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特許7491589ヒト多能性幹細胞の安全領域に長い外来遺伝子を組み込み正常機能させる方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-05-20
(45)【発行日】2024-05-28
(54)【発明の名称】ヒト多能性幹細胞の安全領域に長い外来遺伝子を組み込み正常機能させる方法
(51)【国際特許分類】
C12N 5/10 20060101AFI20240521BHJP
C12N 5/0735 20100101ALI20240521BHJP
C12N 5/074 20100101ALI20240521BHJP
C12Q 1/06 20060101ALI20240521BHJP
C12N 15/54 20060101ALI20240521BHJP
C12N 15/11 20060101ALN20240521BHJP
【ＦＩ】
C12N5/10
C12N5/0735
C12N5/074
C12Q1/06
C12N15/54 ZNA
C12N15/11 Z
【請求項の数】
16
(21)【出願番号】P 2021502204
(86)(22)【出願日】2020-02-21
(86)【国際出願番号】 JP2020007164
(87)【国際公開番号】W WO2020171222
(87)【国際公開日】2020-08-27
【審査請求日】2023-02-06
(31)【優先権主張番号】P 2019030699
(32)【優先日】2019-02-22
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(73)【特許権者】
【識別番号】504258527
【氏名又は名称】国立大学法人 鹿児島大学
(74)【代理人】
【識別番号】100149076
【弁理士】
【氏名又は名称】梅田 慎介
(74)【代理人】
【識別番号】100119183
【弁理士】
【氏名又は名称】松任谷 優子
(72)【発明者】
【氏名】小戝 健一郎
(72)【発明者】
【氏名】三井 薫
(72)【発明者】
【氏名】井手 佳菜子
【審査官】太田 雄三
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１８－５３１６１２（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１５／１０７８８８（ＷＯ，Ａ１）
【文献】井手佳菜子，他，多能性幹細胞の腫瘍化完全克服を目指した「ゲノム編集での自殺遺伝子挿入技術」の開発，第18回日本再生医療学会総会講演要旨集，2019年02月22日，P-02-004
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ ５／００
Ｃ１２Ｑ １／００
Ｃ１２Ｎ １５／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ヒト細胞内において強い活性を有するプロモーター、及び前記プロモーターに機能的に連結した外来遺伝子をゲノム中のセーフハーバー領域に含むヒト多能性幹細胞であって、ヒト細胞内において強い活性を有するプロモーターがｓｕｒｖｉｖｉｎプロモーター、ＴＥＲＴプロモーター、又は、Ｎａｎｏｇプロモーターであり、かつ、
前記プロモーターに機能的に連結した外来遺伝子がヘルペスウイルス由来チミジンキナーゼ遺伝子、ヒト由来チミジンキナーゼ遺伝子、又はＣａｓｐａｓｅであるヒト多能性幹細胞。
【請求項2】
前記セーフハーバー領域が、ヒト第３染色体上のＲｏｓａ２６遺伝子座又はヒト第１９染色体上のＡＡＶＳ１領域又はヒト第２２番染色体上のＨ１１領域である、請求項１に記載のヒト多能性幹細胞。
【請求項3】
ヒト細胞内において強い活性を有するプロモーターと、前記プロモーターに機能的に連結した外来遺伝子の組み合わせが、ｓｕｒｖｉｖｉｎプロモーター、ＴＥＲＴプロモーター、又は、Ｎａｎｏｇプロモーターと、ヘルペスウイルス由来チミジンキナーゼ遺伝子である、請求項１又は請求項２に記載のヒト多能性幹細胞。
【請求項4】
ヒト細胞内において強い活性を有するプロモーターと、前記プロモーターに機能的に連結した外来遺伝子の組み合わせが、ｓｕｒｖｉｖｉｎプロモーター又はＴＥＲＴプロモーターと、ヒト由来チミジンキナーゼ遺伝子である、請求項１又は請求項２に記載のヒト多能性幹細胞。
【請求項5】
ヒト細胞内において強い活性を有するプロモーターと、前記プロモーターに機能的に連結した外来遺伝子の組み合わせが、ｓｕｒｖｉｖｉｎプロモーターとＣａｓｐａｓｅである、請求項１又は請求項２に記載のヒト多能性幹細胞。
【請求項6】
請求項１～請求項５のいずれか１項に記載の細胞を樹立する方法であって、相同組換え法により、ヒト多能性幹細胞のゲノム中のセーフハーバー領域に、ヒト細胞内において強い活性を有するプロモーター、及び前記プロモーターに機能的に連結した外来遺伝子を導入することを含む方法。
【請求項7】
請求項１～請求項５のいずれか１項に記載の細胞を分化誘導処理することにより得られた細胞。
【請求項8】
ヒト多能性幹細胞を分化誘導処理することにより得られた細胞からなる細胞群に含まれる、残存する未分化細胞及び存在する腫瘍化原因細胞に選択的に傷害を与える方法であって、請求項１～請求項５のいずれか１項に記載の細胞を分化誘導処理することにより得られた細胞からなる細胞群を、該自殺遺伝子に対応する薬剤と接触させることにより、前記細胞群に含まれる未分化細胞及び／又は腫瘍化原因細胞に選択的に傷害を与えることを含む方法。
【請求項9】
請求項８に記載の方法であって、更に、相同組換え法により、ヒト多能性幹細胞のゲノム中のセーフハーバー領域に、前記ヒト細胞内において強い活性を有するプロモーター、及び前記プロモーターに機能的に連結した外来遺伝子を導入して、請求項１～請求項５のいずれか１項に記載の細胞を得ること含む方法。
【請求項10】
接触させる前記薬剤のレベルが、未分化細胞及び／又は腫瘍化原因細胞への毒性が分化細胞への毒性よりも強いレベルである、請求項８に記載の方法。
【請求項11】
接触させる前記薬剤のレベルが、未分化細胞及び／又は腫瘍化原因細胞の生存率が分化細胞の生存率よりも３倍以上高いレベルである、請求項１０に記載の方法。
【請求項12】
分化誘導処理後の請求項１～請求項５のいずれか１項に記載の細胞のうち、未分化細胞及び／又は腫瘍化原因細胞に傷害を与える可能性が高く、かつ、分化細胞には障害を与えない可能性が高い、前記薬剤のレベルを決定する方法であって、請求項１～請求項５のいずれか１項に記載の細胞を分化誘導処理することにより得られた細胞と分化誘導処理されていない請求項１～請求項５のいずれか１項に記載の細胞を、複数のレベルの前記薬剤と接触させること、及び、
前記分化誘導処理された細胞と比較して、前記分化誘導処理されていない細胞において細胞傷害効果が高い前記薬剤のレベルを未分化細胞及び／又は腫瘍化原因細胞に傷害を与える可能性が高く、かつ、分化細胞には障害を与えない可能性が高いレベルとして決定することを含む方法。
【請求項13】
請求項１２に記載の方法であって、相同組換え法により、ヒト多能性幹細胞のゲノム中のセーフハーバー領域に、前記強い発現をもたらすプロモーターと機能的に連結した自殺遺伝子を導入して、該自殺遺伝子が導入されたヒト多能性幹細胞を得ること、
得られた自殺遺伝子が導入されたヒト多能性幹細胞を分化誘導処理すること、
得られた分化誘導処理された細胞と、分化誘導処理していない自殺遺伝子が導入されたヒト多能性幹細胞のそれぞれを、複数のレベルの前記薬剤と接触させること、
前記分化誘導処理された細胞と比較して、前記分化誘導処理されていない細胞において細胞傷害効果が高い前記薬剤のレベルを、未分化細胞及び／又は腫瘍化原因細胞に傷害を与える可能性が高く、かつ、分化細胞には障害を与えない可能性が高いレベルとして決定することを含む方法。
【請求項14】
分化誘導処理後のヒト多能性幹細胞に含まれる、残存する未分化細胞及び／又は存在する腫瘍化原因細胞に選択的に傷害を与える方法であって、請求項１～請求項５のいずれか１項に記載の細胞を分化誘導処理することにより得られた細胞からなる細胞群を、前記薬剤と接触させることにより、前記細胞群に含まれる未分化細胞及び／又は腫瘍化原因細胞に選択的に傷害を与えることを含み、
ここで、接触させる前記薬剤のレベルが、請求項１２又は請求項１３において決定されたレベルであることを特徴とする方法。
【請求項15】
分化誘導処理後の、ヘルペスウイルス由来チミジンキナーゼ遺伝子をゲノム中のセーフハーバー領域に含むヒト多能性幹細胞の細胞群に残存する未分化細胞及び／又は存在する腫瘍化原因細胞に選択的に傷害を与える方法であって、請求項１～請求項５のいずれか１項に記載の細胞を分化誘導処理することにより得られた細胞からなる細胞群を、０．０１～１μｇ／ｍＬのガンシクロビルと接触させることにより、前記細胞群に含まれる未分化細胞及び／又は腫瘍化原因細胞に選択的に傷害を与えることを含む方法。
【請求項16】
分化誘導処理後のヒト多能性幹細胞に含まれる、残存する未分化細胞及び／又は存在する腫瘍化原因細胞に選択的に傷害を与える方法であって、請求項１２又は請求１３に記載の方法により、分化誘導処理後の請求項１～請求項５のいずれか１項に記載の細胞のうち、未分化細胞及び／又は腫瘍化原因細胞に傷害を与える可能性が高く、かつ、分化細胞には障害を与えない可能性が高い、前記薬剤のレベルを決定すること、
請求項１～請求項５のいずれか１項に記載の細胞を分化誘導処理すること、
分化誘導処理した細胞を、前記レベルの前記薬剤と接触させることにより、残存する未分化細胞及び存在する未分化細胞及び／又は腫瘍化原因細胞に選択的に傷害を与えることを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【0001】
本国際出願は、２０１９年２月２２日に日本国特許庁に出願された日本国特許出願第２０１９－０３０６９９号に基づく優先権を主張するものであり、日本国特許出願第２０１９－０３０６９９号の全内容を本国際出願に参照により援用する。
【技術分野】
【0002】
本発明は、分化誘導後のヒト多能性幹細胞から効率的かつ網羅的に腫瘍化原因細胞を除去する分野に関する。
【背景技術】
【0003】
ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）およびヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）といったヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）の樹立により、臓器移植に代わる細胞移植療法等の医療・医薬創出に高い期待が寄せられ、再生医療の研究が急速に進められている。日本では、ｈｉＰＳＣを中心とした臨床研究や治験が、米国等ではｈＥＳＣを中心とした治験が進められている。そしてこれらの幾つかは、将来の実用化に繋がるものと期待されている。しかし、分化細胞中に残存する未分化細胞の混在は、細胞移植後の奇形腫や発がん（悪性腫瘍の形成）のリスクをもたらすため、安全性が懸念されている（非特許文献１及び２）。したがって、ｈＰＳＣを用いた細胞移植療法といった再生医療が、広く利用される安全な医療として確立していくには、腫瘍形成を確実に阻止する「腫瘍化原因細胞」となる未分化細胞や発がん細胞を直接・特異的に殺傷する技術の開発は最大の重要課題である。
【0004】
再生医療における幹細胞移植による造腫瘍性リスクについての重要な報告の１つが、十分な非臨床試験で安全性が確立されたという科学界のコンセンサスが得られて上で行われた、造血幹細胞を用いたｅｘ ｖｉｖｏ遺伝子治療の臨床研究において、高率に白血病が発生したという事例である（非特許文献３）。つまり長年に世界中で多数の基礎研究や動物を用いた非臨床研究で「腫瘍化が起こらない」というデータが蓄積されて科学界でコンセンサスが得られた上で実施された、遺伝子治療を施した造血幹細胞を患者へ移植した臨床試験において、顕著な治療効果が得られる技術段階になって初めて、治療後2年経って重篤な副作用である白血病を高度に発症することが明らかとなった。特筆すべきは、この白血病を引き起こした癌細胞が、１つの細胞に由来するクローンであったことである。この事例においては、当初理論的には幹細胞は増殖優位性があるためたった１つの細胞からでも腫瘍が生じ得ると考えられていたものが、その後の非臨床試験でその臨床応用においては腫瘍が生じる確率は低いと結論づけられていた。しかしながら、実際の臨床試験においては、実は当初の理論が正しい（一つの腫瘍化原因細胞から発がんする、よって腫瘍化原因細胞を直接根絶する技術が必須という）ことがヒトで実証されてしまった。ｈＰＳＣは可塑性が高く奇形腫を形成し、また染色体が不安定なために培養中に発がんに繋がる遺伝子変異細胞も生じる可能性も示唆されており、造血幹細胞を用いた臨床試験と同様の結果がｈＰＳＣを用いた再生医療においても起こりうる可能性がある。そこで、ｈＰＳＣの培養法の改善、分化誘導方法の改善といった残存する未分化細胞（腫瘍化原因細胞）の混在を「減らす」という従来の戦略に加えて、これら腫瘍化原因細胞を「直接」「特異的に」「安全に」殺傷除去するという新しい技術開発が求められている。
【0005】
ｈＰＳＣへの遺伝子導入には、プラスミドベクターをエレクトロポレーション、リポフェクションといった方法で導入する非ウイルスＤＮＡデリバリー法と、ウイルスベクターによる感染導入法等が主に用いられている。ｈＰＳＣへの遺伝子導入効率は、非ウイルスＤＮＡデリバリー法に比べ、ウイルスベクターを用いた手法の方が高い効率を示す。遺伝子導入を行う場合、使用するベクターにより、一過的な遺伝子発現のみ可能なものとする場合と、長期安定発現な可能なものとがある。レンチウイルスベクターやレトロウイルスベクターは、外来（目的）遺伝子をｈＰＳＣのゲノム内へ組み込むことから長期安定発現細胞の樹立に非常に適している。よって、本発明者らはこれまでレポーター遺伝子と自殺遺伝子を含み、組換えカセット内にプロモーター領域を有する腫瘍化原因細胞ターゲティングレンチウイルスベクター（ＴＣ－ＬＶ）プラットフォームを開発してきた（特許文献１、非特許文献４）。このプラットフォームを使用することにより、異なる種類のプロモーターでレポーターおよび自殺遺伝子を発現させる様々なＴＣ－ＬＶを効率的かつ同時に産生することが可能であり、産生されたＴＣ－ＬＶをｈＰＳＣへ感染させ解析することで、腫瘍化原因細胞を最も効果的に殺すプロモーターを同定することができる。しかし、レンチウイルスベクターを用いた場合、ゲノム中にランダムな位置に導入されるため、導入部位によっては、導入遺伝子が発がん性のリスクをもたらす可能性がある。そのため、臨床応用においてこのシステムをより安全に活用するためには、ゲノム上のセーフハーバー領域と呼ばれる、つまり遺伝子挿入により細胞に表現形の変化を生じることがないことが知られているからこの通称で呼ばれるが、さらにおそらくは「遺伝子導入される染色体部が同一確定しているので、染色体の構造やエピジェティクスの影響も同一なので、導入された遺伝子の発現は安定して高い発現が得られる（抑制も受けにくい）だろう」と想像されている領域に、外来遺伝子であるレポーターおよび自殺遺伝子を挿入する、すなわち、外来の目的遺伝子をいわゆるセーフハーバー領域という特定の染色体部位へノックインする技術の開発が必要であった。
【0006】
ジンクフィンガーヌクレアーゼまたはＴＡＬＥＮを用いて行われていたゲノム編集技術は、近年、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９の出現により劇的に発展した。しかし、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を用いた場合でも、２９３Ｔ細胞やＫ５６２細胞といった分化細胞に比べ、ｈＰＳＣにおいては遺伝子編集効率は低い。ゲノム編集技術を用いた遺伝子改変のほとんどの研究は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）メカニズムによる遺伝子ノックアウトを行ったものであり、ゲノム編集技術を用いて、外来（目的）遺伝子を相同組換えにより特定の染色体部位にノックインした報告は極めて少ない（非特許文献５）。Ｒｕａｎ，Ｊらは、ブタ線維芽細胞を用いてゲノムのＨｉｐｐ１１（Ｈ１１）領域と呼ばれるセーフハーバー領域に、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術を用いてネオマイシン耐性遺伝子を含む９ｋｂの外来（目的）遺伝子を相同組換えにより挿入したことを報告している（非特許文献６）。霊長類の多能性幹細胞では、アカゲザルのｉＰＳ細胞を用いたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を介したゲノム編集が報告されているが、レポーター遺伝子の発現を確認したのみであった（非特許文献７）。よって、長い塩基配列を有する外来（目的）遺伝子をｈＰＳＣに組み込み、さらにマーカー遺伝子だけでなく自殺遺伝子のように細胞中で機能する遺伝子を発現させた例はこれまでに報告が無かった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0007】
【文献】国際公開第ＷＯ２０１５／１０７８８８号
【非特許文献】
【0008】
【文献】ＴＡＫＡＨＡＳＨＩ，Ｋら（２００７）Ｃｅｌｌ １３１：８６１－７２．
【文献】ＭＩＵＲＡ、Ｋら（２００９）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ２７：７４３－５．
【文献】ＭｃＣｏｒｍａｃｋ，ＭＰら（２００４）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３５０；９１３－２２．
【文献】Ｉｄｅ，Ｋら（２０１７）Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｄｏｉ：１０．１００２／ｓｔｅｍ．２７２５．
【文献】Ｌｉ，Ｓら（２０１５）Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ２４：２９２５－２９４２．
【文献】Ｒｕａｎ，Ｊら（２０１５）Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ｒｅｐｏｒｔｓ ５：１４２５３．
【文献】Ｈｏｎｇ，ＳＧら（２０１７）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｈｅｒａｐｙ ２５：４４－５３．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0009】
ｈＰＳＣを目的細胞に分化誘導した際に、分化細胞中に残存する未分化細胞、すなわち腫瘍化原因細胞の標識法および除去法は、その効率や簡便性等に問題があり、腫瘍化原因細胞を同定および除去する実用可能な方法は、まだ開発途中である。これまでに、本発明者らはレンチウイルスベクターを用いて、未分化細胞において特異的に機能させることができるプロモーターの効率的な探索・同定とその実証、並びに未分化細胞を選択的に可視化・同定し、必要時に選択的に腫瘍化原因細胞を確実に殺傷する自殺遺伝子をハイスループット解析（つまり桁違いの効率で網羅的解析）で同定できる初めてのプラットフォーム技術のＴＣ－ＬＶ法を開発した。このＴＣ－ＬＶ技術の網羅的・効率的解析で見出された「最適の殺傷遺伝子と至適な発現制御プロモーター」をｈＰＳＣの再生医療（細胞移植療法）の臨床応用に用いるには、これらの長い塩基配列を有する外来（目的）遺伝子が導入されたｈＰＳＣが、ゲノムの重要部位に導入されてしまって重要な正常分子機能を阻害・喪失させたり、発がんに繋がるような遺伝子を過剰に活性化させることがないように、またそれに加えてそれらの長い塩基配列の外来（目的）遺伝子が期待するような発現レベルで安定した発現様式を示すことが、特別に同定された最適なゲノム部位に、外来（目的）遺伝子をその部位を標的して導入する方法が必要となるが、これまでにこれらの要件をすべて満たす技術は見いだされていない。例えば、これまでｈＰＳＣにおいて、セーフハーバー領域を標的として蛍光タンパク質等のマーカー遺伝子を導入した報告（Ｍａｌｉ， Ｐ．ら、（２０１３） Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９， ８２３－８２６）はあるが、それは「その他の外来遺伝子でも（一般化できる現象として）正常機能すべき発現レベルが得られるか」について詳細な検討はなく、むしろ「同部に外来遺伝子をいれさえすれば、その外来遺伝子の発現の問題（マーカー遺伝子以外の場合でも、至適なレベルで安定した遺伝子発現が生じることが再現されるか否か）は生じないはずだ」というような常識のもと、「挿入された外来遺伝子の発現レベルで問題が生じる可能性があること、従ってその外来遺伝子を導入した場合はその発現調整が必要」という概念すら存在しないことを示唆している。況してや「最適の殺傷遺伝子と至適発現を誘導できるプロモーター」をセーフハーバー領域に標的して導入し、安全かつ確実にｈＰＳＣの腫瘍化原因細胞を殺傷し、腫瘍化を阻止することができたという報告はない。
【0010】
よって、本発明は、ｈＰＳＣの形質に影響を与えることなく、ｈＰＳＣを目的細胞に分化誘導した際に、分化細胞中に残存する未分化細胞、すなわち腫瘍化原因細胞を効率的かつ簡便に除去する方法を提供することを目的とする。特に、本発明は、ＴＣ－ＬＶというプラットフォーム技術で遺伝子組み換えして網羅的解析で見出した最適候補の殺傷遺伝子ユニットなどに代表される、未分化細胞を選択的に可視化・同定し、必要時に選択的に腫瘍化原因細胞を確実に殺傷する自殺遺伝子を有する配列（腫瘍化原因細胞標的化配列）を、ｈＰＳＣのゲノムセーフハーバー領域に安全かつ効率的に挿入し、挿入されたｈＰＳＣの正常な機能を維持する遺伝子を阻害させることなく、また遺伝子挿入による発がんのリスクなく、目的細胞へ分化させた後に残存する腫瘍化原因細胞を効率的かつ網羅的に除去するための方法を提供することを目的とする。
【0011】
またさらにこの技術は、腫瘍化原因細胞の殺傷のみならず、外来（目的）遺伝子ならびにその発現制御プロモーターなどの長い遺伝子ユニットを、ｈＰＳＣのゲノムセーフハーバー領域に安全かつ効率的に挿入し、挿入されたｈＰＳＣの正常な機能を維持する遺伝子を阻害させることなく、また遺伝子挿入による発がんのリスクなく、外来（目的）遺伝子の適切な発現と期待される機能を発揮させる能力を賦与するものであり、本発明はこの新技術も目的としている。
【課題を解決するための手段】
【0012】
本発明者らは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を介した相同組換えによって、長い塩基配列を有する外来（目的）遺伝子である腫瘍化原因細胞標的化配列を、ｈＰＳＣゲノム中のセーフハーバー領域に効率的に挿入することに初めて成功した。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を介した相同組換え法による多能性細胞への遺伝子の導入は、例えば、アカゲザルのｉＰＳＣに蛍光タンパク質やΔｈＣＤ１９といったマーカー遺伝子を導入したことが報告されている（Ｈｏｎｇ，ＳＧら（２０１７）上掲）が、ｈＰＳＣに導入した例は報告されていない。またこれらのヒト以外の多能性幹細胞の先行論文においても、その長い外来（目的）遺伝子が適切な発現レベルを誘導できたか、その遺伝子発現は安定していたか、その外来（目的）遺伝子が最終的に目的としている意味ある分子機能を正しく発揮できたか、ということについては検証されていない。
【0013】
セーフハーバー領域は、遺伝子挿入により細胞に表現形の変化を生じることがなく、導入した遺伝子が発現抑制を受けにくい領域としてこれまで推察や報告がされている。しかし今回、得られた腫瘍化原因細胞標的化配列を挿入した細胞について注意深く検討したところ、セーフハーバー領域に導入したレポーターおよび自殺遺伝子は、レンチウイルスベクター（ＴＣ－ＬＶ）を用いた遺伝子挿入と同様に安定的にゲノムに挿入されているにも関わらず、強力なプロモーターを用いた場合でも、ＴＣ－ＬＶ導入細胞と比較して発現が低いというこれまでの報告から予想できない、むしろこれまでの予想を覆す驚くべき結果を得た。すなわち、セーフハーバー領域の一つとされたＡＡＶＳ１領域に遺伝子を導入した場合、レンチウイルスベクター等のランダムな遺伝子導入に比べて、遺伝子発現レベルが低くなる傾向があるということを初めて見出した。これらの本発明者らによる予想外の結果に基づき、これを解決するために、強い活性を有するプロモーターを持つ腫瘍化原因細胞標的化配列がセーフハーバー領域に挿入されたｈＰＳＣにおいて、細胞増殖活性との相関のある自殺遺伝子が、対応するプロドラッグの一定の濃度範囲において未分化細胞を選択的に殺傷できることを本発明で見出した。これにより、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を介した相同組換えによりゲノムのセーフハーバー領域に安全に遺伝子を導入しながら、分化誘導後には分化細胞中の未分化細胞のみを網羅的かつ選択的に殺傷することができる仕組みを初めて完全なレベルで完成させるに至った。
【0014】
よって、本発明は以下に関する：
（１） ヒト細胞内において強い活性を有するプロモーター、及び前記プロモーターに機能的に連結した外来遺伝子をゲノム中のセーフハーバー領域に含むｈＰＳＣ。
（２） 前記セーフハーバー領域が、ヒト第３染色体上のＲｏｓａ２６遺伝子座又はヒト第１９染色体上のＡＡＶＳ１領域又はヒト第２２番染色体上のＨ１１領域である、（１）に記載のｈＰＳＣ。
（３） 前記ヒト細胞内において強い活性を有するプロモーターが、ＣＡプロモーター又はｓｕｒｖｉｖｉｎプロモーターである、（１）又は（２）に記載のｈＰＳＣ。
（４） 前記外来遺伝子が自殺遺伝子である、（１）～（３）のいずれか１項に記載のｈＰＳＣ。
（５） 前記自殺遺伝子が、ヘルペスウイルス由来チミジンキナーゼ遺伝子又はシトシンデアミナーゼ遺伝子である、（４）に記載のｈＰＳＣ。
（６） （１）～（５）に記載の細胞を製造する方法であって、
相同組換え法により、ｈＰＳＣのゲノム中のセーフハーバー領域に、ヒト細胞内において強い活性を有するプロモーター、及び前記プロモーターに機能的に連結した自殺遺伝子を導入することを含む方法。
（７） （１）～（５）のいずれか１項に記載の細胞を分化誘導処理することにより得られた細胞。
（８） 分化誘導処理後のｈＰＳＣ（ｈＰＳＣを分化誘導処理することにより得られた細胞群）に含まれる、残存する未分化細胞及び／又は存在する腫瘍化原因細胞に選択的に前記外来遺伝子を発現させる方法であって、
（１）～（５）に記載の細胞を分化誘導処理することにより得られた細胞群を培養することを含む方法。
（９） 分化誘導処理後のｈＰＳＣ（ｈＰＳＣを分化誘導処理することにより得られた細胞群）に含まれる、残存する未分化細胞及び／又は存在する腫瘍化原因細胞に選択的に傷害を与える方法であって、
ヒト細胞内において強い活性を有するプロモーター、及び前記プロモーターに機能的に連結した自殺遺伝子をゲノム中のセーフハーバー領域に含むｈＰＳＣを分化誘導処理すること、
前記分化誘導処理された細胞を、該自殺遺伝子に対応する薬剤と接触させることにより、前記分化誘導処理された細胞群に含まれる未分化細胞及び／又は腫瘍化原因細胞に選択的に傷害を与えることを含む方法。
（１０） 分化誘導処理後のｈＰＳＣ（ｈＰＳＣを分化誘導処理することにより得られた細胞群）に含まれる、残存する未分化細胞及び／又は存在する腫瘍化原因細胞に選択的に傷害を与える方法であって、
相同組換え法により、ｈＰＳＣのゲノム中のセーフハーバー領域に、前記ヒト細胞内において強い活性を有するプロモーター、及び前記プロモーターに機能的に連結した自殺遺伝子を導入して、ヒト細胞内において強い活性を有するプロモーター、及び前記プロモーターに機能的に連結した自殺遺伝子をゲノム中のセーフハーバー領域に含むｈＰＳＣを得ること、
得られた自殺遺伝子が導入されたｈＰＳＣを分化誘導処理すること、
得られた分化誘導処理された細胞を、前記自殺遺伝子に対応する薬剤と接触させることにより、前記細胞群に含まれる未分化細胞及び／又は腫瘍化原因細胞に選択的に傷害を与えることを含む方法。
（１１） 接触させる前記薬剤のレベルが、未分化細胞及び／又は腫瘍化原因細胞への毒性が分化細胞への毒性よりも強いレベルである、（９）又は（１０）に記載の方法。
（１２） 接触させる前記薬剤のレベルが、該薬剤処理後の分化細胞の生存率が該薬剤処理後の未分化細胞及び／又は腫瘍化原因細胞の生存率よりも３倍以上高いレベルである、（１１）に記載の方法。
（１３） 分化誘導処理後のｈＰＳＣ（ｈＰＳＣを分化誘導処理することにより得られた細胞群）に含まれる、残存する未分化細胞及び／又は存在する腫瘍化原因細胞に選択的に傷害を与えるために分化誘導処理後のｈＰＳＣと接触させる該自殺遺伝子に対応する薬剤のレベルであって、分化誘導処理後の（４）又は（５）に記載の細胞のうち、未分化細胞及び／又は腫瘍化原因細胞に傷害を与える可能性が高く、かつ、分化細胞には障害を与えない可能性が高い、前記薬剤のレベルを決定する方法であって、
（４）又は（５）に記載の細胞を分化誘導処理することにより得られた細胞と分化誘導処理されていない（４）又は（５）に記載の細胞を、複数のレベルの前記薬剤と接触させること、及び、
前記分化誘導処理された細胞と比較して、前記分化誘導処理されていない細胞において細胞傷害効果が高い前記薬剤のレベルを未分化細胞及び／又は腫瘍化原因細胞に傷害を与える可能性が高く、かつ、分化細胞には障害を与えない可能性が高いレベルとして決定することを含む方法。
（１４） （１３）に記載の方法であって、
相同組換え法により、ｈＰＳＣのゲノム中のセーフハーバー領域に、前記強い発現をもたらすプロモーターと機能的に連結した自殺遺伝子を導入して、該自殺遺伝子が導入されたｈＰＳＣを得ること、
得られた自殺遺伝子が導入されたｈＰＳＣを分化誘導処理すること、
得られた分化誘導処理された細胞と、分化誘導処理していない前記自殺遺伝子が導入されたｈＰＳＣのそれぞれを、複数のレベルの前記薬剤と接触させること、
前記分化誘導処理された細胞と比較して、前記分化誘導処理されていない細胞において細胞傷害効果が高い前記薬剤のレベルを、未分化細胞及び／又は腫瘍化原因細胞に傷害を与える可能性が高く、かつ、分化細胞には障害を与えない可能性が高いレベルとして決定することを含む方法。
（１５） 分化誘導処理後のｈＰＳＣに含まれる、残存する未分化細胞及び／又は存在する腫瘍化原因細胞に選択的に傷害を与える方法であって、
（４）又は（５）に記載の細胞を分化誘導処理することにより得られた細胞を、該自殺遺伝子に対応する薬剤と接触させることにより、前記細胞群に含まれる未分化細胞及び／又は腫瘍化原因細胞に選択的に傷害を与えることを含み、
ここで、接触させる前記薬剤のレベルが、（１３）又は（１４）において決定されたレベルであることを特徴とする方法。
（１６） 分化誘導処理後の、ヘルペスウイルス由来チミジンキナーゼ遺伝子をゲノム中のセーフハーバー領域に含むｈＰＳＣの細胞群（ヘルペスウイルス由来チミジンキナーゼ遺伝子をゲノム中のセーフハーバー領域に含むｈＰＳＣを分化誘導処理することにより得られた細胞群）に残存する未分化細胞及び／又は存在する腫瘍化原因細胞に選択的に傷害を与える方法であって、
（４）又は（５）に記載の細胞を分化誘導処理することにより得られた細胞を、０．０１～１μｇ／ｍＬのガンシクロビルと接触させることにより、前記細胞群に含まれる未分化細胞及び／又は腫瘍化原因細胞に選択的に傷害を与えることを含む方法。
（１７） 分化誘導処理後のｈＰＳＣ（ｈＰＳＣを分化誘導処理することにより得られた細胞群）に含まれる、残存する未分化細胞及び／又は存在する腫瘍化原因細胞に選択的に傷害を与える方法であって、
（１３）又は（１４）に記載の方法により、分化誘導処理後の（４）又は（５）に記載の細胞のうち、未分化細胞及び／又は腫瘍化原因細胞に傷害を与える可能性が高く、かつ、分化細胞には障害を与えない可能性が高い、前記薬剤のレベルを決定すること、
（４）又は（５）に記載の細胞を分化誘導処理すること、
分化誘導処理した細胞を、前記レベルの前記薬剤と接触させることにより、残存する未分化細胞及び存在する未分化細胞及び／又は腫瘍化原因細胞に選択的に傷害を与えることを含む方法。
（１） ヒト細胞内において強い活性を有するプロモーター、及び前記プロモーターに機能的に連結した外来遺伝子をゲノム中のセーフハーバー領域に含むｈＰＳＣ。
（２） 前記セーフハーバー領域が、ヒト第３染色体上のＲｏｓａ２６遺伝子座又はヒト第１９染色体上のＡＡＶＳ１領域又はヒト第２２番染色体上のＨ１１領域である、（１）に記載のｈＰＳＣ。
（３） 前記ヒト細胞内において強い活性を有するプロモーターが、ＣＡプロモーター又はｓｕｒｖｉｖｉｎプロモーターである、（１）又は（２）に記載のｈＰＳＣ。
（４） 前記外来遺伝子が自殺遺伝子である、（１）～（３）のいずれか１項に記載のｈＰＳＣ。
（５） 前記自殺遺伝子が、ヘルペスウイルス由来チミジンキナーゼ遺伝子又はシトシンデアミナーゼ遺伝子である、（４）に記載のｈＰＳＣ。
（６） （１）～（５）に記載の細胞を製造する方法であって、
相同組換え法により、ｈＰＳＣのゲノム中のセーフハーバー領域に、ヒト細胞内において強い活性を有するプロモーター、及び前記プロモーターに機能的に連結した自殺遺伝子を導入することを含む方法。
（７） （１）～（５）のいずれか１項に記載の細胞を分化誘導処理することにより得られた細胞。
（８） 分化誘導処理後のｈＰＳＣ（ｈＰＳＣを分化誘導処理することにより得られた細胞群）に含まれる、残存する未分化細胞及び／又は存在する腫瘍化原因細胞に選択的に前記外来遺伝子を発現させる方法であって、
（１）～（５）に記載の細胞を分化誘導処理することにより得られた細胞群を培養することを含む方法。
（９） 分化誘導処理後のｈＰＳＣ（ｈＰＳＣを分化誘導処理することにより得られた細胞群）に含まれる、残存する未分化細胞及び／又は存在する腫瘍化原因細胞に選択的に傷害を与える方法であって、
ヒト細胞内において強い活性を有するプロモーター、及び前記プロモーターに機能的に連結した自殺遺伝子をゲノム中のセーフハーバー領域に含むｈＰＳＣを分化誘導処理すること、
前記分化誘導処理された細胞を、該自殺遺伝子に対応する薬剤と接触させることにより、前記分化誘導処理された細胞群に含まれる未分化細胞及び／又は腫瘍化原因細胞に選択的に傷害を与えることを含む方法。
（１０） 分化誘導処理後のｈＰＳＣ（ｈＰＳＣを分化誘導処理することにより得られた細胞群）に含まれる、残存する未分化細胞及び／又は存在する腫瘍化原因細胞に選択的に傷害を与える方法であって、
相同組換え法により、ｈＰＳＣのゲノム中のセーフハーバー領域に、前記ヒト細胞内において強い活性を有するプロモーター、及び前記プロモーターに機能的に連結した自殺遺伝子を導入して、ヒト細胞内において強い活性を有するプロモーター、及び前記プロモーターに機能的に連結した自殺遺伝子をゲノム中のセーフハーバー領域に含むｈＰＳＣを得ること、
得られた自殺遺伝子が導入されたｈＰＳＣを分化誘導処理すること、
得られた分化誘導処理された細胞を、前記自殺遺伝子に対応する薬剤と接触させることにより、前記細胞群に含まれる未分化細胞及び／又は腫瘍化原因細胞に選択的に傷害を与えることを含む方法。
（１１） 接触させる前記薬剤のレベルが、未分化細胞及び／又は腫瘍化原因細胞への毒性が分化細胞への毒性よりも強いレベルである、（９）又は（１０）に記載の方法。
（１２） 接触させる前記薬剤のレベルが、該薬剤処理後の分化細胞の生存率が該薬剤処理後の未分化細胞及び／又は腫瘍化原因細胞の生存率よりも３倍以上高いレベルである、（１１）に記載の方法。
（１３） 分化誘導処理後のｈＰＳＣ（ｈＰＳＣを分化誘導処理することにより得られた細胞群）に含まれる、残存する未分化細胞及び／又は存在する腫瘍化原因細胞に選択的に傷害を与えるために分化誘導処理後のｈＰＳＣと接触させる該自殺遺伝子に対応する薬剤のレベルであって、分化誘導処理後の（４）又は（５）に記載の細胞のうち、未分化細胞及び／又は腫瘍化原因細胞に傷害を与える可能性が高く、かつ、分化細胞には障害を与えない可能性が高い、前記薬剤のレベルを決定する方法であって、
（４）又は（５）に記載の細胞を分化誘導処理することにより得られた細胞と分化誘導処理されていない（４）又は（５）に記載の細胞を、複数のレベルの前記薬剤と接触させること、及び、
前記分化誘導処理された細胞と比較して、前記分化誘導処理されていない細胞において細胞傷害効果が高い前記薬剤のレベルを未分化細胞及び／又は腫瘍化原因細胞に傷害を与える可能性が高く、かつ、分化細胞には障害を与えない可能性が高いレベルとして決定することを含む方法。
（１４） （１３）に記載の方法であって、
相同組換え法により、ｈＰＳＣのゲノム中のセーフハーバー領域に、前記強い発現をもたらすプロモーターと機能的に連結した自殺遺伝子を導入して、該自殺遺伝子が導入されたｈＰＳＣを得ること、
得られた自殺遺伝子が導入されたｈＰＳＣを分化誘導処理すること、
得られた分化誘導処理された細胞と、分化誘導処理していない前記自殺遺伝子が導入されたｈＰＳＣのそれぞれを、複数のレベルの前記薬剤と接触させること、
前記分化誘導処理された細胞と比較して、前記分化誘導処理されていない細胞において細胞傷害効果が高い前記薬剤のレベルを、未分化細胞及び／又は腫瘍化原因細胞に傷害を与える可能性が高く、かつ、分化細胞には障害を与えない可能性が高いレベルとして決定することを含む方法。
（１５） 分化誘導処理後のｈＰＳＣに含まれる、残存する未分化細胞及び／又は存在する腫瘍化原因細胞に選択的に傷害を与える方法であって、
（４）又は（５）に記載の細胞を分化誘導処理することにより得られた細胞を、該自殺遺伝子に対応する薬剤と接触させることにより、前記細胞群に含まれる未分化細胞及び／又は腫瘍化原因細胞に選択的に傷害を与えることを含み、
ここで、接触させる前記薬剤のレベルが、（１３）又は（１４）において決定されたレベルであることを特徴とする方法。
（１６） 分化誘導処理後の、ヘルペスウイルス由来チミジンキナーゼ遺伝子をゲノム中のセーフハーバー領域に含むｈＰＳＣの細胞群（ヘルペスウイルス由来チミジンキナーゼ遺伝子をゲノム中のセーフハーバー領域に含むｈＰＳＣを分化誘導処理することにより得られた細胞群）に残存する未分化細胞及び／又は存在する腫瘍化原因細胞に選択的に傷害を与える方法であって、
（４）又は（５）に記載の細胞を分化誘導処理することにより得られた細胞を、０．０１～１μｇ／ｍＬのガンシクロビルと接触させることにより、前記細胞群に含まれる未分化細胞及び／又は腫瘍化原因細胞に選択的に傷害を与えることを含む方法。
（１７） 分化誘導処理後のｈＰＳＣ（ｈＰＳＣを分化誘導処理することにより得られた細胞群）に含まれる、残存する未分化細胞及び／又は存在する腫瘍化原因細胞に選択的に傷害を与える方法であって、
（１３）又は（１４）に記載の方法により、分化誘導処理後の（４）又は（５）に記載の細胞のうち、未分化細胞及び／又は腫瘍化原因細胞に傷害を与える可能性が高く、かつ、分化細胞には障害を与えない可能性が高い、前記薬剤のレベルを決定すること、
（４）又は（５）に記載の細胞を分化誘導処理すること、
分化誘導処理した細胞を、前記レベルの前記薬剤と接触させることにより、残存する未分化細胞及び存在する未分化細胞及び／又は腫瘍化原因細胞に選択的に傷害を与えることを含む方法。
【図面の簡単な説明】
【0015】
【図1】
ＡＡＶＳ１領域における相同組換に用いるドナーに含まれる構造である。上から順に、基盤ドナーベクターおよび基盤ドナーベクターのリコンビネーションカセット（ＲＣ）にＣＡプロモーター、Ｓｕｒｖｉｖｉｎ（Ｓｕｒｖ）プロモーター、Ｎａｎｏｇプロモーターを挿入したドナーベクターの構造を示す。ＲＣはΛファージが大腸菌染色体へ侵入する際に関与する部位特異的組換えシステムを利用し、ベクター間で改変したａｔｔ配列に挟まれたＤＮＡ配列の交換反応を行う（Ｊａｍｅｓ，Ｌ．ら （２０００）Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．１０： １７８８－１７９５）。ＲＣ部分は組換え時に特異的に相互作用するＤＮＡ配列（ａｔｔ Ｒ配列）が両端にあり、その間にクロラムフェニコール耐性遺伝子（ＣＭＲ）と大腸菌自殺遺伝子であるｃｃｄＢを有する。ＬＡ：ＡＡＶＳ１領域における二本鎖切断部位の左側の隣接配列と相同性を持つ配列、ＳＡ－２Ａ－Ｐｕｒｏ：ピューロマイシン選択のための発現カセット（ＳＡ；スプライシング・アクセプター配列、２Ａ：自己プロセッシング性ペプチド配列、Ｐｕｒｏ：ピューロマイシン耐性遺伝子）、ｐＡ：ポリＡ配列、Ｖｅｎｕｓ：それぞれのプロモーター制御下でのＶｅｎｕｓ発現領域、ＨＳＶｔｋ：単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＧＣＶをリン酸化することによって細胞毒性を引き起こす。）発現領域、ＲＡ：ＡＡＶＳ１領域における二本鎖切断部位の右側の隣接配列と相同性を持つ配列。
【図2】
（ａ）図１のうちＣＡプロモーターを例に、ＡＡＶＳ１領域における相同組換えのためのドナー構造を示す。２本の矢印は正確な相同組換えを調べるために使用されたＰＣＲプライマーの位置を示す。ＣＡ：ＲＣに挿入されたＣＡプロモーター。ＬＡ、ＳＡ－２Ａ－Ｐｕｒｏ、ｐＡ、Ｖｅｎｕｓ、ＨＳＶｔｋ、ＲＡについては、図１と同じ略語を使用。（ｂ）得られたピューロマイシン耐性クローンからゲノムＤＮＡを抽出し、相同組換えについてＰＣＲスクリーニングにかけた。リバースプライマーをノックイン遺伝子の内側に配置したので、ＨＤＲが成功した場合には１５３９ｂｐのＰＣＲアンプリコンに反映されている。ＷＴ ＫｈＥＳ３、ＷＴ ＫｈＥＳ１、およびゲノム鋳型を含まないＨ２Ｏ試料を陰性対照として使用した。
【図3】ＫｈＥＳ１およびＫｈＥＳ３に、図１で示したｐＣＡ．ＶＨ－ｄｏｎｅｒ、ｐＳｕｒｖ．ＶＨ－ｄｏｎｅｒ、ｐＮａｎｏｇ．ＶＨ－ｄｏｎｅｒを用いてＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を介した相同組換えを行い得られた、ピューロマイシン耐性クローンにおける、Ｖｅｎｕｓ発現を示す写真である。ｐＣＡ．ＶＨ－ｄｏｎｅｒを導入したｈＥＳＣ（ＣＡ．ＶＨ）ではＶｅｎｕｓ発現が観察されたが、ｐＳｕｒｖ．ＶＨ－ｄｏｎｅｒおよびｐＮａｎｏｇ．ＶＨ－ｄｏｎｅｒを導入したｈＥＳＣ（Ｓｕｒｖ．ＶＨ、Ｎａｎｏｇ．ＶＨ）では、蛍光顕微鏡下でのＶｅｎｕｓ発現は観察されなかった。
【図4】ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化後のＣＡ．ＶＨにおける安定な導入遺伝子発現を示す写真である。以下の細胞における蛍光顕微鏡法（スケールバー、２００μｍ）で観察されたＶｅｎｕｓ発現を表す写真である：（ａ）ＡＡＶＳ１領域にＣＡ－Ｖｅｎｕｓ－２Ａ－ＨＳＶｔｋ（ＣＡ．ＶＨ）を有する未分化なＫｈＥＳ１及びＫｈＥＳ３クローン；（ｂ）分化処理７日目のＫｈＥＳ３－ＣＡ．ＶＨ＃２クローンに由来する胚様体（ＥＢ）；（ｃ）分化処理５６日目のＫｈＥＳ３－ＣＡ．ＶＨ＃２クローン。
【図5】すべての相同組換えクローンがＶｅｎｕｓまたはＨＳＶｔｋ ｍＲＮＡを発現することを示す図である。縦軸は各ｍＲＮＡの発現レベル（／ＧＡＰＤＨ）を、横軸はクローンを表す。（ａ）正しく相同組換えされた未分化クローンは、ＨＳＶｔｋ ｍＲＮＡを発現したが、ＷＴは発現しなかった。ＫｈＥＳ３とＫｈＥＳ１の間でＨＳＶｔｋ ｍＲＮＡレベルに明らかな違いはなかった。（ｂ）正しく相同組換えされた未分化クローンは、Ｖｅｎｕｓ ｍＲＮＡについても発現していた。ＫｈＥＳ３とＫｈＥＳ１の間でＶｅｎｕｓのｍＲＮＡ発現レベルに明らかな違いはなかった。（ｃ）正しく相同組換えされた分化クローンはＨＳＶｔｋ ｍＲＮＡを発現したが、ＷＴは発現しなかった。ＨＳＶｔｋの発現は分化状態にかかわらず安定していた。（ｄ）蛍光顕微鏡により確認されたＶｅｎｕｓ発現の場合と同様に、ＶｅｎｕｓのｍＲＮＡレベルも分化状態に関係なく安定していた。
【図6】ＣＡ．ＶＨ、Ｓｕｒｖ．ＶＨ、Ｎａｎｏｇ．ＶＨ、及びＷＴの未分化細胞に対する、ＨＳＶｔｋ／ＧＣＶ依存性細胞傷害性及び特異性を示す図である。ＨＳＶｔｋに依存しない非特異的なＧＣＶ依存性細胞傷害性は、未分化な野生型ＫｈＥＳ１では１０および１００μｇ／ｍｌのＧＣＶ濃度で観察され、未分化な野生型ＫｈＥＳ３では１００μｇ／ｍｌのＧＣＶ濃度で観察された。未分化ＣＡ．ＶＨクローンは０．０１μｇ／ｍｌＧＣＶ含有培地を超える生存率を示さなかった。未分化Ｓｕｒｖ．ＶＨクローンのうち、ＫｈＥＳ１由来クローンでは１μｇ／ｍｌＧＣＶ含有培地で、ＫｈＥＳ３由来クローンでは１０μｇ／ｍｌＧＣＶ含有培地で、ＨＳＶｔｋ／ＧＣＶ依存性細胞傷害性が示された。未分化Ｎａｎｏｇ．ＶＨクローンでは、ＫｈＥＳ１、ＫｈＥＳ３それぞれの由来クローンともに１０μｇ／ｍｌＧＣＶ含有培地で、ＨＳＶｔｋ／ＧＣＶ依存性細胞傷害性が示された。ＧＣＶ依存性細胞傷害性はＫｈＥＳ３よりもＫｈＥＳ１の方が高かった。＊Ｐ＜０．００５および＊＊Ｐ＜０．００１（対ＧＣＶなし）。
【図7】ＣＡ．ＶＨ、Ｓｕｒｖ．ＶＨ、Ｎａｎｏｇ．ＶＨ、及びＷＴの分化細胞に対する、ＨＳＶｔｋ／ＧＣＶ依存性細胞傷害性及び特異性を示す図である。ＨＳＶｔｋに依存しない非特異的なＧＣＶ依存性細胞傷害性は、分化した野生型ＫｈＥＳ１、ＫｈＥＳ３ともに１００μｇ／ｍｌのＧＣＶ濃度で観察された。ＨＳＶｔｋ／ＧＣＶ依存性細胞傷害性は、分化したＣＡ．ＶＨクローンにおいてより低く、１μｇ／ｍｌまでのＧＣＶ濃度で明らかな細胞傷害性はなかった。分化したＳｕｒｖ．ＶＨおよびＮａｎｏｇ．ＶＨクローンでは、ＧＣＶに依存した細胞傷害は観られず、野生型と同様に１００μｇ／ｍｌのＧＣＶ濃度での非特異的なＧＣＶ依存性細胞傷害性が観られた。＊Ｐ＜０．００５および＊＊Ｐ＜０．００１（対ＧＣＶなし）。
【図8】ＫｈＥＳ３－ＣＡ．ＶＨクローンはｉｎ ｖｉｖｏでのＧＣＶ投与後にテラトーマ形成作用を示さないことを示す図である。（ａ、ｂ）ｈＥＳＣ移植後のテラトーマのサイズを示すグラフ（ａ）及び写真（ｂ）である。５０ｍｇ／ｋｇのＧＣＶで７日間連続して１日２回腹腔内処置した動物では、ＣＡ．ＶＨ＃２クローンはテラトーマを形成しなかった。対照的に、ＷＴ ＫｈＥＳ３細胞を投与されたマウスでは、ＧＣＶ投与量にかかわらず、テラトーマ形成が観察された。＊Ｐ＜０．０５、ＣＡ．ＶＨ＃２（移植後６１日目の同じグループのＷＴとの比較［ＧＣＶまたはＰＢＳ］。（ｃ）移植後６１日のマウスから摘出したテラトーマの代表的な病理組織像である。これは、相同組換えによる遺伝子導入が分化に影響を及ぼさなかったことを示している（ＨＥ染色；スケールバー、２００μｍ）。
【発明を実施するための形態】
【0016】
本明細書において、「ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）」とは、多能性及び自己複製能を有する細胞を意味する。本明細書において，「多能性」とは，多分化能と同義であり，分化により複数の系統の細胞に分化可能な細胞の状態を意味する。本明細書における，多能性は，生体を構成する全ての種類の細胞に分化可能な状態（分化全能性（ｔｏｔｉｐｏｔｅｎｃｙ）），胚体外組織を除く全ての種類の細胞に分化可能な状態（分化万能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ）），一部の細胞系列に属する細胞に分化可能な状態（分化多能性（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｃｙ）），及び１種類の細胞に分化可能な状態（分化単能性（ｕｎｉｐｏｔｅｎｃｙ））を含む。よって，本明細書における「多能性幹細胞」は，幹細胞，胚性幹（ＥＳ）細胞，核移植により得られるクローン胚由来の胚性幹細胞（「ｎｔＥＳ細胞」），生殖幹細胞（「ＧＳ細胞」），胚性生殖細胞（「ＥＧ細胞」），および人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞，神経幹細胞，造血幹細胞，間葉系幹細胞，肝幹細胞，膵幹細胞，皮膚幹細胞，筋幹細胞，又は生殖幹細胞を含む。ある細胞が多能性幹細胞であるかどうかは，たとえば，被検細胞が体外培養系において胚様体（ｅｍｂｒｙｏｉｄ ｂｏｄｙ）を形成する場合，又は，分化誘導条件下で培養（分化誘導処理）した後に所望の細胞に分化する場合、当該細胞は多能性幹細胞であると判定することができる。
【0017】
本明細書において、「分化」とは、多能性細胞の分裂によって特定の機能的又は形態的特徴を有する娘細胞を生じる現象をいう。本明細書において「分化処理」及び「分化誘導処理」とは同義であり、幹細胞を分化細胞へと誘導させるための処理を意味する。細胞の分化は、様々な方法により誘導されることが報告されている。多能性細胞は、分化させる細胞の種類等に応じて、分化誘導物質などを利用した分化誘導処理により分化させることができる。「分化細胞」とは、分化して生じた特定の機能的又は形態的特徴を有する娘細胞を意味する。分化細胞は通常安定しており、その増殖能は低く、別のタイプの細胞に分化することは例外的にしか起こらない。
【0018】
「未分化細胞」とは、分化していない細胞を意味し、通常は幹細胞と同義であるが、本明細書における未分化細胞は必ずしも前述の幹細胞の性質を完全に有することを必要とするものではなく、分化細胞と比較して（自己）増殖能が高い（例えば、増殖速度が２倍以上、３倍以上、５倍以上、１０倍以上など）細胞を意味する。特に好ましくは、「未分化細胞」は「腫瘍化原因細胞」である。ある細胞が未分化細胞であるか否かは、例えば、ｃ－Ｍｙｃが活性化している細胞、あるいは、テロメラーゼ逆転写酵素、及び／又はサバイビンの発現レベルが高い細胞を未分化細胞として判定することができる。
【0019】
本明細書において、「腫瘍化原因細胞」とは、幹細胞に対して分化を誘導するために分化処理をしたにもかかわらず分化しなかった未分化細胞であって、腫瘍細胞を生成し得る細胞を意味する。腫瘍化原因細胞は、分化する前の幹細胞（多能性幹細胞）と同等の性質を維持する細胞のみならず、分化する前の未分化細胞とは異なる性質を有しているが分化細胞とはならなかった細胞、例えば、少能性細胞（数種類の細胞にのみ分化できる細胞）、及び腫瘍形成能を有する細胞（例えば、がん幹細胞等）等をも包含する。ここで、「腫瘍細胞を生成し得る」とは、必ずしも１００％腫瘍細胞を生成することを意味するものではなく、分化細胞と比較して腫瘍細胞を生成する能力が高いことを意味する。ある細胞が腫瘍形成能を有するか否かは、例えば、ｃ－Ｍｙｃが活性化している細胞、あるいは、テロメラーゼ逆転写酵素、及び／又はサバイビンの発現レベルが高い細胞を腫瘍形成能を有する細胞として判定することができる。
【0020】
本明細書において、「分化処理後に残存する未分化細胞」、「残存未分化細胞」、「分化処理後の細胞における未分化細胞」等により表現される未分化細胞、特には幹細胞に対して分化誘導処理を行った後に残存する未分化細胞は「腫瘍化原因細胞」となり得る。
【0021】
「ヒト細胞内において強い活性を有するプロモーター」とは、一般にヒトの細胞において強い活性を発揮するプロモーターであれば特に制限されるものではなく、ヒト細胞由来であっても、ヒト以外の細胞やウイルス由来であってもよい。このようなプロモーターとしては、ＣＡプロモーター（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ ｅｎｈａｎｃｅｒ／ｂ－ａｃｔｉｎ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｗｉｔｈ ｂ－ａｃｔｉｎ ｉｎｔｒｏｎ）、ｓｕｒｖｉｖｉｎプロモーター、ＣＭＶ（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）プロモーター、ＣＢＡ（ｃｈｉｃｋｅｎ ｂｅｔａ ａｃｔｉｎ）プロモーター、ＰＧＫ（ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒａｔｅ ｋｉｎａｓｅ １）プロモーター、ＭＭＬＶ ＬＴＲプロモーター、ＲＳＶ（ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ）プロモーター、ＥＦ１αプロモーター、ＴＥＲＴプロモーター、Ｅ３プロモーター、ＨＳＶ（ｈｅｒｐｅｓ
ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ）プロモーター、Ｎａｎｏｇプロモーター、及びＲｅｘ１プロモーターを挙げることができる。また、プロモーターとしての活性を発揮できる限り、本願におけるプロモーターは、これらのプロモーター配列の一部の配列からなってもよい。
ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ）プロモーター、Ｎａｎｏｇプロモーター、及びＲｅｘ１プロモーターを挙げることができる。また、プロモーターとしての活性を発揮できる限り、本願におけるプロモーターは、これらのプロモーター配列の一部の配列からなってもよい。
【0022】
本明細書において、ある遺伝子がプロモーターに「機能的に連結した」とは、「発現可能となるように連結した」と同義であり、プロモーターの下流に当該遺伝子が位置し、プロモーターがその活性を発揮することにより下流の遺伝子の発現が可能となるようにプロモーターと遺伝子が結合されていることを意味する。
【0023】
「外来遺伝子」とは、ｈＰＳＣに人工的に挿入される遺伝子であって、所望の機能を奏する遺伝子を意味し、例えば、自殺遺伝子、毒性遺伝子、標識遺伝子を含む。
【0024】
「自殺遺伝子」とは、活性化プロセスを経ることにより当該遺伝子を有する細胞に毒性を与える遺伝子を意味する。典型的には、自殺遺伝子は、不活性な薬剤を毒性物質に変換する酵素をコードしている。また、自殺遺伝子は、その遺伝子産物により細胞毒性を発揮する化合物に変換される薬剤（以下、本明細書において「自殺遺伝子に対応する薬剤」又は「プロドラッグ」ということがある）と共に使用される。各自殺遺伝子に対応するプロドラッグが既によく知られている。特に、好ましくは、自殺遺伝子は、プロドラッグを核酸の合成阻害剤などの細胞増殖阻害剤や代謝拮抗剤に変換する。本明細書において、プロドラッグの用語は、特にそのように解することが不要である場合を除き、共に用いられる自殺遺伝子に対応するプロドラッグを意味するものである。
【0025】
薬剤依存性自殺遺伝子とプロドラッグ（薬剤）の組み合わせしては、例えば、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼと、ガンシクロビルまたはアシクロビル、ＶａｒｉｃｅｌｌａＺｏｓｔｅｒウイルスチミジンキナーゼと、６メトキシプリンアラビノヌクレオシド（Ｈｕｂｅｒら、１９９１， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８８：８０３９）、Ｅ．ｃｏｌｉシトシンデアミナーゼと、フルオロウラシル（Ｍｕｌｌｅｎら、１９９２，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ． ８９：３３）、Ｅ．ｃｏｌｉキサンチン－グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼと、チオキサンチン（Ｂｅｓｈａｒｄら、１９８７， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．７：４１３９）、Ｅ． ｃｏｌｉまたはＬｅｉｓｈｍａｎｉａプリンヌクレオチドホスホリラーゼと、非毒性プリンデオキシアデノシン、アデノシン、デオキシグアノシン、またはグアノシン誘導体（ＫｏｓｚａｌｋａおよびＫｒｅｎｉｔｓｋｙ，１９７９，Ｊ． Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２５４：８１８５， １９７９；Ｓｏｒｓｃｈｅｒら、１９９４， ＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ １：２３３）、シトクロムｐｌａ５０ ２Ｂ１またはシトクロムｐ４５０レダクターゼと、３－アミノ－１，２，４ベンゾトリアジン１，４－ジオキシド（Ｗａｌｔｏｎら、１９９２，Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ４４：２５１））、細胞表面アルカリホスファターゼと、エトポシド１リン酸（Ｓｅｎｔｅｒら、１９８８，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５：４８４２，１９８８）、ニトロレダクターゼと、メトロニダゾールまたはニトロフラントイン（Ｈｏｆら、１９８８， Ｉｍｍｕｎｉｔａｔ ｕｎｄＩｎｆｅｋｔｉｏｎ １６：２２０）、Ｎ－デオキシリボシル（ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｓｙ）トランスフェラーゼと、１－デアザプリン（Ｂｅｔｂｅｄｅｒら、１９８９、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ Ｒｅｓ １７：４２１７）、ピルビン酸フェロドキシンオキシドレダクターゼと、メトロニダゾール（Ｕｐｃｒｏｆｔら、１９９０，Ｉｎｔ． Ｊ． Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇ， ２０：４８９）、カルボキシペピダーゼＧ２と、アミノアシル酸ナイトロジェンマスタード（Ａｎｔｏｎｉｗら、１９９０，Ｂｒｉｔ Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ６２：９０９）、カルボキシペプチダーゼＡと、メトトレキセートαアラニン（Ｈａｅｎｓｅｌｅｒら、１９９２，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３１：８９１）、ラクタマーゼと、セファロスポリン誘導体（Ｍｅｙｅｒら、１９９３， ＣａｎｃｅｒＲｅｓ． ５３：３９５６；およびＶｒａｄｈｕｌａら、１９９３，
Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ４：３３４）、アクチノマイシンＤシンセターゼ複合体と、合成ペンタペプチドラクトン前駆体（Ｋａｔｚら、１９９０，Ｊ．
Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ４３：２３１）、およびグルクロニダーゼと、デオキソルビシンのような毒性物質のグルクロニド誘導体（Ｂｏｓｓｌｅｔら、１９９４，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ． ５４：２１５１；Ｈａｅｂｅｒｌｉｎら、１９９３，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓ． １０：１５５３）を挙げることができる。好ましくは、自殺遺伝子と薬剤との組み合わせとしては、ヘルペスウイルス由来チミジンキナーゼ遺伝子とガンシクロビルの組み合わせ、及び、シトシンデアミナーゼ遺伝子と５－フルオロウラシルの組み合わせが挙げられる。
Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ４：３３４）、アクチノマイシンＤシンセターゼ複合体と、合成ペンタペプチドラクトン前駆体（Ｋａｔｚら、１９９０，Ｊ．
Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ４３：２３１）、およびグルクロニダーゼと、デオキソルビシンのような毒性物質のグルクロニド誘導体（Ｂｏｓｓｌｅｔら、１９９４，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ． ５４：２１５１；Ｈａｅｂｅｒｌｉｎら、１９９３，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓ． １０：１５５３）を挙げることができる。好ましくは、自殺遺伝子と薬剤との組み合わせとしては、ヘルペスウイルス由来チミジンキナーゼ遺伝子とガンシクロビルの組み合わせ、及び、シトシンデアミナーゼ遺伝子と５－フルオロウラシルの組み合わせが挙げられる。
【0026】
例えば、薬剤依存性自殺遺伝子としてＨＳＶ－ｔｋ等のチミジンキナーゼを用い、薬剤としてガンシクロビル（ＧＣＶ）を用いる場合、ＧＣＶがＨＳＶ－ｔｋにより代謝されて毒性物質であるガンシクロビル三リン酸を生じさせることができる。また、例えば、薬剤依存性自殺遺伝子としてヒト由来チミジンキナーゼ（ｈｕｍａｎ－ｔｍｐｋ）を用い、非毒性のプロドラッグとしてアジドチミジン（ＡＺＴ）を用いる場合、ＡＺＴがｈｕｍａｎ－ｔｍｐｋにより代謝された毒性物質であるＡＺＴ三リン酸を生じさせることができる。また、薬剤依存性自殺遺伝子として大腸菌等の細菌由来のシトシンデアミナーゼ（ＣＤ）を用い、非毒性のプロドラッグとして５－フルオロトキシン（５－ＦＣ）を用いる場合、５－ＦＣがＣＤにより代謝されて毒性物質である５－フルオウリシル（５－ＦＵ）を生じさせることができる。薬剤依存性自殺遺伝子として水痘ウイルスチミジンキナーゼを用い、非毒性のプロドラッグとして６－メトキシプリンアラビノヌクレオシド（Ａｒａ－Ｍ）を用いる場合、Ａｒａ－Ｍが水痘ウイルスチミジンキナーゼにより代謝されて毒性物質である６－メトキシプリンアラビノヌクレオシド（Ａｒａ－ＭＭＰ）を生じさせることができる。
【0027】
あるいは、本発明の薬剤依存性自殺遺伝子は、非毒性のタンパク質を薬剤の添加により毒性物質に変換されるタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。例えば、本発明の薬剤依存性自殺遺伝子は、単量体では毒性を発揮しないが多量体（例えば、二量体）となることにより毒性を発揮するタンパク質をコードしていてもよい。この場合、「薬剤依存性自殺遺伝子が毒性を発揮可能な薬剤」は、薬剤依存性自殺遺伝子を毒性物質に変換させる物質を意味する。例えば、薬剤依存性自殺遺伝子としてはＣａｓｐａｓｅ９、及びＣａｓｐａｓｅ３等のカスパーゼを用い、薬剤としてＤｉｍｅｒｉｚｅｒを用いる場合、Ｄｉｍｅｒｉｚｅｒによってカスパーゼが二量体化することで毒性物質である活性のあるＣａｓｐａｓｅ－９二量体を形成させ、アポトーシスを誘導することができる。このような多量体（例えば、二量体）となることにより毒性を発揮する薬剤依存性自殺遺伝子としては、例えば、Ｆａｓ受容体、及びＦＡＤＤを挙げることができる。
【0028】
本明細書において、「標識遺伝子」とは、当該遺伝子が導入された細胞を検出又は測定可能な標識物質をコードする遺伝子を意味する。標識遺伝子としては、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、あるいはＧＦＰのアミノ酸配列を変える事で標識能がより向上したＥＧＦＰ（ｅｎｈａｎｃｅｄ ＧＦＰ）やＶｅｎｕｓ、あるいは他の蛍光波長を呈する赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、ｍＫａｔｅ２等の赤色、緑色、青色、又は、黄色等の蛍光タンパク質；Β－グルクロニダーゼ、Β－ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、ジヒドロ葉酸還元酵素をコードする遺伝子を挙げることができ、好ましくは、ｍＫａｔｅ２又はＶｅｎｕｓである。また、例えば、フェチリン遺伝子など、画像診断を可能とする標識遺伝子であってもよい。本明細書において、「標識」するとは、その利用目的に応じて一時的に又は長期間、目的の細胞の存在又はその位置を同定し、目的の細胞数（量や割合でも良い）を測定し、あるいは目的の細胞を他の細胞から識別することを可能とすることを意味する。また、本明細書において「同定する」とは、一時的又は長期的に目的の細胞の存在又はその位置を特定することを意味し、「識別する」とは、一時的又は長期的に目的の細胞を他の細胞や組織から区別することを意味する。よって、本明細書における標識は、目的の細胞の存在又はその位置を特定し、あるいは、目的の細胞を他の細胞から区別することができれば特に制限されず、目的の細胞以外の細胞が全く染色等されないことを要するものではない。例えば、分化処理後の細胞中における未分化細胞の存在を、本発明のベクターが有する標識遺伝子の発現により識別する場合、該細胞中の分化細胞と比較して未分化細胞が区別可能な程度に染色されていればよく、分化細胞が（弱く）染色されることを妨げるものではない。
【0029】
「毒性遺伝子」とは、導入された細胞に毒性を与える能力を有する遺伝子を意味し、例えば、いかなるアポトーシス誘導遺伝子（Ｂａｘ，ｐ５３，ＤＰ５，ＰＬ－３，ｒｅａｐｅｒ，ｈｉｄ）、細胞死を誘導する遺伝子、腫瘍細胞を抑制する遺伝子であってもよい。また、「毒性遺伝子」に変えて、分化誘導を促進する遺伝子を用いてもよい。
【0030】
本明細書において、「一つのプロモーターにより２つの遺伝子を同時に発現させることが可能な配列」とは、一つのプロモーターが活性化することにより２種類のタンパク質又はペプチドを翻訳させることが可能な配列を意味する。このような配列は、自己切断活性を持つ配列であって、一つのプロモーターの活性化により２つの遺伝子を共に発現させて該配列を介して結合された２つのタンパク質又はペプチドとして翻訳された後に、該配列を介して結合された当該２つのタンパク質又はペプチドが、該配列の領域で自己切断されて、結果的にセパレートされた２つのタンパク質又はペプチドが翻訳される配列であってもよい。あるいは、「一つのプロモーターにより２つの遺伝子を同時に発現させることが可能な配列」は、リボソームを引きつけてｍＲＮＡの途中から２度目の翻訳を開始させ、１つのｍＲＮＡから２つの異なる遺伝子がバイシストロニックに翻訳させる配列であってもよい。前者としては、例えば、「２Ａ配列」を挙げることができ、後者としては、例えば、「ＩＲＥＳ（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｅｎｔｒｙ ｓｉｔｅ）配列」を挙げることができる。より具体的には、２Ａ配列には、口蹄疫ウイルス由来の２Ａ配列、ｅｑｕｉｎｅ ｒｈｉｎｉｔｉｓ Ａウイルス由来の２Ａ配列が含まれる（Ｆｕｒｌｅｒ，Ｓら（２００１）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ８，８６４－７３；及びＨａｓｅｇａｗａら（２００７）Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２５，１７０７－１２参照）。
【0031】
「リコンビネーションカセット」とは、リコンビネーション（リコンビナーゼ）によって遺伝子を組み換えることできる領域を意味し、リコンビナーゼにより認識される核酸配列と、当該核酸配列に挟まれた外来遺伝子挿入部位を備える。リコンビネーションカセットとしては、例えば、ａｔｔＬ－末端ＤＮＡ断片とａｔｔＲ含有ドナーベクターとの間でリコンビネーションが起こる、ＬＲリコンビネーション（バクテリオファージΛインテグラーゼ及びエクシジョナーゼ、並びに、大腸菌インテグレーションホスト因子タンパク質）、及び、ａｔｔＢ－末端ＤＮＡ断片とａｔｔＰ含有ドナーベクターとの間でリコンビネーションが起こる、ＢＰリコンビネーション（バクテリオファージΛインテグラーゼ、及び、大腸菌インテグレーションホスト因子タンパク質）等のΛファージのリコンビネーション（Ｌａｎｄｙ，Ａ（１９８９）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５８：９１３－９４９；及びＰｔａｓｈｎｅ，Ｍ．（１９９２）Ａ Ｇｅｎｅｔｅｃｈ Ｓｗｉｔｃｈ： Ｐｈａｇｅ （Ｌａｍｂｄａ） Ａｎｄ Ｈｉｇｈｅｒ Ｏｒｇａｎｉｓｍｓ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ：Ｃｅｌｌ Ｐｒｅｓｓ）参照）（Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）；Ｃｒｅ－ｌｏｘＰリコンビネーション（Ｃｒｅ）；ＦＬＰ－ＦＲＴリコンビネーション（Ｆｌｉｐｐａｓｅ）；並びに、ＲＳリコンビネーション（Ｒ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ、ＧＩＸ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ）等が挙げられる。
【0032】
「セーフハーバー領域」とは、外来遺伝子が導入されても細胞の機能、生存、形態や性質等に影響しない領域を意味する。このような領域として、Ｒｏｓａ２６、ＡＡＶＳ１やＨ１１が知られている。セーフハーバー領域への遺伝子の導入は、相同組換え法において、これらの領域を標的としたドナーベクターを使用することにより行うことができる。
（導入遺伝子が導入された細胞）
一態様において、本発明は、ヒト細胞内において強い活性を有するプロモーター、及び前記プロモーターに機能的に連結した外来遺伝子（例えば、自殺遺伝子）をゲノム中のセーフハーバー領域に含むｈＰＳＣに関する。本明細書全体にわたって、「ヒト細胞内において強い活性を有するプロモーター、及び前記プロモーターに機能的に連結した外来遺伝子（例えば、自殺遺伝子）」（以下、「導入遺伝子」ということがある）は、標識遺伝子又は自殺遺伝子、及び、プロモーターを含む核酸（分子）であって、該標識遺伝又は該自殺遺伝子が該プロモーターと機能的に連結されている発現カセットであってもよいし、又は、一つのプロモーターにより２つの遺伝子を同時に発現させることが可能な配列を介して結合した標識遺伝子と自殺遺伝子、及び、プロモーターを含む核酸（分子）であって、該標識遺伝子及び該自殺遺伝子が該プロモーターと機能的に連結されている発現カセットであってもよい。また、当該発現カセットは、更に、プロモーター領域を内部に含むリコンビネーションカセットを有していてもよい。
（細胞への遺伝子導入）
一態様において、本発明は、ヒト細胞内において強い活性を有するプロモーター、及び前記プロモーターに機能的に連結した外来遺伝子（例えば、自殺遺伝子）をゲノム中のセーフハーバー領域に含むｈＰＳＣ（以下、「本ｈＰＳＣ」という）を製造する方法であって、相同組換え法により、ｈＰＳＣのゲノム中のセーフハーバー領域に、ヒト細胞内において強い活性を有するプロモーター、及び前記プロモーターに機能的に連結した外来遺伝子（例えば、自殺遺伝子）を導入することを含む方法に関する。
（導入遺伝子が導入された細胞）
一態様において、本発明は、ヒト細胞内において強い活性を有するプロモーター、及び前記プロモーターに機能的に連結した外来遺伝子（例えば、自殺遺伝子）をゲノム中のセーフハーバー領域に含むｈＰＳＣに関する。本明細書全体にわたって、「ヒト細胞内において強い活性を有するプロモーター、及び前記プロモーターに機能的に連結した外来遺伝子（例えば、自殺遺伝子）」（以下、「導入遺伝子」ということがある）は、標識遺伝子又は自殺遺伝子、及び、プロモーターを含む核酸（分子）であって、該標識遺伝又は該自殺遺伝子が該プロモーターと機能的に連結されている発現カセットであってもよいし、又は、一つのプロモーターにより２つの遺伝子を同時に発現させることが可能な配列を介して結合した標識遺伝子と自殺遺伝子、及び、プロモーターを含む核酸（分子）であって、該標識遺伝子及び該自殺遺伝子が該プロモーターと機能的に連結されている発現カセットであってもよい。また、当該発現カセットは、更に、プロモーター領域を内部に含むリコンビネーションカセットを有していてもよい。
（細胞への遺伝子導入）
一態様において、本発明は、ヒト細胞内において強い活性を有するプロモーター、及び前記プロモーターに機能的に連結した外来遺伝子（例えば、自殺遺伝子）をゲノム中のセーフハーバー領域に含むｈＰＳＣ（以下、「本ｈＰＳＣ」という）を製造する方法であって、相同組換え法により、ｈＰＳＣのゲノム中のセーフハーバー領域に、ヒト細胞内において強い活性を有するプロモーター、及び前記プロモーターに機能的に連結した外来遺伝子（例えば、自殺遺伝子）を導入することを含む方法に関する。
【0033】
本明細書において、相同組換え法とは、ゲノム編集技術を利用した相同組換えを意味し、部位特異的なヌクレアーゼ、あるいはガイドＲＮＡとヌクレアーゼを組み合わせて、ゲノムＤＮＡの標的とする部位に二本鎖切断を導入し、細胞の修復機構である相同組換えを介してドナーベクターを目的部位に挿入する方法である。部位特異的なヌクレアーゼは、ＺＦＮ（Ｚｉｎｃ－Ｆｉｎｇｅｒ Ｎｕｃｌｅａｓｅ）とＴＡＬＥＮ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ａｃｔｉｃａｔｏｒ－Ｌｉｋｅ Ｅｆｆｅｃｔｏｒ Ｎｕｃｌｅａｓｅ）とがある。ＺＦＮおよびＴＡＬＥＮはＤＮＡ結合ドメインとＤＮＡ切断ドメインから成る人工制限酵素であり、二量体でＤＮＡ切断を行う。ＺＦＮでは、ＤＮＡ結合ドメインは、任意の３塩基対のＤＮＡ配列を認識するように改変したジンクフィンガーを通常３から６個含み、９から１８塩基対の認識を可能とする。ＴＡＬＥＮでは、キサントモナス属に属する植物病原細菌により分泌されるＴＡＬエフェクター（ＴＡＬＥ）を改変した１５から２０塩基を認識するＤＮＡ結合ドメインを利用する。標的ごとに設計したＺＦＮあるいはＴＡＬＥＮとドナーベクターを細胞へ導入することにより、ゲノムの標的部位に遺伝子を導入できる。ガイドＲＮＡとヌクレアーゼを組み合わせて行う手法がＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９である。ＤＮＡ二本鎖切断を担うＣａｓ９ヌクレアーゼ（Ｃａｓ９）、Ｃａｓ９を染色体上の２０塩基の標的部位に配向させるガイドＲＮＡとドナーベクターを細胞へ導入することにより、ゲノムの標的部位に遺伝子を導入できる。
【0034】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を介した相同組換え法による遺伝子の導入は、Ｃａｓ９を含むプラスミド、ガイドＲＮＡをコードしたプラスミド、および導入遺伝子を含むプラスミドを目的の細胞にコトランスフェクションすることにより行うことができる。ガイドＲＮＡは、セーフハーバー領域又はその近傍の塩基配列を認識するように設計される。トランスフェクション方法は、ｈＰＳＣに適用可能な方法から適宜選択することができ、例えば、ＦｕＧＥＮＥ ＨＤトランスフェクション試薬を用いて行うことができる。また、トランスフェクション時の各プラスミドの構成比は、モル比で等分（１：１：１）となるように行うことが好ましい。
（分化誘導細胞）
別の態様において、本発明は、分化誘導処理後の本ｈＰＳＣ、及び本ｈＰＳＣを分化誘導処理することにより得られた細胞（以下、「分化誘導細胞」という）に関する。多能性細胞は，分化させる目的の細胞の種類等に応じて，分化誘導物質などを利用した分化誘導処理により分化させることができる。既に多くの分化誘導方法が当業者に知られているが，例えば，神経幹細胞（例えば、特開２００２－２９１４６９），膵幹様細胞（例えば、特開２００４－１２１１６５），造血細胞（例えば、特表２００３－５０５００６）、活性ニューロン（例えば、ＳＴＥＭ ＣＥＬＬＳ．（２００９）；２７（４）：８０６－８１１）、及び心筋細胞（例えば、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．（２０１２）；１１１：３４４－３５８）への分化誘導法が知られている。分化誘導後のｈＰＳＣは、理想的には１００％の確率で目的の分化細胞となることが望ましいが、実際には分化しないで未分化細胞として残存する細胞、又は目的の分化細胞以外の細胞、例えば、腫瘍化原因細胞へと変化する細胞を含みうる。よって、本明細書において、「分化誘導細胞」とは、必ずしも分化細胞を意味するものではなく、分化誘導処理された結果として得られた細胞であれば、分化細胞以外の細胞をも含み得る。
（分化誘導細胞）
別の態様において、本発明は、分化誘導処理後の本ｈＰＳＣ、及び本ｈＰＳＣを分化誘導処理することにより得られた細胞（以下、「分化誘導細胞」という）に関する。多能性細胞は，分化させる目的の細胞の種類等に応じて，分化誘導物質などを利用した分化誘導処理により分化させることができる。既に多くの分化誘導方法が当業者に知られているが，例えば，神経幹細胞（例えば、特開２００２－２９１４６９），膵幹様細胞（例えば、特開２００４－１２１１６５），造血細胞（例えば、特表２００３－５０５００６）、活性ニューロン（例えば、ＳＴＥＭ ＣＥＬＬＳ．（２００９）；２７（４）：８０６－８１１）、及び心筋細胞（例えば、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．（２０１２）；１１１：３４４－３５８）への分化誘導法が知られている。分化誘導後のｈＰＳＣは、理想的には１００％の確率で目的の分化細胞となることが望ましいが、実際には分化しないで未分化細胞として残存する細胞、又は目的の分化細胞以外の細胞、例えば、腫瘍化原因細胞へと変化する細胞を含みうる。よって、本明細書において、「分化誘導細胞」とは、必ずしも分化細胞を意味するものではなく、分化誘導処理された結果として得られた細胞であれば、分化細胞以外の細胞をも含み得る。
【0035】
別の態様において、本発明は、分化誘導細胞に含まれる、未分化細胞及び腫瘍化原因細胞に選択的に外来遺伝子を発現させる方法であって、当該細胞を培養することを含む方法に関する。また、別の態様において、本発明は、分化誘導細胞に含まれる、未分化細胞及び腫瘍化原因細胞に選択的に傷害を与える方法であって、分化誘導細胞又は分化誘導細胞からなる細胞群（以下、総称して「分化誘導細胞群」という）を、プロドラッグと接触させることにより、前記細胞群に含まれる未分化細胞及び／又は腫瘍化原因細胞に選択的に傷害を与えることを含む方法に関する。
【0036】
前記方法は、傷害を与えるステップの前に、本ｈＰＳＣを分化誘導処理することにより、前記分化誘導細胞を得る工程を含んでいてもよい。また、前記方法は（更にその前段階として）、相同組換え法により、ｈＰＳＣのゲノム中のセーフハーバー領域に、前記ヒト細胞内において強い活性を有するプロモーター、及び前記プロモーターに機能的に連結した外来遺伝子（例えば、自殺遺伝子）を導入して、本発明のｈＰＳＣを得る工程を含んでいてもよい。
【0037】
分化誘導細胞群へのプロドラッグの接触は、分化誘導細胞群の培養物にプロドラッグの適量を添加することにより実施することができる。本発明では活性の強いプロモーターを採用することから、未分化細胞及び／又は腫瘍化原因細胞への毒性と分化細胞への非毒性が両立されるようにプロドラッグの量を適切にコントロールすることが非常に重要である。ここで、適量とは、細胞培養物への添加後の最終的なプロドラッグのレベルが、未分化細胞及び／又は腫瘍化原因細胞への毒性が分化細胞への毒性よりも強いレベルとなる量を意味する。本明細書において、レベルとは、存在量を数値で表す単位を意味し、典型的には濃度を表すが、シャーレやウェル１つあたりの絶対量などのその他の単位であってもよいし、存在量を測定した際の測定値そのものや、当該測定値から別の数値に換算された値であってもよい。好ましくは、プロドラッグのレベルは、未分化細胞及び／又は腫瘍化原因細胞の大部分、例えば、半分以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、又は９５％以上に傷害を与えることができ、かつ、分化細胞の少数、例えば、３０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、又は１％以下にしか傷害を与えないレベルである。あるいは、プロドラッグのレベルは、未分化細胞及び／又は腫瘍化原因細胞の生存率が分化細胞の生存率よりも３倍以上、４倍以上、５倍以上、６倍以上、７倍以上、８倍以上、９倍以上、又は１０倍以上高いレベルであってもよい。このようなプロドラッグの適量は、以下に記載する薬剤のレベルを決定する方法により決定することができる。また、プロドラッグの適量は、以下に記載する薬剤のレベルを決定する方法により決定レベルであってもよい。例えば、自殺遺伝子がヘルペスウイルス由来チミジンキナーゼ遺伝子である場合、対応するプロドラッグであるガンシクロビルの適量は、０．０１～１μｇ／ｍＬであってもよい。
【0038】
別の態様において、本発明は、分化誘導細胞のうち、未分化細胞及び／又は腫瘍化原因細胞に傷害を与える可能性が高く、かつ、分化細胞には障害を与えない可能性が高い、プロドラッグのレベルを決定する方法であって、分化誘導細胞と、分化誘導処理されていない本ｈＰＳＣを、複数のレベルの前記プロドラッグと接触させること、及び、前記分化誘導細胞と比較して、前記分化誘導処理されていない細胞において細胞傷害効果が高い前記薬剤のレベルを、「未分化細胞及び／又は腫瘍化原因細胞に傷害を与える可能性が高く、かつ、分化細胞には障害を与えない可能性が高いレベル」として決定することを含む方法に関する。
【0039】
前記方法は、プロドラッグと細胞との接触前に、本ｈＰＳＣを分化誘導処理することを含んでいてもよい。更に、その前段階として、相同組換え法により、ｈＰＳＣのゲノム中のセーフハーバー領域に、前記強い発現をもたらすプロモーターと機能的に連結した自殺遺伝子を導入して本発明のｈＰＳＣを得ることを含んでいてもよい。
【0040】
前記分化誘導細胞と比較して、前記分化誘導処理されていない細胞において細胞傷害効果が高いとは、好ましくは、未分化細胞及び／又は腫瘍化原因細胞の生存率が分化細胞の生存率よりも３倍以上、４倍以上、５倍以上、６倍以上、７倍以上、８倍以上、９倍以上、又は１０倍以上高いことを意味していてもよい。
【0041】
また、本願の方法は、プロドラッグの適量の決定から未分化細胞及び／又は腫瘍化原因細胞に選択的に傷害を与えることまでの全てのステップを含んでいてもよい。すなわち、本発明は、分化誘導処理後のｈＰＳＣに含まれる、未分化細胞及び／又は腫瘍化原因細胞に選択的に傷害を与える方法であって、上記の方法により、分化誘導処理後の本ｈＰＳＣのうち、未分化細胞及び／又は腫瘍化原因細胞に傷害を与える可能性が高く、かつ、分化細胞には障害を与えない可能性が高い、前記薬剤のレベルを決定すること、必要に応じて、本ｈＰＳＣを分化誘導処理すること、及び、分化誘導細胞を、決定されたレベルのプロドラッグと接触させることにより、未分化細胞及び／又は腫瘍化原因細胞に選択的に傷害を与えることを含む方法を含む。
【0042】
これらの方法は、通常ｉｎ ｖｉｔｒｏで行うことが想定されているが、必要に応じてｉｎ ｖｉｖｏで行ってもよい。すなわち、分化誘導細胞をヒトに移植した後、当該分化誘導細胞に由来する未分化細胞及び／又は腫瘍化原因細胞が存在しているか又はその恐れがある場合には、必要に応じて当該ヒトにプロドラッグを投与することにより、当該未分化細胞及び／又は腫瘍化原因細胞を選択的に殺傷することができる。よって、本発明は、患者の体内に移植した前記分化誘導細胞に由来する未分化細胞及び／又は腫瘍化原因細胞を除去する方法であっても良い。より具体的には、当該方法は、分化誘導細胞を移植された患者に、前記自殺遺伝子が毒性を発揮可能なプロドラッグを投与するステップを備える、患者に移植された分化誘導細胞に由来する未分化細胞及び／又は腫瘍化原因細胞を殺傷又は除去する方法であってもよい。又は、本方法は、患者に分化誘導細胞を移植するステップ、及び、前記患者に前記自殺遺伝子が毒性を発揮可能なプロドラッグを投与するステップを備える、患者に移植された分化誘導細胞に由来する未分化細胞及び／又は腫瘍化原因細胞を殺傷又は除去する方法であってもよい。
【0043】
自殺遺伝子が毒性を発揮可能な薬剤の投与量は、各自殺遺伝子の種類に応じて適宜選択することができるが、好ましくは、未分化細胞及び／又は腫瘍化原因細胞における最終的なプロドラッグのレベルが、未分化細胞及び／又は腫瘍化原因細胞への毒性が分化細胞への毒性よりも強いレベルとなる量である。また、投与は全身投与も可能であるが、好ましくは局所投与である。
【0044】
以下、本発明をより詳細に説明するため実施例を示すが、本発明はこれに限定されるものではない。なお、本願全体を通して引用される全文献は参照によりそのまま本願に組み込まれる。また、本願は２０１９年２月２２日付にて出願された日本国特許出願第２０１９－０３０６９９号の優先権を主張する。本願が優先権を主張する日本国特許出願第２０１９－０３０６９９号記載の内容は全て参照によりそのまま本願に組み込まれる。
【実施例】
【0045】
（統計解析）
データは平均±標準誤差（ｓ．ｅ．）として表した。スチューデントｔ検定を用いて統計的有意性を決定した。Ｐ＜０．０５を統計的に有意であると定義した。
（細胞培養）
ＫｈＥＳ－１及びＫｈＥＳ－３ ｈＥＳＣ（Ｓｕｅｍｏｒｉ，Ｈら，（２００６）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ３４５：９２６－９３２．）は京都大学より提供された。ｈＥＳＣを、Ｍａｔｒｉｇｅｌまたはヒト組換えＬａｍｉｎｉｎ５２１でコートした６０ｍｍディッシュ（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｊａｐａｎ）上に播種し、ｍＴｅＳＲ１培地（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、Ｃａｎａｄａ）中で培養した。継代時には、Ａｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を用いてｈＥＳＣを単一細胞に分散させた後、必要量のｈＥＳＣを新しいＲｈｏ関連キナーゼ阻害剤Ｙ－２７６３２（１０μＭ；Ｗａｋｏ、Ｊａｐａｎ）を含むｍＴｅＳＲ１中懸濁し、Ｍａｔｒｉｇｅｌまたはヒト組換えＬａｍｉｎｉｎ５２１でコートした６０ｍｍディッシュに播種した。翌日から毎日培地交換を行い、４日ごとに継代を行った。
（ＡＡＶＳ１領域へ相同組換えのためのプラスミド構築）
この系の実現可能性を試験するために、ｐＰＳ（Ｉｄｅ，Ｋら（２０１７）Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｄｏｉ：１０．１００２／ｓｔｅｍ．２７２５．）、およびｐＳＡ－２Ａ－ｐｕｒｏ－ｐＡ－ＲＣ－Ｖｅｎｕｓ－２Ａ－ＨＳＶｔｋ－ｐＡを用いて、Ｖｅｎｕｓ－２Ａ－ＨＳＶｔｋの上流にＣＡプロモーター、Ｓｕｒｖｉｖｉｎプロモーター、又はＮａｎｏｇプロモーターを有するドナープラスミドを作製した（図１）。
データは平均±標準誤差（ｓ．ｅ．）として表した。スチューデントｔ検定を用いて統計的有意性を決定した。Ｐ＜０．０５を統計的に有意であると定義した。
（細胞培養）
ＫｈＥＳ－１及びＫｈＥＳ－３ ｈＥＳＣ（Ｓｕｅｍｏｒｉ，Ｈら，（２００６）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ３４５：９２６－９３２．）は京都大学より提供された。ｈＥＳＣを、Ｍａｔｒｉｇｅｌまたはヒト組換えＬａｍｉｎｉｎ５２１でコートした６０ｍｍディッシュ（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｊａｐａｎ）上に播種し、ｍＴｅＳＲ１培地（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、Ｃａｎａｄａ）中で培養した。継代時には、Ａｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を用いてｈＥＳＣを単一細胞に分散させた後、必要量のｈＥＳＣを新しいＲｈｏ関連キナーゼ阻害剤Ｙ－２７６３２（１０μＭ；Ｗａｋｏ、Ｊａｐａｎ）を含むｍＴｅＳＲ１中懸濁し、Ｍａｔｒｉｇｅｌまたはヒト組換えＬａｍｉｎｉｎ５２１でコートした６０ｍｍディッシュに播種した。翌日から毎日培地交換を行い、４日ごとに継代を行った。
（ＡＡＶＳ１領域へ相同組換えのためのプラスミド構築）
この系の実現可能性を試験するために、ｐＰＳ（Ｉｄｅ，Ｋら（２０１７）Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｄｏｉ：１０．１００２／ｓｔｅｍ．２７２５．）、およびｐＳＡ－２Ａ－ｐｕｒｏ－ｐＡ－ＲＣ－Ｖｅｎｕｓ－２Ａ－ＨＳＶｔｋ－ｐＡを用いて、Ｖｅｎｕｓ－２Ａ－ＨＳＶｔｋの上流にＣＡプロモーター、Ｓｕｒｖｉｖｉｎプロモーター、又はＮａｎｏｇプロモーターを有するドナープラスミドを作製した（図１）。
【0046】
また、ｈＰＳＣｓにおいて確実にＣａｓ９タンパク質を十分に発現させるために、ＣＡプロモーターの制御下にＣａｓ９を発現するプラスミドを作製した。
【0047】
各プラスミドを以下のように構築した。ｐＦｌａｇ－Ｖｅｎｕｓ－２ＡおよびｐＴ－ＨＳＶｔｋは、以前の実験で構築した（Ｉｄｅ，Ｋら（２０１７）上掲）。ｐＴ－ＨＳＶｔｋをＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩで切断して得たＨＳＶｔｋを、ＳｍａＩで切断したｐＦｌａｇ－Ｖｅｎｕｓ－２Ａに挿入し、ｐＦＬＡＧ－ＶＨを得た。次に、Ｖｅｎｕｓ－２ＡとＨＳＶｔｋの間にＳｗａＩ部位を挿入して他のレポーター遺伝子または自殺遺伝子と容易に置換できるようにするために、以下のプライマーを用いてＶｅｎｕｓ－２Ａ－ＨＳＶｔｋ遺伝子をＰＣＲで増幅した：
ＳｗａＩ－Ｖｅｎｕｓ－Ｆ：５’－ＡＴＴＴＡＡＡＴＧＡＴＴＡＣＣＧＧＴＣＡＣＣＡＴＧＧＴＧ－３’（配列番号１）
ＨＳＶｔｋ－ＳｗａＩ－Ｒ：５’－ＡＧＴＣＴＡＧＴＴＴＡＡＡＣＡＴＴＴＡＡＡＴＴＣＡＧＴＴＡＧＣＣＴＣＣＣＣＣＡＴＣＴＣ－３’（配列番号２）
この増幅産物をｐＧＥＭ－Ｔ Ｅａｓｙ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にクローニングし、ｐＴ－ＶＨを得た。以前の実験（Ｉｄｅ，Ｋら（２０１７）上掲）で構築したｐＦｌａｇ－ＣＭＶ－２ＡをＮｃｏＩ／ＳｍａＩで切断することによりｐＡを取り出し、ＰｍｅＩで切断したｐＴ－ＶＨに挿入してｐＴ－ＶＨ－ｐＡを得た。次に、ｐＴ－ＶＨ－ｐＡをＳｐｅＩで切断し、平滑末端化してＲＣ－Ｒ（Ｇａｔｅｗａｙ［ＧＷ］カセットＢ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の断片を導入し、ｐＴ－ＲＣ－ＶＨ－ｐＡを得た。次いで、このプラスミドからＮｄｅＩ／ＳａｃＩＩ切断によりＲＣ－Ｖｅｎｕｓ－２Ａ－ＨＳＶｔｋ－ｐＡを取り出して、ＳａｌＩで切断したＡＡＶＳ１相同領域を含むｐＳＡ－２Ａ－Ｐｕｒｏ－ｐＡドナー（Ａｄｄｇｅｎｅ ２２０７５；Ｆ， Ｂｅａｒｄ Ｃら，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２００９；２７：８５１－７）に挿入し、ｐＲＣ－ＶＨ－ドナーを得た。最終ドナープラスミドｐＣＡ－ＶＨドナー、は、ｐＰＳ（プロモーターを含む）とｐＲＣ－ＶＨドナーとの間のＬＲ－クロナーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によるリコンビネーション反応を用いて作製した。簡潔に述べると、ｐＰＳおよびｐＲＣ－ＶＨドナーをＬＲ－クロナーゼ（商標）ＩＩ酵素混合物と混合し、２５℃で１時間インキュベートし、次いでプロテイナーゼＫにより３７℃で１０分間反応させた。この混合物を用いて大腸菌を形質転換し、アンピシリンを含むＬＢプレート上で増殖させた。次の日に出現したコロニーからプラスミドＤＮＡを抽出し、正しいドナープラスミドについて調べ、増幅、精製した。ｐＳｕｒｖｉｖｉｎ－ＶＨ－ドナー、又はｐＮａｎｏｇ－ＶＨ－ドナーは、同様の方法により作製した。
ＳｗａＩ－Ｖｅｎｕｓ－Ｆ：５’－ＡＴＴＴＡＡＡＴＧＡＴＴＡＣＣＧＧＴＣＡＣＣＡＴＧＧＴＧ－３’（配列番号１）
ＨＳＶｔｋ－ＳｗａＩ－Ｒ：５’－ＡＧＴＣＴＡＧＴＴＴＡＡＡＣＡＴＴＴＡＡＡＴＴＣＡＧＴＴＡＧＣＣＴＣＣＣＣＣＡＴＣＴＣ－３’（配列番号２）
この増幅産物をｐＧＥＭ－Ｔ Ｅａｓｙ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にクローニングし、ｐＴ－ＶＨを得た。以前の実験（Ｉｄｅ，Ｋら（２０１７）上掲）で構築したｐＦｌａｇ－ＣＭＶ－２ＡをＮｃｏＩ／ＳｍａＩで切断することによりｐＡを取り出し、ＰｍｅＩで切断したｐＴ－ＶＨに挿入してｐＴ－ＶＨ－ｐＡを得た。次に、ｐＴ－ＶＨ－ｐＡをＳｐｅＩで切断し、平滑末端化してＲＣ－Ｒ（Ｇａｔｅｗａｙ［ＧＷ］カセットＢ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の断片を導入し、ｐＴ－ＲＣ－ＶＨ－ｐＡを得た。次いで、このプラスミドからＮｄｅＩ／ＳａｃＩＩ切断によりＲＣ－Ｖｅｎｕｓ－２Ａ－ＨＳＶｔｋ－ｐＡを取り出して、ＳａｌＩで切断したＡＡＶＳ１相同領域を含むｐＳＡ－２Ａ－Ｐｕｒｏ－ｐＡドナー（Ａｄｄｇｅｎｅ ２２０７５；Ｆ， Ｂｅａｒｄ Ｃら，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２００９；２７：８５１－７）に挿入し、ｐＲＣ－ＶＨ－ドナーを得た。最終ドナープラスミドｐＣＡ－ＶＨドナー、は、ｐＰＳ（プロモーターを含む）とｐＲＣ－ＶＨドナーとの間のＬＲ－クロナーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によるリコンビネーション反応を用いて作製した。簡潔に述べると、ｐＰＳおよびｐＲＣ－ＶＨドナーをＬＲ－クロナーゼ（商標）ＩＩ酵素混合物と混合し、２５℃で１時間インキュベートし、次いでプロテイナーゼＫにより３７℃で１０分間反応させた。この混合物を用いて大腸菌を形質転換し、アンピシリンを含むＬＢプレート上で増殖させた。次の日に出現したコロニーからプラスミドＤＮＡを抽出し、正しいドナープラスミドについて調べ、増幅、精製した。ｐＳｕｒｖｉｖｉｎ－ＶＨ－ドナー、又はｐＮａｎｏｇ－ＶＨ－ドナーは、同様の方法により作製した。
【0048】
ｐＣＭＶ－Ｃａｓ９（Ａｄｄｇｅｎｅ ４１８１５；Ｍａｌｉ，Ｐ，Ｙａｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０１３；３３９：８２３－８２６．）のＣＭＶを、ｐＣＡ－ＥＧＦＰ由来のＣＡを含有するＸｂａＩ／ＳｐｅＩ－およびＳａｌＩ／ＥｃｏＲＩで切断したフラグメントと置き換えることによって、ｐＣＡ－Ｃａｓ９を構築した。
（相同組換えｈＰＳＣ樹立）
トランスフェクションの４８時間前に、２．０×１０６個のｈＥＳＣを１００ｍｍディッシュに播種した。ＦｕＧＥＮＥ ＨＤトランスフェクション試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）を製造元のプロトコールに従って用いて、細胞をｐＣＡ－Ｃａｓ９、ｐｇＲＮＡ－Ｔ２（Ａｄｄｇｅｎｅ ４１８１８；Ｍａｌｉ，Ｐ，Ｙａｎｇら（２０１３）上掲）、およびｐＣＡ－ＶＨ－ドナー、ｐＳｕｒｖｉｖｉｎ－ＶＨ－ドナー、又はｐＮａｎｏｇ－ＶＨ－ドナーをトランスフェクションした。ＤＮＡ：ＦｕＧＥＮＥ
ＨＤ比は３．５：１であった（１００ｍｍディッシュあたり５７μｇＤＮＡ／１９５μＬ ＦｕＧＥＮＥ ＨＤ）。トランスフェクションの４８時間後、細胞を０．５μｇ／ｍＬピューロマイシンで７日間処理した。生存細胞はコロニーを形成し、その一部は正確に相同組換えされたと推定された。トランスフェクションの１２日後に、生存しているコロニーを４８ウェルプレートに採取した。先に報告されたように（Ｍａｌｉ，Ｐ，Ｙａｎｇら（２０１３）上掲）、ＡＡＶＳ１遺伝子座内の相同領域の外側の標的遺伝子座に位置するプライマーおよびＳＡ－２Ａ－Ｐｕｒｏカセット内に位置する別のプライマーを用いたＰＣＲにより、相同組換えについてのスクリーニングを行った。プライマー配列は以下の通りとした。
フォワード：５’－ＣＴＧＣＣＧＴＣＴＣＴＣＴＣＣＴＧＡＧＴ－３’（配列番号３）
リバース：５’－ＧＣＴＣＧＴＡＧＡＡＧＧＧＧＡＧＧＴＴＧ－３’（配列番号４）
（ｑＲＴ－ＰＣＲ分析）
全ＲＮＡをＩＳＯＧＥＮ ＩＩ（登録商標）（Ｎｉｐｐｏｎｇｅｎｅ）を用いて単離し、続いてＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＩＩファーストストランドｃＤＮＡ合成キット（登録商標）（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ）を用いて逆転写した。ＱｕａｎｔｉＦａｓｔ ＳＹＢＲ
Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｊａｐａｎ）を用いたｑＲＴ－ＰＣＲを、Ｒｏｔｏｒ－Ｇｅｎｅ ＲＧ－３０００（Ｑｉａｇｅｎ）で行った。相対的なｍＲＮＡ発現レベルは、比較Ｃｔ法によって決定し、個々の遺伝子の発現レベルを参照遺伝子、グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）のレベルに対して標準化した。以下のプライマーセットを使用して、６０℃のアニーリング温度でｑＲＴ－ＰＣＲ分析を行った。
ＧＡＰＤＨ：５’－ＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＴＴＣＣＡＧＧＡＧ－３’（配列番号５）、および、５’－ＴＧＴＣＡＴＡＣＣＡＧＧＡＡＡＴＧＡＧＣＴＴ－３’（配列番号６）
Ｖｅｎｕｓ：５’－ＧＧＧＣＡＣＡＡＧＣＴＧＧＡＧＴＡＣＡＡＣＴＡＣ－３’（配列番号７）、及び、５’－ＧＡＡＣＴＣＣＡＧＣＡＧＧＡＣＣＡＴＧＴＧＡＴ－３’（配列番号８）
ＨＳＶｔｋ：５’－ＡＧＣＡＡＧＡＡＧＣＣＡＣＧＧＡＡＧＴＣ－３’（配列番号９）、および、５’－ＧＣＡＣＣＣＧＣＣＡＧＴＡＡＧＴＣＡＴＣ－３’（配列番号１０）
（未分化細胞特異的ＧＣＶ依存性細胞殺傷効果のｉｎ ｖｉｔｒｏ解析）
分化ｈＥＳＣに対する細胞傷害性の評価のために、既に報告されているように（Ｓｕｅｍｏｒｉ， Ｈら（２００６）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ
３４５： ９２６－９３２．）、０．１ｍＭ ２－メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｊａｐａｎ、東京、日本）、ＭＥＭ 非必須アミノ酸（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｊａｐａｎ），５ｎｇ／ｍＬ組換えヒト塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ；ＲｅｐｒｏＣＥＬＬ、横浜、日本）、２０％ ＫｎｏｃｋＯｕｔ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｊａｐａｎ、東京、日本）を添加した、高グルコースダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）およびハムの栄養混合物Ｆ－１２（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｊａｐａｎ）の１：１混合物からなるＥＳ培地中のマイトマイシンＣ処理マウス胚線維芽細胞上に未分化ｈＥＳＣ（ＣＡ．ＶＨ、Ｓｕｒｖｉｖｉｎ．ＶＨ及びＮａｎｏｇ．ＶＨクローン）を播種した。コロニーが形成された後、１ｍｇ／ｍＬコラゲナーゼＩＶ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、０．２５％トリプシン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１ｍＭ ＣａＣｌ２（Ｎａｃａｌａｉ Ｔｅｓｑｕｅ）および２０％ＫｎｏｃｋＯｕｔ（商標）Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で処理して細胞を剥離させ、ｂＦＧＦを含まない１０μＭのＹ－２７６３２を添加したｈＥＳ培地に懸濁し、次いで超低結合プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ、米国）に移して胚様体（ＥＢｓ）を生成させた。懸濁液中で８日間培養した後、ＥＢをゼラチン被覆プレートに移し、さらに２０または４８日間培養した。続いて、分化した細胞を、２．０×１０４細胞／ウェルでゼラチンコートした９６穴培養プレートに播種し、０，０．０１，０．１，１，１０または１００μｇ／ｍＬのＧＣＶと共にさらに７日間培養した。細胞生存率は、Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔ Ｒｅａｇｅｎｔ ＳＦ（登録商標）（Ｎａｃａｌａｉ Ｔｅｓｑｕｅ）を用いたＷＳＴ－８アッセイによって決定した。
（相同組換えｈＰＳＣ樹立）
トランスフェクションの４８時間前に、２．０×１０６個のｈＥＳＣを１００ｍｍディッシュに播種した。ＦｕＧＥＮＥ ＨＤトランスフェクション試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）を製造元のプロトコールに従って用いて、細胞をｐＣＡ－Ｃａｓ９、ｐｇＲＮＡ－Ｔ２（Ａｄｄｇｅｎｅ ４１８１８；Ｍａｌｉ，Ｐ，Ｙａｎｇら（２０１３）上掲）、およびｐＣＡ－ＶＨ－ドナー、ｐＳｕｒｖｉｖｉｎ－ＶＨ－ドナー、又はｐＮａｎｏｇ－ＶＨ－ドナーをトランスフェクションした。ＤＮＡ：ＦｕＧＥＮＥ
ＨＤ比は３．５：１であった（１００ｍｍディッシュあたり５７μｇＤＮＡ／１９５μＬ ＦｕＧＥＮＥ ＨＤ）。トランスフェクションの４８時間後、細胞を０．５μｇ／ｍＬピューロマイシンで７日間処理した。生存細胞はコロニーを形成し、その一部は正確に相同組換えされたと推定された。トランスフェクションの１２日後に、生存しているコロニーを４８ウェルプレートに採取した。先に報告されたように（Ｍａｌｉ，Ｐ，Ｙａｎｇら（２０１３）上掲）、ＡＡＶＳ１遺伝子座内の相同領域の外側の標的遺伝子座に位置するプライマーおよびＳＡ－２Ａ－Ｐｕｒｏカセット内に位置する別のプライマーを用いたＰＣＲにより、相同組換えについてのスクリーニングを行った。プライマー配列は以下の通りとした。
フォワード：５’－ＣＴＧＣＣＧＴＣＴＣＴＣＴＣＣＴＧＡＧＴ－３’（配列番号３）
リバース：５’－ＧＣＴＣＧＴＡＧＡＡＧＧＧＧＡＧＧＴＴＧ－３’（配列番号４）
（ｑＲＴ－ＰＣＲ分析）
全ＲＮＡをＩＳＯＧＥＮ ＩＩ（登録商標）（Ｎｉｐｐｏｎｇｅｎｅ）を用いて単離し、続いてＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＩＩファーストストランドｃＤＮＡ合成キット（登録商標）（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ）を用いて逆転写した。ＱｕａｎｔｉＦａｓｔ ＳＹＢＲ
Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｊａｐａｎ）を用いたｑＲＴ－ＰＣＲを、Ｒｏｔｏｒ－Ｇｅｎｅ ＲＧ－３０００（Ｑｉａｇｅｎ）で行った。相対的なｍＲＮＡ発現レベルは、比較Ｃｔ法によって決定し、個々の遺伝子の発現レベルを参照遺伝子、グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）のレベルに対して標準化した。以下のプライマーセットを使用して、６０℃のアニーリング温度でｑＲＴ－ＰＣＲ分析を行った。
ＧＡＰＤＨ：５’－ＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＴＴＣＣＡＧＧＡＧ－３’（配列番号５）、および、５’－ＴＧＴＣＡＴＡＣＣＡＧＧＡＡＡＴＧＡＧＣＴＴ－３’（配列番号６）
Ｖｅｎｕｓ：５’－ＧＧＧＣＡＣＡＡＧＣＴＧＧＡＧＴＡＣＡＡＣＴＡＣ－３’（配列番号７）、及び、５’－ＧＡＡＣＴＣＣＡＧＣＡＧＧＡＣＣＡＴＧＴＧＡＴ－３’（配列番号８）
ＨＳＶｔｋ：５’－ＡＧＣＡＡＧＡＡＧＣＣＡＣＧＧＡＡＧＴＣ－３’（配列番号９）、および、５’－ＧＣＡＣＣＣＧＣＣＡＧＴＡＡＧＴＣＡＴＣ－３’（配列番号１０）
（未分化細胞特異的ＧＣＶ依存性細胞殺傷効果のｉｎ ｖｉｔｒｏ解析）
分化ｈＥＳＣに対する細胞傷害性の評価のために、既に報告されているように（Ｓｕｅｍｏｒｉ， Ｈら（２００６）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ
３４５： ９２６－９３２．）、０．１ｍＭ ２－メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｊａｐａｎ、東京、日本）、ＭＥＭ 非必須アミノ酸（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｊａｐａｎ），５ｎｇ／ｍＬ組換えヒト塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ；ＲｅｐｒｏＣＥＬＬ、横浜、日本）、２０％ ＫｎｏｃｋＯｕｔ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｊａｐａｎ、東京、日本）を添加した、高グルコースダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）およびハムの栄養混合物Ｆ－１２（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｊａｐａｎ）の１：１混合物からなるＥＳ培地中のマイトマイシンＣ処理マウス胚線維芽細胞上に未分化ｈＥＳＣ（ＣＡ．ＶＨ、Ｓｕｒｖｉｖｉｎ．ＶＨ及びＮａｎｏｇ．ＶＨクローン）を播種した。コロニーが形成された後、１ｍｇ／ｍＬコラゲナーゼＩＶ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、０．２５％トリプシン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１ｍＭ ＣａＣｌ２（Ｎａｃａｌａｉ Ｔｅｓｑｕｅ）および２０％ＫｎｏｃｋＯｕｔ（商標）Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で処理して細胞を剥離させ、ｂＦＧＦを含まない１０μＭのＹ－２７６３２を添加したｈＥＳ培地に懸濁し、次いで超低結合プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ、米国）に移して胚様体（ＥＢｓ）を生成させた。懸濁液中で８日間培養した後、ＥＢをゼラチン被覆プレートに移し、さらに２０または４８日間培養した。続いて、分化した細胞を、２．０×１０４細胞／ウェルでゼラチンコートした９６穴培養プレートに播種し、０，０．０１，０．１，１，１０または１００μｇ／ｍＬのＧＣＶと共にさらに７日間培養した。細胞生存率は、Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔ Ｒｅａｇｅｎｔ ＳＦ（登録商標）（Ｎａｃａｌａｉ Ｔｅｓｑｕｅ）を用いたＷＳＴ－８アッセイによって決定した。
【0049】
未分化ｈＥＳＣに対する細胞傷害性を評価するために、ＣＡ．ＶＨ、Ｓｕｒｖｉｖｉｎ．ＶＨ及びＮａｎｏｇ．ＶＨクローン、を、未分化条件下でマトリゲル被覆９６ウェル培養プレート上に１．０×１０４細胞／ウェルで播種し、続いて０，０．０１，０．１，１，１０または１００μｇ／ｍＬのＧＣＶで７日間培養した後、ＷＳＴ－８アッセイを行って細胞生存率を決定した。
（ｉｎ ｖｉｖｏにおける抗腫瘍形成効果および動物実験における病理学的検査）
ｈＥＳＣ（４．０×１０６細胞）を３０％マトリゲル含有ＰＢＳ １００μＬに懸濁し、６週齢の雌ｓｃｉｄ（重症複合免疫不全）マウス（ＣＬＥＡ Ｊａｐａｎ、東京、日本）の背面腹部に皮下注射した。注射後１日目から、マウスにＰＢＳまたはＧＣＶ（５０ｍｇ／ｋｇ）のいずれかの腹腔内注射を１日２回、７日間連続して行った。ＧＣＶ処置の開始後４週目から更に４週間、形成されたテラトーマの大きさを週に２回測定し、その後組織学的分析のためにマウスを安楽死させた。すべてのテラトーマを摘出し、１０％ホルマリンで固定し、パラフィンに包埋し、４μｍ切片に切断し、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ－Ｅ）で染色した。すべての動物実験は、国立衛生研究所のガイドラインに従って、鹿児島大学自然科学研究センター動物実験室部門の承認を得て行われた。苦しみを最小限に抑えるためにすべての合理的な努力がなされた。
（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を用いたＡＡＶＳ１領域への相同組換えｈＥＳＣ作製）
ヒトＡＡＶＳ１遺伝子座は、１９番染色体上のＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ遺伝子の最初のイントロンに位置し、外来遺伝子の組み込みが有害な影響を及ぼさない「セーフハーバー領域」としてよく知られていることからプロモーター領域を含むＶｅｎｕｓ遺伝子およびＨＳＶｔｋ遺伝子の導入部位として利用した。Ｖｅｎｕｓ遺伝子およびＨＳＶｔｋ遺伝子がＡＡＶＳ１座にノックインされたＫｈＥＳ３およびＫｈＥＳ１クローンを作製するため、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を介した相同組換えを行った。ＡＡＶＳ１相同配列を含むＡＡＶＳ１ドナープラスミド（ｐＲＣ－ＶＨ－ドナー）を構築した。プロモータートラップ選択のためのＳＡ－２Ａ－Ｐｕｒｏ－ｐＡカセット（Ｈｏｃｋｅｍｅｙｅｒ，Ｄら（２０１０）Ｎａｔｕｒｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２７：８５１－８５７．）と、腫瘍形成性ｈＰＳＣを除去するための組換えカセット－Ｒ（ＲＣ－Ｒ）－Ｖｅｎｕｓ－２Ａ－ＨＳＶ－ｔｋ－ｐＡカセット（Ｍｉｔｓｕｉ，Ｋら（２０１７）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ．Ｄｅｖ．５：５１－５８．）とを、ＡＡＶＳ１相同配列に挿入した。この実験では、このシステムの可能性を探索するためにＣＡプロモーター、Ｓｕｒｖｉｖｉｎプロモーター、又はＮａｎｏｇプロモーターを使用した。ＣＡプロモーター（ｐＣＡ．ＶＨ－ドナー）の例を図２ａに示す。ｈＥＳＣにＤＮＡ二本鎖切断を誘導するために、ＣＡプロモーターを有するＣａｓ９発現プラスミドを調製した。ガイドＲＮＡ（Ｍａｌｉ，Ｐら（２０１３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９：８２３－８２６．）を発現させるためにｇＲＮＡ－Ｔ２プラスミド（ｐｇＲＮＡ－Ｔ２）を用いた。ＥＧＦＰ発現プラスミドのトランスフェクション効率は、ＫｈＥＳ３では７６．３２％、ＫｈＥＳ１では２５．０％であった。ＡＡＶＳ１ドナーベクター、ｐＣＡ．ＶＨ－ドナーは、ピューロマイシン耐性遺伝子がベクター組み込み部位の上流に位置する活性プロモーターからのみ発現するため、ランダムな組込みに対する相同組換えの比率を増加させるはずである。合計１２８個のピューロマイシン耐性コロニーがＫｈＥＳ３から得られ、ＰＣＲ分析により、ピューロマイシン耐性コロニーの２０％が相同組換えによりＡＡＶＳ１座に挿入されていることが確認できた。ＫｈＥＳ１では、２つのコロニーのみが正確に挿入されていた（図２ｂ、表１）。正確に相同組換えされたクローンをさらなる実験のために増殖させ、得られた細胞をＣＡ．ＶＨと命名した。同様にして、ｐＳｕｒｖｉｖｉｎ－ＶＨ－ドナー及びｐＮａｎｏｇ－ＶＨ－ドナーでトランスフェクトした細胞から得られたそれぞれ４コロニー及び２コロニーをＳｕｒｖｉｖｉｎ．ＶＨ及びＮａｎｏｇ．ＶＨと命名した。
（ｉｎ ｖｉｖｏにおける抗腫瘍形成効果および動物実験における病理学的検査）
ｈＥＳＣ（４．０×１０６細胞）を３０％マトリゲル含有ＰＢＳ １００μＬに懸濁し、６週齢の雌ｓｃｉｄ（重症複合免疫不全）マウス（ＣＬＥＡ Ｊａｐａｎ、東京、日本）の背面腹部に皮下注射した。注射後１日目から、マウスにＰＢＳまたはＧＣＶ（５０ｍｇ／ｋｇ）のいずれかの腹腔内注射を１日２回、７日間連続して行った。ＧＣＶ処置の開始後４週目から更に４週間、形成されたテラトーマの大きさを週に２回測定し、その後組織学的分析のためにマウスを安楽死させた。すべてのテラトーマを摘出し、１０％ホルマリンで固定し、パラフィンに包埋し、４μｍ切片に切断し、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ－Ｅ）で染色した。すべての動物実験は、国立衛生研究所のガイドラインに従って、鹿児島大学自然科学研究センター動物実験室部門の承認を得て行われた。苦しみを最小限に抑えるためにすべての合理的な努力がなされた。
（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を用いたＡＡＶＳ１領域への相同組換えｈＥＳＣ作製）
ヒトＡＡＶＳ１遺伝子座は、１９番染色体上のＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ遺伝子の最初のイントロンに位置し、外来遺伝子の組み込みが有害な影響を及ぼさない「セーフハーバー領域」としてよく知られていることからプロモーター領域を含むＶｅｎｕｓ遺伝子およびＨＳＶｔｋ遺伝子の導入部位として利用した。Ｖｅｎｕｓ遺伝子およびＨＳＶｔｋ遺伝子がＡＡＶＳ１座にノックインされたＫｈＥＳ３およびＫｈＥＳ１クローンを作製するため、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を介した相同組換えを行った。ＡＡＶＳ１相同配列を含むＡＡＶＳ１ドナープラスミド（ｐＲＣ－ＶＨ－ドナー）を構築した。プロモータートラップ選択のためのＳＡ－２Ａ－Ｐｕｒｏ－ｐＡカセット（Ｈｏｃｋｅｍｅｙｅｒ，Ｄら（２０１０）Ｎａｔｕｒｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２７：８５１－８５７．）と、腫瘍形成性ｈＰＳＣを除去するための組換えカセット－Ｒ（ＲＣ－Ｒ）－Ｖｅｎｕｓ－２Ａ－ＨＳＶ－ｔｋ－ｐＡカセット（Ｍｉｔｓｕｉ，Ｋら（２０１７）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ．Ｄｅｖ．５：５１－５８．）とを、ＡＡＶＳ１相同配列に挿入した。この実験では、このシステムの可能性を探索するためにＣＡプロモーター、Ｓｕｒｖｉｖｉｎプロモーター、又はＮａｎｏｇプロモーターを使用した。ＣＡプロモーター（ｐＣＡ．ＶＨ－ドナー）の例を図２ａに示す。ｈＥＳＣにＤＮＡ二本鎖切断を誘導するために、ＣＡプロモーターを有するＣａｓ９発現プラスミドを調製した。ガイドＲＮＡ（Ｍａｌｉ，Ｐら（２０１３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９：８２３－８２６．）を発現させるためにｇＲＮＡ－Ｔ２プラスミド（ｐｇＲＮＡ－Ｔ２）を用いた。ＥＧＦＰ発現プラスミドのトランスフェクション効率は、ＫｈＥＳ３では７６．３２％、ＫｈＥＳ１では２５．０％であった。ＡＡＶＳ１ドナーベクター、ｐＣＡ．ＶＨ－ドナーは、ピューロマイシン耐性遺伝子がベクター組み込み部位の上流に位置する活性プロモーターからのみ発現するため、ランダムな組込みに対する相同組換えの比率を増加させるはずである。合計１２８個のピューロマイシン耐性コロニーがＫｈＥＳ３から得られ、ＰＣＲ分析により、ピューロマイシン耐性コロニーの２０％が相同組換えによりＡＡＶＳ１座に挿入されていることが確認できた。ＫｈＥＳ１では、２つのコロニーのみが正確に挿入されていた（図２ｂ、表１）。正確に相同組換えされたクローンをさらなる実験のために増殖させ、得られた細胞をＣＡ．ＶＨと命名した。同様にして、ｐＳｕｒｖｉｖｉｎ－ＶＨ－ドナー及びｐＮａｎｏｇ－ＶＨ－ドナーでトランスフェクトした細胞から得られたそれぞれ４コロニー及び２コロニーをＳｕｒｖｉｖｉｎ．ＶＨ及びＮａｎｏｇ．ＶＨと命名した。
【0050】
【表1】
ＫｈＥＳ３およびＫｈＥＳ１の両方の細胞において、Ｖｅｎｕｓは、ｐＣＡ．ＶＨ－ドナーでは強く発現し、ｐＳｕｒｖｉｖｉｎ－ＶＨ－ドナーでは弱い発現がみられ、ｐＮａｎｏｇ－ＶＨ－ドナーではほとんど発現がみられなかった（図３）。特に、ＫｈＥＳ３およびＫｈＥＳ１ ＣＡ．ＶＨクローンの両方において、未分化状態（図４ａ）のみならず分化７日目の胚様体（ＥＢ）（図４ｂ）においても確認された。ＣＡ．ＶＨクローンにおけるＶｅｎｕｓの発現は、ＥＢをゼラチンコートディッシュに移すことによってさらに分化した細胞においても観察された（分化第４２日；図４ｃ）。
（全てのクローンにおける安定したｍＲＮＡ発現のリアルタイムＰＣＲによる確認）
より詳細に細胞を分析するため、我々は未分化ＣＡ．ＶＨクローンのＨＳＶｔｋおよびＶｅｎｕｓのｍＲＮＡ発現レベルをリアルタイムＰＣＲによって測定した（図５ａ、ｂ）。全ての相同組換えクローンはＶｅｎｕｓとＨＳＶｔｋを発現していたため、クローンＫｈＥＳ３－ＣＡ．ＶＨ＃２とＫｈＥＳ１－ＣＡ．ＶＨ＃１を更に特徴解析するためのクローンとして選択した。分化細胞におけるＨＳＶｔｋおよびＶｅｎｕｓのｍＲＮＡ発現レベルを調べ、すべての分化したクローンが、未分化ＣＡ．ＶＨと同レベルの両遺伝子を発現することを見出した（図５ｃ、ｄ）。Ｓｕｒｖｉｖｉｎ．ＶＨ及びＮａｎｏｇ．ＶＨについても同様の解析を行い、ＨＳＶｔｋの発現、Ｖｅｎｕｓの発現をリアルタイムＰＣＲで確認した。
（未分化細胞に特異的なＨＳＶｔｋ特異的／ＧＣＶ依存性細胞傷害）
上述のリアルタイムＰＣＲ実験により、ＨＳＶ－ｔｋが全ての細胞で発現していることが確認された。したがって、未分化および分化のＣＡ．ＶＨ、Ｓｕｒｖｉｖｉｎ．ＶＨ及びＮａｎｏｇ．ＶＨにおけるＨＳＶｔｋ特異的／ＧＣＶ依存性細胞傷害について検証した。非特異的な（すなわち、ＨＳＶｔｋ非依存性の）ＧＣＶによる細胞傷害は、未分化のＫｈＥＳ３－ＣＡ．ＶＨでは１００μｇ／ｍＬのＧＣＶ濃度で観察され、未分化のＫｈＥＳ１－ＣＡ．ＶＨでは１０および１００μｇ／ｍＬのＧＣＶ濃度で観察された。未分化のＫｈＥＳ３－ＣＡ．ＶＨ細胞におけるＨＳＶｔｋ特異的／ＧＣＶ依存性細胞毒性は、より低いＧＣＶ濃度（０．０１，０．１，１および１０μｇ／ｍＬ）で誘導された。一方、この細胞傷害性は、１０μｇ／ｍＬ未満のＧＣＶ濃度で野生型ＫｈＥＳ３細胞においては誘導されなかった。ＨＳＶｔｋ特異的／ＧＣＶ依存性細胞傷害性は、未分化のＫｈＥＳ１－ＣＡ．ＶＨにおいて、ＫｈＥＳ３－ＣＡ．ＶＨよりも強く、０．０１μｇ／ｍＬという極めて低いＧＣＶ濃度においてもほとんどの細胞が死滅した。さらに、非特異的なＧＣＶによる細胞毒性は、野生型ＫｈＥＳ３よりも野生型ＫｈＥＳ１において強かった（図６）。
各未分化ＣＡ．ＶＨクローンは０．０１μｇ／ｍｌＧＣＶ含有培地を超える生存率を示さなかった。ＧＣＶ依存性細胞傷害性はＫｈＥＳ３よりもＫｈＥＳ１の方が高かった。
ＨＳＶｔｋ／ＧＣＶ依存性細胞傷害性は、分化したＣＡ．ＶＨクローンにおいてより低く、１μｇ／ｍｌまでのＧＣＶ濃度で明らかな細胞傷害性はなかった＊ Ｐ ＜０．００５および＊＊ Ｐ ＜０．００１（対ＧＣＶなし）。
【0051】
ＨＳＶｔｋの細胞傷害性は細胞増殖活性の低下と関連するため、分化細胞における細胞傷害性を試験した。分化後の分化クローンにおいては、非特異的なＧＣＶによる細胞毒性はいずれの濃度でも認められず、かつ、ＧＣＶ濃度０．０１，０．１，１μｇ／ｍＬではＨＳＶｔｋ特異的／ＧＣＶ依存性細胞毒性も認められなかった（図７）。したがって、ＨＳＶｔｋ特異的／ＧＣＶ依存性細胞毒性は、ＫｈＥＳ３－ＣＡ．ＶＨおよびＫｈＥＳ１－ＣＡ．ＶＨの両方で観察され、分化によりこの細胞傷害性は減少した。Ｓｕｒｖｉｖｉｎ．ＶＨ及びＮａｎｏｇ．ＶＨは、未分化状態においてもＣＡ．ＶＨと比較してＨＳＶｔｋ特異的／ＧＣＶ依存性細胞傷害性が弱かったことから、分化状態となり、さらにＨＳＶｔｋの細胞傷害性が低下した結果、ＨＳＶｔｋ特異的／ＧＣＶ依存性細胞毒性が認められなかったものと思われる。
【0052】
更に、上記で作製したものに加えて、複数の種類のプロモーター、三種類の自殺遺伝子（単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ；ＨＳＶ－ｔｋ，ヒト由来チミジンキナーゼ；ｈｕｍａｎ－ｔｍｐｋ、誘導性ヒトＣａｓｐａｓｅ－９；ｉＣａｓｐａｓｅ－９）と二種類の蛍光タンパク質（緑色蛍光タンパク質；Ｖｅｎｕｓ、赤色蛍光タンパク質；ｍＫａｔｅ２）の組み合わせのドナーベクターを用いて、ＡＡＶＳ１領域へ相同組換えしたｈＥＳＣを作製し、蛍光タンパク質の発現および自殺遺伝子の細胞障害性について評価を行った。その結果を表２に示す。以下の表２において、ベクター構築を行うことに成功した組み合わせは「Ｄ」、ベクター構築を行うことに成功し、蛍光タンパク質の発現を確認した組み合わせは「Ｃ」、それに加え未分化細胞における自殺遺伝子の細胞障害性を確認した組み合わせは「Ｂ」、Ｃの評価項目に加え、さらに分化細胞における自殺遺伝子の細胞障害性まで解析した組み合わせは「Ａ」で示す。
【0053】
【表2】
（ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＫｈＥＳ３－ＣＡ．ＶＨの抗腫瘍形成効果の検証）
ＫｈＥＳ３－ＣＡ．ＶＨ細胞が多能性であるかどうかを判定し、その抗腫瘍形成効果をｉｎ ｖｉｖｏで評価するために、未分化のＫｈＥＳ３－ＣＡ．ＶＨおよび野生型ＫｈＥＳ３を免疫不全マウス（ＮＯＤ－ｓｃｉｄマウス）に皮下移植してテラトーマ形成実験を行った２つの群に移植した。ＧＣＶの代わりにリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を投与した場合、テラトーマの顕著かつ連続的な増殖は２群間で有意な違いがみられなかった（図８ａ、ｂ）。一方、ＧＣＶを投与した場合、ＫｈＥＳ３－ＣＡ．ＶＨを移植したマウスでのテラトーマ形成は、野生型ＫｈＥＳ３を移植した対照マウスと比較してより強力に阻害された。ＧＣＶのこの用量（５０ｍｇ／ｋｇ）は、本発明者らの以前の研究で安全であることが確認されており（Ｉｄｅ，Ｋら（２０１７）Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｄｏｉ： １０．１００２／ｓｔｅｍ．２７２５．）、有害な影響は観察されなかった。細胞移植の５６日後に安楽死させたマウスより摘出したテラトーマについて組織病理学的な解析を行ったところ、テラトーマは３つの胚葉から誘導された複数の組織型からなることが明らかとなった（図８ｃ）。これらの結果から、相同組換えが多能性に影響を及ぼさないこと、および未分化ＫｈＥＳ３－ＣＡ．ＶＨに対するＨＳＶｔｋ特異的／ＧＣＶ依存性細胞傷害性がｉｎ ｖｉｖｏにおいても有効であることを確認した。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【配列表】