特許 7491591 ソリッドイマージョンメニスカスレンズのための装置、システム及び方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-05-20

(45)【発行日】2024-05-28

(54)【発明の名称】ソリッドイマージョンメニスカスレンズのための装置、システム及び方法

(51)【国際特許分類】

   G01N 21/17 20060101AFI20240521BHJP

   G01N 21/64 20060101ALI20240521BHJP

   G02B 21/00 20060101ALI20240521BHJP

   G02B 21/06 20060101ALI20240521BHJP

   G02B 21/36 20060101ALI20240521BHJP

【ＦＩ】

G01N21/17 A

G01N21/64 E

G02B21/00

G02B21/06

G02B21/36

【請求項の数】 11

(21)【出願番号】P 2021540516

(86)(22)【出願日】2020-01-14

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2022-03-04

(86)【国際出願番号】 US2020013512

(87)【国際公開番号】W WO2020150239

(87)【国際公開日】2020-07-23

【審査請求日】2023-01-13

(31)【優先権主張番号】62/792,138

(32)【優先日】2019-01-14

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】514104933

【氏名又は名称】ユニヴァーシティ オブ ワシントン

(74)【代理人】

【識別番号】100114890

【弁理士】

【氏名又は名称】アインゼル・フェリックス＝ラインハルト

(74)【代理人】

【識別番号】100098501

【弁理士】

【氏名又は名称】森田 拓

(74)【代理人】

【識別番号】100116403

【弁理士】

【氏名又は名称】前川 純一

(74)【代理人】

【識別番号】100134315

【弁理士】

【氏名又は名称】永島 秀郎

(74)【代理人】

【識別番号】100162880

【弁理士】

【氏名又は名称】上島 類

(72)【発明者】

【氏名】ジョナサン ティー．シー． リウ

(72)【発明者】

【氏名】リンジー エイ． バーナー

(72)【発明者】

【氏名】アダム ケー． グレーサー

【審査官】嶋田 行志

(56)【参考文献】

【文献】特表２０１９－５２１３８５（ＪＰ，Ａ）

【文献】米国特許出願公開第２０１８／００８８３０８（ＵＳ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１８／１１１７２２（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１８／００６８３６（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特開２０１８－１８９９４６（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２０１８－１８５４５６（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２０１８／１６７４８４（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１８／０９２１０９（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１８／０５１２８３（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１８／０４９３０６（ＷＯ，Ａ１）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｇ０１Ｎ ２１／００－Ｇ０１Ｎ ２１／８３

Ｇ０２Ｂ ２１／００－Ｇ０２Ｂ ２１／３６

Ｇ０２Ｂ ３／００－Ｇ０２Ｂ ３／１４

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＪＳＴＣｈｉｎａ（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｉｒｅｃｔ

ＡＣＳ ＰＵＢＬＩＣＡＴＩＯＮＳ

Ｎａｔｕｒｅ

ＳＣＩＥＮＣＥ

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

サンプルを支持するように構成されている第１の側面、及び、前記第１の側面の反対側の第２の側面を有するサンプルホルダと、
前記サンプルホルダの前記第２の側面に隣接する浸漬流体を保持するように構成されている浸漬チャンバと、
前記浸漬流体の外側に配置され、前記サンプル内に焦点を有するように構成されている照明用対物レンズと、
前記浸漬流体の外側に配置され、前記サンプル内に焦点を有するように構成されている収集用対物レンズと、
前記照明用対物レンズと前記浸漬流体との間に配置された第１のソリッドイマージョンメニスカスレンズ（ＳＩＭレンズ）と、
前記収集用対物レンズと前記浸漬流体との間に配置された第２のソリッドイマージョンメニスカスレンズ（ＳＩＭレンズ）と、
を備える装置であって、
前記第２のＳＩＭレンズは、前記第１のＳＩＭレンズから独立しており、各ＳＩＭレンズは、第１の表面と、前記第１の表面の反対側の第２の表面とを有しており、前記第２の表面は、前記浸漬流体に隣接しており、前記対物レンズと前記焦点との間を通過する光は、前記第１の表面と前記第２の表面とに対してほぼ垂直である、装置。

【請求項2】

前記第１のＳＩＭレンズ及び前記第２のＳＩＭレンズの前記第１の表面及び前記第２の表面は、前記ＳＩＭレンズを通過する光の波面と調和するように、それぞれ湾曲させられている、
請求項１に記載の装置。

【請求項3】

前記第１のＳＩＭレンズの前記第１の表面は、第１の曲率を有しており、前記第１のＳＩＭレンズの前記第２の表面は、第２の曲率を有しており、前記第２のＳＩＭレンズの前記第１の表面は、第３の曲率を有しており、前記第２のＳＩＭレンズの前記第２の表面は、第４の曲率を有しており、前記第１の曲率、前記第２の曲率、前記第３の曲率及び前記第４の曲率は、互いに等しくない、
請求項２に記載の装置。

【請求項4】

前記第１のＳＩＭレンズ及び前記第２のＳＩＭレンズのそれぞれの前記第１の表面は、前記第１の表面から前記焦点までの距離の曲率半径を有しており、前記第１のＳＩＭレンズ及び前記第２のＳＩＭレンズのそれぞれの前記第２の表面は、前記第２の表面から前記焦点までの距離の曲率半径を有している、
請求項１に記載の装置。

【請求項5】

前記第１のＳＩＭレンズの前記第１の表面は、第１の曲率半径を有しており、前記第１のＳＩＭレンズの前記第２の表面は、第２の曲率半径を有しており、前記第２のＳＩＭレンズの前記第１の表面は、第３の曲率半径を有しており、前記第２のＳＩＭレンズの前記第２の表面は、第４の曲率半径を有しており、前記第１の曲率半径、前記第２の曲率半径、前記第３の曲率半径及び前記第４の曲率半径は互いに等しくない、
請求項１に記載の装置。

【請求項6】

前記浸漬チャンバに対して３次元で前記サンプルホルダを動かすように構成されているアクチュエータをさらに備える、
請求項１に記載の装置。

【請求項7】

照明光を生成するように構成されている光源と、
収集された光を受け取るように構成されている検出器と、
をさらに備え、
前記第１の対物レンズは、照明ビームとして前記照明光を前記焦点に向けて配向するように構成されており、前記第２の対物レンズは、前記焦点からの光を受け取るように構成されている、
請求項１に記載の装置。

【請求項8】

前記対物レンズは、第１の光軸を有しており、前記第２の対物レンズは、第２の光軸を有しており、前記第１の光軸は、前記第２の光軸に対してほぼ直交している、
請求項１に記載の装置。

【請求項9】

前記対物レンズと少なくとも１つの追加の対物レンズとを保持するように構成されているレンズタレットであって、前記焦点を含む光路に沿って、前記対物レンズ及び前記少なくとも１つの追加の対物レンズのうちの１つを選択的に配置するように構成されているレンズタレットをさらに備える、
請求項１に記載の装置。

【請求項10】

前記照明用対物レンズは、前記浸漬流体と非接触である、
請求項１に記載の装置。

【請求項11】

前記収集用対物レンズは、前記浸漬流体と接触している浸漬対物レンズである、
請求項１に記載の装置。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年１月１４日に出願された米国仮出願シリアル番号６２／７９２，１３８の以前の出願日の米国特許法第１１９条に基づく利益を主張し、その全内容は、あらゆる目的のために、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。

【0002】

研究開発に関する声明
本発明は、アメリカ国立衛生研究所によって授与されたＫ９９ ＣＡ２４０６８１、国防総省、連邦議会管理医療プログラム（ＣＤＭＲＰ）、前立腺癌研究プログラム（ＰＣＲＰ）によって授与されたＷ８１ＸＷＨ－１８－１０３５８及びアメリカ国立科学財団（ＮＳＦ）によって授与された大学院研究フェローシップ賞の下での政府の支援を受けてなされた。政府は本発明において一定の権利を有している。

【0003】

技術分野
本発明の実施形態は、全般的に、光学イメージング、特に顕微鏡検査に関する。

【背景技術】

【0004】

背景
顕微鏡検査は全般的に、光をサンプルに向け、次いで、サンプルから受け取った光に基づいてサンプルを画像化することを含み得る。一部の顕微鏡は、システムの光学系を、サンプルに対してサンプルホルダの反対側（下側）に配置する。これによって、サンプルへのアクセス、サンプルの準備／取り付けの容易さ等が向上する可能性がある。したがって、照明光と収集光とは、サンプルホルダの材料を通過して光学系とサンプルとの間を通過し得る。対物レンズが配置されている周囲環境の屈折率と、サンプルホルダの屈折率との違いによる収差等、様々な収差のため、画像を歪ませずにサンプル内へ光を結合すること／サンプルから光を取り出すことが困難な場合がある。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0005】

概要
少なくとも１つの態様において、本開示は、サンプルホルダ、浸漬チャンバ、照明用対物レンズ、収集用対物レンズ、第１のソリッドイマージョンメニスカスレンズ及び第２のソリッドイマージョンメニスカスレンズを備える装置に関する。サンプルホルダは、サンプルを支持するように構成されている第１の側面と、第１の側面の反対側の第２の側面とを有している。浸漬チャンバは浸漬流体を保持し、サンプルホルダの第２の側面は浸漬流体に隣接している。照明用対物レンズは、浸漬流体の外側に配置されており、サンプル内に焦点領域を有している。収集用対物レンズは、浸漬流体の外側に配置されており、サンプル内に焦点領域を有している。第１のソリッドイマージョンメニスカスレンズ（ＳＩＭレンズ）は、照明用対物レンズと浸漬流体との間に配置されている。第２のＳＩＭレンズは、収集用対物レンズと浸漬流体との間に配置されており、第１のＳＩＭレンズから独立している。各ＳＩＭレンズは、第１の表面と、第１の表面の反対側の第２の表面とを有しており、第２の表面は浸漬流体に隣接している。対物レンズと焦点領域との間を通過する光は、各ＳＩＭレンズの第１の表面と第２の表面とに対してほぼ垂直である。

【0006】

第１のＳＩＭレンズ及び第２のＳＩＭレンズの第１の表面及び第２の表面はそれぞれ、ＳＩＭレンズを通過する光の波面と調和するように湾曲し得る。第１のＳＩＭレンズの第１の表面は第１の曲率を有していてよく、第１のＳＩＭレンズの第２の表面は第２の曲率を有していてよく、第２のＳＩＭレンズの第１の表面は第３の曲率を有していてよく、第２のＳＩＭレンズの第２の表面は第４の曲率を有していてよく、第１の曲率、第２の曲率、第３の曲率及び第４の曲率は互いに等しくない場合がある。

【0007】

第１のＳＩＭレンズ及び第２のＳＩＭレンズのそれぞれの第１の表面は、第１の表面から焦点領域までの距離の曲率半径を有していてよく、第１のＳＩＭレンズ及び第２のＳＩＭレンズのそれぞれの第２の表面は、第２の表面から焦点領域までの距離の曲率半径を有していてよい。第１のＳＩＭレンズの第１の表面は第１の曲率半径を有していてよく、第１のＳＩＭレンズの第２の表面は第２の曲率半径を有していてよく、第２のＳＩＭレンズの第１の表面は第３の曲率半径を有していてよく、第２のＳＩＭレンズの第２の表面は第４の曲率半径を有していてよく、第１の曲率半径、第２の曲率半径、第３の曲率半径及び第４の曲率半径は互いに等しくない場合がある。

【0008】

装置は、浸漬チャンバに対して３次元でサンプルホルダを動かすことができるアクチュエータを含み得る。装置は、照明光を生成することができる光源を含み得る。第１の対物レンズは、照明ビームとして照明光を焦点領域に向けて配向するように構成されていてよい。検出器は収集された光を受け取ることができ、第２の対物レンズは焦点領域からの光を受け取ることができる。対物レンズは第１の光軸を有していてよく、第２の対物レンズは第２の光軸を有していてよい。第１の光軸は、第２の光軸に対して直交していてよい。装置は、対物レンズと少なくとも１つの追加の対物レンズとを保持することができるレンズタレットを含み得る。レンズタレットは、焦点領域を含む光路に沿って、対物レンズ及び少なくとも１つの追加の対物レンズのうちの１つを選択的に配置することができる。

【0009】

少なくとも１つの態様において、本開示は、サンプルホルダ、浸漬チャンバ、第１の対物レンズ、第２の対物レンズ及びソリッドイマージョンメニスカスレンズ（ＳＩＭレンズ）を含む装置に関する。サンプルホルダは、サンプルを支持するように構成されている第１の側面と、第１の側面の反対側の第２の側面とを有している。浸漬チャンバは浸漬流体を保持する。サンプルホルダの第２の側面は浸漬流体に隣接している。第１の対物レンズは、周囲環境において、浸漬流体の外側に配置されており、サンプルの焦点領域に光を集束させる。第２の対物レンズは、周囲環境において、浸漬流体の外側に配置されており、サンプルの焦点領域に光を集束させる。ＳＩＭレンズは第１の対物レンズと浸漬流体との間に配置されているが、第２の対物レンズと浸漬流体との間には配置されていない。周囲環境は第１の屈折率を有しており、ＳＩＭレンズは第１の屈折率とは異なる第２の屈折率を有しており、サンプル、サンプルホルダ及び浸漬流体は第１の屈折率及び第２の屈折率とは異なる第３の屈折率を有している。

【0010】

周囲環境は空気であってよく、第１の対物レンズは、空気対物レンズ（air objective）であってよい。ＳＩＭレンズは、第１の湾曲表面と、第１の湾曲表面の反対側の第２の湾曲表面とを有していてよい。第１の湾曲表面及び第２の湾曲表面は、サンプルと第１の対物レンズとの間を通過する光の波面と調和するように成形されていてよい。第１の湾曲表面は、第１の湾曲表面と対物レンズの焦点領域との間の距離の曲率半径を有していてよく、第２の湾曲表面は、第２の湾曲表面と焦点領域との間の距離の曲率半径を有していてよい。第２の対物レンズは、浸漬流体と接触している浸漬対物レンズであってよい。

【0011】

装置は、第２の対物レンズと浸漬流体との間に配置されている第２のＳＩＭレンズも含み得る。第２のＳＩＭレンズは、第１のＳＩＭレンズから独立していてよい。第２のＳＩＭレンズは、第２の屈折率を有していてよい。第１の対物レンズは、照明ビームをサンプルの焦点領域に向けて配向することができ、第２の対物レンズは、焦点領域から光を収集することができる。

【0012】

少なくとも１つの態様において、本開示は方法に関する。この方法は、照明経路に沿って、第１の対物レンズを通ってサンプルに向けて照明光を配向することを含み、ここで、照明光は、浸漬流体を通過し、サンプルホルダを通過し、サンプルに入る。この方法は、収集経路に沿って、第２の対物レンズでサンプルから、収集された光を受け取ることを含み、受け取った光は、サンプルホルダ、浸漬流体及びソリッドイマージョンメニスカスレンズ（ＳＩＭレンズ）を通過する。ＳＩＭレンズは、収集された光の波面と調和するようにそれぞれ構成されている第１の湾曲表面と第２の湾曲表面とを有している。第２の湾曲表面は、浸漬媒体に隣接している。照明光はＳＩＭレンズを通過しない。

【0013】

照明経路は、第１の対物レンズと浸漬流体との間に配置されている第２のＳＩＭレンズを含み得る。この方法は、浸漬流体の屈折率をサンプルの屈折率に調和させることも含み得る。この方法は、収集された光に基づいてサンプルを画像化することも含み得る。サンプルホルダは、サンプルを支持し得る第１の側面と、第１の側面の反対側の第２の側面とを有していてよく、第２の側面は、浸漬流体に隣接していてよい。この方法は、画像の深度スタックを生成するために、第１の側面から第２の側面へと、軸線に沿ってサンプルホルダを走査することをさらに含み得る。

【図面の簡単な説明】

【0014】

【図1】本開示のいくつかの実施形態による、ソリッドイマージョンメニスカスレンズを備えた頂部開口型顕微鏡のブロック図である。

【図2】本開示のいくつかの実施形態による光学システムの一部の概略図である。

【図3】本開示のいくつかの実施形態による光学システムを通る光路の概略図である。

【図4】本開示のいくつかの実施形態による光学システムの概略図である。

【図5】本開示のいくつかの実施形態による、交換可能な対物レンズマウントを備えた光学システムの概略図である。

【図6】本開示のいくつかの実施形態による、サンプルを画像化する方法のフローチャートである。

【発明を実施するための形態】

【0015】

詳細な説明
特定の実施形態の以下の説明は、本質的に単なる例示であり、本開示又はその適用又は使用の範囲を制限することを決して意図するものではない。本システム及び方法の実施形態の以下の詳細な説明では、本明細書の一部を形成し、説明されたシステム及び方法が実施され得る特定の実施形態を例示するために示される添付の図面を参照する。これらの実施形態は、当業者が現在開示されているシステム及び方法を実践することを可能にするのに十分詳細に説明されており、他の実施形態が利用されてよく、構造的及び論理的変更が開示の精神及び範囲から逸脱することなくなされ得ることが理解されるべきである。さらに、明確にするために、特定の特徴の詳細な説明は、それらが本開示の実施形態の説明を曖昧にしないように、当業者に明らかである場合には議論されない。したがって、以下の詳細な説明は、限定的な意味で解釈されるべきではなく、本開示の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ定義される。

【0016】

様々な例示的な値が本明細書全体に与えられている。実際のシステムでは完全な位置合わせが不可能な場合があるため、これらの値は概算値であることを理解する必要がある。したがって、「垂直」又は「直交」等の値を、実際の値が目的の角度の許容範囲内にある可能性がある「ほぼ９０°」と解釈する必要がある。たとえば、直交していると説明されている２つのものが、互いに対して８５°乃至９５°の範囲で配置されてよい。他の角度及び測定値も同様に解釈されるべきである。

【0017】

顕微鏡検査は、通常、典型的には肉眼では見えない視野及び／又は解像度を有するサンプルの画像を生成するために、広範囲の用途で使用され得る。照明光は、照明用光学系を備えたサンプルに向かって配向されていてよい。収集用光学系は、サンプルから検出器（たとえば、ＣＣＤ検出器、ＣＭＯＳ検出器又はユーザの眼）に光を収集するために使用され得る。場合によっては、検出器に到達する光は、照明光の一部を含み得る。場合によっては、検出器に到達する光は、発光するように照明光によって刺激された後、（たとえば、蛍光を介して）サンプルから放出されてよい。視野が均一な照明を受けることを保証すること、及び、照明がサンプルの深さを透過することを保証することが望ましい場合がある。

【0018】

ライトシート顕微鏡検査法は、検出器によって画像化されるサンプル内の薄い２次元照明「ライトシート」に沿って蛍光を励起することによって、均一な照明と光学セクショニング（焦点外光の除去）との両方を達成する。照明用光学系と収集用光学系とは互いに分離されており、それぞれを個別に最適化して画像化性能を向上させることができる。照明用光学系と収集用光学系との分割は、収集用光学系に直接的に到達する照明光の量を減らすのに役立つ場合がある。したがって、これは、光顕微鏡検査法又は暗視野顕微鏡検査法等の特定のタイプの顕微鏡検査法に役立つ場合がある。

【0019】

照明用光学系及び／又は収集用光学系は、サンプルホルダ（たとえば、サンプルを支持する透明なプレート）に対してある角度で配置されていてよい。たとえば、照明用光学系及び収集用光学系は、それぞれ、サンプルホルダに対して４５°の角度であってよい。これは、画像化パラメータ及び画像化の深さの最適化に利点を提供する可能性があるが、サンプルホルダによる照明光及び／又は収集光の非垂直入射は、様々な収差をもたらし得る。ソリッドイマージョンレンズ（ＳＩＬ）は、サンプルに出入りする光線が垂直角度でＳＩＬに入射するように、照明光又は収集光の波面と調和する表面を含み得る。しかし、ＳＩＬを使用すると、制限が生じる場合がある。これらはたとえば、サンプルの屈折率をＳＩＬの屈折率に調和させる必要が生じる、又は、サンプルホルダ及びサンプルに対して相対的に、ＳＩＬを通る照明光及び収集された光の幾何学的形状を維持するためにＳＩＬに対して相対的なサンプルホルダの動きが制限される等である。

【0020】

本開示は、ソリッドイマージョンメニスカスレンズ（ＳＩＭレンズ）に関する。顕微鏡は、第１の側面及び第２の側面を備えたサンプルホルダを有していてよい。第１の側面はサンプルを支持することができ、他方で第２の側面は浸漬媒体（たとえば、浸漬流体）と接触している。収集用対物レンズ又は照明用対物レンズ等の対物レンズは、サンプルホルダの第２の側面に配置されていてよい。ＳＩＭレンズが対物レンズと浸漬媒体との間に配置されてよく、これによってＳＩＭレンズの第１の湾曲表面は浸漬媒体と接触し、他方で、ＳＩＭレンズの第２の湾曲表面は浸漬媒体と接触しない（たとえば、反対側は、空気と接触していてよい）。ＳＩＭレンズの第１の湾曲表面及び第２の湾曲表面は、その表面を通過する光の波面と調和するように成形されていてよい。たとえば、第１の湾曲表面及び第２の湾曲表面は、光線が（たとえば、照明経路又は収集経路に沿って）、ＳＩＭレンズの表面に垂直に、ＳＩＭレンズの材料を横切るように成形されていてよい。これによって、光が対物レンズを含む周囲環境から浸漬流体へ入るときに屈折が減少する場合がある。いくつかの実施形態では、サンプル、サンプルホルダ及び浸漬媒体は、同等の屈折率を有し得るが、ＳＩＭレンズの材料は、異なる屈折率を有し得る。ＳＩＭレンズの使用は、浸漬材料／サンプルと調和させられる必要がないＳＩＭレンズ材料の使用を可能にすることができ、ＳＩＭレンズに対して相対的なサンプルホルダの３次元の動きを容易にすることができる。

【0021】

図１は、本開示のいくつかの実施形態による、ソリッドイマージョンメニスカスレンズを備えた頂部開口型顕微鏡のブロック図である。図１は、頂部開口型顕微鏡１０２と、オプションのコントローラ１０４とを含む光学システム１００を示している。コントローラ１０４は、顕微鏡１０２を操作することができ、及び／又は、顕微鏡１０２からの情報を解釈することができる。いくつかの実施形態では、コントローラ１０４の１つ又は複数の部分が省略されてよく、顕微鏡１０２は、手動で操作されてよい。いくつかの実施形態では、コントローラ１０４の１つ又は複数の部分は、顕微鏡１０２に統合されていてよい。

【0022】

顕微鏡１０２は、サンプルホルダ１０８の頂部面に沿ってサンプル１０６を支持するサンプルホルダ１０８を含む。サンプルホルダ１０８の底面は、浸漬チャンバ１１０内に含まれる浸漬流体１１２と接触している。図１の顕微鏡１０２は、互いに分離された照明経路及び収集経路を有している。照明経路は、光源１１８、照明用光学系１２０及び照明用対物レンズ１２２を含む。照明経路は、浸漬媒体１１２及びサンプルホルダ１０８を通過してサンプル１０６を照明する照明ビーム１２４を提供する。収集経路は、収集用対物レンズ１２８、収集用光学系１３０及び検出器１３２を含む。収集経路は、照明ビーム１２４によって照明される焦点領域１２６から光を収集することができる。

【0023】

ソリッドイマージョンメニスカスレンズ（ＳＩＭレンズ）は、照明経路及び／又は収集経路に沿って配置されていてよい。図１の実施形態では、照明用ＳＩＭレンズ１１４は照明経路の一部として示され、収集用ＳＩＭレンズ１１６は収集経路の一部として示されている。ＳＩＭレンズ１１４及びＳＩＭレンズ１１６は、それぞれ照明経路又は収集経路に沿って通過する光が、浸漬流体１１２と、ＳＩＭレンズ１１４又はＳＩＭレンズ１１６の材料と、顕微鏡１０２の周囲環境との間を通過する際に屈折することを防止するように成形されていてよい。いくつかの実施形態では、単一のＳＩＭレンズが（たとえば、照明用ＳＩＭレンズ１１４と同様に）照明経路の一部として使用されてよく、他方でＳＩＭレンズは、収集経路の一部として使用されない。いくつかの実施形態では、単一のＳＩＭレンズは（たとえば、収集用ＳＩＭレンズ１１６と同様に）収集経路の一部として使用されてよく、他方でＳＩＭレンズは、照明経路の一部として使用されない。

【0024】

光源１１８は、照明経路に沿って照明光を提供して、サンプル１０６の焦点領域１２６を照明する。光源１１８は、狭いスペクトルにおいて光を放出することができるレーザー又は発光ダイオード（ＬＥＤ）等の狭帯域光源であり得る。いくつかの実施形態では、光は、広いスペクトル（たとえば、白色）照明を生成し得る広帯域光源（たとえば、白熱光源、アーク光源）であり得る。いくつかの実施形態では、照明光の１つ又は複数の部分は、可視範囲の外にあってよい。いくつかの実施形態では、フィルタ（図示せず）を照明経路の一部として使用して、照明光の波長をさらに洗練することができる。たとえば、バンドパスフィルタは、光源１１８から広帯域照明を受け取り、より狭いスペクトルで照明光を提供することができる。いくつかの実施形態では、光源１１８はレーザーであってよく、コリメート光を生成し得る。

【0025】

いくつかの実施形態では、光学システム１００は、サンプル１０６内の蛍光を画像化するために用いられてよい。照明ビーム１２４は、サンプル１０６内の蛍光体を励起できる特定の励起波長での光を含み得る。照明ビーム１２４は、励起波長を含む広いスペクトルの光を含み得るものであり、又は、励起波長を中心とする狭帯域であり得る。いくつかの実施形態では、光源１１８は、励起波長を中心とする（又は励起波長に近い）狭いスペクトルの光を生成することができる。いくつかの実施形態では、フィルタ（図示せず）を照明用光学系１２０において使用して、照明ビーム１２４を励起波長に近い波長に制限することができる。照明シートによって励起されると、サンプル１０６内の蛍光体は、光を放出することができる（これは、所与の発光波長を中心としてよい）。収集経路（たとえば、収集用光学系１３０）は、検出器１３２に到達する光を発光波長に近い光の波長に制限するために使用され得る１つ又は複数のフィルタを含み得る。

【0026】

照明用光学系１２０は、光源１１８からの光を照明用対物レンズ１２２へ結合してよい。たとえば、照明用光学系１２０は、光ファイバを含み得るものであり、これは、照明用対物レンズ１２２の背面側に光源１１８からの光を伝送する。いくつかの実施形態では、照明用光学系１２０は、光源１１８によって提供された光を実質的に変更することなく、光源１１８と対物レンズ１２２との間で光を結合することができる。いくつかの実施形態では、照明用光学系１２０は、光源１１８によって提供された光の形状、波長、強度及び／又は他の特性を変え得る。たとえば、照明用光学系１２０は、光源１１８から広帯域光を受け取り、対物レンズ１２２に狭帯域光を提供するために、光をフィルタリングすることができる（たとえば、フィルタ、回折格子、音響光学変調器等を用いて）。

【0027】

いくつかの実施形態では、照明経路は、ライトシート顕微鏡又はライトシート蛍光顕微鏡（ＬＳＦＭ）の一部であるライトシートである照明ビーム１２４を提供することができる。ライトシートは、第１の軸（たとえば、ｙ軸）に沿った第１の開口数と、第１の軸に直交する第２の軸に沿った、第１の開口数よりも大きい第２の開口数とを備える、ほぼ楕円形の断面を有し得る。照明用光学系１２０は、光源１１８から受け取った光を照明シートに再成形する光学系を含み得る。たとえば、照明用光学系１２０は、直交軸ではない１つの軸に光を集束させる１つ又は複数の円筒形光学系を含み得る。

【0028】

いくつかの実施形態では、照明用光学系１２０は、サンプル１０６に対して相対的に照明ビーム１２４を走査するために使用され得る走査光学系を含み得る。たとえば、照明ビームによって照明される領域は、所望の焦点領域１２６よりも小さくてよい。この場合、照明用光学系１２０は、焦点領域１２６の照明を確実にするために、所望の焦点領域１２６を横切って照明ビーム１２４を急速に振動させることができる。

【0029】

照明用対物レンズ１２２は、照明ビーム１２４を提供する１つ又は複数のレンズを含み得る。たとえば、照明用対物レンズ１２２は、照明ビーム１２４を焦点領域１２６に向けて集束させることができる。焦点領域１２６が、全般的に、サンプル１０６内にあるように、サンプルホルダ１０８がサンプル１０６を配置してよい。照明用対物レンズは、いくつかの実施形態では、１つ又は複数の内部光学要素を含む市販の対物レンズであり得る。いくつかの実施形態では、照明用対物レンズ１２２は、周囲環境（たとえば、空気）によって取り囲まれていてよく、照明用対物レンズ１２２は空気対物レンズであり得る。照明用対物レンズ１２２は、１つ又は複数の開口数によって特徴付けられていてよく、この開口数は、光が焦点領域１２６で収束する角度に基づいていてよい。いくつかの実施形態では、焦点領域１２６は、焦点として理想化され得る。

【0030】

照明ビーム１２４を、照明用ＳＩＭレンズ１１４を通過し、浸漬流体１１２へ入るように配向することができる。照明用ＳＩＭレンズ１１４は、照明用対物レンズ１２２を含む周囲環境（たとえば、空気）から照明用ＳＩＭレンズ１１４の材料を通って浸漬流体１１２へ入る光の屈折を最小にするように成形されていてよい。次に、照明ビーム１２４は、サンプル１０６及びサンプルホルダ１０８に向かって浸漬流体１１２を通過してよい。光と、ＳＩＭレンズ１１４及び浸漬流体１１２との相互作用は、図２乃至図３でより詳細に説明されている。

【0031】

照明ビーム１２４は、サンプル１０６へと配向されてよい。サンプル１０６は、サンプルホルダ１０８の上面によって支持され得る。いくつかの実施形態では、サンプル１０６は、サンプルホルダ１０８の上面に直接的に配置されていてよい。いくつかの実施形態では、サンプル１０６は、容器（たとえば、スライドガラス、ウェルプレート、組織培養フラスコ等）内にパッケージされてよく、この容器は、サンプルホルダ１０８上に配置されていてよい。いくつかの実施形態では、容器は、サンプルホルダ１０８に統合されていてよい。いくつかの実施形態では、サンプル１０６は、光学システム１００上での画像化の前に処理されてよい。たとえば、サンプル１０６は、画像化の前に洗浄、スライス及び／又はラベル付けされてよい。

【0032】

いくつかの実施形態では、サンプル１０６は、生物学的サンプルであり得る。たとえば、サンプル１０６は、疑わしい疾患（たとえば、癌）の領域から生検された組織であり得る。いくつかの実施形態では、組織は、光学システム１００によって検査される前に、光学的クリアランス、組織スライス及び／又はラベル付け等の様々な処理を受けることがある。いくつかの実施形態では、治療の進行状況を判断する、病気の進行状況を監視する等のために、光学システム１００による組織の検査が診断に使用されることがある。

【0033】

いくつかの実施形態では、サンプル１０６は非生物学的サンプルであり得る。たとえば、サンプル１０６は流体であってよく、調査のための１つ又は複数の成分を含み得る。たとえば、サンプル１０６は燃焼ガスであってよく、光学システム１００は、粒子画像流速測定法（ＰＩＶ）を実行して、ガスの成分を特徴付けることができる。

【0034】

いくつかの実施形態では、サンプル１０６は、１つ又は複数のタイプの蛍光体を含み得る。蛍光体は、サンプル１０６に固有であってもよく（たとえば、生物学的サンプル中のＤＮＡ及びタンパク質）、又は、サンプル１０６に適用される蛍光標識（たとえば、アクリジンオレンジ、エオシン）であってもよい。いくつかのサンプル１０６は固有のタイプの蛍光体と蛍光標識との組合せを含み得る。各タイプの蛍光体は、励起波長を中心とすることができる励起スペクトルを有していてよい。蛍光体が励起スペクトルにおける光によって励起されると、これは、励起波長とは異なる（たとえば、赤方偏移された）発光波長を中心とし得る発光スペクトルにおける光を放出する可能性がある。

【0035】

サンプルホルダ１０８は、照明ビーム１２４及びサンプル１０６の焦点領域１２６から収集された光に対して全般的に透明である材料上でサンプル１０６を支持することができる。いくつかの実施形態では、サンプルホルダ１０８は、サンプル１０６をその上に配置することができる透明材料から形成されている窓を有していてよく、サンプルホルダ１０８の残りの部分は、不透明な材料から形成されていてよい。いくつかの実施形態では、サンプルホルダ１０８は、透明な材料から作製されてよい。たとえば、サンプルホルダ１０８はガラス板であり得る。

【0036】

いくつかの実施形態では、サンプルホルダ１０８は、サンプル１０６を支持するための１つ又は複数の構造を含み得る。たとえば、サンプルホルダ１０８は、クリップ又はウェルを含み得る。いくつかの実施形態では、サンプルホルダ１０８はシステム１００のモジュラーコンポーネントであってよく、異なるサンプルホルダ１０８が、サンプルの種類、画像化の種類、照明光／収集された光の波長及びそれらの組合せに関連して、交換のために出し入れされてよい。

【0037】

サンプルホルダ１０８は、サンプル１０６を支持するサンプルホルダ１０８の表面の反対側の第２の表面（たとえば、下面）を有していてよい。浸漬流体１１２を保持する浸漬チャンバ１１０が、サンプルホルダ１０８の第２の表面の下に配置されてよい。いくつかの実施形態では、浸漬チャンバ１１０は、開いた頂部を有していてよく、浸漬流体１１２は、サンプルホルダ１０８の第２の表面と接触していてよい。いくつかの実施形態では、サンプルホルダ１０８の第２の表面が浸漬流体１１２と接触していてよく、（サンプル１０６を支持する）サンプルホルダ１０８の第１の表面は、対物レンズ１２２及び１２８と同様の環境（たとえば、空気）と接触していてよい。

【0038】

サンプルホルダ１０８は、サンプルホルダ１０８を１つ又は複数の方向に動かすことができるアクチュエータ１０９に結合されていてよい。いくつかの実施形態では、サンプルホルダ１０８は、浸漬チャンバ１１０及び対物レンズ１２２及び対物レンズ１２８に対して相対的に、最大３つの次元（たとえば、ｘ、ｙ及びｚ軸に沿って）移動可能であってよい。サンプルホルダ１０８は、サンプル１０６内の焦点領域１２６の位置を変更するために、及び／又は、サンプルホルダ１０８を装填位置と画像化位置との間で移動させるために、移動され得る。いくつかの実施形態では、アクチュエータは、ねじ又は粗い／細かい調整ノブ等の手動アクチュエータであってよい。いくつかの実施形態では、アクチュエータは自動化されていてよく、これはたとえば、手動入力及び／又はコントローラ１０４からの指示に応答し得る電気モータである。いくつかの実施形態では、アクチュエータ１０９は、手動調整及び自動コントロールの両方に応答し得る（たとえば、手動調整とコントローラ１０４からの指示との両方に応答するノブ）。

【0039】

浸漬チャンバ１１０は、浸漬流体１１２を含む。いくつかの実施形態では、浸漬チャンバ１１０は、浸漬流体１１２を交換するのに有用であり得るソース及び／又はシンクを含み得る。たとえば、浸漬チャンバ１１０は、浸漬流体１１２を提供する流体入力ライン（これはその後、ポンプ及び／又はリザーバに結合され得る）と、浸漬チャンバ１１０から浸漬流体１１２を除去するために開くことができるドレインとに結合されていてよい。本明細書でより詳細に記述されるように、浸漬流体のタイプは、サンプル１０６及び／又はサンプルホルダ１０８の屈折率に基づいて選択されてよい。

【0040】

収集経路は、焦点領域１２６から光を受け取り、受け取った光を検出器１３２に配向することができる。検出器１３２は、受け取った光を画像化し、及び／又は、さもなければ測定することができる。焦点領域１２６からの光は、照明ビーム１２４の、方向を変えられた部分であり得る（たとえば、散乱光及び／又は反射光）、照明ビーム１２４に応答して（たとえば、蛍光を介して）焦点領域１２６から放出される光であり得る、又は、それらの組合せであり得る。収集された光は、収集用ＳＩＭレンズ１１６を通過する前に、サンプルホルダ１０８及び浸漬流体１１２を通過して、収集用対物レンズ１２８を含む周囲環境（たとえば、空気）へ入ることができる。収集用ＳＩＭレンズ１１６は、収集された光が通過するときに、屈折を最小化にするように成形されていてよい。光とＳＩＭレンズとの相互作用については、図２乃至図３において詳細に説明する。収集用ＳＩＭレンズ１１６は、照明用ＳＩＭレンズ１１４とは別個の光学コンポーネントであり得る。いくつかの実施形態では、収集用ＳＩＭレンズ１１６は、照明用ＳＩＭレンズ１１４とは異なる材料から作製されていてよい。

【0041】

照明用ＳＩＭレンズ１１４及び収集用ＳＩＭレンズ１１６は、それぞれ、照明ビーム１２４及び収集された光の波面と調和するように独立して成形されていてよい。たとえば、照明ビーム１２４の波面は、照明経路の光学系に基づいていてよく、他方で、収集された光の波面は、収集経路の光学系に基づいていてよい。照明経路の光学系と収集経路の光学系とは互いに独立しているため、照明光の波面の形状と、収集された光の波面の形状とが異なる場合がある。２つのＳＩＭレンズ１１４及びＳＩＭレンズ１１６は別個の光学要素であり得るので、照明用ＳＩＭレンズ１１４の形状（たとえば、前面及び背面の曲率）は、収集用ＳＩＭレンズ１１６の形状（たとえば、前面及び背面の曲率）とは異なっていてよい。このように、照明用ＳＩＭレンズ１１４は照明ビーム１２４に基づいた形状を有していてよく、収集用ＳＩＭレンズ１１６は、収集された光に基づいた形状を有していてよい。

【0042】

焦点領域１２６の幾何学的形状は、収集経路の視野によって部分的に規定されていてよく、これはまた、収集用対物レンズ１２８の開口数に部分的に関連していてよい。照明用対物レンズ１２２と同様に、収集用対物レンズ１２８は、１つ又は複数のレンズを含む市販の対物レンズであり得る。いくつかの実施形態では、収集用対物レンズ１２８は、空気対物レンズであり得る。いくつかの実施形態では、収集経路が焦点合わせされる焦点領域と、照明経路が焦点合わせされる焦点領域とは、全般的に、焦点領域１２６で重複し得る。いくつかの実施形態では、照明経路と収集経路とは、自身の各焦点領域の異なる形状、異なるサイズ及び／又は異なる位置を有していてよい。

【0043】

収集経路は、収集用対物レンズから検出器１３２に光を向け直すことができる収集用光学系１３０を含む。たとえば、収集用光学系１３０は、収集用対物レンズの後端からの光を、検出器１３２上に投影された画像に集束させるように設計されたチューブレンズであり得る。いくつかの実施形態では、収集用光学系１３０は、収集用対物レンズ１２８から受け取った光を変更する１つ又は複数の要素を含み得る。たとえば、収集用光学系１３０は、フィルタ、ミラー、走査除去（de-scanning）光学系又はそれらの組合せを含み得る。

【0044】

検出器１３２は、焦点領域１２６を画像化するために使用され得る。いくつかの実施形態では、検出器１３２は、ユーザが焦点領域１２６を観察することができるように、接眼鏡を表していてよい。いくつかの実施形態では、検出器１３２は、焦点領域１２６の画像を記録するために信号を生成することができる。たとえば、検出器１３２は、アレイに入射する光に基づいて電子信号を生成することができるＣＣＤアレイ又はＣＭＯＳアレイを含み得る。

【0045】

照明経路は、第１の光軸に沿って光を配向することができる。収集経路は、第２の光軸に沿って光を収集することができる。図１に示されたもの等のいくつかの実施形態では、第１の光軸と第２の光軸とは、互いに直交し得る。第１の光軸及び第２の光軸のそれぞれが、サンプルホルダに対して非直交であってもよい。たとえば、第１の光軸は、サンプルホルダ１０８の底面に対して４５°の角度であってよく、第２の光軸も、サンプルホルダ１０８の底面に対して４５°の角度であってよい。

【0046】

いくつかの実施形態では、照明経路及び収集経路は、互いに非直交であってよい。たとえば、照明光路は、サンプルホルダの底面に対して４５°の角度である第１の光軸に追従することができ、収集経路は、サンプルホルダの底面に対して９０°の角度である第２の光軸に追従することができ、したがって、第１の光軸と第２の光軸との間に約４５°の角度があってよい。

【0047】

いくつかの実施形態では、対物レンズ１２２及び対物レンズ１２８のうちの１つは、空気対物レンズ（air objective）であり得るが、他の対物レンズは、非空気対物レンズ（たとえば、浸漬対物レンズ）であり得る。非空気対物レンズは、いくつかの実施形態では、浸漬流体１１２に浸漬していてよい（又は浸漬流体１１２に接触する前面を有していてよい）。いくつかの実施形態では、空気対物レンズは、対物レンズと浸漬流体との間に配置されているＳＩＭレンズを有していてよく、他方でＳＩＭレンズを、非空気対物レンズとともに使用することはできない。たとえば、照明用対物レンズ１２２は、照明ビーム１２４を、照明用ＳＩＭレンズ１１４を通って浸漬流体１１２へ入るように配向してよく、他方で、収集用対物レンズ１２８は、浸漬流体１１２に隣接していてよい（たとえば、接触していてよい）。

【0048】

顕微鏡１０２は、コントローラ１０４に結合されていてよく、コントローラ１０４は、顕微鏡１０２の１つ又は複数の部分を操作し、顕微鏡１０２からのデータを表示し、顕微鏡１０２からのデータを解釈するために、又は、それらの組合せに使用され得る。いくつかの実施形態では、コントローラ１０４は、顕微鏡から分離されていてよく、これはたとえば汎用コンピュータである。いくつかの実施形態では、コントローラ１０４の１つ又は複数の部分は、顕微鏡１０２と一体であり得る。

【0049】

コントローラ１０４は、１つ又は複数の入力／出力デバイス１４２を含み、これによって、ユーザは、コントローラ１０４からのフィードバック、顕微鏡１０２からのデータを見ることができ、コントローラ１０４に指示を提供し、顕微鏡１０２に指示を提供することができ、又は、それらの組合せを行うことができる。たとえば、入力／出力デバイス１４２は、デジタルディスプレイ、タッチスクリーン、マウス、キーボード、又は、それらの組合せを含み得る。

【0050】

コントローラ１０４は、メモリ１４４に格納された１つ又は複数の命令を実行し得るプロセッサ１４０を含む。命令は、顕微鏡１０２をコントロールする方法に関する命令を含み得るコントロールソフトウェア１５２を含み得る。コントロールソフトウェア１５２に基づいて、プロセッサ１４０は、コントローラ１０４に、アクチュエータ１０９等の、顕微鏡１０２の様々なコンポーネントに信号を送信させることができる。命令は、検出器１３２からの「ライブ」の画像１４６又は事前にメモリ１４４に格納されている画像１４６のいずれかを処理するために使用され得る画像処理ソフトウェア１５０を含み得る。画像処理ソフトウェア１５０は、たとえば、画像１４６から背景ノイズを除去することができる。命令は、画像１４６の１つ又は複数の特性を決定するためにプロセッサ１４０によって実行され得る分析ソフトウェア１４８を含み得る。たとえば、分析ソフトウェア１４８は、画像１４６内の細胞核を強調表示することができる。

【0051】

いくつかの実施形態では、コントローラ１０４は、サンプル内のいくつかの異なる視野から画像を収集するように顕微鏡に指示することができる。たとえば、コントローラ１０４は、画像の深度スタックを収集するための命令を含み得る。コントローラ１０４は、検出器１３２に第１の画像を収集するように指示し、次に、アクチュエータ１０９に、サンプルホルダ１０８を垂直方向に（たとえば、ｚ軸に沿って）設定された距離だけ動かすように指示することができる。これはまた、焦点領域１２６に対してサンプル１０６を移動させることができ、これは、焦点領域１２６が配置されるサンプル内の高さを変えることができる。次に、コントローラ１０４は、検出器１３２に他の画像を収集するように指示し、次に、スタック内の設定された数の画像及び／又はｚ方向の設定された総変位が達成されるまでプロセスを繰り返すことができる。次に、分析ソフトウェア１４８は、サンプル１０６の３Ｄ（又は疑似３Ｄ）画像化を実現するために、画像の深度スタックを組み合わせてよい。

【0052】

図２は、本開示のいくつかの実施形態による光学システムの一部の概略図である。図２は、いくつかの実施形態では、図１の顕微鏡１０２の一部を表していてよい。図２は、サンプル２０６、サンプルホルダ２０８、浸漬チャンバ２１０、浸漬流体２１２、ＳＩＭレンズ２１４及びＳＩＭレンズ２１６並びに対物レンズ２２２及び対物レンズ２２８の図を示している。

【0053】

照明用対物レンズ２２２は、照明用対物レンズ２２２の前端を出て、照明用対物レンズ２２２を取り囲む媒体を通過する照明ビーム２２４を提供する。照明用対物レンズ２２２を取り囲む媒体は、顕微鏡が配置されている周囲環境の一部であり得る。たとえば、周囲媒体は空気であってよい。周囲媒体を通過した後、照明ビームは、照明用ＳＩＭレンズ２１４を通過して、浸漬流体２１２へ入る。

【0054】

照明用ＳＩＭレンズ２１４は、第１の湾曲表面を有していてよく、照明用ＳＩＭレンズ２１４の、第１の湾曲表面の反対側に第２の湾曲表面を有していてよい。いくつかの実施形態では、第１の湾曲表面は、周囲媒体と接触していてよい。他方で、第２の湾曲表面は浸漬流体と接触していてよい。ＳＩＭレンズ２１４の縁部が浸漬チャンバ２１０の壁に取り付けられていてよく、ＳＩＭレンズ２１４は、チャンバ２１０内の浸漬流体２１２を含包するのに役立ち得る。ＳＩＭレンズ２１４は、光が浸漬チャンバ２１０の外部と浸漬チャンバ２１０の内部との間を通過するための窓として作用してよい。照明ビームが照明用ＳＩＭレンズ２１４と相互作用する場所で、照明用ＳＩＭレンズ２１４の第１の湾曲表面及び第２の湾曲表面はそれぞれ照明ビームの波面と調和するように成形されていてよい。

【0055】

たとえば、照明ビーム２２４を、照明用対物レンズの表面を横切って放出され、焦点領域２２６に向かって収束する光線の束と見なすことができる。第１の湾曲表面は、各光線が、その光線が第１の湾曲表面に入射するポイントで第１の湾曲表面に対して垂直である（たとえば、９０°の入射角を有する）ように成形されていてよい。第２の湾曲表面は、同様の形状であってよい。このように、照明ビームは、それが照明用ＳＩＭレンズ２１４を通過する際に、屈折しなくてよい（又は最小量の屈折を有していてよい）。ＳＩＭレンズための例示的な形状は図３においてより詳細に議論される。

【0056】

照明ビーム２２４は、周囲媒体（たとえば、空気）から、ＳＩＭレンズ２１４の材料を通過するときに屈折を受けない（又は最小の屈折を受ける）ので、照明ビーム２２４は、最小の屈折又は収差で浸漬流体に入ることができる。照明経路は、ＳＩＭレンズ２１４材料の屈折率と浸漬流体２１２の屈折率との間の差に比較的鈍感であり得る。いくつかの実施形態では、照明経路は、サンプルホルダと比較して「オフ軸」であってよい。言い換えれば、照明ビームの光軸は、サンプルホルダ２０８に対して非垂直であり得る。浸漬流体２１２は、浸漬流体２１２の屈折率が、サンプルホルダ２０８の材料の屈折率と調和するように選択され得る。このようにして、照明ビームがサンプルホルダの表面に垂直でなくても、照明ビーム２２４が浸漬流体２１２からサンプルホルダ２０８の材料へ通過するときに屈折は存在しない（又は最小である）。次に、サンプルホルダ２０８の材料は、サンプル２０６の屈折率と調和し得るので、照明ビーム２２４はまた、サンプルホルダ２０８の材料からサンプル２０６へ通過するときに最小の屈折を受け得る。

【0057】

いくつかの実施形態では、サンプルホルダ２０８の材料及び浸漬流体２１２は、所望のサンプル２０６の屈折率と調和するように選択されてよい。サンプルホルダ２０８はモジュール式であってよく、浸漬チャンバ２１０を異なる浸漬流体で満たすことが比較的容易であり得るので、サンプル２０６の広範囲の屈折率が受け入れられてよい。いくつかの実施形態では、１つ又は複数の処理ステップがサンプル２０６に対して、その屈折率をサンプルホルダ２０８の屈折率と調和させるために実行されてよい。

【0058】

照明ビーム２２４は、サンプル２０６内の焦点領域に集束され得る。反射光、散乱光、放出光又はそれらの組合せ等の照明された焦点領域２２６からの光は、収集経路によって収集され得る。照明経路と同様に、サンプル２０６、サンプルホルダ２０８及び浸漬流体２１２の屈折率調和のために、並びに、収集用ＳＩＭレンズ２１６波面調和曲率のために、収集用対物レンズ２２８への収集経路に沿って最小の回折又は収差が存在し得る。たとえば、光がサンプル２０６からサンプルホルダ２０８に遷移するとき、光は界面に対して垂直ではないかもしれないが、同様の屈折率が光の回折を妨げる可能性がある。同様の方法で、光はまた、サンプルホルダ２０８の材料から浸漬流体２１２に通過するときに回折しない場合がある。

【0059】

収集用対物レンズ２２８は、ある範囲の角度にわたって光を収集することができ、これは、収集用対物レンズ２２８の焦点領域に向かって収束する光線の束を含む収集された光２２５と考えることができる。したがって収集用対物レンズ２２８によって収集された、収集された光２２５は、この光線の束に沿って通過する光であり得る。収集用対物レンズ２２８は、その倍率及び／又は開口数（ＮＡ）によって特徴付けられてよい。たとえば、収集用対物レンズ２２８は、倍率が１０倍の対物レンズ（ＮＡ＝０．２１）又は倍率が２０倍の対物レンズ（ＮＡ＝０．３５）であってよい。

【0060】

照明用ＳＩＭレンズ２１４と同様に、収集用ＳＩＭレンズ２１６は、第１の湾曲表面と第２の湾曲表面とを有していてよく、これらのそれぞれは、収集された光２２５の波面に調和するように成形されていてよい。たとえば第１の湾曲表面及び第２の湾曲表面は、各表面に入射する、収集された光の光線が収集用ＳＩＭレンズ２１６の表面に対して垂直であるように成形されていてよい。このようにして、収集された光が浸漬流体２１２から収集用ＳＩＭレンズ２１６の材料へ通過する際に、及び、収集用ＳＩＭレンズ２１６の材料から、収集用対物レンズ２２８を含む周囲環境へ通過する際に、屈折が最小になり得る。

【0061】

いくつかの実施形態では、収集用ＳＩＭレンズ２１６は、照明用ＳＩＭレンズ２１４の屈折率に調和する屈折率を有していてよい。いくつかの実施形態では、２つのＳＩＭレンズ２１４及びＳＩＭレンズ２１６は、互いに異なる屈折率を有していてよい。ＳＩＭレンズ２１４及びＳＩＭレンズ２１６のそれぞれの２つの表面の曲率は、それぞれ、照明光及び収集された光の波面に基づいていてよく、したがって、この波面は、照明用対物レンズ２２２及び収集用対物レンズ２２８の光学系に基づいていてよい。たとえば開口数を使用して、照明用対物レンズ２２２及び収集用対物レンズ２２８を特徴付けることができる。いくつかの実施形態では、照明用対物レンズ２２２及び収集用対物レンズ２２８は、互いに異なる開口数を有していてよく、したがって、照明用ＳＩＭレンズ２１４の曲率は、収集用ＳＩＭレンズ２１６の曲率とは異なっていてよい。

【0062】

図３は、本開示のいくつかの実施形態による、光学システムを通る光路の概略図である。図３は、図１の光学システム１００及び／又は図２の光学システム２００に含まれ得る光学システム３００の一部を示している。図３の光学システム３００は、光が対物レンズ３２２と焦点領域３２６との間で遭遇し得る屈折率に基づいて、複数の領域に分割されている。特に、光は焦点領域３２６から到来して、対物レンズ３２２に入るように描かれているので、図３に示されているような対物レンズ３２２は、収集用対物レンズであり得る（たとえば、図１の１２２及び／又は図２の２２２）。光学系は全般的に可逆的であるため、図３に関して説明した原理は、照明ビーム及び照明用対物レンズにも同様に適用できることを理解されたい。

【0063】

対物レンズ３２２は、第１の屈折率ｎ_１を有している第１の媒体３４０に配置されている。ＳＩＭレンズ３１６は、第２の屈折率ｎ_２を有している材料で製造されている。ＳＩＭレンズ３１６は、第３の屈折率ｎ_３を有している領域３１２から第１の媒体３４０を分離させる。収集された光は、領域３１２内にある焦点領域３２６から到来して、ＳＩＭレンズ３１６を通過して第１の媒体３４０へ入り、次に対物レンズ３２２に入ってよい。表現を容易にするために、焦点領域３２６は焦点として示されているが、いくつかの実施形態では、非点焦点領域が使用され得ることを理解されたい。

【0064】

領域３１２は、同一（又は類似の）屈折率を有する光学システムの複数のコンポーネントを表していてよい。たとえば、領域３１２は、浸漬流体、サンプルホルダ及びサンプルを表していてよい。これらのコンポーネントは、全般的に同等の屈折率を有している可能性があるため（又はそれらの屈折率が類似している可能性があるため）、これらの材料間を通過するときに光は全般的に有意な量の屈折をしない可能性がある。明確にするために、これらのコンポーネントは単一の領域３１２として示されている。

【0065】

焦点領域３２６によって提供され、対物レンズ３２２に入る、収集された光を表すために、３つの光線が使用される。焦点領域３２６から対物レンズ３２２の中心まで延びる中心光線及び焦点領域３２６から、光を受け取る対物レンズ３２２の縁部上の最も遠い点まで延びる２つの周辺光線が示されている。図３の実施形態では、対物レンズ３２２は、（たとえば、全般的に円形による）半径方向の対称性を有していてよく、したがって、中心光線と周辺光線との間の開きは、角度θによって特徴付けられてよい。

【0066】

対物レンズは、以下の式１によって与えられ得る、その開口数ＮＡによって定義され得る。
ＮＡ＝ｎ＊ｓｉｎ（θ） 式１

【0067】

第１の媒体３４０は、光学システム３００が配置されている周囲環境を表していてよい。たとえば、第１の媒体３４０は、光学システム３００が配置されている部屋の空気を表していてよい。第１の媒体３４０が空気である実施形態では、第１の屈折率ｎ_１は約１であり得る。対物レンズは、空気対物レンズであってよく、また、対物レンズは、以下の式２によって与えられるように、空気によって囲まれていることに基づいて、特定のＮＡを有することができる。
ＮＡ_ａｉｒ＝ｎ_１＊ｓｉｎ（θ） 式２

【0068】

ｎ_１は約１であり得るので、対物レンズのＮＡ_ａｉｒは角度θに基づいていてよい。しかし、対物レンズの有効開口数ＮＡ_ｅｆｆは、光と焦点領域３２６との相互作用に基づいていてよく、これは、以下の式３によって表されてよい。
ＮＡ_ｅｆｆ＝ｎ_３＊ｓｉｎ（θ） 式３

【0069】

領域３１２の屈折率は、全般的に、媒体３４０の屈折率よりも大きい場合があるので（たとえば、ｎ_３＞ｎ_１）、有効開口数は、対物レンズの指定された開口数と比較して増加し得る。これは、焦点領域３２６が媒体３４０と同等の屈折率を有する領域に位置する場合と比較して、画像解像度の増加等の性能の向上を生じさせる可能性がある。

【0070】

いくつかの実施形態では、約１乃至１．５６の屈折率ｎ_３を有する浸漬流体３１２が選択されてよい。たとえば、浸漬流体として空気を使用すると、約１の屈折率を与えることができ、水は約１．３３の屈折率を与えることができ、ケイ皮酸エチルは約１．５６の屈折率を与えることができる。いくつかの例では、材料を混合して、浸漬流体において異なる屈折率を達成することができる。たとえば、約１．３３の屈折率は水のみであってよく、約１．４４の屈折率は６０％のＴＤＥ（２，２’－チオジエタノール）／４０％の水であってよく、約９０％の屈折率は９０％のＴＤＥ／１０％の水であってよい。

【0071】

ＳＩＭレンズ３１６は次のように湾曲させられていてよい。すなわち、焦点領域３２６と対物レンズ３２２との間を移動する光線が、それらが領域３１２からＳＩＭレンズ３１６の材料へ通過するときに、又は、それらがＳＩＭレンズ３１６の材料から媒体３４０へ通過するときに、屈折しないように湾曲させられていてよい。ＳＩＭレンズ３１６の第１の表面が、媒体３４０と接触するように配置されていてよく、他方で、第１の表面と反対側のＳＩＭレンズの第２の表面は、領域３１２と接触して（たとえば浸漬流体と接触して）配置されていてよい。

【0072】

焦点を焦点領域３２６（又は、対物レンズ３２２までの距離と比較してそれが点と見なされ得るほど十分に小さい焦点領域）として示す図３の実施形態では、ＳＩＭレンズ３１６は、球体の曲率に従う表面を有していてよい。たとえば、第２の表面は、焦点からＳＩＭレンズ３１６の第２の表面までの距離である曲率半径Ｒを有していてよい。第１の表面は、焦点からＳＩＭレンズ３１６の第１の表面までの距離である曲率半径Ｒ’を有していてよい。距離Ｒ及びＲ’は、ＳＩＭレンズ３１６の厚さによって異なっていてもよい。たとえば、ＳＩＭレンズ３１６が２ｍｍの厚さであり、第１の表面が焦点領域から１７ｍｍである場合には、第１の表面は１７ｍｍの曲率半径を有していてよく、第２の表面は１５ｍｍの曲率半径を有していてよい。いくつかの実施形態では、焦点領域は正確な点ではない場合があり、したがって、曲率半径（たとえば、距離）は、視野と比較して曲率半径を大きくするように部分的に選択されてよく、したがって、これは、正確な焦点からではない光の回折による収差の影響を減少させ得る。

【0073】

各表面の曲率半径は、焦点領域３２６までの距離に基づいているので、焦点領域３２６から延びる光線は、湾曲表面の半径に追従していてよく、９０°の角度で表面と交差していてよい。光線の入射角は、ＳＩＭレンズ３１６の両方の表面の作業領域を横切って表面に垂直であり得るので、ＳＩＭレンズ３１６の材料に出入りするときの光の屈折は最小であり得る。

【0074】

対物レンズが半径方向の対称性を有する（たとえば、円形である）実施形態では、ＳＩＭレンズ３１６は、球殻の一部であり得る。いくつかの実施形態では、ＳＩＭレンズ３１６の表面は、ＳＩＭレンズ３１６を通過する光の断面に基づいて、より複雑な幾何学的形状を有していてよく、これは、したがって、光の提供／収集を伴う光路に基づいてよい。たとえば、光がライトシートの一部であり、ここで第１の軸に沿った開口数が、第１の軸に直交する第２の軸に沿った開口数とは異なる場合、ＳＩＭレンズ３１６の表面は、球体ではなく楕円体の形状に従ってよい。

【0075】

いくつかの実施形態では、光学システムは、別々に最適化及び成形され得る２つ以上のＳＩＭレンズ（たとえば、照明用ＳＩＭレンズ及び収集用ＳＩＭレンズ）を含み得る。たとえば、第１のＳＩＭレンズは、焦点領域から第１の距離Ｒ１である第１の表面と、焦点領域から第２の距離Ｒ１’である第２の表面とを有し得る。第２のＳＩＭレンズは、焦点領域から第３の距離Ｒ２である第１の表面と、焦点領域から第４の距離Ｒ２’である第２の表面とを有していてよい。距離の少なくとも１つの対が互いに調和しない場合がある（たとえば、Ｒ１≠Ｒ２及び／又はＲ１’≠Ｒ２’）。したがって、距離のいずれもが互いに等しくない場合、第１のＳＩＭレンズの第１の表面は第１の曲率半径を有していてよく、第１のＳＩＭレンズの第２の表面は第２の曲率半径を有していてよく、第２のＳＩＭレンズの第１の表面は第３の曲率半径を有していてよく、第２のＳＩＭレンズの第２の表面は第４の曲率半径を有していてよい。第１の曲率半径、第２の曲率半径、第３の曲率半径及び第４の曲率半径は互いに等しくない場合がある。

【0076】

いくつかの実施形態では、照明光及び収集光の波面は、他の方法で異なる場合があり、第１のＳＩＭレンズ及び第２のＳＩＭレンズの形状もそれに応じて異なる場合がある。たとえば、第１のＳＩＭレンズは、円筒形光学系を使用する照明経路に沿っていてよく、他方で、第２のＳＩＭレンズは、円形光学系を使用する収集経路に沿っていてよい。したがって、第１のＳＩＭレンズは、全般的に、照明光の波面に調和するように円筒形であり得るが、第２のＳＩＭレンズは、全般的に、球殻セクションであり得る。いくつかの実施形態では、２つのＳＩＭレンズは、異なるサイズであってよい。たとえば、第１のＳＩＭレンズは第１の直径を有していてよく、第２のＳＩＭレンズは第１の直径とは異なる第２の直径を有していてよい。

【0077】

図４は、本開示のいくつかの実施形態による光学システムの概略図である。光学システム４００は、収集経路に沿ってＳＩＭレンズ４１６を使用するが、照明経路に沿ってＳＩＭレンズを使用しないシステムを表している。光学システム４００は、図１の光学システム１００内の同様のコンポーネントに概ね類似するコンポーネントを含み得る。簡潔にするために、図１に関して前述した特徴及び動作は、図４に関して繰り返されない。

【0078】

光学システム４００は、サンプル４０６に向けて照明ビーム４２４を配向する照明用対物レンズ４２２含む。サンプル４０６は、浸漬チャンバ４１０内に収容された浸漬流体４１２内に配置されていてよい。図４の実施形態では、照明ビーム４２４は、浸漬チャンバ４１０の壁を通過してサンプル４０６に到達することができる。浸漬チャンバ４１０の壁は、透明であるものとするとよく、及び／又は、照明ビーム４２４が通過することを可能にするために、窓が配置されているものとするとよい。

【0079】

サンプル４０６からの収集された光４２５は、浸漬流体４１２を通過し、浸漬流体４１２と収集用対物レンズ４２８との間に配置されているＳＩＭレンズ４１６を通って浸漬チャンバ４１０を離れてよい。ＳＩＭレンズ４１６は、第１の湾曲表面と、第１の湾曲表面の反対側にある第２の湾曲表面とを有しており、これらは両方とも、ＳＩＭレンズ４１６と交差する、収集された光４２５の波面に調和するように成形されている。したがって、浸漬流体４１２とＳＩＭレンズ４１６の材料との間（及びＳＩＭレンズ４１６の材料と浸漬チャンバ４１０の外側の周囲環境との間）に屈折率の不調和があり得るとしても、収集された光４２５がＳＩＭレンズ４１６を通過するとき、収集された光４２５の屈折がない（又は屈折が最小である）可能性がある。チューブレンズ４３０は、収集用対物レンズ４２８からの光を検出器４３２に集束させて、サンプル４０６の画像を生成することができる。

【0080】

図５は、本開示のいくつかの実施形態による、交換可能な対物レンズマウントを備えた光学システムの概略図である。図５の光学システム５００は、光学システム５００が、交換可能な対物レンズマウント５２９に取り付けられたいくつかの収集用対物レンズ５２８ａ乃至５２８ｃを有することを除いて、図１の顕微鏡１０２と概ね同様であり得る。簡潔にするために、図１に関して以前に説明された特徴及びコンポーネントは、図５に関して再び説明されないだろう。

【0081】

光学システム５００は、いくつかの対物レンズ５２８ａ乃至５２８ｃが取り付けられている交換可能な対物レンズマウント５２９を含む。たとえば、対物レンズ５２８ａ乃至５２８ｃは、市販の対物レンズであってよく、スレッディング等の標準的な取り付け装置を有していてよい。交換可能な対物レンズマウント５２９は、（たとえば、手動及び／又は自動のいずれかで）移動して、マウントされた対物レンズ５２８ａ乃至５２８ｃの１つを収集経路に沿って配置することができる。たとえば、交換可能な対物レンズマウント５２９は、第１の位置、第２の位置及び第３の位置の間で移動可能であり得る。第１の位置では、対物レンズ５２８ａは、焦点領域５２６から（たとえば、ＳＩＭレンズ５１６を介して）光を受け取り、その受け取った光を（たとえば、収集用光学系５３０を介して）検出器に提供し、他方で、対物レンズ５２８ｂ及び５２８ｃは光学システムの収集経路に沿っていない。第２の位置では、対物レンズ５２８ｂは収集経路に沿っていてもよく、他方で対物レンズ５２８ａ及び５２８ｃはそうではない、等々である。いくつかの実施形態では、交換可能な対物レンズマウントは、位置間で回転することができるタレット（市販の顕微鏡対物レンズタレット等）であってよい。いくつかの実施形態では、交換可能な対物レンズマウント５２９は、１つ又は複数の「開」位置を有し得る。

【0082】

異なる特性を有する対物レンズが、異なる画像化の必要性（又は予想される画像化モード）に基づいて、交換可能な対物レンズマウント５２９にマウントされていてよい。たとえば、異なる対物レンズ５２８ａ乃至５２８ｃのそれぞれは、開口数及び／又は倍率等の異なる光学特性を有していてよい。たとえば、第１の対物レンズ５２８ａは、倍率が１０倍の対物レンズ（ＮＡ＝０．２１）であってよく、第２の対物レンズ５２８ｂは、倍率が２０倍の対物レンズ（ＮＡ＝０．３５）であってよい。いくつかの実施形態では、サンプルによって放出され得る異なる蛍光波長を画像化するのに有用であり得る異なるフィルタ等の追加の光学系が、交換可能な対物レンズマウント５２９に含まれていてよい。たとえば、第１の対物レンズ５２８ａは、第１の蛍光体の発光波長を含む第１のフィルタを有していてよく、第２の対物レンズ５２８ｂは、第２の蛍光体の発光波長を含む第２のフィルタを有していてよい。

【0083】

図６は、本開示のいくつかの実施形態による、サンプルを画像化する方法のフローチャートである。方法６００は、本明細書に記載の光学システムのうちの１つ又は複数によって実施されてよい。

【0084】

この方法は、全般的に、光源で照明光を生成することを説明するボックス６１０から開始されてよい。光源（たとえば、図１の場合には光源１１８）は、コヒーレント光源又は非コヒーレント光源であってよく、また、比較的広い又は狭い帯域幅にわたって光を生成してよい。

【0085】

ボックス６１０には、全般的に、ボックス６２０が続いてよく、ボックス６２０は、照明経路に沿って、第１の対物レンズを通ってサンプルに向けて照明光を配向することを説明している。１つ又は複数の照明用光学系（たとえば、図１の１２０）を使用して、光源からの照明光を第１の対物レンズに結合することができる。いくつかの実施形態では、ボックス６２０のステップは、照明用光学系を用いて照明光の１つ又は複数の特性を変更することを含み得る。たとえば、ボックス６２０は、光のフィルタリング、（たとえば、ライトシートへの）光の再成形、光の分割、光の結合又はそれらの組合せを含み得る。第１の対物レンズは、照明用対物レンズ（たとえば、図１の１２２）であってよく、サンプルの焦点領域に向けられる照明ビームを生成し得る。

【0086】

ボックス６２０の後には、全般的に、照明光を、ソリッドイマージョンメニスカスレンズ（ＳＩＭレンズ）を通過させて浸漬流体に入れることを説明するボックス６３０が続いてよい。ＳＩＭレンズ（たとえば、図１の１１４）は、浸漬チャンバの壁に沿って配置されよく、浸漬チャンバへの窓として機能してよい。第１の対物レンズは、浸漬流体の外側の周囲環境に配置されてよい。ＳＩＭレンズは、それぞれが照明光の波面と調和し得る第１の湾曲表面と第２の湾曲表面とを有していてよい。浸漬流体に入った後、照明光は浸漬流体を通過し、サンプルホルダの材料に入り、サンプルホルダからサンプルへ入ることができる。いくつかの実施形態では、浸漬流体、第１のＳＩＭレンズ及び周囲環境はすべて、異なる屈折率を有し得る。

【0087】

ボックス６３０には、全般的に、ボックス６４０が続いてよく、ボックス６４０は、収集された光を、収集経路に沿って、第２のＳＩＭレンズを通って、浸漬流体から第２の対物レンズに通すことを説明する。収集経路は、焦点領域から発生してよい。収集経路に沿った光は、焦点領域でのサンプルからの反射、散乱、放出又はそれらの組合せであり得る。収集された光は、サンプル及びサンプルホルダを通過して浸漬流体へ入ってよい。収集された光は、第２のＳＩＭレンズを通過することによって浸漬流体を出ることができる。第２のＳＩＭレンズは、第１の湾曲表面と、第１の湾曲表面の反対側にある第２の湾曲表面とを有し得る。湾曲表面のそれぞれは、収集経路に沿った光の波面と調和し得る。したがって、収集された光が浸漬流体からＳＩＭレンズの材料を通って、第２の対物レンズを含む周囲環境へ通過するとき、最小の屈折が存在し得る（又は屈折が存在しない）。いくつかの実施形態では、浸漬流体、第２のＳＩＭレンズの材料及び周囲環境はすべて、異なる屈折率を有していてよい。いくつかの実施形態では、第２のＳＩＭレンズの材料は、第１のＳＩＭレンズの材料と同等の屈折率を有していてよい。いくつかの実施形態では、第１のＳＩＭレンズ及び第２のＳＩＭレンズは、同一の材料から作製されてよい。

【0088】

ボックス６４０には、全般的に、第２の対物レンズで、サンプルからの収集された光を受け取ることを説明するボックス６５０が続いてよい。第２の対物レンズは、収集された光を検出器に提供してよい。第２の対物レンズと検出器との間の１つ又は複数の収集用光学系は、方向、波長、ビーム形状及びそれらの組合せ等の光の１つ又は複数の特性を変更することができる。

【0089】

方法６００は、収集された光が検出器に到達した後に、収集された光に基づいてサンプルを画像化することを含み得る。いくつかの実施形態では、方法６００は、サンプルホルダを移動させて、サンプルに対して相対的に焦点領域を移動させることを含み得る。いくつかの実施形態では、この方法は、サンプルを支持するサンプルホルダの第１の側面とサンプルホルダの第２の側面との間の軸線に沿ってサンプルホルダを移動させて、画像の深度スタックを生成することを含み得る。

【0090】

いくつかの実施形態では、方法６００は、浸漬流体の屈折率をサンプル又はサンプルホルダの屈折率に調和させることを含み得る。たとえば、サンプルホルダの屈折率が既知である場合、サンプルホルダの屈折率に調和する浸漬流体を選択することができ、方法６００は、選択された浸漬流体で浸漬チャンバを満たすことを含み得る。いくつかの実施形態では、サンプル、サンプルホルダの材料及び浸漬流体の屈折率は、互いに調和し得る。

【0091】

当然、本明細書に記載の例、実施形態又はプロセスのいずれか１つを、１つ又は複数の他の例、実施形態及び／又はプロセスと組み合わせることができ、又は、本システム、デバイス及び方法に従って、別個のデバイス又はデバイス部分間で分離及び／又は実行することができることを理解されたい。

【0092】

「頂部」及び「側面」のような用語は、説明を容易にするために使用され、様々なコンポーネントの相対的な位置を示すことのみを意味することを理解されたい。他の実施形態は、コンポーネントの他の配置を使用することができる。特定の波長の光に関して、様々なコンポーネント及び動作を説明することができる。他の波長（可視スペクトル外の波長等）が使用され、本明細書で使用される光が任意の電磁放射を表し得ることを理解されたい。特定の材料を、それらの光学特性（たとえば、透過性）の観点から説明することができ、システムによって使用される光の任意の波長に対して、所望の特性を有する材料を選択できることを理解されたい。

【0093】

最後に、上記の議論は、本システムを単に例示することを意図しており、添付の特許請求の範囲を任意の特定の実施形態又は実施形態のグループに限定するものとして解釈されるべきではない。したがって、本システムは、例示的な実施形態を参照して特に詳細に説明されてきたが、以下の特許請求の範囲に記載されている本システムのより広い、意図された精神及び範囲から逸脱することなく、当業者によって多数の修正及び代替の実施形態が考案され得ることも理解されたい。したがって、明細書及び図面は、例示的な方法で見なされるべきであり、添付の特許請求の範囲を限定することを意図するものではない。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】