特許7488914単球特異的アプタマー、及びがんへの薬物送達を増強するためのそれらの使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-05-14
(45)【発行日】2024-05-22
(54)【発明の名称】単球特異的アプタマー、及びがんへの薬物送達を増強するためのそれらの使用
(51)【国際特許分類】
C12N 15/115 20100101AFI20240515BHJP
A61K 31/711 20060101ALI20240515BHJP
A61K 47/24 20060101ALI20240515BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240515BHJP
A61P 35/04 20060101ALI20240515BHJP
【ＦＩ】
C12N15/115 Z ZNA
A61K31/711
A61K47/24
A61P35/00
A61P35/04
【請求項の数】
16
(21)【出願番号】P 2022572649
(86)(22)【出願日】2021-05-26
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2023-06-28
(86)【国際出願番号】 US2021034369
(87)【国際公開番号】W WO2021242933
(87)【国際公開日】2021-12-02
【審査請求日】2023-01-20
(31)【優先権主張番号】63/030,674
(32)【優先日】2020-05-27
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(73)【特許権者】
【識別番号】505008028
【氏名又は名称】中央研究院
【氏名又は名称原語表記】ＡＣＡＤＥＭＩＡ ＳＩＮＩＣＡ
【住所又は居所原語表記】１２８ Ａｃａｄｅｍｉａ Ｒｏａｄ，Ｓｅｃｔｉｏｎ ２，Ｎａｎｋａｎｇ Ｔａｉｐｅｉ，Ｔａｉｗａｎ
(74)【代理人】
【識別番号】100094569
【弁理士】
【氏名又は名称】田中 伸一郎
(74)【代理人】
【識別番号】100103610
【弁理士】
【氏名又は名称】▲吉▼田 和彦
(74)【代理人】
【識別番号】100109070
【弁理士】
【氏名又は名称】須田 洋之
(74)【代理人】
【識別番号】100119013
【弁理士】
【氏名又は名称】山崎 一夫
(74)【代理人】
【識別番号】100123777
【弁理士】
【氏名又は名称】市川 さつき
(74)【代理人】
【識別番号】100111796
【弁理士】
【氏名又は名称】服部 博信
(74)【代理人】
【識別番号】100123766
【弁理士】
【氏名又は名称】松田 七重
(74)【代理人】
【識別番号】100137626
【弁理士】
【氏名又は名称】田代 玄
(72)【発明者】
【氏名】シェ パトリック シーエイチ
(72)【発明者】
【氏名】リー ケン－ジュン
(72)【発明者】
【氏名】チェン フン－チー
【審査官】三谷 直也
(56)【参考文献】
【文献】米国特許出願公開第２０１２／０２７６１９３（ＵＳ，Ａ１）
【文献】特表２０１４－５２８４１１（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１４－５０００２４（ＪＰ，Ａ）
【文献】Zhaoyi LI et al.，Molecules，2019年01月29日，Vol. 24, No. 3，pp. 478 (1-14)
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ
ＰｕｂＭｅｄ
Ｇｏｏｇｌｅ／Ｇｏｏｇｌｅ Ｓｃｈｏｌａｒ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
５’－ＧＧＡ ＴＧＧ ＧＡＧ ＧＧＡ ＧＧＧ ＧＧＣ ＴＣＧ ＴＧＧ ＣＧＧ ＣＴＡ ＧＧＧ ＧＧＴ ＡＴＡ Ａ－３’（配列番号１）のコアヌクレオチド配列を含む単球標的化核酸アプタマー。
【請求項2】
コアヌクレオチド配列に隣接している５’プライマー部位及び３’プライマー部位を含む、請求項１に記載の単球標的化核酸アプタマー。
【請求項3】
前記５’プライマー部位が５’－ＡＣ ＧＣＴ ＣＧＧ ＡＴＧ ＣＣＡ ＣＴＡ ＣＡＧ－３’のヌクレオチド配列を含み、且つ／又は前記３’プライマー部位が５’－ＣＴ ＣＡＴ ＧＧＡ ＣＧＴ ＧＣＴ ＧＧＴ ＧＡＣ－３’のヌクレオチド配列を含む、請求項２に記載の単球標的化核酸アプタマー。
【請求項4】
５’－ＡＣ ＧＣＴ ＣＧＧ ＡＴＧ ＣＣＡ ＣＴＡ ＣＡＧ ＧＧＡ ＴＧＧ ＧＡＧ ＧＧＡ ＧＧＧ ＧＧＣ ＴＣＧ ＴＧＧ ＣＧＧ ＣＴＡ ＧＧＧ ＧＧＴ ＡＴＡ ＡＣＴ ＣＡＴ ＧＧＡ ＣＧＴ ＧＣＴ ＧＧＴ ＧＡＣ－３’のヌクレオチド配列を含む、請求項３に記載の単球標的化核酸アプタマー。
【請求項5】
アンカー核酸断片に結合されている、請求項１～４のいずれか１項に記載の単球標的化核酸アプタマー。
【請求項6】
前記アンカー核酸断片が、前記アプタマーの５’末端に位置していてもよい５’－ＣＡＡ ＴＡＧ ＡＧＴ ＣＧＴ ＡＣＡ ＧＧＴ ＣＧ－３’のヌクレオチド配列を含む、請求項５に記載の単球標的化核酸アプタマー。
【請求項7】
請求項１～６のいずれか１項に記載の単球標的化核酸アプタマーが上に付着した脂質ナノ粒子を含む単球標的化脂質ナノ粒子。
【請求項8】
前記脂質ナノ粒子が、脂質に付着したドッキング核酸断片を含む結合体を含み、前記ドッキング核酸断片が、単球特異的核酸アプタマー又はその一部分に結合されたアンカー核酸断片に相補的であるヌクレオチド配列を含み、前記アンカー核酸断片が、前記ドッキング核酸断片と塩基対を形成することによって前記単球特異的核酸アプタマーを前記脂質ナノ粒子上に固定する、請求項７に記載の単球標的化脂質ナノ粒子。
【請求項9】
前記ドッキング核酸断片がポリエチレングリコール（ＰＥＧ）リンカーを介して前記脂質に付着されている、請求項８に記載の単球標的化脂質ナノ粒子。
【請求項10】
前記脂質が１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホリルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）である、請求項８又は９に記載の単球標的化脂質ナノ粒子。
【請求項11】
治療薬又は診断薬をさらに含む、請求項７～１０のいずれか１項に記載の単球標的化脂質ナノ粒子。
【請求項12】
前記治療薬又は診断薬ががん治療又はがん診断用である、請求項１１に記載の単球標的化脂質ナノ粒子。
【請求項13】
請求項７～１２のいずれか１項に記載の単球標的化脂質ナノ粒子及び医薬として許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項14】
抗がん薬を対象の腫瘍部位に送達するための、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項15】
前記対象が、がんを有する、又はがんのリスクがあるヒト患者である、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項16】
前記がんが、膵臓がん、又は転移性黒色腫であってもよい黒色腫である、請求項１５に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願への相互参照
本発明は、２０２０年５月２７日に出願された「単球特異的アプタマー、及びがんへの薬物送達を増強するためのそれらの使用（MONOCYTE-SPECIFIC APTAMERS AND USES THEREOF FOR ENHANCING DRUG DELIVERY TO CANCER）」というタイトルの米国仮特許出願第６３／０３０６７４号の優先権を主張するものである。
本発明は、２０２０年５月２７日に出願された「単球特異的アプタマー、及びがんへの薬物送達を増強するためのそれらの使用（MONOCYTE-SPECIFIC APTAMERS AND USES THEREOF FOR ENHANCING DRUG DELIVERY TO CANCER）」というタイトルの米国仮特許出願第６３／０３０６７４号の優先権を主張するものである。
【背景技術】
【0002】
療法の送達のための循環系への依存は、手術などのより侵襲的な方法と比較して、患者にとって苦痛が最小限の方法であるため、長い間、多くの疾患治療のための最適な方法であった。しかし、低い血管密度又は血管透過性を伴う疾患は、薬物送達可能性を低減させ得るため、それは、多くの場合に実用的でない。単球などの免疫細胞の動員が、生理的環境の変化に対する自然の反応として生じる。本明細書に開示される薬物送達プラットフォームは、免疫細胞が疾患部位に浸透できることを利用することによって、専ら循環系に依存することなく、動員された単球とともに疾患傷害の部位内への薬物送達を標的とするためのビヒクルとして作用することが可能である。
一部のがん、特に膵管腺癌（ＰＤＡＣ）における血管過小では、薬物送達が専ら循環系を介することになって非効率的となるため、意図する場所への薬物のより良好な送達を達成するために補助が必要になる。Provenzano et al., Cancer Cell 21, 418-429 (2012)。単球などの免疫細胞の動員が、生理的環境の変化に対する自然の反応として生じる。腫瘍微小環境において、単球は、腫瘍細胞と戦うための反応として絶えず動員される。Nahrendorf et al. J. Exp. Med. 204, 3037-3047 (2007)、及びSwirski et al., Science 325, 612-616 (2009)。転移の形成の前に、単球は、肝臓に動員されて、侵入する腫瘍細胞の成長及び増殖を支えて、結果として転移をもたらす。Condeelis et al., Cell 124, 263-266 (2006)及びGil-Bernabe et al., Blood 119, 3164-3175 (2012)。動員された単球とともに腫瘍部位への薬物送達を標的として腫瘍及びそれらの転移を治療するためのビヒクルとして作用することができる、血流中の循環単球の表面上に選択的に付着することが可能な薬物送達プラットフォームを本明細書に開示する。
一部のがん、特に膵管腺癌（ＰＤＡＣ）における血管過小では、薬物送達が専ら循環系を介することになって非効率的となるため、意図する場所への薬物のより良好な送達を達成するために補助が必要になる。Provenzano et al., Cancer Cell 21, 418-429 (2012)。単球などの免疫細胞の動員が、生理的環境の変化に対する自然の反応として生じる。腫瘍微小環境において、単球は、腫瘍細胞と戦うための反応として絶えず動員される。Nahrendorf et al. J. Exp. Med. 204, 3037-3047 (2007)、及びSwirski et al., Science 325, 612-616 (2009)。転移の形成の前に、単球は、肝臓に動員されて、侵入する腫瘍細胞の成長及び増殖を支えて、結果として転移をもたらす。Condeelis et al., Cell 124, 263-266 (2006)及びGil-Bernabe et al., Blood 119, 3164-3175 (2012)。動員された単球とともに腫瘍部位への薬物送達を標的として腫瘍及びそれらの転移を治療するためのビヒクルとして作用することができる、血流中の循環単球の表面上に選択的に付着することが可能な薬物送達プラットフォームを本明細書に開示する。
【発明の概要】
【0003】
本開示は、少なくとも一部に、単球に対する高結合親和性及び特異性を有する核酸アプタマーの識別、並びにアプタマーベースの脂質ナノ粒子薬物送達システムの開発に基づく。この薬物送達システムは、がんの治療又はがんの検出のために、治療薬又は診断薬を固形腫瘍に送達するのに問題なく使用された。
したがって、本開示の一態様は、５’－ＧＧＡ ＴＧＧ ＧＡＧ ＧＧＡ ＧＧＧ ＧＧＣ ＴＣＧ ＴＧＧ ＣＧＧ ＣＴＡ ＧＧＧ ＧＧＴ ＡＴＡ Ａ－３’（配列番号１）と少なくとも８５％（例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又はそれより高い）同一性を有するコアヌクレオチド配列を含む単球標的化核酸アプタマーを提供する。一部の場合において、単球標的化核酸アプタマーは、配列番号１のコアヌクレオチド配列を含む。
本明細書に開示される単球標的化核酸アプタマーはいずれも、コアヌクレオチド配列に隣接している５’プライマー部位及び３’プライマー部位をさらに含んでいてもよい。一部の例において、５’プライマー部位は、５’－ＡＣ ＧＣＴ ＣＧＧ ＡＴＧ ＣＣＡ ＣＴＡ ＣＡＧ－３’のヌクレオチド配列を含み、且つ／又は３’プライマー部位は、５’－ＣＴ ＣＡＴ ＧＧＡ ＣＧＴ ＧＣＴ ＧＧＴ ＧＡＣ－３’のヌクレオチド配列を含む。例えば、単球標的化核酸アプタマーは、５’－ＡＣ ＧＣＴ ＣＧＧ ＡＴＧ ＣＣＡ ＣＴＡ ＣＡＧ ＧＧＡ ＴＧＧ ＧＡＧ ＧＧＡ ＧＧＧ ＧＧＣ ＴＣＧ ＴＧＧ ＣＧＧ ＣＴＡ ＧＧＧ ＧＧＴ ＡＴＡ ＡＣＴ ＣＡＴ ＧＧＡ ＣＧＴ ＧＣＴ ＧＧＴ ＧＡＣ－３’のヌクレオチド配列を含んでいてもよい。
したがって、本開示の一態様は、５’－ＧＧＡ ＴＧＧ ＧＡＧ ＧＧＡ ＧＧＧ ＧＧＣ ＴＣＧ ＴＧＧ ＣＧＧ ＣＴＡ ＧＧＧ ＧＧＴ ＡＴＡ Ａ－３’（配列番号１）と少なくとも８５％（例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又はそれより高い）同一性を有するコアヌクレオチド配列を含む単球標的化核酸アプタマーを提供する。一部の場合において、単球標的化核酸アプタマーは、配列番号１のコアヌクレオチド配列を含む。
本明細書に開示される単球標的化核酸アプタマーはいずれも、コアヌクレオチド配列に隣接している５’プライマー部位及び３’プライマー部位をさらに含んでいてもよい。一部の例において、５’プライマー部位は、５’－ＡＣ ＧＣＴ ＣＧＧ ＡＴＧ ＣＣＡ ＣＴＡ ＣＡＧ－３’のヌクレオチド配列を含み、且つ／又は３’プライマー部位は、５’－ＣＴ ＣＡＴ ＧＧＡ ＣＧＴ ＧＣＴ ＧＧＴ ＧＡＣ－３’のヌクレオチド配列を含む。例えば、単球標的化核酸アプタマーは、５’－ＡＣ ＧＣＴ ＣＧＧ ＡＴＧ ＣＣＡ ＣＴＡ ＣＡＧ ＧＧＡ ＴＧＧ ＧＡＧ ＧＧＡ ＧＧＧ ＧＧＣ ＴＣＧ ＴＧＧ ＣＧＧ ＣＴＡ ＧＧＧ ＧＧＴ ＡＴＡ ＡＣＴ ＣＡＴ ＧＧＡ ＣＧＴ ＧＣＴ ＧＧＴ ＧＡＣ－３’のヌクレオチド配列を含んでいてもよい。
【0004】
一部の実施形態において、本明細書に開示される単球標的化核酸アプタマーを、アンカー核酸断片又はその一部分と相補的なドッキング核酸断片を含む支持部材に核酸断片を付着させるのに使用するためのアンカー核酸断片に結合できる。一部の例において、アンカー核酸断片は、アプタマーの５’末端に位置していてもよい５’－ＣＡＡ ＴＡＧ ＡＧＴ ＣＧＴ ＡＣＡ ＧＧＴ ＣＧ－３’のヌクレオチド配列を含んでいてもよい。
別の態様において、本明細書に記載の単球特異的核酸アプタマーが上に付着した脂質ナノ粒子を含む単球標的化脂質ナノ粒子を本明細書で提供する。一部の実施形態において、脂質ナノ粒子は、脂質に付着したドッキング核酸断片を含む結合体を含んでいてもよい。ドッキング核酸断片は、単球特異的核酸アプタマー又はその一部分に結合されたアンカー核酸断片に相補的であるヌクレオチド配列を含む。そのように、アンカー核酸断片は、ドッキング核酸断片と塩基対を形成することによって、単球特異的核酸アプタマーを脂質ナノ粒子上に固定する。
一部の実施形態において、ドッキング核酸断片を脂質に直接付着させることができる。或いは、ドッキング核酸断片は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）リンカーを介して脂質に付着されていてもよい。具体的な例において、脂質は、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホリルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）であり得る。
本明細書に開示される単球標的化脂質ナノ粒子はいずれも、治療薬又は診断薬をさらに含んでいてもよい。一部の実施形態において、本明細書に開示される単球標的化脂質ナノ粒子は、抗がん薬、例えば、がんを治療するための治療薬をさらに含んでいてもよい。或いは、抗がん薬は、がんを検出するための診断薬であってもよい。
別の態様において、本明細書に記載の単球特異的核酸アプタマーが上に付着した脂質ナノ粒子を含む単球標的化脂質ナノ粒子を本明細書で提供する。一部の実施形態において、脂質ナノ粒子は、脂質に付着したドッキング核酸断片を含む結合体を含んでいてもよい。ドッキング核酸断片は、単球特異的核酸アプタマー又はその一部分に結合されたアンカー核酸断片に相補的であるヌクレオチド配列を含む。そのように、アンカー核酸断片は、ドッキング核酸断片と塩基対を形成することによって、単球特異的核酸アプタマーを脂質ナノ粒子上に固定する。
一部の実施形態において、ドッキング核酸断片を脂質に直接付着させることができる。或いは、ドッキング核酸断片は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）リンカーを介して脂質に付着されていてもよい。具体的な例において、脂質は、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホリルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）であり得る。
本明細書に開示される単球標的化脂質ナノ粒子はいずれも、治療薬又は診断薬をさらに含んでいてもよい。一部の実施形態において、本明細書に開示される単球標的化脂質ナノ粒子は、抗がん薬、例えば、がんを治療するための治療薬をさらに含んでいてもよい。或いは、抗がん薬は、がんを検出するための診断薬であってもよい。
【0005】
他の態様において、本明細書に開示される単球標的化脂質ナノ粒子のいずれか、及び医薬として許容される担体を含む医薬組成物、並びに抗がん薬を腫瘍部位に送達するための方法であって、それを必要とする対象に、本明細書に開示される医薬組成物の有効量を投与することを含む方法を本明細書で提供する。一部の実施形態において、対象は、がん、例えば膵臓がん若しくは黒色腫（例えば転移性黒色腫）を有する、又はそのリスクがあるヒト患者であり得る。
治療薬又は診断薬を腫瘍部位に送達するのに使用するための、本明細書に開示される単球特異的脂質ナノ粒子のいずれかを含む医薬組成物、及び本明細書に開示されるように意図する医療目的に使用できる医薬品を製造するための当該単球特異的脂質ナノ粒子の使用も本開示の範囲内である。
以下の説明では、本発明の１つ以上の実施形態の詳細を記載する。本発明の他の特徴又は利点は、下記の図面及びいくつかの実施形態の詳細な説明からも添付の特許請求の範囲からも明らかになる。
下記の図面は、本明細書の一部をなすものであり、本明細書に提示される具体的な実施形態の詳細な説明と併せて図面を参照することによってより良く理解できる本開示の特定の態様をさらに実証するために含められる。
治療薬又は診断薬を腫瘍部位に送達するのに使用するための、本明細書に開示される単球特異的脂質ナノ粒子のいずれかを含む医薬組成物、及び本明細書に開示されるように意図する医療目的に使用できる医薬品を製造するための当該単球特異的脂質ナノ粒子の使用も本開示の範囲内である。
以下の説明では、本発明の１つ以上の実施形態の詳細を記載する。本発明の他の特徴又は利点は、下記の図面及びいくつかの実施形態の詳細な説明からも添付の特許請求の範囲からも明らかになる。
下記の図面は、本明細書の一部をなすものであり、本明細書に提示される具体的な実施形態の詳細な説明と併せて図面を参照することによってより良く理解できる本開示の特定の態様をさらに実証するために含められる。
【図面の簡単な説明】
【0006】
【図1A-E】単球に対する高結合親和性を有するアプタマーの指数関数的濃縮（ＳＥＬＥＸ）選択によるリガンドの細胞ベースの系統的進化を示す図を含む。図１Ａ及び１Ｂは、それぞれＲＡＷ２６４．７（マウス単球細胞株）及びＪ７７４Ａ．１（マウス単球細胞株）に対する単球特異的アプタマーの結合を示す図である。核酸アプタマーを、約２０回の選択サイクル後にＳＥＬＥＸ手法を使用して識別し、ＰＣＲで増幅させた。上図は、アプタマーに対する単球と内皮細胞との結合能力の比較を示す写真である。下図は、数回の選択後の（蛍光染料に結合された）アプタマーの単球細胞に対する結合能力の漸進的増加を示す図である。図１Ｃは、ＲＡＷ２６４．７に対するアプタマー（ＡｐｔＲ）の結合親和性を示す図である。図１Ｄは、Ｊ７７４Ａ．１に対するアプタマー（ＡｐｔＪ）の結合親和性を示す図である。図１Ｅは、定量的ＰＣＲを使用するインビトロの単球特異的アプタマーの選択を示す図である。マウス単球細胞株ＲＡＷ２６４．７及びＪ７７４Ａ．１に対する各アプタマー候補の特異性を試験した。
【図2A-D】単球に対するＪ１０アプタマーの特異性を示す図を含む。図２Ａは、フローサイトメトリによって測定された単球細胞株ＲＡＷ２６４．７及びＪ７７４Ａ．１並びにマウス内皮細胞株ＳＶＥＣにおけるＣｙ５標識Ｊ１０アプタマー及びＣｙ５標識Ｓ２アプタマーの量を示すグラフである。マウス内皮細胞株ＳＶＥＣを陰性選択として使用した。Ｓ２アプタマーは、Ｊ１０アプタマーと同様のヌクレオチド組成を有していたが、配列がランダムであった。テューキー調整を伴う二元配置分散分析を使用してデータを分析した（*Ｐ＜０．０５、**Ｐ＜０．０１、***Ｐ＜０．００１を有意とした）。図２Ｂの上図は、ＰＣＲによって測定された損傷心臓の梗塞領域におけるＪ１０及びＳ２アプタマーの蓄積量を示す画像を示す。下図は、ＰＣＲ結果の定量を示す。対応のないスチューデントｔ－検定を使用してデータを分析した（*Ｐ＜０．０５、**Ｐ＜０．０１、***Ｐ＜０．００１を有意とした）。図２Ｃは、生体イメージングによる、循環ＣＸ３ＣＲ１－ＧＦＰ+単球に対するＳ２アプタマーＱＤ６５５（上図）及びＪ１０アプタマーＱＤ６５５（下図）のインビボ標的化を示す画像である。アプタマーを量子ドットＱＤ６５５と結合させた。示されるスケールバーは、１００μｍを表す。図２Ｄは、末梢血液から単離されたＣＤ４５+及びＣＤ１１ｂ+細胞と結合したＣｙ５－Ｊ１０の量を分析するためにフローサイトメトリで調べた循環単球に対するＪ１０アプタマーのエキソビボ標的化を示すグラフを示す。対応のないスチューデントｔ－検定を使用してデータを分析した（*Ｐ＜０．０５、**Ｐ＜０．０１、***Ｐ＜０．００１、****Ｐ＜０．０００１を有意とした）。
【図3】フローサイトメトリによって測定された、ヒト単球細胞株ＴＨＰ－１及びＵ９３７に対するＪ１０アプタマーの親和性を示すグラフを示す。アプタマーをＣｙ５染料で標識した。Ｓ２アプタマーは、Ｊ１０アプタマーと同様のヌクレオチド組成を有していたが、ランダム配列であった。Ｓ２アプタマーを対照として使用した。ヒト臍帯内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を陰性対照として使用した。テューキー調整を伴う二元配置分散分析を使用してデータを分析した。***Ｐ＞０．００１。
【図4A-C】脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）の質量スペクトルの画像を示す。図４Ａは、アプタマー結合のためのリンカーの質量スペクトルを示す。図４Ｂは、Ｍａｌ－ＰＥＧ２０００－ＤＳＰＥ脂質の質量スペクトルを示す。図４Ｃは、リンカー－ＰＥＧ２０００－ＤＳＰＥ脂質の質量スペクトルを示す。
【図5A-E】循環単球を介して腫瘍を標的とするＪ１０アプタマー－ゲムシタビン－脂質ナノ粒子を示す図を含む。図５Ａは、低温電子顕微鏡下での脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、ゲムシタビン（Ｇｅｍ）装填ＬＮＰ、Ｓ２アプタマーで修飾されたＧｅｍ装填ＬＮＰ、及びＪ１０アプタマーで修飾されたＧｅｍ装填ＬＮＰの画像を示す。示されるスケールバーは、１００μｍを表す。図５Ｂは、遊離（ｇｅｍ標準）並びにリポソーム封入ゲムシタビン（Ｓ２－Ｇｅｍ－ＬＮＰ及びＪ１０－Ｇｅｍ－ＬＮＰ）の代表的なフッ素（19Ｆ）ＮＭＲスペクトルの画像を示す。図５Ｃは、ゲムシタビン（Ｇｅｍ）装填脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、Ｓ２アプタマーで修飾されたＧｅｍ装填ＬＮＰ、及びＪ１０アプタマーで修飾されたＧｅｍ装填ＬＮＰの高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）スペクトルの画像を示す。図５Ｄは、培養されたマウス膵臓がん（ＫＰＣ）細胞株に対する遊離及びリポソーム封入ゲムシタビンの細胞毒性を示すグラフを示す。図５Ｅは、マウス単球細胞株Ｊ７７４Ａ．１及びＲＡＷ２６４．７並びにマウス内皮細胞株ＳＶＥＣにおけるＧｅｍ－ＬＮＰ、及びＤｉＤ親油性シアニン染料で標識されたＧｅｍ－ＬＮＰ及びアプタマー－Ｇｅｍ－ＬＮＰのインビトロ結合親和性分析を示すグラフを示す。テューキー調整を伴う二元配置分散分析を使用してデータを分析した（*Ｐ＜０．０５、**Ｐ＜０．０１、***Ｐ＜０．００１を有意とし、「ｎｓ」は、有意でないことを示す）。
【図6】５時間目（５ｈ）並びに１、４、７、１４、２１、３５及び４２日目に全血球計算（ＣＢＣ）により判断された膵臓がんの同所移植後のマウスにおける循環単球の数を示すグラフである。テューキー調整を伴う二元配置分散分析をデータ分析に使用した（***Ｐ＜０．００１を有意とし、「ｎｓ」は、有意でないことを示す）。
【図7A-C】ＣＣＲ２－ＲＦＰ遺伝子移植マウスにマウスＫＰＣ膵臓がん細胞を同所移植した後の腫瘍部位へのＣＣＲ２－ＲＦＰ+単球細胞の動員の画像を示す。図７Ａは、検出を容易にするためにルシフェラーゼを発現するようにマウスＫＰＣ膵臓がん細胞株を改変した、ＩＶＩＳイメージングにより収集された画像を示す。示されるスケールバーは、１００μｍである。図７Ｂは、ＩＶＩＳを使用する腫瘍部位におけるＣＣＲ２－ＲＦＰ+単球の定量分析を示す。テューキー調整を伴う二元配置分散分析を使用してデータを分析した（*Ｐ＜０．０５、**Ｐ＜０．０１、***Ｐ＜０．００１、****Ｐ＜０．０００１を有意とした）。図７Ｃは、生体顕微鏡を介して捕捉された同所移植後の腫瘍部位におけるＣＣＲ２－ＲＦＰ+単球の動員を示す。示されるスケールバーは、１００μｍである。
【図8A-F】Ｇｅｍ－ＬＮＰ、Ｓ２－Ｇｅｍ－ＬＮＰ又はＪ１０－Ｇｅｍ－ＬＮＰで処置されたマウスの単球、リンパ球及び顆粒球に対するアプタマー－Ｇｅｍ－ＬＮＰのインビボ結合特異性の画像を示す。図８Ａは、Ｇｅｍ－ＬＮＰ、Ｓ２－Ｇｅｍ－ＬＮＰ又はＪ１０－Ｇｅｍ－ＬＮＰで処置されたマウス由来の単球に対するアプタマー－Ｇｅｍ－ＬＮＰのインビボ結合特異性を示す。図８Ｂは、Ｇｅｍ－ＬＮＰ、Ｓ２－Ｇｅｍ－ＬＮＰ又はＪ１０－Ｇｅｍ－ＬＮＰで処置されたマウス由来のリンパ球に対するアプタマー－Ｇｅｍ－ＬＮＰのインビボ結合特異性を示す。図８Ｃは、Ｇｅｍ－ＬＮＰ、Ｓ２－Ｇｅｍ－ＬＮＰ又はＪ１０－Ｇｅｍ－ＬＮＰで処置されたマウス由来の顆粒球に対するアプタマー－Ｇｅｍ－ＬＮＰのインビボ結合特異性を示す。図８Ｄは、Ｇｅｍ－ＬＮＰ、Ｓ２－Ｇｅｍ－ＬＮＰ又はＪ１０－Ｇｅｍ－ＬＮＰで処置されたマウス由来の単球に対するアプタマー－Ｇｅｍ－ＬＮＰのインビボ結合特異性の定量を示す。図８Ｅは、Ｇｅｍ－ＬＮＰ、Ｓ２－Ｇｅｍ－ＬＮＰ又はＪ１０－Ｇｅｍ－ＬＮＰで処置されたマウス由来のリンパ球に対するアプタマー－Ｇｅｍ－ＬＮＰのインビボ結合特異性の定量を示す。図８Ｆは、Ｇｅｍ－ＬＮＰ、Ｓ２－Ｇｅｍ－ＬＮＰ又はＪ１０－Ｇｅｍ－ＬＮＰで処置されたマウス由来の顆粒球に対するアプタマー－Ｇｅｍ－ＬＮＰのインビボ結合特異性の定量を示す。
【図9A-B】同所腫瘍移植の４８時間後のＰＤＡＣマウスから採取されたマウス同所膵臓腫瘍におけるアプタマー－Ｇｅｍ－ＬＮＰの蓄積を示す画像を示す。図９Ａは、採取された腫瘍におけるＤｉＤ標識Ｇｅｍ－ＬＮＰ、ＤｉＤ標識Ｓ２－Ｇｅｍ－ＬＮＰ及びＤｉＤ標識Ｊ１０－Ｇｅｍ－ＬＮＰの蓄積を示す画像を示す。図９Ｂは、採取された腫瘍におけるＤｉＤ標識Ｇｅｍ－ＬＮＰ、ＤｉＤ標識Ｓ２－Ｇｅｍ－ＬＮＰ及びＤｉＤ標識Ｊ１０－Ｇｅｍ－ＬＮＰの蓄積としてのＤｉＤ染料強度の定量を示すグラフを示す。
【図10】
19Ｆ ＮＭＲを使用するマウウ同所膵臓がんにおけるゲムシタビン、ｇｅｍ－ＬＮＰ、Ｓ２－Ｇｅｍ－ＬＮＰ及びＪ１０－Ｇｅｍ－ＬＮＰによる処置後のゲムシタビンの蓄積の定量を示すグラフを示す。
【図11A-K】Ｊ１０－Ｇｅｍ－ＬＮＰの投与後のマウス膵臓がんモデルにおけるゲムシタビンの治療効果の増強を示す図を含む。図１１Ａは、マウスＰＤＡＣモデルにおけるアプタマー－Ｇｅｍ－ＬＮＰのインビボ機能的評価のための実験的設計の概略を示す画像である。図１１Ｂは、アプタマー－Ｇｅｍ－ＬＮＰ処置の１０日後の膵臓腫瘍におけるアポトーシスの検出のための末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）ｄＵＴＰニック末端標識（ＴＵＮＥＬ）分析の画像を示す。アポトーシス指数を、調べた視野におけるＴＵＮＥＬ+細胞の割合と定義した。示されるスケールバーは、２０μｍを表す。図１１Ｃは、アプタマー－Ｇｅｍ－ＬＮＰ処置の１０日後のマウスＰＤＡＣモデル由来の膵臓腫瘍におけるＫｉ６７+細胞の画像を示す。示されるスケールバーは、２０μｍを表す。図１１Ｄは、アプタマー－Ｇｅｍ－ＬＮＰ処置後の時間経過時のマウスＰＤＡＣにおけるマウスＫＰＣ細胞株のルシフェラーゼ活性を検出するためにＩＶＩＳで判断した膵臓腫瘍サイズの画像を示す。テューキー調整を伴う一元配置分散分析をデータ分析に使用した（*Ｐ＜０．０５、**Ｐ＜０．０１、***Ｐ＜０．００１を有意とした）。図１１Ｅは、アプタマー－Ｇｅｍ－ＬＮＰ処置後の時間経過時に実施した磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）で判断した膵臓腫瘍サイズの画像を示す。テューキー調整を伴う一元配置分散分析をデータ分析に使用した（*Ｐ＜０．０５、**Ｐ＜０．０１、***Ｐ＜０．００１を有意とした）。図１１Ｆは、ＰＢＳ、Ｇｅｍ、Ｇｅｍ－ＬＮＰ、Ｓ２－Ｇｅｍ－ＬＮＰ及びＪ１０－Ｇｅｍ－ＬＮＰで処置されたＰＤＡＣマウスから採取した同所膵臓腫瘍質量の定量を示すグラフを示す。テューキー調整を伴う一元配置分散分析をデータ分析に使用した（*Ｐ＜０．０５、**Ｐ＜０．０１、***Ｐ＜０．００１を有意とした）。図１１Ｇは、腫瘍移植の４８時間後までにわたるＰＢＳ、Ｇｅｍ、Ｇｅｍ－ＬＮＰ、Ｓ２－Ｇｅｍ－ＬＮＰ及びＪ１０－Ｇｅｍ－ＬＮＰで処置したＰＤＡＣマウスの体重の変化を示すグラフを示す。テューキー調整を伴う二元配置分散分析をデータ分析に使用した（*Ｐ＜０．０５、**Ｐ＜０．０１、***Ｐ＜０．００１を有意とした）。図１１Ｈは、マウスＰＤＡＣモデルにおける生存率に対するアプタマー－Ｇｅｍ－ＬＮＰの効果を示すグラフを示す。テューキー調整を伴う一元配置分散分析をデータ分析に使用し、カプラン－マイヤー法及びログランク（マンテル－コックス）検定をｑの生存曲線の作成及び分析に使用した（*Ｐ＜０．０５、**Ｐ＜０．０１及び***Ｐ＜０．００１）。図１１Ｉは、アプタマー－Ｇｅｍ－ＬＮＰ処置の３６日後に実施した磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）で判断した肝臓転移腫瘍体積を示すグラフを示す。図１１Ｊは、アプタマー－Ｇｅｍ－ＬＮＰ処置の３２日後に実施したＩＶＩＳで判断した肝臓転移腫瘍体積を示すグラフを示す。テューキー調整を伴う一元配置分散分析をデータ分析に使用した（*Ｐ＜０．０５、**Ｐ＜０．０１、***Ｐ＜０．００１を有意とした）。図１１Ｋは、肝臓転移腫瘍を有するマウスの生存率に対するアプタマー－Ｇｅｍ－ＬＮＰの効果を示すグラフを示す。テューキー調整を伴う一元配置分散分析をデータ分析に使用し、カプラン－マイヤー法及びログランク（マンテル－コックス）検定をｑの生存曲線の作成及び分析に使用した（*Ｐ＜０．０５、**Ｐ＜０．０１及び***Ｐ＜０．００１）。
【図12A-E】マウスへの粒子注入の１週間後に血液検査により調べた肝臓及び腎臓機能に対するアプタマー－Ｇｅｍ－ＬＮＰの効果を示すグラフを示す。テューキー調整を伴う一元配置分散分析をデータ分析に使用した。図１２Ａは、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）に対するアプタマー－Ｇｅｍ－ＬＮＰの効果を示す。図１２Ｂは、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）に対するアプタマー－Ｇｅｍ－ＬＮＰの効果を示す。図１２Ｃは、血中尿素窒素（ＢＵＮ）に対するアプタマー－Ｇｅｍ－ＬＮＰの効果を示す。図１２Ｄは、クレアチニン（ＣＲＥＡ）に対するアプタマー－Ｇｅｍ－ＬＮＰの効果を示す。図１２Ｅは、アルカリ性ホスファターゼ（ＡＬＰ）に対するアプタマー－Ｇｅｍ－ＬＮＰの効果を示す。
【発明を実施するための形態】
【0007】
疾患部位へのマクロファージの動員は、急性又は慢性疾患の患者における発病時に生じる重要事象である。Pawelec et al., Current Opinion in Immunology. 2014; 29:23-28。これらのマクロファージは、最初に血管における単球として現れる。Gordon et al., Nature Reviews Immunology. 2005;5:953-964。次いで、循環単球が、疾患部位に最も近い血管に移動し、次いで溢血として知られるプロセスである内膜浸透によってその部位に到達する。Hume, Current Opinion in Immunology. 2006;18:49-53。
本開示は、少なくとも一部に、選択的に単球を標的とし、それらに結合する核酸アプタマー（例えばＪ１０）の開発、及び脂質ナノ粒子の表面上のＪ１０などの当該単球特異的核酸アプタマーを含むアプタマーベースの脂質ナノ粒子標的化システムの開発に基づく。当該アプタマー標識脂質ナノ粒子は、単球などの循環血液細胞を「シャトル」として使用して、アプタマー標識脂質ナノ粒子に封入された治療薬又は診断薬が腫瘍部位などの対象の部位に到達させることが可能である有益な薬物送達ビヒクルとして機能できる。アプタマー標識脂質ナノ粒子を担持する循環単球は、内膜と交差すると、活性化されてマクロファージを形成する。続いて、これらの自己活性化マクロファージは、アプタマー標識脂質ナノ粒子を食菌することで、封入された抗がん薬（例えば、ゲムシタビンなどの化学療法薬、又はがん診断薬）をマクロファージの内部で放出又は機能させることにより、その治療又は診断効果を発揮する。
本開示は、少なくとも一部に、選択的に単球を標的とし、それらに結合する核酸アプタマー（例えばＪ１０）の開発、及び脂質ナノ粒子の表面上のＪ１０などの当該単球特異的核酸アプタマーを含むアプタマーベースの脂質ナノ粒子標的化システムの開発に基づく。当該アプタマー標識脂質ナノ粒子は、単球などの循環血液細胞を「シャトル」として使用して、アプタマー標識脂質ナノ粒子に封入された治療薬又は診断薬が腫瘍部位などの対象の部位に到達させることが可能である有益な薬物送達ビヒクルとして機能できる。アプタマー標識脂質ナノ粒子を担持する循環単球は、内膜と交差すると、活性化されてマクロファージを形成する。続いて、これらの自己活性化マクロファージは、アプタマー標識脂質ナノ粒子を食菌することで、封入された抗がん薬（例えば、ゲムシタビンなどの化学療法薬、又はがん診断薬）をマクロファージの内部で放出又は機能させることにより、その治療又は診断効果を発揮する。
【0008】
したがって、Ｊ１０などの単球標的化核酸アプタマー、アプタマーベースの脂質ナノ粒子単球標的化システム、それらを含む医薬組成物、腫瘍を治療又は検出するために膵臓腫瘍部位（例えば膵管腺癌（ＰＤＡＣ）部位）などの腫瘍部位に治療薬又は診断薬を送達するための方法を本明細書に記載する。
単球標的化核酸アプタマー
単球を標的とし、それらに結合する核酸アプタマー（例えばＪ１０）を本明細書に記載する。本明細書に使用される核酸アプタマーとは、特定の免疫細胞（例えば単球）に対する結合活性を有する核酸分子（ＤＮＡ又はＲＮＡ）を指す。本開示の単球標的化アプタマーは、線形又は円形で、ＲＮＡ、ＤＮＡ（例えば一本鎖ＤＮＡ）、修飾核酸、又はそれらの混合体であってもよい。単球標的化アプタマーは、（例えば、在来遺伝子に存在しないヌクレオチド配列を含む、又は天然に存在しない修飾ヌクレオチドを含む）非天然分子であってもよい。或いは、又は加えて、単球標的化アプタマーは、機能性ペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでいなくてもよい。
単球標的化核酸アプタマー
単球を標的とし、それらに結合する核酸アプタマー（例えばＪ１０）を本明細書に記載する。本明細書に使用される核酸アプタマーとは、特定の免疫細胞（例えば単球）に対する結合活性を有する核酸分子（ＤＮＡ又はＲＮＡ）を指す。本開示の単球標的化アプタマーは、線形又は円形で、ＲＮＡ、ＤＮＡ（例えば一本鎖ＤＮＡ）、修飾核酸、又はそれらの混合体であってもよい。単球標的化アプタマーは、（例えば、在来遺伝子に存在しないヌクレオチド配列を含む、又は天然に存在しない修飾ヌクレオチドを含む）非天然分子であってもよい。或いは、又は加えて、単球標的化アプタマーは、機能性ペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでいなくてもよい。
【0009】
一部の実施形態において、本明細書に開示される単球標的化アプタマーは、５‘－ＧＧＡＴＧＧＧＡＧＧＧＡＧＧＧＧＧＣＴＣＧＴＧＧＣＧＧＣＴＡＧＧＧＧＧＴＡＴＡＡ－３’（配列番号１）と少なくとも７０％（例えば８０％、８５％、９０％、９５％又は９８％）の同一性を有するコアヌクレオチド配列を含んでいてもよい。一部の例において、本明細書に開示される単球標的化核酸アプタマーは、配列番号１のコアヌクレオチド配列のヌクレオチド配列を含んでいてもよい。
【0010】
本明細書に開示されるコアヌクレオチド配列に加えて、単球標的化アプタマーは、コア配列の５’末端（５’プライマー部位）、コア配列の３’末端（３’プライマー部位）、又はその両方にプライマー部位をさらに含んでいてもよい。一部の例において、本明細書に開示される単球標的化アプタマーは、５’－ＡＣ ＧＣＴ ＣＧＧ ＡＴＧ ＣＣＡ ＣＴＡ ＣＡＧ－３’と少なくとも７０％（例えば、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％又は１００％）の同一性を有するヌクレオチド配列を含んでいてもよい５’プライマー部位を含んでいてもよい。或いは、又は加えて、本明細書に開示される単球標的化アプタマーは、５’－ＣＴ ＣＡＴ ＧＧＡ ＣＧＴ ＧＣＴ ＧＧＴ ＧＡＣ－３’と少なくとも７０％（例えば、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％又は１００％）の同一性を有するヌクレオチド配列を含んでいてもよい３’プライマー部位を含んでいてもよい。一部の例において、本明細書に開示される単球標的化アプタマーは、５’－ＡＣ ＧＣＴ ＣＧＧ ＡＴＧ ＣＣＡ ＣＴＡ ＣＡＧ－３’のヌクレオチド配列を含む５’プライマー部位、及び配列番号１のヌクレオチド配列を含むコアヌクレオチド配列に隣接している５’－ＣＴ ＣＡＴ ＧＧＡ ＣＧＴ ＧＣＴ ＧＧＴ ＧＡＣ－３’のヌクレオチド配列を含む３’プライマー部位を含んでいてもよい。一部の例において、本明細書に開示される単球標的化アプタマーは、５’－ＡＣＧＣＴＣＧＧＡＴＧＣＣＡＣＴＡＣＡＧＧＧＡＴＧＧＧＡＧＧＧＡＧＧＧＧＧＣＴＣＧＴＧＧＣＧＧＣＴＡＧＧＧＧＧＴＡＴＡＡＣＴＣＡＴＧＧＡＣＧＴＧＣＴＧＧＴＧＡＣ－３’（配列番号２）のヌクレオチド配列、又は配列番号２と少なくとも７０％（例えば、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９８％）の同一性を有するヌクレオチド配列を含んでいてもよい。
一部の実施形態において、本明細書に開示される単球標的化アプタマーは、脂質ナノ粒子へのアプタマーの付着を容易にすることができるアンカー核酸断片に結合されてもよい。一部の例において、アンカー核酸断片は、本明細書に開示される単球標的化アプタマーの３’末端に結合されてもよい。一部の例において、アンカー核酸断片は、本明細書に開示される単球標的化アプタマーの５’末端に結合されてもよい。一部の例において、アンカー核酸断片は、５’－ＣＡＡＴＡＧＡＧＴＣＧＴＡＣＡＧＧＴＣＧ－３’のヌクレオチド配列を含んでいてもよい。
一部の実施形態において、本明細書に開示される単球標的化アプタマーは、脂質ナノ粒子へのアプタマーの付着を容易にすることができるアンカー核酸断片に結合されてもよい。一部の例において、アンカー核酸断片は、本明細書に開示される単球標的化アプタマーの３’末端に結合されてもよい。一部の例において、アンカー核酸断片は、本明細書に開示される単球標的化アプタマーの５’末端に結合されてもよい。一部の例において、アンカー核酸断片は、５’－ＣＡＡＴＡＧＡＧＴＣＧＴＡＣＡＧＧＴＣＧ－３’のヌクレオチド配列を含んでいてもよい。
【0011】
具体的な例において、単球標的化アプタマーは、
のヌクレオチド配列（５’の下線が引かれた断片がアンカー核酸断片であり、イタリック体の領域が５’及び３’プライマー部位であり、太字の断片が単球結合のためのコアヌクレオチド配列である）を含んでいてもよい。
２つの核酸の「同一性パーセント」は、Karlin and Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-77, 1993のように改造された、Karlin and Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68, 1990のアルゴリズムを使用して判断される。当該アルゴリズムは、Altschul, et al. J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990のＮＢＬＡＳＴ及びＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）に組み込まれる。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索をＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長－１２で実施して、本発明の核酸分子に相同なヌクレオチド配列を得ることができる。２つの配列の間にギャップが存在する場合は、Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402, 1997に記載されるようにギャップドＢＬＡＳＴを利用することができる。ＢＬＡＳＴ及びギャップドＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合は、それぞれのプログラム（例えばＸＢＬＡＳＴ及びＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメータを使用することができる。
【化1】
２つの核酸の「同一性パーセント」は、Karlin and Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-77, 1993のように改造された、Karlin and Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68, 1990のアルゴリズムを使用して判断される。当該アルゴリズムは、Altschul, et al. J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990のＮＢＬＡＳＴ及びＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）に組み込まれる。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索をＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長－１２で実施して、本発明の核酸分子に相同なヌクレオチド配列を得ることができる。２つの配列の間にギャップが存在する場合は、Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402, 1997に記載されるようにギャップドＢＬＡＳＴを利用することができる。ＢＬＡＳＴ及びギャップドＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合は、それぞれのプログラム（例えばＸＢＬＡＳＴ及びＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメータを使用することができる。
【0012】
他の実施形態において、本明細書に記載の単球標的化アプタマーは、配列番号１又は配列番号２のヌクレオチド配列と比較して８つまで（例えば７つ、６つ、５つ、４つ、３つ、２つ又は１つまでの）ヌクレオチド変種を含んでいてもよい。当該変種を導入できる位置を、例えば、標的単球の参考ヌクレオチド配列に基づいて判断することができる。
本明細書に開示される単球標的化アプタマーのいずれも２００ヌクレオチド（ｎｔｓ）、例えば１５０ｎｔｓ、１００ｎｔｓ、８０ｎｔｓ、７０ｎｔｓ、６０ｎｔｓ、５０ｎｔｓ、４０ｎｔｓ又は３０ｎｔｓまで含んでいてもよい。一部の例において、単球標的化アプタマーは、３０～１５０ｎｔｓ、３０～１００ｎｔｓ、３０～８０ｎｔｓ、３０～７０ｎｔｓ、３０～６０ｎｔｓ、３０～５０ｎｔｓ又は３０～４０ｎｔｓの範囲のヌクレオチドを含んでいてもよい。
単球標的化アプタマーは、ヒト単球を特異的に結合し得る。或いは、アプタマーは、異なる種（例えばヒトとマウス）の単球に結合し得る。
本明細書に開示される単球標的化アプタマーのいずれも２００ヌクレオチド（ｎｔｓ）、例えば１５０ｎｔｓ、１００ｎｔｓ、８０ｎｔｓ、７０ｎｔｓ、６０ｎｔｓ、５０ｎｔｓ、４０ｎｔｓ又は３０ｎｔｓまで含んでいてもよい。一部の例において、単球標的化アプタマーは、３０～１５０ｎｔｓ、３０～１００ｎｔｓ、３０～８０ｎｔｓ、３０～７０ｎｔｓ、３０～６０ｎｔｓ、３０～５０ｎｔｓ又は３０～４０ｎｔｓの範囲のヌクレオチドを含んでいてもよい。
単球標的化アプタマーは、ヒト単球を特異的に結合し得る。或いは、アプタマーは、異なる種（例えばヒトとマウス）の単球に結合し得る。
【0013】
一部の実施形態において、本明細書に記載の単球標的化アプタマーは、非天然核酸塩基、糖又は共有ヌクレオシド間結合（骨格）を含んでいてもよい。当該修飾オリゴヌクレオチドは、当該修飾オリゴヌクレオチドは、細胞取り込みの増強、標的核酸との親和性の向上、及びインビボ安定性の強化などの望ましい特性を付与する。
一例において、本明細書に記載のアプタマーは、リン原子を保持するもの（例えば、米国特許第３，６８７，８０８号、第４，４６９，８６３号、第５，３２１，１３１号、第５，３９９，６７６号及び第５，６２５，０５０号参照）並びにリン原子を有さないもの（例えば、米国特許第５，０３４，５０６号、第５，１６６，３１５号及び第５，７９２，６０８号）を含む修飾骨格を有する。リン含有修飾骨格の例としては、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキル－ホスホトリエステル、３’－アルキレンホスホネート、５’－アルキレンホスホネート及びキラルホスホネートを含むメチル及び他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、３’－アミノホスホルアミデート及びアミノアルキルホスホルアミデートを含むホスホルアミデート、チオノホスホルアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、セレノホスフェート、並びに３’－５’結合又は２’－５’結合を有するボラノホスフェートが挙げられるが、それらに限定されない。当該骨格としては、反転極性、即ち３’対３’、５’対５’又は２’対２’結合を有するものも挙げられる。リン原子を含まない修飾骨格は、短鎖アルキル又はシクロアルキルのヌクレオシド間結合、ヘテロ原子及びアルキル若しくはシクロアルキルのヌクレオシド間結合との混合体、又は１つ以上の短鎖ヘテロ原子若しくは複素環のヌクレオシド間結合によって形成される。当該骨格としては、（一部にヌクレオシドの糖部から形成された）モルホリノ結合を有する骨格、シロキサン骨格、スルフィド、スルホキシド及びスルホン骨格、ホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格、メチレンホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格、リボアセチル骨格、アルケン含有骨格、スルファメート骨格、メチレンイミノ及びメチレンヒドラジノ骨格、スルホネート及びスルホンアミド骨格、アミド骨格、並びにＮ、Ｏ、Ｓ及びＣＨ２成分部分の混合体を有する他の骨格が挙げられる。
一例において、本明細書に記載のアプタマーは、リン原子を保持するもの（例えば、米国特許第３，６８７，８０８号、第４，４６９，８６３号、第５，３２１，１３１号、第５，３９９，６７６号及び第５，６２５，０５０号参照）並びにリン原子を有さないもの（例えば、米国特許第５，０３４，５０６号、第５，１６６，３１５号及び第５，７９２，６０８号）を含む修飾骨格を有する。リン含有修飾骨格の例としては、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキル－ホスホトリエステル、３’－アルキレンホスホネート、５’－アルキレンホスホネート及びキラルホスホネートを含むメチル及び他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、３’－アミノホスホルアミデート及びアミノアルキルホスホルアミデートを含むホスホルアミデート、チオノホスホルアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、セレノホスフェート、並びに３’－５’結合又は２’－５’結合を有するボラノホスフェートが挙げられるが、それらに限定されない。当該骨格としては、反転極性、即ち３’対３’、５’対５’又は２’対２’結合を有するものも挙げられる。リン原子を含まない修飾骨格は、短鎖アルキル又はシクロアルキルのヌクレオシド間結合、ヘテロ原子及びアルキル若しくはシクロアルキルのヌクレオシド間結合との混合体、又は１つ以上の短鎖ヘテロ原子若しくは複素環のヌクレオシド間結合によって形成される。当該骨格としては、（一部にヌクレオシドの糖部から形成された）モルホリノ結合を有する骨格、シロキサン骨格、スルフィド、スルホキシド及びスルホン骨格、ホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格、メチレンホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格、リボアセチル骨格、アルケン含有骨格、スルファメート骨格、メチレンイミノ及びメチレンヒドラジノ骨格、スルホネート及びスルホンアミド骨格、アミド骨格、並びにＮ、Ｏ、Ｓ及びＣＨ２成分部分の混合体を有する他の骨格が挙げられる。
【0014】
別の例において、本明細書に記載の単球標的化アプタマーは、１つ以上の置換糖部分を含む。当該置換糖部分は、ＯＨ、Ｆ、Ｏ－アルキル、Ｓ－アルキル、Ｎ－アルキル、Ｏ－アルケニル、Ｓ－アルケニル、Ｎ－アルケニル、Ｏ－アルキニル、Ｓ－アルキニル、Ｎ－アルキニル及びＯ－アルキル－Ｏ－アルキルの基のうちの１つをそれらの２’位に含むことができる。これらの基において、アルキル、アルケニル及びアルキニルは、置換又は非置換のＣ１～Ｃ１０アルキル又はＣ２～Ｃ１０アルケニル及びアルキニルであり得る。それらは、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ開裂基、レポーター基、インターカレーター、オリゴヌクレオチドの薬物動態特性を向上させるための基、又はオリゴヌクレオチドの薬力学的特性を向上させるための基をそれらの２’位に含んでいてもよい。好適な置換糖部分としては、２’－メトキシエトキシ、２’－ジメチルアミノオキシエトキシ及び２’－ジメチルアミノエトキシエトキシを有するものが挙げられる。Martin et al., Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504参照。
【0015】
或いは、又は加えて、本明細書に記載の単球標的化アプタマーは、１つ以上の修飾在来核酸塩基（即ちアデニン、グアニン、チミン、シトシン及びウラシル）を含んでいてもよい。修飾核酸塩基としては、米国特許第３，６８７，８０８号、The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, pages 858-859、Kroschwitz, J. I., ed. John Wiley & Sons, 1990、Englisch et al., Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613、及びSanghvi, Y. S., Chapter 15, Antisense Research and Applications, pages 289-302, CRC Press, 1993に記載されているものが挙げられる。これらの核酸塩基の特定のものには、アプタマー分子のそれらの標的化部位に対する結合親和性を増強するのに特に有用なものがある。これらは、５－置換ピリミジン、６－アザピリミジン、並びにＮ－２、Ｎ－６及びＯ－６置換プリン（例えば、２－アミノプロピル－アデニン、５－プロピルウラシル及び５－プロピニルシトシン）を含む。Sanghvi, et al., eds., Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278参照。
【0016】
本明細書に記載の単球標的化アプタマーはいずれも、従来の方法、例えば化学的合成又はインビトロ転写によって調製できる。本明細書に記載のそれらの意図する生物活性を例えば以下の実施例に記載のものによって検証することができる。単球標的化アプタマーのいずれかを発現するためのベクターも本開示の範囲内である。
本明細書に記載の単球標的化アプタマーはいずれも、共有結合、非共有結合又はその両方を介してポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分などの１つ以上のポリエーテル部分に結合されてもよい。したがって、一部の実施形態において、本明細書に記載の単球標的化アプタマーをペグ化することができる。本開示は、特定の分子量のＰＥＧ部分に関して限定することを意図しない。一部の実施形態において、ポリエチレングリコール部分は、５ｋＤａから１００ｋＤａ、１０ｋＤａから８０ｋＤａ、２０ｋＤａから７０ｋＤａ、２０ｋＤａから６０ｋＤａ、２０ｋＤａから５０ｋＤａ、又は３０ｋＤａから５０ｋＤａの範囲の分子量を有する。一部の例において、ＰＥＧ部分は、４０ｋＤａの分子量を有する。本明細書に記載の単球標的化アプタマーに結合されたＰＥＧ部分は、直鎖状又は分枝状であり得る。それは、核酸アプタマーの５’末端、アプタマーの３’末端、又はその両方に結合されてもよい。必要であれば、ＰＥＧ部分を核酸アプタマーの３’末端に共有結合させることができる。
本明細書に記載の単球標的化アプタマーはいずれも、共有結合、非共有結合又はその両方を介してポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分などの１つ以上のポリエーテル部分に結合されてもよい。したがって、一部の実施形態において、本明細書に記載の単球標的化アプタマーをペグ化することができる。本開示は、特定の分子量のＰＥＧ部分に関して限定することを意図しない。一部の実施形態において、ポリエチレングリコール部分は、５ｋＤａから１００ｋＤａ、１０ｋＤａから８０ｋＤａ、２０ｋＤａから７０ｋＤａ、２０ｋＤａから６０ｋＤａ、２０ｋＤａから５０ｋＤａ、又は３０ｋＤａから５０ｋＤａの範囲の分子量を有する。一部の例において、ＰＥＧ部分は、４０ｋＤａの分子量を有する。本明細書に記載の単球標的化アプタマーに結合されたＰＥＧ部分は、直鎖状又は分枝状であり得る。それは、核酸アプタマーの５’末端、アプタマーの３’末端、又はその両方に結合されてもよい。必要であれば、ＰＥＧ部分を核酸アプタマーの３’末端に共有結合させることができる。
【0017】
ＰＥＧ部分を核酸に結合させるための方法は、当該技術分野で公知であり、例えば、その該当教示内容が参照により本明細書に組み込まれているＰＣＴ国際公開第２００９／０７３８２０号に既に記載されている。ＰＥＧ結合核酸アプタマー、及びＰＥＧを本明細書に記載の核酸アプタマーに結合させるための方法は、例示的であり、限定することを意図しないことを理解されたい。
アプタマーベースの脂質ナノ粒子単球標的化システム
本開示は、単球特異的核酸アプタマーのいずれかが表面に付着した脂質ナノ粒子も提供する。脂質ナノ粒子は、診断薬又は治療薬などの１つ以上の好適な薬剤を含んでいてもよい。本明細書に開示される脂質ナノ粒子は、核酸アプタマーの単球標的化活性により、アプタマーベースの脂質ナノ粒子単球標的化システムとして機能することによって、単球を、脂質ナノ粒子と結合した薬剤を相応の対象、例えば疾患又は傷害部位に送達するためのベシクルとして使用することができる。
アプタマーベースの脂質ナノ粒子単球標的化システム
本開示は、単球特異的核酸アプタマーのいずれかが表面に付着した脂質ナノ粒子も提供する。脂質ナノ粒子は、診断薬又は治療薬などの１つ以上の好適な薬剤を含んでいてもよい。本明細書に開示される脂質ナノ粒子は、核酸アプタマーの単球標的化活性により、アプタマーベースの脂質ナノ粒子単球標的化システムとして機能することによって、単球を、脂質ナノ粒子と結合した薬剤を相応の対象、例えば疾患又は傷害部位に送達するためのベシクルとして使用することができる。
【0018】
（ｉ）単球特異的核酸アプタマーを担持した脂質ナノ粒子
本明細書に記載のアプタマーベースの脂質ナノ粒子単球標的化システムは、好適な任意の脂質ナノ粒子、及びナノ粒子の表面に表示できる、本明細書に開示される１つ以上の単球標的化アプタマー（例えばＪ１０）を含むことができる。単球標的化アプタマーの少なくとも一部分は、アプタマーが結合パートナー、例えば単球などの循環血液細胞の表面と相互作用できるように、脂質ナノ粒子の表面に暴露されてもよい。一部の実施形態において、リポソームにおける脂質と単球標的化アプタマーの比は、１，０００，０００：１～３０：１（ｗ／ｗ）の範囲である。一部の例において、その比は、１，０００：１、３０：１～５０：１（ｗ／ｗ）、例えば３０：１～４０：１又は４０：１～５０：１である。
本明細書に記載のアプタマーベースの脂質ナノ粒子単球標的化システムは、好適な任意の脂質ナノ粒子、及びナノ粒子の表面に表示できる、本明細書に開示される１つ以上の単球標的化アプタマー（例えばＪ１０）を含むことができる。単球標的化アプタマーの少なくとも一部分は、アプタマーが結合パートナー、例えば単球などの循環血液細胞の表面と相互作用できるように、脂質ナノ粒子の表面に暴露されてもよい。一部の実施形態において、リポソームにおける脂質と単球標的化アプタマーの比は、１，０００，０００：１～３０：１（ｗ／ｗ）の範囲である。一部の例において、その比は、１，０００：１、３０：１～５０：１（ｗ／ｗ）、例えば３０：１～４０：１又は４０：１～５０：１である。
【0019】
本明細書に記載の単球標的化アプタマー結合脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）は、単球、好中球、及び／又は傷害部位に遊走し得る他の循環血液細胞に結合することが可能である。一部の実施形態において、ＬＮＰは、内皮細胞などの他の種類の細胞と比較して、単球に特異的に結合する。単球などの標的細胞に「特異的に結合する」ＬＮＰは、当該技術分野で良く理解されている用語であり、当該特異的結合を判断する方法も当該技術分野で周知である。ＬＮＰは、代替的な標的細胞（例えば内皮細胞）と反応又は結合する場合より高頻度で、迅速に、長い時間にわたって、且つ／又は大きな親和性で標的細胞と反応又は結合する場合に、単球などの標的細胞に対する「特異的結合」活性を発揮すると言われる。ＬＮＰは、内皮細胞などの他の種類の細胞に結合する場合より大きな親和性、結合力で、容易に、且つ／又は長い時間にわたって結合する場合に、単球に「特異的に結合する」。定義を読むことにより、例えば、第１の標的細胞に特異的に結合するＬＮＰは、第２の標的細胞に特異的又は優先的に結合してもしなくてもよいことも理解される。そのように、「特異的結合」又は「優先的結合」は、排他的結合を（含むことができるが）必ずしも必要としない。概して、結合への言及は、必ずしもではないが、優先的結合を意味する。一部の具体例において、本明細書に記載のＬＮＰは、内皮細胞に結合しないため、血栓症を誘発しない。即ち、ＬＮＰは、内皮細胞に結合しない、又は実質的に低レベルで内皮細胞に結合するため、結合するとしても、有意な血栓症（例えば、通常の医学的アッセイによって判断できる臨床的に重大な血栓症）を誘発するのに十分でない。
【0020】
一部の場合において、本明細書に開示される脂質ナノ粒子は、１つ以上の単球標的化アプタマーを表面表示できるリポソームであってもよい。本明細書に使用されている「リポソーム」という用語は、内部の水性スペースを囲む外側脂質層膜（例えば、単層リポソームとして知られる単一脂質二重層、又は多層リポソームとして知られる多重脂質二重層）を含む組成物を指す。例えば、Cullis et al., Biochim. Biophys Acta, 559: 399-420 (1987)参照。単層リポソームは、概して、約２０から約４００ナノメートル（ｎｍ）、約５０から約３００ｎｍ、約３００から約４００ｎｍ又は約１００から約２００ｎｍの範囲の径を有する。多層リポソームは、通常、約１から約１０マイクロメートルの範囲の径を有し、水相の層と交互の同心の２から１００のいずれかの脂質二重層を含んでいてもよい。
【0021】
脂質二重層の各々は、逆向きに配向した両親媒性脂質分子を含む２つの単層を含んでいてもよい。両親媒性脂質は、典型的には、１つ以上の非極性（疎水性）アシル又はアルキル鎖に共有結合した極性（親水性）先端基を含む。疎水性アシル鎖と周囲の水性媒体とのエネルギー的に好ましくない接触は、極性先端基が二重層の表面に向かって配向し、アシル鎖が二重層の内部に向かって配向するように両親媒性脂質分子を誘発し、両親媒性脂質分子を配置させることで、水性環境との接触からアシル鎖を効果的に保護する。
【0022】
１つ以上の天然及び／又は合成脂質化合物は、本明細書に記載のリポソームの調製に使用されてもよい。リポソームは、負に帯電した脂質、正に帯電した脂質、又はそれらの組合せを含んでいてもよい。好適な負に帯電した脂質の例としては、ジミリストイル、－ジパルミトイル－及びジステアロイルファスファチジルグリセロール、ジミリストイル、－ジパルミトイル－及びジパルミトイルホスファチジン酸、ジミリストイル、－ジパルミトイル－及びジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、それらの不飽和ジアシル及びアシル鎖同等物の混合体、並びにカルジオリピンが挙げられるが、それらに限定されない。正に帯電した脂質の例としては、Ｎ，Ｎ’－ジメチル－Ｎ，Ｎ’－ジオクタシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）及びクロリド（ＤＤＡＣ）、Ｎ－（１－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、３－ベータ－［Ｎ－（Ｎ’，Ｎ’－ジメチルアミノエチル）カルバモイル］コレステロール（ＤＣ－コール）、１，２－ジオレオイルオキシ－３－［トリメチルアンモニオ］－プロパン（ＤＯＴＡＰ）、１，２－ジオクタデシルオキシ－３－［トリメチルアンモニオ］－プロパン（ＤＳＴＡＰ）及び１，２－ジオレオイルオキシプロピル－３－ジメチル－ヒドロキシエチルアンモニウムクロリド（ＤＯＲＩ）、並びに例えばMartin et al., Current Pharmaceutical Design 2005, 11, 375-394に記載されている陽イオン性脂質が挙げられるが、それらに限定されない。好適な電荷的に中性の脂質の例としては、ＤＬＰＣ（１，２－ジラウロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン）、ＤＭＰＣ（１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン）、ＤＰＰＣ（１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン）、ＤＳＰＣ（１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン）、ＤＯＰＣ（１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン）、ＤＭＰＡ（１，２－ジテトラデカノイル－ｓｎ－グリセロ－３－リン酸ナトリウム）、ＤＰＰＥ（１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン）、及びＤＯＰＥ（１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン）が挙げられるが、それらに限定されない。
【0023】
一部の実施形態において、本明細書に記載のリポソームは、１つ以上のリン脂質、並びに任意に、疎水性部分及び親水性部分の両方を有する類似の分子形状及び寸法の１つ以上のさらなる分子（例えばコレステロール）を使用して調製できる。本明細書に記載のリポソームを調製するのに使用するための好適なリン脂質としては、ホスファチジルコリン（レシチン）、リソレシチン、リソホスファチジルエタノール－アミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン、ホスファチジルエタノールアミン（セファリン）、カルジオリピン、ホスファチジン酸、セレブロシド、ジセチルホスフェート、ホスファチジルコリン及びジパルミトイル－ホスファチジルグリセロールが挙げられるが、それらに限定されない。さらなる非リン含有脂質としては、ステアリルアミン、ドデシルアミン、ヘキサデシル－アミン、パルミチン酸アセチル、リシノール酸グリセロール、ステアリン酸ヘキサデシル、ミリスチン酸イソプロピル、両性アクリルポリマー、脂肪酸、脂肪酸アミド、コレステロール、コレステロールエステル、ジアシルグリセロール、及びジアシルグリセロールスクシネート等が挙げられるが、それらに限定されない。
【0024】
一部の実施形態において、本明細書に記載のリポソームの主たる脂質成分は、鎖長及び飽和度が異なる様々なアシル鎖基を有していてもよいホスファチジルコリンであり得る。一部の例において、ホスファチジルコリンは、炭素鎖長が例えばＣ14－Ｃ22の範囲の飽和脂肪酸を含む。飽和長鎖ホスファチジルコリンは、それらの不飽和同等物よりインビボでの透過性が低く安定性が高い。一又は二不飽和脂肪酸、及び飽和脂肪酸と不飽和脂肪酸の混合物を有するホスファチジルコリンも使用してもよい。
本明細書に記載のリポソームはいずれも、ステロール、好ましくはコレステロールを約０．１～１．０（コレステロール：リン脂質）の範囲のモル比でさらに含んでいてもよい。一部の例において、リポソームは、ジステアロイルホスファチジルコリン／コレステロール、ジパルミトイルホスファチジルコリン／コレステロール、ジミリストイルホスファチジルコリン／コレステロール、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）／コレステロール、又は卵スフィンゴミエリン／コレステロールの組合せを含んでいてもよい。
本明細書に記載のリポソームはいずれも、ステロール、好ましくはコレステロールを約０．１～１．０（コレステロール：リン脂質）の範囲のモル比でさらに含んでいてもよい。一部の例において、リポソームは、ジステアロイルホスファチジルコリン／コレステロール、ジパルミトイルホスファチジルコリン／コレステロール、ジミリストイルホスファチジルコリン／コレステロール、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）／コレステロール、又は卵スフィンゴミエリン／コレステロールの組合せを含んでいてもよい。
【0025】
必要であれば、本明細書に記載のリポソームをポリマー層で被覆してインビボでのリポソームの安定性を高めることができる（例えば立体安定化リポソーム）。好適なポリマーの例としては、リポソームの循環半減期を向上させ、治療標的に到達するリポソームの量を増加させる親水性表面層を形成できるポリ（エチレングリコール）が挙げられるが、それに限定されない。例えば、Working et al. J Pharmacol Exp Ther, 289: 1128-1133 (1999)、Gabizon et al., J Controlled Release 53: 275-279 (1998)、AdlakhaHutcheon et al., Nat Biotechnol 17: 775-779 (1999)、及びKoning et al., Biochim Biophys Acta 1420: 153-167 (1999)参照。本明細書に記載のリポソームを作製するのに使用するための有用なＰＥＧ－脂質の例としては、１，２－ジアシル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－３５０］（ｍＰＥＧ３５０ＰＥ）、１，２－ジアシル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－５５０］（ｍＰＥＧ５５０ＰＥ）、１，２－ジアシル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－７５０］（ｍＰＥＧ７５０ＰＥ）、１，２－ジアシル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－１０００］（ｍＰＥＧ１０００ＰＥ）、１，２－ジアシル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００］（ｍＰＥＧ２０００ＰＥ）、１，２－ジアシル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－３０００］（ｍＰＥＧ３０００ＰＥ）、１，２－ジアシル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－５０００］（ｍＰＥＧ５０００ＰＥ）、Ｎ－アシル－スフィンゴシン－１－［スクシニル（メトキシポリエチレングリコール）７５０］（ｍＰＥＧ７５０セラミド）、Ｎ－アシル－スフィンゴシン－１－［スクシニル（メトキシポリエチレングリコール）２０００］（ｍＰＥＧ２０００セラミド）、及びＮ－アシル－スフィンゴシン－１－［スクシニル（メトキシポリエチレングリコール）５０００］（ｍＰＥＧ５０００セラミド）が挙げられるが、それらに限定されない。
【0026】
本明細書に記載のリポソームを調製するために様々な方法を使用することができる。当該方法は、当該技術分野で公知である、又は本明細書に開示されており、例えば、Lichtenberg and Barenholz in Methods of Biochemical Analysis, Volume 33, 337-462 (1988)に記載の方法である。その各々の該当開示内容が参照により本明細書に組み込まれているSzoka et al., Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9:467 (1980)、米国特許第４，２３５，８７１号、第４，５０１，７２８号及び第４，８３７，０２８号、Liposomes, Marc J. Ostro, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1983, Chapter 1、並びにHope, et al., Chem. Phys. Lip. 40:89 (1986)も参照。前述のように薄膜水和及び反復押出の標準的方法の組合せによって小さな単層ベシクル（ＳＵＶ、サイズ＜１００ｎｍ）を調製することができる（Tseng et al., 1999）。
【0027】
リポソームを所望のサイズに設定するために従来の技術が利用可能である。例えば、その各々の該当開示内容が参照により組み込まれている米国特許第４，７３７，３２３号、及びHope et al., Biochim. Biophys. Acta, 812: 55-65 (1985)参照。槽又はプローブ超音波処理によりリポソーム懸濁液を超音波処理すると微粉化が進行して、サイズが約５０ｎｍ未満の小さな単層ベシクルになる。均質化又は微小流体化は、剪断エネルギーに依存して、大きなリポソームを小さなリポソームに断片化する他の方法である。典型的な均質化手順では、選択されたリポソームサイズ、典型的には約１００～５００ｎｍが確認されるまで、標準的なエマルジョンホモジナイザを介して多層ベシクルを再循環する。いずれの方法においても、粒子サイズ分布を従来のレーザビーム粒子サイズ識別法によってモニタリングできる。
小孔ポリカーボネート膜又は非対称セラミック膜を介するリポソームの押出は、リポソームサイズを比較的明確なサイズ分布まで小さくする非常に有効な方法である。典型的には、所望のリポソームサイズ分布が達成されるまで、懸濁液を、１回以上膜を介して循環させる。リポソームを、段階的に穴が小さくなった膜を介して押し出して、リポソームサイズを漸進的に小さくすることを達成できる。
小孔ポリカーボネート膜又は非対称セラミック膜を介するリポソームの押出は、リポソームサイズを比較的明確なサイズ分布まで小さくする非常に有効な方法である。典型的には、所望のリポソームサイズ分布が達成されるまで、懸濁液を、１回以上膜を介して循環させる。リポソームを、段階的に穴が小さくなった膜を介して押し出して、リポソームサイズを漸進的に小さくすることを達成できる。
【0028】
本明細書に記載のリポソームをいずれも従来の方法によって分析して、その物理的及び／又は化学的特徴を判断することができる。例えば、ホスフェートアッセイを使用してリポソーム濃度を判断することができる。１つのホスフェートアッセイは、モリブデートとマラカイトグリーン染料との相互作用に基づく。主原理は、無機ホスフェートがモリブデートと反応して、酸性条件下で還元されると青色の錯体に変換される無色の未還元ホスホモリブデート錯体を形成することである。ホスホモリブデートは、マラカイトグリーンと錯体を形成すると、色が２０又は３０倍になる。最終生成物の還元緑色可溶性錯体を６２０ｎｍのその吸光度で測定し、溶液中の無機ホスフェートの直接的な尺度とする。
他の実施形態において、本明細書に記載の薬物送達のための粒子は、１つ以上のポリマー又はコポリマーで構成されたナノ粒子であり得る。例えば、ナノ粒子は、通常の技術によって調製できる乳酸・グリコール酸共重合体（ＰＬＡＧ）ナノ粒子であり得る。
本明細書に開示される単球特異的核酸アプタマーはいずれも、従来の手法により脂質ナノ粒子に結合されてもよい。例えば、ドッキング核酸断片が、脂質ナノ粒子に付着されていてもよい。ドッキング核酸断片は、単球特異的核酸アプタマーの一部分、例えば、アンカー核酸断片又はその一部分に相補的なヌクレオチド配列を含む。塩基対を介して、アプタマーを脂質ナノ粒子に付着させることができる。
他の実施形態において、本明細書に記載の薬物送達のための粒子は、１つ以上のポリマー又はコポリマーで構成されたナノ粒子であり得る。例えば、ナノ粒子は、通常の技術によって調製できる乳酸・グリコール酸共重合体（ＰＬＡＧ）ナノ粒子であり得る。
本明細書に開示される単球特異的核酸アプタマーはいずれも、従来の手法により脂質ナノ粒子に結合されてもよい。例えば、ドッキング核酸断片が、脂質ナノ粒子に付着されていてもよい。ドッキング核酸断片は、単球特異的核酸アプタマーの一部分、例えば、アンカー核酸断片又はその一部分に相補的なヌクレオチド配列を含む。塩基対を介して、アプタマーを脂質ナノ粒子に付着させることができる。
【0029】
ドッキング核酸断片を結合するために、本明細書に記載のリポソームの調製に使用される１つ以上の天然及び／又は合成脂質化合物は、ドッキング核酸断片と反応できる少なくとも１つの活性化末端基を有していてもよい。脂質化合物誘導体の末端基形態の例としては、メチル化、カルボキシル化、アミノ化及びマレイル化が挙げられる。一部の例において、本明細書に記載のリポソームの調製に使用される脂質化合物は、カルボキシルを末端とする脂質、アミノを末端とする脂質、ヒドラジドを末端とする脂質、又はマレイミドを末端とする脂質であってもよい。一部の例において、本明細書に記載のリポソームの調製に使用される脂質化合物は、Ｎ－（５’－ヒドロキシ－３’－オキシペンチル）－１０－１２－ペンタコサジインアミド（ｈ－ＰＥＧ１－ＰＣＤＡ）、Ｎ－（５’－スルホ－３’－オキシペンチル－１）－１０－１２－ペンタコサジインアミド（スルホ－ＰＥＧ１－ＰＣＤＡ）、Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－７５０］－１０－１２－ペンタコサジインアミド（ｍ－ＰＥＧ７５０－ＰＣＤＡ）、Ｎ－［マレイミド（ポリエチレングリコール）－１５００］－１０－１２－ペンタコサジインアミド（ｍａｌ－ＰＥＧ１５００－ＰＣＤＡ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［マレイミド（ポリエチレングリコール）－２０００］（Ｍａｌ－ＰＥＧ－ＤＳＰＥ）、Ｌ－ａ－ホスファチジルコリン水添大豆（水添大豆ＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、コレステロール、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００］（ｍ－Ｐｅｇ２０００－ＤＳＰＥ）、及びそれらの組合せであってもよい。
【0030】
ドッキング核酸は、上記の活性化末端基との反応を介して脂質ナノ粒子に付着されていてもよい。一部の例において、ドッキング核酸は、反応基、例えばチオール基を付加するために修飾されてもよい。当該ドッキング核酸は、脂質上の活性化末端基と反応して、共有結合を形成することができる。
一部の例において、本明細書に記載のドッキング核酸断片は、結合技術により、本明細書に記載の脂質化合物誘導体の活性化末端基に付着されていてもよい。好適な結合技術の例としては、カルボニル付加・脱離／還元的アミノ化、アミド化、マレイミド－チオールカップリング、グルタルアルデヒド架橋、イソチオシアネート－アミンカップリング、ヒドラゾンカップリング、オキシムカップリング、シッフ塩基形成／還元、水性ディールス・アルダー及び「クリック」ケミストリが挙げられる。一部の例において、本明細書に記載のドッキング核酸断片を本明細書に記載の脂質化合物誘導体に、それらを還元剤の存在下でインキュベートすることによって結合させる。一部の例において、ドッキング核酸断片と還元剤と脂質化合物誘導体とのモル比が約１：１０：２０である場合に、本明細書に記載の脂質化合物誘導体に対する本明細書に記載のドッキング核酸断片の結合が生じる。一部の例において、本明細書に記載の脂質化合物誘導体に対する本明細書に記載のドッキング核酸断片の結合は、効率が約７０％から約１００％である。
一部の例において、本明細書に記載のドッキング核酸断片は、結合技術により、本明細書に記載の脂質化合物誘導体の活性化末端基に付着されていてもよい。好適な結合技術の例としては、カルボニル付加・脱離／還元的アミノ化、アミド化、マレイミド－チオールカップリング、グルタルアルデヒド架橋、イソチオシアネート－アミンカップリング、ヒドラゾンカップリング、オキシムカップリング、シッフ塩基形成／還元、水性ディールス・アルダー及び「クリック」ケミストリが挙げられる。一部の例において、本明細書に記載のドッキング核酸断片を本明細書に記載の脂質化合物誘導体に、それらを還元剤の存在下でインキュベートすることによって結合させる。一部の例において、ドッキング核酸断片と還元剤と脂質化合物誘導体とのモル比が約１：１０：２０である場合に、本明細書に記載の脂質化合物誘導体に対する本明細書に記載のドッキング核酸断片の結合が生じる。一部の例において、本明細書に記載の脂質化合物誘導体に対する本明細書に記載のドッキング核酸断片の結合は、効率が約７０％から約１００％である。
【0031】
一部の実施形態において、本明細書に開示される単球標的化アプタマーは、ＬＮＰを含む脂質に結合されたドッキング核酸断片を介して、本明細書に開示されるＬＮＰにハイブリダイズされてもよい。一部の例において、ドッキング核酸断片は、本明細書に開示される単球標的化アプタマーと相互作用し、単球標的化アプタマーは、ドッキング核酸断片に対応するアンカー核酸断片を含む。一部の例において、単球標的化アプタマーは、約８時間から約１８時間のインキュベーションによりドッキング核酸断片に結合された脂質を含むＬＮＰにハイブリダイズする。一部の例において、インキュベーション時の単球標的化アプタマーに対するドッキング核酸断片を含むＬＮＰの比率は、約１：０．２５、１：０．５、１：１．２５、１：１．５０、１：１．７５、１：２、１：２．５、１：３、１：４又は１：５であってもよい。一部の例において、本明細書に開示される単球標的化アプタマーに対するドッキング核酸断片のハイブリダイゼーションは、効率が約８％から約８５％であり得る。
【0032】
（ｉｉ）治療薬及び診断薬
本明細書に記載の単球標的化アプタマー標識脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）はいずれも、がん治療のための治療薬（例えば、化学療法薬、タンパク質ベースのがん治療薬、核酸ベースのがん治療薬若しくは放射線剤）を含む治療薬、例えば抗がん薬、又はがん検出のための診断薬を封入することができる。
本明細書に記載の単球標的化アプタマー標識脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）はいずれも、がん治療のための治療薬（例えば、化学療法薬、タンパク質ベースのがん治療薬、核酸ベースのがん治療薬若しくは放射線剤）を含む治療薬、例えば抗がん薬、又はがん検出のための診断薬を封入することができる。
【0033】
化学療法薬の例としては、ドセタキセル、ミトキサントロン、ドキソルビシン、ゲムシタビン、ピリミジン類似体（５－フルオロウラシル、フロクスウリジン、カペシタビン、ゲムシタビン及びシタラビン）、プリン類似体、フォレートアンタゴニスト及び関連阻害薬（メルカプトプリン、チオグアニン、ペントスタチン及び２－クロロデオキシアデノシン（クラドリビン））、ビンカアルカロイド（ビンブラスチン、ビンクリスチン及びビノレルビン）などの天然産物、タキサン（パクリタキセル、ナノ粒子アルブミン結合パクリタキセル（Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標））、ドセタキセル）、エリブリン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ノコダゾール、エポチロン及びナベルビンなどの微小管破壊剤、エピジポドフィロトキシン（エトポシド及びテニポシド）、ＤＮＡ損傷剤（アクチノマイシン、アムサクリン、アントラシクリン、ブレオマイシン、ブスルファン、カンプトテシン、カルボプラチン、クロラムブシル、シスプラチン、シクロホスファミド、シストキサン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、ヘキサメチルメラミンオキサリプラチン（ｈｅｘａｍｅｔｈｙｈｎｅｌａｍｉｎｅｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ）、イホスファミド、メルファラン、メクロレタミン、マイトマイシン、ミトキサントロン、ニトロソ尿素、プリカマイシン、プロカルバジン、タキソール、タキソテール、テニポシド、トリエチレンチオホスホルアミド及びエトポシド（ＶＰ１６））を含む抗増殖／抗有糸分裂薬、ダクチノマイシン（アクチノマイシンＤ）、ダウノルビシン、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、イダルビシン、アントラシクリン、ミトキサントロン、ブレオマイシン、プリカマイシン（ミトラマイシン）及びマイトマイシンなどの抗生物質、酵素（Ｌ－アスパラギンを全身代謝させ、それら自体のアスパラギンを合成する能力のない細胞を奪うＬ－アスパラギナーゼ）、抗血小板薬、窒素マスタード（メクロレタミン、シクロホスファミド及び類似体、メルファラン、クロルアンブシル）、エチレンイミン及びメチルメラミン（ヘキサメチルメラミン及びチオテパ）、アルキルスルフォネート－ブスルファン、ニトロソ尿素（カルムスチン（ＢＣＮＵ）及び類似体、ストレプトゾシン）、トラゼン－ダカルバジニン（ＤＴＩＣ）などの抗増殖／抗有糸分裂アルキル化剤、葉酸類似体（メトトレキセート）などの抗増殖／抗有糸分裂抗代謝薬、白金配位錯体（シスプラチン、カルボプラチン）、プロカルバジン、ヒドロキシ尿素、ミトタン、アミノグルテチミド、ホルモン、ホルモン類似体（エストロゲン、タモキシフェン、ゴセレリン、ビカルタミド、ニルタミド）及びアロマターゼ阻害薬（レトロゾール、アナストロゾール）、抗凝血薬（ヘパリン、合成ヘパリン塩及び他のトロンビン阻害薬）、繊維素溶解薬（組織プラスミノゲン活性剤、ストレプトキナーゼ及びウロキナーゼなど）、アスピリン、ジピリダモール、チクロピジン、クロピドグレル、アブシキシマブ、抗遊走薬、抗分泌薬（ブレベルジン）、免疫抑制薬（シクロスポリン、タクロリムス（ＦＫ－５０６）、ゲムシタビン（Ｇｅｍｚａｒ（登録商標））、メシル酸イマチニブ（ＧＬＥＥＶＥＣ（商標））、エルロチニブ塩酸塩（ＴＡＲＣＥＶＡ（商標））、スニチニブリンゴ酸塩（ＳＵ１１２４８、ＳＵＴＥＮＴ（商標））、ゲフィチニブ（ＩＲＥＳＳＡ（商標））、シロリムス（ラパマイシン）、アザチオプリン、マイコフェノレートモフェチル）、抗血管新生化合物（例えば、ＴＮＰ－４７０、ゲニステイン、ベバシズマブ）及び成長因子阻害薬（例えば、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）阻害薬）、アンジオテンシン受容体ブロッカー、一酸化窒素供与体、アンチセンスオリゴヌクレオチド、抗体（トラスツズマブ）、細胞周期阻害薬及び分化誘導物質（トレチノイン）、ｍＴＯＲ阻害薬、トポイソメラーゼ阻害薬（ドキソルビシン（アドリアマイシン）、アムサクリン、カンプトテシン、ダウノルビシン、ダクチノマイシン、エニポシド、エピルビシン、エトポシド、イダルビシン、ミトキサントロン、トポテカン、イリノテカン（例えば、Ｏｎｉｖｙｄｅ（登録商標）などのイリノテカンリポソーム注射剤）、コルチコステロイド（コルチソン、デキサメタソン、ヒドロコルチソン、メチルプレドニソロン、プレドニソン及びプレドニソロン）、成長因子シグナル伝達キナーゼ阻害薬、ヌクレオチド類似体及びチミジンホスホリラーゼ阻害薬（例えば、トリフルリジン－チピラシル又はＬｏｎｓｕｒｆ（登録商標））、ミトコンドリア機能障害誘発物質及びカスパーゼ活性剤、クロマチン破壊剤又はチェックポイント阻害薬（例えば、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ－３、Ａ２ａＲ、ＴＩＧＩＴ及びＶＩＳＴＡ）が挙げられるが、それらに限定されない。
【0034】
（腫瘍抑制遺伝子、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡを含む）核酸－酸ベースの治療薬の例としては、その各々の開示内容の全体が参照により本明細書に組み込まれている米国公開特許出願第２００７／００６５４９９号及び米国特許第７，７８０，８８２号に記載されているものが挙げられる。抗体ベースの治療薬の例としては、ベバシズマブ、セツキシマブ、パニツルヌマブ、アレムツズマブ、リツキシマブ、トラスツズマブが挙げられるが、それらに限定されない。
【0035】
或いは、本明細書に記載の単球標的化アプタマー標識脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）はいずれも、診断薬を封入することができる。例示的な診断薬は、医学的イメージング剤、例えば、造影剤、放射性薬剤、放射性医薬品、酸化鉄粒子等であってもよい。インビボイメージングに好適な放射性分子としては、122Ｉ、123Ｉ、124Ｉ、125Ｉ、131Ｉ、18Ｆ、75Ｂｒ、76Ｂｒ、77Ｂｒ、211Ａｔ、225Ａｃ、177Ｌｕ、153Ｓｍ、186Ｒｅ、188Ｒｅ、67Ｃｕ、213Ｂｉ、212Ｂｉ、212Ｐｂ及び67Ｇａが挙げられるが、それらに限定されない。インビボイメージングに好適な例示的な放射性医薬品としては、111Ｉｎオキシキノリン、131Ｉヨウ化ナトリウム、99ｍＴｃメブロフェニン及び99ｍＴｃ赤血球、123Ｉヨウ化ナトリウム、99ｍＴｃエキサメタジム、99ｍＴｃ粗大凝集アルブミン、99ｍＴｃメドロネート、99ｍＴｃメルチアチド、99ｍＴｃオキシドロネート、99ｍＴｃペンテテート、99ｍＴｃパーテクネテート、99ｍＴｃセスタミビ、99ｍＴｃ硫黄コロイド、99ｍＴｃテトロホスミン、タリウム－２０１並びにキセノン－１３３が挙げられる。診断薬は、対象の腫瘍部位などの疾患部位を検出するのに有用である染料、例えばフルオロフォアであることもできる。本明細書に記載の治療薬又は診断薬はいずれも、従来の方法又は本明細書に記載の方法によって、本明細書にも記載の好適なリポソームに組み込むことが可能である。一部の実施形態において、リポソームは、例えば、意図する目的で参照により本明細書に組み込まれているMaurer et al., Expert Opinion in Biological Therapy 1, 923-47、NBoman et al., Cancer Res. 54, 2830-2833、Waterhouse et al., Methods Enzymol. 391 (2005) 40-57に記載されているように、リポソーム膜（リポソーム内部は酸性である）に対してｐＨ勾配を与え、リポソームを、封入される治療又は診断薬とともにインキュベートすることによって装填できる。この方法は、当該技術分野で使用される「活性装填」を意味することが理解される。一部の例において、ｐＨ勾配は、意図する目的で参照により本明細書に組み込まれているHaran et al., Biochim. Biophys. Acta 1115 (1993) 201-215及び米国特許第５，３１６，７７１号に概説されている硫酸アンモニウム勾配であり得る。治療薬又は診断薬がリポソームに装填されると、組成物をそのまま使用することもできるし、組成物をさらに処理してあらゆる未装填薬物を除去することもできる。
【0036】
ｐＨ装填技術は、一般に２つの工程、即ち低リポソーム内ｐＨでのｐＨ勾配の生成、及びその後の治療薬又は診断薬の装填を含む。膜透過プロトン勾配を様々な方法によって生成することができる。例えば、リポソームをｐＨ４のクエン酸緩衝剤などの低ｐＨ緩衝剤中で調製した後、外部緩衝液をｐＨ７．５緩衝剤と交換することができる（例えば、Madden et al., Chem. Phys. Lipids, 53:37-46 (1990)）。或いは、イオノフォアを陽イオン勾配（高内部陽イオン濃度）と併用することができる（例えば、Fenske et al., Biochim Biophy. Acta, 1414:188-204 (1998)）。ニゲリシン及びＡ２３１８７などのイオノフォアは、一価又は二価陽イオンの外方向移動をそれぞれプロトンの内方向移動に結びつけるため、リポソームの内部が酸性になる。また、リポソームを高濃度の硫酸アンモニウムなどの弱塩基の存在下で調製することができる（Haran et al., Biochim. Biophys. Acta, 1151:201-215 (1993)）。外部アンモニウム塩溶液を除去すると、同様の原理に従ってｐＨ勾配が生成し、その後の薬物装填プロセスにも関与する。
【0037】
ｐＨ勾配に加えて、金属イオン勾配を治療薬又は診断薬の活性装填に使用することもできる。例えば、Cheung et al., Biochim Biophys Acta, 1414:205-216 (1998)参照。弱塩基治療薬又は診断薬の中性形態は、膜を浸透することが可能であり、薬物－金属イオン錯体の形成を通じてリポソームの水性の内部に保持される。
治療薬又は診断薬が水溶性の弱塩基薬物である場合は、それを水溶液（例えば、３００ｍＭスクロース、又は適切なｐＨを有する等張緩衝液）に溶解し、リポソーム懸濁液と組み合わせ、次いで好適な温度でインキュベートしてもよい。薬物溶液は、薬物の溶解度を高めるために少量の水混和性有機溶媒（例えば１０％未満のエタノール）を含むことができる。インキュベーション温度及び時間は、脂質組成及び薬物の性質に依存する。典型的には、ＤＳＰＣ／コレステロールなどのコレステロール及び長鎖飽和脂肪酸から構成されるリポソームは、短鎖飽和脂質（例えばＤＭＰＣ／コレステロール）又は不飽和脂質から形成されるリポソームより透過性が低く、高速で効率的な装填を達成するためにより高い温度を必要とする。例えば、ＤＳＰＣ／コレステロールリポソームは、典型的には、６０℃以上の温度を必要とし、装填は、典型的には５～１５分後に完了するが、２時間まで要することがある。
治療薬又は診断薬が水溶性の弱塩基薬物である場合は、それを水溶液（例えば、３００ｍＭスクロース、又は適切なｐＨを有する等張緩衝液）に溶解し、リポソーム懸濁液と組み合わせ、次いで好適な温度でインキュベートしてもよい。薬物溶液は、薬物の溶解度を高めるために少量の水混和性有機溶媒（例えば１０％未満のエタノール）を含むことができる。インキュベーション温度及び時間は、脂質組成及び薬物の性質に依存する。典型的には、ＤＳＰＣ／コレステロールなどのコレステロール及び長鎖飽和脂肪酸から構成されるリポソームは、短鎖飽和脂質（例えばＤＭＰＣ／コレステロール）又は不飽和脂質から形成されるリポソームより透過性が低く、高速で効率的な装填を達成するためにより高い温度を必要とする。例えば、ＤＳＰＣ／コレステロールリポソームは、典型的には、６０℃以上の温度を必要とし、装填は、典型的には５～１５分後に完了するが、２時間まで要することがある。
【0038】
治療薬又は診断薬が脂溶性である場合は、リポソーム二重層の２つの単層の間の薬剤の分布を可能にする条件下でリポソームを作製するために、薬剤を脂質と混合することができる。次いで、外部単層における薬剤を、本明細書に記載の方法を使用して、膜貫通ｐＨ又は他のイオン勾配に対応して、リポソーム内部に装填する（ＬＮ二重層の内部単層に投じる）ことができる。
リポソームへの化合物の遠隔装填には、Ceh et al., Biochim Biophys Acta. 1995 Nov 1;1239(2):145-56に記載される膜貫通勾配の形成が採用される。この方法は、リポソームに装填される治療薬又は診断薬及びボロン酸化合物を懸濁リポソームとともにインキュベートすることによって、リポソーム内の治療薬の蓄積を達成することを含む（Ceh et al., 1995及び米国特許第６，０５１，２５１号）。
リポソームへの化合物の遠隔装填には、Ceh et al., Biochim Biophys Acta. 1995 Nov 1;1239(2):145-56に記載される膜貫通勾配の形成が採用される。この方法は、リポソームに装填される治療薬又は診断薬及びボロン酸化合物を懸濁リポソームとともにインキュベートすることによって、リポソーム内の治療薬の蓄積を達成することを含む（Ceh et al., 1995及び米国特許第６，０５１，２５１号）。
【0039】
医薬組成物及びそれらの使用
１つ以上の治療薬又は診断薬を含む、本明細書に開示される単球標的化脂質ナノ粒子をいずれも、医薬として許容される担体と混合して、例えば標的疾患を治療するのに使用するための医薬組成物を形成することができる。「許容される」とは、担体が、組成物の有効成分と相溶性を有する（且つ好ましくは、有効成分を安定化することが可能である）とともに、処置される対象に有害でないことが必要であることを意味する。医薬として許容される賦形剤（担体）は、当該技術分野で周知である緩衝剤を含む。例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. (2000) Lippincott Williams and Wilkins, Ed. K. E. Hoover参照。
本方法に使用される医薬組成物は、凍結乾燥配合物又は水溶液の形態で医薬として許容される担体、賦形剤又は安定剤を含むことができる。例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. (2000) Lippincott Williams and Wilkins, Ed. K. E. Hoover参照。許容される担体、賦形剤又は安定剤は、使用される投与量及び濃度でレシピエントに無毒であり、ホスフェート、シトレート及び他の有機酸などの緩衝剤、アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤、（オクタデシルジメチルベンジルクロリド、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンズアルコニウム、塩化ベンズエトニウム、フェノール、ブチル若しくはベンジルアルコール、メチル若しくはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、３－ペンタノール及びｍ－クレゾールなどの）防腐剤、（約１０残基未満の）低分子量ポリペプチド、血清アルブミン、ゼラチン若しくは免疫グロブリンなどのタンパク質、ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン若しくはリシンなどのアミノ酸、グルコース、マンノース若しくはデキストランを含む単糖、二糖及び他の炭水化物、ＥＤＴＡなどのキレート剤、スクロース、マンニトール、トレハロース若しくはソルビトールなどの糖、ナトリウムなどの塩形成対イオン、金属錯体（例えばＺｎ－タンパク質錯体）、並びに／又はＴｗｅｅｎ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）若しくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤を含むことができる。
１つ以上の治療薬又は診断薬を含む、本明細書に開示される単球標的化脂質ナノ粒子をいずれも、医薬として許容される担体と混合して、例えば標的疾患を治療するのに使用するための医薬組成物を形成することができる。「許容される」とは、担体が、組成物の有効成分と相溶性を有する（且つ好ましくは、有効成分を安定化することが可能である）とともに、処置される対象に有害でないことが必要であることを意味する。医薬として許容される賦形剤（担体）は、当該技術分野で周知である緩衝剤を含む。例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. (2000) Lippincott Williams and Wilkins, Ed. K. E. Hoover参照。
本方法に使用される医薬組成物は、凍結乾燥配合物又は水溶液の形態で医薬として許容される担体、賦形剤又は安定剤を含むことができる。例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. (2000) Lippincott Williams and Wilkins, Ed. K. E. Hoover参照。許容される担体、賦形剤又は安定剤は、使用される投与量及び濃度でレシピエントに無毒であり、ホスフェート、シトレート及び他の有機酸などの緩衝剤、アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤、（オクタデシルジメチルベンジルクロリド、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンズアルコニウム、塩化ベンズエトニウム、フェノール、ブチル若しくはベンジルアルコール、メチル若しくはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、３－ペンタノール及びｍ－クレゾールなどの）防腐剤、（約１０残基未満の）低分子量ポリペプチド、血清アルブミン、ゼラチン若しくは免疫グロブリンなどのタンパク質、ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン若しくはリシンなどのアミノ酸、グルコース、マンノース若しくはデキストランを含む単糖、二糖及び他の炭水化物、ＥＤＴＡなどのキレート剤、スクロース、マンニトール、トレハロース若しくはソルビトールなどの糖、ナトリウムなどの塩形成対イオン、金属錯体（例えばＺｎ－タンパク質錯体）、並びに／又はＴｗｅｅｎ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）若しくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤を含むことができる。
【0040】
本開示は、本明細書に記載の治療薬又は診断薬の１つ以上、及び医薬として許容される担体又は賦形剤を封入できる本明細書に記載の単球標的化アプタマー結合脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）のいずれかを含む医薬組成物も提供する。医薬組成物における担体は、それが組成物の有効成分と相溶性を有し、好ましくは有効成分を安定化させることが可能であり、処置される対象に有害でないという意味で「許容される」必要がある。
本明細書に開示される医薬組成物のための好適な担体又は賦形剤は、ＬＮＰを吸収し、単球に対するＬＮＰの結合を容易にし、且つ／又は単球から発生するマクロファージによるＬＮＰのエンドサイトーシスを強化する個体の身体の能力を高める物質であってもよい。好適な担体及び／又は賦形剤は、簡便且つ正確な投与を可能にするために本明細書に記載の修飾ＬＮＰで配合物の体積を大きくするために使用できる任意の物質も含む。加えて、担体及び／又は賦形剤は、本明細書に記載のＬＮＰのハンドリングを補助するために製造工程で使用されてもよい。投与経路及び投薬形態に応じて、異なる担体及び／又は賦形剤を使用してもよい。例示的な賦形剤としては、抗接着剤、結着剤、コーティング剤、崩壊剤、フィラー、（甘味料などの）香味料及び着色剤、流動促進剤、滑剤、防腐剤、吸着剤が挙げられるが、それらに限定されない。本明細書に記載の担体及び／又は賦形剤は、ビヒクル及び／又は希釈剤を含んでいてもよく、「ビヒクル」は、通常は溶媒又は担体として作用する様々な媒体のいずれかを示し、「希釈剤」は、組成物の有効成分を希釈するために補給される希釈剤を示し、好適な希釈剤は、医薬製剤の粘度を低下させることができる任意の物質を含む。
本明細書に開示される医薬組成物のための好適な担体又は賦形剤は、ＬＮＰを吸収し、単球に対するＬＮＰの結合を容易にし、且つ／又は単球から発生するマクロファージによるＬＮＰのエンドサイトーシスを強化する個体の身体の能力を高める物質であってもよい。好適な担体及び／又は賦形剤は、簡便且つ正確な投与を可能にするために本明細書に記載の修飾ＬＮＰで配合物の体積を大きくするために使用できる任意の物質も含む。加えて、担体及び／又は賦形剤は、本明細書に記載のＬＮＰのハンドリングを補助するために製造工程で使用されてもよい。投与経路及び投薬形態に応じて、異なる担体及び／又は賦形剤を使用してもよい。例示的な賦形剤としては、抗接着剤、結着剤、コーティング剤、崩壊剤、フィラー、（甘味料などの）香味料及び着色剤、流動促進剤、滑剤、防腐剤、吸着剤が挙げられるが、それらに限定されない。本明細書に記載の担体及び／又は賦形剤は、ビヒクル及び／又は希釈剤を含んでいてもよく、「ビヒクル」は、通常は溶媒又は担体として作用する様々な媒体のいずれかを示し、「希釈剤」は、組成物の有効成分を希釈するために補給される希釈剤を示し、好適な希釈剤は、医薬製剤の粘度を低下させることができる任意の物質を含む。
【0041】
担体及び／又は賦形剤の種類及び量は、選択された医薬形態に応じて選択される。好適な医薬形態は、溶液、浸出液、懸濁液のような液体系、コロイド、ゲル、ペースト又はクリームのような半固体系、粉末、顆粒、錠剤、カプセル、ペレット、微粒、微小錠剤、マイクロカプセル、マイクロペレット、座剤のような固体系等である。上記系の各々は、当該技術分野で周知の技術を使用して、通常、遅延又は加速放出のために好適に配合できる。
１つ以上の治療薬又は診断薬を含む本明細書に記載の単球標的化ＬＮＰを含む医薬組成物は、標準的な技術並びに本明細書に記載の技術に従って調製できる。一部の例において、細管内投与、静脈内投与、皮下投与又は筋肉内投与を含む非経口投与のために配合される。一部の例において、医薬組成物は、ボーラス注射又は注入により静脈内投与される。本発明に使用するための好適な配合物は、Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Philadelphia, Pa., 17th ed. (1985)に見いだされる。
１つ以上の治療薬又は診断薬を含む本明細書に記載の単球標的化ＬＮＰを含む医薬組成物は、標準的な技術並びに本明細書に記載の技術に従って調製できる。一部の例において、細管内投与、静脈内投与、皮下投与又は筋肉内投与を含む非経口投与のために配合される。一部の例において、医薬組成物は、ボーラス注射又は注入により静脈内投与される。本発明に使用するための好適な配合物は、Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Philadelphia, Pa., 17th ed. (1985)に見いだされる。
【0042】
一部の例において、医薬組成物は、静脈内注入などの注射のために配合される。無菌の注射可能組成物、例えば無菌の注射可能水性又は油性懸濁液は、好適な分散若しくは湿潤剤（例えばＴｗｅｅｎ８０）又は懸濁剤を使用して、当該技術分野で公知の技術により配合できる。無菌の注射可能製剤は、例えば１，３－ブタンジオール中溶液としての無毒性の非経口的に許容される希釈剤又は溶媒中の無菌の注射可能溶液又は懸濁液とすることもできる。採用できる許容されるビヒクル及び溶媒は、マンニトール、水、リンガー溶液及び等張性塩化ナトリウム溶液である。加えて、無菌の固定油が、溶媒又は懸濁媒体（例えば合成モノ又はジグリセリド）として従来通り採用される。オレイン酸及びそのグリセリド誘導体などの脂肪酸は、特にそれらのポリオキシエチル化バージョンにおいて、オリーブ油又はヒマシ油などの天然の医薬として許容される油のように、注射剤の調製に有用である。これらの油溶液又は懸濁液は、長鎖アルコール希釈剤若しくは分散剤、又はカルボキシメチルセルロース若しくは類似の分散剤、Ｔｗｅｅｎ若しくはＳｐａｎｓなどの他の広く使用されている界面活性剤、又は医薬品の製造に広く使用されている他の類似の乳化剤若しくは生物学的利用性エンハンサーを含むこともできる。
【0043】
医薬組成物はいずれも、担体として循環単球を使用して治療薬を所望の標的部位に送達するために使用できる。この使用を実行するために、任意の単球標的化アプタマー又はそれらのリンカー結合体及び治療薬を含む有効量の医薬組成物を、本明細書に記載のものなどの好適な経路を介して、治療を必要とする対象（例えばヒト対象）に投与することができる。また、この使用を実行するために、治療薬（例えば抗炎症薬）を封入する本明細書に記載のＬＮＰのいずれかを含む有効量の医薬組成物を、本明細書に記載のものなどの好適な経路を介して、治療を必要とする対象（例えばヒト対象）に投与することができる。単球に対する結合活性により、ＬＮＰは、対象の循環単球と結合し、単球が蓄積する部位（例えば、炎症が生じる部位）に送達される。単球が内皮細胞層を交差すると、それらは、エンドサイトーシスを介して、結合したＬＮＰを吸収するマクロファージに分化することにより、捕捉された治療薬を放出してその治療効果を発揮させる。
本明細書に使用される「有効量」は、対象に治療効果を付与するのに必要な活性薬剤単独又は１つ以上の他の活性薬剤と組み合わせた、各活性薬剤の量を指す。有効量は、当業者が認識するように、投与経路、賦形剤の利用、及び他の活性薬剤との使用に応じて異なる。
本明細書に使用される「有効量」は、対象に治療効果を付与するのに必要な活性薬剤単独又は１つ以上の他の活性薬剤と組み合わせた、各活性薬剤の量を指す。有効量は、当業者が認識するように、投与経路、賦形剤の利用、及び他の活性薬剤との使用に応じて異なる。
【0044】
当該量は、勿論、治療されている特定の状態、状態の重度、年齢、身体的状態、サイズ、性別及び体重を含む個別的な患者のパラメータ、治療継続期間、併用療法（存在する場合）の性質、具体的な投与経路及び知識の範囲内での類似要因、並びに医療従事者の見解に依存する。これらの要因は、当業者に周知であり、日常の実験だけで対応できる。個々の成分又はそれらの組合せの最大用量、即ち的確な医学的判断による最大限の安全用量を使用することが一般的に好ましい。しかし、患者は、医学的理由、心理学的理由、又は実質的にあらゆる他の理由から、より低い用量又は許容可能な用量を要求し得ることを当業者は理解する。
一部の実施形態において、本明細書に記載の抗がん薬を含む医薬組成物は、がんを治療するのに使用するためのものである。「治療している（処置している）（treating）」という用語は、本明細書で使用される場合、アレルギー性疾患、アレルギー性疾患の症状又はアレルギー疾患に罹りやすい体質を有する対象に、１つ以上の活性薬剤を含む組成物を、当該疾患、当該疾患の症状又は当該疾患に罹りやすい体質を治療、治癒、軽減、緩和、変更、矯正、改善、向上する、又はそれに影響を及ぼす目的で、適用又は投与することを指す。
一部の実施形態において、本明細書に記載の抗がん薬を含む医薬組成物は、がんを治療するのに使用するためのものである。「治療している（処置している）（treating）」という用語は、本明細書で使用される場合、アレルギー性疾患、アレルギー性疾患の症状又はアレルギー疾患に罹りやすい体質を有する対象に、１つ以上の活性薬剤を含む組成物を、当該疾患、当該疾患の症状又は当該疾患に罹りやすい体質を治療、治癒、軽減、緩和、変更、矯正、改善、向上する、又はそれに影響を及ぼす目的で、適用又は投与することを指す。
【0045】
一部の実施形態において、本開示は、対象における固形腫瘍を治療するための方法であって、それを必要とする対象に、本明細書に記載の医薬組成物の有効量を投与することを含む方法を提供する。本明細書に記載のＬＮＰは、固形腫瘍を有する対象、固形腫瘍を有することが疑われる対象、又は固形腫瘍の存在のリスクがある対象に投与された後に、単球に付着することにより、固形腫瘍に送達されて、標的部位で所望の治療効果を発揮することができる。例示的な固形腫瘍としては、膵管腺がん（ＰＤＡ）、大腸がん（ＣＲＣ）、黒色腫、胆管癌、乳がん、小細胞及び非小細胞肺がん、上部及び下部胃腸悪性腫瘍、胃がん、扁平上皮頭頸部がん、泌尿生殖器がん、肝細胞癌、卵巣がん、肉腫、中皮腫、膠芽細胞腫、食道がん、膀胱がん、尿路上皮がん、腎臓がん、子宮頸及び子宮内膜がんが挙げられるが、それらに限定されない。一部の実施形態において、本開示は、対象における腫瘍転移を治療するための方法であって、それを必要とする対象に、本明細書に記載の医薬組成物の有効量を投与することを含む方法を提供する。本明細書に記載のＬＮＰは、腫瘍転移を有する対象、腫瘍転移を有することが疑われる対象、又は腫瘍転移のリスクがある対象に投与された後に、単球に付着することにより、転移腫瘍領域に送達されて、標的部位で所望の治療効果を発揮することができる。
【0046】
一部の実施形態において、本開示は、対象における膵臓がんを治療するための方法であって、それを必要とする対象に、本明細書に記載の単球標識ＬＮＰを含む医薬組成物の有効量を投与することを含む方法を提供する。一部の態様において、膵臓がんを治療するために使用される単球標識ＬＮＰは、エルロチニブ塩酸塩、エベロリムス、５－ＦＵ（フルオロウラシル注射剤）、ゲムシタビン塩酸塩、ジェムザール（ゲムシタビン塩酸塩）、塩酸イリノテカンリポソーム、マイトマイシンＣ、パクリタキセルアルブミン安定化ナノ粒子配合物、スニチニブリンゴ酸塩及びホルフィルノクスのうちの１つ以上を封入する。
一部の実施形態において、本開示は、対象における卵巣がんを治療するための方法であって、それを必要とする対象に、本明細書に記載の単球標識ＬＮＰを含む医薬組成物の有効量を投与することを含む方法を提供する。一部の態様において、卵巣がんを治療するために使用される単球標識ＬＮＰは、ベバシズマブ、カルボプラチン、シスプラチン、シクロホスファミド、塩酸ドキソルビシン、塩酸ドキソルビシンリポソーム、ゲムシタビン塩酸塩、メルファラン、ニラパリブトシル酸塩一水和物、オラパリブ、パクリタキセル、カンシル酸ルカパリブ（Ｒｕｃａｐａｒｉｂ Ｃａｍｓｙｌａｔｅ）、チオテパ及びトポテカン塩酸塩のうちの１つ以上を封入する。
一部の実施形態において、本開示は、対象における卵巣がんを治療するための方法であって、それを必要とする対象に、本明細書に記載の単球標識ＬＮＰを含む医薬組成物の有効量を投与することを含む方法を提供する。一部の態様において、卵巣がんを治療するために使用される単球標識ＬＮＰは、ベバシズマブ、カルボプラチン、シスプラチン、シクロホスファミド、塩酸ドキソルビシン、塩酸ドキソルビシンリポソーム、ゲムシタビン塩酸塩、メルファラン、ニラパリブトシル酸塩一水和物、オラパリブ、パクリタキセル、カンシル酸ルカパリブ（Ｒｕｃａｐａｒｉｂ Ｃａｍｓｙｌａｔｅ）、チオテパ及びトポテカン塩酸塩のうちの１つ以上を封入する。
【0047】
一部の実施形態において、本開示は、対象における乳がんを治療するための方法であって、それを必要とする対象に、本明細書に記載の単球標識ＬＮＰを含む医薬組成物の有効量を投与することを含む方法を提供する。一部の態様において、乳がんを治療するために使用される単球標識ＬＮＰは、ラロキシフェン塩酸塩、タモキシフェンクエン酸塩、ベマシクリブ（ｂｅｍａｃｉｃｌｉｂ）、アド－トラスツズマブエムタンシン、アルペリシブ、アナストロゾール、アテゾリズマブ、カペシタビン、シクロホスファミド、ドセタキセル、塩酸ドキソルビシン、エピルビシン塩酸塩、エリブリンメシル酸塩、エベロリムス、エキセメスタン、５－ＦＵ（フルオロウラシル注射剤）、フルベストラント、ゲムシタビン塩酸塩、ゴセレリン酢酸塩、イクサベピロン、レトロゾール、酢酸メゲストロール、メトトレキセート、ネラチニブマレイン酸塩、オラパリブ、パクリタキセル、パクリタキセルアルブミン安定化ナノ粒子配合物、パルボシクリブ、パミドロン酸二ナトリウム、ペルツズマブ、リボシクリブ、タラゾパリブトシル酸塩、タモキシフェンクエン酸塩、チオテパ、トレミフェン、トラスツズマブ、トラスツズマブ／ヒアルロニダーゼ－ｏｙｓｋ及び硫酸ビンブラスチンのうちの１つ以上を封入する。
【0048】
一部の実施形態において、本開示は、対象における肺がんを治療するための方法であって、それを必要とする対象に、本明細書に記載の単球標識ＬＮＰを含む医薬組成物の有効量を投与することを含む方法を提供する。一部の態様において、肺がんを治療するために使用される単球標識ＬＮＰは、アファチニブ二マレイン酸塩、アレクチニブ、アテゾリズマブ、ベバシズマブ、ブリガチニブ、カルボプラチン、セリチニブ、クリゾチニブ、ダブラフェニブメシル酸塩、ダコミチニブ、ドセタキセル、塩酸ドキソルビシン、デュルバルマブ、エントレクチニブ、エルロチニブ塩酸塩、エベロリムス、ゲフィチニブ、ゲムシタビン塩酸塩、ロルラチニブ、塩酸メクロレタミン、メトトレキセート、ネシツムマブ、ニボルマブ、オシメルチニブメシル酸塩、パクリタキセル、パクリタキセルアルブミン安定化ナノ粒子配合物、ペムブロリズマブ、ペメトレキセド二ナトリウム、ラムシルマブ、トラメチニブ及びビノレルビン酒石酸塩のうちの１つ以上を封入する。
キット
本開示は、治療薬を標的部位に送達するのに使用するための、又は化学療法薬などの抗がん薬を腫瘍領域に送達することによってがんを治療するのに使用するためのキットも提供する。当該キットは、本明細書に記載の単球標的化アプタマー結合脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、又は治療薬及び医薬として許容される担体を封入する類似のナノ粒子を含む本明細書に記載の医薬組成物のいずれかを含む１つ以上の容器を含むことができる。
キット
本開示は、治療薬を標的部位に送達するのに使用するための、又は化学療法薬などの抗がん薬を腫瘍領域に送達することによってがんを治療するのに使用するためのキットも提供する。当該キットは、本明細書に記載の単球標的化アプタマー結合脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、又は治療薬及び医薬として許容される担体を封入する類似のナノ粒子を含む本明細書に記載の医薬組成物のいずれかを含む１つ以上の容器を含むことができる。
【0049】
一部の実施形態において、キットは、本明細書に記載の方法のいずれかによる使用に対する取扱説明書を含むことができる。含まれる取扱説明書は、そこに封入される治療薬を送達するための、又は本明細書に記載の方法のいずれかによりがんを治療するための医薬組成物の投与の説明を含むことができる。キットは、治療に好適な個体を、その個体ががんを有するかどうか、がんを有することが疑われるかどうか、又はがんのリスクがあるかどうかの識別に基づいて選択することについての説明をさらに含んでいてもよい。
治療薬又は診断薬を封入するＬＮＰを含む本明細書に記載の医薬組成物の使用に関する取扱説明書は、一般に、意図する治療についての投与量、投与スケジュール及び投与経路に関する情報を含む。容器は、単位用量、大量包装体（例えば複数回用量包装体）又は小単位用量であってもよい。本発明のキットにおいて供給される取扱説明書は、典型的には、ラベル又は添付文書（例えば、キットに含められた紙シート）での書面の取扱説明書であるが、機械可読取扱説明書（例えば、磁気又は光学記憶ディスクに保持される取扱説明書）も許容される。
治療薬又は診断薬を封入するＬＮＰを含む本明細書に記載の医薬組成物の使用に関する取扱説明書は、一般に、意図する治療についての投与量、投与スケジュール及び投与経路に関する情報を含む。容器は、単位用量、大量包装体（例えば複数回用量包装体）又は小単位用量であってもよい。本発明のキットにおいて供給される取扱説明書は、典型的には、ラベル又は添付文書（例えば、キットに含められた紙シート）での書面の取扱説明書であるが、機械可読取扱説明書（例えば、磁気又は光学記憶ディスクに保持される取扱説明書）も許容される。
【0050】
ラベル又は添付文書は、組成物が、治療薬を標的部位に送達するために、又はがんを治療するために使用されることを示す。取扱説明書は、本明細書に記載の方法のいずれかを実行するために提供されてもよい。
本明細書に記載のキットは、好適に包装されている。好適な包装としては、バイアル、ボトル、瓶、及びフレキシブル包装（例えば、密封マイラー又はプラスチックバッグ）等が挙げられるが、それらに限定されない。吸入具、経鼻投与デバイス（例えば噴霧器）、又はミニポンプなどの注入デバイスなどの特定のデバイスとの併用のための包装体も考えられる。キットは、無菌の挿入口を有していてもよい（例えば、容器は、静脈注射用溶液バッグ、又は皮下注射針が貫通可能なストッパを有するバイアルであってもよい）。容器も、無菌の挿入口を有していてもよい（例えば、容器は、静脈注射用溶液バッグ、又は皮下注射針が貫通可能なストッパを有するバイアルであってもよい）。
本明細書に記載のキットは、緩衝剤などのさらなる成分、及び解釈的情報を提供してもよい。通常、キットは、容器、及び容器上の、又は容器に随伴するラベル又は添付文書を含む。一部の実施形態において、本開示は、上記キットの内容物を含む製造品を提供する。
本明細書に記載のキットは、好適に包装されている。好適な包装としては、バイアル、ボトル、瓶、及びフレキシブル包装（例えば、密封マイラー又はプラスチックバッグ）等が挙げられるが、それらに限定されない。吸入具、経鼻投与デバイス（例えば噴霧器）、又はミニポンプなどの注入デバイスなどの特定のデバイスとの併用のための包装体も考えられる。キットは、無菌の挿入口を有していてもよい（例えば、容器は、静脈注射用溶液バッグ、又は皮下注射針が貫通可能なストッパを有するバイアルであってもよい）。容器も、無菌の挿入口を有していてもよい（例えば、容器は、静脈注射用溶液バッグ、又は皮下注射針が貫通可能なストッパを有するバイアルであってもよい）。
本明細書に記載のキットは、緩衝剤などのさらなる成分、及び解釈的情報を提供してもよい。通常、キットは、容器、及び容器上の、又は容器に随伴するラベル又は添付文書を含む。一部の実施形態において、本開示は、上記キットの内容物を含む製造品を提供する。
【0051】
一般的技術
本発明の実行には、別段の指定がなければ、当該技術分野の技能の範囲内である分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学及び免疫学の従来の技術が採用される。当該技術は、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition (Sambrook, et al., 1989) Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J. E. Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R. I. Freshney, ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J. P. Mather and P. E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J. B. Griffiths, and D. G. Newell, eds., 1993-8) J. Wiley and Sons; Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Handbook of Experimental Immunology (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. M. Miller and M. P. Calos, eds., 1987); Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel, et al., eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis, et al., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J. E. Coligan et al., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (C. A. Janeway and P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: a practical approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal antibodies: a practical approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using antibodies: a laboratory manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti and J. D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995)などの文献において詳細に説明されている。
本発明の実行には、別段の指定がなければ、当該技術分野の技能の範囲内である分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学及び免疫学の従来の技術が採用される。当該技術は、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition (Sambrook, et al., 1989) Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J. E. Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R. I. Freshney, ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J. P. Mather and P. E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J. B. Griffiths, and D. G. Newell, eds., 1993-8) J. Wiley and Sons; Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Handbook of Experimental Immunology (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. M. Miller and M. P. Calos, eds., 1987); Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel, et al., eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis, et al., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J. E. Coligan et al., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (C. A. Janeway and P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: a practical approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal antibodies: a practical approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using antibodies: a laboratory manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti and J. D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995)などの文献において詳細に説明されている。
【0052】
さらなる検討を行うことなく、当業者は、上記説明に基づいて本発明を最大限に利用できると考えられる。したがって、以下の具体的な実施形態は、単なる例示であり、本開示の他の箇所を限定するものでは決してないと解釈されるべきである。本明細書に引用されるすべての出版物は、本明細書に言及される目的又は主題のために参照により組み込まれている。
【実施例】
【0053】
本開示を、その具体的な実施形態を参照しながら説明したが、本開示の真の主旨及び範囲を逸脱することなく、様々な変更を加えることができるとともに同等物と置き換えることができることを当業者は理解するはずである。加えて、特定の状況、材料、組成物、プロセス、１つ以上のプロセス工程を本開示の目的、主旨及び範囲に適応させるために多くの修正を加えることができる。すべての当該修正は、本開示の範囲内であることが意図される。
【0054】
（実施例１）
単球特異的アプタマーの開発
細胞－ＳＥＬＥＸ（指数関数的濃縮によるリガンドの系統的進化）法を使用して、単球に特異的に結合可能なＤＮＡアプタマーを生成した。手短に述べると、１０15の配列を含むｓｓＤＮＡライブラリを、０．１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ及び１ｍｇ／ｍＬのサケ精子ＤＮＡが補給されたＳＥＬＥＸ緩衝剤（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ2、１ｍＭ ＣａＣｌ2及び４０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４）中にてマウス単球細胞株ＲＡＷ２６４．７又はＪ７７４Ａ．１の１０6の陽性細胞とともに３７℃で３０分間インキュベートした。未結合ｓｓＤＮＡをＳＥＬＥＸ緩衝剤による洗浄によって除去した。単球標的化ｓｓＤＮＡを９５℃で１０分間溶出し、ＰＣＲで増幅させた。基礎結合能力を確定するための６回の陽性選択の後、マウス内皮細胞株のＳＶＥＣをＳＥＬＥＸに続く陰性選択のために添加した。１６及び１７サイクル後に、単球標的化ｓｓＤＮＡを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑシステムによる次世代シークエンシング（ＮＧＳ）によって分析した。最後に、約２０回の反復サイクルにわたってＳＥＬＥＸ手法を実行することによって単球特異的アプタマーを選択した。得られたＲＡＷ２６４．７（図１Ａ）及びＪ７７４Ａ．１（図１Ｂ）に特異的なアプタマーをＰＣＲで増幅させた。得られたＲＡＷ２６４．７及びＪ７７４Ａ．１に特異的なアプタマーの結合親和性をフローサイトメトリによって測定した。手短に述べると、５×１０5のＲＡＷ２６４．７又はＪ７７４Ａ．１細胞をブロッキング緩衝剤（ＰＢＳ中２０％ＦＢＳ及び１０％サケ精子ＤＮＡ）中にて４℃で３０分間予備混合した。その後、細胞をブロッキング緩衝剤中にてＣｙ５標識アプタマーの上方段階希釈物（０ｎＭから３００ｎＭ）と４℃で３０分間反応させた。未結合Ｃｙ５標識をＰＢＳ中２％ＦＢＳによる洗浄及び４℃で３分間にわたる３００ｇでの遠心分離によって除去した。最後に、サンプルにフローサイトメトリを施した。図１Ｃは、得られたＲＡＷ２６４．７に特異的なアプタマー（ＡｐｔＲ）の結合親和性を示し、図１Ｄは、得られたＪ７７４Ａ．１に特異的なアプタマー（ＡｐｔＲ）の結合親和性を示す。図１Ｅは、定量的ＰＣＲを使用するインビトロの単球特異的アプタマーの選択を示す。
単球特異的アプタマーの開発
細胞－ＳＥＬＥＸ（指数関数的濃縮によるリガンドの系統的進化）法を使用して、単球に特異的に結合可能なＤＮＡアプタマーを生成した。手短に述べると、１０15の配列を含むｓｓＤＮＡライブラリを、０．１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ及び１ｍｇ／ｍＬのサケ精子ＤＮＡが補給されたＳＥＬＥＸ緩衝剤（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ2、１ｍＭ ＣａＣｌ2及び４０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４）中にてマウス単球細胞株ＲＡＷ２６４．７又はＪ７７４Ａ．１の１０6の陽性細胞とともに３７℃で３０分間インキュベートした。未結合ｓｓＤＮＡをＳＥＬＥＸ緩衝剤による洗浄によって除去した。単球標的化ｓｓＤＮＡを９５℃で１０分間溶出し、ＰＣＲで増幅させた。基礎結合能力を確定するための６回の陽性選択の後、マウス内皮細胞株のＳＶＥＣをＳＥＬＥＸに続く陰性選択のために添加した。１６及び１７サイクル後に、単球標的化ｓｓＤＮＡを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑシステムによる次世代シークエンシング（ＮＧＳ）によって分析した。最後に、約２０回の反復サイクルにわたってＳＥＬＥＸ手法を実行することによって単球特異的アプタマーを選択した。得られたＲＡＷ２６４．７（図１Ａ）及びＪ７７４Ａ．１（図１Ｂ）に特異的なアプタマーをＰＣＲで増幅させた。得られたＲＡＷ２６４．７及びＪ７７４Ａ．１に特異的なアプタマーの結合親和性をフローサイトメトリによって測定した。手短に述べると、５×１０5のＲＡＷ２６４．７又はＪ７７４Ａ．１細胞をブロッキング緩衝剤（ＰＢＳ中２０％ＦＢＳ及び１０％サケ精子ＤＮＡ）中にて４℃で３０分間予備混合した。その後、細胞をブロッキング緩衝剤中にてＣｙ５標識アプタマーの上方段階希釈物（０ｎＭから３００ｎＭ）と４℃で３０分間反応させた。未結合Ｃｙ５標識をＰＢＳ中２％ＦＢＳによる洗浄及び４℃で３分間にわたる３００ｇでの遠心分離によって除去した。最後に、サンプルにフローサイトメトリを施した。図１Ｃは、得られたＲＡＷ２６４．７に特異的なアプタマー（ＡｐｔＲ）の結合親和性を示し、図１Ｄは、得られたＪ７７４Ａ．１に特異的なアプタマー（ＡｐｔＲ）の結合親和性を示す。図１Ｅは、定量的ＰＣＲを使用するインビトロの単球特異的アプタマーの選択を示す。
【0055】
上記の細胞－ＳＥＬＥＸプロセスにより、最良の候補としてのＪ１０アプタマーが得られた。Ｊ１０の配列をスクランブルして対照アプタマーＳ２を得た。得られたＳ２アプタマーは、Ｊ１０アプタマーと同様のヌクレオチド組成を有するが、配列の順序が異なっていた。Ｊ１０及びＳ２の配列を以下の表１に示す。
下線が引かれた配列は、リポソームとハイブリダイズするリンカー配列を示し、イタリック体の配列は、増幅に使用されたアプタマーライブラリにおける共通の（プライマー）配列を示し、太字の配列は、単球に結合可能な結合配列を示し、普通の字体の配列は、スクランブルされたＪ１０配列を示す。
【表1】
【0056】
Ｊ１０はインビトロで単球に選択的に結合可能であるが、Ｓ２はそうでないことを確認するために、まずＪ１０及びＳ２アプタマーを蛍光標識試薬Ｃｙ５（（２Ｚ）－２－［（２Ｅ，４Ｅ）－５－［１－（５－カルボキシペンチル）－３，３－ジメチル－５－スルホインドール－１－イウム－２－イル］ペンタ－２，４－ジエニリデン］－１－エチル－３，３－ジメチルインドール－５－スルホネート）で標識し、次いで単球細胞株ＲＡＷ２６４．７及びＪ７７４Ａ．１とともにインキュベートした。Ｃｙ５標識Ｊ１０及びＳ２も、陰性選択として使用されたマウス内皮細胞株ＳＶＥＣとともにインキュベートした。手短に述べると、５×１０5の各選択細胞株をブロッキング緩衝剤（ＰＢＳ中２０％ＦＢＳ及び１０％サケ精子ＤＮＡ）中にて４℃で３０分間予備混合した。その後、細胞を２００ｎＭ Ｃｙ５－Ｊ１０又はＣｙ５－Ｓ２とブロッキング緩衝剤中にて４℃で３０分間反応させた。最後に、当該技術分野で公知の標準的なプロトコルを使用して、サンプルにフローサイトメトリを施した。図２Ａに示されるように、Ｃｙ５標識Ｊ１０単球（ＲＡＷ２６４．７及びＪ７７４Ａ．１細胞）の割合がＣｙ５標識Ｓ２単球の割合より有意に高く、内皮マウス細胞株ＳＶＥＣにはＣｙ５標識Ｊ１０もＣｙ５標識Ｓ２も検出されなかった。また、ＰＣＲ分析により、心虚血再かん流（Ｉ／Ｒ）モデルにおけるＣｙ５標識Ｊ１０又はＳ２の静脈内注射後の傷害部位に対するＪ１０アプタマーのインビボ標的化能力を確認した（図２Ｂ）。それとともに、図２Ａ及び２Ｂのデータにより、Ｊ１０はインビトロで単球に選択的に結合し、インビボで傷害部位に送達可能であるが、Ｓ２はそうでないことを確認した。
【0057】
Ｊ１０はまたインビボで単球に選択的に結合可能であるが、Ｓ２はそうでないことを確認するために、まず６５５ｎｍで蛍光発光する量子ドット（ＱＤ）ナノ粒子（ＱＤ６５５、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をＪ１０又はＳ２アプタマーで修飾することによってアプタマー－量子ドット結合体を形成した。次いで、Ｓ２又はＪ１０で修飾したＱＤ６５５を使用して、多光子生体イメージングにより、インビボでマウス血管を通過するＪ１０－ＱＤ６５５タグ付き単球を視覚化した。多光子生体イメージングは、Vinegoni et al., Nat. Protoc. 10, 1802-1819 (2015)に記載の手順と同様にして実施された。手短に述べると、米国Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｔａｒｏｔｙから入手した雄の１０～１２週齢のヘテロ接合遺伝子導入マウスＢ６．１２９Ｐ２（Ｃｇ）－Ｃｘ３ｃｒ１tm1Litt／Ｊ（ＣＸ３ＣＲ１GFP/WT）を生体イメージングに使用した。実験中にすべての動物を１．５％イソフルラン（Ｍｉｎｒａｄ）で麻酔した。次いで、Ｊ１０又はＳ２で修飾された２０μＬのＱＤ６５５を１時間にわたってＣＸ３ＣＲ１GFP/WTマウスに注入し、注入したＱＤ６５５プローブの励起後に多光子顕微鏡（ＦＶＭＰＥ－ＲＳ、Ｏｌｙｍｐｕｓ）によって対象の領域を視覚化した。図２Ｃに示されるように、生体イメージングにより、Ｊ１０アプタマーＱＤ６５５では、循環ＣＸ３ＣＲ１－ＧＦＰ+単球に対するインビボ標的化が検出されたが、Ｓ２アプタマーＱＤ６５５では検出されなかった。図２Ｃのデータにより、Ｊ１０はインビボで単球に選択的に結合可能であるが、Ｓ２はそうでないことを確認した。
【0058】
Ｊ１０結合は、インビトロでヒト単球に対して選択的であるが、Ｓ２結合はそうでないことを確認するために、Ｃｙ５標識Ｊ１０及びＳ２も、ヒト単球細胞株、ＴＨＰ－１及びＵ９３７、並びに陰性対照として使用したヒト臍帯内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）とともにインキュベートした。手短に述べると、５×１０5の各選択細胞株をブロッキング緩衝剤（ＰＢＳ中２０％ＦＢＳ及び１０％サケ精子ＤＮＡ）中にて４℃で３０分間予備混合した。その後、細胞を２００ｎＭ Ｃｙ５－Ｊ１０又はＣｙ５－Ｓ２とブロッキング緩衝剤中にて４℃で３０分間反応させた。最後に、当該技術分野で公知の標準的なプロトコルを使用して、サンプルにフローサイトメトリを施した。図３に示されるように、Ｊ１０アプタマーは、ヒト単球細胞株ＴＨＰ－１及びＵ９３７に対しても高い結合親和性を有するが、ヒト内皮細胞株ＨＵＶＥＣに対してはそうでないことが示されたのに対して、Ｓ２は、試験された細胞株のいずれにおいても結合親和性を有さなかった。
【0059】
エキソビボ結合特異性及び親和性を試験するために、健常マウスの末梢血液１００μＬを顎下腺静脈から採取し、ＥＤＴＡ含有抗凝血チューブ（ＢＤ Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ）に回収し、２ｍＬのＡＣＫ溶解緩衝剤とともに１０分間インキュベートして赤血球を溶解させた。その後、ＰＢＳ中２％ＦＢＳを添加して反応を停止させた。（４℃にて３分間にわたる３００ｇでの）遠心分離後、上澄みを除去した。２０分間のインキュベーション後に、１００万個の細胞をＣＤ１６／ＣＤ３２Ｆｃブロッキング抗体（１：１００）によりブロックした。次いで、細胞を４℃で３０分間にわたってＣＤ４５（ＰＥ－Ｃｙ７、１：１００ Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＣＤ１１ｂ（ＰＥ、１：２００ Ｂｉｏｌｅｇｎｄ）及び２μＭのＣｙ５－Ａｐｔに対して染色した。最後に、細胞をＰＢＳ中２％ＦＢＳで洗浄し、当該技術分野で公知の標準的なプロトコルを使用して細胞にフローサイトメトリを施した。図２Ｄに示されるように、Ｊ１０アプタマーは、循環骨髄細胞（ＣＤ４５+ＣＤ１１ｂ+細胞）に対する高い親和性を保有していた。
それとともに、実施例１に示されるデータは、細胞－ＳＥＬＥＸ法により識別されたＪ１０アプタマーが、マウス及びヒト循環単球の両方に良好な親和性で選択的に結合できることを証明している。
それとともに、実施例１に示されるデータは、細胞－ＳＥＬＥＸ法により識別されたＪ１０アプタマーが、マウス及びヒト循環単球の両方に良好な親和性で選択的に結合できることを証明している。
【0060】
（実施例２）
アプタマーベースの脂質ナノ粒子標的化システムの形成
リンカー－ＰＥＧ－ＤＳＰＥ結合体の合成及び精製。ＴＣＥＰ（トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン）（１．５ｍＭ、ｐＨ＝７．０）をジスルフィド標識ＤＮＡ（モル比＝１００：１）とともに４℃で終夜インキュベートした。リンカー－ＤＮＡを、－８０℃で３０分間にわたって３倍の低温エタノール及び０．１倍の低温酢酸ナトリウム（３Ｍ）を使用して沈殿させた後、１７，０００ｒｐｍで後続の遠心分離を行った。次いで、リンカー－ＤＮＡを、ＴＣＥＰとともに４℃で終夜インキュベートすることによって１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［マレイミド（ポリエチレングリコール）－２０００］（Ｍａｌ－ＰＥＧ－ＤＳＰＥ、Ａｖａｎｔｉ）と結合させ（リンカー－ＤＮＡ：ＴＣＥＰ：Ｍａｌ－ＰＥＧ－ＤＳＰＥのモル比＝１：１０：２０）、凍結乾燥により乾燥させた。最後に、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用して、リンカー－脂質を精製し、アセトニトリル（ＡＣＮ）及び酢酸トリエチルアンモニウム（ＴＥＡＡ）系における遊離リンカー－ＳＨ及び遊離Ｍａｌ－脂質を除去した。Ｃ５カラム（Ｓｉｇｍａ）により移動相を１ｍＬ／分の流量にて４０分以内に２０％ＡＣＮから１００％ＡＣＮで開始させた。各工程後に質量分析を実施して、当該分野で公知の標準的なプロトコルを使用して合成が順調であることを確認した（図４Ａ～４Ｃ）。
アプタマーベースの脂質ナノ粒子標的化システムの形成
リンカー－ＰＥＧ－ＤＳＰＥ結合体の合成及び精製。ＴＣＥＰ（トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン）（１．５ｍＭ、ｐＨ＝７．０）をジスルフィド標識ＤＮＡ（モル比＝１００：１）とともに４℃で終夜インキュベートした。リンカー－ＤＮＡを、－８０℃で３０分間にわたって３倍の低温エタノール及び０．１倍の低温酢酸ナトリウム（３Ｍ）を使用して沈殿させた後、１７，０００ｒｐｍで後続の遠心分離を行った。次いで、リンカー－ＤＮＡを、ＴＣＥＰとともに４℃で終夜インキュベートすることによって１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［マレイミド（ポリエチレングリコール）－２０００］（Ｍａｌ－ＰＥＧ－ＤＳＰＥ、Ａｖａｎｔｉ）と結合させ（リンカー－ＤＮＡ：ＴＣＥＰ：Ｍａｌ－ＰＥＧ－ＤＳＰＥのモル比＝１：１０：２０）、凍結乾燥により乾燥させた。最後に、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用して、リンカー－脂質を精製し、アセトニトリル（ＡＣＮ）及び酢酸トリエチルアンモニウム（ＴＥＡＡ）系における遊離リンカー－ＳＨ及び遊離Ｍａｌ－脂質を除去した。Ｃ５カラム（Ｓｉｇｍａ）により移動相を１ｍＬ／分の流量にて４０分以内に２０％ＡＣＮから１００％ＡＣＮで開始させた。各工程後に質量分析を実施して、当該分野で公知の標準的なプロトコルを使用して合成が順調であることを確認した（図４Ａ～４Ｃ）。
【0061】
脂質ナノ粒子の製造及びそれらの装填。マレイミド含有ＤＳＰＥ－ＰＥＧに容易に付着するチオール化リンカーを使用することによって脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を合成した。具体的には、ＤＳＰＣ、コレステロール及びＤＳＰＥ－ＰＥＧをクロロホルムに溶解させ、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ－リンカー及びＤｉＤをメタノールに溶解させることによって（モル比＝４５：５０：０．０４７：０．００３：０．００５）、丸底フラスコに脂質膜（総質量＝３５ｍｇ）を調製した。溶媒を室温で減圧除去し、脂質膜を終夜凍結乾燥した。
対象の治療薬を、ＬＮＰへの装填のために添加した。例示的な方法において、膀胱がん、膵臓がん、卵巣がん及び乳がん並びに非小細胞肺がんを治療するために使用される化学療法薬であるゲムシタビン（「Ｇｅｍ」、Ｇｅｍｚａｒ（登録商標）としても公知）を対象の治療薬として使用した。Ｇｅｍ－ＬＮＰの作製には、乾燥膜をＰＢＳ溶液中１ｍｇのゲムシタビン（７５ｍｇ／ｍｌ）によって水和させて、多重層ビヒクル（ＭＬＶ）リンカー－Ｇｅｍ－ＬＮＰを形成した。乾燥膜を完全に溶解させた後、液体窒素及び６５℃の水槽を使用する真空下での１０回の凍結・解凍サイクルによってＭＬＶのサイズを小さくした。プローブ超音波処理器を使用して、一連の２秒の超音波処理及び１０秒の休止により合計２分間にわたってリンカー－Ｇｅｍ－ＬＮＰを超音波処理した。次いで、リンカー－Ｇｅｍ－ＬＮＰを、０．１μｍのポリカーボネート膜を通して６５℃で２１回押し出し、４℃で終夜保管した。ＰＢＳを含むＣＬ－４Ｂサイズ排除カラムを移動相として使用することによりリンカー－Ｇｅｍ－ＬＮＰを精製した。
対象の治療薬を、ＬＮＰへの装填のために添加した。例示的な方法において、膀胱がん、膵臓がん、卵巣がん及び乳がん並びに非小細胞肺がんを治療するために使用される化学療法薬であるゲムシタビン（「Ｇｅｍ」、Ｇｅｍｚａｒ（登録商標）としても公知）を対象の治療薬として使用した。Ｇｅｍ－ＬＮＰの作製には、乾燥膜をＰＢＳ溶液中１ｍｇのゲムシタビン（７５ｍｇ／ｍｌ）によって水和させて、多重層ビヒクル（ＭＬＶ）リンカー－Ｇｅｍ－ＬＮＰを形成した。乾燥膜を完全に溶解させた後、液体窒素及び６５℃の水槽を使用する真空下での１０回の凍結・解凍サイクルによってＭＬＶのサイズを小さくした。プローブ超音波処理器を使用して、一連の２秒の超音波処理及び１０秒の休止により合計２分間にわたってリンカー－Ｇｅｍ－ＬＮＰを超音波処理した。次いで、リンカー－Ｇｅｍ－ＬＮＰを、０．１μｍのポリカーボネート膜を通して６５℃で２１回押し出し、４℃で終夜保管した。ＰＢＳを含むＣＬ－４Ｂサイズ排除カラムを移動相として使用することによりリンカー－Ｇｅｍ－ＬＮＰを精製した。
【0062】
脂質ナノ粒子とアプタマーとの結合。例示的な方法において、４℃での終夜のインキュベーションによりリンカー－Ｇｅｍ－ＬＮＰを個別的にＪ１０及びＳ２アプタマーと結合させた後（アプタマー：リンカー＝２．５：１）、ＰＢＳを含むセファロースＣＬ－４Ｂサイズ排除カラムを移動相として使用して精製した。アプタマー－リポソームの作製のためのリンカーとアプタマーの効率的な比率を、以下の式を使用してハイブリダイゼーション効率の割合として測定した。
【0063】
【数1】
【表2】
【0064】
低温電子顕微鏡法を実施して、脂質ナノ粒子を視覚化した。手短に述べると、穴あき炭素膜で被覆された２００メッシュ銅グリッド（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を炭素側で１５秒間グロー放電させた。脂質を１５μＭの濃度で含むサンプル（４μＬ）をグリッド上にピペット採取した後、湿度１００％にて４℃で３秒間ブロッティングし、Ｖｉｔｒｏｂｏｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して液体窒素により冷却された液体エタン中にプランジ凍結させた。グリッドを液体窒素下で保管し、クライオステージを使用して電子顕微鏡に移した。７０μｍの対物口径を有する２００ｋｅＶのＴｅｃｎａｉ Ｆ２０電子顕微鏡（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用することによって、炭素膜における穴の中のリポソームの画像を得た。各露光の低線量条件は、約２５ｅ-／Å2とした。画像を２μｍデフォーカスで撮り、４ｋ×４ｋ ＣＣＤカメラ（Ｇａｔａｎ、米国）に記録した。低温電子顕微鏡により、ゲムシタビンの封入が順調であることを確認した（図５Ａ）。
【0065】
生体に存在しないためゲムシタビンに由来するものと考えられるＮＭＲ活性19Ｆ原子核を観察することによるゲムシタビンの定量のための最適な方法として、核磁気共鳴（ＮＭＲ）を使用した。Olive et al., Science. 324, 1457-1461 (2009)及びBapiro et al., Cancer Chemother. Pharmacol. 68, 1243-1253 (2011)。ＮＭＲによるゲムシタビン封入定量のためのサンプルを調製するために、まず脂質ナノ粒子（脂質濃度１μＭ）をアセトニトリル／Ｄ2Ｏ（３０：７０）に溶解させ、１ｍｇ／ｍＬの内部標準の２－フルオロ－２’－デオキシアデノシン（２Ｆ２ｄＡ、Ｓｉｇｍａ）でスパイクし、１Ｎ ＨＣｌでｐＨ５に調整し、次いで測定のための５ｍｍのＮＭＲチューブに移した。いずれの19Ｆ－ＮＭＲ測定もＢｒｕｋｅｒ Ａｖａｎｃｅ５００ＡＶ（５００ＭＨｚ、１１．７Ｔ）ＮＭＲスペクトロメータで実施し、いずれのスペクトルの取得にもＱＮＰクライオプローブを使用した。１６０ｐｐｍのスペクトル掃引幅、３２，７６８ポイント、２，０４８スキャン、０．２秒の取得時間及び３秒の弛緩遅延で１Ｄ 19Ｆ ＮＭＲ（４７０ＭＨｚ）スペクトルを取得した。内部参照化合物の２Ｆ２ｄＡを、－１１６．３３ｐｐｍにゲムシタビン（ｄＦｄＣ）ピークを示す－５２．０６ｐｐｍの化学シフトに割り当てた。得られた磁場誘導減衰（ＦＩＤ）を６５，５３６ポイントにゼロ充填し、指数ウインドウ関数を使用して処理し、位相化し、基線補正した。定量のために標準及びゲムシタビンピークに注意深く統合した。19Ｆ－ＮＭＲ分光法により、ゲムシタビンの封入が順調であることを確認した（図５Ｂ）。
【0066】
ＨＰＬＣ分析も脂質ナノ粒子に対して実施した。手短に述べると、測定のために脂質ナノ粒子をＡＣＮ／Ｈ2Ｏ（３０：７０）に溶解させた。分離は、３５℃でＸ－ブリッジＣ１８カラムにて１ｍＬ／分の流量のＡＣＮ／Ｈ2Ｏ（３０：７０）を使用してＷａｔｅｒｓ ｅ２６９５分離モジュールにより実施した。検出は、２７２ｎｍでＷａｔｅｒｓ２４８９ＵＶ／Ｖｉｓ検出器を使用して実施した。ＨＰＬＣ分析により、ゲムシタビンの封入が順調であることを確認した（図５Ｃ）。
次いでアプタマーを含む場合及び含まない場合のＬＮＰを、サイズ及びゼータ電位測定のために特徴づけた。いずれのサイジング及びゼータ電位測定も２５℃にてＺｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳで行った。サイジング測定をそのままのリポソームサンプルで実施したのに対して、ゼータ電位測定ではサンプルをＰＢＳで１０倍に希釈した。例示的な例において、表３に示されるように、Ｊ１０アプタマーを含む場合及び含まない場合のゲムシタビン担持ＬＮＰについてのサイズ及びゼータ電位測定値を収集した。
次いでアプタマーを含む場合及び含まない場合のＬＮＰを、サイズ及びゼータ電位測定のために特徴づけた。いずれのサイジング及びゼータ電位測定も２５℃にてＺｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳで行った。サイジング測定をそのままのリポソームサンプルで実施したのに対して、ゼータ電位測定ではサンプルをＰＢＳで１０倍に希釈した。例示的な例において、表３に示されるように、Ｊ１０アプタマーを含む場合及び含まない場合のゲムシタビン担持ＬＮＰについてのサイズ及びゼータ電位測定値を収集した。
【0067】
【表3】
アプタマーを含む特異性脂質ナノ粒子の特徴づけ。封入されたゲムシタビンが腫瘍細胞を殺すことができることを確認するために、細胞毒性アッセイを実施した。手短に述べると、19Ｆ－ＮＭＲを使用してゲムシタビンを定量した後、特定のゲムシタビン濃度のＪ１０－Ｇｅｍ－ＬＮＰ、Ｓ２－Ｇｅｍ－ＬＮＰ、Ｇｅｍ－ＬＮＰ又はゲムシタビンをマウス膵臓がん細胞株由来の細胞のＫＰＣとともに４８時間インキュベートした。メーカー（Ｓｉｇｍａ）の取扱説明書に従って細胞カウンティングキット－８を使用して、生存率アッセイを実施した。図５Ｄに示されるように、ＫＰＣ細胞において、アプタマー標識ＬＮＰに封入されたゲムシタビンは、未封入のゲムシタビンより細胞毒性が低かった。
【0068】
マウス単球細胞株Ｊ７７４Ａ．１及びＲＡＷ２６４．７並びにマウス内皮細胞株ＳＶＥＣに対するアプタマー－Ｇｅｍ－ＬＮＰのインビトロ結合親和性を測定した。手短に述べると、５×１０5の各選択細胞株をブロッキング緩衝剤（ＰＢＳ中２０％ＦＢＳ及び１０％サケ精子ＤＮＡ）中にて４℃で３０分間予備混合した。その後、細胞を５μＭのＤｉＤ標識Ｊ１０－Ｇｅｍ－ＬＮＰ、ＤｉＤ標識Ｓ２－Ｇｅｍ－ＬＮＰ又はＤｉＤ標識Ｇｅｍ－ＬＮＰとブロッキング緩衝剤中にて４℃で３０分間反応させた。未結合アプタマー－Ｇｅｍ－ＬＮＰをＰＢＳ中２％ＦＢＳによる洗浄及び４℃で３分間にわたる３００ｇでの遠心分離によって除去した。最後に、サンプルにフローサイトメトリを施した。図５Ｅは、Ｊ１０装飾ＬＮＰが、Ｓ２－及び非装飾ＬＮＰと比較してより高効率で単球に結合することが可能であることを示す。
【0069】
（実施例３）
循環単球の増強及び腫瘍部位への動員
膵管腺癌（ＰＤＡＣ）の治療のための治療薬の送達に最も効率的な時点を判断するために、米国Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｔａｒｏｔｙから入手した雄の６～８週齢のヘテロ接合遺伝子導入マウスＢ６．１２９（Ｃｇ）－Ｃｃｒ２tm2.1Ifc／Ｊ（ＣＣＲ２RFP/WT）のＰＤＡＣモデルを使用して単球動員プロファイルを構築した。
マウスＰＤＡＣモデルを生成するために、同所腫瘍移植法を使用した。手短に述べると、２０μＬの無菌ＰＢＳに懸濁された５×１０5の生ＫＰＣ細胞を、Kim et al., Nat. Protoc. 4, 1670-1680 (2009)及びChai et al., J. Vis. Exp. (2013)に開示されている方法と同様にして、６～８週齢のＣＣＲ２RFP/WTマウスに、膵尾から２～３ｍｍ付近に膵臓内注射によって投与した。
循環単球の増強及び腫瘍部位への動員
膵管腺癌（ＰＤＡＣ）の治療のための治療薬の送達に最も効率的な時点を判断するために、米国Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｔａｒｏｔｙから入手した雄の６～８週齢のヘテロ接合遺伝子導入マウスＢ６．１２９（Ｃｇ）－Ｃｃｒ２tm2.1Ifc／Ｊ（ＣＣＲ２RFP/WT）のＰＤＡＣモデルを使用して単球動員プロファイルを構築した。
マウスＰＤＡＣモデルを生成するために、同所腫瘍移植法を使用した。手短に述べると、２０μＬの無菌ＰＢＳに懸濁された５×１０5の生ＫＰＣ細胞を、Kim et al., Nat. Protoc. 4, 1670-1680 (2009)及びChai et al., J. Vis. Exp. (2013)に開示されている方法と同様にして、６～８週齢のＣＣＲ２RFP/WTマウスに、膵尾から２～３ｍｍ付近に膵臓内注射によって投与した。
【0070】
ＰＤＡＣの確立後の循環単球の数を５時間目（５ｈ）並びに１、４、７、１４、２１、３５及び４２日目に全血球計算（ＣＢＣ）により判断した。ＫＰＣ腫瘍細胞移植後の循環ＲＦＰ+単球の数が増加して、ＫＰＣ腫瘍細胞移植後７日目に最大量に達することがデータにより示された（図６）。
移植が順調であり、単球が動員されていることがインビボイメージングシステム（ＩＶＩＳ）イメージングによって確認された。マウスＫＰＣ膵臓がん細胞株が同所移植されたＣＣＲ２－ＲＦＰ遺伝子導入マウスにおいて、腫瘍へのＣＣＲ２－ＲＦＰ+単球動員の分析をインビボイメージングシステム（ＩＶＩＳ）イメージングによって実施した。マウスＫＰＣ膵臓がん細胞株を、検出を容易にするためにルシフェラーゼを発現するように改質した。手短に述べると、ルシフェリン基質１２０μｇ／ｇ（ＢｉｏＳｙｎｔｈ Ｃａｔ：Ｌ－８８２０）を腹腔内注入した。イソフルラン吸入によりマウスに麻酔し、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＩＶＩＳスペクトルを使用して１分間隔で反復ＩＶＩＳ画像を取得した。分析のために最も強い発光信号の時点を選択した。腫瘍移植が順調であり、単球細胞が腫瘍部位に動員されたことによって（図７Ａ及び７Ｂ）、ＣＣＲ－ＲＦＰ+単球が注入部位においてはっきりと確認された（図７Ｃ）ことがＩＶＩＳイメージングにより明らかになった。
移植が順調であり、単球が動員されていることがインビボイメージングシステム（ＩＶＩＳ）イメージングによって確認された。マウスＫＰＣ膵臓がん細胞株が同所移植されたＣＣＲ２－ＲＦＰ遺伝子導入マウスにおいて、腫瘍へのＣＣＲ２－ＲＦＰ+単球動員の分析をインビボイメージングシステム（ＩＶＩＳ）イメージングによって実施した。マウスＫＰＣ膵臓がん細胞株を、検出を容易にするためにルシフェラーゼを発現するように改質した。手短に述べると、ルシフェリン基質１２０μｇ／ｇ（ＢｉｏＳｙｎｔｈ Ｃａｔ：Ｌ－８８２０）を腹腔内注入した。イソフルラン吸入によりマウスに麻酔し、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＩＶＩＳスペクトルを使用して１分間隔で反復ＩＶＩＳ画像を取得した。分析のために最も強い発光信号の時点を選択した。腫瘍移植が順調であり、単球細胞が腫瘍部位に動員されたことによって（図７Ａ及び７Ｂ）、ＣＣＲ－ＲＦＰ+単球が注入部位においてはっきりと確認された（図７Ｃ）ことがＩＶＩＳイメージングにより明らかになった。
【0071】
単球に対するアプタマー－Ｇｅｍ－ＬＮＰのインビボ結合特異性において、リンパ球及び顆粒球をフローサイトメトリによって評価した。手短に述べると、Ｊ１０－Ｇｅｍ－ＬＮＰ、Ｓ２－Ｇｅｍ－ＬＮＰ又はＧｅｍ－ＬＮＰの１０日目での投与後、５０μＬの末梢血液を顎下腺静脈からＥＤＴＡ含有抗凝血チューブ（ＢＤ Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ）に回収した。Ｆｃ受容体を２０分間にわたって全血１０μＬ当たり０．１μｇのＣＤ１６／ＣＤ３２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によってブロックした。ＰＢＳにＣＤ１１ｂ ＰＥ（１：５０、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）及びＣＤ４５ＰＥ－Ｃｙ７（１：５０、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を含む染色液（合計４５μＬ）を調製し、それにＦｃ受容体がブロックされた全血５μＬを添加した。懸濁液を３０分間インキュベート及び遮光した。次いで、Ｔｈｅｒｍｏ Ａｔｔｕｎｅ（登録商標）音響集束サイトメータでのフローサイトメトリ測定の直前にＰＢＳ（２ｍＬ）をチューブに加えた。Ｊ１０装飾ＬＮＰは、Ｓ２及び非装飾ＬＮＰと比較して、より効率的に単球に結合することが可能であることがデータにより示された（図８Ａ及び８Ｄ）。加えて、Ｊ１０装飾ＬＮＰは、リンパ球（図８Ｂ及び８Ｅ）にも顆粒球（図８Ｃ及び８Ｆ）にも優先的に結合しなかった。
【0072】
インビボイメージングシステム（ＩＶＩＳ）イメージングを使用して腫瘍組織内の全ゲムシタビンを定量した。手短に述べると、ＰＤＡＣモデルマウスを、ＤｉＤが親油性シアニン染料であるＤｉＤ標識Ｇｅｍ－ＬＮＰ、ＤｉＤ標識Ｓ２標識Ｇｅｍ－ＬＮＰ又はＤｉＤ標識Ｊ１０標識Ｇｅｍ－ＬＮＰで処置してから２４時間後に組織を採取した。次いで、採取された組織をＤｉＤ強度に対するＩＶＩＳで視覚化した。（ＬＮＰ投与の２４時間後の）採取された腫瘍組織のＩＶＩＳ分析により、Ｊ１０ナノ粒子の蓄積が有意により大きいことが示された（図９Ａ及び９Ｂ）。
【0073】
腫瘍組織内の全ゲムシタビンも、19Ｆ ＮＭＲを使用して定量した。まず、ＰＤＡＣモデルマウスをＧｅｍ単独、Ｇｅｍ－ＬＮＰ、Ｓ２標識Ｇｅｍ－ＬＮＰ又はＪ１０標識Ｇｅｍ－ＬＮＰで処置してから２４時間後の解剖時に、組織を採取し、急速凍結し、質量測定した。次に、４倍の体積の氷冷アセトニトリルを加えてサンプルを均質化した。（アセトニトリルと）同体積の氷冷水をサンプルに加え、次いでそれらを氷上で１０分間インキュベートした。サンプルを１４，０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離した。上澄みを耐寒性バイアルに移し、液体窒息で急速凍結した。サンプルを凍結乾燥器に移し、少なくとも２４時間乾燥させた。（少なくとも１００ｍｇの湿質量の組織からの）凍結乾燥腫瘍組織抽出物を２００μＬのＤ2Ｏに再懸濁させ、０．１ｍｇの内部標準の２Ｆ２ｄＡでスパイクし、１Ｎ ＨＣｌでｐＨ５に調整し、次いで測定のための５ｍｍのＳｈｉｇｅｍｉ ＮＭＲチューブに移した。いずれの19Ｆ ＮＭＲ測定もＢｒｕｋｅｒ Ａｖａｎｃｅ ５００ＡＶ（５００ＭＨｚ、１１．７Ｔ）ＮＭＲスペクトロメータで実施し、いずれのスペクトルの取得にもＱＮＰクライオプローブを使用した。１６０ｐｐｍのスペクトル掃引幅、３２，７６８ポイント、２，０４８スキャン、０．２秒の取得時間及び３秒の弛緩遅延で１Ｄ 19Ｆ ＮＭＲ（４７０ＭＨｚ）スペクトルを取得した。内部参照化合物の２Ｆ２ｄＡを、－１１６．３３ｐｐｍにゲムシタビン（ｄＦｄＣ）ピークを示す－５２．０６ｐｐｍ9の化学シフトに割り当てた。得られた磁場誘導減衰（ＦＩＤ）を６５，５３６ポイントにゼロ充填し、指数ウインドウ関数を使用して処理し、位相化し、基線補正した。定量のために標準及びゲムシタビンピークに注意深く統合した。19Ｆ ＮＭＲを使用する腫瘍組織内の全ゲムシタビンの定量により、Ｊ１０群では、２４時間後にゲムシタビンの蓄積が最大になることが明らかになった（図１０）。
総合すると、ゲムシタビン装填ナノ粒子は、腫瘍を標的とすることが可能であり、Ｊ１０装飾ナノ粒子が最大の効率を有することがこれらのデータにより示される。
総合すると、ゲムシタビン装填ナノ粒子は、腫瘍を標的とすることが可能であり、Ｊ１０装飾ナノ粒子が最大の効率を有することがこれらのデータにより示される。
【0074】
（実施例４）
がん治療における薬物装填脂質ナノ粒子の治療的使用
マウス膵臓がんモデルにおいて、ゲムシタビン装填ナノ粒子の治療効果を評価した（図１１Ａ）。手短に述べると、以上の例に記載されているように、ルシフェラーゼを含むＫＰＣ細胞をマウスに注入した。細胞注入後、ＩＶＩＳを使用して腫瘍成長を毎週モニタリングした。腫瘍が１００ｍｍ2に達すると、１００ｍｍ2の腫瘍の識別から０日目、３日目及び６日目に、マウスに５ｍＭの１００μＬのＧｅｍ－ＬＮＰ、Ｓ２－ｇｅｍ－ＬＮＰ、Ｊ１０－Ｇｅｍ－ＬＮＰ、ＰＢＳ又はＧｅｍを注入した。
ＰＤＡＣマウスモデルにおけるアポトーシスに対するアプタマー標識Ｇｅｍ－ＬＮＰ処置の効果を評価するために、ＴＵＮＥＬ（末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼｄＵＴＰニック末端標識）染色を実施した。手短に述べると、０日目の脂質ナノ粒子の投与の１０日後にマウスから腫瘍を回収した。サンプルを４％ｗ／ｖのＰＦＡで終夜固定し、パラフィンに包埋し、薄片化した。ＡｐｏｐＴａｇ Ｒｅｄインサイツアポトーシス検出キット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）をメーカーの取扱説明書に従って使用してスライドにＴＵＮＥＬ染色を施した。二重染色細胞をパノラマ式２５０ＦＬＡＳＨ ＩＩで撮像し、ＣａｓｅＶｉｅｗｅｒ２．０で定量した。図１１Ｂに示されるように、Ｊ１０－Ｇｅｍ－ＬＮＰで処置すると、Ｓ２－Ｇｅｍ－ＬＮＰと比較して、腫瘍細胞アポトーシスが有意に増大した。
がん治療における薬物装填脂質ナノ粒子の治療的使用
マウス膵臓がんモデルにおいて、ゲムシタビン装填ナノ粒子の治療効果を評価した（図１１Ａ）。手短に述べると、以上の例に記載されているように、ルシフェラーゼを含むＫＰＣ細胞をマウスに注入した。細胞注入後、ＩＶＩＳを使用して腫瘍成長を毎週モニタリングした。腫瘍が１００ｍｍ2に達すると、１００ｍｍ2の腫瘍の識別から０日目、３日目及び６日目に、マウスに５ｍＭの１００μＬのＧｅｍ－ＬＮＰ、Ｓ２－ｇｅｍ－ＬＮＰ、Ｊ１０－Ｇｅｍ－ＬＮＰ、ＰＢＳ又はＧｅｍを注入した。
ＰＤＡＣマウスモデルにおけるアポトーシスに対するアプタマー標識Ｇｅｍ－ＬＮＰ処置の効果を評価するために、ＴＵＮＥＬ（末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼｄＵＴＰニック末端標識）染色を実施した。手短に述べると、０日目の脂質ナノ粒子の投与の１０日後にマウスから腫瘍を回収した。サンプルを４％ｗ／ｖのＰＦＡで終夜固定し、パラフィンに包埋し、薄片化した。ＡｐｏｐＴａｇ Ｒｅｄインサイツアポトーシス検出キット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）をメーカーの取扱説明書に従って使用してスライドにＴＵＮＥＬ染色を施した。二重染色細胞をパノラマ式２５０ＦＬＡＳＨ ＩＩで撮像し、ＣａｓｅＶｉｅｗｅｒ２．０で定量した。図１１Ｂに示されるように、Ｊ１０－Ｇｅｍ－ＬＮＰで処置すると、Ｓ２－Ｇｅｍ－ＬＮＰと比較して、腫瘍細胞アポトーシスが有意に増大した。
【0075】
ＰＤＡＣマウスモデルにおける増殖に対するアプタマー標識Ｇｅｍ－ＬＮＰ処置の効果を評価するために、採取された腫瘍におけるＫｉ６７+細胞の比率から増殖指数を求めた。手短に述べると、０日目の脂質ナノ粒子の投与の１０日後にマウスから腫瘍を回収した。サンプルを４％ｗ／ｖのＰＦＡで終夜固定し、パラフィンに包埋し、薄片化した。スライドをキシレンで処理し、各等級のアルコールから水に再水和させ、メーカーの取扱説明書に従って抗原回復及びブロッキングを施した。抗Ｋｉ６７（１：５００、ＧｅｎｅＴｅｘ ＧＴＸ１６６６７）抗体を使用して増殖アッセイを実施した。ブロッキング緩衝剤で希釈した一次抗体を４℃で終夜付加した。スライドをＰＢＳで３回洗浄した。二次抗体のヤギ抗ウサギＩｇＧ－ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５６８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ａ－１１０１１）を室温で１時間にわたって検体に付加した。少なくとも３つの個別の薄片を調べ、薄片ごとに少なくとも３つの画像を取り込んだ。二重染色細胞をパノラマ式２５０ＦＬＡＳＨ ＩＩで撮像し、ＣａｓｅＶｉｅｗｅｒ（ＣａｓｅＶｉｗｅｒ）２．０で定量した。図１１Ｃに示されるように、Ｊ１０－Ｇｅｍ－ＬＮＰで処置すると、Ｓ２－Ｇｅｍ－ＬＮＰと比較して、腫瘍細胞の増殖が有意に低減された。
【0076】
６日目のＬＮＰの第３の処置の後に、ＩＶＩＳを使用して腫瘍成長の進行を毎週モニタリングした。手短に述べると、ルシフェリン基質１２０μｇ／ｇ（ＢｉｏＳｙｎｔｈ Ｃａｔ：Ｌ－８８２０）を腹腔内注入した。イソフルラン吸入によりマウスに麻酔し、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＩＶＩＳスペクトルを使用して１分間隔で反復ＩＶＩＳ画像を取得した。分析のために最も強い発光信号の時点を選択した。図１１Ｄに示されるように、ＰＤＡＣマウスのＪ１０－Ｇｅｍ－ＬＮＰ処置群は、腫瘍のサイズが最も小さく、腫瘍成長が抑制されていることを示していた。同様に、ｆＭＲＩによって腫瘍成長もモニタリングした。手短に述べると、８０μ秒で３００ｍＴ／ｍの活性遮蔽勾配を有する水平７．０Ｔスペクトロメータ（ＰｈａｒｍａＳｃａｎ７０／１６、Ｂｒｕｋｅｒ、ドイツ）を使用して動物をＭＲＩ検査した。内径が３８ｎｍのボリュームコイルを高周波励起及びシグナル検出の両方に使用した。ＦＯＶ＝４．０ｃｍ、スライス厚さ＝１．０ｍｍ、２０スライス、ＴＲ＝５，５００ミリ秒、ＴＥ＝６０ミリ秒、エコートレイン長さ＝８、ＮＥＸ＝５及びマトリックスサイズ＝２５６×２５６の高速スピンエコーシーケンスを使用して、Ｔ２ＷＩ軸方向像及び冠状像を個々に取得した。図１１Ｅに示されるように、ＰＤＡＣマウスのＪ１０－Ｇｅｍ－ＬＮＰ処置群は、腫瘍サイズが最も小さく、腫瘍成長が抑制されていることを示していた。死亡日（４８日目）の腫瘍組織の質量も測定したところ、結果（図１１Ｆ）は、ＩＶＩＳ及びｆＭＲＩの結果と一致していた。
【0077】
ゲムシタビン装填ナノ粒子についての体重測定（図１１Ｇ）により、処置は体重に影響しないことが示された。ゲムシタビン装填ナノ粒子の肝臓及び腎臓機能に対する効果についても評価した。手短に述べると、処置（ＰＤＡＣモデルではＪ１０－Ｇｅｍ－ＬＮＰ、Ｓ２－Ｇｅｍ－ＬＮＰ、Ｇｅｍ－ＬＮＰ又はゲムシタビン）の７日後に下顎腺静脈から末梢血液を回収し、１５分間かけて凝固させた。生化学試験による腎臓毒性及び肝臓毒性評価のために血清を回収した。肝臓機能についてはＡＳＴ（アスパラギン酸トランスアミナーゼ）、ＡＬＴ（アラニントランスアミナーゼ）及びＡＬＰ（アルカリホスファターゼ）を測定し、腎臓機能評価ではＢＵＮ（血中尿素窒素）及びＣＲＥＡ（クレアチン）を測定した。図１２Ａ～１２Ｅに示されるように、ゲムシタビン装填ナノ粒子は、肝臓又は腎臓機能を損なわなかった。
【0078】
これらの結果をすべて合わせると、ＰＤＡＣのマウスモデルにおいて、本発明者らのナノ粒子は、順調に腫瘍部位を標的とし、腫瘍細胞アポトーシスを増大させ、腫瘍細胞増殖及び成長を低減し、マウスの生存を全体的に長くしたことを示した（図１１Ｈ）。
膵臓がんの最も一般的な転移部位の１つは肝臓であるため、肝臓転移のあるマウスモデル膵臓がんを使用して本発明者らのナノ粒子の効能をさらに調べた。これらの試験についての動物モデルを調製するために、２０μＬの無菌ＰＢＳに懸濁された５×１０5の生ＫＰＣ細胞を、６～８週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの膵尾から２～３ｍｍ付近に膵臓内注入によって投与した。ＰＤＡＣ肝臓転移モデルでは、１０μＬの無菌ＰＢＳに懸濁された５×１０5の生ＫＰＣ細胞を、ハミルトンシリンジを使用して門脈に注射することによって、同所移植後１０日目にＫＰＣ細胞の注入を行った。ｆＭＲＩを使用した腫瘍体積測定（図１１Ｉ）及びＩＶＩＳを使用した腫瘍サイズ測定（図１１Ｊ）により示されるように、Ｊ１０群では腫瘍成長の進行が同様に抑制された。ＰＤＡＣモデルから得られた結果と同様に、Ｊ１０－ｇｅｍ装填ＬＮＰ処置法は、肝臓転移を標的とし、マウスの生存を高めることも可能であった（図１１Ｋ）。
膵臓がんの最も一般的な転移部位の１つは肝臓であるため、肝臓転移のあるマウスモデル膵臓がんを使用して本発明者らのナノ粒子の効能をさらに調べた。これらの試験についての動物モデルを調製するために、２０μＬの無菌ＰＢＳに懸濁された５×１０5の生ＫＰＣ細胞を、６～８週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの膵尾から２～３ｍｍ付近に膵臓内注入によって投与した。ＰＤＡＣ肝臓転移モデルでは、１０μＬの無菌ＰＢＳに懸濁された５×１０5の生ＫＰＣ細胞を、ハミルトンシリンジを使用して門脈に注射することによって、同所移植後１０日目にＫＰＣ細胞の注入を行った。ｆＭＲＩを使用した腫瘍体積測定（図１１Ｉ）及びＩＶＩＳを使用した腫瘍サイズ測定（図１１Ｊ）により示されるように、Ｊ１０群では腫瘍成長の進行が同様に抑制された。ＰＤＡＣモデルから得られた結果と同様に、Ｊ１０－ｇｅｍ装填ＬＮＰ処置法は、肝臓転移を標的とし、マウスの生存を高めることも可能であった（図１１Ｋ）。
【0079】
（実施例５）
マウス肺転移モデルにおける黒色腫に対するアプタマー－Ｇｅｍ－ＬＮＰ標的
マウス肺転移モデルにおいてゲムシタビン装填ナノ粒子の治療効果を評価した。手短に述べると、ルシフェラーゼ及びＧＦＰを発現する２×１０5のＢ１６Ｆ１０細胞（黒色腫マウス腫瘍細胞株）を８週齢の雄のＣ５７ＢＬ／６マウスに１４日にわたって静脈内注入して、肺転移を確立した。１４日後、肺を免疫組織及びＮＭＲ分析のために採取する前に、Ｇｅｍ、Ｇｅｍ－ＬＮＰ、又はアプタマー標識Ｇｅｍ－ＬＮＰ（Ｊ１０－Ｇｅｍ－ＬＮＰ及びＳ２－Ｇｅｍ－ＬＮＰ）の１つを６時間にわたってマウスに静脈内注入した。図１３Ａに示されるように、単球細胞マーカーに対する免疫染色が肺においてＧＦＰ発現Ｂ１６Ｆ１０細胞と共局在化していたため、マウスモデルにおける肺の転移性黒色腫に単球が動員されたことが実証された。マウスから採取された腫瘍組織内の全ゲムシタビンを、本明細書に記載される方法で19Ｆ ＮＭＲを使用して定量することにより、Ｊ１０群では、６時間後に転移性黒色腫におけるゲムシタビンの蓄積が最大になったことが明らかになった（図１３Ｂ）。
他の実施形態
本明細書に開示されるすべての特徴は、任意の組合せで組み合わされてもよい。本明細書に開示される各特徴は、同様、同等又は類似の目的を担う代替的な特徴で置き換えられてもよい。したがって、明示的に別段の指示がない限り、開示される各特徴は、包括的な同等又は類似の特徴のシリーズの一例に過ぎない。
上記説明から、当業者は、本発明の基本的な特性を容易に確認し、その主旨及び範囲を逸脱することなく、本発明の様々な変更及び修正を加えて、それを様々な使用法及び条件に適応させることが可能である。したがって、他の実施形態も特許請求の範囲内にある。
マウス肺転移モデルにおける黒色腫に対するアプタマー－Ｇｅｍ－ＬＮＰ標的
マウス肺転移モデルにおいてゲムシタビン装填ナノ粒子の治療効果を評価した。手短に述べると、ルシフェラーゼ及びＧＦＰを発現する２×１０5のＢ１６Ｆ１０細胞（黒色腫マウス腫瘍細胞株）を８週齢の雄のＣ５７ＢＬ／６マウスに１４日にわたって静脈内注入して、肺転移を確立した。１４日後、肺を免疫組織及びＮＭＲ分析のために採取する前に、Ｇｅｍ、Ｇｅｍ－ＬＮＰ、又はアプタマー標識Ｇｅｍ－ＬＮＰ（Ｊ１０－Ｇｅｍ－ＬＮＰ及びＳ２－Ｇｅｍ－ＬＮＰ）の１つを６時間にわたってマウスに静脈内注入した。図１３Ａに示されるように、単球細胞マーカーに対する免疫染色が肺においてＧＦＰ発現Ｂ１６Ｆ１０細胞と共局在化していたため、マウスモデルにおける肺の転移性黒色腫に単球が動員されたことが実証された。マウスから採取された腫瘍組織内の全ゲムシタビンを、本明細書に記載される方法で19Ｆ ＮＭＲを使用して定量することにより、Ｊ１０群では、６時間後に転移性黒色腫におけるゲムシタビンの蓄積が最大になったことが明らかになった（図１３Ｂ）。
他の実施形態
本明細書に開示されるすべての特徴は、任意の組合せで組み合わされてもよい。本明細書に開示される各特徴は、同様、同等又は類似の目的を担う代替的な特徴で置き換えられてもよい。したがって、明示的に別段の指示がない限り、開示される各特徴は、包括的な同等又は類似の特徴のシリーズの一例に過ぎない。
上記説明から、当業者は、本発明の基本的な特性を容易に確認し、その主旨及び範囲を逸脱することなく、本発明の様々な変更及び修正を加えて、それを様々な使用法及び条件に適応させることが可能である。したがって、他の実施形態も特許請求の範囲内にある。
【0080】
同等物
いくつかの発明実施形態を本明細書に記載及び説明したが、当業者は、機能を果たす、且つ／又は結果及び／若しくは本明細書に記載の利点の１つ以上を得るための様々な他の手段及び／又は構造を容易に想定し、当該変更及び／又は修正の各々は、本明細書に記載の発明実施形態の範囲内にあると見なされる。より一般的には、当業者は、本明細書に記載のいずれのパラメータ、寸法、材料及び構成も例示であることを意図し、実際のパラメータ、寸法、材料及び／又は構成が、具体的な用途、又は発明の教示を使用する用途に依存することを容易に理解する。当業者は、日常の実験だけを使用して、本明細書に記載の具体的な発明実施形態の多くの同等物を認識する、又は確認することが可能である。したがって、先述の実施形態は単に例として提示されており、添付の請求項及びその同等物の範囲内で、発明実施形態を、具体的に記載及びクレームされているのとは異なる方法で実行してもよいことが理解されるべきである。本開示の発明実施形態は、本明細書に記載の個々の特徴、システム、物品、材料、キット及び／又は方法それぞれに向けられる。加えて、当該特徴、システム、物品、材料、キット及び／又は方法が相互に矛盾しなければ、２つ以上の当該特徴、システム、物品、材料、キット及び／又は方法のあらゆる組合せが本開示の発明の範囲内に含められる。
いくつかの発明実施形態を本明細書に記載及び説明したが、当業者は、機能を果たす、且つ／又は結果及び／若しくは本明細書に記載の利点の１つ以上を得るための様々な他の手段及び／又は構造を容易に想定し、当該変更及び／又は修正の各々は、本明細書に記載の発明実施形態の範囲内にあると見なされる。より一般的には、当業者は、本明細書に記載のいずれのパラメータ、寸法、材料及び構成も例示であることを意図し、実際のパラメータ、寸法、材料及び／又は構成が、具体的な用途、又は発明の教示を使用する用途に依存することを容易に理解する。当業者は、日常の実験だけを使用して、本明細書に記載の具体的な発明実施形態の多くの同等物を認識する、又は確認することが可能である。したがって、先述の実施形態は単に例として提示されており、添付の請求項及びその同等物の範囲内で、発明実施形態を、具体的に記載及びクレームされているのとは異なる方法で実行してもよいことが理解されるべきである。本開示の発明実施形態は、本明細書に記載の個々の特徴、システム、物品、材料、キット及び／又は方法それぞれに向けられる。加えて、当該特徴、システム、物品、材料、キット及び／又は方法が相互に矛盾しなければ、２つ以上の当該特徴、システム、物品、材料、キット及び／又は方法のあらゆる組合せが本開示の発明の範囲内に含められる。
【0081】
本明細書に規定及び使用されるすべての定義は、辞書の定義、参照により組み込まれている文書における定義、及び／又は規定の用語の通常の意味を包含することが理解されるべきである。
本明細書及び請求項に使用される不定冠詞「１つ（ａ）」及び「１つ（ａｎ）」は、そうでないことが明示される場合を除いて、「少なくとも１つ」を意味することが理解されるべきである。
本明細書及び請求項に使用される「及び／又は」という語句は、かくして等位接続される要素、即ちある場合は接続的に存在し、他の場合は非接続的に存在する要素の「いずれか又は両方」を意味することが理解されるべきである。「及び／又は」とともに記載される複数の要素、即ちかくして等位接続される要素の「１つ以上」も同様に解釈されるべきである。「及び／又は」節によって具体的に特定される要素以外の他の要素も、具体的に特定されるそれらの要素に関連するか関連しないかにかかわらず、存在してもよい。したがって、非限定的な例として、「Ａ及び／又はＢ」への言及は、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などのオープンエンドな文体と一緒に使用される場合は、一実施形態ではＡのみ（Ｂ以外の要素を含んでいてもよい）、別の実施形態ではＢのみ（Ａ以外の要素を含んでいてもよい）、さらに別の実施形態ではＡとＢの両方（他の要素を含んでいてもよい）等を指すことができる。
本明細書及び請求項に使用される不定冠詞「１つ（ａ）」及び「１つ（ａｎ）」は、そうでないことが明示される場合を除いて、「少なくとも１つ」を意味することが理解されるべきである。
本明細書及び請求項に使用される「及び／又は」という語句は、かくして等位接続される要素、即ちある場合は接続的に存在し、他の場合は非接続的に存在する要素の「いずれか又は両方」を意味することが理解されるべきである。「及び／又は」とともに記載される複数の要素、即ちかくして等位接続される要素の「１つ以上」も同様に解釈されるべきである。「及び／又は」節によって具体的に特定される要素以外の他の要素も、具体的に特定されるそれらの要素に関連するか関連しないかにかかわらず、存在してもよい。したがって、非限定的な例として、「Ａ及び／又はＢ」への言及は、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などのオープンエンドな文体と一緒に使用される場合は、一実施形態ではＡのみ（Ｂ以外の要素を含んでいてもよい）、別の実施形態ではＢのみ（Ａ以外の要素を含んでいてもよい）、さらに別の実施形態ではＡとＢの両方（他の要素を含んでいてもよい）等を指すことができる。
【0082】
本明細書及び請求項に使用されるように、「又は」は、以上に規定される「及び／又は」と同様の意味を有することが理解されるべきである。例えば、リストの項目を区別する場合は、「又は」又は「及び／又は」は、包含的である、即ちいくつかの要素又は要素のリストのうちの少なくとも１つ、さらには２つ以上を含む、及びさらなる非記載の項目を含んでいてもよいものと解釈されるべきである。「のうちの１つのみ」若しくは「のうちの正確に１つ」、又は請求項において使用される場合の「からなる」などの、反対の意味で明示される用語のみは、いくつかの要素又は要素のリストのうちの正確に１つの要素を含むことを指す。概して、本明細書に使用される「又は」という用語は、「いずれか」、「のうちの１つ」、「のうちの１つのみ」又は「のうちの正確に１つ」などの排他の用語の後に続く場合にのみ排他的選択肢（即ち、「一方又はもう一方であって両方ではない」）を指すものとして解釈されるべきである。請求項で使用される「から実質的になる」は、特許法の分野で使用されるその通常の意味を有する。
【0083】
本明細書及び請求項に使用されるように、１つ以上の要素のリストに言及する際の「少なくとも１つ」という語句は、要素のリストにおける要素のうちのいずれか１つ以上から選択されるが、要素のリスト内に具体的に記載される各要素及びあらゆる要素の少なくとも１つを必ずしも含まず、要素のリストにおける要素のいかなる組合せも排除しない少なくとも１つの要素を意味するものと理解されるべきである。この定義は、「少なくとも１つ」という語句が指す要素のリスト内で具体的に特定される要素以外の要素も、具体的に特定されるそれらの要素に関連するか関連しないかにかかわらず、存在してもよいことを許容する。したがって、非限定的な例として、「Ａ及びＢのうちの少なくとも１つ」（又は同等には、「Ａ又はＢの少なくとも１つ」、又は同等には「Ａ及び／又はＢの少なくとも１つ」）は、一実施形態では２つ以上のＡを含んでいてもよい少なくとも１つのＡが存在し、Ｂが存在しない（且つＢ以外の要素を含んでいてもよい）こと、別の実施形態では２つ以上のＢを含んでいてもよい少なくとも１つのＢが存在し、Ａが存在しない（且つＡ以外の要素を含んでいてもよい）こと、さらに別の実施形態では２つ以上のＡを含んでいてもよい少なくとも１つのＡが存在し、２つ以上のＢを含んでいてもよい少なくとも１つのＢが存在する（且つ他の要素を含んでいてもよい）こと等を指すことができる。
【0084】
そうでないことが明示される場合を除いて、２つ以上の工程又は行為を含む、ここにクレームされるいずれの方法において、方法の工程又は行為の順序が、方法の工程又は行為の記載の順序に必ずしも限定されないことも理解されるべきである。
請求項並びに以上の明細書において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「担持する（ｃａｒｒｙｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「伴う（ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ）」、「保持する（ｈｏｌｄｉｎｇ）」及び「構成される（ｃｏｍｐｏｓｅｄ ｏｆ）」等の移行句はいずれも、オープンエンドであること、即ち限定することなく含むことを意味することが理解されるべきである。米国特許庁、特許調査手順マニュアルセクション２１１１．０３に記載されるように「からなる」及び「から実質的になる」という移行句のみが、それぞれクローズド又はセミクローズド移行句である。
請求項並びに以上の明細書において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「担持する（ｃａｒｒｙｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「伴う（ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ）」、「保持する（ｈｏｌｄｉｎｇ）」及び「構成される（ｃｏｍｐｏｓｅｄ ｏｆ）」等の移行句はいずれも、オープンエンドであること、即ち限定することなく含むことを意味することが理解されるべきである。米国特許庁、特許調査手順マニュアルセクション２１１１．０３に記載されるように「からなる」及び「から実質的になる」という移行句のみが、それぞれクローズド又はセミクローズド移行句である。
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図1D】
【図1E】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図2D】
【図3】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図5D】
【図5E】
【図6】
【図7A】
【図7B】
【図7C】
【図8A】
【図8B】
【図8C】
【図8D】
【図8E】
【図8F】
【図9A】
【図9B】
【図10】
【図11A】
【図11B】
【図11C】
【図11D】
【図11E】
【図11F】
【図11G】
【図11H】
【図11I】
【図11J】
【図11K】
【図12A】
【図12B】
【図12C】
【図12D】
【図12E】
【図13A】
【図13B】
【配列表】