知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-05-15
(45)【発行日】2024-05-23
(54)【発明の名称】多能性幹細胞を含む細胞集団及びその製造方法
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/06 20060101AFI20240516BHJP
C12N 5/074 20100101ALI20240516BHJP
C12N 5/0735 20100101ALI20240516BHJP
C12N 5/0775 20100101ALI20240516BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240516BHJP
C12N 15/12 20060101ALN20240516BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/06 ZNA
C12N5/074
C12N5/0735
C12N5/0775
C12N5/10
C12N15/12
【請求項の数】
8
(21)【出願番号】P 2021511858
(86)(22)【出願日】2020-03-25
(86)【国際出願番号】 JP2020013279
(87)【国際公開番号】W WO2020203538
(87)【国際公開日】2020-10-08
【審査請求日】2023-02-08
(31)【優先権主張番号】P 2019066845
(32)【優先日】2019-03-29
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(73)【特許権者】
【識別番号】000000941
【氏名又は名称】株式会社カネカ
(74)【代理人】
【識別番号】100141139
【弁理士】
【氏名又は名称】及川 周
(74)【代理人】
【識別番号】100134359
【弁理士】
【氏名又は名称】勝俣 智夫
(74)【代理人】
【識別番号】100162868
【弁理士】
【氏名又は名称】伊藤 英輔
(74)【代理人】
【識別番号】100178847
【弁理士】
【氏名又は名称】服部 映美
(72)【発明者】
【氏名】竹内 一博
(72)【発明者】
【氏名】伊吹 将人
【審査官】山本 匡子
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１８／１６４２４０（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１７／１７５８７６（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１６／０５２７５９（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１８／２３５５８３（ＷＯ，Ａ１）
【文献】NAKAGAWA M. et al.，A novel efficient feeder-free culture system for the derivation of human induced pluripotent stem cells，Sci Rep.，2014年01月08日，4:3594，DOI:10.1038/srep03594
【文献】TANO K. et al.，A Novel In Vitro Method for Detecting Undifferentiated Human Pluripotent Stem Cells as Impurities in Cell Therapy Products Using a Highly Efficient Culture System，PLOS ONE，2014年10月27日，Vol.9, Issue 10，e110496，DOI: 10.1371/journal.pone.0110496
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １／００－５／２８
Ｃ１２Ｑ
ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＣＡＰＬＵＳ（ＳＴＮ）
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
多能性幹細胞を含む細胞集団を培養する工程と、前記多能性幹細胞を含む細胞集団の中から、以下に示す（ａ）及び（ｂ）の特性を有する細胞集団を選別する工程と、
を含む、多能性幹細胞を含む細胞集団の製造方法；
（ａ）前記細胞集団において、β－Ａｃｔｉｎ遺伝子の発現量に対するＬＥＦ１遺伝子の相対発現量が５．５×１０－４以下であり、
（ｂ）前記細胞集団において、ＬＥＦ１が陽性を呈する細胞の比率が５５％以下である。
【請求項2】
多能性幹細胞を含む細胞集団を培養する工程と、前記細胞集団が、以下に示す（ａ）及び（ｂ）の特性を有する細胞集団であるかを確認する工程と、
前記（ａ）及び（ｂ）の特性を有する細胞集団であることが確認された前記細胞集団を取得する工程と
を含む、多能性幹細胞を含む細胞集団の製造方法；
（ａ）前記細胞集団において、β－Ａｃｔｉｎ遺伝子の発現量に対するＬＥＦ１遺伝子の相対発現量が５．５×１０－４以下であり、
（ｂ）前記細胞集団において、ＬＥＦ１が陽性を呈する細胞の比率が５５％以下である。
【請求項3】
多能性幹細胞を含む細胞集団を培養する工程と、前記多能性幹細胞を含む細胞集団の中から、以下に示す（ａ）及び（ｂ）の特性を有する細胞集団を選別する工程と、
前記（ａ）及び（ｂ）の特性を有する細胞集団を分化誘導因子の存在下で培養する工程と、
を含む体細胞の製造方法；
（ａ）前記細胞集団において、β－Ａｃｔｉｎ遺伝子の発現量に対するＬＥＦ１遺伝子の相対発現量が５．５×１０－４以下であり、
（ｂ）前記細胞集団において、ＬＥＦ１が陽性を呈する細胞の比率が５５％以下である。
【請求項4】
多能性幹細胞を含む細胞集団を培養する工程と、前記細胞集団が、以下に示す（ａ）及び（ｂ）の特性を有する細胞集団であるかを確認する工程と、
前記（ａ）及び（ｂ）の特性を有する細胞集団であることが確認された前記細胞集団を、分化誘導因子の存在下で培養する工程と、
を含む、体細胞の製造方法；
（ａ）前記細胞集団において、β－Ａｃｔｉｎ遺伝子の発現量に対するＬＥＦ１遺伝子の相対発現量が５．５×１０－４以下であり、
（ｂ）前記細胞集団において、ＬＥＦ１が陽性を呈する細胞の比率が５５％以下である。
【請求項5】
前記体細胞が、内胚葉系細胞、中胚葉系細胞、及び外胚葉系細胞からなる群より選択される、請求項３また４に記載の製造方法。
【請求項6】
前記体細胞が、心筋細胞、骨格筋細胞、神経細胞、巨核球、造血幹細胞、気道上皮細胞、生殖細胞、樹状細胞、好酸球、肥満細胞、軟骨細胞、T細胞、エリスロポエチン産生細胞、腸管上皮、膵臓細胞、肝細胞、肺胞上皮細胞、及び腎臓細胞からなる群より選択される少なくとも１つである、請求項３または４に記載の製造方法。
【請求項7】
以下に示す（ａ）及び（ｂ）の特性を指標として、多能性幹細胞を含む細胞集団の分化能をモニタリングする方法；（ａ）前記細胞集団において、β－Ａｃｔｉｎ遺伝子の発現量に対するＬＥＦ１遺伝子の相対発現量が５．５×１０－４以下であり、
（ｂ）前記細胞集団において、ＬＥＦ１が陽性を呈する多能性幹細胞の比率が５５％以下である。
【請求項8】
以下に示す（ａ）及び（ｂ）の特性を指標として、多能性幹細胞を含む細胞集団の分化能を評価する方法；（ａ）前記細胞集団において、β－Ａｃｔｉｎ遺伝子の発現量に対するＬＥＦ１遺伝子の相対発現量が５．５×１０－４以下であり、
（ｂ）前記細胞集団において、ＬＥＦ１が陽性を呈する多能性幹細胞の比率が５５％以下である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、多能性幹細胞を含む細胞集団、及びその製造方法に関する。本発明はさらに、体細胞の製造方法に関する。本発明はさらに、多能性幹細胞を含む細胞集団における多能性幹細胞の分化能をモニタリングする方法に関する。本発明はさらに、多能性幹細胞を含む細胞集団における多能性幹細胞の分化能を評価する方法に関する。
本願は、２０１９年３月２９日に、日本に出願された特願２０１９－０６６８４５号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
本願は、２０１９年３月２９日に、日本に出願された特願２０１９－０６６８４５号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
【背景技術】
【0002】
ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞は、無限に増殖できる能力と様々な体細胞に分化する能力を有している。多能性幹細胞から分化誘導させた体細胞を移植する治療法の実用化によって、難治性疾患や生活習慣病に対する治療法を根本的に変革できる可能性を有する。多能性幹細胞を用いた再生医療の実用化に際しては、多能性幹細胞を効率よく目的体細胞へ分化誘導する技術の確立が必要である。多能性幹細胞を目的細胞へと効率よく分化誘導させるための取り組みは、種々報告されている。例えば、出発原料となる多能性幹細胞集団の均質性を高める取り組み、具体的には、多能性幹細胞の未分化性を維持しながら培養する方法、及び未分化状態から逸脱した細胞（未分化逸脱細胞）を除去する方法が挙げられる。
【0003】
特許文献１には、ヒト多能性幹細胞におけるＣＨＤ７の発現レベルを測定することを含む、該多能性幹細胞の分化能の予測方法が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0004】
【文献】国際公開第２０１８／２３５５８３号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
しかしながら、特許文献１には、多能性幹細胞を含む細胞集団の中から特定の優れた特徴を有する幹細胞集団を選択的に調製すること、具体的には、効率的な分化誘導を可能とする未分化能を高く維持した細胞集団を、多能性幹細胞の特性を指標として選択的に調製することについては、記載も示唆もない。
本発明は、効率的に分化誘導可能である多能性幹細胞を含む細胞集団、及び多能性幹細胞の製造方法を提供することを解決すべき課題とした。本発明はさらに、上記の多能性幹細胞を含む細胞集団を用いた、体細胞の製造方法を提供することを解決すべき課題とした。本発明はさらに、多能性幹細胞を含む細胞集団における多能性幹細胞の分化能をモニタリングする方法を提供することを解決すべき課題とした。
本発明は、効率的に分化誘導可能である多能性幹細胞を含む細胞集団、及び多能性幹細胞の製造方法を提供することを解決すべき課題とした。本発明はさらに、上記の多能性幹細胞を含む細胞集団を用いた、体細胞の製造方法を提供することを解決すべき課題とした。本発明はさらに、多能性幹細胞を含む細胞集団における多能性幹細胞の分化能をモニタリングする方法を提供することを解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【0006】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、多能性幹細胞の未分化維持培養において、ＬＥＦ１遺伝子発現量及びＬＥＦ１が陽性を呈する多能性幹細胞の比率が所定の値以下である多能性幹細胞を含む細胞集団では、未分化逸脱細胞の出現頻度が低く、ＬＥＦ１遺伝子発現量及びＬＥＦ１が陽性を呈する多能性幹細胞の比率が所定の値以上である多能性幹細胞を含む細胞集団では、未分化逸脱細胞が多く出現することを見出した。これにより、ＬＥＦ１を指標にして細胞を選別することで、未分化逸脱細胞の含有率が低い多能性幹細胞を調製することができ、より高効率に体細胞へ分化誘導できることが判明した。本発明は、これらの知見に基づいて完成したものである。
【0007】
すなわち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
＜１＞ 多能性幹細胞を含む細胞集団を培養する工程と、
前記多能性幹細胞を含む細胞集団の中から、以下に示す（ａ）及び（ｂ）の特性を有する細胞集団を選別する工程と、を含む、多能性幹細胞を含む細胞集団の製造方法；
（ａ）前記細胞集団において、β－Ａｃｔｉｎ遺伝子の発現量に対するＬＥＦ１遺伝子の相対発現量が５．５×１０－４以下であり、
（ｂ）前記細胞集団において、ＬＥＦ１が陽性を呈する細胞の比率が５５％以下である。
＜２＞ 多能性幹細胞を含む細胞集団を培養する工程と、
前記細胞集団が、以下に示す（ａ）及び（ｂ）の特性を有する細胞集団であるかを確認する工程と、
前記（ａ）及び（ｂ）の特性を有する細胞集団であることが確認された前記細胞集団を取得する工程と
を含む、多能性幹細胞を含む細胞集団の製造方法；
（ａ）前記細胞集団において、β－Ａｃｔｉｎ遺伝子の発現量に対するＬＥＦ１遺伝子の相対発現量が５．５×１０－４以下であり、
（ｂ）前記細胞集団において、ＬＥＦ１が陽性を呈する細胞の比率が５５％以下である。
＜３＞ 多能性幹細胞を含む細胞集団を培養する工程と、
前記多能性幹細胞を含む細胞集団の中から、以下に示す（ａ）及び（ｂ）の特性を有する細胞集団を選別する工程と、
前記（ａ）及び（ｂ）の特性を有する細胞集団を分化誘導因子の存在下で培養する工程と、を含む体細胞の製造方法；
（ａ）前記細胞集団において、β－Ａｃｔｉｎ遺伝子の発現量に対するＬＥＦ１遺伝子の相対発現量が５．５×１０－４以下であり、
（ｂ）前記細胞集団において、ＬＥＦ１が陽性を呈する細胞の比率が５５％以下である。
＜４＞ 多能性幹細胞を含む細胞集団を培養する工程と、
前記細胞集団が、以下に示す（ａ）及び（ｂ）の特性を有する細胞集団であるかを確認する工程と、
前記（ａ）及び（ｂ）の特性を有する細胞集団であることが確認された前記細胞集団を、分化誘導因子の存在下で培養する工程と、
を含む、体細胞の製造方法；
（ａ）前記細胞集団において、β－Ａｃｔｉｎ遺伝子の発現量に対するＬＥＦ１遺伝子の相対発現量が５．５×１０－４以下であり、
（ｂ）前記細胞集団において、ＬＥＦ１が陽性を呈する細胞の比率が５５％以下である。
＜５＞ 前記体細胞が、内胚葉系細胞、中胚葉系細胞、及び外胚葉系細胞からなる群より選択される少なくとも１つである、＜３＞また＜４＞に記載の製造方法。
＜６＞ 前記体細胞が、心筋細胞、骨格筋細胞、神経細胞、巨核球、造血幹細胞、気道上皮細胞、生殖細胞、樹状細胞、好酸球、肥満細胞、軟骨細胞、Ｔ細胞、エリスロポエチン産生細胞、腸管上皮、膵臓細胞、肝細胞、肺胞上皮細胞、及び腎臓細胞からなる群より選択される少なくとも１つである、＜３＞または＜４＞に記載の製造方法。
＜６－１＞ 前記（ａ）及び（ｂ）の特性を有する細胞集団を選別する工程が、多能性幹細胞を含む細胞集団をＲＯＣＫ阻害剤の存在下において培養することを含む、＜１＞、＜３＞、＜５＞、および＜６＞の何れかに記載の方法。
＜６－２＞ 前記多能性幹細胞を含む細胞集団を培養する工程が、多能性幹細胞を含む細胞集団をＲＯＣＫ阻害剤の存在下において培養することを含む、＜１＞～＜６＞の何れかに記載の方法。
＜７＞ 多能性幹細胞を含む細胞集団であって、以下に示す（ａ）及び（ｂ）の特性を有する細胞集団：
（ａ）前記細胞集団において、β－Ａｃｔｉｎ遺伝子の発現量に対するＬＥＦ１遺伝子の相対発現量が５．５×１０－４以下であり、
（ｂ）前記細胞集団において、ＬＥＦ１が陽性を呈する多能性幹細胞の比率が５５％以下である。
＜７－１＞ 以下に示す（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）の特性をさらに有する、＜７＞に記載の細胞集団：
（ｃ）前記細胞集団において、β－Ａｃｔｉｎ遺伝子の発現量に対するＯｃｔ４遺伝子の相対発現量が２．０×１０－１以上であり、
（ｄ）前記細胞集団において、β－Ａｃｔｉｎ遺伝子の発現量に対するＳｏｘ２遺伝子の相対発現量が１．０×１０－２以上であり、
（ｅ）前記細胞集団において、β－Ａｃｔｉｎ遺伝子の発現量に対するＮａｎｏｇ遺伝子の相対発現量が１．２×１０－２以上である。
＜７－２＞ 以下に示す（ｆ）、（ｇ）及び（ｈ）の特性をさらに有する、＜７＞又は＜７－１＞に記載の細胞集団：
（ｆ）前記細胞集団において、β－Ａｃｔｉｎ遺伝子の発現量に対するＢｒａｃｈｙｕｒｙ遺伝子の相対発現量が１．０×１０－４以下であり、
（ｇ）前記細胞集団において、β－Ａｃｔｉｎ遺伝子の発現量に対するＳｏｘ１７遺伝子の相対発現量が１．０×１０－４以下であり、
（ｈ）前記細胞集団において、β－Ａｃｔｉｎ遺伝子の発現量に対するＰａｘ６遺伝子の相対発現量が１．０×１０－４以下である。
＜８＞ 以下に示す（ａ）及び（ｂ）の特性を指標として、多能性幹細胞を含む細胞集団の分化能をモニタリングする方法；
（ａ）前記細胞集団において、β－Ａｃｔｉｎ遺伝子の発現量に対するＬＥＦ１遺伝子の相対発現量が５．５×１０－４以下であり、
（ｂ）前記細胞集団において、ＬＥＦ１が陽性を呈する多能性幹細胞の比率が５５％以下である。
＜８－１＞ 多能性幹細胞の分化能のモニタリングを、ＲＯＣＫ阻害剤の存在下において行う、＜８＞に記載の方法。
＜９＞ 以下に示す（ａ）及び（ｂ）の特性を指標として、多能性幹細胞を含む細胞集団の分化能を評価する方法；
（ａ）前記細胞集団において、β－Ａｃｔｉｎ遺伝子の発現量に対するＬＥＦ１遺伝子の相対発現量が５．５×１０－４以下であり、
（ｂ）前記細胞集団において、ＬＥＦ１が陽性を呈する多能性幹細胞の比率が５５％以下である。
＜１＞ 多能性幹細胞を含む細胞集団を培養する工程と、
前記多能性幹細胞を含む細胞集団の中から、以下に示す（ａ）及び（ｂ）の特性を有する細胞集団を選別する工程と、を含む、多能性幹細胞を含む細胞集団の製造方法；
（ａ）前記細胞集団において、β－Ａｃｔｉｎ遺伝子の発現量に対するＬＥＦ１遺伝子の相対発現量が５．５×１０－４以下であり、
（ｂ）前記細胞集団において、ＬＥＦ１が陽性を呈する細胞の比率が５５％以下である。
＜２＞ 多能性幹細胞を含む細胞集団を培養する工程と、
前記細胞集団が、以下に示す（ａ）及び（ｂ）の特性を有する細胞集団であるかを確認する工程と、
前記（ａ）及び（ｂ）の特性を有する細胞集団であることが確認された前記細胞集団を取得する工程と
を含む、多能性幹細胞を含む細胞集団の製造方法；
（ａ）前記細胞集団において、β－Ａｃｔｉｎ遺伝子の発現量に対するＬＥＦ１遺伝子の相対発現量が５．５×１０－４以下であり、
（ｂ）前記細胞集団において、ＬＥＦ１が陽性を呈する細胞の比率が５５％以下である。
＜３＞ 多能性幹細胞を含む細胞集団を培養する工程と、
前記多能性幹細胞を含む細胞集団の中から、以下に示す（ａ）及び（ｂ）の特性を有する細胞集団を選別する工程と、
前記（ａ）及び（ｂ）の特性を有する細胞集団を分化誘導因子の存在下で培養する工程と、を含む体細胞の製造方法；
（ａ）前記細胞集団において、β－Ａｃｔｉｎ遺伝子の発現量に対するＬＥＦ１遺伝子の相対発現量が５．５×１０－４以下であり、
（ｂ）前記細胞集団において、ＬＥＦ１が陽性を呈する細胞の比率が５５％以下である。
＜４＞ 多能性幹細胞を含む細胞集団を培養する工程と、
前記細胞集団が、以下に示す（ａ）及び（ｂ）の特性を有する細胞集団であるかを確認する工程と、
前記（ａ）及び（ｂ）の特性を有する細胞集団であることが確認された前記細胞集団を、分化誘導因子の存在下で培養する工程と、
を含む、体細胞の製造方法；
（ａ）前記細胞集団において、β－Ａｃｔｉｎ遺伝子の発現量に対するＬＥＦ１遺伝子の相対発現量が５．５×１０－４以下であり、
（ｂ）前記細胞集団において、ＬＥＦ１が陽性を呈する細胞の比率が５５％以下である。
＜５＞ 前記体細胞が、内胚葉系細胞、中胚葉系細胞、及び外胚葉系細胞からなる群より選択される少なくとも１つである、＜３＞また＜４＞に記載の製造方法。
＜６＞ 前記体細胞が、心筋細胞、骨格筋細胞、神経細胞、巨核球、造血幹細胞、気道上皮細胞、生殖細胞、樹状細胞、好酸球、肥満細胞、軟骨細胞、Ｔ細胞、エリスロポエチン産生細胞、腸管上皮、膵臓細胞、肝細胞、肺胞上皮細胞、及び腎臓細胞からなる群より選択される少なくとも１つである、＜３＞または＜４＞に記載の製造方法。
＜６－１＞ 前記（ａ）及び（ｂ）の特性を有する細胞集団を選別する工程が、多能性幹細胞を含む細胞集団をＲＯＣＫ阻害剤の存在下において培養することを含む、＜１＞、＜３＞、＜５＞、および＜６＞の何れかに記載の方法。
＜６－２＞ 前記多能性幹細胞を含む細胞集団を培養する工程が、多能性幹細胞を含む細胞集団をＲＯＣＫ阻害剤の存在下において培養することを含む、＜１＞～＜６＞の何れかに記載の方法。
＜７＞ 多能性幹細胞を含む細胞集団であって、以下に示す（ａ）及び（ｂ）の特性を有する細胞集団：
（ａ）前記細胞集団において、β－Ａｃｔｉｎ遺伝子の発現量に対するＬＥＦ１遺伝子の相対発現量が５．５×１０－４以下であり、
（ｂ）前記細胞集団において、ＬＥＦ１が陽性を呈する多能性幹細胞の比率が５５％以下である。
＜７－１＞ 以下に示す（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）の特性をさらに有する、＜７＞に記載の細胞集団：
（ｃ）前記細胞集団において、β－Ａｃｔｉｎ遺伝子の発現量に対するＯｃｔ４遺伝子の相対発現量が２．０×１０－１以上であり、
（ｄ）前記細胞集団において、β－Ａｃｔｉｎ遺伝子の発現量に対するＳｏｘ２遺伝子の相対発現量が１．０×１０－２以上であり、
（ｅ）前記細胞集団において、β－Ａｃｔｉｎ遺伝子の発現量に対するＮａｎｏｇ遺伝子の相対発現量が１．２×１０－２以上である。
＜７－２＞ 以下に示す（ｆ）、（ｇ）及び（ｈ）の特性をさらに有する、＜７＞又は＜７－１＞に記載の細胞集団：
（ｆ）前記細胞集団において、β－Ａｃｔｉｎ遺伝子の発現量に対するＢｒａｃｈｙｕｒｙ遺伝子の相対発現量が１．０×１０－４以下であり、
（ｇ）前記細胞集団において、β－Ａｃｔｉｎ遺伝子の発現量に対するＳｏｘ１７遺伝子の相対発現量が１．０×１０－４以下であり、
（ｈ）前記細胞集団において、β－Ａｃｔｉｎ遺伝子の発現量に対するＰａｘ６遺伝子の相対発現量が１．０×１０－４以下である。
＜８＞ 以下に示す（ａ）及び（ｂ）の特性を指標として、多能性幹細胞を含む細胞集団の分化能をモニタリングする方法；
（ａ）前記細胞集団において、β－Ａｃｔｉｎ遺伝子の発現量に対するＬＥＦ１遺伝子の相対発現量が５．５×１０－４以下であり、
（ｂ）前記細胞集団において、ＬＥＦ１が陽性を呈する多能性幹細胞の比率が５５％以下である。
＜８－１＞ 多能性幹細胞の分化能のモニタリングを、ＲＯＣＫ阻害剤の存在下において行う、＜８＞に記載の方法。
＜９＞ 以下に示す（ａ）及び（ｂ）の特性を指標として、多能性幹細胞を含む細胞集団の分化能を評価する方法；
（ａ）前記細胞集団において、β－Ａｃｔｉｎ遺伝子の発現量に対するＬＥＦ１遺伝子の相対発現量が５．５×１０－４以下であり、
（ｂ）前記細胞集団において、ＬＥＦ１が陽性を呈する多能性幹細胞の比率が５５％以下である。
【発明の効果】
【0008】
本発明の方法によれば、高効率に体細胞へと分化誘導可能な多能性幹細胞を含む細胞集団を製造できる。また、本発明による多能性幹細胞を含む細胞集団は、高効率に体細胞へと分化誘導可能である。
【図面の簡単な説明】
【0009】
【図2A】図２Ａ～２Ｃは、ヒトｉＰＳ細胞の培養５日目におけるＬＥＦ１遺伝子発現量、未分化マーカー遺伝子発現量及び分化マーカー遺伝子発現量を測定した結果を示す。図２Ａは、未分化マーカー遺伝子発現量を測定した結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【0010】
［多能性幹細胞を含む細胞集団］
本発明による多能性幹細胞を含む細胞集団は、以下に示す（ａ）及び（ｂ）の特性を有する細胞集団である：
（ａ）前記細胞集団において、β－Ａｃｔｉｎ遺伝子の発現量に対するＬＥＦ１遺伝子の相対発現量が５．５×１０－４以下であり、
（ｂ）前記細胞集団において、ＬＥＦ１が陽性を呈する多能性幹細胞の比率が５５％以下である。
本発明による多能性幹細胞を含む細胞集団は、以下に示す（ａ）及び（ｂ）の特性を有する細胞集団である：
（ａ）前記細胞集団において、β－Ａｃｔｉｎ遺伝子の発現量に対するＬＥＦ１遺伝子の相対発現量が５．５×１０－４以下であり、
（ｂ）前記細胞集団において、ＬＥＦ１が陽性を呈する多能性幹細胞の比率が５５％以下である。
【0011】
β－Ａｃｔｉｎ遺伝子は、ハウスキーピング遺伝子でありＡＣＴＢとも表記され、定量的リアルタイムＰＣＲの内在性コントロールとして用いられる遺伝子の１種である。ヒトβ―Ａｃｔｉｎ遺伝子（ＧＥＮＥ ＩＤ：６０）のｃＤＮＡ配列及び前記ｃＤＮＡ配列にコードされるアミノ酸配列としては、ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ：ＮＭ＿００１１０１．５及びＮＰ＿００１０９２．１として登録されているものそれぞれが挙げられる。
ＬＥＦ１遺伝子は、Ｌｙｍｐｈｏｉｄ ｅｎｈａｎｃｅｒ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ １遺伝子である。ＬＥＦ１は、別名として、ＬＥＦ－１、ＴＣＦ１０、ＴＣＦ１ＡＬＰＨＡ、ＴＣＦ７Ｌ３とも表記される。ＬＥＦ１は、生物の発生に重要なＷＮＴ／β－ｃａｔｅｎｉｎシグナルにおける転写因子であり、β－ｃａｔｅｎｉｎを介してＷＮＴ標的遺伝子の転写に関わることが報告されている。ヒトＬＥＦ１遺伝子（ＧＥＮＥ ＩＤ：５１１７６）のｃＤＮＡ配列及び前記ｃＤＮＡ配列にコードされるアミノ酸配列としては、ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ：ＮＭ＿０１６２６９．５及びＮＰ＿０５７３５３．１（配列番号３１及び３２）、ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ：００１１３０７１３．２及びＮＰ＿００１１２４１８５．１（配列番号３３及び３４）、ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ：ＮＭ＿００１１３０７１４．２及びＮＰ＿００１１２４１８６．１（配列番号３５及び３６）、並びにＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ：ＮＭ＿００１１６６１１９．１及びＮＰ＿００１１５９５９１．１（配列番号３７及び３８）として登録されているものがそれぞれ挙げられる。
ＬＥＦ１遺伝子は、Ｌｙｍｐｈｏｉｄ ｅｎｈａｎｃｅｒ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ １遺伝子である。ＬＥＦ１は、別名として、ＬＥＦ－１、ＴＣＦ１０、ＴＣＦ１ＡＬＰＨＡ、ＴＣＦ７Ｌ３とも表記される。ＬＥＦ１は、生物の発生に重要なＷＮＴ／β－ｃａｔｅｎｉｎシグナルにおける転写因子であり、β－ｃａｔｅｎｉｎを介してＷＮＴ標的遺伝子の転写に関わることが報告されている。ヒトＬＥＦ１遺伝子（ＧＥＮＥ ＩＤ：５１１７６）のｃＤＮＡ配列及び前記ｃＤＮＡ配列にコードされるアミノ酸配列としては、ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ：ＮＭ＿０１６２６９．５及びＮＰ＿０５７３５３．１（配列番号３１及び３２）、ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ：００１１３０７１３．２及びＮＰ＿００１１２４１８５．１（配列番号３３及び３４）、ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ：ＮＭ＿００１１３０７１４．２及びＮＰ＿００１１２４１８６．１（配列番号３５及び３６）、並びにＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ：ＮＭ＿００１１６６１１９．１及びＮＰ＿００１１５９５９１．１（配列番号３７及び３８）として登録されているものがそれぞれ挙げられる。
【0012】
（多能性幹細胞）
多能性幹細胞とは、生体を構成する全ての種類の細胞に分化することができる多分化能（多能性）を有する細胞であって、適切な条件下のインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）での培養において多能性を維持したまま無限に増殖を続けることができる細胞をいう。具体的には胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、胎児の始原生殖細胞由来の多能性幹細胞（ＥＧ細胞：Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１９９８，９５：１３７２６－３１）、精巣由来の多能性幹細胞（ＧＳ細胞：Ｎａｔｕｒｅ．２００８，４５６：３４４－９）、人工多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ；ｉＰＳ細胞）、ヒトの体性幹細胞（組織幹細胞）などが挙げられるが、これに限定されるものではない。本発明に用いる多能性幹細胞は、好ましくは、ｉＰＳ細胞又はＥＳ細胞であり、より好ましくはｉＰＳ細胞である。
多能性幹細胞とは、生体を構成する全ての種類の細胞に分化することができる多分化能（多能性）を有する細胞であって、適切な条件下のインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）での培養において多能性を維持したまま無限に増殖を続けることができる細胞をいう。具体的には胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、胎児の始原生殖細胞由来の多能性幹細胞（ＥＧ細胞：Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１９９８，９５：１３７２６－３１）、精巣由来の多能性幹細胞（ＧＳ細胞：Ｎａｔｕｒｅ．２００８，４５６：３４４－９）、人工多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ；ｉＰＳ細胞）、ヒトの体性幹細胞（組織幹細胞）などが挙げられるが、これに限定されるものではない。本発明に用いる多能性幹細胞は、好ましくは、ｉＰＳ細胞又はＥＳ細胞であり、より好ましくはｉＰＳ細胞である。
【0013】
ＥＳ細胞としては、任意の温血動物、好ましくは哺乳動物に由来する細胞を使用できる。哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ヤギ、サル、又はヒトが挙げられる。好ましくはヒトに由来する細胞を使用できる。
【0014】
ＥＳ細胞の具体例としては、着床以前の初期胚を培養することによって樹立した哺乳動物等のＥＳ細胞、体細胞の核を核移植することによって作製された初期胚を培養することによって樹立したＥＳ細胞、及びこれらのＥＳ細胞の染色体上の遺伝子を遺伝子工学の手法を用いて改変したＥＳ細胞が挙げられる。各ＥＳ細胞は当分野で通常実施されている方法や、公知文献に従って調製することができる。 マウスのＥＳ細胞は、１９８１年にエバンスら（Ｅｖａｎｓ ｅｔ ａｌ．，１９８１，Ｎａｔｕｒｅ ２９２：１５４－６）、及びマーチンら（Ｍａｒｔｉｎ ＧＲ．ｅｔ ａｌ．，１９８１，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ７８：７６３４－８）によって樹立されている。ヒトのＥＳ細胞は、１９９８年にトムソンら（Ｔｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９８，２８２：１１４５－７）によって樹立されており、ＷｉＣｅｌｌ研究施設（ＷｉＣｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、ウェブサイト：ｗｗｗ．ｗｉｃｅｌｌ．ｏｒｇ／、マジソン、ウイスコンシン州、米国）、米国国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）、京都大学などから入手可能であり、例えばＣｅｌｌａｒｔｉｓ社（ウェブサイト：ｗｗｗ．ｃｅｌｌａｒｔｉｓ．ｃｏｍ／、スウェーデン）から購入可能である。
【0015】
人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）は、体細胞を初期化することによって得られる多能性を有する細胞である。ｉＰＳ細胞の作製は、京都大学の山中伸弥教授らのグループ、マサチューセッツ工科大学のルドルフ・ヤニッシュ(Ｒｕｄｏｌｆ Ｊａｅｎｉｓｃｈ)らのグループ、ウイスコンシン大学のジェームス・トムソン（Ｊａｍｅｓ Ｔｈｏｍｓｏｎ）らのグループ、ハーバード大学のコンラッド・ホッケドリンガー（Ｋｏｎｒａｄ Ｈｏｃｈｅｄｌｉｎｇｅｒ）らのグループなどを含む複数のグループが成功している。例えば、国際公開第２００７／０６９６６６号には、Ｏｃｔファミリー遺伝子、Ｋｌｆファミリー遺伝子及びＭｙｃファミリー遺伝子の遺伝子産物を含む体細胞の核初期化因子、並びにＯｃｔファミリー遺伝子、Ｋｌｆファミリー遺伝子、Ｓｏｘファミリー遺伝子及びＭｙｃファミリー遺伝子の遺伝子産物を含む体細胞の核初期化因子が記載されており、さらに体細胞に上記核初期化因子を接触させる工程を含む、体細胞の核初期化により誘導多能性幹細胞を製造する方法が記載されている。
【0016】
ｉＰＳ細胞の製造に用いる体細胞の種類は特に限定されず、任意の体細胞を用いることができる。即ち、体細胞とは、生体を構成する細胞のうち、生殖細胞以外の全ての細胞を包含し、分化した体細胞でもよいし、未分化の幹細胞でもよい。体細胞の由来は、哺乳動物、鳥類、魚類、爬虫類、両生類の何れでもよく特に限定されないが、好ましくは哺乳動物（例えば、マウスなどのげっ歯類、又はヒトなどの霊長類）であり、特に好ましくはマウス又はヒトである。また、ヒトの体細胞を用いる場合、胎児、新生児又は成人の何れの体細胞を用いてもよい。体細胞の具体例としては、例えば、線維芽細胞（例えば、皮膚線維芽細胞）、上皮細胞（例えば、胃上皮細胞、肝上皮細胞、肺胞上皮細胞）、内皮細胞（例えば、血管、リンパ管）、神経細胞（例えば、ニューロン、グリア細胞）、膵臓細胞、白血球細胞（Ｂ細胞、Ｔ細胞等）、骨髄細胞、筋肉細胞（例えば、骨格筋細胞、平滑筋細胞、心筋細胞）、肝実質細胞、非肝実質細胞、脂肪細胞、骨芽細胞、歯周組織を構成する細胞（例えば、歯根膜細胞、セメント芽細胞、歯肉線維芽細胞、骨芽細胞）、腎臓・眼・耳を構成する細胞などが挙げられる。本発明で用いられる細胞は、任意の動物由来のものであってよく、例えば、マウス、ラット、ハムスター等のげっ歯類；ヒト、ゴリラ、チンパンジー等の霊長類；及びイヌ、ネコ、ウサギ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ等の家畜若しくは愛玩動物などの哺乳動物由来のものであってよいが、ヒト由来の細胞が好ましい。
【0017】
ｉＰＳ細胞は、所定の培養条件下（例えば、ＥＳ細胞を培養する条件下）において長期にわたって自己複製能を有し、また所定の分化誘導条件下において様々な体細胞への多分化能を有する幹細胞である。また、ｉＰＳ細胞はマウスなどの試験動物に移植した場合にテラトーマを形成する能力を有する幹細胞でもよい。
【0018】
体細胞からｉＰＳ細胞を製造するためには、まず、少なくとも１種類以上の初期化遺伝子を体細胞に導入する。初期化遺伝子とは、体細胞を初期化してｉＰＳ細胞とする作用を有する初期化因子をコードする遺伝子である。初期化遺伝子の組み合わせの具体例としては、以下の組み合わせを挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
（ｉ）Ｏｃｔ遺伝子、Ｋｌｆ遺伝子、Ｓｏｘ遺伝子、Ｍｙｃ遺伝子
（ｉｉ）Ｏｃｔ遺伝子、Ｓｏｘ遺伝子、ＮＡＮＯＧ遺伝子、ＬＩＮ２８遺伝子
（ｉｉｉ）Ｏｃｔ遺伝子、Ｋｌｆ遺伝子、Ｓｏｘ遺伝子、Ｍｙｃ遺伝子、ｈＴＥＲＴ遺伝子、ＳＶ４０ ｌａｒｇｅＴ遺伝子
（ｉｖ）Ｏｃｔ遺伝子、Ｋｌｆ遺伝子、Ｓｏｘ遺伝子
（ｉ）Ｏｃｔ遺伝子、Ｋｌｆ遺伝子、Ｓｏｘ遺伝子、Ｍｙｃ遺伝子
（ｉｉ）Ｏｃｔ遺伝子、Ｓｏｘ遺伝子、ＮＡＮＯＧ遺伝子、ＬＩＮ２８遺伝子
（ｉｉｉ）Ｏｃｔ遺伝子、Ｋｌｆ遺伝子、Ｓｏｘ遺伝子、Ｍｙｃ遺伝子、ｈＴＥＲＴ遺伝子、ＳＶ４０ ｌａｒｇｅＴ遺伝子
（ｉｖ）Ｏｃｔ遺伝子、Ｋｌｆ遺伝子、Ｓｏｘ遺伝子
【0019】
上記以外にも、導入遺伝子をさらに減らした方法（Ｎａｔｕｒｅ．２００８ Ｊｕｌ ３１；４５４（７２０４）：６４６－５０）、低分子化合物を利用した方法（Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ．２００９ Ｊａｎ ９；４（１）：１６－９、Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ．２００９ Ｎｏｖ ６；５（５）：４９１－５０３）、遺伝子の代わりに転写因子タンパク質を利用した方法（Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ．２００９ Ｍａｙ ８；４（５）：３８１－４）などが報告されており、いずれの方法で製造されたｉＰＳ細胞でもよい。
【0020】
初期化因子の細胞への導入形態は特に限定されないが、例えば、プラスミドを用いた遺伝子導入、合成ＲＮＡの導入、タンパク質として直接導入などが挙げられる。また、ｍｉｃｒｏＲＮＡ若しくはＲＮＡ、又は低分子化合物等を用いた方法で作製されたｉＰＳ細胞を用いてもよい。ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞を始めとする多能性幹細胞は、市販品又は分譲を受けた細胞を用いてもよいし、新たに作製したものを用いてもよい。
【0021】
ｉＰＳ細胞として、例えば２５３Ｇ１株、２５３Ｇ４株、２０１Ｂ６株、２０１Ｂ７株、４０９Ｂ２株、４５４Ｅ２株、６０６Ａ１株、６１０Ｂ１株、６４８Ａ１株、１２０１Ｃ１株、１２０５Ｄ１株、１２１０Ｂ２株、１２３１Ａ３株、１３８３Ｄ２株、１３８３Ｄ６株、ｉＰＳ－ＴＩＧ１２０－３ｆ７株、ｉＰＳ－ＴＩＧ１２０－４ｆ１株、ｉＰＳ－ＴＩＧ１１４－４ｆ１株、ＲＰＣｈｉＰＳ７７１－２株、１５Ｍ６３株、１５Ｍ６６株、ＨｉＰＳ－ＲＩＫＥＮ－１Ａ株、ＨｉＰＳ－ＲＩＫＥＮ－２Ａ株、ＨｉＰＳ－ＲＩＫＥＮ－１２Ａ株、Ｎｉｐｓ－Ｂ２株、ＴｋＤＮ４－Ｍ株、ＴｋＤＡ３－１株、ＴｋＤＡ３－２株、ＴｋＤＡ３－４株、ＴｋＤＡ３－５株、ＴｋＤＡ３－９株、ＴｋＤＡ３－２０株、ｈｉＰＳＣ ３８－２株、ＭＳＣ－ｉＰＳＣ１株、ＢＪ－ｉＰＳＣ１株等を使用することができる。
【0022】
ＥＳ細胞として、例えばＫｈＥＳ－１株、ＫｈＥＳ－２株、ＫｈＥＳ―３株、ＫｈＥＳ－４株、ＫｈＥＳ－５株、ＳＥＥＳ１株、ＳＥＥＳ２株、ＳＥＥＳ３株、ＨＵＥＳ８株、ＣｙＴ４９株、Ｈ１株、Ｈ９株、ＨＳ－１８１株等を使用することができる。新たに作製された臨床グレードのｉＰＳ細胞又はＥＳ細胞を用いてもよい。
【0023】
本発明における多能性幹細胞を含む細胞集団は、多能性幹細胞の比率が８０％以上であることが好ましく、９０％以上であることがより好ましく、１００％であってもよい。前記（ａ）及び（ｂ）の指標を満たす細胞集団は、通常、前記比率で多能性幹細胞を含む細胞集団である。
【0024】
（β－Ａｃｔｉｎ遺伝子の発現量に対するＬＥＦ１遺伝子の相対発現量）
本発明の細胞集団においては、β－Ａｃｔｉｎ遺伝子の発現量に対するＬＥＦ１遺伝子の相対発現量が、５．５×１０－４以下である。β－Ａｃｔｉｎ遺伝子の発現量に対するＬＥＦ１遺伝子の相対発現量の上限は、例えば、５．０×１０－４以下、４．５×１０－４以下、４．０×１０－４以下、３．５×１０－４以下、３．０×１０－４以下、２．５×１０－４以下、又は２．０×１０－４以下であり、１．９×１０－４以下、１．８×１０－４以下、１．７×１０－４以下、１．６×１０－４以下、１．５×１０－４以下、１．４×１０－４以下、１．３×１０－４以下、１．２×１０－４以下、１．１×１０－４以下、１．０×１０－４以下、９．０×１０－５以下、８．０×１０－５以下、７．０×１０－５以下、６．０×１０－５以下、５．０×１０－５以下、４．０×１０－５以下、３．０×１０－５以下、２．０×１０－５以下、１．０×１０－５以下、又は１．０×１０－６以下が好ましい。また、下限としては例えば、１．０×１０－７以上が好ましい。
本発明の細胞集団においては、β－Ａｃｔｉｎ遺伝子の発現量に対するＬＥＦ１遺伝子の相対発現量が、５．５×１０－４以下である。β－Ａｃｔｉｎ遺伝子の発現量に対するＬＥＦ１遺伝子の相対発現量の上限は、例えば、５．０×１０－４以下、４．５×１０－４以下、４．０×１０－４以下、３．５×１０－４以下、３．０×１０－４以下、２．５×１０－４以下、又は２．０×１０－４以下であり、１．９×１０－４以下、１．８×１０－４以下、１．７×１０－４以下、１．６×１０－４以下、１．５×１０－４以下、１．４×１０－４以下、１．３×１０－４以下、１．２×１０－４以下、１．１×１０－４以下、１．０×１０－４以下、９．０×１０－５以下、８．０×１０－５以下、７．０×１０－５以下、６．０×１０－５以下、５．０×１０－５以下、４．０×１０－５以下、３．０×１０－５以下、２．０×１０－５以下、１．０×１０－５以下、又は１．０×１０－６以下が好ましい。また、下限としては例えば、１．０×１０－７以上が好ましい。
【0025】
β－Ａｃｔｉｎ遺伝子の発現量に対するＬＥＦ１遺伝子の相対発現量は、定量的リアルタイムＰＣＲ解析により測定することができる。定量的リアルタイムＰＣＲ解析は当業者に公知の方法により行うことができる。例えば、培養した細胞のｔｏｔａｌ ＲＮＡを回収し、ｃＤＮＡの合成を行い、このｃＤＮＡを鋳型とし、測定対象の遺伝子及びβ－Ａｃｔｉｎ遺伝子について定量的リアルタイムＰＣＲを実施することにより、β－Ａｃｔｉｎ遺伝子の発現量に対する測定対象遺伝子の発現量を測定することができる。
【0026】
なお、本発明で使用する定量的リアルタイムＰＣＲ解析の手法については、後述の実施例で記載する方法と同様に行うことができる。具体的には、例えば、細胞集団の一部を採取してＲＮＡを単離及び精製し、前記ＲＮＡから逆転写反応によりｃＤＮＡを合成する。次いで、前記ｃＤＮＡを鋳型として用いて、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎによるインターカレーション法により、定量的リアルタイムＰＣＲを行う。β－Ａｃｔｉｎ遺伝子の発現量は、β－ＡｃｔｉｎのｃＤＮＡ配列から設計したプライマー（例えば、配列番号１、２）を用いてリアルタイムＰＣＲを行うことにより測定することができる。ＬＥＦ１遺伝子の発現量は、ＬＥＦ１のｃＤＮＡ配列から設計したプライマー（例えば、配列番号１５、１６）を用いてリアルタイムＰＣＲを行うことにより測定することができる。β－Ａｃｔｉｎ遺伝子の発現量に対するＬＥＦ１遺伝子の発現量は、前記のように測定されたβ－Ａｃｔｉｎ遺伝子の発現量及びＬＥＦ１遺伝子の発現量を用いて、比較Ｃｔ法により算出することができる。
【0027】
（ＬＥＦ１が陽性を呈する多能性幹細胞の比率）
本発明の細胞集団においては、ＬＥＦ１が陽性を呈する多能性幹細胞の比率が５５％以下である。ＬＥＦ１が陽性を呈する多能性幹細胞の比率の上限としては、例えば、５４％以下、５３％以下、５２％以下、５１％以下、５０％以下、又は４９％以下であり、４８％以下、４７％以下、４６％以下、４５％以下、４４％以下、４３％以下、４２％以下、４１％以下、４０％以下、３９％以下、又は３８％以下でもよい。また、下限としては、例えば、０％を含んでもよく、１％以上、１０％以上、２０％以上、又は３０％以上が好ましい。
本発明の細胞集団においては、ＬＥＦ１が陽性を呈する多能性幹細胞の比率が５５％以下である。ＬＥＦ１が陽性を呈する多能性幹細胞の比率の上限としては、例えば、５４％以下、５３％以下、５２％以下、５１％以下、５０％以下、又は４９％以下であり、４８％以下、４７％以下、４６％以下、４５％以下、４４％以下、４３％以下、４２％以下、４１％以下、４０％以下、３９％以下、又は３８％以下でもよい。また、下限としては、例えば、０％を含んでもよく、１％以上、１０％以上、２０％以上、又は３０％以上が好ましい。
【0028】
細胞集団におけるＬＥＦ１が陽性を呈する多能性幹細胞の比率は、フローサイトメトリー解析により測定することができる。フローサイトメトリーメトリー解析は当業者に公知の方法により行うことができる。例えば、培養した細胞の固定化及び膜透過処理を行い、蛍光標識済抗ＬＥＦ１抗体及び蛍光標識済のアイソタイプコントロール抗体で蛍光免疫染色し、フローサイトメーターを用いて染色細胞の蛍光を検出することによって、フローサイトメトリー解析を実施することができる。ネガティブコントロール（アイソタイプコントロール）と比較してより強い蛍光を発する細胞が検出された場合、当該細胞はＬＥＦ１が「陽性」と判定される。なお、本発明で使用するフローサイトメトリー解析の手法については後述の実施例で記載する方法と同様に行うことができる。
【0029】
上述した条件を満たす多能性幹細胞を含む細胞集団は、未分化性（多能性）を維持しており、体細胞への高い分化能を有し、効率的に前記体細胞へと分化誘導することができる。
【0030】
（分化能）
本発明における分化能とは、多能性幹細胞を特定の細胞種へ分化誘導したときに前記細胞種に分化する多能性幹細胞の能力を意味する。多能性幹細胞を含む細胞集団の分化能は、前記細胞集団を特定の細胞種へ分化誘導したときの前記細胞種への分化誘導効率として評価される。具体的には、多能性幹細胞を含む細胞集団を特定の細胞種へ分化誘導した後、目的細胞の形態的特徴や、遺伝子発現、タンパク質発現、分泌物等を指標として、目的細胞への分化誘導効率を評価することができる。目的細胞については、特に限定されないが、具体的には後述の中胚葉系細胞、内胚葉系細胞、外胚葉系細胞、所望の機能を有する体細胞等が挙げられる。分化誘導方法については、細胞種に応じて適切な分化誘導方法を用いればよく、特に限定されないが、例えば後述の分化誘導培地等を用いた分化誘導方法が挙げられる。分化誘導効率の評価方法については、特に限定されないが、例えば、目的細胞に特徴的な細胞形態を顕微鏡での目視観察若しくは画像解析によって評価する方法、目的細胞に特徴的な遺伝子発現量を定量的リアルタイムＰＣＲ解析によって評価する方法、目的細胞に特徴的なタンパク質発現をフローサイトメトリー解析、免疫沈降、免疫染色によって評価する方法、目的細胞が分泌する物質の量によって評価する方法等が挙げられる。
本発明における分化能とは、多能性幹細胞を特定の細胞種へ分化誘導したときに前記細胞種に分化する多能性幹細胞の能力を意味する。多能性幹細胞を含む細胞集団の分化能は、前記細胞集団を特定の細胞種へ分化誘導したときの前記細胞種への分化誘導効率として評価される。具体的には、多能性幹細胞を含む細胞集団を特定の細胞種へ分化誘導した後、目的細胞の形態的特徴や、遺伝子発現、タンパク質発現、分泌物等を指標として、目的細胞への分化誘導効率を評価することができる。目的細胞については、特に限定されないが、具体的には後述の中胚葉系細胞、内胚葉系細胞、外胚葉系細胞、所望の機能を有する体細胞等が挙げられる。分化誘導方法については、細胞種に応じて適切な分化誘導方法を用いればよく、特に限定されないが、例えば後述の分化誘導培地等を用いた分化誘導方法が挙げられる。分化誘導効率の評価方法については、特に限定されないが、例えば、目的細胞に特徴的な細胞形態を顕微鏡での目視観察若しくは画像解析によって評価する方法、目的細胞に特徴的な遺伝子発現量を定量的リアルタイムＰＣＲ解析によって評価する方法、目的細胞に特徴的なタンパク質発現をフローサイトメトリー解析、免疫沈降、免疫染色によって評価する方法、目的細胞が分泌する物質の量によって評価する方法等が挙げられる。
【0031】
前記（ａ）及び（ｂ）の指標を用いることにより、多能性幹細胞を含む細胞集団を目的の細胞種に分化誘導する前に、前記細胞集団の分化能を評価することができる。すなわち、前記（ａ）及び（ｂ）の指標を満たす細胞集団は、分化能が高いと評価することができる。
【0032】
（未分化マーカーの発現）
本発明の細胞集団における多能性幹細胞の未分化性は、未分化マーカーの発現状態を解析することにより確認することができる。未分化マーカーの発現状態の解析は、例えば、定量的リアルタイムＰＣＲ解析、又はフローサイトメトリー解析等により行うことができる。
本発明の細胞集団における多能性幹細胞の未分化性は、未分化マーカーの発現状態を解析することにより確認することができる。未分化マーカーの発現状態の解析は、例えば、定量的リアルタイムＰＣＲ解析、又はフローサイトメトリー解析等により行うことができる。
【0033】
未分化マーカーとしては、例えば、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、ＳＳＥＡ－３、ＳＳＥＡ－４、ＴＲＡ－１－６０、ＴＲＡ－１－８１、ＲＥＸ－１、ＬＩＮ２８、ＬＥＦＴＢ、ＧＤＦ３、ＺＦＰ４２、ＦＧＦ４、ＥＳＧ１、ＤＰＰＡ２、ＴＥＲＴ、ＫＬＦ４、ｃ－Ｍｙｃ、Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ等が挙げられるが、これらに限定されない。未分化マーカーとしては、上記の中でも、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、及びＮａｎｏｇが好ましい。なお、未分化マーカーは多能性幹細胞マーカーと同義であり、両者は互換的に使用することができる。
【0034】
本発明の細胞集団において、β－Ａｃｔｉｎ遺伝子の発現量に対するＯｃｔ４遺伝子の相対発現量は下限としては例えば、２．０×１０－１以上、２．１×１０－１以上、２．２×１０－１以上、２．３×１０－１以上、２．４×１０－１以上、２．５×１０－１以上、２．６×１０－１以上、２．７×１０－１以上、２．８×１０－１以上、２．９×１０－１、３．０×１０－１以上、４．０×１０－１以上、５．０×１０－１以上、又は６．０×１０－１以上が好ましい。また、上限としては例えば、１０以下、又は１．０以下が好ましい。
【0035】
本発明の細胞集団において、β－Ａｃｔｉｎ遺伝子の発現量に対するＳｏｘ２遺伝子の相対発現量は下限としては例えば、１．０×１０－２以上、１．１×１０－２以上、１．２×１０－２以上、１．３×１０－２以上、１．４×１０－２以上、１．５×１０－２以上、１．６×１０－２以上、１．７×１０－２以上、１．８×１０－２以上、１．９×１０－２以上、２．０×１０－２以上、２．１×１０－２以上、２．２×１０－２以上、２．３×１０－２以上、２．６×１０－２以上、又は２．９×１０－２以上が好ましい。また、上限としては例えば、１０以下、１．０以下、又は０．１以下が好ましい。
【0036】
本発明の細胞集団において、β－Ａｃｔｉｎ遺伝子の発現量に対するＮａｎｏｇ遺伝子の相対発現量は下限としては例えば、１．２×１０－２以上、１．３×１０－２以上、１．４×１０－２以上、１．５×１０－２以上、１．６×１０－２以上、１．７×１０－２以上、１．８×１０－２以上、１．９×１０－２以上、２．０×１０－２以上、３．０×１０－２以上、４．０×１０－２以上、５．０×１０－２以上、６．０×１０－２以上、７．０×１０－２以上、又は８．０×１０－２以上が好ましい。また、上限としては例えば、１０以下、１．０以下、又は０．１以下が好ましい。
【0037】
β－Ａｃｔｉｎ遺伝子の発現量に対する上記遺伝子の相対発現量は、定量的リアルタイムＰＣＲ解析により測定することができる。
【0038】
（分化マーカーの発現）
本発明の細胞集団における多能性幹細胞の未分化性は、分化マーカーの発現状態を解析することにより確認してもよい。分化マーカーの発現状態の解析は、例えば、リアルタイムＰＣＲ、又はフローサイトメトリー等により行うことができる。
本発明の細胞集団における多能性幹細胞の未分化性は、分化マーカーの発現状態を解析することにより確認してもよい。分化マーカーの発現状態の解析は、例えば、リアルタイムＰＣＲ、又はフローサイトメトリー等により行うことができる。
【0039】
分化マーカーとしては、例えば、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ、Ｓｏｘ１７、Ｐａｘ６、ＦＯＸＡ２、ＣＸＣＲ４、ＡＦＰ、ＧＡＴＡ４、ＥＯＭＥＳ、ＭＥＳＰ１、ＭＥＳＰ２、ＦＯＸＦ１、ＨＡＮＤ１、ＥＶＸ１、ＩＲＸ３、ＣＤＸ２、ＴＢＸ６、ＭＩＸＬ１、ＩＳＬ１、ＳＮＡＩ２、ＦＯＸＣ１、ＶＥＧＦＲ２、ＰＤＧＦＲα、ＦＧＦ５、ＯＴＸ２、ＳＯＸ１、ＮＥＳＴＩＮ等が挙げられるが、これらに限定されない。分化マーカーとしては、上記の中でも、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ、Ｓｏｘ１７、及びＰａｘ６が好ましい。
前記Ｂｒａｃｈｙｕｒｙは、中胚葉で特異的に発現する遺伝子であり、中胚葉系細胞のマーカー遺伝子として用いることができる。
前記Ｓｏｘ１７は、内胚葉で特異的に発現する遺伝子であり、内胚葉系細胞のマーカー遺伝子として用いることができる。
前記Ｐａｘ６は、外胚葉で特異的に発現する遺伝子であり、外胚葉系細胞のマーカー遺伝子として用いることができる。
前記Ｂｒａｃｈｙｕｒｙは、中胚葉で特異的に発現する遺伝子であり、中胚葉系細胞のマーカー遺伝子として用いることができる。
前記Ｓｏｘ１７は、内胚葉で特異的に発現する遺伝子であり、内胚葉系細胞のマーカー遺伝子として用いることができる。
前記Ｐａｘ６は、外胚葉で特異的に発現する遺伝子であり、外胚葉系細胞のマーカー遺伝子として用いることができる。
【0040】
本発明の細胞集団において、β－Ａｃｔｉｎ遺伝子の発現量に対するＢｒａｃｈｙｕｒｙ遺伝子の相対発現量は、上限としては例えば、１．０×１０－４以下、１．０×１０－５以下、１．０×１０－６以下、又は１．０×１０－７以下が好ましい。また、下限としては例えば、１．０×１０－９以上が好ましい。
【0041】
本発明の細胞集団において、β－Ａｃｔｉｎ遺伝子の発現量に対するＳｏｘ１７遺伝子の相対発現量は、上限としては例えば、１．０×１０－４以下、１．０×１０－５以下、１．０×１０－６以下、又は１．０×１０－７以下が好ましい。また、下限としては例えば、１．０×１０－９以上が好ましい。
【0042】
本発明の細胞集団において、β－Ａｃｔｉｎ遺伝子の発現量に対するＰａｘ６遺伝子の相対発現量は、上限としては例えば、１．０×１０－４以下であり、より好ましくは１．０×１０－５以下、又は１．５×１０－６以下である。また、下限としては例えば、１．０×１０－９以上が好ましい。
【0043】
β－Ａｃｔｉｎ遺伝子の発現量に対する上記遺伝子の相対発現量は、定量的リアルタイムＰＣＲ解析により測定することができる。
【0044】
上記した未分化マーカー及び分化マーカーを解析するタイミングは、特に限定されないが、例えば、培養工程の途中、培養工程における純化後、Ｎ回継代した直後（Ｎは１以上の整数を示す）、維持培養の途中、凍結保存前、解凍後、製剤化する前、又は製剤化した後などが挙げられる。
【0045】
［多能性幹細胞を含む細胞集団の製造方法］
本発明は、多能性幹細胞を含む細胞集団の中から、以下に示す（ａ）及び（ｂ）の特性を有する細胞集団を選別する工程を含む、多能性幹細胞を含む細胞集団の製造方法に関する。
（ａ）前記細胞集団において、β－Ａｃｔｉｎ遺伝子の発現量に対するＬＥＦ１遺伝子の相対発現量が５．５×１０－４以下であり、
（ｂ）前記細胞集団において、ＬＥＦ１が陽性を呈する多能性幹細胞の比率が５５％以下である。
本発明は、多能性幹細胞を含む細胞集団の中から、以下に示す（ａ）及び（ｂ）の特性を有する細胞集団を選別する工程を含む、多能性幹細胞を含む細胞集団の製造方法に関する。
（ａ）前記細胞集団において、β－Ａｃｔｉｎ遺伝子の発現量に対するＬＥＦ１遺伝子の相対発現量が５．５×１０－４以下であり、
（ｂ）前記細胞集団において、ＬＥＦ１が陽性を呈する多能性幹細胞の比率が５５％以下である。
【0046】
本発明においては、多能性幹細胞を含む細胞集団が、上記（ａ）及び（ｂ）の条件を満たすように調製する。前記（ａ）及び（ｂ）の条件は、未分化性を維持し、高い分化能を有する多能性幹細胞を含む細胞集団を取得する際の指標として有用である。細胞集団の調製方法は、前記指標を満たす細胞集団を取得できるものであれば、特に限定されない。そのような方法としては、例えば、セルソーターにて（ｂ）を満たす細胞集団を選択し、次いで、得られた細胞集団を（ａ）を満たす条件下において培養することが挙げられる。また、前記指標を満たす前記細胞集団の他の調製方法としては、細胞集団を、上記（ａ）及び（ｂ）を満たす条件下において培養することが挙げられる。培養条件や培養方法の詳細については以下で説明する。
【0047】
β－Ａｃｔｉｎ遺伝子の発現量に対するＬＥＦ１遺伝子の相対発現量の好ましい範囲、並びにＬＥＦ１が陽性を呈する多能性幹細胞の比率の好ましい範囲は、本明細書中において上記した通りである。
【0048】
多能性幹細胞を含む細胞集団は、多能性幹細胞を、所望により維持培養した後に、多能性幹細胞を接着培養又は浮遊培養を行うことにより、製造することができる。
【0049】
（維持培養）
本発明において接着培養又は浮遊培養を行う前の多能性幹細胞は、未分化維持培地を用いて未分化性を維持したものとすることが好ましい。未分化維持培地を用いて多能性幹細胞の未分化性を維持する培養のことを、多能性幹細胞の維持培養ともいう。
本発明において接着培養又は浮遊培養を行う前の多能性幹細胞は、未分化維持培地を用いて未分化性を維持したものとすることが好ましい。未分化維持培地を用いて多能性幹細胞の未分化性を維持する培養のことを、多能性幹細胞の維持培養ともいう。
【0050】
未分化維持培地は、多能性幹細胞の未分化性を維持できる培地であれば特に限定されない。未分化維持培地としては、例えば、ＦＧＦ２（Ｂａｓｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ－２）、ＴＧＦ－β１（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ－β１）、Ａｃｔｉｖｉｎ Ａ、ＩＧＦ－１、ＭＣＰ－１、ＩＬ－６、ＰＡＩ、ＰＥＤＦ、ＩＧＦＢＰ－２、ＬＩＦ（Ｌｅｕｋｅｍｉａ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ）及びＩＧＦＢＰ－７からなる群から選択される１つ以上を基礎培地に含む培地等が挙げられる。前記例示した因子は、多能性幹細胞の未分化性を維持する性質を有していることが知られている。未分化維持培地としては、例えば、ＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）（例えば、ＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎなど）（味の素社）、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ８培地（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）、ＳＴＥＭＰＲＯ（登録商標）ｈＥＳＣ ＦＭ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）、ｍＴｅＳＲ１（Ｖｅｒｉｔａｓ社）、ＴｅＳＲ２（Ｖｅｒｉｔａｓ社）等を使用することができるが、特に限定されない。また、未分化維持培地には、ペニシリン、ストレプトマイシン及びアンフォテリシンＢなどの抗生物質を添加してもよく、Ｃｕｌｔｕｒｅ ｓｕｒｅ Ｙ－２７６３２（和光純薬工業）等のＲＯＣＫ阻害剤を添加してもよい。
【0051】
多能性幹細胞の維持培養は、ビトロネクチン、フィブロネクチン、ラミニン、又はマトリゲル等の細胞接着タンパク質をコートした細胞培養用ディッシュ上において、上記した未分化維持培地を用いて行うことができる。
【0052】
多能性幹細胞の維持培養の培養温度は、特に限定されないが、好ましくは３６．０℃から３８．０℃であり、より好ましくは３６．５℃から３７．５℃である。培養期間は、特に限定されないが、好ましくは１日から１４日間とすることができる。多能性幹細胞の維持培養は、例えば、１日から７日毎、２日から５日毎、３日から５日毎、３日から４日毎に細胞を継代しながら行ってもよい。維持培養における継代数は特に限定されない。ＣＯ２インンキュベータ等を利用して、約１％から１０％、好ましくは５％のＣＯ２濃度雰囲気下で培養を行うことが好ましい。
【0053】
多能性幹細胞の維持培養を行う際には、適当な頻度で培地交換を行うことが好ましい。培地交換の頻度は特に限定されず、細胞種や培養条件により適宜培地交換の頻度を調整することができる。例えば、好ましくは５日に一回以上、４日に一回以上、３日に一回以上、２日に一回以上、又は１日に一回以上の頻度で培地交換作業を行うことができる。培地交換に用いる液体培地としては、上記と同様の液体培地を用いることができる。培地交換の方法は特に限定されない。例えば、好ましくは培養容器から上清をアスピレーターやピペット等で吸引除去し、その後、新鮮な液体培地を穏やかに添加した後、再度培養容器をＣＯ２インキュベーター等の培養環境に戻すことで継続して維持培養することができる。
【0054】
継代の方法は特に限定されない。例えば、好ましくは培養容器から上清をアスピレーターやピペット等で吸引除去し、その後、必要に応じて洗浄を行うことができる。洗浄液には、バッファ（ＰＢＳバッファを含む）、生理食塩水、又は液体培地（基礎培地が好ましい）を使用すればよい。洗浄後の細胞に対し、例えば機械的、化学的又は生物学的な方法により細胞を剥離し、維持培養を継続するために維持培養用の新鮮培地及び培養容器に播種して維持培養を継続してもよい。継代後の維持培養に用いる液体培地及び培養の条件としては、上記と同様の未分化維持培地及び条件を用いることができる。また剥離の際は、ＥＤＴＡ、ＴｒｙＰＬＥＴＭ Ｓｅｌｅｃｔ、アキュターゼＴＭ、コラゲナーゼ、ディスパーゼ、トリプシン、トリプシン／ＥＤＴＡ、トリプシン／コラゲナーゼ、ＲｅＬｅＳＲＴＭ等を細胞剥離液として使用して培養基材から剥離又は細胞同士を剥離さてもよいし、セルスクレーパー等を用いて細胞を培養基材から剥離させてもよい。剥離させた細胞は、ピペッティング又はストレーナーを用いて十分に分散させて単離してもよいし、分散させずにコロニー状のまま播種してもよい。
【0055】
（接着培養)
本発明においては、多能性幹細胞を培地中において接着培養してもよい。接着培養とは、細胞を培養皿等の培養面に接着した状態で培養することである。
本発明においては、多能性幹細胞を培地中において接着培養してもよい。接着培養とは、細胞を培養皿等の培養面に接着した状態で培養することである。
【0056】
接着培養における培地は、多能性幹細胞の未分化性を維持できる培地であれば特に限定されない。接着培養における培地としては、例えば、ＦＧＦ２（Ｂａｓｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ－２）、ＴＧＦ－β１（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ－β１）、Ａｃｔｉｖｉｎ Ａ、ＩＧＦ－１、ＭＣＰ－１、ＩＬ－６、ＰＡＩ、ＰＥＤＦ、ＩＧＦＢＰ－２、ＬＩＦ（Ｌｅｕｋｅｍｉａ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ）及びＩＧＦＢＰ－７からなる群から選択される１つ以上を基礎培地に含む培地等が挙げられる。前記例示した因子は、多能性幹細胞の未分化性を維持する性質を有していることが知られている。接着培養における培地としては、例えば、ＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）（例えば、ＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎなど）（味の素社）、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ８培地（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）、ＳＴＥＭＰＲＯ（登録商標）ｈＥＳＣ ＳＦＭ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）、ｍＴｅＳＲ１（Ｖｅｒｉｔａｓ社）、ＴｅＳＲ２（Ｖｅｒｉｔａｓ社）等を使用することができるが、特に限定されない。また、接着培養における培地には、ペニシリン、ストレプトマイシン及びアンフォテリシンＢなどの抗生物質を添加してもよい。また、接着培養における培地は、Ｌ－アスコルビン酸、インスリン、トランスフェリン、セレン及び炭酸水素ナトリウムからなる群から選択される少なくとも１つを含んでもいてもよく、Ｌ－アスコルビン酸、インスリン、トランスフェリン、セレン及び炭酸水素ナトリウムの全てを含んでいてもよい。
【0057】
接着培養における培地にはＦＧＦ２が含まれていてもよい。接着培養における培地がＦＧＦ２を含む場合、ＦＧＦ２濃度の上限としては、例えば、１００ｎｇ／ｍＬ以下であり、９０ｎｇ／ｍＬ以下、８０ｎｇ／ｍＬ以下、７０ｎｇ／ｍＬ以下、６０ｎｇ／ｍＬ以下、５０ｎｇ／ｍＬ以下、４０ｎｇ／ｍＬ以下、３０ｎｇ／ｍＬ以下、２０ｎｇ／ｍＬ以下、１０ｎｇ／ｍＬ以下、９ｎｇ／ｍＬ以下、８ｎｇ／ｍＬ以下、７ｎｇ／ｍＬ以下、６ｎｇ／ｍＬ以下、５ｎｇ／ｍＬ以下、４ｎｇ／ｍＬ以下、３ｎｇ／ｍＬ以下、２ｎｇ／ｍＬ以下、又は１ｎｇ／ｍＬ以下が好ましい。また、下限としては０．１ｎｇ／ｍＬ以上が好ましい。ＦＧＦ２の存在下で培養することにより、多能性幹細胞の未分化維持及び細胞増殖を促進することができる。
【0058】
接着培養における培地には、ＲＯＣＫ（ロック；Ｒｈｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｋｉｎａｓｅ；Ｒｈｏ結合キナーゼ）阻害剤が含まれていてもよい。ＲＯＣＫ阻害剤の存在下で培養することにより、多能性幹細胞の細胞凝集塊（スフェロイド）の形成及び成長を促進することができる。
【0059】
ＲＯＣＫ阻害剤は、Ｒｈｏ－キナーゼ(ＲＯＣＫ、Ｒｈｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ）のキナーゼ活性を阻害する物質として定義され、例えば、Ｙ－２７６３２（４－［（１Ｒ）－１－アミノエチル］－Ｎ－ピリジン－４－イルシクロヘキサン－１－カルボキサミド）又はその２塩酸塩（例えば、Ｉｓｈｉｚａｋｉ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５７，９７６－９８３（２０００）；Ｎａｒｕｍｉｙａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．３２５，２７３－２８４（２０００）参照）、Ｆａｓｕｄｉｌ／ＨＡ１０７７（１－（５－イソキノリンスルホニル）ホモピペラジン）又はその２塩酸塩（例えば、Ｕｅｎａｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３８９：９９０－９９４ （１９９７）参照）、Ｈ－１１５２（（Ｓ）－（＋）－２－メチル－１－［（４－メチル－５－イソキノリニル）スルホニル］－ヘキサヒドロ－１Ｈ－１，４－ジアゼピン）又はその２塩酸塩（例えば、Ｓａｓａｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．９３：２２５－２３２（２００２）参照）、Ｗｆ－５３６（（＋）－（Ｒ）－４－（１－アミノエチル）－Ｎ－（４－ピリジル）ベンズアミド１塩酸塩）（例えば、Ｎａｋａｊｉｍａ ｅｔ ａｌ．，ＣａｎｃｅｒＣｈｅｍｏｔｈｅｒ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５２（４）：３１９－３２４（２００３）参照）及びそれらの誘導体、並びにＲＯＣＫに対するアンチセンス核酸、ＲＮＡ干渉誘導性核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ）、ドミナントネガティブ変異体、及びそれらの発現ベクターが挙げられる。また、ＲＯＣＫ阻害剤としては他の低分子化合物も知られているので、本発明においてはこのような化合物又はそれらの誘導体も使用できる（例えば、米国特許出願公開第２００５０２０９２６１号、同第２００５０１９２３０４号、同第２００４００１４７５５号、同第２００４０００２５０８号、同第２００４０００２５０７号、同第２００３０１２５３４４号、同第２００３００８７９１９号、及び国際公開第２００３／０６２２２７号、同第２００３／０５９９１３号、同第２００３／０６２２２５号、同第２００２／０７６９７６号、同第２００４／０３９７９６号参照）。本発明では、少なくとも１種のＲＯＣＫ阻害剤が使用され得る。
【0060】
培地がＹ－２７６３２等のＲＯＣＫ阻害剤を含む場合、ＲＯＣＫ阻害剤の濃度の下限としては、好ましくは０．１μＭ以上、０．２μＭ以上、０．５μＭ以上、１μＭ以上、２μＭ以上、３μＭ以上、４μＭ以上、５μＭ以上、６μＭ以上、７μＭ以上、８μＭ以上、９μＭ以上、又は１０μＭ以上である。ＲＯＣＫ阻害剤の濃度の上限としては、好ましくは２００μＭ以下、１５０μＭ以下、１００μＭ以下、９０μＭ以下、８０μＭ以下、７０μＭ以下、６０μＭ以下、５０μＭ以下、４０μＭ以下、３０μＭ以下、２０μＭ以下、又は１５μＭ以下である。
【0061】
本発明における接着培養は、多能性幹細胞をＷＮＴ阻害剤の存在下において培養する工程でもよい。ＷＮＴ阻害剤としては、ＸＡＶ９３９、ＩＷＲ－１―ｅｎｄｏ、ＩＷＲ－１―ｅｘｏ、ＩＣＧ－００１、Ａｎｔ１．４Ｂｒ、Ａｎｔ １．４Ｃｌ、Ｎｉｃｌｏｓａｍｉｄｅ、ａｐｉｃｕｌａｒｅｎ、ｂａｆｉｌｏｍｙｃｉｎ、Ｇ００７－ＬＫ、Ｇ２４４－ＬＭ、ｐｙｒｖｉｎｉｕｍ、ＮＳＣ６６８０３６、２，４－ｄｉａｍｉｎｏ－ｑｕｉｎａｚｏｌｉｎｅ、Ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ、ＰＫＦ１１５－５８４、ＢＣ２０５９、Ｓｈｉｚｏｋａｏｌ Ｄ、Ｄｋｋ－１などが挙げられる。ＸＡＶ９３９などのＷＮＴ阻害剤を使用する場合、培地における添加濃度は、特に限定されないが、下限としては、好ましくは１ｎＭ以上、１０ｎＭ以上、０．１μＭ以上、０．２μＭ以上、０．５μＭ以上、１μＭ以上、２μＭ以上、３μＭ以上、４μＭ以上、５μＭ以上、６μＭ以上、７μＭ以上、８μＭ以上、９μＭ以上、１０μＭ以上又は１５μＭ以上である。ＷＮＴ阻害剤の濃度の上限としては、好ましくは２００μＭ以下、１５０μＭ以下、１００μＭ以下、９０μＭ以下、８０μＭ以下、７０μＭ以下、６０μＭ以下、５０μＭ以下、４０μＭ以下、３０μＭ以下、又は２５μＭ以下である。
【0062】
接着培養のための多能性幹細胞は、常法により調製したものを用いることができる。例えば、多能性幹細胞は、上記した維持培養後に、例えば機械的、化学的又は生物学的な方法により剥離し、接着培養のための培地に播種することができる。例えば、ＥＤＴＡ、ＴｒｙＰＬＥＴＭ Ｓｅｌｅｃｔ、アキュターゼＴＭ、コラゲナーゼ、ディスパーゼ、トリプシン、トリプシン／ＥＤＴＡ、トリプシン／コラゲナーゼ、ＲｅＬｅＳＲＴＭ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ）等を細胞剥離液として使用して細胞を剥離することができる。
【0063】
接着培養のための培養容器は特に限定されず、接着培養用プレートなどを使用することができる。培養容器としては、特に限定はされないが、細胞との接着性を向上させるための人工的処理（例えば、細胞外マトリックス等によるコーティング処理）がされている培養容器を使用してもよい。多能性幹細胞の接着培養は、例えば、ビトロネクチン、フィブロネクチン、ラミニン、又はマトリゲル等の細胞接着タンパク質をコートしたプレート上において行うことができる。
【0064】
接着培養を行う際には、多能性幹細胞を、例えば１×１０３細胞から１×１０６細胞／ｍＬ、好ましくは１×１０４細胞から１ｘ１０５細胞／ｍＬ、より好ましくは２×１０４細胞から１×１０５細胞／ｍＬの細胞密度で培地に播種し、接着培養を行うことができる。
【0065】
接着培養の培養温度は、特に限定されないが、好ましくは３６．０℃から３８．０℃であり、より好ましくは３６．５℃から３７．５℃である。ＣＯ２インンキュベータ等を利用して、約１％から１０％、好ましくは５％のＣＯ２濃度雰囲気下で培養を行うことが好ましい。
【0066】
接着培養の培養期間は特に限定されないが、培養期間の下限は１日以上、２日以上、３日以上、４日以上、５日以上、６日以上、７日以上、８日以上、９日以上、又は１０日以上でもよく、培養期間の上限は３０日以下、２９日以下、２８日以下、２７日以下、２６日以下、２５日以下でもよい。接着培養は、例えば、１～７日毎、２～５日毎、３～５日毎、３～４日毎に細胞を継代しながら行ってもよい。接着培養における継代数は特に限定されない。
【0067】
接着培養を行う際には、適当な頻度で培地交換を行うことが好ましい。培地交換の頻度は特に限定されず、細胞種や培養条件により適宜培地交換の頻度を調整することができる。例えば、好ましくは５日に一回以上、４日に一回以上、３日に一回以上、２日に一回以上、又は１日に一回以上の頻度で培地交換作業を行うことができる。培地交換に用いる液体培地としては、上記と同様の液体培地を用いることができる。培地交換の方法は特に限定されない。例えば、好ましくは培養容器から上清をアスピレーターやピペット等で吸引除去し、その後、新鮮な液体培地を穏やかに添加した後、再度培養容器をＣＯ２インキュベーター等の培養環境に戻すことで継続して維持培養することができる。
【0068】
継代の方法は特に限定されない。例えば、好ましくは培養容器から上清をアスピレーターやピペット等で吸引除去し、その後、必要に応じて洗浄を行うことができる。洗浄液には、バッファ（ＰＢＳバッファを含む）、生理食塩水、又は液体培地（基礎培地が好ましい）を使用すればよい。洗浄後の細胞に対し、例えば機械的、化学的又は生物学的な方法により細胞を剥離し、維持培養を継続するために維持培養用の新鮮培地及び培養容器に播種して維持培養を継続してもよい。継代後の維持培養に用いる液体培地及び培養の条件としては、上記と同様の接着培養における培地及び条件を用いることができる。また剥離の際は、ＥＤＴＡ、ＴｒｙＰＬＥＴＭ Ｓｅｌｅｃｔ、アキュターゼＴＭ、コラゲナーゼ、ディスパーゼ、トリプシン、トリプシン／ＥＤＴＡ、トリプシン／コラゲナーゼ、ＲｅＬｅＳＲＴＭ等を細胞剥離液として使用して培養基材から剥離又は細胞同士を剥離さてもよいし、セルスクレーパー等を用いて細胞を培養基材から剥離させてもよい。剥離させた細胞は、ピペッティング又はストレーナーを用いて十分に分散させて単離してもよいし、分散させずにコロニー状のまま播種してもよい。
【0069】
（浮遊培養）
本発明においては、多能性幹細胞を培地中において浮遊培養してもよい。浮遊培養とは、細胞を培養皿等の培養容器に非接着の状態で培養することである。浮遊培養の形態は、細胞が培養容器に非接着の状態で培養されていれば、特に限定されない。例えば、細胞をマイクロキャリア等に接着させたものを培養してもよいし、後述するように複数の細胞が互いに接着して一つの塊となった細胞凝集塊の形態で浮遊培養してもよい。また、前記細胞凝集塊の中にコラーゲン等の高分子を混在させることもできる。このように液体培地中で細胞を浮遊させながら培養する浮遊培養は、スケールアップが容易であることから、細胞の大量生産に適していると期待される。
本発明においては、多能性幹細胞を培地中において浮遊培養してもよい。浮遊培養とは、細胞を培養皿等の培養容器に非接着の状態で培養することである。浮遊培養の形態は、細胞が培養容器に非接着の状態で培養されていれば、特に限定されない。例えば、細胞をマイクロキャリア等に接着させたものを培養してもよいし、後述するように複数の細胞が互いに接着して一つの塊となった細胞凝集塊の形態で浮遊培養してもよい。また、前記細胞凝集塊の中にコラーゲン等の高分子を混在させることもできる。このように液体培地中で細胞を浮遊させながら培養する浮遊培養は、スケールアップが容易であることから、細胞の大量生産に適していると期待される。
【0070】
浮遊培養における培地は、多能性幹細胞の未分化性を維持できる培地であれば特に限定されないが、例えば、ＦＧＦ２（Ｂａｓｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ－２）、ＴＧＦ－β１（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ－β１）、Ａｃｔｉｖｉｎ Ａ、ＩＧＦ－１、ＭＣＰ－１、ＩＬ－６、ＰＡＩ、ＰＥＤＦ、ＩＧＦＢＰ－２、ＬＩＦ（Ｌｅｕｋｅｍｉａ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ）及びＩＧＦＢＰ－７からなる群から選択される１つ以上を基礎培地に含む培地等が挙げられる。前記例示した因子は、多能性幹細胞の未分化性を維持する性質を有していることが知られている。浮遊培養における培地としては、例えば、ＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）（例えば、ＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎなど）（味の素社）、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ８培地（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）、ＳＴＥＭＰＲＯ（登録商標）ｈＥＳＣ ＳＦＭ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）、ｍＴｅＳＲ１（Ｖｅｒｉｔａｓ社）、ＴｅＳＲ２（Ｖｅｒｉｔａｓ社）等を使用することができるが、特に限定されない。
また、浮遊細胞における培地には、ペニシリン、ストレプトマイシン及びアンフォテリシンＢなどの抗生物質を添加してもよい。また、浮遊培養における培地は、Ｌ－アスコルビン酸、インスリン、トランスフェリン、セレン及び炭酸水素ナトリウムからなる群から選択される少なくとも１つを含んでもいてもよく、Ｌ－アスコルビン酸、インスリン、トランスフェリン、セレン及び炭酸水素ナトリウムの全てを含んでいてもよい。浮遊培養における培地は、脂肪酸又は脂質、アミノ酸（例えば、非必須アミノ酸）、ビタミン、サイトカイン、抗酸化剤、２－メルカプトエタノール、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類、リン酸化酵素阻害剤等の成分を含有してもよい。
また、浮遊細胞における培地には、ペニシリン、ストレプトマイシン及びアンフォテリシンＢなどの抗生物質を添加してもよい。また、浮遊培養における培地は、Ｌ－アスコルビン酸、インスリン、トランスフェリン、セレン及び炭酸水素ナトリウムからなる群から選択される少なくとも１つを含んでもいてもよく、Ｌ－アスコルビン酸、インスリン、トランスフェリン、セレン及び炭酸水素ナトリウムの全てを含んでいてもよい。浮遊培養における培地は、脂肪酸又は脂質、アミノ酸（例えば、非必須アミノ酸）、ビタミン、サイトカイン、抗酸化剤、２－メルカプトエタノール、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類、リン酸化酵素阻害剤等の成分を含有してもよい。
【0071】
浮遊培養における培地にはＦＧＦ２が含まれていてもよい。浮遊培養における培地がＦＧＦ２を含む場合、ＦＧＦ２濃度の上限は例えば、１００ｎｇ／ｍＬ以下であり、９０ｎｇ／ｍＬ以下、８０ｎｇ／ｍＬ以下、７０ｎｇ／ｍＬ以下、６０ｎｇ／ｍＬ以下、５０ｎｇ／ｍＬ以下、４０ｎｇ／ｍＬ以下、３０ｎｇ／ｍＬ以下、２０ｎｇ／ｍＬ以下、１０ｎｇ／ｍＬ以下、９ｎｇ／ｍＬ以下、８ｎｇ／ｍＬ以下、７ｎｇ／ｍＬ以下、６ｎｇ／ｍＬ以下、５ｎｇ／ｍＬ以下、４ｎｇ／ｍＬ以下、３ｎｇ／ｍＬ以下、２ｎｇ／ｍＬ以下、又は１ｎｇ／ｍＬ以下が好ましい。また、下限としては例えば、０．１ｎｇ／ｍＬ以上が好ましい。ＦＧＦ２の存在下で培養することにより、多能性幹細胞の未分化維持及び細胞増殖を促進することができる。
【0072】
浮遊培養における培地には、ＲＯＣＫ（ロック；Ｒｈｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｋｉｎａｓｅ；Ｒｈｏ結合キナーゼ）阻害剤が含まれていてもよい。ＲＯＣＫ阻害剤の存在下で培養することにより、多能性幹細胞の細胞凝集塊（スフェロイド）の形成及び成長を促進することができる。ＲＯＣＫ阻害剤についての詳細な説明は前述した通りである。
【0073】
培地がＹ－２７６３２等のＲＯＣＫ阻害剤を含む場合、ＲＯＣＫ阻害剤の濃度の下限としては、好ましくは０．１μＭ以上、０．２μＭ以上、０．５μＭ以上、１μＭ以上、２μＭ以上、３μＭ以上、４μＭ以上、５μＭ以上、６μＭ以上、７μＭ以上、８μＭ以上、９μＭ以上、又は１０μＭ以上である。ＲＯＣＫ阻害剤の濃度の上限としては、好ましくは２００μＭ以下、１５０μＭ以下、１００μＭ以下、９０μＭ以下、８０μＭ以下、７０μＭ以下、６０μＭ以下、５０μＭ以下、４０μＭ以下、３０μＭ以下、２０μＭ以下、又は１５μＭ以下である。
【0074】
本発明における浮遊培養は、多能性幹細胞をＷＮＴ阻害剤の存在下において培養する工程でもよい。ＷＮＴ阻害剤としては、ＸＡＶ９３９、ＩＷＲ－１―ｅｎｄｏ、ＩＷＲ－１―ｅｘｏ、ＩＣＧ－００１、Ａｎｔ１．４Ｂｒ、Ａｎｔ １．４Ｃｌ、Ｎｉｃｌｏｓａｍｉｄｅ、ａｐｉｃｕｌａｒｅｎ、ｂａｆｉｌｏｍｙｃｉｎ、Ｇ００７－ＬＫ、Ｇ２４４－ＬＭ、ｐｙｒｖｉｎｉｕｍ、ＮＳＣ６６８０３６、２，４－ｄｉａｍｉｎｏ－ｑｕｉｎａｚｏｌｉｎｅ、Ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ、ＰＫＦ１１５－５８４、ＢＣ２０５９、Ｓｈｉｚｏｋａｏｌ Ｄ、Ｄｋｋ－１などが挙げられる。ＸＡＶ９３９などのＷＮＴ阻害剤を使用する場合、培地における添加濃度は、特に限定されないが、下限としては、好ましくは０．１μＭ以上、０．２μＭ以上、０．５μＭ以上、１μＭ以上、２μＭ以上、３μＭ以上、４μＭ以上、５μＭ以上、６μＭ以上、７μＭ以上、８μＭ以上、９μＭ以上、１０μＭ以上又は１５μＭ以上である。ＷＮＴ阻害剤の濃度の上限としては、好ましくは２００μＭ以下、１５０μＭ以下、１００μＭ以下、９０μＭ以下、８０μＭ以下、７０μＭ以下、６０μＭ以下、５０μＭ以下、４０μＭ以下、３０μＭ以下、又は２５μＭ以下である。
【0075】
浮遊培養のための多能性幹細胞は、常法により調製したものを用いることができる。例えば、多能性幹細胞は、上記した維持培養後に、例えば機械的、化学的又は生物学的な方法により剥離し、浮遊培養のための培地に播種することができる。例えば、ＥＤＴＡ、ＴｒｙＰＬＥＴＭ Ｓｅｌｅｃｔ、アキュターゼＴＭ、コラゲナーゼ、ディスパーゼ、トリプシン、トリプシン／ＥＤＴＡ、トリプシン／コラゲナーゼ、ＲｅＬｅＳＲＴＭ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ）等を細胞剥離液として使用して細胞を剥離することができる。十分に分散させてから浮遊培養に用いる。細胞を分散させるためにストレーナーを通過させて単一細胞にまで分散させることができる。
【0076】
浮遊培養のための培養容器は特に限定されず、浮遊培養用のプレート、又はバイオリアクターなどを使用することができる。培養容器としては、特に限定はされないが、細胞との接着性を向上させるための人工的処理（例えば、細胞外マトリックス等によるコーティング処理）がされていない培養容器を使用してもよいし、人工的に接着を抑制する処理（例えば、ポリヒドロキシエチルメタクリル酸によるコーティング処理）がなされた培養容器を使用してもよい。また、培養容器の形状は特に限定されないが、例えば、ディッシュ状、フラスコ状、ウェル状、バッグ状、スピナーフラスコ状等の形状の培養容器が挙げられる。
【0077】
浮遊培養は、静置培養であってもよいし、液体培地が流動する条件での培養であってもよい。静置培養を行う場合、例えば、培地の粘性等を利用してもよく、凹凸を有するマイクロウェル等を用いてもよい。液体培地が流動する条件での培養としては、スピナー等を使用して液体培地を懸濁する条件での培養であってもよいが、細胞の凝集を促進するように液体培地が流動する条件での培養が好ましい。細胞の凝集を促進するように液体培地が流動する条件での培養としては、例えば、旋回流、揺動流等の流れによる応力（遠心力、求心力）により細胞が一点に集まるように液体培地が流動する条件での培養、及び直線的な往復運動により液体培地が流動する条件での培養が挙げられ、旋回流及び／又は揺動流を利用した培養が特に好ましい。
【0078】
旋回培養（振盪培養）は、液体培地と細胞を収容した培養容器を概ね水平面に沿って円、楕円、扁平した円、扁平した楕円等の閉じた軌道を描くように旋回させることにより行う。旋回速度は特に限定されないが、好ましくは２００ｒｐｍ以下、１５０ｒｐｍ以下、１２０ｒｐｍ以下、１１５ｒｐｍ以下、１１０ｒｐｍ以下、１０５ｒｐｍ以下、１００ｒｐｍ以下、９５ｒｐｍ以下、又は９０ｒｐｍ以下でもよい。旋回速度の下限は特に限定されず、好ましくは１ｒｐｍ以上、１０ｒｐｍ以上、５０ｒｐｍ以上、６０ｒｐｍ以上、７０ｒｐｍ以上、８０ｒｐｍ以上、又は９０ｒｐｍ以上でもよい。旋回速度がこの範囲であるとき、適切な大きさの細胞凝集塊が形成されやすく、好適に細胞が増殖できる。
【0079】
旋回培養の際の旋回幅は特に限定されないが、好ましくは１ｍｍ以上、１０ｍｍ以上、２０ｍｍ以上、又は２５ｍｍ以上でもよい。旋回幅の上限は特に限定されず、好ましくは２００ｍｍ以下、１００ｍｍ以下、５０ｍｍ以下、３０ｍｍ以下、又は２５ｍｍ以下でもよい。旋回培養の際の回転半径もまた特に限定されないが、好ましくは旋回幅が前記の範囲となるように設定される。回転半径は好ましくは５ｍｍ以上、又は１０ｍｍ以上でもよい。回転半径の上限は特に前提されず、好ましくは１００ｍｍ以下、又は５０ｍｍ以下でもよい。旋回幅がこの範囲であるとき、適切な大きさの細胞凝集塊が形成されやすく、好適に細胞が増殖できる。
【0080】
揺動培養は、揺動（ロッキング）撹拌により液体培地を流動させながら行う培養である。揺動培養は、液体培地と細胞を収容した培養容器を概ね水平面に垂直な平面内で揺動させることにより行う。揺動速度は特に限定されないが、例えば１分間に２回から５０回、好ましくは４回から２５回（一往復を１回とする）揺動させることができる。揺動角度は特に限定されないが、例えば０．１°から２０°、より好ましくは２°から１０°とすることができる。
更に、上記のような旋回と揺動とを組み合わせた運動により撹拌しながら培養することもできる。
更に、上記のような旋回と揺動とを組み合わせた運動により撹拌しながら培養することもできる。
【0081】
スピナーフラスコ状の培養容器を用いた培養は、培養容器の中に攪拌翼を使用して、液体培地を攪拌しながら行う培養である。回転数や培地量は特に限定されない。市販のスピナーフラスコ状の培養容器であれば、メーカー推奨の培養液量を好適に使用することができる。回転数は例えば１０ｒｐｍ以上、３００ｒｐｍ以下とすることができるが、特に限定されない。
【0082】
浮遊培養を行う際には、培地中の多能性幹細胞の播種密度（浮遊培養の開始時の細胞密度）は適宜調整することができる。前記播種密度の下限としては、例えば１×１０４細胞／ｍＬ以上、２×１０４細胞／ｍＬ以上、又は１×１０５細胞／ｍＬ以上が好ましく、上限としては例えば１×１０７細胞／ｍＬ以下、又は１×１０６細胞／ｍＬ以下が好ましい。播種密度がこの範囲であるとき、適切な大きさの細胞凝集塊が形成されやすく、好適に細胞が増殖できる。
【0083】
浮遊培養の際の培地量は使用する培養容器によって適宜調整することができる。例えば１２ウェルプレート（１ウェルあたりの平面視でのウェル底面の面積が３．５ｃｍ２）を使用する場合は、培地量は、０．５ｍＬ／ウェル以上、１．５ｍＬ／ウェル以下とすることができ、より好ましくは１ｍＬ／ウェルとすることができる。例えば６ウェルプレート（１ウェルあたりの平面視でのウェル底面の面積が９．６ｃｍ２）を使用する場合は、培地量の下限は好ましくは１．５ｍＬ／ウェル以上、２ｍＬ／ウェル以上、又は３ｍＬ／ウェル以上でもよく、培地量の上限は好ましくは６．０ｍＬ／ウェル以下、５ｍＬ／ウェル以下、又は４ｍＬ／ウェル以下でもよい。例えば１２５ｍＬ三角フラスコ（容量が１２５ｍＬの三角フラスコ）を使用する場合は、培地量の下限は好ましくは１０ｍＬ／容器以上、又は３０ｍＬ／容器以上でもよく培地量の上限は、好ましくは５０ｍＬ／容器以下でもよい。例えば５００ｍＬ三角フラスコ（容量が５００ｍＬの三角フラスコ）を使用する場合は、培地量の下限は好ましくは１００ｍＬ／容器以上、又は１２０ｍＬ／容器以上でもよく、培地量の上限は好ましくは１５０ｍＬ／容器以下、又は１２５ｍＬ／容器以下でもよい。例えば１０００ｍＬ三角フラスコ（容量が１０００ｍＬの三角フラスコ）を使用する場合は、培地量の下限は好ましくは２５０ｍＬ／容器以上、又は２９０ｍＬ／容器以上でもよく、培地量の上限は好ましくは３５０ｍＬ／容器以下、又は３１０ｍＬ／容器以下でもよい。例えば２０００ｍＬ三角フラスコ（容量が２０００ｍＬの三角フラスコ）の場合は、培地量の下限は好ましくは５００ｍＬ／容器以上、又は６００ｍＬ／容器以上でもよく、培地量の上限は好ましくは１０００ｍＬ／容器以下、又は７００ｍＬ／容器以下でもよい。例えば３０００ｍＬ三角フラスコ（容量が３０００ｍＬの三角フラスコ）の場合は、培地量の下限は好ましくは１０００ｍＬ／容器以上、又は１５００ｍＬ／容器以上とすることができ、培地量の上限は好ましくは２０００ｍＬ／容器以下、又は１６００ｍＬ／容器以下でもよい。例えば２Ｌ培養バッグ（容量が２Ｌのディスポーザブル培養バッグ）の場合は、培地量の下限は好ましくは１００ｍＬ／バッグ以上、又は１０００ｍＬ／バッグ以上でもよく、培地量の上限は好ましくは２０００ｍＬ／バッグ以下、又は１１００ｍＬ／バッグ以下でもよい。例えば１０Ｌ培養バッグ（容量が１０Ｌのディスポーザブル培養バッグ）の場合は、培地量の下限は好ましくは５００ｍＬ／バッグ以上、又は５Ｌ／バッグ以上でもよく、培地量の上限は好ましくは１０Ｌ／バッグ以下、又は６Ｌ／バッグ以下でもよい。例えば、２０Ｌ培養バッグ（容量が２０Ｌのディスポーザブル培養バッグ）の場合は、培地量の下限は好ましくは１Ｌ／バッグ以上、又は１０Ｌ／バッグ以上でもよく、培地量の上限は好ましくは２０Ｌ／バッグ以下、又は１１Ｌ／バッグ以下でもよい。例えば５０Ｌ培養バッグ（容量が５０Ｌのディスポーザブル培養バッグ）の場合は、培地量の下限は好ましくは１Ｌ／バッグ以上、又は２５Ｌ／バッグ以上でもよく、培地量の上限は好ましくは５０Ｌ／バッグ以下、又は３０Ｌ／バッグ以下でもよい。培養液量がこの範囲であるとき、適切な大きさの細胞凝集塊が形成されやすく、好適に細胞が増殖できる。
【0084】
使用する培養容器の容量は適宜選択することができ特に限定されないが、液体培地を収容する部分の底面を平面視したときの面積の下限として、好ましくは０．３２ｃｍ２以上、０．６５ｃｍ２以上、１．９ｃｍ２以上、３．０ｃｍ２以上、３．５ｃｍ２以上、９．０ｃｍ２以上、又は９．６ｃｍ２以上でもよい。前記面積の上限として、好ましくは１０００ｃｍ２以下、５００ｃｍ２以下、３００ｃｍ２以下、１５０ｃｍ２以下、７５ｃｍ２以下、５５ｃｍ２以下、２５ｃｍ２以下、又は２１ｃｍ２以下でもよい。
【0085】
浮遊培養の培養温度は、特に限定されないが、好ましくは３６．０℃から３８．０℃であり、より好ましくは３６．５℃から３７．５℃である。ＣＯ２インンキュベータ等を利用して、約１％から１０％、好ましくは５％のＣＯ２濃度雰囲気下で培養を行うことが好ましい。
【0086】
浮遊培養の培養期間は特に限定されないが、培養期間の下限は１日以上、２日以上、３日以上、４日以上、５日以上、６日以上、７日以上、８日以上、９日以上、又は１０日以上でもよく、培養期間の上限は３０日以下、２９日以下、２８日以下、２７日以下、２６日以下、２５日以下でもよい、
【0087】
本発明において、浮遊培養する工程は、好ましくは、細胞凝集塊を形成する工程を含む。細胞凝集塊とは、複数の細胞が三次元的に凝集して形成される塊状の細胞集団であって、スフェロイドとも呼ばれる。多能性幹細胞の細胞凝集塊は、多能性幹細胞の細胞集団から形成される。また、細胞凝集塊は通常、略球状を呈し、一般的には３０μｍから２０００μｍ程度の直径を有する。
本発明においては、上記した浮遊培養により、培養液中に、多能性幹細胞の細胞凝集塊を形成することができる。
本発明においては、上記した浮遊培養により、培養液中に、多能性幹細胞の細胞凝集塊を形成することができる。
【0088】
本発明の方法により作製される細胞凝集塊の寸法は特に限定されないが、顕微鏡で観察したとき、観察像での最も幅の広い部分の寸法の上限としては、例えば１０００μｍ以下、９００μｍ以下、８００μｍ以下、７００μｍ以下、６００μｍ以下、５００μｍ以下、４００μｍ以下、又は３００μｍ以下が好ましくい。前記寸法の下限としては、例えば３０μｍ以上、４０μｍ以上、５０μｍ以上、６０μｍ以上、７０μｍ以上、８０μｍ以上、９０μｍ以上、又は１００μｍ以上が好ましい。このような寸法範囲の細胞凝集塊は、内部の細胞にも酸素や栄養成分が供給され易く細胞の増殖環境として好ましい。
【0089】
本発明により形成される細胞凝集塊の集団は、前記集団を構成する細胞凝集塊のうち重量基準で、例えば１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、又は９０％以上が上記の範囲の寸法を有することができる。上記の範囲の寸法の細胞凝集塊を２０％以上含む細胞凝集塊の集団では、個々の細胞凝集塊において、内部の細胞にも酸素や栄養成分が供給され易く細胞の増殖環境として好ましい。
【0090】
また、本発明により形成される細胞凝集塊は、前記細胞凝集塊を構成する細胞のうち生細胞の割合（生存率）が、例えば５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、又は９０％以上であることが好ましい。上記の範囲の生存率の細胞集団は、細胞の増殖に好ましい状態である。
【0091】
浮遊培養を行う際には、適当な頻度で培地交換を行うことが好ましい。培地交換の頻度は特に限定されず、細胞種や培養条件により異なるが、好ましくは５日に一回以上、４日に一回以上、３日に一回以上、２日に一回以上、又は１日に一回以上の頻度で培地交換作業を行うことができる。この頻度の培地交換は、本発明に使用したような多能性幹細胞の細胞凝集塊を培養する際に特に好適である。培地交換に用いる液体培地としては、上記と同様の液体培地を用いることができ、培養の条件としては上記と同様の条件を用いることができる。培地交換の方法は特に限定されない。例えば、好ましくは細胞凝集塊を含む培養液を遠沈管に全量回収し、遠心分離又は静置状態で５分程度置き、沈降した細胞凝集塊を残して上清を除去し、その後、新鮮な液体培地を添加し、穏やかに細胞凝集塊を分散させた後、再度プレート等の培養容器に分散した細胞を戻すことで細胞凝集塊を継続して培養することができる。
【0092】
浮遊培養を行う際には、適当な頻度で継代を行うことが好ましい。継代の頻度は特に限定されないが、好ましくは８日に一回以上、７日に一回以上、６日に一回以上、５日に一回以上、４日に一回以上、又は３日に一回以上の頻度で継代作業を行うことができる。この頻度の継代は、本発明に使用したような多能性幹細胞の細胞凝集塊を培養する際に特に好適である。継代の方法は特に限定されない。例えば、好ましくは細胞凝集塊を含む培養液を遠沈管に全量回収し、遠心分離又は静置状態で５分程度置き、沈降した細胞凝集塊を残して上清を除去し、細胞凝集塊を回収することができる。また、回収した細胞凝集塊を必要に応じて洗浄することができる。洗浄方法は特に限定されないが、例えば、遠沈管に回収した細胞凝集塊に対して洗浄液を加え、再度上記の方法で細胞凝集塊を沈降させ、上清を除去することによって細胞凝集塊を洗浄することができる。洗浄回数は限定されない。洗浄液には、バッファ（ＰＢＳバッファを含む）、生理食塩水、又は液体培地（基礎培地が好ましい）を使用することができる。回収した細胞凝集塊に対して、例えば機械的、化学的又は生物学的な方法により単離し、浮遊培養のための新鮮培地に播種して浮遊培養を再開することができる。継代後の浮遊培養に用いる液体培地及び培養の条件としては上記と同様の液体培地及び条件を用いることができる。単離に用いる剥離剤として例えば、ＥＤＴＡ、ＴｒｙＰＬＥＴＭ Ｓｅｌｅｃｔ、アキュターゼＴＭ、コラゲナーゼ、ディスパーゼ、トリプシン、トリプシン／ＥＤＴＡ、トリプシン／コラゲナーゼ、ＲｅＬｅＳＲＴＭ等を含む細胞剥離液を使用して培養基材から細胞を剥離又は細胞同士を剥離させ、ピペッティングやストレーナーを用いて十分に分散させて、単離した状態で細胞を播種することができる。
【0093】
浮遊培養後、細胞は培養液中に浮遊した状態で存在する。したがって、細胞の回収は、静置状態又は遠心分離により上清の液体成分を除去することで達成できる。また、細胞の回収方法としてはフィルターや中空糸分離膜等を選択することもできる。静置状態で液体成分を除去する場合、培養液の入った容器を静置状態５分程度置き、沈降した細胞や細胞凝集塊を残して上清を除去すればよい。また遠心分離は、遠心力によって細胞がダメージを受けない回転速度と処理時間で行えばよい。例えば、回転速度の下限は、細胞を沈降できれば特に限定はされないが、例えば１００ｒｐｍ以上、５００ｒｐｍ以上、８００ｒｐｍ以上、又は１０００ｒｐｍ以上とすることができる。一方、上限は細胞が遠心力によるダメージを受けない、又は受けにくい速度であればよく、例えば１４００ｒｐｍ以下、１５００ｒｐｍ以下、又は１６００ｒｐｍ以下とすることができる。また処理時間の下限は、上記回転速度により細胞を沈降できる時間であれば特に限定はされないが、例えば１０秒以上、３０秒以上、１分以上、３分以上、又は５分以上とすることができる。また、処理時間の上限は、上記回転により細胞がダメージを受けない、又は受けにくい時間であればよく、例えば３０秒以下、６分以下、８分以下、又は１０分以下とすることができる。回収した細胞は、必要に応じて洗浄することができる。洗浄方法は、特に限定されない。例えば前述の浮遊培養工程における「継代方法」に記載の洗浄方法と同様に行ってもよい。洗浄液には、バッファ（ＰＢＳバッファを含む）、生理食塩水、又は液体培地（基礎培地が好ましい）を使用することができる。
【0094】
本発明においては、上記した浮遊培養により、培養液中に、多能性幹細胞の細胞凝集塊を形成することができる。
【0095】
細胞凝集塊を構成する多能性幹細胞は、好ましくは未分化性を保持している。細胞の未分化性は、未分化マーカーの発現状態を解析することにより確認することができる。未分化マーカーの発現状態の解析は、例えば、定量的リアルタイムＰＣＲ解析、又はフローサイトメトリー解析等により行うことができる。未分化マーカーとしては、例えば、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、ＳＳＥＡ－３、ＳＳＥＡ－４、ＴＲＡ－１－６０、ＴＲＡ－１－８１、ＲＥＸ－１、ＬＩＮ２８、ＬＥＦＴＢ、ＧＤＦ３、ＺＦＰ４２、ＦＧＦ４、ＥＳＧ１、ＤＰＰＡ２、ＴＥＲＴ、ＫＬＦ４、ｃ－Ｍｙｃ等が挙げられるが、これらに限定されない。未分化マーカーとしては、上記の中でも、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、及びＮａｎｏｇが好ましい。なお、未分化マーカーは多能性幹細胞マーカーと同義であり、両者は互換的に使用することができる。
【0096】
細胞凝集塊において、Ｏｃｔ４が陽性を呈する細胞の比率は、好ましくは９０％以上であり、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、又は９５％以上でもよい。
細胞凝集塊において、Ｓｏｘ２が陽性を呈する細胞の比率は、好ましくは９０％以上であり、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上でもよい。
細胞凝集塊において、Ｎａｎｏｇが陽性を呈する細胞の比率は、好ましくは９０％以上であり、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、又は９６％以上でもよい。
細胞凝集塊において、Ｓｏｘ２が陽性を呈する細胞の比率は、好ましくは９０％以上であり、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上でもよい。
細胞凝集塊において、Ｎａｎｏｇが陽性を呈する細胞の比率は、好ましくは９０％以上であり、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、又は９６％以上でもよい。
【0097】
本発明の方法では、以下に示す（ａ）及び（ｂ）の特性を有する細胞集団を選別する工程を含んでもよい。
（ａ）前記細胞集団において、β－Ａｃｔｉｎ遺伝子の発現量に対するＬＥＦ１遺伝子の相対発現量が５．５×１０－４以下であり、
（ｂ）前記細胞集団において、ＬＥＦ１が陽性を呈する多能性幹細胞の比率が５５％以下である。
前記（ａ）及び（ｂ）の特性を有する細胞集団を選別するとは、複数の細胞集団の中から前記（ａ）及び（ｂ）の特性を有する細胞集団を識別して取得することであってもよく、ある細胞集団から前記（ａ）及び（ｂ）の特性を有する細胞集団を調製することであってもよい。複数の細胞集団の中から前記（ａ）及び（ｂ）の特性を有する細胞集団を識別して取得する場合、前記複数の細胞集団のそれぞれについて（ａ）及び（ｂ）の特性を有するかを確認し、（ａ）及び（ｂ）の特性を有する細胞集団を取得すればよい。ある細胞集団から前記（ａ）及び（ｂ）の特性を有する細胞集団を調製する方法としては、例えばＦＡＣＳ、セルソーター、磁気ビーズによる分取などの物理的な方法、及び適切な培養条件によって上記指標を満たさない細胞を淘汰し、上記指標を満たす細胞集団を純化する化学的な方法を挙げることができるが、その方法は特に限定されず、培養方法等に応じて適宜選択すればよい。例えば、ＦＡＣＳ、セルソーター、磁気ビーズ等の物理的な方法では、抗ＬＥＦ１抗体を用いてＬＥＦ１を発現する細胞を分取することができる。また、（ａ）及び（ｂ）の指標を満たさない細胞を淘汰する培養条件としては、上記で説明した培養条件が挙げられる。より具体的には、多能幹細胞の未分化性を維持する因子の存在下で細胞集団を培養してもよい。そのような因子としては、例えば、ＦＧＦ２、ＲＯＣＫ阻害剤、ＷＮＴ阻害剤等が挙げられる。これらの因子は、培地中の濃度が上記と同様の濃度となるように培地中に添加することができる。
なお、上記選別の前に、上記特性を指標として、多能性幹細胞を含む細胞集団を識別する工程を含んでもよい。
（ａ）前記細胞集団において、β－Ａｃｔｉｎ遺伝子の発現量に対するＬＥＦ１遺伝子の相対発現量が５．５×１０－４以下であり、
（ｂ）前記細胞集団において、ＬＥＦ１が陽性を呈する多能性幹細胞の比率が５５％以下である。
前記（ａ）及び（ｂ）の特性を有する細胞集団を選別するとは、複数の細胞集団の中から前記（ａ）及び（ｂ）の特性を有する細胞集団を識別して取得することであってもよく、ある細胞集団から前記（ａ）及び（ｂ）の特性を有する細胞集団を調製することであってもよい。複数の細胞集団の中から前記（ａ）及び（ｂ）の特性を有する細胞集団を識別して取得する場合、前記複数の細胞集団のそれぞれについて（ａ）及び（ｂ）の特性を有するかを確認し、（ａ）及び（ｂ）の特性を有する細胞集団を取得すればよい。ある細胞集団から前記（ａ）及び（ｂ）の特性を有する細胞集団を調製する方法としては、例えばＦＡＣＳ、セルソーター、磁気ビーズによる分取などの物理的な方法、及び適切な培養条件によって上記指標を満たさない細胞を淘汰し、上記指標を満たす細胞集団を純化する化学的な方法を挙げることができるが、その方法は特に限定されず、培養方法等に応じて適宜選択すればよい。例えば、ＦＡＣＳ、セルソーター、磁気ビーズ等の物理的な方法では、抗ＬＥＦ１抗体を用いてＬＥＦ１を発現する細胞を分取することができる。また、（ａ）及び（ｂ）の指標を満たさない細胞を淘汰する培養条件としては、上記で説明した培養条件が挙げられる。より具体的には、多能幹細胞の未分化性を維持する因子の存在下で細胞集団を培養してもよい。そのような因子としては、例えば、ＦＧＦ２、ＲＯＣＫ阻害剤、ＷＮＴ阻害剤等が挙げられる。これらの因子は、培地中の濃度が上記と同様の濃度となるように培地中に添加することができる。
なお、上記選別の前に、上記特性を指標として、多能性幹細胞を含む細胞集団を識別する工程を含んでもよい。
【0098】
上記（ａ）及び（ｂ）の特性を有する細胞集団を選別するタイミングは、特に限定されないが、例えば、維持培養前、維持培養の途中、維持培養後、接着培養前、接着培養の途中、接着培養後、浮遊培養前、浮遊培養の途中、浮遊培養後、細胞集団の回収前、細胞集団の回収後、分化誘導前、細胞の凍結保存ストック作製前等を挙げることができる。
【0099】
本発明はさらに、
多能性幹細胞を含む細胞集団を培養する工程と、
前記細胞集団が、前記（ａ）及び（ｂ）の特性を有する細胞集団であるかを確認する工程と、
前記（ａ）及び（ｂ）の特性を有する細胞集団であることが確認された前記細胞集団を取得する工程と、
を含む、多能性幹細胞を含む細胞集団の製造方法に関する。
多能性幹細胞を含む細胞集団を培養する工程と、
前記細胞集団が、前記（ａ）及び（ｂ）の特性を有する細胞集団であるかを確認する工程と、
前記（ａ）及び（ｂ）の特性を有する細胞集団であることが確認された前記細胞集団を取得する工程と、
を含む、多能性幹細胞を含む細胞集団の製造方法に関する。
【0100】
多能性幹細胞を含む細胞集団を培養する工程は、上記と同様に行うことができる。例えば、多能性細胞を含む集団を培養する工程は、多能幹細胞の未分化性を維持する因子の存在下で細胞集団を培養することができる。そのような因子としては、例えば、ＦＧＦ２、ＲＯＣＫ阻害剤、ＷＮＴ阻害剤等が挙げられる。これらの因子は、培地中の濃度が上記と同様の濃度となるように培地中に添加することができる。
【0101】
多能性幹細胞を含む細胞集団が、前記（ａ）及び（ｂ）の特性を有する細胞集団であるかを確認する工程は、上記と同様に定量的リアルタイムＰＣＲ及びフローサイトメトリー解析により行うことができる。
前記（ａ）及び（ｂ）の特性を有する細胞集団は、分化能の高い細胞集団であるといえる。そのため、（ａ）及び（ｂ）の特性を有することが確認された細胞集団を取得することにより、分化能の高い多能性幹細胞を含む細胞集団を得ることができる。
前記（ａ）及び（ｂ）の特性を有する細胞集団は、分化能の高い細胞集団であるといえる。そのため、（ａ）及び（ｂ）の特性を有することが確認された細胞集団を取得することにより、分化能の高い多能性幹細胞を含む細胞集団を得ることができる。
【0102】
［多能性幹細胞の分化能をモニタリングする方法］
本発明はさらに、以下に示す（ａ）及び（ｂ）の特性を指標として、多能性幹細胞を含む細胞集団の分化能をモニタリングする方法に関する。
（ａ）前記細胞集団において、β－Ａｃｔｉｎ遺伝子の発現量に対するＬＥＦ１遺伝子の相対発現量が５．５×１０－４以下であり、
（ｂ）前記細胞集団において、ＬＥＦ１が陽性を呈する多能性幹細胞の比率が５５％以下である。
前記モニタリングが必要な工程としては、例えば、培養する工程、培養によって取得した細胞集団を凍結保存する工程を挙げることができる。
本発明はさらに、以下に示す（ａ）及び（ｂ）の特性を指標として、多能性幹細胞を含む細胞集団の分化能をモニタリングする方法に関する。
（ａ）前記細胞集団において、β－Ａｃｔｉｎ遺伝子の発現量に対するＬＥＦ１遺伝子の相対発現量が５．５×１０－４以下であり、
（ｂ）前記細胞集団において、ＬＥＦ１が陽性を呈する多能性幹細胞の比率が５５％以下である。
前記モニタリングが必要な工程としては、例えば、培養する工程、培養によって取得した細胞集団を凍結保存する工程を挙げることができる。
【0103】
培養する工程においては、指標を経時的に測定することで、多能性幹細胞を含む細胞集団の分化能を迅速に把握かつ予測することができる。例えば、培養中に、培養細胞の一部を採取して、上記（ａ）及び（ｂ）の指標について調査することができる。上記指標を満たす多能性幹細胞を含む細胞集団においては、前記細胞集団の分化能が高いことが分かる。一方、上記指標から値が逸脱した培養状態が継続している場合には、多能性幹細胞を含む細胞集団の分化能が低下していることが予測できる。分化能が低下しつつあることを指標から読み取った場合には、培養条件（培地または添加剤の追加や変更など）を必要に応じて適切に変更することによって、多能性幹細胞を含む細胞集団の分化能を向上させることができる。例えば、多能幹細胞の分化能を向上させるために、未分化性を維持する因子の存在下で多能性幹細胞を培養してもよい。そのような因子としては、例えば、ＦＧＦ２、ＲＯＣＫ阻害剤、ＷＮＴ阻害剤等が挙げられる。これらの因子は、培地中の濃度が上記と同様の濃度となるように培地中に添加することができる。なお、培養の初期段階においては、その工程の最終段階において前記指標をみたすように培養条件（播種密度、培地、添加剤など）を設計して、少なくとも最終段階においては、上記指標を満たすことが出来ればよい。
【0104】
また、培養の最終段階において上記指標を満たさない場合には、例えば抗ＬＥＦ１抗体を用いたセルソーティング技術等を利用することによって、上記指標を満たす多能性幹細胞を含む細胞集団を選別することができる。
【0105】
本発明は、また、以下に示す（ａ）及び（ｂ）の特性を指標として、多能性幹細胞を含む細胞集団の分化能を評価する方法に関する。
（ａ）前記細胞集団において、β－Ａｃｔｉｎ遺伝子の発現量に対するＬＥＦ１遺伝子の相対発現量が５．５×１０－４以下であり、
（ｂ）前記細胞集団において、ＬＥＦ１が陽性を呈する多能性幹細胞の比率が５５％以下である。
（ａ）前記細胞集団において、β－Ａｃｔｉｎ遺伝子の発現量に対するＬＥＦ１遺伝子の相対発現量が５．５×１０－４以下であり、
（ｂ）前記細胞集団において、ＬＥＦ１が陽性を呈する多能性幹細胞の比率が５５％以下である。
【0106】
例えば、評価対象の細胞集団について、前記（ａ）及び（ｂ）の指標を確認し、前記（ａ）及び（ｂ）の指標を満たす場合には、前記細胞集団は分化能が高いと、評価することができる。一方。前記（ａ）及び（ｂ）の指標を満たさない場合には、前記細胞集団は分化能が低いと、評価することができる。
評価対象とする細胞集団としては、例えば、後述の体細胞の製造御方法に用いる細胞集団が挙げられる。
評価対象とする細胞集団としては、例えば、後述の体細胞の製造御方法に用いる細胞集団が挙げられる。
【0107】
本発明はまた、以下に示す（ａ）及び（ｂ）の特性を指標として、多能性幹細胞を含む細胞集団の未分化性をモニタリングする方法に関する。
（ａ）前記細胞集団において、β－Ａｃｔｉｎ遺伝子の発現量に対するＬＥＦ１遺伝子の相対発現量が５．５×１０－４以下であり、
（ｂ）前記細胞集団において、ＬＥＦ１が陽性を呈する多能性幹細胞の比率が５５％以下である。
（ａ）前記細胞集団において、β－Ａｃｔｉｎ遺伝子の発現量に対するＬＥＦ１遺伝子の相対発現量が５．５×１０－４以下であり、
（ｂ）前記細胞集団において、ＬＥＦ１が陽性を呈する多能性幹細胞の比率が５５％以下である。
【0108】
本発明はまた、以下に示す（ａ）及び（ｂ）の特性を指標として、多能性幹細胞を含む細胞集団の未分化性を評価する方法に関する。
（ａ）前記細胞集団において、β－Ａｃｔｉｎ遺伝子の発現量に対するＬＥＦ１遺伝子の相対発現量が５．５×１０－４以下であり、
（ｂ）前記細胞集団において、ＬＥＦ１が陽性を呈する多能性幹細胞の比率が５５％以下である。
（ａ）前記細胞集団において、β－Ａｃｔｉｎ遺伝子の発現量に対するＬＥＦ１遺伝子の相対発現量が５．５×１０－４以下であり、
（ｂ）前記細胞集団において、ＬＥＦ１が陽性を呈する多能性幹細胞の比率が５５％以下である。
【0109】
［体細胞の製造方法］
本発明は、本発明の細胞集団を、分化誘導因子の存在下で培養し体細胞へと分化させることを含む、体細胞の製造方法に関する。
本発明は、本発明の細胞集団を、分化誘導因子の存在下で培養し体細胞へと分化させることを含む、体細胞の製造方法に関する。
【0110】
本発明で使用する分化誘導因子としては、例えば、ＴＧＦβシグナルに作用する物質、ＷＮＴシグナルに作用する物質、ヘッジホッグシグナルに作用する物質、ＢＭＰシグナルに作用する物質、並びにＮｏｄａｌ／アクチビンシグナルに作用する物質が挙げられ、具体的には国際公開第２０１６/０６３９８６号、国際公開第２０１２/０２０８４５号、並びに国際公開第２０１６/０６０２６０号に記載されている分化誘導因子を用いることができる。
【0111】
また、本発明の多能性幹細胞は、未分化性を維持していることから、所望の体細胞に効率よく分化誘導することができる。多能性幹細胞から所望の細胞への分化誘導のためには、任意の分化誘導培地を使用することができる。分化誘導培地としては、例えば、神経分化培地、骨芽細胞分化培地、心筋細胞分化培地、脂肪細胞分化培地、腸上皮細胞分化培地等を使用することができるが、特に限定されない。分化誘導培地としては、外胚葉分化培地、中胚葉分化培地、又は内胚葉分化培地を使用することができる。本発明の多能性幹細胞を、所望の体細胞への分化誘導に適した分化培地を用いて培養することにより、所望の体細胞を調製することができる。
【0112】
多能性幹細胞を内胚葉系細胞に分化誘導させることを意図する場合には、例えば、Ｄ‘Ａｍｏｕｒ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｈｏｒｍｏｎｅ－ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２００６ Ｎｏｖ；２４（１１）：１３９２－４０１に記載されている方法を使用することができ、ヒトＥＳ細胞をＷＮＴ３ａとアクチビンＡを含む培地中で培養することで内胚葉系細胞に分化誘導できることが示されている。
【0113】
多能性幹細胞を中胚葉系細胞に分化誘導させることを意図する場合には、例えば、特表２０１３－５３０６８０号公報に記載されている方法を使用することができる。特表２０１３－５３０６８０号公報には、（ｉ）アクチビンＡおよびＷＮＴを含む培地中でヒト多能性幹細胞を培養する工程、および（ｉｉ）ＢＭＰおよびＷＮＴもしくはＷＮＴの機能等価物を含む培地中で、工程（ｉ）で得られた細胞を培養する工程を含む、ヒト多能性幹細胞から中間中胚葉系細胞の製造方法が記載されている。また、Ａｌｂｅｒｔ Ｑ Ｌａｍ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｎｅｐｈｒｏｌ ２５：１２１１－１２２２５，２０１５には、ヒト多能性幹細胞を、ＧＳＫ３β阻害剤であるＣＨＩＲ９９０２１で処理した後に、ＦＧＦ２及びレチノイン酸で処理することにより効率的に中胚葉系細胞に分化誘導できることが記載されている。本発明においても、上記文献に記載されている分化誘導因子を用いて、多能性幹細胞を中胚葉系細胞に分化誘導させることができる。
【0114】
多能性幹細胞を外胚葉系細胞に分化誘導させることを意図する場合には、例えば、ＢＭＰ阻害剤（Ｎｏｇｇｉｎ等）及びＴＧＦβ／アクチビン阻害剤を含む培地中で多能性幹細胞を培養する方法（Ｃｈａｍｂｅｒｓ ＳＭ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２７，２７５－２８０（２００９））、ＢＭＰ阻害剤（Ｎｏｇｇｉｎ等）及びＮｏｄａｌ／アクチビン阻害剤を含む培地中で多能性幹細胞を培養する方法（Ｂｅａｔａ Ｓｕｒｎａｃｚ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ，２０１２；３０：１８７５－１８８４）を採用することができる。
【0115】
分化誘導の培養条件は、動物細胞を培養できる条件であれば特に限定されないが、例えば、上記多様性幹細胞の維持培養と同様の条件を用いることができる。分化誘導の培養温度は、特に限定されないが、好ましくは３６．０℃から３８．０℃であり、より好ましくは３６．５℃から３７．５℃である。ＣＯ２インンキュベータ等を利用して、約１％から１０％、好ましくは５％のＣＯ２濃度雰囲気下で培養を行うことが好ましい。
【0116】
内胚葉系細胞は、消化管、肺、甲状腺、膵臓、肝臓などの器官の組織、消化管に開口する分泌腺の細胞、腹膜、胸膜、喉頭、耳管、気管、気管支、尿路（膀胱、尿道の大部分、尿管の一部）などへと分化する能力を有し、一般的に、胚体内胚葉（ＤＥ）と言われることがある。多能性幹細胞から内胚葉系細胞への分化は、内胚葉系細胞に特異的な遺伝子の発現量を測定することにより確認することができる。内胚葉系細胞に特異的な遺伝子としては、例えば、ＳＯＸ１７、ＦＯＸＡ２、ＣＸＣＲ４、ＡＦＰ、ＧＡＴＡ４、及びＥＯＭＥＳ等を挙げることができる。
分化誘導により得られる内胚葉系細胞におけるＳＯＸ１７の発現量は、ハウスキーピング遺伝子であるＡＣＴＢ（β－Ａｃｔｉｎ）に対する相対遺伝子発現量として、１．０×１０－４以上、１．０×１０－３以上、又は１．０×１０－２以上であることが好ましい。
分化誘導により得られる内胚葉系細胞におけるＦＯＸＡ２の発現量は、ハウスキーピング遺伝子であるＡＣＴＢ（β－Ａｃｔｉｎ）に対する相対遺伝子発現量として、１．０×１０－５以上、１．０×１０－４以上、又は１．０×１０－３以上であることが好ましい。
分化誘導により得られる内胚葉系細胞におけるＣＸＣＲ４の発現量は、ハウスキーピング遺伝子であるＡＣＴＢ（β－Ａｃｔｉｎ）に対する相対遺伝子発現量として、１．０×１０－３以上、１．０×１０－３以上、又は１．０×１０－１以上であることが好ましい。
分化誘導により得られる内胚葉系細胞におけるＳＯＸ１７の発現量は、ハウスキーピング遺伝子であるＡＣＴＢ（β－Ａｃｔｉｎ）に対する相対遺伝子発現量として、１．０×１０－４以上、１．０×１０－３以上、又は１．０×１０－２以上であることが好ましい。
分化誘導により得られる内胚葉系細胞におけるＦＯＸＡ２の発現量は、ハウスキーピング遺伝子であるＡＣＴＢ（β－Ａｃｔｉｎ）に対する相対遺伝子発現量として、１．０×１０－５以上、１．０×１０－４以上、又は１．０×１０－３以上であることが好ましい。
分化誘導により得られる内胚葉系細胞におけるＣＸＣＲ４の発現量は、ハウスキーピング遺伝子であるＡＣＴＢ（β－Ａｃｔｉｎ）に対する相対遺伝子発現量として、１．０×１０－３以上、１．０×１０－３以上、又は１．０×１０－１以上であることが好ましい。
【0117】
中胚葉系細胞は、体腔及びそれを裏打ちする中皮、筋肉、骨格、皮膚真皮、結合組織、心臓、血管（血管内皮も含む）、血液（血液細胞も含む）、リンパ管、脾臓、腎臓、尿管、性腺（精巣、子宮、性腺上皮）などへと分化する。中胚葉系細胞に特異的な遺伝子としては、例えば、ＭＥＳＰ１、ＭＥＳＰ２、ＦＯＸＦ１、ＢＲＡＣＨＹＵＲＹ、ＨＡＮＤ１、ＥＶＸ１、ＩＲＸ３、ＣＤＸ２、ＣＸＣＲ４、ＴＢＸ６、ＭＩＸＬ１、ＩＳＬ１、ＳＮＡＩ２、ＦＯＸＣ１、ＶＥＧＦＲ２、及びＰＤＧＦＲα等を挙げることができる。
分化誘導により得られる中胚葉系細胞におけるＣＤＸ２の発現量は、ハウスキーピング遺伝子であるＡＣＴＢ（β－Ａｃｔｉｎ）に対する相対遺伝子発現量として、１．０×１０－５以上、１．０×１０－４以上、又は１．０×１０－３以上であることが好ましい。
分化誘導により得られる中胚葉系細胞におけるＣＸＣＲ４の発現量は、ハウスキーピング遺伝子であるＡＣＴＢ（β－Ａｃｔｉｎ）に対する相対遺伝子発現量として、１．０×１０－５以上、１．０×１０－４以上、又は１．０×１０－３以上であることが好ましい。
分化誘導により得られる中胚葉系細胞におけるＶＥＧＦＲ２の発現量は、ハウスキーピング遺伝子であるＡＣＴＢ（β－Ａｃｔｉｎ）に対する相対遺伝子発現量として、１．０×１０－４以上、１．０×１０－３以上、又は１．０×１０－２以上であることが好ましい。
分化誘導により得られる中胚葉系細胞におけるＰＤＧＦＲαの発現量は、ハウスキーピング遺伝子であるＡＣＴＢ（β－Ａｃｔｉｎ）に対する相対遺伝子発現量として、１．０×１０－４以上、１．０×１０－３以上、又は１．０×１０－２以上であることが好ましい。
分化誘導により得られる中胚葉系細胞におけるＣＤＸ２の発現量は、ハウスキーピング遺伝子であるＡＣＴＢ（β－Ａｃｔｉｎ）に対する相対遺伝子発現量として、１．０×１０－５以上、１．０×１０－４以上、又は１．０×１０－３以上であることが好ましい。
分化誘導により得られる中胚葉系細胞におけるＣＸＣＲ４の発現量は、ハウスキーピング遺伝子であるＡＣＴＢ（β－Ａｃｔｉｎ）に対する相対遺伝子発現量として、１．０×１０－５以上、１．０×１０－４以上、又は１．０×１０－３以上であることが好ましい。
分化誘導により得られる中胚葉系細胞におけるＶＥＧＦＲ２の発現量は、ハウスキーピング遺伝子であるＡＣＴＢ（β－Ａｃｔｉｎ）に対する相対遺伝子発現量として、１．０×１０－４以上、１．０×１０－３以上、又は１．０×１０－２以上であることが好ましい。
分化誘導により得られる中胚葉系細胞におけるＰＤＧＦＲαの発現量は、ハウスキーピング遺伝子であるＡＣＴＢ（β－Ａｃｔｉｎ）に対する相対遺伝子発現量として、１．０×１０－４以上、１．０×１０－３以上、又は１．０×１０－２以上であることが好ましい。
【0118】
外胚葉系細胞は、皮膚の表皮や男性の尿道末端部の上皮、毛髪、爪、皮膚腺（乳腺、汗腺を含む）、感覚器（口腔、咽頭、鼻、直腸の末端部の上皮を含む、唾液腺）水晶体などを形成する。外胚葉系細胞の一部は発生過程で溝状に陥入して神経管を形成し、脳や脊髄などの中枢神経系のニューロンやメラノサイトなどの元にもなる。また末梢神経系も形成する。外胚葉系細胞に特異的な遺伝子としては、例えば、ＦＧＦ５、ＯＴＸ２、ＳＯＸ１、ＮＥＳＴＩＮ、及びＰＡＸ６等を挙げることができる。
分化誘導により得られる外胚葉系細胞におけるＰＡＸ６の発現量は、ハウスキーピング遺伝子であるＡＣＴＢ（β－Ａｃｔｉｎ）に対する相対遺伝子発現量として、１．０×１０－６以上、１．０×１０－５以上、又は３．８×１０－５以上であることが好ましい。
分化誘導により得られる外胚葉系細胞におけるＳＯＸ１の発現量は、ハウスキーピング遺伝子であるＡＣＴＢ（β－Ａｃｔｉｎ）に対する相対遺伝子発現量として、１．０×１０－４以上、１．０×１０－３以上、又は１．０×１０－２以上であることが好ましい。
分化誘導により得られる外胚葉系細胞におけるＮＥＳＴＩＮの発現量は、ハウスキーピング遺伝子であるＡＣＴＢ（β－Ａｃｔｉｎ）に対する相対遺伝子発現量として、１．０×１０－３以上、１．０×１０－２以上、又は５．０×１０－２以上であることが好ましい。
分化誘導により得られる外胚葉系細胞におけるＰＡＸ６の発現量は、ハウスキーピング遺伝子であるＡＣＴＢ（β－Ａｃｔｉｎ）に対する相対遺伝子発現量として、１．０×１０－６以上、１．０×１０－５以上、又は３．８×１０－５以上であることが好ましい。
分化誘導により得られる外胚葉系細胞におけるＳＯＸ１の発現量は、ハウスキーピング遺伝子であるＡＣＴＢ（β－Ａｃｔｉｎ）に対する相対遺伝子発現量として、１．０×１０－４以上、１．０×１０－３以上、又は１．０×１０－２以上であることが好ましい。
分化誘導により得られる外胚葉系細胞におけるＮＥＳＴＩＮの発現量は、ハウスキーピング遺伝子であるＡＣＴＢ（β－Ａｃｔｉｎ）に対する相対遺伝子発現量として、１．０×１０－３以上、１．０×１０－２以上、又は５．０×１０－２以上であることが好ましい。
【0119】
本発明における体細胞は、前記本発明の多能性幹細胞を含む細胞集団から分化誘導することができる。体細胞の種類は、生体内に存在し得る体細胞であれば特に限定されないが、例えば、体性幹細胞（骨髄、脂肪組織、歯髄、胎盤、卵膜、臍帯血、羊膜、絨毛膜等に由来する間葉系幹細胞、神経幹細胞等）、神経細胞、グリア細胞、オリゴデンドロサイト、シュワン細胞、心筋細胞、心筋前駆細胞、肝細胞、肝臓前駆細胞、α細胞、β細胞、繊維芽細胞、軟骨細胞、角膜細胞、血管内皮細胞、血管内皮前駆細胞、周細胞、骨格筋細胞、巨核球、造血幹細胞、気道上皮細胞、生殖細胞、樹状細胞、好酸球、肥満細胞、Ｔ細胞、エリスロポエチン産生細胞、腸管上皮、肺胞上皮細胞、腎臓細胞等が例示できる。体細胞は、前記のような細胞に遺伝子導入された形態、または前記のような細胞においてゲノム上の対象遺伝子などがノックダウン若しくはノックアウトされた形態でもよい。
【0120】
本発明はまた、
多能性幹細胞を含む細胞集団を培養する工程と、
前記細胞集団が、以下に示す（ａ）及び（ｂ）の特性を有する細胞集団であるかを確認する工程と、
前記（ａ）及び（ｂ）の特性を有する細胞集団であることが確認された前記細胞集団を、分化誘導因子の存在下で培養する工程と、
を含む、体細胞の製造方法に関する。
（ａ）前記細胞集団において、β－Ａｃｔｉｎ遺伝子の発現量に対するＬＥＦ１遺伝子の相対発現量が５．５×１０－４以下であり、
（ｂ）前記細胞集団において、ＬＥＦ１が陽性を呈する細胞の比率が５５％以下である。
多能性幹細胞を含む細胞集団を培養する工程と、
前記細胞集団が、以下に示す（ａ）及び（ｂ）の特性を有する細胞集団であるかを確認する工程と、
前記（ａ）及び（ｂ）の特性を有する細胞集団であることが確認された前記細胞集団を、分化誘導因子の存在下で培養する工程と、
を含む、体細胞の製造方法に関する。
（ａ）前記細胞集団において、β－Ａｃｔｉｎ遺伝子の発現量に対するＬＥＦ１遺伝子の相対発現量が５．５×１０－４以下であり、
（ｂ）前記細胞集団において、ＬＥＦ１が陽性を呈する細胞の比率が５５％以下である。
【0121】
多能性幹細胞を含む細胞集団を培養する工程は、上記と同様の培地及び培養条件を用いて行うことができる。
前記細胞集団が、前記（ａ）及び（ｂ）の特性を有する細胞集団であるかを確認する工程は、上記と同様に定量的リアルタイムＰＣＲ及びフローサイトメトリー解析により行うことができる。
前記（ａ）及び（ｂ）の特性を有する細胞集団であることが確認された細胞集団を、分化誘導因子の存在下で培養する工程は、分化誘導する体細胞の種類に応じて、上記のような分化誘導因子を用いて行うことができる。
前記細胞集団が、前記（ａ）及び（ｂ）の特性を有する細胞集団であるかを確認する工程は、上記と同様に定量的リアルタイムＰＣＲ及びフローサイトメトリー解析により行うことができる。
前記（ａ）及び（ｂ）の特性を有する細胞集団であることが確認された細胞集団を、分化誘導因子の存在下で培養する工程は、分化誘導する体細胞の種類に応じて、上記のような分化誘導因子を用いて行うことができる。
【0122】
以下の実施例にて本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【実施例】
【0123】
＜比較例１＞
ヒトｉＰＳ細胞２０１Ｂ７株（京都大学ｉＰＳ細胞研究所）をＶｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）コートした細胞培養用ディッシュ上にて、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で維持培養して調製した。維持培養中の培地はＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ（味の素社）培地を使用した。維持培養した細胞をＡｃｃｕｔａｓｅ（イノベーティブセルテクノロジーズ社）で３分間から５分間処理してディッシュから剥離し、ピペッティングによって単細胞まで分散させた。この細胞を最終濃度１０μＭのＹ－２７６３２を含むＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ培地で懸濁し、その一部をトリパンブルー染色して生細胞数を測定した。最終濃度１０μＭのＹ－２７６３２を含むＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ培地を用いて、１ｍＬあたり２×１０５個の細胞を含むように細胞懸濁液を調製した。浮遊培養用６ウェルプレート（住友ベークライト社）に１ウェルあたり４ｍＬの細胞懸濁液を播種した。細胞を播種したプレートはロータリーシェーカー（オプティマ社）上で８３ｒｐｍの速度で水平面に沿って旋回幅（直径）が２５ｍｍの円を描くように旋回させ、３７℃、５％ＣＯ２環境下で浮遊培養を行った。細胞を播種した日を培養０日目とし、培養５日目に継代を行い、培養１０日目まで浮遊培養を行った。培地交換の方法としては、細胞凝集塊を含む培地の全量を遠沈管に回収し、５分程度静置して細胞凝集塊を沈降させた。その後、培養上清を除去し、ＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ培地で穏やかに再懸濁し、元のウェルに戻した。培地交換時に、培養１日目及び６日目は培地にＹ－２７６３２を最終濃度５μＭとなるように添加し、培養２日目及び７日目は培地にＹ－２７６３２を最終濃度２μＭとなるように添加した。培養５日目にウェルから細胞凝集塊と培養上清を遠沈管に回収し、５分程度静置して細胞凝集塊を沈降させて培養上清を回収し、細胞凝集塊にＡｃｃｕｔａｓｅを１ｍＬ添加して１０分間処理した。ピペッティングによって単細胞まで分散させた。この細胞を最終濃度１０μＭのＹ－２７６３２を含むＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ培地で懸濁し、その一部をトリパンブルー染色して生細胞数を測定した。最終濃度１０μＭのＹ－２７６３２を含む培地を用いて、１ｍＬあたり２×１０５個の細胞を含むように細胞懸濁液を調製した。浮遊培養用６ウェルプレートに１ウェルあたり４ｍＬの細胞懸濁液を播種した。細胞を播種したプレートはロータリーシェーカー上で８３ｒｐｍの速度で水平面に沿って旋回幅（直径）が２５ｍｍの円を描くように旋回させ、３７℃、５％ＣＯ２環境下で浮遊培養を継続した。
ヒトｉＰＳ細胞２０１Ｂ７株（京都大学ｉＰＳ細胞研究所）をＶｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）コートした細胞培養用ディッシュ上にて、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で維持培養して調製した。維持培養中の培地はＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ（味の素社）培地を使用した。維持培養した細胞をＡｃｃｕｔａｓｅ（イノベーティブセルテクノロジーズ社）で３分間から５分間処理してディッシュから剥離し、ピペッティングによって単細胞まで分散させた。この細胞を最終濃度１０μＭのＹ－２７６３２を含むＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ培地で懸濁し、その一部をトリパンブルー染色して生細胞数を測定した。最終濃度１０μＭのＹ－２７６３２を含むＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ培地を用いて、１ｍＬあたり２×１０５個の細胞を含むように細胞懸濁液を調製した。浮遊培養用６ウェルプレート（住友ベークライト社）に１ウェルあたり４ｍＬの細胞懸濁液を播種した。細胞を播種したプレートはロータリーシェーカー（オプティマ社）上で８３ｒｐｍの速度で水平面に沿って旋回幅（直径）が２５ｍｍの円を描くように旋回させ、３７℃、５％ＣＯ２環境下で浮遊培養を行った。細胞を播種した日を培養０日目とし、培養５日目に継代を行い、培養１０日目まで浮遊培養を行った。培地交換の方法としては、細胞凝集塊を含む培地の全量を遠沈管に回収し、５分程度静置して細胞凝集塊を沈降させた。その後、培養上清を除去し、ＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ培地で穏やかに再懸濁し、元のウェルに戻した。培地交換時に、培養１日目及び６日目は培地にＹ－２７６３２を最終濃度５μＭとなるように添加し、培養２日目及び７日目は培地にＹ－２７６３２を最終濃度２μＭとなるように添加した。培養５日目にウェルから細胞凝集塊と培養上清を遠沈管に回収し、５分程度静置して細胞凝集塊を沈降させて培養上清を回収し、細胞凝集塊にＡｃｃｕｔａｓｅを１ｍＬ添加して１０分間処理した。ピペッティングによって単細胞まで分散させた。この細胞を最終濃度１０μＭのＹ－２７６３２を含むＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ培地で懸濁し、その一部をトリパンブルー染色して生細胞数を測定した。最終濃度１０μＭのＹ－２７６３２を含む培地を用いて、１ｍＬあたり２×１０５個の細胞を含むように細胞懸濁液を調製した。浮遊培養用６ウェルプレートに１ウェルあたり４ｍＬの細胞懸濁液を播種した。細胞を播種したプレートはロータリーシェーカー上で８３ｒｐｍの速度で水平面に沿って旋回幅（直径）が２５ｍｍの円を描くように旋回させ、３７℃、５％ＣＯ２環境下で浮遊培養を継続した。
【0124】
＜比較例２＞
浮遊培養の播種時及び培地交換時に使用するＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ培地にＦＧＦ２（ペプロテック社）を添加し、添加したＦＧＦ２の最終濃度が５０ｎｇ／ｍＬになるように調製した点を除いて、比較例１と同じ手順で維持培養及び浮遊培養を実施した。
浮遊培養の播種時及び培地交換時に使用するＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ培地にＦＧＦ２（ペプロテック社）を添加し、添加したＦＧＦ２の最終濃度が５０ｎｇ／ｍＬになるように調製した点を除いて、比較例１と同じ手順で維持培養及び浮遊培養を実施した。
【0125】
＜比較例３＞
比較例１と同じ手順でヒトｉＰＳ細胞２０１Ｂ７株を維持培養した。浮遊培養の播種時及び培地交換時に使用するＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ培地にＸＡＶ９３９（富士フイルム和光純薬社）を最終濃度が２０μＭになるように添加した点を除いて、比較例１と同じ手順で浮遊培養を実施した。
比較例１と同じ手順でヒトｉＰＳ細胞２０１Ｂ７株を維持培養した。浮遊培養の播種時及び培地交換時に使用するＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ培地にＸＡＶ９３９（富士フイルム和光純薬社）を最終濃度が２０μＭになるように添加した点を除いて、比較例１と同じ手順で浮遊培養を実施した。
【0126】
＜比較例４＞
ヒトｉＰＳ細胞にＲＰＣｈｉＰＳ７７１－２株を使用した点を除いて、比較例１と同じ手順で維持培養及び浮遊培養を実施した。
ヒトｉＰＳ細胞にＲＰＣｈｉＰＳ７７１－２株を使用した点を除いて、比較例１と同じ手順で維持培養及び浮遊培養を実施した。
【0127】
＜実施例１＞
比較例１と同じ手順で細胞を維持培養した。維持培養した細胞をＡｃｃｕｔａｓｅで３分間から５分間処理してディッシュから剥離し、ピペッティングによって単細胞まで分散させた。この細胞を最終濃度１０μＭのＹ－２７６３２を含むＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ培地で懸濁し、その一部をトリパンブルー染色して生細胞数を測定した。最終濃度１０μＭのＹ－２７６３２を含むＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ培地を用いて、１ｍＬあたり４．６×１０４個の細胞を含むように細胞懸濁液を調製した。Ｖｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎを０．５μｇ／ｃｍ２でコートした細胞培養用６ウェルプレート（住友ベークライト社）に１ウェルあたり２ｍＬの細胞懸濁液を播種し、３７℃、５％ＣＯ２環境下で接着培養を行った。細胞を播種した日を培養０日目とし、培養５日目に継代を行い、培養１０日目まで接着培養を行った。Ｙ－２７６３２を含まない培地で毎日培地交換を行った。培養５日目にウェルから培養上清を回収し、Ａｃｃｕｔａｓｅを１ウェルあたり０．５ｍＬ添加して３分間から５分間処理してウェルから細胞を剥離し、ピペッティングによって単細胞まで分散させた。この細胞を最終濃度１０μＭのＹ－２７６３２を含むＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ培地で懸濁し、その一部をトリパンブルー染色して生細胞数を測定した。細胞懸濁液を最終濃度１０μＭのＹ－２７６３２を含むＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ培地を用いて１ｍＬあたり４．６×１０４個の細胞を含むように調製した。Ｖｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎを０．５μｇ／ｃｍ２でコートした細胞培養用６ウェルプレートに１ウェルあたり２ｍＬの細胞懸濁液を播種し、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で接着培養を継続した。
比較例１と同じ手順で細胞を維持培養した。維持培養した細胞をＡｃｃｕｔａｓｅで３分間から５分間処理してディッシュから剥離し、ピペッティングによって単細胞まで分散させた。この細胞を最終濃度１０μＭのＹ－２７６３２を含むＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ培地で懸濁し、その一部をトリパンブルー染色して生細胞数を測定した。最終濃度１０μＭのＹ－２７６３２を含むＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ培地を用いて、１ｍＬあたり４．６×１０４個の細胞を含むように細胞懸濁液を調製した。Ｖｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎを０．５μｇ／ｃｍ２でコートした細胞培養用６ウェルプレート（住友ベークライト社）に１ウェルあたり２ｍＬの細胞懸濁液を播種し、３７℃、５％ＣＯ２環境下で接着培養を行った。細胞を播種した日を培養０日目とし、培養５日目に継代を行い、培養１０日目まで接着培養を行った。Ｙ－２７６３２を含まない培地で毎日培地交換を行った。培養５日目にウェルから培養上清を回収し、Ａｃｃｕｔａｓｅを１ウェルあたり０．５ｍＬ添加して３分間から５分間処理してウェルから細胞を剥離し、ピペッティングによって単細胞まで分散させた。この細胞を最終濃度１０μＭのＹ－２７６３２を含むＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ培地で懸濁し、その一部をトリパンブルー染色して生細胞数を測定した。細胞懸濁液を最終濃度１０μＭのＹ－２７６３２を含むＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ培地を用いて１ｍＬあたり４．６×１０４個の細胞を含むように調製した。Ｖｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎを０．５μｇ／ｃｍ２でコートした細胞培養用６ウェルプレートに１ウェルあたり２ｍＬの細胞懸濁液を播種し、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で接着培養を継続した。
【0128】
＜実施例２＞
維持培養及び接着培養にＥｓｓｅｎｔｉａｌ ８ＴＭ培地（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を使用した点を除いて、実施例１と同じ手順で維持培養及び接着培養を実施した。
維持培養及び接着培養にＥｓｓｅｎｔｉａｌ ８ＴＭ培地（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を使用した点を除いて、実施例１と同じ手順で維持培養及び接着培養を実施した。
【0129】
＜実施例３＞
ヒトｉＰＳ細胞にＲＰＣｈｉＰＳ７７１－２株を使用した点を除いて、実施例１と同じ手順で維持培養及び接着培養を実施した。
ヒトｉＰＳ細胞にＲＰＣｈｉＰＳ７７１－２株を使用した点を除いて、実施例１と同じ手順で維持培養及び接着培養を実施した。
【0130】
＜実施例４＞
ヒトｉＰＳ細胞にＲＰＣｈｉＰＳ７７１－２株を使用した点と、維持培養及び接着培養にＥｓｓｅｎｔｉａｌ ８ＴＭ培地を使用した点を除いて、実施例１と同じ手順で維持培養及び接着培養を実施した。
ヒトｉＰＳ細胞にＲＰＣｈｉＰＳ７７１－２株を使用した点と、維持培養及び接着培養にＥｓｓｅｎｔｉａｌ ８ＴＭ培地を使用した点を除いて、実施例１と同じ手順で維持培養及び接着培養を実施した。
【0131】
＜実施例５＞
維持培養及び浮遊培養にＥｓｓｅｎｔｉａｌ ８ＴＭ培地を使用した点を除いて、比較例１と同じ手順で維持培養及び浮遊培養を実施した。
維持培養及び浮遊培養にＥｓｓｅｎｔｉａｌ ８ＴＭ培地を使用した点を除いて、比較例１と同じ手順で維持培養及び浮遊培養を実施した。
【0132】
＜実施例６＞
ヒトｉＰＳ細胞にＲＰＣｈｉＰＳ７７１－２株を使用した点と、維持培養及び浮遊培養にＥｓｓｅｎｔｉａｌ ８ＴＭ培地を使用した点を除いて、比較例１と同じ手順で維持培養及び浮遊培養を実施した。
ヒトｉＰＳ細胞にＲＰＣｈｉＰＳ７７１－２株を使用した点と、維持培養及び浮遊培養にＥｓｓｅｎｔｉａｌ ８ＴＭ培地を使用した点を除いて、比較例１と同じ手順で維持培養及び浮遊培養を実施した。
【0133】
＜実施例７＞
ヒトｉＰＳ細胞にＲＰＣｈｉＰＳ７７１－２株を使用した点と、浮遊培養の播種時及び培地交換時に使用するＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ培地にＦＧＦ２を添加し、添加したＦＧＦ２の最終濃度が５０ｎｇ／ｍＬになるように調製した点を除いて、比較例１と同じ手順で維持培養及び浮遊培養を実施した。
ヒトｉＰＳ細胞にＲＰＣｈｉＰＳ７７１－２株を使用した点と、浮遊培養の播種時及び培地交換時に使用するＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ培地にＦＧＦ２を添加し、添加したＦＧＦ２の最終濃度が５０ｎｇ／ｍＬになるように調製した点を除いて、比較例１と同じ手順で維持培養及び浮遊培養を実施した。
【0134】
＜実施例８＞
ヒトｉＰＳ細胞にＲＰＣｈｉＰＳ７７１－２株を使用した点と、浮遊培養の播種時及び培地交換時に使用するＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ培地にＸＡＶ９３９を最終濃度が２０μＭになるように添加した点を除いて、比較例１と同じ手順で維持培養及び浮遊培養を実施した。
ヒトｉＰＳ細胞にＲＰＣｈｉＰＳ７７１－２株を使用した点と、浮遊培養の播種時及び培地交換時に使用するＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ培地にＸＡＶ９３９を最終濃度が２０μＭになるように添加した点を除いて、比較例１と同じ手順で維持培養及び浮遊培養を実施した。
【0135】
＜実施例９：細胞形態の観察＞
比較例１から比較例４及び実施例１から実施例８の培養５日目及び培養１０日目に位相差顕微鏡を用いて取得した細胞の位相差画像を図１に示す。
比較例１から比較例４及び実施例１から実施例８の培養５日目及び培養１０日目に位相差顕微鏡を用いて取得した細胞の位相差画像を図１に示す。
【0136】
＜実施例１０：定量的リアルタイムＰＣＲ解析＞
以下に示す手順で定量的リアルタイムＰＣＲ解析を行った。比較例１から比較例４及び実施例１から実施例８で得られた培養５日目及び培養１０日目の細胞をＡｃｃｕｔａｓｅで３分間から１０分間処理し、ピペッティングによって単細胞まで分散させた。この細胞をＴＲＩｚｏｌＴＭ Ｒｅａｇｅｎｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用いて溶解させた。ＰｕｒｅＬｉｎｋ（登録商標）ＲＮＡ Ｍｉｎｉキット（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用いて、ＴＲＩｚｏｌＴＭ Ｒｅａｇｅｎｔで溶解させた細胞溶液からｔｏｔａｌ ＲＮＡを単離及び精製した。精製したＲＮＡをＢｉｏＳｐｅｃ－ｎａｎｏ（島津製作所社）を用いて濃度測定し、４０ｎｇ分取した。分取したＲＮＡに対し、ＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ（登録商標）ｑＰＣＲ ＲＴ Ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ（東洋紡社）を２μＬとＲＮａｓｅ Ｆｒｅｅ ｄＨ２Ｏを添加して１０μＬに調製し、ＳｉｍｐｌｉＡｍｐ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用いてｃＤＮＡ合成を行った。ｃＤＮＡ合成の反応条件は、３７℃で１５分反応後、５０℃で５分反応、９８℃で５分反応を連続して行い、その後４℃に冷却した。合成したｃＤＮＡ溶液を１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０（ナカライテスク社）で１００倍に希釈し、３８４ｗｅｌｌ ＰＣＲプレート（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）に５μＬ／ｗｅｌｌで添加した。ＫＯＤ ＳＹＢＲ（登録商標）ｑＰＣＲ Ｍｉｘ（東洋紡社）、５０μＭに調製したＦｏｒｗａｒｄプライマー、５０μＭに調製したＲｅｖｅｒｓｅプライマー、ＤＥＰＣ処理水（ナカライテスク社）を１００：１：１：４８の割合で混合し、この混合液を１５μＬ／ｗｅｌｌで前記３８４ｗｅｌｌ ＰＣＲプレートに添加して混合した。プライマーはＡＣＴＢ、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ、Ｓｏｘ１７、Ｐａｘ６を用いた。３８４ｗｅｌｌ ＰＣＲプレートを遠心分離してウェル内の気泡を除去し、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ７ Ｆｌｅｘ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用いて定量的リアルタイムＰＣＲ解析を実施した。反応条件を表１に示す。
以下に示す手順で定量的リアルタイムＰＣＲ解析を行った。比較例１から比較例４及び実施例１から実施例８で得られた培養５日目及び培養１０日目の細胞をＡｃｃｕｔａｓｅで３分間から１０分間処理し、ピペッティングによって単細胞まで分散させた。この細胞をＴＲＩｚｏｌＴＭ Ｒｅａｇｅｎｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用いて溶解させた。ＰｕｒｅＬｉｎｋ（登録商標）ＲＮＡ Ｍｉｎｉキット（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用いて、ＴＲＩｚｏｌＴＭ Ｒｅａｇｅｎｔで溶解させた細胞溶液からｔｏｔａｌ ＲＮＡを単離及び精製した。精製したＲＮＡをＢｉｏＳｐｅｃ－ｎａｎｏ（島津製作所社）を用いて濃度測定し、４０ｎｇ分取した。分取したＲＮＡに対し、ＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ（登録商標）ｑＰＣＲ ＲＴ Ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ（東洋紡社）を２μＬとＲＮａｓｅ Ｆｒｅｅ ｄＨ２Ｏを添加して１０μＬに調製し、ＳｉｍｐｌｉＡｍｐ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用いてｃＤＮＡ合成を行った。ｃＤＮＡ合成の反応条件は、３７℃で１５分反応後、５０℃で５分反応、９８℃で５分反応を連続して行い、その後４℃に冷却した。合成したｃＤＮＡ溶液を１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０（ナカライテスク社）で１００倍に希釈し、３８４ｗｅｌｌ ＰＣＲプレート（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）に５μＬ／ｗｅｌｌで添加した。ＫＯＤ ＳＹＢＲ（登録商標）ｑＰＣＲ Ｍｉｘ（東洋紡社）、５０μＭに調製したＦｏｒｗａｒｄプライマー、５０μＭに調製したＲｅｖｅｒｓｅプライマー、ＤＥＰＣ処理水（ナカライテスク社）を１００：１：１：４８の割合で混合し、この混合液を１５μＬ／ｗｅｌｌで前記３８４ｗｅｌｌ ＰＣＲプレートに添加して混合した。プライマーはＡＣＴＢ、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ、Ｓｏｘ１７、Ｐａｘ６を用いた。３８４ｗｅｌｌ ＰＣＲプレートを遠心分離してウェル内の気泡を除去し、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ７ Ｆｌｅｘ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用いて定量的リアルタイムＰＣＲ解析を実施した。反応条件を表１に示す。
【0137】
【表1】
【0138】
検出はＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎによるインターカレーション法で行い、遺伝子発現量比較は比較Ｃｔ法で行った。各遺伝子の発現量はハウスキーピング遺伝子であるｂＡＣＴにより標準化した。
【0139】
比較例１から比較例４及び実施例１から実施例８で得られた培養５日目の細胞について、前記記載の手順で定量的リアルタイムＰＣＲ解析を実施し、ＬＥＦ１遺伝子の発現量を測定した。定量的リアルタイムＰＣＲ解析に使用したプライマーの塩基配列は以下の通りである(配列表の配列番号１～１６にも記載する)。
【0140】
ＡＣＴＢ（Ｆ）：５’－ＣＣＴＣＡＴＧＡＡＧＡＴＣＣＴＣＡＣＣＧＡ－３’（配列番号１）
ＡＣＴＢ（Ｒ）：５’－ＴＴＧＣＣＡＡＴＧＧＴＧＡＴＧＡＣＣＴＧＧ－３’（配列番号２）
Ｏｃｔ４（Ｆ）：５’－ＡＧＴＧＧＧＴＧＧＡＧＧＡＡＧＣＴＧＡＣＡＡＣ－３’（配列番号３）
Ｏｃｔ４（Ｒ）：５’－ＴＣＧＴＴＧＴＧＣＡＴＡＧＴＣＧＣＴＧＣＴＴＧＡ－３’（配列番号４）
Ｓｏｘ２（Ｆ）：５’－ＣＡＣＣＡＡＴＣＣＣＡＴＣＣＡＣＡＣＴＣＡＣ－３’（配列番号５）
Ｓｏｘ２（Ｒ）：５’－ＧＣＡＡＡＧＣＴＣＣＴＡＣＣＧＴＡＣＣＡＣ－３’（配列番号６）
Ｎａｎｏｇ（Ｆ）：５’－ＡＧＣＣＴＣＣＡＧＣＡＧＡＴＧＣＡＡＧＡＡＣＴＣ－３’（配列番号７）
Ｎａｎｏｇ（Ｒ）：５’－ＴＴＧＣＴＣＣＡＣＡＴＴＧＧＡＡＧＧＴＴＣＣＣＡ－３’（配列番号８）
Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ（Ｆ）：５’－ＴＣＡＣＡＡＡＧＡＧＡＴＧＡＴＧＧＡＧＧＡＡＣ－３’（配列番号９）
Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ（Ｒ）：５’－ＡＣＡＴＧＣＡＧＧＴＧＡＧＴＴＧＴＣＡＧ－３’（配列番号１０）
Ｓｏｘ１７（Ｆ）：５’－ＡＴＣＴＧＣＡＣＴＴＣＧＴＧＴＧＣＡＡＧ－３’（配列番号１１）
Ｓｏｘ１７（Ｒ）：５’－ＧＡＧＴＣＴＧＡＧＧＡＴＴＴＣＣＴＴＡＧＣＴＣ－３’（配列番号１２）
Ｐａｘ６（Ｆ）：５’－ＡＧＧＡＡＴＧＧＡＣＴＴＧＡＡＡＣＡＡＧＧ－３’（配列番号１３）
Ｐａｘ６（Ｒ）：５’－ＧＣＡＡＡＧＣＴＴＧＴＴＧＡＴＣＡＴＧＧ－３’（配列番号１４）
ＬＥＦ１（Ｆ）：５’－ＡＧＡＡＡＧＴＧＣＡＧＣＴＡＴＣＡＡＣＣ－３’（配列番号１５）
ＬＥＦ１（Ｒ）：５’－ＧＡＡＴＧＡＧＣＴＴＣＧＴＴＴＴＣＣＡＣ－３’（配列番号１６）
ＡＣＴＢ（Ｒ）：５’－ＴＴＧＣＣＡＡＴＧＧＴＧＡＴＧＡＣＣＴＧＧ－３’（配列番号２）
Ｏｃｔ４（Ｆ）：５’－ＡＧＴＧＧＧＴＧＧＡＧＧＡＡＧＣＴＧＡＣＡＡＣ－３’（配列番号３）
Ｏｃｔ４（Ｒ）：５’－ＴＣＧＴＴＧＴＧＣＡＴＡＧＴＣＧＣＴＧＣＴＴＧＡ－３’（配列番号４）
Ｓｏｘ２（Ｆ）：５’－ＣＡＣＣＡＡＴＣＣＣＡＴＣＣＡＣＡＣＴＣＡＣ－３’（配列番号５）
Ｓｏｘ２（Ｒ）：５’－ＧＣＡＡＡＧＣＴＣＣＴＡＣＣＧＴＡＣＣＡＣ－３’（配列番号６）
Ｎａｎｏｇ（Ｆ）：５’－ＡＧＣＣＴＣＣＡＧＣＡＧＡＴＧＣＡＡＧＡＡＣＴＣ－３’（配列番号７）
Ｎａｎｏｇ（Ｒ）：５’－ＴＴＧＣＴＣＣＡＣＡＴＴＧＧＡＡＧＧＴＴＣＣＣＡ－３’（配列番号８）
Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ（Ｆ）：５’－ＴＣＡＣＡＡＡＧＡＧＡＴＧＡＴＧＧＡＧＧＡＡＣ－３’（配列番号９）
Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ（Ｒ）：５’－ＡＣＡＴＧＣＡＧＧＴＧＡＧＴＴＧＴＣＡＧ－３’（配列番号１０）
Ｓｏｘ１７（Ｆ）：５’－ＡＴＣＴＧＣＡＣＴＴＣＧＴＧＴＧＣＡＡＧ－３’（配列番号１１）
Ｓｏｘ１７（Ｒ）：５’－ＧＡＧＴＣＴＧＡＧＧＡＴＴＴＣＣＴＴＡＧＣＴＣ－３’（配列番号１２）
Ｐａｘ６（Ｆ）：５’－ＡＧＧＡＡＴＧＧＡＣＴＴＧＡＡＡＣＡＡＧＧ－３’（配列番号１３）
Ｐａｘ６（Ｒ）：５’－ＧＣＡＡＡＧＣＴＴＧＴＴＧＡＴＣＡＴＧＧ－３’（配列番号１４）
ＬＥＦ１（Ｆ）：５’－ＡＧＡＡＡＧＴＧＣＡＧＣＴＡＴＣＡＡＣＣ－３’（配列番号１５）
ＬＥＦ１（Ｒ）：５’－ＧＡＡＴＧＡＧＣＴＴＣＧＴＴＴＴＣＣＡＣ－３’（配列番号１６）
【0141】
【0142】
【表2】
【0143】
【表3】
【0144】
比較例１から比較例４と実施例１から実施例８では分化マーカー遺伝子及びＬＥＦ１遺伝子の発現量に異なる傾向が認められた。
具体的には、培養５日目におけるβ－Ａｃｔｉｎ遺伝子の発現量に対するＬＥＦ１遺伝子の相対発現量は、比較例１から比較例４で得られた多能性幹細胞集団では、５．５×１０－４以上であるのに対し、実施例１から実施例８で得られた多能性幹細胞集団では、５．５×１０－４以下であった（表２及び表３）。
具体的には、培養５日目におけるβ－Ａｃｔｉｎ遺伝子の発現量に対するＬＥＦ１遺伝子の相対発現量は、比較例１から比較例４で得られた多能性幹細胞集団では、５．５×１０－４以上であるのに対し、実施例１から実施例８で得られた多能性幹細胞集団では、５．５×１０－４以下であった（表２及び表３）。
【0145】
また、β－Ａｃｔｉｎ遺伝子の発現量に対する分化マーカー遺伝子の相対発現量は、培養５日目では比較例１から比較例４及び実施例１から実施例８の全てにおいて低く、条件間で大きな違いは認められなかった（表２、図２Ｂ）。しかし、β－Ａｃｔｉｎ遺伝子の発現量に対する分化マーカー遺伝子の相対発現量は、培養１０日目においては、比較例１から比較例４では培養５日目と比較して顕著に増加したのに対し、実施例１から実施例８では、培養５日目と同程度に低く、ほとんど発現していなかった（表３、図３Ｂ）。
【0146】
このことから、β－Ａｃｔｉｎ遺伝子の発現量に対するＬＥＦ１遺伝子の相対発現量が５．５×１０－４以上の細胞集団は、未分化逸脱細胞の出現頻度が高く、未分化状態を維持しておらず、一方、β－Ａｃｔｉｎ遺伝子の発現量に対するＬＥＦ１遺伝子の相対発現量が５．５×１０－４以下の細胞集団は、未分化逸脱細胞の出現頻度が低く、未分化状態を維持した細胞集団であることが明らかになった。
つまり、上記ＬＥＦ１遺伝子の相対発現量が５．５×１０－４以下であるという条件は、多能性幹細胞集団の未分化性を判断する指標とすることができる。
つまり、上記ＬＥＦ１遺伝子の相対発現量が５．５×１０－４以下であるという条件は、多能性幹細胞集団の未分化性を判断する指標とすることができる。
【0147】
＜実施例１１：フローサイトメトリー解析＞
比較例１から比較例４及び実施例１から実施例８で得られた培養５日目のヒトｉＰＳ細胞をＡｃｃｕｔａｓｅで３分間から１０分間処理し、ピペッティングによって単細胞まで分散させた。この細胞をＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）で洗浄した。その後、４％ＰＦＡ（パラホルムアルデヒド）により室温で２０分間固定後、ＰＢＳで３回洗浄し、冷メタノールにより－２０℃で一晩透過処理を行った。ＰＢＳで３回洗浄後、３％ＦＢＳ（ウシ胎仔血清）／ＰＢＳにより室温で１時間ブロッキングした。その後、細胞のサンプルを２つに分けてそれぞれ５０μＬずつに再懸濁した。一方に蛍光標識済抗ＬＥＦ１抗体（Ｃａｔ．Ｎｏ．８４９０、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）を５μＬ加えて混合し、もう一方に蛍光標識済アイソタイプコントロール抗体（Ｃａｔ．Ｎｏ．２９７５、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）を５μＬ加えて混合した。４℃、遮光状態で１時間染色した。３％ＦＢＳ（ウシ胎仔血清）／ＰＢＳで１回洗浄後、セルストレーナーに通過させた細胞をＧｕａｖａ ｅａｓｙＣｙｔｅ ８ＨＴ（メルク社）にて解析した。ゲインコントロール画面において、ＧＲＮ－Ｂについて高感度モードのチェックマークを外し、ゲインの値を１．６８に設定して測定を開始した。測定後にすべてのサンプルについてＦＳＣ／ＳＳＣのドットプロットを表示し、ＦＳＣの値が５０００以上４００００以下であり、ＳＳＣの値が１０００以上４００００以下の領域を選択し、この領域内の細胞集団を抽出した。次にアイソタイプコントロール抗体で処理したサンプルについて、前記ＦＳＣ／ＳＳＣドットプロットにて抽出した細胞集団において、よりＧＲＮ－Ｂ蛍光強度が強い細胞集団が１．５％以下となるすべての領域を選択した。抗ＬＥＦ１抗体で処理したサンプルについて、前記ＦＳＣ／ＳＳＣドットプロットにて抽出した細胞集団において、前記ＧＲＮ－Ｂ領域内に含まれる細胞の割合を算出し、これをＬＥＦ１が陽性を呈する細胞の比率とした。その結果を表４及び図４に示す。
比較例１から比較例４及び実施例１から実施例８で得られた培養５日目のヒトｉＰＳ細胞をＡｃｃｕｔａｓｅで３分間から１０分間処理し、ピペッティングによって単細胞まで分散させた。この細胞をＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）で洗浄した。その後、４％ＰＦＡ（パラホルムアルデヒド）により室温で２０分間固定後、ＰＢＳで３回洗浄し、冷メタノールにより－２０℃で一晩透過処理を行った。ＰＢＳで３回洗浄後、３％ＦＢＳ（ウシ胎仔血清）／ＰＢＳにより室温で１時間ブロッキングした。その後、細胞のサンプルを２つに分けてそれぞれ５０μＬずつに再懸濁した。一方に蛍光標識済抗ＬＥＦ１抗体（Ｃａｔ．Ｎｏ．８４９０、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）を５μＬ加えて混合し、もう一方に蛍光標識済アイソタイプコントロール抗体（Ｃａｔ．Ｎｏ．２９７５、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）を５μＬ加えて混合した。４℃、遮光状態で１時間染色した。３％ＦＢＳ（ウシ胎仔血清）／ＰＢＳで１回洗浄後、セルストレーナーに通過させた細胞をＧｕａｖａ ｅａｓｙＣｙｔｅ ８ＨＴ（メルク社）にて解析した。ゲインコントロール画面において、ＧＲＮ－Ｂについて高感度モードのチェックマークを外し、ゲインの値を１．６８に設定して測定を開始した。測定後にすべてのサンプルについてＦＳＣ／ＳＳＣのドットプロットを表示し、ＦＳＣの値が５０００以上４００００以下であり、ＳＳＣの値が１０００以上４００００以下の領域を選択し、この領域内の細胞集団を抽出した。次にアイソタイプコントロール抗体で処理したサンプルについて、前記ＦＳＣ／ＳＳＣドットプロットにて抽出した細胞集団において、よりＧＲＮ－Ｂ蛍光強度が強い細胞集団が１．５％以下となるすべての領域を選択した。抗ＬＥＦ１抗体で処理したサンプルについて、前記ＦＳＣ／ＳＳＣドットプロットにて抽出した細胞集団において、前記ＧＲＮ－Ｂ領域内に含まれる細胞の割合を算出し、これをＬＥＦ１が陽性を呈する細胞の比率とした。その結果を表４及び図４に示す。
【0148】
【表4】
【0149】
比較例１から比較例４と、実施例１から実施例８とでは、ＬＥＦ１が陽性を呈する細胞の比率に異なる傾向が認められた。具体的には、比較例１から比較例４で得られた培養５日目の多能性幹細胞集団では、ＬＥＦ１が陽性を呈する細胞の比率が５５％以上であったのに対し、実施例１から実施例８で得られた培養５日目の多能性幹細胞集団ではいずれも、ＬＥＦ１が陽性を呈する細胞の比率が５５％以下であった。
【0150】
実施例１０で分析した分化マーカー遺伝子の発現結果（図２Ｂ及び図３Ｂ）と照らすと、ＬＥＦ１が陽性を呈する細胞の比率が５５％以下である多能性幹細胞集団は、未分化逸脱細胞の出現頻度が低く、未分化状態を維持した細胞集団であることが分かった。つまり、ＬＥＦ１が陽性を呈する細胞の比率が５５％以下という条件は、多能性幹細胞を含む細胞集団の未分化性を判断する指標となる。
【0151】
以上の結果から、下記（ａ）及び（ｂ）の特性を有する多能性幹細胞を含む細胞集団は、未分化状態を維持した細胞集団であり、下記（ａ）及び（ｂ）の特性は多能性幹細胞を含む細胞集団の未分化性を判断する指標となることが示された。
（ａ）β－Ａｃｔｉｎ遺伝子の発現量に対するＬＥＦ１遺伝子の相対発現量が、５．５×１０－４以下である。
（ｂ）ＬＥＦ１が陽性を呈する多能性幹細胞の比率が５５％以下である。
（ａ）β－Ａｃｔｉｎ遺伝子の発現量に対するＬＥＦ１遺伝子の相対発現量が、５．５×１０－４以下である。
（ｂ）ＬＥＦ１が陽性を呈する多能性幹細胞の比率が５５％以下である。
【0152】
また、実施例１０で分析した遺伝子発現結果（図２Ａ～２Ｃ及び図３Ａ～３Ｂ）と実施例１０及び１１における遺伝子発現量及びフローサイトメトリーの結果から、上述した（ａ）及び（ｂ）を指標として、多能性幹細胞を含む細胞集団において未分化逸脱細胞の出現を予測する、又は細胞集団における多能性幹細胞の分化能（未分化性）をモニタリングできることが分かった。具体的には、培養５日目では、上記指標を満たす細胞集団、及び上記指標を満たさない細胞集団のいずれにおいても未分化逸脱細胞の出現はほとんど認められなかった。しかし、その後培養を継続していくと、上記指標を満たさない細胞集団においてのみ、顕著に未分化逸脱細胞の出現が増加した。つまり上記指標を満たさない細胞集団については、上記指標を測定した時点においては未分化逸脱細胞の出現が認められていないとしても、培養を継続すれば未分化逸脱細胞の出現頻度が増加してくることを示している。
【0153】
そのため、本発明においては、（ａ）β－Ａｃｔｉｎ遺伝子の発現量に対するＬＥＦ１遺伝子の相対発現量が、５．５×１０－４以下であり、（ｂ）ＬＥＦ１が陽性を呈する多能性幹細胞の比率が５５％以下であることを、未分化逸脱細胞の出現を予測するための指標として用いることができる。
【0154】
また、上記（ａ）及び（ｂ）は、多能性幹細胞を含む細胞集団が未分化性を維持するための最適な培養条件を判断及び／又は予測するための指標としても用いることができる。
さらに、上記（ａ）及び（ｂ）を指標として、経時的に多能性幹細胞を含む細胞集団の遺伝子発現とタンパク質発現の陽性率を測定することによって、細胞集団における多能性幹細胞の分化能をモニタリングすることができる。前記指標の測定結果から、分化能が低いと判断した場合には、上記（ａ）及び（ｂ）を指標としてセルソーター等で細胞を選択する方法、又は培養条件を適切に変更して多能性幹細胞の未分化維持を促す方法により、分化能が高い多能性幹細胞集団を調製することができる。
さらに、上記（ａ）及び（ｂ）を指標として、経時的に多能性幹細胞を含む細胞集団の遺伝子発現とタンパク質発現の陽性率を測定することによって、細胞集団における多能性幹細胞の分化能をモニタリングすることができる。前記指標の測定結果から、分化能が低いと判断した場合には、上記（ａ）及び（ｂ）を指標としてセルソーター等で細胞を選択する方法、又は培養条件を適切に変更して多能性幹細胞の未分化維持を促す方法により、分化能が高い多能性幹細胞集団を調製することができる。
【0155】
＜比較例５：三胚葉系細胞への分化誘導＞
以下の手順で多能性幹細胞の分化誘導を行った。下記工程における培養日数は全て、全て工程１における浮遊培養の開始日を０日目としてカウントしている。
以下の手順で多能性幹細胞の分化誘導を行った。下記工程における培養日数は全て、全て工程１における浮遊培養の開始日を０日目としてカウントしている。
【0156】
（工程１：多能性幹細胞集団の調製）
比較例４と同じ方法で浮遊培養を行い、培養１０日目にウェルから細胞凝集塊と培養上清を遠沈管に回収した。遠沈管を５分程度静置して細胞凝集塊を沈降させた後、培養上清を除去した。細胞凝集塊にＡｃｃｕｔａｓｅを１ｍＬ添加して１０分間処理し、ピペッティングによって単細胞まで分散させた。この細胞を最終濃度１０μＭのＹ－２７６３２を含むＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ培地で懸濁し、その一部をトリパンブルー染色して生細胞数を測定した。最終濃度１０μＭのＹ－２７６３２を含むＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ培地を用いて、１ｍＬあたり２×１０５個の細胞を含むように細胞懸濁液を調製した。浮遊培養用６ウェルプレートに１ウェルあたり４ｍＬの細胞懸濁液を播種した。細胞を播種したプレートはロータリーシェーカー上で８３ｒｐｍの速度で水平面に沿って旋回幅（直径）が２５ｍｍの円を描くように旋回させ、３７℃、５％ＣＯ２環境下で培養１２日目まで浮遊培養を継続した。培養１１日目に、Ｙ－２７６３２を最終濃度５μＭで含むＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ培地で培地交換を行った。培地交換は、細胞凝集塊を含む培地の全量を遠沈管に回収し、５分程度静置して細胞凝集塊を沈降させ、その後、培養上清を除去し、新鮮培地で穏やかに再懸濁して元のウェルに戻すことにより行った。
工程１で得られた多能性幹細胞集団は、比較例４と同等のＬＥＦ１発現を示すと考えられる。つまり、前記（ａ）及び（ｂ）の指標を満たさない多能性幹細胞集団である。
比較例４と同じ方法で浮遊培養を行い、培養１０日目にウェルから細胞凝集塊と培養上清を遠沈管に回収した。遠沈管を５分程度静置して細胞凝集塊を沈降させた後、培養上清を除去した。細胞凝集塊にＡｃｃｕｔａｓｅを１ｍＬ添加して１０分間処理し、ピペッティングによって単細胞まで分散させた。この細胞を最終濃度１０μＭのＹ－２７６３２を含むＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ培地で懸濁し、その一部をトリパンブルー染色して生細胞数を測定した。最終濃度１０μＭのＹ－２７６３２を含むＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ培地を用いて、１ｍＬあたり２×１０５個の細胞を含むように細胞懸濁液を調製した。浮遊培養用６ウェルプレートに１ウェルあたり４ｍＬの細胞懸濁液を播種した。細胞を播種したプレートはロータリーシェーカー上で８３ｒｐｍの速度で水平面に沿って旋回幅（直径）が２５ｍｍの円を描くように旋回させ、３７℃、５％ＣＯ２環境下で培養１２日目まで浮遊培養を継続した。培養１１日目に、Ｙ－２７６３２を最終濃度５μＭで含むＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ培地で培地交換を行った。培地交換は、細胞凝集塊を含む培地の全量を遠沈管に回収し、５分程度静置して細胞凝集塊を沈降させ、その後、培養上清を除去し、新鮮培地で穏やかに再懸濁して元のウェルに戻すことにより行った。
工程１で得られた多能性幹細胞集団は、比較例４と同等のＬＥＦ１発現を示すと考えられる。つまり、前記（ａ）及び（ｂ）の指標を満たさない多能性幹細胞集団である。
【0157】
（工程２－Ａ：内胚葉分化誘導）
前記工程１の後、内胚葉分化誘導を行った。培養１２日目及び１３日目に表５の内胚葉分化誘導培地１で培地交換を行い、培養１４日目に表５の内胚葉分化誘導培地２で培地交換を行い、培養１５日目に表５の内胚葉分化誘導培地３で培地交換を行った。培地交換は、細胞凝集塊を含む培地の全量を遠沈管に回収し、５分程度静置して細胞凝集塊を沈降させ、その後、培養上清を除去し、新鮮培地で穏やかに再懸濁して元のウェルに戻すことにより行った。その後、培養１６日目まで浮遊培養を継続し、内胚葉分化誘導した細胞サンプルとした。
前記工程１の後、内胚葉分化誘導を行った。培養１２日目及び１３日目に表５の内胚葉分化誘導培地１で培地交換を行い、培養１４日目に表５の内胚葉分化誘導培地２で培地交換を行い、培養１５日目に表５の内胚葉分化誘導培地３で培地交換を行った。培地交換は、細胞凝集塊を含む培地の全量を遠沈管に回収し、５分程度静置して細胞凝集塊を沈降させ、その後、培養上清を除去し、新鮮培地で穏やかに再懸濁して元のウェルに戻すことにより行った。その後、培養１６日目まで浮遊培養を継続し、内胚葉分化誘導した細胞サンプルとした。
【0158】
【表5】
【0159】
（工程２－Ｂ：中胚葉分化誘導）
前記工程１の後、中胚葉分化誘導を行った。培養１２日目に表６の中胚葉分化誘導培地１で培地交換を行い、培養１３日目に表６の中胚葉分化誘導培地２で培地交換を行った。培地交換は、細胞凝集塊を含む培地の全量を遠沈管に回収し、５分程度静置して細胞凝集塊を沈降させ、その後、培養上清を除去し、新鮮培地で穏やかに再懸濁して元のウェルに戻すことにより行った。その後、培養１５日目まで浮遊培養を継続し、中胚葉分化誘導した細胞サンプルとした。
前記工程１の後、中胚葉分化誘導を行った。培養１２日目に表６の中胚葉分化誘導培地１で培地交換を行い、培養１３日目に表６の中胚葉分化誘導培地２で培地交換を行った。培地交換は、細胞凝集塊を含む培地の全量を遠沈管に回収し、５分程度静置して細胞凝集塊を沈降させ、その後、培養上清を除去し、新鮮培地で穏やかに再懸濁して元のウェルに戻すことにより行った。その後、培養１５日目まで浮遊培養を継続し、中胚葉分化誘導した細胞サンプルとした。
【0160】
【表6】
【0161】
（工程２－Ｃ：外胚葉分化誘導）
前記工程１の後、外胚葉分化誘導を行った。培養１２日目から１６日目まで毎日、表７の外胚葉分化誘導培地で培地交換を行った。培地交換は、細胞凝集塊を含む培地の全量を遠沈管に回収し、５分程度静置して細胞凝集塊を沈降させ、その後、培養上清を除去し、新鮮培地で穏やかに再懸濁して元のウェルに戻すことにより行った。その後、培養１７日目まで浮遊培養を継続し、外胚葉分化誘導した細胞サンプルとした。
前記工程１の後、外胚葉分化誘導を行った。培養１２日目から１６日目まで毎日、表７の外胚葉分化誘導培地で培地交換を行った。培地交換は、細胞凝集塊を含む培地の全量を遠沈管に回収し、５分程度静置して細胞凝集塊を沈降させ、その後、培養上清を除去し、新鮮培地で穏やかに再懸濁して元のウェルに戻すことにより行った。その後、培養１７日目まで浮遊培養を継続し、外胚葉分化誘導した細胞サンプルとした。
【0162】
【表7】
【0163】
＜実施例１２：三胚葉系細胞への分化誘導＞
以下の手順で多能性幹細胞の分化誘導を行った。
以下の手順で多能性幹細胞の分化誘導を行った。
【0164】
（工程１：多能性幹細胞集団の調製）
培養１０日目まで実施例８と同じ方法で浮遊培養を行った点と、培養１０日目の播種培地と培養１１日目の培地交換培地にＸＡＶ９３９を最終濃度２０μＭとなるように添加した点を除いて、比較例５の工程１と同じ方法で多能性幹細胞集団を調製した。
工程１で得られた多能性幹細胞集団は、実施例８と同等のＬＥＦ１発現を示すと考えられる。つまり、（ａ）β－Ａｃｔｉｎ遺伝子の発現量に対するＬＥＦ１遺伝子の相対発現量が、５．５×１０－４以下であり、（ｂ）ＬＥＦ１が陽性を呈する多能性幹細胞の比率が５５％以下である、多能性幹細胞集団である。
培養１０日目まで実施例８と同じ方法で浮遊培養を行った点と、培養１０日目の播種培地と培養１１日目の培地交換培地にＸＡＶ９３９を最終濃度２０μＭとなるように添加した点を除いて、比較例５の工程１と同じ方法で多能性幹細胞集団を調製した。
工程１で得られた多能性幹細胞集団は、実施例８と同等のＬＥＦ１発現を示すと考えられる。つまり、（ａ）β－Ａｃｔｉｎ遺伝子の発現量に対するＬＥＦ１遺伝子の相対発現量が、５．５×１０－４以下であり、（ｂ）ＬＥＦ１が陽性を呈する多能性幹細胞の比率が５５％以下である、多能性幹細胞集団である。
【0165】
（工程２－Ａ：内胚葉分化誘導）
前記工程１の後、比較例４の工程２―Ａと同じ手順で内胚葉分化誘導を行った。
前記工程１の後、比較例４の工程２―Ａと同じ手順で内胚葉分化誘導を行った。
【0166】
（工程２－Ｂ：中胚葉分化誘導）
前記工程１の後、比較例４の工程２―Ｂと同じ手順で中胚葉分化誘導を行った。
前記工程１の後、比較例４の工程２―Ｂと同じ手順で中胚葉分化誘導を行った。
【0167】
（工程２－Ｃ：外胚葉分化誘導）
前記工程１の後、比較例４の工程２―Ｃと同じ手順で外胚葉分化誘導を行った。
前記工程１の後、比較例４の工程２―Ｃと同じ手順で外胚葉分化誘導を行った。
【0168】
＜実施例１３：定量的リアルタイムＰＣＲ解析による分化誘導効率の比較＞
比較例５及び実施例１２にて三胚葉系細胞へ分化誘導した細胞集団を、実施例１０と同じ手順で定量的リアルタイムＰＣＲ解析した。
比較例５及び実施例１２にて三胚葉系細胞へ分化誘導した細胞集団を、実施例１０と同じ手順で定量的リアルタイムＰＣＲ解析した。
【0169】
内胚葉分化誘導したサンプルの定量的リアルタイムＰＣＲ解析に使用したプライマーの塩基配列を以下に示す。
ＡＣＴＢ（Ｆ）：５’－ＣＣＴＣＡＴＧＡＡＧＡＴＣＣＴＣＡＣＣＧＡ－３’（配列番号１）
ＡＣＴＢ（Ｒ）：５’－ＴＴＧＣＣＡＡＴＧＧＴＧＡＴＧＡＣＣＴＧＧ－３’（配列番号２）
ＳＯＸ１７（Ｆ）：５’－ＡＴＣＴＧＣＡＣＴＴＣＧＴＧＴＧＣＡＡＧ－３’（配列番号１１）
ＳＯＸ１７（Ｒ）：５’－ＧＡＧＴＣＴＧＡＧＧＡＴＴＴＣＣＴＴＡＧＣＴＣ－３’（配列番号１２）
ＦＯＸＡ２（Ｆ）：５’－ＧＧＴＧＡＴＴＧＣＴＧＧＴＣＧＴＴＴＧＴＴＧＴＧ－３’（配列番号１７）
ＦＯＸＡ２（Ｒ）：５’－ＧＣＣＧＡＣＡＴＧＣＴＣＡＴＧＴＡＣＧＴＧＴＴ－３’（配列番号１８）
ＣＸＣＲ４（Ｆ）：５’－ＡＣＴＧＡＧＡＡＧＣＡＴＧＡＣＧＧＡＣＡＡＧ－３’（配列番号１９）
ＣＸＣＲ４（Ｒ）：５’－ＡＧＧＴＡＧＣＧＧＴＣＣＡＧＡＣＴＧＡＴＧ－３’（配列番号２０）
ＡＣＴＢ（Ｆ）：５’－ＣＣＴＣＡＴＧＡＡＧＡＴＣＣＴＣＡＣＣＧＡ－３’（配列番号１）
ＡＣＴＢ（Ｒ）：５’－ＴＴＧＣＣＡＡＴＧＧＴＧＡＴＧＡＣＣＴＧＧ－３’（配列番号２）
ＳＯＸ１７（Ｆ）：５’－ＡＴＣＴＧＣＡＣＴＴＣＧＴＧＴＧＣＡＡＧ－３’（配列番号１１）
ＳＯＸ１７（Ｒ）：５’－ＧＡＧＴＣＴＧＡＧＧＡＴＴＴＣＣＴＴＡＧＣＴＣ－３’（配列番号１２）
ＦＯＸＡ２（Ｆ）：５’－ＧＧＴＧＡＴＴＧＣＴＧＧＴＣＧＴＴＴＧＴＴＧＴＧ－３’（配列番号１７）
ＦＯＸＡ２（Ｒ）：５’－ＧＣＣＧＡＣＡＴＧＣＴＣＡＴＧＴＡＣＧＴＧＴＴ－３’（配列番号１８）
ＣＸＣＲ４（Ｆ）：５’－ＡＣＴＧＡＧＡＡＧＣＡＴＧＡＣＧＧＡＣＡＡＧ－３’（配列番号１９）
ＣＸＣＲ４（Ｒ）：５’－ＡＧＧＴＡＧＣＧＧＴＣＣＡＧＡＣＴＧＡＴＧ－３’（配列番号２０）
【0170】
中胚葉分化誘導したサンプルの定量的リアルタイムＰＣＲ解析に使用したプライマーの塩基配列を以下に示す。
ＡＣＴＢ（Ｆ）：５’－ＣＣＴＣＡＴＧＡＡＧＡＴＣＣＴＣＡＣＣＧＡ－３’（配列番号１）
ＡＣＴＢ（Ｒ）：５’－ＴＴＧＣＣＡＡＴＧＧＴＧＡＴＧＡＣＣＴＧＧ－３’（配列番号２）
ＣＤＸ２（Ｆ）：５’－ＣＡＣＣＣＡＣＡＧＣＣＡＴＡＧＡＣＣＴＡＣ－３’（配列番号２１）
ＣＤＸ２（Ｒ）：５’－ＧＴＣＡＧＴＣＣＡＧＧＣＡＡＴＧＣＴＴＣ－３’（配列番号２２）
ＣＸＣＲ４（Ｆ）：５’－ＡＣＴＧＡＧＡＡＧＣＡＴＧＡＣＧＧＡＣＡＡＧ－３’（配列番号１９）
ＣＸＣＲ４（Ｒ）：５’－ＡＧＧＴＡＧＣＧＧＴＣＣＡＧＡＣＴＧＡＴＧ－３’（配列番号２０）
ＶＥＧＦＲ２（Ｆ）：５’－ＡＧＣＣＡＡＧＣＴＧＴＣＴＣＡＧＴＧＡＣ－３’（配列番号２３）
ＶＥＧＦＲ２（Ｒ）：５’－ＴＣＴＣＣＣＧＡＣＴＴＴＧＴＴＧＡＣＣＧ－３’（配列番号２４）
ＰＤＧＦＲα（Ｆ）：５’－ＧＣＴＧＡＧＣＣＴＡＡＴＣＣＴＣＴＧＣＣ－３’（配列番号２５）
ＰＤＧＦＲα（Ｒ）：５’－ＡＣＴＧＣＴＣＡＣＴＴＣＣＡＡＧＡＣＣＧ－３’（配列番号２６）
ＡＣＴＢ（Ｆ）：５’－ＣＣＴＣＡＴＧＡＡＧＡＴＣＣＴＣＡＣＣＧＡ－３’（配列番号１）
ＡＣＴＢ（Ｒ）：５’－ＴＴＧＣＣＡＡＴＧＧＴＧＡＴＧＡＣＣＴＧＧ－３’（配列番号２）
ＣＤＸ２（Ｆ）：５’－ＣＡＣＣＣＡＣＡＧＣＣＡＴＡＧＡＣＣＴＡＣ－３’（配列番号２１）
ＣＤＸ２（Ｒ）：５’－ＧＴＣＡＧＴＣＣＡＧＧＣＡＡＴＧＣＴＴＣ－３’（配列番号２２）
ＣＸＣＲ４（Ｆ）：５’－ＡＣＴＧＡＧＡＡＧＣＡＴＧＡＣＧＧＡＣＡＡＧ－３’（配列番号１９）
ＣＸＣＲ４（Ｒ）：５’－ＡＧＧＴＡＧＣＧＧＴＣＣＡＧＡＣＴＧＡＴＧ－３’（配列番号２０）
ＶＥＧＦＲ２（Ｆ）：５’－ＡＧＣＣＡＡＧＣＴＧＴＣＴＣＡＧＴＧＡＣ－３’（配列番号２３）
ＶＥＧＦＲ２（Ｒ）：５’－ＴＣＴＣＣＣＧＡＣＴＴＴＧＴＴＧＡＣＣＧ－３’（配列番号２４）
ＰＤＧＦＲα（Ｆ）：５’－ＧＣＴＧＡＧＣＣＴＡＡＴＣＣＴＣＴＧＣＣ－３’（配列番号２５）
ＰＤＧＦＲα（Ｒ）：５’－ＡＣＴＧＣＴＣＡＣＴＴＣＣＡＡＧＡＣＣＧ－３’（配列番号２６）
【0171】
外胚葉分化誘導したサンプルの定量的リアルタイムＰＣＲ解析に使用したプライマーの塩基配列を以下に示す。
ＡＣＴＢ（Ｆ）：５’－ＣＣＴＣＡＴＧＡＡＧＡＴＣＣＴＣＡＣＣＧＡ－３’（配列番号１）
ＡＣＴＢ（Ｒ）：５’－ＴＴＧＣＣＡＡＴＧＧＴＧＡＴＧＡＣＣＴＧＧ－３’（配列番号２）
ＰＡＸ６（Ｆ）：５’－ＡＧＧＡＡＴＧＧＡＣＴＴＧＡＡＡＣＡＡＧＧ－３’（配列番号１３）
ＰＡＸ６（Ｒ）：５’－ＧＣＡＡＡＧＣＴＴＧＴＴＧＡＴＣＡＴＧＧ－３’（配列番号１４）
ＳＯＸ１（Ｆ）：５’－ＡＧＧＣＡＧＧＴＣＣＡＡＧＣＡＣＴＴＡＣ－３’（配列番号２７）
ＳＯＸ１（Ｒ）：５’－ＡＴＡＡＣＴＣＣＧＣＣＧＴＣＴＧＡＡＧＧ－３’（配列番号２８）
ＮＥＳＴＩＮ（Ｆ）：５’－ＴＣＡＡＧＣＡＣＣＡＣＴＧＴＧＧＡＣＴＣ－３’（配列番号２９）
ＮＥＳＴＩＮ（Ｒ）：５’－ＡＧＧＴＴＣＣＡＴＧＣＴＣＣＣＡＧＡＧＡ－３’（配列番号３０）
ＡＣＴＢ（Ｆ）：５’－ＣＣＴＣＡＴＧＡＡＧＡＴＣＣＴＣＡＣＣＧＡ－３’（配列番号１）
ＡＣＴＢ（Ｒ）：５’－ＴＴＧＣＣＡＡＴＧＧＴＧＡＴＧＡＣＣＴＧＧ－３’（配列番号２）
ＰＡＸ６（Ｆ）：５’－ＡＧＧＡＡＴＧＧＡＣＴＴＧＡＡＡＣＡＡＧＧ－３’（配列番号１３）
ＰＡＸ６（Ｒ）：５’－ＧＣＡＡＡＧＣＴＴＧＴＴＧＡＴＣＡＴＧＧ－３’（配列番号１４）
ＳＯＸ１（Ｆ）：５’－ＡＧＧＣＡＧＧＴＣＣＡＡＧＣＡＣＴＴＡＣ－３’（配列番号２７）
ＳＯＸ１（Ｒ）：５’－ＡＴＡＡＣＴＣＣＧＣＣＧＴＣＴＧＡＡＧＧ－３’（配列番号２８）
ＮＥＳＴＩＮ（Ｆ）：５’－ＴＣＡＡＧＣＡＣＣＡＣＴＧＴＧＧＡＣＴＣ－３’（配列番号２９）
ＮＥＳＴＩＮ（Ｒ）：５’－ＡＧＧＴＴＣＣＡＴＧＣＴＣＣＣＡＧＡＧＡ－３’（配列番号３０）
【0172】
遺伝子発現量を測定した結果を表８から表１０及び図５に示す。
【0173】
【表8】
【0174】
【表9】
【0175】
【表10】
【0176】
実施例１２は、比較例５と比べて、内胚葉分化誘導後の内胚葉分化マーカー遺伝子（ＳＯＸ１７、ＦＯＸＡ２、及びＣＸＣＲ４）の発現量が高い傾向を示した。また、中胚葉分化誘導後の中胚葉分化マーカー遺伝子（ＣＤＸ２、ＣＸＣＲ４、ＶＥＧＦＲ２、及びＰＤＧＦＲα）と、外胚葉分化誘導後の外胚葉分化マーカー遺伝子（ＰＡＸ６、ＳＯＸ１、及びＮＥＳＴＩＮ）の発現量も同様に、実施例１２は、比較例５と比べて、高い傾向を示した。
【0177】
これらの結果より、上記（ａ）及び（ｂ）の指標を満たす多能性幹細胞集団を調製することにより、三胚葉系細胞への分化誘導効率が高まるということが明らかになった。
【0178】
＜実施例１３：分化誘導培養＞
比較例１から比較例４及び実施例１から実施例８で得られた培養１０日目の細胞を、非特許文献（Ｓｕｎｄａｒｉ Ｃｈｅｔｔｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ １０（６）：５５３－５５６，Ｊａｎｕａｒｙ ２０１３）に記載されている以下の手順で三胚葉系細胞へ分化誘導することが可能である。
比較例１から比較例４及び実施例１から実施例８で得られた培養１０日目の細胞を、非特許文献（Ｓｕｎｄａｒｉ Ｃｈｅｔｔｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ １０（６）：５５３－５５６，Ｊａｎｕａｒｙ ２０１３）に記載されている以下の手順で三胚葉系細胞へ分化誘導することが可能である。
【0179】
＜工程１：分化誘導細胞の調製＞
比較例１から比較例４及び実施例１から実施例８で得られた培養１０日目の細胞をＡｃｃｕｔａｓｅで３から１０分間処理し、ピペッティングによって単細胞まで分散させる。この細胞を最終濃度１０μＭのＹ－２７６３２及び最終濃度２０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を含むＭＥＦ－ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ培地で懸濁し、その一部をトリパンブルー染色して生細胞数を測定する。細胞懸濁液を最終濃度１０μＭのＹ－２７６３２及び最終濃度２０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦを含むＭＥＦ－ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ培地を用いて１ｍＬあたり５×１０５個の細胞を含むように調製する。Ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｄｕｃｅｄ ｍａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）をコートした細胞培養用６ウェルプレートに１ウェルあたり２ｍＬの細胞懸濁液を播種し、３７℃、５％ＣＯ２環境下で接着培養を行う。細胞を播種した日を培養０日目とし、培養１日目に最終濃度２０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦを含むＭＥＦ－ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ培地で培地交換を行う。
比較例１から比較例４及び実施例１から実施例８で得られた培養１０日目の細胞をＡｃｃｕｔａｓｅで３から１０分間処理し、ピペッティングによって単細胞まで分散させる。この細胞を最終濃度１０μＭのＹ－２７６３２及び最終濃度２０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を含むＭＥＦ－ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ培地で懸濁し、その一部をトリパンブルー染色して生細胞数を測定する。細胞懸濁液を最終濃度１０μＭのＹ－２７６３２及び最終濃度２０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦを含むＭＥＦ－ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ培地を用いて１ｍＬあたり５×１０５個の細胞を含むように調製する。Ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｄｕｃｅｄ ｍａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）をコートした細胞培養用６ウェルプレートに１ウェルあたり２ｍＬの細胞懸濁液を播種し、３７℃、５％ＣＯ２環境下で接着培養を行う。細胞を播種した日を培養０日目とし、培養１日目に最終濃度２０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦを含むＭＥＦ－ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ培地で培地交換を行う。
【0180】
＜工程２－Ａ：外胚葉系細胞への分化誘導＞
実施例１３の工程１で調製した細胞に対し、培養２日目に最終濃度１０％でｋｎｏｃｋｏｕｔ ｓｅｒｕｍ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）、最終濃度５００ｎｇ／ｍＬでＮｏｇｇｉｎ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｙｔｅｍｓ社）、最終濃度１０μＭでＳＢ４３１５４２（Ｔｏｃｒｉｓ社）を含むＫｎｏｃｋＯｕｔ－ＤＭＥＭ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）で培地交換する。培養３日目も同じ培地を用いて培地交換し、培養４日目に外胚葉系細胞集団を得ることができる。
実施例１３の工程１で調製した細胞に対し、培養２日目に最終濃度１０％でｋｎｏｃｋｏｕｔ ｓｅｒｕｍ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）、最終濃度５００ｎｇ／ｍＬでＮｏｇｇｉｎ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｙｔｅｍｓ社）、最終濃度１０μＭでＳＢ４３１５４２（Ｔｏｃｒｉｓ社）を含むＫｎｏｃｋＯｕｔ－ＤＭＥＭ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）で培地交換する。培養３日目も同じ培地を用いて培地交換し、培養４日目に外胚葉系細胞集団を得ることができる。
【0181】
＜工程２－Ｂ：中胚葉系細胞への分化誘導＞
実施例１３の工程１で調製した細胞に対し、培養２日目に最終濃度１００ｎｇ／ｍＬで組み換えヒトＡｃｔｉｖｉｎ Ａ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）を添加したＲＰＭＩ－Ｂ２７（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）培地で培地交換する。培養３、４、５日目に最終濃度１０ｎｇ／ｍＬで組み換えヒトＢＭＰ４（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）を添加したＲＰＭＩ－Ｂ２７（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）培地で培地交換することで、培養６日目に中胚葉系細胞集団を得ることができる。
実施例１３の工程１で調製した細胞に対し、培養２日目に最終濃度１００ｎｇ／ｍＬで組み換えヒトＡｃｔｉｖｉｎ Ａ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）を添加したＲＰＭＩ－Ｂ２７（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）培地で培地交換する。培養３、４、５日目に最終濃度１０ｎｇ／ｍＬで組み換えヒトＢＭＰ４（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）を添加したＲＰＭＩ－Ｂ２７（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）培地で培地交換することで、培養６日目に中胚葉系細胞集団を得ることができる。
【0182】
＜工程２－Ｃ：内胚葉系細胞への分化誘導＞
実施例１３の工程１で調製した細胞に対し、培養２日目に最終濃度２．５ｇ／ＬでＮａＨＣＯ３、最終濃度１％でｇｌｕｔａｍａｘ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）、最終濃度５．５ｍＭでｇｌｕｃｏｓｅ、最終濃度０．１％でＦＡＦ－ＢＳＡ（Ｐｒｏｌｉａｎｔ／Ｌａｍｐｉｒｅ社）、５００００倍希釈になるようにＩＴＳ：Ｘ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）、最終濃度２０ｎｇ／ｍＬでＷＮＴ３Ａ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）、最終濃度１００ｎｇ／ｍＬでＡｃｔｉｖｉｎ Ａを添加したＭＣＤＢ－１３１培地で培地交換する。培養３、４、５日目に前記添加剤のうちＷＮＴ３Ａ以外を添加したＭＣＤＢ－１３１培地で培地交換することで培養６日目に内胚葉系細胞集団を得ることができる。
実施例１３の工程１で調製した細胞に対し、培養２日目に最終濃度２．５ｇ／ＬでＮａＨＣＯ３、最終濃度１％でｇｌｕｔａｍａｘ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）、最終濃度５．５ｍＭでｇｌｕｃｏｓｅ、最終濃度０．１％でＦＡＦ－ＢＳＡ（Ｐｒｏｌｉａｎｔ／Ｌａｍｐｉｒｅ社）、５００００倍希釈になるようにＩＴＳ：Ｘ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）、最終濃度２０ｎｇ／ｍＬでＷＮＴ３Ａ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）、最終濃度１００ｎｇ／ｍＬでＡｃｔｉｖｉｎ Ａを添加したＭＣＤＢ－１３１培地で培地交換する。培養３、４、５日目に前記添加剤のうちＷＮＴ３Ａ以外を添加したＭＣＤＢ－１３１培地で培地交換することで培養６日目に内胚葉系細胞集団を得ることができる。
【0183】
＜工程３：分化誘導効率の測定＞
前記工程２－Ａ、Ｂ、Ｃで得られた細胞集団について、以下の方法で免疫蛍光染色を行い、三胚葉系細胞への分化誘導効率を求めることができる。
前記工程２－Ａ、Ｂ、Ｃで得られた細胞に対し、ＰＢＳで洗浄した後、４％パラホルムアルデヒドで３０分間反応させて細胞を固定化する。細胞をＰＢＳで洗浄し、最終濃度５％でロバ血清、最終濃度０．３％でＴｒｉｔｏｎを含むＰＢＳを添加して、室温で１時間反応させてブロッキングを行う。その後、各サンプルに対して１次抗体を５００倍希釈になるように添加し、１晩反応させる。１次抗体は外胚葉系細胞に対しては抗Ｓｏｘ１抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）、中胚葉系細胞に対しては抗Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）、内胚葉系細胞に対しては抗Ｓｏｘ１７抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）を使用する。１次抗体反応後、細胞をＰＢＳで洗浄し、１次抗体に対応したＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８又はＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４で標識された２次抗体を５００倍希釈になるように添加し、室温で１時間反応させる。反応後、ＰＢＳで洗浄し、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２を１０００倍希釈になるように添加して、核染色を行う。免疫蛍光染色された細胞を、ＣｅｌｌＩｎｓｉｇｈｔ ＣＸ５ Ｈｉｇｈ－Ｃｏｎｔｅｎｔ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ （ＨＣＳ）Ｐｌａｔｆｏｒｍ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用いて、１０倍視野で１ウェルあたり３０枚ずつ画像取得する。取得した画像の標識された核の数から細胞数を算出し、各抗体で標識された細胞の数から各三胚葉系細胞の数を算出する。視野内の細胞数に対する各三胚葉系細胞の数から分化誘導効率を求めることができる。
前記工程２－Ａ、Ｂ、Ｃで得られた細胞集団について、以下の方法で免疫蛍光染色を行い、三胚葉系細胞への分化誘導効率を求めることができる。
前記工程２－Ａ、Ｂ、Ｃで得られた細胞に対し、ＰＢＳで洗浄した後、４％パラホルムアルデヒドで３０分間反応させて細胞を固定化する。細胞をＰＢＳで洗浄し、最終濃度５％でロバ血清、最終濃度０．３％でＴｒｉｔｏｎを含むＰＢＳを添加して、室温で１時間反応させてブロッキングを行う。その後、各サンプルに対して１次抗体を５００倍希釈になるように添加し、１晩反応させる。１次抗体は外胚葉系細胞に対しては抗Ｓｏｘ１抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）、中胚葉系細胞に対しては抗Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）、内胚葉系細胞に対しては抗Ｓｏｘ１７抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）を使用する。１次抗体反応後、細胞をＰＢＳで洗浄し、１次抗体に対応したＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８又はＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４で標識された２次抗体を５００倍希釈になるように添加し、室温で１時間反応させる。反応後、ＰＢＳで洗浄し、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２を１０００倍希釈になるように添加して、核染色を行う。免疫蛍光染色された細胞を、ＣｅｌｌＩｎｓｉｇｈｔ ＣＸ５ Ｈｉｇｈ－Ｃｏｎｔｅｎｔ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ （ＨＣＳ）Ｐｌａｔｆｏｒｍ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用いて、１０倍視野で１ウェルあたり３０枚ずつ画像取得する。取得した画像の標識された核の数から細胞数を算出し、各抗体で標識された細胞の数から各三胚葉系細胞の数を算出する。視野内の細胞数に対する各三胚葉系細胞の数から分化誘導効率を求めることができる。
【0184】
比較例１から比較例４と実施例１から実施例８では分化誘導効率に異なる傾向が見られる。比較例１から４と比較して、実施例１から実施例８は各三胚葉系細胞への分化誘導効率が高い。このことから、ＬＥＦ１遺伝子の発現量及びＬＥＦ１が陽性を呈する多能性幹細胞集団の割合が本発明の範囲内にある多能性幹細胞を含む細胞集団は分化誘導効率が高い。
【0185】
＜実施例１４：体細胞（膵臓β細胞）への分化誘導＞
実施例１から実施例８で得られたｉＰＳ細胞の細胞集団を、最初の２日間は、０．５％Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ、０．４×ＰＳ、１ｍｍｏｌ／Ｌ ｓｏｄｉｕｍ ｐｙｒｕｖａｔｅ、１×ＮＥＡＡ、８０ｎｇ／ｍＬ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎアクチビンＡ、５０ｎｇ／ｍＬ ＦＧＦ２、２０ｎｇ／ｍＬ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ４、３μｍｏｌ／Ｌ ＣＨＩＲ９９０２１を含むＲＰＭＩ１６４０でディッシュ上に接着させた状態で培養する。３日目はこの培地からＣＨＩＲ９９０２１を除いてディッシュ上に接着させた状態で培養を行い、４日目はさらに１％（体積／体積）ＫＳＲを加えた培地でディッシュ上に接着させた状態で培養を１日間行い、多能性幹細胞から内胚葉細胞への分化誘導を行う。次いで、０．５％ＢＳＡ、１ｍｍｏｌ／Ｌ ｓｏｄｉｕｍ ｐｙｒｕｖａｔｅ、１×ＮＥＡＡ、０．４×ＰＳ、５０ｎｇ／ｍＬ ＦＧＦ２、５０ｎｇ／ｍＬ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ＦＧＦ７（ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ社）、２％ Ｂ２７ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（ＧＩＢＣＯ社）、０．６７μｍｏｌ／Ｌ ＥＣ２３（ＳＡＮＴＡ ＣＲＵＺ社）、１μｍｏｌ／Ｌ ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ（ＷＡＫＯ社）、１０μｍｏｌ／Ｌ ＳＢ４３１５４２（ＷＡＫＯ社）、０．２５ｍｏｌ／Ｌ ＳＡＮＴ１（ＷＡＫＯ社）を含むＲＰＭＩ１６４０で２日間培養を行い、内胚葉細胞から原始腸管細胞（ＰＧＴ：Ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ Ｇｕｔ Ｔｕｂｅ）への分化誘導を行う。次いで、０．４×ＰＳ、１×ＮＥＡＡ、５０ｎｇ／ｍＬ ＦＧＦ２、２％ Ｂ２７、０．６７μｍｏｌ／Ｌ ＥＣ２３、１μｍｏｌ／Ｌ ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ、１０μｍｏｌ／Ｌ ＳＢ４３１５４２、０．２５μｍｏｌ／Ｌ ＳＡＮＴ１を含むＤＭＥＭ－ｈｉｇｈ ｇｌｕｃｏｓｅ（ＷＡＫＯ社）で４日間培養を行い、原始腸管細胞（ＰＧＴ）から後前腸細胞（ＰＦＧ：Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ）への分化誘導を行う。次いで、０．４×ＰＳ、１×ＮＥＡＡ、５０ｎｇ／ｍＬ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ＦＧＦ１０（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社）、２％ Ｂ２７、０．５μｍｏｌ／Ｌ ＥＣ２３、１μｍｏｌ／Ｌ ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ、０．２５μｍｏｌ／Ｌ ＳＡＮＴ１、５μｍｏｌ／Ｌ Ａｌｋ５ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ＩＩ（Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ社）、０．３μｍｏｌ／Ｌ ｉｎｄｏｌａｃｔａｍ Ｖ（ＩＬＶ；Ｃａｙｍａｎ社）を含むＤＭＥＭ－ｈｉｇｈ ｇｌｕｃｏｓｅで３日間培養を行い、後前腸細胞（ＰＦＧ）から膵臓前駆細胞（ＰＰ：Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ）への分化誘導を行う。次いで、０．４×ＰＳ、２ｍｍｏｌ／Ｌ Ｌ－ｇｌｕｔａｍｉｎｅ、２％ Ｂ２７、０．２μｍｏｌ／Ｌ ＥＣ２３、１μｍｏｌ／Ｌ ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ、０．２５μｍｏｌ／Ｌ ＳＡＮＴ１、５μｍｏｌ／Ｌ Ａｌｋ５ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ＩＩ、５０ｎｇ／ｍＬ Ｅｘｅｎｄｉｎ４（ＳＩＧＭＡ社）を含むＡｄｖａｎｃｅｄ－ＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ社）で３日間培養を行い、膵臓前駆細胞（ＰＰ）から膵内分泌前駆細胞（ＥＰ：Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ）への分化誘導を行う。次いで、０．４×ＰＳ、２ｍｍｏｌ／Ｌ Ｌ－ｇｌｕｔａｍｉｎｅ、２％ Ｂ２７、１０ｎｇ／ｍＬ ＢＭＰ４、１０ｎｇ／ｍＬ ＦＧＦ２、５０ｎｇ／ｍＬ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ（ＨＧＦ；ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ社）、５０ｎｇ／ｍＬ ｉｎｓｕｌｉｎ－ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ １（ＩＧＦ１；ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ社）、５μｍｏｌ／Ｌ Ａｌｋ５ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ＩＩ、５０ｎｇ／ｍＬ Ｅｘｅｎｄｉｎ４、５ｍｍｏｌ／Ｌ ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ（ＳＩＧＭＡ社）、５μｍｏｌ／Ｌ ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ（ＷＡＫＯ社）を含むＡｄｖａｎｃｅｄ－ＤＭＥＭで６日間培養を行い、膵内分泌前駆細胞（ＥＰ）から膵臓β細胞への分化誘導を行う。上述の分化誘導方法は一つの実施態様ではあるが、多能性幹細胞から膵臓β細胞を分化誘導でき、強いては、体細胞を製造することが可能となる。
実施例１から実施例８で得られたｉＰＳ細胞の細胞集団を、最初の２日間は、０．５％Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ、０．４×ＰＳ、１ｍｍｏｌ／Ｌ ｓｏｄｉｕｍ ｐｙｒｕｖａｔｅ、１×ＮＥＡＡ、８０ｎｇ／ｍＬ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎアクチビンＡ、５０ｎｇ／ｍＬ ＦＧＦ２、２０ｎｇ／ｍＬ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ４、３μｍｏｌ／Ｌ ＣＨＩＲ９９０２１を含むＲＰＭＩ１６４０でディッシュ上に接着させた状態で培養する。３日目はこの培地からＣＨＩＲ９９０２１を除いてディッシュ上に接着させた状態で培養を行い、４日目はさらに１％（体積／体積）ＫＳＲを加えた培地でディッシュ上に接着させた状態で培養を１日間行い、多能性幹細胞から内胚葉細胞への分化誘導を行う。次いで、０．５％ＢＳＡ、１ｍｍｏｌ／Ｌ ｓｏｄｉｕｍ ｐｙｒｕｖａｔｅ、１×ＮＥＡＡ、０．４×ＰＳ、５０ｎｇ／ｍＬ ＦＧＦ２、５０ｎｇ／ｍＬ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ＦＧＦ７（ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ社）、２％ Ｂ２７ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（ＧＩＢＣＯ社）、０．６７μｍｏｌ／Ｌ ＥＣ２３（ＳＡＮＴＡ ＣＲＵＺ社）、１μｍｏｌ／Ｌ ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ（ＷＡＫＯ社）、１０μｍｏｌ／Ｌ ＳＢ４３１５４２（ＷＡＫＯ社）、０．２５ｍｏｌ／Ｌ ＳＡＮＴ１（ＷＡＫＯ社）を含むＲＰＭＩ１６４０で２日間培養を行い、内胚葉細胞から原始腸管細胞（ＰＧＴ：Ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ Ｇｕｔ Ｔｕｂｅ）への分化誘導を行う。次いで、０．４×ＰＳ、１×ＮＥＡＡ、５０ｎｇ／ｍＬ ＦＧＦ２、２％ Ｂ２７、０．６７μｍｏｌ／Ｌ ＥＣ２３、１μｍｏｌ／Ｌ ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ、１０μｍｏｌ／Ｌ ＳＢ４３１５４２、０．２５μｍｏｌ／Ｌ ＳＡＮＴ１を含むＤＭＥＭ－ｈｉｇｈ ｇｌｕｃｏｓｅ（ＷＡＫＯ社）で４日間培養を行い、原始腸管細胞（ＰＧＴ）から後前腸細胞（ＰＦＧ：Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ）への分化誘導を行う。次いで、０．４×ＰＳ、１×ＮＥＡＡ、５０ｎｇ／ｍＬ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ＦＧＦ１０（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社）、２％ Ｂ２７、０．５μｍｏｌ／Ｌ ＥＣ２３、１μｍｏｌ／Ｌ ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ、０．２５μｍｏｌ／Ｌ ＳＡＮＴ１、５μｍｏｌ／Ｌ Ａｌｋ５ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ＩＩ（Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ社）、０．３μｍｏｌ／Ｌ ｉｎｄｏｌａｃｔａｍ Ｖ（ＩＬＶ；Ｃａｙｍａｎ社）を含むＤＭＥＭ－ｈｉｇｈ ｇｌｕｃｏｓｅで３日間培養を行い、後前腸細胞（ＰＦＧ）から膵臓前駆細胞（ＰＰ：Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ）への分化誘導を行う。次いで、０．４×ＰＳ、２ｍｍｏｌ／Ｌ Ｌ－ｇｌｕｔａｍｉｎｅ、２％ Ｂ２７、０．２μｍｏｌ／Ｌ ＥＣ２３、１μｍｏｌ／Ｌ ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ、０．２５μｍｏｌ／Ｌ ＳＡＮＴ１、５μｍｏｌ／Ｌ Ａｌｋ５ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ＩＩ、５０ｎｇ／ｍＬ Ｅｘｅｎｄｉｎ４（ＳＩＧＭＡ社）を含むＡｄｖａｎｃｅｄ－ＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ社）で３日間培養を行い、膵臓前駆細胞（ＰＰ）から膵内分泌前駆細胞（ＥＰ：Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ）への分化誘導を行う。次いで、０．４×ＰＳ、２ｍｍｏｌ／Ｌ Ｌ－ｇｌｕｔａｍｉｎｅ、２％ Ｂ２７、１０ｎｇ／ｍＬ ＢＭＰ４、１０ｎｇ／ｍＬ ＦＧＦ２、５０ｎｇ／ｍＬ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ（ＨＧＦ；ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ社）、５０ｎｇ／ｍＬ ｉｎｓｕｌｉｎ－ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ １（ＩＧＦ１；ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ社）、５μｍｏｌ／Ｌ Ａｌｋ５ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ＩＩ、５０ｎｇ／ｍＬ Ｅｘｅｎｄｉｎ４、５ｍｍｏｌ／Ｌ ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ（ＳＩＧＭＡ社）、５μｍｏｌ／Ｌ ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ（ＷＡＫＯ社）を含むＡｄｖａｎｃｅｄ－ＤＭＥＭで６日間培養を行い、膵内分泌前駆細胞（ＥＰ）から膵臓β細胞への分化誘導を行う。上述の分化誘導方法は一つの実施態様ではあるが、多能性幹細胞から膵臓β細胞を分化誘導でき、強いては、体細胞を製造することが可能となる。
【図1】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図3A】
【図3B】
【図4】
【図5】
【配列表】