特許 7490696 抗生物質感受性の全同定のためのアッセイ

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-05-17

(45)【発行日】2024-05-27

(54)【発明の名称】抗生物質感受性の全同定のためのアッセイ

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/08 20060101AFI20240520BHJP

   G01N 33/50 20060101ALI20240520BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/08

G01N33/50 G

G01N33/50 R

【請求項の数】 7

【外国語出願】

(21)【出願番号】P 2022042545

(22)【出願日】2022-03-17

(62)【分割の表示】P 2020507493の分割

【原出願日】2018-04-19

(65)【公開番号】P2022088465

(43)【公開日】2022-06-14

【審査請求日】2022-04-04

(31)【優先権主張番号】62/487,395

(32)【優先日】2017-04-19

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】519373213

【氏名又は名称】シーエーピー ダイアグノスティック、エルエルシー、ディービーエー パスノスティクス

(74)【代理人】

【識別番号】110000855

【氏名又は名称】弁理士法人浅村特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】バウノッホ、デイビッド、エー．

(72)【発明者】

【氏名】ペニャランダ、ミゲル、エフ．アール．

(72)【発明者】

【氏名】オペル、マイケル、エル．

(72)【発明者】

【氏名】バディル、マー

【審査官】白井 美香保

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０１５／０４２５８３（ＷＯ，Ａ２）

【文献】特表２０１２－５１８４２７（ＪＰ，Ａ）

【文献】Emerging Microbes and Infections，2016年，Vol.5, e116，p.1-11

【文献】RSC Advances，2015年，Vol.5，p.35211-35223

【文献】Journal of Clinical Microbiology，2014年，Vol.52, No.9，p.3310-3317

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｑ １／００－３／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡＰＬＵＳ／ＢＩＯＳＩＳ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

サンプル中の細菌の混合集団の抗生物質感受性を同時に決定するための方法であって、
（ａ）一定量のサンプルを増殖培地と混合し、一定期間インキュベートする工程、ここで該サンプルが感染が疑われる被験者からのものである、
（ｂ）インキュベートしたサンプルの部分をマルチウェルプレートの複数のウェルに同時に適用する工程、ここで複数のウェルの各々は単一の抗生物質または抗生物質の組み合わせを有する液体の抗生物質含有増殖培地を含有し、各々の単一の抗生物質または抗生物質の組み合わせについて、異なる濃度の単一の抗生物質または抗生物質の組み合わせを有する少なくとも二つのウェルが存在し、細菌は抗生物質含有増殖培地に適用するに先立ってサンプルから単離されていない、
（ｃ）前記サンプル部分を前記抗生物質含有増殖培地中で一定期間培養する工程、
（ｄ）ＯＤ_６００を測定し、各抗生物質含有増殖培地について調整されたＯＤ_６００を計算することにより抗生物質含有増殖培地における細菌の増殖を測定する工程、ここで、抗生物質含有増殖培地の調整されたＯＤ_６００測定値がサンプルからの細菌の、抗生物質の各組み合わせに対するおよび単独で試験した各抗生物質に対する感受性または耐性を示すものであり、調整されたＯＤ_６００が０．０６５以上である場合サンプル中の細菌は抗生物質または抗生物質の組み合わせに対して耐性であり、調整されたＯＤ_６００が０．０６５未満である場合サンプル中の細菌は抗生物質または抗生物質の組み合わせに対して感受性である、および
（ｅ）工程（ｄ）に基づく抗生物質耐性結果を準備する工程、
を含む、上記方法。

【請求項2】

前記抗生物質の組み合わせが少なくとも２つの抗生物質、少なくとも３つの抗生物質、少なくとも４つの抗生物質、少なくとも５つの抗生物質、少なくとも６つの抗生物質、少なくとも７つの抗生物質、少なくとも８つの抗生物質、少なくとも９つの抗生物質、または少なくとも１０の抗生物質を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

各ウェルのＯＤ_６００が１回測定される、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

各サンプルのＯＤ_６００が複数回測定される、請求項１に記載の方法。

【請求項5】

前記調整されたＯＤ_６００が、バックグラウンド対照を差し引いた、単一のＯＤ_６００測定値、または複数の測定値の平均ＯＤ_６００を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項6】

前記サンプルが生物学的液体または生検サンプルである、請求項１に記載の方法。

【請求項7】

前記サンプルが、尿、血液、唾液、喀痰、肺洗浄液、膣分泌物、生検組織、または脳脊髄液を含む、請求項１に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【背景技術】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年４月１９日に出願された米国仮出願第６２／４８７，３９５号の利益を主張し、その内容全体は参照により本明細書に組み込まれる。

【0002】

背景技術
感染性疾患は複数の臓器系に影響を及ぼし、重大な罹患率、死亡率、および経済的影響の原因となっている。感染病原体は、単一の病原体としてではなく、複雑な複数菌感染症として最もよく存在している。体内では、これらの複数菌感染症は、生物が感受性である抗生物質の種類だけでなく、感染症の治療に必要な抗生物質のレベルおよび個々の病原体の毒性を変化させる相利共生によって互いに協働する。現在の最も基準となる検査は培養と感受性であり、サンプルを、寒天培地を含むプレート上に設置して一晩培養するプロセスは、個々の生物を分離および同定することを可能にする。通常、抗生物質感受性試験を通じて個々の生物がどの抗生物質に感受性であるかを同定するために、追加の日が必要である。このプロセスの有効性は、手法の感受性と特異性が本質的に低いために制限される。例えば、最近の研究では、すべての尿培養結果の最大２５％が偽陰性所見を生み出し、すべての尿路病原体の最大２／３が培養によって失われていることがわかっている。このプロセスは、通常４８～７２時間かかり、正確な診断なしに、および感染症の治療に有効な抗生物質の種類に関する適切な誘導なしに、臨床医が経験的に患者を治療することを余儀なくされるという点で、臨床診療に大きな影響を及ぼす。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0003】

現在の抗生物質感受性試験における固有の欠点は、生物の全プールを同時に検査するのではなく、個別の生物のみを検査することに依存するということである。分離を必要とすることにより、試験プロセスに最低１日追加される。抗生物質耐性のより迅速な決定を可能にする分離を必要とせずに、抗生物質耐性の同時評価を可能にする試験の必要性がある。本明細書に記載の方法は、事前の分離を必要とせずに、すべての成分における抗生物質耐性を同時に評価するための単純な費用効率の高い方法である。

【0004】

本明細書に開示されるのは、最初にサンプルから細菌を分離することなく、複数の抗生物質に対する患者のサンプルに存在する細菌の混合集団の抗生物質感受性を同時に決定する方法である。

【課題を解決するための手段】

【0005】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるのは、サンプル中の細菌の混合集団の複数の抗生物質に対する感受性を同時に決定するための方法であって、前記サンプルのある量を複数の抗生物質含有培地に同時に適用し、前記サンプルが感染症が疑われる被験者からのものである工程と、前記サンプルを前記培地上で一定期間培養する工程と、前記培地に存在する細菌を溶液で懸濁し、前記懸濁液を回収する工程と、前記懸濁液のＯＤ_６００を測定し、懸濁液の調整されたＯＤ_６００が前記サンプル中の細菌の個々の抗生物質に対する感受性または耐性を示す工程と、前記感受性情報を医療専門家に提供して、前記被験者の抗生物質療法を決定する工程とを含む、方法である。前記サンプルが複数種の細菌を有する疑いがある。

【0006】

いくつかの実施形態では、前記複数の抗生物質含有培地が、複数のウェルに抗生物質含有細菌増殖培地が配置されたマルチウェルアッセイプレートを含む。いくつかの実施形態では、前記マルチウェルアッセイプレートが９６個のウェルを有する。いくつかの実施形態では、前記細菌増殖培地が寒天含有培地である。

【0007】

いくつかの実施形態では、前記複数の抗生物質が、スルファメトキサゾール、トリメトプリム、ニトロフラントイン、ホスホマイシン、アモキシシリン、クラブラナート、セフポドキシム、セフジニル、セファクロル、セフェピム、セファゾリン、シプロフロキサシン、レボフロキサシン、セフトリアキソン、ゲンタマイシン、トブラマイシン、アビバクタム、セフタジジム、セフトロザン、タゾバクタム、ノルフロキサシン、メロペネム、ピペラシリン、セフォキシチン、テトラサイクリン、スルバクタム、セフロキシム、およびバンコマイシンの２以上を含む。いくつかの実施形態では、前記複数のウェルのそれぞれが、単一の抗生物質または抗生物質の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、前記抗生物質の組み合わせが２つの抗生物質を含む。いくつかの実施形態では、前記複数の抗生物質が、少なくとも３つの抗生物質、少なくとも４つの抗生物質、少なくとも５つの抗生物質、少なくとも６つの抗生物質、少なくとも７つの抗生物質、少なくとも８つの抗生物質、少なくとも９つの抗生物質、または少なくとも１０の抗生物質を含む。いくつかの実施形態では、各抗生物質または抗生物質の組み合わせが、２つ以上の濃度で前記ウェルに存在する。いくつかの実施形態では、各抗生物質、または抗生物質の組み合わせが、３つ以上の濃度で前記ウェルに存在する。

【0008】

いくつかの実施形態では、前記懸濁液のＯＤ_６００が複数回測定される。いくつかの実施形態では、前記ＯＤ_６００が２回、３回、４回、または５回測定される。いくつかの実施形態では、前記調整されたＯＤ_６００が、バックグラウンド制御を差し引いた複数の測定値の平均ＯＤ_６００を含む。いくつかの実施形態では、前記調整されたＯＤ_６００が０．０２５未満である場合、前記サンプル中の前記細菌が抗生物質または抗生物質の組み合わせに対して感受性である。いくつかの実施形態では、前記調整されたＯＤ_６００が０．０２５以上である場合、前記サンプル中の前記細菌が抗生物質または抗生物質の組み合わせに対して耐性である。

【0009】

いくつかの実施形態では、前記サンプルが生物学的液体または生検サンプルである。いくつかの実施形態では、前記サンプルが、尿、血液、唾液、喀痰、肺洗浄液、膣分泌物、生検組織、または脳脊髄液を含む。

【0010】

本明細書では、サンプル中の細菌の混合集団の複数の抗生物質に対する感受性を同時に決定するための方法も開示され、この方法が、前記サンプルのある量を増殖培地と混合し、一定期間培養する工程と、前記サンプルを複数の抗生物質含有培地に同時に適用し、前記サンプルが感染症が疑われる被験者からのものである工程と、前記サンプルを前記抗生物質含有培地で一定期間培養する工程と、前記培地中の細菌増殖をＯＤ_６００測定により測定し、前記サンプルの調整されたＯＤ_６００測定値が、前記サンプル内の前記細菌の個々の抗生物質に対する感受性または耐性を示す工程と、前記感受性情報を医療専門家に提供して、前記被験者の抗生物質療法を決定する工程とを含む。前記サンプルが複数種の細菌を有する疑いがある。

【0011】

いくつかの実施形態では、前記複数の抗生物質含有培地が、複数のウェルに抗生物質含有細菌増殖培地が配置されたマルチウェルアッセイプレートを含む。いくつかの実施形態では、前記マルチウェルアッセイプレートが９６個のウェルを有する。いくつかの実施形態では、前記培地が液体ブロス培地である。いくつかの実施形態では、前記培地がミューラーヒントン培地である。

【0012】

いくつかの実施形態では、前記複数の抗生物質が、スルファメトキサゾール、トリメトプリム、ニトロフラントイン、ホスホマイシン、アモキシシリン、クラブラナート、セフポドキシム、セフジニル、セファクロル、シプロフロキサシン、レボフロキサシン、セフトリアキソン、ゲンタマイシン、トブラマイシン、アビバクタム、セフタジジム、セフトロザン、タゾバクタム、ノルフロキサシン、メロペネム、ピペラシリン、セフォキシチン、テトラサイクリン、スルバクタム、セフロキシム、およびバンコマイシンの２以上を含む。いくつかの実施形態では、前記複数のウェルのそれぞれが、単一の抗生物質または抗生物質の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、前記抗生物質の組み合わせが２つの抗生物質を含む。いくつかの実施形態では、前記複数の抗生物質が、少なくとも３つの抗生物質、少なくとも４つの抗生物質、少なくとも５つの抗生物質、少なくとも６つの抗生物質、少なくとも７つの抗生物質、少なくとも８つの抗生物質、少なくとも９つの抗生物質、または少なくとも１０の抗生物質を含む。いくつかの実施形態では、各抗生物質または抗生物質の組み合わせが、２つ以上の濃度で前記ウェルに存在する。いくつかの実施形態では、各抗生物質、または抗生物質の組み合わせが、３つ以上の濃度で含まれる。

【0013】

いくつかの実施形態では、前記サンプルのＯＤ_６００が１回測定される。いくつかの実施形態では、前記サンプルのＯＤ_６００が複数回測定される。いくつかの実施形態では、前記ＯＤ_６００が２回、３回、４回、または５回測定される。いくつかの実施形態では、前記調整されたＯＤ_６００が、バックグラウンド対照を差し引いた、単一のＯＤ_６００測定値、または複数の測定値の平均ＯＤ_６００を含む。いくつかの実施形態では、前記調整されたＯＤ_６００が０．０６５未満である場合、前記サンプル中の前記細菌が抗生物質または抗生物質の組み合わせに対して感受性である。いくつかの実施形態では、前記調整されたＯＤ_６００が０．０６５以上である場合、前記サンプル中の細菌が抗生物質または抗生物質の組み合わせに対して耐性である。

【0014】

いくつかの実施形態では、前記サンプルが生物学的液体または生検サンプルである。いくつかの実施形態では、前記サンプルが、尿、血液、唾液、喀痰、肺洗浄液、膣分泌物、生検組織、または脳脊髄液を含む。

【図面の簡単な説明】

【0015】

【図1】図１は、ウェル内容物と抗生物質濃度（μｇ／ｍＬ）を含む例示的な抗生物質ソースプレートを示す。Ｎｉｔｒｏ＝ニトロフラントイン、Ｃｉｐｒｏ＝シプロフロキサシン、Ｍｅｒｏ＝メロペネム、Ｃｅｆｔｉａｘｏｎｅ＝セフトリアキソン、ＴＭＰ／ＳＭＸ＝トリメトプリム＋スルファメトキサゾール、Ｐｉｐ／Ｔａｚｏ＝ピペラシリン＋タゾバクタム、Ｌｅｖｏ＝レボフロキサシン、Ｃｅｆｏｘｉｔｉｎ＝セフォキシチン、Ｔｅｔｒａ＝テトラサイクリン、Ａｍｐ／Ｓｕｌｂ＝アンピシリン＋スルバクタム、Ａｍｐ＝アンピシリン、Ｖａｎｃｏ＝バンコマイシン

【0016】

【図2】図２は、ウェル内容物と抗生物質濃度（μｇ／ｍＬ）を含む例示的な抗生物質ソースプレートを示す。Ｃｅｆａｚｏｌｉｎ＝セファゾリン、Ｃｅｆｅｐｉｍｅ＝セフェピム、Ｃｅｆｔａｚｉｄｉｍｅ＝セフタジジム、Ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ＝ゲンタマイシン、Ａｍｏｘ／Ｃｌａｖ＝アモキシシリン＋クラブラナート、Ｃｅｆａｃｌｏｒ＝セファクロル

【発明を実施するための形態】

【0017】

複数菌感染症の診断と管理は、特に複数の部位および臓器系に影響を及ぼす複数菌感染症が臨床的および経済的に重要な影響を及ぼしている高齢化人口とともにこれまでになく重要になってきている。これらの感染症の診断と管理は、それらと戦うために利用可能な抗生物質の有効性の低下と相まって、利用可能な質の低い診断ツールの影響を大きく受ける。これらの課題を評価するための優れたモデルシステムは、尿路感染症（ＵＴＩ）の診断と管理である。

【0018】

過去には、尿は「無菌」液体とみなされ、通常は細菌が存在しなかった。細菌の繁殖のない培養物は細菌を含まないと考えられていたが、これは必ずしも細菌が存在しないことによるものではなく、尿培養物における細菌増殖がないことによる可能性があることが現在わかっている。現在、人間の膀胱は、微生物を培養する能力が限られているために見過ごされてきた通常存在する細菌叢のスペクトルを含む微生物叢を有すると認識されている。この問題の結果は、細菌感染の頻度と範囲の控えめな表現である。

【0019】

最近の研究（Ｗｏｌｆｅ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ５０：１３７６－１３８３、２０１２）では、排尿、経尿道、および／または恥骨上の採取方法から得られた尿サンプルを比較し、１６Ｓ ｒＲＮＡのＰＣＲ増幅による標準培養方法を決定した。この研究では、細菌が少なくとも培養陰性の経尿道的に採取された尿の一部に存在し、サンプルが他のソース（膣または直腸の雑菌混入）からの細菌で雑菌混入される可能性が最も低いことが実証された。ＵＴＩの症状のある患者の約半数のみの尿が陽性培養になると推定されている。

【0020】

さらに、ＵＴＩは通常単一の細菌株によると考えられ、培養後に複数の細菌株が尿検体に存在する場合、検体は採取中に雑菌混入されたと推定された。複数の細菌株を含むこれらの培養物は多くの場合廃棄され、さらに処理されなかった。現在、多くのＵＴＩが複数菌であり、細菌株が膀胱に定着する際に互いに協動またはサポートする可能性があることが認識されている。

【0021】

現在存在する尿培養条件は、培地の組成からｐＨ、ガス比、培養時間まで、主に大腸菌などの病原体のサブセットの検出に偏っている。ただし、これらの偏ったアッセイは臨床症状と一致しない。したがって、尿サンプルの定期試験では、多くの尿路病原体を見逃している。

【0022】

抗生物質耐性細菌の有病率が増加しているため、未診断の耐性生物が存在するため、ＵＴＩの治療が多くの場合不十分である。さらに、複数菌感染症は、単菌感染症と比較して抗生物質耐性と病原性の頻度を増加させた。

【0023】

例えば、スタフィロコッカス・サプロフィティカスとミラビリス変形菌の両方による感染症は、上行性腎盂腎炎のリスクを高め、尿路病原性大腸菌（ＵＰＥＣ）とＰ．ミラビリスの両方による感染症は、両方の微生物をもつコロニー形成単位（ＣＦＵ）の増加をもたらし、Ｐ．ミラビリスとプロビデンシア株の両方による感染症は、尿路結石のリスクを高め、緑膿菌とエンテロコッカス・フェカリスの両方による感染症は、腎盂腎炎のリスクを高め、Ｂ群連鎖球菌とＵＰＥＣの両方による感染症は、ＵＰＥＣの力価を増加する。

【0024】

微生物の特定および関連する複数菌感染症の管理に伴う課題は、尿に限定されない。それは、実際には例外ではなく標準であり、耳、鼻、喉、胃腸管、腎臓結石、爪と皮膚、前立腺、呼吸器系、手術前および外科感染症、および創部のケアにおいての感染症が挙げられる。これらの複数菌感染症は、多くの場合、関与する多数の生物と複合したものである。例えば、細菌性前立腺炎は、任意の特定の精液サンプルで病原体が発見される可能性があるため、一度に１～８のさまざまな病原体によって引き起こされ、微生物の完全濃度は２．０～７．５ｌｏｇ１０ＣＦＵ／ｍｌで変化する。嚢胞性繊維症では、同じ患者や肺の別の部分内であっても、感染症は遺伝的および表現型的に多様化していると認識されている。感染症の多様性は管理に影響を与える可能性が高く、同じ空間に存在する２つ以上の種の存在は、個々の細菌種の挙動を変えるようである。それらの伝染は、遺伝データを広げることを含み、抗生物質感受性に影響する。特定の細菌の存在は、より良好な結果またはより悪い結果に関連する可能性がある。

【0025】

手術部位感染症では、医療関連感染症（ＨＡＩ）のサブコンポーネントは、ＨＡＩ全体の２０％を占め、手術部位感染症はすべての外科手術の約５％で生じる。手術部位感染症は、複数菌感染症から生じることが示されている。

【0026】

複数菌感染症の最も一般的な部位の１つは創部のケアにおいてである。褥瘡は、運動障害のある高齢者に最も多く見られ、治癒が非常に困難である。高齢者の約２６％は、入院の瞬間に褥瘡を患っており、年齢の結果として発生が著しくエスカレートする。発生する潰瘍は、いくつかの感染合併症に関連する可能性がある。慢性および急性の創傷は、広範な健康問題を具体化する。皮膚創傷は、嫌気性および好気性の細菌株ならびに真菌株の両方によって定着し、それらのほとんどは、周囲の皮膚、口、および腸の常在微生物叢に属する、または外部環境からのものであり、複数菌群生を形成する。

【0027】

腎臓結石は、複数菌の細菌性病原体を取り込むことが示されている。腎臓結石は、尿路に発達する結石または結晶の固体片である。結石は、尿における血尿、嘔吐、または痛みを伴う排尿につながる場合がある。腎臓や膀胱に長期チューブがある人などの、慢性ＵＴＩに苦しんでいる人、または神経障害（麻痺、多発性硬化症、二分脊椎）により排尿が衰えた人が最もリスクが高くなる。

【0028】

したがって、複数菌感染症の有病率は、新しい手法の開発を必要とする。現在の培養指針を使用して、複数菌感染症は、ほとんどの場合、混合細菌叢、可能性が高い雑菌混入として分類され、詳しく研究されていない。血液中の複数菌感染症を示す多くの研究があり、対応するＵＴＩの結果はサンプルの適切な特性評価の重要性を裏付けている。従来の培養で見られるこの感受性の欠如は、現在の培養の指針と相まって、感染症の症状を呈し、診断が得られない患者の発生率の増加の根拠をなし、効果のない治療につながる。

【0029】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されているのは、患者サンプル中に存在する複合微生物叢（複数菌）の抗生物質感受性アッセイである。したがって、本方法でアッセイされるサンプルは、試験前に任意に保存され、任意に希釈されるサンプルを含む。抗生物質感受性トレーニングの前に、サンプルから細菌は分離されてない。開示された方法は、生物学的文脈でサンプル内に見られる生物の治療に必要な抗生物質を特定し、所望の抗生物質の最小阻害濃度（ＭＩＣ）を決定する。

【0030】

本明細書で使用される「サンプル」という用語は、感染症が疑われる被験者から採取された任意の生物学的液体または組織を指す。例示的な「サンプル」としては、尿、血液、唾液、喀痰、肺洗浄液、糞便、膣分泌物、生検組織、脳脊髄液、または抗生物質感受性アッセイを必要とする任意の体液または組織が挙げられるが、これらに限定されない。

【0031】

本明細書で使用される「被験者」という用語は、抗生物質感受性試験が望まれる任意の哺乳類被験者を指し、ヒト、コンパニオン・アニマル（例えば、犬、猫、モルモット、ハムスター、フェレット、ウサギ、ラット、マウスなど）、家畜（例えば、牛、豚、羊、山羊、馬など）、および感染症が疑われ、抗生物質感受性アッセイが必要なその他の任意の哺乳類が挙げられるが、これらに限定されない。

【0032】

本明細書で使用される「細菌」という用語は、単一の種または複数の種を指し得る。

【0033】

本明細書で使用される「複数菌」という用語は、複数の種の細菌が存在するサンプルを指す。複数菌サンプルは、また、細菌の混合集団を有することを指す。

【0034】

本明細書で使用される「感受性である」という用語は、感染部位を治療するために推奨される用量が使用される場合、通常達成可能な濃度の抗菌剤によって阻害される細菌を指す。

【0035】

本明細書で使用される「耐性」という用語は、通常の投与スケジュールで通常達成可能な濃度の抗生物質によって阻害されない、および／または特定の微生物耐性メカニズム（例えば、β－ラクタマーゼ）が存在する可能性が高い範囲に入る最小阻害濃度を示す細菌を指し、治療研究において、分離株に対する薬剤の臨床的有効性が確実に示されていない。

【0036】

最小阻害濃度（ＭＩＣ）は、寒天またはブロス希釈感受性試験で微生物の目に見える増殖を防ぐ抗菌剤の最低濃度である。

【0037】

現在の抗生物質感受性試験方法は、感受性試験の前にサンプルから培養された個々の生物に対して行われる。米国臨床検査標準委員会（Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）は、試験される細菌種に特有の抗生物質濃度を確立し、生物が試験した抗生物質に対して「感受性あり」、「中間」、または「耐性」であるかを示すために利用される。試験方法には、寒天希釈、液体培養希釈、およびディスク拡散の「最も基準となる検査」方法が含まれる。

【0038】

現在、ブロス（液体）または寒天希釈法のいずれかを使用して、所定の細菌分離株に対する抗菌剤のインビトロ活性を定量的に測定し得る。試験を実行するには、一連のチューブまたはプレートは、さまざまな濃度の抗菌剤を加えたブロスまたは寒天培地を備える。次いで、試験生物の標準懸濁液をチューブまたはプレートに接種する。３５±４℃での培養後、試験が検査され、ＭＩＣが決定される。最終結果は手法によって大きく影響を受け、再現可能な結果（研究所内および研究所間）が達成されるなら、慎重に制御しなければならない。

【0039】

現在、病原性の可能性のある各タイプの生物の分離されたコロニーは、初期の寒天プレートから選択され、感受性について個別に試験される。多くの場合、識別手順は同時に実行される。現在、異なる種類の微生物の混合物を同じ感受性試験プレートまたはパネルで試験しないことが推奨されている。

【0040】

臨床材料（例えば、通常は無菌の体液および組織）で感受性試験を直接実施することは、直接グラム染色が単一の病原体を示唆している場合の臨床上の緊急事態を除き、以前は推奨されていなかった。試験室は、臨床材料で直接試験を実施した場合、結果は予備試験として報告されるべきであり、感受性試験は分離された微生物で標準手法を使用して繰り返した。したがって、開示される方法は、現在受け入れられている手法とは異なる。

【0041】

寒天希釈法は、最も基準となる検査とみなされているが、それは労力、材料、およびスペースの要件が高いため、めったに使用されない。この方法では、増殖培地および抗生物質を含む固体寒天を含むペトリ皿の準備が必要である。各細菌種で試験される抗生物質ごとに、異なる抗生物質濃度からなる個別のペトリ皿を準備する。１２個の抗生物質の最初のパネルについて、これは各種の４５個の個別のペトリ皿に変わる。（細菌種識別プレート上での一晩の培養から得られた）単離された単一生物を取得した後、生物を各寒天プレート上に固定し、一晩培養する。微生物学者は、次いで、各抗生物質含有寒天プレート上で細菌が増殖するかどうかを視覚的に検査し、記録する。

【0042】

より一般的には、ディスク拡散法が現在使用されており、ここで、単離された単一生物を、増殖培地を含むペトリ皿上に固定し、抗生物質を含浸させた濾紙ディスクを寒天プレート上に設置する。抗生物質が寒天に拡散し、細菌の増殖を止めるか、細菌を殺す場合、細菌が存在するディスクの周りに増殖のないゾーンがある。これは阻害ゾーンと呼ばれる。阻害ゾーンのサイズを測定することによって、ＭＩＣ、感受性、および耐性が決定される。ただし、この方法では、培養プレート全体に細菌を均一に堆積させる必要がある。より大きな阻害ゾーンは、より低いＭＩＣと相関する。

【0043】

また、一般的に使用されるのはブロス微量希釈法であり、ここで、単離された単一の生物が液体増殖培地および抗生物質溶液にさまざまな濃度で接種される。抗生物質が細菌の増殖を止めるか、細菌を殺す場合、懸濁液の濁度は、抗生物質を含まない培地に接種される細菌の濁度に比べてはるかに低いか、存在しない。液体培地にさまざまな濃度の抗生物質を作り出すことによって、ＭＩＣ、感受性、耐性を決定することができる。

【0044】

本明細書に記載の方法は、サンプルの組み合わせられた微生物叢の抗生物質感受性を試験するため、サンプルから最初に個々の細菌種を分離する必要がなくなる。各抗生物質または濃度ごとに別々のペトリ皿またはチューブの必要性は、マルチウェルプレートの異なるウェルに寒天増殖培地または液体増殖培地を異なる抗生物質濃度のすべてで固定することによって取り除かれる（例えば、６ウェル、１２ウェル、２４ウェル、４８ウェル、９６ウェル、３８４ウェルプレート、またはこの目的に適した任意のマルチウェルプレート）。増殖の視覚的評価に伴う労力は、分光光度計分析の使用により取り除かれる。寒天培地を利用する方法の場合、一晩の培養後、水溶液をマルチウェルプレートの各ウェルに設置し培養して、寒天の表面上で増殖する細菌コロニーを懸濁液に移す。このプロセスを支援するために手動攪拌を使用し得、寒天プレート上で増殖し得る任意の細菌を含む水溶液を、分光光度分析のために新しいマルチウェルプレートに移す。液体培地を利用する方法の場合、マルチウェルプレートに配置された懸濁液を、新しいマルチウェルプレートに移さずに分光光度分析に適用する。ＯＤ_６００測定を行って、細菌増殖を測定する。単純な閾値を使用して、所定の抗生物質濃度で細菌が存在するか、存在しないかを示す。

【0045】

本方法は、患者の治療に利用可能な多数から選択される複数の抗生物質を使用して実施される。抗生物質（抗菌剤（ａｎｔｉ－ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ａｇｅｎｔｓ）または抗菌剤（ａｎｔｉ－ｂａｃｔｅｒｉａｌ ａｇｅｎｔｓ）とも呼ばれる）としては、ペニシリン、テトラサイクリン、セファロスポリン、キニノロン、リンコマイシン、マクロライド、スルロナミド、グリコペプチド系抗生物質、アミノグリコシド、カルバペネム、アンサマイシン、リポペプチド、モノバクタム、ニトロフラン、オキサキソリジノン、およびポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。

【0046】

ペニシリン系抗生物質としては、ペニシリン、メチシリン、アモキシシリン、アンピシリン、フルクロキサシリン、ペニシリンＧ、ペニシリンＶ、カルベニシリン、ピペラシリン、チカルシリン、オキサシリン、ジクロキサシリン、アズロシリン、クロキサシリン、メズロシリン、テモシリン、およびナフシリンが挙げられるが、これらに限定されない。さらに、ペニシリン系抗生物質は、多くの場合β－ラクタマーゼ阻害剤と組み合わせて使用され、より広いスペクトル活性をもたらし、これらの抗生物質の組み合わせとしては、アモキシシリン／クラブラナート、アンピシリン／スルバクタム、ピペラシリン／タゾバクタム、およびクラブラナート／チカルシリンが挙げられる。

【0047】

テトラサイクリン系抗生物質としては、テトラサイクリン、ドキシサイクリン、デメクロサイクリン、ミノサイクリン、およびオキシテトラサイクリンが挙げられるが、これらに限定されない。

【0048】

セファロスポリン系抗生物質としては、セファドロキシル、セフラジン、セファゾリン、セファレキシン、セフェピム、セフタロリン、ロラカルベフ、セフォテタン、セフロキシム、セフプロジル、セフォキシチン、セファクロル、セフチブテン、セフトリアキソン、セフォタキシム、セフポドキシム、セフジニル、セフィキシム、セフジトレン、セフチゾキシム、セフォペラゾン、セファロチン、セファマナドール、セフタロリンフォサミル、セトビプロール、およびセフタジジムが挙げられるが、これらに限定されない。セファロスポリン系抗生物質は、多くの場合β－ラクタマーゼ阻害剤と組み合わせて使用され、より広いスペクトルの活性をもたらし、これらの抗生物質の組み合わせとしては、アビバクタム／セフタジジムおよびセフトロザン／タゾバクタムが挙げられるが、これらに限定されない。

【0049】

キノロン系抗生物質としては、ロメフロキサシン、オフロキサシン、ノルフロキサシン、ガチフロキサシン、シプロフロキサシン、モキシフロキサシン、レボフロキサシン、ゲミフロキサシン、シノキサシン、ナリジクス酸、トロバロキサシン、エノキサシン、グレパフロキサシン、スマフロキサシン、およびスマフロキサシンが挙げられるが、これらに限定されない。

【0050】

リンコマイシン系抗生物質としては、クリンダマイシンおよびリンコマイシンが挙げられるが、これらに限定されない。

【0051】

マクロライド系抗生物質としては、アジスロマイシン、クラリスロマイシン、エリスロマイシン、テリスロマイシン、ジリスロマイシン、ロキシスロマイシン、トロレアンドマイシン、スピラマイシン、およびフィダゾマイシンが挙げられるが、これらに限定されない。

【0052】

スルホンアミド系抗生物質には、スルファメトキサゾール、スルファサラジン、マフェニド、スルファセタミド、スルファジアジン、スルファジアジン銀、スルファジメトキシン、スルファニルイミド、スルフィソキサゾール、スルホンアミドクリソイジン、およびスルフィソキサゾールが挙げられるが、これらに限定されない。スルホンアミド系抗生物質は、多くの場合、殺菌活性を改善するためにトリメトプリムと組み合わせて使用される。

【0053】

グリコペプチド系抗生物質としては、ダルババンシン、オリタバンシン、テラバンシン、テイコプラニン、およびバンコマイシンが挙げられるが、これらに限定されない。

【0054】

アミノグリコシド系抗生物質としては、パロモマイシン、トブラマイシン、ゲンタマイシン、アミカシン、カナマイシン、ネオマイシン、ネチルマイシン、ストレプトマイシン、およびスペクチノマイシンが挙げられるが、これらに限定されない。

【0055】

カルバペネム系抗生物質としては、イミペネム、メロペネム、ドリペネム、エルタペネム、およびイミペネム／シラスタチンが挙げられるが、これらに限定されない。

【0056】

アンサマイシン系抗生物質としては、ゲルダナマイシン、ハービマイシン、およびリファキシミンが挙げられるが、これらに限定されない。

【0057】

リポペプチド系抗生物質としては、ダプトマイシンが挙げられるが、これに限定されない。

【0058】

モノバクタム系抗生物質としては、アズトレオナムが挙げられるが、これに限定されない。

【0059】

ニトロフラン系抗生物質としては、フラゾリドンおよびニトロフラントインが挙げられるが、これらに限定されない。

【0060】

オキサキソリジノン系抗生物質としては、リネゾリド、ポジゾリド、ラデゾリド、およびトレゾリドが挙げられるが、これらに限定されない。

【0061】

ポリペプチド系抗生物質としては、バシトラシン、コリスチン、およびポリミキシンＢが挙げられるが、これらに限定されない。

【0062】

上記のグループのいずれの一部でもない他の抗生物質としては、クロファジミン、ダプソン、カプレオマイシン、シクロセリン、エタンブトール、エチオナミド、イソニアジド、ピラジナミド、リファンピシン、リファブチン、リファペンチン、ストレプトマイシン、アルスフェナミド、クロラムフェニコール、ホスホマイシン、フシジン酸、メトロニダゾール、ムピロシン、プラテンシマイシン、キヌプリスチン／ダルフォプリスチン、チアムフェニコール、チゲサイクリン、チニダゾール、およびトリメトプリムが挙げられるが、これらに限定されない。

【0063】

いくつかの実施形態では、疑われる感染症は尿路感染症であり、抗生物質は、シプロフロキサシン、レボフロキサシン、ＴＭＰ／ＳＭＸ、セフトリアキソン、フルオロキノロン、シプロフロキサシン、アミノグリコシド（例えば、ゲンタマイシン５ｍｇ／ｋｇ／日）、アモキシシリン、リネゾリド、バンコマイシン、ニトロフラントイン、ホスホマイシン、ピブメシリナム、アモキシシリン－クラブラナート、アンピシリン－スルバクタム、ピペラシリン、ピペラシリン－タゾバクタム、セファレキシン、セファゾリン、セファクロル、セフロキシム、セフォテタン、セフォタキシム、セフトリアキソン、セフタジジム、セフェピム、セフィキシム、セフポドキシム、アズトレオナム、イミペネム、ドリペネム、トリメトプリム、スルファメトキサゾール、ガチフロキサシン、モキシフロキサシン、オフロキサシン、プルリフロキサシン、クリンダマイシン、アジスロマイシン、およびセファレキシンの１つ以上である。

【0064】

いくつかの実施形態では、疑われる感染症は前立腺感染症であり、抗生物質はアモキシシリン－クラブラナート、アンピシリン－スルバクタム、アンピシリン、ピペラシリン、ピペラシリン－タゾバクタム、セファレキシン、セファゾリン、セファクロル、セフロキシム、セフォテタン、セフォタキシム、セフトリアキソン、セフタジジム、セフェピム、セフィキシム、セフポドキシム、アズトレオナム、イミペネム、ドリペネム、
バンコマイシン、ＴＭＰ／ＳＭＸ、トリメトプリム、スルファメトキサゾール、ニトロフラントイン、シプロフロキサシン、ガチフロキサシン、レボフロキサシン、モキシフロキサシン、オフロキサシン、プロリフロキサシン、クロリマイシン、アジスロマイシン、およびクラリスロマイシンの１つ以上である。

【0065】

いくつかの実施形態では、疑われる感染症は胃腸感染症であり、抗生物質はメトロニダゾール、バンコマイシン、フィダキソマイシン、ニタゾキサニド、メトロニダゾール、ニタゾキサニド、アジスロマイシン、シプロフロキサシン、ドキシサイクリン、ＴＭＰ／ＳＭＸ、フィダキソマイシン、およびチニダゾールの１つ以上である。

【0066】

いくつかの実施形態では、疑われる感染症は肺感染症であり、抗生物質はアジスロマイシン、クラリスロマイシン、セフロキシム、セフポドキシム、セフジニル、アンピシリン／クラブラナート、シプロフロキサシン、レボフロキサシン、モキシフロキサシン、ゲミフロキサシン、ＴＭＰ／ＳＭＸ、テトラサイクリン（例えば、ドキシサイクリン）、アモキシシリン、アンピシリン、アモキシシリン／クラブラナート、セフジニル、セフポドキシムプロキセチル、セフジニル、セフロキシム、レボフロキサシン、モキシフロキサシン、アズトレオナムリシン、コリスチン、トブラマイシン、アミカシン、ピペラシリン－タゾバクタム、およびバンコマイシンの１つ以上である。

【0067】

いくつかの実施形態では、疑われる感染症は中枢神経系感染症であり、抗生物質はペニシリン、アンピシリン、ゲンタマイシン、セフォタキシム、セフェピム、セフトリアキソン、バンコマイシン、モキシフロキサシン、ゲミフロキサシン、ガチフロキサシン、ガレノキサシン、トロバフロキサシン、ＴＭＰ／ＳＭＸ、アズトレオン、メロペネム、クロラムフェニコール、リネゾリド、リファンピン、メトロニダゾール、ペニシリンＧ、セフチゾキシム、セフタジジム、アンピシリン－スルバクタム、イミペネム、ミノサイクリン、およびアミカシンの１つ以上である。

【0068】

いくつかの実施形態では、疑われる感染症は創傷感染症であり、抗生物質はＴＭＰ／ＳＭＸ、セファレキシン、アモキシシリン／クラブラナート、ドキシサイクリン、クリンダマイシン、チカルシリン／クラブラン、ピペラシリン／タゾバクタム、エルタペネム、バンコマイシン、セファゾリン、アンピシリン／スルバクタム、セフォタキシム、セフトリアキソン、メトロニダゾール、およびイミペネムの１つ以上である。

【0069】

いくつかの実施形態では、疑われる感染症はスツルバイト感染症／腎臓結石感染症であり、抗生物質はシプロフロキサシン、レボフロキサシン、ＴＭＰ－ＳＭＸ、セフトリアキソン、フルオロキノロン、シプロフロキサシン、アミノグリコシド（例えば、ゲンタマイシン５ｍｇ／ｋｇ／日）、アモキシシリン、リネゾリド、カンコマイシン、ニトロフラントイン、ホスホマイシン、ピベメシリナム、アモキシシリン－クラブラナート、アンピシリン－スルバクタム、ピペラシリン、ピペラシリン－タゾバクタム、セファレキシン、セファゾリン、セファクロル、セフロキシム、セフォテタン、セフォタキシム、セフトリアキソン、セフタジジム、セフェピム、セフィキシム、セフポドキシム、アズトレオナム、イミペネム、ドリペネム、ＴＭＰ／ＳＭＸ、トリメトプリム、スルファメトキサゾール、ガチフロキサシン、モキシフロキサシン、オフロキサシン、プルリフロキサシン、クリンダマイシン、アジスロマイシン、およびセファレキシンの１つ以上である。

【0070】

いくつかの実施形態では、疑われる感染症は、爪、皮膚、爪周囲炎の感染症であり、抗生物質はアンピシリン、ＴＭＰ／ＳＭＸ、セファレキシン、クリンダマイシン、アモキシシリン／クラブラナート、ドキシサイクリン、クリンダマイシン、チカルシリン／クラブラン、ピペラシリン／タゾバクタム、エルタペンメン、バンコマイシン、セファゾリン、アンピシリン／スルバクタム、セフォタキシム、セフトリアキソン、メトロニダゾール、およびイミペネムの１つ以上である。

【0071】

いくつかの実施形態では、疑われる感染症は、耳、鼻、咽喉の感染症であり、抗生物質はアジスロマイシン、クラリスロマイシン、セフロキシム、セフポドキシム、セフジニル、アンピシリン／クラブラナート、シプロフロキサシン、レボフロキサシン、モキシフロキサシン、ゲミフロキサシン、ＴＭＰ／ＳＭＸ、テトラサイクリン（例えば、ドキシサイクリン）、アモキシシリン、アンピシリン、アモキシシリン／クラブラナート、セフジニル、セフポドキシムプロキセチル、セフジニル、セフロキシム、レポフロキサシン、モキシフロキサシン、アズトレオナムリジン、コリスチン、トブラマイシン、アミカシン、トブラマイシン、オフロキサシン、ドキシサイクリン、ペニシリンＶ、ピペラシリン－タゾバクタム、およびバンコマイシンの１つ以上である。

【0072】

いくつかの実施形態では、疑われる感染症は、手術前／手術部位感染症であり、抗生物質はセファゾリン、セフロキシム、セファゾリン、セフロキシム、セファゾリン、セフォキシチン、セフォテタン、セフトリアキソン、アンピシリン－スルバクタム、セフォテタン、メトロニダゾール、硫酸ネオマイシン、エリスロマイシン、エルタペネム、フルオロキノロン、ＴＭＰ／ＳＭＸ、アンピシリン、アズトレオナム、シプロフロキサシン、クリンダマイシン、エルタペネム、フルコナゾール、ゲンタマイシン、レボフロキサシン、モキシフロキサシン、ピペラシリン－タゾバクタム、バンコマイシン、エリスロマイシン、メトロニダゾール、およびネオマイシンの１つ以上である。

【0073】

さらに、現在開示されている方法の範囲には、まだ知られていないか、規制当局によってまだ承認されていない抗生物質の含有が包含される。現在請求されているアッセイは、任意の抗菌剤で実行でき、本明細書に開示されている抗生物質に限定されない。

【0074】

ところで、開示された方法に目を向けると、サンプルは滅菌容器内の標準的な採取手順に従って被験者から採取され、試験施設に運ばれる。

【0075】

抗生物質耐性（ＡＢＲ）試験プレートの準備には２つのステップが含まれる。１つ目は、抗生物質溶液の調製、２つ目は、細菌増殖培地プレートの調製である。任意の所定のサンプルで試験される抗生物質には、感染症が疑われる組織の治療に有用であることが知られている抗生物質、または特定の患者サンプルの知識を有する医療または研究の専門家が要求する任意の抗生物質が含まれる。ほとんどのアッセイは、医療専門家によって疑われる感染症の種類と位置に基づいて、抗生物質の標準パネルを使用して実行されることが予想される。いくつかの実施形態では、抗生物質の標準パネルは、ニトロフラントイン、シプロフロキサシン、メロペネム、セフトリアキソン、トリメトプリム／スルファメトキサゾール、ピペラシリン／タゾバクタム、レボフロキサシン、セフォキシチン、テトラサイクリン、アンピシリン／スルバクタム、アンピシリン、およびバンコマイシンを含む。ただし、公知の抗生物質アレルギーまたは感受性のある患者、または抗生物質耐性の既往がある患者には、専用の抗生物質パネルが必要になる場合がある。アッセイは、無制限の数の抗生物質と同時に実行できる。

【0076】

各抗生物質に適した希釈液を使用して抗生物質ストック溶液を調製し、その後、１０倍溶液を調製し、マルチウェルプレートに保存し、試験プレートへの効率的な移動を可能にする。各抗生物質を、少なくとも２つの濃度で試験する。いくつかの実施形態では、３つの濃度、４つの濃度、５つの濃度、６つの濃度、７つの濃度、８つの濃度、９つの濃度、または１０の濃度の抗生物質または抗生物質の組み合わせがアッセイに含まれる。通常、抗生物質の連続希釈物を調製し、ここで、各希釈物は高濃度の半分の濃度を表す。アッセイ用に選択された抗生物質パネル用に確立されたプレート計画に従って、１０倍の抗生物質溶液をマルチウェルプレートに保存する。例示的なプレート計画が、図１および図２の抗生物質ソースプレートに描かれている。抗生物質ストックおよび１０倍溶液を、必要になるまで２～８℃で保存する。

【0077】

ＡＢＲ試験プレートは、マルチウェルプレート（例えば、６ウェル、１２ウェル、２４ウェル、４８ウェル、９６ウェル、３８４ウェルプレート、またはこの目的に適した任意のマルチウェルプレート）であり、細菌増殖培地を含み、細菌を培養することができる。いくつかの実施形態では、プレートは９６ウェルプレートである。いくつかの実施形態では、滅菌寒天細菌増殖培地がプレートの各ウェルに分配される。例示的な寒天細菌増殖培地としては、ミューラ－ヒントン寒天、血液寒天、トリプチケース大豆寒天などが挙げられるが、これらに限定されない。寒天が室温で固化した後、所定のプレート計画に従って、１／１０体積の（細菌増殖培地の）１０倍の抗生物質溶液を試験プレートの各ウェルに加える。抗生物質を細菌増殖培地に導入した後、プレートを少なくとも１時間静置させる。長期保存の場合、抗生物質含有ＡＢＲプレートを２～８℃で保存する。いくつかの実施形態では、サンプルと混合した滅菌液体ブロス細菌増殖培地を、所定のプレート計画に従って配列した（細菌増殖培地の）１／１０体積の１０倍の抗生物質溶液を含むプレートの各ウェルに分注する。（細菌増殖培地と抗生物質溶液の最終ウェル体積の）１／１０体積を含むマルチウェルプレートを、後の使用または長期保存の間２～８℃で保存する。

【0078】

開示された抗生物質耐性試験のサンプルを、滅菌水溶液で任意に希釈するか、細菌増殖培地と混合してもよい。いくつかの実施形態では、開示された抗生物質耐性試験用のある量のサンプルを、最初に増殖培地と混合し、３５±４℃の培養温度で０～２４時間培養する。次いで、サンプルを生理食塩水で希釈し、次いで増殖培地と混合し、マルチウェルプレートの各ウェルの９／１０体積で室温のＡＢＲ試験プレートに加える。いくつかの実施形態では、サンプルを、ウェルに存在する細菌増殖培地の１／２０体積で室温ＡＢＲプレートに加える。各ＡＢＲプレートには、単一の患者検体を使用する。複数の患者検体を試験する場合、各検体は独自のプレートでアッセイされる。一旦接種したら、プレートを覆い、培養して細菌の増殖を促進する。単一のサンプルが複数のプレートを使用してアッセイされる実施形態も、本方法の範囲内である。

【0079】

プレートは嫌気性または好気性細菌の培養に使用できる。嫌気性細菌の培養では、嫌気性細菌の増殖を促進するために、プレートをある温度で、低酸素環境で培養する。好気性細菌の培養では、好気性細菌の増殖を促進するために、プレートをある温度で酸素含有環境で培養する。

【0080】

培養温度は、予想される細菌の種類によって異なり得るが、３５～４０℃の範囲である可能性が高くなる。サンプルを含むプレートを、１２～４８時間、１２～２４時間、２４～２８時間、１２～３６時間、１４～３０時間、１６～２４時間、１６～２０時間、または１６～１８時間、またはこれらの数字で区切られた任意の範囲で培養する。

【0081】

寒天含有培地を用いてアッセイを行ういくつかの実施形態では、培養後、各ウェルに存在する細菌を、水性液体で再懸濁することにより回収する。適切な液体としては、水、生理食塩水、培地などが挙げられるが、これらに限定されない。水性液体は無菌であるか、少なくとも細菌の増殖がないものであるべきである。細菌増殖培地の体積の１００％に等しい体積の液体をＡＢＲプレートのウェルに慎重に加え、少なくとも３０分間静置する。いくつかの実施形態では、プレートは、３５分、４０分、４５分、５０分、または６０分間位置させることができる。次いで、得られた懸濁液を、所定のプレート計画に従って各ウェルから無菌のマルチウェルプレートの個々のウェルに慎重に取り出す。懸濁液を除去する前に、プレートを任意で攪拌して、細菌と液体を混合させる。液体増殖培地を使用してアッセイを実施するいくつかの実施形態では、培養直後にマルチウェルプレートをＯＤ_６００測定値に適用する。

【0082】

次いで、細菌含有懸濁液を含むマルチウェルプレートを分光光度計で読み取る。回収した液体の光学密度をＯＤ_６００で複数回測定して、懸濁液中の細菌粒子の不均一な分布を補正する。いくつかの実施形態では、プレートを、１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、または８回読み取る。複数のプレートの読み取りを、懸濁液をウェルに定着させずに順番に行う。

【0083】

各ウェルの複数のＯＤ_６００を平均して、特定の条件下で各ウェルに存在する細菌を正確に定量する。その後、細菌が増殖できなかったウェルの平均ＯＤ_６００測定値を差し引くことによって、各ウェルの平均ＯＤ_６００をバックグラウンド用に調整して、ブランク値を得る。いくつかの実施形態では、この非増殖ウェルは抗生物質のブレンド（ＡＢブレンド）を含む。いくつかの実施形態では、この非増殖ウェルはアジ化ナトリウム（Ｎａ－Ａｚｉｄｅ）を含む。ブランク値は、ウェル内の特定の抗生物質の存在下で細菌が増殖する能力を表す。

【0084】

ブランク結果を、その後、閾値に基づいて「耐性」（Ｒ）または「感受性あり」（Ｓ）スコアに変換する。閾値以上のＯＤ_６００測定値は耐性があると解釈され、一方、閾値未満の測定値は感受性ありと解釈される。

【0085】

いくつかの実施形態では、閾値は寒天含有培地に関するものである。いくつかの実施形態では、閾値を、標準参照方法との相関に基づいて、０．０１０～１．０００、０．０１０～０．０９０、０．０１５～０．０３５、または０．０２０～０．０３０で決定する。いくつかの実施形態では、閾値は、標準参照法との相関に基づいて、約０．０１０、約０．０１５、約０．０２０、約０．０２５、約０．０３０、約０．０３５、約０．０４０、約０．０４５、約０．０５０、約０．０５５、約０．０６０、約０．０６５、約０．０７０、約０．０７５、約０．０８０、約０．０８５、または約０．０９０で決定される。いくつかの実施形態では、閾値は、標準参照方法との相関に基づいて０．０２５で決定される。

【0086】

いくつかの実施形態では、閾値は液体培地に関するものである。いくつかの実施形態では、閾値は、２つの標準参照方法間のコンセンサススコアとの相関に基づいて、０．０１０～１．０００、０．０２０～０．０９０、０．０５０～０．０８０、０．０５５～０．０７５、または０．０６０～０．０７０で決定される。いくつかの実施形態では、閾値は、２つの標準参照方法間のコンセンサススコアとの相関に基づいて、約０．０１０、約０．０１５、約０．０２０、約０．０２５、約０．０３０、約０．０３５、約０．０４０、約０．０４５、約０．０５０、約０．０５５、約０．０６０、約０．０６５、約０．０７０、約０．０７５、約０．０８０、約０．０８５、約０．０９０、または約０．０９５で決定される。いくつかの実施形態では、２つの標準参照方法間のコンセンサススコアとの相関に基づいて、閾値は０．０６５に決定される。

【0087】

他の実施形態では、ブランクＯＤ_６００測定値よりも大きい任意の調整されたＯＤ_６００測定値は、細菌増殖の指標として決定され、標準参照方法または参照方法の組み合わせとの相関により閾値として適用され得る。

【0088】

各有効な抗生物質についての最小阻害濃度は、次いで、複数の抗生物質濃度での培養の感受性または耐性に基づいて算出される。

【0089】

本明細書に開示されている抗生物質耐性アッセイの結果を、適切な医療専門家に送り、医療専門家は、その後、患者の感染症に対して有効であることが示されている１つまたは複数の抗生物質を処方する、抗生物質をより効果的な抗生物質に変更する、または追加の試験を指示する選択肢を有する。

【実施例】

【0090】

例１ 寒天含有培地を利用した抗生物質耐性（ＡＢＲ）アッセイ
このアッセイでの処理に適した尿サンプルを、ＢＤバキュテイナ（グレートップ）チューブまたは他の適切な漏れ防止滅菌容器を使用して、採取、輸送、保管する。尿サンプルを、試験結果が損なわれる前に、室温で４８時間保持する場合がある。

【0091】

既製の溶液で受けられない抗生物質を、適切な希釈剤に、個々の溶解度に応じて、抗生物質ストックとしてアッセイにおいて望ましい１０倍の濃度で溶解した。抗生物質ストックを２～８℃で保管し、直射日光から保護する。図１に示し、抗生物質の名前と濃度（μｇ／ｍＬ；１０倍の最終濃度）で識別されるように、調製した抗生物質ストック溶液を９６ディープウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に分注して抗生物質ソースプレートを形成した。このアッセイに含まれる抗生物質は、ニトロフラントイン、シプロフロキサシン、メロペネム、セフトリアキソン、トリメトプリム、スルファメトキサゾール、ピペラシリン、タゾバクタム、レボフロキサシン、セフォキシチン、テトラサイクリン、アンピシリン、スルバクタム、およびバンコマイシの単独または組み合わせであった。１つのウェルでは、抗生物質の組み合わせを含むＡＢブレンドを指定し、細菌の増殖がないことを確保した。

【0092】

ミューラ－ヒントン寒天培地１００マイクロリットルを９６ウェルマイクロプレート（ＶＩＳ９６／Ｆ－ＰＳ、エッペンドルフ）の適切な各ウェル位置に分注した。培地を室温で少なくとも１０分間固化させた。

【0093】

さまざまな濃度の抗生物質（１０μＬ）を、次いで抗生物質ソースプレートから所望のウェルに分注した。寒天培地に抗生物質を導入した後、ＡＢＲマイクロプレートを、使用前に少なくとも１時間静置した。長期保存が必要な場合は、抗生物質注入寒天を含むＡＢＲマイクロプレートを暗所で２～８℃で保存する。

【0094】

試験時に、尿サンプルを滅菌生理食塩水で１：２０に希釈し、ボルテックスした。各患者サンプルは、単一のＡＢＲマイクロプレートを使用した。室温のマイクロプレートの各ウェルに５マイクロリットルの希釈患者サンプルを加え、プレートを密封し、３７℃で１６～１８時間培養した。

【0095】

培養後、プレートを培養器から取り出し、慎重にカバーを外した。２００マイクロリットルの脱イオン水を各ウェルに加えて、寒天上に存在する細胞を懸濁し、プレートを室温で３０分間培養した。３０分後、各ウェルからの１００μｌを新しいプレートに移し、分光光度計でＯＤ_６００を決定した。各プレートの個別に５回の読み取りを行い、平均ＯＤ_６００測定値を算出した。

【0096】

対照を表１に示す。

【表1】

【0097】

プレートから採取された生データを表２に示す。スプレッドシート形式のデータを、その対応する「平均」ＯＤに隣接する「ウェル位置」として並べた。

【表2-1】

【表2-2】

【0098】

各ウェル位置は、プレート計画に従ってある濃度で特定の抗生物質に対応する。抗生物質の凡例の追加を表３に示す。

【表3】

【0099】

抗生物質の凡例を一旦適切なウェルに隣接して配置すると、同様の抗生物質を一緒に分類することによってデータを並べ替えた（表４）。

【表4】

【0100】

表５に示すように、次いで、ＡＢブレンドウェルから取得した測定値を使用して、生データを「ブランク」した。

【表5-1】

【表5-2】

【0101】

患者サンプルに存在する細菌性生物がある濃度で特定の抗生物質に対して耐性または感受性であるかどうかを決定するために、ブランクＯＤ測定値を０．０２５の閾値ＯＤ_６００と比較した（表６）。この閾値以上の任意のＯＤ測定値は、耐性（Ｒ）を表し、これは、患者のサンプルに存在する細菌性生物が、そのある特定の濃度でその特定の抗生物質に耐性を示したことを意味した。この閾値未満の任意のＯＤ測定値は、感受性あり（Ｓ）を表し、これは、患者のサンプルに存在する細菌性生物が、そのある特定の濃度でその特定の抗生物質に感受性であることを意味した。

【表6-1】

【表6-2】

【0102】

この例では、サンプルは、ニトロフラントイン、シプロフロキサシン、メロペネム、セフトリアキソン、ピペラシリン／タゾバクタム、およびセフォキシチンに感受性である細菌を含む。ｌｅｖｏの結果はあいまいである。

【0103】

その後、各薬剤のＭＩＣをもたらすことができる。最小阻害濃度（ＭＩＣ）は、サンプルが感受性である試験抗生物質の最小濃度である。上記結果に基づいたメロペネムの例示的なＭＩＣの決定を表７に示す。

【表7】

例２．増殖培地を含む寒天を利用したＡＢＲアッセイの検証

【0104】

精度

【0105】

精度を、試験方法の抗生物質耐性結果を、抗生物質寒天法によって評価された混合培養および分離培養に関して得られた結果と比較することによって評価した。合計１９の細菌プール（プールは２～４の生物からなる）、１７の分離生物、および９の定期的に処理された尿サンプルを１２の抗生物質に対する耐性について試験した。精度は、特異性（真陰性）、感受性（真陽性）、および全体的な精度（すべてのサンプル）に関して評価した。このアッセイは、３つのカテゴリのすべてで良好な精度を示した（表８）。

【表8】

【0106】

精度

【0107】

アッセイ間精度を、「精度」サンプルセットからの３つのサンプルを３日間にわたって試験することで評価した。アッセイ内の精度は、これらの各サンプルを１バッチで３回試験することで評価した。５つの複製すべてのコンセンサス結果を決定し、次いで、コンセンサスに一致する複製の数をカウントすることによって、各サンプルの精度を評価した。次いで、この数値を、すべての測定値の合計（すべての薬剤の測定値の合計）で割って、精度率を決定した。全体の精度を、すべての正しい一致の合計をすべてのサンプルからの測定値の総数で割ることによって算出した。アッセイは非常に良好な精度を示した（表９）。

【表9】

【0108】

分析感受性

【0109】

分析感受性、または検出限界（ＬＯＤ）を、正確な結果をもたらす最低の細菌濃度を決定することにより評価した。１０，０００細胞／ｍＬ未満の細菌濃度はＵＴＩ陽性とはみなされないため、試験された最低濃度は１０，０００細胞／ｍＬであった。コンセンサス結果との一貫した結果（＞９８％）の相関を、試験した最低の細菌濃度で得た。このアッセイのＬＯＤは１０，０００細胞／ｍＬであった。

【0110】

分析特異性

【0111】

このアッセイの分析特異性を、１００，０００，０００細胞／ｍＬの細菌濃度でサンプルを試験することによって評価した。このような濃度は、所定のＵＴＩ患者サンプルでは通常観察されないが、飽和した一晩の細菌培養で達成された。その後、分析測定値範囲の評価（ＡＭＲ）は、「精度」サンプルセットからの３つのサンプルを試験することによって実行され、それぞれ、１００，０００，０００細胞／ｍＬ、１，０００，０００細胞／ｍＬ、１００，０００細胞／ｍＬ、および１０，０００細胞／ｍＬで希釈された。コンセンサス結果との一貫した結果（＞９４％）の相関を、試験したすべての細菌濃度で得た。アッセイは、最大１００，０００，０００細胞／ｍＬの細菌濃度で特異的である。
例３．液体増殖培地を利用した抗生物質耐性（ＡＢＲ）アッセイ

【0112】

このアッセイでの処理に適した尿サンプルを、ＢＤバキュテイナチューブまたは他の適切な漏れ防止滅菌容器を使用して採取、輸送、保管する。尿サンプルを、試験結果が損なわれる前に、室温で４８時間保持する場合がある。

【0113】

既製の溶液で受けられない抗生物質を、適切な溶媒に、個々の溶解度に応じて、アッセイで５０倍の望ましい濃度で溶解し、抗生物質ストックとして保管した。抗生物質ストックを２～８℃で保管し、直射日光から保護する。図２に示し、各ウェルが抗生物質の名前と濃度（μｇ／ｍＬ；１０倍の最終濃度）で識別されるように、調製した抗生物質ストック溶液を９６ディープウェルプレート（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に分注して５０倍の抗生物質ソースプレートを形成し、次いで１：５に希釈して１０倍の抗生物質ソースプレートを形成した。このアッセイに含まれた抗生物質は、アモキシシリン、クラブラナート、アンピシリン、スルバクタム、セファクロル、セファゾリン、セフェピム、セフォキシチン、セフタジジム、セフトリアキソン、シプロフロキサシン、ゲンタマイシン、レボフロキサシン、メロペネム、ニトロフラントイン、ピペラシリン、タゾバクタム、テトラサイクリン、トリメトプリム、スルファメトキサゾールおよびバンコマイシンの単独または組み合わせである。１つのウェルでは、アジ化ナトリウムを指定し、そのウェルで細菌の増殖が観察されないことを確保した。

【0114】

２０マイクロリットルの各抗生物質溶液を、１０倍の抗生物質ソースプレートからの９６ウェルマイクロプレート（ＶＩＳ ９６／Ｆ－ＰＳ、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）の所定のウェルに分注して、接種用のＡＢＲ試験プレートを作成した。これらのＡＢＲ試験プレートは、暗所で２～８℃で使用する前に最大２４時間静置した。

【0115】

試験時に、尿サンプルを遠心分離して任意の細菌細胞を濃縮し、次いで液体ミューラーヒントン培地と混合し、３７℃で６～１６時間培養した。この最初の培養後、サンプルを生理食塩水で０．５～０．６ＭｃＦに希釈し、次いで、その懸濁液５００μｌをミューラーヒントン培地２９．５μｌに加えた。１８０マイクロリットルの希釈サンプルを、すでに１０倍の抗生物質溶液を含むＡＢＲマイクロプレートの各ウェルに分注し、すべての抗生物質を所望の最終濃度にする。次いで、プレートを密閉し、３７℃で１２～１６時間培養する。

【0116】

培養後、プレートを培養器から取り出し、慎重にカバーを外し、分光光度計により各適切なウェルについてＯＤ６００を決定した。プレート上の各ウェルの５つの個別の測定値を取得し、各ウェルについて平均ＯＤ６００測定値を算出する。

【0117】

対照を表１０に示す。

【表10】

【0118】

プレートからまとめられた生データを表１１に示す。スプレッドシート形式のデータを、その対応する「平均」ＯＤに隣接する「ウェル位置」として並べた。

【表11-1】

【表11-2】

【0119】

各ウェル位置は、プレート計画に従ってある濃度で特定の抗生物質に対応する。抗生物質の凡例の追加を表１２に示す。

【表12-1】

【表12-2】

【0120】

抗生物質の凡例が適切なウェルに隣接して並べられると、同様の抗生物質を一緒に分類することによってデータを並べ替えた（表１３）。

【表13】

【0121】

表１４に示すように、次いで、アジ化ナトリウムウェルから取得した測定値を使用して、生データを「ブランク」した。

【表14-1】

【表14-2】

【0122】

患者サンプルに存在する細菌性生物がある濃度で特定の抗生物質に対して耐性または感受性であるかどうかを決定するために、ブランクＯＤ測定値を０．０６５の閾値ＯＤ_６００と比較した（表１５）。この閾値以上のＯＤ測定値は、耐性（Ｒ）を表し、これは、患者のサンプルに存在する細菌性生物がそのある濃度でその特定の抗生物質に耐性を示したことを意味した。この閾値未満の任意のＯＤ測定値は、感受性あり（Ｓ）を表し、これは、患者のサンプルに存在する細菌性生物が、そのある濃度でその特定の抗生物質に感受性であることを意味した。

【表15-1】

【表15-2】

【0123】

この例では、サンプルは、アモキシシリン／クラブラナート、アンピシリン、アンピシリン／スルバクタム、シプロフロキサシン、ゲンタマイシン、レボフロキサシン、ニトロフラントイン、ピペラシリン／タゾバクタム、およびバンコマイシンに感受性である細菌を含む。

【0124】

その後、各薬剤のＭＩＣをもたらすことができる。最小阻害濃度（ＭＩＣ）は、サンプルが感受性である試験抗生物質の最小濃度である。上記結果に基づいたメロペネムの例示的なＭＩＣの決定を表１６に示す。

【表16】

例４．液体増殖培地を利用したＡＢＲアッセイの検証

【0125】

精度

【0126】

試験方法の抗生物質耐性結果を標準参照方法によって得られた結果のコンセンサスと比較することによって精度を評価した。合計１５の分離された生物と２０の日常的に処理された患者の尿サンプルを、１８の抗生物質に対する耐性について試験し、それぞれを合計５７の抗生物質濃度に対して複数の濃度で試験した。特異性（真陰性）、感受性（真陽性）、および全体の精度（すべてのサンプル）に関して精度を評価した。このアッセイは、３つのカテゴリのすべてで良好な精度を示した（表１７）。

【表17】

【0127】

精度

【0128】

５つのサンプルを異なる３日間にわたって試験することによってアッセイ間精度を評価した。同じ５つのサンプルを１日で３回試験することによってアッセイ内精度を評価した。一致率を算出して、このアッセイで得られた結果の精度を測定した。アッセイは非常に良好な精度を示した（表１８）。

【表18】

【0129】

分析感受性

【0130】

Ｅ．ｃｏｌｉおよびＥ．ｆａｅｃａｌｉｓの希釈シリーズを作成することによって分析感受性を評価し、各生物についての最低細菌濃度は１００細胞／ｍＬ未満であった。各分離株の各希釈レベルを試験して、最低濃度までの結果の再現性を示した。両方の分離株についてすべての希釈レベルで９８％の相関を観察し、このアッセイの検出限界（ＬＯＤ）が１００細胞／ｍｌ未満であることを示した。

【0131】

分析特異性

【0132】

あまりにも多くの細菌細胞でアッセイに負担を掛けすぎる阻害効果の文脈で分析特異性を評価した。高い細菌濃度で接種されたサンプルに関して、（偽耐性の結果による）精度の低下を観察した。これは、すべてのサンプルを、事前培養後およびＡＢＲ接種前に指定された細胞密度に希釈する必要があることを示している。

【0133】

事前培養期間の決定

【0134】

このアッセイは、抗生物質にサンプルを導入する前の事前培養ステップを利用する。この事前培養の期間は、２つの分離株（Ｅ．ｃｏｌｉおよびＥ．ｆａｅｃａｌｉｓ）について６および１６時間で試験した。６時間および１６時間の事前培養の培養後に各分離株の良好な精度を観察し、このアッセイに関して６～１６時間の事前培養時間を示した。下の表１９に結果を示す。

【表19】

【0135】

培養期間の決定

【0136】

サンプルを一旦抗生物質に導入すると、サンプルは１２～１６時間培養される。１２時間および１６時間の培養後に精密サンプルのＯＤ測定値を取得することによって、この培養の長さを決定した。１２～１６時間の培養時間内で、すべてのサンプルに関して良好な一致率を観察した（表２０）。

【表20】

【0137】

細菌増殖の確認

【0138】

濁度（高いＯＤ測定値）が細菌の増殖によるものであることを確認するために、感受性と耐性の結果に対応するウェルからＤＮＡを抽出し、ＰＣＲによる病原体同定について試験した。同定結果により、耐性（混濁）ウェルは、感受性（透明）ウェルよりも著しく高い細菌濃度を含むことを確認した（表２１）。

【表21】

【0139】

別段の指示がない限り、本明細書および特許請求の範囲で使用される成分の量、分子量、反応条件などの特性を表すすべての数字は、すべての場合において「約」という用語によって修飾されるものとして理解されるべきである。本明細書で使用されるように、「約」および「およそ」という用語は、１０～１５％範囲内、好ましくは５～１０％範囲内を意味する。したがって、反対に示されない限り、本明細書および添付の特許請求の範囲に記載される数値パラメータは、本発明によって得ようとする所望の特性に応じて変化し得る近似値である。最低限、特許請求の範囲と均等論の適用を制限する試みとしてではなく、各数値パラメータは少なくとも報告された有効桁数と通常の端数切り捨て技術を適用して解釈すべきである。本発明の広い範囲を示す数値範囲およびパラメータは近似値であるにもかかわらず、特定の例に示された数値は可能な限り正確に報告される。しかしながら、数値は、それぞれの試験測定値に見られる標準偏差から必然的に生じる特定の誤差を本質的に含む。

【0140】

本明細書中に別段の指示がない限り、または文脈によって明らかに矛盾しない限り、本発明を説明する文脈において（特に添付の特許請求の範囲の文脈において）使用される用語「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」および類似の指示対象は、単数形および複数形の両方を包含するものと解釈されるべきである。本明細書における値の範囲の列挙は、その範囲内の各別個の値を個別に参照する簡略な方法として役立つことを単に意図するものである。本明細書で別段の指示がない限り、個々の値は、本明細書に個々に列挙されているかのように本明細書に組み込まれる。本明細書中に記載されるすべての方法は、本明細書中で他に指示されない限り、または文脈によって明らかに矛盾しない限り、任意の適切な順序で実施され得る。本明細書で提供される任意のおよびすべての例、または例示的な言語（例えば、「など」）の使用は、単に本発明をよりよく示すことを意図しており、別段の特許請求される本発明の範囲を限定するものではない。本明細書中のいかなる言葉も、本発明の実施に不可欠な、特許請求されていない要素を示すものとして解釈されるべきではない。

【0141】

本明細書で開示される本発明の代替要素または実施形態のグループ分けは、限定として解釈されるべきではない。各グループのメンバーは、個別に、またはグループ内の他のメンバーまた本願明細書に記載されている他の要素と任意の組み合わせで参照され、特許請求され得る。利便性および／または特許性の理由から、１つ以上のグループのメンバーがグループに含まれるか、グループから削除されることが予想され得る。そのような包含または削除が生じた場合、明細書は改変されたグループを含むとみなされ、したがって、添付の特許請求の範囲で使用されるすべてのマーカッシュグループの記述を満たすものとみなされる。

【0142】

この発明を実施するために本発明者らに知られている最良の形態を含む、本発明の特定の実施形態を本明細書に記載する。当然のことながら、これらの記載された実施形態の変形は、上記の説明を読むことによって当業者には明らかになるであろう。本発明者は、当業者がこのような変形を適切に使用することを期待しており、本発明者らは、本明細書に具体的に記載されている以外の方法で本発明を実施しようとする。したがって、本発明は、適用法によって許容されるように、添付の特許請求の範囲に記載された主題のすべての改変物および均等物を含む。さらに、本明細書中で他に指示されない限り、または文脈によって明らかに否定されない限り、すべての可能な変形例における上記要素の任意の組み合わせが本発明に包含される。

【0143】

本明細書で開示された特定の実施形態は、言語からなるか、または本質的に言語からなることを使用する特許請求の範囲においてさらに限定され得る。特許請求の範囲において使用される場合、出願時または補正で加えられたかにかかわらず、「からなる」という移行用語は、特許請求の範囲に記載されていない要素、工程または成分を排除する。「から本質的になる」という移行用語は、特定の材料または工程、および基本的かつ新規な特性（複数）に重大な影響を及ぼさないものに、特許請求の範囲を限定する。そのように特許請求された発明の実施形態は、本質的にまたは明示的に本明細書で説明され、可能にされる。

【0144】

さらに、本明細書を通して、特許および刊行物に多数の参考文献がなされている。上に引用した参考文献および印刷された刊行物のそれぞれは、参照によりその全体が個々に本明細書に組み込まれる。

【0145】

最後に、本明細書で開示される本発明の実施形態は、本発明の原理を例示するものであることを理解されたい。使用され得る他の改変も本発明の範囲内である。したがって、限定ではなく例として、本発明の代替構成を本明細書の教示に従って利用することができる。したがって、本発明は図示され説明されたものに厳密に限定されるものではない。

【図1】

【図2】