特許 7491523 下痢性貝毒を産生する渦鞭毛藻からオカダ酸及び／又はジノフィシストキシンを製造する方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-05-20

(45)【発行日】2024-05-28

(54)【発明の名称】下痢性貝毒を産生する渦鞭毛藻からオカダ酸及び／又はジノフィシストキシンを製造する方法

(51)【国際特許分類】

   C12P 17/06 20060101AFI20240521BHJP

   G01N 30/06 20060101ALI20240521BHJP

   G01N 30/14 20060101ALI20240521BHJP

   B01J 20/287 20060101ALI20240521BHJP

   G01N 30/88 20060101ALI20240521BHJP

【ＦＩ】

C12P17/06

G01N30/06 Z

G01N30/14 A

B01J20/287

G01N30/88 E

【請求項の数】 7

(21)【出願番号】P 2020068688

(22)【出願日】2020-04-06

(65)【公開番号】P2021164418

(43)【公開日】2021-10-14

【審査請求日】2023-02-20

【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成３１年度、国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構 生物系特定産業技術研究支援センター、革新的技術開発・緊急展開事業（うち経営体強化プロジェクト） 先端技術を活用した世界最高水準の下痢性貝毒監視体制の確立、産業技術力強化法第１７条の適用を受ける特許出願

(73)【特許権者】

【識別番号】501168814

【氏名又は名称】国立研究開発法人水産研究・教育機構

(73)【特許権者】

【識別番号】000252300

【氏名又は名称】富士フイルム和光純薬株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100080791

【弁理士】

【氏名又は名称】高島 一

(74)【代理人】

【識別番号】100136629

【弁理士】

【氏名又は名称】鎌田 光宜

(74)【代理人】

【識別番号】100125070

【弁理士】

【氏名又は名称】土井 京子

(74)【代理人】

【識別番号】100121212

【弁理士】

【氏名又は名称】田村 弥栄子

(74)【代理人】

【識別番号】100174296

【弁理士】

【氏名又は名称】當麻 博文

(74)【代理人】

【識別番号】100137729

【弁理士】

【氏名又は名称】赤井 厚子

(74)【代理人】

【識別番号】100151301

【弁理士】

【氏名又は名称】戸崎 富哉

(74)【代理人】

【識別番号】100162455

【弁理士】

【氏名又は名称】辻本 典子

(72)【発明者】

【氏名】内田 肇

(72)【発明者】

【氏名】鈴木 敏之

(72)【発明者】

【氏名】及川 寛

(72)【発明者】

【氏名】松嶋 良次

(72)【発明者】

【氏名】渡邊 龍一

(72)【発明者】

【氏名】尾▲崎▼ 怜生

【審査官】平林 由利子

(56)【参考文献】

【文献】Journal of AOAC International，2016年，Vol.99, No.5 ，pp.1151-1162

【文献】SUPELCO，Discovery Ab-Ion SPE for FAME Fractionation and Cis/Trans Separation，Technical Report，2006年，pp.1-9

【文献】アジレント・テクノロジー株式会社，Bond Elut QuEchERS EMR Lipidsを用いた下痢性貝毒分析の前処理法，2016年，Pub. No. LC-MS-201607TK-001，pp.1,2

【文献】Journal of Chromatgraphic Science，2013年，Vol.51，pp.166-172

【文献】SHIMADZU，C18(ODS)で困ったときに：フェニルカラムによる分離の改善，Technical Report No.50，2011年，pp.1-4

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｐ １／００－４１／００

Ｇ０１Ｎ ３０／００－３０／９６

Ｂ０１Ｊ ２０／００－２０／３４

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

精製されたオカダ酸及び／又はジノフィシストキシンを製造する方法であって、
（１）オカダ酸及び／又はジノフィシストキシンを含む渦鞭毛藻の抽出物についてπ電子相互作用を利用した精製を行うことにより、第１の精製画分を得る工程、
（２）前記第１の精製画分について金属イオンと二重結合との錯体形成を利用した精製を行うことにより、第２の精製画分を得る工程、及び
（３）前記第２の精製画分について、逆相クロマトグラフィーを用いた精製を行うことにより、精製されたオカダ酸及び／又はジノフィシストキシンを得る工程、
を含む方法。

【請求項2】

前記抽出物が、渦鞭毛藻を溶媒と接触させる工程、及び任意で液液抽出法により精製を行う工程に付すことにより得られる、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記π電子相互作用を利用した精製が、フェニル基を有する固相を用いた精製である、請求項１又は請求項２に記載の方法。

【請求項4】

前記金属イオンと二重結合との錯体形成を利用した精製が、銀イオン浸漬シリカゲルを用いた精製である、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項5】

前記渦鞭毛藻が、プロロセントラム属の渦鞭毛藻である、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項6】

前記渦鞭毛藻が、プロロセントラム・リマ（Prorocentrum lima）である請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項7】

前記ジノフィシストキシンが、ジノフィシストキシン-１である、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、下痢性貝毒を産生する渦鞭毛藻からオカダ酸及び／又はジノフィシストキシンを製造する方法に関する。

【背景技術】

【0002】

下痢性貝毒とは、毒化した二枚貝等を摂食することに起因して、下痢をはじめとする消化器系障害を主な症状とする食中毒を引き起こす毒のことである。アカザラガイ、アサリ、イガイ、イタヤガイ、コタマガイ、チョウセンハマグリ、ホタテガイ、マガキ、ムラサキガイ等の二枚貝が毒性を有するプランクトンを摂取することにより、それらの二枚貝の中腸腺等に下痢性貝毒が濃縮され、そのような二枚貝をヒトが摂取することにより食中毒が発生する。

【0003】

下痢性貝毒の原因となる毒として、オカダ酸（okadaic acid）及びその類縁体であるジノフィシストキシン（dinophysistoxin）-１、ジノフィシストキシン-２、ジノフィシストキシン-３（本明細書ではこれらを総称してジノフィシストキシンと呼ぶ）が知られている。それらの貝毒は主として、ジノフィシス属やプロロセントラム属の渦鞭毛藻により産生される。下痢性貝毒による食中毒を防止するために我が国では、水揚げされた二枚貝の毒力を検査している。その際に毒力が規制値を超えると、生産者による出荷自主規制の措置が講じられる。オカダ酸とジノフィシストキシンの化学式を下記に示す。

【0004】

【化1】

【0005】

過去において、下痢性貝毒の毒力を測定する公定法として、我が国ではマウス毒性試験が採用されていた。しかしマウス毒性試験は２０１７年４月から廃止され、我が国の下痢性貝毒の毒力を測定する公定法は高速液体クロマトグラフ／タンデム質量分析計（ＬＣ/ＭＳ/ＭＳ）を用いた機器分析法に変更された。このような機器分析法は従来のマウス毒性試験とは異なり、オカダ酸とジノフィシストキシンの量を個別に測定することが可能であり、且つ測定の精度と感度が高いという利点を有する。

【0006】

ところでＬＣ/ＭＳ/ＭＳを用いて下痢性貝毒の機器分析を行うにあたり、標準物質としてのオカダ酸とジノフィシストキシンが必須となる。分析用の標準物質は、従来はカナダのＮａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｕｎｃｉｌ（ＮＲＣ）から認証標準物質が供給されていたが、現在では国内の国家計量機関である産業技術総合研究所計量標準総合センターからも認証標準物質を入手することが可能である。しかしながら機器分析法への変更により同標準物質の需要が高まっており、その供給は十分ではない。その一方でオカダ酸とジノフィシストキシンは複雑な化学構造を有するために、化学的に合成して標準物質を供給することは困難である。

【0007】

下痢性貝毒の標準物質を製造するための従来法として、下痢性貝毒を産生する渦鞭毛藻から、メタノ－ルなどの有機溶媒を使用してオカダ酸とジノフィシストキシンを抽出する方法が知られている（非特許文献１、非特許文献２）。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0008】

【文献】Toshiyuki Suzuki et al., Marine and Freshwater Halmful Algae, 34-39, (2014)

【文献】Daniel G. Beach et al., Journal of AOAC International, Vol.99, No.5, 1151-1162, (2016)

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0009】

そのような従来法では、抽出された試料からオカダ酸とジノフィシストキシンを単離精製するために、中圧又は高速液体クロマトグラフィーを数回実施する必要がある。

【0010】

よって純度が高いオカダ酸とジノフィシストキシン-１（最も重要なジノフィシストキシンである）の標準物質を２０ｍｇ得るためには、１か月以上もの期間を要する。加えて各種クロマトグラフィーによる精製は回収率が低く、その煩雑な精製を実施するには精製技術に熟練する必要がある。更にジノフィシストキシンについては、オカダ酸と異なる手法で精製しなければならない。そのような従来技術の問題点のために、オカダ酸とジノフィシストキシンの標準物質を簡便かつ効率的に精製することは困難であった。

【0011】

よって本発明の課題は、下痢性貝毒生産渦鞭毛藻からオカダ酸及び／又はジノフィシストキシンの標準物質を簡便かつ効率的に製造するための、新たな方法を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0012】

渦鞭毛藻類からオカダ酸及び／又はジノフィシストキシンを有機溶媒（メタノール）により抽出し、液液抽出によりクロロホルムに転溶させ、その後に数回のクロマトグラフィーによる精製を行うことにより、精製されたオカダ酸及び／又はジノフィシストキシンを得る方法が、従来技術として知られている（非特許文献１）。下記の実施例で示すが、クロマトグラフィーによる精製を行う前のクロロホルム層について、オカダ酸及び／又はジノフィシストキシンと共に抽出されてくる夾雑成分をＬＣ/ＰＤＡ/ＱＴＯＦ（液体クロマトグラフィー/フォトダイオードアレイ/四重極-飛行時間型質量分析計）で解析した結果、色素化合物と高度不飽和脂肪酸が多く含まれていた。

【0013】

この結果から、これまでオカダ酸及び／又はジノフィシストキシンの精製に使用されていない分画手法が、それらの物質の効率的な精製に有効である可能性が示唆された。本発明者らは鋭意検討した結果、π電子相互作用を利用した精製を行い（芳香族化合物が多く含まれる）色素化合物を除去する工程と、金属イオンと二重結合との錯体形成を利用した精製を行い不飽和脂肪酸を除去する工程を行った後に、逆相クロマトグラフィーによる精製を１回行うことにより、純度が高いオカダ酸及び／又はジノフィシストキシンを得られることを見出した。

【0014】

すなわち、本発明は、以下の通りである。
［１］精製されたオカダ酸及び／又はジノフィシストキシンを製造する方法であって、
（１）オカダ酸及び／又はジノフィシストキシンを含む渦鞭毛藻の抽出物についてπ電子相互作用を利用した精製を行うことにより、第１の精製画分を得る工程、
（２）前記第１の精製画分について金属イオンと二重結合との錯体形成を利用した精製を行うことにより、第２の精製画分を得る工程、及び
（３）前記第２の精製画分について、逆相クロマトグラフィーを用いた精製を行うことにより、精製されたオカダ酸及び／又はジノフィシストキシンを得る工程、
を含む方法。
［２］前記抽出物が、渦鞭毛藻を溶媒と接触させる工程、及び任意で液液抽出法により精製を行う工程に付すことにより得られる、［１］に記載の方法。
［３］前記π電子相互作用を利用した精製が、フェニル基を有する固相を用いた精製である、［１］又は［２］に記載の方法。
［４］前記金属イオンと二重結合との錯体形成を利用した精製が、銀イオン浸漬シリカゲルを用いた精製である、［１］～［３］のいずれか１つに記載の方法。
［５］前記渦鞭毛藻が、プロロセントラム属の渦鞭毛藻である、［１］～［４］のいずれか１つに記載の方法。
［６］前記渦鞭毛藻が、プロロセントラム・リマ（Prorocentrum lima）である［１］～［５］のいずれか１つに記載の方法。
［７］前記ジノフィシストキシンがジノフィシストキシン-１である、［１］～［６］のいずれか１つに記載の方法。
［８］下痢性貝毒を産生する渦鞭毛藻の抽出物からオカダ酸及び／又はジノフィシストキシンを精製する方法であって、
（１）前記抽出物についてπ電子相互作用を利用した精製を行うことにより、第１の精製画分を得る工程、
（２）前記第１の精製画分について金属イオンと二重結合との錯体形成を利用した精製を行うことにより、第２の精製画分を得る工程、及び
（３）前記第２の精製画分について、逆相クロマトグラフィーを用いた精製を行うことにより、精製されたオカダ酸及び／又はジノフィシストキシンを得る工程、
を含む方法。

【発明の効果】

【0015】

本発明の方法によれば、下痢性貝毒を産生する渦鞭毛藻の抽出物から、π電子相互作用を利用した精製工程と、金属イオンと二重結合との錯体形成を利用した精製工程を行った後に、液体クロマトグラフィー精製を１回行うことにより、オカダ酸及び／又はジノフィシストキシンを製造することができる。本発明の方法は、オカダ酸及び／又はジノフィシストキシンの精製時間を短縮し、それらの標準物質の安価な製造を可能とするものである。加えて本発明の方法の主要な工程は固相抽出により行われるので、スケールアップも容易である。

【0016】

更に本発明の方法で得た標準物質について、計量学的に妥当な手段によって値付けを行い、認証値及びその不確かさ、並びに計量学的トレーサビリティーを記載した認証書を付して認証標準物質とすることもできる。加えて標準物質の国際的な活用のために、国際単位（ＳＩ）としてトレーサビリティーが確立した認証標準物質も、本発明により得ることができる。

【図面の簡単な説明】

【0017】

【図1】図１は、既往の精製技術（非特許文献１）と本発明の精製技術を比較した図である。

【図2】図２は、クロロホルム層に含まれる夾雑成分のＬＣ/ＰＤＡ/ＱＴＯＦ解析を行った結果を示す図面である。図２において上段は高速液体クロマトグラフィー/フォトダイオードアレイ測定（ＬＣ/ＰＤＡ）の結果であり、下段はＱＴＯＦ－ＭＳの結果である。

【図3】図３は、フェニル基を有する固相抽出カラムで精製を行う前後の試料の純度を示す高速液体クロマトグラフィー/フォトダイオードアレイ測定（ＬＣ/ＰＤＡ）のチャートである。図３において上段はフェニルカラム精製前の試料を解析したチャートであり、下段はフェニルカラム精製後の試料を解析したチャートである。

【図4】図４は、銀イオン浸漬シリカゲル固相抽出カラムで精製を行う前後の試料の純度を示す高速液体クロマトグラフィー/フォトダイオードアレイ測定（ＬＣ/ＰＤＡ）のチャートである。図４において上段は銀イオン浸漬シリカゲル固相抽出カラムによる精製前の試料を解析したチャートであり、下段は銀イオン浸漬シリカゲル固相抽出カラムによる精製後の試料を解析したチャートである。

【図5】図５は、逆相高速液体クロマトグラフィー精製のチャートを示す図面である。

【図6】図６は、得られたオカダ酸とジノフィシストキシン-１の純度をＮＭＲによる検定した結果を示す図面である。図６の上段はオカダ酸を検定したＮＭＲスペクトルであり、下段はジノフィシストキシン-１を検定したＮＭＲスペクトルを示す。

【発明を実施するための形態】

【0018】

従来技術である非特許文献１に記載されたオカダ酸及び／又はジノフィシストキシンの精製技術と、本発明のオカダ酸群の精製技術との比較を図１に示す。

【0019】

図１に示されるように従来技術（非特許文献１）では、渦鞭毛藻の前処理抽出物（クロロホルム画分）について、アルミナ固相抽出とシリカ固相抽出による順相クロマトグラフィー精製を行った後に、中圧及び高速の逆相液体クロマトグラフィー精製を各１回行い、更にゲルろ過クロマトグラフィー（中圧クロマトグラフィー）による精製を１回と、高速の逆相液体クロマトグラフィーによる精製を１回行うことにより、オカダ酸及び／又はジノフィシストキシンの精製物を得ている。このように従来技術による方法は多段階のクロマトグラフィー精製の工程を含むが、中圧及び高速の液体クロマトグラフィーによる精製手法はカラムに供することができる試料の量が少ないために精製に長い時間を要し、スケールアップも困難である。

【0020】

一方、本発明の方法では、同様の前処理で得た渦鞭毛藻の前処理抽出物（クロロホルム画分）の中に含まれる夾雑物である色素化合物と高度不飽和脂肪酸を除去するために、π電子相互作用を利用した精製工程（フェニル固相抽出カラムによる固相抽出）と、金属イオンと二重結合との錯体形成を利用した精製工程（銀イオン浸漬シリカゲルによる固相抽出）を行い、その後に高圧の逆相クロマトグラフィーによる精製を１回行う。本発明の方法の各工程について、以下に詳細に述べる。

【0021】

１．渦鞭毛藻の前処理を行う工程
下痢性貝毒を産生する渦鞭毛藻の前処理を行うことにより、オカダ酸及び／又はジノフィシストキシンを含む抽出物を得る。ここで行われる前処理工程は、その後に行われるπ電子相互作用を利用した精製、金属イオンと二重結合との錯体形成を利用した精製、及び逆相高速液体クロマトグラフィーカラムを用いた精製により、十分に純度が高いオカダ酸及び／又はジノフィシストキシンの標準物質を得ることができるものであれば良く、特に限定されるものではない。

【0022】

本明細書において「下痢性貝毒を産生する渦鞭毛藻」とは、オカダ酸とジノフィシストキシンを代表とする下痢性貝毒を産生する能力を有する渦鞭毛藻を意味する。更に本明細書において「オカダ酸及び／又はジノフィシストキシン」とは、オカダ酸、ジノフィシストキシン-１、ジノフィシストキシン-２、及びジノフィシストキシン-３からなる群から選択された１つ又はそれ以上の化合物の任意の組み合わせを意味する。更に本明細書において「標準物質」とは、試料中のオカダ酸及び／又はジノフィシストキシンの濃度を機器分析法で測定する際に基準として使用される物質を言う。

【0023】

本発明の方法で使用される渦鞭毛藻は好ましくはプロロセントラム属の渦鞭毛藻であり、特に好ましくはプロロセントラム・リマ（Prorocentrum lima）である。しかし本発明で使用される渦鞭毛藻はそれに限定されるものではなく、オカダ酸及び／又はジノフィシストキシンを産生する能力を有する他の渦鞭毛藻、例えばジノフィシス属の渦鞭毛藻も使用することができる。本発明の方法において、下痢性貝毒を産生する渦鞭毛藻を人工海水中で予め培養することにより、その渦鞭毛藻の量を増やしておくことは好適な態様である。

【0024】

本明細書における「渦鞭毛藻の前処理」とは、π電子相互作用を利用した精製と二重結合との錯体形成を利用した精製を行う前に行われる、渦鞭毛藻の処理工程を言う。この前処理の工程は渦鞭毛藻の抽出物を得る工程であり、渦鞭毛藻中のオカダ酸及び／又はジノフィシストキシンを十分に回収し、夾雑物を少なくとも部分的に除去できるかぎり、特に限定されるものではないが、例えば渦鞭毛藻を溶媒と接触させて抽出物を得る工程、及び任意で液液抽出法による精製工程を含み得る。溶媒としては、例えば有機溶媒が挙げられるが、それに限定されるものではない。

【0025】

有機溶媒による抽出に使用される溶媒の一例はメタノールであるが、それに限定されるものではなく、エタノール、プロパノール、ブタノール等の低級アルコール、及びアセトンなども使用することができる。

【0026】

液液抽出の方法の１態様として、非特許文献１に記載された方法を用いることができる。すなわち抽出物の溶媒を除いてメタノールに再溶解し、そのメタノール溶液にヘキサンを加えて攪拌し、分離したヘキサン層を除去することで脱脂し、残ったメタノール層に蒸留水を加え、クロロホルムを加えて攪拌し、オカダ酸及び／又はジノフィシストキシンを含むクロロホルム層を収集することにより後の精製にかける抽出物を得る。しかしながら液液抽出の方法はそのような方法に限定されるものではない。

【0027】

２．π電子相互作用を利用した精製にかける工程
上記１の工程で得た抽出物についてπ電子相互作用を利用した精製を行う。この工程において使用される精製手段はπ電子相互作用を利用した精製である限り特に限定されないが、好ましくはフェニル基を有する固相を用いた精製により実施することができる。

【0028】

本明細書において「π電子相互作用を利用した精製」とは、π-π相互作用（パイ-パイ相互作用）、言い換えれば有機化合物分子の芳香環の間に働く分散力（ロンドン分散力）を利用した精製を言う。パイ-パイ相互作用には２つの芳香環がコインを積み重ねたような配置で安定化する傾向があるため、スタッキング(積み重ね)相互作用とも呼ばれる。

【0029】

本工程の精製を、限定されるものではないが、例えばシリカゲル等の担体にフェニル基を結合させた固相（本明細書において「フェニル基を有する固相」と言う）を用いて実施することができる。そのような固相を充填したカラムはフェニル基結合カラムとして市販されている。なお「フェニル基を有する固相」における固相もシリカゲルに限定されるものではない。

【0030】

すなわちフェニル基を結合させた固相と、上記１の工程で得られた抽出物中に含まれる色素化合物の芳香環との間に生じるパイ-パイ相互作用を利用して精製を実施する。この工程で該抽出物中の色素化合物を除去することが可能であり、この工程で得られる精製物を本明細書において第１の精製画分と称する。

【0031】

上記で述べたフェニル基が結合した固相として、下記の実施例で使用しているＩｎｅｒｔ Ｓｅｐ Ｐｈ（ジーエルサイエンス）を用いることは好適である。しかしそれに限定されるものではなく、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ＤＳＣ－Ｐｈ（シグマアルドリッジ）、Ｂｏｎｄ Ｅｌｕｔ ＰＨ（アジレント）等の他のフェニル基を有する固相を充填したカラムも使用することができる。

【0032】

このフェニル基を有する固相を用いた精製工程では、水・メタノールの比率（例、８０：２０、６０：４０、４０：６０、２０：８０、０：１００、ｖ/ｖ）を変えたステップワイズ溶出によりオカダ酸及びジノフィシストキシンを含む画分を得ることが好ましい。更に試料溶解液及びステップワイズ溶離液に０．１％となるように酢酸などの酸を加え、酸性条件下で実施することでカラムへの負荷能及び分画性能を向上させることができる。

【0033】

３．金属イオンと二重結合との錯体形成を利用した精製を行う工程
工程２で得た第１の精製画分について、金属イオンと二重結合との錯体形成を利用した精製を行う。本明細書において「金属イオンと二重結合との錯体形成を利用した精製」とは、金属イオンが二重結合と錯体を形成することを利用した精製を言う。二重結合と錯体を形成することができる金属イオンとして銀イオンを挙げることができるが、それに限定されるものではない。

【0034】

具体的には銀イオンと二重結合との錯体形成を利用した精製を、例えばシリカゲル等の担体を硫酸銀又は硝酸銀に浸漬処理することにより調製された固相を用いて行うことができる。本明細書において、シリカゲルを硫酸銀又は硝酸銀に浸漬処理した固相を「銀イオン浸漬シリカゲル」と言う。より詳しくはシリカゲルを硫酸銀で処理した固相を「硫酸銀浸漬シリカゲル」と言い、硝酸銀で処理した固相を「硝酸銀浸漬シリカゲル」と言う。なお金属イオンを結合させる担体はシリカゲルに限定されるものではない。

【0035】

この工程において銀イオン浸漬シリカゲルを用いて、銀イオンクロマトグラフィーにより精製を行うことができる。銀イオンクロマトグラフィーとは、有機化合物中の不飽和化合物と銀イオンが錯体を形成することを利用した精製手法である。本発明の方法において銀イオン浸漬シリカゲルの銀イオンは、第１の精製画分中に存在する高度不飽和脂肪酸の二重結合と錯体を形成する。よって銀イオン浸漬シリカゲルカラムを用いた精製を行うことにより、試料中に含まれる高度不飽和脂肪酸を除去することができる。この工程で得られる精製画分を本明細書において第２の精製画分と言う。

【0036】

「硫酸銀浸漬シリカゲル」又は「硝酸銀浸漬シリカゲル」を用いて銀イオンロマトグラフィーを行うことは、本発明において好ましい態様である。例えば、銀イオンロマトグラフィーを行うのに、下記の実施例で使用されているＤｉｓｃｏｖｅｒｙ Ａｇ-ｉｏｎ ＳＰＥ（シグマ－アルドリッチ）を用いることは好適である。しかしそれに限定されるものではなく、硝酸銀含浸シリカゲル（富士フィルム和光純薬）等の他の銀イオンクロマトグラフィーカラム・担体も使用することができる。

【0037】

銀イオンクロマトグラフィーによる精製を行う工程では、アセトンに溶解した試料を銀イオン浸漬シリカゲル固相に供し、アセトンで洗浄した後、アセトンとアセトニトリル（例、３：９７、５：９５、１０：９０、３０：７０、ｖ/ｖ）の比率を変えたステップワイズ溶出法により分画することが好ましい。更に各種分画溶媒は脱水した溶媒を用いることで再現性を向上させることができる。

【0038】

４．逆相高速液体クロマトグラフィーカラムを行う工程
上記３の工程で得た第２の精製画分について、逆相高速液体クロマトグラフィーを用いた精製を行い、オカダ酸及び／又はジノフィシストキシンの精製された標準物質を得る。この逆相高速液体クロマトグラフィーにおいて使用されるカラムは特に限定されるものではない。下記の実施例で使用されているＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ ＡＤＭＥ（大阪ソーダ）を用いることは好適であるが、他の逆相高速液体クロマトグラフィー用カラム、例えばオクタデシル基、オクタデシルシリル基、トリアコンチル基などで修飾された逆相分配系のＨＰＬＣカラムも、十分に純度が高い標準物質を得ることができる限り使用することができる。

【実施例】

【0039】

以下、実施例を挙げて、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

【0040】

実施例１ 本発明の方法によるオカダ酸とジノフィシストキシン-１の製造
工程１ 下痢性貝毒オカダ酸及びジノフィシストキシン-１の生産と抽出
渦鞭毛藻Prorocentrum limaを培養して、オカダ酸及びジノフィシストキシン-１を生産させた。人工海水に栄養塩を添加した培地を用いて、２５℃で約６週間培養した。培地を除去し、培養槽に付着したProrocentrum limaの藻体を集めた。集めた藻体をメタノールにより抽出した。

【0041】

工程２ 液液抽出による精製
工程１で得た抽出物の溶媒を除いてメタノールに再溶解した。メタノール溶液にヘキサンを加えて攪拌し、分離したヘキサン層を除去することにより脱脂した。残ったメタノール層に蒸留水を加え、その後にクロロホルムを加えて攪拌し、クロロホルム層を分離して液液抽出画分を得た。

【0042】

クロロホロム層（液液抽出画分）に含まれる夾雑物成分を、ＬＣ/ＰＤＡ/ＱＴＯＦで解析した。その結果を図２に示す。フォトダイオードアレイ分析測定（ＰＤＡ）の結果は液液抽出により得られたクロロホルム層には夾雑物として色素化合物が多く含まれることを示し、ＱＴＯＦ型質量分析の結果は夾雑物として不飽和脂肪酸が多く含まれることを示した。

【0043】

工程３ フェニル基を有する固相抽出カラムによる精製
工程２で得られたクロロホルム層（液液抽出画分）の溶媒を除き、蒸留水：メタノール（４：１、ｖ/ｖ）に試料を溶解し、フェニル基を有する固相抽出カラム（Ｉｎｅｒｔ Ｓｅｐ Ｐｈ、ジーエルサイエンス）へ供した。メタノール比を１０％ずつ上げるステップワイズ溶出法により、オカダ酸とジノフィシストキシン-１を精製して第一画分を得た。

【0044】

フェニル基を有する固相抽出カラムによる精製を行う前後の純度を比較した、高速液体クロマトグラフィー/フォトダイオードアレイ測定（ＬＣ/ＰＤＡ）のクロマトグラムのチャートを図３に示す。図３から判るように、フェニル基を有する固相抽出カラムによる精製を行うことにより多くの夾雑物が除かれてオカダ酸とジノフィシストキシン-１の純度は増加した。

【0045】

工程４ 銀イオン浸漬シリカゲルによる固相抽出カラム精製
工程３で得た第一画分の溶媒を除き、アセトンに溶解した試料を銀イオン浸漬シリカゲルの固相抽出カラム（Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ａｇ－ｉｏｎ ＳＰＥ、シグマ－アルドリッチ）に供した。カラムをアセトンで洗浄した後、アセトニトリル：アセトンの比率を変えたステップワイズ溶出法で分画し、第二画分を得た。

【0046】

銀イオン浸漬シリカゲルによる精製前後の純度を比較した、高速液体クロマトグラフィー/フォトダイオードアレイ測定（ＬＣ/ＰＤＡ）クロマトグラムのチャートを図４に示す。図４から判るように、銀イオン浸漬シリカゲルによる精製を行うことにより多くの夾雑物が除かれて、オカダ酸とジノフィシストキシン-１の純度は更に増加した。

【0047】

工程５ 逆相高速液体クロマトグラフィー精製
工程４で得た第二画分の溶媒を除き、逆相高速液体クロマトグラフィーで分画に用いる移動相に溶解させた。逆相高速液体クロマトグラフィー（ＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ ＡＤＭＥ、大阪ソーダ）を用いて、水：アセトニトリル：酢酸（３０：７０：０．１）を混合した酸性条件の移動相により分離を行った。ＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ ＡＤＭＥによる高速液体クロマトグラフィーを行った際のチャートを図５に示す。

【0048】

工程６ 純度の検定と値付け
工程５で得られたオカダ酸及びジノフィシストキシン-１の精製された標準物質について核磁気共鳴装置による解析を行って純度を検定した。工程５で得られた純度９５％以上のオカダ酸及びジノフィシストキシン-１のＮＭＲスペクトルを図６に示す。このようにして得られたオカダ酸及びジノフィシストキシン-１の標準物質について、例えば定量ＮＭＲ法により値付けを行い認証標準物質とすることもできる。

【0049】

比較例１ 従来法（非特許文献１の方法）によるオカダ酸とジノフィシストキシン-１の製造
工程１ 下痢性貝毒オカダ酸及びジノフィシストキシン-１の生産と抽出
渦鞭毛藻Prorocentrum limaを培養して、オカダ酸及びジノフィシストキシン-１を生産させた。人工海水に栄養塩を添加したものを培地として、２５℃で約６週間培養した。培地を除去し、培養槽に付着したProrocentrum limaの藻体を集めた。集めた藻体をメタノールにより抽出した。

【0050】

工程２ 液液抽出による精製
工程１で得た抽出物の溶媒を除いてメタノールに再溶解した。メタノール溶液にヘキサンを加えて攪拌し、分離したヘキサン層を除去することにより脱脂した。残ったメタノール層に蒸留水を加え、その後にクロロホルムを加えて攪拌し、クロロホルム層を分離させて採集した。

【0051】

工程３ アルミナカラムによる精製
工程２で得られたクロロホルム層の溶媒を除き、ジクロロメタンとメタノール（１：１、ｖ/ｖ）に溶解した試料をアルミナ（Ａｌ_２Ｏ_３）カラムに供した。１％アンモニアを含む水：メタノール（１：１、ｖ/ｖ）で分画してオカダ酸及びジノフィシストキシン-１を溶出した。

【0052】

工程４ シリカゲルカラムによる精製
工程３で分画した画分をジクロロメタン：メタノール（９５：５、ｖ/ｖ）に溶解し、シリカゲルカラムに供した。ジクロロメタン：メタノール（９５：５、ｖ/ｖ）及びジクロロメタン：メタノール（１：１、ｖ/ｖ）で分画し、１％アンモニアを含む水：メタノール（１：１、ｖ/ｖ）でオカダ酸及びジノフィシストキシン-１を溶出した。

【0053】

工程５ Ｄｅｖｅｒｏｓｉｌ ＬＯＰ ＯＤＳによる精製
工程４で分画したジクロロメタン：メタノール（１：１、ｖ/ｖ）画分をＤｅｖｅｒｏｓｉｌ ＬＯＰ ＯＤＳ（野村化学）の中圧カラムによって水：メタノールの比率によるステップワイズグラジエントで分画した。メタノール：水（８５：１５、ｖ/ｖ）でオカダ酸及びジノフィシストキシン-１を溶出した。

【0054】

工程６ Ｃｏｓｍｏｉｓｉｌ ５Ｃ１８－ＡＲ－ＩＩによる精製
工程５で分画したメタノール：水（８５：１５、ｖ/ｖ）画分をＣｏｓｍｏｓｉｌ ５Ｃ１８－ＡＲ－ＩＩ（ナカライテスク）のＨＰＬＣカラムで精製した。０．１％の酢酸を含む水及びアセトニトリルの２相によるリニアグラジエントで分画し、オカダ酸及びジノフィシストキシン-１を分画した。

【0055】

工程７ ゲルろ過カラムによる精製
工程６で分画したオカダ酸及びジノフィシストキシン-１を含む画分をゲルろ過カラム（ＨＷ４０Ｓ、φ１００ｍｍ×３００ｍｍ、東ソー）でメタノールを移動相として、オカダ酸及びジノフィシストキシン-１を分画した。

【0056】

工程８ Ｄｅｖｅｒｏｓｉｌ Ｃ３０ ＵＧ－５による精製
工程７で分画したオカダ酸及びジノフィシストキシン-１を、Ｄｅｖｅｒｏｓｉｌ Ｃ３０ ＵＧ－５（野村化学）のＨＰＬＣカラムで０．５％酢酸を含むアセトニトリル：水（７：３、ｖ/ｖ）で精製し、オカダ酸及びジノフィシストキシン-１を得た。

【0057】

比較例１と本発明の精製ステップの回収率及び精製ステップに要する時間を表１と表２に示す。表２から判るように本発明の方法で精製を行うのに必要な時間は約８０時間であった。一方表１から判るように、従来法の比較例１の方法で精製を行うのに必要な時間は約２００時間であり、本発明の方法により精製時間を大幅に（半分以下に）短縮することが可能であった。加えて本発明の方法における各精製工程の回収率は約８０％～約９０％であり、高い回収率を示した。

【0058】

【表1】

【0059】

【表2】

【産業上の利用可能性】

【0060】

本発明により、オカダ酸及び／又はジノフィシストキシンの精製標準物質を、効率良く得ることが可能となった。本発明の精製方法は主として固相抽出の工程からなるので、スケールアップも容易である。本発明の方法により、オカダ酸及び／又はジノフィシストキシンの精製された標準物質の安定且つ安価な供給が可能となる。本発明の方法により、オカダ酸及び／又はジノフィシストキシンの認証標準物質、二次標準物質、更には生化学試薬の安価な製造も可能とする。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】