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特許7489917ヘキサヒドロフロフラノール誘導体の調製方法、その中間体、およびその調製方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-05-16
(45)【発行日】2024-05-24
(54)【発明の名称】ヘキサヒドロフロフラノール誘導体の調製方法、その中間体、およびその調製方法
(51)【国際特許分類】
C07D 307/33 20060101AFI20240517BHJP
C07H 7/02 20060101ALI20240517BHJP
C12P 17/04 20060101ALI20240517BHJP
【ＦＩ】
C07D307/33 CSP
C07H7/02
C12P17/04 ZNA
【請求項の数】
19
(21)【出願番号】P 2020549549
(86)(22)【出願日】2018-07-30
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2021-07-01
(86)【国際出願番号】 CN2018097733
(87)【国際公開番号】W WO2019174176
(87)【国際公開日】2019-09-19
【審査請求日】2020-09-15
【審判番号】
【審判請求日】2022-06-27
(31)【優先権主張番号】201810220506.1
(32)【優先日】2018-03-16
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(73)【特許権者】
【識別番号】520079728
【氏名又は名称】江蘇瑞科医薬科技有限公司
(74)【代理人】
【識別番号】110000338
【氏名又は名称】弁理士法人 ＨＡＲＡＫＥＮＺＯ ＷＯＲＬＤ ＰＡＴＥＮＴ ＆ ＴＲＡＤＥＭＡＲＫ
(72)【発明者】
【氏名】高照波
(72)【発明者】
【氏名】陳建華
(72)【発明者】
【氏名】万志東
(72)【発明者】
【氏名】何大偉
(72)【発明者】
【氏名】周増楽
(72)【発明者】
【氏名】馬曉東
(72)【発明者】
【氏名】向韋
(72)【発明者】
【氏名】林荊▲シン▼
(72)【発明者】
【氏名】梅義将
【合議体】
【審判長】阪野 誠司
【審判官】赤澤 高之
【審判官】関 美祝
(56)【参考文献】
【文献】欧州特許出願公開第２６３４１８０（ＥＰ，Ａ１）
【文献】特開２００４－１０７３１５（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２０１６－２１０８１５（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１６－５０９６０１（ＪＰ，Ａ）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ０７Ｄ
ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＣＡｐｌｕｓ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
キラルが式Ｂの化合物または式Ｂ－２の化合物から酵素還元反応によって構築される、（３Ｒ，３ａＳ，６ａＲ）－ヘキサヒドロフロ［２，３－ｂ］フラン－３－オールの中間体Ｃまたは中間体Ｃ２の調製方法であって、【化1】
式中、Ｒ１は、水素または水酸基の保護基であり；
上記酵素は、アルデヒド／ケトンレダクターゼであり、そのアミノ酸配列は、配列番号１に示されるタンパク質であり、上記アルデヒド／ケトンレダクターゼ遺伝子の塩基配列は、配列番号２である、調製方法。
【請求項2】
式Ｂまたは式Ｂ－２の化合物の酵素還元反応によって構築され、さらに水酸基は保護基によって保護される、（３Ｒ，３ａＳ，６ａＲ）－ヘキサヒドロフロ［２，３－ｂ］フラン－３－オールの中間体Ｃｐまたは中間体Ｃｐ－２の調製方法であって、【化2】
式中、Ｒ１の定義は請求項１と同じであり、Ｒ２は水酸基の保護基であり、酵素は請求項１のものと同じである、調製方法。
【請求項3】
Ｒ１は、Ｃ２－１１の直鎖もしくは分岐鎖のアシル基、ベンゾイル基、またはベンゼン環上の一置換もしくは多置換ベンゾイル基であり、当該一置換基もしくは多置換基はアルキル基、アルコキシ基、ニトロ基、またはシアノ基である、請求項１または請求項２に記載の調製方法。
【請求項4】
請求項１に記載の調製方法によって中間体Ｃを調製し、前記中間体Ｃがさらなる還元および閉環反応によって調製されることを特徴とする（３Ｒ，３ａＳ，６ａＲ）－ヘキサヒドロフロ［２，３－ｂ］フラン－３－オールの調製方法。【化3】
（式中、Ｒ１の定義は請求項１と同じである。）
【請求項5】
請求項１に記載の調製方法によって中間体Ｃ－２を調製し、前記中間体Ｃ－２が閉環反応によって調製されることを特徴とする（３Ｒ，３ａＳ，６ａＲ）－ヘキサヒドロフロ［２，３－ｂ］フラン－３－オールの調製方法。【化4】
（式中、Ｒ１の定義は請求項１と同じである。）
【請求項6】
請求項２に記載の調製方法によって中間体Ｃｐを調製し、前記中間体Ｃｐがさらなる還元および閉環反応によって調製されることを特徴とする（３Ｒ，３ａＳ，６ａＲ）－ヘキサヒドロフロ［２，３－ｂ］フラン－３－オールの調製方法。【化5】
（式中、Ｒ１およびＲ２の定義は請求項２と同じである。）
【請求項7】
請求項２に記載の調製方法によって中間体Ｃｐ－２を調製し、前記中間体Ｃｐ－２が閉環反応によって調製されることを特徴とする（３Ｒ，３ａＳ，６ａＲ）－ヘキサヒドロフロ［２，３－ｂ］フラン－３－オールの調製方法。【化6】
（式中、Ｒ１およびＲ２の定義は請求項２と同じである。）
【請求項8】
請求項１または２に記載の調製方法によって中間体Ｃ－２またはＣｐ－２を調製し、前記中間体Ｃ－２またはＣｐ－２がさらなる閉環反応によって調製されることを特徴とする（３Ｒ，３ａＳ，６ａＲ）－ヘキサヒドロフロ［２，３－ｂ］フラン－３－オールの調製方法。
【請求項9】
上記式Ｂの化合物が、式Ａ２の化合物の、以下に示すアシル化反応によって調製されることを特徴とする請求項１または２に記載の調製方法。【化7】
（式中、Ｘは、ハロゲンであり、Ｒ１は、Ｃ２－１１の直鎖もしくは分岐鎖のアシル基、ベンゾイル基、またはベンゼン環上の一置換もしくは多置換ベンゾイル基であり、当該一置換基もしくは多置換基はアルキル基、アルコキシ基、ニトロ基、またはシアノ基である。）
【請求項10】
上記式Ａ２の化合物が、式Ａ１の化合物の、以下に示すハロゲン化反応によって調製されることを特徴とする請求項９に記載の調製方法。【化8】
【請求項11】
ハロゲン化反応、アシル化反応、酵素還元反応、さらなる還元および閉環反応によって調製されることを特徴とする（３Ｒ，３ａＳ，６ａＲ）－ヘキサヒドロフロ［２，３－ｂ］フラン－３－オールの調製方法であり、【化9】
式中、Ｘは、ハロゲンであり、Ｒ１の定義は請求項１と同じであり、酵素の定義は請求項１と同じである、調製方法。
【請求項12】
ハロゲン化反応、アシル化反応、酵素還元反応、保護反応、さらなる還元および閉環反応によって調製されることを特徴とする（３Ｒ，３ａＳ，６ａＲ）－ヘキサヒドロフロ［２，３－ｂ］フラン－３－オールの調製方法であり、【化10】
式中、Ｘは、ハロゲンであり、Ｒ１の定義は請求項１と同じであり、Ｒ２の定義は請求項２と同じであり、酵素の定義は請求項１と同じである、調製方法。
【請求項13】
ハロゲン化反応、酵素還元反応、アシル化反応、還元および閉環反応によって調製されることを特徴とする（３Ｒ，３ａＳ，６ａＲ）－ヘキサヒドロフロ［２，３－ｂ］フラン－３－オールの調製方法。【化11】
（式中、Ｘは、ハロゲンであり、Ｒ１の定義は請求項１と同じであり、酵素の定義は請求項１と同じである。）
【請求項14】
上記アルデヒド／ケトンレダクターゼは、遺伝子操作された細菌の全細胞、破砕酵素液、凍結乾燥粉末、または固定化酵素もしくは固定化細胞であることを特徴とする請求項１に記載の調製方法。
【請求項15】
上記反応系における上記アルデヒド／ケトンレダクターゼである遺伝子操作された細菌の総細胞投入量が１０～１００ｇ／Ｌであり、転化温度が２５～３７℃であることを特徴とする請求項１に記載の調製方法。
【請求項16】
上記反応は、溶媒の存在下で行われることを特徴とする請求項１に記載の調製方法。
【請求項17】
上記溶媒は、水または緩衝液と有機溶媒とからなる混合溶媒であることを特徴とする請求項１６に記載の調製方法。
【請求項18】
上記緩衝液は、リン酸緩衝液、炭酸緩衝液、Ｔｒｉ－ＨＣｌ緩衝液、クエン酸緩衝液またはＭＯＰＳ緩衝液のうちの１つまたは複数から選択されることを特徴とする請求項１７に記載の調製方法。
【請求項19】
上記有機溶媒は、ＤＭＳＯ、酢酸エチル、酢酸ブチル、イソプロパノール、ＤＭＦ、ＴＢＭＥ、ジクロロメタンおよび酢酸ビニルのうちの１つまたは複数から選択されることを特徴とする請求項１７に記載の調製方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【0001】
本出願は、２０１８年３月１６日に中国特許庁に提出された、出願番号２０１８１０２２０５０６．１、「ヘキサヒドロフロフラノール誘導体の調製方法、その中間体、およびその調製方法」と題する中国特許出願の優先権を主張するものである。その内容の全ては、参照により本出願に組み込まれる。
【0002】
＜技術分野＞
本発明は、医薬工業における有機合成の分野に関し、特にヘキサヒドロフロフラノール誘導体の調製方法およびそれらの中間体に関する。
本発明は、医薬工業における有機合成の分野に関し、特にヘキサヒドロフロフラノール誘導体の調製方法およびそれらの中間体に関する。
【0003】
＜背景技術＞
下記のＺ構造を有する化合物の化学名は、（３Ｒ，３ａＳ，６ａＲ）－ヘキサヒドロフロ［２，３－ｂ］フラン－３－オールである。
下記のＺ構造を有する化合物の化学名は、（３Ｒ，３ａＳ，６ａＲ）－ヘキサヒドロフロ［２，３－ｂ］フラン－３－オールである。
【0004】
【化1】
【0005】
ティボテック・ファーマシューティカルズ株式会社（Tibotec Pharmaceuticals Co., Ltd.）の、出願番号０２８１７６３９．１（出願日：２００２年９月６日）および２００５８００１０４００．Ｘの中国特許は、（３Ｒ，３ａＳ，６ａＲ）－ヘキサヒドロフロ［２，３－ｂ］フラン－３－オールの調製方法を提供した。原料は、下記式（３）の化合物である。
【0006】
【化2】
【0007】
【化3】
【0008】
【化4】
【0009】
ロンザ・リミテッド（Lonza Ltd.）による欧州特許出願ＥＰ２６３４１８０Ａ１（出願日：２０１２年１月３日）は、カルボニルレダクターゼによるカルボニル基の水酸基への還元を開示した。この特許は、多数の商業的に入手可能な酵素、例えば、サッカロマイセス・セレビシエ(saccharomyces cerevisiae)由来のＹＮＬ３３１Ｃを列挙している。また、式Ｉａに示す化合物が適切な立体配置であると言及した。
【0010】
【化5】
【0011】
＜発明内容＞
本発明の（３Ｒ，３ａＳ，６ａＲ）－ヘキサヒドロフロ［２，３－ｂ］フラン－３－オールの調製方法は、出発物質の選択およびキラル構成の構築から始まる。重要な中間体のキラリティを構築するための出発物質および酵素法は、すべての先行技術と比較して新規であり、工業化に適した低コストで穏やかな反応条件を有する。
本発明の（３Ｒ，３ａＳ，６ａＲ）－ヘキサヒドロフロ［２，３－ｂ］フラン－３－オールの調製方法は、出発物質の選択およびキラル構成の構築から始まる。重要な中間体のキラリティを構築するための出発物質および酵素法は、すべての先行技術と比較して新規であり、工業化に適した低コストで穏やかな反応条件を有する。
【0012】
本発明の技術的目的を達成するために、本発明は、以下の技術的スキームを提供する。
【0013】
まず、本発明は、（３Ｒ，３ａＳ，６ａＲ）－ヘキサヒドロフロ［２，３－ｂ］フラン－３－オールの中間体の調製方法を提供する。キラルは、式（Ｂ）の化合物または式（ｂ－２）の化合物から酵素還元反応によって構築した。
【0014】
【化6】
【0015】
酵素は、サッカロマイセス・クドリアヴゼヴィイ（Saccharomyces kudriavzevii）株に由来するアルデヒド／ケトンレダクターゼなどの生物学的酵素である。タンパク質は、そのアミノ酸配列が配列番号１に示されるタンパク質、または配列番号１による１つ以上のアミノ酸残基の置換、欠失もしくは付加後のアルデヒド／ケトン還元酵素活性を有するタンパク質、または配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するアルデヒド／ケトン還元酵素活性と８０％を超える相同性を有するタンパク質である。その塩基配列を配列表に配列番号２で示す。アルデヒド／ケトンレダクターゼは、遺伝子操作された細菌の全細胞、酵素破壊液、凍結乾燥粉末、または固定化酵素もしくは固定化細胞に由来し得る。
【0016】
酵素の供給量は５０～１００ｇ／Ｌ、反応温度は２５～３７℃である。
【0017】
ＮＡＤＰ＋またはＮＡＤＰＨである補酵素は、酵素還元反応に選択的に添加され得る。
【0018】
グルコースデヒドロゲナーゼは、酵素還元反応に選択的に添加され得る。
【0019】
酵素還元反応は、水または緩衝液と有機溶媒とからなる混合溶媒である溶媒の存在下で起きる。
【0020】
緩衝液は、リン酸緩衝液、炭酸緩衝液、Ｔｒｉ－ＨＣｌ緩衝液、クエン酸緩衝液またはＭＯＰＳ緩衝液のうちの１つまたは複数から選択される。
【0021】
有機溶媒は、ＤＭＳＯ、酢酸エチル、酢酸ブチル、イソプロパノール、ＤＭＦ、ＴＢＭＥ、ジクロロメタンおよび酢酸ビニルのうちの１つまたは複数から選択される。
【0022】
基質が完全に利用されるまで本発明の酵素還元反応の生物変換処理をモニターするため、Ｈｐｌｃ－ＭｓおよびＨＰＬＣが用いられる。
【0023】
さらに、（３Ｒ，３ａＳ，６ａＲ）－ヘキサヒドロフロ［２，３－ｂ］フラン－３－オールの中間体の調製方法は、式Ｂの化合物の酵素還元反応によって構築され、さらに水酸基は保護基によって保護される。
【0024】
【化7】
【0025】
上記調製方法において、Ｒ１基は、Ｃ２－１１の直鎖もしくは分岐鎖のアシルベンゾイル基、またはベンゼン環上の一置換もしくは多置換ベンゾイル基であることが好ましく、当該一置換基もしくは多置換基はアルキル基、アルコキシ基、ニトロ基、またはシアノ基である。
【0026】
一方、本発明は、中間体化合物Ｃのさらなる還元および閉環反応によって調製される（３Ｒ，３ａＳ，６ａＲ）－ヘキサヒドロフロ［２，３－ｂ］フラン－３－オールの調製方法を提供する。
【0027】
【化8】
【0028】
本発明は、中間体化合物Ｃｐのさらなる還元および閉環反応によって調製され得る（３Ｒ，３ａＳ，６ａＲ）－ヘキサヒドロフロ［２，３－ｂ］フラン－３－オールの調製方法を提供する。
【0029】
【化9】
【0030】
本発明は、化合物の式Ｃ－２または式Ｃｐ－２の調製した化合物を選択的に分離した後に閉環反応によって調製され得る（３Ｒ，３ａＳ，６ａＲ）－ヘキサヒドロフロ［２，３－ｂ］フラン－３－オールの調製方法を提供する。
【0031】
式Ｂの化合物は、式Ａ２の化合物のアシル化によって調製され、その反応は以下のように示される。
【0032】
【化10】
【0033】
本発明の化合物Ａ２は、化合物Ａ１のハロゲン化により調製され、その反応は以下のように示される。
【0034】
【化11】
【0035】
本発明は、（３Ｒ，３ａＳ，６ａＲ）－ヘキサヒドロフロ［２，３－ｂ］フラン－３－オールの調製方法を開示し、好ましい実施形態は、ハロゲン化反応，アシル化反応，酵素還元反応、さらなる還元および閉環反応による調製である。
【0036】
【化12】
【0037】
本発明は、（３Ｒ，３ａＳ，６ａＲ）－ヘキサヒドロフロ［２，３－ｂ］フラン－３－オールの調製方法を開示し、別の好ましい実施形態は、ハロゲン化反応、アシル化反応、酵素還元反応、水酸基の保護反応、さらなる還元および閉環反応による調製である。
【0038】
【化13】
【0039】
本発明において、酵素法により構築されたキラル中心を有する化合物を保護して、以下の構造式を有する（３Ｒ，３ａＳ，６ａＲ）－ヘキサヒドロフロ［２，３－ｂ］フラン－３－オールの中間体化合物を提供する。
【0040】
【化14】
【0041】
ヒドロキシル保護基は、ベンゾイル、ベンゼン環上の一置換もしくは多置換ベンゾイル、ベンゾイル、ｔｅｒｔ－ブチル、またはベンジルであることが好ましい。
【0042】
上記還元反応は、別のカルボニル基をヘミケタール生成物に還元する方法に関し、その反応を以下に示す。
【0043】
【化15】
【0044】
【化16】
【0045】
ヘミケタール生成物は分離することも、または分離せずに次の反応にさらに適用することもできる。例えば、（３Ｒ，３ａＳ，６ａＲ）－ヘキサヒドロフロ［２，３－ｂ］フラン－３－オールの閉環反応による調製は、
【0046】
【化17】
【0047】
ヘミアセタールへの還元反応に使用される還元剤は、ホウ素還元剤、アルミニウム還元剤、またはリチウムケイ素還元剤であってもよい。例えば、水素化ホウ素ナトリウム、シアノ水素化ホウ素ナトリウム、リチウムテトラヒドロアルミニウム、Ｒｅｄ－Ａｌ、水素化アルミニウムリチウム、水酸化ジイソブチルアルミニウム、リチウムジイソプロピルアミド、およびリチウムヘキサメチルジシラジドである。
【0048】
閉環反応のための試薬は、当該分野では一般的な酸または塩基である。
【0049】
本発明の好ましい実施形態は、最初にキラル中心を構築し、次に水酸基を選択的に保護し、次にそれをヘミケタール生成物に還元し、閉環反応を行って、（３Ｒ，３ａＳ，６ａＲ）－ヘキサヒドロフロ［２，３－ｂ］フラン－３－オールを調製することである。
【0050】
【化18】
【0051】
しかしながら、本発明の実施形態は、最初にヘミケタール生成物に還元することもでき、次いで、キラル中心を構築することができる。選択的に分離した後、閉環反応を行って、（３Ｒ，３ａＳ，６ａＲ）－ヘキサヒドロフロ［２，３－ｂ］フラン－３－オールを調製することができる。
【0052】
【化19】
【0053】
本発明の上記のアシル化反応では、
【0054】
【化20】
【0055】
アシル化試薬は、置換安息香酸化合物またはその塩であり、置換安息香酸化合物の置換基は、アルキル基、アルコキシ基、ニトロ基、またはシアノ基などであってもよい。置換は、単置換または多置換であってもよい。
【0056】
アシル化反応は、トリエチルアミン、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、重炭酸ナトリウムなどの有機塩基または無機塩基であり得る塩基の付加を含み得る。
【0057】
Ｒ１は、ｔｅｒｔ－ブチル基などの別の置換基を有する。これは式Ａ３の化合物によって、または式Ａ２の化合物がｔｅｒｔ－ブチル酸と反応することによって変換することができ、式Ａ３の化合物は、式Ａ２の化合物によって調製された。
【0058】
【化21】
【0059】
【化22】
【0060】
本発明において、ハロゲン化反応に用いられる試薬は、ハロゲン化水素酸等である。
【0061】
本発明の（３Ｒ，３ａＳ，６ａＲ）－ヘキサヒドロフロ［２，３－ｂ］フラン－３－オールの調製方法は、還元後にハロゲン化反応、酵素還元反応、アシル化反応、閉環反応によって調製することもでき、反応を以下に示す。
【0062】
【化23】
【0063】
本発明により提供される（３Ｒ，３ａＳ，６ａＲ）－ヘキサヒドロフロ［２，３－ｂ］フラン－３－オールの調製方法は、キラリティを構築するために酵素法を採用し、これにより、高い収率および高い光学純度を有する生成物を生成することができる。上述の欧州特許出願のような従来の方法は、カルボニルレダクターゼポリペプチドまたはカルボニルレダクターゼポリペプチドを含む微生物がカルボニル基の水酸基への還元を実現することを開示しているが、本発明で使用される酵素はより重要な利点を有し、これはより高い光学純度およびより好適な反応条件下での生成物の調製に反映される。本発明の（３Ｒ，３ａＳ，６ａＲ）－ヘキサヒドロフロ［２，３－ｂ］フラン－３－オールの調製方法は、工業生産に適している。
【0064】
＜実施例＞
本発明をさらに理解するために、以下は、本発明によって提供される（３Ｒ，３ａＳ，６ａＲ）－ヘキサヒドロフロ［２，３－ｂ］フラン－３－オール誘導体の調製方法、中間体および調製方法の詳細な記載である。これらの実施形態の説明は、本発明の特性をさらに特定することのみを意図しており、本発明の範囲または請求項の範囲を本発明に限定することを意図していないことを理解されたい。
本発明をさらに理解するために、以下は、本発明によって提供される（３Ｒ，３ａＳ，６ａＲ）－ヘキサヒドロフロ［２，３－ｂ］フラン－３－オール誘導体の調製方法、中間体および調製方法の詳細な記載である。これらの実施形態の説明は、本発明の特性をさらに特定することのみを意図しており、本発明の範囲または請求項の範囲を本発明に限定することを意図していないことを理解されたい。
【0065】
（実施例１）
【0066】
【化24】
【0067】
（実施例２）
【0068】
【化25】
【0069】
（実施例３）
アルデヒド／ケトンレダクターゼ遺伝子の全細胞調製－遺伝子操作された細菌
組み換えアルデヒド／ケトンレダクターゼが遺伝子操作された細菌の調製方法は、Saccharomyces kudriavzevii由来のアルデヒド／ケトンレダクターゼ遺伝子の配列を人工設計のために選択した。人工的に設計した配列を全遺伝子合成（ジェンスクリプト株式会社（GenScript Co., Ltd.）により委託）により合成し、発現ベクターｐＥＴ２８ａのＮｄｅ ＩおよびＸｈｏ Ｉ切断部位にクローニングして宿主細菌である大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）株のコンピテント細胞を形質転換した。ポジティブインバーターを選択し、配列決定によって同定した後、組み換え発現を得た。組み換え型発現ベクターを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）株に移入し、組み換え型アルデヒド／ケトンレダクターゼの発現を誘導できる組み換え型アルデヒド／ケトンレダクターゼが遺伝子操作された細菌を得た。
アルデヒド／ケトンレダクターゼ遺伝子の全細胞調製－遺伝子操作された細菌
組み換えアルデヒド／ケトンレダクターゼが遺伝子操作された細菌の調製方法は、Saccharomyces kudriavzevii由来のアルデヒド／ケトンレダクターゼ遺伝子の配列を人工設計のために選択した。人工的に設計した配列を全遺伝子合成（ジェンスクリプト株式会社（GenScript Co., Ltd.）により委託）により合成し、発現ベクターｐＥＴ２８ａのＮｄｅ ＩおよびＸｈｏ Ｉ切断部位にクローニングして宿主細菌である大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）株のコンピテント細胞を形質転換した。ポジティブインバーターを選択し、配列決定によって同定した後、組み換え発現を得た。組み換え型発現ベクターを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）株に移入し、組み換え型アルデヒド／ケトンレダクターゼの発現を誘導できる組み換え型アルデヒド／ケトンレダクターゼが遺伝子操作された細菌を得た。
【0070】
組み換え型アルデヒド／ケトンレダクターゼが遺伝子操作された細菌を、カナマイシンを含有するＬＢ培地に接種し、３７℃で一晩培養して種培養用培地を得た。種培地に、カナマイシンを含有する培地の体積の１％で接種した。その後、３７℃で２～５時間培養し、無菌ＩＰＴＧで誘導し、ＩＰＴＧの最終濃度は０．１ｍＭに達した。次に、それを２５℃で２０時間インキュベートした。最後に、Saccharomyces kudriavzeviiアルデヒド／ケトンレダクターゼ遺伝子の全細胞を高速遠心分離により得た。遺伝子操作された細菌の全細胞を超音波法で破壊し、遺伝子操作された細菌の全細胞の酵素溶液をSaccharomyces kudriavzeviiから得た。アルデヒド／ケトンレダクターゼは、アミノ酸配列が配列番号１であるタンパク質であり、アルドステロンレダクターゼ遺伝子の塩基配列を配列表の「配列番号２」に示す。
【0071】
誘導後、４５ｋＤａに明らかなタンパク質バンドが存在し、これは、アルデヒド／ケトンレダクターゼが組み換え細菌において高度に発現されたことを示す。Ｔｒｉｓ－ｈｃｌ、ＮＡＤＰＨ（ｐＨ８．０、２ｍｍｏｌ／Ｌ）、０．１ｍｍｏｌ／Ｌ基質
【0072】
【化26】
【0073】
結果は、組み換え遺伝子操作されたアルデヒド／ケトンレダクターゼのアルデヒド／ケトン還元酵素活性が欧州特許（ＥＰ２６３４１８０Ａ１）の配列のそれと比較して２０％を超えて増加し、非変異アルデヒド／ケトンレダクターゼ配列のそれと比較して５０％を超えて増加したことを示した。
【0074】
本発明の実施形態で使用されるアルデヒド／ケトンレダクターゼの遺伝子操作された細菌は、この方法によって調製される。
【0075】
本発明の実施形態および対照実験において使用されるグルコースデヒドロゲナーゼは、シグマ－アルドリッチから購入した市販の酵素である。
【0076】
ｅｅ値のアルゴリズム：
ee(syn)=([R,R]-[S,S])/([R,R]+[S,S])
ee(anti)=([R,S]-[S,R])/([R,S]+[S,R])
de={([R,S]+[S,R])-([R,R]+[S,S])}/{([R,S]+[S,R])+([R,R]+[S,S])}
酵素還元反応：
ee(syn)=([R,R]-[S,S])/([R,R]+[S,S])
ee(anti)=([R,S]-[S,R])/([R,S]+[S,R])
de={([R,S]+[S,R])-([R,R]+[S,S])}/{([R,S]+[S,R])+([R,R]+[S,S])}
酵素還元反応：
【0077】
【化27】
【0078】
工程２：工程１で得られた目的生成物の変換液を精製した。反応系に一定量の酢酸エチルを加え、３７℃で１５分間抽出した後、３回繰り返し、遠心分離により酢酸エチル層を分取し、分取した酢酸エチル層に５％無水硫酸マグネシウムを添加し、１５分間振り混ぜた後、ろ過して硫酸マグネシウムを除去した。次に、脱水した酢酸エチル層を高温減圧下で濃縮したところ、目的生成物は７．４１ｇであり、ｄｅ値は９６．２％、ｅｅ（ａｎｔｉ）値は９９．５％であった。
【0079】
（実施例４）
【0080】
【化28】
【0081】
（実施例５）
【0082】
【化29】
【0083】
（実施例６）
【0084】
【化30】
【0085】
工程１：５Ｌフラスコ中で反応を行い、反応系を２Ｌに制御し、滅菌リン酸カリウム緩衝液１．７Ｌを用いて、フラスコ中のアルデヒド／ケトンレダクターゼが遺伝子操作された細菌の全細胞を懸濁した。グルコースデヒドロゲナーゼを入れ、細胞を超音波により５０分間破壊した。次いで、２５ｇのグルコース、０．４２ｇのＮＡＤＰ＋を添加し、次いで、８０ｇの反応物を秤量し、そしてそれを３００ｍＬのＤＭＳＯに溶解する。基質を有する脱脂ＤＭＳＯ溶液を振盪ボトルにゆっくり注ぎ、２時間反応させた後、１２ｇのグルコースを溶液に添加した。アルデヒド／ケトンが遺伝子操作された細菌の全細胞容積は７５ｇ／Ｌであり、グルコースデヒドロゲナーゼの投入量は２５ｍｇ／Ｌであった。温度は３７℃であり、転化反応は回転速度を２００ｒｐｍに制御した振盪機中で実施し、転化時間は１２時間であった。目的生成物の転化率は９７．８％であった。
【0086】
工程２：式ＶＩＩＩの中間体化合物を含有する工程１からの生成物の精製。精製工程は実施例３を参照されたい。目的生成物は７７．１ｇであり、ｄｅ値は９５．３％、ｅｅ（ａｎｔｉ）値は９９．６％であった。
【0087】
（実施例７）
【0088】
【化31】
【0089】
工程２：工程１で得られた目的生成物の変換液を精製した。反応系に一定量の酢酸エチルを加え、３７℃で１５分間抽出した後、３回繰り返し、遠心分離により酢酸エチル層を分取し、分取した酢酸エチル層に５％無水硫酸マグネシウムを添加し、１５分間振り混ぜた後、ろ過して硫酸マグネシウムを除去した。次に、脱水した酢酸エチル層を高温減圧下で濃縮したところ、目的生成物は９．５５ｇであり、ｄｅ値は９９．１％、ｅｅ（ａｎｔｉ）値は９９．７％であった。
【0090】
１Ｈ ＮＭＲ（６００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３） δ ２．２６９～２．３０１（ｍ、１Ｈ、Ｊ＝６Ｈｚ）、２．３６７～２．４０４（ｍ、１Ｈ）、２．９５４～２．９９３（ｍ、１Ｈ、Ｊ＝６Ｈｚ）、３．４３８～３．４６６（ｍ、１Ｈ）、３．５２０～３．５４９（ｍ、１Ｈ）、４．２２７～４．２６９（ｍ、１Ｈ）、４．２９８～４．３２６（ｍ、１Ｈ）、４．３９１～４．４２０（ｍ、１Ｈ）。ＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ２１０．０３［Ｍ＋Ｈ]＋。
【0091】
（実施例８）
【0092】
【化32】
【0093】
工程２：式ＶＩＩＩの中間体化合物を含有する工程１からの生成物の精製。精製工程は実施例３を参照されたい。目的生成物は９．４２ｇであり、ｄｅ値は９６．９％、ｅｅ（ａｎｔｉ）値は９９．４％であった。
【0094】
（実施例９）
【0095】
【化33】
【0096】
工程２：式ＶＩＩＩの中間体化合物を含有する工程１からの生成物の精製。精製工程は実施例３を参照されたい。目的生成物は９．３７ｇであり、ｄｅ値は９７．１％、ｅｅ（ａｎｔｉ）値は９９．５％であった。
【0097】
（実施例１０）
【0098】
【化34】
【0099】
工程２：式ＶＩＩＩの中間体化合物を含有する工程１からの生成物の精製。精製工程は実施例３を参照されたい。目的生成物は９３．１ｇであり、ｄｅ値は９５．６％、ｅｅ（ａｎｔｉ）値は９９．６％であった。
【0100】
（実施例１１：対照実験）
【0101】
【化35】
【0102】
工程２：精製工程は実施例３を参照されたい。目的生成物は８．１１ｇであり、ｄｅ値は８５.１％、ｅｅ（ａｎｔｉ）値は９３．３％であった。
【0103】
（実施例１２：対照実験）
【0104】
【化36】
【0105】
工程２：精製工程は実施例３を参照されたい。目的生成物は７．７３ｇであり、ｄｅ値は７９.６％、ｅｅ（ａｎｔｉ）値は８８．７％であった。
【配列表】