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特許7489228ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ヌクレオカプシド断片および該断片を用いて抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体を検出する方法およびキット
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-05-15
(45)【発行日】2024-05-23
(54)【発明の名称】ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ヌクレオカプシド断片および該断片を用いて抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体を検出する方法およびキット
(51)【国際特許分類】
C07K 14/165 20060101AFI20240516BHJP
G01N 33/53 20060101ALI20240516BHJP
G01N 33/535 20060101ALI20240516BHJP
G01N 33/532 20060101ALI20240516BHJP
G01N 33/533 20060101ALI20240516BHJP
G01N 33/543 20060101ALI20240516BHJP
【ＦＩ】
C07K14/165 ZNA
G01N33/53 N
G01N33/535
G01N33/532 B
G01N33/533
G01N33/543 541Z
G01N33/543 521
【請求項の数】
9
(21)【出願番号】P 2020080597
(22)【出願日】2020-04-30
(65)【公開番号】P2021172642
(43)【公開日】2021-11-01
【審査請求日】2023-02-13
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）２０２０年度、国立研究開発法人日本医療研究開発機構、感染症実用化研究事業「新型コロナウイルス感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）の診断法開発に資する研究」委託研究開発、産業技術力強化法第１７条の適用を受ける特許出願
(73)【特許権者】
【識別番号】505155528
【氏名又は名称】公立大学法人横浜市立大学
(73)【特許権者】
【識別番号】591045677
【氏名又は名称】関東化学株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100102842
【弁理士】
【氏名又は名称】葛和 清司
(72)【発明者】
【氏名】梁 明秀
(72)【発明者】
【氏名】山岡 悠太郎
(72)【発明者】
【氏名】相澤 大輔
【審査官】西村 亜希子
(56)【参考文献】
【文献】中国特許出願公開第１１１０２４９５４（ＣＮ，Ａ）
【文献】特開２０１７－１４５２４６（ＪＰ，Ａ）
【文献】Accession No.P0DTC9，Database UniProt [online]，2020年04月22日，Internet, <URL:https:// www.uniprot.org/uniprot/P0DTC9.txt?version=1>, [retrieved on 2021.5.21]
【文献】J. Immunol. Methods，2019年，Vol.466，pp.41-46
【文献】Nature，2020年02月03日，Vol.579，pp.265-269 and Supporting information
【文献】Avian Pathol.，2019年，Vol.48，pp.528-536
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ０７Ｋ
Ｃ１２Ｑ
Ｃ１２Ｍ
Ｃ１２Ｎ
Ｇ０１Ｎ ３３／
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ヌクレオカプシドの断片であって、配列番号２で表されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、健常者血清に含まれるＩｇＭ抗体およびＩｇＧ抗体に対する抗原抗体反応を示さないが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染患者血清に含まれるＩｇＭ抗体およびＩｇＧ抗体に対しては抗原抗体反応を示す、前記断片。
【請求項2】
配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる、請求項１に記載の断片。
【請求項3】
抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体をヒト由来の血液、血漿および／または血清から検出する方法であって、ヒト由来の血液、血漿および／または血清を請求項１または２に記載の断片と接触させる工程を含む、前記方法。
【請求項4】
請求項１または２に記載の断片、および／または、ＩｇＭ抗体またはＩｇＧ抗体と結合する抗体またはその抗原結合断片が、標識物質により標識された、請求項３に記載の方法。
【請求項5】
標識物質が、酵素、化学発光物質、蛍光発光物質、色素、金属コロイド粒子、ラテックス粒子、およびセルロース粒子から選択される１以上のものである、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体が、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥから選択される１以上のものである、請求項３～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体が、ＥＬＩＳＡ法および／またはイムノクロマト法の抗原抗体反応に基づいた方法によって検出される、請求項３～６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
請求項１または２に記載の断片を含む、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体を検出するためのキット。
【請求項9】
イムノクロマトストリップの形態である、請求項８に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ヌクレオカプシドの断片、該断片を用いて抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体をヒト由来の血液、血漿および／または血清から検出する方法およびキット等に関する。
【背景技術】
【0002】
コロナウイルスはエンベロープを有する直径６０～２２０ｎｍの一本鎖（＋）ＲＮＡウイルスであり、ヒトに感染すると呼吸器症状を引き起こすことが知られている。コロナウイルスとして高病原性であるＳＡＲＳ（重症急性呼吸器症候群）コロナウイルスおよびＭＥＲＳ（中東呼吸器症候群）コロナウイルス、低病原性であるヒトコロナウイルスＮＬ６３、ヒトコロナウイルス２２９Ｅ、ヒトコロナウイルスＯＣ４３およびヒトコロナウイルスＨＫＵ１等が知られ、またコロナウイルスは風邪の原因ウイルスであることも知られている。
コロナウイルスの検出方法としてはＰＣＲ法等により、ウイルス中の複数の領域を標的とした遺伝子検査法が知られている。また、コロナウイルスのヌクレオカプシド（以下、「ＮＰ」と記す場合がある）を標的として、抗体を用いたウイルス抗原タンパク質の検出や、感染した患者に産生される抗ウイルス抗体を調べる抗体検出による２種類の免疫学的検査法も知られている（特許文献１および非特許文献１）。
コロナウイルスの検出方法としてはＰＣＲ法等により、ウイルス中の複数の領域を標的とした遺伝子検査法が知られている。また、コロナウイルスのヌクレオカプシド（以下、「ＮＰ」と記す場合がある）を標的として、抗体を用いたウイルス抗原タンパク質の検出や、感染した患者に産生される抗ウイルス抗体を調べる抗体検出による２種類の免疫学的検査法も知られている（特許文献１および非特許文献１）。
【0003】
２０１９新型コロナウイルス（以下、「ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２」と記す場合がある）は、中国武漢市付近で２０１９年に発生が初めて確認された、ＳＡＲＳ関連コロナウイルスに属するコロナウイルスである。ヒトに対して病原性があり、新型コロナウイルス感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）を引き起こす。
現在、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の感染拡大について、ＷＨＯがパンデミック（世界的流行）相当との認識を示している。しかしながら、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染患者の治療法は確立されていない。したがって、適切な感染拡大防止策を講じるために、迅速な検査法によりＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染患者を発見するとともに、免疫学的検査を用いて血清中の抗体保有率を調べることで、感染率や感染経路を調査することは極めて重要である。
現在、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の感染拡大について、ＷＨＯがパンデミック（世界的流行）相当との認識を示している。しかしながら、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染患者の治療法は確立されていない。したがって、適切な感染拡大防止策を講じるために、迅速な検査法によりＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染患者を発見するとともに、免疫学的検査を用いて血清中の抗体保有率を調べることで、感染率や感染経路を調査することは極めて重要である。
【0004】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出方法としては、採取した鼻腔ぬぐい液、咽頭ぬぐい液、喀痰等を検体とするリアルタイム逆転写ＰＣＲ法等の遺伝子検査が主に使用されている（非特許文献２および３）。これによってＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の有無を判断することが可能である。他方、前記遺伝子検査では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染しているにも関わらず検体の採取場所、採取時期、保管方法等の影響で前記検体からＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が検出されない事例（偽陰性）が多発しており、これはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が感染拡大する一因となっている。また、遺伝子検査にはＰＣＲ中リアルタイムで蛍光を検出する特殊で特別な装置が必要となり、また結果を得るためには数時間を要することから、感染現場および防疫現場等の設備が十分とはいえない場所における早期発見において実用性に課題が残る。そこで、正確性、迅速性および簡便性を兼ね備えた検査方法として、抗原抗体反応を利用した免疫学的検査法が求められている。免疫学検査には、抗原検出と抗体検出の２種類の方法が知られているが、現在、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に関しては、検体の採取が容易であり、他の生化学検査と並行して実施可能な血液／血漿／血清を用いた抗体検査法の開発と検討が進められている。
【0005】
例えば、非特許文献４には、市販の抗ＳＡＲＳ-ＣｏＶ－２抗体検出キットを用いて、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染患者の発症後日数ごとの抗体陽性率を調べたことが報告されている。発症後日数が１－６日では陽性率が７．１％、７－８日では２５．０％、９－１２日では５２．４％、１３日以降では９６．９％であり、また、非特異反応を否定できない抗体の陽性例があったことが報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0006】
【文献】特開２０１７－１４５２４６号公報
【非特許文献】
【0007】
【文献】Yu et al., Clin. Vaccine Immunol., 14, 146-149 (2007)
【文献】２０１９－ｎＣｏＶ（新型コロナウイルス）感染を疑う患者の検体採取・輸送マニュアル（国立感染症研究所、２０２０年２月２８日）
【文献】病原体検出マニュアル ２０１９－ｎＣｏＶ Ｖｅｒ．２．７（国立感染症研究所、２０２０年２月２５日）
【文献】迅速簡易検出法（イムノクロマト法）による血中抗ＳＡＲＳ-ＣｏＶ-２抗体の評価（国立感染症研究所、２０２０年４月1日）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
本発明は、正確、簡便、かつ迅速に抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体を検出するための手段を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【0009】
本発明者らは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰと他のコロナウイルス由来ＮＰとを分析した結果、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰのアミノ酸配列と他のコロナウイルス由来ＮＰのアミノ酸配列との間で同一性が低い領域を見出した。そして上記課題を鑑み、該領域に対応するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰの断片を作製することによって、本発明を完成するに至った。
【0010】
すなわち、本発明は以下に関する。
［１］ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ヌクレオカプシドの断片であって、配列番号２で表されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる、前記断片。
［２］配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる、［１］の断片。
［３］抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体をヒト由来の血液、血漿および／または血清から検出する方法であって、ヒト由来の血液、血漿および／または血清を［１］または［２］の断片と接触させる工程を含む、前記方法。
［４］［１］または［２］の断片および／または抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体を認識する抗体またはその断片が標識物質により標識された、［３］の方法。
［５］標識物質が、酵素、化学発光物質、蛍光発光物質、色素、金属コロイド粒子、ラテックス粒子、セルロース粒子等から選択される１以上のものである、［４］の方法。
［６］抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体が、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥから選択される１以上のものである、［３］～［５］のいずれかの方法。
［７］抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体が、ＥＬＩＳＡ法および／またはイムノクロマト法等の抗原抗体反応に基づいた方法によって検出される、［３］～［６］のいずれかの方法。
［８］［１］または［２］の断片を含む、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体を検出するためのキット。
［９］イムノクロマトストリップの形態である、［８］のキット。
［１］ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ヌクレオカプシドの断片であって、配列番号２で表されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる、前記断片。
［２］配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる、［１］の断片。
［３］抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体をヒト由来の血液、血漿および／または血清から検出する方法であって、ヒト由来の血液、血漿および／または血清を［１］または［２］の断片と接触させる工程を含む、前記方法。
［４］［１］または［２］の断片および／または抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体を認識する抗体またはその断片が標識物質により標識された、［３］の方法。
［５］標識物質が、酵素、化学発光物質、蛍光発光物質、色素、金属コロイド粒子、ラテックス粒子、セルロース粒子等から選択される１以上のものである、［４］の方法。
［６］抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体が、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥから選択される１以上のものである、［３］～［５］のいずれかの方法。
［７］抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体が、ＥＬＩＳＡ法および／またはイムノクロマト法等の抗原抗体反応に基づいた方法によって検出される、［３］～［６］のいずれかの方法。
［８］［１］または［２］の断片を含む、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体を検出するためのキット。
［９］イムノクロマトストリップの形態である、［８］のキット。
【発明の効果】
【0011】
本発明のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰの断片、該断片を用いて抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体をヒト由来の血液、血漿および／または血清から検出する方法およびキット等により、正確、簡便、かつ迅速にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の感染の有無、あるいは既往歴を検出することが可能である。これは、一般にヒトは風邪の原因である低病原性コロナウイルスに対する抗体を有しているところ、本発明のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰの断片は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰのアミノ酸配列と他のコロナウイルス由来ＮＰのアミノ酸配列との間で同一性が低い領域から構成されることから、該断片に対する抗体を、ヒト由来の血液、血漿および／または血清から特異的に検出することが可能であるためである。
【0012】
また、本発明のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰの断片等をリアルタイム逆転写ＰＣＲ法等の遺伝子検査と併用することにより、該遺伝子検査で偽陰性と判断された検体を改めて正確に検査することができ、偽陰性が生じる事例を減少させることが可能である。そして、医療従事者が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染患者と直接対面して鼻腔ぬぐい液、咽頭ぬぐい液、喀痰等の検体を採取する必要がないことから、医療従事者自身へのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を防ぐことも可能である。
【図面の簡単な説明】
【0013】
【図1】図１は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰと他のコロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３、ＨＣｏＶ－ＨＫＵ１、およびＨＣｏＶ－２２９Ｅ）由来ＮＰとの間のアミノ酸配列の同一性およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰのＢ細胞エピトープ予測によるエピトープ、およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ感染者のエピトープに基づく抗原性を示す。本発明では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰの中で抗原性が高く、他のコロナウイルス由来ＮＰと共通するモチーフを除いたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰの断片（配列番号１で表されるアミノ酸配列の１２１～４１９番目の領域）を抗原とする。
【図2】図２は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰの断片の調製の結果を示す。図２Ａは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰの断片の発現を確認した結果を示す。図２ＢはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰの断片を精製した結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【0014】
本明細書において別様に定義されない限り、本明細書で用いる全ての技術用語および科学用語は、当業者が通常理解しているものと同じ意味を有する。本明細書中で参照する全ての特許、出願および他の出版物や情報は、その全体を参照により本明細書に援用する。
【0015】
［ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ヌクレオカプシドの断片］
本発明の一側面は、配列番号２で表されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ヌクレオカプシドの断片（以下、「本発明の断片」と記す場合がある）に関する。
本発明の一側面は、配列番号２で表されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ヌクレオカプシドの断片（以下、「本発明の断片」と記す場合がある）に関する。
【0016】
本発明において、「ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２」は、中国武漢市付近で２０１９年に発生が初めて確認された、ＳＡＲＳ関連コロナウイルスに属するコロナウイルスを指し、「２０１９新型コロナウイルス」と互換的に用いられる。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、ヒトに対して病原性があり、急性呼吸器疾患（ＣＯＶＩＤ－１９）を引き起こす。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、他のコロナウイルスと同様に、スパイク、ヌクレオ、内在性膜タンパク質、エンベロープタンパク質、およびＲＮＡより構成されている。このうちヌクレオがＲＮＡと結合してＮＰを形成し、脂質と結合したスパイク、内在性膜タンパク質、エンベロープタンパク質がその周りを取り囲んでエンベロープを形成する。なお、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のゲノム配列はGenBankアクセッション番号MN908947.3で公開されている。
【0017】
本発明において、「ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ヌクレオカプシド」は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のヌクレオおよびＲＮＡからなる複合体を指し、「ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰ」と互換的に用いられる。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰのアミノ酸配列は配列番号１で表される。
本発明において、「ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ヌクレオカプシドの断片」は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰのアミノ酸配列（配列番号１）における、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰのアミノ酸配列と他のコロナウイルス由来ＮＰのアミノ酸配列との間で同一性が低い領域（配列番号１で表されるアミノ酸配列の１２１～４１９番目の領域）からなるタンパク質の断片を指す。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰの断片は、配列番号２で表されるアミノ酸配列に対して、９０％以上の配列同一性を有する。正確、簡便、かつ迅速に抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体を検出する観点から、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰの断片は、配列番号２で表されるアミノ酸配列に対して、９５％以上の配列同一性を有することが好ましく、９８％以上の配列同一性を有することが特に好ましく、１００％の配列同一性を有することがさらに好ましい。一態様において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰの断片は、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるものである。
本発明において、「ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ヌクレオカプシドの断片」は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰのアミノ酸配列（配列番号１）における、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰのアミノ酸配列と他のコロナウイルス由来ＮＰのアミノ酸配列との間で同一性が低い領域（配列番号１で表されるアミノ酸配列の１２１～４１９番目の領域）からなるタンパク質の断片を指す。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰの断片は、配列番号２で表されるアミノ酸配列に対して、９０％以上の配列同一性を有する。正確、簡便、かつ迅速に抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体を検出する観点から、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰの断片は、配列番号２で表されるアミノ酸配列に対して、９５％以上の配列同一性を有することが好ましく、９８％以上の配列同一性を有することが特に好ましく、１００％の配列同一性を有することがさらに好ましい。一態様において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰの断片は、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるものである。
【0018】
［抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体をヒト由来の血液、血漿および／または血清から検出する方法］
本発明の別の側面は、ヒト由来の血液、血漿および／または血清を本発明の断片と接触させる工程を含む、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体をヒト由来の血液、血漿および／または血清から検出する方法（以下、「本発明の方法」と記す場合がある）に関する。一態様において、本発明の方法は、本発明の断片と抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体との間で抗原抗体反応を行う工程、および／または、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体と抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体を認識する抗体またはその断片との間で抗原抗体反応を行う工程をさらに含む。一態様において、本発明の断片および／または抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体を認識する抗体またはその断片は、標識物質により標識されている。
本発明の別の側面は、ヒト由来の血液、血漿および／または血清を本発明の断片と接触させる工程を含む、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体をヒト由来の血液、血漿および／または血清から検出する方法（以下、「本発明の方法」と記す場合がある）に関する。一態様において、本発明の方法は、本発明の断片と抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体との間で抗原抗体反応を行う工程、および／または、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体と抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体を認識する抗体またはその断片との間で抗原抗体反応を行う工程をさらに含む。一態様において、本発明の断片および／または抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体を認識する抗体またはその断片は、標識物質により標識されている。
【0019】
本発明において、「ヒト由来の血液、血漿および／または血清」は、任意の健常者および／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染患者から採取された血液、血漿および／または血清を指す。正確、簡便、かつ迅速に抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体を検出する観点から、ヒト由来の血漿および／または血清を使用することが好ましく、ヒト由来の血清を使用することが特に好ましい。
急性期において、正確、簡便、かつ迅速に抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体を検出する観点から、ヒト由来の血液、血漿および／または血清は、発病後７日以内に採取されたものが好ましく、発病後３日以内に採取されたものが特に好ましく、発病後１日以内に採取されたものがさらに好ましい。また、回復期において、正確、簡便、かつ迅速に抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体を検出する観点から、ヒト由来の血液、血漿および／または血清は、発病後１４～２８日以内に採取されたものが好ましく、発病後１４～２５日以内に採取されたものが特に好ましく、発病後１４～２０日以内に採取されたものがさらに好ましい。正確、簡便、かつ迅速に抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体を検出する観点から、採取したヒト由来の血液、血漿および／または血清を、－２０℃以下の温度で保存するのが好ましく、－８０℃以下の温度で保存するのが特に好ましい。
急性期において、正確、簡便、かつ迅速に抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体を検出する観点から、ヒト由来の血液、血漿および／または血清は、発病後７日以内に採取されたものが好ましく、発病後３日以内に採取されたものが特に好ましく、発病後１日以内に採取されたものがさらに好ましい。また、回復期において、正確、簡便、かつ迅速に抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体を検出する観点から、ヒト由来の血液、血漿および／または血清は、発病後１４～２８日以内に採取されたものが好ましく、発病後１４～２５日以内に採取されたものが特に好ましく、発病後１４～２０日以内に採取されたものがさらに好ましい。正確、簡便、かつ迅速に抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体を検出する観点から、採取したヒト由来の血液、血漿および／または血清を、－２０℃以下の温度で保存するのが好ましく、－８０℃以下の温度で保存するのが特に好ましい。
【0020】
ヒト由来の血液、血漿および／または血清は常法に従い分離することができる。
例えば、血清は、非特許文献２に記載のとおり、分離後の血清を密栓できるプラスティックチューブに１～２ｍｌ入れ、蓋をした後、パラフィルムでシールする。凝固剤が入っていてもよく、血清分離剤入りの採血管を用いた場合は、遠心後の血清１～２ｍｌをプラスチックチューブ（滅菌チューブが望ましい）に移し蓋をした後、パラフィルムでシールする。
また、例えば、全血は、非特許文献２に記載のとおり、血液凝固阻止剤（ＥＤＴＡ－ＮａまたＫ）入りの採血管に採取し、１～２ｍｌを密栓できるプラスティックチューブに分注し、蓋をした後、パラフィルムでシールする。可能であれば、血球分離し、末梢血単核球を細胞保存液に懸濁して凍結保存する。末梢血単核球の分離はＢＤバキュテイナ（登録商標）ＣＰＴ（商標）単核球分離用採血管を使うと簡便である。また、採血後の分注や血球分離ができない場合は、ＰＡＸｇｅｎｅ（登録商標）ＲＮＡ採血管を用いて採血し、そのまま凍結保存しておいてもよい。
例えば、血清は、非特許文献２に記載のとおり、分離後の血清を密栓できるプラスティックチューブに１～２ｍｌ入れ、蓋をした後、パラフィルムでシールする。凝固剤が入っていてもよく、血清分離剤入りの採血管を用いた場合は、遠心後の血清１～２ｍｌをプラスチックチューブ（滅菌チューブが望ましい）に移し蓋をした後、パラフィルムでシールする。
また、例えば、全血は、非特許文献２に記載のとおり、血液凝固阻止剤（ＥＤＴＡ－ＮａまたＫ）入りの採血管に採取し、１～２ｍｌを密栓できるプラスティックチューブに分注し、蓋をした後、パラフィルムでシールする。可能であれば、血球分離し、末梢血単核球を細胞保存液に懸濁して凍結保存する。末梢血単核球の分離はＢＤバキュテイナ（登録商標）ＣＰＴ（商標）単核球分離用採血管を使うと簡便である。また、採血後の分注や血球分離ができない場合は、ＰＡＸｇｅｎｅ（登録商標）ＲＮＡ採血管を用いて採血し、そのまま凍結保存しておいてもよい。
【0021】
本発明において、「標識物質」は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰの断片、または抗体を標識する任意の物質を指し、抗原抗体反応を検出できるものであれば特に限定されない。正確、簡便、かつ迅速に抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体を検出する観点から、標識物質は、酵素、化学発光物質、蛍光発光物質、色素、金属コロイド粒子、ラテックス粒子、セルロース粒子等から選択される１以上のものであることが好ましい。
本発明において、「抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体」は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の感染による免疫応答の結果生じた生体由来の抗体を指し、ヒト由来の血液、血漿および／または血清において存在する。正確、簡便、かつ迅速に抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体を検出する観点から、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥからなる群から選択される１以上のものであることが好ましく、ＩｇＧおよび／またはＩｇＭであることが特に好ましく、ＩｇＧであることがさらに好ましい。
本発明において、「抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体」は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の感染による免疫応答の結果生じた生体由来の抗体を指し、ヒト由来の血液、血漿および／または血清において存在する。正確、簡便、かつ迅速に抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体を検出する観点から、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥからなる群から選択される１以上のものであることが好ましく、ＩｇＧおよび／またはＩｇＭであることが特に好ましく、ＩｇＧであることがさらに好ましい。
【0022】
本発明において、「抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体を認識する抗体またはその断片」は、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体に特異的に結合し得る抗体またはその断片を指す。正確、簡便、かつ迅速に抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体を検出する観点から、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体を認識する抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥからなる群から選択される１以上のものであることが好ましく、ＩｇＧおよび／またはＩｇＭであることが特に好ましく、ＩｇＧであることがさらに好ましい。抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体を認識する抗体の断片は、ＦａｂフラグメントまたはＶ－、ＶＨ－またはＣＤＲ－領域等の免疫グロブリン分子の部分を含むが、当該断片も、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体を認識する抗体と同程度に抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体に特異的に結合し得るものである。さらに、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体を認識する抗体は、キメラのおよびヒト化した抗体のような、修飾および／または変化した抗体を含む。抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体を認識する抗体は、修飾または変化したモノクローナルまたはポリクローナル抗体、ならびに、組み換えもしくは合成的に産生したまたは合成した抗体も含む。抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体を認識する抗体の断片は、抗体フラグメント、ならびに、分離した軽鎖および重鎖、Ｆａｂ、Ｆａｂ／ｃ、Ｆｖ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２等の、それらの部分も含む。抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体を認識する抗体は、二機能性抗体のような抗体派生物、および、単鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）、二重特異性ｓｃＦｖｓまたは抗体融合タンパク質のような抗体構築物も含む。
【0023】
本発明において、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体は、本発明の断片と抗体との抗原抗体反応を検出できる任意の免疫学検査によって検出される。免疫学検査は、例えば、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ、ＥＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、化学発光免疫測定法（ＣＩＡ、ＬＩＡ）、酵素抗体法、蛍光抗体法、イムノクロマトグラフィー法（イムノクロマト法）、フィルター抗原アッセイ法、免疫比濁法、ラテックス比濁法、ラテックス凝集反応測定法、赤血球凝集反応法、または粒子凝集反応法等を含む。正確、簡便、かつ迅速に抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体を検出する観点から、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体は、ＥＬＩＳＡ法および／またはイムノクロマト法によって検出されることが好ましい。また、所定量の本発明の断片と抗体との抗原抗体反応から検量線を作成し、測定値を検量線に内挿することによって抗体を定量することもできる。
【0024】
［抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体を検出するためのキット］
本発明の別の側面は、本発明の断片を含む、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体を検出するためのキット（以下、「本発明のキット」と記す場合がある）に関する。正確、簡便、かつ迅速に抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体を検出する観点、医療従事者が感染現場および防疫現場等の設備が十分とはいえない場所で抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体を検出する観点、疫学調査をする観点等から、本発明のキットは、イムノクロマトストリップの形態であることが好ましい。
本発明の別の側面は、本発明の断片を含む、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体を検出するためのキット（以下、「本発明のキット」と記す場合がある）に関する。正確、簡便、かつ迅速に抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体を検出する観点、医療従事者が感染現場および防疫現場等の設備が十分とはいえない場所で抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体を検出する観点、疫学調査をする観点等から、本発明のキットは、イムノクロマトストリップの形態であることが好ましい。
【0025】
［抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体を検出するための組成物］
本発明の別の側面は、本発明の断片を含む、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体を検出するための組成物（以下、「本発明の組成物」と記す場合がある）に関する。
［ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の診断方法］
本発明の別の側面は、ヒト由来の血液、血漿および／または血清を本発明の断片と接触させる工程を含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の診断方法（以下、「本発明の診断方法」と記す場合がある）に関する。一態様において、本発明の診断方法は、本発明の断片と抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体との間で抗原抗体反応を行う工程、および／または、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体と抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体を認識する抗体またはその断片との間で抗原抗体反応を行う工程をさらに含む。一態様において、本発明の断片および／または抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体を認識する抗体またはその断片は、標識物質により標識されている。
本発明の別の側面は、本発明の断片を含む、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体を検出するための組成物（以下、「本発明の組成物」と記す場合がある）に関する。
［ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の診断方法］
本発明の別の側面は、ヒト由来の血液、血漿および／または血清を本発明の断片と接触させる工程を含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の診断方法（以下、「本発明の診断方法」と記す場合がある）に関する。一態様において、本発明の診断方法は、本発明の断片と抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体との間で抗原抗体反応を行う工程、および／または、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体と抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体を認識する抗体またはその断片との間で抗原抗体反応を行う工程をさらに含む。一態様において、本発明の断片および／または抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体を認識する抗体またはその断片は、標識物質により標識されている。
【実施例】
【0026】
例１ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰの断片の調製
配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰの断片を以下の方法により調製した。なお、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰは配列番号１で表されるアミノ酸配列からなり、該アミノ酸配列に対応するＲＮＡ配列は配列番号３で表され、該ＲＮＡ配列に対応するＤＮＡ配列は配列番号４で表される。なお、該ＤＮＡ配列は、アミノ酸配列に基づき真核細胞でのタンパク質合成用にコドン最適化させている。
配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰの断片を以下の方法により調製した。なお、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰは配列番号１で表されるアミノ酸配列からなり、該アミノ酸配列に対応するＲＮＡ配列は配列番号３で表され、該ＲＮＡ配列に対応するＤＮＡ配列は配列番号４で表される。なお、該ＤＮＡ配列は、アミノ酸配列に基づき真核細胞でのタンパク質合成用にコドン最適化させている。
【0027】
［ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰの断片の無細胞タンパク質合成］
まず、配列番号４で表されるＤＮＡ配列を用いて、該ＤＮＡ配列を鋳型とするＰＣＲ法により、配列番号１で表されるアミノ酸配列の１２１～４１９番目の領域（図１）に対応する配列番号４で表されるＤＮＡ配列の３６１～１２６０番目の領域をＰＣＲ法により増幅し、セルフリーサイエンス社のＷＥＰＲＯ７２４０キットの使用説明書に従って、Ｈｉｓタグが付加されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰの断片（配列番号１で表されるアミノ酸配列の１２１～４１９番目の領域（図１））を小麦胚芽抽出液により無細胞タンパク質合成した。
まず、配列番号４で表されるＤＮＡ配列を用いて、該ＤＮＡ配列を鋳型とするＰＣＲ法により、配列番号１で表されるアミノ酸配列の１２１～４１９番目の領域（図１）に対応する配列番号４で表されるＤＮＡ配列の３６１～１２６０番目の領域をＰＣＲ法により増幅し、セルフリーサイエンス社のＷＥＰＲＯ７２４０キットの使用説明書に従って、Ｈｉｓタグが付加されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰの断片（配列番号１で表されるアミノ酸配列の１２１～４１９番目の領域（図１））を小麦胚芽抽出液により無細胞タンパク質合成した。
【0028】
［ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰの断片の発現の確認］
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰの断片の発現を、ウエスタンブロット法によって確認した。まず、Ｈｉｓタグが付加されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰの断片を２×ＳＤＳサンプル緩衝液（１２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、４％ＳＤＳ、２０％グリセロール、０．０１％ブロモフェノールブルー、および１０％２－メルカプトエタノール）と混合して熱処理し、ポリアクリルアミドゲルに供して電気泳動した。次に、電気泳動後のゲルをＰＶＤＦメンブレンに転写した。メンブレンを２％スキムミルク溶液でブロッキングした後、ペルオキシダーゼ標識された抗Ｈｉｓタグ抗体と反応させた。その後、ＨＲＰ標識二次抗体と反応した後に、ペルオキシダーゼ基質溶液を加えて発光させ、化学発光撮影装置を用いて検出した。
その結果、Ｈｉｓタグが付加されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰの断片の分子量は３３．７ｋＤａであるところ、該分子量に対応する位置にバンドが確認されたことから（図２Ａ）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰの断片の発現を確認することができた。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰの断片の発現を、ウエスタンブロット法によって確認した。まず、Ｈｉｓタグが付加されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰの断片を２×ＳＤＳサンプル緩衝液（１２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、４％ＳＤＳ、２０％グリセロール、０．０１％ブロモフェノールブルー、および１０％２－メルカプトエタノール）と混合して熱処理し、ポリアクリルアミドゲルに供して電気泳動した。次に、電気泳動後のゲルをＰＶＤＦメンブレンに転写した。メンブレンを２％スキムミルク溶液でブロッキングした後、ペルオキシダーゼ標識された抗Ｈｉｓタグ抗体と反応させた。その後、ＨＲＰ標識二次抗体と反応した後に、ペルオキシダーゼ基質溶液を加えて発光させ、化学発光撮影装置を用いて検出した。
その結果、Ｈｉｓタグが付加されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰの断片の分子量は３３．７ｋＤａであるところ、該分子量に対応する位置にバンドが確認されたことから（図２Ａ）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰの断片の発現を確認することができた。
【0029】
［ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰの断片の精製］
無細胞タンパク質合成の反応液からＮｉカラムを用いてＨｉｓタグが付加されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰの断片を精製した。転写、無細胞タンパク質合成、および精製の一連の工程は、自動合成装置（セルフリーサイエンス社）を使用して行った。Ｈｉｓタグが付加されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰの断片を３回にわたって精製し、１～３回目の精製画分をそれぞれＥ１～Ｅ３とした。Ｅ１～Ｅ３を２×ＳＤＳサンプル緩衝液（１２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、４％ＳＤＳ、２０％グリセロール、０．０１％ブロモフェノールブルー、および１０％２－メルカプトエタノール）と混合して熱処理し、ポリアクリルアミドゲルに供して電気泳動し、Ｒａｐｉｄ ＣＢＢ ＫＡＮＴＯ ３Ｓ（関東化学株式会社）によって染色した。
その結果、精製前の溶液（Ｓ：可溶性画分）と比較してＥ１～Ｅ３では夾雑タンパク質の存在量が低減されたことから（図２Ｂ）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰの断片が精製されたことを確認することができた。
無細胞タンパク質合成の反応液からＮｉカラムを用いてＨｉｓタグが付加されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰの断片を精製した。転写、無細胞タンパク質合成、および精製の一連の工程は、自動合成装置（セルフリーサイエンス社）を使用して行った。Ｈｉｓタグが付加されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰの断片を３回にわたって精製し、１～３回目の精製画分をそれぞれＥ１～Ｅ３とした。Ｅ１～Ｅ３を２×ＳＤＳサンプル緩衝液（１２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、４％ＳＤＳ、２０％グリセロール、０．０１％ブロモフェノールブルー、および１０％２－メルカプトエタノール）と混合して熱処理し、ポリアクリルアミドゲルに供して電気泳動し、Ｒａｐｉｄ ＣＢＢ ＫＡＮＴＯ ３Ｓ（関東化学株式会社）によって染色した。
その結果、精製前の溶液（Ｓ：可溶性画分）と比較してＥ１～Ｅ３では夾雑タンパク質の存在量が低減されたことから（図２Ｂ）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰの断片が精製されたことを確認することができた。
【0030】
例２ ウエスタンブロット法によるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出
例１で得たＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰの断片を使用するウエスタンブロット法によってＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のヒト血清からの検出が可能であるか否かを検討した。具体的には、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰの断片が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染患者血清に含まれるＩｇＭ抗体およびＩｇＧ抗体に対して抗原抗体反応を示すか否かをウエスタンブロット法によって評価した。また、比較のために、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰの断片の代わりに、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰおよび他のコロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＨＫＵ１、および２２９Ｅ）由来ＮＰを使用した。
例１で得たＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰの断片を使用するウエスタンブロット法によってＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のヒト血清からの検出が可能であるか否かを検討した。具体的には、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰの断片が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染患者血清に含まれるＩｇＭ抗体およびＩｇＧ抗体に対して抗原抗体反応を示すか否かをウエスタンブロット法によって評価した。また、比較のために、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰの断片の代わりに、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰおよび他のコロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＨＫＵ１、および２２９Ｅ）由来ＮＰを使用した。
【0031】
［各ＮＰの無細胞タンパク質合成］
まず、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＨＫＵ１、および２２９Ｅ由来ＮＰをコードする各ＤＮＡ配列を合成した（ジーンウィズ社に委託）（それぞれ配列番号５、６、７、および８で表される）。なお、各ＤＮＡ配列は、アミノ酸配列に基づき真核細胞でのタンパク質合成用にコドン最適化させている。
次に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰおよび他のコロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＨＫＵ１、および２２９Ｅ）由来ＮＰを、それぞれ例１に記載の方法と同様な手順で無細胞タンパク質合成し、精製した。
まず、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＨＫＵ１、および２２９Ｅ由来ＮＰをコードする各ＤＮＡ配列を合成した（ジーンウィズ社に委託）（それぞれ配列番号５、６、７、および８で表される）。なお、各ＤＮＡ配列は、アミノ酸配列に基づき真核細胞でのタンパク質合成用にコドン最適化させている。
次に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰおよび他のコロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＨＫＵ１、および２２９Ｅ）由来ＮＰを、それぞれ例１に記載の方法と同様な手順で無細胞タンパク質合成し、精製した。
【0032】
［ウエスタンブロット法による抗原抗体反応の確認］
まず、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰの断片およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰおよび他のコロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＨＫＵ１、および２２９Ｅ）由来ＮＰを２×ＳＤＳサンプル緩衝液（１２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、４％ＳＤＳ、２０％グリセロール、０．０１％ブロモフェノールブルー、および１０％２－メルカプトエタノール）と混合して熱処理し、ポリアクリルアミドゲルに供して電気泳動した。次に、電気泳動後のゲルをＰＶＤＦメンブレンに転写した。メンブレンを２％スキムミルク溶液でブロッキングした後、健常者血清または患者血清と反応させた。そして、さらにペルオキシダーゼ標識された抗ＩｇＭ抗体または抗ＩｇＧ抗体（ＨＲＰヤギ抗ヒトＩｇＭ抗体またはＩｇＧ抗体）と反応させ、その後、ペルオキシダーゼ基質溶液（1-Step（商標）Ultra TMB-ELISA Substrate Solution、サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を加えて発色させ、波長４５０ｎｍでの吸光度を測定した。なお、健常者血清および患者血清は、５６℃で３０分間加熱し、等量の２％ＮＰ－４０／ＰＢＳを加え、室温で１５分間静置したものを使用した。
まず、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰの断片およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰおよび他のコロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＨＫＵ１、および２２９Ｅ）由来ＮＰを２×ＳＤＳサンプル緩衝液（１２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、４％ＳＤＳ、２０％グリセロール、０．０１％ブロモフェノールブルー、および１０％２－メルカプトエタノール）と混合して熱処理し、ポリアクリルアミドゲルに供して電気泳動した。次に、電気泳動後のゲルをＰＶＤＦメンブレンに転写した。メンブレンを２％スキムミルク溶液でブロッキングした後、健常者血清または患者血清と反応させた。そして、さらにペルオキシダーゼ標識された抗ＩｇＭ抗体または抗ＩｇＧ抗体（ＨＲＰヤギ抗ヒトＩｇＭ抗体またはＩｇＧ抗体）と反応させ、その後、ペルオキシダーゼ基質溶液（1-Step（商標）Ultra TMB-ELISA Substrate Solution、サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を加えて発色させ、波長４５０ｎｍでの吸光度を測定した。なお、健常者血清および患者血清は、５６℃で３０分間加熱し、等量の２％ＮＰ－４０／ＰＢＳを加え、室温で１５分間静置したものを使用した。
【0033】
その結果、健常者血清を加えた反応系では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰおよび他のコロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＨＫＵ１、および２２９Ｅ）由来ＮＰについてＩｇＭ抗体およびＩｇＧ抗体に対する抗原抗体反応が見られたのに対して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰの断片についてはＩｇＭ抗体およびＩｇＧ抗体に対する抗原抗体反応が見られなかった。他方、患者血清を加えた反応系では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰの断片についてＩｇＭ抗体およびＩｇＧ抗体に対する抗原抗体反応が見られた（図３）。
【0034】
よって、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰの断片は、健常者血清に含まれるＩｇＭ抗体およびＩｇＧ抗体に対する抗原抗体反応を示さないが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染患者血清に含まれるＩｇＭ抗体およびＩｇＧ抗体しては抗原抗体反応を示すことがわかった。これは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰの断片（配列番号１で表されるアミノ酸配列の１２１～４１９番目の領域）に対するＩｇＭ抗体およびＩｇＧ抗体が健常者血清には存在しないが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染患者血清には存在するためであると考えられる。すなわち、血清中に含まれる抗体とＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰの断片との抗原抗体反応をウエスタンブロット法で評価することにより、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染について陽性であるか陰性であるかの判断をすることが可能であると考えられる。
以上から、ウエスタンブロット法によるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のヒト血清からの検出が可能であることが示された。
以上から、ウエスタンブロット法によるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のヒト血清からの検出が可能であることが示された。
【0035】
例３ ＥＬＩＳＡ法によるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出
例１で得たＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰの断片を使用するＥＬＩＳＡ法によってＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のヒト血清からの検出が可能であるか否かを検討した。具体的には、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰの断片が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染患者血清に含まれるＩｇＭ抗体およびＩｇＧ抗体に対して抗原抗体反応を示すか否かをＥＬＩＳＡ法によって評価した。
例１で得たＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰの断片を使用するＥＬＩＳＡ法によってＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のヒト血清からの検出が可能であるか否かを検討した。具体的には、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰの断片が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染患者血清に含まれるＩｇＭ抗体およびＩｇＧ抗体に対して抗原抗体反応を示すか否かをＥＬＩＳＡ法によって評価した。
【0036】
ＰＢＳ中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰの断片を１００ｎｇ／ウェルでＥＬＩＳＡプレート（MaxiSorp（商標）、サーモフィッシャーサイエンティフィック社）に加えて固定化し（４℃、終夜）、３％スキムミルク溶液（ＰＢＳ）でブロッキングした（室温、２時間）。プレートをＰＢＳ－Ｔ（０．０５％ Tween20）で３回洗浄後、１％スキムミルク（ＰＢＳ－Ｔ）で２５倍から２倍ずつ段階希釈した健常者血清（Ａ、１８９５９、１８４２７、１８３４０、１８８１６、および１８５７６）または患者血清（１、Ｅ、Ｈ、Ｍａ、Ｍｉ、Ｎ、Ｓ１、Ｔ、およびＳ２）をそれぞれウェルに分注して室温で１時間反応させた。プレートをＰＢＳ－Ｔ（０．０５％ Tween20）で３回洗浄した後に、ペルオキシダーゼ標識された抗ＩｇＭ抗体または抗ＩｇＧ抗体（ＨＲＰヤギ抗ヒトＩｇＭ抗体またはＩｇＧ抗体）と室温で１時間反応させた。プレートをＰＢＳ－Ｔ（０．０５％ Tween20）で３回洗浄した後に、ペルオキシダーゼ基質溶液（1-Step（商標）Ultra TMB-ELISA Substrate Solution、サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を加えて発色させ、波長４５０ｎｍでの吸光度を測定した。なお、健常者血清および患者血清は、５６℃で３０分間加熱し、等量の１％ＮＰ－４０／ＰＢＳを加え、室温で１５分間静置したものを使用した。また、比較のために、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰの断片をＥＬＩＳＡプレートに固定化しない反応系を使用した。
【0037】
その結果、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰの断片をＥＬＩＳＡプレートに固定化しない反応系では、健常者血清および患者血清のいずれの反応系においても抗原抗体反応がほとんど見られなかったのに対して（図４Ａ）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰの断片をＥＬＩＳＡプレートに固定化した反応系では、患者血清の反応系において用量依存的な抗原抗体反応が見られた（図４Ｂ）。図４Ａの吸光度をＮとし、図４Ｂの吸光度をＳとした場合のＳ／Ｎ比を縦軸としたグラフを図４Ｃに示す。
【0038】
よって、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰの断片は、健常者血清に含まれるＩｇＭ抗体およびＩｇＧ抗体に対する抗原抗体反応を示さないが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染患者血清に含まれるＩｇＭ抗体およびＩｇＧ抗体に対しては抗原抗体反応を示すことがわかった。これは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰの断片（配列番号１で表されるアミノ酸配列の１２１～４１９番目の領域）に対するＩｇＭ抗体およびＩｇＧ抗体が健常者血清には存在しないが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染患者血清には存在するためであると考えられる。すなわち、血清中に含まれる抗体とＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰの断片との抗原抗体反応をＥＬＩＳＡ法で評価することにより、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染について陽性であるか陰性であるかを高感度に判断することが可能であると考えられる。
以上から、ＥＬＩＳＡ法によるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のヒト血清からの検出が可能であることが示された。
以上から、ＥＬＩＳＡ法によるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のヒト血清からの検出が可能であることが示された。
【0039】
例４ イムノクロマト法による抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体の検出
例１で得たＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰの断片を使用するイムノクロマト法によって、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体（ＩｇＧ）をヒト血清から検出可能であるか否かを検討した。
例１で得たＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰの断片を使用するイムノクロマト法によって、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体（ＩｇＧ）をヒト血清から検出可能であるか否かを検討した。
【0040】
まず、５０ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）を用いて、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰの断片の濃度を１.７５ｍｇ／ｍＬに調製した。次に、ニトロセルロースメンブレンに対して、試験ライン用にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＮＰの断片を、対照ライン用に 抗ヤギＩｇＧ抗体を、塗布装置（武蔵エンジニアリング社）により線上に塗布した。ニトロセルロースメンブレンをカゼインでブロッキングした後、純水で洗浄して乾燥させ、これをイムノクロマトストリップとした（図５Ａ）。
【0041】
次に、５０μＬの健常者血清または患者血清と５０μＬの金コロイド標識抗ヒトＩｇＧヤギ抗体（ＯＤ５３０＝ 2.0）を混合し、直ちに前記イムノクロマトストリップの試料パッドに滴下した。滴下（反応開始）から１５分後、３０分後に試験ラインにおける呈色を目視で観察した。なお、健常者血清および患者血清は、５６℃で３０分間加熱し、等量の１％ＮＰ－４０／ＰＢＳを加え、室温で１５分間静置したものを使用した。
【0042】
その結果、健常者血清を加えた反応系では、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体（ＩｇＧ）の存在を示す試験ラインが出現しなかったのに対し、患者血清を加えた反応系では、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体（ＩｇＧ抗体）の存在を示す試験ラインが出現した（図５Ｂ）。
よって、当該イムノクロマト法によって、ヒト血清中からＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を示す抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体を検出可能であることが示された。
よって、当該イムノクロマト法によって、ヒト血清中からＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を示す抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体を検出可能であることが示された。
【0043】
本明細書に記載された本発明の種々の特徴は様々に組み合わせることができ、そのような組み合せにより得られる態様は、本明細書に具体的に記載されていない組み合せも含め、すべて本発明の範囲内である。また、当業者は、本発明の精神から逸脱しない多数の様々な改変が可能であることを理解しており、かかる改変を含む均等物も本発明の範囲に含まれる。したがって、本明細書に記載された態様は例示にすぎず、これらが本発明の範囲を制限する意図をもって記載されたものではないことを理解すべきである。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【配列表】