類似体の物理化学的特徴である、腹腔内（ｉ．ｐ．）投与後数分以内のそれらの迅速な吸収、脳内への侵入、および標的への結合が、これらの小分子を極めて興味深いものにしている。式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、およびＩＶの化合物はまた、許容される物理化学的特性を有すると考えられる。
【0021】
本発明者らは本明細書で、Ａおよび新規な類似体２が、著明な神経保護特性を示し、したがって、急性脳損傷後の神経細胞死を減少させる候補として有望であることを示す。
【0022】
定義：
急性脳損傷
本明細書で使用される「急性脳損傷」という用語は、脳組織に急性に損傷を与えるだけでなく、破壊的な神経毒性作用のカスケードも惹起する、原発性脳傷害または虚血性傷害を指す。例としては、外傷性脳損傷、脳卒中、くも膜下出血、新生児低酸素性虚血性脳症または関連する子宮内合併症、心停止による血流ショック、および外科手術時に起こる、または心不全による全体的な低灌流が挙げられる。
急性脳損傷
本明細書で使用される「急性脳損傷」という用語は、脳組織に急性に損傷を与えるだけでなく、破壊的な神経毒性作用のカスケードも惹起する、原発性脳傷害または虚血性傷害を指す。例としては、外傷性脳損傷、脳卒中、くも膜下出血、新生児低酸素性虚血性脳症または関連する子宮内合併症、心停止による血流ショック、および外科手術時に起こる、または心不全による全体的な低灌流が挙げられる。
【0023】
本発明の化合物（ＧＨＢ関連類似体とも表される）
本明細書で使用される「ＧＨＢ関連類似体」という用語は、ＧＨＢ関連構造（式Ｉ）を共有し、ＣＡＭＫ２Ａの固有の部位に結合する本発明の化合物、例えば、Ａ、Ｂ、Ｃ、１、２、または本発明の他の化合物を指す。
本明細書で使用される「ＧＨＢ関連類似体」という用語は、ＧＨＢ関連構造（式Ｉ）を共有し、ＣＡＭＫ２Ａの固有の部位に結合する本発明の化合物、例えば、Ａ、Ｂ、Ｃ、１、２、または本発明の他の化合物を指す。
【0024】
自己リン酸化
本明細書で使用される「自己リン酸化」という用語は、ＣＡＭＫ２Ａの残基Ｔｈｒ２８６、Ｔｈｒ３０５、およびＴｈｒ３０６でのリン酸化を指す。
本明細書で使用される「自己リン酸化」という用語は、ＣＡＭＫ２Ａの残基Ｔｈｒ２８６、Ｔｈｒ３０５、およびＴｈｒ３０６でのリン酸化を指す。
【0025】
ＣＡＭＫ２Ａ
本明細書で使用される「ＣＡＭＫ２Ａ」という用語は、カルシウム／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼＩＩ型アルファを指す。
本明細書で使用される「ＣＡＭＫ２Ａ」という用語は、カルシウム／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼＩＩ型アルファを指す。
【0026】
脳グルコース代謝率（ＣＭＲｇｌｃ）
本明細書で使用される「ＣＭＲｇｌｃ」という用語は、１４Ｃ－２－デオキシグルコースオートラジオグラフィーによって測定される脳グルコース代謝の変化を指す。
本明細書で使用される「ＣＭＲｇｌｃ」という用語は、１４Ｃ－２－デオキシグルコースオートラジオグラフィーによって測定される脳グルコース代謝の変化を指す。
【0027】
出血性
本明細書で使用される「出血性」という用語は、脳内または脳周辺に出血を伴う脳卒中を指す。
本明細書で使用される「出血性」という用語は、脳内または脳周辺に出血を伴う脳卒中を指す。
【0028】
虚血
本明細書で使用される「虚血」という用語は、酸素およびグルコースの送達を制限する、組織への血液供給の途絶を指す。
本明細書で使用される「虚血」という用語は、酸素およびグルコースの送達を制限する、組織への血液供給の途絶を指す。
【0029】
神経保護
本明細書で使用される「神経保護」という用語は、ある化学物質が、神経細胞損傷、例えば脳への急性損傷によって誘発されるものなどの神経細胞損傷を保護する能力を指す。
本明細書で使用される「神経保護」という用語は、ある化学物質が、神経細胞損傷、例えば脳への急性損傷によって誘発されるものなどの神経細胞損傷を保護する能力を指す。
【0030】
梗塞周囲
本明細書で使用される「梗塞周囲」という用語は、梗塞を取り囲む領域を指す。
本明細書で使用される「梗塞周囲」という用語は、梗塞を取り囲む領域を指す。
【0031】
永久中大脳動脈閉塞（ｐＭＣＡＯ）局所虚血
本明細書で使用される「ｐＭＣＡＯ」という用語は、中大脳動脈によって供給される領域により定められる領域への永久的な動脈血流の途絶を指す。
本明細書で使用される「ｐＭＣＡＯ」という用語は、中大脳動脈によって供給される領域により定められる領域への永久的な動脈血流の途絶を指す。
【0032】
光親和性標識
本明細書で使用される「光親和性標識」という用語は、ＵＶ光で刺激したときに標的に共有結合する化学プローブのＵＶ光による活性化を指す。
本明細書で使用される「光親和性標識」という用語は、ＵＶ光で刺激したときに標的に共有結合する化学プローブのＵＶ光による活性化を指す。
【0033】
光血栓性局所虚血
本明細書で使用される「光血栓性局所虚血」という用語は、ｉ．ｐ．注射によって送達される光感受性色素との光化学反応により皮質梗塞を導入する方法を指す。
本明細書で使用される「光血栓性局所虚血」という用語は、ｉ．ｐ．注射によって送達される光感受性色素との光化学反応により皮質梗塞を導入する方法を指す。
【0034】
組換え
本明細書で使用される「組換え」という用語は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトされ、タンパク質として発現されるＤＮＡ配列を指す。
本明細書で使用される「組換え」という用語は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトされ、タンパク質として発現されるＤＮＡ配列を指す。
【0035】
外傷性脳損傷（ＴＢＩ）
本明細書で使用される「外傷性脳損傷」という用語は、脳の正常な機能の破壊を引き起こし得る、脳への急性損傷を指す。
本明細書で使用される「外傷性脳損傷」という用語は、脳の正常な機能の破壊を引き起こし得る、脳への急性損傷を指す。
【図面の簡単な説明】
【0036】
【図1】放射標識としてＡ）３Ｈ－Ｂ、またはＢ、Ｃ、Ｄ）３Ｈ－Ａのいずれかを用いて、ＧＨＢ関連類似体Ａ、Ｂ、Ｃ、１～１０が高親和性前脳結合部位にナノモル濃度の親和性で結合することを示す図である。結合部位は既知のペプチドＣＮ２１を認識しない。
【図2】化合物ＡはＧＡＢＡＢ受容体に結合しない一方でＧＨＢは結合することを示す図である。
【図3】化合物ＡはマウスでＧＡＢＡＢ受容体を介する低体温を引き起こさない一方でＧＢＬ（ＧＨＢ）は引き起こすことを示す図である。
【図4】ＧＨＢプロドラッグＧＢＬ（２００ｍｇ／ｋｇ）が、ＧＡＢＡＢ受容体に介在されない脳グルコース利用を減少させることを示す図である。
【図5】化合物Ａ（１７５ｍｇ／ｋｇ）は、３日前に誘発された光血栓性局所虚血の３０分後マウスに投与（ｉ．ｐ．）されると、梗塞の大きさを有意に減少することを示す図である。
【図6】化合物Ａ（１７．５ｍｇ／ｋｇまたは１７５ｍｇ／ｋｇ）は、３日前に誘発された光血栓性局所虚血の３０分後に投与（ｉ．ｐ．）されると、Ａ）グリッド歩行タスクまたはＢ）シリンダータスクにおいて影響を受けた肢での運動能力を有意に改善することを示す図である。
【図7】化合物Ａ（１７５ｍｇ／ｋｇ）をＡ）は、３日前に生じさせた光血栓性局所傷害後３時間、６時間または１２時間のいずれかでマウスに投与（ｉ．ｐ．）されると、梗塞の大きさを有意に減少することを示す図である。Ｂ）用量９０ｍｇ／ｋｇも同様に神経保護的である。
【図8】化合物Ａ（１７５ｍｇ／ｋｇ）は、３日前に生じさせた光血栓性局所虚血傷害後３時間、６時間または１２時間のいずれかで投与（ｉ．ｐ．）されると、Ａ）グリッド歩行タスクまたはＢ）において影響を受けた肢での運動能力を有意に改善することを示す図である。
【図9】化合物２は、Ａ）７日前に生じさせた光血栓性局所虚血傷害後３時間または６時間でマウスに投与（ｉ．ｐ．）される（１７５ｍｇ／ｋｇ）と、梗塞の大きさを有意に減少し、かつＢ、Ｃ）損傷の７日後に測定されるグリッド歩行タスクおよびシリンダータスクの両方において運動能力を有意に改善することを示す図である。Ｄ）３時間で５０ｍｇ／ｋｇでも同様に、化合物２は梗塞の大きさを減少し、かつＥ、Ｆ）損傷の７日後に測定されるグリッド歩行タスクおよびシリンダータスクの両方において運動能力を有意に改善する。
【図10】化合物Ａが、光血栓性局所傷害後Ａ、Ｂ、Ｃ）３日またはＤ）１２時間に測定される分子マーカー、ＣＤ１４およびＭＭＰ９の発現を有意に減少させることを示す図である。
【図11】化合物Ａが、光血栓性局所傷害後４時間に測定される炎症誘発性サイトカインＩＬ－６の血漿中発現レベルを有意に低下させることを示す図である。
【図12】化合物Ａ（１７５ｍｇ／ｋｇ）は、３日前に生じさせたｐＭＣＡＯ局所病変後３０分でマウスに投与（ｉ．ｐ．）されると、梗塞の大きさを有意に減少することを示す図である。
【図13】化合物Ａ（１７５ｍｇ／ｋｇ）は、２～３日前に生じさせたｐＭＣＡＯ局所病変後３０分で投与されると、感覚運動障害を改善することを示す図である。効果はＡ、Ｂ）ロータロッド試験、Ｃ）握力試験、およびＤ）ハーグリーブス試験で認められた。
【図14】前脳領域への３Ｈ－Ａ放射性リガンドの特異的結合は、Ａの脳浸透性および標的結合を裏付ける。マウスに放射性リガンド（マウス１匹当たり５ＭＢｑ）を注射（ｉ．ｐ．）し３０分後に脳を切り出し、オートラジオグラフィーに供した。
【図15】ＣＡＭＫ２Ａが、Ａ）光親和性標識およびプロテオミクスによって特定され、Ｂ）ウエスタンブロットおよびＣ、Ｄ）放射性リガンド結合試験によって確認される、哺乳動物脳でのＧＨＢに対する高親和性結合部位であることを示す図である。
【図16】ＧＨＢならびに類似体Ａ、Ｂ、Ｃ、１および２が、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞で一過的に発現させた組換えＣＡＭＫ２Ａに直接結合することを示す図である。
【図17】化合物Ａおよび２の細胞内取込みが、ｔｓＡ２０１細胞中に内因性に存在するプロトン共役輸送体においてそれらの基質活性に介在されることを示す図である。
【図18】光血栓法に供されたマウス由来の組織に対するｅｘ ｖｉｖｏのｐＴｈｒ２８６自己リン酸化アッセイは、化合物Ａが過剰な自己リン酸化を抑えることを示す、図である。
【発明を実施するための形態】
【0037】
実施例
材料および方法
ラット脳膜結合アッセイ
化合物を、ラット皮質から調製した粗シナプス膜を用いる既に公開されているプロトコル（Ｗｅｌｌｅｎｄｏｒｐｈ ｅｔ ａｌ．，２００５およびＫｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１６）に従い、３Ｈ－Ａ、３Ｈ－Ｂ、または３Ｈ－ＧＡＢＡ結合アッセイ（ＧＡＢＡＢに対する）で評価した。３Ｈ－Ａおよび３Ｈ－Ｂの結合には、膜を、９６ウェルリガンドプレートで０～４℃にて１時間、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０またはｐＨ７．４）中で、濃度を漸増させた被験化合物または非特異的結合のための１～１０ｍＭ ＧＨＢとインキュベートした。インキュベーション後に９６ウェルＰａｃｋａｒｄセルハーベスター（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）を用いたＧＦ／Ｃユニフィルター（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社、ボストン、マサチューセッツ州、ＵＳＡ）での迅速なろ過および氷冷結合緩衝液での３回の迅速な洗浄を行い、乾燥させたフィルターにｍｉｃｒｏｓｃｉｎｔシンチレーション液（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）を加え、フィルターに結合した放射能の量をＰａｃｋａｒｄ ＴｏｐＣｏｕｎｔマイクロプレートシンチレーションカウンター（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）で定量化した。ＧＡＢＡＢ受容体結合アッセイには、膜を、４８ウェルの設定で室温にて１時間、２．５ｍＭ ＣａＣｌ２と４０μＭイソグバシン（Ｓｉｇｍａ社）とを含有する５０ｍＭトリスＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）中で、濃度を漸増させた被験化合物または非特異的結合のための１００μＭバクロフェン（Ｓｉｇｍａ社）とインキュベートした。結合反応を、４８ウェルハーベスターおよび氷冷結合緩衝液での迅速な洗浄を用いて、０．１％ポリエチレンイミンに浸漬したＧＦ／Ｃフィルター（Ｗｈａｔｍａｎ社）での迅速なろ過により終了させた。乾燥させたフィルターをＯｐｔｉｆｌｕｏｒシンチレーション液（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）に加え、カウントをＴｒｉｃａｒｂ ４９１０ＴＲシンチレーションカウンター（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）で求めた。データを、非線形回帰カーブフィッティングおよびチェン・プルソフ式によってそれぞれ算出した（対照に対する）％特異的結合およびＩＣ５０またはＫｉ値として表す。
材料および方法
ラット脳膜結合アッセイ
化合物を、ラット皮質から調製した粗シナプス膜を用いる既に公開されているプロトコル（Ｗｅｌｌｅｎｄｏｒｐｈ ｅｔ ａｌ．，２００５およびＫｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１６）に従い、３Ｈ－Ａ、３Ｈ－Ｂ、または３Ｈ－ＧＡＢＡ結合アッセイ（ＧＡＢＡＢに対する）で評価した。３Ｈ－Ａおよび３Ｈ－Ｂの結合には、膜を、９６ウェルリガンドプレートで０～４℃にて１時間、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０またはｐＨ７．４）中で、濃度を漸増させた被験化合物または非特異的結合のための１～１０ｍＭ ＧＨＢとインキュベートした。インキュベーション後に９６ウェルＰａｃｋａｒｄセルハーベスター（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）を用いたＧＦ／Ｃユニフィルター（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社、ボストン、マサチューセッツ州、ＵＳＡ）での迅速なろ過および氷冷結合緩衝液での３回の迅速な洗浄を行い、乾燥させたフィルターにｍｉｃｒｏｓｃｉｎｔシンチレーション液（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）を加え、フィルターに結合した放射能の量をＰａｃｋａｒｄ ＴｏｐＣｏｕｎｔマイクロプレートシンチレーションカウンター（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）で定量化した。ＧＡＢＡＢ受容体結合アッセイには、膜を、４８ウェルの設定で室温にて１時間、２．５ｍＭ ＣａＣｌ２と４０μＭイソグバシン（Ｓｉｇｍａ社）とを含有する５０ｍＭトリスＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）中で、濃度を漸増させた被験化合物または非特異的結合のための１００μＭバクロフェン（Ｓｉｇｍａ社）とインキュベートした。結合反応を、４８ウェルハーベスターおよび氷冷結合緩衝液での迅速な洗浄を用いて、０．１％ポリエチレンイミンに浸漬したＧＦ／Ｃフィルター（Ｗｈａｔｍａｎ社）での迅速なろ過により終了させた。乾燥させたフィルターをＯｐｔｉｆｌｕｏｒシンチレーション液（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）に加え、カウントをＴｒｉｃａｒｂ ４９１０ＴＲシンチレーションカウンター（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）で求めた。データを、非線形回帰カーブフィッティングおよびチェン・プルソフ式によってそれぞれ算出した（対照に対する）％特異的結合およびＩＣ５０またはＫｉ値として表す。
【0038】
温度記録
マウスを、実験当日のストレスを最小限に抑えるために、実験前の４日間生理食塩水のｉ．ｐ．注射（０．９％生理食塩水）で前処置した。実験は静かな部屋で実施し、実験前の少なくとも２時間、マウスをその部屋の中で平穏な状態にしておいた。ｉ．ｐ．注射後、マウスをホームケージに２時間入れておき、中核体温を記録し、次いで安楽死させた。中核体温は、潤滑させたサーミスタプローブ（モデルＰＲＡ－２２００２－Ａ、直径２．２ｍｍ；ＥＬＬＡＢ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社）で温度計（モデルＤＭ８５２；ＥＬＬＡＢ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社；コペンハーゲン、デンマーク）により直腸内で測定した。マウスを尾基底部で持ち、安定した温度測定値が得られるまで測定した。
マウスを、実験当日のストレスを最小限に抑えるために、実験前の４日間生理食塩水のｉ．ｐ．注射（０．９％生理食塩水）で前処置した。実験は静かな部屋で実施し、実験前の少なくとも２時間、マウスをその部屋の中で平穏な状態にしておいた。ｉ．ｐ．注射後、マウスをホームケージに２時間入れておき、中核体温を記録し、次いで安楽死させた。中核体温は、潤滑させたサーミスタプローブ（モデルＰＲＡ－２２００２－Ａ、直径２．２ｍｍ；ＥＬＬＡＢ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社）で温度計（モデルＤＭ８５２；ＥＬＬＡＢ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社；コペンハーゲン、デンマーク）により直腸内で測定した。マウスを尾基底部で持ち、安定した温度測定値が得られるまで測定した。
【0039】
グルコース代謝試験
局所脳グルコース代謝率（ｒＣＭＲｇｌｃ）を、実験全体を通して血液試料採取を実施する必要を回避するｒＣＭＲｇｌｃの半定量的指標（ｉｒＣＭＲｇｌｃ）を用いて、意識があり自由に運動するＧＡＢＡＢ（１）受容体ノックアウトマウス（Ｋａｕｐｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，２００３）で測定した。ＧＢＬ（２００ｍｇ／ｋｇ）または生理食塩水ｉ．ｐ．注射の１０分後に、マウスに生理食塩水０．４ｍｌに溶かした５μＣｉの１４Ｃ－２－デオキシグルコース（比活性５４．１ｍＣｉ／ｍｍｏｌ、Ｓｉｇｍａ社、イギリス）をｉ．ｐ．注射した。４５分後に、マウスを頸椎脱臼により安楽死させ、脳を急速凍結し、薄切まで－８０℃で保管した。２０μｍの対照切片を、ブレグマに対応して２．６８ｍｍ、１．３４ｍｍ、０．７４ｍｍ、－１．７ｍｍ、－３．０８ｍｍ、および－５．６８ｍｍで収集し、スライドガラス（Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、デンマーク）上に解凍マウントした。オートラジオグラフィー画像を、切片をカセット内で１４Ｃ感受性プレート（Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｃａｎｄｉｎａｖｉａ社、ナッカ、スウェーデン）に１４Ｃマイクロスケール（Ａｍｅｒｓｈａｍ社、イギリス）とともに曝露することによって作製した。最後に、撮像プレートを、ＢＡＳ－２５００スキャナー（Ｆｕｊｉｆｉｌｍ Ｅｕｒｏｐｅ社、デュッセルドルフ、ドイツ）でスキャンした。前頭皮質および海馬の特異的結合および非特異結合を、ＩｍａｇｅＪを用いてピクセル密度を測定することにより算出し、換算表を用いてｎＣｉに換算した。
局所脳グルコース代謝率（ｒＣＭＲｇｌｃ）を、実験全体を通して血液試料採取を実施する必要を回避するｒＣＭＲｇｌｃの半定量的指標（ｉｒＣＭＲｇｌｃ）を用いて、意識があり自由に運動するＧＡＢＡＢ（１）受容体ノックアウトマウス（Ｋａｕｐｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，２００３）で測定した。ＧＢＬ（２００ｍｇ／ｋｇ）または生理食塩水ｉ．ｐ．注射の１０分後に、マウスに生理食塩水０．４ｍｌに溶かした５μＣｉの１４Ｃ－２－デオキシグルコース（比活性５４．１ｍＣｉ／ｍｍｏｌ、Ｓｉｇｍａ社、イギリス）をｉ．ｐ．注射した。４５分後に、マウスを頸椎脱臼により安楽死させ、脳を急速凍結し、薄切まで－８０℃で保管した。２０μｍの対照切片を、ブレグマに対応して２．６８ｍｍ、１．３４ｍｍ、０．７４ｍｍ、－１．７ｍｍ、－３．０８ｍｍ、および－５．６８ｍｍで収集し、スライドガラス（Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、デンマーク）上に解凍マウントした。オートラジオグラフィー画像を、切片をカセット内で１４Ｃ感受性プレート（Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｃａｎｄｉｎａｖｉａ社、ナッカ、スウェーデン）に１４Ｃマイクロスケール（Ａｍｅｒｓｈａｍ社、イギリス）とともに曝露することによって作製した。最後に、撮像プレートを、ＢＡＳ－２５００スキャナー（Ｆｕｊｉｆｉｌｍ Ｅｕｒｏｐｅ社、デュッセルドルフ、ドイツ）でスキャンした。前頭皮質および海馬の特異的結合および非特異結合を、ＩｍａｇｅＪを用いてピクセル密度を測定することにより算出し、換算表を用いてｎＣｉに換算した。
【0040】
局所虚血の光血栓マウスモデル
処置はいずれも、オタゴ大学、動物実験委員会、およびＧｕｉｄｅ ｆｏｒ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ（ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．８５－２３，１９９６）によって示される実験動物の管理と使用に関するガイドラインに従い実施した。ｉｎ ｖｉｖｏ試験はいずれも、オタゴ大学動物、倫理委員会による承認を受け、ＡＲＲＩＶＥ（Ａｎｉｍａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ：Ｒｅｐｏｒｔｉｎｇ Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ）ガイドラインに従い報告される。光化学的皮質病変モデルは、脳卒中および外傷性脳損傷（ＴＢＩ）と臨床的に関係のある急性脳損傷の状態に類似している。局所虚血を、既に記載されている（Ｃｌａｒｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１０）通りに、体重約２３～３０ｇの雄Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（８～１０週齢）に光血栓法により誘発した。マウスをイソフルラン（Ｏ２中２％～２．５％）による麻酔下で定位装置に置き、頭蓋を正中切開により露出させ、結合組織を取り除き、乾燥させた。４０倍対物レンズに取り付けられ直径２ｍｍの照射を与える冷光源（ＫＬ１５００ ＬＣＤ、Ｚｅｉｓｓ社、オークランド、ニュージーランド）を、ブレグマの側方１．５ｍｍに置いた。次いで、ローズベンガル（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社、オークランド、ニュージーランド；通常の生理食塩水中１０ｍｇ／ｍｌ）０．２ｍｌをｉ．ｐ．投与した。５分後に、脳を、露出させた無傷の頭蓋を通して１５分間照射し、一方で体温を、加温パッド（Ｈａｒｖａｒｄ ａｐｐａｒａｔｕｓ社、ホリストン、マサチューセッツ州、米国）を用いて３７．０±０．３℃で維持した。皮膚を接着し、マウスを覚醒期の間、加温パッドの上に置いたケージの中に入れておいた。マウスを１２時間の明／暗サイクル下で、餌料および水を自由摂取させて飼育した。さらに、マウスを毎日モニターし、体重を測定した。
処置はいずれも、オタゴ大学、動物実験委員会、およびＧｕｉｄｅ ｆｏｒ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ（ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．８５－２３，１９９６）によって示される実験動物の管理と使用に関するガイドラインに従い実施した。ｉｎ ｖｉｖｏ試験はいずれも、オタゴ大学動物、倫理委員会による承認を受け、ＡＲＲＩＶＥ（Ａｎｉｍａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ：Ｒｅｐｏｒｔｉｎｇ Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ）ガイドラインに従い報告される。光化学的皮質病変モデルは、脳卒中および外傷性脳損傷（ＴＢＩ）と臨床的に関係のある急性脳損傷の状態に類似している。局所虚血を、既に記載されている（Ｃｌａｒｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１０）通りに、体重約２３～３０ｇの雄Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（８～１０週齢）に光血栓法により誘発した。マウスをイソフルラン（Ｏ２中２％～２．５％）による麻酔下で定位装置に置き、頭蓋を正中切開により露出させ、結合組織を取り除き、乾燥させた。４０倍対物レンズに取り付けられ直径２ｍｍの照射を与える冷光源（ＫＬ１５００ ＬＣＤ、Ｚｅｉｓｓ社、オークランド、ニュージーランド）を、ブレグマの側方１．５ｍｍに置いた。次いで、ローズベンガル（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社、オークランド、ニュージーランド；通常の生理食塩水中１０ｍｇ／ｍｌ）０．２ｍｌをｉ．ｐ．投与した。５分後に、脳を、露出させた無傷の頭蓋を通して１５分間照射し、一方で体温を、加温パッド（Ｈａｒｖａｒｄ ａｐｐａｒａｔｕｓ社、ホリストン、マサチューセッツ州、米国）を用いて３７．０±０．３℃で維持した。皮膚を接着し、マウスを覚醒期の間、加温パッドの上に置いたケージの中に入れておいた。マウスを１２時間の明／暗サイクル下で、餌料および水を自由摂取させて飼育した。さらに、マウスを毎日モニターし、体重を測定した。
【0041】
ｉｎ ｖｉｖｏ試験のための化合物供給源および化合物調製
Ａのナトリウム塩を、既に記載されている（Ｖｏｇｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１３）通りに社内で合成した。ＧＨＢのナトリウム塩、ＧＨＢプロドラッグのγ－ブチロラクトン（ＧＢＬ）、ＮＣＳ－３８２（Ｂ）、ジクロフェナク、および４’－ヒドロキシジクロフェナクを、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社から購入し、ＣをＣａｒｂｏｓｙｎｔｈ社またはＳａｎｔａＣｒｕｚ社（バークシャー州、イギリス）から入手した。ＣＮ２１ペプチドを、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ社から入手した。
Ａのナトリウム塩を、既に記載されている（Ｖｏｇｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１３）通りに社内で合成した。ＧＨＢのナトリウム塩、ＧＨＢプロドラッグのγ－ブチロラクトン（ＧＢＬ）、ＮＣＳ－３８２（Ｂ）、ジクロフェナク、および４’－ヒドロキシジクロフェナクを、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社から購入し、ＣをＣａｒｂｏｓｙｎｔｈ社またはＳａｎｔａＣｒｕｚ社（バークシャー州、イギリス）から入手した。ＣＮ２１ペプチドを、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ社から入手した。
【0042】
ｉｎ ｖｉｖｏ試験には、全ての化合物を、無菌生理食塩水とＨ２Ｏの混合物に溶かして等張（０．９％）にし、マウスの体重１グラム当たり１０ｍｇ／ｍｌおよび１０μｌの溶液として投与した。化合物の注射（ｉ．ｐ．）を、光血栓性脳卒中誘発の３０分後、３時間後、６時間後、または１２時間後に実施した。溶媒群は、同じ時点（３０分後、３時間後、６時間後、または１２時間後）で対応する体積の生理食塩水（０．９％）を受けた。
【0043】
局所虚血の光血栓モデルでの行動評価
前肢運動能力を、既に記載されている（Ｃｌａｒｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１０）通りにシリンダータスクおよびグリッド歩行タスクを用いて決定した。全個体を、それぞれ、虚血性傷害の１週間前および３日後または７日後に、試験セッションの前と後の両方で試験した。行動をスコア化する観察者には治療群を知らせなかった。
前肢運動能力を、既に記載されている（Ｃｌａｒｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１０）通りにシリンダータスクおよびグリッド歩行タスクを用いて決定した。全個体を、それぞれ、虚血性傷害の１週間前および３日後または７日後に、試験セッションの前と後の両方で試験した。行動をスコア化する観察者には治療群を知らせなかった。
【0044】
局所虚血の永久中大脳動脈閉塞（ｐＭＣＡＯ）モデル
ｐＭＣＡＯ試験を、週齢の一致した雄Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（Ｔａｃｏｎiｃ）の若年成体（７～８週齢）を用いて実施した。マウスを、日周照明下で別個のゲージで飼育し、餌料（１３１４ Ａｌｔｒｏｍｉｎ）および水を自由摂取させた。マウスを、デンマーク動物倫理委員会によって承認されたガイドラインに従い外科手術前の７日間順化させた。
ｐＭＣＡＯ試験を、週齢の一致した雄Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（Ｔａｃｏｎiｃ）の若年成体（７～８週齢）を用いて実施した。マウスを、日周照明下で別個のゲージで飼育し、餌料（１３１４ Ａｌｔｒｏｍｉｎ）および水を自由摂取させた。マウスを、デンマーク動物倫理委員会によって承認されたガイドラインに従い外科手術前の７日間順化させた。
【0045】
局所脳虚血を、左中大脳動脈（ＭＣＡ）遠位部の永久閉塞により生じさせた。マウスを、Ｈｙｐｎｏｒｍ（フェンタニルクエン酸塩０．３１５ｍｇ／ｍｌおよびフルアニソン１０ｍｇ／ｍｌ；Ｊａｎｓｅｎ－Ｃｉｌａｇ社）とＳｔｅｓｏｌｉｄ（５ｍｇ／ｍｌジアゼパム；Ｄｕｍｅｘ社）と蒸留水の混合物の注射（１：１：２；０．２０ｍｌ／１０ｇ体重、ｓ．ｃ．）により麻酔にかけた。マウスを３７±０．５℃の温かい加温パッドの上に置き、眼から耳まで皮膚を切開した。耳下腺および側頭筋の上部を押しのけ、ＭＣＡの遠位部にドリルで小さい穴を開けた。電気凝固によってＭＣＡを閉塞させ、開いた切開部を４．０ナイロン縫合糸で縫合した。外科手術後に、マウスに等張食塩水１ｍｌを注射し、マウスの眼球を軟膏でコートした。マウスを２８℃の回復室で外科手術から回復させた。術後疼痛を治療するため、マウスに１：３０希釈のＴｅｍｇｅｓｉｃ（ストック：０．３ｍｇ／ｍｌブプレノルフィン；Ｒｅｃｋｉｔｔ ＆ Ｃｏｌｍａｎ社、イギリス）０．１５ｍｌを外科手術直後に開始して８時間間隔で３回、ｓ．ｃ．投与した。
【0046】
ｐＭＣＡＯモデルでの行動評価
感覚運動障害を評価するため、マウスを、脳卒中の２～３日後にロータロッド試験、握力試験、およびハーグリーブス試験で試験した。
感覚運動障害を評価するため、マウスを、脳卒中の２～３日後にロータロッド試験、握力試験、およびハーグリーブス試験で試験した。
【0047】
ロータロッド（ＬＥ８２００、Ｐａｎｌａｂ社）は、げっ歯類が回転ロッド上にとどまる時間を評価することにより、その運動能力を測定する。ロッドの回転は脳卒中の４８時間後に５分かけて１分当たり０回転から４０回転（ｒｐｍ）に加速し、マウスを２０分の間隔（休息時間）をあけて４回の反復試験で試験した。外科手術前に、マウスを、４ｒｐｍでロッド上に３０秒間とどまるよう予め訓練した。握力計（ＢＩＯ－ＧＴ－３、ＢＩＯＳＥＢ社）は、マウスにその握った足を放させるのに必要とされる最大の力を求めることによりマウスの神経筋機能の試験を可能にする。マウスに金属格子を握らせ、次いで、水平に後ろ向きに引っ張る。格子にかかる力をピーク張力として記録する。前肢の個々（左および右）の握力と合計（左右）の握力を、ｐＭＣＡＯの前（ベースライン）および３日後に測定した。各マウスを連続５回の試行で試験し、最大握力をスコアとして記録した。温痛覚過敏（通常は無害な熱源からの後肢の引っ込め）を、ハーグリーブス試験の設定で試験した。間に少なくとも２分間の中断を挟んで、片方の後肢につき５回の刺激の遅延時間を記録した。反射遅延の最低スコアと最大スコアを破棄し、左右の平均値を算出し、プロットした。
【0048】
ｉｎ ｖｉｖｏ試験の統計解析
全ての解析を、ＧｒａｐｈＰａｄ６．０（サンディエゴ、カリフォルニア州、米国）で実施した。全てのデータを平均値＋／－ＳＥＭで表す。２つのグループを比較する場合には、対応のないｔ検定を用い、３つ以上のグループを比較する場合には、事後検定にホルム・シダックを用いる一元配置ＡＮＯＶＡを実施した。行動解析には、事後検定にボンフェローニを用いる二次元配置ＡＮＯＶＡ（光血栓性虚血のデータ）または反復測定二次元配置ＡＮＯＶＡ（ｐＭＣＡＯのデータ）を用いた。
全ての解析を、ＧｒａｐｈＰａｄ６．０（サンディエゴ、カリフォルニア州、米国）で実施した。全てのデータを平均値＋／－ＳＥＭで表す。２つのグループを比較する場合には、対応のないｔ検定を用い、３つ以上のグループを比較する場合には、事後検定にホルム・シダックを用いる一元配置ＡＮＯＶＡを実施した。行動解析には、事後検定にボンフェローニを用いる二次元配置ＡＮＯＶＡ（光血栓性虚血のデータ）または反復測定二次元配置ＡＮＯＶＡ（ｐＭＣＡＯのデータ）を用いた。
【0049】
組織学的評価
梗塞領域の定量化のため、マウスに生理食塩水、次いで４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）を灌流し、脳を切り出し、後固定のために一晩４％ＰＦＡに浸漬した。次いで、脳を３０％スクロース溶液に移し、処理まで４℃で保管した。脳を３０μｍの切片に薄切し、不凍媒体に浮遊させた。切片をマウントし、Ｌｉｅら（２０１７）に記載されている通りに、クレシルバイオレットで染色し、梗塞全体を通じて６番目の切片毎に測定することにより、梗塞体積を求めた。全ての解析を、治療群を知らされていない観察者が実施した。ｐＭＣＡＯ試験の脳をＣＯ２（気体）中で急速冷凍し、６つの並行するシリーズの切片（３０μｍ）に処理した。別個のシリーズをスライドガラス上に収集し、梗塞の大きさの解析に使用するか、エッペンドルフチューブに入れ、ｑＰＣＲに使用した。スライドガラスを、さらなる処理まで－８０℃で保管し、次いで、光血栓光化学法で記載した通りにクレシルバイオレット染色し、定量化した。
梗塞領域の定量化のため、マウスに生理食塩水、次いで４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）を灌流し、脳を切り出し、後固定のために一晩４％ＰＦＡに浸漬した。次いで、脳を３０％スクロース溶液に移し、処理まで４℃で保管した。脳を３０μｍの切片に薄切し、不凍媒体に浮遊させた。切片をマウントし、Ｌｉｅら（２０１７）に記載されている通りに、クレシルバイオレットで染色し、梗塞全体を通じて６番目の切片毎に測定することにより、梗塞体積を求めた。全ての解析を、治療群を知らされていない観察者が実施した。ｐＭＣＡＯ試験の脳をＣＯ２（気体）中で急速冷凍し、６つの並行するシリーズの切片（３０μｍ）に処理した。別個のシリーズをスライドガラス上に収集し、梗塞の大きさの解析に使用するか、エッペンドルフチューブに入れ、ｑＰＣＲに使用した。スライドガラスを、さらなる処理まで－８０℃で保管し、次いで、光血栓光化学法で記載した通りにクレシルバイオレット染色し、定量化した。
【0050】
ｑＰＣＲ
梗塞周囲領域の組織を、脳卒中の１２～７２時間後に収集し、急速凍結し、ＲＮＡを、製造業者の指示通りにＲＮＡ ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて抽出した。抽出したＲＮＡを、全て製造業者のプロトコルに従い、Ｔｕｒｂｏ ＤＮＡ－ｆｒｅｅキット（Ａｍｂｉｏｎ社）を使用してＤＮアーゼで処理した。逆転写を、標準的なＰＣＲ機器にｑＳｃｒｉｐｔ（商標）ｃＤＮＡ ＳｕｐｅｒＭｉｘ（Ｑｕａｎｔａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、ゲイザースバーグ、メリーランド州、米国）を用いて実施し（２５℃で５分間、４２℃で３０分間、８５℃で５分間）、ｃＤＮＡを、さらなる処理まで－２０℃で保管した。
梗塞周囲領域の組織を、脳卒中の１２～７２時間後に収集し、急速凍結し、ＲＮＡを、製造業者の指示通りにＲＮＡ ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて抽出した。抽出したＲＮＡを、全て製造業者のプロトコルに従い、Ｔｕｒｂｏ ＤＮＡ－ｆｒｅｅキット（Ａｍｂｉｏｎ社）を使用してＤＮアーゼで処理した。逆転写を、標準的なＰＣＲ機器にｑＳｃｒｉｐｔ（商標）ｃＤＮＡ ＳｕｐｅｒＭｉｘ（Ｑｕａｎｔａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、ゲイザースバーグ、メリーランド州、米国）を用いて実施し（２５℃で５分間、４２℃で３０分間、８５℃で５分間）、ｃＤＮＡを、さらなる処理まで－２０℃で保管した。
【0051】
ｑＰＣＲを、ＰｅｒｆｅＣＴａ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＦａｓｔＭｉｘ（Ｑｕａｎｔａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、無ヌクレアーゼ水（Ｑｉａｇｅｎ社、ウエスト・サセックス州、イギリス）、およびプライマー（ＴＡＧ Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ社（コペンハーゲン、デンマーク））を混合して９６ウェルプレート（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、サンタクララ、カリフォルニア州、米国）で実施した。ＰＣＲを、９５℃で３０秒間の初期変性段階、次いで、９５℃で５秒間、６０℃で１５秒間、および７２℃で１０秒間からなるサイクルを４０サイクルで実施した。単一産物増幅を確実に実施するため、９５℃で６０秒間、５５℃で３０秒間、および９５℃で３０秒間からなる解離曲線解析を実施した。ｑＰＣＲを、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｍｘ３００５Ｐ ｑＰＣＲシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いて実施し、対応するＭｘＰｒｏソフトウェアを用いてＣｔ値を求めた。２（参照Ｃｔ－目的Ｃｔ）を用いてΔＣｔ値を算出した。
【0052】
プライマー配列
配列番号１ ＣＤ１４（Ｆ）ＡＡＴＣＴＡＣＣＧＡＣＣＡＴＧＧＡＧＣ
配列番号２ ＣＤ１４（Ｒ）ＡＣＴＴＴＣＣＴＣＧＴＣＴＡＧＣＴＣＧ
配列番号３ ＩＬ－６（Ｆ）ＣＴＣＴＧＧＧＡＡＡＴＣＧＴＧＧＡＡＡＴ
配列番号４ ＩＬ－６（Ｒ）ＣＣＡＧＴＴＴＧＧＴＡＧＣＡＴＣＣＡＴＣ
配列番号５ ＭＭＰ９（Ｆ）ＣＡＧＣＣＧＡＣＴＴＴＴＧＴＧＧＴＣＴＴＣ
配列番号６ ＭＭＰ９（Ｒ）ＣＧＧＣＣＧＴＡＧＡＧＡＣＴＧＣＴＴＣＴＩ
配列番号７ ＧＦＡＰ（Ｆ）ＧＧＡＧＡＴＧＣＧＧＧＡＴＧＧＴＧＡＧ
配列番号８ ＧＦＡＰ（Ｒ）ＡＣＣＡＣＧＴＣＣＴＴＧＴＧＣＴＣＣＴＧ
配列番号９ Ｒｐｌ１３ａ（Ｆ）ＧＧＡＧＧＧＧＣＡＧＧＴＴＣＴＧＧＴＡＴ
配列番号１０ Ｒｐｌ１３ａ（Ｒ）ＴＧＴＴＧＡＴＧＣＣＴＴＣＡＣＡＧＣＧＴ
配列番号１１ ＳＤＨＡ（Ｆ）ＧＣＣＣＡＴＧＣＣＡＧＧＧＡＡＧＡＴＴＡ
配列番号１２ ＳＤＨＡ（Ｒ）ＴＧＴＴＣＣＣＣＡＡＡＣＧＧＣＴＴＣＴＴ
配列番号１ ＣＤ１４（Ｆ）ＡＡＴＣＴＡＣＣＧＡＣＣＡＴＧＧＡＧＣ
配列番号２ ＣＤ１４（Ｒ）ＡＣＴＴＴＣＣＴＣＧＴＣＴＡＧＣＴＣＧ
配列番号３ ＩＬ－６（Ｆ）ＣＴＣＴＧＧＧＡＡＡＴＣＧＴＧＧＡＡＡＴ
配列番号４ ＩＬ－６（Ｒ）ＣＣＡＧＴＴＴＧＧＴＡＧＣＡＴＣＣＡＴＣ
配列番号５ ＭＭＰ９（Ｆ）ＣＡＧＣＣＧＡＣＴＴＴＴＧＴＧＧＴＣＴＴＣ
配列番号６ ＭＭＰ９（Ｒ）ＣＧＧＣＣＧＴＡＧＡＧＡＣＴＧＣＴＴＣＴＩ
配列番号７ ＧＦＡＰ（Ｆ）ＧＧＡＧＡＴＧＣＧＧＧＡＴＧＧＴＧＡＧ
配列番号８ ＧＦＡＰ（Ｒ）ＡＣＣＡＣＧＴＣＣＴＴＧＴＧＣＴＣＣＴＧ
配列番号９ Ｒｐｌ１３ａ（Ｆ）ＧＧＡＧＧＧＧＣＡＧＧＴＴＣＴＧＧＴＡＴ
配列番号１０ Ｒｐｌ１３ａ（Ｒ）ＴＧＴＴＧＡＴＧＣＣＴＴＣＡＣＡＧＣＧＴ
配列番号１１ ＳＤＨＡ（Ｆ）ＧＣＣＣＡＴＧＣＣＡＧＧＧＡＡＧＡＴＴＡ
配列番号１２ ＳＤＨＡ（Ｒ）ＴＧＴＴＣＣＣＣＡＡＡＣＧＧＣＴＴＣＴＴ
【0053】
血漿中サイトカインの定量化
ＭＣＰ－１（単球走化性タンパク質－１）、ＩＬ－６（インターロイキン－６）、およびＩＬ－１ａ（インターロイキン－１ａ）の検出を、製造業者の指示に従いＬＥＧＥＮＤｐｌｅｘアッセイキット（ＢｉｏＰｌｅｘ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社、サンディエゴ、カリフォルニア州、米国）を使用して実施した。
ＭＣＰ－１（単球走化性タンパク質－１）、ＩＬ－６（インターロイキン－６）、およびＩＬ－１ａ（インターロイキン－１ａ）の検出を、製造業者の指示に従いＬＥＧＥＮＤｐｌｅｘアッセイキット（ＢｉｏＰｌｅｘ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社、サンディエゴ、カリフォルニア州、米国）を使用して実施した。
【0054】
ラット脳からのＧＨＢ高親和性結合部位の光親和性標識および濃縮
粗シナプス膜を、暗所で４℃にて６０分間、６００ｎＭ ４－（４－（（３－アジド－５－（アジドメチル）ベンジル）オキシ）フェニル）－４－ヒドロキシブタン酸（ＳＢＶ３）と０．１２５ｍｇ／ｍｌの濃度でインキュベートした。競合実験には、０．１ｎＭ～１０μＭの化合物Ｃを加えた。次いで、膜を非組織培養物で処理したポリスチレンプレート上に移し、高強度（３０２ｎｍ、８Ｗ、Ｍ－２０Ｖ）に設定したＵＶＰ Ｂｅｎｃｈｔｏｐトランスイルミネーターを用いて、室温で４分間照射した。次いで、過剰のＳＢＶ３を１×ＰＢＳおよび遠心分離で洗い流した。シュタウディンガー・ベルトッツィライゲーションには、膜を１×ＰＢＳ中０．５ｍｇ／ｍｌの濃度に再懸濁させ、０．１％ＳＤＳおよび１ｍＭ ＥＤＴＡを用いて３７℃で１５分間、可溶化した。ＥＺ－Ｌｉｎｋ（商標）Ｐｈｏｓｐｈｉｎｅ－ＰＥＧ３－Ｂｉｏｔｉｎ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を最終濃度２００μＭになるまで加え、反応物を３７℃で６０分間振盪した。ストレプトアビジンアフィニティー濃縮の前に、過剰のＥＺ－Ｌｉｎｋ（商標）Ｐｈｏｓｐｈｉｎｅ－ＰＥＧ３－Ｂｉｏｔｉｎを、ＰＤ ＭｉｎｉＴｒａｐ Ｇ２５スピンカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、ピッツバーグ、ペンシルベニア州、米国）を用いて除去した。
粗シナプス膜を、暗所で４℃にて６０分間、６００ｎＭ ４－（４－（（３－アジド－５－（アジドメチル）ベンジル）オキシ）フェニル）－４－ヒドロキシブタン酸（ＳＢＶ３）と０．１２５ｍｇ／ｍｌの濃度でインキュベートした。競合実験には、０．１ｎＭ～１０μＭの化合物Ｃを加えた。次いで、膜を非組織培養物で処理したポリスチレンプレート上に移し、高強度（３０２ｎｍ、８Ｗ、Ｍ－２０Ｖ）に設定したＵＶＰ Ｂｅｎｃｈｔｏｐトランスイルミネーターを用いて、室温で４分間照射した。次いで、過剰のＳＢＶ３を１×ＰＢＳおよび遠心分離で洗い流した。シュタウディンガー・ベルトッツィライゲーションには、膜を１×ＰＢＳ中０．５ｍｇ／ｍｌの濃度に再懸濁させ、０．１％ＳＤＳおよび１ｍＭ ＥＤＴＡを用いて３７℃で１５分間、可溶化した。ＥＺ－Ｌｉｎｋ（商標）Ｐｈｏｓｐｈｉｎｅ－ＰＥＧ３－Ｂｉｏｔｉｎ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を最終濃度２００μＭになるまで加え、反応物を３７℃で６０分間振盪した。ストレプトアビジンアフィニティー濃縮の前に、過剰のＥＺ－Ｌｉｎｋ（商標）Ｐｈｏｓｐｈｉｎｅ－ＰＥＧ３－Ｂｉｏｔｉｎを、ＰＤ ＭｉｎｉＴｒａｐ Ｇ２５スピンカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、ピッツバーグ、ペンシルベニア州、米国）を用いて除去した。
【0055】
ビオチン化タンパク質を、Ｐｉｅｒｃｅ（商標）Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ａｇａｒｏｓｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて濃縮した。可溶化した膜を最終濃度０．０１％ＳＤＳに希釈し、室温で回転させながら３０分間、レジンとインキュベートした。濃縮後、厳密な洗浄方法（１０ＣＶ １×ＰＢＳ、０．０１％Ｔｗｅｅｎで１分間×３回、および１０ＣＶ １×ＰＢＳ、０．０１％Ｔｗｅｅｎで１０分間×３回）を実施した。ビオチン化タンパク質を、１００μＭ ＤＴＴを添加した１×ＮｕＰＡＧＥ（商標）ＬＤＳ試料緩衝液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）中、１００℃で１０分間、激しく振盪しながら煮沸することによって溶出させた。溶出液をＮｕＰＡＧＥ（商標）４～１２％ビス‐トリスゲル（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）上に負荷し、１７５Ｖで５０分間泳動した。ゲルを、製造業者の指示通りにＧｅｌＣｏｄｅ（商標）Ｂｌｕｅ Ｓｔａｉｎ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて染色した。７０ｋＤａマーカーと２５ｋＤａマーカー（ＰａｇｅＲｕｌｅｒ（商標）Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌａｄｄｅｒ、１０～１８０ｋＤａ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）の間のゲル部分を切り出し、１×１ｍｍの立方体に角切りにした。ゲル内消化を、３７℃で一晩７０ｎｇ／バンドのエンドプロテイナーゼＬｙｓ－Ｃ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）および３７℃で８時間１７５ｎｇ／バンドのトリプシン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）を用いて実施した。ペプチド抽出物を、社内で充填したＣ１８ ＳＴＡＧＥ Ｔｉｐ上に負荷し、２×２０μｌの水中４０％アセトニトリル、０．５％酢酸で９６ウェルマイクロタイタープレートに溶出させ、次いで、真空遠心分離で有機溶媒を除去し、ペプチドを水中２％のアセトニトリル、０．５％の酢酸、０．１％のＴＦＡで再構成した。
【0056】
質量分析
全ての試料を、ナノエレクトロスプレー源を備えたＱ－Ｅｘａｃｔｉｖｅ ＨＦ機器（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）と連結したＥａｓｙ－ｎＬＣ１０００で解析した。ペプチドを、社内で１．９μｍ Ｃ１８ビーズ（Ｄｒ．Ｍａｉｓｃｈ社、ドイツ）を充填した１５ｃｍの分析カラム（内径７５μｍ）で分離した。カラム温度を、組込み型のカラムオーブン（ＰＲＳＯ－Ｖ１、Ｓｏｎａｔｉｏｎ社、ビーベラハ、ドイツ）を用いて４０℃に維持した。ペプチドを、流速２５０ｎｌ／分で３５分間、０．５％酢酸中のアセトニトリルを直線勾配的に増加させることによって分離した。Ｑ－Ｅｘａｃｔｉｖｅ ＨＦ質量分析計をデータ依存性取得モードで稼働させた。スプレー電圧を２kＶに、ＳレンズＲＦレベルを５０に設定し、キャピラリー温度を２７５℃で加熱した。全ての実験を、データ依存性取得モードで実施して、上位１０個の多価前駆体をそれらの強度に従って自動的に単離およびフラグメント化した。前のターゲットイオンを４０秒間、動的に排除し、全ての実験を、正極性モードを用いて取得した。フルスキャン分解能をｍ／ｚ ２００で６０．０００に設定し、質量範囲をｍ／ｚ ３５０～１４００に設定した。フルスキャンイオンターゲット値は、１００ミリ秒の最大充填時間を可能にする３Ｅ６であった。高エネルギー衝突解離（ＨＣＤ）フラグメントスキャンを、単離幅１．３ｍ／ｚおよび正規化衝突エネルギー２８を用い、同時取得に最適な設定で取得した。ＨＣＤフラグメントスキャンのターゲット値を１ｅ５に設定し、最大充填時間を４５ミリ秒とし、分解能６０．０００で解析した。
全ての試料を、ナノエレクトロスプレー源を備えたＱ－Ｅｘａｃｔｉｖｅ ＨＦ機器（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）と連結したＥａｓｙ－ｎＬＣ１０００で解析した。ペプチドを、社内で１．９μｍ Ｃ１８ビーズ（Ｄｒ．Ｍａｉｓｃｈ社、ドイツ）を充填した１５ｃｍの分析カラム（内径７５μｍ）で分離した。カラム温度を、組込み型のカラムオーブン（ＰＲＳＯ－Ｖ１、Ｓｏｎａｔｉｏｎ社、ビーベラハ、ドイツ）を用いて４０℃に維持した。ペプチドを、流速２５０ｎｌ／分で３５分間、０．５％酢酸中のアセトニトリルを直線勾配的に増加させることによって分離した。Ｑ－Ｅｘａｃｔｉｖｅ ＨＦ質量分析計をデータ依存性取得モードで稼働させた。スプレー電圧を２kＶに、ＳレンズＲＦレベルを５０に設定し、キャピラリー温度を２７５℃で加熱した。全ての実験を、データ依存性取得モードで実施して、上位１０個の多価前駆体をそれらの強度に従って自動的に単離およびフラグメント化した。前のターゲットイオンを４０秒間、動的に排除し、全ての実験を、正極性モードを用いて取得した。フルスキャン分解能をｍ／ｚ ２００で６０．０００に設定し、質量範囲をｍ／ｚ ３５０～１４００に設定した。フルスキャンイオンターゲット値は、１００ミリ秒の最大充填時間を可能にする３Ｅ６であった。高エネルギー衝突解離（ＨＣＤ）フラグメントスキャンを、単離幅１．３ｍ／ｚおよび正規化衝突エネルギー２８を用い、同時取得に最適な設定で取得した。ＨＣＤフラグメントスキャンのターゲット値を１ｅ５に設定し、最大充填時間を４５ミリ秒とし、分解能６０．０００で解析した。
【0057】
未処理ＬＣ－ＭＳ／ＭＳデータを、ＭａｘＱｕａｎｔソフトウェア（ｖ．１．５．５．１）を用いて処理し、ラットおよびマウスのＵｎｉＰｒｏｔデータベース（１３．０３．２０１７にダウンロード）に対して検索した。さらに、初期設定の夾雑タンパク質データベースを含め、これにヒットしたものはいずれも、さらなる解析から除外した。システインのカルバミドメチル化を固定修飾とし；セリン、トレオニン、およびチロシン残基のリン酸化、メチオニンの酸化、グルタミンからのピロ－グルタマート形成ならびにタンパク質Ｎ末端アセチル化を、可変修飾として設定した。
【0058】
さらなるデータ解析を、Ｐｅｒｓｅｕｓ（ｖ．１．５．６．０、マックスプランク生化学研究所、プロテオーム・シグナル伝達部門、ミュンヘン）、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｏｆｆｉｃｅ Ｅｘｅｌ、およびＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（ｖ．７．０）を用いて実施した。ＭａｘＱｕａｎｔを用いたデータベース検索の後、Ｐｅｒｓｅｕｓを用いてｐｒｏｔｅｉｎｇｒｏｕｐｓ．ｔｘｔファイルを処理し、具体的には、部位によって確認されただけのヒットまたはリバースデータベースからのヒットを除外した。次いで、データをＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍにエクスポートし、非線形回帰を、「Ｏｎｅ ｓｉｔｅ－Ｆｉｔ ｌｏｇＩＣ５０」関数を用いて全タンパク質について実施した。Ｔｏｐのベストフィット値およびＲ２値をたがいに対しプロットして、競合的な用量依存挙動を示すタンパク質を特定した。
【0059】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞で発現された組換えＣＡＭＫ２への３Ｈ－Ａ結合
ＨＥＫ２９３Ｔを、ＧｌｕｔａＭａｘ、１０％ウシ胎児血清、および１％ペニシリン－ストレプトマイシンを含むダルベッコ改変イーグル培地を使用する標準的条件を用いて培養し、９５％Ｏ２、５％ＣＯ２の加湿雰囲気下、３７℃でインキュベートした。細胞を、ＰｏｌｙＦｅｃｔ（Ｑｉａｇｅｎ社、ウエスト・サセックス州、イギリス）を製造業者のプロトコル通りに用いて、ラットＣＡＭＫ２Ａ（Ｏｒｉｇｅｎｅ社の構築物ＲＲ２０１１２１）またはラットＣＡＭＫ２Ｂ（Ｏｒｉｇｅｎｅ社の構築物ＲＲ２００５２０）でトランスフェクトした。全細胞ホモジネートを、トランスフェクションの４８時間後、細胞を氷冷１×ＰＢＳで洗浄し剥離によって回収することにより、調製した。細胞を収集し、１０００×ｇで１０分間遠心分離した。細胞ペレットを氷冷１×ＰＢＳに再懸濁させ、最大速度で２０秒間ｂｕｌｌｅｔ ｂｌｅｎｄｅｒ中で２×１ｍｍのジルコニウムビーズを用いてホモジナイズした（ＮｅｘｔＡｄｖａｎｃｅ社、ニューヨーク州、米国）。ホモジネートを遠心分離（１０分、４℃、１４．０００×ｇ）により清澄化した。タンパク質濃度を、Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイを用いて求めた。１５０～２００μｇのタンパク質を、５ｎＭの３Ｈ－Ａおよび被験化合物と総体積１ｍｌで１時間、０～４℃にてインキュベートした。非特異的結合を、１～１０ｍＭのＧＨＢで決定した。タンパク質を次いで、氷冷アセトン（アッセイ体積の４倍）を加え、ボルテックスし、－２０℃で１時間インキュベートすることにより、沈殿させた。タンパク質をＧＦ／Ｃユニフィルター（Ｗｈａｔｍａｎ社）で迅速にろ過し、洗浄した。乾燥させたフィルターにシンチレーション液を加え、Ｔｒｉｃａｒｂ ２１００シンチレーションカウンター（Ｐａｃｋａｒｄ社）で放射能を測定した。
ＨＥＫ２９３Ｔを、ＧｌｕｔａＭａｘ、１０％ウシ胎児血清、および１％ペニシリン－ストレプトマイシンを含むダルベッコ改変イーグル培地を使用する標準的条件を用いて培養し、９５％Ｏ２、５％ＣＯ２の加湿雰囲気下、３７℃でインキュベートした。細胞を、ＰｏｌｙＦｅｃｔ（Ｑｉａｇｅｎ社、ウエスト・サセックス州、イギリス）を製造業者のプロトコル通りに用いて、ラットＣＡＭＫ２Ａ（Ｏｒｉｇｅｎｅ社の構築物ＲＲ２０１１２１）またはラットＣＡＭＫ２Ｂ（Ｏｒｉｇｅｎｅ社の構築物ＲＲ２００５２０）でトランスフェクトした。全細胞ホモジネートを、トランスフェクションの４８時間後、細胞を氷冷１×ＰＢＳで洗浄し剥離によって回収することにより、調製した。細胞を収集し、１０００×ｇで１０分間遠心分離した。細胞ペレットを氷冷１×ＰＢＳに再懸濁させ、最大速度で２０秒間ｂｕｌｌｅｔ ｂｌｅｎｄｅｒ中で２×１ｍｍのジルコニウムビーズを用いてホモジナイズした（ＮｅｘｔＡｄｖａｎｃｅ社、ニューヨーク州、米国）。ホモジネートを遠心分離（１０分、４℃、１４．０００×ｇ）により清澄化した。タンパク質濃度を、Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイを用いて求めた。１５０～２００μｇのタンパク質を、５ｎＭの３Ｈ－Ａおよび被験化合物と総体積１ｍｌで１時間、０～４℃にてインキュベートした。非特異的結合を、１～１０ｍＭのＧＨＢで決定した。タンパク質を次いで、氷冷アセトン（アッセイ体積の４倍）を加え、ボルテックスし、－２０℃で１時間インキュベートすることにより、沈殿させた。タンパク質をＧＦ／Ｃユニフィルター（Ｗｈａｔｍａｎ社）で迅速にろ過し、洗浄した。乾燥させたフィルターにシンチレーション液を加え、Ｔｒｉｃａｒｂ ２１００シンチレーションカウンター（Ｐａｃｋａｒｄ社）で放射能を測定した。
【0060】
ｔｓＡ２０１細胞中のＧＨＢ類似体のＭＣＴを介する取込み
取込みを、ｔｓＡ２０１細胞中のＭＣＴの内因性の発現を利用する細胞浸透性ｐＨ感受性色素２’，７’－ビス（２－カルボキシエチル）－５（６）－カルボキシフルオレセインアセトキシメチルエステル（ＢＣＥＣＦ－ＡＭ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社）を用いて測定した。アッセイ前日に、細胞を、底が透明でポリ－Ｄ－リシンでコートした黒色の９６ウェルプレート（ＶＷＲ社、ラドナー、ペンシルベニア州、米国）に播いた（５０，０００個／ウェル）。アッセイ当日に、培地を除去し、細胞を、緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１ｍＭ ＣａＣｌ２、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、および１．８ｍＭプロベネシドを添加したＨＢＳＳ、ｐＨ７．４）中のＢＣＥＣＦ ＡＭを５０μｌ／ウェル（１．６μＭ）添加することにより負荷し、遮光した状態で４５分間、３７℃でインキュベートした。次いで、細胞を緩衝液１００μｌで２回洗浄し、細胞プレートをＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ ３リーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社）で３７℃にてアッセイした。リガンド添加後に、放出される蛍光を、４８５／４４４ｎｍで励起後５３８ｎｍで２分間記録した。４８５／４４４ｎｍの蛍光をナイジェリシン検量曲線により細胞内ｐＨに換算した。
取込みを、ｔｓＡ２０１細胞中のＭＣＴの内因性の発現を利用する細胞浸透性ｐＨ感受性色素２’，７’－ビス（２－カルボキシエチル）－５（６）－カルボキシフルオレセインアセトキシメチルエステル（ＢＣＥＣＦ－ＡＭ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社）を用いて測定した。アッセイ前日に、細胞を、底が透明でポリ－Ｄ－リシンでコートした黒色の９６ウェルプレート（ＶＷＲ社、ラドナー、ペンシルベニア州、米国）に播いた（５０，０００個／ウェル）。アッセイ当日に、培地を除去し、細胞を、緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１ｍＭ ＣａＣｌ２、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、および１．８ｍＭプロベネシドを添加したＨＢＳＳ、ｐＨ７．４）中のＢＣＥＣＦ ＡＭを５０μｌ／ウェル（１．６μＭ）添加することにより負荷し、遮光した状態で４５分間、３７℃でインキュベートした。次いで、細胞を緩衝液１００μｌで２回洗浄し、細胞プレートをＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ ３リーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社）で３７℃にてアッセイした。リガンド添加後に、放出される蛍光を、４８５／４４４ｎｍで励起後５３８ｎｍで２分間記録した。４８５／４４４ｎｍの蛍光をナイジェリシン検量曲線により細胞内ｐＨに換算した。
【0061】
切り出したマウス組織でのｐＴｈｒ２８６自己リン酸化
光血栓性局所虚血の標準的プロトコルとともに、マウスを、損傷の３０分後、生理食塩水または１７５ｍｇ／ｋｇのＡ（ｉ．ｐ．）で治療した。損傷の３時間後に、マウスを屠殺し、脳を切り出し、１％ホスファターゼおよびプロテアーゼ阻害剤（ホスファターゼ阻害剤カクテル３ ＃Ｐ００４４（Ｓｉｇｍａ社）、ホスファターゼ阻害剤カクテル２ ＃Ｐ５７２６（Ｓｉｇｍａ社）、および完全ＥＤＴＡプロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ社））を添加した氷冷ＰＢＳに直ちに５分間浸漬した。梗塞中心部領域からの皮質組織（すなわち、直径２ｍｍの一次運動皮質を含むブレグマの右１．５ｍｍ）を切り出し、ドライアイス上で急速凍結した。組織ホモジナイゼーションを、ホスファターゼおよびプロテアーゼ阻害剤を添加した１×ＲＩＰＡ緩衝液、ならびにＢｕｌｌｅｔ Ｂｌｅｎｄｅｒを用いて、実施した。自己リン酸化を、総ＣＡＭＫ２Ａレベル（抗ＣＡＭＫ２Ａ、＃ＮＢ１００－１９８３、Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ社を用いて定量化した）とリン酸化ＣＡＭＫ２Ａのレベル（ｐＴｈｒ２８６：＃１２７１６Ｓ、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社；ヤギ抗ウサギＨＲＰ：＃ＰＩ－１０００ Ｘ０１２６、Ｖｅｃｔｏｒ社）を比較する、ウエスタンブロット解析により評価した。ｐＴｈｒ２８６ ＣＡＭＫ２ＡおよびＣａＭＫ２Ａのレベルを、参照タンパク質（抗ＧＡＰＤＨ、＃ＮＢ３００－２２１、Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ社）のシグナルに対して正規化した。次いで、正規化したｐＴｈｒ２８６ ＣＡＭＫ２Ａのシグナルと総ＣＡＭＫ２Ａ発現量の比を用いて、自己リン酸化の変化を検出した。バンドのデジタル画像を、冷却ＣＣＤカメラ（ＦｌｕｏｒＣｈｅｍ ＨＤ２システム、ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ社）で取得し、デンシオメトリー（ｄｅｎｓｉｏｍｅｔｒｉｃ）解析を、ＩｍａｇｅＳｔｕｄｉｏＬｉｔｅ（ＬＩ－ＣＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）で実施した。
光血栓性局所虚血の標準的プロトコルとともに、マウスを、損傷の３０分後、生理食塩水または１７５ｍｇ／ｋｇのＡ（ｉ．ｐ．）で治療した。損傷の３時間後に、マウスを屠殺し、脳を切り出し、１％ホスファターゼおよびプロテアーゼ阻害剤（ホスファターゼ阻害剤カクテル３ ＃Ｐ００４４（Ｓｉｇｍａ社）、ホスファターゼ阻害剤カクテル２ ＃Ｐ５７２６（Ｓｉｇｍａ社）、および完全ＥＤＴＡプロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ社））を添加した氷冷ＰＢＳに直ちに５分間浸漬した。梗塞中心部領域からの皮質組織（すなわち、直径２ｍｍの一次運動皮質を含むブレグマの右１．５ｍｍ）を切り出し、ドライアイス上で急速凍結した。組織ホモジナイゼーションを、ホスファターゼおよびプロテアーゼ阻害剤を添加した１×ＲＩＰＡ緩衝液、ならびにＢｕｌｌｅｔ Ｂｌｅｎｄｅｒを用いて、実施した。自己リン酸化を、総ＣＡＭＫ２Ａレベル（抗ＣＡＭＫ２Ａ、＃ＮＢ１００－１９８３、Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ社を用いて定量化した）とリン酸化ＣＡＭＫ２Ａのレベル（ｐＴｈｒ２８６：＃１２７１６Ｓ、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社；ヤギ抗ウサギＨＲＰ：＃ＰＩ－１０００ Ｘ０１２６、Ｖｅｃｔｏｒ社）を比較する、ウエスタンブロット解析により評価した。ｐＴｈｒ２８６ ＣＡＭＫ２ＡおよびＣａＭＫ２Ａのレベルを、参照タンパク質（抗ＧＡＰＤＨ、＃ＮＢ３００－２２１、Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ社）のシグナルに対して正規化した。次いで、正規化したｐＴｈｒ２８６ ＣＡＭＫ２Ａのシグナルと総ＣＡＭＫ２Ａ発現量の比を用いて、自己リン酸化の変化を検出した。バンドのデジタル画像を、冷却ＣＣＤカメラ（ＦｌｕｏｒＣｈｅｍ ＨＤ２システム、ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ社）で取得し、デンシオメトリー（ｄｅｎｓｉｏｍｅｔｒｉｃ）解析を、ＩｍａｇｅＳｔｕｄｉｏＬｉｔｅ（ＬＩ－ＣＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）で実施した。
【0062】
化学合成
特に明示されない限り、下の実施例で使用される全ての試薬は商業的供給源から入手される。
特に明示されない限り、下の実施例で使用される全ての試薬は商業的供給源から入手される。
【0063】
全般的な化学的方法
一般式ＩＩＩａの化合物は、下に記載するように、実施例１～３の手順に従い、適切な置換６，７，８，９－テトラヒドロ－５Ｈ－ベンゾ［７］アヌレン－５－オンから調製され得る。
一般式ＩＩＩａの化合物は、下に記載するように、実施例１～３の手順に従い、適切な置換６，７，８，９－テトラヒドロ－５Ｈ－ベンゾ［７］アヌレン－５－オンから調製され得る。
【化13】
【0064】
一般式ＩＶａの化合物は、下に記載するように、無機塩基の存在下で銅に触媒される、エチル２－（２－ヨード－５－メトキシフェニル）アセタートおよび適切な置換アニリン、フェノール、またはチオフェノール（Ｘ＝Ｎ、Ｏ、またはＳ）から調製され得る。Ｘ＝ＣＨ２は、適切な置換ハロゲン化ベンジルを用い、パラジウムに触媒される交差カップリング反応により、エチル２－（２－ヨード－５－メトキシフェニル）アセタートから調製され得る。保護基はＢＢｒ３によって切断され得る。
【化14】
【0065】
実施例１
（Ｅ）－２－（２－ブロモ－５－ヒドロキシ－５，７，８，９－テトラヒドロ－６Ｈ－ベンゾ［７］アヌレン－６－イリデン）酢酸（１）の合成
段階１：Ｈ２Ｏ（４．６ｍｌ）およびエタノール（１０ｍｌ）中のＮａＯＨ（３６８ｍｇ、９．１ｍｍｏｌ）の溶液に、水（１０ｍｌ）中の２－ブロモ－６，７，８，９－テトラヒドロ－５Ｈ－ベンゾ［７］アヌレン－５－オン（Ｍｕｒｉｎｅｄｄｕ ｅｔ ａｌ．，２００５）（４００ｍｇ、１．６ｍｍｏｌ）とグリオキシル酸一水和物（４９５ｍｇ、６．６ｍｍｏｌ）の混合物を室温で加えた。混合物を溶解するまで室温で攪拌し、次いで、４時間加熱還流した。冷却後、真空下でＥｔＯＨを除去し、残った水溶液をＥｔ２Ｏ（２×１５ｍｌ）で洗浄し、ＨＣｌでｐＨを１に調整し、ＥｔＯＡｃ（２×２０ｍｌ）で抽出した。合わせた有機相をＭｇＳＯ４で乾燥させ、ろ過し、蒸発させた。残渣をカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ ９．５：０．５＋１％のＡｃＯＨ）により精製して、３６９ｍｇ（７５％）の（Ｅ）－２－（２－ブロモ－５－オキソ－５，７，８，９－テトラヒドロ－６Ｈ－ベンゾ［７］アヌレン－６－イリデン）酢酸を褐色の固体として得た。
（Ｅ）－２－（２－ブロモ－５－ヒドロキシ－５，７，８，９－テトラヒドロ－６Ｈ－ベンゾ［７］アヌレン－６－イリデン）酢酸（１）の合成
段階１：Ｈ２Ｏ（４．６ｍｌ）およびエタノール（１０ｍｌ）中のＮａＯＨ（３６８ｍｇ、９．１ｍｍｏｌ）の溶液に、水（１０ｍｌ）中の２－ブロモ－６，７，８，９－テトラヒドロ－５Ｈ－ベンゾ［７］アヌレン－５－オン（Ｍｕｒｉｎｅｄｄｕ ｅｔ ａｌ．，２００５）（４００ｍｇ、１．６ｍｍｏｌ）とグリオキシル酸一水和物（４９５ｍｇ、６．６ｍｍｏｌ）の混合物を室温で加えた。混合物を溶解するまで室温で攪拌し、次いで、４時間加熱還流した。冷却後、真空下でＥｔＯＨを除去し、残った水溶液をＥｔ２Ｏ（２×１５ｍｌ）で洗浄し、ＨＣｌでｐＨを１に調整し、ＥｔＯＡｃ（２×２０ｍｌ）で抽出した。合わせた有機相をＭｇＳＯ４で乾燥させ、ろ過し、蒸発させた。残渣をカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ ９．５：０．５＋１％のＡｃＯＨ）により精製して、３６９ｍｇ（７５％）の（Ｅ）－２－（２－ブロモ－５－オキソ－５，７，８，９－テトラヒドロ－６Ｈ－ベンゾ［７］アヌレン－６－イリデン）酢酸を褐色の固体として得た。
【0066】
段階２：ＣｅＣｌ３・７Ｈ２Ｏ（２３１ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ）および（Ｅ）－２－（２－ブロモ－５－オキソ－５，７，８，９－テトラヒドロ－６Ｈ－ベンゾ［７］アヌレン－６－イリデン）酢酸（１８３ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ）を窒素雰囲気下でＭｅＯＨ（３０ｍｌ）に溶かした。この溶液にＮａＢＨ４（３５１ｍｇ、９．３ｍｍｏｌ）を０℃で徐々に加えた。反応物を室温で４時間攪拌し、次いで、真空下で溶媒を蒸発させた。残渣にＨ２Ｏ（５０ｍｌ）を加え、ＨＣｌでｐＨを１に調整した。水相をＤＣＭ（３×３０ｍｌ）で抽出し、合わせた有機相をＭｇＳＯ４で乾燥させ、ろ過し、真空下で蒸発させた。カラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ＋１％のＡｃＯＨ）により精製して、（Ｅ）－２－（２－ブロモ－５－ヒドロキシ－５，７，８，９－テトラヒドロ－６Ｈ－ベンゾ［７］アヌレン－６－イリデン）酢酸（１２０ｍｇ、６５％）を白色の固体として得た。１Ｈ ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，Ｍｅｔｈａｎｏｌ－ｄ４），δ：７．３９－７．３６（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），７．３５－７．３２（ｄｄ，Ｊ＝８．２，２．１Ｈｚ，１Ｈ），７．２６－７．２５（ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，１Ｈ），６．００（ｓ，１Ｈ），５．２５（ｓ，１Ｈ），３．５０－３．４５（ｄｄｄ，Ｊ＝１１．９，６．９，４．３Ｈｚ，１Ｈ），３．０７－３．００（ｍ，Ｊ＝１４．２，９．１，２．６Ｈｚ，１Ｈ），２．８１－２．７１（ｍ，Ｊ＝２７．５，１３．１，９．２，３．５Ｈｚ，２Ｈ），１．８６－１．７９（ｍ，Ｊ＝１３．７，９．３，７．０，４．５，２．５Ｈｚ，１Ｈ），１．７４－１．６６（ｍ，Ｊ＝１３．６，９．３，４．４，２．７Ｈｚ，１Ｈ）．１３［Ｃ］ＮＭＲ（１５１ＭＨｚ，Ｍｅｔｈａｎｏｌ－ｄ４），δ：１６８．８，１６２．４，１４２．３，１４０．３，１３１．８，１２９．０，１２７．４，１２０．５，１１４．２，７６．３，２９．５，２９．３，２７．５。
【0067】
実施例２
（Ｅ）－２－（５－ヒドロキシ－２－フェニル－５，７，８，９－テトラヒドロ－６Ｈ－ベンゾ［７］アヌレン－６－イリデン）酢酸（２）の合成
段階１：ＤＭＦ（１６ｍｌ）およびＨ２Ｏ（８ｍｌ）中の２－ブロモ－６，７，８，９－テトラヒドロ－５Ｈ－ベンゾ［７］アヌレン－５－オン（Ｍｕｒｉｎｅｄｄｕ ｅｔ ａｌ．，２００５）（１００ｍｇ、０．４ｍｍｏｌ）の溶液にフェニルボロン酸（１０１ｍｇ、０．８ｍｍｏｌ）およびＫ２ＣＯ３（１７３ｍｇ、１．２ｍｍｏｌ）を加えた。溶液を窒素雰囲気下で１０分間攪拌し、次いで、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（９６ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ）を加え、混合物を窒素雰囲気下でさらに１０分間攪拌した。反応物を２４時間加熱還流した。真空下でＤＭＦを蒸発させた後、Ｈ２Ｏ（１６０ｍｌ）を加え、水相をＥｔ２Ｏ（８０ｍｌ）で抽出した。有機相をＨ２Ｏ（１６０ｍｌ）およびブライン（２×８０ｍｌ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、ろ過し、真空下で蒸発させた。カラムクロマトグラフィー（ヘプタン／ＥｔＯＡｃ ９：１）により精製して、２－フェニル－６，７，８，９－テトラヒドロ－５Ｈ－ベンゾ［７］アヌレン－５－オン（６５ｍｇ、６８．８％）を黄色の油として得た。
（Ｅ）－２－（５－ヒドロキシ－２－フェニル－５，７，８，９－テトラヒドロ－６Ｈ－ベンゾ［７］アヌレン－６－イリデン）酢酸（２）の合成
段階１：ＤＭＦ（１６ｍｌ）およびＨ２Ｏ（８ｍｌ）中の２－ブロモ－６，７，８，９－テトラヒドロ－５Ｈ－ベンゾ［７］アヌレン－５－オン（Ｍｕｒｉｎｅｄｄｕ ｅｔ ａｌ．，２００５）（１００ｍｇ、０．４ｍｍｏｌ）の溶液にフェニルボロン酸（１０１ｍｇ、０．８ｍｍｏｌ）およびＫ２ＣＯ３（１７３ｍｇ、１．２ｍｍｏｌ）を加えた。溶液を窒素雰囲気下で１０分間攪拌し、次いで、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（９６ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ）を加え、混合物を窒素雰囲気下でさらに１０分間攪拌した。反応物を２４時間加熱還流した。真空下でＤＭＦを蒸発させた後、Ｈ２Ｏ（１６０ｍｌ）を加え、水相をＥｔ２Ｏ（８０ｍｌ）で抽出した。有機相をＨ２Ｏ（１６０ｍｌ）およびブライン（２×８０ｍｌ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、ろ過し、真空下で蒸発させた。カラムクロマトグラフィー（ヘプタン／ＥｔＯＡｃ ９：１）により精製して、２－フェニル－６，７，８，９－テトラヒドロ－５Ｈ－ベンゾ［７］アヌレン－５－オン（６５ｍｇ、６８．８％）を黄色の油として得た。
【0068】
段階２：Ｈ２Ｏ（０．７ｍｌ）およびエタノール（１０ｍｌ）中のＮａＯＨ（５９ｍｇ、１．４ｍｍｏｌ）、Ｈ２Ｏ（５ｍｌ）中の２－フェニル－６，７，８，９－テトラヒドロ－５Ｈ－ベンゾ［７］アヌレン－５－オン（６５ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）およびグリオキシル酸一水和物（７９ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）を用いて、実施例１（段階１）に記載した通りに実施した。カラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ ９．５：０．５＋１％のＡｃＯＨ）により精製して、（Ｅ）－２－（５－オキソ－２－フェニル－５，７，８，９－テトラヒドロ－６Ｈ－ベンゾ［７］アヌレン－６－イリデン）酢酸（４７ｍｇ、５９％）を黄色の固体として得た。
【0069】
段階３：ＣｅＣｌ３・７Ｈ２Ｏ（１４５ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）、（Ｅ）－２－（５－オキソ－２－フェニル－５，７，８，９－テトラヒドロ－６Ｈ－ベンゾ［７］アヌレン－６－イリデン）酢酸（１１６ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）、ＭｅＯＨ（２０ｍｌ）およびＮａＢＨ４（１４５ｍｇ、５．９ｍｍｏｌ）を用いて、実施例１（段階２）に記載した通りに実施した。カラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ＋１％のＡｃＯＨ）により精製して、（Ｅ）－２－（５－ヒドロキシ－２－フェニル－５，７，８，９－テトラヒドロ－６Ｈベンゾ［７］アヌレン－６－イリデン）酢酸（９２ｍｇ、８０％）を白色の固体として得た。１Ｈ ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，Ｍｅｔｈａｎｏｌ－ｄ４），δ：７．６１－７．５６（ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ），７．５３－７．５０（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，１Ｈ），７．４７－７．４２（ｄｄ，Ｊ＝７．９，２．０Ｈｚ，２Ｈ），７．４２－７．３７（ｔ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，１Ｈ），７．３５－７．３３（ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，１Ｈ），７．３２－７．２７（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，１Ｈ），６．０３（ｓ，１Ｈ），５．３３（ｓ，１Ｈ），３．５５－３．３９（ｍ，１Ｈ），３．２４－３．０４（ｍ，１Ｈ），２．９６－２．７３（ｍ，２Ｈ），１．９１－１．６７（ｍ，２Ｈ）．１３［Ｃ］ＮＭＲ（１５１ＭＨｚ，Ｍｅｔｈａｎｏｌ－ｄ４），δ：１７０．４，１６４．１，１４２．１，１４１．８，１４１．７，１４１．２，１２９．７，１２９．３，１２８．２，１２７．９，１２７．８，１２６．１，１１５．４，７８．５，３５．４，３０．８，２９．３。
【0070】
実施例３
ナトリウム（Ｅ）－２－（５－ヒドロキシ－２－フェニル－５，７，８，９－テトラヒドロ－６Ｈ－ベンゾ［７］アヌレン－６－イリデン）アセタート（２のナトリウム塩）の合成
２（８５．４ｍｇ、０．２９０ｍｍｏｌ）をエタノール（２ｍｌ）に溶かすことによって２のナトリウム塩を調製し、ＮａＯＨ（ａｑ）（２８２μｌ、０．２９６ｍｍｏｌ、０．５Ｍ Ｔｒｉｔｉｓｏｌ）を加えた。真空下で溶媒を除去して、生成物（９０ｍｇ、９９％）を白色の固体として得た。
ナトリウム（Ｅ）－２－（５－ヒドロキシ－２－フェニル－５，７，８，９－テトラヒドロ－６Ｈ－ベンゾ［７］アヌレン－６－イリデン）アセタート（２のナトリウム塩）の合成
２（８５．４ｍｇ、０．２９０ｍｍｏｌ）をエタノール（２ｍｌ）に溶かすことによって２のナトリウム塩を調製し、ＮａＯＨ（ａｑ）（２８２μｌ、０．２９６ｍｍｏｌ、０．５Ｍ Ｔｒｉｔｉｓｏｌ）を加えた。真空下で溶媒を除去して、生成物（９０ｍｇ、９９％）を白色の固体として得た。
【0071】
実施例４
（Ｅ）－２－（５－ヒドロキシ－２－（（Ｅ）－スチリル）－５，７，８，９－テトラヒドロ－６Ｈ－ベンゾ［７］アヌレン－６－イリデン）酢酸（３）の合成
段階１：ＣＨ３ＣＮ（１５ｍｌ）中の２－ブロモ－６，７，８，９－テトラヒドロ－５Ｈ－ベンゾ［７］アヌレン－５－オン（Ｍｕｒｉｎｅｄｄｕ ｅｔ ａｌ．，２００５）の溶液にスチレン（８．４ｍｌ、６．０ｍｍｏｌ、２ｅｑ）およびトリエチルアミン（５．５ｍｌ、３９．７ｍｍｏｌ、１９ｅｑ）を加えた。溶液を窒素雰囲気下で５分間攪拌し、次いで、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（７２５ｍｇ、０．４ｍｍｏｌ）を加え、混合物を窒素雰囲気下でさらに５分間攪拌した。反応物を２２時間加熱還流し、飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液（１０ｍｌ）を加え、次いで、ＥｔＯＡｃ（２×２０ｍｌ）で抽出した。合わせた有機相をＨ２Ｏおよびブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、真空下で蒸発させた。カラムクロマトグラフィー（ヘプタン／ＥｔＯＡｃ ９．８：０．２）により精製して、（Ｅ）－２－スチリル－６，７，８，９－テトラヒドロ－５Ｈ－ベンゾ［７］アヌレン－５－オン（２２９ｍｇ、５２％）を帯黄色の粘着性油として得た。
（Ｅ）－２－（５－ヒドロキシ－２－（（Ｅ）－スチリル）－５，７，８，９－テトラヒドロ－６Ｈ－ベンゾ［７］アヌレン－６－イリデン）酢酸（３）の合成
段階１：ＣＨ３ＣＮ（１５ｍｌ）中の２－ブロモ－６，７，８，９－テトラヒドロ－５Ｈ－ベンゾ［７］アヌレン－５－オン（Ｍｕｒｉｎｅｄｄｕ ｅｔ ａｌ．，２００５）の溶液にスチレン（８．４ｍｌ、６．０ｍｍｏｌ、２ｅｑ）およびトリエチルアミン（５．５ｍｌ、３９．７ｍｍｏｌ、１９ｅｑ）を加えた。溶液を窒素雰囲気下で５分間攪拌し、次いで、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（７２５ｍｇ、０．４ｍｍｏｌ）を加え、混合物を窒素雰囲気下でさらに５分間攪拌した。反応物を２２時間加熱還流し、飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液（１０ｍｌ）を加え、次いで、ＥｔＯＡｃ（２×２０ｍｌ）で抽出した。合わせた有機相をＨ２Ｏおよびブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、真空下で蒸発させた。カラムクロマトグラフィー（ヘプタン／ＥｔＯＡｃ ９．８：０．２）により精製して、（Ｅ）－２－スチリル－６，７，８，９－テトラヒドロ－５Ｈ－ベンゾ［７］アヌレン－５－オン（２２９ｍｇ、５２％）を帯黄色の粘着性油として得た。
【0072】
段階２：Ｈ２Ｏ（１．９ｍｌ）およびエタノール（７ｍｌ）中のＮａＯＨ（１５２ｍｇ、１０ｍｍｏｌ）、Ｈ２Ｏ（５ｍｌ）中の（Ｅ）－２－スチリル－６，７，８，９－テトラヒドロ－５Ｈ－ベンゾ［７］アヌレン－５－オン（１００ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）およびグリオキシル酸一水和物（１４０ｍｇ、５ｍｍｏｌ）を用いて、実施例１（段階１）に記載した通りに実施した。カラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ ９．５：０．５＋１％のＡｃＯＨ）により精製して、（Ｅ）－２－（５－オキソ－２－（（Ｅ）－スチリル）－５，７，８，９－テトラヒドロ－６Ｈ－ベンゾ［７］アヌレン－６－イリデン）酢酸（１２１ｍｇ、５０％）を黄色の固体として得た。
【0073】
段階３：ＣｅＣｌ３・７Ｈ２Ｏ（７０ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）、（Ｅ）－２－（５－オキソ－２－（（Ｅ）－スチリル）－５，７，８，９－テトラヒドロ－６Ｈ－ベンゾ［７］アヌレン－６－イリデン）酢酸（６３ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）、ＭｅＯＨ（２０ｍｌ）、およびＮａＢＨ４（７４ｍｇ、１．９ｍｍｏｌ）を用いて、実施例１（段階２）に記載した通りに実施した。カラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ＋１％のＡｃＯＨ）により精製して、（Ｅ）－２－（５－ヒドロキシ－２－（（Ｅ）－スチリル）－５，７，８，９－テトラヒドロ－６Ｈ－ベンゾ［７］アヌレン－６－イリデン）酢酸（３０ｍｇ、４９％）を白色の固体として得た。１Ｈ ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，Ｍｅｔｈａｎｏｌ－ｄ４），δ：７．５５－７．５０（ｄ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，２Ｈ），７．４５－７．３７（ｍ，２Ｈ），７．３６－７．３０（ｍ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，２Ｈ），７．３０－７．２７（ｄ，Ｊ＝５．２Ｈｚ，１Ｈ），７．２５－７．１９（ｍ，Ｊ＝７．３，６．８Ｈｚ，２Ｈ），６．０１（ｓ，１Ｈ），５．２９（ｓ，１Ｈ），３．５０－３．４０（ｍ，１Ｈ），３．１８－３．０１（ｍ，Ｊ＝１４．１，７．７，３．４Ｈｚ，１Ｈ），２．９７－２．７１（ｍ，２Ｈ），１．９１－１．６８（ｍ，２Ｈ）．１３［Ｃ］ＮＭＲ（１５１ＭＨｚ，Ｍｅｔｈａｎｏｌ－ｄ４），δ：１７０．６，１６４．３，１４１．６，１４１．５，１３８．８，１３８．１，１２９．６，１２９．５，１２９．３，１２８．８，１２７．７，１２７．４，１２５．７，１１５．４，７８．６，３５．３，３０．７，２９．３。
【0074】
実施例５
（Ｅ）－２－（２－クロロ－５－ヒドロキシ－５，７，８，９－テトラヒドロ－６Ｈ－ベンゾ［７］アヌレン－６－イリデン）酢酸（４）の合成
段階１：Ｈ２Ｏ（１８ｍＬ）およびＥｔＯＨ（４０ｍＬ）中のＮａＯＨ（１．４８ｇ、３７．１ｍｍｏｌ）、Ｈ２Ｏ（４０ｍＬ）中の２－クロロ－６，７，８，９－テトラヒドロ－５Ｈ－ベンゾ［７］アヌレン－５－オン（Ｍｕｒｉｎｅｄｄｕ ｅｔ ａｌ．，２００５）（１．２０ｇ、６．１８ｍｍｏｌ）およびグリオキシル酸一水和物（２．２８ｇ、２４．７ｍｍｏｌ）を用いて、実施例１（段階１）に記載した通りに実施した。カラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ ９．５：０．５＋１％のＡｃＯＨ）により精製して、（Ｅ）－２－（５－オキソ－２－クロロ－５，７，８，９－テトラヒドロ－６Ｈ－ベンゾ［７］アヌレン－６－イリデン）酢酸（７６４ｍｇ、４９％）を白色の固体として得た。
（Ｅ）－２－（２－クロロ－５－ヒドロキシ－５，７，８，９－テトラヒドロ－６Ｈ－ベンゾ［７］アヌレン－６－イリデン）酢酸（４）の合成
【化15】
【0075】
段階３：ＣｅＣｌ３・７Ｈ２Ｏ（７３５ｍｇ、３．０ｍｍｏｌ）、（Ｅ）－２－（５－オキソ－２－クロロ－５，７，８，９－テトラヒドロ－６Ｈ－ベンゾ［７］アヌレン－６－イリデン）酢酸（７４０ｍｇ、３．０ｍｍｏｌ）、ＭｅＯＨ（１５０ｍＬ）、およびＮａＢＨ４（１．１ｇ、３０ｍｍｏｌ）を用いて、実施例１（段階２）に記載した通りに実施した。カラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ＋１％のＡｃＯＨ）により精製して、（Ｅ）－２－（５－ヒドロキシ－２－クロロ－５，７，８，９－テトラヒドロ－６Ｈ－ベンゾ［７］アヌレン－６－イリデン）酢酸（４０２ｍｇ、５２％）を白色の固体として得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｍｅｔｈａｎｏｌ－ｄ４），δ：７．４４－７．４３（ｄ，Ｊ＝８．２５Ｈｚ，１Ｈ），７．２０－１．１８（ｄｄ，Ｊ＝２．２９，８．２５Ｈｚ，２Ｈ），７．１１－７．１０（ｄ，Ｊ＝２．２９Ｈｚ，１Ｈ），６．００（ｓ，１Ｈ），５．２７（ｓ，１Ｈ），３．４９－３．４５（ｍ，１Ｈ），３．０７－３．０２（ｍ，１Ｈ），２．８１－２．７３（ｍ，２Ｈ），１．８６－１．８０（ｍ，１Ｈ），１．７４－１．６８（ｍ，１Ｈ）．１３［Ｃ］ＮＭＲ（１５１ＭＨｚ，Ｍｅｔｈａｎｏｌ－ｄ４），δ：１７０．３，１６４．０，１４３．５，１４１．２，１３３．９，１３０．３，１２８．７，１２７．４，１１５．６，７７．８，３５．０，３０．９，２９．０
【0076】
実施例６
（Ｅ）－２－（２－ヨード－５－ヒドロキシ－５，７，８，９－テトラヒドロ－６Ｈ－ベンゾ［７］アヌレン－６－イリデン）酢酸（５）の合成
段階１：乾燥トルエン（３５ｍＬ）中の２－ブロモ－６，７，８，９－テトラヒドロ－５Ｈ－ベンゾ［７］アヌレン－５－オン（Ｍｕｒｉｎｅｄｄｕ ｅｔ ａｌ．，２００５）（８２６ｍｇ、３．５ｍｍｏｌ）、ビス（トリブチルスズ）（４．０ｇ、６．９ｍｍｏｌ）、およびテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）（４００ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）の混合物をアルゴン雰囲気下で３時間加熱還流した。溶媒を、真空下で乾燥するまで蒸発させた。粗生成物を段階２に用いた。
（Ｅ）－２－（２－ヨード－５－ヒドロキシ－５，７，８，９－テトラヒドロ－６Ｈ－ベンゾ［７］アヌレン－６－イリデン）酢酸（５）の合成
【化16】
【0077】
段階２：ＴＨＦ（５０ｍＬ）中の２－（トリブチルスタンニル）－６，７，８，９－テトラヒドロ－５Ｈ－ベンゾ［７］アヌレン－５－オン（１０６８ｇ、２．４ｍｍｏｌ）の溶液を０℃に冷却し、ＴＨＦ（３５ｍＬ）中のヨウ素（９０５ｇ、３．６ｍｍｏｌ）の溶液を滴加した。０℃で１時間経過した後、飽和Ｎａ２Ｓ２Ｏ３水溶液の添加により反応を停止させた。飽和ＮａＨＣＯ３水溶液で中和し、ＥｔＯＡｃで抽出した。合わせた有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、ろ過し、真空下で蒸発させた。カラムクロマトグラフィー（ヘプタン／ＥｔＯＡｃ ４：１）により精製して、生成物（２７２ｍｇ、２７％）を無色の油として得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３），δ：７．６６（ｄｄ，Ｊ＝８．２，１．７Ｈｚ，１Ｈ），７．６１（ｄ，Ｊ＝１．７Ｈｚ，１Ｈ），７．４３（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），２．９０－２．８４（ｔ，Ｊ＝７．２，５．３Ｈｚ，２Ｈ），２．７５－２．６８（ｍ，２Ｈ），１．９３－１．７５（ｍ，４Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１００．６ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３），δ：２０５．３，１４３．２，１３８．７，１３８．３，１３６．１，１３０．３，９９．９，４０．９，３２．３，２５．２，２０．９。
【0078】
段階３：Ｈ２Ｏ（３ｍＬ）およびＥｔＯＨ（６ｍＬ）中のＮａＯＨ（２１５．０ｍｇ、５．２ｍｍｏｌ）、ならびにＨ２Ｏ（７ｍＬ）中の２－ヨード－６，７，８，９－テトラヒドロ－５Ｈ－ベンゾ［７］アヌレン－５－オン（２７２ｍｇ、０．９５ｍｍｏｌ）およびグリオキシル酸一水和物（３５４ｍｇ、３．８ｍｍｏｌ）を用いて、実施例１（段階１）に記載した通りに実施した。カラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ ９．５：０．５＋１％のＡｃＯＨ）により精製して、（Ｅ）－２－（５－オキソ－２－ヨード－５，７，８，９－テトラヒドロ－６Ｈ－ベンゾ［７］アヌレン－６－イリデン）酢酸（１５１ｍｇ、４６％）を黄色の固体として得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｍｅｔｈａｎｏｌ－ｄ４），δ：７．７７（ｄｄ，Ｊ＝８．１，１．７Ｈｚ，１Ｈ），７．７２（ｄ，Ｊ＝１．７Ｈｚ，１Ｈ），７．４７（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），６．６８（ｓ，１Ｈ），２．８２－２．７６（ｄｔ，Ｊ＝６．８，４．８Ｈｚ，４Ｈ），２．０７－１．９８（ｐ，２Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１００．６ＭＨｚ，Ｍｅｔｈａｎｏｌ－ｄ４），δ：１９８．２，１６９．３，１５３．３，１４３．７，１３９．６，１３７．６，１３７．５，１３１．７，１２６．５，１０２．０，３１．８，２６．２，２４．２。
【0079】
段階４：ＣｅＣｌ３・７Ｈ２Ｏ（１５８ｍｇ、０．４ｍｍｏｌ）、（Ｅ）－２－（５－オキソ－２－ヨード－５，７，８，９－テトラヒドロ－６Ｈ－ベンゾ［７］アヌレン－６－イリデン）酢酸（１４５ｍｇ、０．４ｍｍｏｌ）、ＭｅＯＨ（２０ｍＬ）、およびＮａＢＨ４（１６０ｍｇ、４．２ｍｍｏｌ）を用いて、実施例１（段階２）に記載した通りに実施した。カラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ＋１％のＡｃＯＨ）により精製して、（Ｅ）－２－（２－ヨード－５－ヒドロキシ－５，７，８，９－テトラヒドロ－６Ｈ－ベンゾ［７］アヌレン－６－イリデン）酢酸（１１３ｍｇ、７７％）を白色の固体として得た。１Ｈ ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，Ｍｅｔｈａｎｏｌ－ｄ４）δ：７．５５（ｄｄ，Ｊ＝８．１，１．９Ｈｚ，１Ｈ），７．４６（ｄ，Ｊ＝１．９Ｈｚ，１Ｈ），７．２３（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），５．９９（ｓ，１Ｈ），５．２４（ｓ，１Ｈ），３．５０－３．４５（ｄｄｄ，Ｊ＝１１．８，６．９，４．３Ｈｚ，１Ｈ），３．０４－２．９８（ｄｄｄ，Ｊ＝１４．２，９．１，２．６Ｈｚ，１Ｈ），２．８０－２．７１（ｍ，２Ｈ），１．８６－１．７９（ｍ，Ｊ＝１３．６，６．９，４．５，２．５Ｈｚ，１Ｈ），１．７３－１．６５（ｍ，Ｊ＝１３．５，９．３，４．３，２．７Ｈｚ，１Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１５１ＭＨｚ，Ｍｅｔｈａｎｏｌ－ｄ４），δ：１７０．３，１６３．８，１４３．８，１４２．４，１３９．３，１３６．８，１２９．０，１１５．７，９３．４，７７．８，３４．９，３０．９，２９．０．ＨＰＬＣ（２５４ｎｍ）：１００％。
【0080】
実施例７
（Ｅ）－２－（２－フルオロ－５－ヒドロキシ－５，７，８，９－テトラヒドロ－６Ｈ－ベンゾ［７］アヌレン－６－イリデン）酢酸（６）の合成
段階１：アセトン（３５ｍＬ）中の２－（トリブチルスタンニル）－６，７，８，９－テトラヒドロ－５Ｈ－ベンゾ［７］アヌレン－５－オン（１０１７ｍｇ、２．３ｍｍｏｌ）に、Ａｇ２Ｏ（３１ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）、ＮａＨＣＯ３（３９７ｍｇ、４．５ｍｍｏｌ）、およびＦ－ＴＥＤＡ－ＢＦ４（１２０４ｍｇ、３．４ｍｍｏｌ）を室温で加えた。反応混合物を６時間攪拌還流した。室温に冷却した後、反応混合物を短いセライトパッドでろ過し、真空下で蒸発させた。粗生成物を次の段階に用いた。
（Ｅ）－２－（２－フルオロ－５－ヒドロキシ－５，７，８，９－テトラヒドロ－６Ｈ－ベンゾ［７］アヌレン－６－イリデン）酢酸（６）の合成
【化17】
【0081】
段階２：Ｈ２Ｏ（８ｍＬ）およびＥｔＯＨ（１６ｍＬ）中のＮａＯＨ（２２１ｍｇ、５．５ｍｍｏｌ）、ならびにＨ２Ｏ（１６ｍＬ）中の２－フルオロ－６，７，８，９－テトラヒドロ－５Ｈ－ベンゾ［７］アヌレン－５－オン（１７９ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）およびグリオキシル酸一水和物（３７０ｍｇ、４．０ｍｍｏｌ）を用いて、実施例１（段階１）に記載した通りに実施した。カラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ ９．５：０．５＋１％のＡｃＯＨ）により精製して、（Ｅ）－２－（５－オキソ－２－フルオロ－５，７，８，９－テトラヒドロ－６Ｈ－ベンゾ［７］アヌレン－６－イリデン）酢酸を得た。粗生成物を次の段階に用いた。ＭＳ（ｍ／ｚ）ｆｏｒ Ｃ１３Ｈ１１ＦＯ３（Ｍ－１）－ｃａｌｃｄ．：２３４．１，ｆｏｕｎｄ：（Ｍ）Ｈ－２３３．０。
【0082】
段階３：ＣｅＣｌ３・７Ｈ２Ｏ（２３５．７ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ）、（Ｅ）－２－（５－オキソ－２－フルオロ－５，７，８，９－テトラヒドロ－６Ｈ－ベンゾ［７］アヌレン－６－イリデン）酢酸（１３５ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ）、ＭｅＯＨ（３０ｍＬ）、およびＮａＢＨ４（２１８ｍｇ、５．６ｍｍｏｌ）を用いて、実施例１（段階２）に記載した通りに実施した。粗生成物を分取ＨＰＬＣにより精製して、（Ｅ）－２－（２－フルオロ－５－ヒドロキシ－５，７，８，９－テトラヒドロ－６Ｈ－ベンゾ［７］アヌレン－６－イリデン）酢酸（２３．２ｍｇ、１７％）を白色の固体として得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ），δ：７．４４（ｄｄ，Ｊ＝８．５，５．９Ｈｚ，１Ｈ），６．８９（ｔｄ，Ｊ＝８．５，２．７Ｈｚ，１Ｈ），６．８４（ｄｄ，Ｊ＝９．６，２．７Ｈｚ，１Ｈ），５．９８（ｓ，１Ｈ），５．２６（ｓ，１Ｈ），３．４６－３．３８（ｄｄｄ，Ｊ＝１２．１，６．９，４．７Ｈｚ，１Ｈ），３．１３－３．０４（ｄｄｄ，Ｊ＝１４．２，８．８，３．４Ｈｚ，１Ｈ），２．８５－２．７３（ｍ，２Ｈ），１．８６－１．７０（ｍ，２Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１００．６ＭＨｚ，Ｍｅｔｈａｎｏｌ－ｄ４），δ：１７０．４，１６４．６，１６４．１，１６２．２，１４４．１，１４４．０，１３８．３，１２９．３，１２９．２，１１７．３，１１７．１，１１５．７，１１３．７，１１３．５，７８．１，３５．１，３０．６，２９．１．１９Ｆ ＮＭＲ（３７６．４ＭＨｚ，Ｍｅｔｈａｎｏｌ－ｄ４），δ：－１１８．３（ｓ，１Ｆ）．ＭＳ（ｍ／ｚ）ｆｏｒ Ｃ１３Ｈ１３ＦＯ３（Ｍ－１）－ｃａｌｃｄ．：２３６．２，ｆｏｕｎｄ：２３５．０（Ｍ）Ｈ－．ＨＰＬＣ（２５４ｎｍ）：９５．５％。
【0083】
実施例８
（Ｅ）－２－（２－メチル－５－ヒドロキシ－５，７，８，９－テトラヒドロ－６Ｈ－ベンゾ［７］アヌレン－６－イリデン）酢酸（７）の合成
段階１：Ｈ２Ｏ（８０ｍＬ）およびＥｔＯＨ（４０ｍＬ）中のＮａＯＨ（６．７１ｇ、１６７．７ｍｍｏｌ）、Ｈ２Ｏ（４０ｍＬ）中の２－メチル－６，７，８，９－テトラヒドロ－５Ｈ－ベンゾ［７］アヌレン－５－オン（Ｍｕｒｉｎｅｄｄｕ ｅｔ ａｌ．，２００５）（４．８４ｇ、２７．８ｍｍｏｌ）およびグリオキシル酸一水和物（１０．２８ｇ、１１１．７ｍｍｏｌ）を用いて、実施例１（段階１）に記載した通りに実施した。カラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ ９．５：０．５＋１％のＡｃＯＨ）により精製して、（Ｅ）－２－（２－メチル－５－オキソ－５，７，８，９－テトラヒドロ－６Ｈ－ベンゾ［７］アヌレン－６－イリデン）酢酸（５．４２ｇ、８５％）を黄色の固体として得た。
（Ｅ）－２－（２－メチル－５－ヒドロキシ－５，７，８，９－テトラヒドロ－６Ｈ－ベンゾ［７］アヌレン－６－イリデン）酢酸（７）の合成
【化18】
【0084】
段階２：ＣｅＣｌ３・７Ｈ２Ｏ（６．３５ｇ、１７．０ｍｍｏｌ）、（Ｅ）－２－（２－メチル－５－オキソ－５，７，８，９－テトラヒドロ－６Ｈ－ベンゾ［７］アヌレン－６－イリデン）酢酸（３．５６ｇ、１５．５ｍｍｏｌ）、ＭｅＯＨ（１５０ｍＬ）、およびＮａＢＨ４（８．７９ｇ、２３２．３ｍｍｏｌ）を用いて、実施例１（段階２）に記載した通りに実施した。カラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ ３０：１＋１％のＡｃＯＨ）により精製した後、ＥｔＯＡｃから再結晶させて、（Ｅ）－２－（５－ヒドロキシ－２－メチル－５，７，８，９－テトラヒドロ－６Ｈ－ベンゾ［７］アヌレン－６－イリデン）酢酸（１．５６ｇ、４３％）を白色の固体として得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｍｅｔｈａｎｏｌ－ｄ４），δ：７．２９（ｄ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，１Ｈ），７．００（ｄｄ，Ｊ＝７．８，１．９Ｈｚ，１Ｈ），６．９０（ｓ，１Ｈ），５．９６（ｓ，１Ｈ），５．２２（ｓ，１Ｈ），３．４０－３．３３（ｍ，１Ｈ），３．０９－３．０３（ｍ，１Ｈ），２．８５－２．８０（ｍ，１Ｈ），２．７６－２．６９（ｍ，１Ｈ），２．２７（ｓ，３Ｈ），１．８２－１．７２（ｍ，２Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，Ｍｅｔｈａｎｏｌ－ｄ４）δ １７０．４，１６４．８，１４１．２，１３９．１，１３８．４，１３１．５，１２８．１，１２７．６，１１５．３，７９．０，３５．２，３０．５，２９．４，２１．０．ＨＰＬＣ（２５４ｎｍ）：１００％．ＵＰＬＣ－ＭＳ：ｍ／ｚ＝２３１．４［Ｍ－Ｈ］－
【0085】
実施例９
（Ｅ）－２－（１－ブロモ－５－ヒドロキシ－５，７，８，９－テトラヒドロ－６Ｈ－ベンゾ［７］アヌレン－６－イリデン）酢酸（８）の合成
段階１：Ｈ２Ｏ（３ｍＬ）およびＥｔＯＨ（７ｍＬ）中のＮａＯＨ（１９４ｍｇ、４．８ｍｍｏｌ）、Ｈ２Ｏ（７ｍＬ）中の１－ブロモ－６，７，８，９－テトラヒドロ－５Ｈ－ベンゾ［７］アヌレン－５－オン（Ｇｒｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．１９８３）（１９２ｍｇ、０．８ｍｍｏｌ）およびグリオキシル酸一水和物（２９９ｍｇ、３．２ｍｍｏｌ）を用いて、実施例１（段階１）に記載した通りに実施した。カラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ ９．５：０．５＋１％のＡｃＯＨ）による粗精製により、粗（Ｅ）－２－（１－ブロモ－５－オキソ－５，７，８，９－テトラヒドロ－６Ｈ－ベンゾ［７］アヌレン－６－イリデン）酢酸（１７２ｍｇ、７３％）を黄色の固体として得た。
（Ｅ）－２－（１－ブロモ－５－ヒドロキシ－５，７，８，９－テトラヒドロ－６Ｈ－ベンゾ［７］アヌレン－６－イリデン）酢酸（８）の合成
【化19】
【0086】
段階２：ＣｅＣｌ３・７Ｈ２Ｏ（２３６ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ）、（Ｅ）－２－（１－ブロモ－５－オキソ－５，７，８，９－テトラヒドロ－６Ｈ－ベンゾ［７］アヌレン－６－イリデン）酢酸（１６６ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ）、ＭｅＯＨ（８ｍＬ）、およびＮａＢＨ４（２１４ｍｇ、５．６ｍｍｏｌ）を用いて、実施例１（段階２）に記載した通りに実施した。分取ＨＰＬＣ（流速２０ｍＬ／分で勾配３０～５５％のＢ、溶離液Ａ（Ｈ２Ｏ／ＴＦＡ、１００：０．１）および溶離液Ｂ（ＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏ／ＴＦＡ、９０：１０：０．１）、９分間）により精製して、（Ｅ）－２－（１－ブロモ－５－ヒドロキシ－５，７，８，９－テトラヒドロ－６Ｈ－ベンゾ［７］アヌレン－６－イリデン）酢酸（９２ｍｇ、５５％）を白色の固体として得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｍｅｔｈａｎｏｌ－ｄ４）δ：７．４８（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，２Ｈ），７．０９（ｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ），６．０４（ｓ，１Ｈ），５．３７（ｓ，１Ｈ），３．５２－３．３５（ｍ，２Ｈ），３．０７－３．００（ｍ，１Ｈ），２．６９－２．６２（ｍ，１Ｈ），１．８７－１．７８（ｍ，１Ｈ），１．６９－１．５７（ｍ，１Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，Ｍｅｔｈａｎｏｌ－ｄ４）δ：１７０．３，１６３．８，１４５．０，１３９．９，１３２．９，１２９．０，１２６．５，１２５．５，１１５．８，７７．５，３２．５，３０．８，２７．５．ＨＰＬＣ（２５４ｎｍ）：９８％．ＥＳＩ－ＭＳ：ｍ／ｚ＝２９５．０，２９７．０［Ｍ－Ｈ］－
【0087】
実施例１０
（Ｅ）－２－（１－フェニル－５－ヒドロキシ－５，７，８，９－テトラヒドロ－６Ｈ－ベンゾ［７］アヌレン－６－イリデン）酢酸（９）の合成
段階１：ＤＭＦ（２４ｍＬ）およびＨ２Ｏ（１６ｍＬ）中のフェニルボロン酸（２５５ｍｇ、２．１ｍｍｏｌ）、Ｋ２ＣＯ３（４３６ｍｇ、３．１ｍｍｏｌ）、１－ブロモ－６，７，８，９－テトラヒドロ－５Ｈ－ベンゾ［７］アヌレン－５－オン（Ｇｒｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．１９８３）（２４７ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（２３９ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）を用いて、実施例２（段階１）に記載した通りに実施した。カラムクロマトグラフィー（ヘプタン／ＥｔＯＡｃ ９：１）による粗精製により、１－フェニル－６，７，８，９－テトラヒドロ－５Ｈ－ベンゾ［７］アヌレン－５－オン（２２０ｍｇ、９０％）を黄色の油として得た。
（Ｅ）－２－（１－フェニル－５－ヒドロキシ－５，７，８，９－テトラヒドロ－６Ｈ－ベンゾ［７］アヌレン－６－イリデン）酢酸（９）の合成
【化20】
【0088】
段階２：Ｈ２Ｏ（３ｍＬ）およびＥｔＯＨ（８ｍＬ）中のＮａＯＨ（２１４ｍｇ、５．３ｍｍｏｌ）、Ｈ２Ｏ（５ｍＬ）中の１－フェニル－６，７，８，９－テトラヒドロ－５Ｈ－ベンゾ［７］アヌレン－５－オン（２１０ｍｇ、０．９ｍｍｏｌ）およびグリオキシル酸一水和物（３２９ｍｇ、３．６ｍｍｏｌ）を用いて、実施例１（段階１）に記載した通りに実施した。粗（Ｅ）－２－（５－オキソ－１－フェニル－５，７，８，９－テトラヒドロ－６Ｈ－ベンゾ［７］アヌレン－６－イリデン）酢酸を、精製せずに次の段階に用いた。
【0089】
段階３：ＣｅＣｌ３・７Ｈ２Ｏ（３６２ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）、（Ｅ）－２－（５－オキソ－１－フェニル－５，７，８，９－テトラヒドロ－６Ｈ－ベンゾ［７］アヌレン－６－イリデン）酢酸（２５８ｍｇ、０．９ｍｍｏｌ）、ＭｅＯＨ（１４ｍＬ）、およびＮａＢＨ４（３３８ｍｇ、８．９ｍｍｏｌ）を用いて、実施例１（段階２）に記載した通りに実施した。分取ＨＰＬＣ（流速２０ｍＬ／分で勾配３０～７２％のＢ、溶離液Ａ（Ｈ２Ｏ／ＴＦＡ、１００：０．１）および溶離液Ｂ（ＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏ／ＴＦＡ、９０：１０：０．１）、１０分間）により精製して、（Ｅ）－２－（５－ヒドロキシ－１－フェニル－５，７，８，９－テトラヒドロ－６Ｈ－ベンゾ［７］アヌレン－６－イリデン）酢酸（１０６ｍｇ、４０％（２段階での全収率））を白色の固体として得た。１Ｈ ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，Ｍｅｔｈａｎｏｌ－ｄ４）δ：７．５０（ｄｄ，Ｊ＝７．７，１．４Ｈｚ，１Ｈ），７．４２－７．３６（ｍ，２Ｈ），７．３６－７．３０（ｍ，１Ｈ），７．２５－７．１９（ｍ，３Ｈ），７．０９（ｄｄ，Ｊ＝７．６，１．４Ｈｚ，１Ｈ），６．０７（ｓ，１Ｈ），５．４０（ｓ，１Ｈ），３．４７（ｄｄｄ，Ｊ＝１２．５，６．４，４．６Ｈｚ，１Ｈ），３．００（ｄｄｄ，Ｊ＝１４．５，９．１，２．７Ｈｚ，１Ｈ），２．６９（ｔｄｄ，Ｊ＝１１．６，９．３，３．７Ｈｚ，２Ｈ），１．７７－１．７１（ｍ，１Ｈ），１．６５－１．５８（ｍ，１Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１５１ＭＨｚ，Ｍｅｔｈａｎｏｌ－ｄ４）δ：１７０．６，１６４．５，１４３．６，１４３．４，１４３．０，１３８．３，１３０．４，１３０．３，１２９．１，１２７．９，１２７．０，１２６．３，１１５．３，７８．１，３０．９，２９．６，２８．９．ＨＰＬＣ（２５４ｎｍ）：１００％．ＵＰＬＣ－ＭＳ：ｍ／ｚ＝２９３．０［Ｍ－Ｈ］－
【0090】
実施例１１
（Ｅ）－２－（３－ブロモ－５－ヒドロキシ－５，７，８，９－テトラヒドロ－６Ｈ－ベンゾ［７］アヌレン－６－イリデン）酢酸（１０）の合成
段階１：Ｈ２Ｏ（３ｍＬ）およびＥｔＯＨ（７ｍＬ）中のＮａＯＨ（２４６ｍｇ、６．０ｍｍｏｌ）、Ｈ２Ｏ（７ｍＬ）中の３－ブロモ－６，７，８，９－テトラヒドロ－５Ｈ－ベンゾ［７］アヌレン－５－オン（Ｇｒｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．１９８３）（２３７ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）およびグリオキシル酸一水和物（３６６ｍｇ、４．０ｍｍｏｌ）を用いて、実施例１（段階１）に記載した通りに実施した。カラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ ９．５：０．５＋１％のＡｃＯＨ）により精製して、（Ｅ）－２－（３－ブロモ－５－オキソ－５，７，８，９－テトラヒドロ－６Ｈ－ベンゾ［７］アヌレン－６－イリデン）酢酸（２５９ｍｇ、８９％）を黄色の固体として得た。
（Ｅ）－２－（３－ブロモ－５－ヒドロキシ－５，７，８，９－テトラヒドロ－６Ｈ－ベンゾ［７］アヌレン－６－イリデン）酢酸（１０）の合成
【化21】
【0091】
段階２：ＣｅＣｌ３・７Ｈ２Ｏ（３５６ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）、（Ｅ）－２－（３－ブロモ－５－オキソ－５，７，８，９－テトラヒドロ－６Ｈ－ベンゾ［７］アヌレン－６－イリデン）酢酸（２５６ｍｇ、０．９ｍｍｏｌ）、ＭｅＯＨ（１０ｍＬ）、およびＮａＢＨ４（３３２ｍｇ、８．７ｍｍｏｌ）を用いて、実施例１（段階２）に記載した通りに実施した。分取ＨＰＬＣ（流速２０ｍＬ／分で勾配３０～５５％のＢ、溶離液Ａ（Ｈ２Ｏ／ＴＦＡ、１００：０．１）および溶離液Ｂ（ＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏ／ＴＦＡ、９０：１０：０．１）、９分間）により精製して、（Ｅ）－２－（３－ブロモ－５－ヒドロキシ－５，７，８，９－テトラヒドロ－６Ｈ－ベンゾ［７］アヌレン－６－イリデン）酢酸（１３９ｍｇ、５４％）を白色の固体として得た。１Ｈ ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，Ｍｅｔｈａｎｏｌ－ｄ４）δ：７．６４（ｄ，Ｊ＝２．２Ｈｚ，１Ｈ），７．２８（ｄｄ，Ｊ＝８．０，２．２Ｈｚ，１Ｈ），７．００（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），６．０１（ｓ，１Ｈ），５．２８（ｓ，１Ｈ），３．５７（ｄｄｄ，Ｊ＝１２．６，６．５，４．２Ｈｚ，１Ｈ），２．９９（ｄｄｄ，Ｊ＝１４．３，８．６，２．６Ｈｚ，１Ｈ），２．８０（ｄｄｄ，Ｊ＝１４．３，９．８，２．５Ｈｚ，１Ｈ），２．６６（ｄｄｄ，Ｊ＝１２．５，９．９，４．５Ｈｚ，１Ｈ），１．９０－１．８４（ｍ，１Ｈ），１．６５－１．５９（ｍ，１Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１５１ＭＨｚ，Ｍｅｔｈａｎｏｌ－ｄ４）δ：１７０．３，１６３．８，１４５．０，１４０．３，１３２．４，１３１．２，１２９．３，１２１．２，１１５．６，７７．０，３４．９，３１．５，２９．０．ＨＰＬＣ（２５４ｎｍ）：９９％．ＥＳＩ－ＭＳ：ｍ／ｚ＝２９５．０，２９７．０［Ｍ－Ｈ］－
【0092】
実施例１２
アセトキシメチル３－ヒドロキシシクロペント－１－エン－１－カルボキシラート（１１）の合成
乾燥ＤＭＦ（５ｍｌ）中の３－ヒドロキシシクロペント－１－エン－１－カルボン酸（Ａ）（Ｖｏｇｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１３）（２０７．４ｍｇ、１．６２ｍｍｏｌ）、Ｋ２ＣＯ３（１１４．９ｍｇ、０．８３ｍｍｏｌ）、およびＫＩ（１３８．４ｍｇ、０．８３ｍｍｏｌ）の混合物を室温で３０分間攪拌した。この反応混合物に、酢酸クロロメチル（２１８．９ｍｇ、２．０３ｍｍｏｌ）の溶液を滴加し、次いで、７０℃で２時間攪拌した後、それを室温に冷却した。水（１５ｍｌ）を加え、水相をＥｔＯＡｃ（３×２０ｍｌ）で抽出した。合わせた有機相をＭｇＳＯ４で乾燥させ、ろ過し、真空下で蒸発させた。カラムクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／ヘプタン １：１）により精製して、生成物（２０２．５ｇ、６３％）を透明な油として得た。１Ｈ ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，Ｍｅｔｈａｎｏｌ－ｄ４）δ：６．７４（ｑ，Ｊ＝２．１Ｈｚ，１Ｈ），５．８１（ｓ，２Ｈ），４．９１－４．８８（ｍ，１Ｈ），２．７２－２．６５（ｍ，１Ｈ），２．５０－２．４３（ｍ，１Ｈ），２．３８－２．３３（ｍ，１Ｈ），２．０８（ｓ，３Ｈ），１．７９－１．７３（ｍ，１Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１５１ＭＨｚ，Ｍｅｔｈａｎｏｌ－ｄ４）δ：１７１．１，１６４．９，１４６．７，１３８．３，８０．６，７７．５，３４．０，３０．６，２０．５．ＨＰＬＣ（２５４ｎｍ）：９６％。
アセトキシメチル３－ヒドロキシシクロペント－１－エン－１－カルボキシラート（１１）の合成
【化22】
【0093】
実施例１３
３－（２－アセトキシアセトキシ）シクロペント－１－エン－１－カルボン酸（１２）
ＴＨＦ（３ｍＬ）中のアセトキシアセチルクロリド（０．４ｍＬ、３．８ｍｍｏｌ）とアセトキシ酢酸（４５７ｍｇ、３．９ｍｍｏｌ）の混合物を０℃に冷却した。Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（１．８ｍＬ，１０．４ｍｍｏｌ）を５℃未満で加えた。得られた溶液を室温に温め、３０分間攪拌した。３－ヒドロキシシクロペント－１－エン－１－カルボン酸（ＨＯＣＰＣＡ）（Ｖｏｇｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１３）（２２２ｍｇ、１．７ｍｍｏｌ）および４－ジメチルアミノピリジン（２２ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（１．５ｍＬ）に溶かした。この溶液を反応混合物に一度に加え、室温で３時間攪拌した。水（３ｍＬ）を加え、反応物を室温で９０分間攪拌した。混合物をＥｔＯＡｃで抽出した。合わせた有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、ろ過し、真空下で蒸発させた。カラムクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／ヘプタン １：１＋１％のＡｃＯＨ）により精製して、３－（２－アセトキシアセトキシ）シクロペント－１－エン－１－カルボン酸（３５ｍｇ、９％）をオフホワイトの固体として得た。１Ｈ ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，Ｍｅｔｈａｎｏｌ－ｄ４）δ：６．６２（ｑ，Ｊ＝２．１Ｈｚ，１Ｈ），５．８５－５．８２（ｍ，１Ｈ），４．６２（ｓ，２Ｈ），２．７３－２．６７（ｍ，１Ｈ），２．５７－２．５１（ｍ，１Ｈ），２．４８－２．４２（ｍ，１Ｈ），２．１２（ｓ，３Ｈ），１．９８－１．９２（ｍ，１Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１５１ＭＨｚ，Ｍｅｔｈａｎｏｌ－ｄ４）δ１７２．１，１６９．３，１６７．７，１４３．７，１３９．０，８１．９，６１．９，３１．０，３１．０，２０．３．ＨＰＬＣ（２５４ｎｍ）：９５％。
３－（２－アセトキシアセトキシ）シクロペント－１－エン－１－カルボン酸（１２）
【化23】
【0094】
実施例１４
ネオペンチル３－ヒドロキシシクロペント－１－エン－１－カルボキシラート（１３）の合成
段階１：ＤＣＭ（９ｍＬ）中の３－オキソシクロペント－１－エン－１－カルボン酸４（１２６ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）、４－ジメチルアミノピリジン（２４ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）、および２，２－ジメチルプロパン－１－オール（１２４ｍｇ、１．４ｍｍｏｌ）の溶液に、ＤＣＭ（４ｍＬ）中のＮ－（３－ジメチルアミノプロピル）－Ｎ’－エチルカルボジイミド塩酸塩（２６０ｍｇ、１．４ｍｍｏｌ）を０℃で加えた。次いで、混合物を室温に温め、一晩攪拌した。混合物に飽和ＮＨ４Ｃｌ溶液を加え、次いで、これをＤＣＭで洗浄した。合わせた有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、ろ過し、真空下で蒸発させた。カラムクロマトグラフィー（ヘプタン／ＥｔＯＡｃ ４：１）による粗精製により、不純物を含んだネオペンチル３－オキソシクロペント－１－エン－１－カルボキシラート（７５ｍｇ、４３％）を黄色の油として得た。
ネオペンチル３－ヒドロキシシクロペント－１－エン－１－カルボキシラート（１３）の合成
【化24】
【0095】
段階２：ＣｅＣｌ３・７Ｈ２Ｏ（３０９ｍｇ、０．８ｍｍｏｌ）、ネオペンチル３－オキソシクロペント－１－エン－１－カルボキシラート（１３１ｍｇ、０．７ｍｍｏｌ）、ＭｅＯＨ（７ｍＬ）、およびＮａＢＨ４（１２７ｍｇ、３．４ｍｍｏｌ）を用いて、実施例１（段階２）に記載した通りに実施した。カラムクロマトグラフィー（ヘプタン／ＥｔＯＡｃ ３：１）により精製して、ネオペンチル３－ヒドロキシシクロペント－１－エン－１－カルボキシラート（５７ｍｇ、４３％）を透明な油として得た。１Ｈ ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ－ｄ）δ：６．７１（ｑ，Ｊ＝２．１Ｈｚ，１Ｈ），５．０１－４．９７（ｍ，１Ｈ），３．８５（ｓ，２Ｈ），２．７９－２．７３（ｍ，１Ｈ），２．５４－２．４９（ｍ，１Ｈ），２．４５－２．３９（ｍ，１Ｈ），１．８３－１．７８（ｍ，１Ｈ），０．９７（ｓ，９Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１５１ＭＨｚ，Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ－ｄ）δ：１６５．３，１４２．７，１３９．４，７７．４，７４．０，３３．８，３１．６，３０．１，２６．６．ＨＰＬＣ（２５４ｎｍ）：９９％。
【0096】
実施例１５
ｔｅｒｔ－ブチル３－ヒドロキシシクロペント－１－エン－１－カルボキシラート（１４）の合成（Ａｙｅ ｅｔ ａｌ，２００８）
段階１：ＤＭＦ（５ｍＬ）中の３－オキソシクロペント－１－エン－１－カルボン酸４（２０９ｍｇ、１．７ｍｍｏｌ）の溶液にｔｅｒｔ－ブチル２，２，２－トリクロロアセトイミダート（３．０ｍＬ、１６．７ｍｍｏｌ）および三フッ化ホウ素ジエチルエーテラート（０．１ｍＬ、０．９ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を５０℃で一晩攪拌した。飽和ＮａＨＣＯ３溶液を加え、次いで、水相をＥｔＯＡｃで抽出した。合わせた有機相を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、ろ過し、真空下で乾燥するまで蒸発させた。カラムクロマトグラフィー（ヘプタン／ＥｔＯＡｃ ３：１）による粗精製により、ｔｅｒｔ－ブチル３－オキソシクロペント－１－エン－１－カルボキシラート（１３８ｍｇ、４６％）を黄色の油として得た。
ｔｅｒｔ－ブチル３－ヒドロキシシクロペント－１－エン－１－カルボキシラート（１４）の合成（Ａｙｅ ｅｔ ａｌ，２００８）
【化25】
【0097】
段階２：ＣｅＣｌ３・７Ｈ２Ｏ（４９９ｍｇ、１．３ｍｍｏｌ）、ｔｅｒｔ－ブチル３－オキソシクロペント－１－エン－１－カルボキシラート（２０３ｍｇ、１．１ｍｍｏｌ）、ＭｅＯＨ（１１ｍＬ）、およびＮａＢＨ４（２１３ｍｇ、５．６ｍｍｏｌ）を用いて、実施例１（段階２）に記載した通りに実施した。カラムクロマトグラフィー（ヘプタン／ＥｔＯＡｃ ２：１）により精製して、ｔｅｒｔ－ブチル３－ヒドロキシシクロペント－１－エン－１－カルボキシラート（Ａｙｅ ｅｔ ａｌ，２００８）（２５ｍｇ、１２％）をオフホワイトの油として得た。
【0098】
実施例１６
リチウム（Ｉ）（２Ｓ）－２－アミノ－３－（３－（３－ヒドロキシシクロペント－１－エン－１－カルボキサミド）フェニル）プロパノアート（１５）の合成
段階１：３－ヒドロキシシクロペント－１－エン－１－カルボン酸（ＨＯＣＰＣＡ）（Ｖｏｇｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１３）（３５５ｍｇ、２．８ｍｍｏｌ）、４－ジメチルアミノピリジン（３５ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（１５ｍＬ）に溶かし、アルゴン下で０℃に冷却した。無水酢酸（０．４ｍＬ、４．２ｍｍｏｌ）を滴加し、室温で一晩攪拌した。水を加え、混合物をＥｔＯＡｃで抽出した。合わせた有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、ろ過し、真空下で蒸発させた。カラムクロマトグラフィー（ヘプタン／ＥｔＯＡｃ １：３＋１％のＡｃＯＨ）により精製して、３－アセトキシシクロペント－１－エン－１－カルボン酸（４３４ｍｇ、９２％）を白色の固体として得た。
リチウム（Ｉ）（２Ｓ）－２－アミノ－３－（３－（３－ヒドロキシシクロペント－１－エン－１－カルボキサミド）フェニル）プロパノアート（１５）の合成
【化26】
【0099】
段階２：３－アセトキシシクロペント－１－エン－１－カルボン酸（１３７ｍｇ、０．８ｍｍｏｌ）、Ｎ－（３－ジメチルアミノプロピル）－Ｎ’－エチルカルボジイミド塩酸塩（１５２ｍｇ、０．８ｍｍｏｌ）、ヒドロキシベンゾトリアゾール（１０８ｍｇ、０．８ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（０．２２ｍＬ、１．６ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（３ｍＬ）に溶かし、アルゴン下で１０分間攪拌した。ＴＨＦ（３ｍＬ）中のメチル（Ｓ）－３－（３－アミノフェニル）－２－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）プロパノアート（２８１ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）を加え、混合物を室温で一晩攪拌した。混合物に飽和ＮＨ４Ｃｌ溶液を加え、次いで、これをＥｔＯＡｃで洗浄した。合わせた有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、ろ過し、真空下で蒸発させた。カラムクロマトグラフィー（ヘプタン／ＥｔＯＡｃ １：１）により精製して、メチル（２Ｓ）－３－（３－（３－アセトキシシクロペント－１－エン－１－カルボキサミド）フェニル）－２－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）－アミノ）プロパノアート（３２０ｍｇ、９０％）を黄色の固体として得た。
【0100】
段階３：ジオキサン（１．２ｍＬ）中のメチル（２Ｓ）－３－（３－（３－アセトキシシクロペント－１－エン－１－カルボキサミド）フェニル）－２－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）プロパノアート（１３９ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）の溶液に４Ｍ ＨＣｌ／ジオキサン（１．２ｍＬ、４．７ｍｍｏｌ）を０℃で滴加した。混合物を室温で１時間攪拌した。飽和ＮａＨＣＯ３溶液を加え、次いで、水相をＥｔＯＡｃで抽出した。合わせた有機相を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、ろ過し、真空下で乾燥するまで蒸発させた。カラムクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／ＭｅＯＨ ５：１）による粗精製により、対応する中間体を黄色の油として得た。水（０．５ｍＬ）中のＬｉＯＨ（４ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）を、ＭｅＯＨ（０．５ｍＬ）中の中間体の溶液に加えた。混合物を、完全に変換されるまで室温で攪拌した。混合物を、真空下で乾燥するまで蒸発させて、リチウム（Ｉ）（２Ｓ）－２－アミノ－３－（３－（３－ヒドロキシシクロペント－１－エン－１－カルボキサミド）フェニル）プロパノアート（３０ｍｇ、３４％）をオフホワイトの固体として得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｍｅｔｈａｎｏｌ－ｄ４）δ：７．６２（ｄｄｄ，Ｊ＝８．１，２．２，１．０Ｈｚ，１Ｈ），７．３３（ｔ，Ｊ＝１．９Ｈｚ，１Ｈ），７．２５（ｔ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，１Ｈ），７．０５（ｄｔ，Ｊ＝７．６，１．４Ｈｚ，１Ｈ），６．６１（ｑ，Ｊ＝２．１Ｈｚ，１Ｈ），４．９４（ｔｄｄ，Ｊ＝５．２，２．６，１．６Ｈｚ，１Ｈ），３．４７（ｄｄ，Ｊ＝８．１，４．７Ｈｚ，１Ｈ），３．１０（ｄｄ，Ｊ＝１３．５，４．７Ｈｚ，１Ｈ），２．８６－２．７３（ｍ，２Ｈ），２．６５－２．５０（ｍ，１Ｈ），２．４３－２．３５（ｍ，１Ｈ），１．８５－１．７６（ｍ，１Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１５１ＭＨｚ，Ｍｅｔｈａｎｏｌ－ｄ４）δ：１８１．４，１６６．３，１４３．０，１４０．９，１３９．９，１３９．４，１２９．８，１２６．８，１２３．１，１２０．４，７７．９，５８．９，４２．７，３４．１，３１．１．ＨＰＬＣ（２５４ｎｍ）：９９％。
【0101】
実施例１７
ＧＨＢ関連類似体は６．０および７．４の両方のｐＨ値でラット脳シナプス膜中の特定のＧＨＢ部位に高い親和性で結合する（図１）
新規な類似体を、確立されている結合アッセイで試験し、参照化合物と比較した。ｐＨ６で、化合物１～１０は、Ａ）４４０ｎＭのＫｉ値を有する化合物Ｂと比べ、３Ｈ－Ｂ結合を阻害する（Ｋｉ値はそれぞれ５０ｎＭ、９２ｎＭ、３０ｎＭ、５２ｎＭ、５３ｎＭ、１０８ｎＭ、３２５ｎＭ、２２５ｎＭ、３８２ｎＭ、９６８７ｎＭ）ことがわかった。Ｂ）化合物１、２、および３はまた、２．７５μＭのＫｉ値を有するＧＨＢ自体と比べ、３Ｈ－Ａ結合を同程度の親和性（Ｋｉ値はそれぞれ５６ｎＭ、１４４ｎＭおよび５０ｎＭ）で濃縮依存的に阻害した。Ｃ）ｐＨ７．４で、３Ｈ－Ａ結合アッセイにおいて低い親和性が得られ、化合物１、２および３についてそれぞれ約２６７ｎＭ、６０４ｎＭ、および８７ｎＭのＫｉ値を得た。既知のＣＡＭＫ２Ａ阻害剤ＣＮ２１は、最大で３０μＭ（報告されているそのＩＣ５０値の約３００倍）の濃度でも３Ｈ－Ａ結合を変位させることができなかった。Ｄ）３Ｈ－Ａ結合アッセイでの化合物Ｃとジクロフェナクと４’－ヒドロキシジクロフェナクの競合は、化合物Ｃの親和性が４’－ヒドロキシジクロフェナクおよびジクロフェナクよりも優れている（Ｋｉ値は、２２ｎＭ対１６μＭおよび４．７μＭ）ことを示した。
ＧＨＢ関連類似体は６．０および７．４の両方のｐＨ値でラット脳シナプス膜中の特定のＧＨＢ部位に高い親和性で結合する（図１）
新規な類似体を、確立されている結合アッセイで試験し、参照化合物と比較した。ｐＨ６で、化合物１～１０は、Ａ）４４０ｎＭのＫｉ値を有する化合物Ｂと比べ、３Ｈ－Ｂ結合を阻害する（Ｋｉ値はそれぞれ５０ｎＭ、９２ｎＭ、３０ｎＭ、５２ｎＭ、５３ｎＭ、１０８ｎＭ、３２５ｎＭ、２２５ｎＭ、３８２ｎＭ、９６８７ｎＭ）ことがわかった。Ｂ）化合物１、２、および３はまた、２．７５μＭのＫｉ値を有するＧＨＢ自体と比べ、３Ｈ－Ａ結合を同程度の親和性（Ｋｉ値はそれぞれ５６ｎＭ、１４４ｎＭおよび５０ｎＭ）で濃縮依存的に阻害した。Ｃ）ｐＨ７．４で、３Ｈ－Ａ結合アッセイにおいて低い親和性が得られ、化合物１、２および３についてそれぞれ約２６７ｎＭ、６０４ｎＭ、および８７ｎＭのＫｉ値を得た。既知のＣＡＭＫ２Ａ阻害剤ＣＮ２１は、最大で３０μＭ（報告されているそのＩＣ５０値の約３００倍）の濃度でも３Ｈ－Ａ結合を変位させることができなかった。Ｄ）３Ｈ－Ａ結合アッセイでの化合物Ｃとジクロフェナクと４’－ヒドロキシジクロフェナクの競合は、化合物Ｃの親和性が４’－ヒドロキシジクロフェナクおよびジクロフェナクよりも優れている（Ｋｉ値は、２２ｎＭ対１６μＭおよび４．７μＭ）ことを示した。
【0102】
実施例１８
ＧＨＢ類似体の顕著なＧＡＢＡＢ受容体結合の欠如（図２）
ＧＨＢ、化合物Ａ、および化合物Ｃを、確立されている結合アッセイでＧＡＢＡＢ受容体に対する親和性について試験した。ＧＨＢが０．１ｍＭおよび１ｍＭの両方で３Ｈ－ＧＡＢＡＢ結合を阻害できたのに対して、化合物Ａは最大で１ｍＭの濃度でも競合能を示さず、化合物Ｃは濃度１ｍＭでわずかな阻害を示した。
ＧＨＢ類似体の顕著なＧＡＢＡＢ受容体結合の欠如（図２）
ＧＨＢ、化合物Ａ、および化合物Ｃを、確立されている結合アッセイでＧＡＢＡＢ受容体に対する親和性について試験した。ＧＨＢが０．１ｍＭおよび１ｍＭの両方で３Ｈ－ＧＡＢＡＢ結合を阻害できたのに対して、化合物Ａは最大で１ｍＭの濃度でも競合能を示さず、化合物Ｃは濃度１ｍＭでわずかな阻害を示した。
【0103】
実施例１９
化合物Ａはマウスで低体温を引き起こさないが、ＧＢＬは引き起こす（図３）
化合物ＡがＧＡＢＡＢ受容体を機能的に活性化できないことを確認するため、既知のＧＡＢＡＢの低体温作用を、野生型マウスとＧＡＢＡＢ受容体ノックアウトマウス（Ｋａｕｐｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，２００３）でＧＨＢプロドラッグＧＢＬ（７５０ｍｇ／ｋｇ）および化合物Ａ（５００ｍｇ／ｋｇ）の投与を比較することにより試験した。予想された通り、ＧＢＬは大幅な体温低下を促進できた。これとは対照的に、化合物Ａは、野生型マウスでもノックアウトマウスでも低体温に何ら影響を及ぼさなかった。
化合物Ａはマウスで低体温を引き起こさないが、ＧＢＬは引き起こす（図３）
化合物ＡがＧＡＢＡＢ受容体を機能的に活性化できないことを確認するため、既知のＧＡＢＡＢの低体温作用を、野生型マウスとＧＡＢＡＢ受容体ノックアウトマウス（Ｋａｕｐｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，２００３）でＧＨＢプロドラッグＧＢＬ（７５０ｍｇ／ｋｇ）および化合物Ａ（５００ｍｇ／ｋｇ）の投与を比較することにより試験した。予想された通り、ＧＢＬは大幅な体温低下を促進できた。これとは対照的に、化合物Ａは、野生型マウスでもノックアウトマウスでも低体温に何ら影響を及ぼさなかった。
【0104】
実施例２０
ＧＢＬはＧＡＢＡＢ受容体により介在されない脳グルコース代謝率の低下を誘発する（図４）
ＧＨＢプロドラッグＧＢＬが非ＧＡＢＡＢ受容体依存的機序を介してグルコース代謝を変化させることを確認するため、ＧＡＢＡＢ１受容体ノックアウトマウスに生理食塩水（黒のバー）またはＧＢＬ（２００ｍｇ／ｋｇ）（白のバー）を投与（ｉ．ｐ．）した。１０分後に、１４Ｃ－デオキシグルコースを全マウスに投与（ｉ．ｐ．）して、脳のグルコース消費量を推定した。これは、４５分後に前頭皮質および海馬での脳グルコース代謝率の有意なＧＨＢ誘導性の低下を示した（前頭皮質で１０．４６ｎＣｉ／（ＲＯＩ・分）対６．７８ｎＣｉ／（ＲＯＩ・分）、海馬で９．７４対６．４５であり、＊Ｐ＜０．０５であり、エラーバーがＳＤとして示されている）。
ＧＢＬはＧＡＢＡＢ受容体により介在されない脳グルコース代謝率の低下を誘発する（図４）
ＧＨＢプロドラッグＧＢＬが非ＧＡＢＡＢ受容体依存的機序を介してグルコース代謝を変化させることを確認するため、ＧＡＢＡＢ１受容体ノックアウトマウスに生理食塩水（黒のバー）またはＧＢＬ（２００ｍｇ／ｋｇ）（白のバー）を投与（ｉ．ｐ．）した。１０分後に、１４Ｃ－デオキシグルコースを全マウスに投与（ｉ．ｐ．）して、脳のグルコース消費量を推定した。これは、４５分後に前頭皮質および海馬での脳グルコース代謝率の有意なＧＨＢ誘導性の低下を示した（前頭皮質で１０．４６ｎＣｉ／（ＲＯＩ・分）対６．７８ｎＣｉ／（ＲＯＩ・分）、海馬で９．７４対６．４５であり、＊Ｐ＜０．０５であり、エラーバーがＳＤとして示されている）。
【0105】
実施例２１
化合物Ａは光血栓性局所虚血後３０分で投与されると梗塞の大きさを減少させる（図５）
Ａ）大脳皮質への局所性脳卒中の誘発後３０分に、化合物Ａを２つの異なる用量でマウスに投与し、生理食塩水治療個体と比較した。脳卒中誘発から３日後に、左運動皮質で梗塞が見られた。Ｂ）梗塞体積の定量化は、生理食塩水と化合物Ａ（１７５ｍｇ／ｋｇ）を比較する場合３０％の減少を明らかにした（９．３８ｍｍ３対６．５６ｍｍ３、＊＊＊Ｐ＜０．０００５）。低用量（１７．５ｍｇ／ｋｇ）を投与したマウスのグループは、生理食塩水と比較して梗塞体積の有意な減少を示さなかった（９．３８ｍｍ３対８．９５ｍｍ３）。
化合物Ａは光血栓性局所虚血後３０分で投与されると梗塞の大きさを減少させる（図５）
Ａ）大脳皮質への局所性脳卒中の誘発後３０分に、化合物Ａを２つの異なる用量でマウスに投与し、生理食塩水治療個体と比較した。脳卒中誘発から３日後に、左運動皮質で梗塞が見られた。Ｂ）梗塞体積の定量化は、生理食塩水と化合物Ａ（１７５ｍｇ／ｋｇ）を比較する場合３０％の減少を明らかにした（９．３８ｍｍ３対６．５６ｍｍ３、＊＊＊Ｐ＜０．０００５）。低用量（１７．５ｍｇ／ｋｇ）を投与したマウスのグループは、生理食塩水と比較して梗塞体積の有意な減少を示さなかった（９．３８ｍｍ３対８．９５ｍｍ３）。
【0106】
実施例２２
化合物Ａは光血栓性局所虚血の３０分後に投与されると、影響を受けた肢での運動能力を改善する（図６）
局所虚血後に化合物Ａを投与した後の運動機能改善を評価するため、左前肢の運動回復の具体的尺度にシリンダータスクおよびグリッド歩行タスクを用いた。局所虚血後３日のシリンダータスクおよびグリッド歩行タスクで、左前肢と右前肢の間に非対称性が観察された。Ａ）グリッド歩行タスクで、高用量（１７５ｍｇ／ｋｇ）を投与したマウスのグループは生理食塩水治療群と比較して２６％の改善を示し（＊＊Ｐ＜０．０１）、１７．５ｍｇ／ｋｇのグループには有意な減少はみられなかった（１０％）。Ｂ）シリンダータスクで測定した非対称性は、用量１７．５ｍｇ／ｋｇおよび用量１７５ｍｇ／ｋｇのグループの両方で、化合物Ａを投与したときに有意に減少し、その効果はそれぞれ４０％および４２％であった。
化合物Ａは光血栓性局所虚血の３０分後に投与されると、影響を受けた肢での運動能力を改善する（図６）
局所虚血後に化合物Ａを投与した後の運動機能改善を評価するため、左前肢の運動回復の具体的尺度にシリンダータスクおよびグリッド歩行タスクを用いた。局所虚血後３日のシリンダータスクおよびグリッド歩行タスクで、左前肢と右前肢の間に非対称性が観察された。Ａ）グリッド歩行タスクで、高用量（１７５ｍｇ／ｋｇ）を投与したマウスのグループは生理食塩水治療群と比較して２６％の改善を示し（＊＊Ｐ＜０．０１）、１７．５ｍｇ／ｋｇのグループには有意な減少はみられなかった（１０％）。Ｂ）シリンダータスクで測定した非対称性は、用量１７．５ｍｇ／ｋｇおよび用量１７５ｍｇ／ｋｇのグループの両方で、化合物Ａを投与したときに有意に減少し、その効果はそれぞれ４０％および４２％であった。
【0107】
実施例２３
化合物Ａは光血栓性局所虚血の３時間後、６時間後、または１２時間後に投与されると梗塞の大きさを減少させる（図７）
さらに時間が経過したのちの治療の効果を評価するため、梗塞誘発の３時間後、６時間後、または１２時間後に、化合物Ａを２つの異なる用量で投与した。Ａ）脳卒中後３時間、６時間、または１２時間の化合物Ａ（１７５ｍｇ／ｋｇ）の投与は、梗塞の大きさを有意に減少させ（それぞれ、５．５１ｍｍ３対３．１２ｍｍ３、３．６８ｍｍ３、および３．５８ｍｍ３）（Ｐ＜０．０１～０．０５）、３３～４３％の減少に達した。比較のため、３時間の時点でのＧＨＢ（２７５ｍｇ／ｋｇ）は、梗塞の大きさの有意な減少をもたらさなかった（不掲載）。Ｂ）脳卒中後３時間の低用量の化合物Ａ（９０ｍｇ／ｋｇ）の投与は、梗塞の大きさを有意に５１％減少した（５．５５ｍｍ３対２．６８ｍｍ３、＊＊Ｐ＜０．０１）。
化合物Ａは光血栓性局所虚血の３時間後、６時間後、または１２時間後に投与されると梗塞の大きさを減少させる（図７）
さらに時間が経過したのちの治療の効果を評価するため、梗塞誘発の３時間後、６時間後、または１２時間後に、化合物Ａを２つの異なる用量で投与した。Ａ）脳卒中後３時間、６時間、または１２時間の化合物Ａ（１７５ｍｇ／ｋｇ）の投与は、梗塞の大きさを有意に減少させ（それぞれ、５．５１ｍｍ３対３．１２ｍｍ３、３．６８ｍｍ３、および３．５８ｍｍ３）（Ｐ＜０．０１～０．０５）、３３～４３％の減少に達した。比較のため、３時間の時点でのＧＨＢ（２７５ｍｇ／ｋｇ）は、梗塞の大きさの有意な減少をもたらさなかった（不掲載）。Ｂ）脳卒中後３時間の低用量の化合物Ａ（９０ｍｇ／ｋｇ）の投与は、梗塞の大きさを有意に５１％減少した（５．５５ｍｍ３対２．６８ｍｍ３、＊＊Ｐ＜０．０１）。
【0108】
実施例２４
化合物Ａは光血栓性局所虚血の３時間後、６時間後、または１２時間後に投与されると、影響を受けた肢での運動能力を改善する（図８）
梗塞誘発後のさらに遅い時点で用量１７５ｍｇ／ｋｇのＡを投与した治療群での運動技能を評価するため、局所虚血の７日後にグリッド歩行タスクおよびシリンダータスクで左前肢と右前肢との間の非対称性を測定した。Ａ）グリッド歩行タスクで測定した非対称性は、３時間後、６時間後、および１２時間後のいずれの治療時点でも極めて有意に減少された（効果はそれぞれ、３１％、２２％、および２１％（＊＊＊Ｐ＜０．００１）。Ｂ）シリンダータスクで、３時間後（＊Ｐ＜０．０５）および６時間後（＊＊Ｐ＜０．００１）の時点で、生理食塩水治療群と比較してそれぞれ１６％および２０％の改善が観察されたのに対して、１２時間後の時点は有意でなかった。
化合物Ａは光血栓性局所虚血の３時間後、６時間後、または１２時間後に投与されると、影響を受けた肢での運動能力を改善する（図８）
梗塞誘発後のさらに遅い時点で用量１７５ｍｇ／ｋｇのＡを投与した治療群での運動技能を評価するため、局所虚血の７日後にグリッド歩行タスクおよびシリンダータスクで左前肢と右前肢との間の非対称性を測定した。Ａ）グリッド歩行タスクで測定した非対称性は、３時間後、６時間後、および１２時間後のいずれの治療時点でも極めて有意に減少された（効果はそれぞれ、３１％、２２％、および２１％（＊＊＊Ｐ＜０．００１）。Ｂ）シリンダータスクで、３時間後（＊Ｐ＜０．０５）および６時間後（＊＊Ｐ＜０．００１）の時点で、生理食塩水治療群と比較してそれぞれ１６％および２０％の改善が観察されたのに対して、１２時間後の時点は有意でなかった。
【0109】
実施例２５
化合物２は光血栓性局所虚血の３時間後または６時間後に投与されると、梗塞の大きさを減少させ、影響を受けた肢での運動能力を改善する（図９）
梗塞誘発の３時間後または６時間後に、新規な化合物２を１７５ｍｇ／ｋｇ（Ａ～Ｃ）または５０ｍｇ／ｋｇ（Ｄ～Ｆ）の用量で投与（ｉ．ｐ．）した。Ａ）損傷の３時間後または６時間後の２（１７５ｍｇ／ｋｇ）の投与は、梗塞の大きさを有意に減少させ（それぞれ５．５５ｍｍ３対３．４４ｍｍ３および２．９８ｍｍ３、Ｐ＜０．０１～０．０５）、３８～４６％の減少に達した。化合物２の投与は、Ｂ）６時間後のグループで肢の踏外し回数（＊Ｐ＜０．０５）、ならびにＣ）生理食塩水治療で治療したマウスと比べ３時間後および６時間後の両方で、影響を受けた足で過ごす時間（Ｐ＜０．０１～０．００１）、を有意に減少させた。Ｄ）２（５０ｍｇ／ｋｇ）の投与は、損傷後３時間後に同様の保護を促進し、梗塞の大きさを有意に３９％減少させた（５．５５ｍｍ３対３．４ｍｍ３、＊＊Ｐ＜０．０１）。同様に、低用量で治療したマウスは、Ｅ～Ｆ）両方の非対称性試験で運動能力の有意な改善を示した。
化合物２は光血栓性局所虚血の３時間後または６時間後に投与されると、梗塞の大きさを減少させ、影響を受けた肢での運動能力を改善する（図９）
梗塞誘発の３時間後または６時間後に、新規な化合物２を１７５ｍｇ／ｋｇ（Ａ～Ｃ）または５０ｍｇ／ｋｇ（Ｄ～Ｆ）の用量で投与（ｉ．ｐ．）した。Ａ）損傷の３時間後または６時間後の２（１７５ｍｇ／ｋｇ）の投与は、梗塞の大きさを有意に減少させ（それぞれ５．５５ｍｍ３対３．４４ｍｍ３および２．９８ｍｍ３、Ｐ＜０．０１～０．０５）、３８～４６％の減少に達した。化合物２の投与は、Ｂ）６時間後のグループで肢の踏外し回数（＊Ｐ＜０．０５）、ならびにＣ）生理食塩水治療で治療したマウスと比べ３時間後および６時間後の両方で、影響を受けた足で過ごす時間（Ｐ＜０．０１～０．００１）、を有意に減少させた。Ｄ）２（５０ｍｇ／ｋｇ）の投与は、損傷後３時間後に同様の保護を促進し、梗塞の大きさを有意に３９％減少させた（５．５５ｍｍ３対３．４ｍｍ３、＊＊Ｐ＜０．０１）。同様に、低用量で治療したマウスは、Ｅ～Ｆ）両方の非対称性試験で運動能力の有意な改善を示した。
【0110】
実施例２６
化合物Ａでの治療は、光血栓性局所虚血に関連する選択した分子マーカーの発現を減少させる（図１０）
局所虚血性傷害後の脳損傷に対する保護機序を検討するため、脳卒中の３日後に、虚血中心部周囲の脳組織のマーカー、ＧＦＡＰ、ＣＤ１４、およびＭＭＰ９のｍＲＮＡ発現レベルを測定した。Ａ）脳卒中の個体でＧＦＡＰレベルが著明に増大したが、２つの治療群の間でそのレベルに差はみられなかった。Ｂ）Ｃ）これとは対照的に、局所虚血事象の３０分後に化合物Ａ（１７５ｍｇ／ｋｇ）を投与した個体では、ＣＤ１４およびＭＭＰ９のｍＲＮＡレベルが著明に低下した。低用量のＡ（１７．５ｍｇ／ｋｇ）で既に、ＭＭＰ９のｍＲＮＡレベルは生理食塩水を投与した個体よりも有意に低下していた。Ｄ）１２時間後でも同様の結果がみられた。
化合物Ａでの治療は、光血栓性局所虚血に関連する選択した分子マーカーの発現を減少させる（図１０）
局所虚血性傷害後の脳損傷に対する保護機序を検討するため、脳卒中の３日後に、虚血中心部周囲の脳組織のマーカー、ＧＦＡＰ、ＣＤ１４、およびＭＭＰ９のｍＲＮＡ発現レベルを測定した。Ａ）脳卒中の個体でＧＦＡＰレベルが著明に増大したが、２つの治療群の間でそのレベルに差はみられなかった。Ｂ）Ｃ）これとは対照的に、局所虚血事象の３０分後に化合物Ａ（１７５ｍｇ／ｋｇ）を投与した個体では、ＣＤ１４およびＭＭＰ９のｍＲＮＡレベルが著明に低下した。低用量のＡ（１７．５ｍｇ／ｋｇ）で既に、ＭＭＰ９のｍＲＮＡレベルは生理食塩水を投与した個体よりも有意に低下していた。Ｄ）１２時間後でも同様の結果がみられた。
【0111】
実施例２７
化合物Ａでの治療は、光血栓性局所虚血での選択した炎症誘発性サイトカインの血漿中レベルを低下させる（図１１）
早い時点での炎症性応答を評価するため、局所虚血性事象の誘発から４時間後に、血液試料を採取した。Ａ）梗塞の形成は、ＭＣＰ－１、ＩＬ－６、およびＩＬ－１ａのレベルを有意に増大させた。ＭＣＰ－１レベルは、４時間後に化合物Ａで治療した個体の血漿で低下の傾向を示した。Ｂ）化合物Ａでの治療は、生理食塩水で治療したマウスと比べＩＬ－６の血漿中レベルを有意に低下させた。Ｃ）Ａによる治療は、生理食塩水で治療したマウスと比較してＩＬ－１ａレベルに有意に影響しなかった。
化合物Ａでの治療は、光血栓性局所虚血での選択した炎症誘発性サイトカインの血漿中レベルを低下させる（図１１）
早い時点での炎症性応答を評価するため、局所虚血性事象の誘発から４時間後に、血液試料を採取した。Ａ）梗塞の形成は、ＭＣＰ－１、ＩＬ－６、およびＩＬ－１ａのレベルを有意に増大させた。ＭＣＰ－１レベルは、４時間後に化合物Ａで治療した個体の血漿で低下の傾向を示した。Ｂ）化合物Ａでの治療は、生理食塩水で治療したマウスと比べＩＬ－６の血漿中レベルを有意に低下させた。Ｃ）Ａによる治療は、生理食塩水で治療したマウスと比較してＩＬ－１ａレベルに有意に影響しなかった。
【0112】
実施例２８
化合物Ａは局所虚血の永久中大脳動脈閉塞（ｐＭＣＡＯ）モデルの梗塞の大きさを減少させる（図１２）
中大脳動脈の永久閉塞による局所性脳卒中の誘発から３０分後に、マウスに化合物Ａ（１７５ｍｇ／ｋｇ）を投与し、生理食塩水で治療した個体と比較した。脳卒中誘発の３日後に、左運動皮質で梗塞が見られた。梗塞の定量化は、３０分後の生理食塩水とＡ（１７５ｍｇ／ｋｇ）の比較で梗塞体積の有意な減少を明らかにした（１６．６ｍｍ３対１２．３ｍｍ３、＊Ｐ＜０．０５）。
化合物Ａは局所虚血の永久中大脳動脈閉塞（ｐＭＣＡＯ）モデルの梗塞の大きさを減少させる（図１２）
中大脳動脈の永久閉塞による局所性脳卒中の誘発から３０分後に、マウスに化合物Ａ（１７５ｍｇ／ｋｇ）を投与し、生理食塩水で治療した個体と比較した。脳卒中誘発の３日後に、左運動皮質で梗塞が見られた。梗塞の定量化は、３０分後の生理食塩水とＡ（１７５ｍｇ／ｋｇ）の比較で梗塞体積の有意な減少を明らかにした（１６．６ｍｍ３対１２．３ｍｍ３、＊Ｐ＜０．０５）。
【0113】
実施例２９
化合物ＡはｐＭＣＡＯ局所病変の３０分後に投与されると機能回復を改善する（図１３）
中大脳動脈の永久閉塞により局所性脳卒中を誘発してから３０分後に、マウスに化合物Ａ（１７５ｍｇ／ｋｇ）を投与し、生理食塩水で治療した個体と比較し、ロータロッド試験、握力試験、およびハーグリーブス試験を用いて運動障害および感覚障害の両方を検討した。
化合物ＡはｐＭＣＡＯ局所病変の３０分後に投与されると機能回復を改善する（図１３）
中大脳動脈の永久閉塞により局所性脳卒中を誘発してから３０分後に、マウスに化合物Ａ（１７５ｍｇ／ｋｇ）を投与し、生理食塩水で治療した個体と比較し、ロータロッド試験、握力試験、およびハーグリーブス試験を用いて運動障害および感覚障害の両方を検討した。
【0114】
ロータロッド試験では、脳卒中の４８時間後にマウスを４回の試行（Ｔ１～Ｔ４）に供した。Ａ）生理食塩水で治療したマウスは、ロータロッドでＴ２～Ｔ３に有意に学習した。Ｂ）これと比較して、Ａによる治療を実施したマウスは学習曲線の勾配がより大きかった（Ｔ１～Ｔ２）、しかしＴ４でロータロッド上にとどまる時間に群間差はみられなかった。Ｃ）脳卒中から３日後に、生理食塩水で治療したマウスは、影響を受けた前肢での握力の有意な傷害を示し、化合物Ａで治療したマウスは、この試験で何らかの障害を示さなかった。Ｄ）同様に、影響を受けた前肢での感覚障害の評価では、生理食塩水で治療したマウスは、影響を受けた前肢のハーグリーブス試験で応答時間の増大を示し、一方でこれは、Ａで治療したマウスには認められなかった。
【0115】
実施例３０
マウス脳からの冠状脳切片でのｅｘ ｖｉｖｏの３Ｈ－Ａ放射性リガンド結合（図１４）
３Ｈ－Ａを用いて、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスへのｅｘ ｖｉｖｏ結合を実施した。したがって、１グループ当たり５匹のマウスを用いたデザインで、３Ｈ－Ａ（マウス１匹当たり５ＭＢｑ）をｉ．ｐ．注射した。３０分後に、脳を切り出し、オートラジオグラフィーを実施した。正規化に用いた小脳と比較して、有意な特異的結合レベルが海馬および皮質で観察された。
マウス脳からの冠状脳切片でのｅｘ ｖｉｖｏの３Ｈ－Ａ放射性リガンド結合（図１４）
３Ｈ－Ａを用いて、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスへのｅｘ ｖｉｖｏ結合を実施した。したがって、１グループ当たり５匹のマウスを用いたデザインで、３Ｈ－Ａ（マウス１匹当たり５ＭＢｑ）をｉ．ｐ．注射した。３０分後に、脳を切り出し、オートラジオグラフィーを実施した。正規化に用いた小脳と比較して、有意な特異的結合レベルが海馬および皮質で観察された。
【0116】
実施例３１
ＣＡＭＫ２ＡがＧＨＢ高親和性結合部位であることの確認（図１５）
Ａ）光親和標識ワークフローの原理。ラット海馬からの粗シナプス膜を光親和性リガンドＳＢＶ３とインキュベートし、ＵＶ照射（波長３０２ｎｍ）してＧＨＢ結合タンパク質に光親和性リガンドを共有結合させた。シュタウディンガー・ベルトッツィライゲーションによりビオチンをＥＺ－Ｌｉｎｋ（商標）Ｐｈｏｓｐｈｉｎｅ－ＰＥＧ３－Ｂｉｏｔｉｎ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）に導入した後、ビオチン標識タンパク質をアフィニティー精製し、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ解析に供した。Ｂ）抗ビオチンウエスタンブロットは、光リガンドの存在下で（第一のレーン）および不在下で（第二のレーン）５５ｋＤａ付近に特異的に標識されたバンドを示す。Ｃ）ＣＡＭＫ２ＡノックアウトマウスおよびＣＡＭＫ２Ｂノックアウトマウスからの脳の皮質膜への３Ｈ－Ａの結合。Ｄ）ラットＣＡＭＫ２ＡをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞からの全細胞ホモジネートへの３Ｈ－Ａ結合は、非特異的レベルと比べ有意に高い全結合を示し（特異的結合８７％）、一方でＣＡＭＫ２Ｂでは特異的結合はみられなかった（黒のバー＝特異的結合、白のバー＝非特異的結合；１ｍＭ ＧＨＢ）。
ＣＡＭＫ２ＡがＧＨＢ高親和性結合部位であることの確認（図１５）
Ａ）光親和標識ワークフローの原理。ラット海馬からの粗シナプス膜を光親和性リガンドＳＢＶ３とインキュベートし、ＵＶ照射（波長３０２ｎｍ）してＧＨＢ結合タンパク質に光親和性リガンドを共有結合させた。シュタウディンガー・ベルトッツィライゲーションによりビオチンをＥＺ－Ｌｉｎｋ（商標）Ｐｈｏｓｐｈｉｎｅ－ＰＥＧ３－Ｂｉｏｔｉｎ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）に導入した後、ビオチン標識タンパク質をアフィニティー精製し、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ解析に供した。Ｂ）抗ビオチンウエスタンブロットは、光リガンドの存在下で（第一のレーン）および不在下で（第二のレーン）５５ｋＤａ付近に特異的に標識されたバンドを示す。Ｃ）ＣＡＭＫ２ＡノックアウトマウスおよびＣＡＭＫ２Ｂノックアウトマウスからの脳の皮質膜への３Ｈ－Ａの結合。Ｄ）ラットＣＡＭＫ２ＡをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞からの全細胞ホモジネートへの３Ｈ－Ａ結合は、非特異的レベルと比べ有意に高い全結合を示し（特異的結合８７％）、一方でＣＡＭＫ２Ｂでは特異的結合はみられなかった（黒のバー＝特異的結合、白のバー＝非特異的結合；１ｍＭ ＧＨＢ）。
【0117】
実施例３２
ＧＨＢならびにＧＨＢ関連類似体Ａ、Ｂ、Ｃ、１および２は、組換えＣＡＭＫ２Ａに直接結合する（図１６）
ＨＥＫ細胞で発現されたヒト／ラットＣＡＭＫ２Ａを、ＣＡＭＫ２ＡトランスフェクトＨＥＫ２９３Ｔ細胞の全細胞溶解物で実施される社内で確立した３Ｈ－Ａろ過結合アッセイでアッセイした。ラット脳皮質からのシナプス膜への結合について認められるように、化合物ＧＨＢ、Ａ、Ｂ、Ｃ、１および２は、濃度依存的に放射性リガンド結合を阻害できた。得られたＫｉ値は、それぞれ５０．４μＭ、１．９５μＭ、３．７１μＭ、０．８１μＭ、０．７２μＭ、および１．０９μＭであり、化合物１および２は、３Ｈ－Ａ放射性リガンドとの競合でＧＨＢより５０～７０倍もの優れた親和性を示し、このことは、３Ｈ－Ａ結合アッセイで観察された結合能のシフト（図１Ｂ）と類似している。
ＧＨＢならびにＧＨＢ関連類似体Ａ、Ｂ、Ｃ、１および２は、組換えＣＡＭＫ２Ａに直接結合する（図１６）
ＨＥＫ細胞で発現されたヒト／ラットＣＡＭＫ２Ａを、ＣＡＭＫ２ＡトランスフェクトＨＥＫ２９３Ｔ細胞の全細胞溶解物で実施される社内で確立した３Ｈ－Ａろ過結合アッセイでアッセイした。ラット脳皮質からのシナプス膜への結合について認められるように、化合物ＧＨＢ、Ａ、Ｂ、Ｃ、１および２は、濃度依存的に放射性リガンド結合を阻害できた。得られたＫｉ値は、それぞれ５０．４μＭ、１．９５μＭ、３．７１μＭ、０．８１μＭ、０．７２μＭ、および１．０９μＭであり、化合物１および２は、３Ｈ－Ａ放射性リガンドとの競合でＧＨＢより５０～７０倍もの優れた親和性を示し、このことは、３Ｈ－Ａ結合アッセイで観察された結合能のシフト（図１Ｂ）と類似している。
【0118】
実施例３３
化合物Ａおよび２は、プロトン共役輸送体においてそれらの基質活性により迅速にｔｓＡ２０１細胞膜を通過する（図１７）
化合物が細胞内に侵入し、標的（ＣＡＭＫ２Ａ）に到達する能力をモニターするため、ｐＨ感受性色素ＢＣＥＣＦを用いる蛍光ベースのアッセイを用いた。ＭＣＴを発現することがわかっている細胞（ｔｓＡ２０１；ＨＥＫ２９３－Ｔに関連する）を、９６ウェルプレートで増殖させ、化合物に曝露し、ｐＨ低下を２分間測定した。Ａ）既知のＭＣＴ１基質であるＡについて予想された通り、濃度依存性のｐＨ低下が観察された（ＥＣ５０値８．２ｍＭ）。Ｂ）複数の類似体を代表する化合物２も同様に、濃度依存的にｐＨを低下させ（ＥＣ５０値１．６ｍＭ）、細胞の細胞質ゾル内への化合物送達を裏付けた。
化合物Ａおよび２は、プロトン共役輸送体においてそれらの基質活性により迅速にｔｓＡ２０１細胞膜を通過する（図１７）
化合物が細胞内に侵入し、標的（ＣＡＭＫ２Ａ）に到達する能力をモニターするため、ｐＨ感受性色素ＢＣＥＣＦを用いる蛍光ベースのアッセイを用いた。ＭＣＴを発現することがわかっている細胞（ｔｓＡ２０１；ＨＥＫ２９３－Ｔに関連する）を、９６ウェルプレートで増殖させ、化合物に曝露し、ｐＨ低下を２分間測定した。Ａ）既知のＭＣＴ１基質であるＡについて予想された通り、濃度依存性のｐＨ低下が観察された（ＥＣ５０値８．２ｍＭ）。Ｂ）複数の類似体を代表する化合物２も同様に、濃度依存的にｐＨを低下させ（ＥＣ５０値１．６ｍＭ）、細胞の細胞質ゾル内への化合物送達を裏付けた。
【0119】
実施例３４
化合物Ａは光血栓性局所虚血に供されたマウスでｐＴｈｒ２８６ ＣＡＭＫ２Ａ自己リン酸化を防ぐ（図１８）
Ａの機能的活性を評価するため、光血栓性損傷に供され、Ａによる治療を実施したマウスおよび実施していないマウスから単離した皮質組織に、十分に記載されているｐＴｈｒ２８６アッセイ（Ｋｏｏｌ ｅｔ ａｌ．，２０１６）を用いた。
化合物Ａは光血栓性局所虚血に供されたマウスでｐＴｈｒ２８６ ＣＡＭＫ２Ａ自己リン酸化を防ぐ（図１８）
Ａの機能的活性を評価するため、光血栓性損傷に供され、Ａによる治療を実施したマウスおよび実施していないマウスから単離した皮質組織に、十分に記載されているｐＴｈｒ２８６アッセイ（Ｋｏｏｌ ｅｔ ａｌ．，２０１６）を用いた。
【0120】
この目的に向けて、損傷の３時間後に、偽手術マウスまたはマウスを生理食塩水または１７５ｍｇ／ｋｇのＡ（ｉ．ｐ．）で治療した。損傷から３０分後に、マウスを屠殺し、皮質組織を処理した。ウエスタンブロット解析により自己リン酸化を評価し、ｐＴｈｒ２８６ ＣＡＭＫ２Ａのレベルを総ＣＡＭＫ２Ａに対し正規化して自己リン酸化の変化を検出した。虚血に関する他の報告（Ａｈｍｅｄ ｅｔ ａｌ．，２０１７）と一致して、光血栓法により誘発された局所虚血はり、自己リン酸化を有意に増大させた（＃Ｐ＜０．０５）。この応答は、化合物Ａにより有意に阻害され（＊Ｐ＜０．０５）、偽手術条件と比較して自己リン酸化の７３％減少に至った。
【0121】
（参考文献）
Ａｈｍｅｄ，Ｍ．Ｅ．，Ｄｏｎｇ，Ｙ．，Ｌｕ，Ｙ．，Ｔｕｃｋｅｒ，Ｄ．，Ｗａｎｇ，Ｒ．，Ｚｈａｎｇ，Ｑ．，２０１７．Ｂｅｎｅｆｉｃｉａｌ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ａ ＣａＭＫＩＩａ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ＴａｔＣＮ２１ ｐｅｐｔｉｄｅ ｉｎ ｇｌｏｂａｌ ｃｅｒｅｂｒａｌ ｉｓｃｈｅｍｉａ．Ｊ Ｍｏｌ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ６１，４２－５１．
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Ｃｌａｒｋｓｏｎ，Ａ．Ｎ．，Ｈｕａｎｇ，Ｂ．Ｓ．，Ｍａｃｉｓａａｃ，Ｓ．Ｅ．，Ｍｏｄｙ，Ｉ．，Ｃａｒｍｉｃｈａｅｌ，Ｓ．Ｔ．，２０１０．Ｒｅｄｕｃｉｎｇ ｅｘｃｅｓｓｉｖｅ ＧＡＢＡ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｏｎｉｃ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ａｆｔｅｒ ｓｔｒｏｋｅ．Ｎａｔｕｒｅ ４６８，３０５－３０９．
Ｃｏｕｌｔｒａｐ，Ｓ．Ｊ．，Ａｓｈｐｏｌｅ，Ｎ．Ｍ．，Ｈｕｄｍｏｎ，Ａ．，Ｂａｙｅｒ，Ｋ．Ｕ．，２０１１．ＣａＭＫＩＩ ｉｎ ｃｅｒｅｂｒａｌ ｉｓｃｈｅｍｉａ．Ａｃｔａ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｓｉｎ ３２，８６１－８７２．
Ｇｒｕｂｅｒ，Ｒ；Ｃａｇｎｉａｎｔ，Ｄ．，Ｃａｇｎｉａｎｔ，Ｐ．，１９８３．Ｈｙｄｒｏｃａｒｂｕｒｅｓ ａｒｙｌａｌｉｐｈａｔｉｑｕｅｓ．Ｐａｒｔｉｅ ＶＩＩ．Ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ ｄａｎｓ ｌａ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｄｅ ｂｒｏｍａｔｉｏｎ ｄｅ ｂｅｎｚｏｃｙｃｌｅｎｅｓ ｂｉ－ｅｔ ｔｒｉｃｙｃｌｉｑｕｅｓ ｓｕｐｅｒｉｅｕｒｓ．Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ｄｅ ｌａ Ｓｏｃｉｅｔｅ Ｃｈｉｍｉｑｕｅ ｄｅ Ｆｒａｎｃｅ，２，９６－１０４．
Ｋａｕｐｍａｎｎ，Ｋ．，Ｃｒｙａｎ，Ｊ．Ｆ．，Ｗｅｌｌｅｎｄｏｒｐｈ，Ｐ．，Ｍｏｍｂｅｒｅａｕ，Ｃ．，Ｓａｎｓｉｇ，Ｇ．，Ｋｌｅｂｓ，Ｋ．，Ｓｃｈｍｕｔｚ，Ｍ．，Ｆｒｏｅｓｔｌ，Ｗ．，ｖａｎ ｄｅｒ Ｐｕｔｔｅｎ，Ｈ．，Ｍｏｓｂａｃｈｅｒ，Ｊ．，Ｂｒａｕｎｅｒ－Ｏｓｂｏｒｎｅ，Ｈ．，Ｗａｌｄｍｅｉｅｒ，Ｐ．，Ｂｅｔｔｌｅｒ，Ｂ．，２００３．Ｓｐｅｃｉｆｉｃ γ－ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒａｔｅ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅｓ ｂｕｔ ｌｏｓｓ ｏｆ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ γ－ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒａｔｅ ｉｎ ＧＡＢＡＢ１－ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｍｉｃｅ．Ｅｕｒ Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ １８，２７２２－２７３０．
Ｋｌｅｉｎ，Ａ．Ｂ．，Ｂａｙ，Ｔ．，Ｖｉｌｌｕｍｓｅｎ，Ｉ．Ｓ．，Ｆａｌｋ－Ｐｅｔｅｒｓｅｎ，Ｃ．Ｂ．，Ｍａｒｅｋ，Ａ．，Ｆｒｏｌｕｎｄ，Ｂ．，Ｃｌａｕｓｅｎ，Ｒ．Ｐ．，Ｈａｎｓｅｎ，Ｈ．Ｄ．，Ｋｎｕｄｓｅｎ，Ｇ．Ｍ．，Ｗｅｌｌｅｎｄｏｒｐｈ，Ｐ．，２０１６．Ａｕｔｏｒａｄｉｏｇｒａｐｈｉｃ ｉｍａｇｉｎｇ ａｎｄ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｈｉｇｈ－ａｆｆｉｎｉｔｙ ＧＨＢ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅｓ ｉｎ ｒｏｄｅｎｔ ｂｒａｉｎ ｕｓｉｎｇ ３Ｈ－ＨＯＣＰＣＡ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ Ｉｎｔ １００，１３８－１４５．
Ｋｏｏｌ，Ｍ．Ｊ．，Ｖａｎ Ｄｅ Ｂｒｅｅ，Ｊ．Ｅ．，Ｂｏｄｄｅ，Ｈ．Ｅ．，Ｅｌｇｅｒｓｍａ，Ｙ．，Ｖａｎ Ｗｏｅｒｄｅｎ，Ｇ．Ｍ．，２０１６．Ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，ｔｅｍｐｏｒａｌ ａｎｄ ｒｅｇｉｏｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｂｅｔａ ｉｓｏｆｏｒｍ ｏｆ Ｃａｌｃｉｕｍ／Ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｔｙｐｅ ２（ＣＡＭＫ２Ｂ）ｉｎ ｍｏｕｓｅ ｌｏｃｏｍｏｔｉｏｎ．Ｓｃｉ Ｒｅｐ ６：２６９８９，１－１２．
Ｋｕｓｃｈｉｎｓｋｙ，Ｗ．，Ｓｕｄａ，Ｓ．，Ｓｏｋｏｌｏｆｆ，Ｌ．，１９８５．Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ｇａｍｍａ－ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒａｔｅ ｏｎ ｔｈｅ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｂｅｔｗｅｅｎ ｌｏｃａｌ ｃｅｒｅｂｒａｌ ｇｌｕｃｏｓｅ ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｌｏｃａｌ ｃｅｒｅｂｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｆｌｏｗ ｉｎ ｔｈｅ ｒａｔ ｂｒａｉｎ．Ｊ Ｃｅｒｅｂ Ｂｌｏｏｄ Ｆｌｏｗ Ｍｅｔａｂ ５，５８－６４．
Ｌｉｅ，Ｍ．Ｅ．Ｋ．，Ｊｏｈａｎｓｅｎ，Ｎ．Ｂ．，Ｇｏｗｉｎｇ Ｅ．Ｋ．，Ｄａｌｂｙ，Ｎ．Ｏ．，Ｔｈｉｅｓｅｎ，Ｌ．，Ｗｅｌｌｅｎｄｏｒｐｈ，Ｐ．，Ｃｌａｒｋｓｏｎ，Ａ．Ｎ．，Ｉｎ Ｐｒｅｓｓ．Ｔｈｅ ＧＡＴ３ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｌ－ｉｓｏｓｅｒｉｎｅ ｕｐｒｅｇｕｌａｔｅｓ ＧＡＴ３ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｃｒｅａｓｅｓ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ａｆｔｅｒ ａ ｆｏｃａｌ ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｓｔｒｏｋｅ ｉｎ ｍｉｃｅ．Ｊ Ｃｅｒｅｂ Ｂｌｏｏｄ Ｆｌｏｗ Ｍｅｔａｂ ｄｏｉ：１０．１１７７／０２７１６７８Ｘ１７７４４１２３．
Ｍｕｒｉｎｅｄｄｕ，Ｇ．，Ｒｕｉｕ，Ｓ．，Ｌｏｒｉｇａ，Ｇ．，Ｍａｎｃａ，Ｉ．，Ｌａｚｚａｒｉ，Ｐ．，Ｒｅａｌｉ，Ｒ．，Ｐａｎｉ，Ｌ．；Ｔｏｍａ，Ｌ．，Ｐｉｎｎａ，Ｇ．Ａ．，２００５．Ｔｒｉｃｙｃｌｉｃ ｐｙｒａｚｏｌｅｓ．３．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ，ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｏｄｅｌｉｎｇ ｏｆ ａｎａｌｏｇｕｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｃａｎｎａｂｉｎｏｉｄ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ ８－ｃｈｌｏｒｏ－１－（２’，４’－ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）－Ｎ－ｐｉｐｅｒｉｄｉｎ－１－ｙｌ－１，４，５，６－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｂｅｎｚｏ［６，７］ｃｙｃｌｏｈｅｐｔａ［１，２－ｃ］ｐｙｒａｚｏｌｅ－３－ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ．Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ ４８，７３５１－７３６２．
Ｔｈｉｅｓｅｎ，Ｌ．，Ｋｅｈｌｅｒ，Ｊ．，Ｃｌａｕｓｅｎ，Ｒ．Ｐ．，Ｆｒｏｌｕｎｄ，Ｂ．，Ｂｕｎｄｇａａｒｄ，Ｃ．，Ｗｅｌｌｅｎｄｏｒｐｈ，Ｐ．，２０１５．Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ａｃｔｉｖｅ ｂｒａｉｎ ｕｐｔａｋｅ ｏｆ ｔｈｅ ＧＨＢ ａｎａｌｏｇ ＨＯＣＰＣＡ ｂｙ ｔｈｅ ｍｏｎｏｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ ｓｕｂｔｙｐｅ １．Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ ３５４，１６６－１７４．
Ｖｅｓｔ，Ｒ．Ｓ．，Ｄａｖｉｅｓ，Ｋ．Ｄ．，Ｏ’Ｌｅａｒｙ，Ｈ．，Ｐｏｒｔ，Ｊ．Ｄ．，Ｂａｙｅｒ，Ｋ．Ｕ．，２００７．Ｄｕａｌ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ａ ｎａｔｕｒａｌ ＣａＭＫＩＩ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １８，５０２４－５０３３．
Ｖｏｇｅｎｓｅｎ，Ｓ．Ｂ．，Ｍａｒｅｋ，Ａ．，Ｂａｙ，Ｔ．，Ｗｅｌｌｅｎｄｏｒｐｈ，Ｐ．，Ｋｅｈｌｅｒ，Ｊ．，Ｂｕｎｄｇａａｒｄ，Ｃ．，Ｆｒｏｌｕｎｄ，Ｂ．，Ｐｅｄｅｒｓｅｎ，Ｍ．Ｈ．，Ｃｌａｕｓｅｎ，Ｒ．Ｐ．，２０１３．Ｎｅｗ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｔｒｉｔｉｕｍ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｏｆ ａ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｌｉｇａｎｄ ｆｏｒ ｓｔｕｄｙｉｎｇ ｈｉｇｈ－ａｆｆｉｎｉｔｙ γ－ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒａｔｅ（ＧＨＢ）ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅｓ．Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ．５６，８２０１－８２０５．
Ｗａｘｈａｍ，Ｍ．Ｎ．，Ｇｒｏｔｔａ，Ｊ．Ｃ．，Ｓｉｌｖａ，Ａ．Ｊ．，Ｓｔｒｏｎｇ，Ｒ．，Ａｒｏｎｏｗｓｋｉ，Ｊ．，１９９６．Ｉｓｃｈｅｍｉａ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｎｅｕｒｏｎａｌ ｄａｍａｇｅ：ａ ｒｏｌｅ ｆｏｒ ｃａｌｃｉｕｍ／ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ＩＩ．Ｊ Ｃｅｒｅｂ Ｂｌｏｏｄ Ｆｌｏｗ Ｍｅｔａｂ １６，１－６．
Ｗｅｌｌｅｎｄｏｒｐｈ，Ｐ．，Ｈｏｇ，Ｓ．，Ｇｒｅｅｎｗｏｏｄ，Ｊ．Ｒ．，ｄｅ Ｌｉｃｈｔｅｎｂｅｒｇ，Ａ．，Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｂ．，Ｆｒｏｌｕｎｄ，Ｂ．，Ｂｒｅｈｍ，Ｌ．，Ｃｌａｕｓｅｎ，Ｒ．Ｐ．，Ｂｒａｕｎｅｒ－Ｏｓｂｏｒｎｅ，Ｈ．，２００５．Ｎｏｖｅｌ ｃｙｃｌｉｃ γ－ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒａｔｅ（ＧＨＢ）ａｎａｌｏｇｓ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ ａｆｆｉｎｉｔｙ ａｎｄ ｓｔｅｒｅｏｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ ＧＨＢ ｓｉｔｅｓ ｉｎ ｒａｔ ｂｒａｉｎ．Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ ３１５，３４６－３５１
Ａｈｍｅｄ，Ｍ．Ｅ．，Ｄｏｎｇ，Ｙ．，Ｌｕ，Ｙ．，Ｔｕｃｋｅｒ，Ｄ．，Ｗａｎｇ，Ｒ．，Ｚｈａｎｇ，Ｑ．，２０１７．Ｂｅｎｅｆｉｃｉａｌ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ａ ＣａＭＫＩＩａ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ＴａｔＣＮ２１ ｐｅｐｔｉｄｅ ｉｎ ｇｌｏｂａｌ ｃｅｒｅｂｒａｌ ｉｓｃｈｅｍｉａ．Ｊ Ｍｏｌ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ６１，４２－５１．
Ａｙｅ，Ｙ．；Ｄａｖｉｅｓ，Ｓ．Ｇ．，Ｇａｒｎａｅｒ，Ａ．Ｃ．，Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｐ．Ｍ．，Ｓｍｉｔｈ，Ａ．Ｄ．；Ｔｈｏｍｓｏｎ，Ｊ．Ｅ．，２００８ Ｐａｒａｌｌｅｌ ｋｉｎｅｔｉｃ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｃｉｔｅｒｔｃｉ－ｂｕｔｙｌ（ＲＳ）－３－ｏｘｙ－ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ ｃｙｃｌｏｐｅｎｔ－１－ｅｎｅ－ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ３－ｏｘｙ－ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ ｃｉｓｐｅｎｔａｃｉｎ ａｎｄ ｔｒａｎｓｐｅｎｔａｃｉｎ ｄｅｒｉｖａｔｉｅｓ．Ｏｒｇａｎｉｃ Ｂｉｏｍｏｌ Ｃｈｅｍ ６，２１９５－２２０３．
Ｃｌａｒｋｓｏｎ，Ａ．Ｎ．，Ｈｕａｎｇ，Ｂ．Ｓ．，Ｍａｃｉｓａａｃ，Ｓ．Ｅ．，Ｍｏｄｙ，Ｉ．，Ｃａｒｍｉｃｈａｅｌ，Ｓ．Ｔ．，２０１０．Ｒｅｄｕｃｉｎｇ ｅｘｃｅｓｓｉｖｅ ＧＡＢＡ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｏｎｉｃ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ａｆｔｅｒ ｓｔｒｏｋｅ．Ｎａｔｕｒｅ ４６８，３０５－３０９．
Ｃｏｕｌｔｒａｐ，Ｓ．Ｊ．，Ａｓｈｐｏｌｅ，Ｎ．Ｍ．，Ｈｕｄｍｏｎ，Ａ．，Ｂａｙｅｒ，Ｋ．Ｕ．，２０１１．ＣａＭＫＩＩ ｉｎ ｃｅｒｅｂｒａｌ ｉｓｃｈｅｍｉａ．Ａｃｔａ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｓｉｎ ３２，８６１－８７２．
Ｇｒｕｂｅｒ，Ｒ；Ｃａｇｎｉａｎｔ，Ｄ．，Ｃａｇｎｉａｎｔ，Ｐ．，１９８３．Ｈｙｄｒｏｃａｒｂｕｒｅｓ ａｒｙｌａｌｉｐｈａｔｉｑｕｅｓ．Ｐａｒｔｉｅ ＶＩＩ．Ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ ｄａｎｓ ｌａ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｄｅ ｂｒｏｍａｔｉｏｎ ｄｅ ｂｅｎｚｏｃｙｃｌｅｎｅｓ ｂｉ－ｅｔ ｔｒｉｃｙｃｌｉｑｕｅｓ ｓｕｐｅｒｉｅｕｒｓ．Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ｄｅ ｌａ Ｓｏｃｉｅｔｅ Ｃｈｉｍｉｑｕｅ ｄｅ Ｆｒａｎｃｅ，２，９６－１０４．
Ｋａｕｐｍａｎｎ，Ｋ．，Ｃｒｙａｎ，Ｊ．Ｆ．，Ｗｅｌｌｅｎｄｏｒｐｈ，Ｐ．，Ｍｏｍｂｅｒｅａｕ，Ｃ．，Ｓａｎｓｉｇ，Ｇ．，Ｋｌｅｂｓ，Ｋ．，Ｓｃｈｍｕｔｚ，Ｍ．，Ｆｒｏｅｓｔｌ，Ｗ．，ｖａｎ ｄｅｒ Ｐｕｔｔｅｎ，Ｈ．，Ｍｏｓｂａｃｈｅｒ，Ｊ．，Ｂｒａｕｎｅｒ－Ｏｓｂｏｒｎｅ，Ｈ．，Ｗａｌｄｍｅｉｅｒ，Ｐ．，Ｂｅｔｔｌｅｒ，Ｂ．，２００３．Ｓｐｅｃｉｆｉｃ γ－ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒａｔｅ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅｓ ｂｕｔ ｌｏｓｓ ｏｆ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ γ－ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒａｔｅ ｉｎ ＧＡＢＡＢ１－ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｍｉｃｅ．Ｅｕｒ Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ １８，２７２２－２７３０．
Ｋｌｅｉｎ，Ａ．Ｂ．，Ｂａｙ，Ｔ．，Ｖｉｌｌｕｍｓｅｎ，Ｉ．Ｓ．，Ｆａｌｋ－Ｐｅｔｅｒｓｅｎ，Ｃ．Ｂ．，Ｍａｒｅｋ，Ａ．，Ｆｒｏｌｕｎｄ，Ｂ．，Ｃｌａｕｓｅｎ，Ｒ．Ｐ．，Ｈａｎｓｅｎ，Ｈ．Ｄ．，Ｋｎｕｄｓｅｎ，Ｇ．Ｍ．，Ｗｅｌｌｅｎｄｏｒｐｈ，Ｐ．，２０１６．Ａｕｔｏｒａｄｉｏｇｒａｐｈｉｃ ｉｍａｇｉｎｇ ａｎｄ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｈｉｇｈ－ａｆｆｉｎｉｔｙ ＧＨＢ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅｓ ｉｎ ｒｏｄｅｎｔ ｂｒａｉｎ ｕｓｉｎｇ ３Ｈ－ＨＯＣＰＣＡ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ Ｉｎｔ １００，１３８－１４５．
Ｋｏｏｌ，Ｍ．Ｊ．，Ｖａｎ Ｄｅ Ｂｒｅｅ，Ｊ．Ｅ．，Ｂｏｄｄｅ，Ｈ．Ｅ．，Ｅｌｇｅｒｓｍａ，Ｙ．，Ｖａｎ Ｗｏｅｒｄｅｎ，Ｇ．Ｍ．，２０１６．Ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，ｔｅｍｐｏｒａｌ ａｎｄ ｒｅｇｉｏｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｂｅｔａ ｉｓｏｆｏｒｍ ｏｆ Ｃａｌｃｉｕｍ／Ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｔｙｐｅ ２（ＣＡＭＫ２Ｂ）ｉｎ ｍｏｕｓｅ ｌｏｃｏｍｏｔｉｏｎ．Ｓｃｉ Ｒｅｐ ６：２６９８９，１－１２．
Ｋｕｓｃｈｉｎｓｋｙ，Ｗ．，Ｓｕｄａ，Ｓ．，Ｓｏｋｏｌｏｆｆ，Ｌ．，１９８５．Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ｇａｍｍａ－ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒａｔｅ ｏｎ ｔｈｅ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｂｅｔｗｅｅｎ ｌｏｃａｌ ｃｅｒｅｂｒａｌ ｇｌｕｃｏｓｅ ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｌｏｃａｌ ｃｅｒｅｂｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｆｌｏｗ ｉｎ ｔｈｅ ｒａｔ ｂｒａｉｎ．Ｊ Ｃｅｒｅｂ Ｂｌｏｏｄ Ｆｌｏｗ Ｍｅｔａｂ ５，５８－６４．
Ｌｉｅ，Ｍ．Ｅ．Ｋ．，Ｊｏｈａｎｓｅｎ，Ｎ．Ｂ．，Ｇｏｗｉｎｇ Ｅ．Ｋ．，Ｄａｌｂｙ，Ｎ．Ｏ．，Ｔｈｉｅｓｅｎ，Ｌ．，Ｗｅｌｌｅｎｄｏｒｐｈ，Ｐ．，Ｃｌａｒｋｓｏｎ，Ａ．Ｎ．，Ｉｎ Ｐｒｅｓｓ．Ｔｈｅ ＧＡＴ３ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｌ－ｉｓｏｓｅｒｉｎｅ ｕｐｒｅｇｕｌａｔｅｓ ＧＡＴ３ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｃｒｅａｓｅｓ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ａｆｔｅｒ ａ ｆｏｃａｌ ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｓｔｒｏｋｅ ｉｎ ｍｉｃｅ．Ｊ Ｃｅｒｅｂ Ｂｌｏｏｄ Ｆｌｏｗ Ｍｅｔａｂ ｄｏｉ：１０．１１７７／０２７１６７８Ｘ１７７４４１２３．
Ｍｕｒｉｎｅｄｄｕ，Ｇ．，Ｒｕｉｕ，Ｓ．，Ｌｏｒｉｇａ，Ｇ．，Ｍａｎｃａ，Ｉ．，Ｌａｚｚａｒｉ，Ｐ．，Ｒｅａｌｉ，Ｒ．，Ｐａｎｉ，Ｌ．；Ｔｏｍａ，Ｌ．，Ｐｉｎｎａ，Ｇ．Ａ．，２００５．Ｔｒｉｃｙｃｌｉｃ ｐｙｒａｚｏｌｅｓ．３．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ，ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｏｄｅｌｉｎｇ ｏｆ ａｎａｌｏｇｕｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｃａｎｎａｂｉｎｏｉｄ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ ８－ｃｈｌｏｒｏ－１－（２’，４’－ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）－Ｎ－ｐｉｐｅｒｉｄｉｎ－１－ｙｌ－１，４，５，６－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｂｅｎｚｏ［６，７］ｃｙｃｌｏｈｅｐｔａ［１，２－ｃ］ｐｙｒａｚｏｌｅ－３－ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ．Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ ４８，７３５１－７３６２．
Ｔｈｉｅｓｅｎ，Ｌ．，Ｋｅｈｌｅｒ，Ｊ．，Ｃｌａｕｓｅｎ，Ｒ．Ｐ．，Ｆｒｏｌｕｎｄ，Ｂ．，Ｂｕｎｄｇａａｒｄ，Ｃ．，Ｗｅｌｌｅｎｄｏｒｐｈ，Ｐ．，２０１５．Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ａｃｔｉｖｅ ｂｒａｉｎ ｕｐｔａｋｅ ｏｆ ｔｈｅ ＧＨＢ ａｎａｌｏｇ ＨＯＣＰＣＡ ｂｙ ｔｈｅ ｍｏｎｏｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ ｓｕｂｔｙｐｅ １．Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ ３５４，１６６－１７４．
Ｖｅｓｔ，Ｒ．Ｓ．，Ｄａｖｉｅｓ，Ｋ．Ｄ．，Ｏ’Ｌｅａｒｙ，Ｈ．，Ｐｏｒｔ，Ｊ．Ｄ．，Ｂａｙｅｒ，Ｋ．Ｕ．，２００７．Ｄｕａｌ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ａ ｎａｔｕｒａｌ ＣａＭＫＩＩ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １８，５０２４－５０３３．
Ｖｏｇｅｎｓｅｎ，Ｓ．Ｂ．，Ｍａｒｅｋ，Ａ．，Ｂａｙ，Ｔ．，Ｗｅｌｌｅｎｄｏｒｐｈ，Ｐ．，Ｋｅｈｌｅｒ，Ｊ．，Ｂｕｎｄｇａａｒｄ，Ｃ．，Ｆｒｏｌｕｎｄ，Ｂ．，Ｐｅｄｅｒｓｅｎ，Ｍ．Ｈ．，Ｃｌａｕｓｅｎ，Ｒ．Ｐ．，２０１３．Ｎｅｗ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｔｒｉｔｉｕｍ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｏｆ ａ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｌｉｇａｎｄ ｆｏｒ ｓｔｕｄｙｉｎｇ ｈｉｇｈ－ａｆｆｉｎｉｔｙ γ－ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒａｔｅ（ＧＨＢ）ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅｓ．Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ．５６，８２０１－８２０５．
Ｗａｘｈａｍ，Ｍ．Ｎ．，Ｇｒｏｔｔａ，Ｊ．Ｃ．，Ｓｉｌｖａ，Ａ．Ｊ．，Ｓｔｒｏｎｇ，Ｒ．，Ａｒｏｎｏｗｓｋｉ，Ｊ．，１９９６．Ｉｓｃｈｅｍｉａ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｎｅｕｒｏｎａｌ ｄａｍａｇｅ：ａ ｒｏｌｅ ｆｏｒ ｃａｌｃｉｕｍ／ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ＩＩ．Ｊ Ｃｅｒｅｂ Ｂｌｏｏｄ Ｆｌｏｗ Ｍｅｔａｂ １６，１－６．
Ｗｅｌｌｅｎｄｏｒｐｈ，Ｐ．，Ｈｏｇ，Ｓ．，Ｇｒｅｅｎｗｏｏｄ，Ｊ．Ｒ．，ｄｅ Ｌｉｃｈｔｅｎｂｅｒｇ，Ａ．，Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｂ．，Ｆｒｏｌｕｎｄ，Ｂ．，Ｂｒｅｈｍ，Ｌ．，Ｃｌａｕｓｅｎ，Ｒ．Ｐ．，Ｂｒａｕｎｅｒ－Ｏｓｂｏｒｎｅ，Ｈ．，２００５．Ｎｏｖｅｌ ｃｙｃｌｉｃ γ－ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒａｔｅ（ＧＨＢ）ａｎａｌｏｇｓ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ ａｆｆｉｎｉｔｙ ａｎｄ ｓｔｅｒｅｏｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ ＧＨＢ ｓｉｔｅｓ ｉｎ ｒａｔ ｂｒａｉｎ．Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ ３１５，３４６－３５１
【0122】
（項目）
１．式Ｉ
の化合物であって、
式中、Ｒ１とＲ２が環系を形成して、
から選択される化合物を生じ、式中、ｎが、０または１であり；
Ｒ３が、Ｈ、－Ｍｅ、－Ｅｔ、－Ｐｒ、－ｉＰｒ、－Ｂｕ、－ｔＢｕ、－ベンジル、ポリエチレングリコリル（ＰＥＧ）、または
などの基から選択され、式中、Ｒ９が、－Ｍｅ、－Ｅｔ、－Ｐｒ、－ｉＰｒ、－Ｂｕ，－ｉＢｕ、または－ｔＢｕから選択され、Ｒ１０が、Ｈ、－Ｍｅ、－Ｅｔ、－ｉＰｒから選択され；
Ｒ４が、Ｈ、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｍｅ、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｅｔ、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｐｒ、－Ｃ（＝Ｏ）－ｉＰｒ、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｂｕ、－Ｃ（＝Ｏ）－ｔＢｕ、－Ｃ（＝Ｏ）－ベンジル、ポリエチレングリコリル（ＰＥＧ）、または
などの基から選択され、式中、Ｒ１１が、－Ｍｅ、－Ｅｔ、－Ｐｒ、－ｉＰｒ、－Ｂｕ、ｉＢｕ、または－ｔＢｕから選択され、Ｒ１２が、Ｈ、－Ｍｅ、－Ｅｔ、－ｉＰｒから選択され；
Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、およびＲ８が互いに独立に、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、アリール、直鎖または分岐鎖Ｃ１～８アルキル、－ＣＨ２（ＣＨ２）ｐ－アリール、－ＣＨ＝ＣＨ－アリール、ＮＨ２、ＮＯ２、ＯＨ、ＳＨ、直鎖または分岐鎖－Ｏ－Ｃ１～８アルキル、直鎖または分岐鎖－Ｓ－Ｃ１～８アルキル、直鎖または分岐鎖－ＮＨ－Ｃ１～８アルキル、－Ｏ－アリール、－Ｓ－アリール、－ＮＨ－アリールから選択され、アリールが、Ｏ、Ｎ、またはＳから選択される１つまたは複数のヘテロ原子を有するアリールを含み、ｐが、０または１であり；
ｍが、０または１であり；
Ｘが、Ｎ、Ｏ、Ｓ、ＣＨ２であり、
ただし、以下の：
の１つではない、
化合物またはその薬学的に許容される塩。
１．式Ｉ
【化27】
式中、Ｒ１とＲ２が環系を形成して、
【化28】
Ｒ３が、Ｈ、－Ｍｅ、－Ｅｔ、－Ｐｒ、－ｉＰｒ、－Ｂｕ、－ｔＢｕ、－ベンジル、ポリエチレングリコリル（ＰＥＧ）、または
【化29】
Ｒ４が、Ｈ、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｍｅ、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｅｔ、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｐｒ、－Ｃ（＝Ｏ）－ｉＰｒ、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｂｕ、－Ｃ（＝Ｏ）－ｔＢｕ、－Ｃ（＝Ｏ）－ベンジル、ポリエチレングリコリル（ＰＥＧ）、または
【化30】
Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、およびＲ８が互いに独立に、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、アリール、直鎖または分岐鎖Ｃ１～８アルキル、－ＣＨ２（ＣＨ２）ｐ－アリール、－ＣＨ＝ＣＨ－アリール、ＮＨ２、ＮＯ２、ＯＨ、ＳＨ、直鎖または分岐鎖－Ｏ－Ｃ１～８アルキル、直鎖または分岐鎖－Ｓ－Ｃ１～８アルキル、直鎖または分岐鎖－ＮＨ－Ｃ１～８アルキル、－Ｏ－アリール、－Ｓ－アリール、－ＮＨ－アリールから選択され、アリールが、Ｏ、Ｎ、またはＳから選択される１つまたは複数のヘテロ原子を有するアリールを含み、ｐが、０または１であり；
ｍが、０または１であり；
Ｘが、Ｎ、Ｏ、Ｓ、ＣＨ２であり、
ただし、以下の：
【化31】
化合物またはその薬学的に許容される塩。
【0123】
２．式ＩＩまたはＩＩＩを有し、ｎが０である、項目１に記載の化合物。
【0124】
３．式ＩＶを有し、ｎが１である、項目１に記載の化合物。
【0125】
４．Ｒ３およびＲ４の一方がＨである、項目１～３のいずれかに記載の化合物。
【0126】
５．Ｒ３およびＲ４がともにＨである、項目１～４のいずれかに記載の化合物。
【0127】
６．式ＩＩＩを有し、Ｒ５がＨであり、Ｒ６が２位にある、項目１～５のいずれかに記載の化合物。
【0128】
７．ＩＩＩを有し、Ｒ５がＨであり、Ｒ６が、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、アリール、直鎖もしくは分岐鎖Ｃ１～８アルキル、－ＣＨ２（ＣＨ２）ｐ－アリール、または－ＣＨ＝ＣＨ－アリールから選択される、項目１～６のいずれかに記載の化合物。
【0129】
８．式ＩＩＩを有し、Ｒ５がＨであり、Ｒ６が、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｐｈ、または－ＣＨ＝ＣＨ－アリールから選択される、項目１～７のいずれかに記載の化合物。
【0130】
９．式ＩＩＩを有し、Ｒ５がＨであり、Ｒ６が、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｐｈ、または－ＣＨ＝ＣＨ－フェニルから選択される、項目１～８のいずれかに記載の化合物。
【0131】
１０．Ｒ３が、
から選択されるか、またはＲ４が、
から選択される、項目１～４、５～９のいずれかに記載の化合物。
【化32】
【化33】
【0132】
１１．Ｒ３が
である、項目１～４、５～１０に記載の化合物。
【化34】
【0133】
１２．式ＩＩを有し、Ｒ４がＨであり、Ｒ３が
である、項目１～４、１０のいずれかに記載の化合物。
【化35】
【0134】
１３．以下の構造
の１つを有する、項目１～１２のいずれかに記載の化合物。
【化36】
【0135】
１４．医薬での使用のための項目１～１３のいずれかに記載の化合物。
【0136】
１５．本明細書で定義される急性脳損傷の治療での使用のための項目１～１４のいずれかに記載の化合物。
【0137】
１６．本明細書で定義される急性脳損傷の治療のための薬剤の製造のための項目１～１３のいずれかに記載の化合物。
【0138】
１７．急性脳損傷のある対象を治療するための方法であって、上記治療が、上記対象に項目１～１３のいずれかで定められる化合物の有効量を投与することを含む、方法。
【0139】
１８．急性脳損傷の治療での使用のための式Ｉ
による化合物であって、式中、
Ｒ１とＲ２が環系を形成して、
から選択される化合物を生じ、式中、ｎが、０または１であり；
Ｒ３が、Ｈ、－Ｍｅ、－Ｅｔ、－Ｐｒ、－ｉＰｒ、－Ｂｕ、－ｔＢｕ、－ベンジル、ポリエチレングリコリル（ＰＥＧ）、または
などの基から選択され、式中、Ｒ９が、－Ｍｅ、－Ｅｔ、－Ｐｒ、－ｉＰｒ、－Ｂｕ、または－ｔＢｕから選択され、Ｒ１０が、Ｈ、－Ｍｅ、－Ｅｔ、－ｉＰｒから選択され；
Ｒ４が、Ｈ、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｍｅ、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｅｔ、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｐｒ、－Ｃ（＝Ｏ）－ｉＰｒ、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｂｕ、－Ｃ（＝Ｏ）－ｔＢｕ、－Ｃ（＝Ｏ）－ベンジル、ポリエチレングリコリル（ＰＥＧ）、または
などの基から選択され、式中、Ｒ１１が、－Ｍｅ、－Ｅｔ、－Ｐｒ、－ｉＰｒ、－Ｂｕ、または－ｔＢｕから選択され、Ｒ１２が、Ｈ、－Ｍｅ、－Ｅｔ、－ｉＰｒから選択され；
Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、およびＲ８が互いに独立に、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、アリール、直鎖または分岐鎖Ｃ１～８アルキル、－ＣＨ２（ＣＨ２）ｐ－アリール、－ＣＨ＝ＣＨ－アリール、ＮＨ２、ＮＯ２、ＯＨ、ＳＨ、直鎖または分岐鎖－Ｏ－Ｃ１～８アルキル、直鎖または分岐鎖－Ｓ－Ｃ１～８アルキル、直鎖または分岐鎖－ＮＨ－Ｃ１～８アルキル、－Ｏ－アリール、－Ｓ－アリール、－ＮＨ－アリールから選択され、アリールが、Ｏ、Ｎ、またはＳから選択される１つまたは複数のヘテロ原子を有するアリールを含み、ｐが、０または１であり；
ｍが、０または１であり；
Ｘが、Ｎ、Ｏ、Ｓ、ＣＨ２である、
化合物またはその薬学的に許容される塩。
【化37】
Ｒ１とＲ２が環系を形成して、
【化38】
Ｒ３が、Ｈ、－Ｍｅ、－Ｅｔ、－Ｐｒ、－ｉＰｒ、－Ｂｕ、－ｔＢｕ、－ベンジル、ポリエチレングリコリル（ＰＥＧ）、または
【化39】
Ｒ４が、Ｈ、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｍｅ、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｅｔ、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｐｒ、－Ｃ（＝Ｏ）－ｉＰｒ、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｂｕ、－Ｃ（＝Ｏ）－ｔＢｕ、－Ｃ（＝Ｏ）－ベンジル、ポリエチレングリコリル（ＰＥＧ）、または
【化40】
Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、およびＲ８が互いに独立に、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、アリール、直鎖または分岐鎖Ｃ１～８アルキル、－ＣＨ２（ＣＨ２）ｐ－アリール、－ＣＨ＝ＣＨ－アリール、ＮＨ２、ＮＯ２、ＯＨ、ＳＨ、直鎖または分岐鎖－Ｏ－Ｃ１～８アルキル、直鎖または分岐鎖－Ｓ－Ｃ１～８アルキル、直鎖または分岐鎖－ＮＨ－Ｃ１～８アルキル、－Ｏ－アリール、－Ｓ－アリール、－ＮＨ－アリールから選択され、アリールが、Ｏ、Ｎ、またはＳから選択される１つまたは複数のヘテロ原子を有するアリールを含み、ｐが、０または１であり；
ｍが、０または１であり；
Ｘが、Ｎ、Ｏ、Ｓ、ＣＨ２である、
化合物またはその薬学的に許容される塩。
【0140】
１９．
から選択される、項目１８に記載の使用のための化合物。
【化41】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【配列表】