特許 7489409 酵素触媒作用によりスルホキシドを調製するための選択的プロセス

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-05-15

(45)【発行日】2024-05-23

(54)【発明の名称】酵素触媒作用によりスルホキシドを調製するための選択的プロセス

(51)【国際特許分類】

   C12P 11/00 20060101AFI20240516BHJP

   C12P 17/00 20060101ALI20240516BHJP

   C12N 9/02 20060101ALN20240516BHJP

   C12N 15/53 20060101ALN20240516BHJP

【ＦＩ】

C12P11/00

C12P17/00

C12N9/02

C12N15/53

【請求項の数】 10

(21)【出願番号】P 2021576002

(86)(22)【出願日】2020-06-12

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2022-11-28

(86)【国際出願番号】 FR2020051013

(87)【国際公開番号】W WO2020254744

(87)【国際公開日】2020-12-24

【審査請求日】2022-02-16

(31)【優先権主張番号】1906488

(32)【優先日】2019-06-17

(33)【優先権主張国・地域又は機関】FR

(31)【優先権主張番号】2002305

(32)【優先日】2020-03-09

(33)【優先権主張国・地域又は機関】FR

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】505005522

【氏名又は名称】アルケマ フランス

(73)【特許権者】

【識別番号】521553117

【氏名又は名称】セントル ナショナル ドゥ ラ ルシェルシュ スィヤンティフィック

(73)【特許権者】

【識別番号】517370250

【氏名又は名称】ユニヴェルスィテ デクス マルセイユ

(74)【代理人】

【識別番号】110001519

【氏名又は名称】弁理士法人太陽国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】フレミー、ジョルジュ

(72)【発明者】

【氏名】ブラッセレット、ユゴー

(72)【発明者】

【氏名】アルファン、ヴェロニク

(72)【発明者】

【氏名】デュケーヌ、カーティア

【審査官】北村 悠美子

(56)【参考文献】

【文献】Tetrahedron Asymmetry，1992年，Vol.3, No.8, pp.1063-1068

【文献】FEMS Microbiology Letters，1997年，Vol.155, pp.99-105

【文献】Catalysis Communications，2018年，Vol.111, pp.59-63

【文献】Biochemistry，1982年，Vol.21, pp.2644-2655

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｐ １／００－４１／０８

Ｃ１２Ｎ ９／００－９／９９

Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０

Ｃ１２Ｑ １／００－３／００

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

以下の工程を含む、スルホキシドの調製プロセス。
ａ）スルフィドと、
前記スルフィドのスルホキシドへの酸化を触媒する酵素Ｅと、
酸化剤と、
を含む組成物Ｍを調製する工程。
ｂ）前記スルフィドのスルホキシドへの酵素的酸化反応を行う工程。
ｃ）工程ｂ）で得られたスルホキシドを回収する工程。
ここで、前記スルフィドは、前記酵素的酸化反応を行う工程ｂ）において、完全には消費されず、
前記酵素Ｅは、バイヤービリガーモノオキシゲナーゼ（ＢＶＭＯ）であり、
前記スルフィドは、対称スルフィドであり、
前記酵素Ｅが、全細胞で（in whole cells）存在し、［スルフィド］（ｍｍｏｌ／Ｌ）／［細胞］（ｇ _ｃｄｗ ・Ｌ ^－１ ）の比が、０．０１～１０ｍｍｏｌ／ｇ _ｃｄｗ であり、
酵素的酸化反応を行う工程ｂ）の後に残っている前記スルフィドの量は、前記スルフィドの開始重量に対して、０．０００１重量％～９９．９重量％である。

【請求項2】

前記スルフィドが、以下の一般式のスルフィドである、請求項１に記載の調製プロセス。
Ｒ_１－Ｓ－Ｒ_２（Ｉ）
ここで、
Ｒ_１およびＲ_２は、同一であり、（Ｃ_１－Ｃ_２０）アルキル、（Ｃ_２－Ｃ_２０）アルケニル、（Ｃ_２－Ｃ_２０）アルキニル、（Ｃ_３－Ｃ_１０）シクロアルキルおよび（Ｃ_６－Ｃ_１０）アリールからなる群から選択される、
または、
Ｒ_１およびＲ_２は、それらが結合している硫黄原子とともに、ヘテロシクロアルカンまたはヘテロアレーンを形成しており、
前記アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、ヘテロシクロアルカンおよびヘテロアレーンは、１つまたは複数の置換基で置換されていてもよく、
前記アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキルおよびアリールは、１つまたは複数のヘテロ原子を含んでいてもよい。

【請求項3】

前記スルフィドが、ジメチルスルフィド、ジエチルスルフィド、ジプロピルスルフィド、ジブチルスルフィド、ジオクチルスルフィド、ジドデシルスルフィドおよびテトラヒドロチオフェンから選択される、請求項１又は請求項２に記載の調製プロセス。

【請求項4】

前記酸化剤が、空気、低酸素空気、高酸素空気、純酸素および過酸化水素からなる群から選択される、請求項１～請求項３のいずれか一項に記載の調製プロセス。

【請求項5】

前記組成物Ｍが、前記酵素Ｅの少なくとも１種の補因子Ｃを更に含む、請求項１～請求項４のいずれか一項に記載の調製プロセス。

【請求項6】

前記補因子Ｃが、ニコチン補因子およびフラビン補因子から選択される、請求項５に記載の調製プロセス。

【請求項7】

前記酵素Ｅが、シクロヘキサノンモノオキシゲナーゼであり、前記補因子Ｃが、ＮＡＤＰであるか、または、ＮＡＤＰおよびＦＡＤである、請求項５または請求項６に記載の調製プロセス。

【請求項8】

対称スルフィドと、
前記対称スルフィドの対称スルホキシドへの酸化を触媒するバイヤービリガーモノオキシゲナーゼ酵素であって、前記バイヤービリガーモノオキシゲナーゼ酵素が、全細胞で（in whole cells）存在し、［スルフィド］（ｍｍｏｌ／Ｌ）／［細胞］（ｇ _ｃｄｗ ・Ｌ ^－１ ）の比が、０．０１～１０ｍｍｏｌ／ｇ _ｃｄｗ である、バイヤービリガーモノオキシゲナーゼ酵素と、
を含む組成物。

【請求項9】

前記対称スルフィドが、ジメチルスルフィド、ジエチルスルフィド、ジプロピルスルフィド、ジブチルスルフィド、ジオクチルスルフィド、ジドデシルスルフィドおよびテトラヒドロチオフェンから選択される、請求項８に記載の組成物。

【請求項10】

バイヤービリガーモノオキシゲナーゼ酵素の、対称スルフィドを対称スルホキシドに酸化するための使用であって、
前記バイヤービリガーモノオキシゲナーゼ酵素が、全細胞で（in whole cells）存在し、［スルフィド］（ｍｍｏｌ／Ｌ）／［細胞］（ｇ _ｃｄｗ ・Ｌ ^－１ ）の比が、０．０１～１０ｍｍｏｌ／ｇ _ｃｄｗ である、使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、酵素触媒作用によって有機スルフィドから有機スルホキシドを調製するための選択的プロセス、ならびに、特にこのプロセスの実施を可能にする組成物、およびその使用に関する。

【背景技術】

【0002】

メルカプタンは産業的に非常に興味深いものであり、現在、特により複雑な有機分子の合成の出発物質として、化学産業で非常に広く使用されている。例えば、メチルメルカプタン（ＣＨ_３ＳＨ）は、動物の栄養に使用される必須アミノ酸であるメチオニンの合成の出発物質として使用される。メチルメルカプタンは、ジアルキルジスルフィドの合成、より具体的には、石油留分の水素化処理触媒用の硫化添加剤であるジメチルジスルフィド（ＤＭＤＳ）の合成にも使用される。

【0003】

メルカプタン、より具体的にはメチルメルカプタンは、一般に、以下の式（１）に従って、触媒の存在下で高温でアルコールと硫化水素から開始する既知のプロセスによって工業的に合成される。

【0004】

Ｒ－ＯＨ＋Ｈ_２Ｓ→Ｒ－ＳＨ＋Ｈ_２Ｏ（１）

【0005】

しかし、この反応は、以下の式（２）により、スルフィドなどの副生成物の形成を引き起こす。

【0006】

Ｒ－ＯＨ＋Ｒ－ＳＨ→Ｒ－Ｓ－Ｒ＋Ｈ_２Ｏ（２）

【0007】

メルカプタンは、以下の式（３）に従って、ハロゲン化誘導体と、アルカリ金属、アルカリ土類金属またはアンモニウム水硫化物と、から合成することもできる（塩素化誘導体と水硫化ナトリウムとを使用した例を示す）。

【0008】

Ｒ－Ｃｌ＋ＮａＳＨ→Ｒ－ＳＨ＋ＮａＣｌ（３）

【0009】

この第二の合成経路でも、不要なスルフィドの存在が引き起こされる。

【0010】

最後に、メルカプタンは、以下の式（４）に従って、ターゲットが分枝メルカプタンであるか非分枝メルカプタンであるかに応じて、酸触媒作用によって、または、光化学的に、オレフィンと硫化水素から合成することもできる。

【0011】

Ｒ_ＡＲ_ＢＣ＝ＣＲ_ＣＲ_Ｄ＋Ｈ_２Ｓ→Ｒ_ＡＲ_Ｂ－ＣＨ－Ｃ（ＳＨ）Ｒ_ＣＲ_Ｄ（４）

【0012】

再び、この合成は、副生成物としてスルフィドを生成する。

【0013】

これらのスルフィドは工業的に大量に得られ、主に廃棄のために送られる。これは、意図したメルカプタンを製造するプロセスの効率の低下と、それらの廃棄に関連する追加コストを表している。このように廃棄物が生成することは、メルカプタンの生産者にとって真の産業上の問題であり、従って、これらの副生成物から価値を引き出すことを目指している。これを行うにはさまざまな方法がある。

【0014】

まず第一に、スルフィド自体の市場がある。ジメチルスルフィドは、食品フレーバーとして、または石油原料のスチームクラッキングにおけるコークス化防止剤として使用できる。しかし、これらの市場での需要は、スルフィドの生産量よりもはるかに少ない。

【0015】

スルフィドは、スルフヒドロリシス反応によって対応するメルカプタンに変換することもできる。それにもかかわらず、この反応を行うために必要な条件は比較的過酷であり、新たな寄生反応を引き起こす。従って、この産業用途は限られている。

【0016】

最後に、生成されたスルフィドから価値を引き出す別の手段には、スルフィドの酸化反応が含まれ、スルフィドをスルホキシドおよび／またはスルホンに変換する。これらの種類の化学酸化反応はよく知られている。それらは、触媒の存在下または非存在下で、次亜塩素酸ナトリウム、過酸化水素、酸素、オゾンまたはＮ_２Ｏ_４などの酸化窒素などの種々の酸化剤を伴う。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0017】

しかし、スルフィドを酸化する化学的方法は、実際の産業上の問題を提示する。最も重大な問題の１つは、酸化反応の化学選択性が低いことである。現在のところ、酸化をスルホキシドまたはスルホンのみに向けて誘導する利用可能な工業的手段はない。スルホキシドとスルホンの混合物は、スルフィドの酸化の結果として常に得られる。これらの化学的方法の他の欠点は、例えば、安全性の問題につながる非常に強力な試薬を使用すること、または窒素酸化物の入手可能性が低いことである（産業サプライヤーがほとんどない）。更に、これらの化学プロセスのいくつかは、窒素酸化物を使用するプロセスなど、汚染物質排出の問題を引き起こす。

【0018】

化学的酸化と同様に、スルフィドの酸化は、溶液中で、または生物、一般的には微生物中で、酵素触媒作用によって生物学的プロセスにおいて触媒され得る。しかしながら、酵素触媒作用によって行われるこれらの酸化は、得られる生成物に関して選択的ではない。ここでも、対応するスルフィドからスルホキシドとスルホンの混合物が得られる。

【0019】

従って、スルホンに対するスルフィドのスルホキシドへの酸化反応の選択性が低いことは、使用される酸化プロセス（化学的または酵素的）に関係なく、産業の最前線で問題を引き起こす。実際、コストと品質の明らかな理由から、対象の生成物であるスルホキシドまたはスルホンのいずれかに対して可能な限り最大の選択性を有することが望ましい。

【0020】

Ｂｏｒｄｅｗｉｃｋらによる著作物は、非対称芳香族スルフィドのスルホキシド化反応を触媒するためのヤロウイア属モノオキシゲナーゼＡ－Ｈの使用を提案している（Ｓ．Ｂｏｒｄｅｗｉｃｋ，ＥｎｚｙｍｅＭｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，２０１８，１０９，３１－４２）。この出版物では、開始酵素の変異株を得るための遺伝子変異の技術の使用により、ジメチルスルホンの生成が９５％近く減少する。

【0021】

遺伝子変異のそのような技術の使用は不確実で高価である。

【0022】

これらの方法はまた、高い失敗率を有し、これは、全体的な酵素活性、より具体的には目的の基質に対する酵素活性の低下または喪失にもつながる。従って、そのような変更は、良好な選択性を保証するものではない。

【0023】

従って、スルフィド、特にメルカプタン合成からのスルフィドを利用するための、工業的且つ経済的に実施可能なプロセスが必要である。

【0024】

より具体的には、スルフィドをスルホキシドに酸化するための、工業的に実施可能で、より経済的で、より環境に優しいプロセスが必要である。

【0025】

スルフィドをスルホキシドに酸化するための、選択的であり、工業的に操作するのが簡単で経済的であるプロセスが必要である。

【0026】

本発明の目的は、上記の必要性の全部または一部を満たすことである。

【課題を解決するための手段】

【0027】

従って、本発明は、スルホキシドを調製するための、好ましくは選択的な、以下の工程を含むプロセスに関する。
ａ）スルフィドと、
前記スルフィドのスルホキシドへの酸化を触媒する酵素Ｅと、
任意選択で、前記酵素Ｅの少なくとも１種の補因子Ｃと、
酸化剤と、
を含む組成物Ｍを調製する工程。
ｂ）前記スルフィドのスルホキシドへの酵素的酸化反応を行う工程。
ｃ）工程ｂ）で得られたスルホキシドを回収する工程。
ｄ）工程ｃ）で回収されたスルホキシドを任意選択で単離および／または任意選択で精製する工程。
ここで、前記スルフィドは、酵素反応を行う工程ｂ）において、完全には消費されない。

【0028】

驚くべきことに、本発明者らは、酵素触媒作用によってスルホキシドを調製するための選択的プロセスを見出した。前記プロセスを用いて、対応するスルフィドから、より具体的にはスルホンを得ることなく（または無視できる量のスルホンとともに）スルホキシドを得ることが可能である。

【0029】

その理由は、酵素触媒作用によるスルフィドの酸化が、通常、以下の反応シーケンスに従って行われるためである。

【0030】

【化1】

【0031】

上記のスキームにおいて、使用される酵素、その補因子、および酸化剤は、スルホキシドが形成される第１の工程と、スルホンが形成される第２の工程とで同じである。従って、同じ反応混合物内で、スルホキシドとスルホンの両方を得ることが可能であり、これは、上記したように望ましくない。

【0032】

本発明者らは、得られる副生成物、より具体的にはスルホンを減少させるか、更には抑制することによって、スルホキシドを選択的に得ることを可能にするプロセスを見出した。従って、本発明者らは、スルホンを得ることなく（即ち、得られたスルホキシドをスルホンに酸化する酵素なしで）スルホキシドを得る手段を決定した。

【0033】

驚くべきことに、スルフィドのスルホキシドへの酸化が、優先的に、スルホキシドのスルホンへの酸化に対して排他的に起こることが見出された。従って、反応混合物中にスルフィドが存在するとき（例えば、上記で定義された組成物Ｍにおいて）、スルホンが形成されることなく、スルホキシドが選択的に形成される。反応混合物（例えば、上記で定義された組成物Ｍ）がもはやスルフィドを含まず、代わりにスルホキシドのみを含むとき、スルホキシドはスルホンに変換される。

【0034】

従って、本発明のおかげで、スルホキシドまたはスルホンの選択的生成を容易に制御することが可能であり、プロセスの操作条件を変更する必要性を伴わずにそのようなことを行うことが可能である。

【図面の簡単な説明】

【0035】

【図1】図１は、反応が酵素ＣＨＭＯによって触媒される場合の、反応混合物中に存在するジエチルスルフィド（ＤＥＳ）、ジエチルスルホキシド（ＤＥＳＯ）およびジエチルスルホン（ＤＥＳＯ_２）の濃度（ｍＭ）を、時間（時間）の関数として示す。

【発明を実施するための形態】

【0036】

定義

【0037】

「（Ｃ_１－Ｃ_２０）アルキル」という用語は、線状または分枝状であり得、１～２０個の炭素原子を含む飽和脂肪族炭化水素を意味する。好ましくは、アルキルは、１～１２個の炭素原子、または１～４個の炭素原子を含む。例としては、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル、ｓｅｃ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチルなどがある。「分枝」という用語は、アルキル基が主アルキル鎖に沿って置換されていることを意味すると理解される。

【0038】

「（Ｃ_２－Ｃ_２０）アルケニル」という用語は、少なくとも１つの炭素－炭素二重結合を含む上記で定義されたアルキルを意味する。

【0039】

「（Ｃ_２－Ｃ_２０）アルキニル」という用語は、少なくとも１つの炭素－炭素三重結合を含む上記で定義されたアルキルを意味する。

【0040】

「（Ｃ_６－Ｃ_１０）アリール」という用語は、単環式、二環式または三環式芳香族炭化水素化合物、より具体的にはフェニルおよびナフチルを意味する。

【0041】

「（Ｃ_３－Ｃ_１０）シクロアルキル」という用語は、３～１０個の炭素原子を含む単環式または二環式飽和脂肪族炭化水素、例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチルまたはシクロヘキシルを意味する。

【0042】

（Ｃ_３－Ｃ_１０）ヘテロシクロアルカンは、３～１０個の炭素原子を含み且つ少なくとも１つの硫黄原子を含むシクロアルカン、好ましくはテトラヒドロチオフェン、を指し、任意選択で、少なくとも１つの他のヘテロ原子を含む。

【0043】

（Ｃ_４－Ｃ_１０）ヘテロアレーンは、４～１０個の炭素原子を含み且つ少なくとも１つの硫黄原子を含むアレーン、例えばチオフェン、を指し、任意選択で、少なくとも１つの他のヘテロ原子を含む。

【0044】

ヘテロ原子は、具体的には、Ｏ、Ｎ、Ｓ、Ｓｉ、Ｐおよびハロゲンから選択される原子であると理解される。

【0045】

「触媒」は、一般に、反応を加速し、この反応の終了時に変化していない物質であると理解される。一実施形態によれば、酵素Ｅは、スルフィドのスルホキシドへの酸化反応を触媒する。

【0046】

「触媒量」は、具体的には、反応を触媒するのに十分な量、より具体的には、スルフィドのスルホキシドへの酸化を触媒するのに十分な量を指す。より具体的には、触媒量で使用される試薬は、化学量論的比率で使用される試薬の重量に対して、より少ない量で、例えば、約０．０１重量％～２０重量％で使用される。

【0047】

反応の選択性は、一般に、反応後に消費された反応物のモル数、例えば、消費されたスルフィドのモル数に対する、形成された生成物のモル数、例えば、形成されたスルホキシドのモル数を表す。

【0048】

変換、選択性、および収率の通常の定義は以下のとおりである。

【0049】

変換＝（初期状態の反応物のモル数－反応後に残っている反応物のモル数）／（初期状態の反応物のモル数）

【0050】

選択性＝目的の生成物に変換された反応物のモル数／（初期状態の反応物のモル数－反応後に残っている反応物のモル数）

【0051】

収率＝変換×選択性

【0052】

従って、「スルホキシドを調製するための選択的プロセス」は、特に、スルホンを形成せずに（または無視できる量のスルホンを形成して）、スルフィドを消費してスルホキシドを生成するプロセスを指す。一実施形態によれば、スルフィドのスルホキシドへの酸化反応は化学選択的である。

【0053】

例えば、本発明のプロセス、より具体的には工程ｂ）は、スルホキシドに関して９５％～１００％、好ましくは９９％～１００％の選択性を提供する。

【0054】

プロセス

【0055】

本発明のプロセスは、スルホキシドを調製するための選択的であり更に化学選択的であるプロセスであり得る。プロセスは、好ましくは、対応するスルホンの形成をもたらさない。

【0056】

一実施形態によれば、それは工程ｂ）であり、より具体的には、工程ｂ）で行われるスルフィドのスルホキシドへの酵素的酸化反応であり、それは選択的であり、好ましくは化学選択的である。

【0057】

一実施形態によれば、組成物Ｍは、酵素Ｅがスルフィドをスルホキシドに変換するのに十分な量のスルフィドを常に含み、好ましくはスルホンが形成されない。一実施形態によれば、スルフィドは、組成物Ｍ中に過剰に提供される。

【0058】

酵素反応を行う工程ｂ）の後に残っているスルフィドの量は、スルフィドの開始重量、即ち工程ａ）からのスルフィドに対して、０．０００１重量％～９９．９重量％、好ましくは０．１重量％～９９重量％、好ましくは１重量％～５０重量％、例えば１重量％～１０重量％であり得る。

【0059】

より具体的には、組成物Ｍは、
化学量論量のスルフィドと、
触媒量の酵素Ｅと、
任意選択で、触媒量の少なくとも１種の補因子Ｃと、
準化学量論量の酸化剤と、
を含む。

【0060】

スルフィド

【0061】

スルフィドは、具体的には、有機スルフィドであり、これは少なくとも１つの－ＣＳＣ－官能基を含む任意の有機化合物である。

【0062】

一実施形態によれば、組成物Ｍは、少なくとも１種のスルフィドを含む。それは、例えば、１種、２種、またはそれ以上の異なるスルフィドを含み得る。前記スルフィドは対称的であり得る。これは、硫黄原子が化合物に対して対称の中心を表すことを意味する。

【0063】

一実施形態によれば、前記スルフィドは、以下の一般式を有する。

【0064】

Ｒ_１－Ｓ－Ｒ_２（Ｉ）

【0065】

ここで、Ｒ_１およびＲ_２は、同一であっても異なっていてもよく、互いに独立して、（Ｃ_１－Ｃ_２０）アルキル、（Ｃ_２－Ｃ_２０）アルケニル、（Ｃ_２－Ｃ_２０）アルキニル、（Ｃ_３－Ｃ_１０）シクロアルキルおよび（Ｃ_６－Ｃ_１０）アリールからなる群から選択される、または、
Ｒ_１およびＲ_２は、それらが結合している硫黄原子を有する環、好ましくは（Ｃ_３－Ｃ_１０）ヘテロシクロアルカンまたは（Ｃ_６－Ｃ_１０）ヘテロアレーン基を形成している。

【0066】

前記アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、ヘテロシクロアルカンおよびヘテロアレーン基は、任意選択で、１つまたは複数の置換基で置換されていてもよく、前記アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキルおよびアリール基は、１つまたは複数のヘテロ原子を含んでいてもよい。

【0067】

前記アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、ヘテロシクロアルカンおよびヘテロアレーン基は、（Ｃ_１－Ｃ_２０）アルキル、（Ｃ_３－Ｃ_１０）シクロアルキルおよび（Ｃ_６－Ｃ_１０）アリールからなる群から選択される１つまたは複数の置換基で置換されていてもよく、非限定的な例として、アルコール、アルデヒド、ケトン、酸、アミド、ニトリルおよびエステル官能基、または硫黄、リンおよびケイ素を有する官能基から選択される１つまたは複数の官能基で官能化されていてもよい。

【0068】

一実施形態によれば、前記アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、ヘテロシクロアルカンおよびヘテロアレーン基は、（Ｃ_１－Ｃ_２０）アルキル、（Ｃ_３－Ｃ_１０）シクロアルキル、（Ｃ_６－Ｃ_１０）アリール、－ＯＨ、－Ｃ（Ｏ）ＯＨ、－Ｃ（Ｏ）Ｈ、－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ_２、－ＮＨ_２、－ＮＨＲ、－ＮＲＲ’、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－ＮＨＲ’、－Ｃ（Ｏ）－ＮＲＲ’、－ＣＯＯＲおよび－ＣＮからなる群から選択される１つまたは複数の置換基によって置換されていてもよい。ここで、ＲおよびＲ’は、互いに独立して、（Ｃ_１－Ｃ_２０）アルキル基を表す。

【0069】

１つの好ましい実施形態によれば、Ｒ_１およびＲ_２は、同一であっても異なっていてもよく、互いに独立して、（Ｃ_１－Ｃ_２０）アルキル、（Ｃ_２－Ｃ_２０）アルケニル、（Ｃ_２－Ｃ_２０）アルキニルおよび（Ｃ_３－Ｃ_１０）シクロアルキルからなる群から選択される、または、Ｒ_１およびＲ_２は、それらが結合している硫黄原子とともに、（Ｃ_３－Ｃ_１０）ヘテロシクロアルカン基を形成している。

【0070】

Ｒ_１およびＲ_２は、好ましくは、（Ｃ_１－Ｃ_２０）アルキルから選択される、または、Ｒ_１およびＲ_２は、それらを有する硫黄原子とともに、（Ｃ_３－Ｃ_１０）ヘテロシクロアルカンを形成している。スルフィドのＲ_１およびＲ_２は、好ましくは同一である（即ち、対称的なスルフィドを形成している）。

【0071】

より好ましくは、スルフィドは、ジメチルスルフィド、ジエチルスルフィド、ジプロピルスルフィド、ジブチルスルフィド、ジオクチルスルフィド、ジドデシルスルフィドおよびテトラヒドロチオフェンから選択される。本発明によれば、ジメチルスルフィドが、特に好ましい。一実施形態によれば、スルフィドは対称的であり、従ってプロキラルではない。一実施形態によれば、スルフィドは、ｔｅｒｔ－ブチルメチルスルフィド（ＣＡＳ番号６１６３－６４－０）ではない。

【0072】

酸化剤

【0073】

酸化剤は、スルフィドをスルホキシドに酸化することができる任意の化合物である。

【0074】

酸化剤は、空気、低酸素空気、高酸素空気、純酸素および過酸化水素からなる群から選択することができる。１つの特定の実施形態によれば、酸化剤は、酵素Ｅがモノオキシゲナーゼまたはジオキシゲナーゼである場合は、空気、低酸素空気、高酸素空気および純酸素からなる群から選択され、酵素Ｅがペルオキシダーゼである場合は、過酸化水素から選択される。酸化剤がガス状である場合、それは溶解ガスとして組成物Ｍ中に存在する。高酸素または低酸素空気中の酸素のパーセンテージは、当業者に知られている方法で、反応速度および酵素系との適合性に従って選択される。

【0075】

酸化剤は、組成物Ｍにおいて準化学量論量であり得る。従って、存在するスルフィドは、工程ｂ）で行われる酵素反応において酸化剤によって部分的に消費されるが、完全には消費されない。

【0076】

空気（低酸素または高酸素であり得る空気）を使用する場合、酸化剤として工程ｂ）で行われる酵素反応中に消費されるのは明らかに空気内の酸素である。

【0077】

反応の終わりに、酸素は、使用される酵素Ｅがモノオキシゲナーゼである場合、通常水に変換され、酵素Ｅがジオキシゲナーゼである場合、完全に消費される。一方、過酸化水素は、ペルオキシダーゼの作用に続いて水に変換される。従って、本発明のプロセスは、排出物および環境への優しさの点で特に有利である。

【0078】

酵素Ｅ

【0079】

酵素Ｅは、オキシドレダクターゼであり得、好ましくは、モノオキシゲナーゼ、ジオキシゲナーゼおよびペルオキシダーゼからなる群から選択されるオキシドレダクターゼであり得、より好ましくは、モノオキシゲナーゼから選択されるオキシドレダクターゼであり得る。

【0080】

酵素Ｅは、好ましくは、バイヤービリガーモノオキシゲナーゼ（ＢＶＭＯ）である。

【0081】

更により好ましくは、ＢＶＭＯの中で、酵素Ｅは、シクロヘキサノンモノオキシゲナーゼ（ＣＨＭＯ）であり得、より具体的には、シクロヘキサノン１，２－モノオキシゲナーゼまたはシクロペンタノンモノオキシゲナーゼ（ＣＰＭＯ）であり得、より具体的には、シクロペンタノン１，２－モノオキシゲナーゼであり得る。

【0082】

シクロヘキサノン１，２－モノオキシゲナーゼは、具体的には、クラスＥＣ１．１４．１３．２２に由来する。

【0083】

１つの特定の実施形態によれば、ＣＨＭＯは、アシネトバクター属菌種（例えば、菌株ＮＣＩＭＢ９８７１）由来のＣＨＭＯ、および／または、クラスターＡＢ００６９０２に属する遺伝子ｃｈｎＢによってコードされたＣＨＭＯである。

【0084】

シクロペンタノン１，２－モノオキシゲナーゼは、具体的には、クラスＥＣ１．１４．１３．１６に由来する。

【0085】

１つの特定の実施形態によれば、ＣＰＭＯは、コマモナス属菌種（例えば、菌株ＮＣＩＭＢ９８７２）由来のＣＨＭＯ、および／または、遺伝子ｃｐｎＢによってコードされたＣＨＭＯである。

【0086】

モノオキシゲナーゼはまた、ヒドロキシアセトフェノンモノオキシゲナーゼ（ＨＡＰＭＯ）、より具体的には４－ヒドロキシアセトフェノンモノオキシゲナーゼであり得る。

【0087】

ヒドロキシアセトフェノンモノオキシゲナーゼは、具体的には、クラスＥＣ１．１４．１３．８４に由来する。

【0088】

１つの特定の実施形態によれば、ＨＡＰＭＯは、遺伝子ｈａｐＥによってコードされたシュードモナスフルオレッセンス由来のＨＡＰＭＯである。

【0089】

補因子Ｃ

【0090】

「補因子Ｃ」は、特に、上記で定義された酵素Ｅの触媒活性に必要な、および／または、その触媒活性を増強することを可能にする補因子を指す。

【0091】

一実施形態によれば、１種または２種以上の補因子Ｃが組成物Ｍに存在する。例えば、別の補因子Ｃに加えて、酵素Ｅ中にすでに自然に存在する補因子Ｃを、組成物Ｍに混合することが可能である。

【0092】

オキシドレダクターゼがペルオキシダーゼである場合、補因子Ｃを組成物Ｍに添加しないことが可能である。酵素Ｅがモノオキシゲナーゼまたはジオキシゲナーゼのクラスに属する場合、ニコチンおよび／またはフラビン補因子を使用することができる。

【0093】

少なくとも１種の補因子Ｃは、ニコチン補因子およびフラビン補因子から選択され得る。より具体的には、少なくとも１種の補因子Ｃは、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）、フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）および／または対応するそれらの還元型（即ち、ＮＡＤＨ、Ｈ＋ＮＡＤＰＨ、Ｈ＋、ＦＭＮＨ_２、ＦＡＤＨ_２）からなる群から選択され得る。

【0094】

上記の補因子Ｃは、それらの還元型（例えば、ＮＡＤＰＨ、Ｈ＋）および／またはそれらの酸化型（例えば、ＮＡＤＰ＋）で有利に使用され、これらの還元型および／または酸化型の状態で組成物Ｍに添加できる。

【0095】

使用される酵素Ｅは、好ましくは、シクロヘキサノンモノオキシゲナーゼであり、例えば、アシネトバクター属菌種由来のシクロヘキサノンモノオキシゲナーゼであり、使用される補因子Ｃは、ＮＡＤＰであり、任意選択で、ＦＡＤが補充される。

【0096】

補因子Ｃを再生するためのシステム

【0097】

上記で定義された組成物Ｍはまた、補因子Ｃを再生するための少なくとも１つのシステムを含み得る。「補因子Ｃを再生するためのシステム」は、還元された補因子Ｃを酸化された補因子Ｃにまたはその逆に再変換することができる任意の化学反応および／または酵素反応または一連の反応を意味する。

【0098】

再生システムは、例えば、犠牲基質を使用する既知の酵素的レドックスシステムであり得る。この種のシステムは、犠牲基質を使用することによって、使用される補因子Ｃのリサイクルを可能にする第２の酵素（リサイクル酵素と呼ばれる）の使用を伴う。

【0099】

リサイクル酵素には、グルコースデヒドロゲナーゼ、ギ酸デヒドロゲナーゼ、ホスファイトデヒドロゲナーゼ（Ｖｒｔｉｓ，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．，２００２，４１（１７），３２５７－３２５９）または他のデヒドロゲナーゼアルコール（Ｌｅｕｃｈｓ，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｅｎｇ．Ｑ．，２０１１，２５（２），２６７－２８１；Ｇｏｌｄｂｅｒ，Ａｐｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２００７，７６（２），２３７）が含まれる。

【0100】

本発明の文脈内で使用することができる犠牲基質の中で、水素供与性化合物が、最も特に好ましく、これらの中で、完全に適切な化合物は、アルコール、ポリオール、糖、例えばグルコースやグリセロール、などのヒドロキシル官能基を有する水素供与性有機還元化合物である。

【0101】

例えば、ＣＨＭＯの場合、リサイクルシステムの酵素が補因子ＮＡＤＰ＋をＮＡＤＰＨ、Ｈ＋の形に還元し、犠牲基質が酸化される。

【0102】

本発明による組成物Ｍはまた、以下を含み得る。
－任意選択で、水、リン酸緩衝液、トリスＨＣｌ、トリス塩基、重炭酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、ＨＥＰＥＳ（４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸）、ＣＨＥＳ（Ｎ－シクロヘキシル－２－アミノエタンスルホン酸）、もしくは、塩化ナトリウム、塩化カリウムなどの塩、またはそれらの混合物などの緩衝剤、から選択される１種または複数種の溶媒。
－特に酵素反応の１つまたは複数の反応物または基質の溶解性を促進するための、界面活性剤などの任意選択の添加剤。

【0103】

好ましくは、組成物Ｍは水溶液である。例えば、組成物Ｍは、組成物Ｍの総重量に対して、５０重量％～９９重量％、好ましくは８０重量％～９７重量％の水を含む。

【0104】

一実施形態によれば、組成物Ｍは、反応混合物を含むと見なされる。

【0105】

上記の工程ａ）で調製された組成物Ｍの種々の成分は、商業的に容易に入手可能であるか、または当業者に周知の技術によって調製することができる。これらの種々の要素は、固体、液体、または気体の形態であり得、非常に有利に、溶液にされ得るか、または本発明のプロセスで使用される水または任意の他の溶媒に溶解され得る。使用される酵素はまた、支持体にグラフトされ得る（支持された酵素の場合）。

【0106】

一実施形態によれば、酵素Ｅ、任意選択で少なくとも１種の補因子Ｃ、任意選択で少なくとも１つの再生システムは、
－単離された、および／または、精製された形態で、例えば、水溶液で、
－または、粗抽出物、即ち、粉砕された細胞の抽出物で、または
－全細胞で（in whole cells）、
存在する。

【0107】

全細胞が優先的に使用される。［スルフィド］（ｍｍｏｌ／Ｌ）／［細胞］（ｇ_ｃｄｗ・Ｌ^－１）の比は、好ましくは、酵素反応を行う工程ｂ）において、０．０１～１０ｍｍｏｌ／ｇ_ｃｄｗ、好ましくは０．０１～３ｍｍｏｌ／ｇ_ｃｄｗである。乾燥細胞のグラム質量濃度（細胞乾燥重量（Ｃｅｌｌｓ Ｄｒｙ Ｗｅｉｇｈｔ）に関するｇ_ＣＤＷ）は、従来の手法で測定される。

【0108】

酵素Ｅは、以下で宿主細胞と呼ばれる前記細胞において、過剰発現されてもされなくてもよい。

【0109】

宿主細胞は、対応するコード遺伝子の発現から酵素Ｅを生成するのに適切な任意の宿主であり得る。この遺伝子は、宿主のゲノムに位置するか、以下に定義するような発現ベクターによって運ばれる。

【0110】

本発明の目的のために、「宿主細胞」は、具体的には、原核生物または真核生物の細胞であると理解される。組換えまたは非組換えタンパク質の発現に一般的に使用される宿主細胞には、具体的には、大腸菌（Escherichia coli）またはバシラス属菌種（Bacillus sp.）またはシュードモナス（Pseudomonas）などの細菌の細胞、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）またはピキア・パストリス（Pichia pastoris）などの酵母菌の細胞、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍまたはＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉなどの真菌の細胞、Ｓｆ９細胞などの昆虫細胞、またはＨＥＫ２９３、ＰＥＲ－Ｃ６またはＣＨＯ細胞株などの哺乳類（具体的には、ヒト）細胞が含まれる。

【0111】

宿主細胞は、例えば、培養培地から除去された後の定常期にあるものであり得る。

【0112】

好ましくは、酵素Ｅおよびその少なくとも１種の補因子Ｃは、大腸菌において発現される。ＣＨＭＯは、好ましくは、大腸菌、例えば、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）において発現される。

【0113】

ＨＡＰＭＯは、好ましくは、大腸菌、例えば、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）において発現される。

【0114】

例えば、全細胞および／または溶解細胞の場合、使用される補因子Ｃを再生するのは細胞機構である。例えば、大腸菌株がシクロヘキサノンモノオキシゲナーゼ（ＣＨＭＯ）を発現する場合、補因子Ｃは、ＮＡＤＰである。

【0115】

一実施形態によれば、ＣＨＭＯがスルフィドをスルホキシドに変換する場合、補因子Ｃ１はＮＡＤＰであり、任意選択で補因子Ｃ２であるＦＡＤを伴う。ＣＨＭＯがスルフィドをスルホキシドに変換すると、補因子ＮＡＤＰＨ、Ｈ^＋がＮＡＤＰ^＋に酸化され、これは、所定の細胞および／または再生システムによって再生される。還元された補因子の再生は、大腸菌内に自然に存在する酵素、具体的には、例えば培地にグリセロールが補充された場合に、酵素グリセロールデヒドロゲナーゼによって可能になる。グルコースが補充された培地の場合、ペントースリン酸経路の酵素、特に、大腸菌内に自然に存在する、グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼおよび／または６－ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼが、還元された補因子Ｃ１の再生に関与する。

【0116】

本発明によれば、酵素Ｅ、任意選択で少なくとも１種の補因子Ｃ、および任意選択で補因子Ｃを再生するためのシステムを含む宿主細胞は、「生体触媒」と呼ばれる。

【0117】

上記において定義された酵素Ｅおよび／または生体触媒は、当業者に知られている種々の技術によって得ることができる。

【0118】

細胞宿主における酵素Ｅのコード配列を含む発現ベクターの組み込み

【0119】

プラスミドなどの発現ベクターを使用する場合、原核細胞および真核細胞の形質転換は、例えばリポフェクション、エレクトロポレーション、熱ショック、または化学的方法によって当業者によく知られている技術である。発現ベクターおよび発現ベクターを宿主細胞内に導入する方法は、選択された宿主細胞に従って選択される。この形質転換工程により、組換え酵素Ｅをコードする遺伝子を発現する形質転換細胞が得られる。この細胞は、培養／培養工程で培養されて、酵素Ｅを生成することができる。

【0120】

原核細胞および真核細胞の培養／培養は、当業者に良く知られている技術である。当業者は、例えば、培養培地または温度および時間条件を決定することができる。使用するベクターによっては、酵素Ｅの生成の増加に対応する誘導期間が観察され得る。弱い（例えば、ベクターｐＢａｄのアラビノースなど）または強い（例えば、ベクターｐＥＴ２２ｂ、ｐＲＳＦなどのイソプロピルβ－Ｄ－１－チオガラクトシド（ＩＰＴＧ））インダクターの使用を検討することができる。宿主細胞による酵素Ｅの生成は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動の技術またはウエスタンブロット技術を使用して検証することができる。

【0121】

「発現ベクター」は、目的のヌクレオチド配列を挿入することができる小サイズのＤＮＡ分子である。プラスミド、コスミド、ファージなどの多くの既知の発現ベクターから選択を行うことができる。

【0122】

ベクターは、具体的には、使用される細胞宿主に従って選択される。当該発現ベクターは、例えば、文書ＷＯ８３／００４２６１に記載されているものであり得る。

【0123】

発現ベクターの非存在下での宿主細胞のゲノムにおける酵素Ｅのコード配列の組み込み

【0124】

酵素Ｅをコードするヌクレオチド配列は、相同組換えまたはシステムＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９などによる方法などの、任意の既知の方法によって、宿主細胞のゲノムに組み込まれ得る。宿主細胞による酵素Ｅの生成は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動の技術またはウエスタンブロット技術を使用して検証され得る。

【0125】

単離および／または精製された形態で使用するための酵素Ｅの単離および／または精製

【0126】

形質転換宿主細胞の形質転換および培養／培養に続いて、酵素Ｅの単離および任意選択の精製の工程を行うことができる。このようにして、本発明のプロセスは、宿主細胞の存在下ではなく、組成物Ｍ中の溶液中、好ましくは水溶液中の酵素Ｅによって実施される。

【0127】

生成された酵素Ｅの単離および／または精製は、当業者に知られている任意の手段によって行うことができる。これは、例えば、電気泳動、モレキュラーシーブ、超遠心分離、例えば硫酸アンモニウムによる示差沈殿、限外濾過、膜またはゲル濾過、イオン交換、疎水性相互作用による分離、または例えばＩＭＡＣなどのアフィニティークロマトグラフィーから選択される技術を含み得る。

【0128】

宿主細胞の溶解様式、粉砕細胞の粗抽出物の調製

【0129】

細胞溶解物は、超音波処理、圧力（フレンチプレス）、化学薬品（例えば、トリトン）などの使用などの種々の既知の技術によって得ることができる。得られた溶解物は、粉砕された細胞の粗抽出物に相当する。

【0130】

工程ａ）において、組成物Ｍの種々の成分を任意の所望の順序で加えることができる。組成物Ｍは、種々の成分を単に混合することによって調製することができる。

【0131】

一実施形態によれば、本発明のプロセスは、工程ｂ）と工程ｃ）との間に工程ｂ’）を含み、ここで、酵素反応は、生体触媒および／または酵素Ｅの不活性化によって停止される。この工程ｂ’）は、熱ショック（例えば、約１００℃の温度で）または浸透圧ショック、高圧の適用、細胞および／または酵素Ｅの破壊および／または析出を可能にする溶媒の添加、ｐＨ変更（約２の低ｐＨまたは約１０の高ｐＨのいずれか）などの既知手段によって実施できる。

【0132】

スルフィドは、工程ｂ）による酵素反応における反応速度よりも速い速度で組成物Ｍに導入することができる。

【0133】

一実施形態によれば、酵素反応を行う工程である工程ｂ）は、４～１０、好ましくは６～８、より好ましくは７～８、例えば７のｐＨで実施される。

【0134】

一実施形態によれば、酵素反応を行う工程である工程ｂ）は、５℃～１００℃、好ましくは２０℃～８０℃、より好ましくは２５℃～４０℃の温度で実施される。

【0135】

前記酵素反応に使用される圧力は、使用される反応物および装置に応じて、大気圧と比較して低圧から数バール（数百ｋＰａ）までの範囲であり得る。

【0136】

本発明のプロセスによって得られる利点は多くある。これらの利点には、水溶液中で、非常に穏やかな温度と圧力の条件下で、中性に近いｐＨ条件下で作業できる可能性が含まれる。これらの条件はすべて、「グリーン」または「持続可能な」と呼ばれる生体触媒プロセスに典型的なものである。

【0137】

工程ｃ）において、スルホキシドは、液体または固体の形態で回収され得る。スルホキシドは、その溶解度に応じて、水溶液で、またはデカンテーションによって液体の形態で、または析出によって固体の形態で回収することができる。

【0138】

工程ｄ）の場合、精製方法は当該スルホキシドの特性に依存する。従って、限外濾過または遠心分離による細胞（酵素Ｅを含む）の分離後、蒸留はスルホキシドの分離を可能にし得る。

【0139】

この蒸留は、大気圧、減圧（真空）、または当業者によって何らかの利点があるとみなされる場合はより高い圧力下で行われ得る。

【0140】

膜分離はまた、蒸留のために混合物の含水量を減らす目的で、または結晶化プロセスを加速する目的で企図され得る。水性反応混合物からデカンテーションすることによってスルホキシドが回収された場合、モレキュラーシーブでの乾燥（または他の任意の乾燥方法）が考えられ得る。

【0141】

前記プロセスは、バッチ式または連続的に行うことができる。

【0142】

本発明のプロセスは、以下の工程を含み得る。
ａ１）前記酵素Ｅと、
任意選択で、前記少なくとも１種の補因子Ｃと、
前記酸化剤と、
を含む組成物を調製する工程。
ａ２）工程ａ１）で得られた組成物に、好ましくは注入により、前記スルフィドを添加することにより、上記で定義された組成物Ｍを調製する工程。
ｂ）スルフィドのスルホキシドへの酵素的酸化反応を行う工程。
ｃ）工程ｂ）で得られたスルホキシドを回収する工程。
ｄ）工程ｃ）で回収されたスルホキシドを任意選択で単離および／または任意選択で精製する工程。

【0143】

別の実施によれば、プロセスは、以下の工程を含み得る。
ａ１）前記スルフィドと、
前記酵素Ｅと、
任意選択で、前記少なくとも１種の補因子Ｃと、
を含む組成物を調製する工程。
ａ２）工程ａ１）で得られた組成物に前記酸化剤を添加することにより、上記で定義された組成物Ｍを調製する工程。
ｂ）スルフィドのスルホキシドへの酵素的酸化反応を行う工程。
ｃ）工程ｂ）で得られたスルホキシドを回収する工程。
ｄ）工程ｃ）で回収されたスルホキシドを任意選択で単離および／または任意選択で精製する工程。

【0144】

組成物Ｍ

【0145】

本発明はまた、上記で定義された組成物Ｍに関する。

【0146】

組成物Ｍの種々の要素それ自体およびその使用は、上記のプロセスについて定義された通りである。

【0147】

より具体的には、本発明はまた、
上記で定義された対称スルフィドと、
前記対称スルフィドの対称スルホキシドへの酸化を触媒する、上記で定義されたオキシドレダクターゼ酵素、好ましくはバイヤービリガーモノオキシゲナーゼ（ＢＶＭＯ）、より好ましくはシクロヘキサノンモノオキシゲナーゼ（ＣＨＭＯ）と、
任意選択で、上記で定義された酵素Ｅの少なくとも１種の補因子Ｃと、
任意選択で、上記で定義された酸化剤と、
を含む組成物Ｍに関する。

【0148】

更により具体的には、本発明は、
以下の一般式（Ｉ）のスルフィドと、
Ｒ_１－Ｓ－Ｒ_２（Ｉ）（Ｒ_１およびＲ_２は、同一であり、上記で定義されたとおり）
前記スルフィド（Ｉ）の以下の一般式（ＩＩ）のスルホキシドへの酸化を触媒する、上記で定義されたオキシドレダクターゼ酵素、好ましくはバイヤービリガーモノオキシゲナーゼ（ＢＶＭＯ）、より好ましくはシクロヘキサノンモノオキシゲナーゼ（ＣＨＭＯ）と、
Ｒ_１－Ｓ（Ｏ）－Ｒ_２（ＩＩ）（Ｒ_１およびＲ_２は、同一であり、上記で定義されたとおり）
任意選択で、上記で定義された酵素Ｅの少なくとも１種の補因子Ｃと、
任意選択で、上記で定義された酸化剤と、
を含む組成物Ｍに関する。

【0149】

スルフィドは、好ましくは、ジメチルスルフィド、ジエチルスルフィド、ジプロピルスルフィド、ジブチルスルフィド、ジオクチルスルフィド、ジドデシルスルフィドおよびテトラヒドロチオフェンから選択される。ジメチルスルフィドは特に好ましいスルフィドである。

【0150】

一実施形態によれば、前記組成物は、上記で定義されたプロセスを行うための、上記で定義された組成物Ｍに相当する。

【0151】

使用

【0152】

本発明はまた、オキシドレダクターゼ酵素、好ましくはバイヤービリガーモノオキシゲナーゼ（ＢＶＭＯ）、より好ましくは上記で定義されたシクロヘキサノンモノオキシゲナーゼ（ＣＨＭＯ）の、対称スルフィドを対応する対称スルホキシドに酸化するための使用に関する。前記酵素的酸化反応は、特に、本発明の意味で選択的である。一実施形態によれば、前記スルフィドは、一般式Ｒ_１－Ｓ－Ｒ_２（Ｉ）のスルフィドであり、一般式Ｒ_１－Ｓ（Ｏ）－Ｒ_２（ＩＩ）のスルホキシドに変換される（Ｒ_１およびＲ_２は、同一であり、上記で定義されたとおり）。

【0153】

「Ｘ～Ｘ」という表現には、指定された端点が含まれる。以下の実施例は、例示の目的で与えられており、本発明を限定するものではない。

【実施例】

【0154】

実施例１：本発明によるジエチルスルフィドからのジエチルスルホキシドの選択的合成

【0155】

Ｉ．生体触媒の調製

【0156】

プラスミドｐＥＴ２２ｂ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｑｉａｇｅｎにより販売）に挿入されたｃｈｎＢ遺伝子を発現する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅにより販売）の菌株を構築した。それにより、アシネトバクター属菌種由来のシクロヘキサノンモノオキシゲナーゼ（ＣＨＭＯ）の異種発現が可能になる。前記菌株は、ＣＨＭＯ、ＣＨＭＯの補因子、即ち、ＮＡＤＰおよびＦＡＤ、ならびにその再生システムを含むことが理解されよう。

【0157】

この菌株は、当業者に知られている技術によって前培養および培養された。イソプロピルβ－Ｄ－１－チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を最終濃度０．８５ｍｍｏｌ／Ｌで添加することにより誘導段階が開始された後、一定量の培養液を遠心分離（１０分、５０００ｇ、４℃）して、所望量の細胞を得た。この例では、３００ＯＤＵの新鮮な細胞のペレットを、５ｇ／Ｌのグリセロールを添加したｐＨ７の０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液３２ｍＬに再懸濁する。得られた細胞濃度は、９．４ＯＤＵ／ｍＬまたは３ｇ_ＣＤＷ／Ｌ（ＣＤＷは細胞の乾燥重量を表す）である。

【0158】

ＩＩ．生物変換

【0159】

上記の混合物３２ｍＬを含む２５０ｍＬフラスコにおいて、ジエチルスルフィド（ＤＥＳ）の初期濃度は時間＝０で４．５ｍｍｏｌ／Ｌと測定される。

【0160】

一定の間隔で、５０μＬの反応混合物を取り出し、２５ｍｇ／Ｌのウンデカン（内部標準）を含む１４５０μＬのアセトニトリル溶液で希釈する。遠心分離（５分、１２５００ｇ）後、上澄みを、ＧＣ（ガスクロマトグラフィー）に注入して、反応中に形成されたジエチルスルホキシド（ＤＥＳＯ）およびジエチルスルホン（ＤＥＳＯ_２）の定量測定を行う。実施した分析の条件では、測定可能な最小濃度は３０μＭである。

【0161】

分析は、２．５時間の反応の時点での化学選択性の変化を示す。この時点より前では、ＤＥＳＯの量の直線的な増加が測定され、スルホンは検出されない。この部分でのスルフィドの酸化速度としては、１時間あたり混合物１リットルあたり４ｍｍｏｌのＤＥＳが酸化される。

【0162】

３時間後、ＤＥＳＯ_２の量の直線的な増加が、ＤＥＳＯの消費と同時に観察され、ＤＥＳＯ_２は２．８ｍｍｏｌ／Ｌ／時の速度で形成されている。６時間の反応の時点では、ＤＥＳＯ_２のみが存在している。従って、ＤＥＳＯ_２は、ＤＥＳが混合物中で検出されなくなったときに形成されている。

【0163】

この例は、スルフィドが反応混合物中に存在している間はスルフィドのスルホキシドへの酸化反応が化学選択的であることを示している（図１を参照）。

【0164】

得られた選択性は約１００％である。

【0165】

第一に、ＤＥＳが反応混合物にまだ存在しているとき、使用した分析ツールではスルホンは検出されない。

【0166】

第二に、ＤＥＳが反応混合物中で検出されなくなると、ＤＥＳＯの酸化が完了する。反応の終わり（時間＝５時間）の時点で、約１００％のＤＥＳＯ_２が得られ、使用した分析ツールではＤＥＳＯは検出されない。

【0167】

外挿により、計算された［スルフィド］（ｍｍｏｌ／Ｌ）／［細胞］（ｇ_ｃｄｗ・Ｌ^－１）の比は、時間＝２．５の時点で、０．０６ｍｍｏｌ／ｇ_ｃｄｗである。

【0168】

実施例２

【0169】

Ｉ．生体触媒の調製

【0170】

この実施例では、実施例１に記載されたものと同じ菌株が使用された。

【0171】

今回はより多くの量の細胞が使用された。

【0172】

誘導工程の最後の時点で、ＯＤ_６００が、８．４ＯＤＵ／ｍＬで測定され、１０２ｍＬの体積が取り出され、遠心分離（１０分、５０００ｇ、４℃）後、８６０ＯＤＵの新鮮な細胞を含むペレットが得られる。次に、このペレットを、０．５ｇ／Ｌのグリセロールを添加したｐＨ７の０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液３２ｍＬに再懸濁する。得られる細胞濃度は、２７ＯＤＵ／ｍＬ（または約９ｇ_ＣＤＷ／Ｌ）である。

【0173】

ＩＩ．生物変換

【0174】

上記の混合物３２ｍＬを含む２５０ｍＬフラスコにおいて、反応混合物中で測定されるジエチルスルホキシド（ＤＥＳＯ）の濃度は、１１．３ｍｍｏｌ／Ｌである。時間＝２時間の時点で、エタノール溶液中のＤＥＳが添加される。次に、１０．４ｍｍｏｌ／ＬのＤＥＳの濃度が測定される。

【0175】

反応は、実施例１で説明した２つのサンプリング操作を行うことによって監視される。分析は、０～２時間の反応で、最初に添加されたＤＥＳＯからＤＥＳＯ_２のみが生成されることを示している（その後、７．７ｍｍｏｌ／Ｌの濃度が得られる）。時間＝２時間の時点でＤＥＳを添加した後、ＤＥＳＯ_２の濃度は少なくとも４．５時間まで変化しないが、同時にＤＥＳＯが生成される（１０．４ｍｍｏｌ／Ｌが生成される）。１６．５時間の反応の時点では、ＤＥＳＯ_２のみが存在する（ＤＥＳＯは完全に酸化されている）。

【0176】

従って、ＤＥＳを追加すると、スルホン（この場合はＤＥＳＯ_２）の形成が阻止される。

【0177】

この例は、スルフィドのスルホキシドへの酸化が、優先反応であるだけでなく、スルホキシドのスルホンへの酸化反応に対しても排他的であることを示している。

【0178】

実施例３：ジメチルスルフィド（ＤＭＳ）の酵素的酸化

【0179】

Ｉ．生体触媒の調製

【0180】

生体触媒（ＣＨＭＯ）は、実施例１のものと同一であり、実施例１に記載の条件下で生成される。

【0181】

ＩＩ．生物変換

【0182】

実施例１に示されている生物変換条件は、使用されるスルフィドを除いて、この実施例で使用されている条件と同じである。この実施例では、ＤＭＳのエタノール溶液を使用して、４．５ｍＭの初期スルフィド濃度を得る。

【0183】

反応は、実施例１に提示された方法によって監視される。

【0184】

驚くべきことに、使用された生体触媒は、同様の酸化特性をもたらす。具体的には、ＤＭＳが混合物中に存在するときにＤＭＳが化学選択的に酸化され（ジメチルスルホンは検出されない）、次いで、ＤＭＳが混合物中に検出されなくなった時点からスルホキシドが酸化される。

【0185】

この化学選択性に加えて、（ＤＥＳと比較して）同じオーダーのスルフィド酸化速度が反応の初期段階で得られた。１時間あたり混合物１リットルあたり３．９ｍｍｏｌのＤＭＳが酸化される。更に、スルホンの生成速度は１ｍｍｏｌ／Ｌ／時間である。

【0186】

実施例４：メチルエチルスルフィド（ＭＥＳ）の酵素的酸化

【0187】

Ｉ．生体触媒の調製

【0188】

生体触媒（ＣＨＭＯ）は、実施例１のものと同一であり、実施例１に記載の条件下で生成される。

【0189】

ＩＩ．生物変換

【0190】

実施例１に示されている生物変換条件は、使用されるスルフィドを除いて、この実施例で使用されている条件と同じである。この実施例では、ＭＥＳのエタノール溶液を使用して、４．５ｍＭの初期スルフィド濃度を得る。

【0191】

反応は、実施例１に提示された方法によって監視される。

【0192】

驚くべきことに、使用された生体触媒は、同様の酸化特性をもたらす。具体的には、ＭＥＳが混合物中に存在するときにＭＥＳが化学選択的に酸化され（メチルエチルスルホンは検出されない）、次いで、ＭＥＳが混合物中に検出されなくなった時点からメチルエチルスルホキシドが酸化される。

【0193】

この化学選択性に加えて、（他のスルフィドと比較して）同じオーダーの酸化速度が反応の初期段階で得られた。１時間あたり混合物１リットルあたり３．６ｍｍｏｌのＭＥＳが酸化される。更に、スルホンの生成速度は３．５ｍｍｏｌ／Ｌ／時間である。

【0194】

実施例５：テトラヒドロチオフェン（ＴＨＴ）の酵素的酸化

【0195】

Ｉ．生体触媒の調製

【0196】

生体触媒（ＣＨＭＯ）は、実施例１のものと同一であり、実施例１に記載の条件下で生成される。

【0197】

ＩＩ．生物変換

【0198】

実施例１に示されている生物変換条件は、使用されるスルフィドを除いて、この実施例で使用されている条件と同じである。この実施例では、ＴＨＴのエタノール溶液を使用して、４．５ｍＭの初期スルフィド濃度を得る。

【0199】

反応は、実施例１に提示された方法によって監視される。

【0200】

驚くべきことに、使用された生体触媒は、同様の酸化特性をもたらす。具体的には、ＴＨＴが混合物中に存在するときにＴＨＴが化学選択的に酸化され（対応するスルホンであるスルホランは検出されない）、次いで、ＴＨＴが混合物中に検出されなくなった時点からテトラヒドロチオフェン１－オキシドが酸化される。

【0201】

この化学選択性に加えて、（他のスルフィドと比較して）同じオーダーの酸化速度が反応の初期段階で得られた。１時間あたり混合物１リットルあたり３．４ｍｍｏｌのＴＨＴが酸化される。更に、スルホンの生成速度は１．５ｍｍｏｌ／Ｌ／時間である。

【0202】

実施例６：本発明によるスルフィドの混合物の酵素的酸化

【0203】

Ｉ．生体触媒の調製

【0204】

実施例１に記載されたものと同じ菌株がこの実施例で使用された。

【0205】

誘導工程の最後の時点で、ＯＤ_６００が、８．４ＯＤＵ／ｍＬで測定され、３１ｍＬの体積が取り出され、遠心分離（１０分、５０００ｇ、４℃）後、３００ＯＤＵの新鮮な細胞を含むペレットが得られる。次に、このペレットを、０．５ｇ／Ｌのグリセロールを添加したｐＨ７の０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液３２ｍＬに再懸濁する。得られる細胞濃度は、９．４ＯＤＵ／ｍＬ（または約３ｇ_ＣＤＷ／Ｌ）である。

【0206】

ＩＩ．生物変換

【0207】

上記の混合物３２ｍＬを含む２５０ｍＬフラスコにおいて、それぞれ３．６４Ｍのジエチルスルフィド（ＤＥＳ）、ジメチルスルフィド（ＤＭＳ）およびテトラヒドロチオフェン（ＴＨＴ）のエタノール溶液７５μＬを同時に導入する。これが反応の始まりである。

【0208】

実施例１に記載されたのと同じサンプリング操作を行うことによって反応を監視する。

【0209】

分析は、最初の期間中に、混合物中のスルフィドがスルホキシドに酸化され、スルホンが検出されないことを示す。驚くべきことに、ＤＥＳの酸化速度は、存在する他の２つのスルフィド（ＤＭＳおよびＴＨＴ）の酸化速度よりも大きく、これら２つは同様の酸化速度を有している（以下の表１参照）。

【0210】

【表1】

【0211】

反応混合物中にスルフィドが検出されなくなった第２段階でのみ、対応するスルホンが得られる。ただし、ＤＭＳＯ_２は、異なるスルフィドを混合したこれらの条件下では、検出されなかった。
本開示は、以下の実施形態を含む。
＜１＞ 以下の工程を含む、スルホキシドの調製プロセス。
ａ）スルフィドと、
前記スルフィドのスルホキシドへの酸化を触媒する酵素Ｅと、
任意選択で、前記酵素Ｅの少なくとも１種の補因子Ｃと、
酸化剤と、
を含む組成物Ｍを調製する工程。
ｂ）前記スルフィドのスルホキシドへの酵素的酸化反応を行う工程。
ｃ）工程ｂ）で得られたスルホキシドを回収する工程。
ｄ）工程ｃ）で回収されたスルホキシドを任意選択で単離および／または任意選択で精製する工程。
ここで、前記スルフィドは、前記酵素的反応を行う工程ｂ）において、完全には消費されない。
＜２＞ 前記酵素Ｅが、オキシドレダクターゼであり、好ましくは、モノオキシゲナーゼ、ジオキシゲナーゼおよびペルオキシダーゼからなる群から選択されるオキシドレダクターゼであり、より好ましくは、モノオキシゲナーゼから選択されるオキシドレダクターゼである、前記＜１＞に記載の調製プロセス。
＜３＞ 前記酵素Ｅが、バイヤービリガーモノオキシゲナーゼ（ＢＶＭＯ）であり、好ましくは、シクロヘキサノンモノオキシゲナーゼ（ＣＨＭＯ）またはシクロペンタノンモノオキシゲナーゼ（ＣＰＭＯ）である、前記＜１＞または＜２＞に記載の調製プロセス。
＜４＞ 前記スルフィドが、以下の一般式のスルフィドである、前記＜１＞～＜３＞のいずれか一項に記載の調製プロセス。
Ｒ _１ －Ｓ－Ｒ _２ （Ｉ）
ここで、
Ｒ _１ およびＲ _２ は、同一であっても異なっていてよく、（Ｃ _１ －Ｃ _２０ ）アルキル、（Ｃ _２ －Ｃ _２０ ）アルケニル、（Ｃ _２ －Ｃ _２０ ）アルキニル、（Ｃ _３ －Ｃ _１０ ）シクロアルキルおよび（Ｃ _６ －Ｃ _１０ ）アリールからなる群から、互いに独立に選択される、
または、
Ｒ _１ およびＲ _２ は、それらが結合している硫黄原子とともに、ヘテロシクロアルカンまたはヘテロアレーンを形成しており、
前記アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、ヘテロシクロアルカンおよびヘテロアレーン基は、任意選択で、１つまたは複数の置換基で置換されていてもよく、
前記アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキルおよびアリール基は、１つまたは複数のヘテロ原子を含んでいてもよい。
＜５＞ 前記スルフィドのＲ _１ およびＲ _２ が、同一である、前記＜４＞に記載の調製プロセス。
＜６＞ 前記スルフィドが、ジメチルスルフィド、ジエチルスルフィド、ジプロピルスルフィド、ジブチルスルフィド、ジオクチルスルフィド、ジドデシルスルフィドおよびテトラヒドロチオフェンから選択され、好ましくはジメチルスルフィドである、前記＜１＞～＜５＞のいずれか一項に記載の調製プロセス。
＜７＞ ［スルフィド］（ｍｍｏｌ／Ｌ）／［細胞］（ｇ _ｃｄｗ ・Ｌ ^－１ ）の比が、０．０１～１０ｍｍｏｌ／ｇ _ｃｄｗ であり、好ましくは０．０１～３ｍｍｏｌ／ｇ _ｃｄｗ である、前記＜１＞～＜６＞のいずれか一項に記載の調製プロセス。
＜８＞ 前記酸化剤が、空気、低酸素空気、高酸素空気、純酸素および過酸化水素からなる群から選択される、前記＜１＞～＜７＞のいずれか一項に記載の調製プロセス。
＜９＞ 前記補因子Ｃが、ニコチン補因子およびフラビン補因子から選択される、前記＜１＞～＜８＞のいずれか一項に記載の調製プロセス。
＜１０＞ 前記酵素Ｅが、シクロヘキサノンモノオキシゲナーゼであり、前記補因子Ｃが、ＮＡＤＰおよび任意選択でＦＡＤである、前記＜１＞～＜９＞のいずれか一項に記載の調製プロセス。
＜１１＞ 対称スルフィドと、
前記対称スルフィドの対称スルホキシドへの酸化を触媒するオキシドレダクターゼ酵素、好ましくはバイヤービリガーモノオキシゲナーゼ（ＢＶＭＯ）、より好ましくはシクロヘキサノンモノオキシゲナーゼ（ＣＨＭＯ）と、
任意選択で、前記酵素Ｅの少なくとも１種の補因子Ｃと、
任意選択で、酸化剤と、
を含む組成物。
＜１２＞ 前記スルフィド（Ｉ）が、ジメチルスルフィド、ジエチルスルフィド、ジプロピルスルフィド、ジブチルスルフィド、ジオクチルスルフィド、ジドデシルスルフィドおよびテトラヒドロチオフェンから選択され、好ましくはジメチルスルフィドである、前記＜１１＞に記載の組成物。
＜１３＞ オキシドレダクターゼ酵素、好ましくはバイヤービリガーモノオキシゲナーゼ（ＢＶＭＯ）、より好ましくはシクロヘキサノンモノオキシゲナーゼ（ＣＨＭＯ）の、対称スルフィドを対称スルホキシドに酸化するための使用。

【図1】