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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-05-15
(45)【発行日】2024-05-23
(54)【発明の名称】フェルラ酸エステラーゼ及びその応用
(51)【国際特許分類】
C12N 9/18 20060101AFI20240516BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20240516BHJP
C12N 15/55 20060101ALI20240516BHJP
C12N 15/75 20060101ALI20240516BHJP
C12P 7/42 20060101ALI20240516BHJP
【ＦＩ】
C12N9/18 ZNA
C12N1/21
C12N15/55
C12N15/75 Z
C12P7/42
【請求項の数】
11
(21)【出願番号】P 2021560888
(86)(22)【出願日】2020-09-30
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-11-28
(86)【国際出願番号】 CN2020119269
(87)【国際公開番号】W WO2022041397
(87)【国際公開日】2022-03-03
【審査請求日】2021-12-10
(31)【優先権主張番号】202010900348.1
(32)【優先日】2020-08-31
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(31)【優先権主張番号】202010898408.0
(32)【優先日】2020-08-31
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(31)【優先権主張番号】202011048393.5
(32)【優先日】2020-09-29
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
【微生物の受託番号】CCTCC CCTCC M 2020421
(73)【特許権者】
【識別番号】514262886
【氏名又は名称】江南大学
【氏名又は名称原語表記】ＪＩＡＮＧＮＡＮ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ
【住所又は居所原語表記】Ｎｏ． １８００ Ｌｉｈｕ Ａｖｅｎｕｅ， Ｂｉｎ Ｈｕ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ， Ｗｕｘｉ， Ｊｉａｎｇｓｕ， Ｃｈｉｎａ
(74)【代理人】
【識別番号】110002077
【氏名又は名称】園田・小林弁理士法人
(72)【発明者】
【氏名】張涛
(72)【発明者】
【氏名】江波
(72)【発明者】
【氏名】段暁莉
(72)【発明者】
【氏名】繆銘
【審査官】西澤 龍彦
(56)【参考文献】
【文献】中国特許出願公開第１０１０３９４２０（ＣＮ，Ａ）
【文献】中国特許出願公開第１０６４３４５９８（ＣＮ，Ａ）
【文献】alpha/beta hydrolase [Bacillus pumilus]，NCBI Reference Sequence，2018年，WP_106036153.1
【文献】alpha/beta hydrolase [Bacillus pumilus]，NCBI Reference Sequence，2019年，WP_012009018.1
【文献】LIANG, W et al.，A novel feruloyl esterase with high rosmarinic acid hydrolysis activity from Bacillus pumilus W3，International Journal of Biological Macromolecules，2020年06月，Vol. 161，pp. 525-530
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ
Ｃ０７Ｋ
Ｃ１２Ｐ
ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ
ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
アミノ酸配列が配列番号２に示されるフェルラ酸エステラーゼを含むことを特徴とする、フェルラ酸製造剤。
【請求項2】
アミノ酸配列が配列番号２に示されるフェルラ酸エステラーゼをコードする遺伝子を発現可能なように組み込んだ宿主細胞を含むことを特徴とする、フェルラ酸製造剤。
【請求項3】
前記遺伝子のヌクレオチド配列は、配列番号３に示されていることを特徴とする、請求項２に記載のフェルラ酸製造剤。
【請求項4】
前記遺伝子は、組換えプラスミドに含まれていることを特徴とする、請求項２又は３に記載のフェルラ酸製造剤。
【請求項5】
前記組換えプラスミドの発現ベクターは、ｐＭＡ５プラスミド又はｐＵＢプラスミドであることを特徴とする、請求項４に記載のフェルラ酸製造剤。
【請求項6】
前記宿主細胞は、バチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ）又は枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）であることを特徴とする、請求項２～５の何れか一項に記載のフェルラ酸製造剤。
【請求項7】
請求項１に記載のフェルラ酸製造剤を製造するための方法であって、最初に、アミノ酸配列が配列番号２に示されるフェルラ酸エステラーゼをコードする遺伝子を発現可能なように組み込んだ宿主細胞を発酵培地に播種して発酵させ、発酵ブロスを得てから、発酵ブロスからフェルラ酸エステラーゼを分離する工程を含むことを特徴とする、方法。
【請求項8】
フェルラ酸を製造するための方法であって、最初に、請求項１に記載のフェルラ酸製造剤を、フェルラ酸エステル化合物を含有する反応系に添加して反応させ、反応液を得てから、反応液からフェルラ酸を分離するか、又は、最初に、請求項２～６の何れか一項に記載のフェルラ酸製造剤の前記宿主細胞を発酵培地に播種して発酵させ、発酵ブロスを得、次いで発酵ブロスからフェルラ酸エステラーゼを分離し、それからフェルラ酸エステラーゼを、フェルラ酸エステル化合物を含有する反応系に添加して反応させ、反応液を得、最後に反応液からフェルラ酸を分離するか、
又は、最初に、請求項２～６の何れか一項に記載のフェルラ酸製造剤の前記宿主細胞を発酵培地に播種して発酵させ、発酵ブロスを得、次に発酵ブロスを、フェルラ酸エステル化合物を含有する反応系に添加して反応させ、反応液を得、最後に反応液からフェルラ酸を分離することを特徴とする、方法。
【請求項9】
前記フェルラ酸エステル化合物は、フェルラ酸メチル又はフェルラ酸エチルであることを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項10】
前記反応の温度は３０～９０℃であり、時間は１０～３０分であることを特徴とする、請求項８又は９に記載の方法。
【請求項11】
フェルラ酸の製造、リグノセルロースの加水分解、飼料の調製又は製紙における、請求項１～６の何れか一項に記載のフェルラ酸製造剤の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、フェルラ酸エステラーゼ及びその応用に関し、微生物技術分野に属する。
【背景技術】
【0002】
フェルラ酸（Ｆｅｒｕｌｉｃ ａｃｉｄ，ＦＡ）は、植物の細胞壁に広く存在しており、多糖、セルロース、リグニンとエステル結合又はエーテル結合の形態で連結して細胞壁における複雑な網状骨格構造を構成し、細胞壁の完全性を維持し、且つ生分解率を低下させる。
【0003】
フェルラ酸は、世界的に認められている安全な抗酸化剤であり、日本、米国などの国で食品添加剤に組み込まれている。更に、フェルラ酸は、紫外線吸収、抗菌、抗炎症、癌予防、血液脂質低下などの効果を有し、医薬、化粧品、製紙などの分野でいずれも幅広い応用の将来性を有する。
【0004】
現在、フェルラ酸を製造するための方法としては、主に植物抽出法、化学合成法及び生物学的酵素法がある。そのうち、植物抽出法は、主に酸塩基加水分解によってトウキ、オウレン、米糠、小麦ふすまなどの植物から天然のフェルラ酸を抽出して分離するが、酸塩基加水分解法によって細胞壁における他の化学成分の変化を引き起こすため、この方法によりフェルラ酸を製造する場合、植物における他の高価値の化学成分を破壊し、また、酸塩基加水分解法によりフェルラ酸を製造する場合の副生成物が多く、生成物の分離が困難であり、且つ、この方法によりフェルラ酸を製造する場合、エネルギー消費が大きく、環境を汚染する。化学合成法は、主にバニリンを基本原料として一連の有機反応によってフェルラ酸を製造するが、生成物にシスフェルラ酸が混入されるため、この方法によりフェルラ酸を製造する場合、分離コストを増加させ、且つ、この方法により製造されるフェルラ酸は、そのまま医薬原料として使用できず、また、この方法によりフェルラ酸を製造する場合、反応時間が長く、環境に対する汚染が深刻であるなどの欠陥を有する。
【0005】
生物学的酵素法は、主にフェルラ酸エステラーゼ（Ｆｅｒｕｌｏｙｌ ｅｓｔｅｒａｓｅ，Ｆｅｒｕｌｉｃ ａｃｉｄ ｅｓｔｅｒａｓｅ，ＦＡＥ，Ｅ．Ｃ．３．１．１．７３）を、フェルラ酸エステル系化合物を含有する反応系に添加して反応させてフェルラ酸を製造するものであり、生物抽出法、酸塩基加水分解法及び化学合成法と比べ、生物学的酵素法によりフェルラ酸を製造する場合、反応条件が温和であり、特異性が高く、環境に優しいなどの利点を有し、これらの利点により、生物学的酵素法は、フェルラ酸を製造する研究の焦点になっている。しかしながら、従来のフェルラ酸エステラーゼの比活性が低く、例えば、文献「曹艶、夏其楽、陳剣兵ら、フェルラ酸エステラーゼ産生菌のスクリーニング及び同定並びに発酵条件の最適化［Ｊ］、微生物学雑誌、２０１９，（５）：８－１５．」において、アスペルギルス・タマリ由来のフェルラ酸エステラーゼの比活性が２３１．３４Ｕ／ｇだけであるため、生物学的酵素法によるフェルラ酸の製造の工業化進展を大きく制限している。
【0006】
従って、比活性の高いフェルラ酸エステラーゼを早急に見出す必要がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
本発明が解決しようとする技術課題は、比活性の高いフェルラ酸エステラーゼ（Ｆｅｒｕｌｏｙｌ ｅｓｔｅｒａｓｅ，Ｆｅｒｕｌｉｃ ａｃｉｄ ｅｓｔｅｒａｓｅ，ＦＡＥ，Ｅ．Ｃ．３．１．１．７３）を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0008】
上記課題を解決するために、本発明は、アミノ酸配列が配列番号２に示されるフェルラ酸エステラーゼを提供する。
【0009】
本発明は、前記フェルラ酸エステラーゼをコードする遺伝子を更に提供する。
【0010】
本発明の一実施形態において、前記遺伝子のヌクレオチド配列は、配列番号３に示される。
【0011】
本発明は、前記遺伝子を担持する組換えプラスミドを更に提供する。
【0012】
本発明の一実施形態において、前記組換えプラスミドの発現ベクターは、ｐＭＡ５プラスミド又はｐＵＢプラスミドである。
【0013】
本発明は、前記遺伝子又は前記組換えプラスミドを担持する宿主細胞を更に提供する。
【0014】
本発明の一実施形態において、前記宿主細胞は、バチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ）又は枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）である。
【0015】
本発明の一実施形態において、前記枯草菌は、枯草菌１６８、枯草菌ＷＢ８００、枯草菌ＷＢ６００又は枯草菌１Ａ７５１である。
【0016】
本発明は、最初に、前記宿主細胞を発酵培地に播種して発酵させ、発酵ブロスを得、次いで発酵ブロスからフェルラ酸エステラーゼを分離して得るフェルラ酸エステラーゼを製造するための方法を更に提供する。
【0017】
本発明は、前記宿主細胞又は前記フェルラ酸エステラーゼを製造するための方法のフェルラ酸エステラーゼの製造における応用を更に提供する。
【0018】
本発明は、最初に、前記フェルラ酸エステラーゼを、フェルラ酸エステル系化合物を含有する反応系に添加して反応させ、反応液を得、それから反応液からフェルラ酸を分離し、
又は、最初に、前記宿主細胞を発酵培地に播種して発酵させ、発酵ブロスを得、次いで発酵ブロスからフェルラ酸エステラーゼを分離して得、それからフェルラ酸エステラーゼを、フェルラ酸エステル系化合物を含有する反応系に添加して反応させ、反応液を得、最後に反応液からフェルラ酸を分離し、
又は、最初に、前記宿主細胞を発酵培地に播種して発酵させ、発酵ブロスを得、それから発酵ブロスを、フェルラ酸エステル系化合物を含有する反応系に添加して反応させ、反応液を得、最後に反応液からフェルラ酸を分離するフェルラ酸を製造するための方法を更に提供する。
又は、最初に、前記宿主細胞を発酵培地に播種して発酵させ、発酵ブロスを得、次いで発酵ブロスからフェルラ酸エステラーゼを分離して得、それからフェルラ酸エステラーゼを、フェルラ酸エステル系化合物を含有する反応系に添加して反応させ、反応液を得、最後に反応液からフェルラ酸を分離し、
又は、最初に、前記宿主細胞を発酵培地に播種して発酵させ、発酵ブロスを得、それから発酵ブロスを、フェルラ酸エステル系化合物を含有する反応系に添加して反応させ、反応液を得、最後に反応液からフェルラ酸を分離するフェルラ酸を製造するための方法を更に提供する。
【0019】
本発明の一実施形態において、前記フェルラ酸エステル系化合物は、フェルラ酸メチル又はフェルラ酸エチルである。
【0020】
本発明の一実施形態において、前記反応の温度は３０～９０℃であり、時間は１０～３０分である。
【0021】
本発明は、前記フェルラ酸エステラーゼ又は前記遺伝子又は前記組換えプラスミド又は前記宿主細胞又は前記方法のフェルラ酸の製造、リグノセルロースの加水分解、飼料の調製及び製紙における応用を更に提供する。
【発明の効果】
【0022】
有益な効果は、以下の通りである。
（１）本発明は、アミノ酸配列が配列番号２に示されるフェルラ酸エステラーゼを提供し、このフェルラ酸エステラーゼの比活性は、５１９Ｕ／ｇと高いため、このフェルラ酸エステラーゼは、フェルラ酸の製造において非常に高い応用の将来性を有する。
（２）本発明は、枯草菌を宿主とし、アミノ酸配列が配列番号２に示されるフェルラ酸エステラーゼをコードする遺伝子を発現する組換え枯草菌を提供し、この組換え枯草菌は、フェルラ酸エステラーゼを高収量で製造することができ、具体的に、この組換え枯草菌を発酵培地に播種して発酵させ、１４時間発酵させてから、細胞破砕上澄み液におけるフェルラ酸エステラーゼの酵素活性を８２．５３Ｕ／ｍＬと高くすることができる。従って、この組換え枯草菌は、フェルラ酸エステラーゼ及びフェルラ酸の製造において非常に高い応用の将来性を有する。
（１）本発明は、アミノ酸配列が配列番号２に示されるフェルラ酸エステラーゼを提供し、このフェルラ酸エステラーゼの比活性は、５１９Ｕ／ｇと高いため、このフェルラ酸エステラーゼは、フェルラ酸の製造において非常に高い応用の将来性を有する。
（２）本発明は、枯草菌を宿主とし、アミノ酸配列が配列番号２に示されるフェルラ酸エステラーゼをコードする遺伝子を発現する組換え枯草菌を提供し、この組換え枯草菌は、フェルラ酸エステラーゼを高収量で製造することができ、具体的に、この組換え枯草菌を発酵培地に播種して発酵させ、１４時間発酵させてから、細胞破砕上澄み液におけるフェルラ酸エステラーゼの酵素活性を８２．５３Ｕ／ｍＬと高くすることができる。従って、この組換え枯草菌は、フェルラ酸エステラーゼ及びフェルラ酸の製造において非常に高い応用の将来性を有する。
【図面の簡単な説明】
【0023】
【図1】バチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ）ＳＫ５２．００１のコロニー形態である。
【図2】バチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ）ＳＫ５２．００１の菌体形態である。
【図3】フェルラ酸標準品の高速液体クロマトグラムである。
【図4】フェルラ酸メチル標準品の高速液体クロマトグラムである。
【図5】反応液の高速液体クロマトグラムである。
【図6】反応液のＬＣ－ＭＳである。
【図7】タンパク質濃度の標準曲線である。
【図8】反応液におけるフェルラ酸の収量である。
【発明を実施するための形態】
【0024】
以下の実施例に係るフェルラ酸標準品は、北京百霊威科技有限公司から購入され、以下の実施例に係るフェルラ酸メチルは、Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ（中国）化学有限公司から購入され、以下の実施例に係るウシアルブミン及びクーマシーブリリアントブルーＧ－２５０は、上海国薬集団化学試剤有限公司から購入され、以下の実施例に係るｐＭＡ５プラスミドは、優宝生物から購入され、以下の実施例に係る大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＤＨ５αは、通用生物技術有限公司から購入され、以下の実施例に係る枯草菌ＷＢ８００は、ＮＴＣＣ典型培養物寄託センターから購入され、以下の実施例に係るリゾチームは、Ｓａｎｇｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ （Ｓｈａｎｇｈａｉ） Ｃｏ．， Ｌｔｄから購入され、以下の実施例に係るトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ）及びエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム二水和物は、Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｍａｃｋｌｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から購入される。
【0025】
以下の実施例に係る培地は、以下の通りである。
菌株分離培地：ジャガイモ２００ｇ／Ｌ、スクロース２０ｇ／Ｌ、寒天１５ｇ／Ｌ、ｐＨ自然。
スクリーニング固体培地：０．２２μｍの濾過膜で１００ｍｇ／Ｌのフェルラ酸エチルを含有するＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド溶液を濾過し、フェルラ酸エチル溶液を得て、滅菌された基本培地を６０℃に冷却した後、基本培地に１０％（ｖ／ｖ）のフェルラ酸エチル溶液を添加し、均一な乳白色溶液になるまで振とうする。
基本培地：ＮａＮＯ３ ２ｇ／Ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４・３Ｈ２Ｏ １ｇ／Ｌ、ＫＣｌ ０．５ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．５ｇ／Ｌ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．０１ｇ／Ｌ、寒天 １５ｇ／Ｌ、ｐＨ自然。
シード培地：ジャガイモ２００ｇ／Ｌ、スクロース２０ｇ／Ｌ、ｐＨ自然。
基本発酵培地：小麦ふすま２０ｇ／Ｌ、ＮａＮＯ３ ２ｇ／Ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４・３Ｈ２Ｏ １ｇ／Ｌ、ＫＣｌ ０．５ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．５ｇ／Ｌ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．０１ｇ／Ｌ、ｐＨ自然。
ＬＢ液体培地：トリプトン１０ｇ／Ｌ、酵母エキス５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム１０ｇ／Ｌ、ｐＨ自然。
ＬＢ固体培地：トリプトン１０ｇ／Ｌ、酵母エキス５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム１０ｇ／Ｌ、寒天粉末１５ｇ／Ｌ。
Ｓｕｐｅｒ Ｒｉｃｈ培地：トリプトン２５ｇ／Ｌ、酵母エキス２０ｇ／Ｌ、リン酸水素二カリウム３．０ｇ／Ｌ、グルコース３０ｇ／Ｌ、ｐＨ自然。
菌株分離培地：ジャガイモ２００ｇ／Ｌ、スクロース２０ｇ／Ｌ、寒天１５ｇ／Ｌ、ｐＨ自然。
スクリーニング固体培地：０．２２μｍの濾過膜で１００ｍｇ／Ｌのフェルラ酸エチルを含有するＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド溶液を濾過し、フェルラ酸エチル溶液を得て、滅菌された基本培地を６０℃に冷却した後、基本培地に１０％（ｖ／ｖ）のフェルラ酸エチル溶液を添加し、均一な乳白色溶液になるまで振とうする。
基本培地：ＮａＮＯ３ ２ｇ／Ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４・３Ｈ２Ｏ １ｇ／Ｌ、ＫＣｌ ０．５ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．５ｇ／Ｌ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．０１ｇ／Ｌ、寒天 １５ｇ／Ｌ、ｐＨ自然。
シード培地：ジャガイモ２００ｇ／Ｌ、スクロース２０ｇ／Ｌ、ｐＨ自然。
基本発酵培地：小麦ふすま２０ｇ／Ｌ、ＮａＮＯ３ ２ｇ／Ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４・３Ｈ２Ｏ １ｇ／Ｌ、ＫＣｌ ０．５ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．５ｇ／Ｌ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．０１ｇ／Ｌ、ｐＨ自然。
ＬＢ液体培地：トリプトン１０ｇ／Ｌ、酵母エキス５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム１０ｇ／Ｌ、ｐＨ自然。
ＬＢ固体培地：トリプトン１０ｇ／Ｌ、酵母エキス５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム１０ｇ／Ｌ、寒天粉末１５ｇ／Ｌ。
Ｓｕｐｅｒ Ｒｉｃｈ培地：トリプトン２５ｇ／Ｌ、酵母エキス２０ｇ／Ｌ、リン酸水素二カリウム３．０ｇ／Ｌ、グルコース３０ｇ／Ｌ、ｐＨ自然。
【0026】
以下の実施例に関する溶液は、以下の通りである。
溶解液：Ｔｒｉｓ ６．０５７ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ ５．８４４ｇ／Ｌ、塩酸でｐＨを８．０に調節し、１Ｌにメスアップする。
透析液：Ｔｒｉｓ ６．０５７ｇ／Ｌ、塩酸でｐＨを８．０に調節し、１Ｌにメスアップする。
溶解液：Ｔｒｉｓ ６．０５７ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ ５．８４４ｇ／Ｌ、塩酸でｐＨを８．０に調節し、１Ｌにメスアップする。
透析液：Ｔｒｉｓ ６．０５７ｇ／Ｌ、塩酸でｐＨを８．０に調節し、１Ｌにメスアップする。
【0027】
実施例１ バチルス・プミルスＳＫ５２．００１の取得
具体的なステップは、以下の通りである。
具体的なステップは、以下の通りである。
【0028】
１、バチルス・プミルスＳＫ５２．００１の分離精製
江蘇省無錫市貢湖湾湿地地区に由来する土壌をサンプルとし、１．０ｇのサンプルをガラスビーズが入れられた１０ｍＬの滅菌水に入れ、３０℃、２００ｒ／分のシェーカーにより３０分振とうし、菌体を十分に分離させ、混合菌液を得た。０．５ｍＬの混合菌液を吸い取って無菌環境で４．５ｍＬの生理食塩水が入れられた１０ｍＬの遠心管に加え、１０－１の希釈液を得た。上記希釈ステップを繰り返し、１０－２、１０－３、１０－４、１０－５、１０－６の希釈液を順次得て、それぞれ希釈勾配が１０－３、１０－４、１０－５、１０－６の希釈液を１００μＬ吸い取って菌株分離培地に塗布し、３０℃の恒温インキュベータで２４～４８時間倒立培養し、希釈塗抹平板を得た。希釈塗抹平板上の単一コロニーを選別してスクリーニング固体培地に画線し、３０℃の恒温インキュベータで２４時間倒立培養し、単一コロニーを得た。単一コロニーの周囲に透明帯が出現したか否かを観察し、周囲に透明帯が出現した単一コロニーをスクリーニングし、今回、スクリーニングを経て合計で１つの単一コロニーを得た。この単一コロニーに対応する菌株をＳＫ５２．００１と命名する。
江蘇省無錫市貢湖湾湿地地区に由来する土壌をサンプルとし、１．０ｇのサンプルをガラスビーズが入れられた１０ｍＬの滅菌水に入れ、３０℃、２００ｒ／分のシェーカーにより３０分振とうし、菌体を十分に分離させ、混合菌液を得た。０．５ｍＬの混合菌液を吸い取って無菌環境で４．５ｍＬの生理食塩水が入れられた１０ｍＬの遠心管に加え、１０－１の希釈液を得た。上記希釈ステップを繰り返し、１０－２、１０－３、１０－４、１０－５、１０－６の希釈液を順次得て、それぞれ希釈勾配が１０－３、１０－４、１０－５、１０－６の希釈液を１００μＬ吸い取って菌株分離培地に塗布し、３０℃の恒温インキュベータで２４～４８時間倒立培養し、希釈塗抹平板を得た。希釈塗抹平板上の単一コロニーを選別してスクリーニング固体培地に画線し、３０℃の恒温インキュベータで２４時間倒立培養し、単一コロニーを得た。単一コロニーの周囲に透明帯が出現したか否かを観察し、周囲に透明帯が出現した単一コロニーをスクリーニングし、今回、スクリーニングを経て合計で１つの単一コロニーを得た。この単一コロニーに対応する菌株をＳＫ５２．００１と命名する。
【0029】
２、バチルス・プミルスＳＫ５２．００１の同定
菌株ＳＫ５２．００１のゲノムを抽出し、菌株ＳＫ５２．００１の１６Ｓ ｒＤＮＡに増幅及び配列決定を行い（天一輝遠生物科技有限公司により完成する）、配列決定分析により得られた菌株ＳＫ５２．００１の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列（ＳＫ５２．００１の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列は配列番号１に示される）をＧｅｎＢａｎｋにおいてアラインメントし、結果から分かるように、この菌株は、確かにバチルス・プミルスであり、バチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ）ＳＫ５２．００１と命名する。
菌株ＳＫ５２．００１のゲノムを抽出し、菌株ＳＫ５２．００１の１６Ｓ ｒＤＮＡに増幅及び配列決定を行い（天一輝遠生物科技有限公司により完成する）、配列決定分析により得られた菌株ＳＫ５２．００１の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列（ＳＫ５２．００１の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列は配列番号１に示される）をＧｅｎＢａｎｋにおいてアラインメントし、結果から分かるように、この菌株は、確かにバチルス・プミルスであり、バチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ）ＳＫ５２．００１と命名する。
【0030】
３、バチルス・プミルスＳＫ５２．００１の観察
バチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ）ＳＫ５２．００１の菌液を取ってＬＢ固体培地に画線し、３０℃の恒温インキュベータで１２時間倒立培養し、単一コロニーを得た。単一コロニーを選別してＬＢ液体培地に播種し、３０℃、２００ｒ／分のシェーカーで１２時間培養し、菌液を得た。菌液を滅菌水で１００倍希釈した後にＬＢ固体培地に塗布し、３０℃のインキュベータで１８時間培養した後にコロニー形態を観察し（コロニー形態を図１に示す）、菌液を滅菌水で２０倍希釈した後に光学顕微鏡で菌体形態を観察した（菌体形態を図２に示す）。
バチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ）ＳＫ５２．００１の菌液を取ってＬＢ固体培地に画線し、３０℃の恒温インキュベータで１２時間倒立培養し、単一コロニーを得た。単一コロニーを選別してＬＢ液体培地に播種し、３０℃、２００ｒ／分のシェーカーで１２時間培養し、菌液を得た。菌液を滅菌水で１００倍希釈した後にＬＢ固体培地に塗布し、３０℃のインキュベータで１８時間培養した後にコロニー形態を観察し（コロニー形態を図１に示す）、菌液を滅菌水で２０倍希釈した後に光学顕微鏡で菌体形態を観察した（菌体形態を図２に示す）。
【0031】
図１から分かるように、バチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ）ＳＫ５２．００１のコロニー形態は、円形で、薄く、中央が淡黄色で、縁部がやや白く、表面が粘稠で湿潤で、縁部には凸凹があり、不均一である。
【0032】
図２から分かるように、バチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ）ＳＫ５２．００１の菌体形態は、短桿状で、両端が鈍円で、典型的なバチルスの形態特徴を有し、グラム陽性菌に属する。
【0033】
実施例２ フェルラ酸エステラーゼの製造
具体的なステップは、以下の通りである。
具体的なステップは、以下の通りである。
【0034】
実施例１で得られたバチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ）ＳＫ５２．００１の単一コロニーを選別してシード培地に播種し、３０℃、２００ｒ／分のシェーカーで１８時間培養し、シード液を得た。シード液を５％（ｖ／ｖ）の播種量で基本発酵培地に播種し、３０℃、２００ｒ／分のシェーカーで２６時間発酵させ、発酵ブロスを得た。
【0035】
発酵ブロスを４℃、１００００ｒｐｍで１０分遠心分離し、粗酵素液を得た。粗酵素液におけるフェルラ酸エステラーゼの酵素活性を測定し、測定方法は、以下の通りである。
２５０μＬの粗酵素液を７５０μＬの濃度が０．００３ｍｏｌ／Ｌのフェルラ酸メチル溶液（フェルラ酸メチル溶液は、フェルラ酸メチルをｐＨが８．０で、濃度が０．０５ｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液に溶解して得られる）に加え、酵素反応系を得た。酵素反応系を５０℃の水浴鍋で３０分反応させた後、まず、沸騰水で酵素を１０分失活させ、続いて、０．２２μｍの膜で濾過し、反応液を得た。酵素失活後の粗酵素液をブランク対照とし、ＨＰＬＣ法（高速液体クロマトグラフィー）により反応液におけるフェルラ酸の濃度を測定し、フェルラ酸の濃度をフェルラ酸エステラーゼの酵素活性の計算式に代入し、粗酵素液におけるフェルラ酸エステラーゼの酵素活性を得た。
２５０μＬの粗酵素液を７５０μＬの濃度が０．００３ｍｏｌ／Ｌのフェルラ酸メチル溶液（フェルラ酸メチル溶液は、フェルラ酸メチルをｐＨが８．０で、濃度が０．０５ｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液に溶解して得られる）に加え、酵素反応系を得た。酵素反応系を５０℃の水浴鍋で３０分反応させた後、まず、沸騰水で酵素を１０分失活させ、続いて、０．２２μｍの膜で濾過し、反応液を得た。酵素失活後の粗酵素液をブランク対照とし、ＨＰＬＣ法（高速液体クロマトグラフィー）により反応液におけるフェルラ酸の濃度を測定し、フェルラ酸の濃度をフェルラ酸エステラーゼの酵素活性の計算式に代入し、粗酵素液におけるフェルラ酸エステラーゼの酵素活性を得た。
【0036】
フェルラ酸エステラーゼの酵素活性は、５０℃で１分あたりにフェルラ酸メチルを分解して１μｍｏｌのフェルラ酸を生成するために必要な酵素量が１つの酵素活性単位（１Ｕ）であるように定義されている。
【0037】
フェルラ酸エステラーゼの酵素活性の計算式は、以下の通りである。
【0038】
フェルラ酸標準品の高速液体クロマトグラムは図３に示され、フェルラ酸メチル標準品の高速液体クロマトグラムは図４に示され、反応液の高速液体クロマトグラムは図５に示され、フェルラ酸の濃度は、高速液体クロマトグラムにおけるピーク面積Ｙとフェルラ酸の濃度Ｘの間の線形関係Ｙ＝５２５１４Ｘ－８０．４１７（Ｒ２＝０．９９９６）に基づいて計算することにより得られる。
【0039】
ＨＰＬＣ法は、Ａｇｉｌｅｎｔ １ ２００型の高速液体クロマトグラフィー、クロマトグラフィー用カラムとしてＺＯＲＢＡＸ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｐｌｕｓ Ｃ１８（Ａｇｉｌｅｎｔ，４．６ｍｍ×１５０ｍｍ，３．５μｍ）、紫外検出器、移動相Ａとして１％（ｖ／ｖ）の酢酸溶液、移動相Ｂとしてメタノール、流速１ｍＬ／分、カラム温度３０℃、検出波長３２０ｎｍを採用し、勾配溶出プログラムは表１に示す通りである。
【0040】
検出した結果、粗酵素液におけるフェルラ酸エステラーゼの酵素活性は１９５Ｕ／Ｌである。
【0041】
バチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ）ＳＫ５２．００１がフェルラ酸エステラーゼを製造できることを更に証明するために、反応液にＬＣ－ＭＳ分析を行う（分析結果を図６に示す）。
【0042】
図６から分かるように、生成物ピークの相対存在量が最も高い破片は、ｍ／ｚ＝１９３であり、目的生成物の相対分子質量は１９４であり、フェルラ酸モノマーの相対分子量と一致する。
【0043】
【0044】
実施例３ フェルラ酸エステラーゼの製造
具体的なステップは、以下の通りである。
具体的なステップは、以下の通りである。
【0045】
実施例１を基に、基本発酵培地をそれぞれ発酵培地Ａ～Ｅに置き換え、発酵ブロスＡ～Ｅを得た。
そのうち、発酵培地Ａ：小麦ふすま４５ｇ／Ｌ、トリプトン５ｇ／Ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４・３Ｈ２Ｏ １．０ｇ／Ｌ、ＫＣｌ ０．５ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．５ｇ／Ｌ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．０１ｇ／Ｌ、ｐＨ ６．０。
発酵培地Ｂ：脱デンプン小麦ふすま１０ｇ／Ｌ、ＮａＮＯ３ ２ｇ／Ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４・３Ｈ２Ｏ １．０ｇ／Ｌ、ＫＣｌ ０．５ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．５ｇ／Ｌ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．０１ｇ／Ｌ、ｐＨ自然。脱デンプン小麦ふすまの処理方法としては、濃度が０．３％（ｗ／ｗ）の酢酸カリウム溶液で小麦ふすまを浸漬し、混合物を得た。混合物を９５℃で１時間水浴するとともに絶えず撹拌した後、デンプンが完全に除去されるまで脱イオン水で繰り返し洗浄し、１０５℃で恒量まで乾燥して使用に備えた。
発酵培養液Ｃ：小麦ふすま１０ｇ／Ｌ、ＮａＮＯ３ ２ｇ／Ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４・３Ｈ２Ｏ １．０ｇ／Ｌ、ＫＣｌ ０．５ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．５ｇ／Ｌ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．０１ｇ／Ｌ、ｐＨ自然。
発酵培養液Ｄ：小麦ふすま ４５ｇ／Ｌ、ＮａＮＯ３ ２ｇ／Ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４・３Ｈ２Ｏ １．０ｇ／Ｌ、ＫＣｌ ０．５ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．５ｇ／Ｌ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．０１ｇ／Ｌ、ｐＨ自然。
発酵培養液Ｅ：小麦ふすま４５ｇ／Ｌ、酵母エキス ５ｇ／Ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４・３Ｈ２Ｏ １．０ｇ／Ｌ、ＫＣｌ ０．５ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．５ｇ／Ｌ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．０１ｇ／Ｌ、ｐＨ自然。
そのうち、発酵培地Ａ：小麦ふすま４５ｇ／Ｌ、トリプトン５ｇ／Ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４・３Ｈ２Ｏ １．０ｇ／Ｌ、ＫＣｌ ０．５ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．５ｇ／Ｌ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．０１ｇ／Ｌ、ｐＨ ６．０。
発酵培地Ｂ：脱デンプン小麦ふすま１０ｇ／Ｌ、ＮａＮＯ３ ２ｇ／Ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４・３Ｈ２Ｏ １．０ｇ／Ｌ、ＫＣｌ ０．５ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．５ｇ／Ｌ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．０１ｇ／Ｌ、ｐＨ自然。脱デンプン小麦ふすまの処理方法としては、濃度が０．３％（ｗ／ｗ）の酢酸カリウム溶液で小麦ふすまを浸漬し、混合物を得た。混合物を９５℃で１時間水浴するとともに絶えず撹拌した後、デンプンが完全に除去されるまで脱イオン水で繰り返し洗浄し、１０５℃で恒量まで乾燥して使用に備えた。
発酵培養液Ｃ：小麦ふすま１０ｇ／Ｌ、ＮａＮＯ３ ２ｇ／Ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４・３Ｈ２Ｏ １．０ｇ／Ｌ、ＫＣｌ ０．５ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．５ｇ／Ｌ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．０１ｇ／Ｌ、ｐＨ自然。
発酵培養液Ｄ：小麦ふすま ４５ｇ／Ｌ、ＮａＮＯ３ ２ｇ／Ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４・３Ｈ２Ｏ １．０ｇ／Ｌ、ＫＣｌ ０．５ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．５ｇ／Ｌ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．０１ｇ／Ｌ、ｐＨ自然。
発酵培養液Ｅ：小麦ふすま４５ｇ／Ｌ、酵母エキス ５ｇ／Ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４・３Ｈ２Ｏ １．０ｇ／Ｌ、ＫＣｌ ０．５ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．５ｇ／Ｌ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．０１ｇ／Ｌ、ｐＨ自然。
【0046】
発酵ブロスＡ～Ｅをそれぞれ４℃、１００００ｒｐｍで１０分遠心分離し、粗酵素液Ａ～Ｅを得た。粗酵素液Ａ～Ｅにおけるフェルラ酸エステラーゼの酵素活性を測定し、測定した結果、粗酵素液Ａ～Ｅにおけるフェルラ酸エステラーゼの酵素活性は、それぞれ４２１Ｕ／Ｌ、７３Ｕ／Ｌ、１０２Ｕ／Ｌ、２４１Ｕ／Ｌ、３４４Ｕ／Ｌである。発酵培地Ａを使用する時、バチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ）ＳＫ５２．００１によってフェルラ酸エステラーゼを製造する場合の収量が最も高いことが分かる。
【0047】
実施例４ フェルラ酸エステラーゼの性能
具体的なステップは、以下の通りである。
具体的なステップは、以下の通りである。
【0048】
粗酵素液Ａにおけるフェルラ酸エステラーゼの比活性を測定し、測定方法は、以下の通りである。
１００ｍｇのクーマシーブリリアントブルーＧ－２５０を秤量して５０ｍＬの９０％（ｖ／ｖ）エタノールに溶解した後、１００ｍＬの８５％（ｖ／ｖ）リン酸を加え、蒸留水で１Ｌにメスアップし、クーマシーブリリアントブルーＧ－２５０染液を得た。１００ｍｇのウシアルブミンを秤量して溶解し、蒸留水で１００ｍＬにメスアップし、標準タンパク質溶液を得た。それぞれ０、０．０２、０．０４、０．０６、０．０８、０．１０ｍＬの標準タンパク質溶液を吸い取って、それぞれ１．０、０．９８、０．９６、０．９４、０．９２、０．９０ｍＬの蒸留水に加えた後、それぞれ５ｍＬのクーマシーブリリアントブルーＧ－２５０染液を加えて均一に混合し、混合液を得た。混合液を２５℃で２分反応させ、反応液を得た。５９５ｎｍの波長で反応液の吸光度を測定し、タンパク質濃度の標準曲線をプロットした（標準曲線を図７に示す）。
１００ｍｇのクーマシーブリリアントブルーＧ－２５０を秤量して５０ｍＬの９０％（ｖ／ｖ）エタノールに溶解した後、１００ｍＬの８５％（ｖ／ｖ）リン酸を加え、蒸留水で１Ｌにメスアップし、クーマシーブリリアントブルーＧ－２５０染液を得た。１００ｍｇのウシアルブミンを秤量して溶解し、蒸留水で１００ｍＬにメスアップし、標準タンパク質溶液を得た。それぞれ０、０．０２、０．０４、０．０６、０．０８、０．１０ｍＬの標準タンパク質溶液を吸い取って、それぞれ１．０、０．９８、０．９６、０．９４、０．９２、０．９０ｍＬの蒸留水に加えた後、それぞれ５ｍＬのクーマシーブリリアントブルーＧ－２５０染液を加えて均一に混合し、混合液を得た。混合液を２５℃で２分反応させ、反応液を得た。５９５ｎｍの波長で反応液の吸光度を測定し、タンパク質濃度の標準曲線をプロットした（標準曲線を図７に示す）。
【0049】
実施例２で得られた粗酵素液Ａを１００μＬ取り、蒸留水で１ｍＬにメスアップし、希釈液を得た。希釈液に５ｍＬのクーマシーブリリアントブルーＧ－２５０染液を加えて均一に混合し、混合液を得た。混合液を２５℃で２分反応させ、反応液を得た。５９５ｎｍの波長で反応液の吸光度を測定した。測定された吸光度及びタンパク質濃度の標準曲線に基づき、粗酵素液Ａにおけるタンパク質濃度を計算し、粗酵素液Ａにおけるタンパク質濃度に基づき、粗酵素液Ａにおけるフェルラ酸エステラーゼの比活性を計算した。
【0050】
フェルラ酸エステラーゼの比活性の計算式は、以下の通りである。
【0051】
検出した結果、粗酵素液Ａにおけるタンパク質濃度は０．８１ｍｇ／ｍＬであり、粗酵素液Ａにおけるフェルラ酸エステラーゼの比活性は５１９Ｕ／ｇである。
【0052】
ＰＣＲによってバチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ）ＳＫ５２．００１のゲノムからフェルラ酸エステラーゼの遺伝子を増幅して配列決定した。配列決定の結果としては、粗酵素液Ａにおけるフェルラ酸エステラーゼのアミノ酸配列は配列番号２に示され、粗酵素液Ａにおけるフェルラ酸エステラーゼをコードする遺伝子のヌクレオチド配列は配列番号３に示される。
【0053】
実施例５ フェルラ酸の製造
具体的なステップは、以下の通りである。
具体的なステップは、以下の通りである。
【0054】
実施例１で得られたバチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ）ＳＫ５２．００１の単一コロニーを選別してシード培地に播種し、３０℃、２００ｒ／分のシェーカーで１８時間培養し、シード液を得た。シード液を５％（ｖ／ｖ）の播種量で基本発酵培地に播種し、３０℃、２００ｒ／分のシェーカーで４０時間発酵させ、発酵ブロスを得た。発酵プロセスにおいて、発酵ブロスを絶えずサンプリングした。サンプリングされた発酵ブロスを４℃、１００００ｒｐｍで１０分遠心分離し、粗酵素液を得た。２５０μＬの粗酵素液を７５０μＬの濃度が０．００３ｍｏｌ／Ｌのフェルラ酸メチル溶液（フェルラ酸メチル溶液は、フェルラ酸メチルをｐＨが８．０で、濃度が０．０５ｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液に溶解して得られた）に加え、酵素反応系を得た。酵素反応系を５０℃の水浴鍋で３０分反応させ、反応液を得た。
【0055】
反応液におけるフェルラ酸の収量を測定した（測定結果を図８に示す）。
【0056】
反応液におけるフェルラ酸の収量の検出方法は、以下の通りである。
反応液に対して、まず、沸騰水で酵素を１０分失活させ、続いて、０．２２μｍの膜で濾過し、最後に酵素失活後の粗酵素液をブランク対照とし、ＨＰＬＣ法（高速液体クロマトグラフィー）により反応液におけるフェルラ酸の濃度を測定した。
ＨＰＬＣ法は、Ａｇｉｌｅｎｔ １ ２００型の高速液体クロマトグラフィー、クロマトグラフィー用カラムとしてＺＯＲＢＡＸ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｐｌｕｓ Ｃ１８（Ａｇｉｌｅｎｔ，４．６ｍｍ×１５０ｍｍ，３．５μｍ）、紫外検出器、移動相Ａとして１％（ｖ／ｖ）の酢酸溶液、移動相Ｂとしてメタノール、流速１ｍＬ／分、カラム温度３０℃、検出波長３２０ｎｍを採用し、勾配溶出プログラムは表１に示す通りである。
反応液に対して、まず、沸騰水で酵素を１０分失活させ、続いて、０．２２μｍの膜で濾過し、最後に酵素失活後の粗酵素液をブランク対照とし、ＨＰＬＣ法（高速液体クロマトグラフィー）により反応液におけるフェルラ酸の濃度を測定した。
ＨＰＬＣ法は、Ａｇｉｌｅｎｔ １ ２００型の高速液体クロマトグラフィー、クロマトグラフィー用カラムとしてＺＯＲＢＡＸ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｐｌｕｓ Ｃ１８（Ａｇｉｌｅｎｔ，４．６ｍｍ×１５０ｍｍ，３．５μｍ）、紫外検出器、移動相Ａとして１％（ｖ／ｖ）の酢酸溶液、移動相Ｂとしてメタノール、流速１ｍＬ／分、カラム温度３０℃、検出波長３２０ｎｍを採用し、勾配溶出プログラムは表１に示す通りである。
【0057】
図８に示すように、粗酵素液を２６時間発酵させ、３０分反応させた後、フェルラ酸含有量は２８０ｍｇ／Ｌである。
【0058】
実施例６ 組換え枯草菌の構築
具体的なステップは、以下の通りである。
具体的なステップは、以下の通りである。
【0059】
実施例１で得られたバチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ）ＳＫ５２．００１のゲノムをテンプレートとし、ｆａｅ－Ｆ／ｆａｅ－Ｒをプライマーとし、ＰＣＲ増幅によってフェルラ酸エステラーゼをコードする遺伝子（配列番号３）を得た。フェルラ酸エステラーゼをコードする遺伝子とｐＭＡ５プラスミドを相同組換え酵素ＥｘｎａｓｅＩＩによって連結し、連結産物を得て、連結産物を大腸菌ＤＨ５αコンピテント細胞に形質転換した。形質転換後の大腸菌ＤＨ５αコンピテント細胞をＬＢ固体培地（１００μｇ・ｍＬ－１のアンピシリンを含有する）に塗布し、３７℃で２４時間倒立培養した。陽性形質転換体を選別し、プラスミドを抽出し、配列決定によって検証し、正しいと検証したため、組換えプラスミドＰＭＡ５－ｆａｅを得た。得られた組換えプラスミドＰＭＡ５－ｆａｅを枯草菌ＷＢ８００に形質転換し、形質転換産物を得た。形質転換産物をＬＢ固体培地（１００μｇ・ｍＬ－１のカナマイシンを含有する）に塗布し、３７℃の恒温インキュベータで８～１２時間倒立培養し、形質転換体を得た。形質転換体にＰＣＲ検証を行い、正しいと検証したため、組換え枯草菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＷＢ８００／ＰＭＡ５－ｆａｅを得た。
【0060】
プライマーは、以下の通りである。
ｆａｅ－Ｆ：ａａａａｇｇａｇｃｇａｔｔｔａｃａｔａｔｇＡＴＧＡＡＣＴＴＡＣＡＡＧＡＧＣＡＡＡＴＣＡＡＡＡＴＣＧＣＴＧＣ（配列番号４）
ｆａｅ－Ｒ：ｇａｇｃｔｃｇａｃｔｃｔａｇａｇｇａｔｃｃＴＴＡＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＡＴＧＴＴＣＡＡＡＴＧＣＣＴＴＴ（配列番号５）
ｆａｅ－Ｆ：ａａａａｇｇａｇｃｇａｔｔｔａｃａｔａｔｇＡＴＧＡＡＣＴＴＡＣＡＡＧＡＧＣＡＡＡＴＣＡＡＡＡＴＣＧＣＴＧＣ（配列番号４）
ｆａｅ－Ｒ：ｇａｇｃｔｃｇａｃｔｃｔａｇａｇｇａｔｃｃＴＴＡＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＡＴＧＴＴＣＡＡＡＴＧＣＣＴＴＴ（配列番号５）
【0061】
実施例７ フェルラ酸エステラーゼの製造
具体的なステップは、以下の通りである。
具体的なステップは、以下の通りである。
【0062】
実施例１で得られた組換え枯草菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＷＢ８００／ＰＭＡ５－ｆａｅの形質転換体をＬＢ固体培地（１００μｇ・ｍＬ－１のカナマイシンを含有する）に画線し、３０℃の恒温インキュベータで１２時間倒立培養し、単一コロニーを得た。単一コロニーを選別してＬＢ液体培地（１００μｇ・ｍＬ－１のカナマイシンを含有する）に播種し、３７℃、２００ｒ／分で１２時間培養し、シード液を得た。シード液を３％（ｖ／ｖ）の播種量でＳｕｐｅｒ Ｒｉｃｈ培地に移し、３７℃、２００ｒ／分で６０時間培養し、発酵ブロスを得た。
【0063】
発酵プロセスにおいて、一定の時間ごとに発酵ブロスをサンプリングし、サンプリング量は１ｍＬであり、発酵ブロスを４℃、１００００ｒｐｍで１５分遠心分離し、発酵上澄み及び沈殿を得た。沈殿に１ｍＬの溶解液を加えて菌体を再懸濁させ、再懸濁液（全細胞）を得た。
【0064】
異なる発酵時間で得られた発酵上澄み液及び再懸濁液におけるフェルラ酸エステラーゼの酵素活性を検出した（検出結果を表２に示す）。測定方法は、以下の通りである。
１０μＬの発酵上澄み液又は再懸濁液を９９０μＬの濃度が０．００３ｍｏｌ／Ｌのフェルラ酸メチル溶液（フェルラ酸メチル溶液は、フェルラ酸メチルをｐＨが８．０で、濃度が０．０５ｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液に溶解して得られた）に加え、酵素反応系を得た。酵素反応系を５０℃の水浴鍋で１０分反応させた後、まず沸騰水で酵素を１０分失活させ、続いて、０．２２μｍの膜で濾過し、反応液を得た。酵素失活後の粗酵素液をブランク対照とし、ＨＰＬＣ法（高速液体クロマトグラフィー）により反応液におけるフェルラ酸の濃度を測定た。フェルラ酸の濃度をフェルラ酸エステラーゼの酵素活性の計算式に代入し、粗酵素液におけるフェルラ酸エステラーゼの酵素活性を得た。
１０μＬの発酵上澄み液又は再懸濁液を９９０μＬの濃度が０．００３ｍｏｌ／Ｌのフェルラ酸メチル溶液（フェルラ酸メチル溶液は、フェルラ酸メチルをｐＨが８．０で、濃度が０．０５ｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液に溶解して得られた）に加え、酵素反応系を得た。酵素反応系を５０℃の水浴鍋で１０分反応させた後、まず沸騰水で酵素を１０分失活させ、続いて、０．２２μｍの膜で濾過し、反応液を得た。酵素失活後の粗酵素液をブランク対照とし、ＨＰＬＣ法（高速液体クロマトグラフィー）により反応液におけるフェルラ酸の濃度を測定た。フェルラ酸の濃度をフェルラ酸エステラーゼの酵素活性の計算式に代入し、粗酵素液におけるフェルラ酸エステラーゼの酵素活性を得た。
【0065】
フェルラ酸エステラーゼの酵素活性は、５０℃で１分あたりにフェルラ酸メチルを分解して１μｍｏｌのフェルラ酸を生成するために必要な酵素量が１つの酵素活性単位（１Ｕ）であるように定義されている。
【0066】
フェルラ酸エステラーゼの酵素活性の計算式は、以下の通りである。
【0067】
フェルラ酸標準品の高速液体クロマトグラムは図３に示され、フェルラ酸メチル標準品の高速液体クロマトグラムは図４に示され、反応液の高速液体クロマトグラムは図５に示され、フェルラ酸の濃度は、高速液体クロマトグラムにおけるピーク面積Ｙとフェルラ酸の濃度Ｘの間の線形関係Ｙ＝５２５１４Ｘ－８０．４１７（Ｒ２＝０．９９９６）に基づいて計算することにより得られる。
【0068】
ＨＰＬＣ法は、Ａｇｉｌｅｎｔ １ ２００型の高速液体クロマトグラフィー、クロマトグラフィー用カラムとしてＺＯＲＢＡＸ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｐｌｕｓ Ｃ１８（Ａｇｉｌｅｎｔ，４．６ｍｍ×１５０ｍｍ，３．５μｍ）、紫外検出器、移動相Ａとして１％（ｖ／ｖ）の酢酸溶液、移動相Ｂとしてメタノール、流速１ｍＬ／分、カラム温度３０℃、検出波長３２０ｎｍを採用し、勾配溶出プログラムは表１に示す通りである。
【0069】
表２から分かるように、１４時間発酵した時、組換え枯草菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＷＢ８００／ＰＭＡ５－ｆａｅを発酵させて得られた再懸濁液におけるフェルラ酸エステラーゼの酵素活性は、３．２０Ｕ／ｍＬに達した。６０時間発酵した時、組換え枯草菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＷＢ８００／ＰＭＡ５－ｆａｅを発酵させて得られた発酵上澄み液におけるフェルラ酸エステラーゼの酵素活性は、２０．８０Ｕ／ｍＬに達した。１４時間発酵した後、組換え枯草菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＷＢ８００／ＰＭＡ５－ｆａｅを発酵させて得られた再懸濁液におけるフェルラ酸エステラーゼの酵素活性は、まず低下してから上昇し、これは、菌体が定常期に達した後に絶えず死滅し、菌体数が減少し、細胞内酵素活性が低下し、菌体が死滅して自己溶解した後に栄養素が増加し、菌体数が緩やかに上昇し、更にフェルラ酸エステラーゼの酵素活性が徐々に増加するからである。４０時間発酵した後、組換え枯草菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＷＢ８００／ＰＭＡ５－ｆａｅを発酵させて得られた発酵上澄み液におけるフェルラ酸エステラーゼの酵素活性は絶えず増加し、これは、菌体が絶えず死滅して自己溶解して破砕した後、細胞内のフェルラ酸エステラーゼが放出されることに起因する可能性がある。
【0070】
【0071】
実施例８ フェルラ酸エステラーゼの製造
具体的なステップは、以下の通りである。
具体的なステップは、以下の通りである。
【0072】
枯草菌ＷＢ８００を対照とし、実施例７で得られた組換え枯草菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＷＢ８００／ＰＭＡ５－ｆａｅの形質転換体をＬＢ固体培地（１００μｇ・ｍＬ－１のカナマイシンを含有する）に画線し、３０℃の恒温インキュベータで１２時間倒立培養し、単一コロニーを得た。単一コロニーを選別してＬＢ液体培地（１００μｇ・ｍＬ－１のカナマイシンを含有する）に播種し、３７℃、２００ｒ／分で１２時間培養し、シード液を得た。シード液を３％（ｖ／ｖ）の播種量でＳｕｐｅｒ Ｒｉｃｈ培地に移し、３７℃、２００ｒ／分で１４時間培養し、発酵ブロスを得た。
【0073】
発酵終了後、５ｍＬの発酵ブロスを４℃、８０００ｒｐｍで１５分遠心分離し、発酵上澄み液及び沈殿を得て、沈殿に５ｍＬの溶解液を加えて菌体を再懸濁させ、再懸濁液（全細胞）を得た。再懸濁液を１５分超音波処理し、細胞破砕液を得た。細胞破砕液を４℃、８０００ｒｐｍで１５分遠心分離し、細胞破砕上澄みを得た。
【0074】
枯草菌ＷＢ８００及び組換え枯草菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＷＢ８００／ＰＭＡ５－ｆａｅを発酵させて得られた発酵上澄み液及び細胞破砕上澄み液におけるフェルラ酸エステラーゼの酵素活性を検出した（検出結果を表３に示す）。
【0075】
表３から分かるように、１４時間発酵した時、組換え枯草菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＷＢ８００／ＰＭＡ５－ｆａｅを発酵させて得られた細胞内フェルラ酸エステラーゼの酵素活性は、８２．５３Ｕ／ｍＬであり、６０時間発酵した細胞外フェルラ酸エステラーゼの酵素活性の２０．８０Ｕ／ｍＬよりも４倍高く、また、組換え枯草菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＷＢ８００／ｐＭＡ５－ｆａｅの細胞内フェルラ酸エステラーゼの酵素活性は、枯草菌ＷＢ８００の細胞内フェルラ酸エステラーゼの酵素活性よりも明らかに高い。従って、１４時間発酵した細胞内フェルラ酸エステラーゼを後続の酵素精製の基礎とする。
【0076】
【0077】
実施例９ フェルラ酸エステラーゼの性能
具体的なステップは、以下の通りである。
具体的なステップは、以下の通りである。
【0078】
実施例３で得られた組換え枯草菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＷＢ８００／ＰＭＡ５－ｆａｅを発酵させて得られた細胞破砕上澄み液をニッケルカラムで精製した後、まず、０．０１ｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡを含有する透析液で３回透析し、次に、ＥＤＴＡを含有しない透析液で３回透析し、精製酵素を得た。精製酵素を４℃の冷蔵庫に置いて使用に備えた。
【0079】
精製酵素を０～５０倍希釈した後、実施例５の方法を参照して精製酵素のフェルラ酸エステラーゼの酵素活性を検出した。検出結果を表４に示す。
【0080】
表４から分かるように、２０倍の希釈倍数を選択した場合、最適である。２０倍希釈した精製酵素のフェルラ酸エステラーゼの酵素活性を測定し、測定方法は、以下の通りである。
１００ｍｇのクーマシーブリリアントブルーＧ－２５０を秤量して５０ｍＬの９０％（ｖ／ｖ）エタノールに溶解した後、１００ｍＬの８５％（ｖ／ｖ）リン酸を加え、蒸留水で１Ｌにメスアップし、クーマシーブリリアントブルーＧ－２５０染液を得た。１００ｍｇのウシアルブミンを秤量して溶解し、蒸留水で１００ｍＬにメスアップし、標準タンパク質溶液を得た。それぞれ０、０．０２、０．０４、０．０６、０．０８、０．１０ｍＬの標準タンパク質溶液を吸い取って、それぞれ１．０、０．９８、０．９６、０．９４、０．９２、０．９０ｍＬの蒸留水に加えた後、それぞれ５ｍＬのクーマシーブリリアントブルーＧ－２５０染液を加えて均一に混合し、混合液を得た。混合液を室温（２５℃）で５分反応させ、反応液を得て、５６０ｎｍの波長で反応液の吸光度を測定し、タンパク質濃度の標準曲線をプロットした（標準曲線を図７に示す）。
１００ｍｇのクーマシーブリリアントブルーＧ－２５０を秤量して５０ｍＬの９０％（ｖ／ｖ）エタノールに溶解した後、１００ｍＬの８５％（ｖ／ｖ）リン酸を加え、蒸留水で１Ｌにメスアップし、クーマシーブリリアントブルーＧ－２５０染液を得た。１００ｍｇのウシアルブミンを秤量して溶解し、蒸留水で１００ｍＬにメスアップし、標準タンパク質溶液を得た。それぞれ０、０．０２、０．０４、０．０６、０．０８、０．１０ｍＬの標準タンパク質溶液を吸い取って、それぞれ１．０、０．９８、０．９６、０．９４、０．９２、０．９０ｍＬの蒸留水に加えた後、それぞれ５ｍＬのクーマシーブリリアントブルーＧ－２５０染液を加えて均一に混合し、混合液を得た。混合液を室温（２５℃）で５分反応させ、反応液を得て、５６０ｎｍの波長で反応液の吸光度を測定し、タンパク質濃度の標準曲線をプロットした（標準曲線を図７に示す）。
【0081】
５００μＬの精製酵素をとり、それに５００μＬの蒸留水を加えた後、更に５ｍＬのクーマシーブリリアントブルーＧ－２５０染液を加えて均一に混合し、混合液を得た。混合液を室温（２５℃）で５分反応させ、反応液を得た。５９５ｎｍの波長で反応液の吸光度を測定した。測定された吸光度及びタンパク質濃度の標準曲線に基づき、精製酵素のタンパク質濃度を計算した。２０倍希釈した精製酵素におけるフェルラ酸エステラーゼの酵素活性に基づき、フェルラ酸エステラーゼの比活性を計算した。
【0082】
フェルラ酸エステラーゼの比活性の計算式は、以下の通りである。
【0083】
検出した結果、２０倍希釈した精製酵素のタンパク質濃度は０．１５ｍｇ／ｍＬであり、２０倍希釈した精製酵素のフェルラ酸エステラーゼの比活性は２２３０Ｕ／ｍｇである。
【0084】
【0085】
本発明は、好ましい実施例により上記のように開示されたが、それは本発明を限定するためのものではなく、当業者であれば、本発明の精神及び範囲から逸脱しない限り、多様の変動や修飾を加えることができる。従って、本発明の保護範囲は、特許請求の範囲で指定した内容を基準とするものである。
【生物材料の寄託】
【0086】
バチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ）ＳＫ５２．００１は、その分類学上でＢａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓと命名され、２０２０年８月１４日に中国典型培養物寄託センターに寄託され、寄託番号がＣＣＴＣＣ ＮＯ： Ｍ ２０２０４２１であり、寄託場所が中国武漢の武漢大学である。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【配列表】