(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-05-14
(45)【発行日】2024-05-22
(54)【発明の名称】テアフラビンを含む脂肪細胞の分化促進用組成物
(51)【国際特許分類】
A61K 31/353 20060101AFI20240515BHJP
A61K 8/49 20060101ALI20240515BHJP
A61K 8/9789 20170101ALI20240515BHJP
A61Q 19/00 20060101ALI20240515BHJP
A61K 36/82 20060101ALI20240515BHJP
A61K 36/28 20060101ALI20240515BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240515BHJP
A61P 17/00 20060101ALI20240515BHJP
A23L 33/105 20160101ALI20240515BHJP
【ＦＩ】
A61K31/353
A61K8/49
A61K8/9789
A61Q19/00
A61K36/82
A61K36/28
A61P43/00 105
A61P17/00
A23L33/105
【請求項の数】
10
(21)【出願番号】P 2021555605
(86)(22)【出願日】2020-04-06
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-06-23
(86)【国際出願番号】 KR2020004636
(87)【国際公開番号】W WO2020218755
(87)【国際公開日】2020-10-29
【審査請求日】2023-01-10
(31)【優先権主張番号】10-2019-0048189
(32)【優先日】2019-04-25
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(31)【優先権主張番号】10-2020-0029539
(32)【優先日】2020-03-10
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(73)【特許権者】
【識別番号】506213681
【氏名又は名称】アモーレパシフィック コーポレーション
【氏名又は名称原語表記】ＡＭＯＲＥＰＡＣＩＦＩＣ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ
【住所又は居所原語表記】１００， Ｈａｎｇａｎｇ－ｄａｅｒｏ， Ｙｏｎｇｓａｎ－ｇｕ， Ｓｅｏｕｌ， Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｋｏｒｅａ
(74)【代理人】
【識別番号】110000556
【氏名又は名称】弁理士法人有古特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】パク， ピル ジュン
(72)【発明者】
【氏名】ラ， チャン ス
【審査官】愛清 哲
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１９／０９３６５１（ＷＯ，Ａ１）
【文献】韓国公開特許第１０－２０１８－００９１９９１（ＫＲ，Ａ）
【文献】特表２００５－５２３２４２（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２００２／０３９９５６（ＷＯ，Ａ２）
【文献】国際公開第２００６／０７８６００（ＷＯ，Ａ１）
【文献】中国特許出願公開第１０６２５６３５７（ＣＮ，Ａ）
【文献】特開２０１７－１９２３４６（ＪＰ，Ａ）
【文献】Theaflavin-Enriched Fraction Stimulates Adipogenesis in Human Subcutaneous Fat Cells，Int.J.Mol.Sci，2019年04月25日，20,2034，pp.1-11，doi:10.3390/ijms20082034
【文献】Antiobesity and lipid lowering effects of theaflavins on high-fat diet induced obese rats，JOURNAL OF FUNCTIONAL FOODS，2013年，5，pp.1142-1150，http://dx.doi.org/10.1016/j.jff.2013.03.011
【文献】NMRを用いた茶成分のメタボロミクス，天然有機化合物討論会講演要旨集，2015年，第57回，pp.453-458，https://doi.org/10.24496/tennenyuki.57.0_PosterP59
【文献】Purification and Characterization of Polyphenol Oxidase from Garland Chrysanthemum (Chrysanthemum coronarium L.)，J.Agric.Food Chem.，2003年，51，pp.5467-5471，10.1021/jf0212542
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ ３１／００－３１／８０
Ａ６１Ｋ ８／００－ ８／９９
Ａ６１Ｋ ３６／００－３６／９０６８
Ａ６１Ｐ ４３／００
Ａ６１Ｐ １７／００－１７／１８
Ａ６１Ｑ １９／００－１９／１０
Ａ２３Ｌ ３３／００－３３／２９
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
テアフラビン、その異性体、その薬学的に許容可能な塩、その水和物又はその溶媒和物を有効成分として含む、脂肪細胞の分化促進用組成物であって、
前記テアフラビン、その異性体、その薬学的に許容可能な塩、その水和物又はその溶媒和物の組成物中での濃度は、０．５～１０,０００ｍｇ／ｋｇであり、
テアフラビン－３,３’－ジガレートを含まない、
組成物。
【請求項2】
テアフラビン、その異性体、その薬学的に許容可能な塩、その水和物又はその溶媒和物を有効成分として含む発酵緑茶抽出物を含む、脂肪細胞の分化促進用組成物であって、
前記発酵緑茶抽出物は、
（ａ）緑茶及び春菊を混合して混合物を調製するステップ；
（ｂ）前記混合物を減圧状態で発酵及び乾燥するステップ；及び
（ｃ）前記発酵及び乾燥された混合物を抽出するステップを含む方法によって製造されたものであり、
ここで、前記ステップ（ｃ）においては、
抽出溶媒は水及び炭素数１～５のアルコールからなる群より選択される１種以上であり、
抽出温度は２０～８０℃であり、
抽出時間は１～２４時間である、
組成物。
【請求項3】
前記発酵緑茶抽出物は、テアフラビン、テアフラビン－３－ガレート、テアフラビン－３’－ガレート、及びテアフラビン－３,３’－ジガレートを含むテアフラビン類を含み、 前記テアフラビンを前記テアフラビン類の総重量に対し３０～５０重量％含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項4】
前記テアフラビン、その異性体、その薬学的に許容可能な塩、その水和物又はその溶媒和物の投与量は、０．５～１０,０００ｍｇ／ｋｇ／日である、請求項１に記載の組成物。
【請求項5】
前記組成物は、脂肪細胞の分化促進による肌ボリュームアップ用である、請求項１に記載の組成物。
【請求項6】
前記組成物は、脂肪細胞の分化促進による皮下脂肪減少抑制用である、請求項１に記載の組成物。
【請求項7】
前記組成物は、経皮投与用である、請求項１～６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項8】
前記組成物は、化粧料組成物である、請求項１～６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項9】
前記組成物は、薬学組成物である、請求項１～６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項10】
前記組成物は、食品組成物である、請求項１～６のいずれか一項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本明細書は、テアフラビンを含む脂肪細胞の分化促進用組成物に関して記述する。
【0002】
（関連出願に対する相互参照）
本出願は、２０１９年４月２５日付で出願された大韓民国特許出願第１０－２０１９－００４８１８９号及び２０２０年３月１０日付で出願された大韓民国特許出願第１０－２０２０－００２９５３９号に基づく優先権を主張するものであり、その出願内容全体が本出願に参照として取り込まれる。
本出願は、２０１９年４月２５日付で出願された大韓民国特許出願第１０－２０１９－００４８１８９号及び２０２０年３月１０日付で出願された大韓民国特許出願第１０－２０２０－００２９５３９号に基づく優先権を主張するものであり、その出願内容全体が本出願に参照として取り込まれる。
【背景技術】
【0003】
皮下脂肪は、皮膚の構造を支える主な皮膚器官の一つであって、内臓脂肪とは異なり、年を取るにつれて徐々にその効力を失って、構造体としての機能を喪失することが知られている。このため、顔部位の肌凹み現象を抑制及び補完すべく種々の方法にて抗老化を実現しようとしたが、皮下脂肪による抗老化を実現する方法としてエステティックからアプローチする施術方法を除いては、現在まで皮下脂肪の脂肪分化を促進できる明確な方法は存在していない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0004】
【文献】韓国公開特許第１０－２０１８－００９１９９１号公報
【文献】韓国公開特許第１０－２００８－００５２６７５号公報
【文献】国際公開第０２／３９９５６号
【文献】国際公開第２００６／０７８６００号
【文献】中国特許出願公開第１０６２５６３５７号明細書
【非特許文献】
【0005】
【文献】PARK, P. J. et al., Theaflavin-Enriched Fraction Stimulates Adipogensis in Human Subcutaneous Fat Cells, International journal of molecular sciences, 15 April 2019, vol.20, thesis no.:2034, page 9.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
一観点において、本発明が解決しようとする課題は、種々の緑茶由来のポリフェノールの中でも他の物質に変化し易く、その機能を確信できなかったテアフラビンによってヒト由来の皮下脂肪に処理したときに、皮下脂肪に特異的に脂肪を蓄積できる効果を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0007】
一側面において、本発明は、テアフラビン、その異性体、その薬学的に許容可能な塩、その水和物又はその溶媒和物を有効成分として含む、脂肪細胞の分化促進用組成物を提供する。
【発明の効果】
【0008】
一観点において、本発明は、脂肪細胞の分化を促進して肌弾力、しわ改善、肌ボリュームアップ、皮膚再生、皮下脂肪減少を改善する効果を提供する。
【図面の簡単な説明】
【0009】
【図1】各抽出物別のＨＰＬＣ成分の分析結果である：（Ａ）標準化学物質（１；テアフラビン（ｔｈｅａｆｌａｖｉｎ、ＴＦ）、２；テアフラビン－３－ガレート（ｔｈｅａｆｌａｖｉｎ－３－ｇａｌｌａｔｅ、ＴＦ３Ｇ）、３；テアフラビン－３’－ガレート（ｔｈｅａｆｌａｖｉｎ－３’－ｇａｌｌａｔｅ、ＴＦ３’Ｇ）、及び４；テアフラビン－３,３’－ジガレート（ｔｈｅａｆｌａｖｉｎ－３、３’－ｄｉｇａｌｌａｔｅ、ＴＦＤＧ））、（Ｂ）非発酵緑茶抽出物（ＧＴ）、（Ｃ）テアフラビン濃縮生発酵抽出物（ＣｏＦ－ＧＴ）、（Ｄ）緑茶発酵抽出物（Ｆ－ＧＴ）。
【図2】テアフラビン濃縮生発酵抽出物（ＣｏＦ－ＧＴ）、緑茶発酵抽出物（Ｆ－ＧＴ）、テアフラビン（ＴＦ）、テアフラビン－３,３’－ジガレート（ＴＦＤＧ）の細胞増殖効能の分析結果を示した図である。
【図3】テアフラビン濃縮生発酵抽出物（ＣｏＦ－ＧＴ）、緑茶発酵抽出物（Ｆ－ＧＴ）、テアフラビン（ＴＦ）、テアフラビン－３,３’－ジガレート（ＴＦＤＧ）の細胞生存性（７２時間）効能の分析結果を示した図である。
【図4】テアフラビン（ＴＦ）及びテアフラビン－３,３’－ジガレート（ＴＦＤＧ）の皮下脂肪分化促進効果を確認した図である。
【図5】テアフラビン濃縮生発酵抽出物（ＣｏＦ－ＧＴ）及び緑茶発酵抽出物（Ｆ－ＧＴ）の皮下脂肪分化促進効果を確認した図である。
【図6】テアフラビン（ＴＦ）、テアフラビン－３,３’－ジガレート（ＴＦＤＧ）、テアフラビン濃縮生発酵抽出物（ＣｏＦ－ＧＴ）、及び緑茶発酵抽出物（Ｆ－ＧＴ）をそれぞれ処理してから皮下脂肪の脂肪生成量を測定した結果を示した図である。
【図7】テアフラビン（ＴＦ）、テアフラビン－３,３’－ジガレート（ＴＦＤＧ）、テアフラビン濃縮生発酵抽出物（ＣｏＦ－ＧＴ）、及び緑茶発酵抽出物（Ｆ－ＧＴ）をそれぞれ処理してからの遺伝子発現の分析結果を示した図である。
【図8】テアフラビン（ＴＦ）、テアフラビン－３,３’－ジガレート（ＴＦＤＧ）、テアフラビン濃縮生発酵抽出物（ＣｏＦ－ＧＴ）、及び緑茶発酵抽出物（Ｆ－ＧＴ）をそれぞれ処理してからのアディポネクチン（Ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ）生成量の測定結果を示した図である。
【図9】テアフラビン（ＴＦ）の濃度別の細胞増殖効能（２４時間）及び細胞生存性（７２時間）効能の分析結果を示した図である。
【図10】テアフラビン（ＴＦ）の濃度別の脂肪細胞の分化促進効能の分析結果を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【0010】
以下、添付した図面を参照しつつ、本出願の実施例についてより詳細に説明することとする。しかし、本出願に開示された技術は、ここで説明される実施例に限定されるものではなく、他の形態に具体化されてもよい。なお、ここで紹介される実施例は、開示された内容が徹底かつ完全となり得るよう、そして、当業者に本出願の思想が十分に伝えられるようにするために提供されるものである。図面において各構成要素を明確に表現するために、構成要素の幅や厚さなどの大きさを多少拡大して示した。また、説明の便宜のために、構成要素の一部のみを図示したりもしたが、当業者であれば、構成要素の残りの部分についても容易に把握することができるであろう。また、当該分野における通常の知識を有する者であれば、本出願の技術的思想を逸脱しない範囲内で、本出願の思想を種々の他の形態に具現できるであろう。
【0011】
一実施例において、本発明は、テアフラビン（ｔｈｅａｆｌａｖｉｎ）、その異性体、その薬学的に許容可能な塩、その水和物又はその溶媒和物を有効成分として含む組成物を提供することができる。
【0012】
本明細書において「異性体」は、特に光学異性体（ｏｐｔｉｃａｌ ｉｓｏｍｅｒｓ）（例えば、本質的に純粋なエナンチオマー（ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｐｕｒｅ ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒｓ）、本質的に純粋なジアステレオマー（ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｐｕｒｅ ｄｉａｓｔｅｒｅｏｍｅｒｓ）又はそれらの混合物）だけでなく、配座異性体（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｓｏｍｅｒｓ）（すなわち、１つ以上の化学結合のその角度のみ異なる異性体）、位置異性体（ｐｏｓｉｔｉｏｎ ｉｓｏｍｅｒｓ）（特に、互変異性体（ｔａｕｔｏｍｅｒｓ））、又は幾何異性体（ｇｅｏｍｅｔｒｉｃ ｉｓｏｍｅｒｓ）（例えば、シス－トランス異性体）を含む。
【0013】
本明細書において「本質的に純粋な（ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｐｕｒｅ）」とは、例えば、エナンチオマー又はジアステレオマーと関連して用いた場合、エナンチオマー又はジアステレオマーを例として挙げることのできる具体的な化合物が約９０％以上、好ましくは約９５％以上、より好ましくは約９７％以上、又は約９８％以上、さらに好ましくは約９９％以上、最も好ましくは約９９．５％以上（ｗ／ｗ）存在することを意味する。
【0014】
本明細書において「薬学的に許容可能」とは、通常の医薬的服用量（Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ ｄｏｓａｇｅ）で用いる際に相当な毒性効果を避けることにより、動物、より具体的には、ヒトに用いることができるという政府又はこれに準ずる規制機構の承認を受けることができ、又は承認を受け、又は一般的な薬局方に列挙され、又はその他一般的な薬局方に記載されたものと認定されることを意味する。
【0015】
本明細書において「薬学的に許容可能な塩」は、薬学的に許容可能であり、親化合物（ｐａｒｅｎｔ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）の好ましい薬理活性を有する本発明の一側面に係る塩を意味する。前記塩は、（１）塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸などといった無機酸から形成されるか；又は、酢酸、プロピオン酸、ヘキサン酸、シクロペンテンプロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、乳酸、マロン酸、コハク酸、リンゴ酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、３－（４－ヒドロキシベンゾイル）安息香酸、桂皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、１，２－エタン－ジスルホン酸、２－ヒドロキシエタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、４－クロロベンゼンスルホン酸、２－ナフタレンスルホン酸、４－トルエンスルホン酸、カンファースルホン酸、４－メチルビシクロ［２，２，２］－ｏｃｔ－２－エン－１－カルボン酸、グルコヘプトン酸、３－フェニルプロピオン酸、トリメチル酢酸、ｔｅｒｔ－ブチル酢酸、ラウリル硫酸、グルコン酸、グルタミン酸、ヒドロキシナフトエ酸、サリチル酸、ステアリン酸、ムコン酸といった有機酸から形成される酸付加塩（ａｃｉｄ ａｄｄｉｔｉｏｎ ｓａｌｔ）；又は、（２）親化合物に存在する酸性プロトンが置換されるときに形成される塩を含んでよい。
【0016】
本明細書において「水和物（ｈｙｄｒａｔｅ）」は、水が結合している化合物を意味し、水と混合物との間に化学的な結合力のない内包化合物を含む広範囲な概念である。
【0017】
本明細書において「溶媒和物」は、溶質の分子やイオンと溶媒の分子やイオンとの間に生じた高次の化合物を意味する。
【0018】
他の一実施例は、脂肪細胞の分化促進用組成物の製造に用いるための前記テアフラビン、その異性体、その薬学的に許容可能な塩、その水和物又はその溶媒和物の用途を提供することができる。他の一実施例は、前記テアフラビン、その異性体、その薬学的に許容可能な塩、その水和物又はその溶媒和物を、これを必要とする対象に有効量で投与することを含む脂肪細胞の分化促進方法を提供することができる。他の一実施例は、脂肪細胞の分化促進用組成物に用いるための有効成分として、前記テアフラビン、その異性体、その薬学的に許容可能な塩、その水和物又はその溶媒和物を提供することができる。他の一実施例は、脂肪細胞の分化促進に用いるためのテアフラビン、その異性体、その薬学的に許容可能な塩、その水和物又はその溶媒和物を提供することができる。また、脂肪細胞の分化促進のための有効成分として、前記テアフラビン、その異性体、その薬学的に許容可能な塩、その水和物又はその溶媒和物の非治療的用途を提供することができる。
【0019】
本発明は、前記テアフラビン（ｔｈｅａｆｌａｖｉｎ）、その異性体、その薬学的に許容可能な塩、その水和物又はその溶媒和物を有効成分として含むことで、ヒト由来、例えば、顔部位の皮下脂肪細胞に処理した場合、次のような効能を示すことができる。具体的に、テアフラビンは、水溶性で水に溶け易いため他の剤形と混ざり合い易く、ヒト由来の皮下脂肪細胞に処理した結果、濃度に係わらず細胞増殖及び毒性に変化を起こさない。他のテアフラビン類が既存の抗肥満効能と知られた脂肪分化の抑制効能を示すのに対し、本発明の有効成分であるテアフラビンは濃度依存的に皮下脂肪の分化を促進させる。一実施例として、前記組成物は、脂肪細胞の分化促進による肌ボリュームアップ用であってよい。一実施例として、前記組成物は、脂肪細胞の分化促進による皮下脂肪減少抑制用であってよい。
【0020】
一実施例において、前記組成物が含むテアフラビン（ｔｈｅａｆｌａｖｉｎ）、その異性体、その薬学的に許容可能な塩、その水和物又はその溶媒和物の含量は制限されないが、例えば、組成物の総重量に対し０．０１～１００重量％であってよく、具体的には、０．０１～５０重量％であってよい。より具体的に、テアフラビン（ｔｈｅａｆｌａｖｉｎ）、その異性体、その薬学的に許容可能な塩、その水和物又はその溶媒和物は、組成物の総重量に対し０．０１重量％以上、０．１重量％以上、１重量％以上、５重量％以上、１０重量％以上、１５重量％以上、２０重量％以上、２５重量％以上、３０重量％以上、３５重量％以上、４０重量％以上、４５重量％以上、５０重量％以上、５５重量％以上、６０重量％以上、６５重量％以上、７０重量％以上、７５重量％以上、８０重量％以上、８５重量％以上、９０重量％以上、又は９５重量％以上であってよい。より具体的に、テアフラビン（ｔｈｅａｆｌａｖｉｎ）、その異性体、その薬学的に許容可能な塩、その水和物又はその溶媒和物の含量は、組成物の総重量に対し１００重量％以下、９５重量％以下、９０重量％以下、８５重量％以下、８０重量％以下、７５重量％以下、７０重量％以下、６５重量％以下、６０重量％以下、５５重量％以下、５０重量％以下、４５重量％以下、４０重量％以下、３５重量％以下、３０重量％以下、２５重量％以下、２０重量％以下、１５重量％以下、１０重量％以下、５重量％以下、１重量％以下、又は０．１重量％以下であってよい。
【0021】
一実施例において、前記テアフラビン、その異性体、その薬学的に許容可能な塩、その水和物又はその溶媒和物の組成物中の濃度は、０．０１～１０,０００ｍｇ／ｋｇであってよく、これは組成物の投与経路に応じて変わり得る。一実施例において、前記テアフラビン、その異性体、その薬学的に許容可能な塩、その水和物又はその溶媒和物の投与量は、０．０１～１０,０００ｍｇ／ｋｇ／日であってよく、これは組成物の投与経路に応じて変わり得る。より具体的に、前記テアフラビン、その異性体、その薬学的に許容可能な塩、その水和物又はその溶媒和物の濃度又は１日投与量は、０．０１ｍｇ／ｋｇ以上、０．１ｍｇ／ｋｇ以上、０．５ｍｇ／ｋｇ以上、１ｍｇ／ｋｇ以上、２ｍｇ／ｋｇ以上、３ｍｇ／ｋｇ以上、４ｍｇ／ｋｇ以上、５ｍｇ／ｋｇ以上、１０ｍｇ／ｋｇ以上、１５ｍｇ／ｋｇ以上、２０ｍｇ／ｋｇ以上、２５ｍｇ／ｋｇ以上、３０ｍｇ／ｋｇ以上、３５ｍｇ／ｋｇ以上、４０ｍｇ／ｋｇ以上、４５ｍｇ／ｋｇ以上、５０ｍｇ／ｋｇ以上、５５ｍｇ／ｋｇ以上、６０ｍｇ／ｋｇ以上、６５ｍｇ／ｋｇ以上、７０ｍｇ／ｋｇ以上、７５ｍｇ／ｋｇ以上、８０ｍｇ／ｋｇ以上、８５ｍｇ／ｋｇ以上、９０ｍｇ／ｋｇ以上、９５ｍｇ／ｋｇ以上、１００ｍｇ／ｋｇ以上、２００ｍｇ／ｋｇ以上、３００ｍｇ／ｋｇ以上、４００ｍｇ／ｋｇ以上、５００ｍｇ／ｋｇ以上、６００ｍｇ／ｋｇ以上、７００ｍｇ／ｋｇ以上、８００ｍｇ／ｋｇ以上、９００ｍｇ／ｋｇ以上、１,０００ｍｇ／ｋｇ以上、２,０００ｍｇ／ｋｇ以上、３,０００ｍｇ／ｋｇ以上、４,０００ｍｇ／ｋｇ以上、５,０００ｍｇ／ｋｇ以上、６,０００ｍｇ／ｋｇ以上、７,０００ｍｇ／ｋｇ以上、８,０００ｍｇ／ｋｇ以上、９,０００ｍｇ／ｋｇ以上であってよい。より具体的に、前記テアフラビン、その異性体、その薬学的に許容可能な塩、その水和物又はその溶媒和物の濃度は、１０,０００ｍｇ／ｋｇ以下、９,０００ｍｇ／ｋｇ以下、８,０００ｍｇ／ｋｇ以下、７,０００ｍｇ／ｋｇ以下、６,０００ｍｇ／ｋｇ以下、５,０００ｍｇ／ｋｇ以下、４,０００ｍｇ／ｋｇ以下、３,０００ｍｇ／ｋｇ以下、２,０００ｍｇ／ｋｇ以下、１,０００ｍｇ／ｋｇ以下、９００ｍｇ／ｋｇ以下、８００ｍｇ／ｋｇ以下、７００ｍｇ／ｋｇ以下、６００ｍｇ／ｋｇ以下、５００ｍｇ／ｋｇ以下、４００ｍｇ／ｋｇ以下、３００ｍｇ／ｋｇ以下、２００ｍｇ／ｋｇ以下、１００ｍｇ／ｋｇ以下、９５ｍｇ／ｋｇ以下、９０ｍｇ／ｋｇ以下、８５ｍｇ／ｋｇ以下、８０ｍｇ／ｋｇ以下、７５ｍｇ／ｋｇ以下、７０ｍｇ／ｋｇ以下、６５ｍｇ／ｋｇ以下、６０ｍｇ／ｋｇ以下、５５ｍｇ／ｋｇ以下、５０ｍｇ／ｋｇ以下、４５ｍｇ／ｋｇ以下、４０ｍｇ／ｋｇ以下、３５ｍｇ／ｋｇ以下、３０ｍｇ／ｋｇ以下、２５ｍｇ／ｋｇ以下、２０ｍｇ／ｋｇ以下、１５ｍｇ／ｋｇ以下、１０ｍｇ／ｋｇ以下、５ｍｇ／ｋｇ以下、１ｍｇ／ｋｇ以下、０．５ｍｇ／ｋｇ以下、又は０．１ｍｇ／ｋｇ以下であってよい。
【0022】
具体的に、経口投与時における前記テアフラビン、その異性体、その薬学的に許容可能な塩、その水和物又はその溶媒和物の濃度又は１日投与量は、０．０１～１,０００ｍｇ／ｋｇであってよいが、これに制限されない。皮膚塗布時における前記テアフラビン、その異性体、その薬学的に許容可能な塩、その水和物又はその溶媒和物の濃度又は１日投与量は、０．０１～３,０００ｍｇ／ｋｇであってよいが、これに制限されない。皮下への直接投与時における前記テアフラビン、その異性体、その薬学的に許容可能な塩、その水和物又はその溶媒和物の濃度又は１日投与量は、０．０１～１００ｍｇ／ｋｇであってよいが、これに制限されない。
【0023】
一実施例において、前記テアフラビンは、発酵緑茶抽出物に含まれたものであってよい。すなわち、前記組成物は、テアフラビンを含む発酵緑茶抽出物を含むものであってよい。
【0024】
茶は、ツバキ科（Ｔｈｅａｃｅａｅ）、ツバキ属（Ｃａｍｅｌｌｉａ）に属する茶の木（Ｃａｍｅｌｌｉａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ Ｏ、Ｋｕｎｔｚｅ）の芽や葉を加工したものであって、茶の生葉には７５～８０％の水分と２０～２５％の固形分が含有されており、固形分にはカテキン、カフェイン、アミノ酸、繊維素、ペクチンなどの有機物と、脂質、樹脂類、精油、ビタミン、クロロフィルなどの多様な成分が含有されている。茶は、通常、発酵の程度に応じて発酵度が０％である不発酵茶（緑茶）、２０～６０％である半発酵茶（白茶、花茶、包種茶及びウーロン茶）及び８０％以上の発酵茶（紅茶）に大別している。伝統的な発酵茶は、茶葉に含有された酵素による発酵を用いることから酵素発酵茶という。酵素発酵茶である紅茶類は、茶葉を採葉してから萎凋過程を経て葉を柔らかくし香りの生成に必要な生化学反応が起きるように誘導し、揉捻過程を経て酸化酵素とポリフェノールとの反応を促進させ、発酵工程でカテキン類の酸化重合を促進させることでテアフラビン類を生成し褐色化を伴って香と味が生成される。酵素発酵茶は、発酵が進むにつれて酸化酵素によってエピカテキン、エピガロカテキンガレートなどのカテキン類の酸化重合反応が起きて赤黄色を帯びるテアフラビン類（ｔｈｅａｆｌａｖｉｎｓ）を生成し、主にテアフラビン（ｔｈｅａｆｌａｖｉｎ）、テアフラビン－３－ガレート（ｔｈｅａｆｌａｖｉｎ－３－ｇａｌｌａｔｅ）、テアフラビン－３’－ガレート（ｔｈｅａｆｌａｖｉｎ－３’－ｇａｌｌａｔｅ）及びテアフラビン－３,３’－ジガレート（ｔｈｅａｆｌａｖｉｎ－３,３’－ｄｉｇａｌｌａｔｅ）などの４種が報告されている。これらのテアフラビン類は、抗酸化活性、抗突然変異などの効果などを有すると知られており、酸化酵素の作用によって酸化重合物が生成され、これによって茶の赤色度が増加し香や味に差異が生じ、生成物の体内生理活性にも差異がある。
【0025】
本明細書において「発酵緑茶」は、発酵された状態の緑茶を意味するものとし、発酵の程度による差異をすべて包括する。
【0026】
本発明の一実施例に係る前記発酵緑茶抽出物は、テアフラビン、テアフラビン－３－ガレート、テアフラビン－３’－ガレート、及びテアフラビン－３,３’－ジガレートを含むテアフラビン類を含み、このとき、本発明の有効成分であるテアフラビンを、前記テアフラビン類の総重量に対し３０～５０重量％含んでよい。
【0027】
一実施例として、前記発酵緑茶抽出物は、（ａ）緑茶及び春菊を混合してなる混合物を調製するステップ；（ｂ）前記混合物を減圧状態で発酵及び乾燥するステップ；及び（ｃ）前記発酵及び乾燥された混合物を抽出するステップを含む方法によって製造されたものであってよい。
【0028】
本発明に係る発酵緑茶を製造する方法の一実施例として、前記（ａ）ステップは、緑茶及び春菊を混合してなる混合物を調製するステップである。
【0029】
本発明において緑茶は、緑茶葉、緑茶木の幹及び緑茶木の根からなる群より選ばれる１種以上を含んでよく、例えば、緑茶葉を含んでよい。また、前記緑茶は、酵素反応の促進のために生育中の緑茶を用いてよい。
【0030】
本発明の一実施例において、前記春菊は、緑茶の発酵を促進させる発酵添加組成物として用いられてよい。前記春菊にはポリフェノール酸化酵素及びパーオキシダーゼが含まれており、緑茶の発酵を促進できる。本発明の一実施例において、前記春菊は、粉末化した春菊磨砕物又は搾汁液の状態で用いられてよい。前記粉末化した春菊磨砕物は当業界において公知のものであれば特に限定されないが、破砕機（ｃｒｕｓｈｅｒ）で１次粉砕された粉末を粉末機（ｇｒｉｎｄｅｒ）で１～５００μｍ程度の微粒子に再粉砕して製造するか、又は１次粉砕なしにボールミル（ｂａｌｌ ｍｉｌｌ）やハンマーミル（ｈａｍｍｅｒ ｍｉｌｌ）などで微粉末に製造したものであってよい。前記搾汁液は当業界において公知のものであれば特に限定されない。
【0031】
一実施例として、前記緑茶及び春菊は、１：１～９９：１の重量比で混合してよく、具体的には、２０：１～５：１の重量比で混合してよく、より具体的には、１０：１の重量比で混合してよい。前記春菊が緑茶の重量よりも多く含まれると、緑茶発酵を短時間で行うことはできるものの、酸化速度が速くなってテアフラビン類の減少が生じることがあり、また緑茶及び春菊が９９：１の重量比を超えると、緑茶に含まれた酵素に支配されてテアフラビン類のうちのテアフラビンの含量が増加しない。
【0032】
一実施例として、前記緑茶及び春菊を混合してなる混合物は、更に、蒸留水、イオン水、上水、ミネラルを含む地下水、及び３０％未満のアルコールを溶媒として含んでよい。前記溶媒は、一実施例として、緑茶１００重量部に対し５０～２００重量部で含まれてよく、具体的には、８０～１５０重量部で含まれてよい。
【0033】
一実施例において、前記（ｂ）ステップは、前記（ａ）ステップで調製した混合物を減圧状態で発酵及び乾燥させるステップである。本明細書において「発酵」は、緑茶に自然に存在する酸化酵素の作用で起きることを意味する。前記減圧状態は、酸素との接触が遮られた状態のことを言い、一実施例において、１０～５０ｍｍＨｇの減圧状態で発酵及び乾燥させてよい。具体的に、前記減圧状態での発酵は２０～５０℃の温度で１～１０時間行われてよく、より具体的には、２～５時間行われてよい。前記発酵温度が２０℃未満であると、発酵時間が長引くことがあり、また５０℃を超えると、酵素の失活速度が速くなって不完全な発酵がなされることがある。また、前記（ｂ）ステップは、発酵された混合物を乾燥し、前記乾燥は凍結乾燥であってよい。前記凍結乾燥はその方法を特に限定するものではなく、当業界において公知の方法で行われてよい。
【0034】
一実施例において、前記（ｃ）ステップは、前記（ｂ）ステップで発酵及び乾燥された混合物を抽出するステップである。前記抽出は、抽出溶媒を用いて行われ、抽出溶媒は、水及び炭素数１～５のアルコールからなる群より選ばれる１種以上を含み、具体的には、水及びエタノールからなる群より選ばれる１種以上を含んでよい。抽出温度及び抽出時間は特に限定するものではないが、例えば、抽出温度は常温～８０℃であり、抽出時間は１～２４時間である。前記（ｃ）ステップにおいて発酵及び乾燥混合物は多様な方法によって抽出されてよく、例えば、熱水抽出物又は炭素数１～５の低級アルコール抽出物を用いた方法であってよい。
【0035】
例えば、第１具現例として、前記発酵及び乾燥された混合物重量の１０～３０倍数程度の水を添加し１００℃で４時間１次抽出を行ない、同様な方法で４時間２次抽出した後、１次及び２次抽出液を合わせてろ過した後、そのろ液を濃縮器で濃縮する。前記濃縮された抽出液を噴霧乾燥器又は真空冷凍凍結乾燥器を利用して乾燥させる。第２具現例として、７０％のエタノール抽出物の製造方法は、発酵及び乾燥された混合物重量の１０～３０倍数程度の７０％エタノールを添加し５０～８０℃で３０分～３時間抽出した後、ろ過し、そのろ液を濃縮器で濃縮する。前記濃縮された抽出液を噴霧乾燥器又は真空冷凍凍結乾燥器を用いて乾燥させる。第３具現例として、９５％のエタノール抽出物の製造方法は、発酵及び乾燥された混合物重量の１０～３０倍数程度の９５％エタノールを添加し室温で１日～３日間放置し、６時間毎にシェイキング（ｓｈａｋｉｎｇ）作業を繰り返し行って抽出した後、同様な方法で２回繰り返し行って抽出液を得る。前記１次及び２次抽出液を合わせてろ過した後、そのろ液を濃縮器で濃縮する。前記濃縮された抽出液を噴霧乾燥器又は真空冷凍凍結乾燥器を用いて乾燥させる。
【0036】
一般に発酵緑茶抽出物は、発酵が進むにつれて酸化酵素によってエピカテキン、エピガロカテキンガレートなどのカテキン類の酸化重合反応が起きて赤黄色を帯びるテアフラビン類（ｔｈｅａｆｌａｖｉｎs）を生成し、前記テアフラビン類は、テアフラビン（ｔｈｅａｆｌａｖｉｎ）、テアフラビン－３－ガレート（ｔｈｅａｆｌａｖｉｎ－３－ｇａｌｌａｔｅ）、テアフラビン－３’－ガレート（ｔｈｅａｆｌａｖｉｎ－３’－ｇａｌｌａｔｅ）、及びテアフラビン－３,３’－ジガレート（ｔｈｅａｆｌａｖｉｎ－３,３’－ｄｉｇａｌｌａｔｅ）を含む。
【0037】
前記一実施例に係る本発明の発酵緑茶は、テアフラビン類のうちのテアフラビンを他のテアフラビン類に対し高含量で含むことで、ヒト由来の皮下脂肪細胞の分化を促進させて高い脂肪細胞生成誘導効能を示す。具体的に、前記発酵緑茶抽出物は、テアフラビン類の総重量に対しテアフラビンを３０～５０重量％含んでよい。
【0038】
一実施例として、本発明に係る組成物が含む前記発酵緑茶抽出物の含量は特に制限されないが、一例として、組成物の総重量に対し０．０１～９９．９重量％、具体的には、０．１～５０重量％含んでよい。前記含量で含む場合、本発明の意図した効果を示すうえで適切であるだけでなく、組成物の安定性及び安全性をいずれも満たすことができ、且つコスト対効果の面でも好ましい。
【0039】
一実施例において、前記本発明に係る組成物は化粧料組成物であってよい。前記化粧料組成物は、化粧品学又は皮膚科学的に許容可能な媒質又は基剤を含有して剤形化されてよい。これは局所適用に適合したあらゆる剤形であって、経皮投与用であってよい。例えば、溶液、ゲル、固体、練り無水生成物、水相に油相を分散させて得たエマルジョン、懸濁液、マイクロエマルジョン、マイクロカプセル、微細顆粒球若しくはイオン型(リポソーム)及び非イオン型の小胞分散剤の形態で、又はクリーム、スキン、ローション、パウダー、軟膏、スプレー若しくはコンシールスティックの形態で提供されてよい。また、泡沫（ｆｏａｍ）の形態で、又は圧縮された推進剤を更に含有したエアロゾル組成物の形態でも用いられてよい。他の例として、フィラー（ｆｉｌｌｅｒ）のような注射剤、坐剤、パッチなどの剤形であってよいが、これらに制限されるものではない。これらの組成物は、当該分野の通常的な方法によって製造されてよい。
【0040】
一実施例として、前記本発明に係る組成物は、前記有効成分と共に主効果を損なわない範囲内で、好ましくは、主効果に相乗効果を与え得る他の成分を含有しても構わなく、本発明の有効成分に加え、他の成分をその他化粧料組成物の剤形又は使用目的に応じて当業者が難なく適宜選定して配合してよい。また、一実施例として、本発明に係る化粧料組成物は、前記成分と共に必要に応じて通常の化粧料組成物に配合される他の成分を含んでよい。例えば、保湿剤、エモリエント剤、有機及び無機顔料、有機粉体、紫外線吸収剤、防腐剤、殺菌剤、酸化防止剤、植物抽出物、ｐＨ調整剤、アルコール、色素、香料、血行促進剤、冷感剤、制汗剤、精製水などが挙げられる。本発明に係る化粧料組成物に含まれてよいその他の配合成分はこれらに限定されるものではなく、前記成分の配合量は、本発明の目的及び効果を損なわない範囲内であってよい。
【0041】
本発明の実施例に係る組成物は、前記有効成分を含む食品組成物であってよい。例えば、前記有効成分を含む発酵乳、チーズ、ヨーグルト、ジュース、生菌製剤、及び健康食品などといった機能性食品として加工されてよく、その他、多様な食品添加剤の形態で用いられてよい。一実施例として、組成物は、健康食品用組成物であってよい。一実施例として、前記健康食品用組成物は、丸剤、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、キャラメル剤又はドリンク剤などに剤形化することができる。他の一実施例として、液剤、粉末、顆粒、錠剤又はティーバッグなどの形態に加工されてもよい。前記組成物は、単純飲用、注射投与、スプレー方式又はスクイーズ方式などの様々な方法で投与されてよい。前記組成物は、本発明の主効果を損なわない範囲内で主効果に相乗効果を与え得る他の成分などを含有してよい。例えば、物性改善のために、香料、色素、殺菌剤、酸化防止剤、防腐剤、保湿剤、増粘剤、無機塩類、乳化剤、及び合成高分子物質などの添加剤を更に含んでよい。その他にも、水溶性ビタミン、油溶性ビタミン、高分子ペプチド、高分子多糖、及び海草エキスなどの補助成分を更に含んでよい。前記成分は、剤形又は使用目的に応じて当業者が適宜選定して配合してよく、その添加量は、本発明の目的及び効果を損なわない範囲内で選択されてよい。例えば、前記成分の添加量は、組成物の全重量を基準に、０．０００１重量％～９９．９重量％であってよい。
【0042】
本発明の実施例に係る組成物は、前記有効成分を含む薬剤学的組成物であってよい。前記薬剤学的組成物は、防腐剤、安定化剤、水和剤又は乳化促進剤、浸透圧調節のための塩及び／又は緩衝剤などの薬剤学的補助剤、並びにその他治療的に有用な物質を更に含有してよい。
【0043】
一実施例として、前記薬剤学的組成物は、経口投与剤であってよく、前記経口投与剤は、例えば、錠剤、丸剤、硬質及び軟質カプセル剤、液剤、懸濁剤、乳化剤、シロップ剤、粉剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、ペレット剤などがある。これらの剤形は、有効成分の他、界面活性剤、希釈剤（例：ラクトース、デキストロース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、セルロース及びグリシン）、滑沢剤（例：シリカ、タルク、ステアリン酸及びそのマグネシウム又はカルシウム塩、並びにポリエチレングリコール）を含有してよい。錠剤は、更に、マグネシウムアルミニウムシリケート、澱粉ペースト、ゼラチン、トラガカンス、メチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース及びポリビニルピロリジンといった結合剤を含有してよく、場合に応じて、澱粉、寒天、アルギン酸又はそのナトリウム塩といった崩解剤、吸収剤、着色剤、香味剤、及び甘味剤などの薬学的添加剤を含有してよい。前記錠剤は、通常の混合、顆粒化又はコーティング方法によって製造されてよい。
【0044】
一実施例として、前記薬剤学的組成物は、非経口投与剤であってよく、前記非経口投与剤は、直腸、局所、皮下、径皮投与型剤形であってよい。例えば、フィラー（ｆｉｌｌｅｒ）のような注射剤、点滴剤、軟膏、スキン、ローション、ゲル、クリーム、スプレー、懸濁剤、乳剤、坐剤、パッチなどの剤形であってよいが、これらに制限されるものではない。
【0045】
一実施例として、前記薬剤学的組成物の投与量は、治療を受ける対象の年齢、性別、体重と、治療する特定の疾患又は病理状態、疾患又は病理状態の深刻度、投与経路及び処方者の判断に応じて異なり得る。このような因子に基づく投与量の決定は当業者の水準内にある。例えば、前記投与量は、０．０１～１０,０００ｍｇを一日に１回～３回に分けて投与してよいが、前記投与量は、如何なる方法でも本明細書の範囲を限定するものではない。
【0046】
以下、実施例、比較例、及び試験例を参照して本発明を詳しく説明する。なお、これらは単に本発明をより具体的に説明するために例示したものに過ぎず、本発明の範囲がこれらの実施例、比較例及び試験例によって制限されないことは当業者にとって自明であろう。
【0047】
［実施例１］テアフラビン含量が強化されたＣoＦ－ＧＴ（生緑茶・共発酵）分画の生産
生緑茶及び春菊の葉を脱イオン水で２回洗浄し過度な水を軽くたたいて除去した。これらの葉を液体窒素に浸漬してから破砕して－８０℃で保管した。ＣoＦ－ＧＴは次のようにして製造した。ＣoＦ－ＧＴは、生緑茶粉末（１００ｇ）と冷凍された生春菊（５０ｍｇ）との混合物を発酵した。３時間の反応後、混合物を７０％エチルアルコール（ｖ／ｖ）で２時間抽出した。固形分及び残渣を９０メッシュ篩に通してから０．２２μｍフィルタ（Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ｎｙ、ＵＳＡ）でろ過した。ろ過されたサンプルをＨｅｉ－ＶＡＰ回転濃縮蒸発器（Ｈｅｉｄｏｌｐｈ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｓｃｈｗａｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で蒸発させてからＦｒｅｅＺｏｎｅ凍結乾燥器（Ｌａｂｃｏｎｃｏ、Ｋａｎｓａｓ Ｃｉｔｙ、ＭＯ、ＵＳＡ）を用いて粉末化した。
生緑茶及び春菊の葉を脱イオン水で２回洗浄し過度な水を軽くたたいて除去した。これらの葉を液体窒素に浸漬してから破砕して－８０℃で保管した。ＣoＦ－ＧＴは次のようにして製造した。ＣoＦ－ＧＴは、生緑茶粉末（１００ｇ）と冷凍された生春菊（５０ｍｇ）との混合物を発酵した。３時間の反応後、混合物を７０％エチルアルコール（ｖ／ｖ）で２時間抽出した。固形分及び残渣を９０メッシュ篩に通してから０．２２μｍフィルタ（Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ｎｙ、ＵＳＡ）でろ過した。ろ過されたサンプルをＨｅｉ－ＶＡＰ回転濃縮蒸発器（Ｈｅｉｄｏｌｐｈ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｓｃｈｗａｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で蒸発させてからＦｒｅｅＺｏｎｅ凍結乾燥器（Ｌａｂｃｏｎｃｏ、Ｋａｎｓａｓ Ｃｉｔｙ、ＭＯ、ＵＳＡ）を用いて粉末化した。
【0048】
［比較例１］通常に発酵されたＦ－ＧＴ（緑茶一般発酵）分画の生産
Ｆ－ＧＴは、生緑茶の葉を脱イオン水で２回洗浄し過度な水を軽くたたいて除去した。葉を液体窒素に浸漬してから破砕して－８０℃で保管した。３７．５℃の熱ジャケットｚ－ブレード混合器（ＩＫＡ、Ｓｔａｕｆｅｎ ｉｍ Ｂｒｅｉｓｇａｕ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で冷凍された生緑茶粉末（１００ｇ）を発酵して製造した。３時間の反応後、混合物を７０％エチルアルコール（ｖ／ｖ）で２時間抽出した。固形分及び残渣を９０メッシュ篩に通してから０．２２μｍフィルタ（Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ、ＵＳＡ）でろ過した。ろ過されたサンプルをＨｅｉ－ＶＡＰ回転濃縮蒸発器（Ｈｅｉｄｏｌｐｈ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｓｃｈｗａｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で蒸発させてからＦｒｅｅＺｏｎｅ凍結乾燥器（Ｌａｂｃｏｎｃｏ、Ｋａｎｓａｓ Ｃｉｔｙ、ＭＯ、ＵＳＡ）を用いて粉末化した。
Ｆ－ＧＴは、生緑茶の葉を脱イオン水で２回洗浄し過度な水を軽くたたいて除去した。葉を液体窒素に浸漬してから破砕して－８０℃で保管した。３７．５℃の熱ジャケットｚ－ブレード混合器（ＩＫＡ、Ｓｔａｕｆｅｎ ｉｍ Ｂｒｅｉｓｇａｕ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で冷凍された生緑茶粉末（１００ｇ）を発酵して製造した。３時間の反応後、混合物を７０％エチルアルコール（ｖ／ｖ）で２時間抽出した。固形分及び残渣を９０メッシュ篩に通してから０．２２μｍフィルタ（Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ、ＵＳＡ）でろ過した。ろ過されたサンプルをＨｅｉ－ＶＡＰ回転濃縮蒸発器（Ｈｅｉｄｏｌｐｈ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｓｃｈｗａｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で蒸発させてからＦｒｅｅＺｏｎｅ凍結乾燥器（Ｌａｂｃｏｎｃｏ、Ｋａｎｓａｓ Ｃｉｔｙ、ＭＯ、ＵＳＡ）を用いて粉末化した。
【0049】
［試験例１］ＣoＦ－ＧＴ及びＦ－ＧＴ分画のＨＰＬＣ分析
各サンプル（８ｇ）を３０分間超音波処理後に１００ｍｌ ＤＭＳＯ／メタノール／エタノール（５：４５：５０、ｖ／ｖ）の混合物に溶解させてから遠心分離をした後、０．４５μｍポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）注射器フィルタ（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐ.、Ｐｏｒｔ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、ＮＹ、ＵＳＡ）でろ過した。８２ｍｌの試料を５０ｍｌサンプルルーフに充填し光ダイオードアレイ検出器付きのＡＫＴＡｐｕｒｉｆｉｅｒ １０（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ、Ｓｗｅｄｅｎ）に注入して２７５と３６５ｎｍで分析した。精製分離はＡＱ－ＨＧ ｏｃｔａｄｅｃｙｌｓｉｌｙｌコラム（１２０Å、１０μｍ、２０×２５０ｍｍ、ｃｏｌｕｍｎ ｖｏｌｕｍｅ＝７８．５ｍｌ）（ＹＭＣ Ｃｏ.、Ｋｙｏｔｏ、Ｊａｐａｎ）で行った。純粋な水（溶媒Ａ）及びアセトニトリル（溶媒Ｂ）で勾配溶出を行った。１回に８．２ｍｌのサンプル溶液を注入し、移動相の流速は１０ｍｌ／ｍｉｎであった。全ての溶媒はろ過し、脱気し、適切な圧力下で用いられた。サンプルの注入後に分画（１１０ｍｌ）を収集した。各サイクルに４つの分画物を得、１０回のサイクルに亘って個別のボトルに収集した。毎回４番目の分画を一つに集めてＨｅｉ－ＶＡＰ回転式蒸発器（Ｈｅｉｄｏｌｐｈ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）で溶媒を除去し、凍結乾燥して粉末化した後、分析を行うまで－２０℃で保存した。
各サンプル（８ｇ）を３０分間超音波処理後に１００ｍｌ ＤＭＳＯ／メタノール／エタノール（５：４５：５０、ｖ／ｖ）の混合物に溶解させてから遠心分離をした後、０．４５μｍポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）注射器フィルタ（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐ.、Ｐｏｒｔ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、ＮＹ、ＵＳＡ）でろ過した。８２ｍｌの試料を５０ｍｌサンプルルーフに充填し光ダイオードアレイ検出器付きのＡＫＴＡｐｕｒｉｆｉｅｒ １０（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ、Ｓｗｅｄｅｎ）に注入して２７５と３６５ｎｍで分析した。精製分離はＡＱ－ＨＧ ｏｃｔａｄｅｃｙｌｓｉｌｙｌコラム（１２０Å、１０μｍ、２０×２５０ｍｍ、ｃｏｌｕｍｎ ｖｏｌｕｍｅ＝７８．５ｍｌ）（ＹＭＣ Ｃｏ.、Ｋｙｏｔｏ、Ｊａｐａｎ）で行った。純粋な水（溶媒Ａ）及びアセトニトリル（溶媒Ｂ）で勾配溶出を行った。１回に８．２ｍｌのサンプル溶液を注入し、移動相の流速は１０ｍｌ／ｍｉｎであった。全ての溶媒はろ過し、脱気し、適切な圧力下で用いられた。サンプルの注入後に分画（１１０ｍｌ）を収集した。各サイクルに４つの分画物を得、１０回のサイクルに亘って個別のボトルに収集した。毎回４番目の分画を一つに集めてＨｅｉ－ＶＡＰ回転式蒸発器（Ｈｅｉｄｏｌｐｈ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）で溶媒を除去し、凍結乾燥して粉末化した後、分析を行うまで－２０℃で保存した。
【0050】
前記発酵茶のテアフラビン成分の検出のためにＨＰＬＣ（Ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）を用いて前記実施例１及び比較例１で製造した発酵緑茶抽出物のテアフラビン（ｔｈｅａｆｌａｖｉｎ、ＴＦ）、テアフラビン－３－ガレート（ｔｈｅａｆｌａｖｉｎ－３－ｇａｌｌａｔｅ、ＴＦ－３Ｇ）、テアフラビン－３’－ガレート（ｔｈｅａｆｌａｖｉｎ－３’－ｇａｌｌａｔｅ、ＴＦ－３’Ｇ）、及びテアフラビン－３,３’－ジガレート（ｔｈｅａｆｌａｖｉｎ－３,３’－ｄｉｇａｌｌａｔｅ、ＴＦ－３,３’ＤＧ）の含量分析を行った。テアフラビン標準品はＷａｋｏ社から購入し、試料は５０％エタノール溶媒に溶解して超音波抽出後に０．４５μｍ ＰＶＤＦフィルタでろ過して機器に注入した。機器はＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ Ａｌｌｉａｎｃｅ ２６９５ ｓｙｓｔｅｍ、Ｗａｔｅｒｓ、ＵＳＡ）を用い、検出波長を２７０ｎｍ領域にして分析を行った。コラムはＯｐｔｉｍａｐａｋ Ｃ１８（１５０×４．６ｍｍ、５μｍ）を用い、０．０５％トリフルオロ酢酸（Ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ、ＴＦＡ）とアセトニトリル（Ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ、ＡＣＮ）溶媒を用いたグラジエントモードで分析を行い、溶媒の濃度組成比を下記の表１に表した。全ての分析溶媒はＨＰＬＣ級試薬を用い、データ処理はウォーターズ社のＥｍｐｏｗｅｒ ３プログラムを用いて行った。
【0051】
【表1】
【0052】
その結果、図１に見られるように既存の緑茶発酵技法（比較例１）を適用した緑茶発酵抽出物（Ｆ－ＧＴ）の場合には、主な４種のポリフェノール成分が一様に増加するが、共発酵技法を適用したテアフラビン生発酵抽出物（ＣoＦ－ＧＴ、実施例１）はテアフラビン（１）の含量が優先して多く生成された。
【0053】
［試験例２］細胞培養と分化及び細胞生存性の分析
細胞培養と分化
ヒト由来皮下脂肪細胞（ｈｕｍａｎ Ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ Ｆａｔ ｃｅｌｌｓ、ｈＳＣＦ）と未分化皮下脂肪細胞培養培地をＺｅｎＢｉｏ（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｔｒｉａｎｇｌｅ Ｐａｒｋ、ＮＣ、ＵＳＡ）から購入した。ｈＳＣＦは培養期間の間５％ＣＯ２培養器で培養された。分化を誘導するために１０μｇ／ｍｌインスリン、０．５ｍＭ ３－イソブチル－１－メチルキサンチン（３－ｉｓｏｂｕｔｙｌ－１－ｍｅｔｈｙｌｘａｎｔｈｉｎｅ）、１μｍデキサメタゾン（ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）、１μｇトログリタゾン（ｔｒｏｇｌｉｔａｚｏｎｅ）（いずれもＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（ＵＳＡ）から購入）と共に１０％の胎児血清（ＰＡＡ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ、ＵＳＡ）を含有したダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ；Ｌｏｎｚａ、Ｗａｌｓｖｉｌｌ、ＭＤ、ＭＤ、ＵＳＡ）で２１日間培養された。培地は隔日に取り替えした。
細胞培養と分化
ヒト由来皮下脂肪細胞（ｈｕｍａｎ Ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ Ｆａｔ ｃｅｌｌｓ、ｈＳＣＦ）と未分化皮下脂肪細胞培養培地をＺｅｎＢｉｏ（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｔｒｉａｎｇｌｅ Ｐａｒｋ、ＮＣ、ＵＳＡ）から購入した。ｈＳＣＦは培養期間の間５％ＣＯ２培養器で培養された。分化を誘導するために１０μｇ／ｍｌインスリン、０．５ｍＭ ３－イソブチル－１－メチルキサンチン（３－ｉｓｏｂｕｔｙｌ－１－ｍｅｔｈｙｌｘａｎｔｈｉｎｅ）、１μｍデキサメタゾン（ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）、１μｇトログリタゾン（ｔｒｏｇｌｉｔａｚｏｎｅ）（いずれもＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（ＵＳＡ）から購入）と共に１０％の胎児血清（ＰＡＡ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ、ＵＳＡ）を含有したダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ；Ｌｏｎｚａ、Ｗａｌｓｖｉｌｌ、ＭＤ、ＭＤ、ＵＳＡ）で２１日間培養された。培地は隔日に取り替えした。
【0054】
細胞生存性分析
ｈＳＣＦの生存性はメーカの指針に従ってＥＺ－Ｃｙｔｏｘ検査キット（ＤＡＥＩＬ ＬＡＢ ＳＥＲＶＩＣＥ、ソウル、大韓民国）で測定された。簡単に、７日間培養された細胞に対し、薬物処理後にそれぞれ２４時間と７２時間にわたって０．１、０．５、１、５及び１０μｇ／ｍｌの多様な濃度でテアフラビン濃縮生発酵抽出物（ＣｏＦ－ＧＴ）、緑茶発酵抽出物（Ｆ－ＧＴ）、テアフラビン（ＴＦ）及びテアフラビン－３,３’－ジガレート（ＴＦＤＧ）をそれぞれ処理した。ＥＺ－Ｃｙｔｏｘ溶液（１０μｌ）を各ウェルに加え、３７℃で２時間培養した。４５０ｎｍにおける吸光度を分光光度計（Ｓｙｅｒｇｅｎｅｒｇｙ Ｈ２；ＢｉｏＴｅｋ、Ｗｉｎｏｓｋ、ＶＴ、ＵＳＡ）で測定した。実験は３回繰り返し行われ、データは吸光度値を対照群に対しての比較活性比率（％）で表した。
ｈＳＣＦの生存性はメーカの指針に従ってＥＺ－Ｃｙｔｏｘ検査キット（ＤＡＥＩＬ ＬＡＢ ＳＥＲＶＩＣＥ、ソウル、大韓民国）で測定された。簡単に、７日間培養された細胞に対し、薬物処理後にそれぞれ２４時間と７２時間にわたって０．１、０．５、１、５及び１０μｇ／ｍｌの多様な濃度でテアフラビン濃縮生発酵抽出物（ＣｏＦ－ＧＴ）、緑茶発酵抽出物（Ｆ－ＧＴ）、テアフラビン（ＴＦ）及びテアフラビン－３,３’－ジガレート（ＴＦＤＧ）をそれぞれ処理した。ＥＺ－Ｃｙｔｏｘ溶液（１０μｌ）を各ウェルに加え、３７℃で２時間培養した。４５０ｎｍにおける吸光度を分光光度計（Ｓｙｅｒｇｅｎｅｒｇｙ Ｈ２；ＢｉｏＴｅｋ、Ｗｉｎｏｓｋ、ＶＴ、ＵＳＡ）で測定した。実験は３回繰り返し行われ、データは吸光度値を対照群に対しての比較活性比率（％）で表した。
【0055】
前記各処理物質のｈＳＣＦｓに影響力を示す濃度を確認した結果、前記処理物質はいずれも、２４時間処理の増殖効果実験（図２）と７２時間処理の毒性確認実験（図３）の全濃度区間において若干の細胞増殖効果を除いた如何なる毒性効果も示さない安全な物質であることを確認した。
【0056】
［試験例３］ＯＲＯ（Ｏｉｌ Ｒｅｄ Ｏ）染色によるトリグリセリド（Ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ、ＴＧ）含量分析
皮下脂肪細胞の分化結果は、Ｏｉｌ Ｒｅｄ Ｏ染色によって脂肪生成を定性及び定量的に確認した。
【0057】
ｈＳＣＦを冷たいリン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し３．７％ホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で１時間にわたって固定した。固定された細胞は６０％プロピレングリコール（ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で３０分間洗浄してからＯｉｌ Ｒｅｄ Ｏ（０．７％ ＯＲＯ ｓｔｏｃｋは６０％プロピレングリコールで希釈して調製）の溶液で染色した。再び、細胞を８５％のプロピレングリコールで３回洗浄してから流れる水道水で濯いだ。ＯＲＯで染色された脂肪滴（ｌｉｐｉｄ ｄｒｏｐｌｅｔ、ＬＤ）をＩＸ７１顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）で観察及び写真化した。ＬＤを定量化するために７０％プロピレングリコール（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で染色された細胞を洗浄し、イソプロピルアルコール（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ ａｌｃｏｈｏｌ）に４％ Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ－４０（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を混ぜ合わせた溶液を細胞に処理して、２０分間ＯＲＯで染色された細胞からＯＲＯのみを抽出した。抽出物の吸光度は、分光光度計で４９０ｎｍにおいて測定した。
【0058】
ｈＳＣＦｓが脂肪滴（ｌｉｐｉｄ ｄｒｏｐｌｅｔ）を生成する成熟した脂肪（ｍａｔｕｒｅ ａｄｉｐｏｃｙｔｅｓ）に分化するには約２１日の時間が必要である。したがって、テアフラビン（ＴＦ）及びテアフラビン－３,３’－ジガレート（ＴＦＤＧ）をそれぞれ０．５、２μｇ／ｍｌ、テアフラビン濃縮生発酵抽出物（ＣｏＦ－ＧＴ）及び緑茶発酵抽出物（Ｆ－ＧＴ）をそれぞれ１、５、１０μｇ／ｍｌで処理した培地において２１日間それぞれ培養した。その結果、本発明の一実施例であるテアフラビン（ＴＦ）及びテアフラビン濃縮生発酵抽出物（ＣｏＦ－ＧＴ）の場合、濃度依存的に脂肪生成を増加させることをＯｉｌ Ｒｅｄ Ｏ染色法によって確認し、これと対照的にＴＦＤＧとＦ－ＧＴを処理した場合、既存緑茶の抗肥満効果である脂肪分解が起きることを確認した（図４）。前記図３及び図４の染色された脂肪の量を定量化するために、トリグリセリド（ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ、ＴＧ）の量を測定して図６にグラフで表した。
【0059】
［試験例４］リアルタイム定量ＰＣＲ（Ｒｅａｌｔｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ；ＲＴ－ｑＰＣＲ）
総ＲＮＡは、メーカの指示に従ってＴＲＩｚｏｌ試薬（ＴＲＩｚｏｌ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて抽出し、相補的ＤＮＡ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ＤＮＡ；ｃＤＮＡ）は逆転写キット（Ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）を用いて合成した。ｃＤＮＡは、ＴａｑＭａｎ(登録商標)プローブ（Ｔａｑｍａｎ ｐｒｏｂｅ）を用い、７５００高速リアルタイムＰＣＲシステム（Ｆａｓｔ７５００ Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）でＲＴ－ｑＰＣＲ増幅のテンプレートとして用いられ、ＰＰＡＲγ（Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｇａｍｍａ #Ｈｓ０１１１５５１３_ｍ１）、アディポネクチン（ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ、ＡＤＩＰＯＱ；#Ｈｓ００６０５９１７_ｍ１）及びグリセルアルデヒド（ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ ３－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ、ＧＡＰＤＨ；#４３５２３３９Ｅ）は対照遺伝子として用いられた。データは独立して繰り返された３回の実験で得、標本の値はＧＡＰＤＨ水準に対する相対的な数に変化して提示される。
総ＲＮＡは、メーカの指示に従ってＴＲＩｚｏｌ試薬（ＴＲＩｚｏｌ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて抽出し、相補的ＤＮＡ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ＤＮＡ；ｃＤＮＡ）は逆転写キット（Ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）を用いて合成した。ｃＤＮＡは、ＴａｑＭａｎ(登録商標)プローブ（Ｔａｑｍａｎ ｐｒｏｂｅ）を用い、７５００高速リアルタイムＰＣＲシステム（Ｆａｓｔ７５００ Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）でＲＴ－ｑＰＣＲ増幅のテンプレートとして用いられ、ＰＰＡＲγ（Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｇａｍｍａ #Ｈｓ０１１１５５１３_ｍ１）、アディポネクチン（ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ、ＡＤＩＰＯＱ；#Ｈｓ００６０５９１７_ｍ１）及びグリセルアルデヒド（ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ ３－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ、ＧＡＰＤＨ；#４３５２３３９Ｅ）は対照遺伝子として用いられた。データは独立して繰り返された３回の実験で得、標本の値はＧＡＰＤＨ水準に対する相対的な数に変化して提示される。
【0060】
脂肪分化に関連する遺伝子であるＰＰＡＲγとアディポネクチン（Ａｄｉｐｏｑ）の量を測定した結果、図７に示すように前記試験例３の染色結果及びテアフラビン量と類似した結果を確認した。
【0061】
［試験例５］培地に溶出されたアディポネクチンの分析
皮下脂肪の分化後にコンディション確認のために、培地に溶出される脂肪細胞特異的ホルモン（ａｄｉｐｏｃｙｔｅ ｃｙｔｏｋｉｎｅ、ａｄｉｐｏｋｉｎｅ）の一つであるアディポネクチン（ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ）の量の増加をＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）測定法によって確認した。
皮下脂肪の分化後にコンディション確認のために、培地に溶出される脂肪細胞特異的ホルモン（ａｄｉｐｏｃｙｔｅ ｃｙｔｏｋｉｎｅ、ａｄｉｐｏｋｉｎｅ）の一つであるアディポネクチン（ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ）の量の増加をＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）測定法によって確認した。
【0062】
ｈＳＣＦに多様な濃度のテアフラビン（ＴＦ）、テアフラビン－３,３’－ジガレート（ＴＦＤＧ）、テアフラビン濃縮生発酵抽出物（ＣｏＦ－ＧＴ）、及び緑茶発酵抽出物（Ｆ－ＧＴ）をそれぞれ処理して２１日間分化した。培養培地を収去して１５分間１３,０００ｒｐｍで遠心分離後に異物を除去した。ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ、ＮＹ、ＵＳＡ）は、メーカの指針に従って用いて溶出されたアディポネクチンの水準を測定した。その結果、図８に示したように脂肪分化後に培地に溶出される脂肪細胞由来のホルモン（ａｄｉｐｏｋｉｎｅ）の一つである、アディポネクチンが、テアフラビン－３,３’－ジガレート（ＴＦＤＧ）及び緑茶発酵抽出物（Ｆ－ＧＴ）を処理した場合には減少するのに対し、本発明の一実施例であるテアフラビン（ＴＦ）及びテアフラビン濃縮生発酵抽出物（ＣｏＦ－ＧＴ）の処理時には、その濃度が増加するに伴いアディポネクチンの量も増加した。これは先の試験例３及び４の実験結果とも一致する結果である。
【0063】
［試験例６］テアフラビン（ＴＦ）の濃度別の細胞培養と分化及び細胞生存性分析
前記試験例２と同様な方法によって０．０１～１００μｇ／ｍｌのテアフラビン（ＴＦ）がｈＳＣＦｓに影響力を示す濃度を確認し、これを図９に示した。その結果、２４時間処理の増殖効果実験と７２時間処理の毒性確認実験のいずれも、処理されたすべての濃度において若干の細胞増殖効果を除いた如何なる毒性効果も示さない安全な物質であることを確認した。
前記試験例２と同様な方法によって０．０１～１００μｇ／ｍｌのテアフラビン（ＴＦ）がｈＳＣＦｓに影響力を示す濃度を確認し、これを図９に示した。その結果、２４時間処理の増殖効果実験と７２時間処理の毒性確認実験のいずれも、処理されたすべての濃度において若干の細胞増殖効果を除いた如何なる毒性効果も示さない安全な物質であることを確認した。
【0064】
［試験例７］テアフラビン（ＴＦ）の濃度別のトリグリセリド（Ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ、ＴＧ）増加効能分析
前記試験例３と同様な方法によってテアフラビン（ＴＦ）０～１００μｇ／ｍｌに対し、濃度別の皮下脂肪細胞の分化効能を分析した。
前記試験例３と同様な方法によってテアフラビン（ＴＦ）０～１００μｇ／ｍｌに対し、濃度別の皮下脂肪細胞の分化効能を分析した。
【0065】
その結果、図１０に示したように、テアフラビン（ＴＦ）は５０μｇ／ｍｌまでは濃度依存的に脂肪分化を促進し、１００μｇ／ｍｌで脂肪分化能力が５０μｇ／ｍｌよりも多少減少した。
【0066】
以下、本明細書の一実施例に係る組成物の剤形例を説明するが、他の種々の剤形への応用も可能であり、これは、本明細書を限定するためではない単に具体的に説明するためのものである。
【0067】
［剤形例１］柔軟化粧水（スキンローション）
下記の表に記載された組成にて通常の方法に従い柔軟化粧水を製造した。
下記の表に記載された組成にて通常の方法に従い柔軟化粧水を製造した。
【0068】
【表2】
【0069】
［剤形例２］栄養化粧水（ミルクローション）
下記の表に記載された組成にて通常の方法に従い栄養化粧水を製造した。
下記の表に記載された組成にて通常の方法に従い栄養化粧水を製造した。
【0070】
【表3】
【0071】
［剤形例３］マッサージクリーム
下記の表に記載された組成にて通常の方法に従いマッサージクリームを製造した。
下記の表に記載された組成にて通常の方法に従いマッサージクリームを製造した。
【0072】
【表4】
【0073】
［剤形例４］錠剤
テアフラビン１００ｍｇ、ラクトース４００ｍｇ、とうもろこし澱粉４００ｍｇ及びステアリン酸マグネシウム２ｍｇを混合した後、通常の錠剤の製造方法に従い打錠して錠剤を製造した。
テアフラビン１００ｍｇ、ラクトース４００ｍｇ、とうもろこし澱粉４００ｍｇ及びステアリン酸マグネシウム２ｍｇを混合した後、通常の錠剤の製造方法に従い打錠して錠剤を製造した。
【0074】
［剤形例５］カプセル剤
テアフラビン１００ｍｇ、ラクトース４００ｍｇ、とうもろこし澱粉４００ｍｇ及びステアリン酸マグネシウム２ｍｇを混合した後、通常のカプセル剤の製造方法に従いゼラチンカプセルに充填してカプセル剤を製造した。
テアフラビン１００ｍｇ、ラクトース４００ｍｇ、とうもろこし澱粉４００ｍｇ及びステアリン酸マグネシウム２ｍｇを混合した後、通常のカプセル剤の製造方法に従いゼラチンカプセルに充填してカプセル剤を製造した。
【0075】
［剤形例６］顆粒剤
テアフラビン５０ｍｇ、無水結晶ブドウ糖２５０ｍｇ及び澱粉５５０ｍｇを混合し、流動層造粒機を用いて顆粒に成形した後、分包に充填した。
テアフラビン５０ｍｇ、無水結晶ブドウ糖２５０ｍｇ及び澱粉５５０ｍｇを混合し、流動層造粒機を用いて顆粒に成形した後、分包に充填した。
【0076】
［剤形例７］ドリンク剤
テアフラビン５０ｍｇ、ブドウ糖１０ｇ、クエン酸０．６ｇ、及び液状オリゴ糖２５ｇを混合した後、精製水３００ｍｌを加えて、各瓶に２００ｍｌずつ充填する。瓶に充填した後、１３０℃で４～５秒間殺菌してドリンク剤を製造した。
テアフラビン５０ｍｇ、ブドウ糖１０ｇ、クエン酸０．６ｇ、及び液状オリゴ糖２５ｇを混合した後、精製水３００ｍｌを加えて、各瓶に２００ｍｌずつ充填する。瓶に充填した後、１３０℃で４～５秒間殺菌してドリンク剤を製造した。
【0077】
［剤形例８］キャラメル剤形
テアフラビン５０ｍｇ、とうもろこしシロップ（ｃｏｒｎ ｓｙｒｕｐ）１．８ｇ、脱脂牛乳０．５ｇ、大豆レシチン０．５ｇ、バター０．６ｇ、植物性硬化油０．４ｇ、砂糖１．４ｇ、マーガリン０．５８ｇ、及び食塩２０ｍｇを混合し、キャラメル成形した。
テアフラビン５０ｍｇ、とうもろこしシロップ（ｃｏｒｎ ｓｙｒｕｐ）１．８ｇ、脱脂牛乳０．５ｇ、大豆レシチン０．５ｇ、バター０．６ｇ、植物性硬化油０．４ｇ、砂糖１．４ｇ、マーガリン０．５８ｇ、及び食塩２０ｍｇを混合し、キャラメル成形した。
【0078】
［剤形例９］健康食品
【0079】
【表5】
【0080】
前記ビタミン及び無機質混合物の組成比は、比較的に健康食品に適合した成分を例にして混合組成したが、その配合比を任意に変形実施しても構わなく、通常の健康食品の製造方法に従い前記成分を混合した後、顆粒を製造し、通常の方法に従い健康食品の組成物の製造に用いてよい。
【0081】
［剤形例１０］健康飲料
【0082】
【表6】
【0083】
前記表のように総体積９００ｍｌになるように残量の精製水を添加して、通常の健康飲料の製造方法に従い前記成分を混合してから約１時間８５℃で撹拌加熱し、これにより調製された溶液をろ過して得られたろ液を滅菌された２リットルの容器に入れて密封滅菌した後に冷蔵保管して健康飲料の組成物の製造に用いてよい。
【0084】
［剤形例１１］注射剤
下記の表に記載された組成にて通常の方法に従い注射剤を製造した。
下記の表に記載された組成にて通常の方法に従い注射剤を製造した。
【0085】
【表7】
【0086】
本発明は、一実施例として、次の実施形態を提供することができる。
【0087】
第１実施形態は、テアフラビン、その異性体、その薬学的に許容可能な塩、その水和物又はその溶媒和物を有効成分として含む、脂肪細胞の分化促進用組成物を提供することができる。
【0088】
第２実施形態は、第１実施形態において、当該組成物は、テアフラビンを含む発酵緑茶抽出物を含むものである、組成物を提供することができる。
【0089】
第３実施形態は、第１実施形態及び第２実施形態の一つ以上において、前記発酵緑茶抽出物は、テアフラビン、テアフラビン－３－ガレート、テアフラビン－３’－ガレート、及びテアフラビン－３,３’－ジガレートを含むテアフラビン類を含み、前記テアフラビンを前記テアフラビン類の総重量に対し３０～５０重量％含む、組成物を提供することができる。
【0090】
第４実施形態は、第１実施形態乃至第３実施形態の一つ以上において、前記発酵緑茶抽出物は、
（ａ）緑茶及び春菊を混合して混合物を調製するステップ；
（ｂ）前記混合物を減圧状態で発酵及び乾燥するステップ；及び
（ｃ）前記発酵及び乾燥された混合物を抽出するステップを含む方法によって製造されたものである、組成物を提供することができる。
（ａ）緑茶及び春菊を混合して混合物を調製するステップ；
（ｂ）前記混合物を減圧状態で発酵及び乾燥するステップ；及び
（ｃ）前記発酵及び乾燥された混合物を抽出するステップを含む方法によって製造されたものである、組成物を提供することができる。
【0091】
第５実施形態は、第１実施形態乃至第４実施形態の一つ以上において、前記テアフラビン、その異性体、その薬学的に許容可能な塩、その水和物又はその溶媒和物の組成物中での濃度は、０．０１～１０,０００ｍｇ／ｋｇである、組成物を提供することができる。
【0092】
第６実施形態は、第１実施形態乃至第５実施形態の一つ以上において、前記テアフラビン、その異性体、その薬学的に許容可能な塩、その水和物又はその溶媒和物の投与量は、０．０１～１０,０００ｍｇ／ｋｇ／日である、組成物を提供することができる。
【0093】
第７実施形態は、第１実施形態乃至第６実施形態の一つ以上において、当該組成物は、脂肪細胞の分化促進による肌ボリュームアップ用である、組成物を提供することができる。
【0094】
第８実施形態は、第１実施形態乃至第７実施形態の一つ以上において、当該組成物は、脂肪細胞の分化促進による皮下脂肪減少抑制用である、組成物を提供することができる。
【0095】
第９実施形態は、第１実施形態乃至第８実施形態の一つ以上において、当該組成物は、経皮投与用である、組成物を提供することができる。
【0096】
第１０実施形態は、第１実施形態乃至第９実施形態の一つ以上において、当該組成物は、化粧料組成物である、組成物を提供することができる。
【0097】
第１１実施形態は、第１実施形態乃至第１０実施形態の一つ以上において、当該組成物は、薬学組成物である、組成物を提供することができる。
【0098】
第１２実施形態は、第１実施形態乃至第１１実施形態の一つ以上において、当該組成物は、食品組成物である、組成物を提供することができる。
【0099】
前記実施形態は本発明の説明のために開示されたものであり、前記説明は本発明の範囲を制限するものではない。したがって、本発明の意味及び範囲を逸脱しない限り、種々の修正、変形、及び置き換えが当該技術分野の通常の技術者から生じることがある。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】