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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-05-17
(45)【発行日】2024-05-27
(54)【発明の名称】肝機能改善または脂肪蓄積抑制の微生物、及びその用途
(51)【国際特許分類】
C12N 1/20 20060101AFI20240520BHJP
A23L 33/135 20160101ALI20240520BHJP
A61K 35/747 20150101ALI20240520BHJP
A61P 1/16 20060101ALI20240520BHJP
A61P 3/04 20060101ALI20240520BHJP
A61P 3/06 20060101ALI20240520BHJP
A61P 9/10 20060101ALI20240520BHJP
A61P 9/00 20060101ALI20240520BHJP
C12R 1/25 20060101ALN20240520BHJP
C12R 1/225 20060101ALN20240520BHJP
【ＦＩ】
C12N1/20 E ZNA
A23L33/135
A61K35/747
A61P1/16
A61P3/04
A61P3/06
A61P9/10
A61P9/00
C12R1:25
C12R1:225
【請求項の数】
6
(21)【出願番号】P 2022557711
(86)(22)【出願日】2020-11-17
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2023-05-10
(86)【国際出願番号】 KR2020016195
(87)【国際公開番号】W WO2021194040
(87)【国際公開日】2021-09-30
【審査請求日】2022-11-15
(31)【優先権主張番号】10-2020-0035900
(32)【優先日】2020-03-24
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 令和１年１１月１８日、「Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ ｓｔｒａｉｎ ＬＭＴ１５－１４ １６Ｓ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ＲＮＡ ｇｅｎｅ，ｐａｒｔｉａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ」（ＧｅｎＢａｎｋデータベース、アクセッション番号ＭＮ６８９６２２）として、以下のアドレスに発表＜ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｕｃｃｏｒｅ／１７７４９５９５７５＞
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 令和１年１１月１８日、「Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ｓｔｒａｉｎ ＬＭＴ１９－１ １６Ｓ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ＲＮＡ ｇｅｎｅ，ｐａｒｔｉａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ」 （ＧｅｎＢａｎｋデータベース、アクセッション番号ＭＮ６８９６２３）として、以下のアドレスに発表＜ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｕｃｃｏｒｅ／ＭＮ６８９６２３．１＞
【微生物の受託番号】KCTC KCTC14142BP
【微生物の受託番号】KCTC KCTC14141BP
(73)【特許権者】
【識別番号】513243723
【氏名又は名称】メディトックス インク．
(74)【代理人】
【識別番号】110002077
【氏名又は名称】園田・小林弁理士法人
(72)【発明者】
【氏名】チェ， ウジン
(72)【発明者】
【氏名】キム， タイフン
【審査官】鳥居 敬司
(56)【参考文献】
【文献】特開２０１３－１４７４５７（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１８－５３６３８５（ＪＰ，Ａ）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １／００－１／３８
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
中性脂肪抑制、脂肪酸化促進及び脂肪合成抑制の活性を有するラクトバチルス・サリバリウスＬＭＴ１５－１４（受託番号ＫＣＴＣ１４１４２ＢＰ）。
【請求項2】
中性脂肪抑制、脂肪酸化促進及び脂肪合成抑制の活性を有するラクトバチルス・プランタルムＬＭＴ１９－１（受託番号ＫＣＴＣ１４１４１ＢＰ）。
【請求項3】
有効成分として、請求項１または２に記載の微生物、あるいはその培養物を含む、肝機能を改善または肥満関連疾患を予防もしくは治療するための薬剤学的組成物。
【請求項4】
前記肥満関連疾患は、非アルコール性脂肪肝、２型糖尿、高脂血症、心血管疾患、動脈硬化症、脂質関連代謝症侯群及び肥満からなる群から選択される少なくとも１つである、請求項３に記載の薬剤学的組成物。
【請求項5】
有効成分として、請求項１または２に記載の微生物、あるいはその培養物を含む、肝機能を改善または肥満関連疾患を予防もしくは改善するための食品組成物。
【請求項6】
前記肥満関連疾患は、非アルコール性脂肪肝、２型糖尿、高脂血症、心血管疾患、動脈硬化症、脂質関連代謝症侯群及び肥満からなる群から選択される少なくとも１つである、請求項５に記載の食品組成物。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ラクトバチルス・サリバリウスＬＭＴ１５－１４（受託番号ＫＣＴＣ１４１４２ＢＰ）及びラクトバチルス・プランタルムＬＭＴ１９－１（受託番号ＫＣＴＣ１４１４１ＢＰ）からなる群から選択される微生物、またはその組み合わせ、あるいはその培養物またはその抽出物、及びその用途に関する。
【背景技術】
【0002】
ラクトバチルス属バクテリアは、グラム陽性、選択的嫌気性（facultative anaerobic）または微細好気性（microaerophilic）、バー状、胞子を形成しないバクテリア属（genus）である。ラクトバチルスは、乳酸菌グループの主要部分である。ヒトにおいて、ラクトバチルスは、消化系、泌尿系及び生殖器系のような多くの身体部位において、微生物群集（microbiota）の主要成分である。
ラクトバチルス属バクテリアは、ヨーグルトのような食品に含まれている。また、一部ラクトバチルス種は、抗炎症活性のような生理的活性を有する。例えば、一部ラクトバチルスは、過敏性腸症侯群（ＩＢＳ：irritable bowel syndrome）に効果があると報告されている。
ラクトバチルス属バクテリアは、ヨーグルトのような食品に含まれている。また、一部ラクトバチルス種は、抗炎症活性のような生理的活性を有する。例えば、一部ラクトバチルスは、過敏性腸症侯群（ＩＢＳ：irritable bowel syndrome）に効果があると報告されている。
【0003】
一方、肥満は、体内に脂肪が過度に蓄積されることを示す。肥満は、脂肪肝（fatty liver）、高脂血症、高血糖、動脈硬化、糖尿病のような疾病の原因と知られている。肥満は、脂肪分化（adipogenesis）の結果として、脂肪細胞の数が増加し、脂肪細胞の脂質含量が増加することによって示される。脂肪細胞（adipocyte）は、超過カロリーを中性脂肪（triglycerides）に合成して保存するのに主要な役割を行い、脂肪分化の結果として、脂肪細胞の大きさと数とが増加し、細胞内脂質蓄積が加速化される。
【0004】
脂肪肝（fatty liver）は、肝臓内に過度な脂肪がたまって生じるが、一般的に、肝臓重量の５％以上の脂肪がたまることになれば、脂肪肝と診断される。そのような脂肪肝は、過飲によるアルコール性脂肪肝と、酒と関係なく生じる非アルコール性脂肪肝とに分けられる。非アルコール性脂肪肝疾患は、１つの病気とするよりも、軽い脂肪肝から、慢性肝炎、肝硬変症に至る多様な病気を含む。非アルコール性脂肪肝は、肥満、成人型糖尿病、高脂血症のような代謝症侯群と関連されて示されるが、過度な熱量を続けて摂取することになれば、体内脂肪細胞及び肝臓に脂肪が蓄積され、増大された脂肪二より、肝臓に有害なさまざまな物質、例えば、サイトカインが分泌され、脂肪肝炎と肝硬変症とに進む。
【0005】
ラクトバチルス属バクテリアは、人体の腸内に棲息する正常微生物群集の主要構成員であり、健康な消化器官と膣内環境との維持にあたって重要であると、かなり前から知られており、米国の公衆健康ガイドライン（Ｕ．Ｓ． Public Health Service guidelines）によれば、現在、米国菌株寄託機関（ＡＴＣＣ）に寄託されたラクトバチルス菌株は、いずれも人体や動物に疾病を誘発する潜在的危険については、知られているところがないと認められる「安全レベル（bio-safety level）１」に分類されている。
ただし、乳酸菌は、既存の研究を介し、免疫反応調節効果と、抗癌及び抗酸化の効果とにすぐれていると知られているが、ラクトバチルス菌株が、体内脂肪含量を低減させる効果、または脂肪関連疾患を治療する効果については、特に知られていない。
ただし、乳酸菌は、既存の研究を介し、免疫反応調節効果と、抗癌及び抗酸化の効果とにすぐれていると知られているが、ラクトバチルス菌株が、体内脂肪含量を低減させる効果、または脂肪関連疾患を治療する効果については、特に知られていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
一目的は、中性脂肪抑制、脂肪酸化促進及び脂肪合成抑制の活性を有するラクトバチルス・サリバリウスＬＭＴ１５－１４（受託番号ＫＣＴＣ１４１４２ＢＰ）及びラクトバチルス・プランタルムＬＭＴ１９－１（受託番号ＫＣＴＣ１４１４１ＢＰ）からなる群から選択される微生物、またはその組み合わせを提供することである。
【0007】
他の目的は、有効成分として、前記微生物、あるいはその培養物またはその抽出物、またはそれらの混合物を含む、肝機能を改善させたり、肥満関連疾患を予防または治療したりするための薬剤学的組成物を提供することである。
【0008】
他の目的は、有効成分として、前記微生物、あるいはその培養物またはその抽出物、またはそれらの混合物を含む、肝機能を改善または肥満関連疾患を予防または改善するための食品組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0009】
一態様は、中性脂肪抑制、脂肪酸化促進及び脂肪合成抑制の活性を有するラクトバチルス・サリバリウスＬＭＴ１５－１４（受託番号ＫＣＴＣ１４１４２ＢＰ）及びラクトバチルス・プランタルムＬＭＴ１９－１（受託番号ＫＣＴＣ１４１４１ＢＰ）からなる群から選択される微生物、またはその組み合わせを提供する。
【0010】
他の態様は、ラクトバチルス・サリバリウスＬＭＴ１５－１４（受託番号ＫＣＴＣ１４１４２ＢＰ）及びラクトバチルス・プランタルムＬＭＴ１９－１（受託番号ＫＣＴＣ１４１４１ＢＰ）からなる群から選択される微生物、またはその組み合わせの培養物または抽出物を提供する。前記抽出物は、微生物、またはその組み合わせのタンパク質抽出物でもある。前記抽出物は、微生物、またはその組み合わせを溶菌させた溶菌物、またはそれを遠心分離して沈殿物を除去して残った上澄み液でもある。
【0011】
前記微生物、またはその組み合わせ、あるいはその培養物またはその抽出物において、前記組み合わせは、ラクトバチルス・サリバリウスＬＭＴ１５－１４（受託番号ＫＣＴＣ１４１４２ＢＰ）及びラクトバチルス・プランタルムＬＭＴ１９－１（受託番号ＫＣＴＣ１４１４１ＢＰ）が、重量基準において、任意の比率で混合されたものでもある。前記混合の比率は、例えば、１：０．３ないし３．０でもある。
前記微生物、またはその組み合わせ、あるいはその培養物またはその抽出物は、耐酸性を有するもの；耐胆汁酸性を有するもの；酸化を促進させる活性、脂肪合成を抑制する活性、または２つの活性をいずれも有するもの；脂肪蓄積を抑制するもの、または蓄積された脂肪を低減させるもの；ＳＲＥＢＰ－１ｃ及びＦＡＳからなる群から選択される１以上の遺伝子の発現を抑制するもの；ＰＰＡＲ－１α及びＣＰＴ１からなる群から選択される１以上の遺伝子の発現を促進させるもの；ＡＭＰＫのリン酸化レベルを上昇させるもの；個体に投与される場合、血中アディポネクチンレベルを上昇させるもの；個体に投与される場合、体重及び体内脂肪量からなる群から選択される１以上を低減させるもの；及び肝機能を改善させるもの；からなる群から選択される１以上でもある。前記脂肪は、トリグリセリドでもある。
前記微生物、またはその組み合わせ、あるいはその培養物またはその抽出物は、耐酸性を有するもの；耐胆汁酸性を有するもの；酸化を促進させる活性、脂肪合成を抑制する活性、または２つの活性をいずれも有するもの；脂肪蓄積を抑制するもの、または蓄積された脂肪を低減させるもの；ＳＲＥＢＰ－１ｃ及びＦＡＳからなる群から選択される１以上の遺伝子の発現を抑制するもの；ＰＰＡＲ－１α及びＣＰＴ１からなる群から選択される１以上の遺伝子の発現を促進させるもの；ＡＭＰＫのリン酸化レベルを上昇させるもの；個体に投与される場合、血中アディポネクチンレベルを上昇させるもの；個体に投与される場合、体重及び体内脂肪量からなる群から選択される１以上を低減させるもの；及び肝機能を改善させるもの；からなる群から選択される１以上でもある。前記脂肪は、トリグリセリドでもある。
【0012】
前記耐酸性は、ＭＲＳ培地において、ｐＨ２．５及び３７℃において２時間培養した場合、生存率が、８０％以上、８５％以上、９０％以上、８０ないし９０％、８０％ないし９５％、８５％ないし９０％、または９０ないし９５％であるのでもある。
前記耐胆汁酸性は、０．３％胆汁酸含有ＭＲＳ培地において、３７℃で２時間培養した場合、生存率が、７５％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、７５ないし９０％、７５ないし９５％、８０ないし９０％、８０％ないし９５％、８５％ないし９０％、または９０ないし９５％であるのでもある。
前記耐胆汁酸性は、０．３％胆汁酸含有ＭＲＳ培地において、３７℃で２時間培養した場合、生存率が、７５％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、７５ないし９０％、７５ないし９５％、８０ないし９０％、８０％ないし９５％、８５％ないし９０％、または９０ないし９５％であるのでもある。
【0013】
前記微生物、またはその組み合わせ、あるいはその培養物またはその抽出物は、ＰＰＡＲ－１α及びＣＰＴ１からなる群から選択される１以上の遺伝子の発現を促進させることができる。前記促進は、前記微生物、またはその組み合わせ、あるいはその培養物またはその抽出物が存在しない場合に比べ、ＰＰＡＲ－１α及びＣＰＴ１からなる群から選択される１以上の遺伝子の発現を、１０％以上、１５％以上、２０％以上、２５％以上、３０％以上、３５％以上、４５％以上、５０％以上、５５％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、１００％以上、１０％ないし１００％、２０％ないし１００％、３０％ないし１００％、４０％ないし１００％、５０％ないし１００％、６０％ないし１００％、７０％ないし１００％、８０％ないし１００％、または９０％ないし１００％増大させるものでもある。
【0014】
前記微生物、またはその組み合わせ、あるいはその培養物またはその抽出物は、ＳＲＥＢＰ－１ｃ及びＦＡＳからなる群から選択される１以上の遺伝子の発現を抑制することができる。前記抑制は、前記微生物、またはその組み合わせ、あるいはその培養物またはその抽出物が存在しない場合に比べ、ＳＲＥＢＰ－１ｃ及びＦＡＳからなる群から選択される１以上の遺伝子の発現を、１０％以上、１５％以上、２０％以上、２５％以上、３０％以上、３５％以上、４５％以上、５０％以上、５５％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、１００％以上、１０％ないし１００％、２０％ないし１００％、３０％ないし１００％、４０％ないし１００％、５０％ないし１００％、６０％ないし１００％、７０％ないし１００％、８０％ないし１００％、または９０％ないし１００％低減させるものでもある。
【0015】
前記微生物、またはその組み合わせ、あるいはその培養物またはその抽出物は、脂肪の量またはその蓄積を抑制するものでもある。前記抑制は、前記微生物、またはその組み合わせ、あるいはその培養物またはその抽出物が存在しない場合に比べ、脂肪の量またはその蓄積を１０％以上、１５％以上、２０％以上、２５％以上、３０％以上、３５％以上、４５％以上、５０％以上、５５％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、１００％以上、１０％ないし１００％、２０％ないし１００％、３０％ないし１００％、４０％ないし１００％、５０％ないし１００％、６０％ないし１００％、７０％ないし１００％、８０％ないし１００％、または９０％ないし１００％減少させるものでもある。
【0016】
前記微生物、またはその組み合わせ、あるいはその培養物またはその抽出物は、個体に投与される場合、体重、及び体内の脂肪組織量からなる群から選択される１以上を低減させるものでもある。前記低減は、前記微生物、またはその組み合わせ、あるいはその培養物またはその抽出物が存在しない場合に比べ、１０％以上、１５％以上、２０％以上、２５％以上、３０％以上、３５％以上、４５％以上、５０％以上、５５％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、１００％以上、１０％ないし１００％、２０％ないし１００％、３０％ないし１００％、４０％ないし１００％、５０％ないし１００％、６０％ないし１００％、７０％ないし１００％、８０％ないし１００％、または９０％ないし１００％低減させるものでもある。
【0017】
前記微生物、またはその組み合わせ、あるいはその培養物またはその抽出物は、個体に投与される場合、トリグリセリドレベルを低下させるものでもある。前記低下は、前記微生物、またはその組み合わせ、あるいはその培養物またはその抽出物が存在しない場合に比べ、重量基準で１０％以上、１５％以上、２０％以上、２５％以上、３０％以上、３５％以上、４５％以上、５０％以上、５５％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、１００％以上、１０％ないし１００％、２０％ないし１００％、３０％ないし１００％、４０％ないし１００％、５０％ないし１００％、６０％ないし１００％、７０％ないし１００％、８０％ないし１００％、または９０％ないし１００％低下させるものでもある。
【0018】
他の態様は、前述のラクトバチルス・サリバリウスＬＭＴ１５－１４（受託番号ＫＣＴＣ１４１４２ＢＰ）及びラクトバチルス・プランタルムＬＭＴ１９－１（受託番号ＫＣＴＣ１４１４１ＢＰ）からなる群から選択される微生物、またはその組み合わせ、あるいはその培養物またはその抽出物を有効成分として含む組成物を提供する。
【0019】
前記組成物は、耐酸性を有するもの；耐胆汁酸性を有するもの；酸化を促進させる活性、脂肪合成を抑制する活性、または２つの活性をいずれも有するもの；脂肪蓄積を抑制するもの、または蓄積された脂肪を低減させるもの；ＳＲＥＢＰ－１ｃ及びＦＡＳからなる群から選択される１以上の遺伝子の発現を抑制するもの；ＰＰＡＲ－１α及びＣＰＴ１からなる群から選択される１以上の遺伝子の発現を促進させるもの；ＡＭＰＫのリン酸化レベルを上昇させるもの；個体に投与される場合、血中アディポネクチンレベルを上昇させるもの；個体に投与される場合、体重及び体内脂肪量からなる群から選択される１以上を低減させるもの；及び肝機能を改善させるもの； からなる群から選択される１以上でもある。前記脂肪は、トリグリセリドでもある。
【0020】
従って、前記組成物は、耐酸性及び耐胆汁酸性を有するものであるので、酸性を帯びる腸内においても使用される。また、前記組成物は、酸化を促進させるもの；脂肪合成を抑制するもの；脂肪の量または蓄積を低減させるもの、あるいは蓄積された脂肪を低減させるもの；ＳＲＥＢＰ－１ｃ及びＦＡＳからなる群から選択される１以上の遺伝子の発現を抑制するもの；ＰＰＡＲ－１α及びＣＰＴ１からなる群から選択される１以上の遺伝子の発現を促進させるもの；ＡＭＰＫのリン酸化レベルを上昇させるもの；個体に投与され、血中アディポネクチンレベルを上昇させるもの；肝機能を改善させるもの；及び個体に投与され、体重及び体内脂肪量からなる群から選択される１以上を低減させるもの；のうち１以上のためににも使用される。前記脂肪は、トリグリセリドでもある。
【0021】
体内の脂肪量を減少させることは、治療目的に減少させることを含むものでもある。例えば、体内の脂肪量を減少させることは、肥満関連疾患の予防または治療に使用するためのものでもある。前記肥満関連疾患は、脂肪肝、２型糖尿、高脂血症、心血管疾患、動脈硬化症、脂質関連代謝症侯群及び肥満からなる群から選択される１種以上のものでもある。前記脂肪肝は、非アルコール性脂肪肝でもある。前記個体は、肥満関連疾患が発病したが、あるいは発病する可能性があるヒトを含む動物でもある。
【0022】
前記組成物は、食品または薬剤学的組成物、すなわち、の薬品でもある。前記組成物は、食品学的または薬剤学的に許容可能な担体を含むものでもある。
【0023】
前記組成物は、また前記組成物において、前記微生物、またはその組み合わせ、あるいはその培養物またはその抽出物を、「食品学的有効量」または「治療学的有効量」で含むものでもある。前記組成物において、「治療学的有効量」は、治療を必要とする個体に投与される場合、治療効果を示すに十分な量を意味する。用語「治療」は、個体、例えば、ヒトを含む哺乳類において、疾患または医学的症状、例えば、肥満疾病を治療することを意味し、それは、次を含む：（ａ）疾患または医学的症状の発生を予防すること、すなわち、患者の予防的治療；（ｂ）疾患または医学的症状の緩和、すなわち、患者において、疾患または医学的症状の除去または回復を引き起こし；（ｃ）疾患または医学的症状の抑制、すなわち、個体において、疾患または医学的症状の進行を遅らせたり、停止させたりすること；または（ｄ）個体において、疾患または医学的症状を軽減させること。前記「有効量」は、当業者が適切に選択することができる。前記「有効量」は、０．０１ｍｇないし１０，０００ｍｇ、０．１ｍｇないし１，０００ｍｇ、１ｍｇないし１００ｍｇ、０．０１ｍｇないし１，０００ｍｇ、０．０１ｍｇないし１００ｍｇ、０．０１ｍｇないし１０ｍｇ、または０．０１ｍｇないし１ｍｇでもある。
【0024】
前記組成物は、経口投与されうる。従って、前記組成物は、錠剤、カプセル剤、水性液剤または懸濁液剤のような多様な形態にも製剤化される。該経口用錠剤の場合、ラクトース、とうもろこし澱粉のような賦形剤、及びステアリン酸マグネシウムのような滑沢剤が一般的に加えられうる。該経口投与用カプセル剤の場合、ラクトース及び／または乾燥とうもろこし澱粉が希釈剤としても使用される。該経口用水性懸濁液剤が必要な場合、活性成分を、乳化剤及び／または懸濁化剤と結合させることができる。必要な場合、特定甘味剤及び／または香味剤を加えることができる。
【0025】
他の態様は、ラクトバチルス・サリバリウスＬＭＴ１５－１４（受託番号ＫＣＴＣ１４１４２ＢＰ）及びラクトバチルス・プランタルムＬＭＴ１９－１（受託番号ＫＣＴＣ１４１４１ＢＰ）からなる群から選択される微生物、またはその組み合わせ、あるいはその培養物またはその抽出物を、肝臓または脂肪細胞と接触させる段階を含む、肝臓または脂肪細胞において、脂肪含量を減少させる方法を提供する。
【0026】
前記方法において、前記接触は、微生物、またはその組み合わせ、あるいはその培養物またはその抽出物を、肝細胞または脂肪細胞を含む培地中で培養するものでもある。前記方法は、インビトロ方法またはインビボ方法でもある。
【0027】
他の態様は、ラクトバチルス・サリバリウスＬＭＴ１５－１４（受託番号ＫＣＴＣ１４１４２ＢＰ）及びラクトバチルス・プランタルムＬＭＴ１９－１（受託番号ＫＣＴＣ１４１４１ＢＰ）からなる群から選択される微生物、またはその組み合わせ、あるいはその培養物またはその抽出物を個体に投与する段階を含む、個体の脂肪含量を減少させるか、あるいは肝機能を改善させる方法を提供する。
【0028】
前記方法において、当業者であるならば、投与時、投与経路は、患者の状態によって適切に選択することができるであろう。前記投与は、経口投与または局所投与でもある。
【0029】
前記方法において、投与量は、前述のように、患者の状態、投与経路、主治のの判断のような多様な因子によって多様になる。効果的な投与量は、体外実験または動物モデル試験で得られた用量反応曲線から推定することができる。投与される組成物に存在する本発明の化合物の比率及び濃度は、化学的特性、投与経路、治療的投与量などによっても決定される。前記投与量は、個体に、約１μｇ／ｋｇ／日ないし約１ｇ／ｋｇ／日、または約０．１ｍｇ／ｋｇ／日ないし約５００ｍｇ／ｋｇ／日の有効量でもっても投与される。前記用量は、個体の年齢・体重・感受性、または症状によっても変更される。
前記方法において、前記個体は、ヒトを含む哺乳動物でもある。
前記方法において、前記個体は、ヒトを含む哺乳動物でもある。
【発明の効果】
【0030】
一態様による微生物、またはその組み合わせ、あるいはその培養物またはその抽出物は、脂肪含量を減少させるため、または肝機能を改善させるために使用することができる。
【0031】
他の態様による組成物は、脂肪含量を減少させるため、または肝機能を改善させるとために使用することができる。
他の態様による方法によれば、脂肪含量を効率的に減少させるか、あるいは肝機能を効率的に改善させることができる。
他の態様による方法によれば、脂肪含量を効率的に減少させるか、あるいは肝機能を効率的に改善させることができる。
【図面の簡単な説明】
【0032】
【図1A】高脂肪食餌で脂肪肝誘導されたマウスにおいて、２種乳酸菌を投与し、予防モデルにおいて、経時的な体重変化を示した図である。
【図1B】高脂肪食餌で脂肪肝誘導されたマウスにおいて、２種乳酸菌を投与し、治療モデルにおいて、経時的な体重変化を示した図である。
【図2A】高脂肪食餌で脂肪肝誘導されたマウスにおいて、２種乳酸菌を投与し、予防モデルにおいて、肝組織の体重変化、及び脂質蓄積変化を示した図である。
【図2B】高脂肪食餌で脂肪肝誘導されたマウスにおいて、２種乳酸菌を投与し、治療モデルにおいて、肝組織の体重変化、及び脂質蓄積変化を示した図である。
【図3A】高脂肪食餌で脂肪肝誘導されたマウスにおいて、２種乳酸菌を投与し、予防モデルにおいて、肝組織内中性脂肪含量を示した図である。
【図3B】高脂肪食餌で脂肪肝誘導されたマウスにおいて、２種乳酸菌を投与し、治療モデルにおいて、肝組織内中性脂肪含量を示した図である。
【図4A】高脂肪食餌で脂肪肝誘導されたマウスにおいて、２種乳酸菌を投与し、予防モデルにおいて、肝組織内ＡＭＰＫの活性を示した図である。
【図4B】高脂肪食餌で脂肪肝誘導されたマウスにおいて、２種乳酸菌を投与し、治療モデルにおいて、肝組織内ＡＭＰＫの活性を示した図である。
【図5A】高脂肪食餌で脂肪肝誘導されたマウスにおいて、２種乳酸菌を投与し、予防モデルにおいて、肝組織内脂肪酸化関連遺伝子及び脂肪合成関連遺伝子の発現量を示した図である。
【図5B】高脂肪食餌で脂肪肝誘導されたマウスにおいて、２種乳酸菌を投与し、治療モデルおいて、肝組織内脂肪酸化関連遺伝子及び脂肪合成関連遺伝子の発現量を示した図である。
【図6A】高脂肪食餌で脂肪肝誘導されたマウスにおいて、２種乳酸菌を投与し、予防モデルにおいて、内臓脂肪組織の体重変化を示した図である。
【図6B】高脂肪食餌で脂肪肝誘導されたマウスにおいて、２種乳酸菌を投与し、治療モデルにおいて、内臓脂肪組織の体重変化を示した図である。
【図7A】高脂肪食餌で脂肪肝誘導されたマウスにおいて、２種乳酸菌を投与し、予防モデルにおいて、内臓脂肪組織内ＡＭＰＫの活性を示した図である。
【図7B】高脂肪食餌で脂肪肝誘導されたマウスにおいて、２種乳酸菌を投与し、治療モデルにおいて、内臓脂肪組織内ＡＭＰＫの活性を示した図である。
【図8A】高脂肪食餌で脂肪肝誘導されたマウスにおいて、２種乳酸菌を投与し、予防モデルにおいて、内臓脂肪組織内の脂肪酸化関連遺伝子及び脂肪合成関連遺伝子の発現量を示した図である。
【図8B】高脂肪食餌で脂肪肝誘導されたマウスにおいて、２種乳酸菌を投与し、治療モデルにおいて、内臓脂肪組織内の脂肪酸化関連遺伝子及び脂肪合成関連遺伝子の発現量を示した図である。
【図9A】高脂肪食餌で脂肪肝誘導されたマウスにおいて、２種乳酸菌を投与し、予防モデルにおいて、血液内アディポネクチンの含量を示した図である。
【図9B】高脂肪食餌で脂肪肝誘導されたマウスにおいて、２種乳酸菌を投与し、治療モデルにおいて、血液内アディポネクチンの含量を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【0033】
以下、本発明について、実施例を介し、さらに詳細に説明する。しかし、それら実施例は、本発明を例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲は、それら実施例に限定されるものではない。
【0034】
実施例１．菌株の分離
１．菌株の分離
菌株の分離は、家庭で直接つけた伝統発酵食品、及び乳酸菌に接していない幼児糞便を１００ｇ取り、滅菌水に希釈し、ストマッカ（stomacher）で５分間均質化して行った。均質化されたサンプルは、段階的に希釈し、ブロモフェノールブルー（Sigma、米国）を含むＭＲＳ（Difco、米国）アガール平板培地に塗抹し、３７℃で２ないし３日間培養し、示されたコロニーを、形態別及び色別に区別し、さらに純粋分離し、最終２個菌株を得た。純粋分離された乳酸菌は、それぞれの系統を確認するために、下記実施例１．２．のように、１６Ｓ ｒＤＮＡ系統分析を実施した。
１．菌株の分離
菌株の分離は、家庭で直接つけた伝統発酵食品、及び乳酸菌に接していない幼児糞便を１００ｇ取り、滅菌水に希釈し、ストマッカ（stomacher）で５分間均質化して行った。均質化されたサンプルは、段階的に希釈し、ブロモフェノールブルー（Sigma、米国）を含むＭＲＳ（Difco、米国）アガール平板培地に塗抹し、３７℃で２ないし３日間培養し、示されたコロニーを、形態別及び色別に区別し、さらに純粋分離し、最終２個菌株を得た。純粋分離された乳酸菌は、それぞれの系統を確認するために、下記実施例１．２．のように、１６Ｓ ｒＤＮＡ系統分析を実施した。
【0035】
２．１６Ｓ ｒＤＮＡ分析
選別された乳酸菌は、２７Ｆ（配列番号３）と１４９２Ｒ（配列番号４）とのプライマーセットと、それぞれのＬＭＴ１５－１４及びＬＭＴ１９－１のゲノムとをテンプレートにしてＰＣＲを行い、１６Ｓ ｒＤＮＡ増幅産物を得た。前記増幅産物のヌクレオチド配列を、シーケンシングを介して確認した。その結果、ＬＭＴ１５－１４及びＬＭＴ１９－１の１６Ｓ ｒＤＮＡは、それぞれ配列番号１及び２のヌクレオチド配列を有する。また、前記１６Ｓ ｒＤＮＡのヌクレオチド配列を、ＮＣＢＩ ｂｌａｓｔ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）を使用して解析した。系統樹分析結果、ＬＭＴ１５－１４は、ラクトバチルス・サリバリウス種のようであり、ＬＭＴ１９－１は、ラクトバチルス・プランタルム種のようであった。ＬＭＴ１５－１４及びＬＭＴ１９－１の１６Ｓ ｒＤＮＡは、それぞれラクトバチルス・サリバリウス種及びラクトバチルス・プランタルム種と配列同一性が、それぞれ９９．９％及び９９．９％であり、従って、ＬＭＴ１５－１４菌株及びＬＭＴ１９－１菌株は、ラクトバチルス・サリバリウス種及びラクトバチルス・プランタルム種に属する新たな菌株であると確認された。該２個菌株は、それぞれラクトバチルス・サリバリウス（Lactobacillus salivarius）ＬＭＴ１５－１４及びラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）ＬＭＴ１９－１と命名し、それらを韓国生命工学研究院所在韓国細胞株銀行（ＫＣＴＣ：Korean Collection for Type Cultures）に、２０２０年２月２１日付けで、寄託番号ＫＣＴＣ１４１４２ＢＰ及び同ＫＣＴＣ１４１４１ＢＰで寄託した。
選別された乳酸菌は、２７Ｆ（配列番号３）と１４９２Ｒ（配列番号４）とのプライマーセットと、それぞれのＬＭＴ１５－１４及びＬＭＴ１９－１のゲノムとをテンプレートにしてＰＣＲを行い、１６Ｓ ｒＤＮＡ増幅産物を得た。前記増幅産物のヌクレオチド配列を、シーケンシングを介して確認した。その結果、ＬＭＴ１５－１４及びＬＭＴ１９－１の１６Ｓ ｒＤＮＡは、それぞれ配列番号１及び２のヌクレオチド配列を有する。また、前記１６Ｓ ｒＤＮＡのヌクレオチド配列を、ＮＣＢＩ ｂｌａｓｔ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）を使用して解析した。系統樹分析結果、ＬＭＴ１５－１４は、ラクトバチルス・サリバリウス種のようであり、ＬＭＴ１９－１は、ラクトバチルス・プランタルム種のようであった。ＬＭＴ１５－１４及びＬＭＴ１９－１の１６Ｓ ｒＤＮＡは、それぞれラクトバチルス・サリバリウス種及びラクトバチルス・プランタルム種と配列同一性が、それぞれ９９．９％及び９９．９％であり、従って、ＬＭＴ１５－１４菌株及びＬＭＴ１９－１菌株は、ラクトバチルス・サリバリウス種及びラクトバチルス・プランタルム種に属する新たな菌株であると確認された。該２個菌株は、それぞれラクトバチルス・サリバリウス（Lactobacillus salivarius）ＬＭＴ１５－１４及びラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）ＬＭＴ１９－１と命名し、それらを韓国生命工学研究院所在韓国細胞株銀行（ＫＣＴＣ：Korean Collection for Type Cultures）に、２０２０年２月２１日付けで、寄託番号ＫＣＴＣ１４１４２ＢＰ及び同ＫＣＴＣ１４１４１ＢＰで寄託した。
【0036】
実施例２．高脂肪食餌で非アルコール性脂肪肝が誘導されたＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスモデルにおける乳酸菌による脂肪肝抑制効能評価
１．Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの肥満誘導、及び乳酸菌処理
高脂肪食餌によって誘発された脂肪肝の抑制効能を評価するために、予防モデルと治療モデルとの２モデルにおいて、乳酸菌投与時の脂肪肝誘発様相を評価した。
１．Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの肥満誘導、及び乳酸菌処理
高脂肪食餌によって誘発された脂肪肝の抑制効能を評価するために、予防モデルと治療モデルとの２モデルにおいて、乳酸菌投与時の脂肪肝誘発様相を評価した。
【0037】
実験に使用された動物は、高脂肪食餌で肥満が誘発されるＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスであり、予防モデルとしての７週齢マウス（オス、１８～２２ｇ）と、治療モデルとしての４週齢マウス（オス、１３～１７ｇ）をオリエントバイオから購入し、１週間一般食餌（ＳＡＦＥ、フランス）を給与し、環境に適応させた。その後、該予防モデルは、正常対照群を除いた残り群は、高脂肪食餌（Research diet、米国）、並びに８週間陽性対照物質、及びそれぞれの乳酸菌を、一日に１回経口投与ゾンデを利用し、胃内に直接投与し、総８週後の非アルコール性脂肪肝誘発様相を比較した。治療モデルは、高脂肪食餌で、８週間非アルコール性脂肪肝を誘導し、８週後からは、高脂肪食餌、並びに陽性対照物質、及びそれぞれの乳酸菌を、一日に１回経口投与ゾンデを利用し、胃内に直接投与し、総１６週後の非アルコール性脂肪肝誘発様相を比較した。群（ｎ＝１０）は、総８群であり、下記表１のように構成した。
【表1】
【0038】
体重及び食餌量は、週１回測定し、実験期間が終わった後、実験動物は、絶食させ、ＣＯ２ガスで、低酸素症及び睡眠誘導させ、安楽死させた。血漿及び組織のサンプルは、使用時まで零下８０℃で保管した。
【0039】
２．高脂肪食餌で非アルコール性脂肪肝が誘導されたＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスモデルにおける体重変化測定
全実験期間の間、毎日一定時間に、実験動物の体重を測定し、その結果を、予防モデルは、図１Ａに示し、治療モデルは、図１Ｂに示した。図１Ａ、図１Ｂは、高脂肪食餌で脂肪肝誘導されたマウスにおいて、２種の選別された乳酸菌を投与した場合、経時的な体重変化を示した図面である。図１Ａ、図１Ｂにおいて、横軸は、時間（週）を示し、縦軸は体重を示す。
全実験期間の間、毎日一定時間に、実験動物の体重を測定し、その結果を、予防モデルは、図１Ａに示し、治療モデルは、図１Ｂに示した。図１Ａ、図１Ｂは、高脂肪食餌で脂肪肝誘導されたマウスにおいて、２種の選別された乳酸菌を投与した場合、経時的な体重変化を示した図面である。図１Ａ、図１Ｂにおいて、横軸は、時間（週）を示し、縦軸は体重を示す。
【0040】
図１Ａ、図１Ｂに示されているように、予防モデル及び治療モデルにおいて、脂肪肝誘導高脂肪食餌を給与した群において、体重が増加した。高脂肪食餌及び乳酸菌を経口投与した群の場合、対照群対比で、予防モデルにおいて、Ｌ．サリバリウスＬＭＴ１５－１４は、７．５％減少し、Ｌ．プランタルムＬＭＴ１９－１は、１２．１％減少し、治療モデルにおいては、Ｌ．サリバリウスＬＭＴ１５－１４は、７．９％減少し、Ｌ．プランタルムＬＭＴ１９－１は、５．６％減少した。
【0041】
３．高脂肪食餌で非アルコール性脂肪肝が誘導されたＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスモデルにおける肝組織変化分析
（１）肝組織の重さ測定
高脂肪食餌を利用した非アルコール性脂肪肝誘導モデルにおいて、乳酸菌を投与することによる脂肪肝改善効果を評価した。予防モデル及び治療モデルの実験期間終了後、各群のマウスから肝組織を摘出して重さを測定し、その結果を、予防モデルは、図２Ａに示し、治療モデルは、図２Ｂに示した。
図２Ａ、図２Ｂに示されているように、高脂肪食餌及び乳酸菌を経口投与した群の場合、肝組織の重さを確認した結果、対照群対比で、予防モデルにおいて、Ｌ．サリバリウスＬＭＴ１５－１４は、２６．６％減少し、Ｌ．プランタルムＬＭＴ１９－１は、２４．６％減少し、治療モデルにおいては、Ｌ．サリバリウスＬＭＴ１５－１４は、２７．８％減少し、Ｌ．プランタルムＬＭＴ１９－１は、２４．９％減少した。
（１）肝組織の重さ測定
高脂肪食餌を利用した非アルコール性脂肪肝誘導モデルにおいて、乳酸菌を投与することによる脂肪肝改善効果を評価した。予防モデル及び治療モデルの実験期間終了後、各群のマウスから肝組織を摘出して重さを測定し、その結果を、予防モデルは、図２Ａに示し、治療モデルは、図２Ｂに示した。
図２Ａ、図２Ｂに示されているように、高脂肪食餌及び乳酸菌を経口投与した群の場合、肝組織の重さを確認した結果、対照群対比で、予防モデルにおいて、Ｌ．サリバリウスＬＭＴ１５－１４は、２６．６％減少し、Ｌ．プランタルムＬＭＴ１９－１は、２４．６％減少し、治療モデルにおいては、Ｌ．サリバリウスＬＭＴ１５－１４は、２７．８％減少し、Ｌ．プランタルムＬＭＴ１９－１は、２４．９％減少した。
【0042】
（２）肝組織内の中性脂肪含量確認
高脂肪食餌を利用した非アルコール性脂肪肝誘導モデルにおいて、乳酸菌を投与することによる脂肪肝改善効果を確認するために、肝臓内中性脂肪含量を確認した。各群のマウスから得た肝組織サンプルを、５％ ＮＰ－４０（BioVision、米国）を利用し、１００℃で５分加熱した後、常温に冷やした後、該過程を３回反復させた。反復後、上澄み液だけを取り、中性脂肪定量キット（BioVision、米国）を利用し、中性脂肪の含量を、スペクトロフォトメータを利用し、５７０ｎｍにおける吸光度を測定し、その結果を、予防モデルは、図３Ａに示し、治療モデルは、図３Ｂに示した。
高脂肪食餌を利用した非アルコール性脂肪肝誘導モデルにおいて、乳酸菌を投与することによる脂肪肝改善効果を確認するために、肝臓内中性脂肪含量を確認した。各群のマウスから得た肝組織サンプルを、５％ ＮＰ－４０（BioVision、米国）を利用し、１００℃で５分加熱した後、常温に冷やした後、該過程を３回反復させた。反復後、上澄み液だけを取り、中性脂肪定量キット（BioVision、米国）を利用し、中性脂肪の含量を、スペクトロフォトメータを利用し、５７０ｎｍにおける吸光度を測定し、その結果を、予防モデルは、図３Ａに示し、治療モデルは、図３Ｂに示した。
【0043】
図３Ａ、図３Ｂに示されているように、高脂肪食餌及び乳酸菌を経口投与した群の場合、肝内中性脂肪含量を確認した結果、対照群対比で、予防モデルにおいて、Ｌ．サリバリウスＬＭＴ１５－１４は、６５．４％減少し、Ｌ．プランタルムＬＭＴ１９－１は、６８．７％減少し、治療モデルにおいては、Ｌ．サリバリウスＬＭＴ１５－１４は、５４．４％減少し、Ｌ．プランタルムＬＭＴ１９－１は、５５．５％減少した。乳酸菌を投与した群は、対照群に比べ、肝組織内中性脂肪含量が明らかに低いということを確認することができ、それは、乳酸菌が肝内中性脂肪の分解を促進し、その合成を抑制し、非アルコール性脂肪肝を改善させたと予想された。
【0044】
（３）肝組織内のＡＭＰＫ（ＡＭＰ－activated protein kinase）活性化確認
ＡＭＰＫは、細胞内エネルギー状態を感知するタンパク質であり、エネルギー代謝と係わる肝臓、筋肉、脂肪組織などにおいて、糖、脂肪、コレステロールの分解及び合成を調節する役割を行う。すなわち、細胞内において、糖の吸収及び脂肪の酸化を促進させる物質であり、該ＡＭＰＫの活性化は、肝組織内脂質酸化を増大させ、中性脂肪数値を低減させる。
ＡＭＰＫは、細胞内エネルギー状態を感知するタンパク質であり、エネルギー代謝と係わる肝臓、筋肉、脂肪組織などにおいて、糖、脂肪、コレステロールの分解及び合成を調節する役割を行う。すなわち、細胞内において、糖の吸収及び脂肪の酸化を促進させる物質であり、該ＡＭＰＫの活性化は、肝組織内脂質酸化を増大させ、中性脂肪数値を低減させる。
【0045】
高脂肪食餌を利用した非アルコール性脂肪肝誘導モデルにおいて、乳酸菌を投与することによる脂肪肝改善効果を確認するために、肝組織内ＡＭＰＫ活性程度を確認した。すなわち、各群のマウスから得た肝組織サンプルを、タンパク質抽出溶液であるＰＲＯ－ＰＲＥ－Ｐ（Intron、韓国）を利用し、タンパク質を獲得した。抽出されたタンパク質は、Bradford assay（Bio-Rad、米国）を介して定量した後、ＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル（Invitrogen、米国）でもって電気泳動によって分離し、ＰＶＤＦ（poly vinylidene difluoride membrane）メンブレン（Bio-Rad、米国）に移した。タンパク質が転移されたＰＶＤＦメンブレンは、常温において１時間、５％ ＢＳＡを含むＴＢＳＴ ０．１％（Tris buffered saline with ０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０）溶液で遮断した後、一次抗体である抗ｐ－ＡＭＰＫ、抗ＡＭＰＫ及び抗β－アクチンの抗体（１：１，０００、Cell Signaling、米国）と、４℃で１８時間反応させた。反応が終わった後、ＴＢＳＴ ０．１％溶液で洗浄し、二次抗体である抗兎ＩｇＧ ＨＲＰ連結抗体（１：２，０００、Cell Signaling、米国）で、常温で１時間反応させた後、ＴＢＳＴ ０．１％で洗浄した。洗浄後、ＥＣＬ溶液（Thermo Fisher Scientific、米国）で反応させ、Ｃｈｅｍｉ－ｄｏｃ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、米国）で測定した。その結果を、予防モデルは、図４Ａに示し、治療モデルは、図４Ｂに示した。
【0046】
図４Ａ、図４Ｂに示されているように、高脂肪食餌及び乳酸菌を経口投与した群の場合、肝組織内ＡＭＰＫ活性化を確認した結果、対照群対比で、予防モデルにおいて、Ｌ．サリバリウスＬＭＴ１５－１４は、３９．７％ ＡＭＰＫのリン酸化が増大し、Ｌ．プランタルムＬＭＴ１９－１は、４２．１％ ＡＭＰＫのリン酸化が増大し、治療モデルにおいては、Ｌ．サリバリウスＬＭＴ１５－１４は、４５．４％ ＡＭＰＫのリン酸化が増大し、Ｌ．プランタルムＬＭＴ１９－１は、６６．０％ ＡＭＰＫのリン酸化が増加した。それは、リン酸化されたＡＭＰＫが増加することにより、肝内脂肪酸化活性化が増大し、脂肪合成を調節し、非アルコール性脂肪肝を抑制することができるということを示唆する。
【0047】
（４）肝組織の脂肪酸化と脂肪合成との関連バイオマーカー遺伝子発現の有意的差確認
高脂肪食餌を利用した非アルコール性脂肪肝誘導モデルにおいて、乳酸菌を投与することによる脂肪肝改善効果を確認するために、各群のマウスから得た肝組織サンプルを利用し、肝組織内脂肪酸化関連遺伝子であるＰＰＡＲ－α及びＣＰＴ１と、脂肪合成関連遺伝子であるＳＲＥＢＰ－１ｃ及びＦＡＳとの発現差を、リアルタイム（real time）ＰＣＲを介して測定した。
高脂肪食餌を利用した非アルコール性脂肪肝誘導モデルにおいて、乳酸菌を投与することによる脂肪肝改善効果を確認するために、各群のマウスから得た肝組織サンプルを利用し、肝組織内脂肪酸化関連遺伝子であるＰＰＡＲ－α及びＣＰＴ１と、脂肪合成関連遺伝子であるＳＲＥＢＰ－１ｃ及びＦＡＳとの発現差を、リアルタイム（real time）ＰＣＲを介して測定した。
【0048】
すなわち、各群のマウスから得た肝組織サンプルを、ＲＮＡ抽出キットであるAccuPrep（登録商標）Universal ＲＮＡ Extraction Kit（Bioneer、韓国）を利用し、ＲＮＡを抽出した。その後、RocketScript Cycle ＲＴ Premix（Bioneer、韓国）を利用し、ＲＮＡに相補的なＤＮＡを得た後、ＳＹＢＲ green（Takara、日本）、及び下記の表２に示したプライマーを利用し、脂肪酸化関連遺伝子（ＰＰＡＲ－α及びＣＰＴ１）及び脂肪合成関連遺伝子（ＳＲＥＢＰ－１ｃ及びＦＡＳ）の発現を確認した。その結果を、予防モデルは、図５Ａに示し、治療モデルは、図５Ｂに示した。
【表2】
【0049】
図５Ａ、図５Ｂに示されているように、高脂肪食餌及び乳酸菌を経口投与した群の場合、肝組織内脂肪酸化関連遺伝子であるＰＰＡＲ－α及びＣＰＴ１の発現量を確認した結果、対照群対比で、予防モデルにおいて、Ｌ．サリバリウスＬＭＴ１５－１４は、１３１．３％、４３８．１％増加し、Ｌ．プランタルムＬＭＴ１９－１は、１６３．６％、４９４．９％増加し、治療モデルにおいては、Ｌ．サリバリウスＬＭＴ１５－１４は、４３．５％、１０２．２％増加し、Ｌ．プランタルムＬＭＴ１９－１は、４４．２％、６９．２％増加した。また、肝組織内脂肪合成関連遺伝子であるＳＲＥＢＰ－１ｃ及びＦＡＳの発現量を確認した結果、対照群対比で、予防モデルにおいて、Ｌ．サリバリウスＬＭＴ１５－１４は、５８．０％、６５．８％低減し、Ｌ．プランタルムＬＭＴ１９－１は、３９．２％、５７．７％低減し、治療モデルにおいては、Ｌ．サリバリウスＬＭＴ１５－１４は、６９．１％、６０．１％低減し、Ｌ．プランタルムＬＭＴ１９－１は、６５．７％、６０．１％低減した。従って、前記乳酸菌投与時間内、脂肪酸化増大及び脂肪合成抑制を介し、脂肪肝を抑制することができる。
【0050】
４．高脂肪食餌で非アルコール性脂肪肝が誘導されたＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスモデルにおける内臓脂肪組織変化分析
（１）内臓脂肪組織の重さ測定
正常に、肝組織脂肪酸は、８０％が脂肪組織の中性脂肪が脂肪酸に分解された後、循環系を介して肝組織に流入され、１５％は、食事後、消化系を介して吸収された後、循環系を介して肝組織に流入され、残り５％は、肝組織の脂肪酸新生過程（de novo lipogenesis）を介して新たにされる。従って、脂肪組織からの脂肪酸流入増大は、肝組織において、過度な脂肪肝を形成するのに密接な関連性を有する。
（１）内臓脂肪組織の重さ測定
正常に、肝組織脂肪酸は、８０％が脂肪組織の中性脂肪が脂肪酸に分解された後、循環系を介して肝組織に流入され、１５％は、食事後、消化系を介して吸収された後、循環系を介して肝組織に流入され、残り５％は、肝組織の脂肪酸新生過程（de novo lipogenesis）を介して新たにされる。従って、脂肪組織からの脂肪酸流入増大は、肝組織において、過度な脂肪肝を形成するのに密接な関連性を有する。
【0051】
そのために、高脂肪食餌を利用した非アルコール性脂肪肝誘導モデルにおいて、乳酸菌を投与することによる内臓脂肪組織抑制効果を評価した。予防モデル及び治療モデルの実験期間終了後、各群のマウスから、内臓脂肪組織、すなわち、腹部側腹腔内に存在する脂肪から、皮下脂肪を除いた、腸と、腸間とに有機的に存在する脂肪を摘出して重さを測定し、その結果を、予防モデルは、図６Ａに示し、治療モデルは、図６Ｂに示した。
【0052】
図６Ａ、図６Ｂに示されているように、高脂肪食餌及び乳酸菌を経口投与した群の場合、内臓脂肪組織の重さを確認した結果、対照群対比で、予防モデルにおいて、Ｌ．サリバリウスＬＭＴ１５－１４は、２７．１％減少し、Ｌ．プランタルムＬＭＴ１９－１は、３３．９％減少し、治療モデルにおいては、Ｌ．サリバリウスＬＭＴ１５－１４は、３３．７％減少し、Ｌ．プランタルムＬＭＴ１９－１は、２４．６％減少した。
【0053】
（２）内臓脂肪組織内のＡＭＰＫ活性化確認
高脂肪食餌を利用した非アルコール性脂肪肝誘導モデルにおいて、乳酸菌を投与することによる脂肪肝改善効果を確認するために、内臓脂肪組織内ＡＭＰＫ活性程度を確認した。各群のマウスから得た内臓脂肪組織サンプルを利用し、前記実施例３．３と同一方法で進め、その結果を、予防モデルは、図７Ａに示し、治療モデルは、図７Ｂに示した。
高脂肪食餌を利用した非アルコール性脂肪肝誘導モデルにおいて、乳酸菌を投与することによる脂肪肝改善効果を確認するために、内臓脂肪組織内ＡＭＰＫ活性程度を確認した。各群のマウスから得た内臓脂肪組織サンプルを利用し、前記実施例３．３と同一方法で進め、その結果を、予防モデルは、図７Ａに示し、治療モデルは、図７Ｂに示した。
【0054】
図７Ａ、図７Ｂに示されているように、高脂肪食餌及び乳酸菌を経口投与した群の場合、内臓脂肪組織内ＡＭＰＫ活性化を確認した結果、対照群対比で、予防モデルにおいて、Ｌ．サリバリウスＬＭＴ１５－１４は、７３．０％ ＡＭＰＫのリン酸化が増大し、Ｌ．プランタルムＬＭＴ１９－１は、８０．８％ ＡＭＰＫのリン酸化が増大し、治療モデルにおいては、Ｌ．サリバリウスＬＭＴ１５－１４は、４４．８％ ＡＭＰＫのリン酸化が増大し、Ｌ．プランタルムＬＭＴ１９－１は、４４．９％ ＡＭＰＫのリン酸化が増大した。それは、リン酸化されたＡＭＰＫが増大することにより、脂肪細胞内脂肪酸化活性化が増大し、脂肪合成を調節し、肝臓における脂肪酸流入を低減させることができるということを示唆する。
【0055】
（３）内臓脂肪組織の脂肪酸化と脂肪合成との関連バイオマーカー遺伝子発現の有意的差確認
高脂肪食餌を利用した非アルコール性脂肪肝誘導モデルにおいて、乳酸菌を投与することによる脂肪肝改善効果を確認するために、内臓脂肪組織内脂肪酸化関連遺伝子であるＰＰＡＲ－α及びＣＰＴ１と、脂肪合成関連遺伝子であるＳＲＥＢＰ－１ｃ及びＦＡＳとの発現差を、リアルタイムＰＣＲを介して測定した。各群のマウスから得た内臓脂肪組織サンプルを利用し、前記実施例３．４と同一方法で進め、その結果を、予防モデルは、図８Ａに示し、治療モデルは、図８Ｂに示した。
高脂肪食餌を利用した非アルコール性脂肪肝誘導モデルにおいて、乳酸菌を投与することによる脂肪肝改善効果を確認するために、内臓脂肪組織内脂肪酸化関連遺伝子であるＰＰＡＲ－α及びＣＰＴ１と、脂肪合成関連遺伝子であるＳＲＥＢＰ－１ｃ及びＦＡＳとの発現差を、リアルタイムＰＣＲを介して測定した。各群のマウスから得た内臓脂肪組織サンプルを利用し、前記実施例３．４と同一方法で進め、その結果を、予防モデルは、図８Ａに示し、治療モデルは、図８Ｂに示した。
【0056】
図８Ａ及び図８Ｂに示されているように、高脂肪食餌及び乳酸菌を経口投与した群の場合、内臓脂肪組織内脂肪酸化関連遺伝子であるＰＰＡＲ－α及びＣＰＴ１の発現量を確認した結果、対照群対比で、予防モデルにおいて、Ｌ．サリバリウスＬＭＴ１５－１４は、７８．８％、８６．８％増加し、Ｌ．プランタルムＬＭＴ１９－１は、７６．６％、８３．０％増加し、治療モデルにおいては、Ｌ．サリバリウスＬＭＴ１５－１４は、３６．９％、１１２．３％、増加し、Ｌ．プランタルムＬＭＴ１９－１は、４１．７％、１１７．５％増加した。また、内臓脂肪組織内脂肪合成関連遺伝子であるＳＲＥＢＰ－１ｃ及びＦＡＳの発現量を確認した結果対照群対比で、予防モデルにおいて、Ｌ．サリバリウスＬＭＴ１５－１４は、６５．５％、５９．１％低減し、Ｌ．プランタルムＬＭＴ１９－１は、８０．７％、６７．１％低減し、治療モデルにおいては、Ｌ．サリバリウスＬＭＴ１５－１４は、５３．４％、５３．７％低減し、Ｌ．プランタルムＬＭＴ１９－１は、５９．３％、７１．１％低減した。従って、前記乳酸菌は、投与時、脂肪組織の脂肪酸化増大及び脂肪合成抑制を介し、中性脂肪の合成を抑制し、肝内脂肪酸の流入を低減させ、脂肪肝を抑制することができる。
【0057】
５．高脂肪食餌で非アルコール性脂肪肝が誘導されたＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスモデルにおけるアディポネクチン確認
アディポネクチンは、脂肪組織から分泌されるホルモンであり、ＡＭＰＫ活性とＰＰＡＲα活性とに影響を与え、脂肪調節に影響を与える。肥満患者において血液内アディポネクチン量が低減し、体脂肪低減は、アディポネクチン生産を増大させ、脂肪酸のβ－酸化を促進し、脂肪肝を抑制する役割を行う。そのようなアディポネクチンは、体脂肪が過度に蓄積された場合、発現量及び血中濃度が低減されるので、脂肪蓄積の指標として使用することができる。
アディポネクチンは、脂肪組織から分泌されるホルモンであり、ＡＭＰＫ活性とＰＰＡＲα活性とに影響を与え、脂肪調節に影響を与える。肥満患者において血液内アディポネクチン量が低減し、体脂肪低減は、アディポネクチン生産を増大させ、脂肪酸のβ－酸化を促進し、脂肪肝を抑制する役割を行う。そのようなアディポネクチンは、体脂肪が過度に蓄積された場合、発現量及び血中濃度が低減されるので、脂肪蓄積の指標として使用することができる。
【0058】
そのような脂肪酸化活性化に影響を与えるホルモンであるアディポネクチンの含量を測定するために、各群のマウスから採取した血液サンプルをチューブに収集し、遠心分離し、血清を分離した。分離された血清は、Adiponectin（mouse）ＥＬＩＳＡ kit（Adipogen Ｉｎｃ、韓国）を使用し、アディポネクチン含量を測定し、その結果を、予防モデルは、図９Ａに示し、治療モデルは、図９Ｂに示した。
【0059】
図９Ａ及び図９Ｂに示されているように、高脂肪食餌及び乳酸菌を経口投与した群の場合、血中アディポネクチン含量を確認した結果、対照群対比で、予防モデルにおいて、Ｌ．サリバリウスＬＭＴ１５－１４は、２２．４％アディポネクチンが増加し、Ｌ．プランタルムＬＭＴ１９－１は、２６．７％アディポネクチンが増加し、治療モデルにおいては、Ｌ．サリバリウスＬＭＴ１５－１４は、２５．６％アディポネクチンが増加し、Ｌ．プランタルムＬＭＴ１９－１は、２６．３％アディポネクチンが増加した。従って、アディポネクチンが増加することにより、脂肪酸のβ－酸化に関連があるＡＭＰＫの活性化を増大させ、脂肪肝生成を抑制することが可能である。
【0060】
実施例３．菌株の形態学的及び発酵的な特性調査
１．菌学的特性分析
非アルコール性脂肪肝抑制に効果がある２種の乳酸菌Ｌ．サリバリウスＬＭＴ１５－１４とＬ．プランタルムＬＭＴ１９－１とを、ＭＲＳ平板培地で培養し、コロニーの形態を観察し、該コロニー形態は、下記表３に示した。
１．菌学的特性分析
非アルコール性脂肪肝抑制に効果がある２種の乳酸菌Ｌ．サリバリウスＬＭＴ１５－１４とＬ．プランタルムＬＭＴ１９－１とを、ＭＲＳ平板培地で培養し、コロニーの形態を観察し、該コロニー形態は、下記表３に示した。
【表3】
【0061】
２．選抜された乳酸菌株の糖発酵特性
糖発酵特性は、ＡＰＩ ５０ ＣＨＬキット（Biomerieux、フランス）を利用し、供給社の実験方法によって調査した。非アルコール性脂肪肝抑制に効果がある２種の乳酸菌であるＬ．サリバリウスＬＭＴ１５－１４とＬ．プランタルムＬＭＴ１９－１との糖発酵特性を下記表４に示した。
糖発酵特性は、ＡＰＩ ５０ ＣＨＬキット（Biomerieux、フランス）を利用し、供給社の実験方法によって調査した。非アルコール性脂肪肝抑制に効果がある２種の乳酸菌であるＬ．サリバリウスＬＭＴ１５－１４とＬ．プランタルムＬＭＴ１９－１との糖発酵特性を下記表４に示した。
【表4】
【0062】
実施例７．安定性
１．乳酸菌の耐酸性の調査
乳酸菌が腸内において、プロバイオティックスとしての効能を発揮するためには、摂取後、低いｐＨ上を通過しなければならない。乳酸菌の耐酸性を調査するために、滅菌されたＭＲＳ液体培地に接種した後、３７℃で１８時間培養し、その次に、ＨＣｌでｐＨ２．５に調整し、滅菌されたＭＲＳ液体培地に、前記乳酸菌を接種し、３７℃で２時間培養した。乳酸菌接種直後と、２時間培養後との試料を回収し、ＭＲＳ液体培地に希釈し、ＭＲＳ平板培地に塗抹した後、３７℃で２４時間培養した後、平板培地上のコロニー数を係数し、乳酸菌数を測定し、下記表５に示した。
１．乳酸菌の耐酸性の調査
乳酸菌が腸内において、プロバイオティックスとしての効能を発揮するためには、摂取後、低いｐＨ上を通過しなければならない。乳酸菌の耐酸性を調査するために、滅菌されたＭＲＳ液体培地に接種した後、３７℃で１８時間培養し、その次に、ＨＣｌでｐＨ２．５に調整し、滅菌されたＭＲＳ液体培地に、前記乳酸菌を接種し、３７℃で２時間培養した。乳酸菌接種直後と、２時間培養後との試料を回収し、ＭＲＳ液体培地に希釈し、ＭＲＳ平板培地に塗抹した後、３７℃で２４時間培養した後、平板培地上のコロニー数を係数し、乳酸菌数を測定し、下記表５に示した。
【表5】
【0063】
実施例７．安定性
１．乳酸菌の耐酸性の調査
乳酸菌が腸内において、プロバイオティックスとしての効能を発揮するためには、摂取後、低いｐＨ上を通過しなければならない。乳酸菌の耐酸性を調査するために、滅菌されたＭＲＳ液体培地に接種した後、３７℃で１８時間培養し、その次に、ＨＣｌでｐＨ２．５に調整し、滅菌されたＭＲＳ液体培地に、前記乳酸菌を接種し、３７℃で２時間培養した。乳酸菌接種直後と、２時間培養後との試料を回収し、ＭＲＳ液体培地に希釈し、ＭＲＳ平板培地に塗抹した後、３７℃で２４時間培養した後、平板培地上のコロニー数を係数し、乳酸菌数を測定し、下記表６に示した。
１．乳酸菌の耐酸性の調査
乳酸菌が腸内において、プロバイオティックスとしての効能を発揮するためには、摂取後、低いｐＨ上を通過しなければならない。乳酸菌の耐酸性を調査するために、滅菌されたＭＲＳ液体培地に接種した後、３７℃で１８時間培養し、その次に、ＨＣｌでｐＨ２．５に調整し、滅菌されたＭＲＳ液体培地に、前記乳酸菌を接種し、３７℃で２時間培養した。乳酸菌接種直後と、２時間培養後との試料を回収し、ＭＲＳ液体培地に希釈し、ＭＲＳ平板培地に塗抹した後、３７℃で２４時間培養した後、平板培地上のコロニー数を係数し、乳酸菌数を測定し、下記表６に示した。
【表6】
【0064】
その結果、非アルコール性脂肪肝抑制に効果がある２種乳酸菌において、Ｌ．サリバリウスＬＭＴ１５－１４は、８４．４％、Ｌ．プランタルムＬＭＴ１９－１は、９７．８％と、ｐＨ２．５における酸性に対し、高い生存率を確認することができた。そのような乳酸菌の特徴は、前述の生理的ｐＨと近いｐＨ３より低いｐＨにおいて、５０％以上の適正乳酸菌数を維持しているために、胃酸分泌による低いｐＨにおいても、安定して生菌数が維持され、摂取時、腸内到達率が非常に高いとも予想される。
【0065】
２．乳酸菌の耐胆汁性の調査
乳酸菌の耐胆汁性を調査するために、以下の方法で実験を実施した。乳酸菌は、滅菌されたＭＲＳ液体培地に接種した後、３７℃で１８時間培養し、腸管内胆汁酸塩濃度が０．１（ｗ／ｖ）％前後であることを勘案し、０．３（ｗ／ｖ）％の胆汁酸塩［（Bile salts（Sigma、米国）］が含有されたＭＲＳ液体培地に、前記乳酸菌を接種し、３７℃で２時間それぞれ培養した。乳酸菌接種直後と、２時間培養後との試料を回収し、ＭＲＳ液体培地に希釈し、ＭＲＳ平板培地に塗抹した後、３７℃で２４時間培養した後、平板培地上のコロニー数を係数し、乳酸菌数を測定し、下記表７に示した。
乳酸菌の耐胆汁性を調査するために、以下の方法で実験を実施した。乳酸菌は、滅菌されたＭＲＳ液体培地に接種した後、３７℃で１８時間培養し、腸管内胆汁酸塩濃度が０．１（ｗ／ｖ）％前後であることを勘案し、０．３（ｗ／ｖ）％の胆汁酸塩［（Bile salts（Sigma、米国）］が含有されたＭＲＳ液体培地に、前記乳酸菌を接種し、３７℃で２時間それぞれ培養した。乳酸菌接種直後と、２時間培養後との試料を回収し、ＭＲＳ液体培地に希釈し、ＭＲＳ平板培地に塗抹した後、３７℃で２４時間培養した後、平板培地上のコロニー数を係数し、乳酸菌数を測定し、下記表７に示した。
【表7】
【0066】
その結果、非アルコール性脂肪肝抑制に効果がある２種乳酸菌において、Ｌ．サリバリウスＬＭＴ１５－１４は、０．８％、Ｌ．プランタルムＬＭＴ１９－１は、７３．９％と、特に、Ｌ．プランタルムＬＭＴ１９－１は、腸内実際濃度と類似した０．１％よりもさらに高い０．３％においても、５０％以上の適正乳酸菌数を維持した。従って、人体や動物の腸内においても、十分に生存することができ、腸内到達率が非常に高いと予想することができる根拠にもなる。
【図1A】
【図1B】
【図2A】
【図2B】
【図3A】
【図3B】
【図4A】
【図4B】
【図5A】
【図5B】
【図6A】
【図6B】
【図7A】
【図7B】
【図8A】
【図8B】
【図9A】
【図9B】
【配列表】