特許 7490679 ＰＤ－１アゴニストおよびそれを使用する方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-05-17

(45)【発行日】2024-05-27

(54)【発明の名称】ＰＤ－１アゴニストおよびそれを使用する方法

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/28 20060101AFI20240520BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20240520BHJP

   A61P 3/10 20060101ALI20240520BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20240520BHJP

   A61P 37/06 20060101ALI20240520BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20240520BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20240520BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20240520BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240520BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20240520BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20240520BHJP

   C12N 15/63 20060101ALN20240520BHJP

【ＦＩ】

C07K16/28

A61K39/395 M

A61K39/395 U

A61P3/10

A61P29/00

A61P37/06

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C12N15/13 ZNA

C12P21/08

C12N15/63 Z

【請求項の数】 23

(21)【出願番号】P 2021572414

(86)(22)【出願日】2020-06-04

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2022-08-03

(86)【国際出願番号】 US2020036143

(87)【国際公開番号】W WO2020247648

(87)【国際公開日】2020-12-10

【審査請求日】2022-01-28

(31)【優先権主張番号】62/857,699

(32)【優先日】2019-06-05

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/863,193

(32)【優先日】2019-06-18

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/983,512

(32)【優先日】2020-02-28

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】521531344

【氏名又は名称】アナプティスバイオ インコーポレイティッド

(74)【代理人】

【識別番号】100080791

【弁理士】

【氏名又は名称】高島 一

(74)【代理人】

【識別番号】100136629

【弁理士】

【氏名又は名称】鎌田 光宜

(74)【代理人】

【識別番号】100125070

【弁理士】

【氏名又は名称】土井 京子

(74)【代理人】

【識別番号】100121212

【弁理士】

【氏名又は名称】田村 弥栄子

(74)【代理人】

【識別番号】100174296

【弁理士】

【氏名又は名称】當麻 博文

(74)【代理人】

【識別番号】100137729

【弁理士】

【氏名又は名称】赤井 厚子

(74)【代理人】

【識別番号】100151301

【弁理士】

【氏名又は名称】戸崎 富哉

(72)【発明者】

【氏名】ケーリー、マリリン

(72)【発明者】

【氏名】パームリー、スティーブン

(72)【発明者】

【氏名】モース、ロバート ピー．

(72)【発明者】

【氏名】ゴールド、グレゴリー エヌ．

(72)【発明者】

【氏名】フィッシャー、ジェニーン

(72)【発明者】

【氏名】ダール、マーティン エドワード

(72)【発明者】

【氏名】マリーノ、マーガレット ハバシュ

(72)【発明者】

【氏名】カラパンダ、ルーパル

【審査官】山▲崎▼ 真奈

(56)【参考文献】

【文献】特表２００６－５２１７８３（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１２－５０１６６９（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１３－５２１７６９（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列番号４７または少なくともそのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む免疫グロブリン重鎖可変領域と、配列番号４９または少なくともそのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域とを含む、抗ＰＤ－１結合剤。

【請求項2】

免疫グロブリン重鎖可変領域が、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、Ｍａｒｔｉｎ、ＩＧＭＴ、またはＡＨｏ番号付けに従って決定される配列番号４７の少なくともＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、免疫グロブリン軽鎖可変領域が、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、Ｍａｒｔｉｎ、ＩＧＭＴ、またはＡＨｏ番号付けに従って決定される配列番号４９の少なくともＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む、請求項１の抗ＰＤ－１結合剤。

【請求項3】

免疫グロブリン重鎖可変領域が、Ｋａｂａｔ番号付けに従って決定される以下のＣＤＲｓ：
ＣＤＲ１：配列番号６４、
ＣＤＲ２：配列番号６５、
ＣＤＲ３：配列番号６６
を含み、
免疫グロブリン軽鎖可変領域が、Ｋａｂａｔ番号付けに従って決定される以下のＣＤＲｓ：
ＣＤＲ１：配列番号６７、
ＣＤＲ２：配列番号６８、
ＣＤＲ３：配列番号６９
を含む、請求項１の抗ＰＤ－１結合剤。

【請求項4】

免疫グロブリン重鎖可変領域が、ＩＧＭＴ番号付けに従って決定される以下のＣＤＲｓ：
ＣＤＲ１：配列番号７０、
ＣＤＲ２：配列番号７１、
ＣＤＲ３：配列番号７２
を含み、
免疫グロブリン軽鎖可変領域が、ＩＧＭＴ番号付けに従って決定される以下のＣＤＲｓ：
ＣＤＲ１：配列番号７３、
ＣＤＲ２：配列番号７４、
ＣＤＲ３：配列番号７５
を含む、請求項１の抗ＰＤ－１結合剤。

【請求項5】

免疫グロブリン重鎖可変領域が配列番号４４、４７または６１～６３のいずれか１つに対して少なくとも９０％の配列同一性を含む、請求項１の抗ＰＤ－１結合剤。

【請求項6】

免疫グロブリン軽鎖可変領域が配列番号４８～５０のいずれか１つに対して少なくとも９０％の配列同一性を含む、
請求項１または５の抗ＰＤ－１結合剤。

【請求項7】

免疫グロブリン重鎖可変領域が配列番号４４、４７または６１～６３のいずれか１つを含む、請求項５または６の抗ＰＤ－１結合剤。

【請求項8】

免疫グロブリン軽鎖可変領域が配列番号４８～５０のいずれか１つを含む、請求項５～７のいずれかの抗ＰＤ－１結合剤。

【請求項9】

免疫グロブリン重鎖可変領域が配列番号４７に対して少なくとも９０％の配列同一性を含み；
免疫グロブリン軽鎖可変領域が配列番号４９に対して少なくとも９０％の配列同一性を含む、請求項１の抗ＰＤ－１結合剤。

【請求項10】

免疫グロブリン重鎖可変領域が配列番号４６に対して少なくとも９０％の配列同一性を含み；
免疫グロブリン軽鎖可変領域が配列番号５０に対して少なくとも９０％の配列同一性を含む、請求項１の抗ＰＤ－１結合剤。

【請求項11】

配列番号４７の免疫グロブリン重鎖可変領域、および配列番号４９の免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む、請求項１の抗ＰＤ－１結合剤。

【請求項12】

配列番号５１を含む免疫グロブリン重鎖、および配列番号５２を含む免疫グロブリン軽鎖を含む、請求項１の抗ＰＤ－１結合剤。

【請求項13】

抗ＰＤ－１結合剤が抗体、抗原結合抗体フラグメント、またはそれらのコンジュゲートである、請求項１～１２のいずれか一項の抗ＰＤ－１結合剤。

【請求項14】

抗ＰＤ－１結合剤がＦ（ａｂ’）_２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、または単鎖結合ポリペプチドである、請求項１～１１のいずれか一項の抗ＰＤ－１結合剤。

【請求項15】

抗ＰＤ－１結合剤が抗原提示細胞上のＦｃ受容体に結合するＩｇＧ Ｆｃ領域を含む、請求項１～１１のいずれか一項の抗ＰＤ－１結合剤。

【請求項16】

抗ＰＤ－１結合剤がＩｇＧ１のＦｃ領域またはＦｃγＲに結合する他のＦｃ領域を含む、請求項１～１２のいずれか一項の抗ＰＤ－１結合剤。

【請求項17】

（ａ）請求項１～１６のいずれか一項の抗ＰＤ－１結合剤、および（ｂ）薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。

【請求項18】

（１－１）配列番号４７または少なくともそのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む免疫グロブリン重鎖可変領域を含む、免疫グロブリン重鎖、
（１－２）配列番号４９または少なくともそのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む、免疫グロブリン軽鎖、または
（２）請求項１～１６のいずれかの抗ＰＤ－１結合剤
をコードする核酸。

【請求項19】

請求項１～１６のいずれかの抗ＰＤ－１結合剤を発現する細胞。

【請求項20】

請求項１～１６のいずれか一項の抗ＰＤ－１結合剤を製造する方法であって、該方法が、
（１）請求項１～１６のいずれかの抗ＰＤ－１結合剤をコードする核酸か、
（２－１）配列番号４７または少なくともそのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む免疫グロブリン重鎖可変領域を含む、免疫グロブリン重鎖をコードする核酸および
（２－２）配列番号４９または少なくともそのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む、免疫グロブリン軽鎖をコードする核酸か
を細胞において発現させることを含む、方法。

【請求項21】

哺乳動物における免疫応答を阻害するための、請求項１～１６のいずれかの抗ＰＤ－１結合剤、または請求項１７の医薬組成物。

【請求項22】

哺乳動物における炎症性または自己免疫障害を治療するための、請求項１～１６のいずれかの抗ＰＤ－１結合剤、または請求項１７の医薬組成物。

【請求項23】

炎症性または自己免疫障害が原発性胆汁性胆管炎（ＰＢＣ）、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）、白斑、ＡＮＣＡ血管炎、１型糖尿病、または非感染性ブドウ膜炎である、請求項２２の抗ＰＤ－１結合剤または医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願への相互参照
本特許出願は、２０１９年６月５日付で出願された米国仮特許出願６２／８５７，６９９号；２０１９年６月１８日付で出願された米国仮特許出願６２／８６３，１９３号；および２０２０年２月２８日付で出願された米国仮特許出願６２／９８３，５１２号の優先権を主張し、それらの全体の開示が、参照により本明細書に組み込まれる。

【背景技術】

【0002】

発明の背景
プログラム死１（ＰＤ－１）（プログラム細胞死１としても知られる）は、アポトーシスを受けているマウスＴ細胞株のサブトラクティブハイブリダイゼーションによって最初に同定された２６８アミノ酸のＩ型膜貫通タンパク質である（Ｉｓｉｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｅｍｂｏ Ｊ．，１１：３８８７－９５（１９９２））。ＰＤ－１は、Ｔ細胞レギュレーターのＣＤ２８／ＣＴＬＡ－４ファミリーのメンバーであり、活性化Ｔ細胞、Ｂ細胞、および骨髄系細胞上で発現すると報告されている（Ｇｒｅｅｎｗａｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２３：５１５－５４８（２００５）；およびＳｈａｒｐｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．，８：２３９－２４５（２００７））。

【0003】

ＰＤ－１の２つのリガンド、ＰＤリガンド１（ＰＤ－Ｌ１）およびＰＤリガンド２（ＰＤ－Ｌ２）が同定されており、これらの両方とも、Ｂ７タンパク質スーパーファミリーに属する（上記のＧｒｅｅｎｗａｌｄ ｅｔ ａｌ．）。ＰＤ－Ｌ１は、肺、心臓、胸腺、脾臓、および腎臓の細胞を含むさまざまな細胞型で発現する（例えば、Ｆｒｅｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．，１９２（７）：１０２７－１０３４（２０００）；およびＹａｍａｚａｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６９（１０）：５５３８－５５４５（２００２）を参照）。ＰＤ－Ｌ１の発現は、リポ多糖（ＬＰＳ）およびＧＭ－ＣＳＦ処理に応答してマクロファージおよび樹状細胞（ＤＣ）上で、並びにＴ細胞およびＢ細胞受容体を介したシグナル伝達時にＴ細胞およびＢ細胞上でアップレギュレートされる。ＰＤ－Ｌ１はまた、さまざまなマウスおよびヒトの腫瘍細胞株において発現する（例えば、Ｉｗａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ，９９（１９）：１２２９３－１２２９７（２００２）；およびＢｌａｎｋ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，６４（３）：１１４０－１１４５（２００４）を参照）。対照的に、ＰＤ－Ｌ２は、より制限された発現パターンを示し、主に抗原提示細胞（例えば、樹状細胞およびマクロファージ）およびいくつかの腫瘍細胞株（例えば、Ｌａｔｃｈｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２（３）：２６１－２３８（２００１））を参照）によって発現される。

【0004】

ＰＤ－１は、Ｔ細胞活性化を負に調節し、この阻害機能は、細胞質ドメインにおける免疫受容体チロシンベースのスイッチモチーフ（ＩＴＳＭ）に関連している（例えば、上記のＧｒｅｅｎｗａｌｄ ｅｔ ａｌ．；およびＰａｒｒｙ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．，２５：９５４３－９５５３（２００５）を参照）。ＰＤ－Ｌ１によって誘導されるＰＤ－１のクラスター化は、ＣＤ２８を優先的に脱リン酸化してＴ細胞機能を抑制するＳＨＰ２ホスファターゼのリクルートを誘導することが見出されている（Ｈｕｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３５５：１４２８－１４３３（２０１７））。ＰＤ－１の欠乏は、自己免疫に至り得る。例えば、Ｃ５７ＢＬ／６ ＰＤ－１ノックアウトマウスは、ループス様症候群を発症することが示されている（例えば、Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，１１：１４１－１１５１（１９９９）を参照）。ヒトにおいては、ＰＤ－１遺伝子における一塩基多型は、全身性エリテマトーデス、１型糖尿病、関節リウマチ、および多発性硬化症の進行の高い発生率に関連している（例えば、Ｎｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｉｓｓｕｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ，６２（６）：４９２－４９７（２００３）；Ｂｅｒｔｓｉａｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．，６０（１）：２０７－２１８（２００９）；Ｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅｔ．，１２１（２）：２２３－２３２（２００７）；Ｔａｈｏｏｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ． Ｅｘｐ． Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．，２９（５）：７６３－７６７（２０１１）；およびＫｒｏｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ． Ｎｅｕｒｏｌ．，５８（１）：５０－５７（２００５）を参照）。

【0005】

さまざまなタイプの癌を治療するための、および免疫増強のための（例えば、感染症を治療するための）ＰＤ－１活性を阻害することにおける最近の進歩にもかかわらず、負のシグナル伝達を促進し、ＰＤ－１アゴニストとして機能する、高親和性でＰＤ－１に結合するＰＤ－１結合剤（例えば、抗体）の需要がある。

【発明の概要】

【0006】

発明の簡単な要約
本発明は、アゴニスト性ＰＤ－１結合剤を提供する。一つの実施態様においては、ＰＤ－１結合剤は、免疫グロブリン重鎖可変領域および免疫グロブリン軽鎖可変領域を含み、ここで、該免疫グロブリン重鎖可変領域は：配列番号１を含むＣＤＲ１；配列番号２を含むＣＤＲ２；および配列番号３を含むＣＤＲ３を含み；該免疫グロブリン軽鎖可変領域は、配列番号４を含むＣＤＲ１；配列番号５を含むＣＤＲ２；および配列番号６を含むＣＤＲ３を含む。

【0007】

配列番号２４～３３のいずれか１つに対して少なくとも８０％、８５％若しくは９０％の配列同一性を有する免疫グロブリン重鎖可変領域、または少なくとも配列番号２４～３３のＣＤＲ領域を含む重鎖可変領域、および／あるいは配列番号３４若しくは３５に対して少なくとも８０％、８５％若しくは９０％の配列同一性を有する免疫グロブリン軽鎖可変領域、または少なくとも配列番号３４若しくは３５のＣＤＲ領域を含む軽鎖可変領域を含む抗ＰＤ－１結合剤もまた、提供される。

【0008】

別の一面においては、ＰＤ－１結合剤は、免疫グロブリン重鎖可変領域および免疫グロブリン軽鎖可変領域を含み、ここで、該免疫グロブリン重鎖可変領域は：配列番号７を含むＣＤＲ１；配列番号８を含むＣＤＲ２；および配列番号９を含むＣＤＲ３を含み；該免疫グロブリン軽鎖可変領域は、配列番号１０を含むＣＤＲ１；配列番号１１を含むＣＤＲ２；および配列番号１２を含むＣＤＲ３を含む。

【0009】

配列番号４３～４７若しくは６１～６３のいずれか１つに対して少なくとも８０％、８５％若しくは９０％の配列同一性を有する免疫グロブリン重鎖可変領域、または少なくともそれらのＣＤＲ領域を含む重鎖可変領域、および／あるいは配列番号４８～５０に対して少なくとも８０％、８５％若しくは９０％の配列同一性を有する免疫グロブリン軽鎖可変領域、または少なくともそれらのＣＤＲ領域を含む軽鎖可変領域を含む抗ＰＤ－１結合剤もまた、提供される。

【0010】

さらに、本発明は、前述の免疫グロブリンポリペプチドをコードする単離されたまたは精製された核酸配列、そのような核酸配列を含むベクター、前述の免疫グロブリンポリペプチドを含む単離されたＰＤ－１結合剤、そのようなＰＤ－１結合剤をコードする核酸配列、そのような核酸配列を含むベクター、そのようなベクターを含む単離された細胞、そのようなＰＤ－１結合剤またはそのようなベクターを薬学的に許容される担体とともに含む組成物、および有効量のそのような組成物を哺乳動物に投与することによって免疫応答を阻害し、哺乳動物における炎症性または自己免疫障害を治療する方法を提供する。

【図面の簡単な説明】

【0011】

図面のいくつかの図の簡単な説明

【図1】図１は、ヒトＰＤ－１で安定的にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞への抗ＰＤ－１抗体の結合の結果を示すグラフである。

【図2】図２は、カニクイザルＰＤ－１で安定的にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞への抗ＰＤ－１抗体の結合の結果を示すグラフである。

【図3】図３は、２日間の抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８活性化ヒト末梢血ＣＤ４^＋ Ｔ細胞への抗ＰＤ－１抗体の結合の結果を示すグラフである。

【図4】図４～７は、ＰＤ－１ ＣＨＯ－Ｋ１細胞への結合についてＰＤ－Ｌ１－ＦｃまたはＰＤ－Ｌ２－Ｆｃのいずれかと競合する抗ＰＤ－１抗体の試験結果を示すグラフである。 図４は、ヒトＰＤ－１で安定的にトランスフェクトしたＣＨＯ－Ｋ１細胞への結合についてＰＤ－Ｌ１－Ｆｃと競合する抗ＰＤ－１抗体の能力を示す、競合アッセイの結果を示すグラフである。

【図5】図５は、ヒトＰＤ－１で安定的にトランスフェクトしたＣＨＯ－Ｋ１細胞への結合についてＰＤ－Ｌ１－Ｆｃと競合する抗ＰＤ－１抗体の能力を示す、競合アッセイの結果を示すグラフである。

【図6】図６は、ヒトＰＤ－１で安定的にトランスフェクトしたＣＨＯ－Ｋ１細胞への結合についてＰＤ－Ｌ２－Ｆｃと競合する抗ＰＤ－１抗体の能力を示す、競合アッセイの結果を示すグラフである。

【図7】図７は、ヒトＰＤ－１で安定的にトランスフェクトしたＣＨＯ－Ｋ１細胞への結合についてＰＤ－Ｌ２－Ｆｃと競合する抗ＰＤ－１抗体の能力を示す、競合アッセイの結果を示すグラフである。

【図8】図８Ａは、２：１のビーズ対細胞比を使用するビーズベースのＣＤ４^＋ Ｔ細胞アゴニストアッセイにおける抗ＰＤ－１抗体のアゴニスト活性性能を示すグラフである。図８Ｂは、１：１のビーズ対細胞比を使用するビーズベースのＣＤ４^＋ Ｔ細胞アゴニストアッセイにおける抗ＰＤ－１抗体のアゴニスト活性性能を示すグラフである。

【図9】図９Ａは、４：１のビーズ対細胞比を使用するビーズベースのＣＤ４^＋ Ｔ細胞アゴニストアッセイにおける抗ＰＤ－１抗体のアゴニスト活性性能を示すグラフである。図９Ｂは、２：１のビーズ対細胞比を使用するビーズベースのＣＤ４^＋ Ｔ細胞アゴニストアッセイにおける抗ＰＤ－１抗体のアゴニスト活性性能を示すグラフである。図９Ｃは、１：１のビーズ対細胞比を使用するビーズベースのＣＤ４^＋ Ｔ細胞アゴニストアッセイにおける抗ＰＤ－１抗体のアゴニスト活性性能を示すグラフである。

【図10A】図１０Ａは、抗ＰＤ－１抗体についてのビーズベースのＣＤ４^＋ Ｔ細胞アゴニストアッセイにおける複数のドナーにわたるＩＦＮγ産生の平均％阻害を示すグラフである。

【図10B】図１０Ｂは、抗ＰＤ－１抗体の説明、ＩＦＮγの％阻害、および図１０Ａ中に含まれるドナーの数を提供するチャートである。

【図11A】図１１Ａは、抗ＰＤ－１抗体についてのビーズベースのＣＤ４^＋ Ｔ細胞アゴニストアッセイにおける複数のドナーにわたるＩＦＮγ産生の平均％阻害を示すグラフである。

【図11B】図１１Ｂは、参照ＰＤ－１アゴニスト、ＰＤ－Ｌ１－ＦｃについてのビーズベースのＣＤ４^＋ Ｔ細胞アゴニストアッセイにおける同じドナーにわたるＩＦＮγ産生の平均％阻害を示すグラフである。

【図11C】図１１Ｃは、候補抗体、抗体の説明、ＩＦＮγの％阻害、および図１１Ａおよび１１Ｂ中に含まれるドナーの数を提供するチャートである。

【図12A】図１２Ａは、プレートベースのヒトＰＢＭＣアゴニストアッセイ（ドナー＃７４７）におけるＩＬ－２産生を阻害することにおける抗ＰＤ－１抗体のアゴニスト効力を示すグラフである。

【図12B】図１２Ｂは、プレートベースのヒトＰＢＭＣアゴニストアッセイ（ドナー＃５００）におけるＩＬ－２産生を阻害することにおける抗ＰＤ－１抗体およびＰＤ－Ｌ１－Ｆｃのアゴニスト効力を示すグラフである。

【図13A】図１３Ａは、プレートベースのヒトＰＢＭＣアゴニストアッセイ（凍結ドナー＃５００）におけるＩＬ－２産生を阻害することにおける抗ＰＤ－１抗体およびＰＤ－Ｌ１－Ｆｃのアゴニスト効力を示すグラフである。

【図13B】図１３Ｂは、プレートベースのヒトＰＢＭＣアゴニストアッセイ（凍結ドナー＃５００）におけるＩＬ－２産生を阻害することにおける抗ＰＤ－１抗体およびＰＤ－Ｌ１－Ｆｃのアゴニスト効力を示すグラフである。

【図14A】図１４Ａは、プレートベースのヒトＰＢＭＣアゴニストアッセイ（凍結ドナー＃１２０２）におけるＩＬ－２産生を阻害することにおける抗ＰＤ－１抗体およびＰＤ－Ｌ１－Ｆｃのアゴニスト効力を示すグラフである。

【図14B】図１４Ｂは、プレートベースのヒトＰＢＭＣアゴニストアッセイ（凍結ドナー＃１２０２）におけるＩＬ－２産生を阻害することにおける抗ＰＤ－１抗体およびＰＤ－Ｌ１－Ｆｃのアゴニスト効力を示すグラフである。

【図15A】図１５Ａは、ヒト全血破傷風リコールアッセイにおけるＰＤ－Ｌ１－Ｆｃテトラマーの観察されたアゴニスト活性、およびブロッキング抗ＰＤ－Ｌ１／抗ＰＤ－Ｌ２の存在下におけるニボルマブのアゴニスト活性の欠如を示すグラフである。

【図15B】図１５Ｂは、ブロッキング抗ＰＤ－Ｌ１／抗ＰＤ－Ｌ２の存在下におけるヒト全血破傷風リコールアッセイにおけるＰＤ－１アゴニスト抗体の観察されたアゴニスト活性を示すグラフである。

【図15C】図１５Ｃは、ヒト全血破傷風リコールアッセイにおけるＩＦＮγに対するＷＴ ＩｇＧ１抗ＰＤ－１アゴニスト抗体の効果（閉じた三角形のデータポイント）を示すグラフである。

【図15D】図１５Ｄは、ヒト全血破傷風リコールアッセイにおけるＩＦＮγに対するＩｇＧ２アイソタイプ抗ＰＤ－１抗体の効果（白い三角形のデータポイント）を示すグラフである。

【図16A】図１６Ａは、本発明の実施態様による、実施例８中に記載されている移植片対宿主病研究のための異種ＮＳＧ／Ｈｕ－ＰＢＭＣマウスモデルの概略図である。

【図16B】図１６Ｂは、本発明の実施態様による、実施例８中に記載されているＮＳＧ／Ｈｕ－ＰＢＭＣ移植片対宿主病研究のタイムライン、投薬スケジュール、およびモデル群を示す概略図である。

【図16C】図１６Ｃは、抗ＰＤ－１抗体についての実施例８におけるＮＳＧ／Ｈｕ－ＰＢＭＣ移植片対宿主病研究の＞１０％体重減少までの時間の結果を示すグラフである。

【図16D】図１６Ｄは、抗ＰＤ－１抗体についての実施例８におけるＮＳＧ／Ｈｕ－ＰＢＭＣ移植片対宿主病研究の＞１０％体重減少までの時間の結果を示すグラフである。

【図17A】図１７Ａは、抗ＰＤ－１抗体の１０ｍｇ／ｋｇの静脈内または皮下単回投与後のカニクイザルにおける薬物動態特性を示すグラフである。

【図17B】図１７Ｂは、抗ＰＤ－１抗体の１０ｍｇ／ｋｇの静脈内または皮下単回投与後のカニクイザルにおける薬物動態特性を示すグラフである。

【図18A】図１８Ａは、抗ＰＤ－１抗体の１０ｍｇ／ｋｇの静脈内または皮下単回投与後のカニクイザルにおけるＣＤ３^＋ Ｔ細胞ＰＤ－１受容体占有率を示すグラフである。

【図18B】図１８Ｂは、抗ＰＤ－１抗体の１０ｍｇ／ｋｇの静脈内または皮下単回投与後のカニクイザルにおけるＣＤ３^＋ Ｔ細胞ＰＤ－１受容体占有率を示すグラフである。

【図19A】図１９Ａは、抗ＰＤ－１（上）、抗ＳＨＰ２（中央）、または抗ＳＨＰ１（下）のいずれかを用いたＰＤ－１免疫沈降物のイムノブロッティングの結果を示すＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルである。

【図19B】図１９Ｂは、図１９Ａにおいて示されるイムノブロットのデンシトメトリー定量化を示すグラフである。

【図20】図２０Ａは、ヒトＰＤ－Ｌ１細胞外結合ドメインの結晶構造の空間充填モデル（灰色）とドッキングされたヒトＰＤ－１細胞外ドメインの結晶構造のリボンモデル図（黒色）である。分子は、左下のＰＤ－１の膜近位領域に配向している。図２０Ｂは、ヒトＰＤ－Ｌ１細胞外結合ドメインの結晶構造の空間充填モデル（灰色）とドッキングされたヒトＰＤ－１細胞外ドメインの結晶構造のリボンモデル図（黒色）である。分子は、図２０Ａにおいて示される分子の図と比較して９０°回転しており、下部中央にＰＤ－１の膜近位領域を示す。

【図21A】図２１Ａは、ＩｇＧ１アイソタイプと比較した、ケラチノサイト抗原で刺激された円形脱毛症ドナーからのＰＢＭＣにおける分泌されたＩＦＮγに対するＩｇＧ１ ３．７Ｃ６抗ＰＤ－１抗体の効果を示すグラフである。

【図21B】図２１Ｂは、ＩｇＧ１アイソタイプテトラマーと比較した、ケラチノサイト抗原で刺激された円形脱毛症ドナーからのＰＢＭＣにおける分泌されたＩＦＮγに対するＰＤ－Ｌ１－ＩｇＧ１ Ｆｃテトラマーの効果を示すグラフである。

【図21C】図２１Ｃは、ケラチノサイト抗原で刺激された円形脱毛症ドナーから単離されたＰＢＭＣにおけるＩＦＮγスポット形成細胞（ＳＦＣ）の数に対するＩｇＧ１ ３．７Ｃ６抗ＰＤ－１抗体の効果を示すグラフである。

【図21D】図２１Ｄは、ケラチノサイト抗原で刺激された円形脱毛症ドナーから単離されたＰＢＭＣにおけるＩＦＮγスポット形成細胞（ＳＦＣ）の数に対するＰＤ－Ｌ１ ＩｇＧ１－Ｆｃテトラマーの効果を示すグラフである。

【図22】図２２Ａは、ＩｇＧ１アイソタイプと比較した、破傷風トキソイド特異的抗原リコールアッセイにおける分泌されたＩＮＦγに対するＩｇＧ１ ３．７Ｃ６抗ＰＤ－１抗体の効果を示すグラフである。図２２Ｂは、ＩｇＧ１アイソタイプと比較した、破傷風トキソイド特異的抗原リコールアッセイにおける分泌されたＩＬ－１７Ａに対するＩｇＧ１ ３．７Ｃ６抗ＰＤ－１抗体の効果を示すグラフである。

【図23A】図２３Ａは、ｉｇＧ１アイソタイプと比較した、メラノサイト抗原で刺激された円形脱毛症ドナーからのＰＢＭＣにおける分泌されたＩＦＮγに対するＩｇＧ１ ３．７Ｃ６抗ＰＤ－１抗体の効果を示すグラフである。

【図23B】図２３Ｂは、ＩｇＧ１アイソタイプテトラマーと比較した、メラノサイト抗原で刺激された円形脱毛症ドナーからのＰＢＭＣにおける分泌されたＩＦＮγに対するＰＤ－Ｌ１－ＩｇＧ１－Ｆｃテトラマーの効果を示すグラフである。

【図23C】図２３Ｃは、メラノサイト抗原で刺激された円形脱毛症ドナーから単離されたＰＢＭＣにおけるＩＦＮγ ＳＦＣの数に対するＩｇＧ１ ３．７Ｃ６抗ＰＤ－１抗体の効果を示すグラフである。

【図23D】図２３Ｄは、メラノサイト抗原で刺激された円形脱毛症ドナーから単離されたＰＢＭＣにおけるＩＦＮγ ＳＦＣの数に対するＰＤ－Ｌ１ ＩｇＧ１－Ｆｃテトラマーの効果を示すグラフである。

【図24A】図２４Ａは、本発明の実施態様による、実施例１５中に記載されている移植片対宿主病研究のための異種ＮＳＧ／Ｈｕ－ＰＢＭＣマウスモデルの概略図である。

【図24B】図２４Ｂは、本発明の実施態様による、実施例１５中に記載されているＮＳＧ／Ｈｕ－ＰＢＭＣ移植片対宿主病研究のタイムライン、投薬スケジュール、およびモデル群を示す概略図である。

【図24C】図２４Ｃは、抗ＰＤ－１アゴニストＩｇＧ１抗体３．７Ｃ６についての実施例１５におけるＮＳＧ／Ｈｕ－ＰＢＭＣ移植片対宿主病研究の死亡までの時間の結果を示すグラフである。

【図24D】図２４Ｄは、研究期間中のアイソタイプ対照についての個々の動物の研究の開始からのパーセント体重変化の結果を示すグラフである。

【図24E】図２４Ｅは、研究期間中の３０ｍｇ／ｋｇ投与量での抗ＰＤ－１アゴニストＩｇＧ１抗体３．７Ｃ６についての個々の動物の研究の開始からのパーセント体重変化の結果を示すグラフである。

【図24F】図２４Ｆは、研究期間中の１０ｍｇ／ｋｇ投与量での抗ＰＤ－１アゴニストＩｇＧ１抗体３．７Ｃ６についての個々の動物の研究の開始からのパーセント体重変化の結果を示すグラフである。

【図24G】図２４Ｇは、研究期間中の３ｍｇ／ｋｇ投与量での抗ＰＤ－１アゴニストＩｇＧ１抗体３．７Ｃ６についての個々の動物の研究の開始からのパーセント体重変化の結果を示すグラフである。

【図24H】図２４Ｈは、研究期間中の陽性対照ＣＴＬＡ－４－Ｉｇについての個々の動物の研究の開始からのパーセント体重変化の結果を示すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0012】

発明の詳細な説明
本発明は、ＰＤ－１結合剤を提供する。上記で論じたように、プログラム死１（ＰＤ－１）（プログラム細胞死１としても知られる）は、２６８アミノ酸のＩ型膜貫通タンパク質である（上記のＩｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．）。ＰＤ－１は、Ｔ細胞レギュレーターのＣＤ２８／ＣＴＬＡ－４ファミリーのメンバーであり、活性化Ｔ細胞、Ｂ細胞、および骨髄系細胞上で発現すると報告されている（上記のＧｒｅｅｎｗａｌｄ ｅｔ ａｌ．；および上記のＳｈａｒｐｅ ｅｔ ａｌ．）。ＰＤ－１は、短い細胞外茎によって伴われる細胞外ＩｇＶドメイン、膜貫通領域および細胞内テールを含む。ＰＤ－１細胞内テールは、リン酸化されたときにチロシンホスファターゼをリクルートすることによってＴ細胞受容体シグナル伝達を負に調節するように機能する（例えば、上記のＩｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．；および上記のＢｌａｎｋブランク ｅｔ ａｌ．を参照）、免疫受容体チロシンベースの阻害モチーフおよび免疫受容体チロシンベースのスイッチモチーフに位置する２つのリン酸化部位を含有する。

【0013】

いくつかの実施態様においては、本明細書において提供されるＰＤ－１結合剤は、アゴニストであり、これは、ＰＤ－１結合剤がＰＤ－１に結合するが、ＰＤ－１のＰＤ－１リガンドへの結合を有意には阻害せず、それにより、Ｔ細胞受容体シグナル伝達を負に調節するＰＤ－１の能力を維持することを意味する。特定の実施態様によれば、本明細書において提供されるＰＤ－１結合剤は、Ｔ細胞受容体シグナル伝達を負に調節し、免疫応答を抑制するＰＤ－１の能力を誘導するまたは刺激することができる。特定の実施態様においては、ヒトＰＤ１の残基３３～４１（配列：ＮＰＰＴＦＳＰＡＬ）および／またはヒトＰＤ－１の９６～１１０（配列：ＲＶＴＱＬＰＮＧＲＤＦＨＭＳＶ）を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなるエピトープでＰＤ－１に結合するＰＤ－１結合剤が、提供される。

【0014】

ＰＤ－１結合剤は、免疫グロブリン重鎖可変領域および免疫グロブリン軽鎖可変領域を含み、これらのそれぞれは、通常ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３として呼ばれる３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。ＣＤＲ領域はまた、命名法においてそれぞれ重または軽鎖を示す「Ｈ」または「Ｌ」を使用して、すなわち、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、またはＣＤＲＬ３と呼ばれる。所与のＩｇ配列のＣＤＲは、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、Ｍａｒｔｉｎ（Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｃｈｏｔｈｉａ）、ＩＧＭＴ、またはＡＨｏなどのいくつかの従来の番号付けスキームのいずれによっても決定することができる（例えば、Ｋａｂａｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｕ．Ｓ． Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ（１９９１）；Ｃｈｏｔｈｉａ，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｏｎｉｃａｌ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ Ｒｅｇｉｏｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ，Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．，１９６：９０１－９１７（１９８７）；Ａｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｎｏｎｉｃａｌ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ，Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．，２７３：９２７－９４８（１９９７）；Ａｂｈｉｎａｎｄａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔｓ ｔｏ Ｋａｂａｔ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｌｙ Ｃｏｒｒｅｃｔ Ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｖａｒｉａｂｌｅ Ｄｏｍａｉｎｓ，Ｍｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．，４５：３８３２－３８３９（２００８）；Ｌｅｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ ＩＭＧＴ ｕｎｉｑｕｅ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ ｆｏｒ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ，Ｔ ｃｅｌｌ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ａｎｄ Ｉｇ－ｌｉｋｅ ｄｏｍａｉｎｓ，Ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｓｔ，７：１３２－１３６（１９９９）；Ｌｅｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ．，ＩＭＧＴ ｕｎｉｑｕｅ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ ｆｏｒ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ａｎｄ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎｓ ａｎｄ Ｉ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ Ｖ－ｌｉｋｅ ｄｏｍａｉｎｓ，Ｄｅｖ． Ｃｏｍｐ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２７：５５－７７（２００３）；およびＨｏｎｅｇｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｙｅｔ ａｎｏｔｈｅｒ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ ｓｃｈｅｍｅ ｆｏｒ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎｓ：ａｎ ａｕｔｏｍａｔｉｃ ｍｏｄｅｌｉｎｇ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｔｏｏｌ，Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ３０９：６５７－６７０（２００１）を参照）。

【0015】

本発明の一つの一面によれば、ＰＤ－１結合剤の免疫グロブリン重鎖可変領域は、配列番号１を含むＣＤＲ１；配列番号２を含むＣＤＲ２；および配列番号３を含むＣＤＲ３を含み；免疫グロブリン軽鎖可変領域は、配列番号４を含むＣＤＲ１；配列番号５を含むＣＤＲ２；および配列番号６を含むＣＤＲ３を含む。いくつかの実施態様においては、重鎖ＣＤＲ１は、配列番号１３～１８のいずれか１つを含む。さらに、またはあるいは、重鎖ＣＤＲ３のいくつかの実施態様は、配列番号１９～２１のいずれか１つを含む。さらに、軽鎖ＣＤＲ１は、配列番号２２または２３を含み得る。

【0016】

特定の実施態様においては、ＰＤ－１結合剤は、配列番号２４～３３のいずれか１つの免疫グロブリン重鎖可変領域、または配列番号２４～３３のいずれか１つに対して少なくとも８０％、８５％、若しくは９０％の配列同一性（例えば、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含み得る。他の実施態様においては、ＰＤ－１結合剤は、配列番号２４～３３のいずれかのＣＤＲを含む免疫グロブリン重鎖可変領域を含み、ここで、該ＣＤＲは、上記で提供されるとおりであるかまたはさまざまな既知の免疫グロブリンの番号付けスキーム（例えば、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、Ｍａｒｔｉｎ（Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｃｈｏｔｈｉａ）、ＩＧＭＴ、またはＡＨｏ）のいずれかによって決定されるとおりである。任意に、配列番号２４～３３のいずれかのＣＤＲを含む免疫グロブリン重鎖可変領域はまた、配列番号２４～３３のいずれかに対して少なくとも８０％、８５％、または９０％の配列同一性（例えば、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を有する。

【0017】

上記のＩｇ重鎖可変領域に加えて、またはあるいは、抗ＰＤ－１結合剤は、配列番号３４若しくは３５の免疫グロブリン軽鎖可変領域、または配列番号３４若しくは３５に対して少なくとも８０％、８５％、若しくは９０％の配列同一性（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含み得る。他の実施態様においては、ＰＤ－１結合剤は、配列番号３４または３５のＣＤＲを含む免疫グロブリン軽鎖可変領域を含み、ここで、該ＣＤＲは、上記で提供されるとおりであるかまたはさまざまな既知の免疫グロブリン番号付けスキーム（例えば、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、Ｍａｒｔｉｎ（Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｃｈｏｔｈｉａ）、ＩＧＭＴ、またはＡＨｏ）のいずれかによって決定されるとおりである。任意に、配列番号３４または３５のＣＤＲを含む免疫グロブリン軽鎖可変領域はまた、配列番号３４または３５に対して少なくとも８０％、８５％、または９０％の配列同一性（例えば、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を有する。

【0018】

一つの実施態様によれば、ＰＤ－１結合剤は、配列番号２９の免疫グロブリン重鎖可変領域またはそれに対して少なくとも８０％、８５％、若しくは９０％の配列同一性（例えば、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列；あるいは少なくとも配列番号２９のＣＤＲを含む免疫グロブリン重鎖可変領域（ここで、ＣＤＲ領域は、上記で提供されるとおりである（例えば、ＣＤＲ１－配列番号１５、ＣＤＲ２－配列番号２、およびＣＤＲ３－配列番号２０）かまたはさまざまな既知の免疫グロブリン番号付けスキーム（例えば、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、Ｍａｒｔｉｎ（Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｃｈｏｔｈｉａ）、ＩＧＭＴ、またはＡＨｏ）のいずれかによって決定されるとおりである）；および配列番号３５の免疫グロブリン軽鎖可変領域またはそれに対して少なくとも８０％、８５％、若しくは９０％の配列同一性（例えば、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列、あるいは少なくとも配列番号３５のＣＤＲを含む免疫グロブリン軽鎖可変領域（ここで、ＣＤＲ領域は、上記で提供されるとおりである（例えば、ＣＤＲ１－配列番号２３、ＣＤＲ２－配列番号５、およびＣＤＲ３－配列番号６）かまたはさまざまな既知の免疫グロブリン番号付けスキーム（例えば、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、Ｍａｒｔｉｎ（Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｃｈｏｔｈｉａ）、ＩＧＭＴ、またはＡＨｏ）のいずれかによって決定されるとおりである）を含み得る。いくつかの実施態様においては、抗体は、配列番号２９の重鎖可変領域および配列番号３５の軽鎖可変領域、または少なくともＫａｂａｔによって決定されるそれらのＣＤＲを含む。いくつかの実施態様においては、抗体は、配列番号２９の重鎖可変領域および配列番号３５の軽鎖可変領域、または少なくともＣｈｏｔｈｉａによって決定されるそれらのＣＤＲを含む。いくつかの実施態様においては、抗体は、配列番号２９の重鎖可変領域および配列番号３５の軽鎖可変領域、または少なくともＭａｒｔｉｎによって決定されるそれらのＣＤＲを含む。いくつかの実施態様においては、抗体は、配列番号２９の重鎖可変領域および配列番号３５の軽鎖可変領域、または少なくともＩＧＭＴによって決定されるそれらのＣＤＲを含む。いくつかの実施態様においては、抗体は、配列番号２９の重鎖可変領域および配列番号３５の軽鎖可変領域、または少なくともＡＨｏによって決定されるそれらのＣＤＲを含む。さらなる例として、抗ＰＤ－１結合剤は、配列番号３６を含む免疫グロブリン重鎖および配列番号３７を含む免疫グロブリン軽鎖、またはそれぞれ配列番号３６および３７に対して少なくとも８０％、８５％、若しくは９０％の配列同一性（例えば、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含み得、任意にここで、該配列は、それぞれ配列番号３６および３７の重鎖および軽鎖ＣＤＲを保持し、ここで、該ＣＤＲは、上記で提供されるとおりであるかまたはさまざまな既知の免疫グロブリン番号付けスキーム（例えば、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、Ｍａｒｔｉｎ（Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｃｈｏｔｈｉａ）、ＩＧＭＴ、またはＡＨｏ）のいずれかによって決定されるとおりである。

【0019】

別の実施態様によれば、ＰＤ－１結合剤は、配列番号２４の免疫グロブリン重鎖可変領域またはそれに対して少なくとも８０％、８５％、若しくは９０％の配列同一性（例えば、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、またはそれに１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列；あるいは少なくとも配列番号２４のＣＤＲを含む免疫グロブリン重鎖可変領域（ここで、ＣＤＲ領域は、上記で提供されるとおりである（例えば、ＣＤＲ１－配列番号１３、ＣＤＲ２－配列番号２、およびＣＤＲ３－配列番号１９）かまたはさまざまな既知の免疫グロブリン番号付けスキーム（例えば、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、Ｍａｒｔｉｎ（Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｃｈｏｔｈｉａ）、ＩＧＭＴ、またはＡＨｏ）のいずれかによって決定されるとおりである）；および配列番号３４の免疫グロブリン軽鎖可変領域またはそれに対して少なくとも８０％、８５％、若しくは９０％の配列同一性（例えば、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列、あるいは少なくとも配列番号３４のＣＤＲを含む免疫グロブリン軽鎖可変領域（ここで、ＣＤＲ領域は、上記で提供されるとおりである（例えば、ＣＤＲ１－配列番号２２、ＣＤＲ２－配列番号５、およびＣＤＲ３－配列番号６）かまたはさまざまな既知の免疫グロブリン番号付けスキーム（例えば、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、Ｍａｒｔｉｎ（Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｃｈｏｔｈｉａ）、ＩＧＭＴ、またはＡＨｏ）のいずれかによって決定されるとおりである）を含み得る。いくつかの実施態様においては、抗体は、配列番号２４の重鎖可変領域および配列番号３４の軽鎖可変領域、または少なくともＫａｂａｔによって決定されるそれらのＣＤＲを含む。いくつかの実施態様においては、抗体は、配列番号２４の重鎖可変領域および配列番号３４の軽鎖可変領域、または少なくともＣｈｏｔｈｉａによって決定されるそれらのＣＤＲを含む。いくつかの実施態様においては、抗体は、配列番号２４の重鎖可変領域および配列番号３４の軽鎖可変領域、または少なくともＭａｒｔｉｎによって決定されるそれらのＣＤＲを含む。いくつかの実施態様においては、抗体は、配列番号２４の重鎖可変領域および配列番号３４の軽鎖可変領域、または少なくともＩＧＭＴによって決定されるそれらのＣＤＲを含む。いくつかの実施態様においては、抗体は、配列番号２４の重鎖可変領域および配列番号３４の軽鎖可変領域、または少なくともＡＨｏによって決定されるそれらのＣＤＲを含む。

【0020】

一つの実施態様によれば、ＰＤ－１結合剤は、配列番号３０の免疫グロブリン重鎖可変領域またはそれに対して少なくとも８０％、８５％、若しくは９０％の配列同一性（例えば、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列；あるいは少なくとも配列番号３０のＣＤＲを含む免疫グロブリン重鎖可変領域（ここで、ＣＤＲ領域は、上記で提供されるとおりである（例えば、ＣＤＲ１－配列番号１５、ＣＤＲ２－配列番号２、およびＣＤＲ３－配列番号２１）かまたはさまざまな既知の免疫グロブリン番号付けスキーム（例えば、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、Ｍａｒｔｉｎ（Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｃｈｏｔｈｉａ）、ＩＧＭＴ、またはＡＨｏ）のいずれかによって決定されるとおりである）；および配列番号３５の免疫グロブリン軽鎖可変領域またはそれに対して少なくとも８０％、８５％、若しくは９０％の配列同一性（例えば、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、それに対して少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列、あるいは少なくとも配列番号３５のＣＤＲを含む免疫グロブリン軽鎖可変領域（ここで、ＣＤＲ領域は、上記で提供されるとおりである（例えば、ＣＤＲ１－配列番号２３、ＣＤＲ２－配列番号５、およびＣＤＲ３－配列番号６）かまたはさまざまな既知の免疫グロブリン番号付けスキーム（例えば、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、Ｍａｒｔｉｎ（Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｃｈｏｔｈｉａ）、ＩＧＭＴ、またはＡＨｏ）のいずれかによって決定されるとおりである）を含み得る。いくつかの実施態様においては、抗体は、配列番号３０の重鎖可変領域および配列番号３５の軽鎖可変領域、または少なくともＫａｂａｔによって決定されるそれらのＣＤＲを含む。いくつかの実施態様においては、抗体は、配列番号３０の重鎖可変領域および配列番号３５の軽鎖可変領域、または少なくともＣｈｏｔｈｉａによって決定されるそれらのＣＤＲを含む。いくつかの実施態様においては、抗体は、配列番号３０の重鎖可変領域および配列番号３５の軽鎖可変領域、または少なくともＭａｒｔｉｎによって決定されるそれらのＣＤＲを含む。いくつかの実施態様においては、抗体は、配列番号３０の重鎖可変領域および配列番号３５の軽鎖可変領域、または少なくともＩＧＭＴによって決定されるそれらのＣＤＲを含む。いくつかの実施態様においては、抗体は、配列番号３０の重鎖可変領域および配列番号３５の軽鎖可変領域、または少なくともＡＨｏによって決定されるそれらのＣＤＲを含む。

【0021】

別の一面によれば、抗ＰＤ－１結合剤は、配列番号７を含むＣＤＲ１；配列番号８を含むＣＤＲ２；および配列番号９を含むＣＤＲ３を含む免疫グロブリン重鎖可変領域；並びに配列番号１０を含むＣＤＲ１；配列番号１１を含むＣＤＲ２；および配列番号１２を含むＣＤＲ３を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む。いくつかの実施態様においては、重鎖ＣＤＲ１は、配列番号５７～６０のいずれかを含む。いくつかの実施態様においては、重鎖ＣＤＲ２は、配列番号３８～４２のいずれか１つを含む。

【0022】

いくつかの実施態様においては、ＰＤ－１結合剤は、配列番号４３～４７若しくは６１～６３のいずれか１つの免疫グロブリン重鎖可変領域、または配列番号４３～４７若しくは６１～６３のいずれか１つに対して少なくとも８０％、８５％、若しくは９０％の配列同一性（例えば、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様においては、ＰＤ－１結合剤は、配列番号４３～４７または６１～６３のいずれかのＣＤＲを含む免疫グロブリン重鎖可変領域を含み、ここで、該ＣＤＲは、上記で提供されるとおりであるかまたはさまざまな既知の免疫グロブリン番号付けスキーム（例えば、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、Ｍａｒｔｉｎ（Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｃｈｏｔｈｉａ）、ＩＧＭＴ、またはＡＨｏ）のいずれかによって決定されるとおりである。任意に、配列番号４３～４７または６１～６３のいずれかのＣＤＲを含む免疫グロブリン重鎖可変領域はまた、配列番号４３～４７または６１～６３のいずれか１つに対して少なくとも８０％、８５％、または９０％の配列同一性（例えば、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性）を有する。

【0023】

上記のＩｇ重鎖可変領域（例えば、配列番号４３～４７または６１～６３）に加えて、またはあるいは、抗ＰＤ－１結合剤は、配列番号４８～５０のいずれかの免疫グロブリン軽鎖可変領域、または配列番号４８～５０のいずれか１つに対して少なくとも８０％、８５％、若しくは９０％の配列同一性（例えば、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性）のアミノ酸配列を含み得る。他の実施態様においては、ＰＤ－１結合剤は、配列番号４８～５０のいずれかのＣＤＲを含む免疫グロブリン軽鎖可変領域を含み、ここで、該ＣＤＲは、上記で提供されるとおりであるかまたはさまざまな既知の免疫グロブリン番号付けスキーム（例えば、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、Ｍａｒｔｉｎ（Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｃｈｏｔｈｉａ）、ＩＧＭＴ、またはＡＨｏ）のいずれかによって決定されるとおりである。任意に、配列番号４８～５０のいずれかのＣＤＲを含む免疫グロブリン軽鎖可変領域はまた、配列番号４８～５０のいずれかに対して少なくとも８０％、８５％、または９０％の配列同一性（例えば、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を有する。

【0024】

特定の実施形態においては、抗ＰＤ－１結合剤は、配列番号４７の免疫グロブリン重鎖可変領域、または配列番号４７に対して少なくとも８０％、８５％、若しくは９０％の配列同一性（例えば、 。、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列；あるいは少なくとも配列番号４７のＣＤＲを含む免疫グロブリン重鎖可変領域（ここで、ＣＤＲ領域は、上記で提供されるとおりである（例えば、ＣＤＲ１－配列番号５７、ＣＤＲ２－配列番号４２、およびＣＤＲ３－配列番号９）かまたはさまざまな既知の免疫グロブリン番号付けスキーム（例えば、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、Ｍａｒｔｉｎ（Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｃｈｏｔｈｉａ）、ＩＧＭＴ、またはＡＨｏ）のいずれかによって決定されるとおりである）；および配列番号４９の免疫グロブリン軽鎖可変領域、または配列番号４９に対して少なくとも８０％、８５％、若しくは９０％の配列同一性（例えば、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列；あるいは少なくとも配列番号４９のＣＤＲを含む免疫グロブリン重鎖可変領域（ここで、ＣＤＲ領域は、上記で提供されるとおりである（例えば、ＣＤＲ１－配列番号１０、ＣＤＲ２－配列番号１１、およびＣＤＲ３－配列番号１２）かまたはさまざまな既知の免疫グロブリン番号付けスキーム（例えば、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、Ｍａｒｔｉｎ（Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｃｈｏｔｈｉａ）、ＩＧＭＴ、またはＡＨｏ）のいずれかによって決定されるとおりである。いくつかの実施態様においては、抗体は、配列番号４７の重鎖可変領域および配列番号４９の軽鎖可変領域、または少なくともＫａｂａｔによって決定されるそれらのＣＤＲを含む。いくつかの実施態様においては、抗体は、配列番号４７の重鎖可変領域および配列番号４９の軽鎖可変領域、または少なくともＣｈｏｔｈｉａによって決定されるそれらのＣＤＲを含む。いくつかの実施態様においては、抗体は、配列番号４７の重鎖可変領域および配列番号４９の軽鎖可変領域、または少なくともＭａｒｔｉｎによって決定されるそれらのＣＤＲを含む。いくつかの実施態様においては、抗体は、配列番号４７の重鎖可変領域および配列番号４９の軽鎖可変領域、または少なくともＩＧＭＴによって決定されるそれらのＣＤＲを含む。いくつかの実施態様においては、抗体は、配列番号４７の重鎖可変領域および配列番号４９の軽鎖可変領域、または少なくともＡＨｏによって決定されるそれらのＣＤＲを含む。さらなる例として、抗ＰＤ－１結合剤は、配列番号５１を含む免疫グロブリン重鎖および配列番号５２を含む免疫グロブリン軽鎖、または配列番号５１および５２に対して少なくとも８０％、８５％、若しくは９０％の配列同一性（例えば、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性）のアミノ酸配列を含み得、任意にここで、該配列は、上記で提供されるとおりのまたはさまざまな既知の免疫グロブリン番号付けスキーム（例えば、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、Ｍａｒｔｉｎ（Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｃｈｏｔｈｉａ）、ＩＧＭＴ、またはＡＨｏ）のいずれかに従って決定さるとおりの配列番号５１および５２の重鎖および軽鎖ＣＤＲを保持する。

【0025】

別の実施態様においては、抗ＰＤ－１結合剤は、配列番号４６の免疫グロブリン重鎖可変領域、または配列番号４６に対して少なくとも８０％、８５％、若しくは９０％の配列同一性（例えば、 。、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列；あるいは少なくとも配列番号４６のＣＤＲを含む免疫グロブリン重鎖可変領域（ここで、ＣＤＲ領域は、上記で提供されるとおりである（例えば、ＣＤＲ１－配列番号５７、ＣＤＲ２－配列番号４１、およびＣＤＲ３－配列番号９）かまたはさまざまな既知の免疫グロブリン番号付けスキーム（例えば、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、Ｍａｒｔｉｎ（Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｃｈｏｔｈｉａ）、ＩＧＭＴ、またはＡＨｏ）のいずれかによって決定されるとおりである）；および配列番号５０の免疫グロブリン軽鎖可変領域、または配列番号５０に対して少なくとも８０％、８５％、若しくは９０％の配列同一性（例えば、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列；あるいは少なくとも配列番号５０のＣＤＲを含む免疫グロブリン重鎖可変領域（ここで、ＣＤＲ領域は、上記で提供されるとおりである（例えば、ＣＤＲ１－配列番号１０、ＣＤＲ２－配列番号１１、およびＣＤＲ３－配列番号１２）かまたはさまざまな既知の免疫グロブリン番号付けスキーム（例えば、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、Ｍａｒｔｉｎ（Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｃｈｏｔｈｉａ）、ＩＧＭＴ、またはＡＨｏ）のいずれかによって決定されるとおりである）を含む。いくつかの実施態様においては、抗体は、配列番号４６の重鎖可変領域および配列番号５０の軽鎖可変領域、または少なくともＫａｂａｔによって決定されるそれらのＣＤＲを含む。いくつかの実施態様においては、抗体は、配列番号４６の重鎖可変領域および配列番号５０の軽鎖可変領域、または少なくともＣｈｏｔｈｉａによって決定されるそれらのＣＤＲを含む。いくつかの実施態様においては、抗体は、配列番号４６の重鎖可変領域および配列番号５０の軽鎖可変領域、または少なくともＭａｒｔｉｎによって決定されるそれらのＣＤＲを含む。いくつかの実施態様においては、抗体は、配列番号４６の重鎖可変領域および配列番号５０の軽鎖可変領域、または少なくともＩＧＭＴによって決定されるそれらのＣＤＲを含む。いくつかの実施態様においては、抗体は、配列番号４６の重鎖可変領域および配列番号５０の軽鎖可変領域、または少なくともＡＨｏによって決定されるそれらのＣＤＲを含む。

【0026】

本明細書において記載される配列「同一性」は、目的の核酸またはアミノ酸配列を参照核酸またはアミノ酸配列と比較することによって決定することができる。パーセント同一性は、目的の配列と参照配列との間で同じである（すなわち、同一である）ヌクレオチドまたはアミノ酸残基の数を、最も長い配列の長さ（すなわち、目的の配列または参照配列のいずれか長い方の長さ）で割ったものである。最適なアラインメントを取得し、２つ以上の配列間の同一性を計算するための多くの数学的アルゴリズムが、知られており、多くの利用可能なソフトウェアプログラムに組み込まれている。そのようなプログラムの例は、ＣＬＵＳＴＡＬ－Ｗ、Ｔ－Ｃｏｆｆｅｅ、およびＡＬＩＧＮ（核酸およびアミノ酸配列のアラインメント用）、ＢＬＡＳＴプログラム（例えば、ＢＬＡＳＴ ２．１、ＢＬ２ＳＥＱ、およびそれらの以降のバージョン）およびＦＡＳＴＡプログラム（例えば、ＦＡＳＴＡ３ｘ、ＦＡＳＴＭ、およびＳＳＥＡＲＣＨ）（配列アラインメントおよび配列類似性検索用）を含む。配列アラインメントアルゴリズムはまた、例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌ．，２１５（３）：４０３－４１０（１９９０），Ｂｅｉｇｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ，１０６（１０）：３７７０－３７７５（２００９），Ｄｕｒｂｉｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ｐｒｏｂａｌｉｓｔｉｃ Ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ（２００９），Ｓｏｄｉｎｇ，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，２１（７）：９５１－９６０（２００５），Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２５（１７）：３３８９－３４０２（１９９７），およびＧｕｓｆｉｅｌｄ，Ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ ｏｎ Ｓｔｒｉｎｇｓ，Ｔｒｅｅｓ ａｎｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ ＵＫ（１９９７））中に開示されている。

【0027】

配列同一性における変動は、１つ以上のアミノ酸残基の付加、置換、または欠失によって達成することができる。アミノ酸の「置換（ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）」または「置換（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）」は、ポリペプチド配列内の所与の位置または残基の１つのアミノ酸の同じ位置または残基の別のアミノ酸による置換を指す。アミノ酸の置換（ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）または置換（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）は、置換（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）が、置換される（ｒｅｐｌａｃｅｄ）残基と同様の特性を有するアミノ酸残基によるものであるかどうかに依存して、保存的、半保存的、または非保存的であり得る。個々のアミノ酸間の共通の特性を定義する機能的な方法は、相同生物の対応するタンパク質間のアミノ酸変化の正規化された頻度を分析することである（Ｓｃｈｕｌｚ ａｎｄ Ｓｃｈｉｒｍｅｒ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９７９））。そのような分析によれば、アミノ酸のグループは、グループ内のアミノ酸が、互いに優先的に交換し、従って全体的なタンパク質構造へのそれらの影響において互いに最も似ている場合に定義され得る（上記のＳｃｈｕｌｚ ａｎｄ Ｓｃｈｉｒｍｅｒ）。

【0028】

アミノ酸は、「芳香族」または「脂肪族」として広くグループ化することができる。芳香族アミノ酸は、芳香環を含む。「芳香族」アミノ酸の例は、ヒスチジン（ＨまたはＨｉｓ）、フェニルアラニン（ＦまたはＰｈｅ）、チロシン（ＹまたはＴｙｒ）、およびトリプトファン（ＷまたはＴｒｐ）を含む。非芳香族アミノ酸は、「脂肪族」として広くグループ化される。「脂肪族」アミノ酸の例は、グリシン（ＧまたはＧｌｙ）、アラニン（ＡまたはＡｌａ）、バリン（ＶまたはＶａｌ）、ロイシン（ＬまたはＬｅｕ）、イソロイシン（ＩまたはＩｌｅ）、メチオニン（ＭまたはＭｅｔ）、セリン（ＳまたはＳｅｒ）、スレオニン（ＴまたはＴｈｒ）、システイン（ＣまたはＣｙｓ）、プロリン（ＰまたはＰｒｏ）、グルタミン酸（ＥまたはＧｌｕ）、アスパラギン酸（ＡまたはＡｓｐ）、アスパラギン（ＮまたはＡｓｎ）、グルタミン（ＱまたはＧｌｎ）、リジン（ＫまたはＬｙｓ）、およびアルギニン（ＲまたはＡｒｇ）を含む。

【0029】

脂肪族アミノ酸は、４つのサブグループに細分し得る。「大きな脂肪族非極性サブグループ」は、バリン、ロイシン、およびイソロイシンからなる。「脂肪族のわずかに極性のサブグループ」は、メチオニン、セリン、スレオニン、およびシステインからなる。「脂肪族極性／荷電サブグループ」は、グルタミン酸、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン、リジン、およびアルギニンからなる。「小さい残基のサブグループ」は、グリシンおよびアラニンからなる。荷電／極性アミノ酸のグループは、３つのサブグループ：リジンおよびアルギニンからなる「正に荷電したサブグループ」、グルタミン酸およびアスパラギン酸からなる「負に荷電したサブグループ」、並びにアスパラギンおよびグルタミンからなる「極性サブグループ」に細分し得る。

【0030】

芳香族アミノ酸は、２つのサブグループ：ヒスチジンおよびトリプトファンからなる「窒素環サブグループ」並びにフェニルアラニンおよびチロシンからなる「フェニルサブグループ」に細分し得る。

【0031】

保存的アミノ酸置換の例は、上記のサブグループ内のアミノ酸の置換、例えば、正電荷が維持され得るようなアルギニンの代わりのリジンおよびその逆、負電荷が維持され得るようなアスパラギン酸の代わりのグルタミン酸およびその逆、遊離の－ＯＨを維持することができるようなスレオニンの代わりのセリン、遊離の－ＮＨ_２を維持することができるようなアスパラギンの代わりのグルタミンを含む。「半保存的変異」は、本明細書においてリストされている同じグループ内であるが同じサブグループ内でないアミノ酸のアミノ酸置換を含む。例えば、アスパラギンの代わりのアスパラギン酸、またはリジンの代わりのアスパラギンの置換は、同じグループ内であるが異なるサブグループのアミノ酸を含む。「非保存的変異」は、異なるグループ間のアミノ酸置換、例えば、トリプトファンの代わりのリジン、セリンの代わりのフェニルアラニン等を含む。

【0032】

いくつかの実施態様においては、ＰＤ－１結合剤は、免疫グロブリン重および軽鎖可変領域または本明細書において提供される完全な重および軽鎖ポリペプチドを含むか、本質的にそれらからなるか、またはそれらからなり得る。単離されたＰＤ－１結合剤は、少なくとも特定の免疫グロブリン重および軽鎖可変領域を含む任意のタイプの分子または構築物であり得る。すなわち、ＰＤ－１結合剤は、例えば、本明細書において記載される全体の免疫グロブリン若しくは抗体、または抗原結合（ＰＤ－１結合）免疫グロブリン若しくは抗体「フラグメント」であり得る。抗体または免疫グロブリンに関して使用される用語「フラグメント」は、免疫グロブリンまたは抗体のいくらかの部分を含み、標的抗原に結合する任意の分子または構築物を意味する。そのようなフラグメントは、一般にＣＤＲを含む重および軽鎖可変領域の少なくとも一部を含み、また、任意に通常は免疫グロブリンまたは抗体の一部ではない他の要素（例えば、リンカー等）とともに、定常領域の一部を含み得る。そのような「フラグメント」の例は、（ｉ）Ｖ_Ｌ、Ｖ_Ｈ、Ｃ_Ｌ、およびＣＨ_１ドメインからなる一価フラグメントであるＦａｂフラグメント、（ｉｉ）ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂフラグメントを含む二価フラグメントであるＦ（ａｂ’）_２フラグメント、（ｉｉｉ）抗体の単鎖のＶ_ＬおよびＶ_ＨドメインからなるＦｖフラグメント、（ｉｖ）穏やかな還元条件を使用してＦ（ａｂ’）_２フラグメントのジスルフィド架橋を切断することから生じるＦａｂ’フラグメント；（ｖ）ダイアボディ；（ｖｉ）単鎖可変領域（ｓｃＦｖ）、および（ｖｉｉ）ジスルフィド安定化Ｆｖフラグメント（ｄｓＦｖ）を含むが、これらに限定されない。

【0033】

いくつかの実施態様においては、ＰＤ－１結合剤は、フラグメント結晶化可能（Ｆｃ）領域またはその一部などの免疫グロブリン重鎖定常領域を含む。Ｆｃ領域は、任意のＩｇクラス／サブクラス（それらの変異体を含む、ＩｇＡ（ＩｇＡ１、ＩｇＡ２）、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４）、ＩｇＭであり得る。特定の実施態様においては、ＰＤ－１結合剤は、抗原提示細胞（例えば、樹状細胞、マクロファージ、ランゲルハンス細胞、またはＢ細胞）のＦｃ受容体に結合するＦｃ領域を含む。Ｆｃ受容体は、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２）、ＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２）、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６ａ）、ＦｃγＲＩＩＩＢ（ＣＤ１６ｂ）などのＦｃγ受容体（ＦｃγＲ）であり得る。一つの実施態様においては、ＰＤ－１結合剤は、ＩｇＧ１などのＦｃγＲに結合するＦｃ領域を含む。すなわち、いくつかの実施態様においては、ＰＤ－１結合剤は、「全体の（ｗｈｏｌｅ）」または「完全な」Ｉｇ（すなわち、抗体）である。追加の実施態様においては、ＰＤ－１結合剤は、ＩｇＧ抗体、特にＩｇＧ１抗体である。

【0034】

単離されたＰＤ－１結合剤はまた、抗体コンジュゲートであり得る。この点において、単離されたＰＤ－１結合剤は、ＰＤ－１結合剤（例えば、抗ＰＤ－１抗体または抗体フラグメント）および別の生物学的に活性な部分を含むコンジュゲートであり得る。例えば、ＰＤ－１結合剤は、ペプチド、蛍光分子、または化学療法剤、特に免疫応答を抑制することにおいて有用な薬剤に接合され得る。

【0035】

単離されたＰＤ－１結合剤は、ヒト抗体、非ヒト抗体、若しくはキメラ抗体であり得るか、またはそれらから得ることができる。「キメラ」によって、ヒトおよび非ヒト領域の両方を含む抗体またはその断片を意味する。好ましくは、単離されたＰＤ－１結合剤は、ヒト化抗体である。「ヒト化」抗体は、ヒト抗体足場および非ヒト抗体から得られるかまたはそれに由来する少なくとも１つのＣＤＲを含むモノクローナル抗体である。非ヒト抗体は、例えば、齧歯類（例えば、マウスまたはラット）などの任意の非ヒト動物から単離された抗体を含む。ヒト化抗体は、非ヒト抗体から得られるかまたはそれに由来する１つ、２つ、または３つのＣＤＲを含み得る。本発明の好ましい実施態様においては、本発明のＰＤ－１結合剤のＣＤＲＨ３は、マウスモノクローナル抗体から得られるかまたはそれに由来し、一方、本発明のＰＤ－１結合剤の残りの可変領域および定常領域は、ヒトモノクローナル抗体から得られるかまたはそれに由来する。

【0036】

ヒト抗体、非ヒト抗体、キメラ抗体、またはヒト化抗体は、インビトロ供給源（例えば、ハイブリドーマまたは抗体を組換え的に産生する細胞株）およびインビボ供給源（例えば、齧歯類）を介するものを含む任意の手段によって得ることができる。抗体を生成するための方法は、当技術分野において知られており、例えば、Ｋｏｅｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．，５：５１１－５１９（１９７６）；Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（ｅｄｓ．），Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ＣＳＨ Ｐｒｅｓｓ（１９８８）；およびＪａｎｅｗａｙ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ，５ｔｈ Ｅｄ．，Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ（２００１）；Ｓｔａｒｋｉｅ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，１１（３）：ｅ０１５２２８２（２０１６））中に記載されている。特定の実施態様においては、ヒト抗体またはキメラ抗体は、１つ以上の内因性免疫グロブリン遺伝子が１つ以上のヒト免疫グロブリン遺伝子で置換されているトランスジェニック動物（例えば、マウス）を使用して生成することができる。内因性抗体遺伝子がヒト抗体遺伝子で効果的に置換されているトランスジェニックマウスの例は、メダレックスＨＵＭＡＢ－ＭＯＵＳＥ（商標）、キリンＴＣ ＭＯＵＳＥ（商標）、および協和キリンＫＭ－ＭＯＵＳＥ（商標）（例えば、Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２３（９）：１１１７－２５（２００５）およびＬｏｎｂｅｒｇ，Ｈａｎｄｂ． Ｅｘｐ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１８１：６９－９７（２００８）を参照）を含むが、これらに限定されない。ヒト化抗体は、例えば、ヒト抗体足場上への非ヒトＣＤＲの移植（例えば、Ｋａｓｈｍｉｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ，３６（１）：２５－３４（２００５）；およびＨｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１４４（１）：１１５－１２０（２００８）を参照）を含む、当技術分野において知られている任意の適切な方法（例えば、Ａｎ，Ｚ．（ｅｄ．），Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｆｒｏｍ Ｂｅｎｃｈ ｔｏ Ｃｌｉｎｉｃ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｈｏｂｏｋｅｎ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ（２００９）を参照）を使用して生成することができる。一つの実施態様においては、ヒト化抗体は、例えば、米国特許出願公開第２０１１／０２８７４８５Ａ１号中に記載されている方法を使用して製造することができる。

【0037】

ＰＤ－１結合剤は、ヒトＰＤ－１に対して任意の適切な親和性を有し得る。用語「親和性」は、２つの薬剤の可逆的結合についての平衡定数を指し、解離定数（Ｋ_Ｄ）として表される。エピトープについての抗体の親和性などの、リガンドに対する結合剤の親和性は、例えば、約１ピコモル（ｐＭ）から約１００マイクロモル（μＭ）（例えば、約１ピコモル（ｐＭ）から約１ナノモル（ｎＭ）、約１ｎＭから約１マイクロモル（μＭ）、または約１μＭから約１００μＭ）であり得る。一つの実施態様においては、ＰＤ－１結合剤は、１ｎＭ以下（例えば、０．９ｎＭ、０．８ｎＭ、０．７ｎＭ、０．６ｎＭ、０．５ｎＭ、０．４ｎＭ、０．３ｎＭ、０．２ｎＭ、０．１ｎＭ、０．０５ｎＭ、０．０２５ｎＭ、０．０１ｎＭ、０．００１ｎＭ、または前述の値の任意の２つによって定義される範囲）のＫ_Ｄを有するＰＤ－１タンパク質に結合し得る。別の実施態様においては、ＰＤ－１結合剤は、２００ｐＭ以下（例えば、１９０ｐＭ、１７５ｐＭ、１５０ｐＭ、１２５ｐＭ、１１０ｐＭ、１００ｐＭ、９０ｐＭ、８０ｐＭ、７５ｐＭ、６０ｐＭ、５０ｐＭ、４０ｐＭ、３０ｐＭ、２５ｐＭ、２０ｐＭ、１５ｐＭ、１０ｐＭ、５ｐＭ、１ｐＭ、または前述の値の任意の２つによってれる範囲）のＫ_Ｄを有するＰＤ－１に結合し得る。いくつかの実施態様においては、ＰＤ－１結合剤は、ヒトＰＤ－１に関して論じた前述の範囲のいずれかの親和性を有する、カニクイザルＰＤ－１と交差反応性である。目的の抗原またはエピトープについての免疫グロブリン親和性は、当技術分野で認められている任意のアッセイを使用して測定することができる。そのような方法は、例えば、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）、分離可能なビーズ（例えば、磁気ビーズ）、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、液相競合（ＫｉｎＥｘＡ（登録商標））、抗原パニング、および／またはＥＬＩＳＡ（例えば、Ｊａｎｅｗａｙ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ，５ｔｈ ｅｄ．，Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，２００１を参照）を含む。

【0038】

ＰＤ－１結合剤は、ＰＤ－１に結合するが、好ましくはＰＤ－１が免疫応答を負に調節する能力を完全には阻害しないかまたは、いくつかの場合においては、ＰＤ－１が免疫応答を負に調節する能力を実質的には阻害しないかまたはＰＤ－１が免疫応答を負に調節する能力を高めさえする。いくつかの実施態様においては、ＰＤ－１結合剤は、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との間の結合を完全には遮断しないか、または、好ましくは、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との間の結合を実質的には低下させない。ＰＤ－１結合剤が免疫応答のＰＤ－１調節またはＰＤ－Ｌ１へのＰＤ－１結合を阻害する程度の評価は、実施例において記載されているもののようなアッセイまたは当技術分野において知られている他のアッセイを使用して実施することができる。いくつかの実施態様においては、ＰＤ－１結合剤は、ＰＤ－Ｌ１へのＰＤ－１結合を、約８０％以下、約７５％以下、約７０％以下、約６５％以下、約６０％以下、約５５％以下、約５０％以下、約４５％以下、約４０％以下、約３５％以下、約３０％以下、約２５％以下、約２０％以下、約１５％以下、約１０％以下阻害する。

【0039】

使用／治療の方法
本発明は、本明細書において記載されるＰＤ－１結合剤を哺乳動物に投与することにより、哺乳動物における免疫応答、特にＴ細胞媒介性免疫応答を抑制する方法を提供する。本発明はさらに、ＰＤ－１活性における減少（例えば、免疫系の負の調節における減少などの、減少したＰＤ－Ｌ１結合を通したＰＤ－１シグナル伝達における減少）が疾患の病理学的影響を引き起こすか若しくはそれに寄与する疾患または障害、あるいはＰＤ－１活性における増加（例えば、免疫系の負の調節における増加などの、ＰＤ－Ｌ１結合を通したＰＤ－１シグナル伝達における増加）が治療効果を有するであろう任意の疾患または傷害を治療する方法であって、該方法は、障害の任意の症状を低下させる若しくは排除するか、またはそのような症状の発症を予防する若しくは阻害するために、本明細書において記載されるＰＤ－１結合剤を哺乳動物に投与することを含む、方法を提供する。本明細書において使用される免疫系の負の調節は、免疫抑制と同義語である。いくつかの場合においては、ＰＤ－１結合剤を症状の発症の前に（例えば、免疫応答を引き起こす抗原への曝露の前に）投与して、抗原の導入時の免疫応答の重症度を予防し、抑制し、または低下させることができることが理解されるであろう。

【0040】

疾患または障害は、炎症性または自己免疫障害であり得る。炎症性または自己免疫障害の例は、例えば、感染症（ウイルス性、細菌性、真菌性および寄生性）、感染症に関連する内毒性ショック、関節炎、関節リウマチ、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、骨盤炎症性疾患、ベーチェット病、アルツハイマー病、クローン病および潰瘍性大腸炎を含む炎症性腸疾患、ペイロニー病、腹腔疾患、胆嚢疾患、ピロニダル病、腹膜炎、乾癬、乾癬性関節炎、血管炎、抗好中球細胞質抗体関連（ＡＮＣＡ）血管炎、外科的癒着、脳卒中、Ｉ型糖尿病、ライム病、関節炎、髄膜脳炎、自己免疫性血管炎、多発性硬化症などの中枢および末梢神経系の免疫介在性炎症性障害、ループス（全身性エリテマトーデスおよび慢性円盤状エリテマトーデスなどの）およびギランバレー（Ｇｕｉｌｌａｉｎ－Ｂａｒｒ）症候群、アトピー性皮膚炎、多発性筋炎、皮膚筋炎、自己免疫性肝障害、線維性肺胞炎、グレイブス病、ＩｇＡ腎症、特発性血小板減少性紫斑病、メニエール病、ペンフィガス、ペンフィゴイド、原発性胆汁性胆管炎、肝炎、サルコイドーシス、強皮症（局所性強皮症、全身性強皮症、および進行性全身性強皮症）、多発血管炎性肉腫症、他の自己疾患障害、胆管炎、膵炎、外傷（手術）、移植片対宿主病、移植拒絶、心筋梗塞並びにアテローム性動脈硬化症などの虚血性疾患を含む心臓病、結節性動脈炎（結節性多発動脈炎および顕微鏡的多発血管炎）、アレルギー性肉芽腫性血管炎、過敏症血管炎、大動脈炎症候群（高安動脈炎）、側頭動脈炎、血管内凝固、骨吸収、骨粗鬆症、骨関節炎、歯周炎および低塩素血症、スティル病、コーガン症候群、ＲＳ３ＰＥ、リウマチ性多発筋痛、線維筋痛症候群、抗リン脂質抗体症候群、好酸球性筋炎、ギランバレー症候群、重力筋無力症、慢性萎縮性胃炎、グッドパスチャー症候群、急速進行性糸球体腎炎、巨核芽球性貧血、溶血性貧血、自己免疫性好中球減少症、橋本甲状腺炎、自己免疫性副腎機能不全、原発性甲状腺機能低下症、特発性アジソン病（慢性副腎機能不全）、妊娠性ヘルペス、線形ＩｇＡ水疱性皮膚病、後天性表皮水疱症、円形脱毛症、白斑、原田病、自己免疫性視神経症、特発性無精子症、再発性胎児喪失、または胎児－母体耐性の欠如に関連する不妊症を含む。

【0041】

いくつかの実施態様においては、疾患または障害は、巨細胞性動脈炎、リウマチ性多発筋痛、原発性シェーグレン症候群、ＴＮＦ抵抗性関節リウマチ、円形脱毛症、原発性胆汁性胆管炎（ＰＢＣ）、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）、白斑、ＡＮＣＡ血管炎、１型糖尿病、または非感染性ブドウ膜炎である。

【0042】

「免疫応答」は、例えば、抗体産生および／若しくは免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）の活性化、炎症性サイトカインの産生、または本明細書において記載される若しくは当技術分野において別途知られている適応症若しくは障害のいずれかを伴い得る。本明細書において使用される用語「治療」、「治療すること」等は、所望の薬理学的および／または生理学的効果を得ることを指す。好ましくは、効果は、治療的であり、すなわち、効果は、疾患および／または疾患に起因する有害な症状を部分的にまたは完全に治癒する。この目的のために、本発明の方法は、「治療有効量」のＰＤ－１結合剤を投与することを含む。「治療有効量」は、所望の治療結果を達成するために必要な投与量および期間で有効な量を指す。治療有効量は、病状、年齢、性、および個人の体重などの要因、並びに個人において望ましい反応を引き出すＰＤ－１結合剤の能力によって変化し得る。

【0043】

あるいは、薬理学的および／または生理学的効果は予防的であり得る、すなわち、該効果は、その疾患または症状を完全にまたは部分的に予防する。この点において、本発明の方法は、「予防有効量」のＰＤ－１結合剤を投与することを含む。「予防有効量」は、所望の予防結果（例えば、発病の予防）を達成するために必要な投与量および期間で有効な量を指す。

【0044】

ＰＤ－１結合剤は、哺乳動物への投与に適した組成物の一部であり得る。好ましくは、組成物は、担体、好ましくは薬学的に許容される（例えば、生理学的に許容される）担体、および本発明のアミノ酸配列、抗原結合剤、またはベクターを含む、薬学的に許容される（例えば、生理学的に許容される）組成物である。任意の適切な担体が、本発明の文脈内で使用することができ、そのような担体は、当技術分野においてよく知られている。担体の選択は、部分的に、組成物が投与され得る特定の部位および組成物を投与するために使用される特定の方法によって決定されるであろう。組成物はまた、治療用分子（例えば、タンパク質または抗体）の製剤において使用される任意の他の賦形剤、特に、例えば、緩衝液、張性修飾剤、安定剤、界面活性剤等を含む非経口処方を含み得る。組成物は任意に、無菌であり得る。組成物は、保存のために凍結しまたは凍結乾燥し、使用の前に適切な無菌担体中で再構成することができる。組成物は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２１ｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ（２００１）中に記載されている従来の技術に従って生成することができる。

【0045】

ＰＤ－１結合剤の典型的な用量は、例えば、動物またはヒトの体重の１ｐｇ／ｋｇから２０ｍｇ／ｋｇの範囲中であり得るが；しかしながら、この例示的な範囲より下または上の用量は、本発明の範囲内である。１日あたりの非経口用量は、総体重の約０．００００１μｇ／ｋｇから約２０ｍｇ／ｋｇ（例えば、約０．００１μｇ／ｋｇ、約０．１μｇ／ｋｇ、約１μｇ／ｋｇ、約５μｇ／ｋｇ、約１０μｇ／ｋｇ、約１００μｇ／ｋｇ、約５００μｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ、または前述の値の任意の２つによって定義される範囲）、好ましくは総体重の約０．１μｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇ（例えば、約０．５μｇ／ｋｇ、約１μｇ／ｋｇ、約５０μｇ／ｋｇ、約１５０μｇ／ｋｇ、約３００μｇ／ｋｇ、約７５０μｇ／ｋｇ、約１．５ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、または前述の値の任意の２つによって定義される範囲）、より好ましくは総体重の約１μｇ／ｋｇから５ｍｇ／ｋｇ（例えば、約３μｇ／ｋｇ、約１５μｇ／ｋｇ、約７５μｇ／ｋｇ、約３００μｇ／ｋｇ、約９００μｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ、約４ｍｇ／ｋｇ、または前述の値の任意の２つによって定義される範囲）、およびさらにより好ましくは１日あたり約０．５から１５ｍｇ／ｋｇ体重（例えば、約１ｍｇ／ｋｇ、約２．５ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ、約６ｍｇ／ｋｇ、約９ｍｇ／ｋｇ、約１１ｍｇ／ｋｇ、約１３ｍｇ／ｋｇ、または前述の値の任意の２つによって定義される範囲）であり得る。治療または予防効果は、治療される患者の定期的評価によってモニターすることができる。数日以上にわたる反復投与については、状態に依存して、治療を、疾患症状の所望の抑制が起こるまで繰り返すことができる。しかしながら、他の投与計画が、有用であり得、本発明の範囲内である。所望の投与量は、組成物の単回ボーラス投与、組成物の複数回ボーラス投与、または組成物の連続注入投与によって送達することができる。

【0046】

ＰＤ－１結合剤は、経口、静脈内、腹腔内、皮下、肺、経皮、筋肉内、鼻腔内、口腔内、舌下、または坐剤投与を含む、標準的な投与技術を使用して哺乳動物に投与することができる。組成物は好ましくは、非経口投与に適している。本明細書において使用される用語「非経口」は、静脈内、筋肉内、皮下、直腸、膣、および腹腔内投与を含む。より好ましくは、組成物は、静脈内、腹腔内、または皮下注射による末梢全身送達を使用して哺乳動物に投与される。

【0047】

いったん哺乳動物（例えば、ヒト）に投与されると、本発明のＰＤ－１結合剤の生物学的活性は、当技術分野において知られている任意の適切な方法によって測定することができる。例えば、生物学的活性は、特定のＰＤ－１結合剤の安定性を決定することによって評価することができる。本発明の一つの実施態様においては、ＰＤ－１結合剤（例えば、抗体）は、約３０分と４５日との間（例えば、約３０分、約４５分、約１時間、約２時間、約４時間、約６時間、約１０時間、約１２時間、約１日、約５日、約１０日、約１５日、約２５日、約３５日、約４０日、約４５日、または前述の値の任意の２つによって定義される範囲）のインビボ半減期を有する。別の実施態様においては、ＰＤ－１結合剤は、約２時間と２０日との間（例えば、約５時間、約１０時間、約１５時間、約２０時間、約２日、約３日、約７日、約１２日、約１４日、約１７日、約１９日、または前述の値の任意の２つによって定義される範囲）のインビボ半減期を有する。別の実施態様においては、ＰＤ－１結合剤は、約１０日と約４０日との間（例えば、約１０日、約１３日、約１６日、約１８日、約２０日、約２３日、約２６日、約２９日、約３０日、約３３日、約３７日、約３８日、約３９日、約４０日、または前述の値の任意の２つによって定義される範囲）のインビボ半減期を有する。

【0048】

本発明のＰＤ－１結合剤は、単独でまたは他の活性剤若しくは薬物と組み合わせて投与し得る。例えば、ＰＤ－１結合剤は、本明細書において開示される疾患の治療または予防のために他の薬剤と組み合わせて投与することができる。この点において、ＰＤ－１結合剤は、例えば、他のモノクローナル抗体、疾患を殺すウイルス、遺伝子治療、および養子Ｔ細胞転移を含む少なくとも１つの他の炎症性若しくは自己免疫障害阻害剤、並びに／または手術と組み合わせて使用することができる。本明細書において記載される本発明のＰＤ－１結合剤はまた、例えば、メトトレキサート、コルチコステロイド、並びに自己免疫および炎症性疾患を治療するために使用される他の小分子薬剤を含む、少なくとも１つの他の免疫抑制剤と組み合わせて使用することができる。本発明の方法が感染症を治療するとき、ＰＤ－１結合剤は、少なくとも１つの抗菌剤または少なくとも１つの抗ウイルス剤と組み合わせて投与することができる。この点において、抗菌剤は、当技術分野において知られている任意の適切な抗生物質であり得る。抗ウイルス剤は、特定のウイルスを特異的に標的とする任意の適切なタイプの任意のワクチン（例えば、弱毒化生ワクチン、サブユニットワクチン、組換えベクターワクチン、および小分子抗ウイルス療法（例えば、ウイルス複製阻害剤およびヌクレオシド類似体）であり得る。

【0049】

治療的使用に加えて、本明細書において記載されるＰＤ－１結合剤は、診断または研究用途において使用することができる。この点において、ＰＤ－１結合剤は、癌または感染症を診断する方法において使用することができる。同様の方法で、ＰＤ－１結合剤は、異常なＰＤ－１発現に関連する疾患または障害について試験される対象におけるＰＤ－１タンパク質レベルをモニターするアッセイにおいて使用することができる。研究用途は、例えば、サンプル中、例えば、ヒト体液中または細胞若しくは組織抽出物中のＰＤ－１タンパク質を検出するためのＰＤ－１結合剤および標識を利用する方法を含む。ＰＤ－１結合剤は、検出可能な部分での共有結合若しくは非共有結合標識などの修飾をしてまたはせずに使用することができる。例えば、検出可能な部分は、放射性同位元素（例えば、^３Ｈ、^１４Ｃ、^３２Ｐ、^３５Ｓ、または^１２５Ｉ）、蛍光若しくは化学発光化合物（例えば、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、またはルシフェリン）、酵素（例えば、アルカリホスファターゼ、ベータガラクトシダーゼ、または西洋ワサビペルオキシダーゼ）、または補欠分子族であり得る。抗原結合剤（例えば、抗体）を検出可能な部分に別個に接合させるための当技術分野において知られている任意の方法を、本発明の文脈において使い得る（例えば、Ｈｕｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９４：４９５－４９６（１９６２）；Ｄａｖｉｄ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１３：１０１４－１０２１（１９７４）；Ｐａｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈ．，４０：２１９－２３０（１９８１）；およびＮｙｇｒｅｎ，Ｊ． Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ． Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．，３０：４０７－４１２（１９８２）を参照）。

【0050】

ＰＤ－１タンパク質レベルは、当技術分野において知られている任意の適切な方法によって本発明のＰＤ－１結合剤を使用して測定することができる。そのような方法は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、およびＦＡＣＳを含む。ＰＤ－１タンパク質の正常なまたは標準的な発現値は、任意の適切な技術を使用して、例えば、抗原－抗体複合体を形成するために適した条件下でＰＤ－１ポリペプチドを含む、または含むと疑われるサンプルを、ＰＤ－１特異的抗体と組み合わせることによって証明することができる。抗体は、結合または非結合抗体の検出を促進するために、検出可能な物質で直接的にまたは間接的に標識されている。適切な検出可能な物質は、さまざまな酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、および放射性物質を含む（例えば、Ｚｏｌａ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．（１９８７）を参照）。次いで、サンプル中で発現したＰＤ－１ポリペプチドの量を、標準値と比較する。

【0051】

ＰＤ－１結合剤は、キット、すなわち、診断アッセイを実施するための説明書を有する所定量の試薬のパッケージ化された組合せで提供することができる。ＰＤ－１結合剤が酵素で標識されている場合、キットは望ましくは、酵素によって必要とされる基質および補因子（例えば、検出可能な発色団またはフルオロフォアを提供する基質前駆体）を含む。さらに、安定剤、緩衝液（例えば、ブロッキング緩衝液または溶解緩衝液）などの他の添加剤をキット中に含め得る。さまざまな試薬の相対量は、アッセイの感度を実質的に最適化する試薬の溶液中濃度を提供するために変化させることができる。試薬は、溶解時に適切な濃度を有する試薬溶液を提供する賦形剤を含む乾燥粉末（典型的には凍結乾燥された）として提供し得る。

【0052】

核酸、細胞、製造方法
本発明はまた、ＰＤ－１結合剤またはその個々の重若しくは軽鎖免疫グロブリンポリペプチドをコードする１つ以上の単離されたまたは精製された核酸配列を提供する。すなわち、一つの実施態様においては、核酸は、本明細書において提供される免疫グロブリン軽鎖可変領域または完全な免疫グロブリン軽鎖をコードする。別の実施態様においては、核酸は、本明細書において提供される免疫グロブリン重鎖可変領域または完全な免疫グロブリン軽鎖をコードする。さらに別の実施態様においては、核酸は、本明細書において提供される、免疫グロブリン軽鎖可変領域または完全な免疫グロブリン軽鎖、および免疫グロブリン重鎖可変領域または完全な免疫グロブリン重鎖の両方をコードする。免疫グロブリン重鎖をコードする核酸配列の例は、それぞれ配列番号２９および４７の重鎖可変領域、並びにそれぞれ配列番号３６および５１の完全な重および軽鎖をコードする配列番号５３および５５によって提供される。免疫グロブリン軽鎖をコードする核酸配列の例は、それぞれ配列番号３５および４９の軽鎖可変領域、並びにそれぞれ配列番号３７および５２の完全な鎖および軽鎖をコードする配列番号５４および５６によって提供される。

【0053】

用語「核酸」および「核酸配列」は、一本鎖または二本鎖であり得、非天然のまたは改変されたヌクレオチドを含有し得る、ＤＮＡまたはＲＮＡのポリマー、すなわち、ポリヌクレオチドを包含することが意図される。本明細書において使用される用語「核酸」および「ポリヌクレオチド」は、リボヌクレオチド（ＲＮＡ）またはデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）のいずれかの任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。これらの用語は、分子の一次構造を指し、すなわち、二本および一本鎖ＤＮＡ、並びに二本および一本鎖ＲＮＡを含む。該用語は、同等物として、ヌクレオチド類似体から作製されたＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかの類似体並びに、限定されないが、メチル化および／またはキャップされたポリヌクレオチドなどの修飾ポリヌクレオチドを含む。核酸は、多くの他の連結が当技術分野において知られている（例えば、ホスホロチオエート、ボラノホスフェート等）が、典型的にはリン酸結合を介して連結して核酸配列またはポリヌクレオチドを形成する。

【0054】

核酸は、ベクターの一部であり得る。ベクターは、例えば、プラスミド、エピソーム、コスミド、ウイルスベクター（例えば、レトロウイルスまたはアデノウイルス）、またはファージであり得る。適切なベクターおよびベクター調製の方法は、当技術分野においてよく知られている（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（２００１），およびＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９９４）を参照）。

【0055】

免疫グロブリン重および／または軽鎖をコードする核酸配列に加えて、ベクターは、宿主細胞におけるコード配列の発現を提供する、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、転写ターミネーター、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）などの発現制御配列を含み得る。例示的な発現制御配列は、当技術分野において知られており、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ，Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）中に記載されている。

【0056】

さまざまな異なる供給源からの、構成的、誘導性、および抑制性プロモーターを含む、多数のプロモーターが、当技術分野においてよく知られている。プロモーターの代表的な供給源は例えば、ウイルス、哺乳動物、昆虫、植物、酵母、および細菌を含み、これらの供給源からの適切なプロモーターは、容易に入手可能であるか、または例えば、ＡＴＣＣなどの寄託機関並びに他の商用の若しくは個別の供給源から公的に入手可能な配列に基づいて、合成的に製造することができる。プロモーターは、一方向性（すなわち、一方向に転写を開始する）または双方向性（すなわち、３’または５’方向のいずれかに転写を開始する）であり得る。プロモーターの非限定的な例は、例えば、Ｔ７細菌発現系、ｐＢＡＤ（ａｒａＡ）細菌発現系、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＲＳＶプロモーターを含む。誘導性プロモーターは、例えば、Ｔｅｔ系（米国特許第５，４６４，７５８号および第５，８１４，６１８号）、エクジソン誘導系（Ｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．，９３：３３４６－３３５１（１９９６））、Ｔ－ＲＥＸ（商標）系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、ＬＡＣＳＷＩＴＣＨ（商標）系（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、およびＣｒｅ－ＥＲＴタモキシフェン誘導性リコンビナーゼ系（Ｉｎｄｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃ． Ａｃｉｄ． Ｒｅｓ．，２７：４３２４－４３２７（１９９９）；Ｎｕｃ． Ａｃｉｄ． Ｒｅｓ．，２８：ｅ９９（２０００）；米国特許７，１１２，７１５号；およびＫｒａｍｅｒ ＆ Ｆｕｓｓｅｎｅｇｇｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．，３０８：１２３－１４４（２００５））を含む。

【0057】

本明細書において使用される用語「エンハンサー」は、例えば、それが作動可能に連結されている核酸配列の転写を増加させるＤＮＡ配列を指す。エンハンサーは、核酸配列のコード領域から何キロベースも離れて位置し得、調節因子の結合、ＤＮＡメチル化のパターン、またはＤＮＡ構造における変化を仲介し得る。さまざまな異なる供給源からの多数のエンハンサーが、当技術分野においてよく知られており、クローン化ポリヌクレオチドとしてまたはその内で利用可能である（例えば、ＡＴＣＣなどの寄託機関並びに他の商用のまたは個々の供給源から）。プロモーター（一般的に使用されるＣＭＶプロモーターなどの）を含む多くのポリヌクレオチドはまた、エンハンサー配列を含む。エンハンサーは、コード配列の上流、内部、または下流に位置し得る。

【0058】

ベクターはまた、選択可能なマーカー遺伝子を含み得る。本明細書において使用される用語「選択可能なマーカー遺伝子」は、対応する選択剤の存在下において、核酸配列を発現する細胞が特異的に選択されることを可能にする核酸配列を指す。適切な選択可能なマーカー遺伝子は、当技術分野において知られており、例えば、国際特許出願公開ＷＯ１９９２／００８７９６およびＷＯ１９９４／０２８１４３；Ｗｉｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ，７７：３５６７－３５７０（１９８０）；Ｏ’Ｈａｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ，７８：１５２７－１５３１（１９８１）；Ｍｕｌｌｉｇａｎ ＆ Ｂｅｒｇ，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ，７８：２０７２－２０７６（１９８１）；Ｃｏｌｂｅｒｒｅ－Ｇａｒａｐｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．，１５０：１－１４（１９８１）；Ｓａｎｔｅｒｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，３０：１４７－１５６（１９８４）；Ｋｅｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３７：９０１－９０３（１９８７）；Ｗｉｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１１：２２３－２３２（１９７７）；Ｓｚｙｂａｌｓｋａ ＆ Ｓｚｙｂａｌｓｋｉ，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ，４８：２０２６－２０３４（１９６２）；Ｌｏｗｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，２２：８１７－８２３（１９８０）；並びに米国特許第５，１２２，４６４号および第５，７７０，３５９号中に記載されている。

【0059】

いくつかの実施態様においては、ベクターは、宿主細胞において複製することができ、適切な選択的圧力の存在下において宿主細胞内のＤＮＡの染色体外セグメントとして存続する「エピソーム発現ベクター」または「エピソーム」である（例えば、Ｃｏｎｅｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，１１：１７３５－１７４２（２００４）を参照）。代表的な市販のエピソーム発現ベクターは、エプスタインバー核抗原１（ＥＢＮＡ１）およびエプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）複製起点（ｏｒｉＰ）を利用するエピソームプラスミドが含むが、これらに限定されない。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）からのベクターｐＲＥＰ４、ｐＣＥＰ４、ｐＲＥＰ７、およびｐｃＤＮＡ３．１並びにＳｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）からのｐＢＫ－ＣＭＶは、ＥＢＮＡ１およびｏｒｉＰの代わりにＴ抗原およびＳＶ４０複製起点を使用するエピソームベクターの非限定的な例を表す。

【0060】

他の適切なベクターは、宿主細胞のＤＮＡ中にランダムに統合され得るか、または発現ベクターと宿主細胞の染色体との間の特異的組換えを可能にする組換え部位を含み得る、統合発現ベクターを含む。そのような統合発現ベクターは、所望のタンパク質の発現をもたらすために宿主細胞の染色体の内因性発現制御配列を利用し得る。サイト特定の方法で統合されるベクターの例は、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）からのｆｌｐ－ｉｎ系の成分（例えば、ｐｃＤＮＡ（商標）５／ＦＲＴ）、またはＳｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）からのｐＥｘｃｈａｎｇｅ－６コアベクター中に見出され得るようなｃｒｅ－ｌｏｘ系を含む。宿主細胞の染色体中にランダムに統合されるベクターの例は、例えば、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）からのｐｃＤＮＡ３．３（Ｔ抗原の非存在下において導入されるとき）、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）からのＵＣＯＥ、およびＰｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）からのｐＣＩまたはｐＦＮ１０Ａ（ＡＣＴ）ＦＬＥＸＩ（商標）を含む。

【0061】

ウイルスベクターもまた、使用することができる。代表的な市販のウイルス発現ベクターは、Ｃｒｕｃｅｌｌ，Ｉｎｃ．（Ｌｅｉｄｅｎ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）から入手可能なアデノウイルスベースのＰｅｒ．Ｃ６系、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）からのレンチウイルスベースのｐＬＰ１、およびＡｇｉｌｅｎｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）からのレトロウイルスベクターｐＦＢ－ＥＲＶプラスｐＣＦＢ－ＥＧＳＨを含むが、これらに限定されない。

【0062】

本発明のアミノ酸配列をコードする核酸配列は、同じベクター上で細胞に（すなわち、シスで）提供することができる。一方向プロモーターを、各核酸配列の発現を制御するために使用することができる。別の実施態様においては、双方向性および一方向性プロモーターの組合せを、複数の核酸配列の発現を制御するために使用することができる。あるいは、本発明のアミノ酸配列をコードする核酸配列を、別個のベクター上で細胞の集団に（すなわち、トランスで）提供することができる。別個のベクターのそれぞれにおける核酸配列のそれぞれは、同じまたは異なる発現制御配列を含み得る。別個のベクターは、同時に細胞に提供することができる。

【0063】

本発明のアミノ酸配列をコードする核酸（複数可）を含むベクター（複数可）は、任意の適切な原核生物または真核生物細胞を含む、それによってコードされるポリペプチドを発現することができる宿主細胞中に導入することができる。そのようなものとして、本発明は、本発明のベクターを含むインビトロ細胞または細胞株を提供する。本発明はまた、免疫グロブリン重および／若しくは軽鎖ポリペプチドを発現する、またはＰＤ－１結合剤を発現するインビトロ細胞または細胞株を提供する。好ましい宿主細胞は、容易にかつ確実に増殖することができ、適度に速い増殖速度を有し、よく特徴づけられた発現系を有し、容易にかつ効率的に形質転換しまたはトランスフェクトすることができるものである。

【0064】

適切な原核生物細胞の例は、バチルス属（枯草菌およびブレビバチルスなどの）、エシェリキア属（大腸菌などの）、シュードモナス属、ストレプトマイセス属、サルモネラ属、およびエルウィニア属からの細胞を含むが、これらに限定されない。特に有用な原核生物細胞は、大腸菌のさまざまな株（例えば、Ｋ１２、ＨＢ１０１（ＡＴＣＣ番号３３６９４）、ＤＨ５α、ＤＨ１０、ＭＣ１０６１（ＡＴＣＣ番号５３３３８）、およびＣＣ１０２）を含む。

【0065】

いくつかの実施態様においては、ベクターは、真核生物細胞中に導入される。適切な真核生物細胞は、当技術分野において知られており、例えば、酵母細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞を含む。適切な酵母細胞の例は、クルイウェロマイセス属、ピキア属、リノスポリジウム属、サッカロマイセス属、およびシゾサッカロマイセス属からのものを含む。好ましい酵母細胞は、例えば、サッカロマイセス・セリビサエおよびピキア・パストリスを含む。

【0066】

適切な昆虫細胞は、例えば、Ｋｉｔｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１４：８１０－８１７（１９９３）；Ｌｕｃｋｌｏｗ，Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，４：５６４－５７２（１９９３）；およびＬｕｃｋｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．，６７：４５６６－４５７９（１９９３）中に記載されている。好ましい昆虫細胞は、Ｓｆ－９およびＨＩ５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を含む。

【0067】

いくつかの実施態様においては、哺乳動物細胞が、本発明において利用される。多くの適切な哺乳動物宿主細胞が当技術分野において知られており、多くは、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から入手可能である。適切な哺乳動物細胞の例は、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ６１）、ＣＨＯ ＤＨＦＲ細胞（例えば、Ｕｒｌａｕｂ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ，９７：４２１６－４２２０（１９８０））、ヒト胚性腎臓（ＨＥＫ）２９３または２９３Ｔ細胞（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１５７３）、および３Ｔ３細胞（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ９２）を含むが、これらに限定されない。他の適切な哺乳動物細胞株は、サルＣＯＳ－１（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１６５０）およびＣＯＳ－７細胞株（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１６５１）、並びにＣＶ－１細胞株（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ７０）である。さらなる例示的な哺乳動物宿主細胞は、マウス骨髄腫株ＭＯＰＣ２１（例えば、Ｔｙｓａｂｒｉ）の誘導体であるマウス細胞株ＮＳ０、および形質転換細胞株を含む、霊長類細胞株および齧歯類細胞株を含む。正常な二倍体細胞、一次組織のインビトロ培養に由来する細胞株、並びに一次外植片も、また適切である。他の適切な哺乳動物細胞株は、その全てがＡＴＣＣから入手可能である、マウス神経芽細胞腫Ｎ２Ａ細胞、ＨｅＬａ、マウスＬ－９２９細胞、およびＢＨＫまたはＨａＫハムスター細胞株を含むが、これらに限定されない。適切な哺乳動物宿主細胞を選択するための方法並びに細胞の形質転換、培養、増幅、スクリーニング、および精製のための方法は、当技術分野において知られている。

【0068】

いくつかの実施態様においては、哺乳動物細胞は、ヒト細胞である。例えば、哺乳動物細胞は、プレＢリンパ球起源の細胞株などの、ヒトリンパ球またはリンパ球由来の細胞株であり得る。ヒトリンパ球細胞株の例は、限定なしに、ＲＡＭＯＳ（例えば、ＣＲＬ－１５９６）、Ｄａｕｄｉ（例えば、ＣＣＬ－２１３）、ＥＢ－３（例えば、ＣＣＬ－８５）、Ｒａｊｉ細胞（例えば、ＣＣＬ－８６）、およびそれらの誘導体を含む。

【0069】

本発明のアミノ酸配列をコードする核酸配列は、「トランスフェクション」、「形質転換」、または「形質導入」などの任意の適切な技術によって細胞中に導入し得る。本明細書において使用される「トランスフェクション」、「形質転換」、または「形質導入」は、物理的または化学的方法を使用することによる宿主細胞中への１つ以上の外因性ポリヌクレオチドの導入を指す。多くのトランスフェクション技術が、当技術分野において知られており、例えば、リン酸カルシウムＤＮＡ共沈（例えば、Ｍｕｒｒａｙ Ｅ．Ｊ．（ｅｄ．），Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．７，Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ（１９９１）を参照）；ＤＥＡＥ－デキストラン；エレクトロポレーション；カチオン性リポソーム媒介トランスフェクション；タングステン粒子促進微粒子衝撃（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ，３４６：７７６－７７７（１９９０））；およびリン酸ストロンチウムＤＮＡ共沈（Ｂｒａｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，７：２０３１－２０３４（１９８７））を含む。ファージまたはウイルスベクターは、その多くが市販されている、適切なパッケージング細胞における感染性粒子の増殖の後、宿主細胞中に導入することができる。

【0070】

核酸および細胞は、本明細書において記載されるＰＤ－１結合剤の製造のためなどの任意の目的に使用することができる。この点において、本発明は、ＰＤ－１結合剤の重および／または軽免疫グロブリンポリペプチドをコードする核酸を含む細胞を培養することを含む、ＰＤ－１結合剤を製造する方法を提供する。別の言い方をすると、該方法は、細胞中でＰＤ－１結合剤の免疫グロブリン重および／または軽鎖をコードする核酸を発現させることを含む。免疫グロブリン重および軽鎖は、所与の細胞中の単一の核酸から発現させることができるか、または免疫グロブリン重および軽鎖は、同じ細胞中の別個の核酸から発現させることができることが理解されるであろう。該方法は、既知の技術を使用して細胞または細胞培養培地からＰＤ－１結合剤を回収および／または精製することをさらに含み得る。

【0071】

以下の実施例は、本発明をさらに例示するが、もちろん、決してその範囲を制限するものとして解釈されるべきでない。

【実施例】

【0072】

以下の実施例は、本発明の実施態様による、特定の抗ＰＤ－１抗体重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチド配列を記載する。これらの実施例において使用される抗体は、以下に記載するとおりである。

【0073】

４３７Ｍ５－１１２抗体は、免疫化されたマウス脾臓からのソートされたＰＤ－１結合ＩｇＧスイッチドＢ細胞上での単一細胞ＰＣＲに由来した。３．７Ｃ６抗体は、免疫化されたマウスの脾臓細胞から標準的な融合技術によって生成されたマウスハイブリドーマに由来した。抗体は、本明細書において記載される標準的な技術を使用してヒト化した。最終的な最適化された抗体は、ＣＨＯ細胞中で発現させた。抗体配列は、表１Ａ、１Ｂ、および１Ｃ中に要約しており、ここで、「Ｈ」および「Ｌ」鎖は、それぞれ重および軽鎖を指し、ＣＤＲは、ＫａｂａｔおよびＩＭＧＴの両方の定義に従って（表１Ｂ）または特定の抗体についてはＫａｂａｔ若しくはＩＭＧＴに従って（表１Ｃ）アミノ酸を含むと決定する。

【0074】

【表1】

【0075】

【表2】

【0076】

【表3】

【0077】

実施例１
この実施例は、本明細書において開示される抗体が安定的にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞において発現されるヒトおよびカニクイザルＰＤ－１への飽和結合を示すことを実証する。

【0078】

ＨＥＫ２９３細胞を、ヒトＰＤ－１またはカニクイザルＰＤ－１のいずれかを発現するように安定的にトランスフェクトした。細胞を、Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）処理（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）によって回収し、カニクイザルＰＤ－１を発現する細胞を、親油性蛍光色素Ｖｙｂｒａｎｔ（登録商標）ＤｉＤ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）で処理し、次いで同数のヒトＰＤ－１を発現する非標識ＨＥＫ２９３細胞と混合した。細胞（サンプルあたり合計２ｘ１０^５）を、指示された濃度の各抗体で穏やかに振とうしながら４℃で４０分間染色し、遠心分離して１回洗浄した。細胞を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の２％パラホルムアルデヒド中で室温で１０分間固定し、洗浄し、抗体を、フィコエリトリン（ＰＥ）接合ヤギ抗ヒトカッパ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ）で穏やかに振とうしながら４℃で１５分間検出した。細胞を、洗浄し、再懸濁し、結合した抗体の蛍光を、ＢＤ ＦＡＣＳＡｒｒａｙ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）上で定量化した。データを、ＦｌｏｗＪｏ（登録商標）分析ソフトウェア（ＦｌｏｗＪｏ，ＬＬＣ）を使用して蛍光強度の中央値（ＭＦＩ）について分析した。ＥＣ_５０値を、ｌｏｇ（アゴニスト）対応答－可変勾配（４パラメーター）カーブフィットを使用してＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ５．０（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）において決定した。結果を、図１および２中に示し、ＥＣ_５０値を、表２（ヒト）および表３（カニクイザル）において記載する。ＡＰＥ０６３３９は、鶏卵リゾチームに特異的なヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体である。ＡＰＥ０８１４５は、参照抗ＰＤ－１抗体である。

【0079】

【表4】

【0080】

【表5】

【0081】

実施例２
この実施例は、本明細書において開示される抗体が２日間の抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８活性化ヒト末梢血ＣＤ４^＋ Ｔ細胞に結合することを実証する。

【0082】

初代ヒト末梢血ＣＤ４^＋ Ｔ細胞を、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の磁気ビーズ分離（ＣＤ４^＋ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ，Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）を使用して調製し、６ウェルプレート中でプラスチックコーティングされた抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８で４８時間活性化した。細胞（サンプルあたり１ｘ１０^５）を、洗浄し、Ｖ底９６ウェルプレート中で指示された濃度の各抗体で穏やかに振とうしながら４℃で３０分間染色し、遠心分離して１回洗浄した。細胞を、ＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒド中で室温で１０分間固定し、洗浄し、抗体を、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７接合Ｆ（ａｂ’）２ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）で４℃で１０分間検出した。細胞を、洗浄し、再懸濁し、結合した抗体の蛍光を、ＢＤ ＦＡＣＳＡｒｒａｙ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）上で定量化した。データを、ＦｌｏｗＪｏ（登録商標）分析ソフトウェア（ＦｌｏｗＪｏ，ＬＬＣ）を使用して幾何平均蛍光強度（ＭＦＩ）について分析した。ＥＣ_５０値を、ｌｏｇ（アゴニスト）対応答－可変勾配（４パラメーター）カーブフィットを使用してＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ７．０２（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）において決定した。結果を、図３中に示し、ＥＣ_５０値を、表４において記載する。ＡＰＥ１０７８７は、ＰＤ－１に特異的なヒトＩｇＧ１陽性対照抗体であり、ＡＰＥ０６３３９は、鶏卵リゾチームに特異的なヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体である。

【0083】

【表6】

【0084】

実施例３
この実施例は、本明細書において開示される抗体がヒトＰＤ－１でトランスフェクトしたＣＨＯ－Ｋ１細胞への結合についてＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２と競合する程度を記録する。

【0085】

競合アッセイを、抗ＰＤ－１抗体とＰＤ－Ｌ１－ＦｃまたはＰＤ－Ｌ２－Ｆｃ構築物との間のＰＤ－１結合についての競合を試験するために実施した。図４～７中に示すように、テストした抗体は、ＰＤ－Ｌ１と中程度の競合（約７０％の最大阻害）およびＰＤ－Ｌ２と強い競合を示し；別のテストした抗体は、ＰＤ－Ｌ１と弱い／最小の競合（約１５％の最大阻害）およびＰＤ－Ｌ２と中程度の競合（約７０％の最大阻害）を示す。

【0086】

ＣＨＯ－Ｋ１細胞を、ヒトＰＤ－１を発現するように安定的にトランスフェクトし、高レベルの発現クローンを、選択した。細胞を、Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）処理（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）によって回収し、Ｕ底９６ウェルプレート（２ｘ１０^５細胞／ウェル）中に入れた。試験のために、ＰＤ－Ｌ１競合抗体を、連続希釈し、ＤｙＬｉｇｈｔ ６５０（ＤｙＬ６５０）標識ヒトＰＤ－Ｌ１－マウスＩｇＧ１ Ｆｃ融合タンパク質（Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）と事前に混合した（１０ｎＭ最終濃度ＤｙＬ６５０－ＰＤ－Ｌ１－Ｆｃおよび図４および５中に示されている抗体濃度）。氷上での１０分間インキュベーション後、抗体／ＤｙＬ６５０－ＰＤ－Ｌ１－Ｆｃ混合物を、穏やかに振とうしながら４℃で３０分間細胞に添加した。細胞を、遠心分離し、１回洗浄し、ヨウ化プロピジウムを含有するバッファー中で再懸濁し、結合したＰＤ－Ｌ１－Ｆｃ蛍光を、ＢＤ ＦＡＣＳＡｒｒａｙ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）上で定量化した。データを、ＦｌｏｗＪｏ（登録商標）分析ソフトウェア（ＦｌｏｗＪｏ，ＬＬＣ）を使用してＰＤ－Ｌ１幾何中央値蛍光強度（ＭＦＩ）について分析した。ＩＣ_５０値を、ｌｏｇ（アゴニスト）対応答－可変勾配（４パラメーター）カーブフィットを使用してＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ７．０２（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）において決定した。結果を、図４および５中に示し、結果として得られるＩＣ_５０値を、表４～５において記載する。ＡＰＥ１０７８７（「１０７８７」）は、ＰＤ－１に特異的なヒトＩｇＧ１陽性対照アンタゴニスト抗体であり、ＡＰＥ０６３３９（「０６３３９．０８」）は、鶏卵リゾチームに特異的なヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体である。ＡＰＥ０８１４５（「０８１４５．０５」および「０８１４５．０６」）は、参照抗体である。ＡＰＥ１２０４３（「１２０４３．０２」および「１２０４３．０３」）は、実施例１において記載される４３７Ｍ５－１１２抗ＰＤ－１抗体である。ＡＰＥ１２０９５（「１２０９５．０３」および「１２０９５．０４」）は、実施例１において記載される３．７Ｃ６抗ＰＤ－１抗体である。

【0087】

高レベルのヒトＰＤ－１を安定的に発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞クローンを、Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）処理（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎ Ｄｉｒｇｏ，ＣＡ）によって回収し、Ｕ底９６ウェルプレート（２ｘ１０^５細胞／ウェル）中に入れた。試験のために、ＰＤ－Ｌ２競合抗体を、連続希釈し、ＤｙＬ６５０標識ヒトＰＤ－Ｌ２－マウスＩｇＧ１ Ｆｃ融合タンパク質（Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）と事前に混合した（１０ｎＭ最終濃度ＤｙＬ６５０－ＰＤ－Ｌ２－Ｆｃおよび図６および７中に示されている抗体濃度）。氷上での１０分間インキュベーション後、抗体／ＤｙＬ６５０－ＰＤ－Ｌ２－Ｆｃ混合物を、穏やかに振とうしながら４℃で３０分間細胞に添加した。細胞を、遠心分離し、１回洗浄し、ヨウ化プロピジウムを含有するバッファー中で再懸濁し、結合したＰＤ－Ｌ２－Ｆｃ蛍光を、ＢＤ ＦＡＣＳＡｒｒａｙ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）上で定量化した。データを、ＦｌｏｗＪｏ（登録商標）分析ソフトウェア（ＦｌｏｗＪｏ，ＬＬＣ）を使用してＰＤ－Ｌ２幾何中央値蛍光強度（ＭＦＩ）について分析した。ＩＣ_５０値を、ｌｏｇ（アゴニスト）対応答－可変勾配（４パラメーター）カーブフィットを使用してＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ７．０２（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）において決定した。結果を、図６および７中に示し、結果として得られるＩＣ_５０値を、表６～７において記載する。ＡＰＥ１０７８７（「１０７８７」）は、ＰＤ－１に特異的なヒトＩｇＧ１陽性対照アンタゴニスト抗体であり、ＡＰＥ０６３３９（「０６３３９．０８」）は、鶏卵リゾチームに特異的なヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体である。ＡＰＥ０８１４５（「０８１４５．０５」および「０８１４５．０６」）は、参照抗体である。ＡＰＥ１２０４３（「１２０４３．０２」および「１２０４３．０３」）は、実施例１において記載される４３７Ｍ５－１１２抗ＰＤ－１抗体である。ＡＰＥ１２０９５（「１２０９５．０３」および「１２０９５．０４」）は、実施例１において記載される３．７Ｃ６抗ＰＤ－１抗体である。

【0088】

【表7】

【0089】

【表8】

【0090】

【表9】

【0091】

【表10】

【0092】

実施例４
この実施例は、本明細書において開示される抗体がビーズベースおよびプレートベースのアゴニストアッセイにおいて一貫したアゴニスト活性を示すことを実証する。

【0093】

ビーズベースのアゴニストアッセイのために、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｍ－２８０ Ｔｏｓｙｌａｃｔｉｖａｔｅｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ－Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を、製造業者の説明書に従って、抗ＣＤ３（１０μｇ）、抗ＰＤ－１またはＰＤ－Ｌ１－Ｆｃ（４０μｇ）、および陰性対照抗体結合鶏卵リゾチーム（５０μｇ）と結合し、合計１００μｇの結合タンパク質とした。ビーズカップリングの程度は、フローサイトメトリーによって定量化した。初代ヒト末梢血ＣＤ４^＋ Ｔ細胞を、ＰＢＭＣの磁気ビーズ分離（ＣＤ４^＋ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ，Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）を使用して調製した。精製したＣＤ４^＋ Ｔ細胞（１ｘ１０^５細胞／ウェル）を、可溶性抗ＣＤ２８（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ；示される２５０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌまたは５０ｎｇ／ｍｌ）の存在下において、示される異なる数のビーズ（４：１、２：１、または１：１の比率のビーズ：Ｔ細胞）と７２時間インキュベートした。培養上清中の分泌されたＩＦＮγを、ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）によって定量化した。図８Ａおよび８Ｂ中に示し、表８において要約するように、本明細書において開示される抗ＰＤ－１抗体（４３７Ｍ５－１１２および３．７Ｃ６）は、ビーズアッセイにおいてＰＤ－Ｌ１－Ｆｃに匹敵する一貫した阻害（アゴニスト）活性を示した。

【0094】

図９Ａ～９Ｃ中に示すように、３．７Ｃ６変異体ＡＰＥ１２０９３およびＡＰＥ１２０９５は、ＰＤ－Ｌ１－Ｆｃと比較してより強い阻害を有する、ビーズベースのアッセイにおいて最もよいアゴニストであった。４３７Ｍ５－１１２変異体ＡＰＥ１２０４３およびＡＰＥ１２０４４は、親抗体ＡＰＥ１１８４４と比較して改善されたアゴニスト活性を有していた。

【0095】

【表11】

【0096】

ビーズベースのアゴニストアッセイにおいて試験したドナー全体にわたる本明細書において開示される抗ＰＤ－１抗体によるＩＦＮγ産生の阻害を、図１０Ａ～１０Ｂおよび図１１Ａ～１１Ｃ中に示す。

【0097】

プレートベースのアゴニストアッセイのために、９６ウェルプレートを、４℃で一晩抗ＣＤ３（０．３μｇ／ｍｌ）で連続的にコーティングし、ウェルを、吸引してＰＢＳで洗浄し、次いで４℃で一晩図１２～１４中に示すさまざまな濃度の抗ＰＤ－１抗体またはＰＤ－Ｌ１－Ｆｃでの第２のコーティングに供した。新鮮なまたは凍結したヒトＰＢＭＣを、フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ；２μｇ／ｍｌ）の存在下において４８時間培養し、回収し、ＰＨＡを除去するために洗浄し、ＩＬ－２の存在下において一晩培養した。細胞を、回収し、洗浄してヒトガンマグロブリン（１００μｇ／ｍｌ）の存在下において抗ＣＤ３／抗ＰＤ－１コーティングウェル（１ｘ１０^５細胞／ウェル）中で４８時間インキュベートした。培養上清中の分泌されたＩＬ－２を、ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）によって定量化した。３人のＰＢＭＣドナーにわたるＰＤ－１抗体によるＩＬ－２産生の阻害を、図１２Ａ～１２Ｂ、１３Ａ～１３Ｂ、および１４Ａ～１４Ｂ中に示す。本明細書において開示される抗ＰＤ－１抗体によるＩＬ－２産生の阻害は、ＰＤ－Ｌ１－Ｆｃによって誘導されるものに匹敵した。

【0098】

実施例５
この実施例は、本明細書において開示される抗ＰＤ－１抗体がブロッキング抗ＰＤ－Ｌ１／抗ＰＤ－Ｌ２の存在下において溶液中でアゴニスト抗体活性を示したことを実証する。

【0099】

破傷風トキソイド免疫化ドナーからの全血を、１：３に希釈し、破傷風トキソイド（Ａｓｔａｒｔｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，Ｂｏｔｈｅｌｌ，ＷＡ；５μｇ／ｍｌ）、抗ＰＤ－Ｌ１＋抗ＰＤ－Ｌ２（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ；各２μｇ／ｍｌ）、および示された濃度のテトラマーＰＤ－Ｌ１－Ｆｃ、本明細書において記載される抗ＰＤ－１ ＩｇＧ１抗体（３．７Ｃ６ ＡＰＥ１２０９５；４３７Ｍ５－１１２ ＡＰＥ１２０４３）、または対照ヒトＩｇＧ１の存在下において、Ｕ底９６ウェルプレート中で４日間培養した。培養上清中の分泌されたＩＦＮγを、ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）によって定量化した。この破傷風トキソイドリコール応答全血アッセイにおいて、図１５Ａ（陽性および陰性対照）および１５Ｂ（抗ＰＤ－１抗体）中に示すように、本明細書において記載される抗ＰＤ－１抗体の強力なアゴニスト抗体活性が、ブロッキング抗ＰＤ－Ｌ１／抗ＰＤ－Ｌ２の存在下において観察された。

【0100】

ＩｇＧ１ ３．７Ｃ６抗ＰＤ－１抗体を、ヒトＩｇＧ２として調製した同じ抗体と比較した（図１５Ｃおよび１５Ｄ）。抗体の抗ＰＤ－１ ＩｇＧ２バージョンは、抗ＰＤ－１ ＩｇＧ１と同一の活性化Ｔ細胞結合を有していたが、アゴニスト活性は示さなかった。抗体のＩｇＧ２、ＩｇＧ４、またはＩｇＧ１（Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ）アイソタイプはまた、アゴニスト活性を欠き、これは、機能的アゴニスト活性のためのＦｃγＲエンゲージメント／抗体クラスタリングについての要件を実証する。

【0101】

実施例６
この実施例は、本明細書において提供される抗ＰＤ－１抗体が濃度依存的に全血中の免疫応答を低下させることを実証する。

【0102】

インビトロで適切な抗原で刺激したヒト全血は、ドナーが以前に目的の抗原への曝露を経験したとき、特定のＴ細胞リコール免疫応答を引き出すであろう。免疫応答は、ＩＦＮ－γおよびＩＬ１７Ａレベルによって測定することができる。

【0103】

健康なヒトドナー（Ｎ＝６）を、該ドナーが一般的な破傷風ワクチン接種の過程で以前に曝露された可能性が高い抗原破傷風トキソイドに対するインビトロリコール応答性について事前にスクリーニングした。ドナーからの全血を、破傷風トキソイドおよび抗ＰＤ－１ ３．７Ｃ６抗体（ＡＰＥ１２８９０）または無関係なヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照のいずれかの存在下において９６時間培養した。９６時間の培養後、上清を、サイトカイン検出キット（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を使用して、サイトカインＩＦＮ－γおよびＩＬ１７Ａの存在についてアッセイした。結果を、図２２Ａおよび２２Ｂ中に提供する。

【0104】

何人かのドナーは他のドナーよりも強く応答したが、全てのドナーは、かなりの量のＩＦＮ－γおよびＩＬ－１７Ａを産生することによって破傷風トキソイド特異的刺激に応答した。図２２Ａおよび２２Ｂ中に示すように、３．７Ｃ６抗体は、ＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体と比較して、濃度依存的にＩＦＮ－γおよびＩＬ－１７Ａの両方の分泌を低下させた。ヒト全血破傷風トキソイドリコールアッセイにおける３．７Ｃ６の中央値ＩＣ_５０および平均ＩＣ_５０±ＳＤは、ＩＦＮ－γ阻害についてはそれぞれ０．０５３ｎＭおよび０．０９１±０．１１５ｎＭであり、ＩＬ－１７Ａ阻害についてはそれぞれ０．０９７ｎＭおよび０．１１９±０．０９８ｎＭであると決定した。

【0105】

実施例７
この実施例は、本明細書において開示される抗体の結合動態（親和性）および熱安定性を実証する。

【0106】

３．７Ｃ６（ＡＰＥ１２０９５．０６およびＡＰＥ１２５３７．０１）は、ヒトおよびカニクイザルＰＤ－１に匹敵する表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）による結合動態を示した。緊密な結合動態は、機器についての限界に近づいた。ＳＰＲデータは、動的排除アッセイ（ＫｉｎＥｘＡ（登録商標））によって決定されたＡＰＥ１２０９５についての平衡結合親和力とよく一致する。最終の親和性測定値は、ヒトＰＤ－１についてのＫｉｎＥｘＡ（登録商標）Ｋ_Ｄ：７５ｐＭ；およびカニクイザルＰＤ－１についてのＫｉｎＥｘＡ（登録商標）Ｋ_Ｄ：４５０ｐＭであった。

【0107】

４３７Ｍ５－１１２（ＡＰＥ１２０４３．０５およびＡＰＥ１２５３８．０１）はまた、ヒトおよびカニクイザルＰＤ－１に非常に匹敵するＳＰＲによる結合動態を示した。緊密な結合動態は、機器についての限界に近づいた。ＳＰＲデータは、ＫｉｎＥｘＡ（登録商標）によって決定されたＡＰＥ１２０４３についての平衡結合親和性とよく一致する。最終の親和性測定値は、ヒトＰＤ－１についてのＫｉｎＥｘＡ（登録商標）Ｋ_Ｄ：５１ｐＭ；およびカニクイザルＰＤ－１についてのＫｉｎＥｘＡ（登録商標）Ｋ_Ｄ：２１０ｐＭであった。表面プラズモン共鳴およびＫｉｎＥｘＡ（登録商標）による本明細書において開示される抗ＰＤ－１抗体についてのＫ_Ｄ測定の要約を、表９において記載する。

【0108】

【表12】

【0109】

ＡＰＥ１２５３７抗体結合親和性および熱安定性を、「０３０－１３２６３／０３０－１３２６４」と指定される同様の抗体のものと比較した。ＡＰＥ１２５３７は、重鎖における２つの変異：Ｋａｂａｔ番号付けによるＡ５２ａＩおよびＤ６２Ｑ（配列リストにおける位置を使用したＡ５３ＩおよびＤ６３Ｑ）によって、０３０－１３２６３／０３０－１３２６４とは異なった。表１０において提供される結果は、これらの変異が結合親和性および熱安定性を増加させたことを示す。

【0110】

【表13】

【0111】

表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によるスクリーニングのためのＫ_Ｄ測定を、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）上で実施し、運動定数を、１：１結合モデルを使用してグローバルに適合させた。ビオチン化ヒトまたはカニクイザルＰＤ－１細胞外ドメインモノマーを、ストレプトアビジンで事前に固定化したカルボキシメチル化デキストラン表面を用いて、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｓｅｎｓｏｒ ｃｈｉｐ ＳＡ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）上に１ｎＭの濃度で捕捉した。捕捉した抗原レベルは、解離速度に対する和合力効果を防ぐために低い応答をもたらすことを目標とした。Ｔｍ測定値は、蛍光ベースの熱シフトおよび示差走査熱量測定によって決定した。

【0112】

実施例８
この実施例は、本明細書において開示される抗ＰＤ－１抗体が異種ＮＳＧ／Ｈｕ－ＰＢＭＣ移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）モデルにおいてインビボで有効性を示すことを実証する。

【0113】

本明細書において開示される抗ＰＤ－１抗体の有効性を試験する異種ＮＳＧ／Ｈｕ－ＰＢＭＣ ＧｖＨＤモデルを、Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ＪＡＸ（登録商標）Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（Ｓａｃｒａｍｅｎｔｏ，ＣＡ）で実施した。ＮＯＤ－ｓｃｉｄ ＩＬ２ｒγ^ｎｕｌｌ（ＮＳＧ）マウスに１Ｇｙで照射し、その後、図１６Ａ中に例示するように、各マウス中への３ｘ１０^６個のヒトＰＢＭＣの静脈内注射を行った。抗体は、ＰＢＭＣ注射の翌日から始めて４週間、週２回１０ｍｇ／ｋｇで腹腔内投与し、ベラタセプトバイオシミラーは、４週間、週３回７５μｇ／マウスで腹腔内投与した。本研究における投与計画および投与群を、図１６Ｂ中に示す。疾患は、体重減少、死亡、およびＧｖＨＤスコア測定：体重減少、活動、毛皮の質感、蒼白、および姿勢によって週３回モニターした。１０％を超える体重減少を示す動物を、毎日疾患モニターし、開始体重から２０％を超える体重減少を示す動物を、安楽死させた。

【0114】

本明細書において開示される３．７Ｃ６ ＰＤ－１アゴニスト抗体（ＡＰＥ１２０９５）は、１０％の体重減少までの時間において、アイソタイプ対照に対して統計的に有意な有効性を示した（図１６Ｃ）。本明細書において開示される４３７Ｍ５－１１２抗ＰＤ－１アゴニスト抗体もまた、１０％の体重減少までの時間において、アイソタイプ対照に対して統計的に有意な有効性を示した（図１６Ｄ）。両方の抗ＰＤ－１抗体に対する応答は、二峰性であり、各群における動物の割合は研究において完全に生存していた（図１６Ｃおよび１６Ｄ）。

【0115】

実施例９
この実施例は、カニクイザルの単回投与薬物動態および耐容性研究の研究デザインを実証する。

【0116】

カニクイザルの単回投与薬物動態および耐容性研究の研究デザインを、表１１において記載する。研究中の評価は、以下のとおりであった：
－臨床病理学、投与前（２回）、２、６、２２、および３５日目（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ＣＲＬ））
－血液ＦＡＣＳパネル－主要な白血球集団および２０個のＴ細胞サブセット、投与前（２回）、２、６、２２、および３５日目（ＣＲＬ）
- Ｂ、Ｔ、ＮＫ、単球
- ＣＤ４、ＣＤ８、Ｔセントラルメモリー、Ｔエフェクターメモリー、ＰＤ－１^＋、活性化ＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋、Ｔｒｅｇ
－受容体占有率、４、１４、２８、３５日目
－ＰＫサンプル分析、投与前および３５日目の抗薬物抗体分析
－血清サイトカイン分析（１７プレックス：ＩＬ－１β、ＩＬ－１Ｒａ、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２ｐ４０、ＩＬ－１３、ＩＬ－１７ａ、Ｇ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＦＮγ、ＭＩＰ１β、ＭＩＰ１α、ＴＮＦ－α）、投与前、４時間および２４時間、７日目および３５日目
－Ｐｈｏｅｎｉｘ（登録商標）ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ（登録商標）（Ｃｅｒｔａｒａ，ＵＳＡ）を使用したＰＫパラメーター分析。

【0117】

両方のＰＤ－１抗体は、２８日目に全ての動物において検出可能な薬物レベルでよく作動する薬物動態特性を示した（図１７Ａおよび１７Ｂ）。研究は、３５日目に完了した。用量は、忍容性が高く、有害な臨床兆候または臨床病理における変化は何ら観察されなかった。研究の結果を、表１１および１２において記載する。

【0118】

【表14】

【0119】

【表15】

【0120】

【表16】

【0121】

示されるように、抗体ＡＰＥ１２５３８．０１を投与した全６匹の動物は、３６日目に測定可能な／低力価の抗薬物抗体を有していた。抗体ＡＰＥ１２５３７．０１を投与した６匹の動物のうちの２匹は、３６日目に測定可能な／低力価の抗薬物抗体を有していた。評価したいずれのサイトカインにおいても、意味のある変化は何らなかった。さらに図１８Ａおよび１８Ｂ中に示すように、１４日目まで通した持続的な受容体占有が、＃１００１（４３７Ｍ５－１１２でＩＶ投与した）を除く全ての動物において観察され；いくらかの占有が、２８日目まで通してほとんどの動物において見られた。

【0122】

実施例１０
この実施例は、本明細書において開示される抗ＰＤ－１抗体がＰＤ－１でトランスフェクトされたＪｕｒｋａｔ細胞においてＰＤ－１細胞質ドメインへのホスファターゼＳＨＰ２のリクルートを誘導したことを実証する。

【0123】

抗体３．７Ｃ６（ＡＰＥ１２８９０）または鶏卵リゾチームを認識するヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体および一定量の抗ＣＤ３（ＵＣＨＴ１クローン；ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を、磁気ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標）Ｍ－２８０ Ｔｏｓｙｌａｔｅｄ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）／ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に結合させた。ビーズ上の抗ＰＤ－１抗体は、抗原提示細胞上の抗体によるＦｃγＲの関与を模倣する。安定なヒトＰＤ－１トランスフェクトＪｕｒｋａｔ細胞を、示されたビーズで２分間または１０分間のいずれかの間刺激し、細胞を溶解し、ＰＤ－１を、３．７Ｃ６結合ビーズの添加により免疫沈降させた。免疫沈降物を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析し、その後、抗ＰＤ－１（図１９Ａ、上）、抗ＳＨＰ２（図１９Ａ、中央）、または抗ＳＨＰ１（図１９Ａ、下）のいずれかでイムノブロットした。このシグナル伝達アッセイにおいて、図１９Ａ（イムノブロット）および１９Ｂ（イムノブロットのデンシトメトリー定量化）中に示すように、抗ＣＤ３でのＰＤ－１ Ｊｕｒｋａｔ細胞活性化の後、アイソタイプ対照抗体ではなく、本明細書において記載される３．７Ｃ６抗体が、ＰＤ－１細胞質ドメインへのホスファターゼＳＨＰ２のリクルートを誘導したが、ＳＨＰ１のリクルートは誘導しなかった。抗ＣＤ３コーティングビーズの存在下において、図１９Ａ～Ｂ中に示すように、ＰＤ－１アンタゴニスト抗体ニボルマブ（溶液中で１００ｎＭで使用）は、ＰＤ－１へのＳＨＰ２またはＳＨＰ１のいずれのリクルートも誘導しなかった。可溶性ニボルマブでは、ＳＨＰのリクルートは何ら見られなかった。Ｔ細胞活性化およびＣＤ２８共刺激と組み合わせて、抗体３．７Ｃ６はまた、ＺＡＰ７０およびＬＡＴのリン酸化を低下させた（データは示していない）。抗体３．７Ｃ６は、Ｔ細胞活性化不在下においてシグナル伝達経路に何ら影響を与えなかった。

【0124】

実施例１１
この実施例は、本明細書において開示される３．７Ｃ６抗体が結合するヒトＰＤ－１上のエピトープがＰＤ－Ｌ１結合部位からＰＤ－１の反対側の面上にあることを実証する。

【0125】

本明細書において開示される３．７Ｃ６抗体（ＡＰＥ１２５３７）が結合するＰＤ－１上のペプチドの水素－重水素交換マッピングを、組換えヒトＰＤ－１モノマーを使用してＢｉｏｍｏｔｉｆ ＡＢ（Ｄａｎｄｅｒｙｄ，Ｓｗｅｄｅｎ）で実施した。ＰＤ－１の構造は、ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）がアクセッション４ＺｑＫ（Ｚａｋ，Ｋ． Ｍ． ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ２３：２３４１－２３４８も参照；およびＰＤＢアクセッション５ＧＧＲ（Ｌｅｅ，Ｊ． Ｙ． ｅｔ ａｌ．，２０１６，Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ．，７：１３３５４も参照）で運営するＰｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ（ＰＤＢ）を通して公に入手可能である。図２０Ａおよび２０Ｂ中で「ＨＤＸマッピングされたβ－ヘアピン」とラベル付けされた１つの主要なペプチドを、３．７Ｃ６抗体によって水素－重水素交換から保護した。「ＨＤＸマッピングされたβヘアピン」は、ＰＤ－１のアミノ酸９６～１１０で構成され、該アミノ酸は、配列ＲＶＴＱＬＰＮＧＲＤＦＨＭＳＶを有する。別の主要なペプチドは、ＰＤ－１のアミノ酸３３～４１で構成され、該アミノ酸は、配列ＮＰＰＴＦＳＰＡＬを有する。図２０Ａおよび２０Ｂは、ヒトＰＤ－Ｌ１細胞外結合ドメインの結晶構造の空間充填モデル（薄い灰色）とドッキングされたヒトＰＤ－１細胞外ドメインの結晶構造のリボンモデル（黒色）（ＮＣＢＩ ＰＤＢからのＰＤ－１およびＰＤ－Ｌ１構造）を示す。分子は、左下のＰＤ－１の膜近位領域に配向し（図２０Ａ）、９０°回転して下部中央にＰＤ－１の膜近位領域を示す（図２０Ｂ）。定義された表面領域における異なるセットの変異を含有するヒトＰＤ－１モノマーを発現させ、本明細書において開示される３．７Ｃ６抗体（ＡＰＥ１２０９５）の結合を、表面プラズモン共鳴によって評価した。図２０Ａおよび２０Ｂ中で「ＰＤ－１三重点変異体」とラベル付けされた領域における変異は、本明細書において開示される３．７Ｃ６抗体の結合を完全に無効にした。図２０Ａおよび２０Ｂ中の「ＨＤＸマッピングされたβヘアピン」とラベル付けされたループの上部における変異は、本明細書において開示される３．７Ｃ６抗体の結合に影響を与えなかった。水素－重水素交換およびＰＤ－１変異マッピングの組合せは、本明細書において開示される３．７Ｃ６ ＰＤ－１アゴニスト抗体がＰＤ－Ｌ１結合部位からＰＤ－１の反対側の面上にある、図２０Ｂ中で点線の円によって描写されている領域への結合を示すことを実証した。

【0126】

実施例１２
この実施例は、本明細書において開示される抗ＰＤ－１抗体がケラチノサイトペプチド抗原で刺激された円形脱毛症ドナーからの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）におけるＩＦＮγの産生を阻害したことを実証する。

【0127】

円形脱毛症は、免疫系によって媒介される脱毛である。脱毛は、毛包の免疫特権がＩＦＮγを産生するケラチノサイトおよびメラノサイト抗原特異的Ｔ細胞によって破壊されるときに結果として生じる。Ｔ細胞は、毛包の根鞘に浸潤する。活性化されたＴ細胞は、過剰なＩＦＮγを産生する。主要組織適合性複合体クラスＩおよびＩＩ分子は、異常に発現し、引き続く毛包細胞の破壊および脱毛を結果としてもたらす。

【0128】

ＰＢＭＣを、円形脱毛症ドナーの血液から単離し、ケラチノサイトペプチド抗原（ペプチド抗原プールは、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｅｒｍａｔｏｌ． ２０１６ Ａｕｇ；１３６（８）：１６１７－１６２６によって記載されるとおりであった）、および示された濃度のテトラマーＰＤ－Ｌ１－ＩｇＧ１ Ｆｃ、ＩｇＧ１ ３．７Ｃ６抗ＰＤ－１抗体（ＡＰＥ１２８９０）、または対照ＩｇＧ１アイソタイプテトラマー、または対照ＩｇＧ１アイソタイプの存在下においてプレート中で培養した（２×１０^５細胞／ウェル）。５日後、細胞を、洗浄してＥＬＩＳｐｏｔプレート中でさらなる２０時間インキュベートして、ＩＦＮγ分泌細胞の数を検出した。各ドナーおよび治療群からの結果を、未治療のウェルに対して正規化して、治療および陰性対照についての１２人のドナーからのデータの統計的比較を可能にした。

【0129】

図２１Ａ中に示すように、ＩｇＧ１ ３．７Ｃ６抗ＰＤ－１抗体は、対照ＩｇＧ１アイソタイプと比較して濃度依存的にＩＦＮγ産生を阻害した。図２１Ｂ中に示すように、陽性対照ＰＤ－Ｌ１－ＩｇＧ１ Ｆｃテトラマーは、ＩｇＧ１アイソタイプテトラマーと比較して濃度依存的に対照ＩｇＧ１アイソタイプテトラマーと比較してＩＦＮγ産生を阻害した。本明細書において記載される抗ＰＤ－１抗体およびＰＤ－Ｌ１－ＩｇＧ１ Ｆｃテトラマーの両方が、図２１Ｃおよび２１Ｄ中に示すように、１ｎＭ以上の濃度でＩＦＮγ分泌細胞の数を有意に阻害した（ｐ＜０．００１）。

【0130】

実施例１３
この実施例は、本明細書において開示される抗ＰＤ－１抗体がメラノサイトペプチド抗原で刺激された円形脱毛症ドナーからの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）におけるＩＦＮγの産生を阻害したことを実証する。

【0131】

円形脱毛症は、免疫系によって媒介される脱毛である。脱毛および／または髪の色素沈着の喪失は、毛包の免疫特権がＩＦＮγを産生するケラチノサイトおよびメラノサイト抗原特異的Ｔ細胞によって破壊されるときに結果として生じる。Ｔ細胞は、毛包の根鞘に浸潤する。活性化されたＴ細胞は、過剰なＩＦＮγを産生する。主要組織適合性複合体クラスＩおよびＩＩ分子は、異常に発現し、引き続く毛包細胞の破壊および脱毛を結果としてもたらす。皮膚における同様のメラノサイト特異的Ｔ細胞応答は、白斑におけるメラノサイトの破壊を結果としてもたらす。

【0132】

ＰＢＭＣを、円形脱毛症ドナーの血液から単離し、メラノサイトペプチド抗原（ペプチド抗原プールは、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｅｒｍａｔｏｌ．２０１６ Ａｕｇ １３６（８）：１６１７－１６２６によって記載されるとおりであった）、および示された濃度のテトラマーＰＤ－Ｌ１－ＩｇＧ１ Ｆｃ、ＩｇＧ１ ３．７Ｃ６抗ＰＤ－１抗体（ＡＰＥ１２８９０）、または対照ＩｇＧ１アイソタイプテトラマー、または対照ＩｇＧ１アイソタイプの存在下においてプレート中で培養した（２×１０５細胞／ウェル）。５日後、培養上清中の分泌されたＩＦＮγを、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）によって定量化した。各ドナーおよび治療からの結果を、未治療のウェルに対して正規化して、治療および陰性対照についての１２人のドナーからのデータの統計的比較を可能にした。さらに、５日後、細胞を洗浄しＥＬＩＳｐｏｔアッセイにおいてさらなる２０時間インキュベートして、ＩＦＮγ分泌細胞の数を検出した。各ドナーおよび治療からの結果を、未治療のウェルに対して正規化して、治療および陰性対照についての１２人のドナーからのデータの統計的比較を可能にした。結果を、図２３Ａ～２３Ｄ中に示す。

【0133】

図２３Ａ中に示されるように、ＩｇＧ１ ３．７Ｃ６抗ＰＤ－１抗体は、対照ＩｇＧ１アイソタイプと比較して濃度依存的にＩＦＮγ産生を阻害した。図２３Ｂ中に示すように、陽性対照ＰＤ－Ｌ１－ＩｇＧ１ Ｆｃテトラマーは、ＩｇＧ１アイソタイプテトラマーと比較して濃度依存的に対照ＩｇＧ１アイソタイプテトラマーと比較してＩＦＮγ産生を阻害した。本明細書において記載される抗ＰＤ－１抗体およびＰＤ－Ｌ１－ＩｇＧ１ Ｆｃテトラマーの両方が、１００ｎＭ以上の濃度でＩＦＮγ産生を有意に阻害した（ｐ＜０．００１）。図２３Ｃおよび２３Ｄ中に示すように、本明細書において記載される抗ＰＤ－１抗体およびＰＤ－Ｌ１－ＩｇＧ１ Ｆｃテトラマーの両方が、１０ｎＭ以上の濃度でＩＦＮγ分泌細胞の数を有意に低下させた（ｐ＜０．００１）。

【0134】

実施例１４
この実施例は、本明細書において開示される抗ＰＤ－１抗体が３ｍｇ／ｋｇの投与量で異種ＮＳＧ／Ｈｕ－ＰＢＭＣ移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）モデルにおいてインビボで有効性を示すことを実証する。

【0135】

本明細書において開示される抗ＰＤ０１抗体の有効性を試験する異種ＮＳＧ／Ｈｕ－ＰＢＭＣ ＧｖＨＤモデルを、Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｓａｃｒａｍｅｎｔｏ，ＣＡ）で実施した。ＮＯＤ－ｓｃｉｄ ＩＬ２ｒγ^ｎｕｌｌ（ＮＳＧ）マウスに１ Ｇｙを照射し、その後、図２４Ａ中に例示するように、各マウス中への０．９ｘ１０^７個のヒトＰＢＭＣの静脈内注射を行った。抗体は、ＰＢＭＣ注射の翌日から始めて４週間、週２回３０ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、または３ｍｇ／ｋｇで腹腔内投与した。第４の群は、無関係なアイソタイプ対照抗体を週２回３０ｍｇ／ｋｇで投与し、第５の群は、モデルにおける有効性についての既知の陽性対照であるＣＴＬＡ－４－ＩｇＧを週３回７５μｇ／マウスで投与した。本研究における投与計画および投与群を、図２４Ｂ中に示す。疾患は、体重減少、死亡、およびＧｖＨＤスコア測定：体重減少、活動、毛皮の質感、蒼白、および姿勢によって週３回モニターした。１０％を超える体重減少を示す動物を、毎日疾患モニターし、開始体重から２０％を超える体重減少を示す動物を、安楽死させた。

【0136】

本明細書において開示される３．７Ｃ６ ＰＤ－１アゴニスト抗体（ＡＰＥ１２８９０）は、生存においてアイソタイプ対照に対して統計的に有意な有効性を示し、生存時間の中央値を増加させた（図２４Ｃ）。研究期間中にわたる個々の動物の開始体重のパーセントを、３０ｍｇ／ｋｇのアイソタイプ対照ＩｇＧ１、３０ｍｇ／ｋｇの抗ＰＤ－１アゴニストＩｇＧ１（３．７Ｃ６）、１０ｍｇ／ｋｇの抗ＰＤ－１アゴニストＩｇＧ１（３．７Ｃ６）、３ｍｇ／ｋｇの抗ＰＤ－１アゴニストＩｇＧ１（３．７Ｃ６）、および７５μｇ／用量のＣＴＬＡ－４－Ｉｇ（陽性対照）を投与したときについて、それぞれ図２４Ｄ、２４Ｅ、２４Ｆ、２４Ｇ、および２４Ｈ中に示す。

【0137】

抗ＰＤ－１アゴニストＩｇＧ１（３．７Ｃ６）３０ｍｇ／ｋｇと抗ＰＤ－１アゴニストＩｇＧ１（３．７Ｃ６）３ｍｇ／ｋｇ用量群との間で生存における有意差はなかった。これは、ＧｖＨＤモデルにおける有効性が３ｍｇ／ｋｇ未満の用量で得られ得ることを示唆する。

【0138】

本明細書において引用される刊行物、特許出願、および特許を含む全ての参考文献は、各参考文献が参照により組み込まれることが個別にかつ具体的に示され、その全体が本明細書において記載されているかのように同程度に参照により本明細書に組み込まれる。

【0139】

本発明を説明する文脈における（特に以下の特許請求の範囲の文脈における）用語「ａ」および「ａｎ」および「ｔｈｅ」および「少なくとも１つ」並びに同様の指示対象の使用は、本明細書において別途示されているかまたは文脈によって明確に矛盾することがない限り、単数形および複数形の両方をカバーすると解釈されるべきである。１つ以上の項目のリストによって伴われる用語「少なくとも１つ」（例えば、「ＡおよびＢの少なくとも１つ」）は、本明細書において別途示されているかまたは文脈によって明確に矛盾することがない限り、リストされた項目（ＡまたはＢ）から選択される１つの項目またはリストされた項目（ＡおよびＢ）の２つ以上の任意の組合せを意味すると解釈されるべきである。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、および「含有する」は、別途特に言及されていない限り、制限のない用語（すなわち、「含むが、これに限定されない」を意味する）として解釈されるべきである。本明細書における値の範囲の列挙は、本明細書において別途示されていない限り、範囲内にある各別個の値を個別に指す簡単な方法として役立つことを単に意図し、各別個の値は、本明細書において個別に列挙されているかのように明細書中に組み込まれる。本明細書において記載される全ての方法は、本明細書において別途示されているかさもなければ文脈によって明確に矛盾することがない限り、任意の適切な順序で実施することができる。本明細書において提供されるありとあらゆる実施例、または例示的な言い回し（例えば、「などの」）の使用は、単に本発明をよりよく明らかにすることを意図し、別途請求の範囲において請求されていない限り本発明の範囲に制限を置くものではない。明細書中のいかなる言い回しも、本発明の実施に不可欠であるとして請求の範囲において請求されていない任意の要素を示すとして解釈されるべきではない。

【0140】

この発明の好ましい実施態様は、本発明を行うための本発明者らに知られている最良の態様を含めて、本明細書において記載されている。それらの好ましい実施態様の変形は、前述の説明を読むと、当業者に明らかになる得る。本発明者らは、当業者がそのような変形を適切に使うことを期待し、本発明者らは、本明細書において具体的に記載されている以外の方法で本発明を実施することを意図する。従って、この発明は、適用法によって許可される、本明細書に添付される特許請求の範囲において列挙されている主題の全ての修正および同等物を含む。さらに、その全ての可能な変形における上記の要素の任意の組合せは、本明細書において別途示されているかさもなければ文脈によって明確に矛盾することがない限り、本発明によって包含される。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10A】

【図10B】

【図11A】

【図11B】

【図11C】

【図12A】

【図12B】

【図13A】

【図13B】

【図14A】

【図14B】

【図15A】

【図15B】

【図15C】

【図15D】

【図16A】

【図16B】

【図16C】

【図16D】

【図17A】

【図17B】

【図18A】

【図18B】

【図19A】

【図19B】

【図20】

【図21A】

【図21B】

【図21C】

【図21D】

【図22】

【図23A】

【図23B】

【図23C】

【図23D】

【図24A】

【図24B】

【図24C】

【図24D】

【図24E】

【図24F】

【図24G】

【図24H】

【配列表】

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