(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-05-14
(45)【発行日】2024-05-22
(54)【発明の名称】薬剤耐性細菌又は炎症惹起性細菌に対する抗菌組成物
(51)【国際特許分類】
A61K 35/741 20150101AFI20240515BHJP
A61P 31/04 20060101ALI20240515BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20240515BHJP
【ＦＩ】
A61K35/741 ZNA
A61P31/04
A61P29/00
【請求項の数】
3
(21)【出願番号】P 2021503646
(86)(22)【出願日】2020-03-05
(86)【国際出願番号】 JP2020009423
(87)【国際公開番号】W WO2020179868
(87)【国際公開日】2020-09-10
【審査請求日】2023-03-01
(31)【優先権主張番号】62/815,101
(32)【優先日】2019-03-07
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成３０年度、国立研究開発法人日本医療研究開発機構、「革新的先端研究開発支援事業インキュベートタイプ」「腸内細菌株カクテルを用いた新規医薬品の創出」委託研究開発、産業技術力強化法第１７条の適用を受ける特許出願
【微生物の受託番号】NITE NITE BP-03147
【微生物の受託番号】NITE NITE BP-03148
【微生物の受託番号】NITE NITE BP-03149
【微生物の受託番号】NITE NITE BP-03150
【微生物の受託番号】NITE NITE BP-03151
【微生物の受託番号】NITE NITE BP-03152
【微生物の受託番号】NITE NITE BP-03153
【微生物の受託番号】NITE NITE BP-03154
【微生物の受託番号】NITE NITE BP-03155
【微生物の受託番号】NITE NITE BP-03156
【微生物の受託番号】NITE NITE BP-03157
【微生物の受託番号】NITE NITE BP-03158
【微生物の受託番号】NITE NITE BP-03159
【微生物の受託番号】NITE NITE BP-03160
【微生物の受託番号】NITE NITE BP-03161
【微生物の受託番号】NITE NITE BP-03162
【微生物の受託番号】NITE NITE BP-03163
【微生物の受託番号】NITE NITE BP-03164
(73)【特許権者】
【識別番号】598121341
【氏名又は名称】慶應義塾
(74)【代理人】
【識別番号】110001047
【氏名又は名称】弁理士法人セントクレスト国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】本田 賢也
(72)【発明者】
【氏名】安間 恵子
(72)【発明者】
【氏名】新 幸二
(72)【発明者】
【氏名】成島 聖子
(72)【発明者】
【氏名】古市 宗弘
(72)【発明者】
【氏名】河口 貴昭
【審査官】長部 喜幸
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１９／０１７３８９（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特開２０１１－２００２１１（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１４－５０１１００（ＪＰ，Ａ）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ ３５／７４１
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
腸内細菌を有効成分として含有する、薬剤耐性細菌又は炎症惹起性細菌に対する抗菌組成物であって、前記腸内細菌が、配列番号：１０５、６９、８０、８５～９２、９４、９６、９８～１０１及び１０３のうちのいずれかに記載の塩基配列又は当該塩基配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡを各々有する１８種の腸内細菌の組み合わせである、抗菌組成物。
【請求項2】
医薬組成物である、請求項１に記載の抗菌組成物。
【請求項3】
感染症又は炎症性疾患を治療、改善又は予防するための医薬組成物である、請求項１に記載の抗菌組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、薬剤耐性細菌又は炎症惹起性細菌に対する抗菌組成物に関する。また、本発明は、薬剤耐性細菌又は炎症惹起性細菌に起因する疾患を治療、改善又は予防等するための、医薬組成物又は方法に関する。
【背景技術】
【0002】
消化管や口腔等の粘膜には多様な常在細菌が存在し、全体としてフローラを形成している。常在菌フローラは、宿主の生理や健康維持に対して非常に大きな役割を果たしている。常在菌フローラの構成異常はＤｙｓｂｉｏｓｉｓとよばれ、様々な疾患の原因となっていることが徐々に明らかになってきている。粘膜常在菌フローラの解明が進めば、様々な疾患に対する新たな疾病対策・治療開発に結びつく可能性が高いものの、その複雑さから詳細なメカニズムは十分明らかになっていない。
【0003】
ヒトは毎日１．５Ｌほどの唾液を作り出し、飲み込んでいる。通常、唾液に含まれる菌は（口腔内細菌）、腸管をただ単に通過するだけで、定着しない。しかし、ある状況では口腔内細菌が腸管に定着することがある。特にクローン病や、肝硬変、大腸がんにおいて、疾患発症の早期から、口腔内細菌の腸管定着が観察されることが報告されている。そして、定着した口腔内細菌が、疾患の病態に影響を与えることが知られている（非特許文献１～６）。
【0004】
また、本発明者らは、クローン病等の患者の口腔内細菌から、腸管に定着し、Ｔｈ１細胞を誘導することによって、当該疾患の発症に関与する菌を、単離培養し、同定することに成功している（特許文献１）。より具体的には、本発明者らは、あるクローン病患者由来唾液を無菌マウスに経口投与した結果、大腸においてインターフェロンガンマ（ＩＦＮ－γ）産生性ＣＤ４陽性Ｔ細胞（Ｔｈ１細胞）が著増することを、見出している。そして、このＴｈ１細胞の増加が見られたマウスの腸内から、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに属すると考えられるＫｐ２Ｈ７株を単離培養することに成功している。さらに、クローン病患者の唾液由来の当該菌が、腸管に定着し、Ｔｈ１細胞の増殖又は活性化を誘導することによって、腸炎の発症に関与していることも、明らかにしている。
【0005】
さらに、本発明者らは、Ｋｐ２Ｈ７株を、ＳＰＦ（ｓｐｅｃｉｆｉｃ－ｐａｔｈｏｇｅｎ－ｆｒｅｅ）マウスに経口投与した場合、前記無菌マウスの場合と異なり、これら細菌株の腸内定着が認められないということを見出した。さらに、ＳＰＦマウスに抗生物質を投与することによって、これら細菌株が、当該マウスの腸管に定着できる場合があることも明らかにした。そして、このような結果から、腸管には、Ｋｐ２Ｈ７株等のＴｈ１細胞誘導性細菌の腸内定着を阻害する腸内細菌が存在しており、前記抗生物質投与によって、前記腸内細菌が腸管内から排除されることにより、当該細菌の腸内定着が可能となるということを、本発明者らは想定した。
【0006】
そこで、ヒト腸内細菌において、Ｔｈ１細胞誘導性細菌の腸内定着を抑制する細菌の同定を試みた。その結果、３人の健常人（＃Ｋ、＃Ｆ及び＃Ｉ）由来の糞便試料から、各々６８株、３７株及び４２株の腸内細菌株を単離培養し、また各菌株の１６ＳｒＤＮＡの配列を決定することに成功した。さらに、これら細菌株投与によって、Ｔｈ１細胞誘導性細菌の腸内定着が抑制されることを明らかにしている（特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0007】
【文献】国際公開２０１８／０８４１７２
【文献】国際公開２０１９／０１７３８９
【非特許文献】
【0008】
【文献】Ｙ．Ｃｈｅｎｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ｒｅｐｏｒｔｓ ６，３４０５５（２０１６）
【文献】Ｄ．Ｇｅｖｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ｈｏｓｔ＆ｍｉｃｒｏｂｅ １５，３８２－３９２（２０１４）
【文献】Ｃ．Ａ．Ｌｏｚｕｐｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ｈｏｓｔ＆ｍｉｃｒｏｂｅ １４，３２９－３３９（２０１３）
【文献】Ｉ．Ｖｕｊｋｏｖｉｃ－Ｃｖｉｊｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ５，１９３ｒａ１９１（２０１３）
【文献】Ｎ．Ｑｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ５１３，５９－６４（２０１４）
【文献】Ｃ．Ｌ．Ｓｅａｒｓ，Ｗ．Ｓ．Ｇａｒｒｅｔｔ，Ｃｅｌｌ ｈｏｓｔ＆ｍｉｃｒｏｂｅ １５，３１７－３２８（２０１４）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0009】
本発明において、薬剤耐性細菌又は炎症惹起性細菌に対して抗菌活性を有する腸内細菌を見出し、当該腸内細菌を有効成分とする、薬剤耐性細菌又は炎症惹起性細菌に対する抗菌組成物、薬剤耐性細菌又は炎症惹起性細菌に起因する疾患を治療、改善又は予防等するための、医薬組成物又は方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0010】
本発明者らは、前記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、前述のＴｈ１細胞誘導性細菌の腸内定着を抑制する細菌（健常人＃Ｋ由来の腸内細菌６８株、健常人＃Ｆ由来の腸内細菌３７株、健常人＃Ｉ由来の腸内細菌４２株）は、多剤耐性細菌（カルバぺネム耐性腸内細菌科細菌、バンコマイシン耐性腸球菌、クロストリジウム ディフィシル、カンピロバクター ジェジュニ）及び炎症惹起性細菌（接着侵入性大腸菌）の腸内定着を抑制できることを明らかにした。
【0011】
さらに、このような腸内における細菌定着抑制能に関し、健常人＃Ｆ由来の腸内細菌３７株と同程度のそれを発揮し得る１８株を、当該３７株から選抜することに成功し、本発明を完成するに至った。
【0012】
すなわち、本発明は以下を提供するものである。
〔１〕 腸内細菌を有効成分として含有する、薬剤耐性細菌又は炎症惹起性細菌に対する抗菌組成物。
〔２〕 前記腸内細菌が、配列番号：６９～１０５のうちのいずれかに記載の塩基配列又は当該塩基配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡを有する、少なくとも１の細菌である、〔１〕に記載の抗菌組成物。
〔３〕 前記腸内細菌が、配列番号：６９、８０、８５～９２、９４、９６、９８～１０１、１０３及び１０５のうちのいずれかに記載の塩基配列又は当該塩基配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡを有する、少なくとも１の細菌である、〔１〕に記載の抗菌組成物。
〔４〕 前記腸内細菌が、受託番号 ＮＩＴＥ ＢＰ－０３１４７～０３１６４のうちのいずれかにて特定される、少なくとも１の細菌である、〔１〕に記載の抗菌組成物。
〔５〕 前記腸内細菌が、配列番号：１～１４７のうちのいずれかに記載の塩基配列又は当該塩基配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡを有する、少なくとも１の細菌である、〔１〕に記載の抗菌組成物。
〔６〕 前記腸内細菌が、配列番号：１～６８のうちのいずれかに記載の塩基配列又は当該塩基配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡを有する、少なくとも１の細菌である、〔１〕に記載の抗菌組成物。
〔７〕 前記腸内細菌が、配列番号：１０６～１４７のうちのいずれかに記載の塩基配列又は当該塩基配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡを有する、少なくとも１の細菌である、〔１〕に記載の抗菌組成物。
〔８〕 医薬組成物である、〔１〕～〔７〕のうちのいずれか一項に記載の抗菌組成物。
〔９〕 感染症又は炎症性疾患を治療、改善又は予防するための医薬組成物である、〔１〕～〔７〕のうちのいずれか一項に記載の抗菌組成物。
〔１〕 腸内細菌を有効成分として含有する、薬剤耐性細菌又は炎症惹起性細菌に対する抗菌組成物。
〔２〕 前記腸内細菌が、配列番号：６９～１０５のうちのいずれかに記載の塩基配列又は当該塩基配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡを有する、少なくとも１の細菌である、〔１〕に記載の抗菌組成物。
〔３〕 前記腸内細菌が、配列番号：６９、８０、８５～９２、９４、９６、９８～１０１、１０３及び１０５のうちのいずれかに記載の塩基配列又は当該塩基配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡを有する、少なくとも１の細菌である、〔１〕に記載の抗菌組成物。
〔４〕 前記腸内細菌が、受託番号 ＮＩＴＥ ＢＰ－０３１４７～０３１６４のうちのいずれかにて特定される、少なくとも１の細菌である、〔１〕に記載の抗菌組成物。
〔５〕 前記腸内細菌が、配列番号：１～１４７のうちのいずれかに記載の塩基配列又は当該塩基配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡを有する、少なくとも１の細菌である、〔１〕に記載の抗菌組成物。
〔６〕 前記腸内細菌が、配列番号：１～６８のうちのいずれかに記載の塩基配列又は当該塩基配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡを有する、少なくとも１の細菌である、〔１〕に記載の抗菌組成物。
〔７〕 前記腸内細菌が、配列番号：１０６～１４７のうちのいずれかに記載の塩基配列又は当該塩基配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡを有する、少なくとも１の細菌である、〔１〕に記載の抗菌組成物。
〔８〕 医薬組成物である、〔１〕～〔７〕のうちのいずれか一項に記載の抗菌組成物。
〔９〕 感染症又は炎症性疾患を治療、改善又は予防するための医薬組成物である、〔１〕～〔７〕のうちのいずれか一項に記載の抗菌組成物。
【発明の効果】
【0013】
本発明によれば、薬剤耐性細菌又は炎症惹起性細菌の腸管への定着等を抑制することによって、これら細菌の増殖又は活性化の抑制が可能となり、ひいては、これら細菌に起因する疾患を治療、改善又は予防することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【0014】
【図1】無菌マウスにクレブシエラ２Ｈ７株（Ｋｐ２Ｈ７）を投与し、その１週間後に健常人の便サンプルをマウスに投与（ＦＭＴ）した時の、便中クレブシエラの菌量の継時的変化をＣＦＵにて示したグラフである。５種類の便を使用したがいずれのサンプルでもクレブシエラは著明に減少した。
【図2】ドナー健常者 Ｆ、Ｉ、Ｋ由来の３種類の便の１６Ｓメタ解析の結果を示した棒グラフである。一つ一つのマスが１菌株を示し、その大きさは全体の菌量に占めるその菌の割合を示している。３種類の便を嫌気環境下で培養したが、そこで培養し単離できた株を隣のグラフの（カラー表示下）黄色にて示した。下に単離できた菌の総数を示した。
【図3】無菌マウスにＫｐ２Ｈ７を定着させた後、便から単離した菌株をそれぞれ混合して投与したときの、Ｋｐ２Ｈ７の便中菌量の継時的変化をＣＦＵにて示したグラフである。ドナー健常者 Ｆ由来の便（Ｆ便）由来の３７株が便サンプルと同等にクレブシエラを減少させた。
【図4】無菌マウスにＫｐ２Ｈ７を定着させた後、便から単離した菌株をそれぞれ混合して投与したときの、Ｋｐ２Ｈ７の便中菌量の継時的変化をＣＦＵで示したグラフである。Ｆ便由来の３７株が便サンプルとドナー健常者 Ｋ由来の便（Ｋ便）から単離した６８菌株は同等にクレブシエラを減少させた。
【図5】無菌マウスにＫｐ２Ｈ７を投与した後、１週間後にＦ３７ｍｉｘ（Ｆ便由来の３７菌株）を投与し、さらに１ヶ月後にアンピシリンを飲水投与したときのＫｐ２Ｈ７の便中菌量の継時的変化をＣＦＵにて示したグラフである。アンピシリン投与により、クレブシエラは一過性に増加したが、その後再度低下した。
【図6A】図５に示した実験における、各菌量（Ｆ３１、Ｆ２２、Ｆ２０、Ｆ３２）の全菌量における存在比率の継時的変化を示した図である。図の下には各菌の番号、ｒ（クレブシエラとのスピアマンの順位相関係数）及び菌名を示した。
【図6B】図５に示した実験における、各菌量（Ｆ２６、Ｆ２８、Ｆ２１、Ｆ３０）の全菌量における存在比率の継時的変化を示した図である。図の下には各菌の番号、ｒ（クレブシエラとのスピアマンの順位相関係数）及び菌名を示した。
【図6C】図５に示した実験における、各菌量（Ｆ２４、Ｆ２３／Ｆ２５、Ｆ３５／Ｆ３６、Ｆ０９）の全菌量における存在比率の継時的変化を示した図である。図の下には各菌の番号、ｒ（クレブシエラとのスピアマンの順位相関係数）及び菌名を示した。
【図6D】図５に示した実験における、各菌量（Ｆ３３、Ｆ１２、Ｆ１７／Ｆ１９、Ｆ１８）の全菌量における存在比率の継時的変化を示した図である。図の下には各菌の番号、ｒ（クレブシエラとのスピアマンの順位相関係数）及び菌名を示した。
【図6E】図５に示した実験における、各菌量（Ｆ３４、Ｆ０３／Ｆ０８、Ｆ２９、Ｆ１３）の全菌量における存在比率の継時的変化を示した図である。図の下には各菌の番号、ｒ（クレブシエラとのスピアマンの順位相関係数）及び菌名を示した。
【図6F】図５に示した実験における、各菌量（Ｆ０４／Ｆ０８、Ｆ３７、Ｆ０１、Ｆ０２）の全菌量における存在比率の継時的変化を示した図である。図の下には各菌の番号、ｒ（クレブシエラとのスピアマンの順位相関係数）及び菌名を示した。
【図6G】図５に示した実験における、各菌量（Ｆ０５、Ｆ０７、Ｆ１４）の全菌量における存在比率の継時的変化を示した図である。図の下には各菌の番号、ｒ（クレブシエラとのスピアマンの順位相関係数）及び菌名を示した。
【図6H】図５に示した実験における、各菌量（Ｆ１０／Ｆ１５、Ｆ１６、Ｆ１１／Ｆ２７）の全菌量における存在比率の継時的変化を示した図である。図の下には各菌の番号、ｒ（クレブシエラとのスピアマンの順位相関係数）及び菌名を示した。
【図7】Ｋｐ２Ｈ７と各菌の菌量におけるスピアマンの順位相関係数の正に相関のある順番に菌を並べた図である。ＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓにおいてはＫｐ２Ｈ７と関係のない動きをしているものが多く、負の相関をしているものはＦｕｒｍｉｃｕｔｅｓ属が多い。
【図8】無菌マウスにＫｐ２Ｈ７を投与して定着させた後に、図７に示す３７株（Ｆ３７ｍｉｘ）、その３７株のうちＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓに属する８株（Ｆ８ｍｉｘ）、又はそれ以外の２９菌株（Ｆ２９ｍｉｘ）を各々混合して投与した時の、便中Ｋｐ２Ｈ７の菌量の継時的変化をＣＦＵにて示したグラフである。Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓを除いた２９株も３７株とほぼ同等のクレブシエラの減少を認め、クレブシエラの排除にＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓが不要であると考えらえる。
【図9】図８に示す実験にて用いたＦ３７ｍｉｘ、Ｆ８ｍｉｘ及びＦ２９ｍｉｘの内訳を示す、系統樹である。系統樹は、単離菌のサンガー法による１６ＳｒＤＮＡ解析結果のＤＮＡ塩基配列をＭＥＧＡ Ｘを用い、Ｎｅｉｇｈｂｏｒ－ｊｏｉｎｉｎｇ法にて作成した。系統樹の作成については、図１０及び１２においても同様である。
【図10】Ｆ便由来の１８菌株（Ｆ１８ｍｉｘ）の内訳を示す、系統樹である。
【図11】無菌マウスにＫｐ２Ｈ７を定着させた後、Ｆ便由来の３７菌株（前記Ｆ３７ｍｉｘ）、Ｆ便由来の１８菌株（図１０に示すＦ１８ｍｉｘ）、又は健常者I由来の便（Ｉ便）由来の４２菌株を各々混合して投与したときの、Ｋｐ２Ｈ７の便中菌量の継時的変化をＣＦＵにて示したグラフである．Ｆ１８ｍｉｘでもＦ３７ｍｉｘと同等にクレブシエラを排除できている。
【図12】Ｆ便由来の１８菌株（Ｆ１８ｍｉｘ）を４グループに分類し、それらの内訳を示す、系統樹である。これらの４つのグループを１８菌株（Ｆ１８ｍｉｘ）から引いてＦ１５ｍｉｘ（Ｆ１８ｍｉｘ－ｏｔｈｅｒ ｐｈｙｌａ）、Ｆ１２ｍｉｘ（Ｆ１８ｍｉｘ－Ｌａｃｈｎｏｃｌｏｓｔｉｒｉｄｕｍ）、Ｆ１４ｍｉｘ（Ｆ１８ｍｉｘ－Ｂｌａｕｔｉａ）、Ｆ１３ｍｉｘ（Ｆ１８ｍｉｘ－ｏｔｈｅｒ Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）の菌株グループを調製し、図１１に示す実験に供した。
【図13】無菌マウスにＫｐ２Ｈ７を定着させた後、Ｆ３７ｍｉｘから重複している株及びＦ１８ｍｉｘを除いた群（Ｆ３１－１８ｍｉｘ）、前記Ｆ１５ｍｉｘ、前記Ｆ１２ｍｉｘ、前記Ｆ１４ｍｉｘ、前記Ｆ１３ｍｉｘ、又は前記Ｆ１８ｍｉｘを各々混合して投与したときの、Ｋｐ２Ｈ７の便中菌量の継時的変化をＣＦＵにて示したグラフである。なお、図１３には２回行った実験データを合わせて示している。Ｆ１８ｍｉｘから図１２に示したどの群を除いても、クレブシエラ排除能は低下し、どの群もクレブシエラの排除に重要であることが明らかになった。
【図14】図１３に示した実験において、ｄａｙ２８の時点での各群における便中Ｋｐ２Ｈ７のＣＦＵを示す、グラフである。Ｆ１８ｍｉｘ投与群は、Ｆ３７ｍｉｘ以外の他の投与群よりも、統計学的に有意にクレブシエラの菌量が少ない。
【図15】Ｆ３７ｍｉｘ投与群、Ｆ１８ｍｉｘ投与群、又はＫｐ２Ｈ７単独投与群の、マウス大腸粘膜固有層における免疫細胞を、フローサイトメトリーにて解析した結果を示す、ドットプロット図である。図中の各ゲート（四角）の中の数値は、ＣＤ４＋ＩＦＮγ＋細胞の割合を示している。Ｋｐ２Ｈ７単独投与群に比べて、Ｆ３７ｍｉｘ投与群及びＦ１８ｍｉｘ投与群ではＣＤ４＋ＩＦＮγ＋細胞の誘導が抑制されている。
【図16】無菌マウスにＫｐ２Ｈ７を投与し、１週間後に各菌株ｍｉｘを投与した時のＫｐ２Ｈ７の便中菌量の継時的変化をＣＦＵで示したグラフである。図中の「Ｆ１５ｍｉｘ」は、Ｆ１８ｍｉｘからＥ．ｃｏｌｉ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、及びＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの３株を除いて投与したマウスの結果を示し、「Ｆ１８ｍｉｘ－Ｅ．ｃｏｌｉ」、「Ｆ１８ｍｉｘ－Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ」及び「Ｆ１８ｍｉｘ－Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ」は、前記３株のうち各１株ずつＦ１８ｍｉｘから除いて投与したマウスの結果を各々示す。これら３株はいずれもＦ１８ｍｉｘから除くとその効果は減弱し、それぞれがクレブシエラの排除に関わっていることが示された。
【図17】無菌のＲａｇ２－／－γｃ－／－マウス、ＭｙＤ８８－／－Ｔｒｉｆｆ－／－マウス、又は野生型マウス（ＷＴ）にＫｐ２Ｈ７を投与し、１週間後に混合したＦ３７ｍｉｘを投与した時のＫｐ２Ｈ７の便中菌量の継時的変化をＣＦＵで示したグラフである。どのタイプのマウスでもクレブシエラを同等に排除することができた。このことから、宿主の主要な自然免疫、獲得免疫はクレブシエラの排除に関与していないことが示唆された。
【図18】無菌マウスにクレブシエラ（Ｋｐ－ＣＲＥ）を投与し、その１週間後に単離菌ｍｉｘ（Ｆ３７ｍｉｘ、Ｋ６８ｍｉｘ、Ｉ４２ｍｉｘ）をマウスに投与した時の、便中ＣＲＥ菌量の継時的変化をＣＦＵにて示したグラフである。Ｆ３７ｍｉｘ、Ｋ６８ｍｉｘはＣＲＥも減少させることができる。
【図20】無菌マウスにＶＲＥ（バンコマイシン耐性腸球菌）を投与し、その１週間後に単離菌ｍｉｘ（Ｆ３７ｍｉｘ、Ｋ６８ｍｉｘ、Ｉ４２ｍｉｘ）をマウスに投与した時の、便中ＶＲＥ菌量の継時的変化をＣＦＵにて示したグラフである。ＶＲＥに対してはＦ３７ｍｉｘよりもＫ６８ｍｉｘの方が菌量を低下させることができた。
【図22】無菌マウスにＡＩＥＣを投与し、その１週間後に単離菌ｍｉｘ（Ｆ３７ｍｉｘ、Ｋ６８ｍｉｘ、Ｉ４２ｍｉｘ）をマウスに投与した時の、便中ＡＩＥＣ菌量の継時的変化をＣＦＵにて示したグラフである。ＡＩＥＣに対しては、Ｆ３７ｍｉｘが最も効果的に菌量を減らせた。
【図23】無菌マウスにＥＳＢＬ産生クレブシエラを投与し、その１週間後に単離菌ｍｉｘ（Ｆ３７ｍｉｘ、Ｋ６８ｍｉｘ、Ｉ４２ｍｉｘ）をマウスに投与した時の、便中ＥＳＢＬ産生クレブシエラ菌量の継時的変化をＣＦＵにて示したグラフである。Ｆ３７ｍｉｘ、Ｋ６８ｍｉｘは、Ｆ由来の糞便同等に、ＥＳＢＬ産生クレブシエラを排除することができた。
【図24】無菌マウスにＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉを投与し、その１週間後に単離菌ｍｉｘ（Ｆ３７ｍｉｘ、Ｋ６８ｍｉｘ、Ｉ４２ｍｉｘ）又は健常人Ｆ由来の糞便試料をマウスに投与した時の、便中Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ菌量の継時的変化をＣＦＵでにて示したグラフである。いずれの単離菌ｍｉｘ投与群においても同程度に、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉの排除が認められた。
【図25】無菌マウスにＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉを投与し、その１週間後に単離菌ｍｉｘ（Ｆ３７ｍｉｘ、Ｋ６８ｍｉｘ、Ｉ４２ｍｉｘ）又は健常人Ｆ由来の糞便試料をマウスに投与した時の、便中Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒの菌量の継時的変化を全菌量で割った相対値にて示したグラフである。いずれの単離菌ｍｉｘ投与群においても同程度に、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉの排除が認められた。
【図26】無菌マウスにＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅを投与し、その１週間後に単離菌ｍｉｘ（Ｆ３７ｍｉｘ、Ｋ６８ｍｉｘ、Ｉ４２ｍｉｘ、Ｋ４７ｍｉｘ）又は健常人Ｆ由来の糞便試料をマウスに投与した時の、便中Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの菌量の継時的変化を、ｑＰＣＲにて解析した結果を示す、グラフである。Ｋ６８ｍｉｘ、Ｋ４７ｍｉｘは、Ｆ由来の糞便よりもＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅを排除することができたが、Ｆ３７ｍｉｘの排除効果は低かった。
【発明を実施するための形態】
【0015】
＜腸内細菌＞
本発明において、抗菌組成物の有効成分として含まれる腸内細菌は、腸管内で、薬剤耐性細菌又は炎症惹起性細菌（以下「薬剤耐性細菌等」とも称する）に対して抗菌作用を有する。
本発明において、抗菌組成物の有効成分として含まれる腸内細菌は、腸管内で、薬剤耐性細菌又は炎症惹起性細菌（以下「薬剤耐性細菌等」とも称する）に対して抗菌作用を有する。
【0016】
本発明において、「抗菌活性」とは、細菌の活動を抑制する活性、より具体的には、細菌の増殖若しくは定着を抑制し、又は細菌を死滅させる活性を意味し、例えば、腸内における細菌の定着を抑制する活性、腸内から細菌を排除する活性が挙げられる。
【0017】
「腸内細菌」とは、動物の腸管内に存在する細菌を意味する。また、かかる細菌が存在する動物としては、ヒト、非ヒト動物（マウス、ラット、サル、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、カモ、ダチョウ、アヒル、イヌ、ネコ、ウサギ、ハムスター等）が挙げられるが、これら動物の中では、ヒトが好ましい。
【0018】
本発明において「腸内細菌」は、１株の細菌であってもよく、複数株の細菌から構成される細菌株の混合物であってもよい。なお、複数株の細菌から構成される場合には、そのうちの少なくとも１の細菌株が薬剤耐性細菌等に対する抗菌活性を有していることが望ましい。また、そのような場合、前記複数株の細菌には、前記抗菌活性を有していない細菌株であっても、前記抗菌活性を有している細菌株の当該活性を増強する作用を有する細菌株、前記抗菌活性を有している細菌株の増殖又は定着を維持する作用を有する細菌株、前記抗菌活性を阻害する細菌に対して当該阻害活性を抑制する作用を有する細菌株が含まれていてもよい。
【0019】
本発明において「腸内細菌」としては、例えば、配列番号：１～１４７のうちのいずれかに記載の塩基配列若しくは当該塩基配列に対して少なくとも７０％の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡを有する、少なくとも１の細菌、配列番号：１～６８のうちのいずれかに記載の塩基配列若しくは当該塩基配列に対して少なくとも７０％の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡを有する、少なくとも１の細菌、配列番号：６９～１０５のうちのいずれかに記載の塩基配列若しくは当該塩基配列に対して少なくとも７０％の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡを有する、少なくとも１の細菌（例えば、配列番号：６９、８０、８５～９２、９４、９６、９８～１０１、１０３及び１０５のうちのいずれかに記載の塩基配列又は当該塩基配列に対して少なくとも７０％の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡを有する、少なくとも１の細菌）、又は配列番号：１０６～１４７のうちのいずれかに記載の塩基配列若しくは当該塩基配列に対して少なくとも７０％の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡを有する、少なくとも１の細菌が挙げられる。
【0020】
各配列番号にて示される配列は、添付の資料におけるＫ６８、Ｆ３７及びＩ４３各菌の１６ＳｒＤＮＡの配列である。下記表１～４において、各菌と、各１６ＳｒＤＮＡの配列を示す配列番号と、当該配列から推定される各菌種との対応を示す。なお、Ｋ、Ｆ及びＩは、健常人（日本人）３人の糞便から各々単離された腸内細菌であることを表す（特許文献２ 参照）。
【0021】
【表1】
【0022】
【表2】
【0023】
【表3】
【0024】
【表4】
【0025】
表１～４には各配列番号に記載の配列を、ＲｅｆＳｅｑの１６ｓＤＮＡ配列データベースに対して、ＢＬＡＳＴ検索にかけ、ｔｏｐ ｈｉｔした種名及びＲｅｆＳｅｑのａｃｃｅｓｓｉｏｎを示す（２０２０年１月８日時点）。なお、一般に％ｉｄｅｎｔｉｔｙ＞９７％で種（ｓｐｅｃｉｅｓ）まで同定可能であり、＞９４％で属（ｇｅｎｕｓ）まで同定可能と言われている。そのため、％ｉｄｅｎｔｉｔｙが＞９４％である菌株については、属レベルにて特定され得る菌であるということにつき理解されたし。
【0026】
本発明の腸内細菌における「少なくとも７０％の同一性」とは、各塩基配列に対する同一性が、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上（例えば、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上）、より好ましくは９４％以上（例えば、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上）、特に好ましくは９９％以上である。
【0027】
また、配列（アミノ酸配列又はヌクレオチド（塩基）配列）の相同性又は同一性は、ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ、基本ローカルアラインメント検索）のプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３－４１０，１９９０）を利用して決定することができる。該プログラムは、Ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：２２６４－２２６８，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：５８７３－５８７７，１９９３）に基づいている。ＢＬＡＳＴによって、配列間の相同性又は同一性を解析する場合には、例えば、米国国立生物学情報センター（ＮＣＢＩ）のＢＬＡＳＴ等を利用して（例えば、デフォルト、すなわち初期設定のパラメータを用いて）決定することができる。
【0028】
本発明において、配列番号：１～１４７のうちのいずれかに記載の塩基配列又は当該塩基配列に対して少なくとも７０％の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡを有する「腸内細菌」として、好ましくは、それら腸内細菌群の内の少なくとも１５の細菌であり、より好ましくは、前記腸内細菌群の内の少なくとも３０の細菌であり、さらに好ましくは、前記腸内細菌群の内の少なくとも７５の細菌であり、より好ましくは、前記腸内細菌群の内の少なくとも１２０の細菌であり、さらに好ましくは、前記腸内細菌群の内の少なくとも１３５の細菌であり、より好ましくは、前記腸内細菌群の内の少なくとも１４０の細菌であり、さらに好ましくは、配列番号：１～１４７のうちのいずれかに記載の塩基配列又は当該塩基配列に対して少なくとも７０％の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡを、各々有する１４７の腸内細菌であり、特に好ましくは、配列番号：１～１４７のうちのいずれかに記載の塩基配列からなるＤＮＡを各々有する１４７の細菌である。
【0029】
本発明において、配列番号：１～６８のうちのいずれかに記載の塩基配列又は当該塩基配列に対して少なくとも７０％の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡを有する「腸内細菌」として、好ましくは、それら腸内細菌群の内の少なくとも７の細菌であり、より好ましくは、前記腸内細菌群の内の少なくとも１５の細菌であり、さらに好ましくは、前記腸内細菌群の内の少なくとも３５の細菌であり、より好ましくは、前記腸内細菌群の内の少なくとも６０の細菌であり、さらに好ましくは、前記腸内細菌群の内の少なくとも６５の細菌でありより好ましくは、配列番号：１～６８のうちのいずれかに記載の塩基配列又は当該塩基配列に対して少なくとも７０％の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡを、各々有する６８の腸内細菌であり、特に好ましくは、配列番号：１～６８のうちのいずれかに記載の塩基配列からなるＤＮＡを各々有する６８の細菌である。また、配列番号：１～６８のうちのいずれかに記載の塩基配列又は当該塩基配列に対して少なくとも７０％の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡを有する「腸内細菌」としては、アンピシリンに対して抵抗性を有していることが望ましい。また、配列番号：１～４６のうちのいずれかに記載の塩基配列若しくは当該塩基配列に対して少なくとも７０％の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡを、各々有する４６の細菌も、本発明において好適に用いられる。
【0030】
本発明において、配列番号：６９～１０５のうちのいずれかに記載の塩基配列又は当該塩基配列に対して少なくとも７０％の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡを有する「腸内細菌」として、好ましくは、それら腸内細菌群の内の少なくとも４の細菌であり、より好ましくは、前記腸内細菌群の内の少なくとも８の細菌であり、さらに好ましくは、前記腸内細菌群の内の少なくとも１８の細菌であり、より好ましくは、前記腸内細菌群の内の少なくとも２９の細菌であり、さらに好ましくは、前記腸内細菌群の内の少なくとも３３の細菌であり、より好ましくは、前記腸内細菌群の内の少なくとも３５の細菌であり、さらに好ましくは、配列番号：６９～１０５のうちのいずれかに記載の塩基配列又は当該塩基配列に対して少なくとも７０％の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡを、各々有する３７の腸内細菌であり、特に好ましくは、配列番号：６９～１０５のうちのいずれかに記載の塩基配列からなるＤＮＡを各々有する３７の細菌である。また、配列番号：６９～１０５のうちのいずれかに記載の塩基配列又は当該塩基配列に対して少なくとも７０％の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡを有する「腸内細菌」としては、アンピシリンに対して感受性を有していることが望ましい。
【0031】
本発明において、配列番号：６９、８０、８５～９２、９４、９６、９８～１０１、１０３及び１０５のうちのいずれかに記載の塩基配列又は当該塩基配列に対して少なくとも７０％の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡを有する「腸内細菌」として、好ましくは、それら腸内細菌群の内の少なくとも２の細菌であり、より好ましくは、前記腸内細菌群の内の少なくとも５の細菌であり、さらに好ましくは、前記腸内細菌群の内の少なくとも１０の細菌であり、より好ましくは、前記腸内細菌群の内の少なくとも１４の細菌であり、さらに好ましくは、前記腸内細菌群の内の少なくとも１５の細菌であり、より好ましくは、前記腸内細菌群の内の少なくとも１６の細菌であり、さらに好ましくは、前記腸内細菌群の内の少なくとも１７の細菌であり、より好ましくは、配列番号：６９、８０、８５～９２、９４、９６、９８～１０１、１０３及び１０５のうちのいずれかに記載の塩基配列又は当該塩基配列に対して少なくとも７０％の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡを、各々有する１８の腸内細菌であり、特に好ましくは、配列番号：６９、８０、８５～９２、９４、９６、９８～１０１、１０３及び１０５のうちのいずれかに記載の塩基配列からなるＤＮＡを各々有する１８の細菌（配列番号：６９に記載の塩基配列からなるＤＮＡを有する細菌、配列番号：８０に記載の塩基配列からなるＤＮＡを有する細菌、配列番号：８５に記載の塩基配列からなるＤＮＡを有する細菌、配列番号：８６に記載の塩基配列からなるＤＮＡを有する細菌、配列番号：８７に記載の塩基配列からなるＤＮＡを有する細菌、配列番号：８８に記載の塩基配列からなるＤＮＡを有する細菌、配列番号：８９に記載の塩基配列からなるＤＮＡを有する細菌、配列番号：９０に記載の塩基配列からなるＤＮＡを有する細菌、配列番号：９１に記載の塩基配列からなるＤＮＡを有する細菌、配列番号：９２に記載の塩基配列からなるＤＮＡを有する細菌、配列番号：９４に記載の塩基配列からなるＤＮＡを有する細菌、配列番号：９６に記載の塩基配列からなるＤＮＡを有する細菌、配列番号：９８に記載の塩基配列からなるＤＮＡを有する細菌、配列番号：９９に記載の塩基配列からなるＤＮＡを有する細菌、配列番号：１００に記載の塩基配列からなるＤＮＡを有する細菌、配列番号：１０１に記載の塩基配列からなるＤＮＡを有する細菌、配列番号：１０３に記載の塩基配列からなるＤＮＡを有する細菌、及び配列番号：１０５に記載の塩基配列からなるＤＮＡを有する細菌）である。
【0032】
なお、配列番号：６９、８０、８５～９２、９４、９６、９８～１０１、１０３及び１０５のうちのいずれかに記載の塩基配列からなるＤＮＡを各々有する１８の細菌の典型例は、下記表５に示す、受託菌株である。いずれの細菌株も、２０２０年３月２日付で独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ、〒２９２－０８１８ 千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８ １２２号室）に寄託されている。
【0033】
【表5】
【0034】
なお、薬剤耐性細菌又は炎症惹起性細菌に対する抗菌作用等が損なわれない限り、これら各菌から、変異処理、遺伝子組換え、ゲノム編集、自然変異株の選択等によって育種された細菌（派生株、誘導株等）も、本発明にかかる腸内細菌に含まれる。
【0035】
本発明において、配列番号：１０６～１４７のうちのいずれかに記載の塩基配列又は当該塩基配列に対して少なくとも７０％の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡを有する「腸内細菌」として、好ましくは、それら腸内細菌群の内の少なくとも４の細菌であり、より好ましくは、前記腸内細菌群の内の少なくとも９の細菌であり、さらに好ましくは、前記腸内細菌群の内の少なくとも２２の細菌であり、より好ましくは、前記腸内細菌群の内の少なくとも３４の細菌であり、さらに好ましくは、前記腸内細菌群の内の少なくとも３９の細菌であり、より好ましくは、前記腸内細菌群の内の少なくとも４１の細菌であり、さらに好ましくは、配列番号：１０６～１４７のうちのいずれかに記載の塩基配列又は当該塩基配列に対して少なくとも７０％の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡを、各々有する４２の腸内細菌であり、特に好ましくは、配列番号：１０６～１４７のうちのいずれかに記載の塩基配列からなるＤＮＡを各々有する４２の細菌である。また、配列番号：１０６～１４７のうちのいずれかに記載の塩基配列又は当該塩基配列に対して少なくとも７０％の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡを有する「腸内細菌」としては、アンピシリンに対して感受性を有していることが望ましい。
【0036】
また、本発明において、「腸内細菌」の一態様としては、スペクチノマイシンからなる群から選択される少なくとも一の化合物に対する抵抗性、及び／又は、アンピシリン、タイロシン及びクロロホルムからなる群から選択される少なくとも一の化合物に対する感受性を示す腸内細菌が挙げられる。また、別の態様として、メトロニダゾールに対する抵抗性、及び／又は、バンコマイシン及びタイロシンからなる群から選択される少なくとも一の化合物に対する感受性を示す腸内細菌が挙げられる。
【0037】
なお、後述の実施例に示すとおり、上述の腸内細菌は、本発明者らによって単離されたものであり、薬剤耐性細菌、炎症惹起性細菌等に対して抗菌作用を発揮し、有用なものである。したがって、本発明は、以下も提供し得る。
（１） 配列番号：６９～１０５のうちのいずれかに記載の塩基配列又は当該塩基配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡを有する、少なくとも１の細菌。
（２） 配列番号：６９、８０、８５～９２、９４、９６、９８～１０１、１０３及び１０５のうちのいずれかに記載の塩基配列又は当該塩基配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡを有する、少なくとも１の細菌。
（３） 受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ－０３１４７～０３１６４のうちのいずれかにて特定される、少なくとも１の細菌。
（４） 配列番号：１～１４７のうちのいずれかに記載の塩基配列又は当該塩基配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡを有する、少なくとも１の細菌。
（５） 配列番号：６９～１０５のうちのいずれかに記載の塩基配列又は当該塩基配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡを有する、少なくとも１の細菌。
（６） 配列番号：１０６～１４７のうちのいずれかに記載の塩基配列又は当該塩基配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡを有する、少なくとも１の細菌。
（７） 腸管内で、薬剤耐性細菌、炎症惹起性細菌、又はＴｈ１細胞の増殖又は活性化を誘導する細菌に対し、抗菌作用を有する細菌である、（１）～（６）のうちのいずれか一項に記載の細菌。
（１） 配列番号：６９～１０５のうちのいずれかに記載の塩基配列又は当該塩基配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡを有する、少なくとも１の細菌。
（２） 配列番号：６９、８０、８５～９２、９４、９６、９８～１０１、１０３及び１０５のうちのいずれかに記載の塩基配列又は当該塩基配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡを有する、少なくとも１の細菌。
（３） 受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ－０３１４７～０３１６４のうちのいずれかにて特定される、少なくとも１の細菌。
（４） 配列番号：１～１４７のうちのいずれかに記載の塩基配列又は当該塩基配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡを有する、少なくとも１の細菌。
（５） 配列番号：６９～１０５のうちのいずれかに記載の塩基配列又は当該塩基配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡを有する、少なくとも１の細菌。
（６） 配列番号：１０６～１４７のうちのいずれかに記載の塩基配列又は当該塩基配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡを有する、少なくとも１の細菌。
（７） 腸管内で、薬剤耐性細菌、炎症惹起性細菌、又はＴｈ１細胞の増殖又は活性化を誘導する細菌に対し、抗菌作用を有する細菌である、（１）～（６）のうちのいずれか一項に記載の細菌。
【0038】
＜抗菌組成物及び医薬組成物＞
本発明の組成物は、前述の腸内細菌を含むものであればよく、当該細菌は、生菌であってもよく、死菌体であってもよい。また、組成物を複合して用いることができ、結果として併用して摂取又は吸収される場合（併用組成物の場合）、前述の腸内細菌は２種以上の組成物の中に分けて存在することもできる。
本発明の組成物は、前述の腸内細菌を含むものであればよく、当該細菌は、生菌であってもよく、死菌体であってもよい。また、組成物を複合して用いることができ、結果として併用して摂取又は吸収される場合（併用組成物の場合）、前述の腸内細菌は２種以上の組成物の中に分けて存在することもできる。
【0039】
本発明の組成物は、医薬組成物、医薬部外品用組成物、飲食品（動物用飼料を含む）、あるいは研究目的（例えば、インビトロやインビボの実験）に用いられる試薬の形態であり得る。
【0040】
本発明の組成物は、薬剤耐性細菌等に対して抗菌活性を奏するため、当該細菌に起因する疾患の治療、予防又は改善のための医薬組成物、医薬部外品用組成物、飲食品として、好適に用いられる。
【0041】
本発明の組成物は、公知の製剤学的方法により製剤化することができる。例えば、カプセル剤、錠剤、丸剤、液剤、散剤、顆粒剤、細粒剤、フィルムコーティング剤、ペレット剤、トローチ剤、舌下剤、咀嚼剤、バッカル剤、ペースト剤、シロップ剤、懸濁剤、エリキシル剤、乳剤、塗布剤、軟膏剤、硬膏剤、パップ剤、経皮吸収型製剤、ローション剤、吸引剤、エアゾール剤、注射剤、坐剤等として、経口的、非経口的（例えば、腸管内、筋肉内、静脈内、気管内、鼻内、経皮、皮内、皮下、眼内、膣、腹腔内、直腸若しくは吸入）、又はこれらの複数の組み合わせからなる経路による投与用に使用することができる。
【0042】
これら製剤化においては、薬理学上若しくは飲食品として許容される担体、具体的には、滅菌水、生理食塩水、緩衝液、培地、植物油、溶剤、基剤、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、芳香剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤、希釈剤、等張化剤、無痛化剤、増量剤、崩壊剤、緩衝剤、コーティング剤、滑沢剤、着色剤、甘味剤、粘稠剤、矯味矯臭剤、溶解補助剤あるいはその他の添加剤等と適宜組み合わせることができる。
【0043】
また、これら製剤化においては、腸管内における薬剤耐性細菌等に対してより効率的に抗菌活性を奏する等の観点から、特に経口投与を目的とする製剤においては、本発明の組成物を腸管内に効率良く送達することを可能にする組成物と組み合わせてもよい。このような腸管内への送達を可能とする組成物については特に制限されることなく、公知の組成物を適宜採用することができ、例えば、ｐＨ感受性組成物、腸管までの放出を抑制する組成物（セルロース系ポリマー、アクリル酸重合体及び共重合体、ビニル酸重合体及び共重合体等）、腸管粘膜特異的に接着する生体接着性組成物（例えば、米国特許第６．３６８．５８６号明細書に記載のポリマー）、プロテアーゼ阻害剤含有組成物、腸管内酵素によって特異的に分解される組成物）が挙げられる。
【0044】
また、本発明の抗菌組成物を医薬組成物として用いる場合には、薬剤耐性細菌等に起因する疾患の治療、予防又は改善に用いられる公知の物質（例えば、他の抗菌剤、抗炎症剤、免疫抑制剤）を更に含んでいてもよく、またかかる物質と併用してもよい。
【0045】
本発明の組成物を飲食品として用いる場合、当該飲食品は、例えば、健康食品、機能性食品、特定保健用食品、栄養機能食品、機能性表示食品、栄養補助食品、病者用食品、あるいは動物用飼料であり得る。飲食品の具体例としては、発酵飲料、油分を含む製品、スープ類、乳飲料、清涼飲料水、茶飲料、アルコール飲料、ドリンク剤、ゼリー状飲料等の液状食品、炭水化物含有食品、畜産加工食品、水産加工食品；野菜加工食品、半固形状食品、発酵食品、菓子類、レトルト製品、電子レンジ対応食品等が挙げられる。さらには、粉末、穎粒、錠剤、カプセル剤、液状、ペースト状又はゼリー状に調製された健康飲食品も挙げられる。なお、本発明における飲食品の製造は、当該技術分野に公知の製造技術により実施することができる。当該飲食品においては、薬剤耐性細菌等に起因する疾患の改善又は予防に有効な成分（例えば、栄養素等）を添加してもよい。また、当該改善等以外の機能を発揮する他の成分あるいは他の機能性食品と組み合わせることによって、多機能性の飲食品としてもよい。
【0046】
本発明の組成物の製品（医薬品、医薬部外品、飲食品、試薬）又はその説明書は、薬剤耐性細菌等に対して抗菌活性を奏する、又は薬剤耐性細菌等に起因する疾患を治療、改善若しくは予防するために用いられる旨の表示を付したものであり得る。また、飲食品に関しては、形態及び対象者等において一般食品との区別がつくよう、保健機能食品（特定保健用食品、栄養機能食品、機能性表示食品）として健康機能の表示を、本発明の組成物の製品等に付したものであり得る。ここで「製品又は説明書に表示を付した」とは、製品の本体、容器、包装等に表示を付したこと、あるいは製品の情報を開示する説明書、添付文書、宣伝物、その他の印刷物等に表示を付したことを意味する。また、本発明の組成物は、キットの態様であってもよい。
【0047】
また、上述のとおり、本発明の腸内細菌等を用い、公知の製剤化技術により、医薬組成物を製造することができる。したがって、本発明は、薬剤耐性細菌等に起因する疾患を治療、改善又は予防するための医薬組成物を製造するための、本発明の腸内細菌等の使用をも提供する。
【0048】
＜治療方法等＞
本発明は、上述の抗菌組成物若しくは医薬組成物、又はそれらの有効成分となる上述の腸内細菌（以下、「本発明の医薬組成物等又はそれらの有効成分等」とも総称する）を、対象に摂取させることを特徴とする、対象における薬剤耐性細菌等に起因する疾患を治療、改善又は予防する方法をも提供するものである。
本発明は、上述の抗菌組成物若しくは医薬組成物、又はそれらの有効成分となる上述の腸内細菌（以下、「本発明の医薬組成物等又はそれらの有効成分等」とも総称する）を、対象に摂取させることを特徴とする、対象における薬剤耐性細菌等に起因する疾患を治療、改善又は予防する方法をも提供するものである。
【0049】
本発明において、「薬剤耐性細菌」とは、抗菌剤（抗生物質等）に対して抵抗性を有し、当該薬剤が効かない、又は効きにくくなった細菌を意味する。また、当該薬剤は１の薬剤であってもよく、複数の薬剤であってもよい。すなわち、本発明に係る薬剤耐性細菌には、多剤耐性細菌も含まれる。かかる細菌としては、特に制限はないが、例えは、カルバぺネム耐性腸内細菌科細菌（ＣＲＥ、ＫＰＣ－２産生Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ等）、バンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ、バンコマイシン耐性遺伝子（ｖａｎＡ）を有する細菌等）、クロストリジウム ディフィシル、カンピロバクター ジェジュニが挙げられる。より具体的には、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（ＡＴＣＣ ＢＡＡ－１７０５）、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ（Ｏｒｌａ－Ｊｅｎｓｅｎ）Ｓｃｈｌｅｉｆｅｒ ａｎｄ Ｋｉｌｐｐｅｒ－Ｂａｌｚ（ＡＴＣＣ ７００２２１）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ（Ｐｒｅｖｏｔ）Ｌａｗｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（ＡＴＣＣ ４３２５５、菌株表示：ＶＰＩ １０４６３）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ（Ｐｒｅｖｏｔ）Ｌａｗｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（ＡＴＣＣ ＢＡＡ－１３８２、菌株表示：６３０）、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ ８１－１７６（ＡＴＣＣ ＢＡＡ２１５１）が挙げられる。
【0050】
「薬剤耐性細菌に起因する疾患」とは、薬剤耐性細菌による感染症が挙げられる。また当該感染に起因、関連する疾患も含まれる。かかる疾患としては、例えば、敗血症、腹膜炎、髄膜炎、胃腸炎、肺炎等の呼吸器感染症、尿路感染症、手術部位感染症、軟部感染症、医療器具関連感染症（医療器具関連血流感染症等）が挙げられる。
【0051】
本発明において、「炎症惹起性細菌」とは、腸管内にて炎症を惹起する細菌を意味し、例えば、接着侵入性大腸菌（ＡＩＥＣ）が挙げられる。より具体的には、ＡＩＥＣ ＬＦ８２が挙げられる。
【0052】
「炎症惹起性細菌に起因する疾患」とは、当該細菌によって惹起される炎症に起因、又は関与する疾患が挙げられる。かかる疾患としては、例えば、炎症性腸疾患（クローン病、潰瘍性大腸炎、炎症性腸疾患といった慢性炎症性腸疾患等）が挙げられる。
【0053】
本発明の医薬組成物等又はそれらの有効成分等は、ヒトを含む動物を対象として使用することができるが、ヒト以外の動物としては特に制限はなく、種々の家畜、家禽、ペット、実験用動物等を対象とすることができる。
【0054】
また、本発明の腸内細菌等の摂取対象としては、薬剤耐性細菌等に起因する疾患の発症の如何を問わず、薬剤耐性細菌等を保有する動物が挙げられる。また予防の観点からは、該細菌を保有していない又はその保有の疑いのある動物に、本発明の医薬組成物等又はそれらの有効成分等を摂取させてもよい。
【0055】
本発明の医薬組成物等又はそれらの有効成分等の摂取方法としては、特に制限はなく、経口投与であってもよく、また非経口投与（例えば、腸管内への投与）であってもよいが、経口投与である場合には、本発明の医薬組成物等又はそれらの有効成分等の効果をより向上させるという観点から、本発明の医薬組成物等又はそれらの有効成分等の摂取対象は、プロトンポンプ阻害剤（ＰＰＩ）等の摂取により胃酸の産生を減少させておくことが好ましい。
【0056】
また、本発明の医薬組成物等又はそれらの有効成分等を摂取させる場合、その摂取量は、対象の年齢、体重、疾患の症状、健康状態、組成物の種類（医薬品、飲食品等）、摂取方法等に応じて、当業者であれば適宜選択することができる。
【0057】
以上、本発明の抗菌組成物及び医薬組成物、並びに治療方法等の好適な実施形態について説明したが、上記実施形態に限定されるものではない。
【0058】
後述の実施例に示すとおり、Ｔｈ１細胞誘導性細菌であるクレブシエラ２Ｈ７株（Ｋｐ２Ｈ７）の腸内定着抑制能に関し、健常人＃Ｆ由来の腸内細菌３７株と同程度のそれを発揮し得る１８株を選抜することに成功した。したがって、本発明は、抗菌組成物及び医薬組成物、並びに治療方法等に関し、下記態様も提供し得る。
＜１＞ 腸内細菌を有効成分として含有し、前記前記腸内細菌が、配列番号：６９、８０、８５～９２、９４、９６、９８～１０１、１０３及び１０５のうちのいずれかに記載の塩基配列又は当該塩基配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡを有する、少なくとも１の細菌である、Ｔｈ１細胞誘導性細菌に対する抗菌組成物。
＜２＞ 医薬組成物である、＜１＞に記載の抗菌組成物。
＜３＞ Ｔｈ１細胞に起因する疾患を治療、改善又は予防するための医薬組成物である、＜１＞又は＜２＞に記載の抗菌組成物。
＜４＞ ＜１＞～＜３＞のうちのいずれか一項に記載の抗菌組成物、又は、配列番号：６９、８０、８５～９２、９４、９６、９８～１０１、１０３及び１０５のうちのいずれかに記載の塩基配列又は当該塩基配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡを有する、少なくとも１の細菌を、対象に摂取させることを特徴とする、対象におけるＴｈ１細胞の増殖若しくは活性化を抑制する方法、該対象における免疫を抑制する方法、又は該対象におけるＴｈ１細胞に起因する疾患を治療、改善又は予防する方法。
＜１＞ 腸内細菌を有効成分として含有し、前記前記腸内細菌が、配列番号：６９、８０、８５～９２、９４、９６、９８～１０１、１０３及び１０５のうちのいずれかに記載の塩基配列又は当該塩基配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡを有する、少なくとも１の細菌である、Ｔｈ１細胞誘導性細菌に対する抗菌組成物。
＜２＞ 医薬組成物である、＜１＞に記載の抗菌組成物。
＜３＞ Ｔｈ１細胞に起因する疾患を治療、改善又は予防するための医薬組成物である、＜１＞又は＜２＞に記載の抗菌組成物。
＜４＞ ＜１＞～＜３＞のうちのいずれか一項に記載の抗菌組成物、又は、配列番号：６９、８０、８５～９２、９４、９６、９８～１０１、１０３及び１０５のうちのいずれかに記載の塩基配列又は当該塩基配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡを有する、少なくとも１の細菌を、対象に摂取させることを特徴とする、対象におけるＴｈ１細胞の増殖若しくは活性化を抑制する方法、該対象における免疫を抑制する方法、又は該対象におけるＴｈ１細胞に起因する疾患を治療、改善又は予防する方法。
【0059】
本発明にかかる「Ｔｈ１細胞誘導性細菌」は、通常ヒトの口腔内に存在しているが、腸管内に定着することにより、Ｔｈ１細胞の増殖又は活性化を誘導する細菌である。好ましくは、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａに属し、より好ましくは、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ又はＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ａｅｒｏｍｏｂｉｌｉｓに属し、かつ腸管内でＴｈ１細胞の増殖又は活性化を誘導する細菌である。また、「Ｔｈ１細胞誘導性細菌」は、好ましくは、抗菌剤の投薬により健常状態と比較して多様性が変化した腸内環境において、定着しやすい細菌である。また、大腸炎等により健常状態と比較して多様性が変化した腸内環境において、定着しやすい細菌でもある。
【0060】
「Ｔｈ１細胞誘導性細菌」の例については、特許文献１を参照とすることができるが、典型的には、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａに属するＫｐ２Ｈ７株、Ｋａ１１Ｅ１２株、３４Ｅ１株、ＢＡＡ－１７０５株、７００６０３株、４０Ｂ３株が挙げられる。これらの中で、より好ましくは、Ｋｐ２Ｈ７株又はＫａ１１Ｅ１２株であり、特に好ましくは、Ｋｐ２Ｈ７株である。なお、これら細菌の詳細については、表６を参照のほど。
【0061】
【表6】
【0062】
また、本発明の「Ｔｈ１細胞誘導性細菌」としては、Ｋｐ２Ｈ７株、Ｋａ１１Ｅ１２株、３４Ｅ１株、ＢＡＡ－１７０５株、７００６０３株又は４０Ｂ３株の１６ＳｒＲＮＡをコードするヌクレオチド配列と９０％以上（９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上）の同一性を有するヌクレオチド配列からなるＤＮＡを含有する細菌が挙げられ、また、Ｋｐ２Ｈ７株、Ｋａ１１Ｅ１２株、３４Ｅ１株、ＢＡＡ－１７０５株、７００６０３株又は４０Ｂ３株に特異的なヌクレオチド配列と７０％以上（好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、より好ましくは９４％以上（例えば、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上））の相同性又は同一性を有するヌクレオチド配列からなるＤＮＡを含有する細菌も挙げられる。
【0063】
本発明において、「Ｔｈ１細胞」とは、ＣＤ４陽性のヘルパーＴ細胞（Ｔｈ細胞）の亜群であり、細胞性免疫を増強させる細胞を意味する。また、「Ｔｈ１細胞の活性」とは、該細胞によるＴｈ１サイトカイン（ＩＦＮ－γ等）の産生、該サイトカインによるマクロファージ、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）等の細胞の活性化、該活性化による細胞性免疫の増強を含む意味である。さらに、「Ｔｈ１細胞の増殖又は活性化の誘導」とは、Ｔｈ１細胞の増殖又は活性化に至る、ナイーブＴ細胞からＴｈ１細胞への分化誘導も含む意味である。
【0064】
腸管内におけるＴｈ１細胞を増殖又は活性化を誘導する作用は、Ｔｈ１細胞特異的なマーカー（例えば、ＣＤ４及びＩＦＮ－γ）を定量的に検出することによって、評価することができる。かかる定量的な検出は、公知の手法によって行うことができ、例えば、フローサイトメトリー、イメージングサイトメトリー、ＥＬＩＳＡ法、ラジオイムノアッセイ、免疫組織化学的染色法、免疫沈降法、イムノブロッティング、抗体アレイ解析法等の抗体を用いて検出する方法（免疫学的手法）によって行うことができる。
【0065】
任意の菌等が、腸管内におけるＴｈ１細胞を増殖又は活性化を誘導する作用を有しているか否かは、例えば、フローサイトメトリーによって検出された腸管内におけるＣＤ４＋ＴＣＲβ＋Ｔ細胞における、ＩＦＮ－γ＋細胞の割合が、１０％以上であった場合に、前記菌等が、腸管内におけるＴｈ１細胞を増殖又は活性化を誘導する作用を有していると判定することができる（２５％以上であった場合に、前記菌等が、腸管内におけるＴｈ１細胞を増殖又は活性化を誘導する作用を有していると判定することが好ましく、３０％以上であった場合に、前記菌、物質等が、腸管内におけるＴｈ１細胞を増殖又は活性化を誘導する作用を有していると判定することがより好ましい）。
【0066】
本発明において、「Ｔｈ１細胞に起因する疾患」とは、Ｔｈ１細胞の増殖又は活性化によって誘発された疾患を意味し、炎症性腸疾患（クローン病、潰瘍性大腸炎、炎症性腸疾患といった慢性炎症性腸疾患等）、１型糖尿病、関節リウマチ、実験的免疫性脳炎（ＥＡＥ）、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス等の自己免疫疾患、慢性炎症性疾患が挙げられる。また、本発明において抑制される「免疫」には、粘膜免疫（腸管免疫等）のみならず、全身免疫も含まれる。さらに、細胞性免疫のみならず、液性免疫も含まれる。
【0067】
また、本発明の抗菌組成物を医薬組成物として用いる場合には、Ｔｈ１細胞に起因する疾患の治療、予防又は改善に用いられる公知の物質（例えば、抗炎症剤、免疫抑制剤）を更に含んでいてもよく、またかかる物質と併用してもよい。
【0068】
なお、上記＜１＞～＜４＞における、その他の文言については、上述の＜抗菌組成物及び医薬組成物＞及び＜治療方法等＞を適宜参照のほど。
【0069】
＜薬剤耐性細菌等に起因する疾患の検査用組成物＞
本発明において、薬剤耐性細菌等が腸管に定着等することを抑制し得る腸内細菌の存在が明らかになった。そのため、当該腸内細菌の存在を検出することにより、薬剤耐性細菌等に起因する疾患を検査することが可能となる。
本発明において、薬剤耐性細菌等が腸管に定着等することを抑制し得る腸内細菌の存在が明らかになった。そのため、当該腸内細菌の存在を検出することにより、薬剤耐性細菌等に起因する疾患を検査することが可能となる。
【0070】
したがって、本発明は、以下の薬剤耐性細菌等に起因する疾患を検査するための組成物を提供する。
【0071】
本発明の腸内細菌等を特異的に認識する抗体を含む、薬剤耐性細菌等に起因する疾患を検査するための組成物。
【0072】
本発明の薬剤耐性細菌等に特異的なヌクレオチド配列を検出するためのポリヌクレオチドを含む、薬剤耐性細菌等に起因する疾患を検査するための組成物。
【0073】
本発明において、「本発明の腸内細菌等を特異的に認識する抗体」は、該細菌を特異的に認識し得る限り、ポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよく、また抗体の機能的断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、可変領域断片（Ｆｖ）、ジスルフィド結合Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ｓｃ（Ｆｖ）２、ダイアボディー、多特異性抗体、又はこれらの重合体）であってもよい。本発明の抗体は、ポリクローナル抗体であれば、抗原（本発明の腸内細菌等に由来するポリペプチド、ポリヌクレオチド、糖鎖、脂質等）で免疫動物を免疫し、その抗血清から、従来の手段（例えば、塩析、遠心分離、透析、カラムクロマトグラフィーなど）によって、精製して取得することができる。また、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法や組換えＤＮＡ法によって作製することができる。
【0074】
また、本発明の検査に用いる抗体としては、標識物質を結合させた抗体を使用することができる。当該標識物質を検出することにより、本発明の腸内細菌等又は該細菌に由来する物質に結合した抗体量を直接測定することが可能である。標識物質としては、抗体に結合することができ、化学的又は光学的方法に検出できるものであれば特に制限されることはなく、例えば、蛍光色素（ＧＦＰ等）、酵素（ＨＲＰ等）、放射性物質が挙げられる。
【0075】
本発明の検査用組成物には、抗体成分の他、組成物として許容される他の成分を含むことができる。このような他の成分としては、例えば、担体、賦形剤、崩壊剤、緩衝剤、乳化剤、懸濁剤、安定剤、保存剤、防腐剤、生理食塩、標識物質、二次抗体が挙げられる。また、上記検査用組成物の他、標識物質の検出に必要な基質、陽性対照や陰性対照、あるいは試料の希釈や洗浄に用いる緩衝液、試料と本発明の抗体との反応に用いるチューブ又はプレート等を組み合わせることができ、薬剤耐性細菌等に起因する疾患の検査用キットとすることもできる。また、標識されていない抗体を抗体標品とした場合には、当該抗体に結合する物質（例えば、二次抗体、プロテインＧ、プロテインＡ等）を標識化したものを組み合わせることができる。また、かかる薬剤耐性細菌等に起因する疾患の検査用キットには、当該キットの使用説明書を含めることができる。
【0076】
さらに、本発明の検査用組成物には、本発明の抗体を検出するための装置を組み合わせることもできる。かかる装置としては、例えば、フローサイトメトリー装置、マイクロプレートリーダーが挙げられる。
【0077】
本発明において、「本発明の腸内細菌等に特異的なヌクレオチド配列を検出するためのポリヌクレオチド」としては、該細菌に特異的な配列を検出する限り、特に制限はなく、例えば、少なくとも１５ヌクレオチドの鎖長を有する、下記（ａ）～（ｂ）に記載のいずれかであるポリヌクレオチドが、挙げられる。
（ａ）前記特異的なヌクレオチド配列を挟み込むように設計された一対のプライマーであるポリヌクレオチド
（ｂ）前記特異的なヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列にハイブリダイズするプライマー又はプローブであるポリヌクレオチド。
（ａ）前記特異的なヌクレオチド配列を挟み込むように設計された一対のプライマーであるポリヌクレオチド
（ｂ）前記特異的なヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列にハイブリダイズするプライマー又はプローブであるポリヌクレオチド。
【0078】
本発明のポリヌクレオチドは、本発明の腸内細菌等のヌクレオチド配列に相補的な塩基配列を有する。ここで「相補的」とは、ハイブリダイズする限り、完全に相補的でなくともよい。これらポリヌクレオチドは、前記ヌクレオチド配列に対して、通常、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、特に好ましくは１００％の相同性を有する。
【0079】
本発明のポリヌクレオチドにおける「鎖長」としては、プライマーとして用いる場合に、通常１５～１００ヌクレオチドであり、好ましくは１７～３０ヌクレオチドであり、より好ましくは２０～２５ヌクレオチドである。また、プローブとして用いる場合には、通常１５～１０００ヌクレオチドであり、好ましくは２０～１００ヌクレオチドである。
【0080】
本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよく、またその一部又は全部において、ＬＮＡ（登録商標、架橋化核酸）、ＥＮＡ（登録商標、２’－Ｏ，４’－Ｃ－Ｅｔｈｙｌｅｎｅ－ｂｒｉｄｇｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ）、ＧＮＡ（グリセロール核酸）、ＴＮＡ（トレオ―ス核酸）、ＰＮＡ（ペプチド核酸）等の人工核酸によって、ヌクレオチドが置換されているものであってもよい。
【0081】
なお、本発明のポリヌクレオチドは、市販のヌクレオチド自動合成機等を用いて化学的に合成することができる。また、本発明の検査に用いるポリヌクレオチドとしては、標識物質を結合させたポリヌクレオチドを使用することができる。標識物質としては、ポリヌクレオチドに結合することができ、化学的又は光学的方法に検出できるものであれば特に制限されることはなく、例えば、蛍光色素（ＤＥＡＣ、ＦＩＴＣ、Ｒ６Ｇ、ＴｅｘＲｅｄ、Ｃｙ５等）、蛍光色素以外にＤＡＢ等の色素（ｃｈｒｏｍｏｇｅｎ）、酵素、放射性物質が挙げられる。
【0082】
本発明の検査用組成物には、前述のポリヌクレオチドの他、薬理学上許容される他の成分を含むことができる。このような他の成分としては、例えば、緩衝剤、乳化剤、懸濁剤、安定剤、防腐剤、生理食塩等が挙げられる。
【0083】
また、上記検査用組成物の他、ポリヌクレオチドに付加した標識物質の検出に必要な基質、陽性対照や陰性対照、試料の希釈や洗浄に用いる緩衝液等の標品を組み合わせ、試料と本発明のポリヌクレオチドとの反応に用いるチューブ又はプレート等を組み合わせることができ、薬剤耐性細菌等に起因する疾患の検査用キットとすることもできる。さらに、かかる薬剤耐性細菌等に起因する疾患の検査用キットには、当該キットの使用説明書を含めることができる。
【0084】
また、本発明の検査用組成物には、本発明の腸内細菌等に特異的なヌクレオチド配列を検出するための装置を組み合わせることもできる。かかる装置としては、例えば、サーマルサイクラ―、シークエンサー、マイクロアレイが挙げられる。
【0085】
さらに、本発明においては、前述の抗体、ポリヌクレオチド、又は検査用組成物を用いた、薬剤耐性細菌等に起因する疾患の検査方法も提供する。すなわち、
前記抗体、ポリヌクレオチド、又は検査用組成物と、被検体から単離された試料とを接触させる工程、及び、該接触により、腸管内で本発明の腸内細菌等の存在又は非存在を検出する工程、を含む、薬剤耐性細菌等に起因する疾患の検査方法を、本発明は提供する。
前記抗体、ポリヌクレオチド、又は検査用組成物と、被検体から単離された試料とを接触させる工程、及び、該接触により、腸管内で本発明の腸内細菌等の存在又は非存在を検出する工程、を含む、薬剤耐性細菌等に起因する疾患の検査方法を、本発明は提供する。
【0086】
被検体としては特に制限はなく、薬剤耐性細菌等に起因する疾患の罹患が疑われるヒト等の動物が挙げられる。また、かかる被検体から単離された試料としても特に制限はないが、被検体の糞便試料、その培養物、又はそれらから抽出されるポリペプチド、ポリヌクレオチド、糖鎖、脂質等が、本発明の方法において好適に用いられる。
【0087】
本発明の抗体又はそれを含む検査用組成物と、前記試料とを接触させることにより、本発明の腸内細菌等の存在又は非存在を検出する方法としては、例えば、ＥＬＩＳＡ法、イムノブロッティング、抗体アレイ解析法、免疫組織化学的染色法、フローサイトメトリー、イメージングサイトメトリー、ラジオイムノアッセイ、免疫沈降法等の抗体を用いて検出する方法（免疫学的手法）が挙げられる。
【0088】
また、本発明のポリヌクレオチド又はそれを含む検査用組成物と、前記試料とを接触させることにより、本発明の腸内細菌等の存在又は非存在を検出する方法としては、例えば、ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、定量ＰＣＲ）、ＤＮＡマイクロアレイ解析法、ノーザンブロッティング、１６ｓｒＲＮＡシークエンシング、次世代シークエンシング法（合成シークエンシング法（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ－ｂｙ－ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、例えば、イルミナ社製Ｓｏｌｅｘａゲノムアナライザー又はＨｉｓｅｑ（登録商標）２０００によるシークエンシング）、パイロシークエンシング法（例えば、ロッシュ・ダイアグノステックス（４５４）社製のシークエンサーＧＳＬＸ又はＦＬＸによるシークエンシング（所謂４５４シークエンシング））、リガーゼ反応シークエンシング法（例えば、ライフテクノロジー社製のＳｏｌｉＤ（登録商標）又は５５００ｘｌによるシークエンシング）、ビーズアレイ法、ｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーション、ドットブロット、ＲＮａｓｅプロテクションアッセイ法、質量分析法、ゲノムＰＣＲ法、サザンブロッティングを用いることができる。
【0089】
本発明において、薬剤耐性細菌等に起因する疾患の「検査」とは、該疾患の発症の有無のみならず、その発症のリスクを検査することも含まれ、前述の方法により、腸管内で本発明の腸内細菌等の存在が検出されれば、薬剤耐性細菌等に起因する疾患が発症していない又はその発症リスクが低いと判定することができる。
【0090】
被検体における薬剤耐性細菌等に起因する疾患の診断は、通常、医師（医師の指示を受けた者も含む）によって行われるが、本発明の方法によって得られるデータは、医師による診断に役立つものである。よって、本発明の方法は、医師による診断に役立つデータを収集し、提示する方法とも表現しうる。
【0091】
また、本発明においては、前述の検査方法を利用したコンパニオン診断法、及びその薬剤も提供することができる。すなわち、本発明は以下も提供する。
【0092】
本発明の医薬組成物等又はそれらの有効成分等の、薬剤耐性細菌等に起因する疾患の治療、改善又は予防における有効性を判定する方法であって、前記抗体、ポリヌクレオチド、又は検査用組成物と、被検体から単離された試料とを接触させる工程、該接触により、前記腸内細菌等の存在又は非存在を検出する工程、前記工程において、該細菌の存在が検出されなかった場合において、前記被検体における本発明の医薬組成物等又はそれらの有効成分等の前記疾患の治療、改善又は予防における有効性が高いと判定される方法。
【0093】
薬剤耐性細菌等に起因する疾患を治療、改善又は予防する方法であって、前記判定方法により、本発明の医薬組成物等又はそれらの有効成分等の有効性が高いと判定された患者に、該医薬組成物等又はそれらの有効成分等を摂取させる工程を含む方法。
【0094】
本発明の腸内細菌等を、有効成分として含む、薬剤耐性細菌等に起因する疾患を治療、改善又は予防するための組成物であって、前記判定方法により有効性が高いと判定された被検体に摂取される組成物。
【0095】
＜腸管内で薬剤耐性細菌等に対して抗菌活性を有する腸内細菌をスクリーニングする方法＞
腸内細菌において、腸管内で薬剤耐性細菌等の定着等を抑制する細菌が存在することも、本発明者らによって初めて明らかとなった。したがって、本発明は、以下の工程を含む、薬剤耐性細菌等に対して抗菌活性を有する腸内細菌をスクリーニングする方法を提供する。
腸内細菌において、腸管内で薬剤耐性細菌等の定着等を抑制する細菌が存在することも、本発明者らによって初めて明らかとなった。したがって、本発明は、以下の工程を含む、薬剤耐性細菌等に対して抗菌活性を有する腸内細菌をスクリーニングする方法を提供する。
【0096】
腸管内で薬剤耐性細菌等と、被験腸内細菌とを、非ヒト無菌動物に摂取させる工程、
該非ヒト無菌動物の腸管内において、前記薬剤耐性細菌等を検出する工程、
前記工程にて検出された細菌の数が、前記被験腸内細菌を摂取させなかった場合と比較して減少している場合に、該被験腸内細菌を、薬剤耐性細菌等に対して抗菌活性を有する腸内細菌であると判定する工程。
該非ヒト無菌動物の腸管内において、前記薬剤耐性細菌等を検出する工程、
前記工程にて検出された細菌の数が、前記被験腸内細菌を摂取させなかった場合と比較して減少している場合に、該被験腸内細菌を、薬剤耐性細菌等に対して抗菌活性を有する腸内細菌であると判定する工程。
【0097】
「薬剤耐性細菌等」については上述のとおりである。「非ヒト無菌動物」は、無菌条件下で、出生及び生育している、ヒト以外の動物を意味する。ヒト以外の動物としては、例えば、マウス、ラット、サル、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、カモ、ダチョウ、アヒル、イヌ、ネコ、ウサギ、ハムスター等が挙げられるが、これらに制限されない。また、これら動物においては、マウスが好適に用いられる。
【0098】
非ヒト無菌動物に摂取させる被験腸内細菌としては、動物の腸内に存在する細菌であればよく、かかる動物としては、ヒト、非ヒト動物（マウス、ラット、サル、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、カモ、ダチョウ、アヒル、イヌ、ネコ、ウサギ、ハムスター等）が挙げられる。また、非ヒト無菌動物に摂取させる被験腸内細菌は、単離された腸内細菌であってもよいが、腸内細菌を含む試料（例えば、前記動物の糞便試料、又はその培養物）が挙げられる。
【0099】
また、被験腸内細菌及び薬剤耐性細菌等を、非ヒト動物に「摂取」させる方法としては特に制限はなく、通常、経口投与によって行われるが、非経口投与（例えば、腸管内への投与）であってもよい。また、被験腸内細菌と薬剤耐性細菌等との摂取は、同時であってもよく、被験腸内細菌を非ヒト動物に摂取させた後に前記薬剤耐性細菌等を該動物に摂取させてもよく、前記薬剤耐性細菌等を非ヒト動物に摂取させた後に被験腸内細菌を該動物に摂取させてもよい。
【0100】
腸管内における薬剤耐性細菌等の「検出」は、当該薬剤耐性細菌等特異的なヌクレオチド配列を検出することによって行なうことができる。かかる検出方法として、例えば、ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、定量ＰＣＲ）、ＤＮＡマイクロアレイ解析法、ノーザンブロッティング、１６ｓｒＲＮＡシークエンシング、次世代シークエンシング法（合成シークエンシング法（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ－ｂｙ－ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、例えば、イルミナ社製Ｓｏｌｅｘａゲノムアナライザー又はＨｉｓｅｑ（登録商標）２０００によるシークエンシング）、パイロシークエンシング法（例えば、ロッシュ・ダイアグノステックス（４５４）社製のシークエンサーＧＳＬＸ又はＦＬＸによるシークエンシング（所謂４５４シークエンシング））、リガーゼ反応シークエンシング法（例えば、ライフテクノロジー社製のＳｏｌｉＤ（登録商標）又は５５００ｘｌによるシークエンシング）、ビーズアレイ法、ｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーション、ドットブロット、ＲＮａｓｅプロテクションアッセイ法、質量分析法、ゲノムＰＣＲ法、サザンブロッティングが挙げられる。
【0101】
また、腸管内における薬剤耐性細菌等の「検出」は、例えば、当該薬剤耐性細菌等特異的なアミノ酸配列を検出することによって行なうことができる。かかる検出方法として、ＥＬＩＳＡ法、イムノブロッティング、抗体アレイ解析法、免疫組織化学的染色法、フローサイトメトリー、イメージングサイトメトリー、ラジオイムノアッセイ、免疫沈降法等の抗体を用いて検出する方法（免疫学的手法）が挙げられる。検出のタイミングとしては、特に制限はなく、当業者であれば、用いる動物の種類等に応じ、適宜調整し得る。
【0102】
なお、本発明のスクリーニング方法において、１回の実施により、薬剤耐性細菌等に対して抗菌活性を有する腸内細菌を選抜することができなかった場合には、得られた該細菌を含む腸管内試料を、次なる被験腸内細菌として、新たな非ヒト無菌動物に摂取させ、前述のスクリーニングを複数回行うことにより、前記抗菌活性を有する腸内細菌を単離することができる。
【実施例】
【0103】
（実施例１）
図１の上部に示すように、無菌マウスにクレブシエラ２Ｈ７株（Ｋｐ２Ｈ７）を投与し、１週間後に健常ボランティアの便サンプルを投与した。
図１の上部に示すように、無菌マウスにクレブシエラ２Ｈ７株（Ｋｐ２Ｈ７）を投与し、１週間後に健常ボランティアの便サンプルを投与した。
【0104】
具体的には、無菌マウスはＣ５７ＢＬ／６Ｎ（日本クレア株式会社）の４～８週齢を、飼育用ビニルアイソレータ（無菌アイソレータ）（株式会社アイシーエム製；ＩＣＭ－１Ｂ）内で、自由飲水給餌条件で１週間以上飼育し、環境馴化させてから使用した。実験開始時の週齢は８～１４週齢となる。本明細書中の他の実施例も同様である。
【0105】
クレブシエラの菌液を、ＬＢ液体培地に入れ３７℃で一晩培養しＯＤ値を１．２（１＊１０＾９ＣＦＵ／ｍＬ相当）に調整し、２００μＬ／匹（２＊１０＾８ＣＦＵ／匹相当）の菌液をマウスの胃内にゾンデを使用して投与した。
【0106】
便サンプルは、日本人健常者ボランティア（＃Ａ、＃Ｆ、＃Ｉ、＃Ｊ、＃Ｋ）から提供された糞便をグリセロールＰＢＳ溶液（グリセロールの終濃度：２０体積％）で５倍重量に希釈し、１００μｍ径フィルタで濾過したものを、ストック液として－８０℃で保存した。便投与時に嫌気チャンバー内でストック液をＰＢＳで１０倍希釈し２００μＬ／匹ずつマウスの胃内にゾンデを使用して投与した。
【0107】
マウスの便サンプルをグリセロール（終濃度２０％）及びＥＤＴＡ（終濃度１０ｍＭ）をＰＢＳに混合した溶液に５０ｍｇ便／ｍＬの割合で溶解した。便溶解液を５０ｍｇ／Ｌ アンピシリン及び５０ｍｇ／Ｌ スペクチノマイシンを入れたＤＨＬ培地に適切な希釈をした後に播種し、３７℃で一晩培養した後にコロニー数をカウントし、便１ｇあたりのＣＦＵ数を算出した。
【0108】
本明細書中の他の実施例でも、クレブシエラの菌液及び糞便の投与は同様の方法で行い、ＣＦＵも同様の方法でカウントした。
【0109】
その結果、図１の下部（グラフ）に示すとおり、５種類の便を使用したが、いずれのサンプルでも、Ｋｐ２Ｈ７菌量の顕著な低下が認められた。
【0110】
（実施例２） 健常者ボランティア便からの菌の単離
実施例１において調製した、健常者Ｆ、Ｋ及びＩ由来の便（Ｆ便、Ｋ便及びＩ便）由来の各凍結便サンプルを、常温にて融解した後、ＰＢＳで希釈し、ＥＧ培地、変法ＧＡＭ寒天培地（日水製薬株式会社；０５４２６）、ＲＥＩＮＦＯＲＣＥＤ ＣＬＯＳＴＲＩＤＩＡＬ ＡＧＡＲ（ＲＣＭ ＡＧＡＲ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ；ＣＭ０１５１）又はＳｃｈａｅｄｌｅｒ血液培地（Ｗａｋｏ社製；５１７－４５８０５）の各アガープレートにて、３７℃、１０％ＣＯ２嫌気環境下で培養し、形成したコロニーを単離した。Ｆ便からは３７株、Ｉ便からは４２株、Ｋ便からは４７株を単離した。その後Ｋ便に関しては再度単離を行い、最終的にＫ便から６８株を単離した。
実施例１において調製した、健常者Ｆ、Ｋ及びＩ由来の便（Ｆ便、Ｋ便及びＩ便）由来の各凍結便サンプルを、常温にて融解した後、ＰＢＳで希釈し、ＥＧ培地、変法ＧＡＭ寒天培地（日水製薬株式会社；０５４２６）、ＲＥＩＮＦＯＲＣＥＤ ＣＬＯＳＴＲＩＤＩＡＬ ＡＧＡＲ（ＲＣＭ ＡＧＡＲ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ；ＣＭ０１５１）又はＳｃｈａｅｄｌｅｒ血液培地（Ｗａｋｏ社製；５１７－４５８０５）の各アガープレートにて、３７℃、１０％ＣＯ２嫌気環境下で培養し、形成したコロニーを単離した。Ｆ便からは３７株、Ｉ便からは４２株、Ｋ便からは４７株を単離した。その後Ｋ便に関しては再度単離を行い、最終的にＫ便から６８株を単離した。
【0111】
単離菌は、サンガー法による１６ＳｒＤＮＡ解析により、遺伝子配列の解析及び菌種の推定を行った。シークエンス解析は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製３１３０ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｚｅｒ、及び、以下の配列のプライマーセットを用いて行なった。
２７Ｆｏｒｗａｒｄ－ｍｏｄ：５’－ＡＧＲＧＴＴＴＧＡＴＹＭＴＧＧＣＴＣＡＧ－３’ （配列番号：１４８）
１４９２Ｒｅｖｅｒｓｅ：５’－ＧＧＹＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣＴＴ－３’ （配列番号：１４９）
ここで、Ｒ：Ａ又はＧ、Ｙ：Ｃ又はＴ、Ｍ：Ａ又はＣである。
２７Ｆｏｒｗａｒｄ－ｍｏｄ：５’－ＡＧＲＧＴＴＴＧＡＴＹＭＴＧＧＣＴＣＡＧ－３’ （配列番号：１４８）
１４９２Ｒｅｖｅｒｓｅ：５’－ＧＧＹＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣＴＴ－３’ （配列番号：１４９）
ここで、Ｒ：Ａ又はＧ、Ｙ：Ｃ又はＴ、Ｍ：Ａ又はＣである。
【0112】
さらに、Ｆ便由来の３７菌株について、次世代シーケンサーを用いてゲノム配列を決定した。すなわち、Ｉｌｌｕｍｉｎａ社製 ＭｉＳｅｑ及びＰａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製Ｓｅｑｕｅｌを用いて、それぞれゲノムシークエンスを行い、Ｕｎｉｃｙｃｌｅｒを用いたハイブリッドアセンブリにより全ゲノム配列をそれぞれ取得した。この各ゲノム配列に対し、ＲＮＡｍｍｅｒを用いて１６Ｓ ｒＲＮＡ配列を抽出することで、前記サンガー法で決定した１６Ｓ ｒＤＮＡ配列では決定することができなかった両末端配列を含む、より高精度な配列を取得した。
【0113】
このようにして解析した結果を、表１～４に示す。また、ドナーＦ、Ｉ、Ｋ由来の３種類の便を１６Ｓメタ解析した結果を、図２に示す。
【0114】
（実施例３）
図３の上部に示すように、無菌マウスにＫｐ２Ｈ７を投与し、１週間後に混合した単離菌（Ｆ便由来の３７株（Ｆ３７ｍｉｘ）、Ｉ便由来の４２株（Ｉ４２ｍｉｘ）、Ｋ便由来の４７株（Ｋ４７ｍｉｘ））又はＩ便を投与した。
図３の上部に示すように、無菌マウスにＫｐ２Ｈ７を投与し、１週間後に混合した単離菌（Ｆ便由来の３７株（Ｆ３７ｍｉｘ）、Ｉ便由来の４２株（Ｉ４２ｍｉｘ）、Ｋ便由来の４７株（Ｋ４７ｍｉｘ））又はＩ便を投与した。
【0115】
単離菌はｍＧＡＭ液体培地、ＥＧ培地又はＣＭ０１４９培地を用いて３７℃で、嫌気チャンバー内で２４～４８時間培養し、混合した。混合液を５倍濃縮し、２００μＬ／匹（Ｔｏｔａｌ菌量 １＊１０＾９ＣＦＵ／匹相当）の菌液を、ゾンデを用いて胃内に投与した。以下の実施例での混合単離菌株の投与も同様の方法にて行った。
【0116】
その結果、図３の下部（グラフ）に示すとおり、Ｆ便由来の３７株は、クレブシエラのマウス腸管内からの排除能に関し、Ｉ便と同等の活性を有していることが明らかになった。
【0117】
（実施例４）
図４の上部に示すように、無菌マウスにＫｐ２Ｈ７を投与し、１週間後に混合した単離菌（Ｆ便由来の３７株、Ｋ便由来の６８株）を投与した。その結果、図４の下部（グラフ）に示すとおり、Ｆ便由来の３７株とＫ便由来の６８株は同等にクレブシエラをマウスの腸管内から排除した。
図４の上部に示すように、無菌マウスにＫｐ２Ｈ７を投与し、１週間後に混合した単離菌（Ｆ便由来の３７株、Ｋ便由来の６８株）を投与した。その結果、図４の下部（グラフ）に示すとおり、Ｆ便由来の３７株とＫ便由来の６８株は同等にクレブシエラをマウスの腸管内から排除した。
【0118】
（実施例５）
図５の上部に示すように、無菌マウスにＫｐ２Ｈ７を投与し、１週間後に混合した単離菌（Ｆ３７ｍｉｘ）を投与し、単離菌投与後後からアンピシリン ２００ｍｇ／Ｌを飲水投与した。投与した各菌の菌量の変化を調べるために、各菌の特異的プライマーを用いてＰＣＲを行なった。解析に用いたプライマーを表７に示す。
図５の上部に示すように、無菌マウスにＫｐ２Ｈ７を投与し、１週間後に混合した単離菌（Ｆ３７ｍｉｘ）を投与し、単離菌投与後後からアンピシリン ２００ｍｇ／Ｌを飲水投与した。投与した各菌の菌量の変化を調べるために、各菌の特異的プライマーを用いてＰＣＲを行なった。解析に用いたプライマーを表７に示す。
【0119】
【表7】
【0120】
その結果、図５の下部に示すように、アンピシリン投与により、クレブシエラの菌量は一過性に上昇したがその後再度減少した。
【0121】
また、全菌量における各単離菌菌の存在比率について、Ｋｐ２Ｈ７のそれと共に、経時的変化を解析した。得られた結果を図６Ａ～６Ｈに示す。さらに、クレブシエラの菌量と各菌のスピアマンの順位相関係数を算出し、正の相関の高いものから順に並べた。得られた結果を図７に示す。
【0122】
図７に示すとおり、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓに属する株はクレブシエラの動きと関係なく動いていることが判明した。一方、負の相関をしている株はＦｕｒｍｉｃｕｔｅｓ属に属するものが多かった。
【0123】
（実施例６）
図９に示すように、Ｆ便由来の３７株をＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓに属する８株（Ｆ８ｍｉｘ）とそれ以外の２９菌株（Ｆ２９ｍｉｘ）に分けてそれぞれ混合し、無菌マウスにＫｐ２Ｈ７を定着させた後、混合した単離菌を投与した。なお、図９、１０及び１２に示す系統樹は、単離菌のサンガー法による１６ＳｒＤＮＡ解析結果のＤＮＡ塩基配列をＭＥＧＡ Ｘを用い、Ｎｅｉｇｈｂｏｒ－ｊｏｉｎｉｎｇ法にて作成した。
図９に示すように、Ｆ便由来の３７株をＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓに属する８株（Ｆ８ｍｉｘ）とそれ以外の２９菌株（Ｆ２９ｍｉｘ）に分けてそれぞれ混合し、無菌マウスにＫｐ２Ｈ７を定着させた後、混合した単離菌を投与した。なお、図９、１０及び１２に示す系統樹は、単離菌のサンガー法による１６ＳｒＤＮＡ解析結果のＤＮＡ塩基配列をＭＥＧＡ Ｘを用い、Ｎｅｉｇｈｂｏｒ－ｊｏｉｎｉｎｇ法にて作成した。
【0124】
その結果、図８に示すとおり、Ｆ３７ｍｉｘとＦ２９ｍｉｘは同等にクレブシエラをマウスの腸管内から排除した。一方、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓに属するＦ８ｍｉｘ投与群において、クレブシエラの菌量は変わらず、Ｆ８ｍｉｘは、クレブシエラの排除に関係ないことが示唆された。
【0125】
（実施例７）
３７株からＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓに属する株、１６ＳｒＤＮＡレベルで重複している株、アンピシリン投与で消失した株、クレブシエラと無関係の挙動を示す株を除外し１８株を選出した（図１０ 参照）。
３７株からＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓに属する株、１６ＳｒＤＮＡレベルで重複している株、アンピシリン投与で消失した株、クレブシエラと無関係の挙動を示す株を除外し１８株を選出した（図１０ 参照）。
【0126】
そして、図１１の上部に示すように、無菌マウスにＫｐ２Ｈ７株を投与し、１週間後に混合した単離菌（Ｆ便由来の３７株（Ｆ３７ｍｉｘ）、１８株（Ｆ１８ｍｉｘ）、Ｉ便由来の４２株（Ｉ４２ｍｉｘ））を投与した。
【0127】
【0128】
（実施例８）
図１０に示す１８株を系統樹に基づいて４つのグループに分けた（Ｂｌａｕｔｉａ、Ｌａｃｈｏｎｏｃｌｏｓｔｒｉｄｕｍ、ｏｔｈｅｒ Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ、ｏｔｈｅｒ Ｐｈｙｌａ）（図１２ 参照）。さらに、これらの４つのグループを１８菌株（Ｆ１８ｍｉｘ）から引いてＦ１５ｍｉｘ（Ｆ１８ｍｉｘ－ｏｔｈｅｒ ｐｈｙｌａ）、Ｆ１２ｍｉｘ（Ｆ１８ｍｉｘ－Ｌａｃｈｎｏｃｌｏｓｔｉｒｉｄｕｍ）、Ｆ１４ｍｉｘ（Ｆ１８ｍｉｘ－Ｂｌａｕｔｉａ）、Ｆ１３ｍｉｘ（Ｆ１８ｍｉｘ－ｏｔｈｅｒ Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）の菌株グループを作製した。また３７株から重複した株を除き、その３１株からさらに前記１８株を除いた１３株（Ｆ１３ｍｉｘ（Ｆ３１－１８ｍｉｘ））を混合した菌株セットも作製した。そして、図１３の上部に示すように、無菌マウスにＫｐ２Ｈ７を投与し、１週間後に、前述のとおり混合した各単離菌を投与した。
図１０に示す１８株を系統樹に基づいて４つのグループに分けた（Ｂｌａｕｔｉａ、Ｌａｃｈｏｎｏｃｌｏｓｔｒｉｄｕｍ、ｏｔｈｅｒ Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ、ｏｔｈｅｒ Ｐｈｙｌａ）（図１２ 参照）。さらに、これらの４つのグループを１８菌株（Ｆ１８ｍｉｘ）から引いてＦ１５ｍｉｘ（Ｆ１８ｍｉｘ－ｏｔｈｅｒ ｐｈｙｌａ）、Ｆ１２ｍｉｘ（Ｆ１８ｍｉｘ－Ｌａｃｈｎｏｃｌｏｓｔｉｒｉｄｕｍ）、Ｆ１４ｍｉｘ（Ｆ１８ｍｉｘ－Ｂｌａｕｔｉａ）、Ｆ１３ｍｉｘ（Ｆ１８ｍｉｘ－ｏｔｈｅｒ Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）の菌株グループを作製した。また３７株から重複した株を除き、その３１株からさらに前記１８株を除いた１３株（Ｆ１３ｍｉｘ（Ｆ３１－１８ｍｉｘ））を混合した菌株セットも作製した。そして、図１３の上部に示すように、無菌マウスにＫｐ２Ｈ７を投与し、１週間後に、前述のとおり混合した各単離菌を投与した。
【0129】
その結果、図１３の下部（グラフ）に示すとおり、Ｆ１８ｍｉｘは最もよくクレブシエラを排除した。しかしながら、そこからどのグループを除いてもクレブシエラの菌量は有意に多くなった。また図１４に示すとおり、図１３に示す実験におけるｄａｙ２８の時点における各投与群における便中クレブシエラのＣＦＵにおいても、Ｆ１８ｍｉｘは、Ｆ３７ｍｉｘ以外の他の群よりも、統計学的に有意にクレブシエラを低減できた。
【0130】
以上のことから、図１０に示した４つのグループのいずれも、クレブシエラの排除に関わっており、コミュニティとしてクレブシエラの排除を行なっていることが示唆された。
【0131】
また、図１３に示す実験において、Ｆ３７ｍｉｘ、Ｆ１８ｍｉｘ、Ｆ３１－１８ｍｉｘのグループのマウスから大腸粘膜固有層のリンパ球を抽出し、フローサイトメトリーでの解析に供した。
【0132】
その結果、図１５に示すように、ＣＤ４＋ＩＦＮγ＋細胞の割合はＦ１３ｍｉｘ（Ｆ３１－１８ｍｉｘ）群で高く、Ｆ３７ｍｉｘ、Ｆ１８ｍｉｘではＴｈ１細胞の誘導が抑制されていることが明らかになった。
【0133】
（実施例９）
実施例８にて示したとおり、Ｆ１８ｍｉｘから各グループの菌を除いた実験において、ｏｔｈｅｒ Ｐｈｙｌａの３株を除いたＦ１５ｍｉｘが、クレブシエラ排除能において、最も低かった。そこで、この群に着目し、Ｆ便由来の１８株からこの３株（Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）を１株ずつ除いたものを作製した。そして、図１６の上部に示すように、無菌マウスにＫｐ２Ｈ７株を投与し、１週間後に、前記のとおり混合した単離菌、Ｆ１８ｍｉｘ又はＦ１５ｍｉｘを投与した。
実施例８にて示したとおり、Ｆ１８ｍｉｘから各グループの菌を除いた実験において、ｏｔｈｅｒ Ｐｈｙｌａの３株を除いたＦ１５ｍｉｘが、クレブシエラ排除能において、最も低かった。そこで、この群に着目し、Ｆ便由来の１８株からこの３株（Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）を１株ずつ除いたものを作製した。そして、図１６の上部に示すように、無菌マウスにＫｐ２Ｈ７株を投与し、１週間後に、前記のとおり混合した単離菌、Ｆ１８ｍｉｘ又はＦ１５ｍｉｘを投与した。
【0134】
その結果、図１６の下部（グラフ）に示すとおり、前記３株のいずれかを除くことによって、クレブシエラ菌量の１ｌｏｇ程度の増加が認められ、いずれの株もクレブシエラの排除に関わっていることが示唆された。
【0135】
（実施例１０）
Ｆ３７ｍｉｘのクレブシエラを排除するメカニズムを探索するために、本メカニズムにホストの免疫が関与しているかに着目した。そこで、図１７の上部に示すとおり、無菌のＲａｇ２－／－γｃ－／－マウス、ＭｙＤ８８－／－Ｔｒｉｆｆ－／－マウス、又は野生型マウスにクレブシエラ２Ｈ７株を投与し、１週間後に混合したＦ３７ｍｉｘを投与した。
Ｆ３７ｍｉｘのクレブシエラを排除するメカニズムを探索するために、本メカニズムにホストの免疫が関与しているかに着目した。そこで、図１７の上部に示すとおり、無菌のＲａｇ２－／－γｃ－／－マウス、ＭｙＤ８８－／－Ｔｒｉｆｆ－／－マウス、又は野生型マウスにクレブシエラ２Ｈ７株を投与し、１週間後に混合したＦ３７ｍｉｘを投与した。
【0136】
その結果、図１７の下部（グラフ）に示すとおり、どのタイプのマウスにおいても、Ｆ３７ｍｉｘによる同程度のクレブシエラ２Ｈ７株の排除が認められた。このことから、ホストの主要な自然免疫、獲得免疫は、クレブシエラの排除に関与していないことが示唆された。
【0137】
次に、単離した菌株のＫｐ２Ｈ７株以外の病原菌や薬剤耐性菌への排除効果を評価した。なお、解析には、各菌特異的なプライマーとして、表８に示すプライマーを用いた。
【0138】
【表8】
【0139】
（実施例１１）
先ず、図１８の上部に示すように、無菌マウスにカルバペネム耐性クレブシエラ（ＣＲＥ）を投与し、１週間後に、混合したＦ３７ｍｉｘ、Ｋ６８ｍｉｘ又はＩ４２ｍｉｘを投与した。得られた結果を、図１８の下部に示す。
先ず、図１８の上部に示すように、無菌マウスにカルバペネム耐性クレブシエラ（ＣＲＥ）を投与し、１週間後に、混合したＦ３７ｍｉｘ、Ｋ６８ｍｉｘ又はＩ４２ｍｉｘを投与した。得られた結果を、図１８の下部に示す。
【0140】
なお、ＣＲＥの菌液は、ＬＢ液体培地に入れ３７℃で一晩培養し、ＯＤ値を１．２（１＊１０＾９ ＣＦＵ／ｍＬ相当）に調整し、２００μＬ／匹（２＊１０＾８ ＣＦＵ／匹相当）の菌液をマウスの胃内にゾンデを使用して投与した。ＣＲＥのＣＦＵのカウントには、アンピシリン３０ｍｇ／Ｌ、スペクチノマイシン ３０ｍｇ／Ｌ入りのＤＨＬ培地を選択培地として使用し、３７℃好気条件下で一晩培養した。
【0141】
また、混合した単離菌の投与後１ヶ月のマウスを解剖し、大腸を４％ＰＦＡで固定し、パラフィン包埋した後、薄切切片を作製した。この切片をヘマトキシリン液及びエオジン液で染色し、組織の炎症像を観察した。得られた結果を図１９に示す。
【0142】
図１８の下部（グラフ）に示すとおり、Ｆ３７ｍｉｘ及びＫ６８ｍｉｘは同等のＣＲＥ排除能を示し、Ｉ４２ｍｉｘはそれらよりもやや劣る結果であった。また、図１９に示すとおり、いずれのマウスにおいても、潰瘍形成や炎症細胞の浸潤等の炎症所見は認められなかった。このことから、前記各単離菌混合群を投与することによって、大腸における炎症惹起が抑制されることが明らかになった。
【0143】
（実施例１２）
図２０の上部に示すように、無菌マウスにバンコマイシン耐性Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ（ＶＲＥ）を投与し、１週間後に混合したＦ３７ｍｉｘ、Ｋ６８ｍｉｘ又はＩ４２ｍｉｘを投与した。
図２０の上部に示すように、無菌マウスにバンコマイシン耐性Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ（ＶＲＥ）を投与し、１週間後に混合したＦ３７ｍｉｘ、Ｋ６８ｍｉｘ又はＩ４２ｍｉｘを投与した。
【0144】
なお、ＶＲＥの菌液は、ＬＢ液体培地に入れ３７℃で一晩培養しＯＤ値 １．２（１＊１０＾９ ＣＦＵ／ｍＬ相当）に調整し、２００μＬ／匹（２＊１０＾８ ＣＦＵ／匹相当）の菌液をマウスの胃内にゾンデを使用して投与した。ＶＲＥのＣＦＵカウントにはＶＲＥ培地（日本ベクトン）を使用し、３７℃好気条件下で一晩培養した。
【0145】
その結果、図２０の下部（グラフ）に示すように、ＶＲＥに対し、Ｋ６８ｍｉｘが最も高い排除能を発揮した。また、図２１に示すとおり、いずれのマウスにおいても、潰瘍形成や炎症細胞の浸潤等の炎症所見は認められなかった。このことから、前記各単離菌混合群を投与することによって、大腸における炎症惹起が抑制されることが明らかになった。
【0146】
（実施例１３）
図２２の上部に示すように、無菌マウスにａｄｈｅｓｉｏｎ－ｉｎｖａｓｉｖｅ Ｅ．ｃｏｌｉ（ＡＩＥＣ ＬＦ８２）を投与し、１週間後に混合したＦ３７ｍｉｘ、Ｋ６８ｍｉｘ、Ｉ４２ｍｉｘを投与した。
図２２の上部に示すように、無菌マウスにａｄｈｅｓｉｏｎ－ｉｎｖａｓｉｖｅ Ｅ．ｃｏｌｉ（ＡＩＥＣ ＬＦ８２）を投与し、１週間後に混合したＦ３７ｍｉｘ、Ｋ６８ｍｉｘ、Ｉ４２ｍｉｘを投与した。
【0147】
なお、ＡＩＥＣ ＬＦ８２の菌液は、ＬＢ液体培地に入れ３７℃で一晩培養しＯＤ １．２（１＊１０＾９ ＣＦＵ／ｍＬ相当）に調整し、２００μＬ／匹（２＊１０＾８ ＣＦＵ／匹相当）の菌液をマウスの胃内にゾンデを使用して投与した。ＡＩＥＣ ＬＦ８２のＣＦＵのカウントには、セフォタキシム１ｍｇ／Ｌ入りのマッコンキー培地を選択培地として使用し、３７℃好気条件下で一晩培養しＣＦＵを算出した。
【0148】
その結果、図２２の下部（グラフ）に示すとおり、Ｆ３７ｍｉｘが最もＡＩＥＣ ＬＦ８２に対する排除能が高かった。
【0149】
（実施例１４）
図２３の上部に示すように、無菌マウスにＥＳＢＬ産生クレブシエラ（Ｋｐ－ＥＳＢＬ）（ＡＴＣＣ ７００７２１）を投与し、１週間後に混合したＦ３７ｍｉｘ、Ｋ６８ｍｉｘ、Ｉ４２ｍｉｘ又はＦ便を投与した。
図２３の上部に示すように、無菌マウスにＥＳＢＬ産生クレブシエラ（Ｋｐ－ＥＳＢＬ）（ＡＴＣＣ ７００７２１）を投与し、１週間後に混合したＦ３７ｍｉｘ、Ｋ６８ｍｉｘ、Ｉ４２ｍｉｘ又はＦ便を投与した。
【0150】
なお、Ｋｐ－ＥＳＢＬの菌液は、ＬＢ液体培地に入れ３７℃で一晩培養し、ＯＤ １．２（１＊１０＾９ ＣＦＵ／ｍＬ相当）に調整し、２００μＬ／匹（２＊１０＾８ ＣＦＵ／匹相当）の菌液をマウスの胃内にゾンデを使用して投与した。Ｋｐ－ＥＳＢＬのＣＦＵのカウントには、アンピシリン ３０ｍｇ／Ｌ、スペクチノマイシン ３０ｍｇ／Ｌ入りのＤＨＬ培地を選択培地として使用し、３７℃好気条件下で一晩培養し算出した。
【0151】
その結果、図２３の下部（グラフ）に示すとおり、Ｆ３７ｍｉｘ及びＫ６８ｍｉｘは、Ｆ便と同等のＫｐ－ＥＳＢＬ排除能を示した。
【0152】
（実施例１５）
図２４及び２５の上部に示すように、無菌マウスにＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ ８１－１７６（ＡＴＣＣ ＢＡＡ２１５１）を投与し、１週間後に混合したＦ３７ｍｉｘ、Ｋ６８ｍｉｘ、Ｉ４２ｍｉｘ又はＦ便を投与した。
図２４及び２５の上部に示すように、無菌マウスにＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ ８１－１７６（ＡＴＣＣ ＢＡＡ２１５１）を投与し、１週間後に混合したＦ３７ｍｉｘ、Ｋ６８ｍｉｘ、Ｉ４２ｍｉｘ又はＦ便を投与した。
【0153】
Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉの菌液は、ＴＳ液体培地に入れ微好気アネロパックとともに嫌気ジャーに入れて４２℃、４８時間培養し、その菌液をマウスの胃内にゾンデを使用して投与した。
【0154】
Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉに関してはその菌量を示すのに、ＣＦＵ及びｑＰＣＲを用いた。
【0155】
ＣＦＵカウントにはクロモアガーカンピロバクターを使用し、微好気アネロパックとともに嫌気ジャーに入れて４２℃、４８時間培養した。得られた結果を図２４に示す。
【0156】
ｑＰＣＲ測定は、以下の手順で行った
ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０ＩＩ（Ｒｏｃｈｅ；０５０１５２４３００１）及びＴｈｕｎｄｅｒｂｉｒｄ（登録商標）ＳＹＢＲ（登録商標）ｑＰＣＲ Ｍｉｘ（ＴＯＹＯＢＯ；ＱＰＳ－２０１Ｘ５）を用いて、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉゲノム特異的プライマー及びユニバーサル細菌プライマーで増幅定量し、算出したＤＮＡ濃度比率をＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉの存在比率とした。得られた結果を図２５に示す。
ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０ＩＩ（Ｒｏｃｈｅ；０５０１５２４３００１）及びＴｈｕｎｄｅｒｂｉｒｄ（登録商標）ＳＹＢＲ（登録商標）ｑＰＣＲ Ｍｉｘ（ＴＯＹＯＢＯ；ＱＰＳ－２０１Ｘ５）を用いて、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉゲノム特異的プライマー及びユニバーサル細菌プライマーで増幅定量し、算出したＤＮＡ濃度比率をＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉの存在比率とした。得られた結果を図２５に示す。
【0157】
なお、ｑＰＣＲのＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉゲノム特異的プライマーとして、配列番号：２２０及び２２１に記載のプライマーセットを用い、ユニバーサル細菌プライマーとしては、配列番号：２２２及び２２３に記載のプライマーセットを用いた。
【0158】
また、菌ゲノムの抽出は、以下の工程で行った
マウス糞便１０ｍｇに対してＥＤＴＡ及びグリセロール含有ＰＢＳ溶液（ＥＤＴＡの終濃度：１０ｍＭ、グリセロールの終濃度：２０体積％）を５倍重量加え、激しく振盪撹拌して破砕懸濁した。サンプル液１００μＬに、１５ｍｇリゾチーム（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製、Ｌｙｓｏｚｙｍｅ ｆｒｏｍ ｃｈｉｃｋｅｎ ｅｇｇ ｗｈｉｔｅ；Ｌ４９１９）及び５μＬ ＲＮａｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、ＰｕｒｅＬｉｎｋ ＲＮａｓｅ Ａ（２０ｍｇ／ｍＬ）；１２０９１－０２１）を溶解した１０ｍＭ Ｔｒｉｓ／１０ｍＭ ＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ８．０、以下「ＴＥ１０」とも称する）８００μＬを加え、３７℃で１時間振盪した。続いて、アクロモペプチダーゼ（登録商標）（Ｗａｋｏ；０１５－０９９５１）２，０００Ｕを添加し、３７℃で３０分間振盪し、溶菌した。そして、２０％ＳＤＳ ＴＥ１０溶液 ５０μＬと、終濃度が２０ｍｇ／ｍｌ プロテイナーゼＫ（Ｒｏｃｈｅ，Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ，ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ，ＰＣＲ Ｇｒａｄｅ；０３１１５８５２００１）を溶解したＴＥ１０溶液５０μＬを加え、５５℃で６０分間振盪した。次いで、４００μＬの溶液からＭａｘｗｅｌｌ（登録商標） ＲＳＣ Ｃｕｌｔｕｒｅｄ Ｃｅｌｌｓ ＤＮＡ Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いてＤＮＡを得た。
マウス糞便１０ｍｇに対してＥＤＴＡ及びグリセロール含有ＰＢＳ溶液（ＥＤＴＡの終濃度：１０ｍＭ、グリセロールの終濃度：２０体積％）を５倍重量加え、激しく振盪撹拌して破砕懸濁した。サンプル液１００μＬに、１５ｍｇリゾチーム（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製、Ｌｙｓｏｚｙｍｅ ｆｒｏｍ ｃｈｉｃｋｅｎ ｅｇｇ ｗｈｉｔｅ；Ｌ４９１９）及び５μＬ ＲＮａｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、ＰｕｒｅＬｉｎｋ ＲＮａｓｅ Ａ（２０ｍｇ／ｍＬ）；１２０９１－０２１）を溶解した１０ｍＭ Ｔｒｉｓ／１０ｍＭ ＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ８．０、以下「ＴＥ１０」とも称する）８００μＬを加え、３７℃で１時間振盪した。続いて、アクロモペプチダーゼ（登録商標）（Ｗａｋｏ；０１５－０９９５１）２，０００Ｕを添加し、３７℃で３０分間振盪し、溶菌した。そして、２０％ＳＤＳ ＴＥ１０溶液 ５０μＬと、終濃度が２０ｍｇ／ｍｌ プロテイナーゼＫ（Ｒｏｃｈｅ，Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ，ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ，ＰＣＲ Ｇｒａｄｅ；０３１１５８５２００１）を溶解したＴＥ１０溶液５０μＬを加え、５５℃で６０分間振盪した。次いで、４００μＬの溶液からＭａｘｗｅｌｌ（登録商標） ＲＳＣ Ｃｕｌｔｕｒｅｄ Ｃｅｌｌｓ ＤＮＡ Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いてＤＮＡを得た。
【0159】
図２４及び２５に示すとおり、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉに対してはいずれの混合した菌もＦ便と同等の良好な菌排除能を有していた。
【0160】
（実施例１６）
図２６の上部に示すとおり、無菌マウスにＣｌｏｓｔｒｉｄｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ（Ｓｔ．６３０）を投与し、１週間後に混合したＦ３７ｍｉｘ、Ｋ６８ｍｉｘ、Ｉ４２ｍｉｘ、Ｋ４７ｍｉｘ又はＦ便を投与した。なお、Ｋ４７ｍｉｘは、＃Ｋ由来の糞便試料から単離された４７株であり、１の菌株を除き、前記６８菌株と重複（表１及び２に記載のＫ１～Ｋ４６）している。
図２６の上部に示すとおり、無菌マウスにＣｌｏｓｔｒｉｄｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ（Ｓｔ．６３０）を投与し、１週間後に混合したＦ３７ｍｉｘ、Ｋ６８ｍｉｘ、Ｉ４２ｍｉｘ、Ｋ４７ｍｉｘ又はＦ便を投与した。なお、Ｋ４７ｍｉｘは、＃Ｋ由来の糞便試料から単離された４７株であり、１の菌株を除き、前記６８菌株と重複（表１及び２に記載のＫ１～Ｋ４６）している。
【0161】
Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｌｅの菌液は、Ｓｐｏｒｅ化し、１ｘ１０＾５ ｃｅｌｌｓ前後に調整しててマウスの胃内にゾンデを使用して投与した。Ｓｐｏｒｅ化は、Ｃｌｏｓｐｏｒｅ培地で８日間、３７℃嫌気チャンバー内で培養し、培地をＰＢＳでｗａｓｈした後、超音波処理、Ｌｙｓｏｉｚｙｍｅ及びｔｒｙｐｓｉｎを加えて４５℃、６時間、その後７０℃で１０分間処理し作製した。
【0162】
Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｌｅに関してはその菌量を定量するのにｑＰＣＲを用いた。ｑＰＣＲのプライマーには、配列番号：２２４及び２２５に記載のプライマーセットを用いた。
【0163】
その結果、図２６の下部に示すように、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに対しては、Ｋ６８ｍｉｘ及びＫ４７ｍｉｘにおいて高い排除能が認められた。
【産業上の利用可能性】
【0164】
以上説明したように、本発明によれば、薬剤耐性細菌及び炎症惹起性細菌の腸管への定着等を抑制することによって、これら細菌に起因する疾患を治療、改善又は予防することが可能となる。したがって、本発明は、薬剤耐性細菌又は炎症惹起性細菌に起因する感染症等に関する、医薬品の開発、治療、改善及び予防等において、極めて有用である。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6A】
【図6B】
【図6C】
【図6D】
【図6E】
【図6F】
【図6G】
【図6H】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【配列表】