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▶ ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティーの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-05-20
(45)【発行日】2024-05-28
(54)【発明の名称】操作されたＢ型肝炎コアポリペプチド
(51)【国際特許分類】
C07K 19/00 20060101AFI20240521BHJP
C07K 14/02 20060101ALI20240521BHJP
C12N 7/01 20060101ALI20240521BHJP
A61K 9/48 20060101ALN20240521BHJP
C12N 15/36 20060101ALN20240521BHJP
C12N 15/62 20060101ALN20240521BHJP
【ＦＩ】
C07K19/00
C07K14/02 ZNA
C12N7/01
A61K9/48
C12N15/36
C12N15/62 Z
【請求項の数】
12
(21)【出願番号】P 2021538029
(86)(22)【出願日】2019-12-23
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-03-28
(86)【国際出願番号】 US2019068370
(87)【国際公開番号】W WO2020139843
(87)【国際公開日】2020-07-02
【審査請求日】2022-12-21
(31)【優先権主張番号】62/785,866
(32)【優先日】2018-12-28
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(73)【特許権者】
【識別番号】515158308
【氏名又は名称】ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティー
(74)【代理人】
【識別番号】100114557
【弁理士】
【氏名又は名称】河野 英仁
(74)【代理人】
【識別番号】100078868
【弁理士】
【氏名又は名称】河野 登夫
(72)【発明者】
【氏名】シュヴァルツ，ジェームス アール．
(72)【発明者】
【氏名】マシュー，リンチュー
(72)【発明者】
【氏名】ロービー，マーカス ジョン
(72)【発明者】
【氏名】長澤 茉耶
【審査官】山▲崎▼ 真奈
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１４－５２７０７２（ＪＰ，Ａ）
【文献】米国特許出願公開第２００９／０２２６５２５（ＵＳ，Ａ１）
【文献】特表２０１６－５０７５２０（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２００８－５００３６４（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２００１／００２５５１（ＷＯ，Ａ２）
【文献】特開２００８－０７４８６７（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２００４－５００８６８（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１０／０４２７４３（ＷＯ，Ａ２）
【文献】特表平１１－５０４８０１（ＪＰ，Ａ）
【文献】Izzat Fahimuddin Bin Mohamed Suffian et al.，Biomaterials，2017年，Vol. 120，pp. 126-138
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ
Ａ６１Ｋ
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
Ｂ型肝炎コアタンパク質（ＨＢｃ）ポリペプチドであって、
カルボキシ末端でのカーゴローディングドメインを含んでおり、
前記カーゴローディングドメインが、（配列番号４）ＥＧＦＧＥＧＦＧＥＧＦ、（配列番号５）ＥＧＦＧＥＧＦＧＥＧＦＣ、（配列番号６）ＩＧＩＧＣ、及び（配列番号７）ＩＧＩＧＩＣから選択される、
ＨＢｃポリペプチド。
【請求項2】
前記カーゴローディングドメインの前または後に、Ｃ末端ポリヒスチジンタグをさらに含む、請求項１に記載のＨＢｃポリペプチド。
【請求項3】
元になるアミノ酸配列が配列番号１に示されるアミノ酸配列である場合、アミノ酸置換Ａ１３１Ｋを伴う、請求項１または２に記載のＨＢｃポリペプチド。
【請求項4】
元になるアミノ酸配列が配列番号１に示されるアミノ酸配列である場合、［Ｄ２９Ｃ、Ｒ１２７Ｃ］、［Ｔ１０９Ｃ、Ｖ１２０Ｃ］、［Ｙ１３２Ｃ、Ｎ１３６Ｃ］、［Ｙ１３２Ｃ、Ａ１３７Ｃ］、［Ｒ１３３Ｃ、Ｎ１３６Ｃ］、［Ｒ１３３Ｃ、Ａ１３７Ｃ］、［Ｐ１３４Ｃ、Ｐ１３５Ｃ］、［Ｐ１３４Ｃ、Ｎ１３６Ｃ］、［Ｐ１３４Ｃ、Ａ１３７Ｃ］、および［Ｐ１３５Ｃ、Ｎ１３６Ｃ］から選択される１つ以上のアミノ酸置換をさらに含む、請求項１～３のいずれか一項に記載のＨＢｃポリペプチド。
【請求項5】
元になるアミノ酸配列が配列番号１に示されるアミノ酸配列である場合、前記アミノ酸置換は、［Ｄ２９Ｃ、Ｒ１２７Ｃ、Ｐ１３４Ｃ、Ｎ１３６Ｃ］である、請求項４に記載のＨＢｃポリペプチド。
【請求項6】
元になるアミノ酸配列が配列番号１に示されるアミノ酸配列である場合、アミノ酸置換［Ｑ５７Ｖ、Ｌ６０Ｓ、Ｇ６３Ｒ、Ｄ６４Ｅ、Ｌ６５Ｖ、Ｍ６６Ｔ、Ｔ６７Ｄ、Ｌ６８Ｆ、Ａ６９Ｇ、Ｔ７０Ｄ、Ｔ７４Ｎ、Ｌ７６Ｍ、Ｅ７７Ｑ、Ｐ７９Ｑ、Ｓ８１Ａ、Ｓ８７Ｎ、Ｔ９１Ａ、Ｖ９３Ｉ、Ｆ９７Ｉ］、または［Ｔ７４Ｎ、Ｌ７６Ｍ、Ｅ７７Ｑ、Ｐ７９Ｑ、Ｓ８１Ａ］をさらに含む、請求項４または５に記載のＨＢｃポリペプチド。
【請求項7】
少なくとも１つの非天然アミノ酸をさらに含む、請求項１～６のいずれか一項に記載のＨＢｃポリペプチド。
【請求項8】
前記非天然アミノ酸は、クリックケミストリー反応のための反応基を提供する、請求項７に記載のＨＢｃポリペプチド。
【請求項9】
前記非天然アミノ酸は、アジドホモアラニン、ホモプロパルギルグリシン、ｐ－アセチル－Ｌ－フェニルアラニン、またはｐ－アジド－Ｌ－フェニルアラニンである、請求項８に記載のＨＢｃポリペプチド。
【請求項10】
前記非天然アミノ酸にコンジュゲートされた１つ以上の追加の部分をさらに含む、請求項９に記載のＨＢｃポリペプチド。
【請求項11】
請求項１～１０のいずれか一項に記載のＨＢｃポリペプチドからなるＶＬＰ。
【請求項12】
カプセル化されたカーゴを含む、請求項１１に記載のＶＬＰ。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【0001】
ウイルス様粒子（ＶＬＰ）は非感染性であり、高い表面密度を有する分子を提示することができる反復表面を有し、天然ウイルスと比較して同等の細胞取り込みおよび細胞内輸送を有する。これらの機能的属性のすべてのため、ＶＬＰは、ワクチン、診断、および治療薬の組織化コア（ａｓｓｅｍｂｌｙ ｃｏｒｅ）として魅力的である。これらは、核酸、タンパク質、および他の化学部分の提示のための多価足場として潜在的に機能することができる。ＶＬＰは、インビボ安定性、リンパ節への輸送、ならびに提示されたエピトープによるＢ細胞およびＴ細胞応答の刺激を提供するため、ワクチンとして特に魅力的である。ＶＬＰは、カーゴを充填して送達ビヒクルとして役立つこともできる。
【0002】
無細胞タンパク質合成（ＣＦＰＳ）は、ＶＬＰ、例えば、Ｂ型肝炎コアタンパク質（ＨＢｃ）、ＭＳ２バクテリオファージコートタンパク質、およびＱβバクテリオファージコートタンパク質などを含むものを産生するための有効な方法であり得る。ＣＦＰＳはまた、タンパク質中に非天然アミノ酸（ｎｎＡＡ）を導入するための容易な手段を提供し、これにより、Ｃｕ（Ｉ）触媒［３＋２］シクロ付加クリックケミストリーを使用して、抗原のＶＬＰへの直接タンパク質－タンパク質カップリングを可能にする。
【0003】
異なるタイプのＶＬＰの中で、ＨＢｃ ＶＬＰは、外来ペプチド配列のナレッジベースの提示のための柔軟で有望なモデルである。ＨＢｃ粒子は、１９８６年に有望なＶＬＰ担体として最初に報告された。第１のＶＬＰ候補の１つであり、第１の正２０面体ＶＬＰ担体であるＨＢｃ ＶＬＰは、１００を超える異なる外来配列の担体として十分に特徴付けられ、広く使用されている。ＨＢｃキャプシドタンパク質は、１８３～１８５アミノ酸長である。ＨＢｃタンパク質のアルギニンリッチＣ末端は、ＶＬＰ組織化に必ずしも必要ではなく、アミノ酸１４９で切断されたＨＢｃタンパク質が広く使用される。切断されたＨＢｃ（１～１４９）タンパク質は、３０～３５ｎｍの平均直径、およびＴ＝４の優性の正２０面体対称性を有する粒子に自己組織化することができる。
【0004】
改善されたカーゴローディングを提供するためのコアタンパク質の操作および組織化方法は、非常に関心があるものであり、本明細書で扱われる。
【発明の概要】
【0005】
遺伝子修飾されたＢ型肝炎コア（ＨＢｃ）タンパク質が提供され、これらのタンパク質は、ＨＢｃタンパク質のカルボキシ末端にカーゴローディングドメインを付加することを含む、タンパク質の安定性および／または有用性を増強する配列修飾を含む。本明細書に記載される修飾は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、タンパク質、化学療法薬などの小分子などを含むが、これらに限定されない治療用カーゴをＶＬＰにローディングすることを可能にする。ローディングは、疎水性またはイオン対合吸引を利用してもよい。任意選択で、カーゴは、ジスルフィド結合によってＶＬＰの内部に結合される。
【0006】
カーゴをローディングしたＶＬＰを産生するための方法が提供される。カーゴは、ＨＢｃタンパク質、例えば、本明細書に開示される修飾ＨＢｃタンパク質を含有する溶液に添加され、溶液のイオン強度の増加によって誘導される、同時の薬物ローディングおよびＶＬＰ組織化を可能にする。カーゴをローディングしたＶＬＰが精製および安定化された後、それらは、血清半減期を増強させるための部分、例えば、ＰＥＧなどを含む、異なる機能を付与する分子、特定の細胞標的化部分、例えば、一本鎖抗体断片、アプタマー、細胞表面受容体のリガンドなどを含むが、これらに限定されないタンパク質を表面に同時に付着させることによってさらに修飾され得る。いくつかの実施形態では、標的化部分は、ＶＬＰを癌細胞に標的化する。いくつかの実施形態では、標的化部分は、ＶＬＰを、感染細胞、例えば、病原体感染細胞に標的化する。
【0007】
本明細書に記載される修飾ＨＢｃタンパク質を含むＶＬＰは、０．５ＭのＮａＣｌ溶液中で自己組織化することができる。いくつかの実施形態では、ローディング中にカーゴ溶解度を維持するために、ＶＬＰ組織化は、有機溶媒の存在下で、例えば、約０．５％～約２０％、例えば、少なくとも約５％、少なくとも約１０％および約２０％以下、約１５％以下のＤＭＳＯ、ＤＭＦなどの有機溶媒の存在下で実施される。非イオン性界面活性剤も、例えば、約０．０１％～約１％、例えば約０．１％の濃度で、ｔｗｅｅｎ－２０なども含めることができる。組織化後、ＶＬＰは、ジアミンなどの軽度の酸化剤で処理される。酸化後、ジスルフィド結合は、通常の生理食塩水および同等の賦形剤中で安定である。ジスルフィド結合が還元された後、例えば、細胞によって取り込まれると、ＶＬＰは低イオン性溶液中で分解する。この条件付き安定化は、細胞質に存在する還元条件下での治療用カーゴの放出を可能にする。
【0008】
いくつかの実施形態では、配列番号１、配列番号２、または同等のＨＢｃポリペプチドに示される配列は、残基Ａ１３１における塩基性アミノ酸、例えば、Ｈ、Ｋ、Ｒへのアミノ酸置換によって修飾され、いくつかの実施形態では、置換は、Ａ１３１Ｋである。この修飾は、一般に、配列番号１または配列番号２と比較して、タンパク質の「スパイク先端」、すなわち、残基７３～８１の領域上の負の電荷を低減する一連のアミノ酸置換と組み合わせて行われる。いくつかの実施形態では、配列番号１または配列番号２と比較した一連のアミノ酸変化は、Ｉ５７Ｖ、Ｌ６０Ｓ、Ｇ６３Ｒ、Ｄ６４Ｅ、Ｌ６５Ｖ、Ｍ６６Ｔ、Ｔ６７Ｄ、Ｌ６８Ｆ、Ａ６９Ｇ、Ｔ７０Ｄ、Ｔ７４Ｎ、Ｌ７６Ｍ、Ｅ７７Ｑ、Ｐ７９Ｑ、Ｓ８１Ａ、Ｓ８７Ｎ、Ｔ９１Ａ、Ｖ９３Ｉ、およびＦ９７Ｉである。いくつかの実施形態では、一連のアミノ酸変化は、Ｔ７４Ｎ、Ｌ７６Ｍ、Ｅ７７Ｑ、Ｐ７９Ｑ、およびＳ８１Ａである。いくつかの実施形態では、低減された負の電荷を有するＨＢｃタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号３である。この一連の先端置換は、組織化に必要なイオン強度、例えば、約１．５ＭのＮａＣｌまで増加することが見出されている。Ａ１３１置換の包含は、組織化に必要なイオン強度を低減し、例えば、１Ｍ未満、０．７５Ｍ未満、０．５Ｍ未満、および０．２５Ｍ未満であり得る。
【0009】
カーゴをローディングするために、ＨＢｃタンパク質は、末端、通常はＣ末端にカーゴローディングドメインを付加することによってさらに修飾され得る。カーゴローディングドメインの選択は、意図されたカーゴの性質に基づいてもよい。例示的なカーゴローディングドメインは、少なくとも１つであり、通常は１５以下のアミノ酸長、例えば、少なくとも２、少なくとも３、および最大１２、最大１０、最大８のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、カーゴローディングドメインは、１つのシステイン残基を含む。カーゴの分子サイズが２ｎｍ未満であるいくつかの実施形態では、システインがカーゴローディングドメインに提供され、カーゴは、遊離スルフドリルを有するように選択されるか、または遊離スルフヒドリルを導入するように修飾される。
【0010】
例示的なカーゴローディングドメインとしては、（配列番号４）ＥＧＦＧＥＧＦＧＥＧＦ、（配列番号５）ＥＧＦＧＥＧＦＧＥＧＦＣ、（配列番号６）ＩＧＩＧＣ、（配列番号７）ＩＧＩＧＩＣ、ＲＲＲ、Ｒ、ＩＩＩＣ、Ｃ、ＣＲＣ、ＥＥＥなどが挙げられるが、これらに限定されない。本明細書で提供される方法を使用して、カーゴローディングドメインのための配列を経験的に選択して、ＶＬＰあたりのローディング分子の数を最大化し、タンパク質分解による損失を回避しながら、ＶＬＰサブユニットの効果的な産生（蓄積、折り畳み、および精製）およびＶＬＰへの効果的なサブユニットの組織化を可能にすることができる。
【0011】
ＨＢｃタンパク質は、所定の部位に１つ以上の非天然アミノ酸をさらに含むことができる。関心対象の非天然アミノ酸は、アジドホモアラニン、ホモプロパルギルグリシン、ｐ－アセチル－フェニルアラニン、ｐ－エチニル－フェニルアラニン、ｐ－プロパルギルオキシフェニルアラニン、ｐ－アジド－フェニルアラニンなどを含むが、これらに限定されない。非天然アミノ酸は、ＨＢｃタンパク質のスパイクに位置付けられ得る。関心対象の部位は、例えば、Ｎ７５、Ｔ７４、Ｌ７６、Ｑ７７、Ｄ７８、Ｑ７９、およびＡ８０を含む。いくつかの実施形態では、非天然アミノ酸は、Ａ８０を置き換える。いくつかの実施形態では、非天然アミノ酸は、アジドホモアラニンである。
【0012】
ＨＢｃポリペプチド、またはそこから生成されるＶＬＰは、ＨＢｃポリペプチド以外のコンジュゲート部分を含んでもよく、かかる部分は、例えば、クリックケミストリーによって、導入された非天然アミノ酸でＨＢｃにコンジュゲートされる。好適な部分としては、ポリペプチド、核酸、多糖類、治療薬、イメージング部分などが挙げられる。関連する実施形態では、ＨＢｃ中の非天然アミノ酸は、クリックケミストリー反応において利用されて、本発明のＨＢｃ、または本発明のＨＢｃを含むＶＬＰに追加の部分を結合する方法が提供される。
【0013】
本発明のＨＢｃポリペプチドは、宿主細胞を、ポリペプチドをコードする核酸で形質転換し、宿主細胞を培養し、培養物からポリペプチドを回収することによって、または代替的に、ＨＢｃポリペプチドをコードする核酸構築物を生成し、細胞遊離合成によってポリペプチドを産生することによって作製することができ、この合成は、カップリングされた転写および翻訳反応を含み得る。ＨＢｃポリペプチドをコードするベクターおよびポリヌクレオチドもまた提供される。いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドを含むＶＬＰが提供される。
【0014】
本発明の一実施形態では、本発明のタンパク質の無細胞タンパク質合成（ＣＦＰＳ）のための方法が提供される。いくつかの実施形態では、ＣＦＰＳ生成物は合成され、還元環境でＶＬＰにさらに組織化されてもよい。ＣＦＰＳ生成物は、約１Ｍ～約２Ｍの塩、例えば、約１．５Ｍの塩、例えば、ＮａＣｌなど、の溶液と接触させてもよい。組織化されたＶＬＰは、還元環境中で単離され得る。合成およびＶＬＰへの組織化の後、ＶＬＰは、安定化ジスルフィド結合を生成するために、酸化環境に切り替えられてもよい。
【0015】
本発明は、添付の図面と併せて読む場合に、以下の詳細な説明から最もよく理解される。一般的な実施によれば、図面の様々な特徴は、縮尺通りでないことが強調される。逆に、様々な特徴の寸法は、明確にするために任意に拡大または縮小される。図面には、以下の図が含まれる。
【図面の簡単な説明】
【0016】
【図1】成功した組織化バリアントを示し、スパイク移植修飾と組み合わせたＡ１３１Ｋ変異は、５００～１０００ｍＭのＮａＣｌの有意な組織化を可能にする。誤差バーは、反復実験の平均（ｎ＝３）からの標準偏差を表す。
【図2】Ａ１３１Ｋ ＨｅｐＢｃバリアントの組織化動態を示す。
【図3】Ａ１３１Ｋ ＨｅｐＢｃバリアント（左）および野生型ＨｅｐＢｃ（右）のＴＥＭ画像は、同様のＶＬＰ形態を示す。
【図4】ドキソルビシンおよびローダミン１２３のサイズ推定は、それらが、最大寸法が約２１Åである最大のＶＬＰ孔を通過するために十分に小さいことを示す。
【図5】初期ローディング実験の結果を示す。ＨｅｐＢｃ Ｃ末端ローディングドメインは、左上隅に示され、疎水性および負に荷電した残基の両方を有し、疎水性および正に荷電した制癌薬（ｃａｎｃｅｒ ｄｒｕｇ）模倣物であるローダミン１２３を引き付ける。ＳＥＣクロマトグラムは、良好なＶＬＰ組織化の効率を示し、ＶＬＰあたり約１０００分子のカーゴのローディングが示唆される。
【図6】ローダミン１２３をローディングしたＶＬＰの連続したＳＥＣカラム洗浄は、カーゴがＶＬＰシェルの細孔から漏出することを示す。
【図7】スルフィド部分を示すカーゴ分子のジスルフィド結合保持のためのシステイン残基も含有するＣ末端カーゴローディングドメインを有するＨｅｐＢｃ二量体サブユニットの概略図である。この場合、ローディングドメインは、疎水性カーゴ分子を引き付けるための疎水性残基を含む。サブユニット精製およびエンドソーム回避の誘導に使用されるヘキサヒスチジン伸長もまた示される。
【図8】疎水性カーゴおよびジスルフィド保持のためのＨｅｐＢｃ Ｃ末端ローディングドメインの概略図である。２つの例示的なカーゴ、メルタンシン（ＤＭ１）およびＢＤＦＬ、ならびにそれらの寸法を示す。
【図9】異なるＣ末端カーゴローディング配列を有するＨｅｐＢｃ変異体の還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル自己放射線図である。配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２のカーゴローディングドメイン配列が示される。
【図10】より強力な疎水性相互作用のために塩化ナトリウム濃度を増加させることによって、ＶＬＰ組織化（ＨＰスパイクを有するＨｅｐＢｃサブユニットの場合）を改善する。
【図11】システインを介して小分子染料（Ｂｏｄｉｐｙ ＦＬ－システイン、ＢＤＦＬ）をローディングおよびコンジュゲートすることを示すサイズ排除クロマトグラムである。この分析の前に、ＢＤＦＬをローディングした（およびコンジュゲートした）ＶＬＰを有意な洗浄に供し、ＶＬＰと関連付けられたＢＤＦＬがコンジュゲートされていることを証明した。
【図12】ＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）を含有する溶液中の優れたＶＬＰ組織化を示すＳＥＣクロマトグラムである。
【図13】抗癌薬（ａｎｔｉ－ｃａｎｃｅｒ ｄｒｕｇ）メルタンシンの２５倍モル過剰の存在の有無にかかわらず、１５％ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）を含有する溶液中の優れたＶＬＰ組織化を示すＳＥＣクロマトグラムである。
【図14】高分子治療用カーゴおよび各カーゴのために設計されたローディング／保持機構の概要を示す。
【図15A】２２ｎｔの一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）構築物を示す。スルフヒドリルおよび蛍光タグ（６－ＦＡＭ）で官能基化されている。
【図15B】２２ｎｔの一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）構築物を示す。スルフヒドリル、蛍光タグ、および疎水性ローディングタグ（コレステロール）で官能基化されている。
【図16】ＨｅｐＢｃ（Ｃｙｓ）上のニュートラルローディングドメインを使用した一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）のローディングを表す。サイズ排除クロマトグラムは、ＶＬＰおよびｓｓＤＮＡ濃度を示す。上のチャートは、完全なｓｓＤＮＡプロファイルであり、下のチャートは、ＶＬＰに関連するｓｓＤＮＡを示すために［ＤＮＡ］座標を縮小している。実験では、ＨｅｐＢｃ ＨＰ Ａ１３１Ｋ ６Ｈをローディングドメイン－Ｃとともに使用した。
【図17】ＨｅｐＢｃ（Ｃｙｓ－Ａｒｇ－Ｃｙｓ）上のイオン対合ローディングドメインを使用した一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）のローディングを表す。サイズ排除クロマトグラムは、ＶＬＰおよびｓｓＤＮＡ濃度を示す。上のチャートは完全なｓｓＤＮＡプロファイルであり、下のチャートは、ＶＬＰに関連付けられたｓｓＤＮＡを示すために［ＤＮＡ］座標を縮小している。実験では、ＨｅｐＢｃ ＨＰ Ａ１３１Ｋ ６Ｈをローディングドメイン－ＣＲＣとともに使用した。
【図18】ＨｅｐＢｃ（Ｉｌｅ－Ｇｌｙ－Ｉｌｅ－Ｇｌｙ－Ｉｌｅ－Ｃｙｓ）上の疎水性ローディングドメインを使用した一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）のローディングを表す。サイズ排除クロマトグラムは、ＶＬＰおよびｓｓＤＮＡ濃度を示す。上のチャートは完全なｓｓＤＮＡプロファイルであり、下のチャートは、ＶＬＰに関連付けられたｓｓＤＮＡを示すために［ＤＮＡ］座標を縮小している。実験では、ＨｅｐＢｃ ＨＰ ２ＡＳＶｉｎｓ ＳＳ１ ＳＳ８ ８０Ｍ ６Ｈをローディングドメイン－ＩＧＩＧＩＣとともに使用した。
【図19】ＨｅｐＢｃ ＶＬＰへのｓｓＤＮＡローディングのアガロースゲル電気泳動分析を示す。ＤＮＡは、付着したフルオロフォアの蛍光によって可視化される。ＤＮＡローディングしたＶＬＰを第１のレーンに適用し、第２のレーンは、ＶＬＰが低減してカーゴを放出した後の結果を示す。３番目のレーンは、比較のためにローディングする前のカーゴを示す。
【図20】様々なＨｅｐＢｃ ＶＬＰバリアントについて、ＶＬＰ当たりのローディングされたｓｓＤＮＡの概要を示す。誤差バーは、反復実験の平均（ｎ＝３）からの標準偏差を表す。
【図21】様々なＨｅｐＢｃ ＶＬＰバリアントについて、ＶＬＰ当たりのローディングされたタンパク質の概要を示す。誤差バーは、反復実験の平均（ｎ＝３）からの標準偏差を表す。
【図22】ＨｅｐＢｃ ＨＰ ＳＳ１ ７８ＡＨＡ ６Ｈを使用して、各ＨｅｐＢｃ ＶＬＰに付着した抗ＰＳＭＡ ＤＮＡアプタマーの数を変化させることを示す。
【図23】ＬＮＣａＰ細胞とのＶＬＰ会合のフローサイトメトリー分析を示す。アプタマーを欠くＶＬＰおよびＰＣ－３細胞で見られるように、いくつかの非特異的結合が存在するが、アプタマーを示すＶＬＰは、ＰＳＭＡ＋ＬＮＣａＰ細胞とより大きく会合する。カウントは、各サンプルについて分析された細胞の数を指す。
【発明を実施するための形態】
【0017】
Ｂ型肝炎コア（ＨＢｃ）タンパク質のカルボキシ末端にカーゴローディングドメインを付加することを含む、タンパク質の安定性および／または有用性を増強する配列修飾を含む、遺伝子修飾されたＨＢｃタンパク質が提供される。本明細書に記載される修飾は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、タンパク質、化学療法薬などの小分子などを含む治療用カーゴを、ＶＬＰにローディングすることを可能にする。ローディングは、疎水性またはイオン対合吸引を利用してもよい。任意選択で、カーゴは、ジスルフィド結合によってＶＬＰの内部に結合される。
【0018】
本発明のＨＢｃポリペプチドは、ＶＬＰ、特にカーゴを封入するために設計されたＶＬＰの成分として特定の用途を見出す。ＶＬＰは、さらに、例えば、クリックケミストリーを通じて１つ以上の追加の部分にコンジュゲートされてもよい。いくつかの実施形態では、非天然アミノ酸を使用して、ＨＢｃタンパク質を追加の部分に連結する。
【0019】
いくつかの実施形態では、本発明は、医薬の製造における本明細書のコンジュゲート、化合物、または組成物の使用を提供する。一実施形態では、本発明は、感染の予防または治療のための医薬、例えばワクチンの製造における、本明細書のコンジュゲート、化合物、または組成物の使用を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、感染の予防または治療のための本明細書のコンジュゲート、化合物、または組成物の使用を提供する。
【0020】
定義
本発明は、説明される特定の方法論、プロトコル、細胞株、動物種または属、および試薬に限定されるものではなく、それら自体は変化し得ることを理解されたい。本明細書で使用される用語は、特定の実施形態のみを説明する目的のためのものであり、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定することが意図されるものではないことも理解されるべきである。
本発明は、説明される特定の方法論、プロトコル、細胞株、動物種または属、および試薬に限定されるものではなく、それら自体は変化し得ることを理解されたい。本明細書で使用される用語は、特定の実施形態のみを説明する目的のためのものであり、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定することが意図されるものではないことも理解されるべきである。
【0021】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用するとき、冠詞「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、別途文脈が明確に指示しない限り、複数の指示対象を含むことに留意されたい。したがって、例えば、「ａ ｃｅｌｌ」への参照は、複数のかかる細胞を含み、「ｔｈｅ ｃｕｌｔｕｒｅ」への参照は、当業者に既知の１つ以上の培養物およびその等価物などを含む。別段に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する当業者によって一般的に理解される意味と同じ意味を有する。
【0022】
「ＨＢｃ」という用語は、Ｂ型肝炎コアタンパク質のアミノ酸ペプチド配列、または配列番号１もしくは配列番号２に記載されるその切断されたバージョン、または同等のタンパク質、例えば、１つ以上のジスルフィド結合で修飾されたタンパク質を指し、参照により本明細書に具体的に組み込まれる、米国特許第９，８９６，４８３号に記載される先端修飾などを含む、非天然アミノ酸の導入のための部位を提供するように修飾される。
【0023】
様々な基は、合成中または発現中にペプチドの中へ導入されてもよく、これは、他の分子または表面への連結を可能にする。導入された基は、ＨＢｃドメイン自体に含まれる必要はないが、ＨＢｃドメインにタグまたは融合Ｃ末端もしくはＮ末端として導入され得る。したがって、システインを使用して、チオエーテル、金属イオン複合体に連結させるためのポリヒスチジン、アミドまたはエステルを形成するためのカルボキシル基、アミドを形成するためのアミノ基などを作製することができる。メチオニルアミノペプチダーゼによる翻訳開始非天然メチオニン類似体を除去するためのイニシエーターであるホルミルメチオニンの後の３つのアミノ酸（ＡＳＶ）の挿入が、望ましくない位置での表面コンジュゲーションを回避するために含まれ得る。
【0024】
いくつかの実施形態では、非天然アミノ酸は、タンパク質中の１つ以上の定義された部位に含まれ、それは残基８０を含むがこれらに限定されない。本発明のＨＢｃポリペプチドは、コンジュゲーションパートナーへの直接結合の制御のための非天然アミノ酸を含み得る。コンジュゲーションパートナーは、ＨＢｃポリペプチド上の非天然アミノ酸へのコンジュゲーションのための活性基を有してもよい。いくつかの実施形態では、コンジュゲーションパートナーは、非天然アミノ酸を含むように修飾され、ＨＢｃポリペプチド、通常は、非天然アミノ酸も含み、ジスルフィド安定化ＶＬＰ中に組織化されたＨＢｃポリペプチドと反応する。コンジュゲーションパートナー上の非天然アミノ酸は、ＨＢｃポリペプチド上に存在する非天然アミノ酸とは異なり、かつそれと反応する。
【0025】
当業者は、タンパク質の機能を改変させることなく、例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、または最大約１０個のアミノ酸の変化なしに、配列中でわずかなアミノ酸変化を行うことができ、完全長タンパク質が、本明細書に例示される切断されたバージョンに置換され得ることを理解する。ＨＢｃは、自己組織化して、粒子のような正２０面体ウイルスを形成することが機能的に可能である。本発明のＨＢｃポリペプチドは、上記のようなアミノ酸置換を含み、これには、残基Ａ１３１での修飾、またはカーゴローディングドメインの添加が含まれるが、これらに限定されない。
【0026】
本明細書で使用される場合、「精製された」および「単離された」という用語は、それが得られた材料からの汚染物質を実質的に含まないポリペプチドの文脈で使用される場合、例えば、細胞物質、例えば、限定されないが、細胞デブリ、細胞壁物質、膜、小器官、細胞内に存在する核酸、炭水化物、タンパク質、および／または脂質のバルクなどが細胞内に存在することを示す。したがって、単離されるポリペプチドは、約３０％、２０％、１０％、５％、２％、または１％（乾燥重量）未満の細胞物質および／または汚染物質を有するポリペプチドの調製物を含む。本明細書で使用される場合、「精製された」および「単離された」という用語は、化学的に合成されるポリペプチドの文脈で使用される場合、ポリペプチドの合成に関与する化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まないポリペプチドを指す。
【0027】
「ポリペプチド」、「ペプチド」、「オリゴペプチド」および「タンパク質」という用語は、本明細書では交換的に使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマー形態を指し、コードされたおよびコードされていないアミノ酸、化学的もしくは生化学的に修飾された、または誘導されたアミノ酸、ならびに修飾ペプチド骨格を有するポリペプチドを含むことができる。
【0028】
ポリペプチドは、組換え合成または無細胞タンパク質合成の従来の方法に従って単離および精製してもよい。例示的なコード配列が提供されるが、当業者は、提供されたアミノ酸配列に基づいて好適なコード配列を容易に設計することができる。当業者に周知の方法を使用して、コード配列および適切な転写／翻訳制御シグナルを含有する発現ベクターを構築することができる。これらの方法は、例えば、インビトロ組換えＤＮＡ技術、合成技術、およびインビボ組換え／遺伝子組換えを含む。あるいは、関心対象のポリペプチドをコードすることができるＲＮＡは、化学的に合成され得る。当業者は、周知のコドン使用表および合成方法を容易に利用して、本発明のポリペプチドのいずれかに好適なコード配列を提供することができる。核酸は、単離され、実質的な純度で得られる。通常、核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかとして、他の天然に存在する核酸配列を実質的に含まずに得られ、概して、少なくとも約５０％、通常は少なくとも約９０％純粋であり、典型的には、例えば、天然に存在する染色体上で通常会合しない１つ以上のヌクレオチドに隣接する「組換え」である。本発明の核酸は、直鎖分子としてまたは環状分子内で提供され得、自律複製分子（ベクター）内または複製配列なしの分子内で提供され得る。核酸の発現は、それら自身または当該技術分野において既知の他の調節配列によって調節することができる。本発明の核酸は、当該技術分野で利用可能な様々な技術を使用して、好適な宿主細胞に導入することができる。
【0029】
本明細書で使用される場合、「ウイルス様粒子」という用語は、１つ以上のウイルスタンパク質、通常はウイルスコートタンパク質の安定な高分子組織化体を指す。ＶＬＰ中の別個のタンパク質鎖の数は、通常、特異的なウイルス形状に応じて、少なくとも約６０個のタンパク質、約８０個のタンパク質、少なくとも約１２０個のタンパク質、またはそれ以上である。本発明の方法では、ＨＢｃは、カプシド構造への自己組織化のための許容条件、特に還元条件に維持される。本発明の方法は、ウイルスポリヌクレオチドゲノムの非存在下でコートタンパク質の合成を提供し、したがって、キャプシドは空であってもよく、または非ウイルス成分、例えばｍＲＮＡ断片などを含有してもよい。
【0030】
安定したＶＬＰは、生理学的条件下で、延長された期間、例えば、少なくとも約２４時間、少なくとも約１週間、少なくとも約１ヶ月以上、キャプシド構造中のタンパク質の会合を維持する。一旦組織化すると、ＶＬＰは、例えば、ｐＨ変化、熱、凍結、イオン変化などに曝露されたときに、天然ウイルス粒子に相応しい安定性を有することができる。当該技術分野で既知であるように、ＶＬＰの追加の構成要素は、ＶＬＰ内に含まれるか、またはＶＬＰ上に配置されることができる。ＶＬＰは、無傷のウイルス核酸を含有せず、非感染性である。いくつかの実施形態では、ＶＬＰ調製物が免疫原性組成物に製剤化され、動物またはヒトに投与されるとき、免疫応答（細胞媒介性または体液性）が上昇するように、ＶＬＰの表面上に十分なウイルス表面エンベロープ糖タンパク質および／またはアジュバント分子が存在する。
【0031】
物質の「有効量」または「十分な量」は、臨床結果を含む有益な結果などの所望の生物学的効果を引き起こすために十分な量であり、したがって、「有効量」は、それが適用される文脈に依存する。本発明の文脈において、有効量のワクチンの例は、個体における免疫応答（例えば、抗体産生）を誘導するために十分な量である。有効量は、１つ以上の投与において投与することができる。
【0032】
本明細書で使用される場合、折り畳みとは、ポリペプチドおよびタンパク質の三次元構造を形成するプロセスを指し、アミノ酸残基間の相互作用は、構造を安定化させるように作用する。非共有結合相互作用は、構造を決定する上で重要であり、タンパク質との膜接触の効果は、正しい構造にとって重要であり得る。天然に存在するタンパク質およびポリペプチド、またはその誘導体およびバリアントについて、適切な折り畳みの結果は、典型的には、最適な生物学的活性をもたらす配列であり、活性、例えば、リガンド結合、酵素活性、ＶＬＰに組織化する能力などについてのアッセイによって好都合に監視することができる。
【0033】
いくつかの場合において、例えば、所望の生成物が合成起源である場合、生物学的活性に基づくアッセイは、あまり意味がない。かかる分子の適切な折り畳みは、物理的特性、エネルギー的考慮事項、モデリング研究などに基づいて決定されてもよい。
【0034】
関心対象の分離手順としては、アフィニティークロマトグラフィーが挙げられる。親和性クロマトグラフィーは、通常、生物学的高分子中に存在する高度に特異的な結合部位を使用し、特定のリガンドに結合するそれらの能力に応じて分子を分離する。共有結合は、リガンドをタンパク質サンプルに明らかに提示する方法で、リガンドを不溶性の多孔質支持媒体に結合させ、それによって、１つの分子種の天然の生体特異的結合を使用して、混合物から第２の種を分離および精製する。抗体は、親和性クロマトグラフィーで一般的に使用される。好ましくは、微粒子またはマトリックスは、親和性クロマトグラフィーの支持体として使用される。かかる支持体は、当該技術分野で既知であり、市販されており、リンカー分子に組み合わせることができる活性化支持体を含む。例えば、アガロースまたはポリアクリルアミドに基づくＡｆｆｉ－Ｇｅｌ支持体は、蠕動ポンプまたは重力フロー溶出によるほとんどの実験室スケールの精製に好適な低圧ゲルである。Ａｆｆｉ－Ｐｒｅｐ支持体は、圧力安定性のマクロ多孔性ポリマーに基づいて、調製およびプロセススケールの適用に適している。
【0035】
タンパク質は、当該技術分野で既知の方法を使用して、イオン交換クロマトグラフィー、および／または濃縮、濾過、透析などによって分離されてもよい。本発明の方法は、天然タンパク質に匹敵する生物学的活性を有する非天然アミノ酸を含有するタンパク質を提供する。機能アッセイにおける活性レベルを決定すること、非機能アッセイ、例えば、免疫染色、ＥＬＩＳＡに存在するタンパク質の量を定量化すること、クマシーまたは銀染色ゲル上の定量化、ならびに生物学的に活性なタンパク質対総タンパク質の比を決定することによって、組成物中のタンパク質の比活性を決定してもよい。一般に、このように定義される比活性は、天然タンパク質の少なくとも約５％、通常は天然タンパク質の少なくとも約１０％であり、約２５％、約５０％、約９０％以上であり得る。
【0036】
本発明の修飾ＨＢｃタンパク質は、所定の部位に少なくとも１つの非天然アミノ酸を含み得、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれ以上の非天然アミノ酸を含むもしくは含有し得る。ポリペプチド中の２つ以上の部位に存在する場合、非天然アミノ酸は、同じであっても、または異なってもよい。非天然アミノ酸が異なる場合、直交ｔＲＮＡおよび同族ｔＲＮＡ合成酵素が各非天然アミノ酸に対して存在する。いくつかの実施形態では、単一の非天然アミノ酸は、残基８０に存在する。
【0037】
本発明の方法で使用することができる非天然アミノ酸の例としては、チロシンアミノ酸の非天然アナログ、グルタミンアミノ酸の非天然アナログ、フェニルアラニンアミノ酸の非天然アナログ、メチオニンアミノ酸の非天然アナログ、スレオニンアミノ酸の非天然アナログ；アルキル、アリール、アシル、アジド、シアノ、ハロ、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドロキシル、アルケニル、アルキニル（ａｌｋｙｎｌ）、エーテル、チオール、スルホニル、セレノ、エステル、チオ酸、ホウ酸塩、ボロン酸エステル、ホスホ、ホスホノ、ホスフィン、ヘテロ環式、エノン、イミン、アルデヒド、ヒドロキシルアミン、ケト、またはアミノ置換アミノ酸、またはこれらの任意の組み合わせ；光活性化可能な架橋剤を有するアミノ酸；スピン標識アミノ酸；蛍光アミノ酸；新規の官能基を有するアミノ酸；別の分子と共有または非共有相互作用するアミノ酸；金属結合アミノ酸；金属含有アミノ酸；放射性アミノ酸；光ケージ化および／または光異性化可能なアミノ酸；ビオチンまたはビオチンアナログ含有アミノ酸；グリコシル化または糖質修飾アミノ酸；ケト含有アミノ酸；ポリエチレングリコールまたはポリエーテルを含むアミノ酸；重原子置換アミノ酸；化学的に切断可能なまたは光切断可能なアミノ酸；細長い側鎖を有するアミノ酸；毒性基を含有するアミノ酸；糖置換アミノ酸、例えば糖置換セリンなど；炭素結合糖含有アミノ酸；酸化還元活性アミノ酸；α－ヒドロキシ含有酸；アミノチオ酸含有アミノ酸；α、α二置換アミノ酸；β－アミノ酸；プロリン以外の環状アミノ酸などが含まれる。
【0038】
関心対象の非天然アミノ酸としては、クリックケミストリー反応のための反応基を提供するアミノ酸が挙げられるが、これらに限定されない（Ｃｌｉｃｋ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｄｉｖｅｒｓｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ａ Ｆｅｗ Ｇｏｏｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ Ｈａｒｔｍｕｔｈ Ｃ．Ｋｏｌｂ，Ｍ．Ｇ．Ｆｉｎｎ，Ｋ．Ｂａｒｒｙ Ｓｈａｒｐｌｅｓｓ Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ Ｖｏｌｕｍｅ ４０，２００１，Ｐ．２００４参照、特に参照により本明細書に組み込まれる）。例えば、アミノ酸アジドホモアラニン、ホモプロパルギルグリシン、ｐ－アセチル－Ｌ－フェニルアラニン、およびｐ－アジド－Ｌ－フェニルアラニンが、関心の対象である。
【0039】
いくつかの実施形態では、非天然アミノ酸は、タンパク質上のメチオニンのグローバル置換によって導入され、例えば、メチオニンは、無細胞反応混合物から放出され、０．２５～２．５ｍＭのアジドホモアラニン（ＡＨＡ）によって置換され得る。かかる実施形態では、天然メチオニン、例えば、Ｍ６６を異なるアミノ酸で置換することが好ましく、一方、ＡＴＧコドンは、非天然アミノ酸導入、例えば、残基８０のために所望の部位でコード配列に導入される。
【0040】
あるいは、非天然アミノ酸は、直交成分によって導入される。直交成分としては、非天然アミノ酸でアミノアシル化されたｔＲＮＡが挙げられ、直交ｔＲＮＡ塩基は、通常アミノ酸とは会合しないコドン、例えば、停止コドン、４ｂｐコドンなどと対合する。反応混合物は、同族直交ｔＲＮＡを（非天然アミノ酸で）アミノアシル化することができるｔＲＮＡ合成酵素をさらに含み得る。そのような成分は、例えば、２００６年５月１６日に発行された米国特許第７，０４５，３３７号に記載されているように、当該技術分野で既知である。直交ｔＲＮＡは、例えば、ストップコドン、例えば、琥珀、オークル、およびオパールコドン、４つ以上の塩基コドン、天然または非天然塩基対に由来するコドンなどのナンセンスコドンであり得るセレクターコドンを認識する。直交ｔＲＮＡアンチコドンループは、ｍＲＮＡ上のセレクターコドンを認識し、この部位の非天然アミノ酸をポリペプチドに組み込む。
【0041】
直交ｔＲＮＡ合成酵素は、通常、少なくとも約１０μｇ／ｍｌ、少なくとも約２０μｇ／ｍｌ、少なくとも約３０μｇ／ｍｌ、および約２００μｇ／ｍｌ以下の規定量で、外因的に合成され、精製され、本発明の反応混合物に添加され得る。タンパク質は、当技術分野で既知のように、細菌または真核細胞で合成され、例えば、親和性クロマトグラフィー、ＰＡＧＥ、ゲル排除クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーなどによって精製されてもよい。
【0042】
「コンジュゲーションパートナー」または「選択された追加の部分」という用語は、交換的に使用され、一般に、本発明のＨＢｃポリペプチドにコンジュゲートされる、任意の部分、例えば、ペプチドまたはタンパク質、核酸、多糖、標識などを指す。コンジュゲーションパートナーは、本発明のＨＢｃポリペプチドへのクリックケミストリーコンジュゲーションのための相補的活性基を含み得る。例えば、ＨＢｃタンパク質上に存在する非天然アミノ酸へのコンジュゲーションを可能にする１つ以上の非天然アミノ酸で合成されてもよい。当業者は、コンジュゲーションのための化学が周知であり、例えば、ＣｐＧ ＤＮＡ配列、検出可能な標識、抗原、ポリペプチドなどの様々な基に容易に適用され得ることを理解する。
【0043】
いくつかの実施形態では、コンジュゲーションパートナーは、構造タンパク質、例えば、コラーゲン、ケラチン、アクチン、ミオシン、エラスチン、フィブリリン、ラミンなどである。いくつかの実施形態では、コンジュゲーションパートナーは、免疫原、例えば、ヘマグルチニンなどのインフルエンザタンパク質を含むが、これらに限定されない、免疫に有用な病原体タンパク質である。関心対象のウイルスコートタンパク質としては、既知のウイルスタイプ、例えば、天然痘（バリオラ）などのｄｓＤＮＡウイルス、ワクシニア、水痘帯状疱疹ウイルス（ｖａｒｉｃｅｌｌａ－ｚｏｓｔｅｒ）を含むヘルペスウイルス、ＨＳＶ１、ＨＳＶ２、ＫＳＶＨ、ＣＭＶ、ＥＢＶ、アデノウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、ＳＶ４０、Ｔ４ファージ、Ｔ２ファージなどのＴ偶数ファージ、ラムダファージなどのいずれかが挙げられる。一本鎖ＤＮＡウイルスとしては、ｐｈｉＸ－１７４、アデノ随伴ウイルスなどが挙げられる。マイナス鎖ＲＮＡウイルスとしては、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、パラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ）、メタニューモウイルス、狂犬病ウイルス、エボラウイルス、インフルエンザウイルスなどが挙げられる。プラス鎖ＲＮＡウイルスとしては、ポリオウイルス、ライノウイルス、コロナウイルス、風疹、黄熱病ウイルス、ウエストナイルウイルス、デング熱ウイルス、ウマ脳炎ウイルス、Ａ型肝炎およびＣ型肝炎ウイルス、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）などが挙げられる。二本鎖ＲＮＡウイルスとしては、レオウイルスなどが挙げられる。レトロウイルスとしては、ラウス肉腫ウイルス、ＨＩＶ－１およびＨＩＶ－２などのレンチウイルスが挙げられる。
【0044】
コンジュゲーションパートナーとして好適なポリペプチドおよび核酸の例としては、抗体およびその断片、アプタマーなどの標的化部分が挙げられるが、これらに限定されない。他の実施形態では、コンジュゲーションパートナーは、腫瘍抗原、ウイルスタンパク質、結核抗原を含む細菌タンパク質、マラリアタンパク質を含む原虫タンパク質、レニンなどの抗原性タンパク質；ヒト成長ホルモンを含む成長ホルモン；ウシ成長ホルモン；成長ホルモン放出因子；副甲状腺ホルモン；甲状腺刺激ホルモン；リポタンパク質；アルファ－１－抗トリプシン；インスリンＡ鎖；インスリン；プロインスリン；濾胞刺激ホルモン；カルシトニン；黄体形成ホルモン；グルカゴン、第ＶＩＩＩｃ因子、第ＩＸ因子、組織因子、およびフォン・ヴィレブランド因子などの凝固因子；プロテインＣなどの抗凝固因子；心房性ナトリウム因子；肺サーファクタント；ウロキナーゼまたはヒト尿またはヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔ－ＰＡ）などのプラスミノーゲン活性化因子；ボムベシン；トロンビン；血小板増殖因子；腫瘍壊死因子－アルファおよびベータ；エンケファリナーゼ；ＲＡＮＴＥＳおよび他のケモカイン；ヒトマクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ－１α）；ヒト血清アルブミンなどの血清アルブミン；ミュレリアン阻害物質；リラクシンＡ鎖；リラクシンＢ鎖；プロレラキシン；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；β－ラクタマーゼなどの微生物タンパク質；ＤＮａｓｅ；インヒビン；アクチビン；血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）；ホルモンまたは成長因子の受容体；インテグリン；プロテインＡまたはＤ；リウマトイド因子；骨由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、神経栄養因子－３、－４、－５、もしくは－６（ＮＴ－３、ＮＴ－４、ＮＴ－５、もしくはＮＴ－６）などの神経栄養因子、またはＮＧＦ－βなどの神経成長因子；血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）；αＦＧＦおよびβＦＧＦなどの線維芽細胞増殖因子；上皮成長因子（ＥＧＦ）；ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２、ＴＧＦ－β３、ＴＧＦ－β４、またはＴＧＦ－β５を含むＴＧＦ－αおよびＴＧＦ－βなどの線維芽細胞増殖因子（ＴＧＦ）；インスリン様成長因子－ＩおよびＩＩ（ＩＧＦ－ＩおよびＩＧＦ－ＩＩ）；ｄｅｓ（１－３）－ＩＧＦ－Ｉ（脳ＩＧＦ－Ｉ）、インスリン様成長因子結合タンパク質；ＣＤ－３、ＣＤ－４、ＣＤ－８、およびＣＤ－１９などのＣＤタンパク質；エリスロポエチン；骨誘導因子；免疫毒素；骨形成タンパク質（ＢＭＰ）；インターフェロンα、－β、およびγなどのインターフェロン；コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、例えば、Ｍ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、およびＧ－ＣＳＦ；インターロイキン（ＩＬ）、例えば、ＩＬ－１～ＩＬ－１８；スーパーオキシドジスムターゼ；Ｔ細胞受容体；表面膜タンパク質；減衰加速因子；例えば、ＡＩＤＳエンベロープの一部などのウイルス抗原；輸送タンパク質；ホーミング受容体；アドレッシン；調節タンパク質；抗体、特に一本鎖Ｆｖ抗体；ならびに、上記のポリペプチドの任意のものの断片である。
【0045】
カーゴ。ＶＬＰは、カーゴ、例えば、ＶＬＰが細胞内にあるときに放出される分子をカプセル化してもよい。カプセル化されたカーゴは、ＶＬＰ内で保護され、典型的には、ＶＬＰの表面に提示されない。安定してローディングされたカーゴは、洗浄後にＶＬＰ内に保持される。
【0046】
多くの分子は、カーゴとして好適であり、ＲＮＡ、例えば、ガイドＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡなど；ＤＮＡ、例えば、プラスミド、コード配列などを含むが、これらに限定されない二本鎖または一本鎖ＤＮＡ；例えば、ジフテリアＡ鎖、エクソトキシンＡ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、クルシン、クロチン、フェノマイシン、エノマイシン、オーリスタチン－Ｅなどを含む毒素タンパク質などのタンパク質；ＣＲＩＳＰＲを含むが、これらに限定されない遺伝子修飾タンパク質；抗体またはそれに由来する断片などの結合タンパク質などを含むが、これらに限定されない。細胞傷害性薬剤は数多くあり、また様々である。細胞傷害性薬剤の１つの例示的なクラスは、化学療法剤である。例示的な化学療法剤としては、アルデスロイキン、アルトレタミン、アミフォスチン、アスパラギナーゼ、ブレオマイシン、カペシタビン、カルボプラチン、カルマスチン、クラドリビン、シサプリド、シスプラチン、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、ダクチノマイシン、ドセタキセル、ドキソルビシン、ドロナビノール、デュオカルマイシン、エポエチンアルファ、エトポシド、フィルグラスチム、フルダラビン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、グラニセトロン、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イホスファミド、インターフェロンアルファ、イリノテカン、ランソプラゾール、レバミソール、ロイコボリン、メゲストロール、メスナ、メトトレキサート、メルタンシン、メトクロプラミド、ミトマイシン、ミトタン、ミトキサントロン、オメプラゾール、オンダンセトロン、パクリタキセル、ピロカルピン、ピロクロロペラジン、リツキシマブ、サプロイン、タモキシフェン、タキソール、トポテカン塩酸塩、トラスツズマブ、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビン酒石酸塩などが挙げられるが、これらに限定されない。
【0047】
いくつかの実施形態では、カーゴは、例えば、ＨＢｃタンパク質へのコンジュゲーションのための遊離スルフヒドリル基を添加することによって、ＶＬＰによるカプセル化を増強するように修飾される。あるいは、遊離スルフヒドリル基、例えば、メルタンシンを含むカーゴ剤が選択され得る。極性カーゴ、例えば、ｓｓＤＮＡ、ＲＮＡなどの核酸は、ローディングを増強するために、例えば、コレステロールなどの疎水性基にコンジュゲートされ得る。あるいは、１つ以上の極性または荷電アミノ酸を、カーゴにコンジュゲートすることができる。
【0048】
無細胞タンパク質合成は、本明細書で使用される場合、生物学的抽出物および／または定義された試薬を含む反応混合物中のポリペプチドの無細胞合成を指す。反応混合物は、高分子の産生のための鋳型、例えば、ＤＮＡ、ｍＲＮＡなど、合成される高分子のための単量体、例えば、アミノ酸、ヌクレオチドなど、ならびに合成に必要なかかる補因子、酵素、および他の試薬、例えば、リボソーム、ｔＲＮＡ、ポリメラーゼ、転写因子などを含む。このような合成反応系は当技術分野で周知であり、文献に記載されている。無細胞合成反応は、当該技術分野において既知のように、バッチ、連続フロー、または半連続フローとして実施され得る。
【0049】
ＣＦＰＳおよび他の後続のステップは、還元条件下、例えば、１ｍＭのＤＴＴまたは等価物の存在下で実施され得る。ＶＬＰの組織化後、条件は、例えば、還元剤を除去するための透析によって、任意選択で、塩、例えば、最大約１Ｍの塩、最大約１．５Ｍの塩、最大約２Ｍの塩、例えば、ＮａＣｌなどの存在下で、酸化環境に変更されてもよく、次いで、５～１０ｍＭのＨ２Ｏ２、５～１０ｍＭのジアミド、または等価物を添加することによって、酸化して、ジスルフィド結合を形成してもよい。
【0050】
本発明のいくつかの実施形態では、無細胞合成は、酸化リン酸化が活性化される反応、例えば、ＣＹＴＯＭＩＭ（商標）システムにおいて実施される。呼吸鎖の活性化および酸化リン酸化は、Ｏ２の存在下でのポリペプチド合成の増加によって証明される。酸化リン酸化が活性化される反応において、Ｏ２の存在下での全体的なポリペプチド合成は、ＨＱＮＯなどの特定の電子輸送鎖阻害剤の存在下でまたはＯ２の不在下で少なくとも約４０％低減される。反応化学は、参照により本明細書に組み込まれる国際特許出願第ＷＯ２００４／０１６７７８号に記載されるようにしてもよい。
【0051】
合成のためのＣＹＴＯＭＩＭ（商標）環境は、グルコースおよびリン酸塩を含有する培地中で成長した細菌細胞由来の細胞抽出物を利用し、グルコースは、最初に少なくとも約０．２５％（重量／体積）、より通常は少なくとも約１％の濃度で存在し、通常は約４％以下、より通常は約２％以下である。かかる培地の例は、２ＹＴＰＧ培地であるが、当業者は、栄養素の定義された供給源および定義されていない供給源の両方を使用して、Ｅ．ｃｏｌｉなどの細菌の成長に好適な多くの公開された培地が存在するため、多くの培養培地がこの目的に適合され得ることを理解する（グルコース含有培地の例について、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，ａｎｄ Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ．１９８９．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ参照）。あるいは、培養物は、定義された成長培地または複雑な成長培地のいずれかにおいて高い成長速度を維持するために必要に応じてグルコースを継続的に供給するプロトコルを使用して成長させてもよい。反応混合物は、小胞、例えば、内部膜小胞溶液を含むことによって補充され得る。提供される場合、かかる小胞は、約０～約０．５体積、通常、約０．１～約０．４体積を含んでよい。
【0052】
いくつかの実施形態では、ＰＥＧは、微量以下、例えば、０．１％未満で存在し、０．０１％未満であってもよい。ＰＥＧを実質的に含まない反応は、例えば、酸化リン酸化がＰＥＧ阻害されない、十分に低いレベルのＰＥＧを含有する。スペルミジン分子およびプトレシンがＰＥＧの代わりに使用され得る。スペルミンまたはスペルミジンは、少なくとも約０．５ｍＭ、通常は少なくとも約１ｍＭ、好ましくは約１．５ｍＭ、および約２．５ｍＭ以下の濃度で存在する。プトレシンは、少なくとも約０．５ｍＭ、好ましくは少なくとも約１ｍＭ、好ましくは約１．５ｍＭ、および約２．５ｍＭ以下の濃度で存在する。スペルミジンおよび／またはプトレシンは、初期細胞抽出物中に存在し得るか、または別々に添加され得る。
【0053】
反応混合物中のマグネシウムの濃度は、全体の合成に影響を及ぼす。多くの場合、細胞抽出物中にマグネシウムが存在し、濃度を最適化するために追加のマグネシウムで調整してもよい。かかる方法に有用なマグネシウム塩の供給源は、当該技術分野において既知である。本発明の一実施形態では、マグネシウムの供給源は、グルタミン酸マグネシウムである。好ましいマグネシウム濃度は、少なくとも約５ｍＭ、通常は少なくとも約１０ｍＭ、および好ましくは少なくとも約１２ｍＭであり、かつ約２５ｍＭ以下、通常は約２０ｍＭ以下の濃度である。合成を増強し得る、またはコストを低減し得る他の変化としては、反応混合物からのＨＥＰＥＳ緩衝液およびホスホエノールピルビン酸塩の省略が挙げられる。
【0054】
システムは、好気性および嫌気性条件下で実行することができる。酸素は、合成収率を増加させるために、特に１５μｌを超える反応に対して供給され得る。反応チャンバーの頭部空間に酸素を充填することができ、酸素を反応混合物に注入することができる。酸素は連続的に供給され得るか、または反応チャンバーの頭部空間は、より長い反応時間のタンパク質発現の過程中に再充填され得る。硝酸塩、硫酸塩、またはフマル酸塩などの他の電子受容体は、必要な酵素が細胞抽出物中で活性であるように、細胞抽出物の調製と併せて供給されてもよい。
【0055】
酸化リン酸化の活性化のために外因性補因子を添加する必要はない。ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）、ＮＡＤ＋、またはアセチルコエンザイムＡなどの化合物を使用して、タンパク質合成収率を補完することができるが、必要ではない。ホスホエノールピルビン酸合成酵素（Ｐｐｓ）の代謝阻害剤であるシュウ酸の添加は、タンパク質収量の増加に有益であり得るが、必要ではない。
【0056】
無細胞タンパク質合成のための鋳型は、ｍＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかであり得、好ましくは、組み合わされたシステムは、認識可能なプロモーターを有するＤＮＡ鋳型からｍＲＮＡを連続的に生成する。内因性ＲＮＡポリメラーゼを使用するか、または外因性ファージＲＮＡポリメラーゼ、典型的にはＴ７またはＳＰ６を反応混合物に直接添加するかのいずれかである。あるいは、ｍＲＮＡは、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼであるＱＢレプリカーゼのための鋳型にメッセージを挿入することによって継続的に増幅することができる。精製されたｍＲＮＡは、反応混合物に添加される前に、一般に化学修飾によって安定化される。ヌクレアーゼは、ｍＲＮＡレベルを安定化させるために役立つように、抽出物から除去することができる。鋳型は、関心対象の任意の特定の遺伝子をコードすることができる。
【0057】
他の塩、特に、マンガンなどの生物学的に関連する塩も添加され得る。カリウムは、一般に、少なくとも約５０ｍＭ、および約２５０ｍＭ以下の濃度で存在する。アンモニウムは、通常、２００ｍＭ以下の濃度、より通常は約１００ｍＭ以下の濃度で存在してもよい。通常、反応は、約ｐＨ５～１０の範囲および約２０℃～５０℃の温度で維持され、より通常は、約ｐＨ６～９の範囲および約２５℃～４０℃の温度で維持され、これらの範囲は、関心対象の特定の条件のために拡大され得る。
【0058】
望ましくない酵素活性に対する代謝阻害剤を反応混合物に添加してもよい。あるいは、望ましくない活性を引き起こす酵素または因子は、抽出物から直接除去され得るか、または望ましくない酵素をコードする遺伝子は、染色体から不活性化もしくは欠失され得る。
【0059】
ポリペプチド
本発明のポリペプチドは、例えば、配列番号１または配列番号２を参照して、ＨＢｃ配列を含み、様々な修飾が、特にカーゴをローディングするための有用性を向上させるために行われる。いくつかの実施形態では、配列番号１、配列番号２、または同等のＨＢｃポリペプチドに記載される配列は、残基Ａ１３１における塩基性アミノ酸、例えば、Ｈ、Ｋ、Ｒへのアミノ酸置換によって修飾され、いくつかの実施形態では、置換は、Ａ１３１Ｋである。この修飾は、一般に、配列番号１または配列番号２と比較して、タンパク質の「スパイク先端」、すなわち、残基７３～８１の領域上の負の電荷を低減する一連のアミノ酸置換と組み合わせて行われる。いくつかの実施形態では、配列番号１または配列番号２に対する一連のアミノ酸変化は、Ｉ５７Ｖ、Ｌ６０Ｓ、Ｇ６３Ｒ、Ｄ６４Ｅ、Ｌ６５Ｖ、Ｍ６６Ｔ、Ｔ６７Ｄ、Ｌ６８Ｆ、Ａ６９Ｇ、Ｔ７０Ｄ、Ｔ７４Ｎ、Ｌ７６Ｍ、Ｅ７７Ｑ、Ｐ７９Ｑ、Ｓ８１Ａ、Ｓ８７Ｎ、Ｔ９１Ａ、Ｖ９３Ｉ、およびＦ９７Ｉである。いくつかの実施形態では、一連のアミノ酸変化は、Ｔ７４Ｎ、Ｌ７６Ｍ、Ｅ７７Ｑ、Ｐ７９Ｑ、およびＳ８１Ａである。いくつかの実施形態では、低減された負の電荷を有するＨＢｃタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号３である。この一連の先端置換は、組織化に必要なイオン強度、例えば、約１．５ＭのＮａＣｌまで増加することが見出されている。Ａ１３１置換の包含は、組織化に必要なイオン強度を低減し、例えば、１Ｍ未満、０．７５Ｍ未満、０．５Ｍ未満、および０．２５Ｍ未満であり得る。
本発明のポリペプチドは、例えば、配列番号１または配列番号２を参照して、ＨＢｃ配列を含み、様々な修飾が、特にカーゴをローディングするための有用性を向上させるために行われる。いくつかの実施形態では、配列番号１、配列番号２、または同等のＨＢｃポリペプチドに記載される配列は、残基Ａ１３１における塩基性アミノ酸、例えば、Ｈ、Ｋ、Ｒへのアミノ酸置換によって修飾され、いくつかの実施形態では、置換は、Ａ１３１Ｋである。この修飾は、一般に、配列番号１または配列番号２と比較して、タンパク質の「スパイク先端」、すなわち、残基７３～８１の領域上の負の電荷を低減する一連のアミノ酸置換と組み合わせて行われる。いくつかの実施形態では、配列番号１または配列番号２に対する一連のアミノ酸変化は、Ｉ５７Ｖ、Ｌ６０Ｓ、Ｇ６３Ｒ、Ｄ６４Ｅ、Ｌ６５Ｖ、Ｍ６６Ｔ、Ｔ６７Ｄ、Ｌ６８Ｆ、Ａ６９Ｇ、Ｔ７０Ｄ、Ｔ７４Ｎ、Ｌ７６Ｍ、Ｅ７７Ｑ、Ｐ７９Ｑ、Ｓ８１Ａ、Ｓ８７Ｎ、Ｔ９１Ａ、Ｖ９３Ｉ、およびＦ９７Ｉである。いくつかの実施形態では、一連のアミノ酸変化は、Ｔ７４Ｎ、Ｌ７６Ｍ、Ｅ７７Ｑ、Ｐ７９Ｑ、およびＳ８１Ａである。いくつかの実施形態では、低減された負の電荷を有するＨＢｃタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号３である。この一連の先端置換は、組織化に必要なイオン強度、例えば、約１．５ＭのＮａＣｌまで増加することが見出されている。Ａ１３１置換の包含は、組織化に必要なイオン強度を低減し、例えば、１Ｍ未満、０．７５Ｍ未満、０．５Ｍ未満、および０．２５Ｍ未満であり得る。
【0060】
カーゴをローディングするために、ＨＢｃタンパク質は、末端、通常はＣ末端にカーゴローディングドメインを付加することによってさらに修飾され得る。カーゴローディングドメインの選択は、意図されるカーゴの性質に基づき得る。例示的なカーゴローディングドメインは、少なくとも１つであり、通常は１５以下のアミノ酸長、例えば、少なくとも２、少なくとも３、および最大１２、最大１０、最大８のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、カーゴローディングドメインは、１つのシステイン残基を含む。例示的なカーゴローディングドメインとしては、（配列番号４）ＥＧＦＧＥＧＦＧＥＧＦ、（配列番号５）ＥＧＦＧＥＧＦＧＥＧＦＣ、（配列番号６）ＩＧＩＧＣ、（配列番号７）ＩＧＩＧＩＣ、ＲＲＲ、Ｒ、ＩＩＩＣ、Ｃ、ＣＲＣ、ＥＥＥなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【0061】
ＨＢｃは、例えば、配列番号１に関して、１つまたは１対のジスルフィド結合、ＳＳ１：Ｄ２９Ｃ、Ｒ１２７Ｃ、ＳＳ２：Ｔ１０９Ｃ、Ｖ１２０Ｃ、ＳＳ３：Ｙ１３２Ｃ、Ｎ１３６Ｃ、ＳＳ４：Ｙ１３２Ｃ、Ａ１３７Ｃ、ＳＳ５：Ｒ１３３Ｃ、Ｎ１３６Ｃ、ＳＳ６：Ｒ１３３Ｃ、Ａ１３７Ｃ、ＳＳ７：Ｐ１３４Ｃ、Ｐ１３５Ｃ、ＳＳ８：Ｐ１３４Ｃ、Ｎ１３６Ｃ、ＳＳ９：Ｐ１３４Ｃ、Ａ１３７Ｃ、およびＳＳ１０：Ｐ１３５Ｃ、Ｎ１３６Ｃのうちの１つ以上を提供するように修飾されてもよい。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、Ｄ２９ＣおよびＲ１２７Ｃである。他の実施形態では、アミノ酸置換は、Ｐ１３４ＣおよびＮ１３６Ｃである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、Ｄ２９Ｃ、Ｒ１２７Ｃ、Ｐ１３４Ｃ、およびＮ１３６Ｃである。
【0062】
ＨＢｃタンパク質は、所定の部位に１つ以上の非天然アミノ酸をさらに含むことができる。関心対象の非天然アミノ酸としては、アジドホモアラニン、ホモプロパルギルグリシン、ｐ－アセチル－フェニルアラニン、ｐ－エチニル－フェニルアラニン、ｐ－プロパルギルオキシフェニルアラニン、ｐ－アジド－フェニルアラニンなどが挙げられるが、これらに限定されない。非天然アミノ酸は、ＨＢｃタンパク質のスパイクに位置付けられ得る。関心対象の部位としては、例えば、Ｎ７５、Ｔ７４、Ｌ７６、Ｑ７７、Ｄ７８、Ｑ７９、およびＡ８０が挙げられる。いくつかの実施形態では、非天然アミノ酸は、Ａ８０を置き換える。いくつかの実施形態では、非天然アミノ酸は、アジドホモアラニンである。
【0063】
本発明のいくつかの実施形態では、本発明のＨＢｃポリペプチドの単量体形態が提供される。他の実施形態では、本発明のＨＢｃポリペプチドの二量体形態が提供される。いくつかの実施形態では、ＨＢｃポリペプチドは、ＶＬＰに組織化され、これは、酸化時に分子間ジスルフィド結合によって安定化され得る。
【0064】
カーゴローディングの方法
本明細書に記載される修飾は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、タンパク質、化学療法薬などの小分子などを含むが、これらに限定されない治療用カーゴをＶＬＰにローディングすることを可能にする。ローディングは、疎水性またはイオン対合引力を利用し得る。任意選択で、カーゴは、ジスルフィド結合によってＶＬＰの内部に結合される。
本明細書に記載される修飾は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、タンパク質、化学療法薬などの小分子などを含むが、これらに限定されない治療用カーゴをＶＬＰにローディングすることを可能にする。ローディングは、疎水性またはイオン対合引力を利用し得る。任意選択で、カーゴは、ジスルフィド結合によってＶＬＰの内部に結合される。
【0065】
カーゴは、ＨＢｃタンパク質を含有する溶液に添加され、溶液のイオン強度の増加によって誘導される、同時の薬物ローディングおよびＶＬＰ組織化を可能にする。カーゴをローディングしたＶＬＰが精製および安定化された後、それらは、血清半減期を増強するための部分、例えばＰＥＧなどを含む、異なる官能性を付与する分子、特定の細胞標的化部分、例えば、一本鎖抗体断片、アプタマー、細胞表面受容体用リガンドなどを含むがこれらに限定されないタンパク質を同時に表面に付着させることによってさらに修飾され得る。いくつかの実施形態では、標的化部分は、ＶＬＰを癌細胞に標的化する。いくつかの実施形態では、標的化部分は、ＶＬＰを、感染細胞、例えば、病原体感染細胞に標的化する。本明細書に記載される修飾ＨＢｃタンパク質を含むＶＬＰは、０．５ＭのＮａＣｌ溶液中で自己組織化することができる。いくつかの実施形態では、ローディング中にカーゴ溶解度を維持するために、ＶＬＰ組織化は、有機溶媒の存在下で、例えば、約０．５％～約２０％、例えば、少なくとも約５％、少なくとも約１０％および約２０％以下、約１５％以下のＤＭＳＯ、ＤＭＦなどの有機溶媒の存在下で実施される。非イオン性界面活性剤もまた、例えば約０．０１％～約１％、例えば、約０．１％の濃度で、ｔｗｅｅｎ－２０なども含めることができる。組織化後、ＶＬＰは、ジアミンなどの軽度の酸化剤で処理される。ジスルフィド結合の酸化後、通常の生理食塩水および同等の賦形剤中で安定である。ジスルフィド結合が還元された後、例えば、細胞によって取り込まれると、ＶＬＰは低イオン性溶液中で分解する。この条件付き安定化は、細胞質に存在する還元条件下での治療用カーゴの放出を可能にする。
【0066】
コンジュゲーションの方法
コンジュゲーションのための活性基が反応性アジド基およびアルキン基である場合、ＨＢｃとパートナーとの間の反応は、当技術分野で既知のように、触媒化に十分な濃度、例えば、少なくとも約１μＭ、少なくとも約０．１ｍＭ、少なくとも約１ｍＭなどで、銅（Ｉ）触媒で触媒化され得る。この反応は、反応が嫌気条件下で実施される限り、臭化銅もしくは塩化銅などの市販の銅（Ｉ）またはテトラキス（アセトニトリル）銅（Ｉ）ヘキサフルオロホスフェートなどの化合物の供給源を使用して実施することができる。この反応は、様々な溶媒中で実行することができ、水およびアルコール、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ、ｔＢｕＯＨおよびアセトンを含む様々な（部分的に）混和性有機溶媒の混合物は、良好に機能する。反応は、室温で進行し、所望の完了レベルに、例えば、少なくとも約１５分、少なくとも約１時間、少なくとも約４時間、少なくとも約８時間以上で進行する。
コンジュゲーションのための活性基が反応性アジド基およびアルキン基である場合、ＨＢｃとパートナーとの間の反応は、当技術分野で既知のように、触媒化に十分な濃度、例えば、少なくとも約１μＭ、少なくとも約０．１ｍＭ、少なくとも約１ｍＭなどで、銅（Ｉ）触媒で触媒化され得る。この反応は、反応が嫌気条件下で実施される限り、臭化銅もしくは塩化銅などの市販の銅（Ｉ）またはテトラキス（アセトニトリル）銅（Ｉ）ヘキサフルオロホスフェートなどの化合物の供給源を使用して実施することができる。この反応は、様々な溶媒中で実行することができ、水およびアルコール、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ、ｔＢｕＯＨおよびアセトンを含む様々な（部分的に）混和性有機溶媒の混合物は、良好に機能する。反応は、室温で進行し、所望の完了レベルに、例えば、少なくとも約１５分、少なくとも約１時間、少なくとも約４時間、少なくとも約８時間以上で進行する。
【0067】
本発明は、本発明のＨＢｃポリペプチドをコードする核酸をさらに提供する。当業者には理解されるように、遺伝子コードの劣化により、極めて多数の核酸を作作製ることができ、これらのすべては、本発明のＨＢｃポリペプチドをコードする。したがって、特定のアミノ酸配列を同定した当業者であれば、アミノ酸配列を変化させない方法で１つ以上のコドンの配列を単純に修飾することによって、任意の数の異なる核酸を作製することができる。
【0068】
ＨＢｃポリペプチドをコードする本発明の核酸を使用して、様々な発現構築物を作製することができる。発現構築物は、宿主ゲノムに組み込まれる自己複製染色体外ベクターまたはベクターであり得る。あるいは、無細胞発現の目的のために、構築物は、所望のポリペプチドの転写および翻訳に必要なそれらの要素を含んでもよいが、複製起点、選択マーカーなどの要素を含まなくてもよい。無細胞構築物は、インビトロで、例えばＰＣＲによって複製され得、増幅反応のために最適化された末端配列を含み得る。
【0069】
一般に、発現構築物は、融合タンパク質をコードする核酸に作動可能に連結された転写および翻訳調節核酸を含む。「制御配列」という用語は、特定の発現系、例えば、哺乳動物細胞、細菌細胞、無細胞合成などにおける、作動可能に連結されたコード配列の発現に必要なＤＮＡ配列を指す。原核生物系に好適な制御配列としては、例えば、プロモーター、場合によりオペレーター配列、およびリボソーム結合部位が挙げられる。真核細胞系は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、およびエンハンサーを利用し得る。
【0070】
核酸は、別の核酸配列と機能的関係に置かれる場合、「作動可能に連結される」。例えば、前配列または分泌リーダーのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に関与する前タンパク質として発現される場合、ポリペプチドのＤＮＡに作動可能に連結され、プロモーターまたはエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼす場合、コード配列に作動可能に連結され、またはリボソーム結合部位は、翻訳の開始を促進するように配置される場合、コード配列に作動可能に連結される。一般に、「作動可能に連結された」とは、連結されているＤＮＡ配列が連続しており、分泌リーダーの場合、連続しており、読み取り段階であることを意味する。連結は、ライゲーションによって、または増幅反応によって達成される。合成オリゴヌクレオチドアダプタまたはリンカーは、従来の慣行に従って配列を連結するために使用され得る。
【0071】
一般に、転写および翻訳調節配列としては、プロモーター配列、リボソーム結合部位、転写開始および停止配列、翻訳開始および停止配列、ならびにエンハンサーまたは活性化因子配列が挙げられ得るが、これらに限定されない。好ましい一実施形態では、調節配列は、プロモーターおよび転写開始および停止配列を含む。
【0072】
プロモーター配列は、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターのいずれかをコードする。プロモーターは、天然プロモーターまたはハイブリッドプロモーターのいずれかであり得る。複数のプロモーターの要素を組み合わせたハイブリッドプロモーターも当該技術分野で既知であり、本発明において有用である。好ましい実施形態では、プロモーターは強力なプロモーターであり、Ｔ７プロモーターなどのインビトロ発現系で高発現を可能にする。
【0073】
加えて、発現構築物は、追加の要素を含み得る。例えば、発現ベクターは、１つまたは２つの複製系を有してもよく、したがって、発現のための生物、例えば、哺乳動物または昆虫細胞、ならびにクローニングおよび増幅のための原核宿主において、それを維持することを可能にする。加えて、発現構築物は、形質転換宿主細胞の選択を可能にするために、選択可能なマーカー遺伝子を含有し得る。選択遺伝子は、当該技術分野において周知であり、使用される宿主細胞とともに変化する。
【0074】
製剤および使用
ＨＢｃからなるＶＬＰ、カーゴを含むＶＬＰを含み、任意選択で１つ以上のコンジュゲートされた部分を含む、ＨＢｃポリペプチドは、薬学的に許容される賦形剤中に提供され得、様々な製剤中にあってもよい。当技術分野で周知であるように、薬学的に許容される賦形剤は、薬理学的に有効な物質の投与を容易にする比較的不活性な物質である。例えば、賦形剤は、形態または一貫性を与えることができ、または希釈剤として作用することができる。好適な賦形剤としては、安定化剤、湿潤剤および乳化剤、様々な浸透圧に対する塩、カプセル化剤、緩衝液、および皮膚浸透促進剤が挙げられるが、これらに限定されない。賦形剤、ならびに非経口および非経口ではない（ｎｏｎｐａｒｅｎｔｅｒａｌ）薬物送達のための製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １９ｔｈ Ｅｄ．Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ（１９９５）に記載されている。
ＨＢｃからなるＶＬＰ、カーゴを含むＶＬＰを含み、任意選択で１つ以上のコンジュゲートされた部分を含む、ＨＢｃポリペプチドは、薬学的に許容される賦形剤中に提供され得、様々な製剤中にあってもよい。当技術分野で周知であるように、薬学的に許容される賦形剤は、薬理学的に有効な物質の投与を容易にする比較的不活性な物質である。例えば、賦形剤は、形態または一貫性を与えることができ、または希釈剤として作用することができる。好適な賦形剤としては、安定化剤、湿潤剤および乳化剤、様々な浸透圧に対する塩、カプセル化剤、緩衝液、および皮膚浸透促進剤が挙げられるが、これらに限定されない。賦形剤、ならびに非経口および非経口ではない（ｎｏｎｐａｒｅｎｔｅｒａｌ）薬物送達のための製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １９ｔｈ Ｅｄ．Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ（１９９５）に記載されている。
【0075】
一般に、これらの組成物は、注射または吸入、例えば、腹腔内、静脈内、皮下、筋肉内などによる投与のために製剤化される。したがって、これらの組成物は、好ましくは、生理食塩水、リンガー溶液、デキストロース溶液などの薬学的に許容されるビヒクルと組み合わせられる。特定の投与計画、すなわち、投与量、タイミングおよび反復は、特定の個体およびその個体の病歴に依存する。
【0076】
本発明は、記載される特定の方法論、プロトコル、細胞株、動物種または属、構築物、および試薬に限定されるものではなく、それら自体は変化し得ることを理解されたい。本明細書で使用される用語は、特定の実施形態のみを説明する目的のためのものであり、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定することが意図されるものではないことも理解されるべきである。
【0077】
別段に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する当業者によって一般的に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書に記載されるデバイスおよび材料と類似または同等の任意のデバイスおよび材料は、本発明の実施または試験に使用することができるが、ここでは、いくつかの潜在的かつ例示的なデバイスおよび材料を説明する。
【0078】
本明細書で言及されるすべての刊行物は、例えば、刊行物に記載されており、本発明と関連して使用され得る試薬、細胞、構築物、および方法論を記載および開示する目的で、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書で考察される刊行物は、本出願の出願日前に専らそれらの開示のために提供されている。いかなる刊行物の引用も、出願日以前のその開示に関するものであり、本発明が、先行発明を理由に、そのような刊行物に先行する権利がないことを認めるものと解釈されるべきではない。
【0079】
以下の実施例は、本発明の作製および使用方法の完全な開示および説明を当業者に提供するために提示されるものであり、発明とみなされるものについての範囲を限定することを意図するものではない。使用される数字（例えば、量、温度、濃度など）に対する精度を確保する努力がなされているが、ある程度の実験誤差および偏差は許容されるべきである。別様に示されない限り、部とは重量部であり、分子量は平均分子量であり、温度は摂氏であり、圧力は大気圧または略大気圧である。
【0080】
実験
実施例１
Ｂ型肝炎ウイルス様粒子組織化の操作
Ｂ型肝炎コアサブユニットの精製。歴史的に、ＨｅｐＢｃ ＶＬＰは、組織化されていない単量体または二量体ではなく、ＶＬＰとして産生および精製された。ＨｅｐＢｃ単量体の取得は、初期の適用には必要ではなく、ＳＥＣは、無細胞反応におけるほとんどの他のタンパク質からＶＬＰを精製するための最も単純な方法であった。Ｅ．ｃｏｌｉまたは当研究室での無細胞タンパク質合成（ＣＦＰＳ）のいずれかを使用したＨｅｐＢｃの発現後、粗混合物を、増加したイオン強度の緩衝液に対して透析して、ＨｅｐＢｃ ＶＬＰの自己組織化を誘導した。次いで、単一のＳＥＣステップを使用して、ＶＬＰを、それらの大きなサイズに基づいて精製した。その後の安定化および表面付着を実施し、第２のＳＥＣステップを使用して、最終生成物を精製した。しかしながら、この方法には２つの大きな欠点があった。まず、ＨｅｐＢｃ単量体の精製を可能にしない。所望のカーゴをローディングするためには、高精製ＨｅｐＢｃサブユニットから始める必要がある。他の者は、精製されていないタンパク質のＶＬＰ組織化、続いてサブユニットを精製するための分解反応を使用してきたが、その方法は、厳しい化学物質（尿素、グアニジンなど）でＶＬＰを処理することを伴い、カーゴのローディングおよび再組織化後の収率および生成物の品質を低減させる可能性がある。第２の欠点は、この方法がまた、共精製されたＥ．ｃｏｌｉタンパク質複合体であることである。
実施例１
Ｂ型肝炎ウイルス様粒子組織化の操作
Ｂ型肝炎コアサブユニットの精製。歴史的に、ＨｅｐＢｃ ＶＬＰは、組織化されていない単量体または二量体ではなく、ＶＬＰとして産生および精製された。ＨｅｐＢｃ単量体の取得は、初期の適用には必要ではなく、ＳＥＣは、無細胞反応におけるほとんどの他のタンパク質からＶＬＰを精製するための最も単純な方法であった。Ｅ．ｃｏｌｉまたは当研究室での無細胞タンパク質合成（ＣＦＰＳ）のいずれかを使用したＨｅｐＢｃの発現後、粗混合物を、増加したイオン強度の緩衝液に対して透析して、ＨｅｐＢｃ ＶＬＰの自己組織化を誘導した。次いで、単一のＳＥＣステップを使用して、ＶＬＰを、それらの大きなサイズに基づいて精製した。その後の安定化および表面付着を実施し、第２のＳＥＣステップを使用して、最終生成物を精製した。しかしながら、この方法には２つの大きな欠点があった。まず、ＨｅｐＢｃ単量体の精製を可能にしない。所望のカーゴをローディングするためには、高精製ＨｅｐＢｃサブユニットから始める必要がある。他の者は、精製されていないタンパク質のＶＬＰ組織化、続いてサブユニットを精製するための分解反応を使用してきたが、その方法は、厳しい化学物質（尿素、グアニジンなど）でＶＬＰを処理することを伴い、カーゴのローディングおよび再組織化後の収率および生成物の品質を低減させる可能性がある。第２の欠点は、この方法がまた、共精製されたＥ．ｃｏｌｉタンパク質複合体であることである。
【0081】
これらの問題を解決するために、我々は、ＨｅｐＢｃ単量体のＣ末端にヘキサヒスチジンタグを導入し、Ｎｉ－ＮＴＡ固定化金属親和性クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）を使用して組織化されていないＨｅｐＢｃ単量体の精製を可能にした。ヘキサヒスチジンタグを使用して、比較的過酷なイミダゾール洗浄を使用して、粗Ｅ．ｃｏｌｉ溶解物から他のタンパク質を含むＣＦＰＳ反応生成物の混合物からほとんどの不純物を除去することができた。さらに、ＶＬＰが標的細胞に結合し、エンドサイトーシスを受けると、その生体分子カーゴを送達するためにエンドソームを回避する必要がある。それが失敗し、リソソームに到達すると、多くのカーゴが破壊される。ポリヒスチジン配列は、プロトンスポンジ効果を介したエンドソーム回避を可能にするために、以前に示されている。新しい製造プロセスは、透析ステップおよび最初のＳＥＣステップを、Ｎｉ－ＮＴＡ樹脂への結合、Ｎｉ－ＮＴＡを使用した単量体精製を改善するためのＣＦＰＳ後の緩衝液交換ステップ、Ｎｉ－ＮＴＡ樹脂からタンパク質を溶出させるために使用されるイミダゾールを除去する緩衝液交換ステップ、およびＶＬＰ組織化に必要な臨界濃度（約５μＭ）に達するための濃度ステップと置き換える。
【0082】
ＶＬＰ ＳＥＣ精製は予想されるＳＥＣプロファイルを生成したが、我々はまた、動的光散乱（ＤＬＳ）および透過電子顕微鏡法（ＴＥＭ）を使用して、新しいＶＬＰが同一であることを検証した。ＤＬＳデータは、粒子が均一なサイズであることを暗示する、低多分散指数（ＰＤＩ）を有する３６．９１ｎｍの平均直径を示唆する。結晶構造分析は、ＤＬＳ分析と一致する約３５ｎｍのサイズを示唆する。また、ＴＥＭ画像は、予想されるサイズのほとんど均一なキャプシドを示す。
【0083】
次に、ＶＬＰ組織化中の電界スクリーニングを低減するために、ＨｅｐＢｃ二量体間の結合界面を再設計することを求めた。静電気相互作用を介して核酸などの治療用カーゴをローディングするために、我々は、組織化に必要なイオン強度を低減して、ＨＰスパイク移植に必要な１．５ＭのＮａＣｌから、０．５ＭのＮａＣｌの野生型レベルに戻すことを目的とした。ゴールは、スパイク領域を変更することなく、低減されたイオン強度での組織化を可能にする補償変異（複数可）を同定することであった。
【0084】
補償変異を同定するために、我々は、合理的な設計に基づく変異誘発戦略を採用した。最初に文献を検索し、Ｒｏｂｅｔｔａ ＡＬＡ Ｓｃａｎウェブサーバーを使用して、ＶＬＰ組織化中に２つの二量体が一緒になるときに形成された「組織化体」界面で結合するために重要な残基を同定した。その後、我々は変異の３つのカテゴリを次のように設計した。（１）既存の疎水性相互作用を静電相互作用で補強する、（２）既存の疎水性相互作用を静電相互作用で置き換える、または（３）元々相互作用がなかった場合に新しい静電相互作用を追加する。これらの変異体を産生し、低イオン強度での組織化について試験した。１３２位におけるチロシンは、ＶＬＰ組織化にとって最も重要な残基である。Ｙ１３２Ａ変異体は、組織化不能である。ＶＬＰ組織化を奨励する他の界面残基を同定するために、Ｒｏｂｅｔｔａ ＡＬＡ Ｓｃａｎウェブサーバーを使用した。このサーバーは、まず、近接度に基づいて結合界面で残基を同定する。次に、各残基をインシリコでアラニンに個別に変異させる。複合体形成時のＧｉｂｂの遊離エネルギー（ΔΔＧ）の変化を指すΔΔＧ（複合体）を計算することによって、元の残基が重要であったか否かを判定することができる。ΔΔＧ（複合体）が正である場合、この残基を有しない新しい複合体は、組織化に好ましくないことを意味する（より負のΔＧがより好ましい）。そのため、ΔΔＧ（複合体）値が高いほど、残基は結合のためにより重要である。不思議ではないが、Ｙ１３２は、これまでで最も重要な残基であると同定された。しかしながら、ほとんどが疎水性である多数の他の残基も同定された。
【0085】
Ｙ１３２を変更しなかった単一および二重変異を用いて、理論設計変異ライブラリーを生成した。これらの残基変化を、Ｃ末端ヘキサヒスチジン伸長を有するＨｅｐＢｃ ＨＰバリアントに導入した。変異は、前述の基準、およびＤｕｎｂｒａｃｋ骨格依存性ＡＡ Ｒｏｔａｍｅｒライブラリーに基づくインシリコＰｙＭＯＬ生成構造に基づいて選択した。候補を表１に列挙する。
【0086】
【表1】
【0087】
ほとんどのバリアントは、我々のＣＦＰＳシステムを使用して可溶性タンパク質を蓄積せず、残りのほとんどは組織化しなかった。これらの変異体は、ＶＬＰに組織化することができない代替構造に折り畳まれている可能性が高い。１つの変異（Ａ１３１Ｋ）のみが成功し、０．５ＭのＮａＣｌまでの低塩濃度での組織化を可能にした（図１）。この変異は、我々のすべての基準を満たしていた。
【0088】
我々は、低減したイオン強度でＨｅｐＢｃ ＶＬＰ組織化を改善するＡ１３１Ｋ変異をさらに研究した。これらがまったく組織化することができないバリアントが１つしかなく、ましてや組織化力学をうまく改変することができなかったという事実は、驚くべきことであった。Ｒｏｓｅｔｔａ Ｒｅｍｏｄｅｌを使用したインシリコのモデルを作製した。このモデルは、Ａ１３１ＫがＹ１３２と同じパートナーとの２つの異なる相互作用に関与する可能性があることを示唆している。（１）Ｄ２２を有する塩橋、および（２）Ｆ２３とのカチオン－π相互作用である。以前の研究は、特にタンパク質の疎水性コアに埋設される代わりに溶媒に曝露される場合、カチオン－π相互作用が塩橋よりもさらに強くなり得ることを示唆している。これらの相互作用は、Ｙ１３２の疎水性寄与が自己組織化を開始するために十分に強くない場合、より低いイオン強度で起こり得る。Ａ１３１ＫがＤ２２またはＦ２３のいずれかに引き付けられると、Ｙ１３２はまた、それらと相互作用して、その相互作用を強化し、解離を防止することができる。
【0089】
Ａ１３１Ｋバリアントの組織化動態の研究を、０．５Ｍおよび１．５ＭのＮａＣｌの両方で実施した。結果は、Ａ１３１Ｋがより低いイオン強度での組織化を可能にするが、より高いイオン強度での組織化と同じ程度（または速度）に達しないことを示す（図２）。
【0090】
最後に、Ａ１３１Ｋバリアントを、ＴＥＭを使用して分析し、変異したＶＬＰが、野生型ＶＬＰと形態学的に類似していることを示した。示されるように、それらは同一であるように見える（図３）。
【0091】
以前の研究は、ＨｅｐＢｃ ＶＬＰ配列が変異に非常に適していることを示唆した。しかしながら、本作業の本体は、これが組織化体界面に適用されないことを示唆する。ＨｅｐＢｃ単量体は、４つの異なるドメインを有すると考えられる。すなわち、（１）折り畳みを画定するタンパク質の「コア」、（２）単量体：単量体界面でのアルファヘリックスによって生成される「スパイク」領域、（３）２つの二量体が結合して自己組織化プロセスを開始する「組織化体界面」、および（４）野生型ウイルス内のＣ末端ドメインは、そのウイルスゲノムをローディングするためのアルギニンリッチリピートから構成される。「スパイク」領域は、ウイルスファミリーの相同性内および変異なしの両方において変異を許容するようである。しかしながら、「組織化体界面」は、特に疎水性を低減させる場合、変化に非常に耐えられないことが示されている。ＨｅｐＢｃは、その組織化体界面でのアミノ酸変化に非常に感受性があるように思われるが、１つの変異は非常に有益であった。１３１位におけるアラニンからリジンへの変化は、１．５ＭのＮａＣｌでの組織化の程度を増加させ、０．５ＭのＮａＣｌのような低いイオン強度での組織化を可能にした。
【0092】
材料および方法
無細胞タンパク質合成反応。ＨｅｐＢｃタンパク質の発現反応は、前述のように、ＰＡＮＯｘ－ＳＰ無細胞プロトコルを使用した（Ｖｏｌｏｓｈｉｎ＆Ｓｗａｒｔｚ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．９１，５１６－５２１ （２００５））。Ｂｒａｕｎ １０Ｌ Ｂｉｏｓｔａｔ Ｃ発酵槽で増殖させたＡ１９ｍｅｔ＋、ΔｔｏｎＡ、ΔｔｎａＡ、ΔｓｐｅＡ、ΔｅｎｄＡ、ΔｓｄａＡ、ΔｓｄａＢ、ΔｇｓｈＡ Ｅ．ｃｏｌｉ細胞（株ＫＣ６）から細胞抽出物を調製した。この抽出物に加えて、タンパク質合成に必要な低分子試薬、精製Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、および関心対象のプラスミドを添加した。Ｑｉａｇｅｎ Ｍａｘｉｐｒｅｐ精製キットを使用してプラスミドを調製し、イソプロパノール／エタノール洗浄ステップを含んだ。標準的なアミノ酸に加えて、組み込まれた放射能を測定することによって合成されたタンパク質の定量化を可能にするために、５μＭの１４Ｃ－ロイシンも加えた。反応を複数のスケールで実施した。２ｍＬのエッペンドルフチューブに５０μＬ、６ウェルの組織培養プレートに６００μＬ、または１０ｃｍのペトリ皿に６ｍＬ。反応物を２０～３０℃で様々な時間インキュベートした。液体シンチレーションカウントを使用して組み込まれた放射能を測定することによって、タンパク質濃度を決定した。総タンパク質サンプルを直接測定し、可溶性タンパク質サンプルを、１０ｋｘｇで１５分間遠心分離して不溶性物質を除去した後に測定した。両方のサンプルを、５％トリクロロ酢酸でＷｈａｔｍａｎ濾紙上に沈殿させた後、５％トリクロロ酢酸で３回洗浄して、組み込まれなかった１４Ｃ－ロイシンを除去する。
無細胞タンパク質合成反応。ＨｅｐＢｃタンパク質の発現反応は、前述のように、ＰＡＮＯｘ－ＳＰ無細胞プロトコルを使用した（Ｖｏｌｏｓｈｉｎ＆Ｓｗａｒｔｚ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．９１，５１６－５２１ （２００５））。Ｂｒａｕｎ １０Ｌ Ｂｉｏｓｔａｔ Ｃ発酵槽で増殖させたＡ１９ｍｅｔ＋、ΔｔｏｎＡ、ΔｔｎａＡ、ΔｓｐｅＡ、ΔｅｎｄＡ、ΔｓｄａＡ、ΔｓｄａＢ、ΔｇｓｈＡ Ｅ．ｃｏｌｉ細胞（株ＫＣ６）から細胞抽出物を調製した。この抽出物に加えて、タンパク質合成に必要な低分子試薬、精製Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、および関心対象のプラスミドを添加した。Ｑｉａｇｅｎ Ｍａｘｉｐｒｅｐ精製キットを使用してプラスミドを調製し、イソプロパノール／エタノール洗浄ステップを含んだ。標準的なアミノ酸に加えて、組み込まれた放射能を測定することによって合成されたタンパク質の定量化を可能にするために、５μＭの１４Ｃ－ロイシンも加えた。反応を複数のスケールで実施した。２ｍＬのエッペンドルフチューブに５０μＬ、６ウェルの組織培養プレートに６００μＬ、または１０ｃｍのペトリ皿に６ｍＬ。反応物を２０～３０℃で様々な時間インキュベートした。液体シンチレーションカウントを使用して組み込まれた放射能を測定することによって、タンパク質濃度を決定した。総タンパク質サンプルを直接測定し、可溶性タンパク質サンプルを、１０ｋｘｇで１５分間遠心分離して不溶性物質を除去した後に測定した。両方のサンプルを、５％トリクロロ酢酸でＷｈａｔｍａｎ濾紙上に沈殿させた後、５％トリクロロ酢酸で３回洗浄して、組み込まれなかった１４Ｃ－ロイシンを除去する。
【0093】
オリジナルのＶＬＰ精製法。上記のように、標準的な無細胞タンパク質合成反応を使用して、ＨｅｐＢｃタンパク質を発現させた。初期精製戦略は、５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．４）に対する反応を０．５～１．５ＭのＮａＣｌで４時間、再び１６時間透析して、無細胞タンパク質合成反応におけるＶＬＰ組織化を誘導した。組織化されたＶＬＰを定量化し、２００μＬのサンプルを２．２ｍＬのＳｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗのサイズ排除クロマトグラフィーカラムに適用し、組織化緩衝液で溶出させることによって精製した。２４個の１５０μＬの画分を収集した。各画分中のＨｅｐＢｃ濃度は、液体シンチレーションカウントを使用して放射能を測定することによって決定した。第１のピーク（典型的には画分５と１０との間）をＶＬＰとして収集した。その後、これらのＶＬＰを２０～５０ｍＭのジアミドを使用して酸化して、安定化ジスルフィド結合を形成した。次いで、５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．４）に対して４時間、再び１６時間透析することにより、ジアミドを除去した。
【0094】
改善されたＶＬＰ精製方法。上記のように、標準的な無細胞タンパク質合成反応を使用して、ＨｅｐＢｃタンパク質を発現させた。改善された精製戦略は、まず、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５カラムを使用して、サンプルを５０ｍＭのＴｒｉｓ、２５ｍＭのイミダゾール、０．１％のＴｗｅｅｎ－２０、ｐＨ７．４の緩衝液に交換した。可溶性画分をＮｉ－ＮＴＡカラム上にローディングする前に、１０ｋ×ｇで１５分間遠心分離を使用して不溶性物を除去した。ローディング後、Ｎｉ－ＮＴＡカラムを４カラム体積（ＣＶ）の５０ｍＭのＴｒｉｓ、２５ｍＭのイミダゾール、０．１％のＴｗｅｅｎ－２０、ｐＨ７．４で洗浄し、次いで５０ｍＭのＴｒｉｓ、２５０ｍＭのイミダゾール、０．１％のＴｗｅｅｎ－２０、ｐＨ７．４（合計５ＣＶ）で溶出した。次いで、ＨｅｐＢｃタンパク質を有する画分を、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５樹脂（８．３ｍＬの樹脂にローディングされた２．５ｍＬのサンプル）を含有するＳＥＣカラムに適用して、イミダゾールを除去し、それらを５０ｍＭのＴｒｉｓ、０．１％Ｔｗｅｅｎ－２０、ｐＨ７．４に交換した。サンプルを、撹拌細胞濃縮器またはＭｉｌｌｉｐｏｒｅからの３ｋＤａ分子量カットオフフィルターを使用して、限外濾過ベースの遠心濃縮器を使用して濃縮した。ＶＬＰ組織化を、５０ｍＭのＴｒｉｓ、５ＭのＮａＣｌ、０．１％のＴｗｅｅｎ－２０、ｐＨ７．４の原液を添加することによって、０．５～１．５ＭのＮａＣｌで誘導した。組織化ＶＬＰを定量化し、２４×１５０μＬ画分を溶出する２．２ｍＬのＳｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗサイズ排除クロマトグラフィー樹脂に２００μＬのサンプルを適用することによって精製した。各画分中のタンパク質濃度は、液体シンチレーションカウントを使用して放射能を測定することによって決定した。第１のピーク（典型的には画分５と１０との間）を、ＶＬＰとして収集した。これらのＶＬＰをその後、２０～５０ｍＭのジアミドを使用して酸化した。次いで、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５樹脂を使用して、サンプルを５０ｍＭのＴｒｉｓ、０．１％のＴｗｅｅｎ－２０、ｐＨ７．４に交換することによってジアミドを除去した。
【0095】
動的光散乱および透過電子顕微鏡法を使用したさらなるＶＬＰ解析。上記のようにＶＬＰを精製した後、ＶＬＰが実際に適切な直径の無傷のキャプシドであることを検証するために、動的光散乱および透過電子顕微鏡法を使用した。粒径分布は、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ ＺＳ機器を使用して決定した。粒子サイズについては、５０μＬのサンプルを超マイクロキュベット（８．５ｍｍの窓の高さ、ＢｒａｎｄＴｅｃｈ）に入れ、動的光散乱を使用して平均粒子直径を分析した。Ｚｅｔａｓｉｚｅｒソフトウェアｖ６．１２を使用してデータを分析した。粒子形態については、５μＬのサンプルを３００メッシュのＦｏｍｖａｒ／炭素でコーティングされた銅グリッド（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に適用し、１％の酢酸ウラニルでネガティブに染色した。ＴＥＭ画像は、Ｇａｔａｎ Ｏｒｉｕｓ ＣＣＤカメラを備えたＪＥＯＬ ＪＥＭ－１４００ １２０ｋＶ電子顕微鏡を使用して得た。
【0096】
組織化の変異誘発試験。ＶＬＰ組織化を改変するためのＨｅｐＢｃ変異ライブラリーを２つの部分に分割した。第１の部分は、新たな静電対（アルギニン／リジン＋アスパラギン酸塩／グルタミン酸塩）を添加した単一および二重変異体を含有した。この方法は、疎水性に基づくと予測される組織化機構を大幅に改変することなく、組織化に必要なイオン強度を低減することを試みた。第２の部分は、新しい静電対を添加する前に、界面からすべての疎水性を除去した。この方法は、組織化機構を劇的に改変して疎水性への依存性を低減させ、それによって組織化に必要なイオン強度を低下させようとした。第２の部分のすべての変異体は、Ｙ１３２Ａ変異を含有した。すべてのバリアントは、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ変異誘発およびＩＤＴ（Ｌｉｕ＆Ｎａｉｓｍｉｔｈ，ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８，９１（２００８））からのプライマーを使用して産生した。配列をＳｅｑｕｅｔｅｃｈによるＤＮＡ配列決定により検証した。
【0097】
組織化研究の動態。ＶＬＰ組織化の動態を決定するために、一連の時点でイオン強度を増加させた直後に、ＶＬＰを組織化のために分析した。上記のように組織化を決定した。簡潔に述べると、２００μＬのサンプルを、予め平衡化された２．２ｍＬのＳｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗサイズ排除クロマトグラフィーカラムに適用し、５０ｍＭのＴｒｉｓ、０．５または１．５ＭのＮａＣｌ、０．１％のＴｗｅｅｎ－２０、ｐＨ７．４中の２４×１５０μＬの画分を収集した。各画分中のＨｅｐＢｃ濃度は、液体シンチレーションカウントを使用して放射能を測定することによって決定した。第１のピーク（典型的には画分５と１０との間）は、ＶＬＰであることが決定された。サンプルが樹脂を通過するには時間がかかるため、動態を決定するためのクロマトグラフィーの使用は理想的ではないが、動態計算に使用される平均時間は、バイアスを最小限に抑えるためにＶＬＰに関連するピーク画分の溶出時間であった。
【0098】
実施例２
比較的小さい分子量を有するカーゴのローディングおよび保持
複雑な生物内の意図される細胞に特異的な活性分子の標的送達は、１００年以上前に想定されたが、まだ効率的に達成されていない。例えば、抗癌薬の効率的な標的送達は、腫瘍部位における薬物有効性を改善し、副作用を低減する可能性を有する。この目的のために、抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を集中的に研究し、開発した。しかしながら、それらは、構造的不均一性、不安定性、毒性、および限られた溶解性を含むいくつかの制限に悩まされている。対照的に、リポソーム、ポリマーベース、金属ベース、およびタンパク質ベースのナノ粒子（ＮＰ）を含むＮＰベースの送達剤は、より高いカーゴ／キャリア比で粒子内に抗癌薬を封入することによって、より安全かつより効率的な送達を提供する可能性がある。
比較的小さい分子量を有するカーゴのローディングおよび保持
複雑な生物内の意図される細胞に特異的な活性分子の標的送達は、１００年以上前に想定されたが、まだ効率的に達成されていない。例えば、抗癌薬の効率的な標的送達は、腫瘍部位における薬物有効性を改善し、副作用を低減する可能性を有する。この目的のために、抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を集中的に研究し、開発した。しかしながら、それらは、構造的不均一性、不安定性、毒性、および限られた溶解性を含むいくつかの制限に悩まされている。対照的に、リポソーム、ポリマーベース、金属ベース、およびタンパク質ベースのナノ粒子（ＮＰ）を含むＮＰベースの送達剤は、より高いカーゴ／キャリア比で粒子内に抗癌薬を封入することによって、より安全かつより効率的な送達を提供する可能性がある。
【0099】
異なるタイプのＮＰのうち、操作されたＢ型肝炎コア（ＨｅｐＢｃ）ウイルス様粒子（ＶＬＰ）は、望ましい特徴を提供する。しかしながら、抗癌薬などの薬剤の送達に有用であるために、ＶＬＰは、薬剤の多く、好ましくは数百個の分子をローディングしなければならない。さらに、分子は、ＶＬＰが標的細胞に入るまで、ＶＬＰの内部に保持されなければならない。この例では、これらのニーズを満たすための修飾されたＶＬＰおよび方法について説明する。
【0100】
Ｗｙｎｎｅら（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ，３，７７１（１９９９））は、ＨｅｐＢｃ単量体のＣ末端領域がＶＬＰの内面を含むことを示す、ＨｅｐＢｃキャプシド（ＶＬＰ）の構造を記載している。それらは、キャプシドシェルが異なるサイズの複数の孔を有し、最大孔寸法が約２１Åであることをさらに示す。
【0101】
ここで、一度組織化したＶＬＰの内面を画定するＣ末端にカーゴローディングドメインを導入し、ＨｅｐＢｃ ＶＬＰの小分子を内部にローディングおよび保持する能力を拡大した。第１のローディングドメインは、疎水性および静電性引力を利用して、ドキソルビシンなどの抗癌薬をローディングするように設計された。図４は、疎水性および正荷電特徴を有するドキソルビシンの分子立体構造を示す。効率的なＶＬＰ設計およびローディングプロトコルの開発を容易にするために、蛍光発生代替物であるローダミン１２３を使用した。これは、ローディング効率の簡便な測定を可能にしながら、疎水性および正荷電の特徴も提供するためである。図５の上部に示されるＨｅｐＢｃ Ｃ末端ローディングドメインは、そのようなカーゴの吸着のための疎水性およびイオン対合引力を提供するように設計された。フェニルアラニン残基の包含は、薬物の環構造にπ－スタッキング疎水性引力を提供し、負に荷電したグルタミン酸残基は、薬物の正に荷電したアミン基にイオン対合引力を提供する。グリシン残基は、これらのアミノ酸の間に提供されるため、疎水性側鎖および負に荷電した側鎖は、薬物とのより良い相互作用のために同じ方向に向いている。
【0102】
ヘキサヒスチジン精製タグ後のこの新しいオリゴペプチドの付加は、ＣＦＰＳ中のＨｅｐＢｃサブユニットの折り畳みを可能にし、ＶＬＰ組織化も可能にすることが示された。このＨｅｐＢｃサブユニット誘導体をＮｉ－ＮＴＡクロマトグラフィーによって精製した後、サブユニット調製物をローダミン１２３と混合し、濃縮ＮａＣｌ溶液を添加することによって組織化体を刺激して、イオン強度を増加させた。図５のクロマトグラムは、ローダミン１２３の存在がＶＬＰ組織化を妨げなかったことを示す。加えて、添加されたローダミン１２３の有意な割合がＶＬＰと会合し、ＶＬＰ当たり約１０００分子となった。しかしながら、図６は、外側ＶＬＰ表面に緩やかに吸着されていた可能性がある任意のローダミン１２３を除去するために実装された洗浄ステップ中に、ローディングしたカーゴが失われたことを示す。上記のように、ＶＬＰシェルは、最大２１Åの寸法を有する細孔を有し、図４に示されるように、ローダミン１２３分子の最小寸法は、約１２Åである。この分析は、ローディングしたフルオロフォアが細孔を通して漏出したことを示唆している。
【0103】
この漏出問題を解決するために、ローディングしたドメインを、保持のための共有結合でローディングするための疎水性引力を補完するように再設計した。ジスルフィド結合は、生成物精製、製剤化、貯蔵、および投与中に優れた安定性を提供するため、好ましいが、標的細胞内部の還元環境内でカーゴを放出するために解離される。この新しいタンパク質設計を図７に示す。メルタンシンは、ジスルフィド結合を形成することができるスルフヒドリル基を含むため、モデル抗癌薬として選択された。メルタンシンは、その強力な細胞傷害性のために、ＡＤＣのために最も一般的に使用されるチューブリン重合阻害剤の１つであり、臨床的に承認されたＡＤＣ、Ｋａｄｃｙｌａにも使用される。再び、修飾されたＨｅｐＢｃサブユニットならびに同時ローディングおよび組織化プロトコルの試験を容易にするために、ＶＬＰ開発に蛍光発生模倣物を使用した。メルタンシンおよび蛍光発生模倣物（ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ－システイン（ＢＤＦＬ））の分子構造を図８に示す。
【0104】
図９は、これらの新しいＣ末端ローディングドメインの別の必要な特徴を示す。サブユニットタンパク質の折り畳みおよびＶＬＰ組織化との干渉を回避することに加えて、分子安定性のためにＣ末端伸長を選択する必要がある。ＣＦＰＳ反応に１４Ｃ－ロイシンを添加することにより、ＨｅｐＢｃサブユニット産生中に蓄積するＨｅｐＢｃタンパク質生成物の可視化を可能にする。自己放射線図は、驚くべきことに、ローディングドメインにヘキサヒスチジン精製タグＮ末端を有するＣ末端伸長が、おそらくタンパク質分解切断のために安定しないことを示す。しかしながら、反対の順序を使用すると、所望の、無傷のＨｅｐＢｃ誘導体のみが蓄積することができる。吸着カーゴローディングが疎水性引力によってのみ媒介されるようになったため、より高いイオン強度でのＶＬＰ組織化（Ｃ末端ローディングドメインと疎水性カーゴとの間の吸引力を増加させるため）を試験した。図１０は、１．５ＭのＮａＣｌではなく２．５ＭのＮａＣｌを使用して、より良いＶＬＰ組織化が達成されることを示す。
【0105】
図８の上部に示される新たに設計されたローディングドメインを使用して、図１１に示されるように、約４５０個の分子のＢＤＦＬを、数回の洗浄の後、ＶＬＰごとにローディングし、保持した。まず、ＢＤＦＬおよび精製ＨｅｐＢｃサブユニットを一緒に混合し、濃縮ＮａＣｌ溶液を添加することによって組織化体を誘導した。次に、ジスルフィド結合を形成して、組織化されたＶＬＰを安定化し、軽度の酸化剤である１０ｍＭのジアミドとインキュベートすることによって、カーゴをローディングドメインに繋ぐことの両方を行った。次いで、ＳＥＣ緩衝液交換ステップを使用して、ジアミド、ならびにローディングされていないカーゴおよび繋ぎ止められていないカーゴを除去した。
【0106】
メルタンシンをローディングしようとする最初の試みには、深刻な問題が発生した。ＶＬＰ組織化を誘導するためにイオン強度を増加させると、メルタンシンが急速に沈殿し、ＶＬＰの内部にメルタンシンをローディングすることを顕著に妨げた。驚くべきことに、ＶＬＰ組織化は、溶媒の１０％および１５％のジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）が組織化溶液に含まれた場合でも、依然として効率的であった（図１２）。薬学的に許容される溶媒である１５％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）においても同様であった。両方の溶媒は、２．５ＭのＮａＣｌの添加によりイオン強度を増加させることによってＶＬＰ組織化が誘導されたとき、メルタンシン沈殿を回避した。ローディングしたＶＬＰを、ＳＥＣクロマトグラフィーを使用して洗浄した。ジスルフィド結合を還元し、２％ＳＤＳでＶＬＰを分解し、ＨＰＬＣを使用して放出されたメルタンシンを測定した後、ローディングしたメルタンシンの量は、ＶＬＰ当たり＞３００分子であると判定された。
【0107】
実施例３
Ｂ型肝炎コアウイルス様粒子内への高分子カーゴのローディング
この実施例で説明されている作業は以下を対処する。（１）ＶＬＰ中への高分子カーゴのローディングおよび保持、並びに（２）特異的な細胞標的化前者については、例として核酸およびタンパク質の両方のローディングを示すことになる。後者の場合、前立腺癌（ＰＣａ）細胞の表面上の前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）は、表面修飾ＶＬＰによって標的化される。
Ｂ型肝炎コアウイルス様粒子内への高分子カーゴのローディング
この実施例で説明されている作業は以下を対処する。（１）ＶＬＰ中への高分子カーゴのローディングおよび保持、並びに（２）特異的な細胞標的化前者については、例として核酸およびタンパク質の両方のローディングを示すことになる。後者の場合、前立腺癌（ＰＣａ）細胞の表面上の前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）は、表面修飾ＶＬＰによって標的化される。
【0108】
無細胞タンパク質合成（ＣＦＰＳ）中に容易かつ効率的に組み込まれる非天然アミノ酸（ｎｎＡＡ）を使用して、一本鎖抗体断片（ｓｃＦｖ）またはＤＮＡアプタマーを使用した特異的な細胞標的化を含む、「クリック」反応を介して、追加の機能をＨｅｐＢｃ ＶＬＰの表面に追加することができる。
【0109】
加えて、小核酸のカーゴ保持にも対処される。組織化されたＶＬＰ構造は多孔質で、最大寸法で２１オングストロームまでの開口部がある。これらの細孔は、Ｔ＝４の正２０面体構造における３倍、５倍、および６倍の対称点で形成される。小核酸、例えば、ｓｉＲＮＡは、これらの細孔を通って脱出し得る。
【0110】
ｓｉＲＮＡは、ジスルフィド結合を使用してローディング後にＶＬＰにコンジュゲートされ、標的細胞内での放出を可能にしながら信頼できる保持を提供する。ＶＬＰシェルを安定化するジスルフィドと同様に、カーゴ保持ジスルフィド結合は、サイトゾル内の還元条件によって破壊され、カーゴが標的細胞内でのみ放出されることを可能にする。ＨｅｐＢｃのＣ末端ドメイン（ｓｉＲＮＡの場合、正荷電アミノ酸を含有する）上のカーゴローディングドメインに加えて、遊離スルフヒドリルを含有するシステインも組み込んだ。穏やかな酸化剤であるジアミドは、カーゴをローディングした後、遊離スルフヒドリルを含むように修飾されたローディングしたｓｉＲＮＡをＶＬＰ内面にコンジュゲートするために使用される。
【0111】
実施例２に示されるように、ローディングおよび保持機構は、遊離スルフヒドリルを含有する小分子色素、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ－システイン（ＢＤＦＬ）を使用して実証されている。サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）の結果は、蛍光ＢＤＦＬが、以前にローディングしたすべてのカーゴを抽出したいくつかの洗浄ステップ後にＶＬＰによって保持されることを示す。このアプローチは、現在、核酸カーゴに拡張される。
【0112】
イオン対合相互作用を介したｓｉＲＮＡのローディングに加えて、ｓｉＲＮＡ（コレステロール分子）に疎水性「フック」を添加することによって、疎水性相互作用を介したｓｉＲＮＡのローディングも実証する。このｓｉＲＮＡ構築物をローディングするために、疎水性アミノ酸を含有するカーゴローディングドメイン（Ｃ末端ＨｅｐＢｃ伸長）を使用した。ｓｉＲＮＡに加えて、これらのローディングアプローチは、プラスミドＤＮＡ、ｍＲＮＡ、およびタンパク質（ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９を含むが、これらに限定されない）に拡張され得る。これらのカーゴはすべてより大きく、細孔を通ってＶＬＰから脱出しないはずである。プラスミドＤＮＡおよびｍＲＮＡに関して、イオン対合カーゴローディングドメインは、非常に負に荷電されるため、より魅力的であり得る。タンパク質については、タンパク質の表面特性またはタンパク質上に操作されたＣ末端またはＮ末端の伸長のいずれかを標的とする、イオン対合カーゴローディングドメインまたは疎水性カーゴローディングドメインのいずれかを使用することができる。ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９は、実際にはタンパク質とそのガイドＲＮＡとの複合体であるため、独自のローディング機構を可能にする可能性がある。したがって、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９との複合体でガイドＲＮＡを標的とする荷電カーゴローディングドメインを使用することができる。タンパク質のローディングは、ローディングを評価するために便利なように、ここでは緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を使用して実証される。
【0113】
結果
以下は、種々の高分子カーゴ、例えばｓｉＲＮＡをローディングするための、改変したＣ末端ドメインを有するＨｅｐＢｃバリアントの設計および精製を説明する。便宜上、我々は、同じ配列に一致する一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）構築物を使用してｓｉＲＮＡを模倣し（ウラシルにチミジンを置換する）、便宜的な検出のために蛍光プローブ６－カルボキシフルオレセイン（６ＦＡＭ）にコンジュゲートされる。
以下は、種々の高分子カーゴ、例えばｓｉＲＮＡをローディングするための、改変したＣ末端ドメインを有するＨｅｐＢｃバリアントの設計および精製を説明する。便宜上、我々は、同じ配列に一致する一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）構築物を使用してｓｉＲＮＡを模倣し（ウラシルにチミジンを置換する）、便宜的な検出のために蛍光プローブ６－カルボキシフルオレセイン（６ＦＡＭ）にコンジュゲートされる。
【0114】
カーゴローディングドメインを用いたＢ型肝炎コアバリアントの精製。ＨｅｐＢｃサブユニット精製スキームは、実施例１に記載される通りである。加えて、異なるＣ末端カーゴローディングドメイン以外に、ＨｅｐＢｃシェルの２つのバリアントも使用した。１つは、Ａ１３１Ｋ変異を利用して、０．５ＭのＮａＣｌ以下でＶＬＰ組織化を可能にし、より低いイオン強度でイオン対合引力を介してカーゴをローディングするために使用される。他方は、この変異を使用せず、高イオン強度（例えば、２．５ＭのＮａＣｌ）での疎水性機構を介してカーゴをローディングするために使用される。
【0115】
異なるＶＬＰ変異およびその効果の概要は、以下の通りである。
ＨＰ変異は、単量体が二量体化すると形成される「スパイク」領域に導入される各ＨｅｐＢｃ単量体における一連の１８個のアミノ酸変化であり、この修飾は、負に荷電したリガンドの「クリック」反応を大幅に改善した。ＨｅｐＢｃ ＶＬＰの免疫原性および抗原性も低減する。しかしながら、組織化に必要なイオン強度を０．５Ｍ～１．５ＭのＮａＣｌに増加させる望ましくない効果を有する。
Ａ１３１Ｋは、ＨＰバリアントの組織化に必要なイオン強度を低減して、０．５ＭのＮａＣｌの野生型レベルに戻す組織化体界面における変異である（実施例１）。
ＳＳ１およびＳＳ８は、それぞれＶＬＰシェルの条件的安定化のためにＶＬＰ二量体間に追加の２４０個のジスルフィド結合を追加する２つの異なる「ＳＳ」系列変異である。これらの結合は、サイトゾルの還元条件によって還元される。
８０Ｍは、メチオニン置換を介してメチオニン－アナログｎｎＡＡを組み込むために、メチオニン（ＡＴＧコドン）に変異した位置を指す。
２ＡＳＶｉｎｓは、翻訳開始非天然メチオニン類似体が、ＣＦＰＳに使用される細胞抽出物によって提供されるメチオニルアミノペプチダーゼによって除去されることを可能にするために、イニシエーターホルミルメチオニンの後に３つのアミノ酸（ＡＳＶ）を挿入する。この修飾は、表面スパイクの先端上の所望の残基でのコンジュゲーションに加えて発生するＨｅｐＢｃタンパク質Ｎ末端への表面コンジュゲーションを回避した。
６Ｈは、精製のために、およびプロトンスポンジ効果を介したエンドソーム回避のためにも使用されるＣ末端ヘキサヒスチジンタグを指す。
ＨＰ変異は、単量体が二量体化すると形成される「スパイク」領域に導入される各ＨｅｐＢｃ単量体における一連の１８個のアミノ酸変化であり、この修飾は、負に荷電したリガンドの「クリック」反応を大幅に改善した。ＨｅｐＢｃ ＶＬＰの免疫原性および抗原性も低減する。しかしながら、組織化に必要なイオン強度を０．５Ｍ～１．５ＭのＮａＣｌに増加させる望ましくない効果を有する。
Ａ１３１Ｋは、ＨＰバリアントの組織化に必要なイオン強度を低減して、０．５ＭのＮａＣｌの野生型レベルに戻す組織化体界面における変異である（実施例１）。
ＳＳ１およびＳＳ８は、それぞれＶＬＰシェルの条件的安定化のためにＶＬＰ二量体間に追加の２４０個のジスルフィド結合を追加する２つの異なる「ＳＳ」系列変異である。これらの結合は、サイトゾルの還元条件によって還元される。
８０Ｍは、メチオニン置換を介してメチオニン－アナログｎｎＡＡを組み込むために、メチオニン（ＡＴＧコドン）に変異した位置を指す。
２ＡＳＶｉｎｓは、翻訳開始非天然メチオニン類似体が、ＣＦＰＳに使用される細胞抽出物によって提供されるメチオニルアミノペプチダーゼによって除去されることを可能にするために、イニシエーターホルミルメチオニンの後に３つのアミノ酸（ＡＳＶ）を挿入する。この修飾は、表面スパイクの先端上の所望の残基でのコンジュゲーションに加えて発生するＨｅｐＢｃタンパク質Ｎ末端への表面コンジュゲーションを回避した。
６Ｈは、精製のために、およびプロトンスポンジ効果を介したエンドソーム回避のためにも使用されるＣ末端ヘキサヒスチジンタグを指す。
【0116】
表２は、高分子カーゴをローディングするためのいくつかの異なる設計の概要を提供する。伸長は、ＨｅｐＢｃタンパク質上のＣ末端伸長を指す。カーゴは、ＶＬＰにローディングされるエンティティを指し、ローディングおよび保持を容易にするための修正を含む。スルフヒドリル基を提供するエンティティは、オレンジ色で示され、赤色ではエンティティを正電荷し、緑色では疎水性エンティティを示す。第１の列は、対応する伸長／カーゴ対に使用されるＨｅｐＢｃバリアントを示す。図１４は、同じ配色を使用し、様々な高分子カーゴのローディングドメイン特徴およびローディング機構を提供する。
【0117】
【表2】
【0118】
ＣＦＰＳ生成物の混合物からのＨｅｐＢｃバリアントの精製は、ヘキサヒスチジン精製タグにアクセスできないようにする早期ＶＬＰ組織化によって時折妨げられた。ＣＦＰＳ反応に還元剤（４ｍＭの還元グルタチオン（ＧＳＨ））を添加し、標準的な１７５ｍＭ濃度の代わりに５０ｍＭのＫｇｌｕｔａｍａｔｅを含むことによりイオン強度を低減し、サブユニット精製およびその後のカーゴローディングを改善した。場合によっては、Ａ１３１Ｋバリアントを、ＳＳ１およびＳＳ８変異なしで使用した。各バリアントを組織化するために使用されるＮａＣｌ濃度およびＶＬＰ組織化の程度については、表３を参照されたい。
【0119】
【表3】
【0120】
核酸をローディングすること。本実施例は、イオン対合および疎水性引力という２つの異なる吸着原理を用いた核酸のローディングについて説明する。記載されるように、ｓｓＤＮＡを使用してｓｉＲＮＡを模倣し、２つの異なるｓｓＤＮＡ構築物、すなわち、イオン対合媒介性ローディングのためのＳＨ－ｓｓＤＮＡ－６ＦＡＭ、および疎水性媒介性ローディングのためのＳＨ－ｓｓＤＮＡ－６ＦＡＭ－Ｃｈｏｌが使用される。これらを図１５に示す。ＳＨは、３または６個の炭素鎖のいずれかの後にｓｓＤＮＡに結合した遊離スルフヒドリルを指し、６ＦＡＭは、好都合な検出のためにｓｓＤＮＡにコンジュゲートされた６－カルボキシフルオレセイン、および蛍光プローブを指し、Ｃｈｏｌは、疎水性ローディング「フック」を提供するために使用されるトリエチレングリコール（ＴＥＧ）スペーサーを有するコレステロールを指す。２２ｎｔ ｓｓＤＮＡ配列の実際の配列は、アンドロゲン受容体に対する既知の抗ＰＣａ ｓｉＲＮＡを模倣する。遊離スルフヒドリル修飾は、ＶＬＰ細孔を通る脱出を防止するために、ローディング後のＶＬＰ内面への条件付きコンジュゲートを可能にする。蛍光修飾は、ローディング中の追跡のみのためであり、送達は、最終的なｓｉＲＮＡ治療薬中に存在しない。２つの構築物は、コレステロール－ＴＥＧ疎水性ローディング「フック」の有無において異なる。
【0121】
カーゴローディングは、精製されたＨｅｐＢｃサブユニットに所望のカーゴを添加し、混合物が平衡で会合することを可能にし、イオン対合相互作用（この場合、ＳＨ－ｓｓＤＮＡ－６ＦＡＭをローディングする）を介したローディングのためのイオン強度を０．５Ｍに増加させることによって、または疎水性相互作用（この場合、ＳＨ－ｓｓＤＮＡ－６ＦＡＭ－Ｃｈｏｌをローディングする）を介したローディングのための２．５ＭのＮａＣｌに増加させることによって、同時カーゴローディングおよびＶＬＰ組織化を誘導することによって実施される。サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を使用して、ＶＬＰを組織化されていないサブユニットから分離し、ローディングされていないＤＮＡからも分離する。各画分を放射能について分析して、ＨｅｐＢｃタンパク質の存在を決定し、蛍光について分析して、ｓｓＤＮＡカーゴの存在を決定する。１～２μｇ／ｍＬのＤＮＡでは、ＶＬＰピークに関連する蛍光の有意な増加が見られる。ＣｙｓまたはＣｙｓ－Ａｒｇ－Ｃｙｓカーゴローディング／保持ドメインのいずれかを含有する２つの異なるＡ１３１Ｋ ＨｅｐＢｃバリアントを０．５ＭのＮａＣｌでローディングした（図１６および１７）。ＳＨ－ｓｓＤＮＡ－６ＦＡＭ－Ｃｈｏｌを、（Ｉｌｅ－Ｇｌｙ）２－Ｉｌｅ－Ｃｙｓカーゴローディング／保持ドメインを含有するが、Ａ１３１Ｋ変異を欠くＨｅｐＢｃバリアントに、２．５ＭのＮａＣｌでローディングした。このＶＬＰを組織化するには１．５ＭのＮａＣｌしか必要ないが、イオン強度を上げるとカーゴローディングの原動力が増加する（図１８）。
【0122】
上記のＳＥＣ結果において、ローディングされていないｓｓＤＮＡがローディングしたｓｓＤＮＡに近いことを考慮して、ＶＬＰがｓｓＤＮＡでローディングしたことを検証するために、追加の方法を用いた。まず、天然アガロースゲル（臭化エチジウム、尿素、ＳＤＳ、または任意のローディング染料を欠く）を使用して、ＶＬＰ内にローディングされたｓｓＤＮＡをローディングされていないｓｓＤＮＡから分離し、Ｇｅｎｅｒａｌ Ｅｌｅｃｔｒｉｃ（ＧＥ）Ｔｙｐｈｏｏｎ平床蛍光スキャナ（ｓｓＤＮＡ構築物が蛍光であるため）を使用して可視化した。図１９に示すように、ＶＬＰ内のｓｓＤＮＡは、遊離ｓｓＤＮＡと比較して著しく上昇している。加えて、還元後、ｓｓＤＮＡは、組織化されたＶＬＰから放出され、遊離ｓｓＤＮＡの電気泳動移動度と一致し、カーゴのジスルフィド結合に基づくコンジュゲーションが必要であることを示唆する。加えて、サンプルを「洗浄」して、ローディングされていないｓｓＤＮＡを除去し、ｓｓＤＮＡがローディングされ、保持されたことを検証した。サンプルを最初に１５倍希釈し、続いて５０ｋＤａの分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｕｌｔｒａ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｆｉｌｔｅｒ（ＶＬＰ分子量は４．３ＭＤａであり、ｓｓＤＮＡは８ｋＤａである）を使用して濃縮した（ＶＬＰを保持したが、ローディングされていないｓｓＤＮＡを除去した）。
【0123】
個々のＶＬＰ当たりにローディングしたｓｓＤＮＡの分子を、「洗浄」ステップの前および後のＳＥＣデータの各画分について計算した（図２０）。ＨｅｐＢｃ ＨＰ Ａ１３１Ｋ ６Ｈ－ＣＲＣ ＶＬＰは、ＳＨ－ｓｓＤＮＡ－６ＦＡＭ（ＶＬＰあたり約１０）を使用して、最高ローディングを得たが、疎水性ベースのローディングは、同様であった（ＶＬＰあたり約６）。ＨＰ Ａ１３１Ｋ ６Ｈ－Ｃを用いた受動的ローディングは有意に低かった（ＶＬＰ当たり約２）、これは、カーゴローディングドメイン設計が有益であることを示唆している。これらの値は、ＨｅｐＢｃ ＶＬＰ内にｓｉＲＮＡをローディングするための現在公開されているいずれの結果よりも高い（最も公開されているのは４ｓｉＲＮＡ／ＶＬＰである）。
【0124】
タンパク質のローディング。ＶＬＰ内のタンパク質のローディングを実証するために、ローディングの便宜的な検出のためにスーパーフォルダＧＦＰ（ｓｆＧＦＰ）を使用し、リジンおよびフェニルアラニンを提示してＣ末端ポリペプチド伸長を添加して、ＨｅｐＢｃタンパク質上のＩＧＩＧＩＣ Ｃ末端伸長に疎水性引力を提供した。
【0125】
ｓｆＧＦＰ－ＫＦまたはｓｆＧＦＰ－ＫＦＫＦのいずれかを、精製ＨｅｐＢｃ ＨＰ ２ＡＳＶｉｎｓ ＳＳ１ ＳＳ８ ８０Ｍ ６Ｈ－ＩＧＩＧＩＣサブユニットに添加し、組織化を２．５ＭのＮａＣｌによって誘導した。ＳＥＣを使用して、組織化されていないＨｅｐＢｃサブユニットおよびローディングされていないタンパク質からＶＬＰを分離した。各画分を、放射能について分析して、ＨｅｐＢｃタンパク質の濃度を決定し、蛍光について分析して、ｓｆＧＦＰ－ＫＦまたはｓｆＧＦＰ－ＫＦＫＦカーゴの量を決定した。ローディング結果の要約を図２１に示す。
【0126】
特定の細胞標的化およびカーゴ送達。特定の標的化を可能にするために、「クリック」反応を使用して、前述のように、ＶＬＰの表面上に抗ＰＳＭＡ ＤＮＡアプタマーを提示した。抗ＰＳＭＡ ＤＮＡアプタマーは、以前に記載された（Ｂｏｙａｃｉｏｇｌｕ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．－ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ２，ｅ１０７（２０１３））。本明細書で使用される構築物は、ＶＬＰへのコンジュゲーションのためにアルキンで伸長された単一のアプタマードメイン（アジドホモアラニン、ＡＨＡを示す）のみを含有する。「クリック」反応を介してリガンドをＶＬＰに結合させるための以前に開発された方法を使用して、ＶＬＰ当たり最大１５個のアプタマーのコピーを提示することができる（図２２）。
【0127】
このアプタマーを提示するＶＬＰが、ＰＣａ（前立腺癌）細胞に特異的に結合することができることを示すために、ＬＮＣａＰ（ＰＳＭＡ＋）細胞およびＰＣ－３（ＰＭＳＡ－）細胞を使用した細胞結合アッセイを用いた。細胞を培養プレートから分離し、洗浄し、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に再懸濁した。抗ＰＳＭＡ ＤＮＡアプタマーを示す異なる濃度の放射性ＶＬＰを細胞に添加し、４℃で３時間インキュベートさせた。インキュベーション後、細胞をペレット化し、上清を、放射能を介して残りのＶＬＰについてサンプリングした。細胞に関連付けられたＶＬＰの濃度を計算することにより、結合親和性を推定した。具体的には、ＶＬＰは、いくつかの抗ＰＳＭＡ抗体（ＫＤ＝１．８、１１、１８ｎＭ）の親和性と同様に、ＬＮＣａＰ（ＰＳＭＡ＋）細胞（ＫＤ＝４．６ｎＭ）に対して強いアビディティを示し、無視可能なＰＣ－３（ＰＳＭＡ－）細胞結合が観察された。加えて、漸近体を分析することによって、ＬＮＣａＰ細胞の結合能力は、ＰＳＭＡ／細胞と同じ順序でおよそ４～５００万ＶＬＰであることが決定され、最大結合能力を示す。
【0128】
次いで、細胞標的化特異性を、ＣｙｔｏＦｌｅｘフローサイトメーターを使用して分析した。まず、付着したアプタマーの有無にかかわらず、蛍光ＢＤＦＬをローディングしたＶＬＰを３７℃で接着性ＬＮＣａＰまたはＰＣ－３細胞に添加した。培養物を４時間または２０時間インキュベートし、その後分離し、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むＰＢＳで洗浄した。次いで、フローサイトメーターによって細胞を分析し、各生細胞に関連する蛍光を各サンプルについて決定した。結果を図２３に示す。アプタマーを欠くＶＬＰおよびＰＣ－３細胞で見られるように、いくつかの非特異的結合が存在するが、アプタマーを提示するＶＬＰは、ＰＳＭＡ＋ＬＮＣａＰ細胞への結合が有意に多いことを示す。
【0129】
また、アプタマーの有無にかかわらず、蛍光ＢＤＦＬをローディングしたＶＬＰを３７℃で接着性ＬＮＣａＰまたはＰＣ－３細胞に添加することによって、Ｎｉｋｏｎ Ｔｉ－Ｅ反転エピ蛍光顕微鏡を使用して細胞標的化特異性を分析した。培養物を４時間インキュベートしてから培地を除去し、０．０１％のＴｗｅｅｎ－２０を含むＰＢＳで洗浄した。次いで、生培養物を撮像した。いくつかの非特異的結合がＰＣ－３細胞で見られるが、ＬＮＣａＰ細胞では有意により多くの結合が見られるため、結果は、フローサイトメトリーの結果を支持する。
【0130】
Ｎｉｋｏｎ Ｔｉ－Ｅ反転エピ蛍光顕微鏡。アプタマーの有無にかかわらず、蛍光ＢＤＦＬをローディングしたＶＬＰを３７℃で接着性ＬＮＣａＰまたはＰＣ－３細胞に添加することによって、より厳密なアッセイを実施した。培地を除去する前に、培養物を再び４時間インキュベートした。しかしながら、今回、細胞を、５００ｍＭのＮａＣｌを含む０．５％酢酸で洗浄した。これは、治療薬がエンドサイトーシスを受けているか否かを判断するために役立つように、表面結合タンパク質を除去する前に使用されている。次いで、生培養物を、エピ蛍光顕微鏡を使用して撮像した。ここでの結果は、受容体媒介性内在化が、アプタマーおよびＬＮＣａＰ細胞を示すＶＬＰでのみ生じることを示す。アプタマーを含まないＰＣ－３細胞およびＶＬＰは、無視可能な量の内部移行を示す。
【0131】
本明細書で提示される作業は、ＶＬＰシェルの外面および内面への変化の影響を検討する。外面を、ＨｅｐＢｃタンパク質中の８０位に組み込まれたＡＨＡによって修飾し、「クリック」ケミストリーを使用して抗ＰＳＭＡ ＤＮＡアプタマーを提示した。内面は、異なるカーゴのローディングを可能にするためにＣ末端ドメインを変異させることによって修飾した。３つすべての層への修飾を組み合わせることにより、この新規のナノ粒子を、多くの疾患に対する非常に効果的で標的化された治療として使用することが可能になる。
【0132】
ＰＣａは、モデル疾患標的として使用されるが、プラットフォームは、いくつかの疾患の治療を開発するために有用である。ビヒクルの機能を３つの異なる層に分離することによって、疾患標的、治療用カーゴ、または組織化要件を改変するためにＶＬＰを別々に修飾することができる。本明細書に示されるように、アプタマーベースの標的化は非常に有効であり得るが、このシステムはまた、抗体断片またはｓｃＦｖなどのタンパク質ベースの標的化剤を容易に使用することができる。
【0133】
カーゴローディング作業は、異なるタイプのカーゴ（タンパク質および核酸）をローディングすること、ならびに異なるローディング機構（イオン対合引力または疎水性ベースの方法）を使用することに焦点を当てた。結果は、それらの表面特性または単純ローディングタグの影響に基づいて、新しい治療薬をローディングするための実現可能性を示す。ジスルフィド結合に基づく保持機構の開発はまた、ローディングされ得るカーゴのサイズ範囲を広げる。
【0134】
この作業は、ｓｉＲＮＡなどの多くの治療用カーゴについて、プロヒビチン－１、アンドロゲン受容体、ＥＧＦＲ、およびサバイビンなどのサイレンス遺伝子、ならびにグランザイムＢなどのタンパク質に伸長されてアポトーシスを誘導することができる。
【0135】
材料および方法
ＶＬＰ変異誘発試験。本試験で使用した各種ＨｅｐＢｃおよびＧＦＰバリアントを、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ変異誘発およびＩＤＴからのプライマーを使用して作製した。配列をＳｅｑｕｅｔｅｃｈによるＤＮＡ配列決定によって検証した。
ＶＬＰ変異誘発試験。本試験で使用した各種ＨｅｐＢｃおよびＧＦＰバリアントを、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ変異誘発およびＩＤＴからのプライマーを使用して作製した。配列をＳｅｑｕｅｔｅｃｈによるＤＮＡ配列決定によって検証した。
【0136】
無細胞タンパク質合成反応。ＨｅｐＢｃタンパク質の初期発現反応は、前述のように、ＰＡＮＯｘ－ＳＰ無細胞プロトコルを使用した。Ｂｒａｕｎ １０Ｌ Ｂｉｏｓｔａｔ Ｃ発酵槽で増殖させたＡ１９ｍｅｔ＋、ΔｔｏｎＡ、ΔｔｎａＡ、ΔｓｐｅＡ、ΔｅｎｄＡ、ΔｓｄａＡ、ΔｓｄａＢ，ΔｇｓｈＡ Ｅ．ｃｏｌｉ細胞（株ＫＣ６）から細胞抽出物を調製した。本抽出物に加えて、タンパク質合成に必要な小分子試薬、精製したＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ、および関心対象のプラスミドを添加した。プラスミドを、Ｑｉａｇｅｎ Ｍａｘｉｐｒｅｐ精製キットを使用して調製し、イソプロパノール／エタノール洗浄ステップを含めた。標準アミノ酸に加えて、組み込まれた放射能を測定することによって合成タンパク質の定量化を可能にするために、５μＭの１４Ｃ－ロイシンも加えた。ＰａｎＯｘ－ＳＰ反応を複数のスケールで実施した。２ｍＬのＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブ中５０μＬ、密封された６ウェル組織培養プレート中６００μＬ、または密封された１０ｃｍのペトリ皿中６ｍＬ。反応物を２０～３０℃で様々な時間インキュベートした。液体シンチレーションカウントを使用して組み込まれた放射能を測定することによって、タンパク質濃度を決定した。全生成物サンプルを直接測定し、可溶性生成物サンプルを、１０ｋｘｇで１５分間遠心分離して不溶物を除去した後に測定した。両方のサンプルを、５％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）でＷｈａｔｍａｎ濾紙上に沈殿させた後、５％ＴＣＡで３回洗浄して、組み込まれなかった１４Ｃ－ロイシンを除去する。場合によっては、正常な１７５ｍＭのＫｇｌｕｔａｍａｔｅ濃度を、早期ＨｅｐＢｃサブユニットの会合を避けるために、より低いイオン強度でのタンパク質合成のために５０ｍＭに低減した。
【0137】
ＶＬＰ精製方法。上記のように、標準的な無細胞タンパク質合成反応を使用して、ＨｅｐＢｃタンパク質を発現させた。１０ｋｘｇで１５分間の遠心分離を使用して不溶性を除去した。改良された精製戦略は、可溶性画分をＮｉ－ＮＴＡ樹脂にローディングする前に、まずＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５樹脂を使用して、サンプルを５０ｍＭのＴｒｉｓ、２５ｍＭのイミダゾール、０．１％のＴｗｅｅｎ－２０、ｐＨ７．４に交換した。Ｎｉ－ＮＴＡカラムにローディングした後、サンプルを、４カラム体積（ＣＶ）の５０ｍＭのＴｒｉｓ、２５ｍＭのイミダゾール、０．１％のＴｗｅｅｎ－２０、ｐＨ７．４で洗浄し、５ＣＶの５０ｍＭのＴｒｉｓ、２５０ｍＭのイミダゾール、０．１％のＴｗｅｅｎ－２０、ｐＨ７．４で溶出した。次いで、ＨｅｐＢｃサブユニットを含有する溶出画分を、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５樹脂（８．３ｍＬの樹脂にローディングされた２．５ｍＬのサンプル）に再び適用して、イミダゾールを除去し、５０ｍＭのＴｒｉｓ、０．１％のＴｗｅｅｎ－２０、ｐＨ７．４に交換した。Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅからの３ｋＤａ分子量カットオフフィルターを使用して、撹拌細胞濃縮器または限外濾過ベースの遠心濃縮器を使用してサンプルを濃縮した。５０ｍＭのＴｒｉｓ、５ＭのＮａＣｌ、０．１％のＴｗｅｅｎ－２０、ｐＨ７．４の原液から、０．５～２．５ＭのＮａＣｌを直接添加することによって、ＶＬＰ組織化を誘導した。組織化されたＶＬＰを定量化し、２００μＬのサンプルを２．２ｍＬのＳｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗのサイズ排除カラムに適用し、組織化緩衝液を適用し、２４×１５０μＬ画分を収集することによって精製した。各画分中のタンパク質濃度は、液体シンチレーションカウントを使用して放射能を測定することによって決定した。第１のピーク（典型的には、画分５と１０との間）を、ＶＬＰとして収集した。その後、これらのＶＬＰを２０～５０ｍＭのジアミドを使用して酸化して、安定化ジスルフィド結合を形成した。次いで、ジアミドを、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５樹脂を使用して除去し、サンプルを５０ｍＭのＴｒｉｓ、０．１％のＴｗｅｅｎ－２０、ｐＨ７．４に交換した。
【0138】
早期組織化を低減するように修飾されたＶＬＰ発現方法。早期ＶＬＰ組織化を低減するために、２つの大きな変更が行われた。まず、無細胞タンパク質合成反応を、グルタミン酸カリウムを１７５ｍＭから５０ｍＭに低減させることにより、より低いイオン強度（２１５ｍＭの代わりに９０ｍＭ）を含有するように改変させた。第２の変化は、４ｍＭの還元グルタチオンを無細胞タンパク質合成反応に添加して、ジスルフィド結合形成を防止することであった。
【0139】
早期ＶＬＰ組織化のＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびオートラジオグラム分析（ａｕｔｏｒａｄｉｏｇｒａｍ ａｎａｌｙｓｉｓ）。タンパク質サイズは、ドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）および自動放射線撮影によって分析した。ＮｕＰＡＧＥ Ｎｏｖｅｘプレキャストゲルおよび試薬をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）から購入した。サンプルをローディング緩衝液（１×ＬＤＳローディング緩衝液および５０ｍＭジチオスレイトール）中で９０℃で１０分間変性させた。サンプルを、Ｍａｒｋ１２分子量タンパク質標準のための別々のレーンを有する１０％（ｗ／ｖ）のＢｉｓ－Ｔｒｉｓプレキャストゲルにローディングし、ＭＥＳ／ＳＤＳランニング緩衝液中で電気泳動を行った。ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ ＳａｆｅＳｔａｉｎを使用して、メーカーの推奨に従ってゲルを染色および固定した。ゲル乾燥機モデル５８３（Ｂｉｏ－Ｒａｄ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）を使用してゲルを乾燥させた後、ストレージホスファスクリーン（ｓｔｏｒａｇｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒ ｓｃｒｅｅｎ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）に曝露し、その後、Ｔｙｐｈｏｏｎ Ｓｃａｎｎｅｒ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用してスキャンした。
【0140】
ＶＬＰ内でのカーゴのローディング。ＮａＣｌを添加することによって自己組織化を誘導する前に、ＨｅｐＢｃ単量体を所望のカーゴと室温で３０分間インキュベートした。ＨｅｐＢｃ単量体は、１０～５０μＭであり、カーゴを２０～５００μＭで添加した。上記のように０．５～２．５ＭのＮａＣｌを添加することによって自己組織化を誘導した後、まず、２００μＬのサンプルを２．２ｍＬのＳｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗのサイズ排除クロマトグラフィー樹脂に適用し、組織化緩衝液で２４×１５０μＬ画分を溶出することによって、ローディングを決定した。各画分中のＨｅｐＢｃ濃度は、液体シンチレーションカウントを使用して放射能を測定することによって決定した。各画分中のカーゴ濃度は、９６ウェルのフルオリメータを使用して蛍光を測定することによって決定した。第１のピーク（典型的には、画分５と１０との間）をＶＬＰとして収集し、ローディングのために定量化した。
【0141】
ｓｓＤＮＡローディングサンプルを、天然アガロースゲル電気泳動を使用して分析した。各サンプル１５μＬを、ＴＢＥ緩衝液中の１％アガロースゲルにローディングした。１００Ｖをゲルに４５分間適用し、ゲルを、Ｔｙｐｈｏｏｎ Ｓｃａｎｎｅｒ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して蛍光について撮像した。サンプルを１５倍に希釈し、限外濾過膜を使用して１倍濃度に戻した。５０ｋＤａの分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｕｌｔｒａ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｆｉｌｔｅｒｓを使用して、ローディングされていないｓｓＤＮＡを除去した（ＶＬＰ分子量は４．３ＭＤａであり、ｓｓＤＮＡは８ｋＤａである）。次いで、サンプルを、液体シンチレーションカウントを使用して放射能について分析し、蛍光計を使用して、ローディングを定量化した。
【0142】
「クリック」反応による表面官能基化。精製および酸化されたＶＬＰの表面を、銅（Ｉ）触媒シクロ付加反応（「クリック」反応としても知られる）を介してＤＮＡアプタマーをそれらの表面にコンジュゲーションすることによって修飾した。４０～８５ｎＭのＨｅｐＢｃ ＶＬＰを、ｐＨ８で５０ｍＭのリン酸緩衝液中の１０～１００μＭのリガンド、０．５ｍＭのＴｒｉｓ（トリアゾリルメチル）アミン、０．０１％のＴｗｅｅｎ－２０、および２ｍＭのテトラキス銅（Ｉ）と組み合わせて、４～１６時間嫌気的に反応させた。上記のように、ＶＬＰ精製のために、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を使用して、銅（Ｉ）およびコンジュゲートされていないリガンドを除去した。コンジュゲーションの程度は、ドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）および自動放射線撮影（データは図示せず）によって決定した。ＮｕＰＡＧＥ Ｎｏｖｅｘプレキャストゲルおよび試薬をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）から購入した。サンプルを、ローディング緩衝液（１×ＬＤＳローディング緩衝液および５０ｍＭのジチオスレイトール）中で９０℃で１０分間変性させた。サンプルを、Ｍａｒｋ １２分子量タンパク質標準のための別々のレーンを有する１０％（ｗ／ｖ）のＢｉｓ－Ｔｒｉｓプレキャストゲルにローディングし、ＭＥＳ／ＳＤＳランニング緩衝液中で電気泳動した。ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ ＳａｆｅＳｔａｉｎを使用して、メーカーの推奨に従ってゲルを染色および固定した。ゲル乾燥機モデル５８３（Ｂｉｏ－Ｒａｄ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）を使用してゲルを乾燥させた後、ストレージホスファスクリーン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）に曝露し、その後、Ｔｙｐｈｏｏｎ Ｓｃａｎｎｅｒ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用してスキャンした。
【0143】
細胞培養。前立腺癌細胞株（ＬＮＣａＰおよびＰＣ－３）を、１０％ＦＢＳ（Ａｌｓｔｅｍ）、１％ペニシリン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、および１％ストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）でＤＭＥＭ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で培養した。細胞を５％ＣＯ２、３７℃で増殖させた。実験に応じて、細胞を９６ウェルプレートまたは６ウェルプレートに播種し、使用前に２日間増殖させた。
【0144】
放射性リガンド細胞結合アッセイ。細胞を６ウェルプレートに播種し、２日後にＶＬＰでインキュベートした。ＬＮＣａＰ細胞を１ウェル当たり３０万個の細胞で播種し、ＰＣ－３細胞を１ウェル当たり１２５，０００個の細胞で播種した。培地を吸引し、ＰＢＳ中０．５ｍＭのＥＤＴＡと３７℃で１０分間インキュベートすることによって細胞を分離した。細胞をエッペンドルフチューブに移し、ペレット化し、１％ＢＳＡを有するＰＢＳで２回洗浄した。次いで、１００，０００個の細胞を含有するサンプルを、抗ＰＳＭＡ ＤＮＡアプタマー（１５個のアプタマー／ＶＬＰ）を示す０～１００ｎＭのＶＬＰとともにインキュベートした。細胞を４℃で３時間インキュベートし、内部移行を低減した。その後、細胞をペレット化し、上清を吸引した。上清中のＶＬＰ濃度は、液体シンチレーションカウントを使用して放射能を測定することによって決定した。
【0145】
フローサイトメトリー。細胞を６ウェルプレートに播種し、２日後にＶＬＰでインキュベートした。ＬＮＣａＰ細胞を１ウェル当たり３０万個の細胞で播種し、ＰＣ－３細胞を１ウェル当たり１２５，０００個の細胞で播種した。２日後、抗ＰＳＭＡ ＤＮＡアプタマー（１５アプタマー／ＶＬＰ）を示すＶＬＰを９ｎＭで各ウェルに添加し、３７℃で４時間インキュベートした。インキュベーション後、培地を吸引し、細胞を、ＰＢＳ中の０．５ｍＭのＥＤＴＡとともに、３７℃で１０分間インキュベートすることによって脱離した。細胞をエッペンドルフチューブに移し、ペレット化し、１０％ＦＢＳを含むＰＢＳで２回洗浄した。細胞を、１０％ＦＢＳを有する２００μＬのＰＢＳ中に再懸濁し、０．３５ミクロンフィルターを通してチューブに移した。次いで、中程度の流量を有し、サンプル当たり４０００個を超える生細胞をカウントするＣｙｔｏＦｌｅｘフローサイトメーターを使用して、サンプルを分析した。データをＦｌｏｗＪｏで分析した。
【0146】
蛍光顕微鏡。ＶＬＰと一緒にインキュベートする２日前に、ＬＮＣａＰ細胞をウェル当たり１０，０００細胞で播種し、ＰＣ－３細胞をウェル当たり３，０００細胞で播種した。２日後、抗ＰＳＭＡ ＤＮＡアプタマー（１５アプタマー／ＶＬＰ）を示すＶＬＰを９ｎＭで各ウェルに添加し、３７℃で４時間インキュベートした。インキュベーション後、培地を吸引し、細胞を、１０％ＦＢＳを含むＰＢＳで２回洗浄した。Ｎｉｋｏｎ Ｔｉ－Ｅ反転エピ蛍光顕微鏡を用いて、９６ウェルプレート中の培養物の画像を撮影した。
【0147】
実施例４
改善されたウイルス様粒子安定化
この実施例は、二重ジスルフィドブリッジネットワークを使用した安定化されたウイルス様粒子を説明する。これにより、ナノ粒子が分解されて、わずかに還元された条件下で、低イオン強度緩衝液中でより小さなサブユニットを形成することを防止する。
改善されたウイルス様粒子安定化
この実施例は、二重ジスルフィドブリッジネットワークを使用した安定化されたウイルス様粒子を説明する。これにより、ナノ粒子が分解されて、わずかに還元された条件下で、低イオン強度緩衝液中でより小さなサブユニットを形成することを防止する。
【0148】
軽度の還元条件下での溶液安定性が向上したウイルス様粒子（ＶＬＰ）変異体が提供される。これは、２４０個のＶＬＰサブユニットの各々を接続する２つのジスルフィド架橋を組み合わせることによって達成される。これは、以前にＶＬＰタンパク質に導入されたＤ２９Ｃ－Ｒ１２７Ｃジスルフィド対に、Ｐ１３４Ｃ－Ｎ１３６Ｃ対を付加することによって構築され、これは、ＶＬＰサブユニットをＣ末端に近づけて安定化させる。二重ジスルフィド架橋変異体は、これらの粒子の下流官能化に必要な軽度の還元条件にわたってより強力に安定化される。
【0149】
単一の硫化物架橋によって安定化されたＶＬＰは、Ｃｕ（Ｉ）触媒「クリック」反応の穏やかな還元環境上で分解することが見出された。この反応物は、ＶＬＰ骨格を官能化するための便利な方法である。組織化されたままのＶＬＰが非常に望ましい。
【0150】
クマシー染色非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルを、嫌気性Ｃｕ（Ｉ）触媒コンジュゲーション反応の穏やかな還元条件に曝露した後、単一のジスルフィドネットワーク安定化ＨＢｃバリアントで実施した。ＶＬＰのサブユニットがゲル中に移動することが観察されたため、ＶＬＰは不安定となっている。完全に安定化され、組織化されたＶＬＰが大きすぎて、ゲル内に移行することができない。二重ジスルフィドネットワーク安定化ＨＢｃバリアントを、Ｃｕ（Ｉ）触媒コンジュゲーション反応の同じ穏やかな還元条件に曝露した。より感度が高いオートラジオグラムを使用しても、不安定化サブユニットは観察されない。
【0151】
方法
Ｂ型肝炎コア（ＨＢｃ）タンパク質を、前述のように、ＰＡＮＯｘ－ＳＰ細胞遊離プラットフォームを使用して発現させた。ＫＣ６株（Ａ１９ｍｅｔ＋、ΔｔｏｎＡ、ΔｔｎａＡ、ΔｓｐｅＡ、ΔｅｎｄＡ、ΔｓｄａＡ、ΔｓｄａＢ、ΔｇｓｈＡ）の細胞抽出物を使用してＨＢｃを調製した。細胞抽出物は、Ｂｒａｕｎ １０Ｌ Ｂｉｏｓｔａｔ Ｃ発酵機を使用するか、またはシェイクフラスコ培養物を使用して調製した。この抽出物に加えて、タンパク質合成に必要な低分子試薬（１０ｍＭのグルタミン酸マグネシウム、１０ｍＭのグルタミン酸アンモニウム、１７５ｍＭのグルタミン酸カリウム、１．２５ｍＭのＡＴＰ、１ｍＭのＧＴＰ、１ｍＭのＵＴＰ、１ｍＭのＣＴＰ、３４μｇ／ｍＬのフォリン酸、１７０．６μｇ／ｍＬのｔＲＮＡ、グルタミン酸を除く２０個の天然アミノ酸の各々２ｍＭ、３０ｍＭのホスホエノールピルビン酸塩、０．３３ｍＭのＮＡＤ、０．２７ｍＭのＣｏＡ、２．７ｍＭのシュウ酸、１ｍＭのプトレシン、および１．５ｍＭのスペルミジン）、精製Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、および関心対象のプラスミドを添加した。プラスミドは、反応に添加された最後の成分であった。イソプロパノール／エタノール洗浄ステップを含むＱｉａｇｅｎ Ｍａｘｉｐｒｅｐ精製キットを使用してプラスミドを調製した。標準アミノ酸に加えて、５μＭの１４Ｃ－ロイシンも加えて、組み込まれた放射能を測定することによって合成タンパク質の定量化を可能にした。
Ｂ型肝炎コア（ＨＢｃ）タンパク質を、前述のように、ＰＡＮＯｘ－ＳＰ細胞遊離プラットフォームを使用して発現させた。ＫＣ６株（Ａ１９ｍｅｔ＋、ΔｔｏｎＡ、ΔｔｎａＡ、ΔｓｐｅＡ、ΔｅｎｄＡ、ΔｓｄａＡ、ΔｓｄａＢ、ΔｇｓｈＡ）の細胞抽出物を使用してＨＢｃを調製した。細胞抽出物は、Ｂｒａｕｎ １０Ｌ Ｂｉｏｓｔａｔ Ｃ発酵機を使用するか、またはシェイクフラスコ培養物を使用して調製した。この抽出物に加えて、タンパク質合成に必要な低分子試薬（１０ｍＭのグルタミン酸マグネシウム、１０ｍＭのグルタミン酸アンモニウム、１７５ｍＭのグルタミン酸カリウム、１．２５ｍＭのＡＴＰ、１ｍＭのＧＴＰ、１ｍＭのＵＴＰ、１ｍＭのＣＴＰ、３４μｇ／ｍＬのフォリン酸、１７０．６μｇ／ｍＬのｔＲＮＡ、グルタミン酸を除く２０個の天然アミノ酸の各々２ｍＭ、３０ｍＭのホスホエノールピルビン酸塩、０．３３ｍＭのＮＡＤ、０．２７ｍＭのＣｏＡ、２．７ｍＭのシュウ酸、１ｍＭのプトレシン、および１．５ｍＭのスペルミジン）、精製Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、および関心対象のプラスミドを添加した。プラスミドは、反応に添加された最後の成分であった。イソプロパノール／エタノール洗浄ステップを含むＱｉａｇｅｎ Ｍａｘｉｐｒｅｐ精製キットを使用してプラスミドを調製した。標準アミノ酸に加えて、５μＭの１４Ｃ－ロイシンも加えて、組み込まれた放射能を測定することによって合成タンパク質の定量化を可能にした。
【0152】
反応を複数のスケール、すなわち、１．５ｍＬのエッペンドルフチューブ中５０μＬ、密封された６ウェル組織培養プレート中５００μＬ～１ｍＬ、または密封された１０ｃｍのペトリ皿中３～６ｍＬで実施した。反応物を３０℃で６時間インキュベートした。タンパク質濃度は、液体シンチレーションカウントを使用して組み込まれた放射能を測定することによって決定した（Ｂｅｃｋｍａｎ ＬＳ６０００ ＳＣ）。総タンパク質サンプルを直接測定し、１０ｋ ｒｃｆで１５分間遠心分離して不溶性タンパク質を除去した後、可溶性タンパク質サンプルを測定した。両方のサンプルをＷｈａｔｍａｎフィルターペーパー上で沈殿させた後、５％トリクロロ酢酸で３回洗浄して、組み込まれなかった１４Ｃ－ロイシンを除去した。
【0153】
精製戦略は、まず、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５樹脂（Ｇｅｎｅｒａｌ Ｅｌｅｃｔｒｉｃ）を使用して、可溶性画分を等体積のＮｉ－ＮＴＡ樹脂（Ｑｉａｇｅｎ）にローディングする前に、サンプルを５０ｍＭのＴｒｉｓ、２５ｍＭのイミダゾール、０．１％のＴｗｅｅｎ－２０、ｐＨ７．４に交換した。不溶性タンパク質を、１０ｋ ｒｃｆで１５分間遠心分離を使用して除去した。Ｎｉ－ＮＴＡカラムにローディングした後、サンプルを、５０ｍＭのＴｒｉｓ、２５ｍＭのイミダゾール、０．１％のＴｗｅｅｎ－２０、ｐＨ７．４の５カラム体積（ＣＶ）で洗浄し、０．５ＣＶ画分（合計４ＣＶ）の５０ｍＭのＴｒｉｓ、２５０ｍＭのイミダゾール、０．１％のＴｗｅｅｎ－２０、ｐＨ７．４で溶出した。液体シンチレーションカウントを使用して組み込まれた放射能を測定することによって、ＨＢｃタンパク質についてサンプルを分析した。次いで、ＨＢｃタンパク質を有するサンプルを再びＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５樹脂に適用して、イミダゾールを除去し、それらを５０ｍＭのＴｒｉｓ、０．１％のＴｗｅｅｎ－２０、ｐＨ７．４に交換した。次いで、サンプルを、撹拌細胞濃縮器またはＭｉｌｌｉｐｏｒｅからの３ｋＤａ分子量カットオフフィルターを使用して、限外濾過ベースの遠心濃縮器を使用して濃縮した。ＶＬＰ組織化を、５０ｍＭのＴｒｉｓ、５ＭのＮａＣｌ、０．１％のＴｗｅｅｎ－２０、ｐＨ７．４の原液から最終濃度１．５ＭのＮａＣｌまで塩スパイクによって誘導した。組織化されたＶＬＰを定量化し、２．２ｍＬのＳｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（Ｇｅｎｅｒａｌ Ｅｌｅｃｔｒｉｃ）サイズ排除クロマトグラフィー樹脂に２００μＬのサンプルを適用し、１８×１５０μＬ画分を溶出させることによって精製した。各画分中のタンパク質濃の度は、液体シンチレーションカウントを使用して放射能を測定することによって決定した。２つのピーク、すなわち、画分５と１０との間のＶＬＰ、および画分１１と１８との間の組織化されていないＨＢｃタンパク質を得た。次いで、組織化パーセンテージを、曲線下面積（ＡｏＣ）を使用して計算した。
【0154】
【数1】
【0155】
変異は、Ｑｕｉｋｃｈａｎｇｅ部位特異的変異誘発を使用して作製した。以下のプライマーを、その逆相補体とともに、Ｑｕｉｋｃｈａｎｇｅ反応で使用して、１３４位および１３６位のアミノ酸残基を変化させた。
【0156】
【表4】
【0157】
【表5】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15A】
【図15B】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【配列表】