特許 7490557 ベルベリンを含む組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-05-17

(45)【発行日】2024-05-27

(54)【発明の名称】ベルベリンを含む組成物

(51)【国際特許分類】

   A61K 31/4745 20060101AFI20240520BHJP

   A61K 36/29 20060101ALI20240520BHJP

   A61K 36/71 20060101ALI20240520BHJP

   A61K 36/718 20060101ALI20240520BHJP

   A61K 36/87 20060101ALI20240520BHJP

   A61K 47/22 20060101ALI20240520BHJP

   A61K 47/24 20060101ALI20240520BHJP

   A61K 47/26 20060101ALI20240520BHJP

   A61K 47/42 20170101ALI20240520BHJP

   A61K 47/44 20170101ALI20240520BHJP

   A61K 47/46 20060101ALI20240520BHJP

   A61P 3/04 20060101ALI20240520BHJP

   A61P 3/06 20060101ALI20240520BHJP

   A61P 9/00 20060101ALI20240520BHJP

   A61K 125/00 20060101ALN20240520BHJP

【ＦＩ】

A61K31/4745

A61K36/29

A61K36/71

A61K36/718

A61K36/87

A61K47/22

A61K47/24

A61K47/26

A61K47/42

A61K47/44

A61K47/46

A61P3/04

A61P3/06

A61P9/00

A61K125:00

【請求項の数】 11

(21)【出願番号】P 2020540484

(86)(22)【出願日】2019-01-22

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2021-05-13

(86)【国際出願番号】 IB2019050511

(87)【国際公開番号】W WO2019150225

(87)【国際公開日】2019-08-08

【審査請求日】2022-01-07

(31)【優先権主張番号】102018000002333

(32)【優先日】2018-02-02

(33)【優先権主張国・地域又は機関】IT

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】591092198

【氏名又は名称】インデナ エッセ ピ ア

(74)【代理人】

【識別番号】100123788

【弁理士】

【氏名又は名称】宮崎 昭夫

(74)【代理人】

【識別番号】100127454

【弁理士】

【氏名又は名称】緒方 雅昭

(72)【発明者】

【氏名】コルティ、 ファブリツィオ

(72)【発明者】

【氏名】ロンキ、 マッシモ

(72)【発明者】

【氏名】リバ、 アントネラ

【審査官】新留 素子

(56)【参考文献】

【文献】中国特許出願公開第１０１６０６６２２（ＣＮ，Ａ）

【文献】中国特許出願公開第１０２９４９３７５（ＣＮ，Ａ）

【文献】特表２０１０－５０６５７６（ＪＰ，Ａ）

【文献】米国特許出願公開第２０１３／０２８７７０８（ＵＳ，Ａ１）

【文献】中国特許第１０２７０２１９０（ＣＮ，Ｂ）

【文献】米国特許出願公開第２０１６／００１５８１３（ＵＳ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１６／１４９４２４（ＷＯ，Ａ１）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ａ６１Ｋ

Ａ６１Ｐ

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ａ）ベルベリン（ＢＢＲ）を含有する水性抽出物であって該水性抽出物のＢＢＲ含有量が３０質量％～７０質量％の範囲である水性抽出物；
ｂ）エンドウ豆タンパク質；
ｃ）一つ以上の界面活性剤；および
ｄ）ヴィティス（Ｖｉｔｉｓ） ｖｉｎｉｆｅｒａ種抽出物；を含み、
ここで、ＢＢＲを含有する水性抽出物とエンドウ豆タンパク質との間の重量比は１：１ｗ／ｗ～１０：１ｗ／ｗの範囲である組成物。

【請求項2】

前記水性抽出物が、Ｂｅｒｂｅｒｉｓ ａｒｉｓｔａｔａ、Ｃｏｐｔｉｓ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓまたはＨｙｄｒａｓｔｉｓ Ｃａｎａｄｅｎｓｉｓの根から得られる、請求項１に記載の組成物。

【請求項3】

前記水性抽出物がＢｅｒｂｅｒｉｓ ａｒｉｓｔａｔａの根から得られる、請求項２に記載の組成物。

【請求項4】

前記水性抽出物が５０質量％に等しい量のベルベリンを含有する、請求項２又は３に記載の組成物。

【請求項5】

前記界面活性剤が、リン脂質、スクロースエステル、ポリソルベート、ポリオキシエチレンヒマシ油誘導体、Ｄ－α－トコフェリル－ポリエチレングリコールスクシネートまたはそれらの混合物から選択される、請求項１～４のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項6】

前記界面活性剤がレシチンである請求項５に記載の組成物。

【請求項7】

レシチンが大豆レシチンまたはヒマワリレシチンである請求項６に記載の組成物。

【請求項8】

薬剤として使用するための、請求項１～７のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項9】

脂質異常症、高コレステロール血症、メタボリックシンドロームおよび心血管疾患の予防および／または治療に使用する、請求項１～７のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項10】

請求項１～７のいずれか１項に記載の組成物、または請求項１～７のいずれか１項に記載の組成物および少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤を含む製剤、の製造方法であって、該方法は、界面活性剤の溶液または分散液の調製と、１つ以上の連続工程において、ベルベリン（ＢＢＲ）を含有する水性抽出物、エンドウ豆タンパク質、ヴィティス（Ｖｉｔｉｓ） ｖｉｎｉｆｅｒａ種抽出物、および任意選択で少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤の添加とを含む製造方法。

【請求項11】

請求項１～７のいずれか１項に記載の組成物、および少なくとも１つの適切な薬学的に許容される賦形剤を含む製剤。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、異脂肪血症、高コレステロール血症、メタボリックシンドロームおよび心血管疾患の予防および／または治療のためのベルベリンを含む組成物に関する。

【背景技術】

【0002】

ベルベリン（以下、「ＢＢＲ」と呼ぶ）は種々の植物、例えば、Berberis aristata、Coptis chinensisおよびHydrastis canadensisに存在するアルカロイドであり、これらは、それらの抗寄生虫、抗菌および抗炎症特性のために漢方およびインドの伝統的医学において広く使用されている。

【0003】

さらに最近の多数の研究はＢＢＲの非常に広範な薬理活性を強調しており、メタボリックシンドロームの制御を含む様々な治療分野でのその臨床使用の可能性を示唆している。この後者の適用は、前臨床および臨床レベルの両方で観察される主要な抗脂質異常症および低血糖作用と特に関連している［１，２］。

【0004】

ＢＢＲの抗脂質代謝異常及び低血糖（食後血糖）活性は多数の臨床試験で実証されている［１，２］。また、メタボリックシンドロームにおける血管壁や心血管合併症に伴う炎症機序に対する重要な作用も認められている［１，２］。

【0005】

ＢＢＲがアテローム性動脈硬化過程で保護作用を発揮する主な機序は肝臓のＬＤＬ－Ｒ受容体の合成を誘導し、酵素ＰＣＳＫ９の発現と分泌を阻害することによりＬＤＬ－Ｃ値を低下させることである［３］。後者のメカニズムは、現在、最新世代の抗脂質異常症薬の開発のための優先目標を表す。家族性高コレステロール血症治療のための抗ＰＣＳＫ９モノクローナル抗体が最近発売されたが、治療費が非常に高く、重大な副作用がある［２］。

【0006】

ＢＢＲの血糖降下作用に関しては、Ｔ２ＤＭ患者の血糖パラメータ（体重減少に関連する）、または多嚢胞性卵巣症候群患者の代謝パラメータの改善がかなりの数の臨床文献で実証されている。

【0007】

酵素ＡＭＰｋに関連する細胞エネルギー調節機構に対するＢＢＲの調節活性（これは、血中グルコース調節の最も重要かつ広く研究されている標的となっている）もまた、実証されている。

【0008】

経口投与後、ＢＢＲは腸内細菌叢により前体循環的に代謝され、主代謝物であるベルベルルビンを形成した後、肝臓で吸収されてＢＢＲに再変換され、胆道経路を介して排泄される［４］。

【0009】

したがって、肝臓は主な吸収代謝物であるベルベルルビンをＢＢＲに再変換することから、薬物動態及び薬力学の両面から、ＢＢＲの主な標的臓器であると考えられる。ＬＤＬ－Ｒ受容体（ＢＢＲの主な標的の１つ）は肝細胞で発現し、肝臓は糖代謝に必須の役割を果たし、ＢＢＲが胆汁を介して抱合・排泄される臓器である。

【0010】

また、ＢＢＲの肝活性は、in vivoの実験モデルにおいて、主にメタボリックシンドロームにより誘発される肥満に伴う脂肪変性をはじめ、肝実質に影響を及ぼす変性過程の制御においても有意であることが証明されている［５］。したがって、ＢＢＲは、特に健康全般および心血管リスクに深刻な結果をもたらす、前記症候群のいくつかの原因に対して作用するので、メタボリックシンドロームの第一線製品としてますます提示されるようになっている。

【0011】

ＢＢＲを使用する際の主な問題はその非常に低い経口吸収であり、これは、投与された用量の０．５％を超えず、その０．３６％のみが全身循環に到達する［６］。これは、腸管吸収不良、透過性糖タンパク質（Ｐｇｐ）による消失、細菌叢による体前代謝、肝代謝および胆汁排泄のいくつかの因子による。したがって、服薬コンプライアンスおよび消化器系の有害作用を犠牲にして、大量の投与(５００－２０００ｍｇ、１日数回）が必要である。

【0012】

ＢＢＲの血漿レベルを増大させるために、処方的アプローチあるいは腸細胞からＢＢＲを排除する特異的Ｐｇｐインヒビターの使用によるといった多くの試みがなされてきた。

【0013】

特に、科学文献から、Citrus spp由来のナリンギン［７］およびブドウ種由来のプロシアニジン［８］を含有するいくつかの植物抽出物が、Ｐｇｐ活性を阻害することが知られている。

【0014】

ヨーロッパ特許ＥＰ２１４９３７７［９］は、高血糖症の治療のための、ＢＢＲを含む組成物、またはシリマリンと組み合わせたＢＢＲを含む抽出物、またはシリマリンを含むSilybum marianum抽出物を含む組成物を記載している。

【0015】

しかしながら、ＢＢＲの経口生物学的利用能を増加させ、その治療指数を改善することができる製剤を得る必要性が依然として存在する。

【発明の概要】

【0016】

本発明は、以下を含む組成物に関する：
ａ）ベルベリン（ＢＢＲ）；
ｂ）エンドウ豆タンパク質；
ｃ）一つ以上の界面活性剤；および
ｄ）任意選択で、ヴィティス(Ｖｉｔｉｓ)種またはシトラス（Ｃｉｔｒｕｓ）種の植物抽出物またはそれらの組み合わせ。

【0017】

本発明はまた、前記組成物の調製方法、前記組成物を含む、医薬または栄養補助の製剤、ならびに脂質異常症、高コレステロール血症、メタボリックシンドロームおよび心血管疾患の予防および／または治療のための組成物の使用に関する。

【図面の簡単な説明】

【0018】

【図1】本発明によるエンドウ豆タンパク質およびレシチン（メタノール溶液、～０．１５ｍｇ／ｍｌ）と組み合わせたＢＢＲのサンプルのクロマトグラムを示す図である。

【図2】ＢＢＲ塩化物の標準溶液（メタノール溶液、～０．０５ｍｇ／ｍｌ）のクロマトグラムを示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0019】

ＢＢＲが少なくとも１つの界面活性剤の存在下でエンドウ豆タンパク質と組み合わされる場合、水溶液中のＢＢＲの溶解度は、ＢＢＲ単独の溶解度よりも大きいことが発見された。
ＢＢＲが、エンドウ豆タンパク質、界面活性剤およびヴィティス種の抽出物、好ましくはVitis vinifera抽出物、および／またはシトラス種の抽出物、好ましくはCitrus vinifera抽出物と連合している場合、さらなる増加が観察される。理論に束縛されるものではないが、少なくとも１つの界面活性剤の存在はＢＢＲ、エンドウ豆タンパク質、ならびにヴィティスおよび／またはシトラス種抽出物（使用される場合）の間の相乗的相互作用を促進し、これは次いで、ＢＢＲの溶解性および吸収の増加を生じると考えられる。

【0020】

第１の態様においては、本発明は、以下を含む組成物に関する：
ａ）ベルベリン（ＢＢＲ）；
ｂ）エンドウ豆タンパク質；
ｃ）一つ以上の界面活性剤；および
ｄ）任意選択で、ヴィティス(Ｖｉｔｉｓ)種またはシトラス（Ｃｉｔｒｕｓ）種の植物抽出物またはそれらの組み合わせ。

【0021】

本発明の目的のために、ＢＢＲは、Berberis aristata、Coptis chinensisまたはHydrastis canadensisの根、より好ましくはBerberis aristatataの根の水性抽出物からの水性抽出（水性抽出物）によって得ることができる抽出物の形態で使用することができる。水性抽出物は、好ましくは３０～７０％(ｗ/ｗ)の範囲の、より好ましくは５０％(ｗ/ｗ)のＢＢＲ含量を有する。抽出物は、根を粉砕すること、水性媒体中で抽出すること、沈殿させること、および乾燥させることを含む従来の方法によって得ることができる。

【0022】

さらにより好ましくは、ＢＢＲが樹脂カラム上の５０質量％水性抽出物のさらなる精製によって得ることができる、８５質量％を超えるベルベリン含量を有する抽出物(以下「純粋なＢＢＲ」と呼ぶ)の形態で使用することができる。

【0023】

本発明の実施形態にも適しているＢＢＲ抽出物および純粋なＢＢＲは例えば、Indian Herbs Extractionsから市販されている。
「エンドウ豆タンパク質」という表現は、乾燥エンドウ豆(Pisum sativum)からの水性抽出プロセスによって得られるタンパク質と同一視する。

【0024】

それらは、例えば、Roquette（フランス）から、Nutrulysの商標で市販されており、高い溶解性（５０％以上）、高い消化性、及びバランスのとれたアミノ酸プロファイルによって特徴づけられる。

【0025】

「ヴィティス種抽出物」という表現は、９０重量％を超えるプロアントシアニジン含有量を有するヴィティス種の１つ以上の抽出物を意味する。

【0026】

ＷＯ２００７／０１７０３７［１０］またはＥＰ０３４８７８１［１１］に記載されているようにして得られる、９５重量％以上のプロアントシアニジン含有量および５重量％以上１５重量％以下のカテキンおよびエピカテキン含有量を有するヴィティス・ビニフェラ種抽出物を使用することが好ましい。前記抽出物は、Ｅｎｏｖｉｔａの商標でIndena S.p.から市販されている。

【0027】

「シトラス種抽出物」という表現は、２５重量％以上のフラバノン含有量を有するシトラス種の１つ以上の抽出物を意味する。ＷＯ２０１０／０５５４９０［１２］に記載されているようにして得られる、２８重量％を超えるフランバノン含有量および低減されたフロコウマリン（ベルガプテンおよびベルガモチン）含有量を有するCitrus bergamia(ベルガモット・オレンジ抽出物）の抽出物を使用することが好ましい。

【0028】

ＢＢＲを含有する抽出物とエンドウ豆タンパク質との間の比は好ましくは１：１ｗ／ｗ～１０：１ｗ／ｗの範囲であり、より好ましくは４：１ｗ／ｗの量であり、または純粋なＢＢＲとエンドウ豆タンパク質との間の比は１：１ｗ／ｗ～１０：１ｗ／ｗの範囲であり、より好ましくは３：１ｗ／ｗの量である。
エンドウ豆タンパク質に加えて、ヴィティス種抽出物および／またはシトラス種抽出物を含有する本発明による組成物において、ＢＢＲまたは純粋なＢＢＲを含有する抽出物と、エンドウ豆タンパク質およびヴィティス種抽出物および／またはシトラス種抽出物の総重量との間の重量比は、１：１ｗ／ｗ～５：１ｗ／ｗの範囲である。
エンドウ豆タンパク質とヴィティス種抽出物および／またはシトラス種抽出物との間の比は、１：３ｗ／ｗ～３：１ｗ／ｗの範囲である。

【0029】

本発明の目的のために、「界面活性剤」という表現は、極性基（または頭部）および非極性基（または尾部）を含む１つ以上の薬理学的に許容される物質を意味する。本発明による組成物の調製に適した界面活性剤がノニオン性、カチオン性、アニオン性または両親媒性であり得、Remington：「the Science and Practice of Pharmacy」、第２２版、Pharmaceutical Press、2013に記載されているものから選択することができる。

【0030】

界面活性剤は、好ましくはリン脂質、スクロースエステル、ポリソルベート、ポリオキシエチレンヒマシ油誘導体、Ｄ－α－トコフェリル－ポリエチレングリコールスクシネート（ビタミンE TPGS)、またはそれらの混合物から選択される。

【0031】

より好ましくは、界面活性剤はレシチン、特にホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミンまたはそれらの混合物であり、さらにより好ましくは、レシチンは大豆またはヒマワリレシチンである。

【0032】

本発明による組成物において、界面活性剤は、ＢＢＲ抽出物または純粋なＢＢＲおよびエンドウ豆タンパク質の総重量の５～３０質量％の範囲の量で、ならびに使用される場合、ヴィティス種抽出物および／またはシトラス種抽出物中に存在する。

【0033】

本発明による組成物は、好ましくはシリマリンまたはシリマリンを含有するSilybum marianumの抽出物を含まない。

【0034】

本発明による組成物は植物起源の他の活性成分を含有することができるが、好ましい実施形態では組成物は以下からなる：
ａ）ＢＢＲ;
ｂ）エンドウ豆タンパク質；
ｃ）一つ以上の界面活性剤；
ｄ）および任意選択で、ヴィティス種またはシトラス種の植物抽出物またはそれらの組み合わせ。

【0035】

本発明による組成物は、錠剤、カプセル剤および顆粒剤のような経口投与用の製剤を得るのに適した薬学的に許容される賦形剤を任意選択で含有することができる。前記賦形剤は、例えば以下を含む：
・微結晶性セルロース、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム、マンニトール、マルトデキストリン、イソマルトまたはそれらの組み合わせなどの不溶性および可溶性希釈剤；
・二酸化ケイ素、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、またはそれらの組み合わせなどの潤滑剤および／または流動促進剤。

【0036】

これらおよびさらなる賦形剤は、Remington：「the Science and Practice of Pharmacy」、第２２版、Pharmaceutical Press、2013に記載されている。

【0037】

典型的には、製剤は、本発明による組成物を、好ましくは５００～２０００ｍｇの範囲の量、より好ましくは５００ｍｇの量、および少なくとも１つの賦形剤を含む。典型的には、本発明による組成物と剤形中の少なくとも１つの賦形剤との間の重量比が１：５～５：１ｗ／ｗの範囲である。

【0038】

第２の態様においては、本発明は、本発明による組成物および製剤を得るための方法［方法（Ｐ－１）］に関する。これらの組成物および製剤は、ＢＢＲ、エンドウ豆タンパク質、および任意選択でヴィティス種抽出物またはシトラス種抽出物および／または賦形剤を界面活性剤溶液または分散液に添加することによって得ることができる。ＢＢＲ、エンドウ豆タンパク質、および任意選択でヴィティス種抽出物またはシトラス種抽出物および／または賦形剤は、連続工程で、または単一工程で添加することができる。

【0039】

第１の好ましい方法［方法（Ｐ－１）］は、以下の工程を含む：
ａ－１）界面活性剤または界面活性剤の混合物を、好ましくはエチルアルコール、酢酸エチルおよびアセトンから選択される５０～１００容量の有機溶媒中に、溶液または均一な分散液が得られるまで可溶化または分散させる；
ｂ－１）工程ａ－１）で得られた溶液または分散液に、ＢＢＲ、および任意選択でヴィティス種抽出物および／またはシトラス種抽出物を添加し、好ましくは４０℃～７０℃、より好ましくは６０℃の範囲の温度に加熱して、分散液を得る；
ｃ－１）工程ｂ－１）で得られた分散液を室温に冷却し、分散液が得られるまで、好ましくは約１０～１５分間、撹拌下でエンドウ豆タンパク質を添加する；
ｄ－１）任意選択で工程ｃ－１）で得られた分散液に希釈剤、好ましくは微晶質セルロース、または希釈剤の混合物を添加する；
ｅ－１）工程ｃ－１）で得られた混合物から、好ましくは５０℃～７５℃、より好ましくは≦６５℃の範囲の温度を維持し、好ましくは１００～５００ｍｂａｒの間での低圧蒸発で溶媒を除去し、任意選択で、６０～６５℃の温度に設定されたストーブ内で真空下での乾燥を、好ましくは＜１．２質量％の溶媒残渣が得られるまでで停止させる；
ｆ－１）工程ｅ－１）の終わりに得られた組成物を１０メッシュ篩上で較正し、任意選択で、好ましくはステアリン酸、ステアリン酸マグネシウムおよび二酸化ケイ素、好ましくは二酸化ケイ素から選択される潤滑剤および／または流動促進剤を添加する。

【0040】

第２の好ましい方法［方法（Ｐ－２）］は、以下の工程を含む：
ａ－２）界面活性剤または界面活性剤の混合物を、好ましくはエチルアルコール、酢酸エチルおよびアセトン、好ましくはエチルアルコールから選択される５～１０容量の有機溶媒中に、溶液または均一な懸濁液が得られるまで可溶化または分散させる；
ｂ－２）工程ａ－２）で得られた溶液または懸濁液とは別に、ＢＢＲを含有する抽出物をエンドウ豆タンパク質、任意選択でヴィティス種抽出物および／またはシトラス種抽出物、および希釈剤、好ましくは微結晶セルロースと、均一な混合物が得られるまで、典型的には約５分間混合する；
ｃ－２）工程ｂ－２）で得られた混合物を工程ａ－２）で得られた溶液または懸濁液に加えて混合物を得、得られた混合物を約１０～１５分間撹拌下に保つ；
ｄ－２）工程ｃ－２）で得られた混合物を、真空下、約６０～６５℃の温度で、＜１．２質量％の残留溶媒含量が得られるまで、ストーブ乾燥する；
ｅ－２）工程ｄ－２）の終わりに得られた組成物を１０メッシュ篩上で較正し、任意選択で、好ましくはステアリン酸、ステアリン酸マグネシウムおよび二酸化ケイ素、好ましくは二酸化ケイ素から選択される１つ以上の滑沢剤および／または流動促進剤を添加する。

【0041】

本発明の目的のために、用語「溶液」は目視検査で透明に見える液体組成物を示し；用語「分散液」が目視検査で、懸濁粒子が存在し、不透明かつ曇って見える液体組成物を示し；用語「混合物」は、ソフトで可鍛性の溶液または分散液以外である、固体および液体の均一な混合物を示す。

【0042】

さらに、疑義を避けるために、本明細書及びクレームにおいて数値範囲が特定されている場合、その範囲の両端を含むものとみなす。

【0043】

ＢＢＲ、エンドウ豆タンパク質と任意のヴィティス種抽出物および／またはシトラス種抽出物との間の相乗的相互作用は、模擬胃液などの模擬生物学的流体における溶解度試験の手段によって検証することができる。試験は当業者に公知の方法によって、例えば、以下の実験の項に報告されるように、実施され得る。相互作用は、未結合ＢＢＲで得られる溶解度の少なくとも約３倍の溶解度の増加が観察された場合に起こったと考えられる。溶解度パラメータは、吸収の増加を予測すると考えられる。

【0044】

さらなる態様において、本発明は、特に脂質異常症、高コレステロール血症、メタボリックシンドロームおよび心血管疾患の予防および／または治療のための医薬としての組成物（Ｃ）の使用に関する。
以下の項に記載される実施例は、本発明をさらに説明する。

【実施例】

【0045】

原料
約５０％のＢＢＲ含量を有するBerberis aristataの根からの植物抽出物および純粋なＢＢＲは、Indian Herbs Extractions,Ramnagarから得た。

【0046】

エンドウ豆タンパク質は、フランスRoquetteから得た（Ｎｕｔｒａｌｙｓ）。

【0047】

Vitis vinifera抽出物は、Ｅｎｏｖｉｔａの商標でIndena S.p.から市販されており、水－アルコール抽出、ろ過、レジンカラム上での精製、および乾固によって得られる。

【0048】

Citrus vinifera (bergamot orange)抽出物は、H&AD Herbal and Antioxidant Derivativesから得た。

【0049】

大豆レシチンは、カーギル(R)から入手した。

【0050】

実施例による組成物中の成分のパーセンテージは、組成物の総重量の比として、重量で表される。

【0051】

製造例
実施例１ ５０質量％に滴定したＢＢＲ抽出物、エンドウ豆タンパク質およびレシチンを含有する組成物
５０質量％ＢＢＲ抽出物 ６０．０％
エンドウ豆タンパク質 １５．０％
レシチン １４．０％
ヒドロキシプロピルセルロース ５．０％
二酸化ケイ素 ２．０％
ポリソルベート８０ ４．０％
組成物は、以下の工程を含む、以下の方法（Ｐ－１）によって得られた。
工程１ ポリソルベート８０およびヒドロキシプロピルセルロースを、溶液が得られるまでエチルアルコールに溶解した。
工程２ ５０質量％に滴定したＢＢＲ抽出物を、磁気撹拌下で工程１で得られた溶液に添加し、分散液が得られるまで６０℃に加熱した。
工程３ 工程２で得られた分散液に、磁気撹拌下でレシチンを添加し、６０℃に加熱した。
工程４ 工程３で得られた分散液を室温まで冷却し、エンドウ豆タンパク質を添加して分散液を得た。
工程５ 温度を６５℃以下に維持しながら、工程４で得られた分散液から溶媒を低圧蒸発によって除去した。
工程６ 工程５で得られた生成物を、エチルアルコール残渣が１．２％未満になるまで６５℃で真空下でストーブ乾燥した。
工程７ 工程６で得られた生成物を１０メッシュ篩で較正し、５０メッシュ篩を通して予備篩分けした二酸化ケイ素を添加した。

【0052】

実施例２ ５０質量％に滴定したＢＢＲ抽出物、エンドウ豆タンパク質、レシチンおよびシトルス・ベルガミア抽出物を含有する組成物
５０質量％に滴定したＢＢＲ抽出物 ５４．６％
エンドウ豆タンパク質 １３．２％
レシチン １２．７％
Citrus bergamiaエキス ９．１％
ヒドロキシプロピルセルロース ５．０％
二酸化ケイ素 １．８％
ポリソルベート８０ ３．６％
この組成物は実施例１に記載した方法に従って得たが、Citrus bergamia抽出物も工程２で添加した点が異なる。

【0053】

実施例３ ５０質量％のＢＢＲ抽出物、エンドウ豆タンパク質、レシチンおよびVitis vinifera種抽出物を含有する組成物
５０質量％ＢＢＲ抽出物 ５４．６％
エンドウ豆タンパク質 １３．２％
レシチン １２．７％
Vitis vinifera種抽出物 ９．１％
ヒドロキシプロピルセルロース ５．０％
二酸化ケイ素 １．８％
ポリソルベート８０ ３．６％
組成物は、Vitis vinifera種抽出物も工程２で添加した点を除いて、実施例１に記載の方法に従って得た。

【0054】

実施例４ コーティング錠
実施例１の組成物 ５００．０ｍｇ
リン酸二カルシウム二水和物 ２００．０ｍｇ
マンニトール １５０．０ｍｇ
ポリビニルポリピロリドン ３０．０ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム １０．０ｍｇ
コロイドシリコンジオキシド １０．０ｍｇ
メチルセルロースベース塗料 ２０．０ｍｇ
実施例５ 硬質ゼラチンカプセル
実施例３の組成物 ５５０．０ｍｇ
結晶セルロース ６０．０ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム １０．０ｍｇ
コロイドシリコンジオキシド １０．０ｍｇ
実施例６ 水分散性顆粒
実施例２の組成物 ５５０．０ｍｇ
マルトデキストリン １２００．０ｍｇ
フルクトース ４２５．０ｍｇ
グアーガム ２００．０ｍｇ
オレンジ風味 １００．０ｍｇ
スクラロース ２０．０ｍｇ
コロイドシリコンジオキシド ５．０ｍｇ
評価
模擬生体液中での溶解度試験
溶解度試験は、等量のＢＢＲを含有するサンプルを比較することによって行った。

【0055】

実施例１、２および３に記載されるようにして製造された組成物を、純粋なＢＢＲ(参考例１）および５０質量％に滴定された３３％ＢＢＲ抽出物、６５％レシチンおよび２％二酸化ケイ素（参考例２）を含むがエンドウ豆タンパク質を含まない組成物と比較することによって評価し、模擬生体液中における溶解性の増加を評価した。

【0056】

分析は、以下のUPLC(高速液体クロマトグラフィー)法により行った。
装置：Waters Acquity UPLC H-Class System.
権限ソフトウェア(Empower System Enterprise Client/Server)。
カラム：固定相：Acquity UPL CSH C１８；寸法：ｌ＝１００ｍｍ；内径＝２．１ｍｍ；粒径：１．７μｍ；製造業者：Waters
移動相：溶媒Ａ：０．５％リン酸（ｗ／ｖ）；溶媒Ｂ：アセトニトリル
直線勾配

【0057】

【表1】

【0058】

分析条件：流速：０．４ｍｌ／分；検出：３４８ｎｍ。
可溶化溶媒：８０％メタノール
ブランク溶液：８０％メタノール
試料溶液：２００ｍｌ中３０ｍｇ（図１の～０．１５ｍｇ／ｍｌの典型的な試料のクロマトグラム）。
標準溶液：２００ｍｌのメタノール中の１０ｍｇの純粋な参照ＢＢＲ（標準溶液～０．０５ｍｇ／ｍｌ、図２の典型的なクロマトグラム）。
溶解度試験は、以下に報告するように調製した空腹状態模擬胃液(Fasted-State Simulated Gastric Fluid)(FaSSGF)を溶媒として用いて行った。
１)FaSSGF用ＮａＣｌ／ＨＣｌ溶液の調製（１リットル）：
２ｇのＮａＣｌを０．９ｌの精製水に溶解し、ＨＣｌでｐＨを１．６に調整し、混合物を精製水（１リットル）で容量調整した。
２)０．０６ｇの粉末* (FaSSGF-Biorelevant培地）を、室温で約５００ｍｌのＮａＣｌ／ＨＣｌ溶液に添加し、ＮａＣｌ／ＨＣｌ溶液で容量調整し（１ｌ）、透明なすぐに使用できる液体を得た。
註：* 最終タウロコール酸ナトリウム０．０８ｍＭ、最終レシチン０．０２ｍＭ
試験結果を下記表２に示す：

【0059】

【表2】

【0060】

表２に示す結果は、本発明による組成物が単独で使用されてもレシチンのみと組み合わされても、純粋なＢＢＲよりも模擬胃液中でより大きな溶解度を示すことを示している。
エンドウ豆タンパク質の添加は明らかに、溶解度のさらなる増加を生じる。Citrus bergamia抽出物またはVitis vinifera種抽出物の添加は、ＢＢＲの溶解度のさらなる増加を生じる。特に、ＢＢＲの溶解度はＢＢＲをエンドウ豆タンパク質およびレシチンのみと組み合わせた場合には約３倍増加するが、Citrus bergamia抽出物またはVitis vinifera種抽出物とも組み合わせた場合には約４倍増加する。これらの知見は、本発明による組成物がその腸吸収に対する最大の障害を構成する水性媒体中のＢＢＲの溶解度を増加させることを実証する。

【0061】

ＢＢＲ抽出物およびレシチンのみを含有する参照組成物、ならびに本発明によるＢＢＲを含有する組成物（実施例３に記載のＢＢＲ）の生物学的利用能および腸粘膜への影響の比較評価
トランスウェルインサート上の機能的単層として編成されたCaco２ヒト腸腺癌細胞（ＡＴＣＣ、ＨＴＢ―３７ＴＭ）に基づくヒト腸上皮のin vitroモデルを用いて、ＢＢＲの吸収と生物学的利用能を測定した。トランスウェルインサートの特徴は、頂端側（または管腔側）と基底側（または漿膜側）の２つのコンパートメントであり、微小孔性の膜で隔てられている。

【0062】

糖タンパク質－Ｐ（Ｐ－ｇｐ）のＢＢＲ吸収への関与の可能性を決定するために、腸細胞に吸収された広範囲の基質を腸管内腔に排出する膜ポンプである、選択的糖タンパク質-Ｐ(Ｐ-ｇｐ)阻害剤であるベラパミルの存在下でin vitro吸収実験を行った。

【0063】

in vitro吸収試験を実施する前に、５０質量％に滴定したＢＢＲ抽出物およびレシチンからなる組成物の用量（参考文献２）および実施例３の組成物の用量を、生理学的消化をシミュレートするin vitro消化プロセスに３時間曝露した。次いで、２つの消化された製剤を、インビトロで腸上皮の頂端区画に添加して、吸収試験を行った。表３に示すように、実施例３の組成物からのＢＢＲの吸収は、参考例２の組成物からのＢＢＲの吸収よりも有意に大きい。

【0064】

【表3】

【0065】

消化製剤への暴露後、腸上皮モデルの細胞生存率を、生存細胞によるＭＴＳテトラゾール化合物の還元に基づくＭＴＳアッセイで評価して、４９０ｎｍでの吸光度を測定することによって定量可能な着色産物ホルマザンを生成した。得られた用量（濃度（ｍｇ／ｍｌ））－応答（腸上皮の生存率％）値を以下の表４および５に示す。

【0066】

【表4】

【0067】

【表5】

【0068】

得られた用量応答値は、ＢＢＲの最大濃度（８．２ｍｇ／ｍＬ）で、参考文献２が腸上皮の生存率の４６．６％の減少を誘導し、実施例３の組成物によって誘導されたもの（２１．９％）よりも有意に大きいことを実証する。

【0069】

このことは本発明に基づく組成、特に実施例３に基づく組成は、Ｐ－ｇｐ阻害剤ベラパミレルが存在する場合には大豆たんぱく質と組み合わせない抽出物とは異なり、有効成分ＢＢＲのより高いバイオアクセシビリティを保証し、ＢＢＲの低腸内吸収におけるこの細胞メカニズムの重要性を確認するものであることを示している。

【0070】

さらに、ＢＢＲ濃度が等しい場合、腸粘膜の生存率がより高いことによって示されるように、実施例３による組成物は参考文献２よりも安全であることが証明され、したがって驚くべきことに、吸収の増加にもかかわらず、ＢＢＲに典型的な胃腸障害に対する潜在的な影響がより低くなることを確実にした。

【0071】

ラットにおける薬物動態試験
実施例１に記載の組成物を用いて得られる吸収の増加を評価するために、ラットに対して薬物動態試験を行った。試験は、３匹のSprague Dawleyラットに１００ｍｇ／ｋｇの純粋なＢＢＲに相当する１０００ｍｇ／ｋｇの実施例１に従った組成物、および１００ｍｇ／ｋｇの純粋なＢＢＲを３匹のラットに経口投与することによって行った。生成物を、可溶化剤として１重量％のメチルセルロースと共に蒸留水中で投与した。次いで、血液サンプルを、１５分、３０分、１時間、２時間、４時間および６時間後に、ヘパリン処理した試験管中で０．５ｍｌの体積に達するように、後頭静脈洞から採取した。

【0072】

このようにして得られたサンプルを、抽出し、グルクロニダーゼおよびアリールスルファターゼで処理した後、質量／質量分析検出器と組み合わせた標準的なＨＰＬＣ法によって分析した。

【0073】

等モル用量でのＢＢＲ抽出物の投与後に得られたものと比較して、ＢＢＲの最大血漿レベルの約６倍の増加が、予想外に見出された。

【0074】

化合物の全吸収を表す曲線下面積（ＡＵＣ）と比較して、約３倍の増加が観察された。
これらのデータは溶解度試験の予測値を実証し、インビボでの薬物動態パラメーターおよび生物学的利用能の改善を確認する。

【0075】

参考文献
１）Alberico Luigi Catapano、Berberine：脂質およびグルコース低下特性を有する植物アルカロイド：From in vitro evidence to clinical studies Atherosclerosis 第２４３巻、第２号、２０１５年１２月、４４９～４６１頁。
２）Anil Kumar、ベルベリンの最新の知識と薬理学的プロファイル、An update European Journal of Pharmacology 761（2015）288-297。
３）Jin～lwen Liu, ベルベリンによるＰＣＳＫ９転写の阻害は、ユビキチン-プロテアソーム分解経路を通じた肝ＨＮＦ１ａタンパク質発現のダウンレギュレーションに関与する、The Journal of Biological Chemistry vol.290, no．7、pp4047－4058、13，2015。
４）Jian-Dong Jiang、消化器官細菌叢によるベルベリンの腸吸収可能形態への変換、Scientific Reports |５：１２１５５|DOI: 10.1038/srep12155 2015。
５）Ting Guo、ベルベリンは食餌誘発肥満マウスにおいて肝脂肪化を改善し、肝・脂肪組織炎症を抑制する、Scientific Reports６：２２６１２（２０１６）
６）Xiao-Ying Long、その口腔生物学的利用能に焦点を当てたベルベリンの研究の進展、Fitoterapia 109（2016）274-282．。
７）De Castro、Whocely Victor et al、ラットにおけるタリノロールの腸管担体介在輸送に及ぼすグレープフルーツジュース、ナリンギン、ナリンゲニン、およびベルガモチンの影響、Journal of agricultural and food chemistry ５６．１２（２００８）：４８４０－４８４５。
８）Zhao、Bo－xin et al.、Ａ２７８０／Ｔ細胞におけるＮＦ－κＢおよびＭＡＰＫ／ＥＲＫのダウンレギュレーションを介したｐ－糖タンパク質関連多剤耐性のブドウ種プロシアニジン逆転はＹＢ－１活性を媒介した、PloS one 8.8（2013）：e71071。
９）EP２１４９３７７(Velleja Research SRL)、２０１０年２月３日公開、２０１６年９月１４日付与。
１０）WO２００７／０１７０３７（Ａ１)(Indena S.p.A.)、２００７年２月１５日公開。
１１）EP０３４８７８１(TECNOFARMACI S.p.A.およびINDENA S.p.A.)、１９９０年１月０３日公開、１９９２年９月３０日付与。
１２）WO２０１０／０５５４９０（Ａ１)(Herbal & Antioxidant Derivatives S.r.L.)(２０１０年５月２０日公開）。

【図1】

【図2】