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特許7488903結腸直腸癌又は腺腫を検出するためのバイオマーカー及びその方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-05-14
(45)【発行日】2024-05-22
(54)【発明の名称】結腸直腸癌又は腺腫を検出するためのバイオマーカー及びその方法
(51)【国際特許分類】
G01N 33/50 20060101AFI20240515BHJP
G01N 27/62 20210101ALI20240515BHJP
【ＦＩ】
G01N33/50 Z
G01N27/62 V
【請求項の数】
15
(21)【出願番号】P 2022539743
(86)(22)【出願日】2020-12-28
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2023-03-03
(86)【国際出願番号】 CN2020140431
(87)【国際公開番号】W WO2021129881
(87)【国際公開日】2021-07-01
【審査請求日】2022-07-19
(31)【優先権主張番号】62/954,483
(32)【優先日】2019-12-28
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(73)【特許権者】
【識別番号】522257012
【氏名又は名称】中精普康（北京）医薬科技有限公司
【氏名又は名称原語表記】ＰＲＥＣＯＧＩＦＹ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＣＨＩＮＡ ＣＯ．， ＬＴＤ．
【住所又は居所原語表記】Ａ４０２， Ｚｈｏｎｇｇｕａｎｃｕｎ Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｐａｒｋ Ｎｏ． ５， Ｓｈａｎｇｄｉ Ｋａｉｔｕｏ Ｒｏａｄ， Ｈａｉｄｉａｎ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ Ｂｅｉｊｉｎｇ １０００８５， Ｃｈｉｎａ
(74)【代理人】
【識別番号】110002262
【氏名又は名称】ＴＲＹ国際弁理士法人
(72)【発明者】
【氏名】リン カイ
(72)【発明者】
【氏名】ダイ シドン
(72)【発明者】
【氏名】テン ウィ
(72)【発明者】
【氏名】ワン グァン
【審査官】下村 一石
(56)【参考文献】
【文献】特開２０１８－１６９３７６（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２００９－５０８０９１（ＪＰ，Ａ）
【文献】米国特許出願公開第２０１２／００４０３８３（ＵＳ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１３／１７１５８６（ＷＯ，Ａ２）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｇ０１Ｎ ３３／４８－３３／９８
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
被験体の結腸直腸癌又は結腸直腸腺腫（ＣＲＣ／ＣＲＡ）を検出する方法であって、（ａ）被験体からのサンプル中の複数の代謝産物のパネルにおける１つ以上の代謝産物の存在量を定量化するステップであって、前記複数の代謝産物が表Ａの化合物を含むステップと、
（ｃ）前記サンプルスコアをカットオフスコアと比較することにより前記被験体のＣＲＣ／ＣＲＡを検出するステップと、
を含む、方法。
【請求項2】
前記複数の代謝産物は、表Ｂの化合物を更に含み、
【請求項3】
前記複数の代謝産物は、表Ｃの化合物を更に含み、
【請求項4】
サンプルスコアは、前記被験体がＣＲＣ／ＣＲＡを有する確率を示す、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
ステップ（ｂ）は、ステップ（ａ）で定量化された前記代謝産物のそれぞれの存在量を正規化するステップと、
前記正規化された存在量を予測モデルで処理することにより前記サンプルスコアを決定するステップと、を更に含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
前記予測モデルは、ロジスティック回帰法により確立される、請求項５に記載の方法。
【請求項7】
前記予測モデルは、既知の正常、ＣＲＣ又はＣＲＡステータスとなっているサンプルからの代謝産物の存在量の測定に基づいてロジスティック回帰法により確立される、請求項５に記載の方法。
【請求項8】
ステップ（ｃ）は、前記サンプルスコアが前記カットオフスコア以上である場合、前記被験体のＣＲＣ／ＣＲＡを検出するステップを更に含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線について、０．８０を超える曲線下面積（ＡＵＣ）を有し、前記サンプル中のＣＲＣ／ＣＲＡを検出する感度と特異度の両方が７５％以上である、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
被験体のステージＩ／ＩＩ ＣＲＣを検出する方法であって、（ａ）質量分析により、前記被験体からのサンプル中の複数の代謝産物のパネルにおける少なくとも５つの成分の存在量を定量化するステップであって、前記複数の代謝産物が表Ａの化合物を含むステップと、
（ｃ）評価値をカットオフ値と比較することにより前記被験体のステージＩ／ＩＩ ＣＲＣを検出するステップと、
を含む、方法。
【請求項11】
被験体のステージＩＩＩ／ＩＶ ＣＲＣを検出する方法であって、（ａ）質量分析により、前記被験体からのサンプル中の複数の代謝産物のパネルにおける少なくとも５つの成分の存在量を定量化するステップであって、前記複数の代謝産物が表Ａの化合物を含むステップと、
（ｃ）評価値をカットオフ値と比較することにより前記被験体のステージＩＩＩ／ＩＶ ＣＲＣを検出するステップと、
を含む、方法。
【請求項12】
結腸直腸癌（ＣＲＣ）又は結腸直腸腺腫（ＣＲＡ）の診断に使用可能な診断用バイオマーカーの群であって、表Ｄの代謝産物の少なくとも１、２、３、４、５又は６種を含む群。
【請求項13】
表Ｄの６種全ての代謝産物を含む、請求項１２に記載の診断用バイオマーカーの群。
【請求項14】
表Ｂの少なくとも１種の化合物を更に含む、請求項１３に記載の診断用バイオマーカーの群。
【請求項15】
表Ｃの全ての化合物を更に含む、請求項１３に記載の診断用バイオマーカーの群。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
＜関連出願の相互参照＞
本願は、２０１９年１２月２８日に出願された米国仮特許出願第６２／９５４，４８３号の優先権を主張し、その全ての内容が参照により本明細書に組み込まれる。
本願は、２０１９年１２月２８日に出願された米国仮特許出願第６２／９５４，４８３号の優先権を主張し、その全ての内容が参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
本開示は一般に、結腸直腸異常の検出、特に、結腸直腸癌又は腺腫を検出するためのバイオマーカー及びその方法に関する。
【背景技術】
【0003】
結腸直腸癌（ＣＲＣ）は通常、結腸又は直腸（大腸の一部）から発生した癌を指す。ＣＲＣは、世界中で増大する臨床的課題となっているが、早期診断は、ＣＲＣ患者の生存率を改善する効果的な方法として認識される。腺腫は通常、上皮組織の良性腫瘍を指す。「結腸直腸腺腫（ＣＲＡ）」又は「腺腫性ポリープ」とも呼ばれる結腸腺腫は、悪性になる傾向があり、ＣＲＣを引き起こす。したがって、ＣＲＡ又はＣＲＣの診断は、患者の結腸直腸の健康状態を評価する上で重要である。
【0004】
ＣＲＣ及び／又はＣＲＡの診断には、非侵襲的アプローチ及び侵襲的アプローチを含むいくつかのアプローチが臨床的に用いられる。例えば、非侵襲的アプローチは、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）などの腫瘍バイオマーカーを使用した便潜血検査（ＦＯＢＴ）などを含む。別の例として、侵襲的アプローチは、結腸内視鏡を使用して、可視腫瘍病変又は腺腫性ポリープがあるか否かを判断する生検検査などを含む。侵襲的アプローチは、依然としてＣＲＣ／ＣＲＡ診断における究極の判断基準であるが、多くの場合、患者に不快感、痛み、更に組織の損傷をもたらす。結果として、非侵襲的アプローチが好まれる場合がある。しかし、従来の非侵襲的アプローチの多くは、精度が低いという欠点がある。したがって、ＣＲＣ又はＣＲＡを精度よく検出するための非侵襲的方法を可能にする新しいバイオマーカーを見つけることが望ましい。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0005】
本開示の一態様によれば、結腸直腸癌（ＣＲＣ）又は腺腫の診断に使用可能な診断用バイオマーカー群が提供される。いくつかの実施形態では、診断用バイオマーカー群は、表Ａにリストされた１種以上の代謝産物を含み得る。
【0006】
いくつかの実施形態では、前記複数の代謝産物は、表Ｂの代謝産物を更に含み得る。いくつかの実施形態では、表Ａの８種全ての代謝産物の存在量及び表Ｂの少なくとも１種の代謝産物の存在量が定量化される。
【0007】
いくつかの実施形態では、前記複数の代謝産物は、表Ｃの代謝産物を更に含み得る。いくつかの実施形態では、表Ａの８種全ての代謝産物の存在量及び表Ｃの全ての代謝産物の存在量が定量化され得る。
【0008】
本開示の別の態様によれば、被験体のＣＲＣ／ＣＲＡを検出する方法が提供される。いくつかの実施形態では、本方法は、前記被験体からのサンプル中の複数の代謝産物のパネルにおける１つ以上の成分の存在量を定量化するステップａ）を含み得る。前記複数の代謝産物は、本開示において先に記載されたように、表Ａ、表Ｂ及び／又は表Ｃにリストされた代謝産物を含み得る。いくつかの実施形態では、本方法は、ステップａ）で定量化された前記代謝産物のそれぞれの存在量を処理することによりサンプルスコアを決定するステップを更に含み得る。いくつかの実施形態では、本方法は、前記サンプルスコアをカットオフスコアと比較することにより前記被験体のＣＲＣ／ＣＲＡを検出するステップｃ）を更に含み得る。
【0009】
いくつかの実施形態では、前記予測モデルは、ロジスティック回帰法により確立され得る。
【0010】
いくつかの実施形態では、前記予測モデルは、既知の正常、ＣＲＣ又はＣＲＡステータスとなっているサンプルからの代謝産物の存在量の測定に基づいてロジスティック回帰法により確立され得る。
【0011】
いくつかの実施形態では、ステップ（ｃ）は、前記サンプルスコアが前記カットオフスコア以上である場合、前記被験体のＣＲＣ／ＣＲＡを検出するステップを更に含み得る。
【0012】
いくつかの実施形態では、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線について、本方法は、０．８０を超える曲線下面積（ＡＵＣ）を有し、サンプル中のＣＲＣ／ＣＲＡを検出する感度と特異度の両方が７５％以上であり得る。
【0013】
いくつかの実施形態では、ＲＯＣ曲線について、本方法は、０．８５を超えるＡＵＣを有し、サンプル中のＣＲＣ／ＣＲＡを検出する感度と特異度の両方が８０％以上である。
【0014】
本開示の別の態様によれば、被験体のＣＲＣ／ＣＲＡを検出する方法が提供される。いくつかの実施形態では、本方法は、前記被験体からのサンプル中の複数の代謝産物のパネルにおける１つ以上の成分の存在量を定量化するステップａ）を含み得る。前記複数の代謝産物は、本開示において先に記載されたように、表Ａ、表Ｂ及び／又は表Ｃにリストされた代謝産物を含み得る。いくつかの実施形態では、本方法は、ステップａ）で定量化された前記代謝産物のそれぞれの存在量を処理することによりサンプルスコアを決定することを更に含み得る。いくつかの実施形態では、本方法は、前記サンプルスコアをカットオフスコアと比較することにより前記被験体のＣＲＣ／ＣＲＡを検出するステップｃ）を更に含み得る。
【0015】
本開示の別の態様によれば、被験体のＣＲＡを検出する方法が提供される。本方法は、前記被験体からのサンプル中の複数の代謝産物のパネルにおける少なくとも５つの成分の存在量を定量化するステップａ）を含み得る。本方法は、ステップａ）で定量化された前記代謝産物のそれぞれの存在量を処理することによりサンプルスコアを決定するステップｂ）を更に含み得る。本方法は、評価値をカットオフ値と比較することにより前記被験体のＣＲＡを検出するステップｃ）を更に含み得る。いくつかの実施形態では、前記複数の代謝産物は、本開示において先に記載されたように、表Ａ、表Ｂ及び／又は表Ｃにリストされた代謝産物を含み得る。
【0016】
本開示の更に別の態様によれば、被験体のステージＩ／ＩＩ ＣＲＣを検出する方法が提供される。本方法は、（ａ）質量分析により、前記被験体からのサンプル中の複数の代謝産物のパネルにおける１つ以上の成分の存在量を定量化するステップであって、前記複数の代謝産物が表Ａの代謝産物を含むステップと、（ｂ）ステップ（ａ）で定量化された前記代謝産物のそれぞれの濃度を処理することによりサンプルスコアを決定するステップと、（ｃ）評価値をカットオフ値と比較することにより前記被験体のステージＩ／ＩＩ ＣＲＣを検出するステップと、を含み得る。いくつかの実施形態では、前記複数の代謝産物は、本開示において先に記載されたように、表Ａ、表Ｂ及び／又は表Ｃにリストされた代謝産物を含み得る。
【0017】
本開示の更に別の態様によれば、被験体のステージＩＩＩ／ＩＶ ＣＲＣを検出する方法が提供される。本方法は、（ａ）質量分析により、前記被験体からのサンプル中の複数の代謝産物のパネルにおける１つ以上の成分の存在量を定量化するステップであって、前記複数の代謝産物が表Ａの代謝産物を含むステップと、（ｂ）ステップ（ａ）で定量化された前記代謝産物のそれぞれの濃度を処理することによりサンプルスコアを決定するステップと、（ｃ）評価値をカットオフ値と比較することにより前記被験体のステージＩＩＩ／ＩＶ ＣＲＣを検出するステップと、を含み得る。いくつかの実施形態では、前記複数の代謝産物は、本開示において先に記載されたように、表Ａ、表Ｂ及び／又は表Ｃにリストされた代謝産物を含み得る。
【0018】
本開示の更に別の態様によれば、被験体のＣＲＣ／ＣＲＡを治療する方法が提供される。本方法は、本開示において先に記載された方法に従ってＣＲＣ／ＣＲＡを検出するステップと、前記被験体にＣＲＣ／ＣＲＡの治療を施すステップと、を含み得る。
【0019】
いくつかの実施形態では、本方法は、結腸内視鏡検査によりＣＲＣ／ＣＲＡを検証することを更に含み得る。
【0020】
いくつかの実施形態では、前記治療は、結腸切除術又はオストミーを更に含み得る。
【0021】
いくつかの実施形態では、前記治療は、化学療法、放射線療法、標的薬物療法又は免疫療法を更に含み得る。
【0022】
いくつかの実施形態では、前記治療は緩和ケアを含み得る。
【0023】
本開示の更に別の態様によれば、腸内細菌叢関連（ＧＭＡ）代謝産物をＣＲＣ／ＣＲＡの予測パネルのためのバイオマーカーとして同定する方法が提供される。いくつかの実施形態では、本方法は、ＣＲＣ／ＣＲＡ患者及びＣＲＣ／ＣＲＡを有さない人の対照群からのサンプルに対して非標的質量分析を実施することによりソースデータを取得することを含み得る。本方法は、ＣＲＣ／ＣＲＡ患者において有意に変化する代謝産物の第１の群を同定することを更に含み得る。代謝産物の第２の群は、腸内細菌叢との有意な相関を示す代謝産物を選択することにより前記第１の群から同定され得る。本方法は、選択モデルを使用して、前記代謝産物の第２の群から前記予測パネルのためのＧＭＡ代謝産物を選択するステップを更に含み得る。
【0024】
いくつかの実施形態では、本方法は、メタゲノムシーケンスにより前記代謝産物の第２の群を検証するステップを更に含み得る。
【0025】
いくつかの実施形態では、前記選択モデルは、最小絶対収縮及び選択演算子（ＬＡＳＳＯ）アルゴリズムを利用することができる。
【0026】
追加の特徴は、以下の説明に部分的に記載され、これらの特徴の一部は、以下の添付図面を検討することで、当業者にとって明らかになり、又は実施例の製造又は動作によって知られ得る。本開示の特徴は、以下に説明する具体的な実施例に記載された方法論、手段及び組合せの様々な態様を実施又は使用することにより、実現及び達成されるであろう。
【0027】
本開示は、例示的な実施形態に関して更に説明される。これらの例示的な実施形態は、図面を参照して詳細に説明される。図面は縮尺通りではないことに留意されたい。これらの実施形態は、非限定的で例示的な実施形態であり、図面のいくつかの図にわたって、同様の参照符号は、類似する構造を示す。
【図面の簡単な説明】
【0028】
【図1A】本開示のいくつかの実施形態による実験計画及び分析手順の概要を示す概略図である。
【図1B】本開示のいくつかの実施形態による、負イオンモード及び正イオンモードにおける非標的ＬＣ－ＭＳ特徴のＲ２値の分布図を示す分析図である。
【図1C】本開示のいくつかの実施形態による、負イオンモードにおける代謝産物特徴の二乗平均平方根誤差（ＲＭＳＥ）値の分布を示す分析図である。
【図1D】本開示のいくつかの実施形態による、正イオンモードにおける代謝産物特徴の二乗平均平方根誤差（ＲＭＳＥ）値の分布を示す分析図である。
【図1E】本開示のいくつかの実施形態による、全てのプールされたＣＲＣサンプルにおける非標的ＬＣ－ＭＳ特徴の変動係数（ＣＶ％）の分布図を示す分析図である。
【図1F】本開示のいくつかの実施形態による、全てのサンプルの代謝産物の主成分分析（ＰＣＡ）プロットである。
【図1G】本開示のいくつかの実施形態による、正常群、腺腫群及び結腸直腸癌群における有意に変化した代謝産物の数の比較図である。
【図1H】本開示のいくつかの実施形態による、正常被験体と比較して、腺腫被験体及び結腸直腸癌被験体の両方において有意な変化を示した代謝産物に基づいた、正常被験体（Ｎ、青）、腺腫被験体（Ａ、赤）及び結腸直腸癌被験体（Ｃ、緑）からのサンプルの血清メタボロミクス状態の識別を示すＰＣＡプロットである。
【図2A】本開示のいくつかの実施形態による、一致コホートにおける糞便メタボローム及び血清メタボロームの統合分析の手順を示す分析図である。
【図2B】本開示のいくつかの実施形態による、種レベルでの各個体における１５個のＯＵＴを示す棒グラフである。
【図2C】本開示のいくつかの実施形態による、一致コホートの正常及び結腸直腸異常患者におけるいくつかのＣＲＣ関連腸内細菌叢種の相対的存在量を示す分析図である。
【図2D】本開示のいくつかの実施形態による、結腸直腸異常被験体における腸内細菌叢と血清代謝産物との間の相互関係マップである。
【図2E】本開示のいくつかの実施形態による、ＣＲＣ関連腸内細菌とそれらの相関血清代謝産物との間の共変動を示すサンキーダイアグラムである。
【図3A】検証セットに従って表Ａにリストされた８種の代謝産物の存在量を利用する予測モデルのＲＯＣである。
【図3B】本開示のいくつかの実施形態による、標的メタボロームに基づいた８種の代謝産物のＲＯＣを示す分析図である。
【図3C】本開示のいくつかの実施形態による、非標的メタボローム分析を使用する正常及び結腸直腸の不健康な患者のＰＣＡプロットである。
【図3D】本開示のいくつかの実施形態による、標的メタボローム分析を使用する正常及び結腸直腸の不健康な患者のＰＣＡプロットを示す。
【図3E】一致コホートにおける非標的メタボロミクス分析に基づいた正常群及び結腸直腸異常群の識別のためのＣＲＣ腸内細菌叢関連血清代謝産物（ＧＭＳＭ）パネルのＲＯＣ曲線を示す分析図である。
【図3F】メタボローム分析を使用したＣＩＣＡＭ及びＳＤの正常及び結腸直腸の不健康な患者のＰＣＡプロットである。
【図4A】本開示のいくつかの実施形態による、モデリング群におけるＧＭＳＭパネルの識別効率を示すＲＯＣ曲線を示す分析図である。
【図4B】本開示のいくつかの実施形態による、モデリング群における正常被験体及び結腸直腸異常被験体のＣＲＣ及び腺腫バイオマーカーシグネチャスコアを示す分析図である。
【図4C】本開示のいくつかの実施形態による、０．５４１のカットオフスコアの下での検証群における予測モデルの識別効率を示すＲＯＣ曲線を示す。
【図4D】本開示のいくつかの実施形態による、腺腫患者及び正常被験体の検証群におけるＣＲＣ ＧＭＳＭパネルの識別効率を示すＲＯＣ曲線を示す。
【図5A】本開示のいくつかの実施形態による、ＣＥＡ及びＣＲＣ予測モデルの識別効率を示すＲＯＣ曲線を示す。
【図5B】本開示のいくつかの実施形態による、正常及び結腸直腸異常患者を識別する際の予測モデル及びＣＥＡ効率のグラフ比較のための散布図を示す。
【図6A-6D】検証群におけるＣＲＣ ＧＭＳＭパネルの識別効率を示すＲＯＣ曲線である。
【発明を実施するための形態】
【0029】
以下の説明は、当業者が本開示を実施及び使用することを可能にするために提示され、特定の用途及びその要件に照らして提供される。開示された実施形態の様々な変形は、当業者には容易に明らかであり、本明細書で定義された一般原則は、本開示の精神及び範囲から逸脱することなく、他の実施形態及び用途にも適用することができる。したがって、本開示は、示された実施形態に限定されるものではなく、特許請求の範囲と一致する最も広い範囲が与えられるべきである。
【0030】
本明細書において使用される用語は、単に特定の例示的な実施形態を説明するためのものであり、限定を意図したものではない。本明細書において使用されるように、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」及び「上記（ｔｈｅ）」は、文脈中に特に明示しない限り、複数形も含むことを意図し得る。更に、本明細書において使用される場合、用語「含み／含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ／ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ、ｉｎｃｌｕｄｅｓ／ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」は、記載された特徴、整数、ステップ、動作、素子、及び／又は、構成要素の存在を特定するものであるが、１つ以上の他の特徴、整数、ステップ、動作、素子、構成要素、及び／又は、これらのグループの存在や追加を排除するものではないことが理解されよう。
【0031】
本開示のこれら及び他の特徴及び特性、動作の方法、構造の関連する素子及び部品の組み合わせの機能、及び製造上の経済性は、本明細書の一部を形成する添付の図面を参照して以下の説明を検討することによってより明らかとなるであろう。しかしながら、図面は単に例示及び説明のためのものであり、本開示の範囲を限定することを意図するものではないことが明らかに理解される。図面は縮尺通りではないことが理解される。
【0032】
本開示は、結腸直腸癌又は結腸直腸腺腫の診断に使用可能な診断用バイオマーカーの群を提供する。診断用バイオマーカーの群を使用して結腸直腸癌又は結腸直腸腺腫を検出する方法も提供される。例えば、本開示に係る方法は、体液又は他のサンプル（例えば、血清サンプル、糞便サンプル）を利用して結腸直腸癌を検出する非侵襲的アプローチである。更に、結腸直腸癌を検出する方法は、異なる段階（例えば、前癌段階、初期、中期、後期）の結腸直腸癌を検出することができる。被験体における初期又は前癌段階の結腸直腸癌の検出は、ＣＲＣ患者の生存率を効果的に改善する。結腸直腸癌を検出するための従来の方法（例えば、ＣＥＡバイオマーカーを使用する方法）と比較して、本開示に係る結腸直腸癌を検出する方法は、より正確であり、ＣＲＣ／ＣＲＡを有する被験体を正常被験体と効果的に区別する。
【0033】
本明細書において使用されるように、本開示の「被験体」という用語は、任意のヒト又は非ヒト動物を指す。例示的な非ヒト動物は、哺乳動物（例えば、チンパンジー及び他の類人猿及びサル種）、家畜（例えば、牛、羊、豚、山羊及び馬）、家畜（例えば、犬及び猫）、実験動物（例えば、マウス、ラット及びモルモット）などを含み得る。いくつかの実施形態では、被験体はヒトである。
【0034】
本開示の一態様によれば、結腸直腸癌（ＣＲＣ）又は腺腫の診断に使用可能な診断用バイオマーカー群が提供される。いくつかの実施形態では、腺腫は、腺腫性ポリープとも呼ばれる結腸直腸腺腫（ＣＲＡ）を含む。本開示における「ＣＲＣ／ＣＲＡ」という用語は、正常状態とは異なるＣＲＣ又はＣＲＡのいずれかを指す。
【0035】
いくつかの実施形態では、診断用バイオマーカーの群は、ＣＲＣ／ＣＲＡと相関する１種以上の代謝産物を含み得る。１種以上の代謝産物は、腸内細菌によって産生されるか又は腸内細菌による影響を受ける可能性があり、調節機能などの様々な機能を実行するために被験体の異なる部分に運ばれる可能性がある。本明細書において使用されるように、「腸内細菌による影響を受ける」という語句は、腸内細菌の影響下で代謝産物の存在量が変化（例えば、増加又は減少）する可能性があることを意味する。
【0036】
いくつかの実施形態では、正常被験体から得られたサンプル中の代謝産物の存在量は、ＣＲＣ／ＣＲＡを有する被験体から得られたサンプル中の代謝産物の存在量とは異なり得る。本明細書において使用されるように、「存在量」という用語は、特定のサンプル中の物質の量（ｑｕａｎｔｉｔｙ）又は量（ａｍｏｕｎｔ）を指す。サンプルは、固体サンプル、流体サンプル、ガスサンプルなど、又はそれらの任意の組み合わせであり得る。固体サンプルは、例えば、糞便、耳垢などを含み得る。流体サンプルは、血液、血清、唾液、尿、汗などの被験体の体液、又はそれらの任意の組み合わせを含み得る。ガスサンプルは、腸内ガス、呼気などを含み得る。単なる例として、１種以上の代謝産物が血清中に存在する可能性があり、「血清代謝産物」と呼ばれてもよい。いくつかの実施形態では、代謝産物の存在量を測定するために、流体サンプル（例えば、血清）、固体サンプル又はガスサンプル（例えば、腸内ガス）中の代謝産物の濃度又は量を測定することができる。いくつかの実施形態では、代謝産物の存在量は、正規化された値又は対照に対する相対値であり得る。この場合、代謝産物の存在量は「相対存在量」とも呼ばれる。例えば、代謝産物の存在量は、サンプル内の代謝産物の測定値と全ての代謝産物の合計測定値に基づいたｚスコアを反映することができる。いくつかの実施形態では、測定値は、質量分析、クロマトグラフィー（例えば、ＨＰＬＣ）及び任意の他の技術によって得ることができる。いくつかの実施形態では、対照は、被験体に人工的に添加される化学物質のセットの正確な濃度又は量、例えばスパイクイン対照であり得る。或いは、対照は、ＣＲＣ／ＣＲＡを有さず、身体的に健康であると考えられる被験体のプールから得られたサンプルの同じ代謝産物の濃度又は量であり得る。
【0037】
表１は、ＣＲＣ／ＣＲＡの診断に使用できる代謝産物の例示的な群を示す。バイオマーカーである代謝産物それぞれは、ＣＲＣ／ＣＲＡの存在と強くて忠実な相関関係を示す。いくつかの実施形態では、本開示に係る診断用バイオマーカーの群は、表１の１種以上の代謝産物を含み得る。いくつかの実施形態では、診断用バイオマーカーの群は、表１の代謝産物のうちの少なくとも１つを含み得る。いくつかの実施形態では、診断用バイオマーカーの群は、表１の代謝産物のうちの少なくとも２種を含み得る。いくつかの実施形態では、診断用バイオマーカーの群は、表１の代謝産物のうちの少なくとも３種を含み得る。いくつかの実施形態では、診断用バイオマーカーの群は、表１の代謝産物のうちの少なくとも４種を含み得る。いくつかの実施形態では、診断用バイオマーカーの群は、表１の代謝産物のうちの少なくとも５種を含み得る。いくつかの実施形態では、診断用バイオマーカーの群は、表１の代謝産物のうちの少なくとも６種を含み得る。いくつかの実施形態では、診断用バイオマーカーの群は、表１の代謝産物のうちの少なくとも７種を含み得る。別の例として、診断用バイオマーカーの群は、表１の全ての代謝産物を含み得る。
【0038】
いくつかの実施形態では、表１に示された代謝産物は、被験体のＣＲＣ／ＣＲＡを検出するために使用することができ、更に、ＣＲＣ／ＣＲＡの治療を容易にするために使用することができる。例えば、質量分析（又は他の技術）は、サンプル中の複数の代謝産物のパネル内の１種以上の代謝産物の存在量を定量化するために使用することができる。定量化された代謝産物のそれぞれの存在量は、ＣＲＣ／ＣＲＡを検出し、及び／又は被験体のＣＲＣ／ＣＲＣの治療を容易にするように処理及び使用することができる。いくつかの実施形態では、表１の代謝産物のいずれか１つを定量化して、これらの目的に使用することができる。いくつかの実施形態では、表１の任意の２、３、又は４種の代謝産物を定量化して、これらの目的に使用することができる。いくつかの実施形態では、表１の任意の５、６、又は７種の代謝産物を定量化して、これらの目的に使用することができる。いくつかの実施形態では、表１の８種全ての代謝産物を定量化して、これらの目的に使用することができる。
【0039】
いくつかの実施形態では、表１の代謝産物は、質量分析によって定量化及び同定することができる。表１に示された代謝産物は、１つ以上の異性体形態に対応し得る。表２は、注釈と推定の後、表１に示された代謝産物に対応するいくつかの例示的な化合物を示す。これらの化合物の１つ以上、又はバイオマーカーの存在量は、例えば、質量分析又は他の任意の技術によって定量化することができ、被験体のＣＲＣ／ＣＲＡを検出し、及び／又は被験体のＣＲＣ／ＣＲＡの治療を容易にするために使用することができる。いくつかの実施形態では、表１又は表中の代謝産物のそれぞれは、腸内細菌叢と関連し得る。
【0040】
いくつかの実施形態では、定量化して、ＣＲＣ／ＣＲＡを検出し、及び／又はＣＲＣ／ＣＲＡの治療を容易にするために使用できる診断用バイオマーカー（代謝産物）の群は、９，１２，１３－ＴｒｉＨＯＭＥを含み得る。いくつかの実施形態では、定量化してこれらの目的のために使用できる診断用バイオマーカーの群は、９，１２，１８－ＴｒｉＨＯＭＥを含み得る。いくつかの実施形態では、定量化してこれらの目的のために使用できる診断用バイオマーカーの群は、クリナリサイドを含み得る。いくつかの実施形態では、定量化してこれらの目的のために使用できる診断用バイオマーカーの群は、［（６－｛［５，７－ジヒドロキシ－２－（４－オキソシクロヘキサ－２，５－ジエン－１－イリデン）－２Ｈ－クロメン－３－イル］オキシ｝－３，４，５－トリヒドロキシオキサン－２－イル）メチル］［１－ヒドロキシ－３－（４－ヒドロキシフェニル）プロパ－２－エン－１－イリデン］オキシダニウムを含み得る。いくつかの実施形態では、定量化してこれらの目的のために使用できる診断用バイオマーカーの群は、２－オクテノイルカルニチンを含み得る。いくつかの実施形態では、定量化してこれらの目的のために使用できる診断用バイオマーカーの群は、（Ｅ）－２－（４，８－ジメチルノナ－３，７－ジエン－１－イル）－５－ヒドロキシ－２，７－ジメチル－２Ｈ－クロメン－８－カルバルデヒドを含み得る。いくつかの実施形態では、定量化してこれらの目的のために使用できる診断用バイオマーカーの群は、Ｎ，Ｏ－ビス－（トリメチルシリル）フェニルアラニンを含み得る。いくつかの実施形態では、定量化してこれらの目的のために使用できる診断用バイオマーカーの群は、１４－ＨＤｏＨＥを含み得る。
【0041】
いくつかの実施形態では、定量化して、ＣＲＣ／ＣＲＡを検出し、及び／又はＣＲＣ／ＣＲＡの治療を容易にするために使用できる診断用バイオマーカーの群は、表２の１種以上の代謝産物を含み得る。いくつかの実施形態では、定量化してこれらの目的のために使用できる診断用バイオマーカーの群は、表２の代謝産物のうちの少なくとも１種を含み得る。いくつかの実施形態では、定量化してこれらの目的のために使用できる診断用バイオマーカーの群は、表２の代謝産物のうちの少なくとも２つを含み得る。いくつかの実施形態では、定量化してこれらの目的のために使用できる診断用バイオマーカーの群は、表２の代謝産物のうちの少なくとも３種を含み得る。いくつかの実施形態では、定量化してこれらの目的のために使用できる診断用バイオマーカーの群は、表２の代謝産物のうちの少なくとも４種を含み得る。いくつかの実施形態では、定量化してこれらの目的のために使用できる診断用バイオマーカーの群は、表２の代謝産物のうちの少なくとも５種を含み得る。いくつかの実施形態では、定量化してこれらの目的のために使用できる診断用バイオマーカーの群は、表２の代謝産物のうちの少なくとも６種を含み得る。いくつかの実施形態では、定量化してこれらの目的のために使用できる診断用バイオマーカーの群は、表２の代謝産物のうちの少なくとも７種を含み得る。別の例として、定量化してこれらの目的のために使用できる診断用バイオマーカーの群は、表２の全ての代謝産物を含み得る。
【0042】
いくつかの実施形態では、定量化してこれらの目的のために使用できる診断用バイオマーカーの群は、表２にリストされた少なくとも２種の代謝産物を含み得る。いくつかの実施形態では、少なくとも２種の代謝産物は、９，１２，１３－ＴｒｉＨＯＭＥ及び２－オクテノイルカルニチンを含み得る。いくつかの実施形態では、少なくとも２種の代謝産物は、９，１２，１３－ＴｒｉＨＯＭＥ及び（Ｅ）－２－（４，８－ジメチルノナ－３，７－ジエン－１－イル）－５－ヒドロキシ－２，７－ジメチル－２Ｈ－クロメン－８－カルバルデヒドを含み得る。いくつかの実施形態では、少なくとも２種の代謝産物は、クリナリサイド及び２－オクテノイルカルニチンを含み得る。いくつかの実施形態では、少なくとも２種の代謝産物は、クリナリサイド及びＮ，Ｏ－ビス－（トリメチルシリル）フェニルアラニンを含み得る。いくつかの実施形態では、少なくとも２種の代謝産物は、［（６－｛［５，７－ジヒドロキシ－２－（４－オキソシクロヘキサ－２，５－ジエン－１－イリデン）－２Ｈ－クロメン－３－イル］オキシ｝－３，４，５－トリヒドロキシオキサン－２－イル）メチル］［１－ヒドロキシ－３－（４－ヒドロキシフェニル）プロパ－２－エン－１－イリデン］オキシダニウム及び２－オクテノイルカルニチンを含み得る。いくつかの実施形態では、少なくとも２種の代謝産物は、２－オクテノイルカルニチン及びＮ，Ｏ－ビス－（トリメチルシリル）フェニルアラニンを含み得る。いくつかの実施形態では、少なくとも２種の代謝産物は、２－オクテノイルカルニチン及び１４－ＨＤｏＨＥを含み得る。いくつかの実施形態では、少なくとも２種の代謝産物は、（Ｅ）－２－（４，８－ジメチルノナ－３，７－ジエン－１－イル）－５－ヒドロキシ－２，７－ジメチル－２Ｈ－クロメン－８－カルバルデヒド及びＮ，Ｏ－ビス－（トリメチルシリル）フェニルアラニンを含み得る。
【0043】
いくつかの実施形態では、定量化してこれらの目的のために使用できる診断用バイオマーカーの群は、表３にリストされた少なくとも３種の代謝産物を含み得る。いくつかの実施形態では、定量化してこれらの目的のために使用できる診断用バイオマーカーの群は、９，１２，１３－ＴｒｉＨＯＭＥ、９，１２，１８－ＴｒｉＨＯＭＥ及びＮ，Ｏ－ビス－（トリメチルシリル）フェニルアラニンを含み得る。いくつかの実施形態では、定量化してこれらの目的のために使用され得る診断用バイオマーカーの群は、９，１２，１３－ＴｒｉＨＯＭＥ、クリナリサイド及び２－オクテノイルカルニチンを含み得る。いくつかの実施形態では、定量化してこれらの目的のために使用できる診断用バイオマーカーの群は、９，１２，１３－ＴｒｉＨＯＭＥ、［（６－｛［５，７－ジヒドロキシ－２－（４－オキソシクロヘキサ－２，５－ジエン－１－イリデン）－２Ｈ－クロメン－３－イル］オキシ｝－３，４，５－トリヒドロキシオキサン－２－イル）メチル］［１－ヒドロキシ－３－（４－ヒドロキシフェニル）プロパ－２－エン－１－イリデン］オキシダニウム及び２－オクテノイルカルニチンを含み得る。いくつかの実施形態では、定量化してこれらの目的のために使用できる診断用バイオマーカーの群は、９，１２，１３－ＴｒｉＨＯＭＥ、（Ｅ）－２－（４，８－ジメチルノナ－３，７－ジエン－１－イル）－５－ヒドロキシ－２，７－ジメチル－２Ｈ－クロメン－８－カルバルデヒド及びＮ，Ｏ－ビス－（トリメチルシリル）フェニルアラニンを含み得る。いくつかの実施形態では、定量化してこれらの目的のために使用できる診断用バイオマーカーの群は、９，１２，１３－ＴｒｉＨＯＭＥ、（Ｅ）－２－（４，８－ジメチルノナ－３，７－ジエン－１－イル）－５－ヒドロキシ－２，７－ジメチル－２Ｈ－クロメン－８－カルバルデヒド及びＮ，Ｏ－ビス－（トリメチルシリル）フェニルアラニンを含み得る。いくつかの実施形態では、定量化してこれらの目的のために使用され得る診断用バイオマーカーの群は、９，１２，１８－ＴｒｉＨＯＭＥ、クリナリサイド及び２－オクテノイルカルニチンを含み得る。いくつかの実施形態では、定量化してこれらの目的のために使用できる診断用バイオマーカーの群には、９，１２，１８－ＴｒｉＨＯＭＥ、クリナリサイド及び（Ｅ）－２－（４，８－ジメチルノナ－３，７－ジエン－１－イル）－５－ヒドロキシ－２，７－ジメチル－２Ｈ－クロメン－８－カルバルデヒドを含み得る。いくつかの実施形態では、定量化してこれらの目的のために使用できる診断用バイオマーカーの群は、９，１２，１８－ＴｒｉＨＯＭＥ、［（６－｛［５，７－ジヒドロキシ－２－（４－オキソシクロヘキサ－２，５－ジエン－１－イリデン）－２Ｈ－クロメン－３－イル］オキシ｝－３，４，５－トリヒドロキシオキサン－２－イル）メチル］［１－ヒドロキシ－３－（４－ヒドロキシフェニル）プロパ－２－エン－１－イリデン］オキシダニウム及び２－オクテノイルカルニチンを含み得る。いくつかの実施形態では、定量化してこれらの目的のために使用できる診断用バイオマーカーの群は、９，１２，１８－ＴｒｉＨＯＭＥ、［（６－｛［５，７－ジヒドロキシ－２－（４－オキソシクロヘキサ－２，５－ジエン－１－イリデン）－２Ｈ－クロメン－３－イル］オキシ｝－３，４，５－トリヒドロキシオキサン－２－イル）メチル］［１－ヒドロキシ－３－（４－ヒドロキシフェニル）プロパ－２－エン－１－イリデン］オキシダニウム及び（Ｅ）－２－（４，８－ジメチルノナ－３，７－ジエン－１－イル）－５－ヒドロキシ－２，７－ジメチル－２Ｈ－クロメン－８－カルバルデヒドを含み得る。いくつかの実施形態では、定量化してこれらの目的のために使用できる診断用バイオマーカーの群は、９，１２，１８－ＴｒｉＨＯＭＥ、２－オクテノイルカルニチン及び（Ｅ）－２－（４，８－ジメチルノナ－３，７－ジエン－１－イル）－５－ヒドロキシ－２，７－ジメチル－２Ｈ－クロメン－８－カルバルデヒドを含み得る。いくつかの実施形態では、定量化してこれらの目的のために使用できる診断用バイオマーカーの群は、９，１２，１８－ＴｒｉＨＯＭＥ、２－オクテノイルカルニチン及び１４－ＨＤｏＨＥを含み得る。いくつかの実施形態では、定量化してこれらの目的のために使用できる診断用バイオマーカーの群は、９，１２，１８－ＴｒｉＨＯＭＥ、（Ｅ）－２－（４，８－ジメチルノナ－３，７－ジエン－１－イル）－５－ヒドロキシ－２，７－ジメチル－２Ｈ－クロメン－８－カルバルデヒド及びＮ，Ｏ－ビス－（トリメチルシリル）フェニルアラニンを含み得る。いくつかの実施形態では、定量化してこれらの目的のために使用できる診断用バイオマーカーの群は、９，１２，１８－ＴｒｉＨＯＭＥ、Ｎ，Ｏ－ビス－（トリメチルシリル）フェニルアラニン及び１４－ＨＤｏＨＥを含み得る。いくつかの実施形態では、定量化してこれらの目的のために使用できる診断用バイオマーカーの群は、クリナリサイド、［（６－｛［５，７－ジヒドロキシ－２－（４－オキソシクロヘキサ－２，５－ジエン－１－イリデン）－２Ｈ－クロメン－３－イル］オキシ｝－３，４，５－トリヒドロキシオキサン－２－イル）メチル］［１－ヒドロキシ－３－（４－ヒドロキシフェニル）プロパ－２－エン－１－イリデン］オキシダニウム及び２－オクテノイルカルニチンを含み得る。いくつかの実施形態では、定量化してこれらの目的のために使用できる診断用バイオマーカーの群は、クリナリサイド、［（６－｛［５，７－ジヒドロキシ－２－（４－オキソシクロヘキサ－２，５－ジエン－１－イリデン）－２Ｈ－クロメン－３－イル］オキシ｝－３，４，５－トリヒドロキシオキサン－２－イル）メチル］［１－ヒドロキシ－３－（４－ヒドロキシフェニル）プロパ－２－エン－１－イリデン］オキシダニウム及び１４－ＨＤｏＨＥを含み得る。いくつかの実施形態では、定量化してこれらの目的のために使用できる診断用バイオマーカーの群は、クリナリサイド、２－オクテノイルカルニチン及びＮ，Ｏ－ビス－（トリメチルシリル）フェニルアラニンを含み得る。いくつかの実施形態では、定量化してこれらの目的のために使用できる診断用バイオマーカーの群は、クリナリサイド、２－オクテノイルカルニチン及び１４－ＨＤｏＨＥを含み得る。いくつかの実施形態では、定量化してこれらの目的のために使用できる診断用バイオマーカーの群は、［（６－｛［５，７－ジヒドロキシ－２－（４－オキソシクロヘキサ－２，５－ジエン－１－イリデン）－２Ｈ－クロメン－３－イル］オキシ｝－３，４，５－トリヒドロキシオキサン－２－イル）メチル］［１－ヒドロキシ－３－（４－ヒドロキシフェニル）プロパ－２－エン－１－イリデン］オキシダニウム、２－オクテノイルカルニチン及び（Ｅ）－２－（４，８－ジメチルノナ－３，７－ジエン－１－イル）－５－ヒドロキシ－２，７－ジメチル－２Ｈ－クロメン－８－カルバルデヒドを含み得る。
【0044】
いくつかの実施形態では、定量化してこれらの目的のために使用できる診断用バイオマーカーの群は、［（６－｛［５，７－ジヒドロキシ－２－（４－オキソシクロヘキサ－２，５－ジエン－１－イリデン）－２Ｈ－クロメン－３－イル］オキシ｝－３，４，５－トリヒドロキシオキサン－２－イル）メチル］［１－ヒドロキシ－３－（４－ヒドロキシフェニル）プロパ－２－エン－１－イリデン］オキシダニウム、２－オクテノイルカルニチン及びＮ，Ｏ－ビス－（トリメチルシリル）フェニルアラニンを含み得る。
【0045】
いくつかの実施形態では、定量化してこれらの目的のために使用できる診断用バイオマーカーの群は、［（６－｛［５，７－ジヒドロキシ－２－（４－オキソシクロヘキサ－２，５－ジエン－１－イリデン）－２Ｈ－クロメン－３－イル］オキシ｝－３，４，５－トリヒドロキシオキサン－２－イル）メチル］［１－ヒドロキシ－３－（４－ヒドロキシフェニル）プロパ－２－エン－１－イリデン］オキシダニウム、２－オクテノイルカルニチン及び１４－ＨＤｏＨＥを含み得る。いくつかの実施形態では、定量化してこれらの目的のために使用できる診断用バイオマーカーの群は、［（６－｛［５，７－ジヒドロキシ－２－（４－オキソシクロヘキサ－２，５－ジエン－１－イリデン）－２Ｈ－クロメン－３－イル］オキシ｝－３，４，５－トリヒドロキシオキサン－２－イル）メチル］［１－ヒドロキシ－３－（４－ヒドロキシフェニル）プロパ－２－エン－１－イリデン］オキシダニウム、（Ｅ）－２－（４，８－ジメチルノナ－３，７－ジエン－１－イル）－５－ヒドロキシ－２，７－ジメチル－２Ｈ－クロメン－８－カルバルデヒド及びＮ，Ｏ－ビス－（トリメチルシリル）フェニルアラニンを含み得る。いくつかの実施形態では、定量化してこれらの目的のために使用できる診断用バイオマーカーの群は、［（６－｛［５，７－ジヒドロキシ－２－（４－オキソシクロヘキサ－２，５－ジエン－１－イリデン）－２Ｈ－クロメン－３－イル］オキシ｝－３，４，５－トリヒドロキシオキサン－２－イル）メチル］［１－ヒドロキシ－３－（４－ヒドロキシフェニル）プロパ－２－エン－１－イリデン］オキシダニウム、２－オクテノイルカルニチン及び１４－ＨＤｏＨＥを含み得る。
【0046】
いくつかの実施形態では、定量化してこれらの目的のために使用できる診断用バイオマーカーの群は、２－オクテノイルカルニチン、（Ｅ）－２－（４，８－ジメチルノナ－３，７－ジエン－１－イル）－５－ヒドロキシ－２，７－ジメチル－２Ｈ－クロメン－８－カルバルデヒド及び１４－ＨＤｏＨＥを含み得る。いくつかの実施形態では、定量化してこれらの目的のために使用できる診断用バイオマーカーの群は、２－オクテノイルカルニチン、Ｎ，Ｏ－ビス－（トリメチルシリル）フェニルアラニン及び１４－ＨＤｏＨＥを含み得る。
【0047】
表１にリストされた代謝産物（バイオマーカー）は、ＣＲＣ／ＣＲＡを検出し、及び／又はＣＲＣ／ＣＲＡの治療を容易にするために使用できるパネルを提供する。それにもかかわらず、いくつかの実施形態では、本開示に係る診断用バイオマーカーの群は、表１にリストされていない１つ以上の他の代謝産物を含み得る。例えば、本開示に係る診断用バイオマーカーの群は、表３の少なくとも１種の代謝産物を含み得る。表３の代謝産物のそれぞれは、腸内細菌叢に関連し得る。表３の代謝産物のそれぞれは、ＣＲＣ／ＣＲＡの存在と密接に関連することが分かる。いくつかの実施形態では、表３の代謝産物のうちの１つ以上は、被験体のＣＲＣ／ＣＲＡを検出し、及び／又はＣＲＣ／ＣＲＡの治療を容易にするために、表１又は表２にリストされた代謝産物とは独立して使用され得る。いくつかの実施形態では、表３の代謝産物のうちの１つ以上は、被験体のＣＲＣ／ＣＲＡを検出し、及び／又はＣＲＣ／ＣＲＡの治療を容易にするために、表１又は表２にリストされた代謝産物に加えて使用され得る。いくつかの実施形態では、表３の１種以上の代謝産物の存在量は、例えば、質量分析によって定量化され、ＣＲＣ／ＣＲＡを検出し、及び／又はＣＲＣ／ＣＲＡの治療を容易にするために処理され得る。いくつかの実施形態では、表３の１種以上の代謝産物の存在量は、例えば、質量分析によって定量化され、表１又は表２の１種以上の代謝産物の定量化された存在量と同じグループに分けられ、ＣＲＣ／ＣＲＡを検出し、及び／又はＣＲＣ／ＣＲＡの治療を容易にするために処理され得る。いくつかの実施形態では、表３の代謝産物のうちの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１又は２２の代謝産物のみが定量化される。いくつかの実施形態では、表３の代謝産物のうちの２３種全ての代謝産物の存在量が定量化される。示されているように、表３の代謝産物の定量化された存在量は、表１又は表２の代謝産物の定量化された存在量とは独立して使用することができ、又は表１又は表２の代謝産物の定量化された存在量と一緒に同じグループに分けることができる。
【0048】
特定の実施形態では、表１又は表２の８種全ての代謝産物、並びに表３の１種の代謝産物のみが、定量化され、一緒に同じグループに分けられ、処理され、そして被験体のＣＲＣ／ＣＲＡを検出し、及び／又はＣＲＣ／ＣＲＡの治療を容易にするために使用される。特定の実施形態では、表１又は表２の８種全ての代謝産物、並びに表３の２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１又は２２の代謝産物のみが、定量化され、一緒に同じグループに分けられ、処理され、そして被験体のＣＲＣ／ＣＲＡを検出し、及び／又はＣＲＣ／ＣＲＡの治療を容易にするために使用される。特定の実施形態では、表１又は表２の８種全ての代謝産物、並びに表３の２３種全ての代謝産物が、定量化され、一緒に同じグループに分けられ、処理され、そして被験体のＣＲＣ／ＣＲＡを検出し、及び／又はＣＲＣ／ＣＲＡの治療を容易にするために使用される。
【0049】
特定の実施形態では、表１又は表２の１、２、３、４、５、６又は７種の代謝産物のみ、並びに表３の１種の代謝産物のみが、定量化され、一緒に同じグループに分けられ、処理され、そして被験体のＣＲＣ／ＣＲＡを検出し、及び／又はＣＲＣ／ＣＲＡの治療を容易にするために使用される。特定の実施形態では、表１又は表２の１、２、３、４、５、６又は７種の代謝産物、並びに表３の２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１又は２２の代謝産物のみが、定量化され、一緒に同じグループに分けられ、処理され、そして被験体のＣＲＣ／ＣＲＡを検出し、及び／又はＣＲＣ／ＣＲＡの治療を容易にするために使用される。特定の実施形態では、表１又は表２の１、２、３、４、５、６又は７種の代謝産物、並びに表３の２３種全ての代謝産物が、定量化され、一緒に同じグループに分けられ、処理され、そして被験体のＣＲＣ／ＣＲＡを検出し、及び／又はＣＲＣ／ＣＲＡの治療を容易にするために使用される。
【0050】
更に別の例として、本開示に係る診断用バイオマーカーの群は、表４の１種以上の代謝産物を含み得る。いくつかの実施形態では、本開示に係る診断用バイオマーカーの群は、表４の全ての代謝産物を更に含み得る。表４の代謝産物のそれぞれは、腸内細菌叢に関連し得る。表４の代謝産物のそれぞれは、ＣＲＣ／ＣＲＡの存在と関連することが分かる。いくつかの実施形態では、表４の代謝産物のうちの１つ以上は、被験体のＣＲＣ／ＣＲＡを検出し、及び／又はＣＲＣ／ＣＲＡの治療を容易にするために、表１、表２又は表３にリストされた代謝産物とは独立して使用され得る。いくつかの実施形態では、表４の代謝産物のうちの１つ以上は、被験体のＣＲＣ／ＣＲＡを検出し、及び／又はＣＲＣ／ＣＲＡの治療を容易にするために、表１又は表２にリストされた代謝産物に加えて使用され得る。いくつかの実施形態では、表４の代謝産物のうちの１つ以上は、被験体のＣＲＣ／ＣＲＡを検出し、及び／又はＣＲＣ／ＣＲＡの治療を容易にするために、表１、表２及び表３にリストされた代謝産物に加えて使用され得る。いくつかの実施形態では、表４の代謝産物のうちの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９又は５０の代謝産物のみが定量化される。いくつかの実施形態では、表４の代謝産物のうちの５１種全ての代謝産物の存在量が定量化される。示されているように、表４の代謝産物の定量化された存在量は、表１又は表２、並びに表３の代謝産物の定量化された存在量とは独立して使用することができ、又は表１又は表２、並びに表３の代謝産物の定量化された存在量と一緒に同じグループに分けることができる。
【0051】
特定の実施形態では、表１又は表２の８種全ての代謝産物、並びに表４の１種の代謝産物のみが、定量化され、一緒に同じグループに分けられ、処理され、そして被験体のＣＲＣ／ＣＲＡを検出し、及び／又はＣＲＣ／ＣＲＡの治療を容易にするために使用される。特定の実施形態では、表１又は表２の８種全ての代謝産物、並びに表４の２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９又は５０の代謝産物のみが、定量化され、一緒に同じグループに分けられ、処理され、そして被験体のＣＲＣ／ＣＲＡを検出し、及び／又はＣＲＣ／ＣＲＡの治療を容易にするために使用される。特定の実施形態では、表１又は表２の８種全ての代謝産物、並びに表４の５１種全ての代謝産物が、定量化され、一緒に同じグループに分けられ、処理され、そして被験体のＣＲＣ／ＣＲＡを検出し、及び／又はＣＲＣ／ＣＲＡの治療を容易にするために使用される。
【0052】
特定の実施形態では、表１又は表２の１、２、３、４、５、６、又は７種の代謝産物のみ、並びに表４の１種の代謝産物のみが、定量化され、一緒に同じグループに分けられ、処理され、そして被験体のＣＲＣ／ＣＲＡを検出し、及び／又はＣＲＣ／ＣＲＡの治療を容易にするために使用される。特定の実施形態では、表１又は表２の１、２、３、４、５、６又は７種の代謝産物、並びに表４の２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９又は５０の代謝産物のみが、定量化され、一緒に同じグループに分けられ、処理され、そして被験体のＣＲＣ／ＣＲＡを検出し、及び／又はＣＲＣ／ＣＲＡの治療を容易にするために使用される。特定の実施形態では、表１又は表２の１、２、３、４、５、６又は７種の代謝産物、並びに表４の５１種全ての代謝産物が、定量化され、一緒に同じグループに分けられ、処理され、そして被験体のＣＲＣ／ＣＲＡを検出し、及び／又はＣＲＣ／ＣＲＡの治療を容易にするために使用される。
【0053】
表１、表２、表３及び／又は表４にリストされた代謝産物の少なくとも１つの存在量を利用する予測モデルのＡＵＣ、特異度、及び感度は比較的高く、これは、これらの代謝産物の存在量を利用した予測モデルがＣＲＣ／ＣＲＡを有する被験体を正常被験体と効果的に区別できることを示している。
【0054】
表５は、表１にリストされた代謝産物の情報を示す。表５の代謝産物の特徴は、例えば質量分析を使用して測定できる質量電荷比を示す。表５の「倍率変化」という用語は、元の測定とその後の測定の間で量が変化する程度を表すパラメータを指す。表５の「Ｐ値」という用語は、検定統計量の未知の分布に関する帰無仮説の下で、実際に観測された値より極端又はより極端な値を観測した確率を指す。
【0055】
表１、３又は４にリストされた代謝産物の１つ以上は、１つ以上の異性体形態を有し得、本開示に係る診断用バイオマーカーの群の範囲に含まれることに留意されたい。
【0056】
本開示の別の態様によれば、被験体のＣＲＣ／ＣＲＡを検出する方法が提供される。いくつかの実施形態では、本方法は、被験体からのサンプル中の複数の代謝産物のパネルにおける１つ以上の成分の存在量を定量化するステップａ）を含み得る。複数の代謝産物は、本開示において先に説明されたように、表１、表２、表３及び／又は表４にリストされた代謝産物を含み得る。いくつかの実施形態では、本方法は、ステップａ）で定量化された代謝産物のそれぞれの存在量を処理することによりサンプルスコアを決定するステップを更に含み得る。いくつかの実施形態では、本方法は、サンプルスコアをカットオフスコアと比較することにより被験体のＣＲＣ／ＣＲＡを検出するステップｃ）を更に含み得る。
【0057】
いくつかの実施形態では、複数の代謝産物のパネルにおける１つ以上の成分の存在量は、質量分析（ＭＳ、例えば、液体クロマトグラフィー－質量分析（ＬＣ－ＭＳ）、ガスクロマトグラフィー－質量分析（ＧＣ－ＭＳ）、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦＭＳ））、紫外線分析などを使用して測定され得る。
【0058】
いくつかの実施形態では、サンプルスコアの決定は、コンピューティングデバイス上で実行され得る。コンピューティングデバイスは、サンプルスコアを決定するための予測モデルを取得することができる。ステップａ）で定量化された代謝産物のそれぞれの存在量は、予測モデルに入力され得る。予測モデルは、ステップａ）で定量化された代謝産物のそれぞれの存在量を処理し、サンプルスコアを出力することができる。サンプルスコアは、被験体がＣＲＣ／ＣＲＡを有する確率を示すことができる。
【0059】
単なる例として、ステップａ）で定量化された代謝産物のそれぞれの存在量は、代謝産物のそれぞれの濃度を測定することにより定量化され得る。いくつかの実施形態では、測定された濃度は正規化され得る。例えば、測定された濃度は、サンプル中の全ての代謝産物の総濃度で割ることができる。
【0060】
いくつかの実施形態では、予測モデルは、訓練されたモデルであり得る。予備モデルは、複数のトレーニングデータセットを使用して取得及び訓練され得る。複数のトレーニングデータセットのそれぞれは、サンプル被験体のサンプル代謝産物の濃度、及びサンプル被験体がＣＲＣ／ＣＲＡを有するか正常であるかを示すラベルを含み得る。複数のサンプル被験体は、ＣＲＣ／ＣＲＡを有さない複数の正常被験体、ＣＲＣを有する複数の被験体、及びＣＲＡを有する複数の被験体を含み得る。単なる例として、ラベルは０～１の値であってもよい。サンプル被験体が正常である場合、対応するラベルの値は０として指定され得る。サンプル被験体がＣＲＣ／ＣＲＡを有する場合、対応するラベルの値は１として指定され得る。これにより、予測モデルによって出力されたサンプルスコアは、０～１の値であってもよい。サンプルスコアが１に近いほど、被験体がＣＲＣ／ＣＲＡを有する可能性が高くなる。
【0061】
いくつかの実施形態では、予測モデルは、ロジスティック回帰法、サポートベクターマシン（ＳＶＭ）に基づいた方法、ベイズ分類器に基づいた方法、Ｋ最近傍法（ＫＮＮ）に基づいた方法、決定木法など、又はそれらの任意の組み合わせにより確立され得る。
【0062】
ステップｃ）では、サンプルスコアが予測モデルに関連するカットオフスコアと比較される。本明細書において使用されるように、「カットオフ値」という用語は、試験結果が異なるカテゴリーに分割される測定スケール上の分割点を指す。いくつかの実施形態では、サンプルスコアがカットオフスコア以上である場合、コンピューティングデバイスは、被験体がＣＲＣ／ＣＲＡを有すると決定してもよい。カットオフ値は、予測モデルの性能に基づいて決定されてもよい。いくつかの実施形態では、カットオフ値は、０．３５～０．６５の値であってもよい。いくつかの実施形態では、カットオフ値は、０．４０～０．６０の値であってもよい。いくつかの実施形態では、カットオフ値は、０．４５～０．５５の値であってもよい。例えば、カットオフ値は０．４８、０．５０、０．５２、０．５４１、０．５５などであってもよい。
【0063】
いくつかの実施形態では、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線は、予測モデルの性能を評価するために使用することができる。ＲＯＣ曲線は、そのカットオフ値が変化するときの予測モデルの診断能力を示してもよい。ＲＯＣ曲線は通常、特異度に対して感度をプロットすることにより生成される。曲線下面積（ＡＵＣ）は、ＲＯＣ曲線に基づいて決定されてもよい。ＡＵＣは、分類器（即ち、予測モデル）が、ランダムに選択されたポジティブインスタンスをランダムに選択されたネガティブインスタンスよりも高くランク付けする確率を示してもよい。
【0064】
いくつかの実施形態では、本開示に係る予測モデルのＡＵＣは、０．７を超える。いくつかの実施形態では、本開示に係る予測モデルのＡＵＣは、０．７５を超える。いくつかの実施形態では、本開示に係る予測モデルのＡＵＣは、０．７７を超える。いくつかの実施形態では、本開示に係る予測モデルのＡＵＣは、０．８を超える。いくつかの実施形態では、本開示に係る予測モデルのＡＵＣは、０．８５を超える。いくつかの実施形態では、本開示に係る予測モデルのＡＵＣは、０．９を超える。いくつかの実施形態では、本開示に係る予測モデルのＡＵＣは、０．９５を超える。
【0065】
いくつかの実施形態では、ＣＲＣ／ＣＲＡを検出するための予測モデルの感度は、７０％以上である。いくつかの実施形態では、ＣＲＣ／ＣＲＡを検出するための予測モデルの感度は、７５以上である。いくつかの実施形態では、ＣＲＣ／ＣＲＡを検出するための予測モデルの感度は、８０％以上である。いくつかの実施形態では、ＣＲＣ／ＣＲＡを検出するための予測モデルの感度は、８５％以上である。いくつかの実施形態では、ＣＲＣ／ＣＲＡを検出するための予測モデルの感度は、９０％以上である。いくつかの実施形態では、ＣＲＣ／ＣＲＡを検出するための予測モデルの感度は、９５％以上である。
【0066】
いくつかの実施形態では、ＣＲＣ／ＣＲＡを検出するための予測モデルの特異度は、７０％以上である。いくつかの実施形態では、ＣＲＣ／ＣＲＡを検出するための予測モデルの特異度は、７５以上である。いくつかの実施形態では、ＣＲＣ／ＣＲＡを検出するための予測モデルの特異度は、８０％以上である。いくつかの実施形態では、ＣＲＣ／ＣＲＡを検出するための予測モデルの特異度は、８５％以上である。いくつかの実施形態では、ＣＲＣ／ＣＲＡを検出するための予測モデルの特異度は、９０％以上である。いくつかの実施形態では、ＣＲＣ／ＣＲＡを検出するための予測モデルの特異度は、９５％以上である。
【0067】
図３Ａは、非標的メタボロミクス分析に基づいた検証セットに従って表Ａにリストされた８種の代謝産物の存在量を利用する予測モデルのＲＯＣである。具体的には、図３ＡのＲＯＣは、サンプルスコアを決定するために表１にリストされた８種の代謝産物の存在量を利用する例示的な予測モデルに関する。本開示に係る予測モデルは、表１にリストされた８種の代謝産物のうちの少なくとも１つの存在量を利用し得ることに留意されたい。図３ＡのＲＯＣは、単なる説明の目的として提供される。図３Ａに示すように、ＡＵＣは約０．９５であり、感度は約９５．４％であり、特異度は約９４％である。本明細書において使用されるように、「約」という用語は、値が比較的小さい範囲内（例えば、±０．０２％又は±０．０５％）で変動し得ることを意味する。
【0068】
図４Ｃは、０．５４１のカットオフスコアの下での検証群における予測モデルの識別効率を示すＲＯＣ曲線を示す。図４Ｃに示すように、予測モデルは、この検証セットにおいて、０．９１のＡＵＣ、８７．９％の感度、及び８１％の特異度に達した。
【0069】
診断用バイオマーカーの様々な群を利用する予測モデルの識別効率に関するより多くの説明は、本開示の他の箇所、例えば、実施例７及び実施例８に見出すことができる。これらの実施例に示すように、予測モデルのＡＵＣ、特異度、及び感度は比較的高く、これは、これらの代謝産物の存在量を利用した予測モデルがＣＲＣ／ＣＲＡを有する被験体を正常被験体と効果的に区別できることを示している。
【0070】
いくつかの実施形態では、ＣＲＣ／ＣＲＡを検出する方法は、結腸内視鏡検査、生検検査、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）スキャン、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）スキャンなど、又はそれらの任意の組み合わせなどの他のアプローチを使用して、ＣＲＣ／ＣＲＡを検証するステップを更に含み得る。
【0071】
本開示の別の態様によれば、被験体のＣＲＡを検出する方法が提供される。本方法は、被験体からのサンプル中の複数の代謝産物のパネルにおける少なくとも５つの成分の存在量を定量化するステップａ）を含み得る。本方法は、ステップａ）で定量化された代謝産物のそれぞれの存在量を処理することによりサンプルスコアを決定するステップｂ）を更に含み得る。本方法は、評価値をカットオフ値と比較することにより被験体のＣＲＡを検出するステップｃ）を更に含み得る。いくつかの実施形態では、複数の代謝産物は、本開示において先に説明されたように、表１、表２、表３及び／又は表４にリストされた代謝産物を含み得る。
【0072】
いくつかの実施形態では、ステップｂ）は、ステップ（ａ）で定量化された代謝産物のそれぞれの存在量を正規化するステップと、正規化された存在量を予測モデルで処理することによりサンプルスコアを決定するステップとを更に含み得る。予測モデルは、複数のトレーニングデータセットを使用して確立され得る。例えば、複数のトレーニングデータセットのそれぞれは、サンプル被験体のサンプル代謝産物の濃度、及びサンプル被験体がＣＲＣを有するか正常であるかを示すラベルを含み得る。複数のサンプル被験体は、ＣＲＣを有さない複数の正常被験体及びＣＲＣを有する複数の被験体を含み得る。
【0073】
いくつかの実施形態では、予測モデルは、正常な人々を異なる段階のＣＲＣ患者と区別するために使用されてもよい。いくつかの実施形態では、ＣＲＣを有する複数のサンプル被験体は、前癌段階（ステージ０）のＣＲＣを有する複数の被験体を含み得る。いくつかの実施形態では、ＣＲＣを有する複数のサンプル被験体は、初期（ステージＩ）ＣＲＣを有する複数の被験体を含み得る。いくつかの実施形態では、ＣＲＣを有する複数のサンプル被験体は、中期（ステージＩＩ）ＣＲＣを有する複数の被験体を含み得る。いくつかの実施形態では、ＣＲＣを有する複数のサンプル被験体は、後期（ステージＩＩＩ及びＩＶ）ＣＲＣを有する複数の被験体を含み得る。いくつかの実施形態では、ＣＲＣを検出するための予測モデルは、本開示で先に説明したような、ＣＲＣ／ＣＲＡを検出するための予測モデルと同様の方法で確立され得る。
【0074】
いくつかの実施形態では、ＣＲＣを検出するための予測モデルの感度は、６５％以上である。いくつかの実施形態では、ＣＲＣを検出するための予測モデルの感度は、７０％以上である。いくつかの実施形態では、ＣＲＣを検出するための予測モデルの感度は、７５％以上である。いくつかの実施形態では、ＣＲＣを検出するための予測モデルの感度は、８０％以上である。いくつかの実施形態では、ＣＲＣ／ＣＲＡを検出するための予測モデルの感度は、８５％以上である。いくつかの実施形態では、ＣＲＣを検出するための予測モデルの感度は、９０％以上である。
【0075】
いくつかの実施形態では、ＣＲＣを検出するための予測モデルの特異度は、７０％以上である。いくつかの実施形態では、ＣＲＣを検出するための予測モデルの特異度は、７５％以上である。いくつかの実施形態では、ＣＲＣを検出するための予測モデルの特異度は、８０％以上である。いくつかの実施形態では、ＣＲＣを検出するための予測モデルの特異度は、８５％以上である。いくつかの実施形態では、ＣＲＣを検出するための予測モデルの特異度は、９０％以上である。
【0076】
例えば、実施例６で説明するように、ＣＲＣを検出するための予測モデルは、ステージ０／Ｉ ＣＲＣを有する被験体を正常被験体と区別するために使用され、０．８５のＡＵＣ、８２．１％の感度、及び８１％の特異度を有する（例えば、図６Ｂを参照）。ＣＲＣを検出するための予測モデルは、ステージＩＩ ＣＲＣを有する被験体を正常被験体と区別するためにも使用され、０．８９のＡＵＣ、８８．９％の感度、及び８１％の特異度を有する（例えば、図６Ｃを参照）。ＣＲＣを検出するための予測モデルは、ステージＩＩＩ／ＩＶ ＣＲＣを有する被験体を正常被験体と区別するためにも使用され、０．９１のＡＵＣ、８５％の感度、及び８１％の特異度を有する。
【0077】
本開示の更に別の態様によれば、被験体のステージＩ／ＩＩ ＣＲＣを検出する方法が提供される。本方法は、（ａ）質量分析により、被験体からのサンプル中の複数の代謝産物のパネルにおける１つ以上の成分の存在量を定量化するステップであって、複数の代謝産物が表１の代謝産物を含むステップと、（ｂ）ステップ（ａ）で定量化された代謝産物のそれぞれの濃度を処理することによりサンプルスコアを決定するステップと、（ｃ）評価値をカットオフ値と比較することにより被験体のステージＩ／ＩＩ ＣＲＣを検出するステップと、を含み得る。いくつかの実施形態では、複数の代謝産物は、本開示において先に説明されたように、表１、表２、表３及び／又は表４にリストされた代謝産物を含み得る。
【0078】
いくつかの実施形態では、ステップｂ）は、ステップ（ａ）で定量化された代謝産物のそれぞれの存在量を正規化するステップと、正規化された存在量を予測モデルで処理することによりサンプルスコアを決定するステップとを更に含み得る。予測モデルは、複数のトレーニングデータセットを使用して確立され得る。例えば、複数のトレーニングデータセットのそれぞれは、サンプル被験体のサンプル代謝産物の濃度、及びサンプル被験体がステージＩ／ＩＩ ＣＲＣを有するか正常であるかを示すラベルを含み得る。複数のサンプル被験体は、ＣＲＣを有さない複数の正常被験体及びステージＩ／ＩＩ ＣＲＣを有する複数の被験体を含み得る。
【0079】
本開示の更に別の態様によれば、被験体のステージＩＩＩ／ＩＶ ＣＲＣを検出する方法が提供される。本方法は、（ａ）質量分析により、被験体からのサンプル中の複数の代謝産物のパネルにおける１つ以上の成分の存在量を定量化するステップであって、複数の代謝産物が表１の代謝産物を含むステップと、（ｂ）ステップ（ａ）で定量化された代謝産物のそれぞれの濃度を処理することによりサンプルスコアを決定するステップと、（ｃ）評価値をカットオフ値と比較することにより被験体のステージＩＩＩ／ＩＶ ＣＲＣを検出するステップと、を含み得る。いくつかの実施形態では、複数の代謝産物は、本開示において先に説明されたように、表１、表２、表３及び／又は表４にリストされた代謝産物を含み得る。
【0080】
いくつかの実施形態では、ステップｂ）は、ステップ（ａ）で定量化された代謝産物のそれぞれの存在量を正規化するステップと、正規化された存在量を予測モデルで処理することによりサンプルスコアを決定するステップとを更に含み得る。予測モデルは、複数のトレーニングデータセットを使用して確立され得る。例えば、複数のトレーニングデータセットのそれぞれは、サンプル被験体のサンプル代謝産物の濃度、及びサンプル被験体がステージＩＩＩ／ＩＶ ＣＲＣを有するか正常であるかを示すラベルを含み得る。複数のサンプル被験体は、ＣＲＣを有さない複数の正常被験体及びステージＩＩＩ／ＩＶ ＣＲＣを有する複数の被験体を含み得る。
【0081】
本開示の更に別の態様によれば、被験体のＣＲＣ／ＣＲＡを治療する方法が提供される。本方法は、本開示において先に説明された方法に従ってＣＲＣ／ＣＲＡを検出するステップと、被験体にＣＲＣ／ＣＲＡの治療を施すステップと、を含み得る。
【0082】
いくつかの実施形態では、ＣＲＣ／ＣＲＡを治療するための方法は、結腸内視鏡検査、生検検査、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）スキャン、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）スキャンなど、又はそれらの任意の組み合わせなどの他のアプローチを使用して、ＣＲＣ／ＣＲＡを検証するステップを更に含み得る。いくつかの実施形態では、本開示のプロセスは、結腸内視鏡検査、生検検査、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）スキャン、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）スキャンなど、又はそれらの任意の組み合わせによるＣＲＣ／ＣＲＡの検証を命令するステップを更に含み得る。特定の実施形態では、適切な治療を適用できるように、これらのアプローチを使用してＣＲＣとＣＲＡを区別することができる。
【0083】
いくつかの実施形態では、治療は、化学療法、放射線療法、標的薬物療法、免疫療法など、又はそれらの任意の組み合わせを含み得る。いくつかの実施形態では、治療は緩和ケアを含み得る。例えば、被験体が後期ＣＲＣと診断され、他の治療アプローチが無効であると判明した場合、被験体の痛み及びストレスを軽減するために、緩和ケアが被験体に提供され得る。本明細書において使用される「ＣＲＣ／ＣＲＡの治療」又は「ＣＲＣの治療」は、癌転移を含む結腸直腸癌の進行を部分的又は完全に阻害、遅延又は予防すること、癌転移を含む癌の再発を抑制、遅延又は予防すること、又は哺乳動物、例えばヒトの癌の発生又は発症を予防（化学的予防）することを指す。更に、本発明の方法は、癌を有するヒト患者の治療のために実施され得る。しかし、本方法は他の哺乳動物の癌の治療にも有効である可能性もある。
【0084】
本開示の更に別の態様によれば、腸内細菌叢関連（ＧＭＡ）代謝産物を、ＣＲＣ／ＣＲＡの予測パネルのためのバイオマーカーとして同定する方法が提供される。いくつかの実施形態では、本方法は、ＣＲＣ／ＣＲＡ患者及びＣＲＣ／ＣＲＡを有さない人の対照群からのサンプルに対して非標的質量分析を実施することによりソースデータを取得するステップを含み得る。本方法は、ＣＲＣ／ＣＲＡ患者において有意に変化する代謝産物の第１の群を同定するステップを更に含み得る。代謝産物の第２の群は、腸内細菌叢との有意な相関を示す代謝産物を選択することにより、第１の群から同定され得る。本方法は、選択モデルを使用して、代謝産物の第２の群から予測パネルのためのＧＭＡ代謝産物を選択するステップを更に含み得る。
【0085】
いくつかの実施形態では、メタボロミクスプロファイリング分析は、ソースデータを使用して実行され、代謝産物の第１の群を同定し得る。
【0086】
いくつかの実施形態では、代謝産物の第２の群は、相関分析により代謝産物の第１の群から選択され得る。例えば、ピアソン相関係数分析をＣＲＣ／ＣＲＣ患者内で実行して、第１の閾値よりも高い相対的存在量の腸内細菌叢種と第２の閾値よりも高い存在量の代謝産物とをプロファイリングすることができる。例えば、特定の腸内微生物叢種の相対的存在量は、サンプル中の全ての細菌叢種の量に対する細菌叢種の量の比率に基づいて決定され得る。代謝産物の相対的存在量は、代謝産物に対応するＭＳ／ＭＳで検出されたフラグメントのカウントの合計に基づいて決定され得る。例えば、第１の閾値は、０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％などの０．０１％～１％の値であり得る。別の例として、第２の閾値は、１０００、３０００、５０００、１００００、１２０００、１５０００、１８０００、２０００などの１０００～２０００の値であり得る。
【0087】
いくつかの実施形態では、腸内細菌叢種及びそれらの存在量は、ＣＲＣ／ＣＲＡ患者及びＣＲＣ／ＣＲＡを有さない人の対照群からの糞便サンプルを使用して検出され得る。糞便サンプル中の腸内細菌叢種及びそれらの存在量は、メタゲノムシーケンスを使用して検出され得る。例えば、メタゲノムシーケンスのために糞便サンプルから核酸を抽出してもよい。
【0088】
いくつかの実施形態では、予測パネルのためのＧＭＡ代謝産物は、選択モデルを使用して、代謝産物の第２の群から選択され得る。例えば、選択モデルは、回帰アルゴリズムに基づいたモデルであり得る。回帰アルゴリズムは、最小絶対収縮及び選択演算子（ＬＡＳＳＯ）アルゴリズム、線形回帰アルゴリズム、多項式回帰アルゴリズム、リッジ回帰アルゴリズム、ＥｌａｓｔｉｃＮｅｔ回帰アルゴリズムなど、又はそれらの任意の組み合わせを含むが、これらに限定されない。
【0089】
いくつかの実施形態では、予測パネルのＧＭＡ代謝産物を決定するために、選択モデルを使用して選択された代謝産物の診断効率の安定性を更に評価してもよい。例えば、代謝産物が非標的及び標的検出において一貫したアップレギュレーション又はダウンレギュレーションの傾向を示す場合、代謝産物の診断効率は安定であると見なされる。加えて、又は代替的に、様々なアプローチ（例えば、標的ＬＣ－ＭＳ検出、非標的メタボローム）を使用して代謝産物を安定して測定できる場合、代謝産物の診断効率は安定であると見なされる。
【0090】
本開示に係る方法及び代謝産物バイオマーカーは、本開示の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない以下の実施例に従って更に説明される。
【0091】
＜実施例＞
方法
ＣＲＣメタボロミクスプロファイリングの血清コホート
血清コホートは、２０１７年～２０１９年の間に４５歳～７５歳の５１２人の被験体をランダムに選択することにより確立された。術前放射線療法又は化学療法治療を受けた、又は過去にＣＲＣの病歴がある被験体は除外された。血清コホートは、発見セット、モデリングセット及び検証セットという３つのセットに分けられた。発見セットには、正常群、腺腫群及び結腸直腸癌群という３つの群に分類された９２人の被験体が含まれた。正常群（又は略してＮ）には３１人の被験体が含まれた。腺腫群（又は略してＡ）には１２人の被験体が含まれた。結腸直腸癌群（又は略してＣ）には４９人の被験体が含まれた。モデリングセットには２６５人の被験体が含まれ、そのうち９７人は正常であり、１６８人は結腸直腸異常患者であった。モデリングセットの被験体の３０％はランダムにトレーニングセットに選択され、残りはテストセットに選択された。検証セットには、６９人の正常被験体と１２０人の結腸直腸異常患者を含む１８９人の被験体が含まれた。病理学的診断及び病期は、対癌米国合同委員会と国際対癌連合によって維持されている腫瘍リンパ節転移（ＴＮＭ）病期分類システムに基づいて決定された。３つのセットの被験体の血液は治療前にサンプリングされた。
方法
ＣＲＣメタボロミクスプロファイリングの血清コホート
血清コホートは、２０１７年～２０１９年の間に４５歳～７５歳の５１２人の被験体をランダムに選択することにより確立された。術前放射線療法又は化学療法治療を受けた、又は過去にＣＲＣの病歴がある被験体は除外された。血清コホートは、発見セット、モデリングセット及び検証セットという３つのセットに分けられた。発見セットには、正常群、腺腫群及び結腸直腸癌群という３つの群に分類された９２人の被験体が含まれた。正常群（又は略してＮ）には３１人の被験体が含まれた。腺腫群（又は略してＡ）には１２人の被験体が含まれた。結腸直腸癌群（又は略してＣ）には４９人の被験体が含まれた。モデリングセットには２６５人の被験体が含まれ、そのうち９７人は正常であり、１６８人は結腸直腸異常患者であった。モデリングセットの被験体の３０％はランダムにトレーニングセットに選択され、残りはテストセットに選択された。検証セットには、６９人の正常被験体と１２０人の結腸直腸異常患者を含む１８９人の被験体が含まれた。病理学的診断及び病期は、対癌米国合同委員会と国際対癌連合によって維持されている腫瘍リンパ節転移（ＴＮＭ）病期分類システムに基づいて決定された。３つのセットの被験体の血液は治療前にサンプリングされた。
【0092】
糞便血清一致コホート
５５人の被験体を含む糞便血清一致コホート（又は一致コホートと呼ばれる）が確立され、そのうち１６人は正常で、３９人は結腸直腸癌又は腺腫の患者であった。糞便と血清の両方が同じ被験体から収集された。糞便サンプルは液体窒素で急速凍結され、更に使用するまで－８０℃で保管された。
５５人の被験体を含む糞便血清一致コホート（又は一致コホートと呼ばれる）が確立され、そのうち１６人は正常で、３９人は結腸直腸癌又は腺腫の患者であった。糞便と血清の両方が同じ被験体から収集された。糞便サンプルは液体窒素で急速凍結され、更に使用するまで－８０℃で保管された。
【0093】
非標的メタボロミクス検出のための代謝産物抽出
非標的メタボロミクス検出での代謝産物抽出について、２４０ｍｌのアセトニトリル／イソプロパノール（容量で３：１）を６０ｍｌの予め解凍された血清サンプルに添加して、３００ｍｌ容量の血清溶液を得た。血清タンパク質を沈殿させるために、６０μＬのギ酸アンモニウム（０．５ｇ／ｍｌ）を（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社の１００ｕｇ／ｍｌのＬ－チロシン－（フェニル－３，５－ｄ２）、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｉｓｏｔｏｐｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社の１０ｕｇ／ｍｌの１３Ｃ－コール酸、ＭｅｄＣｈｅｍ Ｅｘｐｒｅｓｓ社の６０ｕｇ／ｍｌのドキセルカルシフェロールを含む）６μＬの内部標準溶液とともに、血清溶液に添加して混合血清溶液を得た。内部標準溶液には、１００ｕｇ／ｍｌのＬ－チロシン－（フェニル－３，５－ｄ２）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、１０ｕｇ／ｍｌの１３Ｃ－コール酸（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｉｓｏｔｏｐｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、及び６０ｕｇ／ｍｌのドキセルカルシフェロール（ＭｅｄＣｈｅｍ Ｅｘｐｒｅｓｓ）が含まれた。混合血清溶液を４分間ボルテックスし、１３，０００ｒｐｍ（又は１７，９４９ｇ）で５分間遠心分離した。次に、混合血清溶液の全ての代謝産物を含む２００μｌの上清を別のチューブに移し、Ｃｅｎｔｒｉｖａｐコールドトラップ遠心分離により乾燥させて、乾燥した代謝産物抽出物を得た。最後に、更に分析するために、乾燥した代謝産物抽出物を、０．１％のギ酸（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を含む７５μＬの５５％メタノール（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）で再構成した。
非標的メタボロミクス検出での代謝産物抽出について、２４０ｍｌのアセトニトリル／イソプロパノール（容量で３：１）を６０ｍｌの予め解凍された血清サンプルに添加して、３００ｍｌ容量の血清溶液を得た。血清タンパク質を沈殿させるために、６０μＬのギ酸アンモニウム（０．５ｇ／ｍｌ）を（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社の１００ｕｇ／ｍｌのＬ－チロシン－（フェニル－３，５－ｄ２）、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｉｓｏｔｏｐｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社の１０ｕｇ／ｍｌの１３Ｃ－コール酸、ＭｅｄＣｈｅｍ Ｅｘｐｒｅｓｓ社の６０ｕｇ／ｍｌのドキセルカルシフェロールを含む）６μＬの内部標準溶液とともに、血清溶液に添加して混合血清溶液を得た。内部標準溶液には、１００ｕｇ／ｍｌのＬ－チロシン－（フェニル－３，５－ｄ２）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、１０ｕｇ／ｍｌの１３Ｃ－コール酸（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｉｓｏｔｏｐｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、及び６０ｕｇ／ｍｌのドキセルカルシフェロール（ＭｅｄＣｈｅｍ Ｅｘｐｒｅｓｓ）が含まれた。混合血清溶液を４分間ボルテックスし、１３，０００ｒｐｍ（又は１７，９４９ｇ）で５分間遠心分離した。次に、混合血清溶液の全ての代謝産物を含む２００μｌの上清を別のチューブに移し、Ｃｅｎｔｒｉｖａｐコールドトラップ遠心分離により乾燥させて、乾燥した代謝産物抽出物を得た。最後に、更に分析するために、乾燥した代謝産物抽出物を、０．１％のギ酸（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を含む７５μＬの５５％メタノール（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）で再構成した。
【0094】
標的メタボロミクス検出のための代謝産物抽出
標的メタボロミクス検出での代謝産物抽出について、以下の変更を除いて、上記と同様の方法を使用した。５μｇ／ｍＬの１３Ｃ－コール酸を含む６μＬの内部標準溶液を、２４０?Ｌのアセトニトリル及びイソプロパノール（４：１の比率、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）と６０μＬのギ酸アンモニウム（０．５ｇ／ｍｌ）とともに、６０μＬの血清に添加して混合溶液を得た。混合溶液を１３，０００ｒｐｍ（１７，９４９ｇ）で５分間遠心分離した。次に、混合溶液の８０μＬの上清を２００μＬの水で希釈してから使用した。
標的メタボロミクス検出での代謝産物抽出について、以下の変更を除いて、上記と同様の方法を使用した。５μｇ／ｍＬの１３Ｃ－コール酸を含む６μＬの内部標準溶液を、２４０?Ｌのアセトニトリル及びイソプロパノール（４：１の比率、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）と６０μＬのギ酸アンモニウム（０．５ｇ／ｍｌ）とともに、６０μＬの血清に添加して混合溶液を得た。混合溶液を１３，０００ｒｐｍ（１７，９４９ｇ）で５分間遠心分離した。次に、混合溶液の８０μＬの上清を２００μＬの水で希釈してから使用した。
【0095】
ＱＣサンプルの調製
発見セット内の各正常被験体及び各ＣＲＣ被験体に由来する血清は、それぞれＣプール及びＮプールとしてプールされた（プールされた各サンプルの総量は１０ｍｌである）。一連の７つの追加の品質管理（ＱＣ）サンプルは、容量でＣプールの１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、７５％、及び９０％をＮプールと混合して調製された。ＱＣサンプルは、半定量的な非標的メタボロミクスプロファイリングに使用された。
発見セット内の各正常被験体及び各ＣＲＣ被験体に由来する血清は、それぞれＣプール及びＮプールとしてプールされた（プールされた各サンプルの総量は１０ｍｌである）。一連の７つの追加の品質管理（ＱＣ）サンプルは、容量でＣプールの１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、７５％、及び９０％をＮプールと混合して調製された。ＱＣサンプルは、半定量的な非標的メタボロミクスプロファイリングに使用された。
【0096】
非標的代謝産物プロファイリング
血清コホート及び糞便血清一致コホートの発見セットから抽出された代謝産物は、ＵｌｔｉＭａｔｅ３０００ ＵＰＬＣ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）に結合されたＱ Ｅｘａｃｔｉｖｅ又はＱ Ｅｘａｃｔｉｖｅ質量分析計によって分析された。ＭＳフルスキャンモードで７０，００００の分解能で、１３０～１２００Ｄａの質量／電荷比（ｍ／ｚ）範囲でデータを取得した。エレクトロスプレー源の条件は、シースガスを４０ｐｓｉとし、キャピラリー温度を３２０℃とし、スプレー電圧を３ｋＶ（正のＨＥＳＩ）及び３．２ｋＶ（負のＨＥＳＩ）とするように設定された。ＣＯＲＴＥＣＳ（Ｗａｔｅｒｓ）Ｃ１８カラム（１．６μｍ、２．１＊１００ｍｍ）は３５℃に維持されたオーブン温度で使用された。流速を０．３ｍＬ／ｍｉｎに設定し、各サンプルを５?Ｌ注入した。移動相Ａ（例えば、０．１％のギ酸を含むアセトニトリル）を（例えば、０．５～１４分で５％～４５％、３２分で７５％、４２分で８０％、５０～５５分で１００％であり、次の５分間で５％に戻る）グラジエントとして適用した。移動相Ｂは、０．１％のギ酸を含むメルクミリポア水であった。得られた質量スペクトルは、更なる処理のためにＰｒｏｇｅｎｅｓｉｓ ＱＩ ソフトウェア（ＮｏｎｌｉｎｅａｒＤｙｎａｍｉｃｓ、Ｄｕｒｈａｍ、ＮＣ、ＵＳＡ）にエクスポートされた。
血清コホート及び糞便血清一致コホートの発見セットから抽出された代謝産物は、ＵｌｔｉＭａｔｅ３０００ ＵＰＬＣ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）に結合されたＱ Ｅｘａｃｔｉｖｅ又はＱ Ｅｘａｃｔｉｖｅ質量分析計によって分析された。ＭＳフルスキャンモードで７０，００００の分解能で、１３０～１２００Ｄａの質量／電荷比（ｍ／ｚ）範囲でデータを取得した。エレクトロスプレー源の条件は、シースガスを４０ｐｓｉとし、キャピラリー温度を３２０℃とし、スプレー電圧を３ｋＶ（正のＨＥＳＩ）及び３．２ｋＶ（負のＨＥＳＩ）とするように設定された。ＣＯＲＴＥＣＳ（Ｗａｔｅｒｓ）Ｃ１８カラム（１．６μｍ、２．１＊１００ｍｍ）は３５℃に維持されたオーブン温度で使用された。流速を０．３ｍＬ／ｍｉｎに設定し、各サンプルを５?Ｌ注入した。移動相Ａ（例えば、０．１％のギ酸を含むアセトニトリル）を（例えば、０．５～１４分で５％～４５％、３２分で７５％、４２分で８０％、５０～５５分で１００％であり、次の５分間で５％に戻る）グラジエントとして適用した。移動相Ｂは、０．１％のギ酸を含むメルクミリポア水であった。得られた質量スペクトルは、更なる処理のためにＰｒｏｇｅｎｅｓｉｓ ＱＩ ソフトウェア（ＮｏｎｌｉｎｅａｒＤｙｎａｍｉｃｓ、Ｄｕｒｈａｍ、ＮＣ、ＵＳＡ）にエクスポートされた。
【0097】
代謝産物の注釈及び推定
代謝産物の注釈は、以下の変更によって行われた。簡単に説明すると、ＭＳ－ＤＩＡＬ４．２４が注釈に適用された。まず、ＱＣ ＭＳ１／ＭＳ２を、ＨＭＤＢ、ＭｏＮＡ及びＭａｓｓＢａｎｋを含む公開スペクトルライブラリにおいてスペクトル検索した。次に、脂質ブラストは、リピドミクス機能によって更に行われた。デフォルトの類似度スコアカットオフが適用された。最後に、同様の読み出しを確認及び区別するために、参照データベースによる手動チェックが行われた。現在の状況ではＭＳ／ＭＳを確実に取得できない代謝産物については、ＨＭＤＢ及びＢｉｏ－ＭＬデータベースにおいてそのＭＺを検索して潜在的なアイデンティティを推定した。代謝産物の注釈の信頼レベルは次のように設定された：現在のクロマグラフィー及びＭＳ条件の参照化合物からのＭＳ／ＭＳ＞ライブラリからのＭＳ／ＭＳ＞ＭＺマッチング。
代謝産物の注釈は、以下の変更によって行われた。簡単に説明すると、ＭＳ－ＤＩＡＬ４．２４が注釈に適用された。まず、ＱＣ ＭＳ１／ＭＳ２を、ＨＭＤＢ、ＭｏＮＡ及びＭａｓｓＢａｎｋを含む公開スペクトルライブラリにおいてスペクトル検索した。次に、脂質ブラストは、リピドミクス機能によって更に行われた。デフォルトの類似度スコアカットオフが適用された。最後に、同様の読み出しを確認及び区別するために、参照データベースによる手動チェックが行われた。現在の状況ではＭＳ／ＭＳを確実に取得できない代謝産物については、ＨＭＤＢ及びＢｉｏ－ＭＬデータベースにおいてそのＭＺを検索して潜在的なアイデンティティを推定した。代謝産物の注釈の信頼レベルは次のように設定された：現在のクロマグラフィー及びＭＳ条件の参照化合物からのＭＳ／ＭＳ＞ライブラリからのＭＳ／ＭＳ＞ＭＺマッチング。
【0098】
メタゲノムシーケンスと分類学的プロファイリング
一致コホートに関与した５５人の被験体の糞便サンプルは、ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｓｔｏｏｌ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）によるＤＮＡ抽出に使用され、そのうち４４人のＤＮＡサンプルは品質管理に合格した。全ゲノムショットガンメタゲノムシーケンスは、腸内細菌叢の分類と機能分析に使用された。ライブラリの構築及びその後のメタゲノムシーケンスは、サンプルあたり１０Ｇｂを超えるシーケンスをターゲットにするＳｈａｎｇｈａｉ ＯＥ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｃｏ．Ｌｔｄで、１５０塩基対とペアエンドリードにより、ＨｉＳｅｑ ４０００プラットフォーム（イルミナ）で実行された。
一致コホートに関与した５５人の被験体の糞便サンプルは、ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｓｔｏｏｌ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）によるＤＮＡ抽出に使用され、そのうち４４人のＤＮＡサンプルは品質管理に合格した。全ゲノムショットガンメタゲノムシーケンスは、腸内細菌叢の分類と機能分析に使用された。ライブラリの構築及びその後のメタゲノムシーケンスは、サンプルあたり１０Ｇｂを超えるシーケンスをターゲットにするＳｈａｎｇｈａｉ ＯＥ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｃｏ．Ｌｔｄで、１５０塩基対とペアエンドリードにより、ＨｉＳｅｑ ４０００プラットフォーム（イルミナ）で実行された。
【0099】
シーケンス生データは、Ｔｒｉｍｍｏｍａｔｉｃ Ｖ０．３６を使用して処理された。この処理には、アダプタートリミング、低品質の読み取り又は塩基対の減少、及びＢｏｗｔｉｅ２を使用したヒトゲノム（ｈｇ１９）に対するマッピングによるホスト汚染の除去が含まれる。その後、クリーン読み取りは、デフォルトパラメータでＭｅｔａＰｈｌＡｎ２バージョン２．２．０を使用して構築され、更に分類学的にプロファイリングされた。合計で、１２４４５の細菌叢種がプロファイリングされ、そのうち、少なくとも１人の被験体で相対存在量が０．１％を超える６４０種のみが、更なる細菌叢－メタボローム相互関係分析のために考慮された。
【0100】
標的代謝産物プロファイリング
ＥｘｉｏｎＬＣ ＡＣシステムは、別々のイオンモード（正と負）で動作する６５００ ＱＴｒａｐ 質量分析計（Ｓｃｉｅｘ）に接続された。逆相液体クロマトグラフィーの移動相とカラムは、非標的代謝産物プロファイリングと同じであった。各サンプルの注入量は１０μｌであった。各遷移のデータ取り込み時間は、中程度の衝突ガスが１０ｍｓ、カーテンガスが４０ｍｓであり、イオンスプレー電圧は５，０００Ｖと－４，５００Ｖであり、ソース温度は４５０℃であった。代謝産物は、最初に移動相Ｂの１２％で、続いて移動相Ｂの６０％に増加した量で、０．３ｍＬ／ｍｉｎの流速で２．５分間カラムから溶出された。移動相Ｂの線形６０％－８５％及び８５％－１００％は、それぞれ６分及び８．５分に設定された。標的分析の品質管理サンプルは、次のようにプールされた：対照群（２５２サンプル）、癌群（２６１サンプル）、及び対照群：癌群（１：１）。デクラスタリング電位と衝突エネルギーは、対照群の品質管理サンプルから最適化された。代謝産物のピークは、Ｓｃｉｅｘ Ａｎａｌｙｓｔ １．６．３ソフトウェアを使用して統合された。
ＥｘｉｏｎＬＣ ＡＣシステムは、別々のイオンモード（正と負）で動作する６５００ ＱＴｒａｐ 質量分析計（Ｓｃｉｅｘ）に接続された。逆相液体クロマトグラフィーの移動相とカラムは、非標的代謝産物プロファイリングと同じであった。各サンプルの注入量は１０μｌであった。各遷移のデータ取り込み時間は、中程度の衝突ガスが１０ｍｓ、カーテンガスが４０ｍｓであり、イオンスプレー電圧は５，０００Ｖと－４，５００Ｖであり、ソース温度は４５０℃であった。代謝産物は、最初に移動相Ｂの１２％で、続いて移動相Ｂの６０％に増加した量で、０．３ｍＬ／ｍｉｎの流速で２．５分間カラムから溶出された。移動相Ｂの線形６０％－８５％及び８５％－１００％は、それぞれ６分及び８．５分に設定された。標的分析の品質管理サンプルは、次のようにプールされた：対照群（２５２サンプル）、癌群（２６１サンプル）、及び対照群：癌群（１：１）。デクラスタリング電位と衝突エネルギーは、対照群の品質管理サンプルから最適化された。代謝産物のピークは、Ｓｃｉｅｘ Ａｎａｌｙｓｔ １．６．３ソフトウェアを使用して統合された。
【0101】
ＣＲＣ及び隣接正常組織の気流支援脱離エレクトロスプレーイオン化質量分析イメージング（ＡＦＡＤＥＳＩ－ＭＳＩ）分析
質量分析イメージングでは、進行性腺腫又はＣＲＣ並びに対応隣接非癌性組織を含む合計９ペアのヒト結腸直腸組織サンプルを収集した。これらのサンプルは、生検直後に液体窒素で新たに凍結され、極低温バイアルに移されて－８０℃で保存された。ＣＭ １８６０ ＵＶ クリオスタットミクロトーム（Ｌｅｉｃａ）を使用して、１０μｍでのセクショニングを行った。従来のＨＥ染色及び質量分析イメージングのために、隣接する切片を顕微鏡スライドに解凍マウントした。
質量分析イメージングでは、進行性腺腫又はＣＲＣ並びに対応隣接非癌性組織を含む合計９ペアのヒト結腸直腸組織サンプルを収集した。これらのサンプルは、生検直後に液体窒素で新たに凍結され、極低温バイアルに移されて－８０℃で保存された。ＣＭ １８６０ ＵＶ クリオスタットミクロトーム（Ｌｅｉｃａ）を使用して、１０μｍでのセクショニングを行った。従来のＨＥ染色及び質量分析イメージングのために、隣接する切片を顕微鏡スライドに解凍マウントした。
【0102】
ＡＤＡＤＥＳＩ－ＭＳＩ分析は、Ｑ－Ｅｘａｃｔｉｖｅ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、正イオンモードと負イオンモードの両方で７０，０００の質量分解能で７０～１，０００ｍ／ｚの範囲で行われた。簡単に説明すると、ＡＤＡＥＳＩ－ＭＳＩの条件は次のとおりである。アセトニトリルと水（容量で８：２）の混合物であるスプレー溶媒を、イオン化中に５μＬ／分の流速で適用した。噴霧器と輸送管の電圧は、正イオンモードでそれぞれ７，５００Ｖと２，０００Ｖに設定され、負イオンモードでそれぞれ－５，５００Ｖと－１，５００Ｖに設定された。抽出ガス流速は４５Ｌ／ｍｉｎ、キャピラリー温度は３５０℃であった。ＡＤＡＥＳＩ－ＭＳＩスキャンは、顕微鏡スライドの長辺（スキャンのＸ軸）に沿って２００μｍ／ｓの一定速度で設定され、２００μｍの垂直ステップがＹ軸の隣接する線を分離した。スキャンは、顕微鏡スライドの左上隅で開始し、顕微鏡スライドの右下隅で終了した。
【0103】
データ分析
データの前処理、統計分析及び予測モデルの構築は、Ｔｈｅ Ｒ（ｖ３．６．１）を使用して実施された。
データの前処理、統計分析及び予測モデルの構築は、Ｔｈｅ Ｒ（ｖ３．６．１）を使用して実施された。
【0104】
メタボロミクスデータの前処理
Ｐｒｏｇｅｎｅｓｉｓ ＱＩ ソフトウェアを使用して、ピーク抽出とアラインメントを行った。より信頼性の高いピークを取得するために、保持時間を小数点以下１桁にし、ｍ／ｚを小数点以下３桁にして代謝産物を集約した。バックグラウンドシグナルを除外するために、８５％を超える被験体における、存在量が５０００未満の代謝産物又は存在量がゼロに等しい代謝産物は除外された。バッチ間の差を排除するために、Ｒ前処理コアソフトウェアパッケージ（ｖ１．４７．１）をロバストマルチアレイアベレージ（ＲＭＡ）の正規化のために使用し、代謝産物の存在量比を計算した。
Ｐｒｏｇｅｎｅｓｉｓ ＱＩ ソフトウェアを使用して、ピーク抽出とアラインメントを行った。より信頼性の高いピークを取得するために、保持時間を小数点以下１桁にし、ｍ／ｚを小数点以下３桁にして代謝産物を集約した。バックグラウンドシグナルを除外するために、８５％を超える被験体における、存在量が５０００未満の代謝産物又は存在量がゼロに等しい代謝産物は除外された。バッチ間の差を排除するために、Ｒ前処理コアソフトウェアパッケージ（ｖ１．４７．１）をロバストマルチアレイアベレージ（ＲＭＡ）の正規化のために使用し、代謝産物の存在量比を計算した。
【0105】
統計
Ｔｕｋｅｙ正直有意差（ＨＳＤ）検定でＡｎｏｖａを使用して、ｐ値が０．００５未満の代謝産物を有意に変化した代謝産物として選択した。この結果に基づいて、結腸直腸異常被験体と正常被験体の倍率変化が１．２未満で０．８を超える代謝産物が濾過された。バッチ間で１５％を超える差がある代謝産物は削除された。
Ｔｕｋｅｙ正直有意差（ＨＳＤ）検定でＡｎｏｖａを使用して、ｐ値が０．００５未満の代謝産物を有意に変化した代謝産物として選択した。この結果に基づいて、結腸直腸異常被験体と正常被験体の倍率変化が１．２未満で０．８を超える代謝産物が濾過された。バッチ間で１５％を超える差がある代謝産物は削除された。
【0106】
腸内細菌叢－血清メタボローム相関分析
腸内細菌叢種と血清代謝産物の間のピアソンの相関係数を使用したペアワイズ相関係数は、一致コホートの３３人の結腸直腸異常被験体で適用された。種と代謝産物のペアのペアワイズ相関係数及びｐ値が計算され、１Ｅ－３以下のｐ値のカットオフと有意に関連すると見なされた。
腸内細菌叢種と血清代謝産物の間のピアソンの相関係数を使用したペアワイズ相関係数は、一致コホートの３３人の結腸直腸異常被験体で適用された。種と代謝産物のペアのペアワイズ相関係数及びｐ値が計算され、１Ｅ－３以下のｐ値のカットオフと有意に関連すると見なされた。
【実施例1】
【0107】
ＣＲＣ患者と腺腫患者の両方で有意に変化した代謝産物を明らかにした、発見セットからの血清中の半定量的な非標的メタボロミクスプロファイリング
血清メタボロームと結腸直腸腺腫又は結腸直腸癌との関係は、ＬＣＭＳを介して検出セットで非標的メタボロームプロファイルを実行することにより決定された。図１Ａは、実験計画及び分析手順の概要を示す概略図である。図１に示すように、発見セットは、正常群、腺腫群及び結腸直腸癌群に分けられた。存在量の少ないシグナル（例えば、３つの群の平均存在量＜５０００）は、最初に濾過して除去された。非標的メタボロミクスデータの精度及び線形性を更に評価するために、上述のように、容量でＣプールの１０％、２０％、３０％、４０％、５０％及び７５％をＮプールと混合して一連のＱＣサンプルを実行した。正規化された相対的存在量がバックグラウンドブランクカットオフを上回った負イオンモードの１３６６６種の代謝産物及び正イオンモードの１４７５８種代謝産物の精度は、測定された存在量から導出されたそれらの混合比をＣプールとＮプールの間の予想された混合比と比較することにより推定された。図１Ｂは、負イオンモード及び正イオンモードにおける非標的ＬＣ－ＭＳ特徴のＲ２値の分布図を示す分析図である。負イオンモードと正イオンモードのいずれかで検出された各代謝産物の予想された混合比と測定された混合比との間の線形回帰モデルのＲ２値をそれぞれ、図１Ｂに示す。図１Ｂに示すように、５０％を超える代謝産物のＲ２値は、負イオンモードと正イオンモードの両方で０．９を超え、これは、代謝産物の大部分が非常に正確に測定でき、これらの代謝産物の相対的存在量が、プールされた正常群とＣＲＣ癌群の差の１０％～１００％の範囲内で、強い線形性を示すことを示す。
血清メタボロームと結腸直腸腺腫又は結腸直腸癌との関係は、ＬＣＭＳを介して検出セットで非標的メタボロームプロファイルを実行することにより決定された。図１Ａは、実験計画及び分析手順の概要を示す概略図である。図１に示すように、発見セットは、正常群、腺腫群及び結腸直腸癌群に分けられた。存在量の少ないシグナル（例えば、３つの群の平均存在量＜５０００）は、最初に濾過して除去された。非標的メタボロミクスデータの精度及び線形性を更に評価するために、上述のように、容量でＣプールの１０％、２０％、３０％、４０％、５０％及び７５％をＮプールと混合して一連のＱＣサンプルを実行した。正規化された相対的存在量がバックグラウンドブランクカットオフを上回った負イオンモードの１３６６６種の代謝産物及び正イオンモードの１４７５８種代謝産物の精度は、測定された存在量から導出されたそれらの混合比をＣプールとＮプールの間の予想された混合比と比較することにより推定された。図１Ｂは、負イオンモード及び正イオンモードにおける非標的ＬＣ－ＭＳ特徴のＲ２値の分布図を示す分析図である。負イオンモードと正イオンモードのいずれかで検出された各代謝産物の予想された混合比と測定された混合比との間の線形回帰モデルのＲ２値をそれぞれ、図１Ｂに示す。図１Ｂに示すように、５０％を超える代謝産物のＲ２値は、負イオンモードと正イオンモードの両方で０．９を超え、これは、代謝産物の大部分が非常に正確に測定でき、これらの代謝産物の相対的存在量が、プールされた正常群とＣＲＣ癌群の差の１０％～１００％の範囲内で、強い線形性を示すことを示す。
【0108】
図１Ｃは、負イオンモードにおける代謝産物特徴の二乗平均平方根誤差（ＲＭＳＥ）値の分布を示す分析図である。図１Ｄは、正イオンモードにおける代謝産物特徴の二乗平均平方根誤差（ＲＭＳＥ）値の分布を示す分析図である。上記の代謝産物プロファイリングの精度は、その線形回帰モデルの二乗平均平方根誤差（ＲＭＳＥ）によって評価された。全ての代謝産物の特徴のＲＭＳＥ値の分布は、負イオンモードと正イオンモードの両方でＲＭＳＥが０．２未満の代謝産物の５０％以上を示す（図１Ｃ～図１Ｄを参照）。結論として、代謝産物プロファイリングは、かなりの精度で半定量的な方法で正確にかつ繰り返して測定することができる。
【0109】
図１Ｅは、全てのプールされたＣＲＣサンプルにおける非標的ＬＣ－ＭＳ特徴の変動係数（ＣＶ％）の分布図を示す分析図である。プールされたＣＲＣサンプルを品質管理として使用して、全ての代謝産物の特徴について変動係数（ＣＶ％）を決定したことは、これらの特徴の９０％以上のＣＶ％が１５％未満であることを明らかにし（図１Ｅ）、異なる検出バッチ間の安定性を示唆している。
【0110】
代謝産物は、各群間のいずれかのペア間で有意に異なる存在量を示した（ｐ値＜０．００５、倍率変化＞１．２又は＜０．８）。図１Ｆは、全てのサンプルの代謝産物の主成分分析（ＰＣＡ）プロットである。図１Ｆから分かるように、腺腫群の分布と結腸直腸癌群の分布は類似していたが、正常群はこれらの２つの群と明確に区別することができた。図１Ｇは、正常群、腺腫群及び結腸直腸癌群における有意に変化した代謝産物の数の比較図である。図１Ｇから分かるように、Ｎ対Ｃは、Ｎ対Ａとの最大の類似性を示し、これは、腫瘍形成が腺腫段階で既に有意な血清代謝変化を誘発したことを示す。結腸直腸異常関連代謝産物と呼ばれる、Ｃ対Ｎ群とＡ対Ｎ群の両方で有意に変化したこれらの代謝産物は、腺腫と結腸直腸癌患者の両方の早期かつ一貫した検出に有利な腫瘍進行中の初期及び持続的な変化の両方を示したため、更なる分析に使用された。合計で、１４２６種の代謝産物の特徴が含まれた。図１Ｈは、正常被験体と比較して、腺腫及び結腸直腸癌被験体の両方において有意な変化を示した代謝産物に基づいた、正常被験体（Ｎ、青）、腺腫被験体（Ａ、赤）、及び結腸直腸癌被験体（Ｃ、緑）からのサンプルの血清メタボロミクス状態の識別を示すＰＣＡプロットである。同様に、これらの代謝産物に基づいて、正常被験体と結腸直腸異常被験体（Ｃ＆Ａ）との間の明確な区分も実現することができた（図１Ｈを参照）。
【0111】
＜実施例２＞
結腸直腸異常患者で有意に変化する腸内細菌叢関連血清代謝産物の測定
図２Ａは、一致コホートにおける糞便メタボローム及び血清メタボロームの統合分析の手順を示す分析図である。合計で、一致コホートの４４人の被験体（１１人の正常及び３３人の結腸直腸異常）からのデータが品質管理に合格した。メタゲノムデータの分類学的プロファイリングにより、１２４５５種の細菌叢種が明らかになった。図２Ｂは、種レベルでの各個体における１５個のＯＵＴを示す棒グラフである。上位１５個の最も豊富な種の中で、腸管毒素原性バクテロイデスフラジリス（ＥＴＢＦ）の上昇が観察され、ＣＲＣ開始のキーストーン病原体であると提案されている。図２Ｃは、一致コホートの正常及び結腸直腸異常患者におけるいくつかのＣＲＣ関連腸内細菌叢種の相対的存在量を示す分析図である。図２Ｃに示すように、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍ、Ｐａｒｖｉｍｏｎａｓ ｍｉｃｒａ及びＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉを含む他のいくつかのＣＲＣ促進種の存在量は全て、ＣＲＣ患者で有意にアップレギュレートされたが、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍなどのプロバイオティクスはダウンレギュレートされた。これらの結果は先の報告とよく一致し、メタゲノムシーケンスデータの品質を更に裏付けている。
結腸直腸異常患者で有意に変化する腸内細菌叢関連血清代謝産物の測定
図２Ａは、一致コホートにおける糞便メタボローム及び血清メタボロームの統合分析の手順を示す分析図である。合計で、一致コホートの４４人の被験体（１１人の正常及び３３人の結腸直腸異常）からのデータが品質管理に合格した。メタゲノムデータの分類学的プロファイリングにより、１２４５５種の細菌叢種が明らかになった。図２Ｂは、種レベルでの各個体における１５個のＯＵＴを示す棒グラフである。上位１５個の最も豊富な種の中で、腸管毒素原性バクテロイデスフラジリス（ＥＴＢＦ）の上昇が観察され、ＣＲＣ開始のキーストーン病原体であると提案されている。図２Ｃは、一致コホートの正常及び結腸直腸異常患者におけるいくつかのＣＲＣ関連腸内細菌叢種の相対的存在量を示す分析図である。図２Ｃに示すように、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍ、Ｐａｒｖｉｍｏｎａｓ ｍｉｃｒａ及びＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉを含む他のいくつかのＣＲＣ促進種の存在量は全て、ＣＲＣ患者で有意にアップレギュレートされたが、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍなどのプロバイオティクスはダウンレギュレートされた。これらの結果は先の報告とよく一致し、メタゲノムシーケンスデータの品質を更に裏付けている。
【0112】
少なくとも１人の被験体で相対的存在量が０．１％を超える細菌叢種と存在量が５０００を超える代謝産物を使用して、一致コホートの３３人の結腸直腸異常被験体に対してピアソン相関係数分析を行って細菌叢関連血清代謝産物を決定した。図２Ｄは、結腸直腸異常被験体における腸内細菌叢と血清代謝産物との間の相互関係マップである。有意な相関のカットオフは１Ｅ－３のｐ値に設定されたが、この点での誤検出率（ＦＤＲ）は図２Ｄで１８％であった。相関する種と代謝産物のペアの中で、前述の１４２６種の結腸直腸異常関連代謝産物内の３２２種の代謝産物の特徴は、腸内細菌叢との有意な関連性を示した。図２Ｅは、ＣＲＣ関連腸内細菌とそれらの相関血清代謝産物との間の共変動を示すサンキーダイアグラムである。結腸直腸癌で腫瘍を促進すると先に報告された種との関連、抗腫瘍種との関連、及びこれらの代謝産物と他の細菌種との関連を図２Ｅに示した。腸内細菌叢には、ＣＲＣを促進するフソバクテリウム・ヌクレアタム、パルビモナス・ミクラ、アリスティペス・ファインゴールディイ、及びオドリバクター・スプランクニカス、並びにプロバイオティクスのビフィドバクテリウム・ロンガム及びパラバクテロイデス・ジスタソニスなど、ＣＲＣの開始及び進行に関連すると報告された一連の細菌種が含まれた。結腸直腸異常の予測において細菌叢関連代謝産物の潜在的な寄与を評価することにより、ＣＲＣ関連細菌叢種に関連する６３種の代謝産物を使用するだけで、発見コホートにおける正常メタボロームと結腸直腸異常メタボロームとの間の全分散の８７％（サンプル外の平均Ｒ２＝０．８７）を説明できるが、合計１４２６種の結腸直腸異常関連代謝産物が、全分散の９３％（サンプル外の平均Ｒ２＝０．９３）を説明することが観察された。これらの観察結果は、ＣＲＣ関連細菌叢種が血清代謝産物の変化につながる可能性があり、６３種の腸内細菌叢関連血清代謝産物が発見コホートでの結腸直腸異常の検出に大きく貢献したことを強く示唆している。更に、先に特徴づけられたＣＲＣ関連種に加えて、これらの代謝産物は、結腸直腸異常との関連が不明な他の膨大な数の種とも密接な関連性を示した。これらの種のいくつか、例えば、バクテロイデス・フラクサス、Ｄｏｒｅ ａｓｐ．Ｄ２７、及びバクテロイデス属細菌ＫＡ００２５１は、正常被験体と結腸直腸異常被験体の間で有意に変化した存在量も示した。
【0113】
＜実施例３＞
腸内細菌叢関連血清代謝産物に基づいた、パネルによる発見コホートにおける結腸直腸異常の予測
上記の腸内細菌叢関連血清代謝産物に基づいて、ＬＡＳＳＯアルゴリズムを実施して結腸直腸異常のための主要な代謝産物バイオマーカーを探した。１０倍交差検証（ＣＶ）を備えたＬＡＳＳＯアルゴリズムは、先に決定された血清メタボロミクスデータ及び腸内細菌叢メタボロミクスからの特徴選択に使用された。正常サンプルとＣＲＣ又は腺腫サンプルとの間で有意に変化する３２２種の代謝産物の特徴（ａｄｊｐ＜５Ｅ－３）は、腸内細菌叢との有意な相関（ｐ＜１Ｅ－３、ＦＤＲ＜＝１８％）を示した。パネル投票アプローチを使用すると、３２種の代謝産物の特徴が２００回のＬＡＳＳＯ実行の７５％以上に関与する。同定可能な場合、ＭＳ２イオンペアを含むそれらの化学構造の注釈は、前述のようにＭＳ／ＭＳスペクトルマッチングによって確立された。上述したように、３２種の代謝産物の特徴のうち８種の代謝産物の特徴を表１に示す。これらの８種の代謝産物は、発見コホートと同じ群の被験体を使用したＭＲＭベースの標的ＬＣ－ＭＳ検出によって検出でき、一貫した変動を示し、これは、これらの代謝産物が異なるアプローチを使用して安定して測定できることを示す（表６を参照）。８種の推定した代謝産物の化学的特性は、最初に、対応する特徴が非標的ＬＣ－ＭＳによって最初に発見されたものと同じサンプルセットを使用して、標的ＬＣ－ＭＳによって評価された。上述したように、３２種の代謝産物の特徴のうち他の２３種の代謝産物の特徴を表３に示す。これらの代謝産物は腸内細菌叢と関連することも示され、サンプルのＣＲＣ／ＣＲＡ異常との有意な相関関係が実証された。
腸内細菌叢関連血清代謝産物に基づいた、パネルによる発見コホートにおける結腸直腸異常の予測
上記の腸内細菌叢関連血清代謝産物に基づいて、ＬＡＳＳＯアルゴリズムを実施して結腸直腸異常のための主要な代謝産物バイオマーカーを探した。１０倍交差検証（ＣＶ）を備えたＬＡＳＳＯアルゴリズムは、先に決定された血清メタボロミクスデータ及び腸内細菌叢メタボロミクスからの特徴選択に使用された。正常サンプルとＣＲＣ又は腺腫サンプルとの間で有意に変化する３２２種の代謝産物の特徴（ａｄｊｐ＜５Ｅ－３）は、腸内細菌叢との有意な相関（ｐ＜１Ｅ－３、ＦＤＲ＜＝１８％）を示した。パネル投票アプローチを使用すると、３２種の代謝産物の特徴が２００回のＬＡＳＳＯ実行の７５％以上に関与する。同定可能な場合、ＭＳ２イオンペアを含むそれらの化学構造の注釈は、前述のようにＭＳ／ＭＳスペクトルマッチングによって確立された。上述したように、３２種の代謝産物の特徴のうち８種の代謝産物の特徴を表１に示す。これらの８種の代謝産物は、発見コホートと同じ群の被験体を使用したＭＲＭベースの標的ＬＣ－ＭＳ検出によって検出でき、一貫した変動を示し、これは、これらの代謝産物が異なるアプローチを使用して安定して測定できることを示す（表６を参照）。８種の推定した代謝産物の化学的特性は、最初に、対応する特徴が非標的ＬＣ－ＭＳによって最初に発見されたものと同じサンプルセットを使用して、標的ＬＣ－ＭＳによって評価された。上述したように、３２種の代謝産物の特徴のうち他の２３種の代謝産物の特徴を表３に示す。これらの代謝産物は腸内細菌叢と関連することも示され、サンプルのＣＲＣ／ＣＲＡ異常との有意な相関関係が実証された。
【0114】
８種の代謝産物の予測効率は、発見群で評価された。図３Ａは、検証セットに従って表１にリストされた８種の代謝産物の存在量を利用する予測モデルのＲＯＣである。非標的メタボロームによって検出された存在量に基づいて、発見コホートの正常被験体と結腸直腸の不健康な患者を効率的に識別して、（図３Ａに示すように）０．９５のＡＵＣ（９５％ ＣＩ：０．８５－１．００）、９７．８％の感度（９５％ ＣＩ：９０．７％－１００％）、及び９１％の特異度（９５％ ＣＩ：７２．８－１００％）に達することができる。
【0115】
これらの８種の代謝産物の予測効率の安定性は、同じ被験体セットの標的メタボロミクスを使用して決定された。これらの８種の代謝産物は全て、非標的検出と標的検出の両方で一貫したアップレギュレーション又はダウンレギュレーションの傾向を示した。図３Ｂは、標的メタボロームに基づいた８種の代謝産物のＲＯＣを示す分析図である。更に、図３Ｂから分かるように、標的メタボロミクス検出によるこれらの代謝産物も、０．９５のＡＵＣ（９５％ ＣＩ：０．８５－１．００）に達し、感度と特異度がそれぞれ、９５．４％（９５％ ＣＩ：８２．８－１００％）と９４％（９５％ ＣＩ：７８．６－１００％）である。非標的ＬＣ－ＭＳからの同じサンプルセットのＲＯＣのＡＵＣは０．９５であり、標的ＬＣ－ＭＳからのＲＯＣのＡＵＣもこの値に達し、これは、代謝産物が、対応するｒｔ／ｍｚを備えた元の特徴として、正常被験体をＣＲＣ又は腺腫被験体から安定して区別できることを示唆している。
【0116】
図３Ｃは、非標的メタボローム分析を使用した正常及び結腸直腸の不健康な患者のＰＣＡプロットである。図３Ｄは、標的メタボローム分析を使用した正常及び結腸直腸の不健康な患者のＰＣＡプロットを示す。ＰＣＡプロットを使用すると、これらの代謝産物による正常及び結腸直腸の不健康な患者を、非標的メタボロームと標的メタボロームの両方を使用して明確に分離することができる（図３Ｃ及び３Ｄを参照）。図３Ｅは、一致コホートにおける非標的メタボロミクス分析に基づいた正常群及び結腸直腸異常群の識別のためのＣＲＣ ＧＭＳＭパネルのＲＯＣ曲線を示す分析図である。図３Ｆは、メタボローム分析を使用したＣＩＣＡＭ及びＳＤの正常及び結腸直腸の不健康な患者のＰＣＡプロットである。２つのセンター、ＣＩＣＡＭ、及びＳＤからの結腸直腸異常患者は、ＰＣＡプロットで一緒にクラスター化され、両方ともＣＩＣＡＭ由来の正常被験体から明確に分離された。更に、独立した糞便血清一致コホートでは、これらの代謝産物も高い診断効率を示し、ＡＵＣは０．９３（９５％ ＣＩ：０．７６－１．００）、感度と特異度はそれぞれ、９１．９％（９５％ ＣＩ：７７．７－１００％）と９６．３％（９５％ ＣＩ：６０．３－１００％）。したがって、（表１、表２及び表６に示された）８種の腸内細菌叢関連血清代謝産物を含むパネルは、ＣＲＣ ＧＭＳＭパネルとも呼ばれ、結腸直腸の不健康な患者を忠実に予測することができる。更に、独立した糞便血清一致コホートでは、他の多くの代謝産物も高い診断効率を示した。上述したように、これらの代謝産物のうち５１種を表４に示す。
【0117】
＜実施例４＞
コホートにおける腺腫及びＣＲＣ患者の診断値を示すＧＭＳＭパネルに基づいた予測モデル
発見コホートで発見されたこの代謝産物パネルに基づいて、モデリング群を使用して予測モデルを構築し、結腸直腸異常におけるその効率を独立した検証群で調べた。合計で、１０３人の正常と１８１人の不健康な患者を含む、ＣＩＣＡＭから得られた２８４人の被験体をモデリングコホートに採用し、標的ＭＲＭ法を使用して８種のＧＭＳＭ代謝産物の相対的存在量を測定した。図４Ａは、モデリング群におけるＧＭＳＭパネルの識別効率を示すＲＯＣ曲線を示す分析図である。予測モデルは、ロジック回帰法を使用して生成され、モデリング群のテストセットで０．９４のＡＵＣ（９５％ ＣＩ：０．９０～０．９９）に達した（図４Ａを参照）。図４Ｂは、モデリング群における正常被験体及び結腸直腸異常被験体のＣＲＣ及び腺腫バイオマーカーシグネチャスコアを示す分析図である。正常及び結腸直腸の不健康な被験体のバイオマーカースコアをプロットすることにより、腺腫及びＣＲＣ群で有意に高いスコアが見出された（図４Ｂを参照）。図４Ｂに示すように、腺腫及びＣＲＣ群のカットオフ値は０．８２５であり、正常群のカットオフ値は０．３７５であった。モデリング群で最高の精度を達成するために、バイオマーカースコアのカットオフは０．５４１に設定され、感度は９２．３％、特異度は８７．４％になった。
コホートにおける腺腫及びＣＲＣ患者の診断値を示すＧＭＳＭパネルに基づいた予測モデル
発見コホートで発見されたこの代謝産物パネルに基づいて、モデリング群を使用して予測モデルを構築し、結腸直腸異常におけるその効率を独立した検証群で調べた。合計で、１０３人の正常と１８１人の不健康な患者を含む、ＣＩＣＡＭから得られた２８４人の被験体をモデリングコホートに採用し、標的ＭＲＭ法を使用して８種のＧＭＳＭ代謝産物の相対的存在量を測定した。図４Ａは、モデリング群におけるＧＭＳＭパネルの識別効率を示すＲＯＣ曲線を示す分析図である。予測モデルは、ロジック回帰法を使用して生成され、モデリング群のテストセットで０．９４のＡＵＣ（９５％ ＣＩ：０．９０～０．９９）に達した（図４Ａを参照）。図４Ｂは、モデリング群における正常被験体及び結腸直腸異常被験体のＣＲＣ及び腺腫バイオマーカーシグネチャスコアを示す分析図である。正常及び結腸直腸の不健康な被験体のバイオマーカースコアをプロットすることにより、腺腫及びＣＲＣ群で有意に高いスコアが見出された（図４Ｂを参照）。図４Ｂに示すように、腺腫及びＣＲＣ群のカットオフ値は０．８２５であり、正常群のカットオフ値は０．３７５であった。モデリング群で最高の精度を達成するために、バイオマーカースコアのカットオフは０．５４１に設定され、感度は９２．３％、特異度は８７．４％になった。
【0118】
次に、予測モデルの診断性能が、ＣＩＣＡＭとＡＳＣＨの２つの別個のソースから取得された１０７人の結腸直腸の不健康な患者と６３人の正常被験体からなる独立した検証群で評価された（例えば、表７を参照）。図４Ｃは、０．５４１のカットオフスコアの下での検証群における予測モデルの識別効率を示すＲＯＣ曲線を示す。モデリング群から導出されたカットオフ値を直接転送することにより、ＧＭＳＭ予測モデルは、この検証セットで、０．９１のＡＵＣ、８７．９％の感度、及び８１％の特異度に達した（図４Ｃを参照）。図４Ｄは、腺腫患者及び正常被験体の検証群におけるＣＲＣ ＧＭＳＭパネルの識別効率を示すＲＯＣ曲線を示す。このモデルの特定の段階の性能は、腺腫、初期／中期（ステージＩ／ＩＩ）及び後期（ステージＩＩＩ／ＩＶ）ＣＲＣ患者を含む検証群の結腸直腸の不健康な患者の腺腫から後期癌までの結腸直腸異常の進行に従って別々に調べられた。結果は、モデルが、ＡＵＣが０．８１、感度が８０．０％の腺腫患者と正常を区別することを示した。初期／中期（ステージＩ／ＩＩ）患者は、ＡＵＣが０．９１であり、感度が８８．２％であったが、後期（ステージＩＩＩ／ＩＶ）ＣＲＣ患者は、感度が８５％に達し、そのＡＵＣは０．９１であった（図４Ｄ及び表を参照）。これらの結果は、予測モデルが、正常被験体を、前癌段階から後期の外科的に解剖可能な階段までのＣＲＣ患者のうち結腸直腸腺腫及びＣＲＣを有する被験体から区別する上で有望な効率を提示していることを示した。
【0119】
＜実施例５＞
結腸直腸異常の識別における予測モデルと臨床バイオマーカーＣＥＡとの比較
血清ＣＥＡは、癌検出の臨床バイオマーカーとして日常的に使用されており、最近の報告では、ＣＥＡと一連の腫瘍関連遺伝子の変異体の無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）テストを組み合わせて、ＣＲＣを含む外科的に解剖可能な癌を検出できることも示された。ＣＥＡの効率と、ＣＲＣ及び腺腫患者の検出のための腸内細菌叢関連血清代謝産物の予測モデルを比較するために、モデリングと検証セットの両方で血清ＣＥＡスコアを持つ全ての被験体からなるＣＥＡ比較コホートでの性能を評価した。図５Ａは、ＣＥＡ及びＣＲＣ予測モデルの識別効率を示すＲＯＣ曲線を示す。ＣＥＡのみを使用して結腸直腸異常を診断すると、臨床的に使用されたカットオフレベル５Ｕ／ｍｌで、ＡＵＣは０．７７、感度は３２．５％、特異度は１００％になるが、感度を８５％以上に設定すると、カットオフは２．８６Ｕ／ｍｌ、感度は５３．６％、特異度は８５．３％になる。これらの結果は、ＣＥＡマーカーが非常に低い感度を示したことを示し、これは、ＣＲＣ識別におけるこのバイオマーカーの高い偽陰性率に関する先の報告と一致した。一方、カットオフ値０．５４１をこの群に直接転送することにより、予測モデルは、このＣＥＡ比較コホートで、ＣＥＡよりもはるかに高い０．９４のＡＵＣ、８９．５％の感度、及び８５．３％の特異度に達した（図５Ａを参照）。図５Ｂは、正常（緑のスポット）及び結腸直腸異常患者（赤いスポット）を識別する際の予測モデル（赤い破線）及びＣＥＡ（臨床的カットオフ、青い破線；最適化されたカットオフ、緑の破線）効率のグラフ比較のための散布図を示す。図５Ｂに示すように、２０９人の結腸直腸の不健康な患者のうち１８７人は予測モデルを使用して検出できたが、この数は、臨床的カットオフでＣＥＡのみを使用した場合にわずか６８に減少し、ＣＲＣの不健康な患者の大部分が診断されなかった。したがって、予測モデルは、結腸直腸異常の識別において臨床バイオマーカーＣＥＡよりも優れている。
結腸直腸異常の識別における予測モデルと臨床バイオマーカーＣＥＡとの比較
血清ＣＥＡは、癌検出の臨床バイオマーカーとして日常的に使用されており、最近の報告では、ＣＥＡと一連の腫瘍関連遺伝子の変異体の無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）テストを組み合わせて、ＣＲＣを含む外科的に解剖可能な癌を検出できることも示された。ＣＥＡの効率と、ＣＲＣ及び腺腫患者の検出のための腸内細菌叢関連血清代謝産物の予測モデルを比較するために、モデリングと検証セットの両方で血清ＣＥＡスコアを持つ全ての被験体からなるＣＥＡ比較コホートでの性能を評価した。図５Ａは、ＣＥＡ及びＣＲＣ予測モデルの識別効率を示すＲＯＣ曲線を示す。ＣＥＡのみを使用して結腸直腸異常を診断すると、臨床的に使用されたカットオフレベル５Ｕ／ｍｌで、ＡＵＣは０．７７、感度は３２．５％、特異度は１００％になるが、感度を８５％以上に設定すると、カットオフは２．８６Ｕ／ｍｌ、感度は５３．６％、特異度は８５．３％になる。これらの結果は、ＣＥＡマーカーが非常に低い感度を示したことを示し、これは、ＣＲＣ識別におけるこのバイオマーカーの高い偽陰性率に関する先の報告と一致した。一方、カットオフ値０．５４１をこの群に直接転送することにより、予測モデルは、このＣＥＡ比較コホートで、ＣＥＡよりもはるかに高い０．９４のＡＵＣ、８９．５％の感度、及び８５．３％の特異度に達した（図５Ａを参照）。図５Ｂは、正常（緑のスポット）及び結腸直腸異常患者（赤いスポット）を識別する際の予測モデル（赤い破線）及びＣＥＡ（臨床的カットオフ、青い破線；最適化されたカットオフ、緑の破線）効率のグラフ比較のための散布図を示す。図５Ｂに示すように、２０９人の結腸直腸の不健康な患者のうち１８７人は予測モデルを使用して検出できたが、この数は、臨床的カットオフでＣＥＡのみを使用した場合にわずか６８に減少し、ＣＲＣの不健康な患者の大部分が診断されなかった。したがって、予測モデルは、結腸直腸異常の識別において臨床バイオマーカーＣＥＡよりも優れている。
【0120】
＜実施例６＞
予測モデルは、正常被験体と異なる段階のＣＲＣを有する被験体を区別することができる。
図６Ａ～図６Ｄは、検証群におけるＣＲＣ ＧＭＳＭパネルの識別効率を示すＲＯＣ曲線である。この予測モデルの特定の段階の性能は、検証群の結腸直腸の不健康な患者の初期から後期までの結腸直腸異常の進行に従って別々に調べられた。図６Ａは、予測モデルが正常被験体とＣＲＣ患者を区別し、ＡＵＣが０．８９、感度が８９．７％であることを示した。図６Ｂは、予測モデルが、ＡＵＣが０．８５、感度が８２．１％、特異度が８１％の初期ＣＲＣ患者と正常被験体を区別したことを示した。図６Ｃは、予測モデルが、ＡＵＣが０．８９、感度が８８．９％、特異度が８１％の中期ＣＲＣ患者と正常被験体を区別したことを示した。図６Ｄは、予測モデルが、ＡＵＣが０．９１、感度が８５％、特異度が８１％の後期ＣＲＣ患者と正常被験体を区別したことを示した。これらの結果は、予測モデルが、正常被験体及び腺腫患者をＣＲＣ患者と区別し、更に、初期、中期、後期などの異なる段階のＣＲＣ患者と正常被験体とを区別する上で有望な効率を提示していることを示した。
予測モデルは、正常被験体と異なる段階のＣＲＣを有する被験体を区別することができる。
図６Ａ～図６Ｄは、検証群におけるＣＲＣ ＧＭＳＭパネルの識別効率を示すＲＯＣ曲線である。この予測モデルの特定の段階の性能は、検証群の結腸直腸の不健康な患者の初期から後期までの結腸直腸異常の進行に従って別々に調べられた。図６Ａは、予測モデルが正常被験体とＣＲＣ患者を区別し、ＡＵＣが０．８９、感度が８９．７％であることを示した。図６Ｂは、予測モデルが、ＡＵＣが０．８５、感度が８２．１％、特異度が８１％の初期ＣＲＣ患者と正常被験体を区別したことを示した。図６Ｃは、予測モデルが、ＡＵＣが０．８９、感度が８８．９％、特異度が８１％の中期ＣＲＣ患者と正常被験体を区別したことを示した。図６Ｄは、予測モデルが、ＡＵＣが０．９１、感度が８５％、特異度が８１％の後期ＣＲＣ患者と正常被験体を区別したことを示した。これらの結果は、予測モデルが、正常被験体及び腺腫患者をＣＲＣ患者と区別し、更に、初期、中期、後期などの異なる段階のＣＲＣ患者と正常被験体とを区別する上で有望な効率を提示していることを示した。
【0121】
この実施例は、予測モデルを使用して、被験体のステージＩ／ＩＩ／ＩＩＩ／ＩＶ ＣＲＣを区別できることを示す。
【0122】
＜実施例７＞
予測モデルは、表２にリストされた少なくとも２種の代謝産物の存在量を使用して、ＣＲＣ／ＣＲＡを有する被験体と正常被験体とを区別することができる。
いくつかの実施形態では、定量化して、ＣＲＣ／ＣＲＡを検出し、及び／又はＣＲＣ／ＣＲＡの治療を容易にするために使用できる診断用バイオマーカーの群は、表２にリストされた２種以上の代謝産物を含み得る。単なる例として、定量化してこれらの目的のために使用できる診断用バイオマーカーの例示的な群を表８に示す。診断用バイオマーカーのこれらの群を利用する予測モデルの対応する性能も評価される。表８に示すように、予測モデルのＡＵＣ、特異度、及び感度は比較的高く、これは、これらの代謝産物の存在量を利用した予測モデルがＣＲＣ／ＣＲＡを有する被験体を正常被験体と効果的に区別できることを示している。
予測モデルは、表２にリストされた少なくとも２種の代謝産物の存在量を使用して、ＣＲＣ／ＣＲＡを有する被験体と正常被験体とを区別することができる。
いくつかの実施形態では、定量化して、ＣＲＣ／ＣＲＡを検出し、及び／又はＣＲＣ／ＣＲＡの治療を容易にするために使用できる診断用バイオマーカーの群は、表２にリストされた２種以上の代謝産物を含み得る。単なる例として、定量化してこれらの目的のために使用できる診断用バイオマーカーの例示的な群を表８に示す。診断用バイオマーカーのこれらの群を利用する予測モデルの対応する性能も評価される。表８に示すように、予測モデルのＡＵＣ、特異度、及び感度は比較的高く、これは、これらの代謝産物の存在量を利用した予測モデルがＣＲＣ／ＣＲＡを有する被験体を正常被験体と効果的に区別できることを示している。
【0123】
＜実施例８＞
予測モデルは、表３にリストされた少なくとも２種の代謝産物の存在量を使用して、ＣＲＣ／ＣＲＡを有する被験体と正常被験体を区別することができる。
いくつかの実施形態では、定量化して、ＣＲＣ／ＣＲＡを検出し、及び／又はＣＲＣ／ＣＲＡの治療を容易にするために使用できる診断用バイオマーカーの群は、表２にリストされた３種以上の代謝産物を含み得る。単なる例として、定量化してこれらの目的のために使用できる診断用バイオマーカーの例示的な群を表９に示す。診断用バイオマーカーのこれらの群を利用する予測モデルの対応する性能も評価される。表９に示すように、予測モデルのＡＵＣ、特異度、及び感度は比較的高く、これは、これらの代謝産物の存在量を利用した予測モデルがＣＲＣ／ＣＲＡを有する被験体を正常被験体と効果的に区別できることを示している。
予測モデルは、表３にリストされた少なくとも２種の代謝産物の存在量を使用して、ＣＲＣ／ＣＲＡを有する被験体と正常被験体を区別することができる。
いくつかの実施形態では、定量化して、ＣＲＣ／ＣＲＡを検出し、及び／又はＣＲＣ／ＣＲＡの治療を容易にするために使用できる診断用バイオマーカーの群は、表２にリストされた３種以上の代謝産物を含み得る。単なる例として、定量化してこれらの目的のために使用できる診断用バイオマーカーの例示的な群を表９に示す。診断用バイオマーカーのこれらの群を利用する予測モデルの対応する性能も評価される。表９に示すように、予測モデルのＡＵＣ、特異度、及び感度は比較的高く、これは、これらの代謝産物の存在量を利用した予測モデルがＣＲＣ／ＣＲＡを有する被験体を正常被験体と効果的に区別できることを示している。
【0124】
このように、基本的な概念を説明したが、当業者であれば、本明細書の詳細な開示を読んだ後、前述の詳細な開示が単なる例として提示されることを意図しており、限定的なものではないことが明らかであろう。本明細書には明示的に記載されていないが、様々な変更、改良及び変形が想到され、これらは意図当業者を対象としている。これらの変更、改良及び変形は、本開示に示唆されることを意図し、本開示の例示的な実施形態の精神及び範囲内にある。
【0125】
また、本開示の実施形態を説明するために所定の用語が使用されている。例えば、「一実施形態」、「実施形態」及び「いくつかの実施形態」という用語は、実施形態に関連して説明する特定の特徴、構造、又は特性が、本開示の少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。したがって、本明細書の様々な部分における「実施形態」、「一実施形態」、又は「代替実施形態」に対する２つ以上の参照は、必ずしも全てが同じ実施形態を参照するわけではないことが強調され、理解されるべきである。更に、特定の特徴、構造及び特性は、本開示の１つ以上の実施形態において適宜組み合わせてもよい。
【0126】
また、当業者によって理解されるように、本開示の態様は、任意の新規で有用なプロセス、機械、製造工程、若しくは物質の組成、又は任意の新規で有用なその改善を含む、いくつかの特許性のある種類又は状況のうちの任意のものにおいて、本明細書において図示及び説明することができる。したがって、本開示の態様は、全体的にハードウェア又はソフトウェア（ファームウェア、常駐ソフトウェア、マイクロコードなどを含む）によって実装されてもよく、又はソフトウェアとハードウェアの組み合わせによって実装されてもよく、これらは全て、本明細書では一般に「ブロック」、「モジュール」、「エンジン」、「ユニット」、「コンポーネント」又は「システム」と呼ぶことができる。更に、本開示の態様は、そこに具体化されたコンピュータ可読プログラムコードを有する、１つ以上のコンピュータ可読媒体内に具体化されたコンピュータプログラム製品の形態をとることもできる。
【0127】
更に、処理要素もしくはシーケンスの記述された順序、又は数字、文字、もしくは他の指定の使用は、特許請求の範囲に指定されている場合を除き、特許請求されたプロセス及び方法をいずれの順序に限定することを意図するものではない。上記開示は、本開示の様々な有用な実施形態であると現在のところ考えられる様々な具体例によって議論されているが、そのような詳細事項は説明のためのものに過ぎず、添付の特許請求の範囲は開示される実施形態に限定されず、むしろ、開示される実施形態の精神及び範囲内の変形及び均等な配置を包含するように意図されることが理解されるべきである。例えば、上述した各構成要素の実装は、ハードウェアデバイスに具現化されてもよいが、ソフトウェア－唯一の解決法－例えば、既存のサーバ又はモバイルデバイスへのインストールとして実装されてもよい。
【0128】
同様に、本開示の実施形態の前述の説明において、様々な特徴は、様々な実施形態のうちの１つ以上の理解を助ける開示を簡略化するために、単一の実施形態、図面、又はその説明にまとめられている場合があることが理解されるべきである。しかしながら、本開示の方法は、特許請求された主題が、各請求項に明示的に記載されたものよりも多くの特徴を必要とするという意図を反映しているものとして解されるべきでない。むしろ、特許請求された主題は、先に開示された単一の実施形態の全ての特徴よりも少ない特徴を含む場合がある。
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図1D】
【図1E】
【図1F】
【図1G】
【図1H】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図2D】
【図2E】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図3D】
【図3E】
【図3F】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図4D】
【図5A】
【図5B】
【図6A】
【図6B】
【図6C】
【図6D】
