▶ シャンハイ インスティチュート オブ ファーマシューティカル インダストリー カンパニー リミテッドの特許一覧 ▶ チャイナ ステート インスティチュート オブ ファーマシューティカル インダストリー カンパニー リミテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-05-20
(45)【発行日】2024-05-28
(54)【発明の名称】肺疾患を治療するための生物学的ペプチドおよびその適用
(51)【国際特許分類】
C07K 7/06 20060101AFI20240521BHJP
C12N 15/09 20060101ALI20240521BHJP
A61K 38/08 20190101ALI20240521BHJP
A61P 11/06 20060101ALI20240521BHJP
A61P 11/00 20060101ALI20240521BHJP
【ＦＩ】
C07K7/06 ZNA
C12N15/09 Z
A61K38/08
A61P11/06
A61P11/00
【請求項の数】
11
(21)【出願番号】P 2022530193
(86)(22)【出願日】2020-11-20
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2023-01-25
(86)【国際出願番号】 CN2020130625
(87)【国際公開番号】W WO2021098854
(87)【国際公開日】2021-05-27
【審査請求日】2022-07-25
(31)【優先権主張番号】201911151330.X
(32)【優先日】2019-11-21
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(31)【優先権主張番号】201911150271.4
(32)【優先日】2019-11-21
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(31)【優先権主張番号】202010568266.1
(32)【優先日】2020-06-19
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(31)【優先権主張番号】202010568997.6
(32)【優先日】2020-06-19
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(73)【特許権者】
【識別番号】522202849
【氏名又は名称】シャンハイ インスティチュート オブ ファーマシューティカル インダストリー カンパニー リミテッド
(73)【特許権者】
【識別番号】522202872
【氏名又は名称】チャイナ ステート インスティチュート オブ ファーマシューティカル インダストリー カンパニー リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】110000578
【氏名又は名称】名古屋国際弁理士法人
(72)【発明者】
【氏名】リウ リー
(72)【発明者】
【氏名】メイ チービョン
(72)【発明者】
【氏名】マ シューメイ
(72)【発明者】
【氏名】リー リャン
(72)【発明者】
【氏名】リウ ナン
(72)【発明者】
【氏名】グ フォンファ
(72)【発明者】
【氏名】ワン ジアフェイ
(72)【発明者】
【氏名】シュー ウェンチ
【審査官】田ノ上 拓自
(56)【参考文献】
【文献】米国特許出願公開第２０１５／０２８４４３０（ＵＳ，Ａ１）
【文献】BioDrugs.，2010年，Vol.24, No.1，p.9-21 (p.1-20)
【文献】Chem. Sci.，2016年，Vol.7，p.2492
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ０７Ｋ １／００－１９／００
Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０
Ａ６１Ｋ ３８／０８
Ａ６１Ｐ １１／０６
Ａ６１Ｐ １１／００
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ポリペプチドまたはその薬学的に許容される塩であって、前記ポリペプチドまたはその薬学的に許容される塩は、アレルギー性喘息を予防、治療および／または緩和するための活性を有し、前記ポリペプチドのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：２に示されることを特徴とする、前記ポリペプチドまたはその薬学的に許容される塩。
【請求項2】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：２に示される前記ポリペプチドにおける３～５個のアミノ酸は、Ｄ型アミノ酸であることを特徴とする請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項3】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示される前記ポリペプチドにおける５個のアミノ酸は、Ｄ型アミノ酸であることを特徴とする請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項4】
単離された核酸分子であって、前記核酸分子は、請求項１に記載のポリペプチドをコードすることを特徴とする、前記単離された核酸分子。
【請求項5】
医薬組成物であって、前記医薬組成物は、
（ａ）請求項１に記載のポリペプチドまたはその薬学的に許容される塩、および
（ｂ）薬学的に許容される担体または賦形剤を含むことを特徴とする、前記医薬組成物。
【請求項6】
アレルギー性喘息の予防、治療および／または緩和において使用するための請求項１に記載のポリペプチドまたはその薬学的に許容される塩。
【請求項7】
ポリペプチドまたはその薬学的に許容される塩であって、前記ポリペプチドまたはその薬学的に許容される塩は、アレルギー性喘息を予防、治療および／または緩和するための活性を有し、
前記ポリペプチドのＮ末端からＣ末端までのアミノ酸配列は、以下の群から選択されるＧＱＴ（Ｇｌｃ）ＹＴ（Ｇｌｃ）Ｓ（Ｇｌｃ）Ｇ；
ＧＱＴ（Ｇｌｃ）ＹＴＳＧ；
ＧＱＴＹＴＳ（Ｇｌｃ）Ｇ；
ＧＱＴ（Ｇｌｃ）ＹＴ（Ｇｌｃ）ＳＧ；
ＧＱＴ（Ｇｌｃ）ＹＴＳ（Ｇｌｃ）Ｇ；
ＧＱＴＹＴ（Ｇｌｃ）Ｓ（Ｇｌｃ）Ｇ
ことを特徴とする、前記ポリペプチドまたはその薬学的に許容される塩。
【請求項8】
医薬組成物であって、前記医薬組成物は、
（ａ）請求項７に記載のポリペプチドまたはその薬学的に許容される塩、および
（ｂ）薬学的に許容される担体または賦形剤を含むことを特徴とする、前記医薬組成物。
【請求項9】
アレルギー性喘息の予防、治療および／または緩和において使用するための請求項７に記載のポリペプチドまたはその薬学的に許容される塩。
【請求項10】
前記医薬組成物の剤形が皮下注射剤または筋肉内注射剤であることを特徴とする請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項11】
（ｉ）炎症の阻害、（ｉｉ）ＩｇＥレベルの低下、（ｉｉｉ）気道抵抗の低下、（ｉｖ）肺コンプライアンスの向上、および／または（ｖ）肺内炎症性細胞浸潤の阻害において使用するための請求項１に記載のポリペプチドまたはその薬学的に許容される塩または請求項７に記載のポリペプチドまたはその薬学的に許容される塩。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【0001】
［技術分野］
本発明は、生物医学の分野に関し、具体的には、肺疾患を治療するための生物学的ペプチドおよびその適用に関する。
本発明は、生物医学の分野に関し、具体的には、肺疾患を治療するための生物学的ペプチドおよびその適用に関する。
【0002】
［背景技術］
ポリペプチドは、アミノ酸の組成およびその接続方法でタンパク質と同じであるが、空間構造が単純で、免疫原性が低いか全くない、生理学的活性が強い等、いくつかの特性がタンパク質とは異なる物質である。しかし、経口利用率が低い、酵素分解性が高い、および半減期が非常に短い等のポリペプチド物質の固有の特性により、それは、薬物の開発および適用において多くの制限を受ける。ポリペプチド薬の不安定性を引き起こす重要な理由は、ポリペプチドの特別な分子構造である。
ポリペプチドは、アミノ酸の組成およびその接続方法でタンパク質と同じであるが、空間構造が単純で、免疫原性が低いか全くない、生理学的活性が強い等、いくつかの特性がタンパク質とは異なる物質である。しかし、経口利用率が低い、酵素分解性が高い、および半減期が非常に短い等のポリペプチド物質の固有の特性により、それは、薬物の開発および適用において多くの制限を受ける。ポリペプチド薬の不安定性を引き起こす重要な理由は、ポリペプチドの特別な分子構造である。
【0003】
喘息および慢性閉塞性肺疾患等の肺疾患は、難治性肺疾患であり、既存の臨床薬では、喘息および慢性閉塞性肺疾患を効果的に治療することは困難である。生物医学技術の発展に伴い、喘息および慢性閉塞性肺疾患に対して多くのポリペプチド薬が開発されたが、これらのポリペプチドは、安定性が低く、インビボ半減期が短く、効果的な治療を行うことが困難であるため、治療薬としては非常に限定される。
【0004】
従って、喘息および慢性閉塞性肺疾患等の肺疾患の効果的な治療のために、安定性が強く、インビボでの作用が長く、および治療効果が高い薬物を開発することは、当技術分野において緊急に必要とされる。
【0005】
［発明の概要］
［発明が解決しようとする課題］
本発明は、７ペプチドに対して構造変化および修飾（例えば、グリコシル化修飾）することにより、その代謝安定性を向上させて、喘息および慢性閉塞性肺疾患等の肺疾患を治療するための薬物として、それを開発および適用することを可能にする。
［発明が解決しようとする課題］
本発明は、７ペプチドに対して構造変化および修飾（例えば、グリコシル化修飾）することにより、その代謝安定性を向上させて、喘息および慢性閉塞性肺疾患等の肺疾患を治療するための薬物として、それを開発および適用することを可能にする。
【0006】
［課題を解決するための手段］
本発明の第１の態様は、式Ｉに示されるポリペプチドまたはその薬学的に許容される塩を提供し、前記ポリペプチドまたはその薬学的に許容される塩は、喘息を予防、治療および／または緩和するための活性を有し、
Ｘ０－Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｘ４－Ｘ５－Ｘ６－Ｘ７－Ｘ８（Ｉ）
式において、
Ｘ０およびＸ８は、それぞれ独立して、存在しないか、または１～３個のアミノ酸のペプチドセグメントであり、
Ｘ１は、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ａｌａからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ２は、Ｓｅｒ、Ｔｈｒからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ３は、Ｔｈｒ、Ｓｅｒからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ４は、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｐｈｅ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ５は、Ｔｈｒ、Ｓｅｒからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ６は、Ｇｌｎ、Ａｓｎからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ７は、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ａｌａからなる群から選択されるアミノ酸である。
本発明の第１の態様は、式Ｉに示されるポリペプチドまたはその薬学的に許容される塩を提供し、前記ポリペプチドまたはその薬学的に許容される塩は、喘息を予防、治療および／または緩和するための活性を有し、
Ｘ０－Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｘ４－Ｘ５－Ｘ６－Ｘ７－Ｘ８（Ｉ）
式において、
Ｘ０およびＸ８は、それぞれ独立して、存在しないか、または１～３個のアミノ酸のペプチドセグメントであり、
Ｘ１は、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ａｌａからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ２は、Ｓｅｒ、Ｔｈｒからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ３は、Ｔｈｒ、Ｓｅｒからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ４は、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｐｈｅ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ５は、Ｔｈｒ、Ｓｅｒからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ６は、Ｇｌｎ、Ａｓｎからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ７は、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ａｌａからなる群から選択されるアミノ酸である。
【0007】
別の好ましい例において、Ｘ０～Ｘ８のうちの一つまたは複数は、Ｄ型アミノ酸である。
別の好ましい例において、Ｘ０～Ｘ８のうちのアミノ酸は、それぞれ独立して、Ｄ型アミノ酸またはＬ型アミノ酸である。
別の好ましい例において、Ｘ０～Ｘ８のうちのアミノ酸は、それぞれ独立して、Ｄ型アミノ酸またはＬ型アミノ酸である。
【0008】
別の好ましい例において、Ｘ０～Ｘ８のうちのアミノ酸は、それぞれ独立して、Ｄ型アミノ酸である。
別の好ましい例において、前記式Ｉに示されるポリペプチドまたはその薬学的に許容される塩は、以下からなる群から選択される一つまたは複数の種の特徴を含み、
Ｘ０およびＸ８は、それぞれ独立して、存在せず、
Ｘ１は、Ｄ－Ｇｌｙであり、
Ｘ２は、Ｄ－Ｓｅであり、
Ｘ３は、Ｄ－Ｔｈｒであり、
Ｘ４は、Ｄ－Ｔｙｒであり、
Ｘ５は、Ｄ－Ｔｈであり、
Ｘ６は、Ｄ－Ｇｌｎであり、および／または
Ｘ７は、Ｄ－Ｇｌｙである。
別の好ましい例において、前記式Ｉに示されるポリペプチドまたはその薬学的に許容される塩は、以下からなる群から選択される一つまたは複数の種の特徴を含み、
Ｘ０およびＸ８は、それぞれ独立して、存在せず、
Ｘ１は、Ｄ－Ｇｌｙであり、
Ｘ２は、Ｄ－Ｓｅであり、
Ｘ３は、Ｄ－Ｔｈｒであり、
Ｘ４は、Ｄ－Ｔｙｒであり、
Ｘ５は、Ｄ－Ｔｈであり、
Ｘ６は、Ｄ－Ｇｌｎであり、および／または
Ｘ７は、Ｄ－Ｇｌｙである。
【0009】
別の好ましい例において、Ｘ０～Ｘ８のうちの１～２個、好ましくは３～５個、より好ましくは６～９個は、Ｄ型アミノ酸である。
別の好ましい例において、前記ポリペプチドの全長は、≦２０個のアミノ酸残基、好ましくは≦１３個のアミノ酸残基、好ましくは≦１２個のアミノ酸残基、好ましくは≦１０個のアミノ酸残基、より好ましくは≦８個のアミノ酸残基、より好ましくは≦７個のアミノ酸残基、最も好ましくは７個のアミノ酸残基である。
別の好ましい例において、前記ポリペプチドの全長は、≦２０個のアミノ酸残基、好ましくは≦１３個のアミノ酸残基、好ましくは≦１２個のアミノ酸残基、好ましくは≦１０個のアミノ酸残基、より好ましくは≦８個のアミノ酸残基、より好ましくは≦７個のアミノ酸残基、最も好ましくは７個のアミノ酸残基である。
【0010】
別の好ましい例において、前記Ｘ０およびＸ８の両方は、存在しないか、または１～３個のアミノ酸のペプチドセグメントである。
別の好ましい例において、前記Ｘ０およびＸ８の両方は、存在しない。
別の好ましい例において、前記Ｘ０およびＸ８の両方は、存在しない。
【0011】
別の好ましい例において、前記ポリペプチドは、
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるアミノ酸配列を有し、長さが５～２０個のアミノ酸（好ましくは８～１２個のアミノ酸）でありポリペプチド、
（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるアミノ酸配列を１～２個のアミノ酸残基の置換、欠失または添加によって形成され、喘息を予防、治療および／または緩和する機能を有する（ａ）から派生されるポリペプチドからなる群から選択される。
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるアミノ酸配列を有し、長さが５～２０個のアミノ酸（好ましくは８～１２個のアミノ酸）でありポリペプチド、
（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるアミノ酸配列を１～２個のアミノ酸残基の置換、欠失または添加によって形成され、喘息を予防、治療および／または緩和する機能を有する（ａ）から派生されるポリペプチドからなる群から選択される。
【0012】
別の好ましい例において、前記派生されたポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるポリペプチドの喘息を予防、治療および／または緩和する活性の≧７０％、好ましくは８０％、より好ましくは８５％、最も好ましくは９０％または９５％以上を保持する。
【0013】
別の好ましい例において、前記派生されたポリペプチドとＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２との相同性は、≧８０％、好ましくは≧９０％、より好ましくは≧９５％である。
【0014】
別の好ましい例において、前記ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：２に示されるポリペプチドからの１～５個、好ましくは１～３個、より好ましくは１～２個のアミノ酸の置換によって、および／または
１～３個、好ましくは１～２個のアミノ酸の欠失によって、および／または
前記ポリペプチドの両端は、それぞれ１～３個、より好ましくは１～２個のアミノ酸の添加によって形成される。
１～３個、好ましくは１～２個のアミノ酸の欠失によって、および／または
前記ポリペプチドの両端は、それぞれ１～３個、より好ましくは１～２個のアミノ酸の添加によって形成される。
【0015】
別の好ましい例において、前記ポリペプチドのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されたとおりである。
別の好ましい例において、前記ポリペプチドのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されたとおりであり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるアミノ酸配列中のすべてのアミノ酸は、Ｄ型アミノ酸である。
別の好ましい例において、前記ポリペプチドのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されたとおりであり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるアミノ酸配列中のすべてのアミノ酸は、Ｄ型アミノ酸である。
【0016】
別の好ましい例において、前記喘息は、アレルギー性喘息、非アレルギー性喘息、遅発性喘息、気流制限型喘息、肥満型喘息、ホルモン抵抗性喘息を含む。
【0017】
本発明の第２の態様は、第１の態様に記載のポリペプチドをコードする単離された核酸分子を提供する。
本発明の第３の態様は、医薬組成物を提供し、前記医薬組成物は、
（ａ）本発明の第１の態様に記載のポリペプチドまたはその薬学的に許容される塩、および
（ｂ）薬学的に許容される担体または賦形剤を含む。
本発明の第３の態様は、医薬組成物を提供し、前記医薬組成物は、
（ａ）本発明の第１の態様に記載のポリペプチドまたはその薬学的に許容される塩、および
（ｂ）薬学的に許容される担体または賦形剤を含む。
【0018】
別の好ましい例において、前記成分（ａ）は、前記医薬組成物の総重量の０．１～９９．９ｗｔ％、好ましくは１０～９９．９ｗｔ％、より好ましくは７０％～９９．９ｗｔ％を占める。
【0019】
別の好ましい例において、前記医薬組成物は、液体、固体、または半固体である。
別の好ましい例において、前記医薬組成物の剤形は、経口剤形、注射剤、スプレー剤、エアロゾル剤または外部用の医薬剤形である。
別の好ましい例において、前記医薬組成物の剤形は、経口剤形、注射剤、スプレー剤、エアロゾル剤または外部用の医薬剤形である。
【0020】
別の好ましい例において、前記医薬組成物の剤形は、錠剤、顆粒剤、カプセル、経口液、または注射剤を含む。
別の好ましい例において、前記医薬組成物は、液体組成物である。
別の好ましい例において、前記医薬組成物は、液体組成物である。
【0021】
別の好ましい例において、前記医薬組成物は、経口製剤である。
別の好ましい例において、前記医薬組成物の剤形は、皮下注射剤または筋肉内注射剤である。
別の好ましい例において、前記医薬組成物の剤形は、皮下注射剤または筋肉内注射剤である。
【0022】
別の好ましい例において、前記薬学的に許容される担体は、注入剤担体および／または注射剤担体からなる群から選択され、好ましくは、前記担体は、生理食塩水、デキストロース食塩水、またはその組み合わせからなる群から選択される一つまたは複数の種の担体である。
【0023】
別の好ましい例において、前記薬学的に許容される担体は、ナノ材料を含む担体であり得る。
別の好ましい例において、前記医薬組成物は、徐放性剤形である。
別の好ましい例において、前記医薬組成物は、徐放性剤形である。
【0024】
別の好ましい例において、前記医薬組成物の剤形は、凍結乾燥粉末である。
別の好ましい例において、前記凍結乾燥粉末は、凍結乾燥保護剤を含む。
別の好ましい例において、前記凍結乾燥粉末は、凍結乾燥保護剤を含む。
【0025】
別の好ましい例において、前記凍結乾燥保護剤は、グルコース、スクロース、マンニトール、またはその組み合わせからなる群から選択される。
【0026】
別の好ましい例において、前記医薬組成物の剤形は、吸入剤である。
別の好ましい例において、前記吸入剤は、凍結乾燥粉末を含む。
別の好ましい例において、前記医薬組成物の剤形は、液体製剤である。
別の好ましい例において、前記吸入剤は、凍結乾燥粉末を含む。
別の好ましい例において、前記医薬組成物の剤形は、液体製剤である。
【0027】
別の好ましい例において、前記液体製剤は、本発明の第１の態様に記載のポリペプチドまたはその薬学的に許容される塩、浸透圧調節剤および水を含む。
【0028】
別の好ましい例において、前記浸透圧調節剤は、塩および／または糖類を含む。
別の好ましい例において、前記塩は、塩化ナトリウムを含む。
別の好ましい例において、前記塩は、塩化ナトリウムを含む。
【0029】
別の好ましい例において、前記糖は、グルコースを含む。
別の好ましい例において、前記医薬組成物の剤形は、スプレー剤である。
別の好ましい例において、前記医薬組成物の剤形は、スプレー剤である。
【0030】
別の好ましい例において、前記医薬組成物の剤形は、エアロゾル剤である。
別の好ましい例において、前記エアロゾル剤は、本発明の第１の態様に記載のポリペプチドまたはその薬学的に許容される塩および推進剤を含む。
別の好ましい例において、前記エアロゾル剤は、本発明の第１の態様に記載のポリペプチドまたはその薬学的に許容される塩および推進剤を含む。
【0031】
別の好ましい例において、前記推進剤は、圧縮二酸化炭素、圧縮窒素ガス、テトラフルオロエタン、ヘプタフルオロプロパン、プロパン、ｎ－ブタン、イソブタンである。
【0032】
別の好ましい例において、前記圧縮二酸化炭素は、液体二酸化炭素である。
別の好ましい例において、前記圧縮窒素ガスは、液体窒素ガスである。別の好ましい例において、前記医薬組成物は、喘息を予防、治療および／または緩和する適用において、単独で、または併用して使用することができる。
別の好ましい例において、前記圧縮窒素ガスは、液体窒素ガスである。別の好ましい例において、前記医薬組成物は、喘息を予防、治療および／または緩和する適用において、単独で、または併用して使用することができる。
【0033】
別の好ましい例において、前記併用使用は、喘息を予防、治療および／または緩和するための他の薬物との併用使用を含む。
別の好ましい例において、前記医薬組成物は、喘息を予防、治療および／または緩和するための他の薬物をさらに含む。
別の好ましい例において、前記医薬組成物は、喘息を予防、治療および／または緩和するための他の薬物をさらに含む。
【0034】
別の好ましい例において、前記喘息を予防、治療および／または緩和するための他の薬物は、糖質コルチコイド、β２受容体アゴニスト、抗コリン作用薬、高分子生物学的標的薬、またはその組み合わせからなる群から選択される。
【0035】
別の好ましい例において、前記糖質コルチコイドは、ベクロメタゾン、フルチカゾン、モメタゾン、ブデソニド、シクレソニド、またはその組み合わせからなる群から選択される。
【0036】
別の好ましい例において、前記β２受容体アゴニストは、アルブテロール、テルブタリン、サルメテロール、ホルモテロール、またはその組み合わせを含む。
【0037】
別の好ましい例において、前記抗コリン作用薬は、臭化イプラトロピウム、臭化チオトロピウム、またはその組み合わせを含む。
別の好ましい例において、前記高分子生物学的標的薬は、ＩｇＥモノクローナル抗体、ＩＬ－４／ＩＬ－４Ｒモノクローナル抗体、ＩＬ－５／ＩＬ－５Ｒモノクローナル抗体、ＴＳＬＰモノクローナル抗体、またはその組み合わせを含む。
別の好ましい例において、前記高分子生物学的標的薬は、ＩｇＥモノクローナル抗体、ＩＬ－４／ＩＬ－４Ｒモノクローナル抗体、ＩＬ－５／ＩＬ－５Ｒモノクローナル抗体、ＴＳＬＰモノクローナル抗体、またはその組み合わせを含む。
【0038】
本発明の第４の態様は、本発明の第１の態様に記載のポリペプチドまたはその薬学的に許容される塩の用途を提供し、薬物の調製に使用され、前記薬物は、喘息を予防、治療および／または緩和するために使用される。
【0039】
別の好ましい例において、前記喘息は、アレルギー性喘息、非アレルギー性喘息、遅発性喘息、気流制限型喘息、肥満型喘息、ホルモン抵抗性喘息を含む。
【0040】
別の好ましい例において、前記アレルギー性喘息は、ＯＶＡ、アジュバント水酸化アルミニウム、またはその組み合わせからなる群から選択されるアレルギー剤によって引き起こされる喘息を含む。
【0041】
別の好ましい例において、前記喘息は、（１）炎症性因子によって引き起こされる喘息を含む。
別の好ましい例において、前記炎症性因子によって引き起こされる喘息は、炎症性因子の分泌または発現の増加によって引き起こされる喘息および／または炎症性因子の活性の増強によって引き起こされる喘息を含む。
別の好ましい例において、前記炎症性因子によって引き起こされる喘息は、炎症性因子の分泌または発現の増加によって引き起こされる喘息および／または炎症性因子の活性の増強によって引き起こされる喘息を含む。
【0042】
別の好ましい例において、前記分泌は、脾臓リンパ球によって、好ましくは、Ｔｈ２細胞によって分泌される。
別の好ましい例において、前記発現は、タンパク質発現、ｍＲＮＡ発現、またはその組み合わせからなる群から選択される。
別の好ましい例において、前記発現は、タンパク質発現、ｍＲＮＡ発現、またはその組み合わせからなる群から選択される。
【0043】
別の好ましい例において、前記炎症性因子は、インターロイキンを含む。
別の好ましい例において、前記インターロイキンは、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－１３、またはその組み合わせからなる群から選択される。
別の好ましい例において、前記インターロイキンは、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－１３、またはその組み合わせからなる群から選択される。
【0044】
別の好ましい例において、前記喘息の予防、治療および／または緩和は、
（ｉ）炎症性因子の阻害、
（ｉｉ）ＩｇＥレベルの低下、
（ｉｉｉ）気道抵抗の低下、
（ｉｖ）肺コンプライアンスの向上、および／または
（ｖ）肺における炎症性細胞浸潤の阻害を含む。
（ｉ）炎症性因子の阻害、
（ｉｉ）ＩｇＥレベルの低下、
（ｉｉｉ）気道抵抗の低下、
（ｉｖ）肺コンプライアンスの向上、および／または
（ｖ）肺における炎症性細胞浸潤の阻害を含む。
【0045】
別の好ましい例において、前記炎症性因子は、インターロイキンを含む。
別の好ましい例において、前記インターロイキンは、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－１３、またはその組み合わせからなる群から選択される。
別の好ましい例において、前記インターロイキンは、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－１３、またはその組み合わせからなる群から選択される。
【0046】
別の好ましい例において、炎症性因子の阻害は、炎症性因子の分泌または発現および／または活性の阻害を含む。
別の好ましい例において、前記ＩｇＥレベルは、血清、全血または血漿中のＩｇＥレベルである。
別の好ましい例において、前記ＩｇＥレベルは、血清、全血または血漿中のＩｇＥレベルである。
【0047】
本発明の第５の態様は、本発明の第１の態様に記載のポリペプチドまたはその薬学的に許容される塩の用途を提供し、薬物の調製に使用され、前記薬物は、（ｉ）炎症の阻害、（ｉｉ）ＩｇＥレベルの低下、（ｉｉｉ）気道抵抗の低下、（ｉｖ）肺コンプライアンスの向上、および／または（ｖ）肺内炎症性細胞浸潤の阻害に使用される。
【0048】
別の好ましい例において、前記炎症は、炎症性因子によって引き起こされる炎症である。
別の好ましい例において、前記炎症性因子は、インターロイキンを含む。
別の好ましい例において、前記炎症性因子は、インターロイキンを含む。
【0049】
別の好ましい例において、前記インターロイキンは、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－１３、またはその組み合わせからなる群から選択される。
本発明の第６の態様は、必要とする対象に本発明の第１の態様に記載のポリペプチドまたはその薬学的に許容される塩を投与する段階を含む、哺乳動物の喘息を予防、治療および／または緩和するための方法を提供する。
本発明の第６の態様は、必要とする対象に本発明の第１の態様に記載のポリペプチドまたはその薬学的に許容される塩を投与する段階を含む、哺乳動物の喘息を予防、治療および／または緩和するための方法を提供する。
【0050】
別の好ましい例において、前記哺乳動物は、ヒトまたは非ヒト哺乳動物を含む。
別の好ましい例において、前記非ヒト哺乳動物は、齧歯類動物（例えば、ラット、マウス）、霊長類動物（例えば、サル）を含む。
別の好ましい例において、前記非ヒト哺乳動物は、齧歯類動物（例えば、ラット、マウス）、霊長類動物（例えば、サル）を含む。
【0051】
別の好ましい例において、前記喘息は、アレルギー性喘息、非アレルギー性喘息、遅発性喘息、気流制限型喘息、肥満型喘息、ホルモン抵抗性喘息、またはその組み合わせからなる群から選択される。
【0052】
別の好ましい例において、前記喘息は、アレルギー性喘息、非アレルギー性喘息、遅発性喘息、気流制限型喘息、肥満型喘息、ホルモン抵抗性喘息を含む。
【0053】
別の好ましい例において、前記投与は、経口、経鼻吸入、筋肉内注射、または静脈内注射を含む。
本発明の第７の態様は、式ＩＩに示されるポリペプチドまたはその薬学的に許容される塩を提供し、前記ポリペプチドまたはその薬学的に許容される塩は、（ａ）慢性閉塞性肺疾患を予防、治療および／または緩和し、および／または（ｂ）喘息を予防、治療および／または緩和するための活性を有し、
Ｘ０－Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｘ４－Ｘ５－Ｘ６－Ｘ７－Ｘ８（ＩＩ）
式において、
Ｘ０およびＸ８は、存在しないか、または１～３個のアミノ酸のペプチドセグメントであり、
Ｘ１は、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ａｌａからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ２は、Ｇｌｎ、Ａｓｎからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ３は、Ｔｈｒ、Ｓｅｒからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ４は、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｐｈｅ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ５は、Ｔｈｒ、Ｓｅｒからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ６は、Ｓｅｒ、Ｔｈｒからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ７は、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ａｌａからなる群から選択されるアミノ酸であり、
ここで、Ｘ０～Ｘ８のうちの一つまたは複数は、それぞれ独立して、グリコシル化によって修飾されたアミノ酸である。
本発明の第７の態様は、式ＩＩに示されるポリペプチドまたはその薬学的に許容される塩を提供し、前記ポリペプチドまたはその薬学的に許容される塩は、（ａ）慢性閉塞性肺疾患を予防、治療および／または緩和し、および／または（ｂ）喘息を予防、治療および／または緩和するための活性を有し、
Ｘ０－Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｘ４－Ｘ５－Ｘ６－Ｘ７－Ｘ８（ＩＩ）
式において、
Ｘ０およびＸ８は、存在しないか、または１～３個のアミノ酸のペプチドセグメントであり、
Ｘ１は、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ａｌａからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ２は、Ｇｌｎ、Ａｓｎからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ３は、Ｔｈｒ、Ｓｅｒからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ４は、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｐｈｅ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ５は、Ｔｈｒ、Ｓｅｒからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ６は、Ｓｅｒ、Ｔｈｒからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ７は、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ａｌａからなる群から選択されるアミノ酸であり、
ここで、Ｘ０～Ｘ８のうちの一つまたは複数は、それぞれ独立して、グリコシル化によって修飾されたアミノ酸である。
【0054】
別の好ましい例において、前記グリコシル化によって修飾されたアミノ酸は、モノグリコシル化によって修飾されたアミノ酸またはダブルグリコシル化によって修飾されたアミノ酸である。
【0055】
別の好ましい例において、前記単糖は、Ｌ型単糖またはＤ型単糖である。
別の好ましい例において、前記単糖は、ペントースまたはヘキソースである。
別の好ましい例において、前記単糖は、ペントースまたはヘキソースである。
【0056】
別の好ましい例において、前記単糖は、ピラノースまたはフラノースである。
別の好ましい例において、前記単糖は、グリセルアルデヒド、エリトロース、ツロース、アラビノース、リボース、キシロース、リキソース、グルコース、マンノース、フルクトースまたはガラクトースである。
別の好ましい例において、前記単糖は、グリセルアルデヒド、エリトロース、ツロース、アラビノース、リボース、キシロース、リキソース、グルコース、マンノース、フルクトースまたはガラクトースである。
【0057】
別の好ましい例において、前記グルコース基は、Ｌ型グルコース基またはＤ型グルコース基である。
別の好ましい例において、前記二糖は、フルクトース、ラクトースからなる群から選択される。
別の好ましい例において、前記二糖は、フルクトース、ラクトースからなる群から選択される。
【0058】
別の好ましい例において、前記一つまたは複数のグリコシル化によって修飾されたアミノ酸は、それぞれ独立して、グリコシド化によって修飾されたアミノ酸、ガラクトシル化によって修飾されたアミノ酸からなる群から選択される。
【0059】
別の好ましい例において、前記グリコシル化によって修飾されたアミノ酸は、グリコシド化によって修飾されたアミノ酸である。
別の好ましい例において、前記グリコシル化によって修飾されたアミノ酸は、糖がグリコシド結合を介してアミノ酸に接続されることを指す。
別の好ましい例において、前記グリコシル化によって修飾されたアミノ酸は、糖がグリコシド結合を介してアミノ酸に接続されることを指す。
【0060】
別の好ましい例において、前記グリコシド化によって修飾されたアミノ酸は、グルコースがグリコシド結合を介してアミノ酸に接続されることを指す。
【0061】
別の好ましい例において、前記グリコシド結合は、－Ｏ－グリコシド結合、－Ｎ－グリコシド結合、リポグリコシド結合またはグリコペプチド結合である。
【0062】
別の好ましい例において、グリコシル化によって修飾されたアミノ酸において、前記糖は、－Ｏ－グリコシド結合、－Ｎ－グリコシド結合、リポグリコシド結合またはグリコペプチド結合を介してアミノ酸に接続される。
【0063】
別の好ましい例において、Ｘ０～Ｘ８のうちのアミノ酸は、それぞれ独立して、Ｄ型アミノ酸またはＬ型アミノ酸である。
別の好ましい例において、Ｘ０～Ｘ８のうちのアミノ酸は、それぞれ独立して、Ｄ型アミノ酸である。
別の好ましい例において、Ｘ０～Ｘ８のうちのアミノ酸は、それぞれ独立して、Ｄ型アミノ酸である。
【0064】
別の好ましい例において、Ｘ０～Ｘ８のうちの６～９個、好ましくは３～５個、より好ましくは１～２個は、グリコシル化によって修飾されたアミノ酸である。
【0065】
別の好ましい例において、Ｘ１～Ｘ７のうちの二つは、グリコシル化によって修飾されたアミノ酸であり、二つのグリコシル化によって修飾されたアミノ酸は、隣接するアミノ酸である。
【0066】
別の好ましい例において、前記Ｘ０は、存在しないか、またはグリコシル化修飾のないアミノ酸である。
別の好ましい例において、前記Ｘ１は、グリコシル化修飾のないアミノ酸である。
別の好ましい例において、前記Ｘ１は、グリコシル化修飾のないアミノ酸である。
【0067】
別の好ましい例において、前記Ｘ２は、グリコシル化修飾のないアミノ酸である。
別の好ましい例において、前記Ｘ３は、グリコシル化によって修飾されたアミノ酸である。
別の好ましい例において、前記Ｘ３は、グリコシル化によって修飾されたアミノ酸である。
【0068】
別の好ましい例において、前記Ｘ４は、グリコシル化修飾のないアミノ酸である。
別の好ましい例において、前記Ｘ５は、グリコシル化によって修飾されたアミノ酸である。
別の好ましい例において、前記Ｘ５は、グリコシル化によって修飾されたアミノ酸である。
【0069】
別の好ましい例において、前記Ｘ６は、グリコシル化によって修飾されたアミノ酸である。
別の好ましい例において、前記Ｘ７は、グリコシル化修飾のないアミノ酸である。
別の好ましい例において、前記Ｘ７は、グリコシル化修飾のないアミノ酸である。
【0070】
別の好ましい例において、前記Ｘ８は、存在しないか、またはグリコシル化修飾のないアミノ酸である。
別の好ましい例において、前記ポリペプチドは、ＳＩＰＩ－Ｇ４、ＳＩＰＩ－Ｇ５、ＳＩＰＩ－Ｇ６、ＳＩＰＩ－Ｇ７、ＳＩＰＩ－Ｇ８、ＳＩＰＩ－Ｇ９、ＳＩＰＩ－Ｇ１０、またはその組み合わせからなる群から選択される。
別の好ましい例において、前記ポリペプチドは、ＳＩＰＩ－Ｇ４、ＳＩＰＩ－Ｇ５、ＳＩＰＩ－Ｇ６、ＳＩＰＩ－Ｇ７、ＳＩＰＩ－Ｇ８、ＳＩＰＩ－Ｇ９、ＳＩＰＩ－Ｇ１０、またはその組み合わせからなる群から選択される。
【0071】
別の好ましい例において、前記ポリペプチドは、ＳＩＰＩ－Ｇ５、ＳＩＰＩ－Ｇ９、またはその組み合わせからなる群から選択される。
別の好ましい例において、前記ポリペプチドは、ＳＩＰＩ－Ｇ９として選択される。
別の好ましい例において、前記ポリペプチドは、ＳＩＰＩ－Ｇ９として選択される。
【0072】
別の好ましい例において、前記ポリペプチドの全長は、≦２０個のアミノ酸残基、好ましくは≦１３個のアミノ酸残基、好ましくは≦１２個のアミノ酸残基、好ましくは≦１０個のアミノ酸残基、より好ましくは≦８個のアミノ酸残基、より好ましくは≦７個のアミノ酸残基、最も好ましくは７個のアミノ酸残基である。
【0073】
別の好ましい例において、前記Ｘ０およびＸ８は、存在しないか、または１～３個のアミノ酸のペプチドセグメントである。
別の好ましい例において、前記ポリペプチドは、
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列を有し、長さが５～２０個のアミノ酸（好ましくは８～１２個のアミノ酸）であるポリペプチド、
（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列を１～２個のアミノ酸残基の置換、欠失または添加によって形成され、慢性閉塞性肺疾患を予防、治療および／または緩和し、および／または喘息を予防、治療および／または緩和する機能を有する（ａ）から派生されるポリペプチドからなる群から選択される。
別の好ましい例において、前記ポリペプチドは、
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列を有し、長さが５～２０個のアミノ酸（好ましくは８～１２個のアミノ酸）であるポリペプチド、
（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列を１～２個のアミノ酸残基の置換、欠失または添加によって形成され、慢性閉塞性肺疾患を予防、治療および／または緩和し、および／または喘息を予防、治療および／または緩和する機能を有する（ａ）から派生されるポリペプチドからなる群から選択される。
【0074】
別の好ましい例において、前記派生されたポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるポリペプチドの（ａ）慢性閉塞性肺疾患を予防、治療および／または緩和し、および／または（ｂ）喘息を予防、治療および／または緩和する活性の≧７０％、好ましくは８０％、より好ましくは８５％、最も好ましくは９０％または９５％以上を保持する。
【0075】
別の好ましい例において、前記派生されたポリペプチドとＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１との相同性は、≧８０％、好ましくは≧９０％、より好ましくは≧９５％である。
【0076】
別の好ましい例において、前記ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：１に示されるポリペプチドからの１～５個、好ましくは１～３個、より好ましくは１～２個のアミノ酸の置換によって、および／または
１～３個、好ましくは１～２個のアミノ酸の欠失によって、および／または
前記ポリペプチドの両端は、それぞれ１～３個、より好ましくは１～２個のアミノ酸の添加によって形成される。
１～３個、好ましくは１～２個のアミノ酸の欠失によって、および／または
前記ポリペプチドの両端は、それぞれ１～３個、より好ましくは１～２個のアミノ酸の添加によって形成される。
【0077】
別の好ましい例において、前記ポリペプチドのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されたとおりである。
別の好ましい例において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列中の二つまたは三つのアミノ酸は、グリコシル化によって修飾されたアミノ酸である。
別の好ましい例において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列中の二つまたは三つのアミノ酸は、グリコシル化によって修飾されたアミノ酸である。
【0078】
別の好ましい例において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列中のすべてのアミノ酸は、グリコシル化によって修飾されたアミノ酸である。
【0079】
本発明の第８の態様は、医薬組成物を提供し、前記医薬組成物は、
（ａ）本発明の第７の態様に記載のポリペプチドまたはその薬学的に許容される塩、および
（ｂ）薬学的に許容される担体または賦形剤を含む。
（ａ）本発明の第７の態様に記載のポリペプチドまたはその薬学的に許容される塩、および
（ｂ）薬学的に許容される担体または賦形剤を含む。
【0080】
別の好ましい例において、前記成分（ａ）は、前記医薬組成物の総重量の０．１～９９．９ｗｔ％、好ましくは１０～９９．９ｗｔ％、より好ましくは７０％～９９．９ｗｔ％を占める。
【0081】
別の好ましい例において、前記医薬組成物は、液体、固体、または半固体である。
別の好ましい例において、前記医薬組成物的剤形は、経口剤形、注射剤、または外部用の医薬剤形である。
別の好ましい例において、前記医薬組成物的剤形は、経口剤形、注射剤、または外部用の医薬剤形である。
【0082】
別の好ましい例において、前記医薬組成物の剤形は、皮下注射剤または筋肉内注射剤である。
別の好ましい例において、前記医薬組成物の剤形は、錠剤、顆粒剤、カプセル、経口液、または注射剤を含む。
別の好ましい例において、前記医薬組成物の剤形は、錠剤、顆粒剤、カプセル、経口液、または注射剤を含む。
【0083】
別の好ましい例において、前記医薬組成物は、液体組成物である。
別の好ましい例において、前記医薬組成物は、経口製剤である。
別の好ましい例において、前記薬学的に許容される担体は、注入剤担体および／または注射剤担体からなる群から選択され、好ましくは、前記担体は、生理食塩水、デキストロース食塩水、またはその組み合わせからなる群から選択される一つまたは複数の種の担体である。
別の好ましい例において、前記医薬組成物は、経口製剤である。
別の好ましい例において、前記薬学的に許容される担体は、注入剤担体および／または注射剤担体からなる群から選択され、好ましくは、前記担体は、生理食塩水、デキストロース食塩水、またはその組み合わせからなる群から選択される一つまたは複数の種の担体である。
【0084】
別の好ましい例において、前記薬学的に許容される担体は、ナノ材料を含む担体であり得る。
別の好ましい例において、前記医薬組成物は、徐放性剤形である。
別の好ましい例において、前記医薬組成物は、徐放性剤形である。
【0085】
別の好ましい例において、前記医薬組成物の剤形は、凍結乾燥粉末である。
別の好ましい例において、前記凍結乾燥粉末は、凍結乾燥保護剤を含む。
別の好ましい例において、前記凍結乾燥粉末は、凍結乾燥保護剤を含む。
【0086】
別の好ましい例において、前記凍結乾燥保護剤は、グルコース、スクロース、マンニトール、またはその組み合わせからなる群から選択される。
【0087】
別の好ましい例において、前記医薬組成物の剤形は、吸入剤である。
別の好ましい例において、前記吸入剤は、凍結乾燥粉末を含む。
別の好ましい例において、前記医薬組成物の剤形は、液体製剤である。
別の好ましい例において、前記吸入剤は、凍結乾燥粉末を含む。
別の好ましい例において、前記医薬組成物の剤形は、液体製剤である。
【0088】
別の好ましい例において、前記液体製剤は、本発明の第７の態様に記載のポリペプチドまたはその薬学的に許容される塩、浸透圧調節剤および水を含む。
【0089】
別の好ましい例において、前記浸透圧調節剤は、塩および／または糖を含む。
別の好ましい例において、前記塩は、塩化ナトリウムを含む。
別の好ましい例において、前記塩は、塩化ナトリウムを含む。
【0090】
別の好ましい例において、前記糖は、グルコースを含む。
別の好ましい例において、前記医薬組成物の剤形は、スプレー剤である。
別の好ましい例において、前記医薬組成物の剤形は、スプレー剤である。
【0091】
別の好ましい例において、前記医薬組成物の剤形は、エアロゾル剤である。
別の好ましい例において、前記エアロゾル剤は、本発明の第７の態様に記載のポリペプチドまたはその薬学的に許容される塩および推進剤を含む。
別の好ましい例において、前記エアロゾル剤は、本発明の第７の態様に記載のポリペプチドまたはその薬学的に許容される塩および推進剤を含む。
【0092】
別の好ましい例において、前記推進剤は、圧縮二酸化炭素、圧縮窒素ガス、テトラフルオロエタン、ヘプタフルオロプロパン、プロパン、ｎ－ブタン、イソブタンである。
【0093】
別の好ましい例において、前記圧縮二酸化炭素は、液体二酸化炭素である。
別の好ましい例において、前記圧縮窒素ガスは、液体窒素ガスである。
別の好ましい例において、前記圧縮窒素ガスは、液体窒素ガスである。
【0094】
別の好ましい例において、前記医薬組成物は、慢性閉塞性肺疾患を予防、治療および／または緩和する適用において、単独で、または併用して使用することができる。
【0095】
別の好ましい例において、前記併用使用は、慢性閉塞性肺疾患を予防、治療および／または緩和するための他の薬物との併用使用を含む。
別の好ましい例において、前記医薬組成物は、慢性閉塞性肺疾患を予防、治療および／または緩和するための他の薬物をさらに含む。
別の好ましい例において、前記医薬組成物は、慢性閉塞性肺疾患を予防、治療および／または緩和するための他の薬物をさらに含む。
【0096】
別の好ましい例において、前記慢性閉塞性肺疾患を予防、治療および／または緩和するための他の薬物は、糖質コルチコイド、β２受容体アゴニスト、抗コリン作用薬または高分子生物学的標的薬からなる群から選択される。
【0097】
別の好ましい例において、前記糖質コルチコイドは、フルチカゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、またはその組み合わせからなる群から選択される。
【0098】
別の好ましい例において、前記β２受容体アゴニストは、ホルモテロール、オロダテロール、サルメテロール、またはその組み合わせからなる群から選択される。
【0099】
別の好ましい例において、前記抗コリン作用薬は、臭化アクリジニウム、臭化グリコピロニウム、臭化チオトロピウム、またはその組み合わせからなる群から選択される。
【0100】
別の好ましい例において、前記高分子生物学的標的薬は、ＩｇＥモノクローナル抗体、ＩＬ－４／ＩＬ－４Ｒモノクローナル抗体、ＩＬ－５／ＩＬ－５Ｒモノクローナル抗体、ＴＳＬＰモノクローナル抗体、またはその組み合わせからなる群から選択される。
【0101】
別の好ましい例において、前記医薬組成物は、喘息を予防、治療および／または緩和するための薬物を含む。
別の好ましい例において、前記喘息を予防、治療および／または緩和するための他の薬物は、糖質コルチコイド、β２受容体アゴニスト、抗コリン作用薬、高分子生物学的標的薬、またはその組み合わせからなる群から選択される。
別の好ましい例において、前記喘息を予防、治療および／または緩和するための他の薬物は、糖質コルチコイド、β２受容体アゴニスト、抗コリン作用薬、高分子生物学的標的薬、またはその組み合わせからなる群から選択される。
【0102】
別の好ましい例において、前記糖質コルチコイドは、ベクロメタゾン、フルチカゾン、モメタゾン、ブデソニド、シクレソニド、またはその組み合わせからなる群から選択される。
【0103】
別の好ましい例において、前記β２受容体アゴニストは、アルブテロール、テルブタリン、サルメテロール、ホルモテロール、またはその組み合わせを含む。
【0104】
別の好ましい例において、前記抗コリン作用薬は、臭化イプラトロピウム、臭化チオトロピウム、またはその組み合わせを含む。
別の好ましい例において、前記高分子生物学的標的薬は、ＩｇＥモノクローナル抗体、ＩＬ－４／ＩＬ－４Ｒモノクローナル抗体、ＩＬ－５／ＩＬ－５Ｒモノクローナル抗体、ＴＳＬＰモノクローナル抗体、またはその組み合わせを含む。
別の好ましい例において、前記高分子生物学的標的薬は、ＩｇＥモノクローナル抗体、ＩＬ－４／ＩＬ－４Ｒモノクローナル抗体、ＩＬ－５／ＩＬ－５Ｒモノクローナル抗体、ＴＳＬＰモノクローナル抗体、またはその組み合わせを含む。
【0105】
本発明の第９の態様は、本発明の第７の態様に記載のポリペプチドまたはその薬学的に許容される塩の用途を提供し、薬物の調製に使用され、前記薬物は、（ａ）慢性閉塞性肺疾患を予防、治療および／または緩和し、および／または（ｂ）喘息を予防、治療および／または緩和するために使用される。
【0106】
別の好ましい例において、前記薬物は、皮下注射剤または筋肉内注射剤である。
別の好ましい例において、前記慢性閉塞性肺疾患は、慢性閉塞性気管支炎、肺気腫、またはその組み合わせからなる群から選択される。
別の好ましい例において、前記慢性閉塞性肺疾患は、慢性閉塞性気管支炎、肺気腫、またはその組み合わせからなる群から選択される。
【0107】
別の好ましい例において、前記喘息は、アレルギー性喘息、非アレルギー性喘息、遅発性喘息、気流制限型喘息、肥満型喘息、ホルモン抵抗性喘息を含む。
【0108】
別の好ましい例において、前記アレルギー性喘息は、ＯＶＡ、アジュバント水酸化アルミニウム、またはその組み合わせからなる群から選択されるアレルギー剤によって匹個々される喘息を含む。
【0109】
別の好ましい例において、前記喘息は、（１）炎症性因子によって引き起こされる喘息を含む。
別の好ましい例において、前記炎症性因子によって引き起こされる喘息は、炎症性因子の分泌または発現の増加によって引き起こされる喘息および／または炎症性因子の活性の増強によって引き起こされる喘息を含む。
別の好ましい例において、前記炎症性因子によって引き起こされる喘息は、炎症性因子の分泌または発現の増加によって引き起こされる喘息および／または炎症性因子の活性の増強によって引き起こされる喘息を含む。
【0110】
別の好ましい例において、前記分泌は、脾臓リンパ球によって、好ましくは、Ｔｈ２細胞によって分泌される。
別の好ましい例において、前記発現は、タンパク質発現、ｍＲＮＡ発現、またはその組み合わせからなる群から選択される。
別の好ましい例において、前記発現は、タンパク質発現、ｍＲＮＡ発現、またはその組み合わせからなる群から選択される。
【0111】
別の好ましい例において、前記炎症性因子は、インターロイキンを含む。
別の好ましい例において、前記インターロイキンは、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－１３、またはその組み合わせからなる群から選択される。
別の好ましい例において、前記インターロイキンは、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－１３、またはその組み合わせからなる群から選択される。
【0112】
好ましい例において、前記慢性閉塞性肺疾患の予防、治療および／または緩和は、
（ｉ）炎症性因子の阻害、
（ｉｉ）ＩｇＥレベルの低下、
（ｉｉｉ）気道抵抗の低下、
（ｉｖ）肺コンプライアンスの向上、および／または
（ｖ）肺における炎症性細胞浸潤の阻害を含む。
（ｉ）炎症性因子の阻害、
（ｉｉ）ＩｇＥレベルの低下、
（ｉｉｉ）気道抵抗の低下、
（ｉｖ）肺コンプライアンスの向上、および／または
（ｖ）肺における炎症性細胞浸潤の阻害を含む。
【0113】
別の好ましい例において、前記喘息の予防、治療および／または緩和は、
（ｉ）炎症性因子の阻害、
（ｉｉ）ＩｇＥレベルの低下、
（ｉｉｉ）気道抵抗の低下、
（ｉｖ）肺コンプライアンスの向上、および／または
（ｖ）肺における炎症性細胞浸潤の阻害を含む。
（ｉ）炎症性因子の阻害、
（ｉｉ）ＩｇＥレベルの低下、
（ｉｉｉ）気道抵抗の低下、
（ｉｖ）肺コンプライアンスの向上、および／または
（ｖ）肺における炎症性細胞浸潤の阻害を含む。
【0114】
別の好ましい例において、前記炎症性因子は、インターロイキンを含む。
別の好ましい例において、前記インターロイキンは、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－１３、またはその組み合わせからなる群から選択される。
別の好ましい例において、前記インターロイキンは、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－１３、またはその組み合わせからなる群から選択される。
【0115】
別の好ましい例において、炎症性因子の阻害は、炎症性因子の分泌または発現および／または活性の阻害を含む。
別の好ましい例において、前記ＩｇＥレベルは、血清、全血または血漿中のＩｇＥレベルである。
別の好ましい例において、前記ＩｇＥレベルは、血清、全血または血漿中のＩｇＥレベルである。
【0116】
本発明の第１０の態様は、本発明の第７の態様に記載のポリペプチドまたはその薬学的に許容される塩の用途を提供し、薬物の調製に使用され、前記薬物は、（ｉ）炎症の阻害、（ｉｉ）ＩｇＥレベルの低下、（ｉｉｉ）気道抵抗の低下、（ｉｖ）肺コンプライアンスの向上、および／または（ｖ）肺内炎症性細胞浸潤の阻害に使用される。
【0117】
別の好ましい例において、前記炎症は、炎症性因子によって引き起こされる炎症である。
別の好ましい例において、前記炎症性因子は、インターロイキンを含む。
別の好ましい例において、前記炎症性因子は、インターロイキンを含む。
【0118】
別の好ましい例において、前記インターロイキンは、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－１３、またはその組み合わせからなる群から選択される。
本発明の第１１の態様は、必要とする対象に本発明の第７の態様に記載のポリペプチドまたはその薬学的に許容される塩を投与する段階を含む、哺乳動物の慢性閉塞性肺疾患を予防、治療および／または緩和し、および／または喘息を予防、治療および／または緩和するための方法を提供する。
本発明の第１１の態様は、必要とする対象に本発明の第７の態様に記載のポリペプチドまたはその薬学的に許容される塩を投与する段階を含む、哺乳動物の慢性閉塞性肺疾患を予防、治療および／または緩和し、および／または喘息を予防、治療および／または緩和するための方法を提供する。
【0119】
別の好ましい例において、前記哺乳動物は、ヒトまたは非ヒト哺乳動物を含む。
別の好ましい例において、前記非ヒト哺乳動物は、齧歯類動物（例えば、ラット、マウス）、霊長類動物（例えば、サル）を含む。
別の好ましい例において、前記非ヒト哺乳動物は、齧歯類動物（例えば、ラット、マウス）、霊長類動物（例えば、サル）を含む。
【0120】
別の好ましい例において、前記慢性閉塞性肺疾患は、慢性閉塞性気管支炎、肺気腫、またはその組み合わせからなる群から選択される。
別の好ましい例において、前記投与は、経口、経鼻吸入、筋肉内注射、または静脈内注射を含む。
別の好ましい例において、前記投与は、経口、経鼻吸入、筋肉内注射、または静脈内注射を含む。
【0121】
［発明の効果］
本発明の範囲内で、本発明の上記の各技術的特徴と以下（例えば、実施例）に具体的に説明される各技術的特徴との間を、互いに組み合わせることにより、新しいまたは好ましい技術的解決策を構成することができることに理解されたい。スペースに限りがあるため、ここでは繰り返さない。
本発明の範囲内で、本発明の上記の各技術的特徴と以下（例えば、実施例）に具体的に説明される各技術的特徴との間を、互いに組み合わせることにより、新しいまたは好ましい技術的解決策を構成することができることに理解されたい。スペースに限りがあるため、ここでは繰り返さない。
【図面の簡単な説明】
【0122】
【図1】ＳＰペプチドおよび誘導体ＳＩＰＩ－Ｄ００の合成経路を示す図である。
【図2】ＳＤラットにＳＰ（１０ｍｇ／ｋｇ）を単回皮下注射した後の血中濃度－時間変化の曲線図である。
【図3】ＳＤラットにＳＩＰＩ－Ｄ００（５ｍｇ／ｋｇ）を単回皮下注射した後の血中濃度－時間変化の曲線図である。
【図4】ＯＶＡによって誘導された喘息モデルマウスの肺の病理に対する様々なグループの影響（４ｘ）である。
【図5】ＯＶＡによって誘導された喘息モデルマウスの肺の病理に対する様々なグループの影響（２０ｘ）である。
【図6】グリコシル化ポリペプチドＳＩＰＩ－Ｇ４、ＳＩＰＩ－Ｇ５、ＳＩＰＩ－Ｇ６、ＳＩＰＩ－Ｇ７、ＳＩＰＩ－Ｇ８、ＳＩＰＩ－Ｇ９、ＳＩＰＩ－Ｇ１０の合成経路である。
【図7】ＳＤラットにＳＩＰＩ－Ｇ９（１ｍｇ／ｋｇ）を単回静脈内注射した後の様々な時点での血漿薬物濃度である。
【図8】ＳＤラットにＳＩＰＩ－Ｇ９（５ｍｇ／ｋｇ）を単回皮下注射した後の様々な時点での血漿薬物濃度である。
【図9】喫煙によって誘導されたＣＯＰＤラットの肺の病理のＨＥ染色結果である。
【図10】喫煙によって誘導されたＣＯＰＤラットの肺の病理のＭａｓｓｏｎ染色結果である。
【図11】ＯＶＡによって誘導された喘息モデルマウスの肺の病理に対する様々なグループの影響（４ｘ）である。
【図12】ＯＶＡによって誘導された喘息モデルマウスの肺の病理に対する様々なグループの影響（２０ｘ）である。
【発明を実施するための形態】
【0123】
本発明者らは、広範囲にわたる詳細な研究および大量のスクリーニングの後、喘息和または慢性閉塞性肺機能を予防、治療および／または緩和し、長さがわずか７～２０である小分子ポリペプチド（例えば、７個のＤ型アミノ酸によって形成された小さなペプチドＳＩＰＩ－Ｄ００、または７個のアミノ酸によって形成された小さなペプチド、ここで、１個、２個、３個、４個は、グリコシル化によって修飾されたアミノ酸である）を初めて開発した。具体的には、本発明において、適切な部位で化学的に修飾されたポリペプチド分子は、安定性が増加し、インビボでの作用時間が延長され、生物学的活性芽保持される。これに基づいて、本発明を完成させた。
【0124】
用語
ポリペプチド
本明細書で使用されるように、本発明のポリペプチドとは、本発明の第１の態様に記載の式Ｉの構造のポリペプチドまたはその薬学的に許容される塩および／または本発明の第７の態様に記載の式ＩＩの構造のポリペプチドまたはその薬学的に許容される塩を指す。
ポリペプチド
本明細書で使用されるように、本発明のポリペプチドとは、本発明の第１の態様に記載の式Ｉの構造のポリペプチドまたはその薬学的に許容される塩および／または本発明の第７の態様に記載の式ＩＩの構造のポリペプチドまたはその薬学的に許容される塩を指す。
【0125】
本明細書で使用されるように、「ＳＩＰＩ－Ｄ００ポリペプチド」、「ＳＩＰＩ－Ｄ００ペプチド」、「ＳＩＰＩ－Ｄ００」、および「Ｄ００」という用語は、交換可能に使用され、喘息を予防、治療および／または緩和し、かつ本発明の第１の態様に記載の式Ｉの構造を有するポリペプチドを指す。
【0126】
本明細書で使用されるように、「ＳＰポリペプチド」、「ＳＰペプチド」および「ＳＰ」という用語は、交換可能に使用され、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを指し、Ｎ末端からＣ末端まで、ＳＰペプチドのアミノ酸配列は、ＧＱＴＹＴＳＧである。
【0127】
本明細書で使用されるように、「Ｄ型アミノ酸」および「Ｄ－アミノ酸」という用語は、交換可能に使用される。代表的には、「Ｄ型トリプトファン」、「Ｄ－トリプトファン」および「Ｄ－Ｓｅｒ」は、交換可能に使用され、他のアミノ酸は類似している。
【0128】
本明細書で使用されるように、「ＳＩＰＩ－Ｇ４ポリペプチド」、「ＳＩＰＩ－Ｇ４ペプチド」、「ＳＩＰＩ－Ｇ－４」および「ＳＰ－Ｇ４」という用語は、交換可能に使用され、Ｎ末端からＣ末端まで、ＳＩＰＩ－Ｇ４ペプチドのアミノ酸配列は、ＧＱＴ（Ｇｌｃ）ＹＴ（Ｇｌｃ）Ｓ（Ｇｌｃ）Ｇである。
【0129】
本明細書で使用されるように、「ＳＩＰＩ－Ｇ５ポリペプチド」、「ＳＩＰＩ－Ｇ５ペプチド」、「ＳＩＰＩ－Ｇ－５」および「ＳＰ－Ｇ５」という用語は、交換可能に使用され、Ｎ末端からＣ末端まで、ＳＩＰＩ－Ｇ５ペプチドのアミノ酸配列は、ＧＱＴＹＴ（Ｇｌｃ）ＳＧである。
【0130】
本明細書で使用されるように、「ＳＩＰＩ－Ｇ６ポリペプチド」、「ＳＩＰＩ－Ｇ６ペプチド」、「ＳＩＰＩ－Ｇ－６」および「ＳＰ－Ｇ６」という用語は、交換可能に使用され、Ｎ末端からＣ末端まで、ＳＩＰＩ－Ｇ６ペプチドのアミノ酸配列は、ＧＱＴ（Ｇｌｃ）ＹＴＳＧである。
【0131】
本明細書で使用されるように、「ＳＩＰＩ－Ｇ７ポリペプチド」、「ＳＩＰＩ－Ｇ７ペプチド」、「ＳＩＰＩ－Ｇ－７」および「ＳＰ－Ｇ７」という用語は、交換可能に使用され、Ｎ末端からＣ末端まで、ＳＩＰＩ－Ｇ７ペプチドのアミノ酸配列は、ＧＱＴＹＴＳ（Ｇｌｃ）Ｇである。
【0132】
本明細書で使用されるように、「ＳＩＰＩ－Ｇ８ポリペプチド」、「ＳＩＰＩ－Ｇ８ペプチド」、「ＳＩＰＩ－Ｇ－８」および「ＳＰ－Ｇ８」という用語は、交換可能に使用され、Ｎ末端からＣ末端まで、ＳＩＰＩ－Ｇ８ペプチドのアミノ酸配列は、ＧＱＴ（Ｇｌｃ）ＹＴ（Ｇｌｃ）ＳＧである。
【0133】
本明細書で使用されるように、「ＳＩＰＩ－Ｇ９ポリペプチド」、「ＳＩＰＩ－Ｇ９ペプチド」、「ＳＩＰＩ－Ｇ－９」および「ＳＰ－Ｇ９」という用語は、交換可能に使用され、Ｎ末端からＣ末端まで、ＳＩＰＩ－Ｇ９ペプチドのアミノ酸配列は、ＧＱＴ（Ｇｌｃ）ＹＴＳ（Ｇｌｃ）Ｇである。
【0134】
本明細書で使用されるように、「ＳＩＰＩ－Ｇ１０ポリペプチド」、「ＳＩＰＩ－Ｇ１０ペプチド」、「ＳＩＰＩ－Ｇ－１０」および「ＳＰ－Ｇ１０」という用語は、交換可能に使用され、Ｎ末端からＣ末端まで、ＳＩＰＩ－Ｇ１０ペプチドのアミノ酸配列は、ＧＱＴＹＴ（Ｇｌｃ）Ｓ（Ｇｌｃ）Ｇである。
【0135】
本明細書で使用されるように、「Ｄ型アミノ酸」および「Ｄ－アミノ酸」という用語は、交換可能に使用される。代表的には、「Ｄ型トリプトファン」、「Ｄ－トリプトファン」および「Ｄ－Ｓｅｒ」は、交換可能に使用され、他のアミノ酸は、類似している。
【0136】
本明細書で使用されるように、「Ｌ型アミノ酸」および「Ｌ－アミノ酸」という用語は、交換可能に使用される。代表的には、「Ｌ型トリプトファン」、「Ｌ－トリプトファン」および「Ｌ－Ｓｅｒ」は、交換可能に使用され、他のアミノ酸は、類似している。
【0137】
好ましい実施形態において、本発明のポリペプチドは、ＳＰペプチド誘導体ＳＩＰＩ－Ｄ００であり、前記ＳＩＰＩ－Ｄ００は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるアミノ酸配列を有し、Ｎ末端からＣ末端まで、ＳＰペプチド誘導体のアミノ酸配列は、ＧＳＴＹＴＱＧである。より好ましくは、ＳＩＰＩ－Ｄ００ポリペプチドのすべてのアミノ酸残基は、Ｄ型アミノ酸残基である。
【0138】
より好ましい実施形態において、本発明のポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるアミノ酸配列を有し、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるアミノ酸配列中の１～２個、好ましくは３～５個、より好ましくは６～７個は、Ｄ型アミノ酸である。
【0139】
より好ましい実施形態において、本発明のポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるアミノ酸配列を有し、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるアミノ酸配列中のすべてのアミノ酸は、Ｄ型アミノ酸である。
【0140】
本明細書で使用されるように、「ＳＰペプチドグリコシル化誘導体」、「グリコシル化ポリペプチド」または「グリコシル化ＳＰペプチド」という用語は、交換可能に使用され、慢性閉塞性肺疾患を予防、治療および／または緩和し、および／または喘息を予防、治療および／または緩和するための活性を有するアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）のグリコシル化タンパク質またはポリペプチド（例えば、ＳＩＰＩ－Ｇ４、ＳＩＰＩ－Ｇ５、ＳＩＰＩ－Ｇ６、ＳＩＰＩ－Ｇ７、ＳＩＰＩ－Ｇ８、ＳＩＰＩ－Ｇ９、ＳＩＰＩ－Ｇ１０、好ましくは、ＳＩＰＩ－Ｇ５、ＳＩＰＩ－Ｇ９である）を指す。
【0141】
さらに、前記「ポリペプチド」という用語は、その変異形態（好ましくは、グリコシル化修飾）を含む。これらの変異形態は、１～５個（通常は、１～４個、好ましくは１～３個、より好ましくは１～２個、最も好ましくは１個である）のアミノ酸の欠失、挿入および／または置換、ならびにＣ末端および／またはＮ末端への一つまたは複数（通常は、５個以内、好ましくは３個以内、より好ましくは２個以内である）のアミノ酸の添加を含む（これらに限定されない）。例えば、当技術分野において、性能が近いまたは類似なアミノ酸で置換される場合、通常は、タンパク質の機能を変化させない。例えば、Ｃ末端および／またはＮ末端への一つまたは複数のアミノ酸の転嫁は、通常、タンパク質の構造および機能も変化させない。
【0142】
本発明は、本発明のポリペプチドの活性フラグメント、誘導体および類似体を含む。本明細書で使用されるように、「フラグメント」、「誘導体」および「類似体」という用語は、喘息を予防、治療および／または緩和する機能または活性を実質的に保持するポリペプチドを指す。本発明のポリペプチドフラグメント、誘導体または類似体は、（ｉ）一つまたは複数の保存的または非保存的アミノ酸残基（好ましくは、保存的アミノ酸残基）が置換されたポリペプチド、または（ｉｉ）一つまたは複数のアミノ酸残基に置換基を有するポリペプチド、または（ｉｉｉ）本発明のポリペプチドと別の化合物（例えば、ポリエチレングリコール等のポリペプチドの半減期を延長する化合物）との融合によって形成されるポリペプチド、または（ｉｖ）追加のアミノ酸配列をこのポリペプチド配列に融合することによって形成されるポリペプチド（リーダー配列、分泌配列または６Ｈｉｓ等のタグ配列と融合することによって形成される後続のタンパク質）であり得る。本明細書の教示に基づいて、これらのフラグメント、誘導体および類似体は、当業者によく知られている範囲内である。
【0143】
好ましいクラスの活性誘導体とは、式Ｉまたは式ＩＩのアミノ酸配列と比較して、最大で５個、好ましくは最大で３個、より好ましくは最大で２個、最も好ましくは１個のアミノ酸が類似または近い性質を有するアミノ酸によって置き換えられてポリペプチドを形成することを指す。これらの保存的変異ポリペプチドは、好ましくは、表Ａによるアミノ酸の置き換えによって生成される。
【0144】
【表1】
【0145】
本発明は、本発明のポリペプチドの類似体をさらに提供する。これらの類似体と本発明のポリペプチドとの違いは、アミノ酸配列の違いであり得、配列に影響を及ぼさない修飾形態上の違いでもあり得、または両方であり得る。類似体は、天然のＬ－アミノ酸とは異なる残基（例えば、Ｄ－アミノ酸）を有する類似体、ならびに非天然または合成アミノ酸（例えば、β、γ－アミノ酸）を有する類似体をさらに含む。本発明のポリペプチドは、上記で例示された代表的なポリペプチドに限定されないことを理解されたい。
【0146】
修飾（通常は一次構造を変更しない）形態は、インビボまたはインビトロでのポリペプチドのアセチル化またはカルボキシル化等の化学的派生形態を含む。修飾は、ポリペプチドの合成およびプロセシングまたはさらなるプロセシング段階におけるグリコシル化修飾によって生成されるそれらのポリペプチド等のグリコシル化をさらに含む。このような修飾は、ポリペプチドを、グリコシル化される酵素（例えば、哺乳動物のグリコシラーゼまたはデグリコシラーゼ）に曝露することによって達成されることができる。修飾形態は、リン酸化アミノ酸残基（例えば、ホスホチロシン、ホスホセリン、ホスホスレオニン）を有する配列をさらに含む。修飾されることにより、そのタンパク質加水分解に対する性能を向上させるか、または溶解性能を最適化するポリペプチドをさらに含む。
【0147】
本発明のポリペプチドは、薬学的にまたは生理学的に許容される酸または塩基派生される塩の形態で使用されることができる。これらの塩は、与如下酸形成的塩：塩酸、臭化水素酸、硫酸、クエン酸、酒石酸、リン酸、乳酸、ピルビン酸、酢酸、コハク酸、シュウ酸、フマル酸、マレイン酸、オキサロ酢酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、またはイセチオン酸等の酸と形成された塩を含む（これらに限定されない）。他の塩は、アルカリ金属またはアルカリ土類金属（例えば、ナトリウム、カリウム、カルシウムまたはマグネシウム）で形成された塩、およびエステル、カルバメートまたは他の従来の「プロドラッグ」の形態を含む。
【0148】
調製方法
本発明のポリペプチドは、化学的に創生されることができる。対応的に、本発明のポリペプチドは、従来の方法によって人工的に合成されることができる。
本発明のポリペプチドは、化学的に創生されることができる。対応的に、本発明のポリペプチドは、従来の方法によって人工的に合成されることができる。
【0149】
好ましい方法は、液相合成技術、またはＢｏｃ固相法、Ｆｍｏｃ固相法または両方の方法の併用使用等の固相合成技術を使用することである。固相合成によりサンプルを迅速に得ることができ、標的ペプチドの配列特徴に応じて適切な樹脂担体および合成システムを選択することができる。例えば、Ｆｍｏｃシステムで好ましい固相担体は、ペプチドのＣ末端アミノ酸に接続されたＷａｎｇ樹脂であり、Ｗａｎｇ樹脂構造は、ポリスチレンであり、アミノ酸間のアームは、４－アルコキシベンジルアルコールであり、２５％ヘキサヒドロピリジン／ジメチルホルムアミドで室温下で２０分間処理して、保護基Ｆｍｏｃを除去し、所与されたアミノ酸配列に従ってＣ末端からＮ末端に一つずつ伸長する。合成完了後、合成されたプロインスリン関連ペプチドを４％ｐ－グレゾールを含むトリフルオロ酢酸で樹脂から切断し、かつ保護基を除去し、樹脂をろ過した後にエーテル沈殿により粗ペプチドを得ることができる。得られた生成物溶液を凍結乾燥した後、ゲルろ過および逆相高圧液体クロマトグラフィーによって所望のペプチドを精製する。固相合成にＢｏｃシステムが使用される場合、好ましい樹脂は、ペプチドのＣ末端アミノ酸に接続されたＰＡＭ樹脂であり、ＰＡＭ樹脂構造は、ポリスチレンであり、アミノ酸間のアームは、４－ヒドロキシメチルフェニルアセトアミドであり、Ｂｏｃ合成システムにおいて、脱保護、中和、カップリングのサイクルにおいて、ＴＦＡ／ジクロロメタン（ＤＣＭ）で保護基Ｂｏｃを除去し、かつジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）／ジクロロメタンで中和する。ペプチド鎖の凝縮完了後、ｐ－クレゾール（５－１０％）を含むフッ化水素（ＨＦ）を使用して、０℃下で１時間処理し、ペプチド鎖を樹脂から切断し、同時に保護基を除去する。５０～８０％酢酸（少量のメルカプトエタノールを含む）でペプチドを抽出し、溶液を凍結乾燥した後にさらにモレキュラーシーブＳｅｐｈａｄｅｘＧ１０またはＴｓｋ－４０ｆで分離および精製し、その後高圧液相で生成して、所望のペプチドを得る。ペプチド化学の分野で知られている様々なカップリング剤およびカップリング方法を使用して、各アミノ酸残基をカップリングすることができ、例えば、ジイソプロピルカルボニルジイミド（ＤＩＣ）、ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）または１，１，３，３－テトラ尿素ヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）を使用して直接カップリングすることができる。合成された短いペプチドの純度および構造は、逆相高速液体クロマトグラフィーおよび質量分析によって確認できる。
【0150】
好ましい例において、本発明のポリペプチドは、その配列に従って固相合成の方法によって調製され、高速液体クロマトグラフィーによって精製され、標的ペプチドの高純度凍結乾燥粉末を得、－２０℃で保存する。
【0151】
慢性閉塞性肺疾患
「ＣＯＰＤ」と呼ばれる慢性閉塞性肺病は、気流閉塞を特徴とする慢性気管支炎および（または）肺気腫の一般的な慢性疾患であり、肺性心および呼吸不全にさらに進化する可能性がある。通常は、有毒な粒子またはガスへの重大な曝露による気道および／または肺胞の異常によって引き起こされる。
「ＣＯＰＤ」と呼ばれる慢性閉塞性肺病は、気流閉塞を特徴とする慢性気管支炎および（または）肺気腫の一般的な慢性疾患であり、肺性心および呼吸不全にさらに進化する可能性がある。通常は、有毒な粒子またはガスへの重大な曝露による気道および／または肺胞の異常によって引き起こされる。
【0152】
典型的には、前記慢性閉塞性肺疾患は、慢性閉塞性気管支炎、肺気腫、またはその組み合わせからなる群から選択される。
喘息
喘息は、複雑な発病メカニズムを伴う気道の慢性炎症性疾患であり、一般に、遺伝的要因および環境的要因の組み合わせによって引き起こされると考えられる。当該病気の主要な特徴は、気道過敏反応、可逆性の気流閉塞、気管支平滑筋の痙攣、ならびに気道の炎症であり、一般的な症状は、喘息、呼吸困難、咳、胸部圧迫感等を含む。
喘息
喘息は、複雑な発病メカニズムを伴う気道の慢性炎症性疾患であり、一般に、遺伝的要因および環境的要因の組み合わせによって引き起こされると考えられる。当該病気の主要な特徴は、気道過敏反応、可逆性の気流閉塞、気管支平滑筋の痙攣、ならびに気道の炎症であり、一般的な症状は、喘息、呼吸困難、咳、胸部圧迫感等を含む。
【0153】
好ましい例において、前記喘息は、（１）炎症性因子によって引き起こされる喘息を含む。
別の好ましい例において、前記炎症性因子によって引き起こされる喘息は、炎症性因子の分泌または発現の増加によって引き起こされる喘息、および／または炎症性因子の活性の増強によって引き起こされる喘息を含む。
別の好ましい例において、前記炎症性因子によって引き起こされる喘息は、炎症性因子の分泌または発現の増加によって引き起こされる喘息、および／または炎症性因子の活性の増強によって引き起こされる喘息を含む。
【0154】
別の好ましい例において、前記分泌は、脾臓リンパ球によって、好ましくは、Ｔｈ２細胞によって分泌される。
別の好ましい例において、前記発現は、タンパク質発現、ｍＲＮＡ発現、またはその組み合わせからなる群から選択される。
別の好ましい例において、前記発現は、タンパク質発現、ｍＲＮＡ発現、またはその組み合わせからなる群から選択される。
【0155】
別の好ましい例において、前記炎症性因子は、インターロイキンを含む。
別の好ましい例において、前記インターロイキンは、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－１３、またはその組み合わせからなる群から選択される。
別の好ましい例において、前記インターロイキンは、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－１３、またはその組み合わせからなる群から選択される。
【0156】
典型的には、前記喘息は、アレルギー性喘息、非アレルギー性喘息、遅発性喘息、気流制限型喘息、肥満型喘息、ホルモン抵抗性喘息を含む。
代表的には、前記喘息は、アレルギー性喘息である。
代表的には、前記喘息は、アレルギー性喘息である。
【0157】
好ましい例において、前記アレルギー性喘息は、ＯＶＡ、アジュバント水酸化アルミニウム、またはその組み合わせからなる群から選択されるアレルギー剤によって引き起こされる喘息を含む。
【0158】
用途
本発明のポリペプチドは、喘息および／または慢性閉塞性肺疾患を予防、治療および／または緩和するために使用されることができる。
本発明のポリペプチドは、喘息および／または慢性閉塞性肺疾患を予防、治療および／または緩和するために使用されることができる。
【0159】
本発明において、「予防」という用語は、疾患および／またはそれに付随する症状の発作予防する方法、または対象が疾患に罹患されないように防ぐ方法を指す。本明細書で使用される「予防」は、疾患および／またはそれに付随する症状の発作を遅らせること、ならびに対象における疾患に罹患されるリスクを低減することを含む。
【0160】
本発明に記載の「治療」は、疾患の進行の遅らせおよび終了、または疾患の排除を含み、１００％の阻害、排除および逆転を必要としない。
一実施形態において、本発明に記載のポリペプチドの組成物、キット、食品ボックスまたは栄養補助食品ボックス、有効成分の組み合わせが存在しない場合のレベルと比較して、本発明に記載の組成物または医薬組成物は、喘息および／または慢性閉塞性肺疾患を、少なくとも約１０％、少なくとも約３０％、少なくとも約５０％、または少なくとも約８０％軽減、阻害および／または逆転させる。
一実施形態において、本発明に記載のポリペプチドの組成物、キット、食品ボックスまたは栄養補助食品ボックス、有効成分の組み合わせが存在しない場合のレベルと比較して、本発明に記載の組成物または医薬組成物は、喘息および／または慢性閉塞性肺疾患を、少なくとも約１０％、少なくとも約３０％、少なくとも約５０％、または少なくとも約８０％軽減、阻害および／または逆転させる。
【0161】
好ましい例において、前記慢性閉塞性肺疾患の予防、治療および／または緩和は、
（ｉ）炎症性因子の阻害、
（ｉｉ）ＩｇＥレベルの低下、
（ｉｉｉ）気道抵抗の低下、
（ｉｖ）肺コンプライアンスの向上、および／または
（ｖ）肺における炎症性細胞浸潤の阻害を含む。
（ｉ）炎症性因子の阻害、
（ｉｉ）ＩｇＥレベルの低下、
（ｉｉｉ）気道抵抗の低下、
（ｉｖ）肺コンプライアンスの向上、および／または
（ｖ）肺における炎症性細胞浸潤の阻害を含む。
【0162】
好ましい例において、前記喘息の予防、治療および／または緩和は、
（ｉ）炎症性因子の阻害、
（ｉｉ）ＩｇＥレベルの低下、
（ｉｉｉ）気道抵抗の低下、
（ｉｖ）肺コンプライアンスの向上、および／または
（ｖ）肺における炎症性細胞浸潤の阻害を含む。
（ｉ）炎症性因子の阻害、
（ｉｉ）ＩｇＥレベルの低下、
（ｉｉｉ）気道抵抗の低下、
（ｉｖ）肺コンプライアンスの向上、および／または
（ｖ）肺における炎症性細胞浸潤の阻害を含む。
【0163】
別の好ましい例において、前記炎症性因子は、インターロイキンを含む。
別の好ましい例において、前記インターロイキンは、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－１３、またはその組み合わせからなる群から選択される。
別の好ましい例において、前記インターロイキンは、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－１３、またはその組み合わせからなる群から選択される。
【0164】
別の好ましい例において、炎症性因子の阻害は、炎症性因子の分泌または発現および／または活性の阻害を含む。
別の好ましい例において、前記ＩｇＥレベルは、血清、全血または血漿中のＩｇＥレベルである。
別の好ましい例において、前記ＩｇＥレベルは、血清、全血または血漿中のＩｇＥレベルである。
【0165】
本発明は、本発明に記載のポリペプチドまたはその薬学的に許容される塩をさらに提供する。（ｉ）炎症の阻害、（ｉｉ）ＩｇＥレベルの低下、（ｉｉｉ）気道抵抗の低下、（ｉｖ）肺コンプライアンスの向上、および／または（ｖ）肺における炎症性細胞浸潤の阻害に使用される。
【0166】
別の好ましい例において、前記炎症は、炎症性因子によって引き起こされる炎症である。
別の好ましい例において、前記炎症性因子は、インターロイキンを含む。
別の好ましい例において、前記炎症性因子は、インターロイキンを含む。
【0167】
別の好ましい例において、前記インターロイキンは、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－１３、またはその組み合わせからなる群から選択される。
医薬組成物
本発明は、有効量（例えば、０．１～９９．９ｗｔ％、好ましくは１０～９９．９ｗｔ％、より好ましくは７０～９９．９ｗｔ％）の本発明のポリペプチド（特にポリペプチドＳＩＰＩ－Ｄ００、ＳＩＰＩ－Ｇ９、ＳＩＰＩ－Ｇ５）、および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。
医薬組成物
本発明は、有効量（例えば、０．１～９９．９ｗｔ％、好ましくは１０～９９．９ｗｔ％、より好ましくは７０～９９．９ｗｔ％）の本発明のポリペプチド（特にポリペプチドＳＩＰＩ－Ｄ００、ＳＩＰＩ－Ｇ９、ＳＩＰＩ－Ｇ５）、および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。
【0168】
通常、本発明のポリペプチドを、非毒性で、不活性で、薬学的に許容される水性担体媒体中で調製することができ、ここで、ｐＨは、通常、約５～８、好ましくは、約６～８である。
【0169】
本明細書で使用されるように、「有効量」または「有効用量」という用語は、ヒトおよび／または動物において機能または活性を生じ、かつヒトおよび／または動物に許容される量を指す。
【0170】
本明細書で使用されるように、「薬学的に許容される」の成分は、過度の有害な副作用（例えば、毒性、刺激およびアレルギー反応）なしにヒトおよび／または哺乳動物での使用に適し、即ち、合理的な利益／リスク比を有する物質である。「薬学的に許容される担体」という用語は、様々な賦形剤および希釈剤を含む、治療剤の投与のための担体を指す。
【0171】
本発明の医薬組成物は、安全かつ有効量の本発明のポリペプチドおよび薬学的に許容される担体を含む。このような担体は、食塩水、緩衝液、グルコース、水、グリセロール、エタノール、およびその組み合わせを含む（これらに限定されない）。通常、薬物製剤は、投与方法と一致する必要があり、本発明の医薬組成物は、注射の形態で、例えば、生理食塩水またはグルコースおよび他のアジュバントを含む水溶液を用いて従来の方法によって調製されることができる。前記医薬組成物は、好ましくは、無菌条件下で製造される。有効成分の投与量は、治療有効量である。本発明の薬物製剤は、徐放性製剤に調製されることもできる。
【0172】
別の好ましい例において、前記医薬組成物の剤形は、スプレー剤、注射剤（例えば、筋肉内または静脈内注射液）である。
本発明に記載のタンパク質の有効量は、投与モードおよび治療される疾患の重症度等によって変化されることができる。好ましい有効量の選択は、様々な要因に基づいて（例えば、臨床試験を通じて）当業者によって決定されることができる。前記要因は、バイオアベイラビリティ、代謝、半減期等の前記薬物動態パラメーター、治療を必要とする患者の疾患の重症度、患者の体重、患者の免疫状況、投与経路を含むがこれらに限定されない。通常、本発明のポリペプチドを一日約０．１～１ｍｇ／ｋｇの動物体重（好ましくは０．３～０．６ｍｇ／ｋｇの動物体重）の投与量で投与されると、満足のいく結果が得られることができる。例えば、治療状況の緊急性により、いくつかの分割された容量が毎日投与されることができるか、投与量を比率に従って減少されることができる。
本発明に記載のタンパク質の有効量は、投与モードおよび治療される疾患の重症度等によって変化されることができる。好ましい有効量の選択は、様々な要因に基づいて（例えば、臨床試験を通じて）当業者によって決定されることができる。前記要因は、バイオアベイラビリティ、代謝、半減期等の前記薬物動態パラメーター、治療を必要とする患者の疾患の重症度、患者の体重、患者の免疫状況、投与経路を含むがこれらに限定されない。通常、本発明のポリペプチドを一日約０．１～１ｍｇ／ｋｇの動物体重（好ましくは０．３～０．６ｍｇ／ｋｇの動物体重）の投与量で投与されると、満足のいく結果が得られることができる。例えば、治療状況の緊急性により、いくつかの分割された容量が毎日投与されることができるか、投与量を比率に従って減少されることができる。
【0173】
本発明の主な利点は、次のとおりである。
（１）本発明のポリペプチドは、喘息および／または慢性閉塞性肺疾患に対して効果的な治療効果を有する。
（１）本発明のポリペプチドは、喘息および／または慢性閉塞性肺疾患に対して効果的な治療効果を有する。
【0174】
（２）本発明のポリペプチドは、優れた薬物動態を有し、皮下注射は、血流への優れた吸収特性を有し、バイオアベイラビリティが顕著に増加し、インビボでの半減期が長いため、より長い時間その効果を発揮することができる。
【0175】
（３）本発明のポリペプチドは、分離量が小さく、生産コストが低く、免疫原性が低く、毒性および副作用が低く、水溶性が良好であり、エアロゾル剤に開発させることができる。
【0176】
以下、本発明は、具体的実施例と併せてさらに説明される。これらの実施例は、本発明を説明するためにのみ使用され、本発明の範囲を限定するものではないことを理解されたい。以下の実施例における具体的な条件を示さない実験方法は、通常、一般的な条件、例えば、（ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌら，分子クローニング：実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ－Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）（第３版）（２００１）ＣＳＨＬ出版社）に記載の条件、メーカーよって提案された条件に従う。特に明記されない限り、パーセンテージと部数とは、重量で計算される。以下の実施例で使用される実験材料および試薬は、特に明記しない限り、商業チャネルから入手することができる。
【0177】
実施例
材料および方法
ＳＰペプチドおよびＳＰペプチド誘導体の一般的な合成方法
図１に示されるように、ポリペプチドとしてＳＰペプチド（ＳＰと呼ばれる）およびＳＰペプチド誘導体ＳＩＰＩ－Ｄ００の固相合成法は、固相担体として２－Ｃｌトリフェニル樹脂を使用し、凝縮系としてヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ）／ジイソプロピルカルボニルジイミド（ＤＩＣ）を使用し、脱保護基Ｆｍｏｃ条件として２０％ピペリジンのＤＭＦ溶液を使用し、切断試薬を使用して、ポリペプチドを樹脂から分離し、アイスエーテルで沈殿して粗ペプチドを得、粗ペプチドは、分取ＨＰＬＣによって精製し、純粋な生成物は、高分解能質量分析を使用して分子量および分子式をマッチングおよび同定する。
材料および方法
ＳＰペプチドおよびＳＰペプチド誘導体の一般的な合成方法
図１に示されるように、ポリペプチドとしてＳＰペプチド（ＳＰと呼ばれる）およびＳＰペプチド誘導体ＳＩＰＩ－Ｄ００の固相合成法は、固相担体として２－Ｃｌトリフェニル樹脂を使用し、凝縮系としてヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ）／ジイソプロピルカルボニルジイミド（ＤＩＣ）を使用し、脱保護基Ｆｍｏｃ条件として２０％ピペリジンのＤＭＦ溶液を使用し、切断試薬を使用して、ポリペプチドを樹脂から分離し、アイスエーテルで沈殿して粗ペプチドを得、粗ペプチドは、分取ＨＰＬＣによって精製し、純粋な生成物は、高分解能質量分析を使用して分子量および分子式をマッチングおよび同定する。
【0178】
ＳＰペプチド（ＳＰ）およびＳＰペプチド誘導体Ｄ００（ＳＩＰＩ－Ｄ００）の合成
ＳＰペプチド（Ｎ末端からＣ末端まで、ＳＰペプチドのアミノ酸配列は、ＧＱＴＹＴＳＧであり、ＳＰペプチドのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１である）およびＳＩＰＩ－Ｄ００（Ｎ末端からＣ末端まで、ＳＩＰＩ－Ｄ００のアミノ酸配列は、ＧＳＴＹＴＱＧであり、ＳＩＰＩ－Ｄ００ペプチドのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２である）を合成するための具体的な段階は、次に示されたとおりであり、
（１）樹脂の膨潤：５００ｍｇの２－Ｃｌトリフェニル樹脂をポリペプチド合成チューブに量り取り、室温条件下で５～１０ｍＬのＤＣＭを加えて樹脂を少なくとも１５分間完全に浸漬し、その後ダイアフラムポンプを使用して溶媒ＤＣＭを抽出および分離する。注：ポリペプチド合成チューブ壁の樹脂をＤＣＭで完全に浸漬することができない場合、ＤＭＦを使用してポリペプチド合成チューブ壁にある樹脂をポリペプチド合成チューブの底部にすすぎ、ＤＣＭを加えて浸漬し、各樹脂が完全に膨潤するようにする。
ＳＰペプチド（Ｎ末端からＣ末端まで、ＳＰペプチドのアミノ酸配列は、ＧＱＴＹＴＳＧであり、ＳＰペプチドのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１である）およびＳＩＰＩ－Ｄ００（Ｎ末端からＣ末端まで、ＳＩＰＩ－Ｄ００のアミノ酸配列は、ＧＳＴＹＴＱＧであり、ＳＩＰＩ－Ｄ００ペプチドのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２である）を合成するための具体的な段階は、次に示されたとおりであり、
（１）樹脂の膨潤：５００ｍｇの２－Ｃｌトリフェニル樹脂をポリペプチド合成チューブに量り取り、室温条件下で５～１０ｍＬのＤＣＭを加えて樹脂を少なくとも１５分間完全に浸漬し、その後ダイアフラムポンプを使用して溶媒ＤＣＭを抽出および分離する。注：ポリペプチド合成チューブ壁の樹脂をＤＣＭで完全に浸漬することができない場合、ＤＭＦを使用してポリペプチド合成チューブ壁にある樹脂をポリペプチド合成チューブの底部にすすぎ、ＤＣＭを加えて浸漬し、各樹脂が完全に膨潤するようにする。
【0179】
（２）樹脂の洗浄：５～１０ｍＬのＤＭＦを使用して、壁に取り付けられた樹脂をポリペプチド合成チューブの底部にすすぎ、ＤＭＦをろ過および除去する。その後５～１０ｍＬのＤＣＭを加え、１分間よく混合し、ＤＣＭをろ過および除去し、この操作を３回繰り返す。最後に、５～１０ｍＬのＤＭＦを加え、１分間よく混合し、ＤＭＦをろ過および初虚子、この操作を３回繰り返す。注：ＤＭＦが壁に取り付けられた壁に取り付けられた樹脂を完全にすすぐことができない場合、外力を利用してポリペプチド合成チューブの底部にこすり落として、反応液がすべての樹脂を完全に浸漬する必要がある。
【0180】
（３）最初のアミノ酸の凝縮：Ｆｍｏｃ－ＡＡ－ＯＨ（３ｅｑ）を量り取って１０ｍＬの遠心分離管に加え、５ｍＬのＤＭＦを量り取ってアミノ酸を溶解し、ＤＩＰＥＡ（８ｅｑ）を量り取って遠心分離管で振とうおよび混合し、室温条件下で１～２分間活性化する。活性化されたアミノ酸をポリペプチド合成チューブに注ぎ、二機能エアバス恒温発振器に入れ、３５℃条件下で１時間振とうした後に洗浄する。注：ＳＰペプチドの最初のアミノ酸は、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨであり、ＳＩＰＩ－Ｄ００の最初のアミノ酸は、Ｆｍｏｃ－Ｄ－Ｇｌｙ－ＯＨであり、アミノ酸を溶解するためのＤＭＦの用量は、樹脂を完全に浸漬できるかどうかに基づいており、通常は３～８ｍＬを必要とする。
【0181】
（４）ポリペプチド樹脂複合体の洗浄：５～１０ｍＬのＤＣＭを加えて１分間よく混合し、ＤＣＭをろ過および除去し、この操作を３回繰り返す。最後に５～１０ｍＬのＤＭＦを加えて１分間よく混合し、ＤＭＦをろ過および除去し、この操作を３回繰り返す。注：ＤＭＦが壁に取り付けられた樹脂を完全にすすぐことができない場合、外力を利用してポリペプチド合成チューブの底部にこすり落として、反応液がすべての樹脂を完全に浸漬する必要がある。
【0182】
（５）樹脂空ウェルのブロッキング：上記のポリペプチド合成チューブに５ｍＬのメタノールを加えて二機能エアバス恒温発振器に入れ、３５℃条件下で２０分間振とうして反応させ、ブロッキング液メタノールをろ過および除去する。この操作を２回繰り返す。（４）ポリペプチド樹脂複合体を洗浄する操作を繰り返す。注：ブロッキング液メタノールの用量は、ポリペプチド樹脂複合体の完全な浸漬に基づく。
【0183】
（６）保護基Ｆｍｏｃの除去：上記のポリペプチド合成チューブに５ｍＬの２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液を加え、二機能エアバス恒温発振器に入れ、３５℃条件下で１０分間振とうして反応させ、反応液を濾過および除去し、この操作を２回繰り返す。（４）ポリペプチド樹脂複合体を洗浄する操作を繰り返す。注：２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液は、ポリペプチド樹脂複合体の完全な浸漬に基づき、２０％ピペリジン／ＤＭＦ（２０ｍＬのピペリジン：８０ｍＬのＤＭＦ）。
【0184】
（７）脱保護されたＦｍｏｃの検出：保護基Ｆｍｏｃを除去する反応には、反応プロセスをモニターリングするためにＫａｉｓｅｒ試薬（ニンヒドリンの定性的な発色）を使用する必要があり、キャピラリードロッパーを使用して少量の樹脂を２ｍＬの遠心分離管に入れ、３滴の５％ニンヒドリンのエタノール溶液および１滴の８０％フェノールのエタノール溶液を滴下し、よく混合した後に２００℃条件下で１分間加熱煮沸し、各樹脂が青色の場合、アミノ末端が完全に露出され、保護基Ｆｍｏｃが完全に除去されていることを意味し、いくつかの樹脂が無色の場合、アミノ末端の保護基Ｆｍｏｃが反応によって除去されていないことを意味し、保護基Ｆｍｏｃを除去する上記の段階を１回繰り返す必要がある。注：Ｋａｉｓｅｒ試薬（５％ニンヒドリンのエタノール溶液：８０％フェノールのエタノール溶液（３：１、ｖ／ｖ））、検出で使用される樹脂は、検出される樹脂が代表的なものであることを確認するために、可能な限り異なる方向から採取する必要がある。
【0185】
（８）２番目のアミノ酸の凝縮：それぞれＦｍｏｃ－ＡＡ－ＯＨ（３ｅｑ）およびＨＯＢＴ（３．６ｅｑ）を量り取って１０ｍＬ遠心分離管に加え、６ｍＬのＤＭＦを加えて振とうおよび混合した後、ＤＩＣ（８ｅｑ）を量り取って遠心分離管で振とうしてよく混合し、室温条件下で１～２分間活性化する。活性化されたアミノ酸をポリペプチド合成チューブに加え、ポリペプチド合成チューブを二機能エアバス恒温発振器に入れ、３５℃条件下で２時間反応させる。（４）ポリペプチド樹脂複合体を洗浄する操作を繰り返す。注：ＳＰペプチドの２番目のアミノ酸は、Ｆｍｏｃ－Ｓｅｒ－ＯＨであり、ＳＩＰＩ－Ｄ００の２番目のアミノ酸は、Ｆｍｏｃ－Ｄ－Ｇｌｎ－ＯＨである。
【0186】
（９）アミノ酸凝縮後の検出：アミノ酸凝縮反応後、Ｋａｉｓｅｒ試薬（ニンヒドリンの定性的な発色）を使用して反応プロセスをモニターリングし、即ち、キャピラリードロッパーを使用して少量の樹脂を２ｍＬの遠心分離管に入れ、３滴の５％ニンヒドリンのエタノール溶液および１滴の８０％フェノールのエタノール溶液を滴下し、よく混合した後に２００℃条件下で１分間加熱煮沸し、樹脂が無色の場合、アミノ末端は完全に凝縮したことを意味し、青色または青紫の場合、アミノ末端は完全に凝縮されていないことを意味し、２番目のアミノ酸を凝縮する上記の段階を繰り返す。
【0187】
（１０）残りのアミノ酸の凝縮：（６）保護基Ｆｍｏｃの除去、（７）脱保護されたＦｍｏｃの検出、（８）２番目のアミノ酸の凝縮、（９）アミノ酸凝縮後の検出等の段階を、ポリペプチド配列に従ってアミノ酸を樹脂に凝縮させる段階を順次に繰り返す。最後に（６）保護基Ｆｍｏｃの除去、（７）脱保護されたＦｍｏｃの検出を繰り返す。
【0188】
（１１）ポリペプチドおよび樹脂の分離：洗浄したポリペプチド樹脂複合体をＤＣＭで３回すすいだ後、エーテルを使用してポリペプチド樹脂複合体を３回洗浄し、ダイアフラムポンプを使用して樹脂を吸引および乾燥させ（ポリペプチド樹脂複合体は、緩い砂の形を示す）、５０ｍＬの遠心分離管に注ぎ、２０ｍＬの切断試薬のＢ試薬を量り取って５０ｍＬの遠心分離管に加え（ポリペプチド樹脂複合体を含む）、密封し、３５℃条件下で４時間激しく振とうして反応させる。反応終了後ろ過し、樹脂および切断液（ポリペプチドを含む）を分離し、ろ液を５０ｍＬの遠心分離管に移し、５ｍＬのＢ試薬で樹脂をすすぎ、得られた溶離液を５０ｍＬの遠心分離管に移し、ろ液（ポリペプチドを含む）を窒素ガスバブリングで濃縮する。４０ｍＬのアイスエーテルを加え、沈殿物を振とうし、遠心分離機で遠心分離し、上清液を注ぎ出し、エーテルを加えて洗浄し、上記の遠心分離およびエーテル洗浄の操作を３回繰り返し、窒素ガスブローによって乾燥させて粗ペプチドを得る。注：Ｂ試薬の比率（８８％のＴＦＡ：５％のフェノール：５％の水：２％のＴＩＰｓ）、遠心分離機の遠心分離時間は、５分間に設定され、回転速度は、３５００ｒ／ｍｉｎに設定される。
（１２）分析、精製および同定：高速液体クロマトグラフィーで粗ペプチドを分析し、液相を調製して粗ペプチドを精製し、質量分析計で同定する。
（１２）分析、精製および同定：高速液体クロマトグラフィーで粗ペプチドを分析し、液相を調製して粗ペプチドを精製し、質量分析計で同定する。
【0189】
１）高速液体クロマトグラフィーの分析条件：重水素ランプをオンにして二波長を検出し、波長は、それぞれ２１４ｎｍおよび２５４ｎｍに設定され、流速は、１．０ｍＬ／ｍｉｎに設定され、注入量は、５μＬに設定される。グラジエント溶出法を使用して溶出し、グラジエント溶出高速液体クロマトグラフィープログラムは、移動相Ｂに基づいて（０分－開始、０分－９０％移動相Ｂ、２分－９０％移動相Ｂ、２０分－２０％移動相Ｂ、３０分－０％移動相Ｂ、６０分－終了）に設定される。ここで、移動相Ａは、分析用純粋なアセトニトリル（０．１％トリフルオロ酢酸を含む）であり、移動相Ｂは、精製水（０．１％トリフルオロ酢酸を含む）である。分析カラムは、Ｄｉａｍｏｎｓｉｌ Ｃ１８ ５μｍ ２５０×４．６ｍＭである。
【0190】
２）分取カラムクロマトグラフィー条件：重水素ランプをオンにして二波長を検出し、波長は、それぞれ２１４ｎｍおよび２５４ｎｍであり、流速は、１０ｍＬ／ｍｉｎに設定され、注入量は、１０ｍＬに設定される。グラジエント溶出法を使用して溶出および精製し、グラジエント溶出プログラムは、移動相Ｂに基づいて（０分－開始、０分－９０％移動相Ｂ、５分－９０％移動相Ｂ、４０分－２０％移動相Ｂ、６０分－０％移動相Ｂ、６０分－終了）に設定される。ここで、移動相Ａは、分析用純粋なアセトニトリル（０．１％酢酸を含む）であり、移動相Ｂは、精製水（０．１％トリフルオロ酢酸を含む）である。分取カラムは、Ｒｙｏｕｎｇ Ｔｅｃｈ Ｌｅｄ Ｃ１８－ＲＰＳ １２ｎｍ １０μｍ ２０×２５０ｍＭである。グラジエント溶出は、標的ピーク溶液を収集し、標的ピーク溶液を液体窒素に入れて凍結させ、凍結乾燥機で乾燥させ、生成物をＨＰＬＣ分析によって生成物の純度を確認し、質量分析計を使用して、生成物の分子式および分子量が理論値と一致するかどうかを同定する。
【0191】
注：注入前に５％移動相Ａを使用してカラムを５分以上すすぎ、明らかな不純物ピークがなくなった後に９０％移動相Ｂを使用してカラムを５～１０分間平衡化すると、明らかな平衡ピークが確認されることができる。
【0192】
合成されたＳＰペプチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）のすべてのアミノ酸残基は、Ｌ－アミノ酸であり、合成されたＳＩＰＩペプチド誘導体ＳＩＰＩ－Ｄ００（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）のすべてのアミノ酸残基は、すべてＤ－アミノ酸である。
【0193】
ＳＰペプチド誘導体（グリコシル化ＳＰペプチド）の一般的な合成方法
ＳＰペプチド（Ｎ末端からＣ末端まで、ＳＰペプチドのアミノ酸配列は、ＧＱＴＹＴＳＧ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１である）グリコシル化誘導体におけるＳＩＰＩ－Ｇ４、ＳＩＰＩ－Ｇ５、ＳＩＰＩ－Ｇ６、ＳＩＰＩ－Ｇ７、ＳＩＰＩ－Ｇ８、ＳＩＰＩ－Ｇ９、ＳＩＰＩ－Ｇ１０の合成策略は、ポリペプチド固相合成法であり（例えば、図６に示される）、固相担体として２－Ｃｌトリフェニル樹脂を使用し、凝縮系としてヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ）／ジイソプロピルカルボニルジイミド（ＤＩＣ）を使用し、脱保護基Ｆｍｏｃ条件として２０％ピペリジンのＤＭＦ溶液を使用し、Ｂ切断試薬を用いてポリペプチドを樹脂から分離し、アイスエーテルで沈殿させて、粗ペプチドを得、粗ペプチドを分取ＨＰＬＣによって精製し、純粋な生成物を高分解能質量分析によって分子量および分子式のマッチングを同定する。最後に、５％ヒドラジン水和物を使用してアセチル保護基を除去し、分取液相を使用して生成し、精製されたグリコシル化ＳＰペプチドを高分解能質量分析によって分子量および分子式のマッチングを同定する。
ＳＰペプチド（Ｎ末端からＣ末端まで、ＳＰペプチドのアミノ酸配列は、ＧＱＴＹＴＳＧ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１である）グリコシル化誘導体におけるＳＩＰＩ－Ｇ４、ＳＩＰＩ－Ｇ５、ＳＩＰＩ－Ｇ６、ＳＩＰＩ－Ｇ７、ＳＩＰＩ－Ｇ８、ＳＩＰＩ－Ｇ９、ＳＩＰＩ－Ｇ１０の合成策略は、ポリペプチド固相合成法であり（例えば、図６に示される）、固相担体として２－Ｃｌトリフェニル樹脂を使用し、凝縮系としてヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ）／ジイソプロピルカルボニルジイミド（ＤＩＣ）を使用し、脱保護基Ｆｍｏｃ条件として２０％ピペリジンのＤＭＦ溶液を使用し、Ｂ切断試薬を用いてポリペプチドを樹脂から分離し、アイスエーテルで沈殿させて、粗ペプチドを得、粗ペプチドを分取ＨＰＬＣによって精製し、純粋な生成物を高分解能質量分析によって分子量および分子式のマッチングを同定する。最後に、５％ヒドラジン水和物を使用してアセチル保護基を除去し、分取液相を使用して生成し、精製されたグリコシル化ＳＰペプチドを高分解能質量分析によって分子量および分子式のマッチングを同定する。
【0194】
七つのグリコシル化ポリペプチドの合成
ＳＩＰＩ－Ｇ４ペプチド、ＳＩＰＩ－Ｇ５ペプチド、ＳＩＰＩ－Ｇ６ペプチド、ＳＩＰＩ－Ｇ７ペプチド、ＳＩＰＩ－Ｇ８ペプチド、ＳＩＰＩ－Ｇ９ペプチド、ＳＩＰＩ－Ｇ１０ペプチドは、ＳＰペプチドのグルコース（Ｇｌｃ）化誘導体である。
ＳＩＰＩ－Ｇ４ペプチド、ＳＩＰＩ－Ｇ５ペプチド、ＳＩＰＩ－Ｇ６ペプチド、ＳＩＰＩ－Ｇ７ペプチド、ＳＩＰＩ－Ｇ８ペプチド、ＳＩＰＩ－Ｇ９ペプチド、ＳＩＰＩ－Ｇ１０ペプチドは、ＳＰペプチドのグルコース（Ｇｌｃ）化誘導体である。
【0195】
ＳＩＰＩ－Ｇ４、ＳＩＰＩ－Ｇ５、ＳＩＰＩ－Ｇ６、ＳＩＰＩ－Ｇ７、ＳＩＰＩ－Ｇ８、ＳＩＰＩ－Ｇ９、ＳＩＰＩ－Ｇ１０を合成するための具体的な段階は、次のとおりである。
【0196】
１）樹脂の膨潤：５００ｍｇの２－Ｃｌトリフェニル樹脂をポリペプチド合成チューブに量り取り、室温条件下で５～１０ｍＬのＤＣＭを加えて樹脂を少なくとも１５分間完全に浸漬し、その後ダイアフラムポンプを使用して溶媒ＤＣＭを抽出および分離する。注：ポリペプチド合成チューブ壁の樹脂をＤＣＭで完全に浸漬することができない場合、ＤＭＦを使用してポリペプチド合成チューブ壁にある樹脂をポリペプチド合成チューブの底部にすすぎ、ＤＣＭを加えて浸漬し、各樹脂が完全に膨潤するようにする。
【0197】
２）樹脂の洗浄：５～１０ｍＬのＤＭＦを使用して、壁に取り付けられた樹脂をポリペプチド合成チューブの底部にすすぎ、ＤＭＦをろ過および除去する。その後５～１０ｍＬのＤＣＭを加えて１分間よく混合し、ＤＣＭをろ過および除去し、この操作を３回繰り返す。最後に５～１０ｍＬのＤＭＦを加えて１分間よく混合し、ＤＭＦをろ過および除去し、この操作を３回繰り返す。注：ＤＭＦが壁に取り付けられた樹脂を完全にすすぐことができない場合、外力を利用してポリペプチド合成チューブの底部にこすり落とす必要がある。
【0198】
３）最初のアミノ酸の凝縮：Ｆｍｏｃ－ＡＡ－ＯＨ（３ｅｑ）を量り取って１０ｍＬの遠心分離管に加え、５ｍＬのＤＭＦを量り取ってアミノ酸を溶解し、ＤＩＰＥＡ（８ｅｑ）を量り取って遠心分離管で振とうおよび混合し、室温条件下で１～２分間活性化する。活性化されたアミノ酸をポリペプチド合成チューブに加え、二機能エアバス恒温発振器に入れ、３５℃条件下で１時間振とうして反応させる。注：最初のアミノ酸は、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨであり、アミノ酸を溶解するためのＤＭＦの用量は、樹脂を完全に浸漬できるかどうかに基づき、通常は、３～８ｍＬを必要とする。
【0199】
４）ポリペプチド樹脂複合体の洗浄：５～１０ｍＬのＤＣＭを加えて１分間よく混合し、ＤＣＭをろ過および除去し、この操作を３回繰り返す。最後に５～１０ｍＬのＤＭＦを加えて１分間よく混合し、ＤＭＦをろ過および除去し、この操作を３回繰り返す。注：ＤＭＦが壁に取り付けられた樹脂を完全にすすぐことができない場合、外力を利用してポリペプチド合成チューブの底部にこすり落とす必要がある。
【0200】
５）樹脂空ウェルのブロッキング：上記のポリペプチド合成チューブに５ｍＬのメタノールを加えて二機能エアバス恒温発振器に入れ、３５℃条件下で２０分間振とうして反応させ、ブロッキング液メタノールをろ過および除去する。この操作を２回繰り返す。（４）ポリペプチド樹脂複合体を洗浄する操作を繰り返す。注：ブロッキング液メタノールの用量は、ポリペプチド樹脂複合体の完全な浸漬に基づく。
【0201】
６）保護基Ｆｍｏｃの除去：上記のポリペプチド合成チューブに５ｍＬの２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液を加え、二機能エアバス恒温発振器に入れ、３５℃条件下で１０分間振とうして反応させ、反応液を濾過および除去し、この操作を２回繰り返す。（４）ポリペプチド樹脂複合体を洗浄する操作を繰り返す。注：２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液は、ポリペプチド樹脂複合体の完全な浸漬に基づき、通常は、３～８ｍＬを必要とする。
【0202】
７）脱保護されたＦｍｏｃの検出：保護基Ｆｍｏｃを除去する反応には、反応プロセスをモニターリングするためにＫａｉｓｅｒ試薬（ニンヒドリンの定性的な発色）を使用する必要があり、キャピラリードロッパーを使用して少量の樹脂を２ｍＬの遠心分離管に入れ、３滴の５％ニンヒドリンのエタノール溶液および１滴の８０％フェノールのエタノール溶液を滴下し、よく混合した後に２００℃条件下で１分間加熱煮沸し、各樹脂が青色の場合、アミノ末端が完全に露出され、保護基Ｆｍｏｃが完全に除去されていることを意味し、樹脂が無色の場合、アミノ末端の保護基Ｆｍｏｃが反応によって除去されていないことを意味し、保護基Ｆｍｏｃを除去する上記の段階を１回繰り返す必要がある。注：Ｋａｉｓｅｒ試薬（５％ニンヒドリンのエタノール溶液：８０％フェノールのエタノール溶液（３：１、ｖ／ｖ））、検出で使用される樹脂は、採取される樹脂が代表的なものであることを確認するために、可能な限り異なる方向から採取する必要がある。
【0203】
８）２番目のアミノ酸の凝縮：ａ）一般的なアミノ酸の凝縮：Ｆｍｏｃ－Ｓｅｒ－ＯＨ（３ｅｑ）およびＨＯＢＴ（３．６ｅｑ）を量り取って１０ｍＬの遠心分離管に加え、５ｍＬのＤＭＦを量り取ってアミノ酸およびＨＯＢＴを溶解し、ＤＩＣ（８ｅｑ）を量り取って遠心分離管で振とうしてよく混合し、室温条件下で１～２分間活性化する。活性化されたアミノ酸をポリペプチド合成チューブに加え、二機能エアバス恒温発振器に入れ、３５℃条件下で１時間振とうして反応させる。（４）ポリペプチド樹脂複合体を洗浄する操作を繰り返す。ｂ）糖アミノ酸の凝縮：それぞれＦｍｏｃ－Ｓｅｒ［ＧｌｃＮＡｃ（Ａｃ４）－ＯＨ］（１．５ｅｑ．）およびＨＯＡＴ（１．５ｅｑ）を量り取って１０ｍＬの遠心分離管に加え、４ｍＬのＤＭＦを加えて糖アミノ酸およびＨＯＢＴを溶解し、ＤＩＣ（８ｅｑ）を量り取って遠心分離管で振とうしてよく混合し、室温条件下で１～２分間活性化する。活性化されたアミノ酸をポリペプチド合成チューブに加え、二機能エアバス恒温発振器に入れ、３５℃条件下で１時間振とうして反応させる。（４）ポリペプチド樹脂複合体を洗浄する操作を繰り返す。注：ＳＩＰＩ－Ｇ４、ＳＩＰＩ－Ｇ７、ＳＩＰＩ－Ｇ９およびＳＩＰＩ－Ｇ１０の２番目のアミノ酸は、Ｆｍｏｃ－Ｓｅｒ［ＧｌｃＮＡｃ（Ａｃ４）－ＯＨ］であり、ＳＩＰＩ－Ｇ５、ＳＩＰＩ－Ｇ６およびＳＩＰＩ－Ｇ８の２番目のアミノ酸は、Ｆｍｏｃ－Ｓｅｒ－ＯＨである。
【0204】
９）アミノ酸凝縮後の検出：アミノ酸凝縮反応後、Ｋａｉｓｅｒ試薬（ニンヒドリンの定性的な発色）を使用して反応プロセスをモニターリングし、即ち、キャピラリードロッパーを使用して少量の樹脂を２ｍＬの遠心分離管に入れ、３滴の５％ニンヒドリンのエタノール溶液および１滴の８０％フェノールのエタノール溶液を滴下し、よく混合した後に２００℃条件下で１分間加熱煮沸し、樹脂が無色の場合、アミノ末端は完全に凝縮したことを意味し、青色または青紫の場合、アミノ末端は完全に凝縮されていないことを意味し、２番目のアミノ酸を凝縮する上記の段階を繰り返す。
【0205】
１０）残りのアミノ酸の凝縮：（６）保護基Ｆｍｏｃの除去、（７）脱保護されたＦｍｏｃの検出、（８）２番目のアミノ酸の凝縮、（９）アミノ酸凝縮後の検出等の段階を、ポリペプチド配列に従ってアミノ酸を樹脂に凝縮させる段階を順次に繰り返す。最後に（６）保護基Ｆｍｏｃの除去、（７）脱保護されたＦｍｏｃの検出を繰り返す。注：ＳＩＰＩ－Ｇ４、ＳＩＰＩ－Ｇ５、ＳＩＰＩ－Ｇ８およびＳＩＰＩ－Ｇ１０の３番目のアミノ酸は、Ｆｍｏｃ－Ｔｈｒ［ＧｌｃＮＡｃ（Ａｃ４）－ＯＨ］であり、ＳＩＰＩ－Ｇ６、ＳＩＰＩ－Ｇ７、ＳＩＰＩ－Ｇ９の３番目のアミノ酸は、Ｆｍｏｃ－Ｔｈｒ－ＯＨであり、ＳＩＰＩ－Ｇ４、ＳＩＰＩ－Ｇ５、ＳＩＰＩ－Ｇ６、ＳＩＰＩ－Ｇ７、ＳＩＰＩ－Ｇ８、ＳＩＰＩ－Ｇ９、ＳＩＰＩ－Ｇ１０の４番目のアミノ酸は、Ｆｍｏｃ－Ｔｙｒ－ＯＨであり、ＳＩＰＩ－Ｇ４、ＳＩＰＩ－Ｇ６、ＳＩＰＩ－Ｇ８およびＳＩＰＩ－Ｇ９の５番目のアミノ酸は、Ｆｍｏｃ－Ｔｈｒ［ＧｌｃＮＡｃ（Ａｃ４）－ＯＨ］であり、ＳＩＰＩ－Ｇ５、ＳＩＰＩ－Ｇ７およびＳＩＰＩ－Ｇ１０の５番目のアミノ酸は、Ｆｍｏｃ－Ｔｈｒ－ＯＨであり、ＳＩＰＩ－Ｇ４、ＳＩＰＩ－Ｇ５、ＳＩＰＩ－Ｇ６、ＳＩＰＩ－Ｇ７、ＳＩＰＩ－Ｇ８、ＳＩＰＩ－Ｇ９、ＳＩＰＩ－Ｇ１０の６番目のアミノ酸は、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｎ－ＯＨであり、ＳＩＰＩ－Ｇ４、ＳＩＰＩ－Ｇ５、ＳＩＰＩ－Ｇ６、ＳＩＰＩ－Ｇ７、ＳＩＰＩ－Ｇ８、ＳＩＰＩ－Ｇ９、ＳＩＰＩ－Ｇ１０の７番目のアミノ酸は、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨである。
【0206】
１１）ポリペプチドおよび樹脂の分離：洗浄したポリペプチド樹脂複合体をＤＣＭで３回すすいだ後、エーテルを使用してポリペプチド樹脂複合体を３回洗浄し、ダイアフラムポンプを使用して樹脂を吸引および乾燥させ（ポリペプチド樹脂複合体は、緩い砂の形を示す）、５０ｍＬの遠心分離管に注ぎ、２０ｍＬの切断試薬のＢ試薬を量り取って５０ｍＬの遠心分離管に加え（ポリペプチド樹脂複合体を含む）、密封し、３５℃条件下で４時間激しく振とうして反応させる。反応終了後ろ過し、樹脂および切断液（ポリペプチドを含む）を分離し、ろ液を５０ｍＬの遠心分離管に移し、５ｍＬのＢ試薬で樹脂をすすぎ、得られた溶離液を５０ｍＬの遠心分離管に移し、ろ液（ポリペプチドを含む）を窒素ガスバブリングで濃縮する。その後当該遠心分離管に、４０ｍＬのアイスエーテルを加え、沈殿物を振とうし、遠心分離機で遠心分離し、上清液を注ぎ出し、エーテルを加えて洗浄し、上記の遠心分離およびエーテル洗浄の操作を３回繰り返し、窒素ガスブローによって乾燥させて粗ペプチドを得る。注：Ｂ試薬の配合比率（８８％のＴＦＡ：５％のフェノール：５％の水：２％のＴＩＰｓ）、遠心分離機の遠心分離時間は、５分間に設定され、回転速度は、３５００ｒ／ｍｉｎに設定される。
【0207】
１２）分析、精製および同定：高速液体クロマトグラフィーで粗ペプチドを分析し、液相を調製して粗ペプチドを精製し、質量分析計で同定する。
【0208】
高速液体クロマトグラフィーの分析条件：重水素ランプをオンにして二波長を検出し、波長は、それぞれ２１４ｎｍおよび２５４ｎｍであり、流速は、１．０ｍＬ／ｍｉｎに設定され、注入量は、５μＬに設定される。グラジエント溶出法を使用して溶出および分析し、グラジエント溶出高速液体クロマトグラフィープログラムは、移動相Ｂに基づいて（０分－開始、０分－９０％移動相Ｂ、２分－９０％移動相Ｂ、２０分－２０％移動相Ｂ、３０分－０％移動相Ｂ、６０分－終了）に設定される。ここで、移動相Ａは、分析用純粋なアセトニトリル（０．１％トリフルオロ酢酸を含む）であり、移動相Ｂは、精製水（０．１％トリフルオロ酢酸を含む）である。分析カラムは、Ｄｉａｍｏｎｓｉｌ Ｃ１８ ５μｍ ２５０×４．６ｍＭである。
【0209】
分取カラムクロマトグラフィー条件：重水素ランプをオンにして二波長を検出し、波長は、それぞれ２１４ｎｍおよび２５４ｎｍであり、流速は、１０ｍＬ／ｍｉｎに設定され、注入量は、１０ｍＬに設定される。グラジエント溶出法を使用して溶出および精製し、グラジエント溶出プログラムは、移動相Ｂに基づいて（０分－開始、０分－９０％移動相Ｂ、５分－９０％移動相Ｂ、４０分－２０％移動相Ｂ、６０分－０％移動相Ｂ、６０分－終了）に設定される。ここで、移動相Ａは、分析用純粋なアセトニトリル（０．１％トリフルオロ酢酸を含む）であり、移動相Ｂは、精製水（０．１％トリフルオロ酢酸を含む）である。分取カラムは、Ｒｙｏｕｎｇ Ｔｅｃｈ Ｌｅｄ Ｃ１８－ＲＰＳ １２ｎｍ １０μｍ ２０×２５０ｍＭである。グラジエント溶出は、標的ピーク溶液を収集し、標的ピーク溶液を液体窒素に入れて凍結させ、凍結乾燥機で乾燥させ、生成物をＨＰＬＣ分析によって生成物の純度を確認し、質量分析計を使用して、生成物の分子式および分子量が理論値と一致するかどうかを同定する。
【0210】
注：注入前に５％移動相Ａを使用してカラムを５分以上すすぎ、明らかな不純物ピークがなくなった後に９０％移動相Ｂを使用してカラムを５～１０分間平衡化すると、明らかな平衡ピークが確認されることができる。
【0211】
１３）脱アセチル化：精製されたペルアセチル保護糖ペプチドを５％ヒドラジン水和物に溶解し、２時間攪拌して反応させ、ＨＰＬＣによって反応プロセスをモニターリングする。
【0212】
１４）分析、精製および同定：高速液体クロマトグラフィーを使用して、反応液を分析し、液相を調製して反応液を精製し、質量分析計で同定する。
【0213】
高速液体クロマトグラフィーの分析条件：重水素ランプをオンにして二波長を検出し、波長は、それぞれ２１４ｎｍおよび２５４ｎｍであり、流速は、１．０ｍＬ／ｍｉｎに設定され、注入量は、５μＬに設定される。グラジエント溶出法を使用して溶出および分析し、グラジエント溶出高速液体クロマトグラフィープログラムは、移動相Ｂに基づいて（０分－開始、０分－９９％移動相Ｂ、２分－９９％移動相Ｂ、２０分－５０％移動相Ｂ、３０分－２０％移動相Ｂ、６０分－終了）に設定される。ここで、移動相Ａは、分析用純粋なアセトニトリル（０．１％トリフルオロ酢酸を含む）であり、移動相Ｂは、精製水（０．１％トリフルオロ酢酸を含む）である。分析カラムは、Ｄｉａｍｏｎｓｉｌ Ｃ１８ ５μｍ ２５０×４．６ｍＭである。
【0214】
分取カラムクロマトグラフィー条件：重水素ランプをオンにして二波長を検出し、波長は、それぞれ２１４ｎｍおよび２５４ｎｍであり、流速は、１０ｍＬ／ｍｉｎに設定され、注入量は、１０ｍＬに設定される。グラジエント溶出法を使用して溶出および精製し、グラジエント溶出プログラムは、移動相Ｂに基づいて（０分－開始、０分－９９％移動相Ｂ、５分－９９％移動相Ｂ、４０分－４０％移動相Ｂ、６０分－０％移動相Ｂ、６０分－終了）に設定される。ここで、移動相Ａは、分析用純粋なアセトニトリル（０．１％トリフルオロ酢酸を含む）であり、移動相Ｂは、精製水（０．１％トリフルオロ酢酸を含む）である。分取カラムは、Ｒｙｏｕｎｇ Ｔｅｃｈ Ｌｅｄ Ｃ１８－ＲＰＳ １２ｎｍ １０μｍ ２０×２５０ｍＭである。グラジエント溶出は、標的ピーク溶液を収集し、標的ピーク溶液を液体窒素に入れて凍結させ、凍結乾燥機で乾燥させ、生成物をＨＰＬＣ分析によって生成物の純度を確認し、質量分析計を使用して、生成物の分子式および分子量が理論値と一致するかどうかを同定する。
【0215】
Ｎ末端からＣ末端まで、ＳＩＰＩ－Ｇ４ペプチドのアミノ酸配列は、ＧＱＴ（Ｇｌｃ）ＹＴ（Ｇｌｃ）Ｓ（Ｇｌｃ）Ｇである。
Ｎ末端からＣ末端まで、ＳＩＰＩ－Ｇ５ペプチドのアミノ酸配列は、ＧＱＴＹＴ（Ｇｌｃ）ＳＧである。
Ｎ末端からＣ末端まで、ＳＩＰＩ－Ｇ５ペプチドのアミノ酸配列は、ＧＱＴＹＴ（Ｇｌｃ）ＳＧである。
【0216】
Ｎ末端からＣ末端まで、ＳＩＰＩ－Ｇ６ペプチドのアミノ酸配列は、ＧＱＴ（Ｇｌｃ）ＹＴＳＧである。
Ｎ末端からＣ末端まで、ＳＩＰＩ－Ｇ７ペプチドのアミノ酸配列は、ＧＱＴＹＴＳ（Ｇｌｃ）Ｇである。
Ｎ末端からＣ末端まで、ＳＩＰＩ－Ｇ７ペプチドのアミノ酸配列は、ＧＱＴＹＴＳ（Ｇｌｃ）Ｇである。
【0217】
Ｎ末端からＣ末端まで、ＳＩＰＩ－Ｇ８ペプチドのアミノ酸配列は、ＧＱＴ（Ｇｌｃ）ＹＴ（Ｇｌｃ）ＳＧである。
Ｎ末端からＣ末端まで、ＳＩＰＩ－Ｇ９ペプチドのアミノ酸配列は、ＧＱＴ（Ｇｌｃ）ＹＴＳ（Ｇｌｃ）Ｇである。
Ｎ末端からＣ末端まで、ＳＩＰＩ－Ｇ９ペプチドのアミノ酸配列は、ＧＱＴ（Ｇｌｃ）ＹＴＳ（Ｇｌｃ）Ｇである。
【0218】
Ｎ末端からＣ末端まで、ＳＩＰＩ－Ｇ１０ペプチドのアミノ酸配列は、ＧＱＴＹＴ（Ｇｌｃ）Ｓ（Ｇｌｃ）Ｇである。
ＳＰペプチド、ＳＩＰＩ－Ｇ４、ＳＩＰＩ－Ｇ５、ＳＩＰＩ－Ｇ６、ＳＩＰＩ－Ｇ７、ＳＩＰＩ－Ｇ８、ＳＩＰＩ－Ｇ９、ＳＩＰＩ－Ｇ１０のアミノ酸は、すべてＬ型アミノ酸である。
ＳＰペプチド、ＳＩＰＩ－Ｇ４、ＳＩＰＩ－Ｇ５、ＳＩＰＩ－Ｇ６、ＳＩＰＩ－Ｇ７、ＳＩＰＩ－Ｇ８、ＳＩＰＩ－Ｇ９、ＳＩＰＩ－Ｇ１０のアミノ酸は、すべてＬ型アミノ酸である。
【0219】
実施例１．ラット全血中の各７ペプチド化合物の安定性
１．１．実験手順およびインキュベーション条件
被験品の調製：ＳＰおよびＳＩＰＩ－Ｄ００を０．１％ギ酸を含む適切な量の５０％アセトニトリル水で溶解および希釈して、濃度が２００μｇ／ｍＬである作業溶液を得る。安定性研究試薬の使用状況は、表１のとおりである。
１．１．実験手順およびインキュベーション条件
被験品の調製：ＳＰおよびＳＩＰＩ－Ｄ００を０．１％ギ酸を含む適切な量の５０％アセトニトリル水で溶解および希釈して、濃度が２００μｇ／ｍＬである作業溶液を得る。安定性研究試薬の使用状況は、表１のとおりである。
【0220】
【表2】
【0221】
１）新鮮なラット全血をＥＰチューブに加えて、穏やかに浸透して混合し、
２）ＥＰチューブを３７℃の水浴で５分間プレインキュベートし、
３）それそれ各化合物を加えて反応を開始させ、３７℃でインキュベートし続け、
４）サンプルチューブからそれぞれ０、２分、５分、１０分、３０分、６０分で５０μＬをストップチューブに取り、５０μＬの氷冷７％過塩素酸を加え、振とうし、反応を停止し、
５）１３０００ｒ／ｍｉｎで１０分間遠心分離し、７５μＬの上清を吸引し、６０μＬの１．２５％アンモニア水を加えてよく混合し、０．２２μＭのミクロポーラスメンブレンでろ過した後、２０μＬを取ってＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析を実施する。
２）ＥＰチューブを３７℃の水浴で５分間プレインキュベートし、
３）それそれ各化合物を加えて反応を開始させ、３７℃でインキュベートし続け、
４）サンプルチューブからそれぞれ０、２分、５分、１０分、３０分、６０分で５０μＬをストップチューブに取り、５０μＬの氷冷７％過塩素酸を加え、振とうし、反応を停止し、
５）１３０００ｒ／ｍｉｎで１０分間遠心分離し、７５μＬの上清を吸引し、６０μＬの１．２５％アンモニア水を加えてよく混合し、０．２２μＭのミクロポーラスメンブレンでろ過した後、２０μＬを取ってＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析を実施する。
【0222】
各サンプルは、二重配管を使用し、結果は、表２に示されたとおりである。
【0223】
【表3】
【0224】
表２からわかるように、全血におけるＳＩＰＩ－Ｄ００ポリペプチドの安定性は、ＳＰペプチドの安定性よりも有意に高く、６０分間全血インキュベートした後、回収率は、依然として１００％に達し、これは、ＳＩＰＩ－Ｄ００は、全血において優れた安定性を有し、それにより、ＳＩＰＩ－Ｄ００は、創薬可能性の薬物動態要件を満たすようにすることが分かる（半減期＞３０分）
実施例２．ＳＤラットにおけるＳＰペプチドまたはＳＩＰＩ－Ｄ００ペプチドの単回皮下注射後の様々な時点での血漿薬物濃度
１．材料
ＳＰペプチド（アミノ酸酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）
ＳＩＰＩ－Ｄ００ポリペプチド（アミノ酸酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）
２．実験動物
体重約２００ｇの雄性ＳＤラット、飼育条件：一定温度のエアコン付きの部屋で飼育し、室温２０～２４℃、湿度４０～７０％、照明１２時間、飲食を制限しない。
実施例２．ＳＤラットにおけるＳＰペプチドまたはＳＩＰＩ－Ｄ００ペプチドの単回皮下注射後の様々な時点での血漿薬物濃度
１．材料
ＳＰペプチド（アミノ酸酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）
ＳＩＰＩ－Ｄ００ポリペプチド（アミノ酸酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）
２．実験動物
体重約２００ｇの雄性ＳＤラット、飼育条件：一定温度のエアコン付きの部屋で飼育し、室温２０～２４℃、湿度４０～７０％、照明１２時間、飲食を制限しない。
【0225】
３．実験方法
３．１．投与方法
経路：背中への単回皮下注射、
薬物の投与量：生理食塩水を使用して、それぞれＳＰペプチドおよびＳＩＰＩ－Ｄ００ポリペプチドを３．３３ｍｇ／ｍＬの溶液に調製し、背中に皮下注射されたＳＰペプチドの投与量は、１０ｍｇ／ｋｇ体重であり、背中に皮下注射されたＳＩＰＩ－Ｄ００ペプチドの投与量は、５ｍｇ／ｋｇ体重である。
３．１．投与方法
経路：背中への単回皮下注射、
薬物の投与量：生理食塩水を使用して、それぞれＳＰペプチドおよびＳＩＰＩ－Ｄ００ポリペプチドを３．３３ｍｇ／ｍＬの溶液に調製し、背中に皮下注射されたＳＰペプチドの投与量は、１０ｍｇ／ｋｇ体重であり、背中に皮下注射されたＳＩＰＩ－Ｄ００ペプチドの投与量は、５ｍｇ／ｋｇ体重である。
【0226】
３．２．投与および血液サンプルの採取
雄性ＳＤラットは、投与前に１２時間絶食させ、水を自由に摂取させる。被験物ＳＰペプチドまたはＳＩＰＩ－Ｇ９ポリペプチドを皮下注射により投与する。それぞれ投与前および投与後の時点で眼窩血液を採取する。採取された全血を１％ヘパリンで抗凝固処理し、８０００ｒｐｍで４分間遠心分離した後に５０μＬの血漿を１．５ｍＬのポリプロピレンチューブに取り、－７０℃の冷蔵庫に入れ、試験する。高濃度サンプルは、空白血漿で希釈する。
雄性ＳＤラットは、投与前に１２時間絶食させ、水を自由に摂取させる。被験物ＳＰペプチドまたはＳＩＰＩ－Ｇ９ポリペプチドを皮下注射により投与する。それぞれ投与前および投与後の時点で眼窩血液を採取する。採取された全血を１％ヘパリンで抗凝固処理し、８０００ｒｐｍで４分間遠心分離した後に５０μＬの血漿を１．５ｍＬのポリプロピレンチューブに取り、－７０℃の冷蔵庫に入れ、試験する。高濃度サンプルは、空白血漿で希釈する。
【0227】
３．３．測定方法
高速液体クロマトグラフィー－質量分析（ＨＰＬＣ－ＭＳ）を併用してＳＩＰＩ－Ｇ９ポリペプチドの血中濃度を測定する。
高速液体クロマトグラフィー－質量分析（ＨＰＬＣ－ＭＳ）を併用してＳＩＰＩ－Ｇ９ポリペプチドの血中濃度を測定する。
【0228】
３．３．１．ＨＰＬＣ－ＭＳ条件
ＨＰＬＣシステム：ＥｘｉｏｎＬＣ ＡＣシステム、ＡＢ会社。
ＭＳシステム：Ｔｒｉｐｌｅ Ｑｕａｄ ５５００型タンデム四重極質量分析計、ＡＢ会社。
ＨＰＬＣシステム：ＥｘｉｏｎＬＣ ＡＣシステム、ＡＢ会社。
ＭＳシステム：Ｔｒｉｐｌｅ Ｑｕａｄ ５５００型タンデム四重極質量分析計、ＡＢ会社。
【0229】
データの収集：Ａｎａｌｙｓｔ（１．７）、ＡＢ会社。
ＨＰＬＣクロマトグラフィー条件：
クロマトグラフィーカラム：ＳＨＩＭ－ＰＡＣＫ ＧＩＳＳ Ｃ１８（２．１×１００ｍｍ、１．９μｍ）、注入体積：２０μＬ、移動相：Ａ相：０．２％酢酸水溶液、Ｂ相：メタノール、グラジエント溶出（詳細は、表３を参照する）。
ＨＰＬＣクロマトグラフィー条件：
クロマトグラフィーカラム：ＳＨＩＭ－ＰＡＣＫ ＧＩＳＳ Ｃ１８（２．１×１００ｍｍ、１．９μｍ）、注入体積：２０μＬ、移動相：Ａ相：０．２％酢酸水溶液、Ｂ相：メタノール、グラジエント溶出（詳細は、表３を参照する）。
【0230】
【表4】
【0231】
３．３．２．質量分析条件
イオン源は、エレクトロスプレーイオン化源（ＥＳＩ）であり、乾燥ガス（Ｎ２）温度は、５５０℃であり、エレクトロスプレー電圧は、５５００Ｖであり、検出方式は、陽イオン検出であり、スキャン方式は、選択的反応モニターリング（ＭＲＭ）方式であり、スキャン時間は、０．１５秒である。質量分析検出パラメーターは、表４に示されたとおりである。
イオン源は、エレクトロスプレーイオン化源（ＥＳＩ）であり、乾燥ガス（Ｎ２）温度は、５５０℃であり、エレクトロスプレー電圧は、５５００Ｖであり、検出方式は、陽イオン検出であり、スキャン方式は、選択的反応モニターリング（ＭＲＭ）方式であり、スキャン時間は、０．１５秒である。質量分析検出パラメーターは、表４に示されたとおりである。
【0232】
【表5】
【0233】
３．４．サンプル処理
５０μＬの血漿を取り、５μＬの内部標準溶液（ＤＸ０７（Ｈｉｓ－Ｌｅｕ－Ｇｌｕ－Ｔｈｒ－Ｇｌｕ－Ｌｅｕ－Ｈｉｓ）１００ｎｇ／ｍＬ）を加えた後、１５０μＬのメタノールを加えてタンパク質を沈殿させ、１３０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、１６０μＬの上清を取り、４０℃のＮ２で乾燥させた後、７５μＬの０．１％ギ酸水溶液で再構成し、２０μＬをＨＰＬＣ－ＭＳに注入し、ＳＩＰＩ－Ｇ９の血中濃度を測定する。
５０μＬの血漿を取り、５μＬの内部標準溶液（ＤＸ０７（Ｈｉｓ－Ｌｅｕ－Ｇｌｕ－Ｔｈｒ－Ｇｌｕ－Ｌｅｕ－Ｈｉｓ）１００ｎｇ／ｍＬ）を加えた後、１５０μＬのメタノールを加えてタンパク質を沈殿させ、１３０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、１６０μＬの上清を取り、４０℃のＮ２で乾燥させた後、７５μＬの０．１％ギ酸水溶液で再構成し、２０μＬをＨＰＬＣ－ＭＳに注入し、ＳＩＰＩ－Ｇ９の血中濃度を測定する。
【0234】
３．５．データ処理
ＤＡＳ２．０ソフトウェアの非コンパートメントモデルを使用して、薬物動態パラメーターを計算する。ＣｍａｘおよびＴｍａｘは、すべて測定値であり、ＡＵＣ、Ｔ１／２、ＣＬおよびＶｚは、ＤＡＳ２．０によって計算される。
ＤＡＳ２．０ソフトウェアの非コンパートメントモデルを使用して、薬物動態パラメーターを計算する。ＣｍａｘおよびＴｍａｘは、すべて測定値であり、ＡＵＣ、Ｔ１／２、ＣＬおよびＶｚは、ＤＡＳ２．０によって計算される。
【0235】
４．実験結果
ＳＤラットにＳＰペプチド（１０ｍｇ／ｋｇ）を単回皮下注射した後の様々な時点での血漿薬物濃度は、図２に示されたとおりであり、その薬物動態パラメーターは、表５に示されたとおりであり、様々な時点での血中濃度は、表６に示されたとおりである。
ＳＤラットにＳＰペプチド（１０ｍｇ／ｋｇ）を単回皮下注射した後の様々な時点での血漿薬物濃度は、図２に示されたとおりであり、その薬物動態パラメーターは、表５に示されたとおりであり、様々な時点での血中濃度は、表６に示されたとおりである。
【0236】
【表6】
【0237】
【表7】
【0238】
ＳＤラットにＳＩＰＩ－Ｄ００ペプチド（５ｍｇ／ｋｇ）を単回皮下注射した後の様々な時点での血漿薬物濃度は、図３に示されたとおりであり、その薬物動態パラメーターは、表７に示されたとおりであり、様々な時点での血中濃度は、表８に示されたとおりである。
【0239】
【表8】
【0240】
【表9】
【0241】
表５～８および図２～３からわかるように、ＳＰと比較して、ＳＩＰＩ－Ｄ００ペプチドのＡＵＣは、有意に向上され、ＳＩＰＩ－Ｄ００は、皮下注射により優れた血液に吸収される特性を示し、バイオアベイラビリティが有意に増加され、インビボでの半減期は、１．５時間に達することにより、長時間有効に薬物効果を有効に発揮することができ、従って、ＳＩＰＩ－Ｄ００ペプチドは、優れた薬物動態特性を有することが分かる。
【0242】
実施例３．ＣｏｎＡ（コンカナバリンＡ）によって刺激されたマウス脾細胞からのＩＬ－４の分泌に対するＳＰペプチドおよびＳＩＰＩ－Ｄ００ペプチドの影響
喘息疾患は、主にＴｈ２細胞によって媒介される炎症性疾患である。疾患の発展過程において、Ｔｈ２細胞は、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－１３を分泌し、これらのサイトカインは、好酸球、肥満細胞、気道構造細胞等に作用し、気管支粘膜上皮における炎症性細胞の蓄積およびリモデリングを促進する。従って、ＩＬ－４の分泌に対するＳＰペプチドおよびＳＩＰＩ－Ｄ００ペプチドの効果を調べることによって、喘息に対するその治療効果を評価する。
喘息疾患は、主にＴｈ２細胞によって媒介される炎症性疾患である。疾患の発展過程において、Ｔｈ２細胞は、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－１３を分泌し、これらのサイトカインは、好酸球、肥満細胞、気道構造細胞等に作用し、気管支粘膜上皮における炎症性細胞の蓄積およびリモデリングを促進する。従って、ＩＬ－４の分泌に対するＳＰペプチドおよびＳＩＰＩ－Ｄ００ペプチドの効果を調べることによって、喘息に対するその治療効果を評価する。
【0243】
１．実験方法
３匹のＢＡＬＢ／Ｃマウスを、麻酔後の頸椎脱臼によって犠牲にする。７５％エタノールに５分間浸漬する。解剖し、脾臓を取り、脾臓リンパ球を調製し、カウントした後、９６ウェルプレートに２×１０５個／ウェルを加え、ＳＰペプチドおよびＳＩＰＩ－Ｄ００ペプチドは、それぞれ異なる濃度群に設定され、異なる濃度のＣｓＡ（シクロスポリンＡ）を陽性対照群として使用する。各ウェルに異なる濃度の被験物を加え、各濃度をダブルデュープリケートウェルとして設定し、ＣｏｎＡ最終濃度は、５μｇ／ｍＬである。３７℃の５％ＣＯ２インキュベーターで２４時間インキュベートし、各ウェルの薬物含有細胞懸濁液を吸引し、４℃下で、２００ｇで１５分間遠心分離し、上清を取り、マウスＩＬ－４Ｅｌｉｓａキット（ｍｏｕｓｅ ＩＬ－４ Ｅｌｉｓａ ｋｉｔ）を使用して、ＩＬ－４の含有量を検出する。
３匹のＢＡＬＢ／Ｃマウスを、麻酔後の頸椎脱臼によって犠牲にする。７５％エタノールに５分間浸漬する。解剖し、脾臓を取り、脾臓リンパ球を調製し、カウントした後、９６ウェルプレートに２×１０５個／ウェルを加え、ＳＰペプチドおよびＳＩＰＩ－Ｄ００ペプチドは、それぞれ異なる濃度群に設定され、異なる濃度のＣｓＡ（シクロスポリンＡ）を陽性対照群として使用する。各ウェルに異なる濃度の被験物を加え、各濃度をダブルデュープリケートウェルとして設定し、ＣｏｎＡ最終濃度は、５μｇ／ｍＬである。３７℃の５％ＣＯ２インキュベーターで２４時間インキュベートし、各ウェルの薬物含有細胞懸濁液を吸引し、４℃下で、２００ｇで１５分間遠心分離し、上清を取り、マウスＩＬ－４Ｅｌｉｓａキット（ｍｏｕｓｅ ＩＬ－４ Ｅｌｉｓａ ｋｉｔ）を使用して、ＩＬ－４の含有量を検出する。
【0244】
２．実験結果
ＣｏｎＡによって刺激されたマウス脾細胞によるＩＬ－４の分泌に対する異なる濃度のＳＰペプチドおよびＳＩＰＩ－Ｄ００ペプチドの影響は、表９に示されたとおりであり、ＩＬ－４の分泌の阻害率は、表１０に示されたとおりである。
ＣｏｎＡによって刺激されたマウス脾細胞によるＩＬ－４の分泌に対する異なる濃度のＳＰペプチドおよびＳＩＰＩ－Ｄ００ペプチドの影響は、表９に示されたとおりであり、ＩＬ－４の分泌の阻害率は、表１０に示されたとおりである。
【0245】
【表10】
【0246】
【表11】
【0247】
表９および表１０からわかるように、ＳＰペプチドと比較して、ＳＩＰＩ－Ｄ００ペプチドは、ＣｏｎＡによって刺激されたマウス脾臓リンパ球によるＩＬ－４の分泌を有意に阻害することにより、ＩＩ型サイトカイン優勢喘息に対して優れた治療効果を有する。
【0248】
実施例４．薬力学的検出
１．材料および機器
ＳＩＰＩ－Ｄ００ペプチド：凍結乾燥粉末、後で使用するために－２０℃で保存する。
１．材料および機器
ＳＩＰＩ－Ｄ００ペプチド：凍結乾燥粉末、後で使用するために－２０℃で保存する。
【0249】
陽性対照薬：デキサメタゾンリン酸ナトリウム注射液、仕様：５ｍｇ／ｍｌ、１ｍｌ／個、外観および物理的と化学的性質：無色液体、保存条件：遮光、密封、涼しい場所で保管し、メーカー：国薬グループ栄生製薬株式会社。
【0250】
ニワトリタンパク質アルブミン（ニワトリ卵白からのアルブミン（Ａｌｂｕｍｉｎ ｆｒｏｍ ｃｈｉｃｋｅｎ ｅｇｇ ｗｈｉｔｅ））（ＯＶＡ）：バッチ番号：ＳＬＢＫ６４４５Ｖ、メーカー：ＳＩＧＭＡ－ＡＬＤＲＩＣＨ。
【0251】
水酸化アルミニウムアジュバント：名称：Ｉｍｊｅｃｔ Ａｌｕｍ、バッチ番号：ＴＪ２７１９０７Ａ、仕様：５０ｍＬ／ボトル、メーカー：Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ。
【0252】
ＥＬＩＳＡキット：Ｍｏｕｓｅ ＩｇＥ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ、バッチ番号：ＧＲ３２４６６９１－４、メーカー：ａｂｃａｍ。
ネブライザー：モデル：４０３Ｃ型家庭用空気圧縮式ネブライザー、メーカー：魚躍医療。
ネブライザー：モデル：４０３Ｃ型家庭用空気圧縮式ネブライザー、メーカー：魚躍医療。
【0253】
動物の肺機能分析システム：モデル：ＡｎｉＲｅｓ２００５。メーカー：北京貝蘭博科学技術株式会社。
２．実験動物
ＳＰＦ雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスに標準的な滅菌マウス飼料を使用し、動物の飲料水は、飲料水ボトルから供給され、動物は、水を自由に飲むことができ、飼育温度は、２０℃～２２℃であり、湿度は、４０％～７０％であり、照明は、明暗を１２時間相互に行う。
２．実験動物
ＳＰＦ雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスに標準的な滅菌マウス飼料を使用し、動物の飲料水は、飲料水ボトルから供給され、動物は、水を自由に飲むことができ、飼育温度は、２０℃～２２℃であり、湿度は、４０％～７０％であり、照明は、明暗を１２時間相互に行う。
【0254】
３．実験方法
３．１．動物のグループ化
ＳＰＦ雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスは、二つのバッチに分けて実験され、一つは、血清ＩｇＥおよび肺の病理の検出に使用され、もう一つは、肺機能の検出に使用される。
３．１．動物のグループ化
ＳＰＦ雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスは、二つのバッチに分けて実験され、一つは、血清ＩｇＥおよび肺の病理の検出に使用され、もう一つは、肺機能の検出に使用される。
【0255】
最初のバッチ：マウスをグループに分け、各グループに１０匹のマウス、即ち、空白対照群（生理食塩水）、モデル群（ＯＶＡ、２０ｕｇ／匹）、ＳＰペプチド群（投与量は、それぞれ１７５μｇ／ｋｇ体重／日、３５０μｇ／ｋｇ体重／日である）、ＳＩＰＩ－Ｄ００ペプチド群（投与量は、１７５μｇ／ｋｇ体重／日、３５０μｇ／ｋｇ体重／日である）、デキサメタゾン群（投与量は、２ｍｇ／ｋｇ体重／日である）。
【0256】
２番目のバッチ：マウスをグループに分け、各グループに１０匹のマウス、即ち、空白対照群（生理食塩水）、モデル群（ＯＶＡ、用量は、２０ｕｇ／匹である）、ＳＰペプチド群（投与量は、それぞれ８７．５μｇ／ｋｇ体重／日、１７５μｇ／ｋｇ体重／日、３５０μｇ／ｋｇ体重／日である）、ＳＩＰＩ－Ｄ００ペプチド群（投与量は、８７．５μｇ／ｋｇ体重／日、１７５μｇ／ｋｇ体重／日、３５０μｇ／ｋｇ体重／日である）、デキサメタゾン群（投与量は、２ｍｇ／ｋｇ体重／日である）。
【0257】
３．２．アレルギー性喘息型モデル動物の構築および投与
３．２．１．薬物の調製および投与経路
３．２．１．１．ＯＶＡの調製および投与方法
３．２．１．１．１．感作（Ｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎ）用ＯＶＡ：
感作用ＯＶＡを滅菌ＰＢＳ溶液に溶解し、最終濃度は、０．２ｍｇ／ｍｌであり、等量の水酸化アルミニウムアジュバントを加え、３０分間振とうした後、マウスにマウスあたり０．２ｍｌ（２０μｇのＯＶＡ／匹）を腹腔内注射する。
３．２．１．薬物の調製および投与経路
３．２．１．１．ＯＶＡの調製および投与方法
３．２．１．１．１．感作（Ｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎ）用ＯＶＡ：
感作用ＯＶＡを滅菌ＰＢＳ溶液に溶解し、最終濃度は、０．２ｍｇ／ｍｌであり、等量の水酸化アルミニウムアジュバントを加え、３０分間振とうした後、マウスにマウスあたり０．２ｍｌ（２０μｇのＯＶＡ／匹）を腹腔内注射する。
【0258】
３．２．１．１．２．チャレンジ（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）用ＯＶＡ：
滅菌ＰＢＳで２％ＯＶＡ溶液を調製する。２％ＯＶＡをネブライザーで噴霧し、マウスをネブライザー吸入ボックスに１日３０分間入れる。
滅菌ＰＢＳで２％ＯＶＡ溶液を調製する。２％ＯＶＡをネブライザーで噴霧し、マウスをネブライザー吸入ボックスに１日３０分間入れる。
【0259】
３．２．１．１．３．デキサメタゾン：
デキサメタゾンリン酸ナトリウム注射液を生理食塩水で希釈した後に腹腔内注射により投与し、投与量は、２ｍｇ／ｋｇである。
デキサメタゾンリン酸ナトリウム注射液を生理食塩水で希釈した後に腹腔内注射により投与し、投与量は、２ｍｇ／ｋｇである。
【0260】
３．２．１．１．４．免疫７ペプチドおよびその誘導体：
投与量に応じて、それぞれＳＰペプチドおよびＳＩＰＩ－Ｄ００を生理食塩水に溶解し、動物の体重に応じて背中に皮下投与する。
投与量に応じて、それぞれＳＰペプチドおよびＳＩＰＩ－Ｄ００を生理食塩水に溶解し、動物の体重に応じて背中に皮下投与する。
【0261】
３．２．２．アレルギー性喘息型モデル動物の構築および投与方法
モデル群、ＳＰペプチド群、ＳＩＰＩ－Ｄ００ペプチド群およびデキサメタゾン群のマウスは、０、７、１４日目にＯＶＡの腹腔内注射によって感作（２０μｇＯＶＡ／ｍｉｃｅ）された後、２１～２５日目に、エアロゾル投与によりＯＶＡ（５日間連続で１日１回）にチャレンジし、喘息型モデル動物を構築する。モデル群のマウスには、２１～２８日目に生理食塩水を投与し、異なる用量のＳＰペプチド群およびＳＩＰＩ－Ｄ００ペプチド群のマウスに、それぞれ１９～２８日目に異なる用量のＳＰおよびＳＩＰＩ－Ｄ００を皮下注射し、デキサメタゾン群のマウスに、２１～２８日目に２ｍｇ／ｋｇ／日のデキサメタゾンを腹腔内注射する。同時に、空白対照群の１０匹のマウスは、処置なしで０～２８日目まで通常とおりに飲食が投与され、空白対照として生理食塩水が投与される。
モデル群、ＳＰペプチド群、ＳＩＰＩ－Ｄ００ペプチド群およびデキサメタゾン群のマウスは、０、７、１４日目にＯＶＡの腹腔内注射によって感作（２０μｇＯＶＡ／ｍｉｃｅ）された後、２１～２５日目に、エアロゾル投与によりＯＶＡ（５日間連続で１日１回）にチャレンジし、喘息型モデル動物を構築する。モデル群のマウスには、２１～２８日目に生理食塩水を投与し、異なる用量のＳＰペプチド群およびＳＩＰＩ－Ｄ００ペプチド群のマウスに、それぞれ１９～２８日目に異なる用量のＳＰおよびＳＩＰＩ－Ｄ００を皮下注射し、デキサメタゾン群のマウスに、２１～２８日目に２ｍｇ／ｋｇ／日のデキサメタゾンを腹腔内注射する。同時に、空白対照群の１０匹のマウスは、処置なしで０～２８日目まで通常とおりに飲食が投与され、空白対照として生理食塩水が投与される。
【0262】
４．実験結果
４．１．血清中のＩｇＥレベルの測定
２８日目が終了後、マウスの眼内眦から採血し、血清を取り、ＥＬＩＳＡキットで血清中のＩｇＥレベルを測定し、結果は、表１１に示されたとおりである。
４．１．血清中のＩｇＥレベルの測定
２８日目が終了後、マウスの眼内眦から採血し、血清を取り、ＥＬＩＳＡキットで血清中のＩｇＥレベルを測定し、結果は、表１１に示されたとおりである。
【0263】
【表12】
【0264】
表１１からわかるように、アジュバント水酸化アルミニウム感作と併用したＯＶＡによって引き起こされるアレルギー性喘息マウスモデル群の血清中のＩｇＥレベルは、有意に増加し（ｐ＜０．０１）、モデル群およびＳＰペプチド群と比較して、ＳＩＰＩ－Ｄ００ペプチド治療投与の血清中のＩｇＥレベルは、有意に低下し、ＳＩＰＩ－Ｄ００ペプチドがアレルギー性喘息マウスモデル群の血清中のＩｇＥレベルを有意に低下させることができることを示す。
【0265】
４．２．肺機能の測定
２８日目に、マウスに麻酔した後に気管挿管および頸静脈挿管を行い、各動物群で吸気気道抵抗および肺コンプライアンスを測定する。各動物は、頸静脈を介して、０．０２５ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ等の倍数で増加したメタコリンが投与される。各用量を投与した後に肺コンプライアンス曲線を５分間継続して記録し、吸気気道抵抗および肺コンプライアンスを計算し、結果は、表１２および表１３に示されたとおりである。
２８日目に、マウスに麻酔した後に気管挿管および頸静脈挿管を行い、各動物群で吸気気道抵抗および肺コンプライアンスを測定する。各動物は、頸静脈を介して、０．０２５ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ等の倍数で増加したメタコリンが投与される。各用量を投与した後に肺コンプライアンス曲線を５分間継続して記録し、吸気気道抵抗および肺コンプライアンスを計算し、結果は、表１２および表１３に示されたとおりである。
【0266】
【表13】
【0267】
【表14】
【0268】
表１２および表１３からわかるように、モデル群のマウスの吸気相抵抗は、有意に増加し、肺コンプライアンスは、有意に低下する。モデル群と比較して、デキサメタゾン群のマウスの吸気相抵抗は、有意に低下し、肺コンプライアンスは、有意に増加し、モデル群と比較して、ＳＩＰＩ－Ｄ００の高、中、低用量群のマウスの吸気相抵抗は、有意に低下し、肺コンプライアンスは、有意に増加し、ＳＩＰＩ－Ｄ００ペプチドがマウスの吸気相抵抗を有意に低下し、肺コンプライアンスを有意に増加することができることを示す。
【0269】
４．３．肺の病理学的観察
２８日目が終了後、マウスの肺組織を取り出し、４％のホルムアルデヒドで固定し、パラフィンに包埋し、切片化し、Ｈ＆Ｅ染色後に病理学的観察を行い、結果は、図４および図５に示されたとおりである。
２８日目が終了後、マウスの肺組織を取り出し、４％のホルムアルデヒドで固定し、パラフィンに包埋し、切片化し、Ｈ＆Ｅ染色後に病理学的観察を行い、結果は、図４および図５に示されたとおりである。
【0270】
図４および５からわかるように、空白対照群のマウスの肺には、炎症性細胞の浸潤がなく、肺胞腔は透明である。モデル群のマウスの肺には、多数の炎症性細胞が浸潤し、炎症性細胞は、主に好酸球および単核細胞であり、肺胞腔は、ひどく損傷し、気道上皮は、損傷して脱落し、気道壁が肥厚であり、粘膜が浮腫であり、気道滲出物が増加し、粘液が貯留し、気道平滑筋が肥厚であることが分かる。陽性対照群のマウスの肺には、少量の炎症性細胞が浸潤しているが、肺胞腔は、ひどく損傷された。
【0271】
ＳＰ低用量群および高用量群のマウス気道粘膜に一部の炎症性細胞浸潤が観察され、気道壁が肥厚であり、粘膜が浮腫であり、気道滲出物が増加し、粘液が貯留し、気道平滑筋が肥厚である。ＳＩＰＩ－Ｄ００低用量群のマウスの肺には、多くの炎症性細胞が浸潤し、炎症性細胞は、主に好酸球および単核細胞であり、肺胞腔は、透明である。ＳＩＰＩ－Ｄ００高用量群のマウスの肺には、少量の炎症性細胞が浸潤し、肺胞腔は、透明であり、気道上皮は、比較的無傷であり、気道壁の厚さは正常で、粘膜の浮腫および滲出はなく、気道平滑筋は、正常である。
【0272】
図４および図５からわかるように、ＳＩＰＩ－Ｄ００ペプチドがマウスの肺の炎症性細胞の浸潤を有意に低下させることができる。
要約すると、ＳＩＰＩ－Ｄ００ペプチドは、炎症性因子を効果的に阻害し、ＩｇＥレベルを低下させ、吸気気道抵抗を低下させ、肺コンプライアンスを向上させ、肺の炎症性細胞の浸潤を阻害することにより、アレルギー性喘息に対して効果的な治療効果を有することが分かる。
要約すると、ＳＩＰＩ－Ｄ００ペプチドは、炎症性因子を効果的に阻害し、ＩｇＥレベルを低下させ、吸気気道抵抗を低下させ、肺コンプライアンスを向上させ、肺の炎症性細胞の浸潤を阻害することにより、アレルギー性喘息に対して効果的な治療効果を有することが分かる。
【0273】
実施例５．ラット全血中の各７ペプチド化合物の安定性
１．１．実験手順およびインキュベーション条件
被験品の調製：ＳＰ、ＳＩＰＩ－Ｇ４、ＳＩＰＩ－Ｇ５、ＳＩＰＩ－Ｇ６、ＳＩＰＩ－Ｇ７、ＳＩＰＩ－Ｇ８、ＳＩＰＩ－Ｇ９およびＳＩＰＩ－Ｇ１０を０．１％ギ酸を含む適切な量の５０％アセトニトリル水で溶解および希釈し、濃度が２００μｇ／ｍＬである作業溶液を得る。安定性研究試薬の使用状況は、表１４のとおりである。
１．１．実験手順およびインキュベーション条件
被験品の調製：ＳＰ、ＳＩＰＩ－Ｇ４、ＳＩＰＩ－Ｇ５、ＳＩＰＩ－Ｇ６、ＳＩＰＩ－Ｇ７、ＳＩＰＩ－Ｇ８、ＳＩＰＩ－Ｇ９およびＳＩＰＩ－Ｇ１０を０．１％ギ酸を含む適切な量の５０％アセトニトリル水で溶解および希釈し、濃度が２００μｇ／ｍＬである作業溶液を得る。安定性研究試薬の使用状況は、表１４のとおりである。
【0274】
【表15】
【0275】
１）新鮮なラット全血をＥＰチューブに加えて、穏やかに浸透して混合し、
２）ＥＰチューブを３７℃の水浴で５分間プレインキュベートし、
３）それそれ各化合物を加えて反応を開始させ、３７℃でインキュベートし続け、
４）サンプルチューブからそれぞれ０、２分、５分、１０分、３０分、６０分で５０μＬをストップチューブに取り、５０μＬの氷冷７％過塩素酸を加え、振とうし、反応を停止し、
５）１３０００ｒ／ｍｉｎで１０分間遠心分離し、７５μＬの上清を吸引し、６０μＬの１．２５％アンモニア水を加えてよく混合し、０．２２μＭのミクロポーラスメンブレンでろ過した後、２０μＬを取ってＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析を実施する。
２）ＥＰチューブを３７℃の水浴で５分間プレインキュベートし、
３）それそれ各化合物を加えて反応を開始させ、３７℃でインキュベートし続け、
４）サンプルチューブからそれぞれ０、２分、５分、１０分、３０分、６０分で５０μＬをストップチューブに取り、５０μＬの氷冷７％過塩素酸を加え、振とうし、反応を停止し、
５）１３０００ｒ／ｍｉｎで１０分間遠心分離し、７５μＬの上清を吸引し、６０μＬの１．２５％アンモニア水を加えてよく混合し、０．２２μＭのミクロポーラスメンブレンでろ過した後、２０μＬを取ってＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析を実施する。
【0276】
各サンプルは、二重配管を使用し、結果は、表１５に示されたとおりである。
【0277】
【表16】
【0278】
表１５からわかるように、全血におけるＳＩＰＩ－Ｇ４、ＳＩＰＩ－Ｇ５、ＳＩＰＩ－Ｇ６、ＳＩＰＩ－Ｇ７、ＳＩＰＩ－Ｇ８、ＳＩＰＩ－Ｇ９およびＳＩＰＩ－Ｇ１０ポリペプチドの安定性は、ＳＰポリペプチドの安定性、特にＳＩＰＩ－Ｇ９ポリペプチドの安定性よりも有意に高く、６０分間全血インキュベートした後、回収率は、依然として９０％以上に達し、これは、ＳＩＰＩ－Ｇ９は、全血において優れた安定性を有し、それにより、創薬可能性の薬物動態要件を満たすようにすることが分かる。
【0279】
実施例６．ＳＤラットにおけるＳＩＰＩ－Ｇ９の単回皮下注射後の様々な時点での血漿薬物濃度
１．材料
ＳＩＰＩ－Ｇ９ポリペプチド。
１．材料
ＳＩＰＩ－Ｇ９ポリペプチド。
【0280】
２．実験動物
体重約２００ｇの雄性ＳＤラット、飼育条件：一定温度のエアコン付きの部屋で飼育し、室温２０～２４℃、湿度４０～７０％、照明１２時間、飲食を制限しない。
体重約２００ｇの雄性ＳＤラット、飼育条件：一定温度のエアコン付きの部屋で飼育し、室温２０～２４℃、湿度４０～７０％、照明１２時間、飲食を制限しない。
【0281】
３．実験方法
３．１．投与方法
経路：背中への単回皮下注射およびテールへの単回静脈内注射、
薬物の投与量：生理食塩水を使用して、ＳＩＰＩ－Ｇ９を溶液に調製し、背中に皮下注射されたＳＩＰＩ－Ｇ９の投与量は、５ｍｇ／ｋｇ体重であり、静脈内注射されたＳＩＰＩ－Ｇ９の投与量は、１ｍｇ／ｋｇ体重である。
３．１．投与方法
経路：背中への単回皮下注射およびテールへの単回静脈内注射、
薬物の投与量：生理食塩水を使用して、ＳＩＰＩ－Ｇ９を溶液に調製し、背中に皮下注射されたＳＩＰＩ－Ｇ９の投与量は、５ｍｇ／ｋｇ体重であり、静脈内注射されたＳＩＰＩ－Ｇ９の投与量は、１ｍｇ／ｋｇ体重である。
【0282】
３．２．投与および血液サンプルの採取
雄性ＳＤラットは、投与前に１２時間絶食させ、水を自由に摂取させる。被験物ＳＩＰＩ－Ｇ９ポリペプチドを皮下注射により投与する。それぞれ投与前および投与後の様々な時点で眼窩血液を採取する。採取された全血を１％ヘパリンで抗凝固処理し、８０００ｒｐｍで４分間遠心分離した後に５０μＬの血漿を１．５ｍＬのポリプロピレンチューブに取り、－７０℃の冷蔵庫に入れ、試験する。高濃度サンプルは、空白血漿で希釈する。
雄性ＳＤラットは、投与前に１２時間絶食させ、水を自由に摂取させる。被験物ＳＩＰＩ－Ｇ９ポリペプチドを皮下注射により投与する。それぞれ投与前および投与後の様々な時点で眼窩血液を採取する。採取された全血を１％ヘパリンで抗凝固処理し、８０００ｒｐｍで４分間遠心分離した後に５０μＬの血漿を１．５ｍＬのポリプロピレンチューブに取り、－７０℃の冷蔵庫に入れ、試験する。高濃度サンプルは、空白血漿で希釈する。
【0283】
３．３．測定方法
高速液体クロマトグラフィー－質量分析（ＨＰＬＣ－ＭＳ）を併用してＳＩＰＩ－Ｇ９ポリペプチドの血中濃度を測定する。
高速液体クロマトグラフィー－質量分析（ＨＰＬＣ－ＭＳ）を併用してＳＩＰＩ－Ｇ９ポリペプチドの血中濃度を測定する。
【0284】
３．３．１．ＨＰＬＣ－ＭＳ条件
ＨＰＬＣシステム：ＥｘｉｏｎＬＣ ＡＣシステム、ＡＢ会社。
ＭＳシステム：Ｔｒｉｐｌｅ Ｑｕａｄ ５５００型タンデム四重極質量分析計、ＡＢ会社。
ＨＰＬＣシステム：ＥｘｉｏｎＬＣ ＡＣシステム、ＡＢ会社。
ＭＳシステム：Ｔｒｉｐｌｅ Ｑｕａｄ ５５００型タンデム四重極質量分析計、ＡＢ会社。
【0285】
データの収集：Ａｎａｌｙｓｔ（１．７）、ＡＢ会社。
ＨＰＬＣクロマトグラフィー条件：
クロマトグラフィーカラム：ＳＨＩＭ－ＰＡＣＫ ＧＩＳＳ Ｃ１８（２．１×１００ｍｍ、１．９μｍ）、注入体積：２０μＬ、移動相：Ａ相：０．２％酢酸水溶液、Ｂ相：メタノール、グラジエント溶出（詳細は、表１６を参照する）。
ＨＰＬＣクロマトグラフィー条件：
クロマトグラフィーカラム：ＳＨＩＭ－ＰＡＣＫ ＧＩＳＳ Ｃ１８（２．１×１００ｍｍ、１．９μｍ）、注入体積：２０μＬ、移動相：Ａ相：０．２％酢酸水溶液、Ｂ相：メタノール、グラジエント溶出（詳細は、表１６を参照する）。
【0286】
【表17】
【0287】
３．３．２．ＭＳ条件
イオン源は、エレクトロスプレーイオン化源（ＥＳＩ）であり、乾燥ガス（Ｎ２）温度は、５５０℃であり、エレクトロスプレー電圧は、５５００Ｖであり、検出方式は、陽イオン検出であり、スキャン方式は、選択的反応モニターリング（ＭＲＭ）方式であり、スキャン時間は、０．１５秒であり、質量分析検出パラメーターは、表１７に示されたとおりである。
イオン源は、エレクトロスプレーイオン化源（ＥＳＩ）であり、乾燥ガス（Ｎ２）温度は、５５０℃であり、エレクトロスプレー電圧は、５５００Ｖであり、検出方式は、陽イオン検出であり、スキャン方式は、選択的反応モニターリング（ＭＲＭ）方式であり、スキャン時間は、０．１５秒であり、質量分析検出パラメーターは、表１７に示されたとおりである。
【0288】
【表18】
【0289】
３．４．サンプル処理
５０μＬの血漿を取り、５μＬの内部標準溶液（ＤＸ０７（Ｈｉｓ－Ｌｅｕ－Ｇｌｕ－Ｔｈｒ－Ｇｌｕ－Ｌｅｕ－Ｈｉｓ）１００ｎｇ／ｍＬ）を加えた後、１５０μＬのメタノールを加えてタンパク質を沈殿させ、１３０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、１６０μＬの上清を取り、４０℃のＮ２で乾燥させた後、７５μＬの０．１％ギ酸水溶液で再構成し、２０μＬをＨＰＬＣ－ＭＳに注入し、ＳＩＰＩ－Ｇ９の血中濃度を測定する。
５０μＬの血漿を取り、５μＬの内部標準溶液（ＤＸ０７（Ｈｉｓ－Ｌｅｕ－Ｇｌｕ－Ｔｈｒ－Ｇｌｕ－Ｌｅｕ－Ｈｉｓ）１００ｎｇ／ｍＬ）を加えた後、１５０μＬのメタノールを加えてタンパク質を沈殿させ、１３０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、１６０μＬの上清を取り、４０℃のＮ２で乾燥させた後、７５μＬの０．１％ギ酸水溶液で再構成し、２０μＬをＨＰＬＣ－ＭＳに注入し、ＳＩＰＩ－Ｇ９の血中濃度を測定する。
【0290】
３．５．データ処理
ＤＡＳ２．０ソフトウェアの非コンパートメントモデルを使用して、薬物動態パラメーターを計算する。ＣｍａｘおよびＴｍａｘは、すべて測定値であり、ＡＵＣ、Ｔ１／２、ＣＬおよびＶｚは、ＤＡＳ２．０によって計算される。
ＤＡＳ２．０ソフトウェアの非コンパートメントモデルを使用して、薬物動態パラメーターを計算する。ＣｍａｘおよびＴｍａｘは、すべて測定値であり、ＡＵＣ、Ｔ１／２、ＣＬおよびＶｚは、ＤＡＳ２．０によって計算される。
【0291】
絶対バイオアベイラビリティは、式Ｆａ＝（ＡＵＣ０－ｔ）Ｔ／（ＡＵＣ０－ｔ）Ｒ ×ＤＲ／ＤＴ×１００％に従って計算され、ここで、（ＡＵＣ０－ｔ）Ｔは、背中にＳＩＰＩ－Ｇ９を皮下注射してから０－ｔ時間内の薬物－時間曲線下の面積であり、ＤＴは、背中にＳＩＰＩ－Ｇ９を皮下注射した投与量（５ｍｇ／ｋｇ体重）であり、（ＡＵＣ０－ｔ）Ｒは、ＳＩＰＩ－Ｇ９を静脈内注射した０－ｔ時間内の薬物－時間曲線下の面積であり、ＤＲは、ＳＩＰＩ－Ｇ９を静脈内注射した投与量（１ｍｇ／ｋｇ体重）である。
【0292】
４．実験結果
ＳＤラットにＳＩＰＩ－Ｇ９（１ｍｇ／ｋｇ）を単回静脈内注射した後の様々な時点での血漿薬物濃度は、表１８および図７に示されたとおりであり、その薬物動態パラメーターは、表１９に示されたとおりである。
ＳＤラットにＳＩＰＩ－Ｇ９（１ｍｇ／ｋｇ）を単回静脈内注射した後の様々な時点での血漿薬物濃度は、表１８および図７に示されたとおりであり、その薬物動態パラメーターは、表１９に示されたとおりである。
【0293】
【表19】
【0294】
【表20】
【0295】
ＳＤラットにＳＩＰＩ－Ｇ９（５ｍｇ／ｋｇ）を単回皮下注射した後の様々な時点での血漿薬物濃度は、表２０および図８に示されたとおりであり、その薬物動態パラメーターは、表２１に示されたとおりである。
【0296】
【表21】
【0297】
【表22】
【0298】
表１８～２１および図７～８からわかるように、ＳＩＰＩ－Ｇ９ポリペプチドは、皮下注射でも静脈内注射でも、特に皮下注射で優れた薬物動態を有し、インビボでの半減期は、２７．１分に達し、これは、長期間有効に発揮できることを示し、同時に、静脈内注射と比較して、皮下注射の絶対バイオアベイラビリティは、８６．２％と高く、これは、ＳＩＰＩ－Ｇ９が皮下注射によってほとんどまたは実質的にすべてを静脈血に入れることができることを示し、ＳＩＰＩ－Ｇ９の皮下注射は、血液への優れた吸収特性を有し、ＳＩＰＩ－Ｇ９の皮下注射による吸收は、実質的に静脈内注射と同様であり、従って、ＳＩＰＩ－Ｇ９の皮下注射は、静脈内投与を置き換えることができ、同様の効果を有し、静脈内注射による投与に比較して、皮下注射は、簡単で、便宜で、コストが低く、安全性が高く、患者のコンプライアンスが強い等の利点を有する。
【0299】
実施例７．ＣｏｎＡ（コンカナバリンＡ）によって刺激されたマウス脾細胞からのＩＬ－４の分泌に対するＳＩＰＩ－Ｇ９の影響
慢性閉塞性肺疾患は、主にＴｈ２細胞によって媒介される炎症性疾患である。疾患の発展過程において、Ｔｈ２細胞は、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－１３を分泌し、これらのサイトカインは、好酸球、肥満細胞、気道構造細胞等に作用し、気管支粘膜上皮における炎症性細胞の蓄積およびリモデリングを促進する。従って、ＩＬ－４の分泌に対するＳＰ、ＳＩＰＩ－Ｇ５、ＳＩＰＩ－Ｇ９の影響を調べることによって、慢性閉塞性肺疾患に対するその治療効果を評価する。
慢性閉塞性肺疾患は、主にＴｈ２細胞によって媒介される炎症性疾患である。疾患の発展過程において、Ｔｈ２細胞は、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－１３を分泌し、これらのサイトカインは、好酸球、肥満細胞、気道構造細胞等に作用し、気管支粘膜上皮における炎症性細胞の蓄積およびリモデリングを促進する。従って、ＩＬ－４の分泌に対するＳＰ、ＳＩＰＩ－Ｇ５、ＳＩＰＩ－Ｇ９の影響を調べることによって、慢性閉塞性肺疾患に対するその治療効果を評価する。
【0300】
１．実験方法
３匹のＢＡＬＢ／Ｃマウスを、麻酔後の頸椎脱臼によって犠牲にする。７５％エタノールに５分間浸漬する。解剖し、脾臓を取り、脾臓リンパ球を調製し、カウントした後、９６ウェルプレートに２×１０５個／ウェルを加え、ＳＰ、ＳＩＰＩ－Ｇ５およびＳＩＰＩ－Ｇ９は、それぞれ異なる濃度群に設定され、異なる濃度のＣｓＡ（シクロスポリンＡ）を陽性対照群として使用する。各ウェルに異なる濃度の被験物を加え、各濃度を三つのデュープリケートウェルとして設定し、ＣｏｎＡの最終濃度は、５μｇ／ｍＬである。３７℃の５％ＣＯ２インキュベーターで２４時間インキュベートし、各ウェルの薬物含有細胞懸濁液を吸引し、４℃下で、２００ｇで１５分間遠心分離し、上清を取り、マウスＩＬ－４Ｅｌｉｓａキット（ｍｏｕｓｅ ＩＬ－４ Ｅｌｉｓａ ｋｉｔ）を使用して、ＩＬ－４の含有量を検出する。
３匹のＢＡＬＢ／Ｃマウスを、麻酔後の頸椎脱臼によって犠牲にする。７５％エタノールに５分間浸漬する。解剖し、脾臓を取り、脾臓リンパ球を調製し、カウントした後、９６ウェルプレートに２×１０５個／ウェルを加え、ＳＰ、ＳＩＰＩ－Ｇ５およびＳＩＰＩ－Ｇ９は、それぞれ異なる濃度群に設定され、異なる濃度のＣｓＡ（シクロスポリンＡ）を陽性対照群として使用する。各ウェルに異なる濃度の被験物を加え、各濃度を三つのデュープリケートウェルとして設定し、ＣｏｎＡの最終濃度は、５μｇ／ｍＬである。３７℃の５％ＣＯ２インキュベーターで２４時間インキュベートし、各ウェルの薬物含有細胞懸濁液を吸引し、４℃下で、２００ｇで１５分間遠心分離し、上清を取り、マウスＩＬ－４Ｅｌｉｓａキット（ｍｏｕｓｅ ＩＬ－４ Ｅｌｉｓａ ｋｉｔ）を使用して、ＩＬ－４の含有量を検出する。
【0301】
２．実験結果
ＣｏｎＡによって刺激されたマウス脾細胞によるＩＬ－４の分泌に対する異なる濃度のＳＰ、ＳＩＰＩ－Ｇ５、ＳＩＰＩ－Ｇ９およびＣｓＡの影響は、表２２に示されたとおりであり、ＩＬ－４の分泌の阻害率は、表２３に示されたとおりである。
ＣｏｎＡによって刺激されたマウス脾細胞によるＩＬ－４の分泌に対する異なる濃度のＳＰ、ＳＩＰＩ－Ｇ５、ＳＩＰＩ－Ｇ９およびＣｓＡの影響は、表２２に示されたとおりであり、ＩＬ－４の分泌の阻害率は、表２３に示されたとおりである。
【0302】
【表23】
【0303】
【表24】
【0304】
表２２および表２３からわかるように、異なる濃度のＳＩＰＩ－Ｇ９は、ＣｏｎＡによって刺激されたマウス脾臓リンパ球によるＩＬ－４の分泌を有意に阻害することにより、慢性閉塞性肺疾患に対して優れた治療効果を有する。
【0305】
実施例８．薬力学的検出１
１．材料および機器
ＳＩＰＩ－Ｇ９ポリペプチド：凍結乾燥粉末、後で使用するために－２０℃で保存する。
１．材料および機器
ＳＩＰＩ－Ｇ９ポリペプチド：凍結乾燥粉末、後で使用するために－２０℃で保存する。
【0306】
陽性対照薬：吸入用ブデソニド懸濁液、仕様：２ｍｌ：０．５ｍｇ、バッチ番号：１６０３２２０、外観および物理的と化学的性質：微粒子懸濁液、メーカー：ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ Ｐｔｙ Ｌｔｄ、オーストラリア。
【0307】
リポ多糖（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）（ＬＰＳ）、バッチ番号：０１１Ｍ４００１Ｖ、仕様：１ｍｇ、メーカー：Ｓｉｇｍａ。
ネブライザー：モデル：４０３Ｃ型家庭用空気圧縮式ネブライザー、メーカー：魚躍医療。
ネブライザー：モデル：４０３Ｃ型家庭用空気圧縮式ネブライザー、メーカー：魚躍医療。
【0308】
動物の肺機能分析システム：モデル：ＡｎｉＲｅｓ２００５、メーカー：北京貝蘭博科学技術株式会社。
２．実験動物
ＳＰＦ雄性ＳＤラットに標準的な滅菌マウス飼料を使用し、動物の飲料水は、飲料水ボトルから供給され、動物は、水を自由に飲むことができ、飼育温度は、２０℃～２２℃であり、湿度は、４０％～７０％であり、照明は、明暗を１２時間相互に行う。
２．実験動物
ＳＰＦ雄性ＳＤラットに標準的な滅菌マウス飼料を使用し、動物の飲料水は、飲料水ボトルから供給され、動物は、水を自由に飲むことができ、飼育温度は、２０℃～２２℃であり、湿度は、４０％～７０％であり、照明は、明暗を１２時間相互に行う。
【0309】
３．実験方法
３．１．動物のグループ化
４０匹のＳＰＦ級雄性ＳＤラットを四つのグループに分け、各グループに１０匹のラット、即ち、空白対照群（生理食塩水）、モデル群（喫煙＋ＬＰＳ）、ＳＩＰＩ－Ｇ９群（投与量３５０μｇ／ｋｇ体重／日）、ブデソニド群（投与量５ｍｇ／ｋｇ体重／日）。
３．１．動物のグループ化
４０匹のＳＰＦ級雄性ＳＤラットを四つのグループに分け、各グループに１０匹のラット、即ち、空白対照群（生理食塩水）、モデル群（喫煙＋ＬＰＳ）、ＳＩＰＩ－Ｇ９群（投与量３５０μｇ／ｋｇ体重／日）、ブデソニド群（投与量５ｍｇ／ｋｇ体重／日）。
【0310】
３．２．慢性閉塞性肺疾患モデルの構築および投与
健康な雄性ＳＤラットを自作の有機ガラス気密喫煙ボックス（８５ｃｍ×８５ｃｍ×４５ｃｍ）にバッチで入れ、週６日、１日４０分、２バッチで喫煙し、その間に１０分休憩し、各バッチに２４本のたばこを与え、煙の量は、４００～５００ｐｐｍである。２００μｇのＬＰＳ（生理食塩水で１ｇ／Ｌの溶液に調製する）を２週間の時間間隔で１回気道に注入する。このサイクルを１２週間続けて、モデル動物を構築する。
健康な雄性ＳＤラットを自作の有機ガラス気密喫煙ボックス（８５ｃｍ×８５ｃｍ×４５ｃｍ）にバッチで入れ、週６日、１日４０分、２バッチで喫煙し、その間に１０分休憩し、各バッチに２４本のたばこを与え、煙の量は、４００～５００ｐｐｍである。２００μｇのＬＰＳ（生理食塩水で１ｇ／Ｌの溶液に調製する）を２週間の時間間隔で１回気道に注入する。このサイクルを１２週間続けて、モデル動物を構築する。
【0311】
１３週目から、構築されたモデル動物をモデル群、ＳＩＰＩ－Ｇ９群およびブデソニド群に分け、各グループに１０匹のラットに配置し、モデル群のラットは、上記の方法従ってモデリングし続け、ＳＩＰＩ－Ｇ９群は、上記の方法に従ってモデリングプロセス中にＳＩＰＩ－Ｇ９を投与し続け（エアロゾル投与、１日１回投与、合計４週間の投与）、ブデソニド群は、上記の方法に従ってモデリングプロセス中にブデソニドを投与し続け（エアロゾル投与、１日１回投与、合計４週間の投与）、１６週目に終了する。
【0312】
同時に、空白対照群の１０匹のラットに、処理なしで０～１６週間まで正常に飲食させ、空白対照として生理食塩水を投与する。
３．３．肺機能の測定
実験終了後、麻酔後のラットに気管挿管および頸静脈挿管を行い、各群の動物に気道抵抗および肺コンプライアンスの測定を行う。各動物は、頸静脈を介して、０．０２５ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇの倍数で増加したメタコリンが投与される。各用量を投与した後に肺コンプライアンス曲線を５分間継続して記録し、様々なグループのラットの肺換気量および換気率は、表２４および表２５に示されたとおりである。
３．３．肺機能の測定
実験終了後、麻酔後のラットに気管挿管および頸静脈挿管を行い、各群の動物に気道抵抗および肺コンプライアンスの測定を行う。各動物は、頸静脈を介して、０．０２５ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇの倍数で増加したメタコリンが投与される。各用量を投与した後に肺コンプライアンス曲線を５分間継続して記録し、様々なグループのラットの肺換気量および換気率は、表２４および表２５に示されたとおりである。
【0313】
【表25】
【0314】
【表26】
【0315】
表２４および表２５からわかるように、モデル群ラットの２００ｍｓ肺換気量および肺換気率が有意に低下する。モデル群と比較して、ブデソニド群ラットの２００ｍｓ肺換気量は、有意に増加し、肺換気率は、有意に増加し、ＳＩＰＩ－Ｇ９群マウスの２００ｍｓ肺換気量は、有意に増加し、肺換気率は、有意に増加する。これは、ＳＩＰＩ－Ｇ９治療群がラットの吸気相抵抗を有意に増加および低下させ、肺換気量および肺換気率を増加させると、肺コンプライアンスを増加させることを示す。
【0316】
３．４．肺の病理学的観察
１６週目が終了後、ラットの肺組織を取り出し、４％のホルムアルデヒドで固定し、パラフィンに包埋し、切片化し、Ｈ＆ＥおよびＭａｓｓｏｎ染色後に病理学的観察を行い、染色は、図９および図１０に示されたとおりである。
１６週目が終了後、ラットの肺組織を取り出し、４％のホルムアルデヒドで固定し、パラフィンに包埋し、切片化し、Ｈ＆ＥおよびＭａｓｓｏｎ染色後に病理学的観察を行い、染色は、図９および図１０に示されたとおりである。
【0317】
図９からわかるように、空白対照群のラットの肺には、炎症性細胞浸潤がなく、肺胞腔は透明である。モデル群のラットの肺には、多数の炎症性細胞が浸潤しており、炎症性細胞は、主に好酸球および単核細胞であり、肺胞腔は、ひどく損傷される。ブデソニド群のラットの肺には、少量の炎症性細胞が浸潤しているが、肺胞腔は、ひどく損傷してない。ＳＩＰＩ－Ｇ９群のラットの肺には、炎症性細胞の浸潤がより少なく、肺胞腔は透明である。
【0318】
図１０からわかるように、空白対照群のラットの肺には、コラーゲン沈着がほとんどなく、モデル群のラットの肺には、大量のコラーゲン沈着があり、ブデソニド群のラットの肺には、少量のコラーゲン沈着が見られることができ、ＳＩＰＩ－Ｇ９群のラットの肺には、コラーゲン沈着がほとんどない。
【0319】
要約すると、ＳＩＰＩ－Ｇ９は、ラットの吸気相抵抗を有意に低下させ、肺換気量および肺換気率を増加させると、肺コンプライアンスを増加させ、肺炎症性細胞浸潤およびコラーゲン沈着を減少させることにより、慢性閉塞性肺疾患モデルに対して優れた治療効果を有する。
【0320】
実施例９．薬力学的検出２
１．材料および機器
ＳＩＰＩ－Ｇ５ペプチドおよびＳＩＰＩ－Ｇ９ペプチド：凍結乾燥粉末、後で使用するために－２０℃で保存する。
１．材料および機器
ＳＩＰＩ－Ｇ５ペプチドおよびＳＩＰＩ－Ｇ９ペプチド：凍結乾燥粉末、後で使用するために－２０℃で保存する。
【0321】
陽性対照薬：デキサメタゾンリン酸ナトリウム注射液、仕様：５ｍｇ／ｍｌ、１ｍｌ／個、外観および物理的と化学的性質：無色液体、保存条件：遮光、密封、涼しい場所で保管し、メーカー：国薬グループ栄生製薬株式会社。
【0322】
ニワトリタンパク質アルブミン（ニワトリ卵白からのアルブミン（Ａｌｂｕｍｉｎ ｆｒｏｍ ｃｈｉｃｋｅｎ ｅｇｇ ｗｈｉｔｅ））（ＯＶＡ）：バッチ番号：ＳＬＢＫ６４４５Ｖ、メーカー：ＳＩＧＭＡ－ＡＬＤＲＩＣＨ。
【0323】
水酸化アルミニウムアジュバント：名称：Ｉｍｊｅｃｔ Ａｌｕｍ、バッチ番号：ＴＪ２７１９０７Ａ、仕様：５０ｍＬ／ボトル、メーカー：Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ。
【0324】
ＥＬＩＳＡキット：Ｍｏｕｓｅ ＩｇＥ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ、バッチ番号：ＧＲ３２４６６９１－４、メーカー：ａｂｃａｍ。
ネブライザー：モデル：４０３Ｃ型家庭用空気圧縮式ネブライザー、メーカー：魚躍医療。
ネブライザー：モデル：４０３Ｃ型家庭用空気圧縮式ネブライザー、メーカー：魚躍医療。
【0325】
動物の肺機能分析システム：モデル：ＡｎｉＲｅｓ２００５。メーカー：北京貝蘭博科学技術株式会社。
２．実験動物
ＳＰＦ雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスに標準的な滅菌マウス飼料を使用し、動物の飲料水は、飲料水ボトルから供給され、動物は、水を自由に飲むことができ、飼育温度は、２０℃～２２℃であり、湿度は、４０％～７０％であり、照明は、明暗を１２時間相互に行う。
２．実験動物
ＳＰＦ雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスに標準的な滅菌マウス飼料を使用し、動物の飲料水は、飲料水ボトルから供給され、動物は、水を自由に飲むことができ、飼育温度は、２０℃～２２℃であり、湿度は、４０％～７０％であり、照明は、明暗を１２時間相互に行う。
【0326】
３．実験方法
３．１．動物のグループ化
ＳＰＦ雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスは、二つのバッチに分けて実験され、一つは、血清ＩｇＥおよび肺の病理の検出に使用され、もう一つは、肺機能の検出に使用される。
３．１．動物のグループ化
ＳＰＦ雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスは、二つのバッチに分けて実験され、一つは、血清ＩｇＥおよび肺の病理の検出に使用され、もう一つは、肺機能の検出に使用される。
【0327】
最初のバッチ：マウスをグループに分け、各グループに１０匹のマウス、即ち、空白対照群（生理食塩水）、モデル群（ＯＶＡ、２０ｕｇ／匹）、ＳＰペプチド群（投与量は、それぞれ１７５μｇ／ｋｇ体重／日、３５０μｇ／ｋｇ体重／日である）、ＳＩＰＩ－Ｇ５ペプチド群（投与量は、１７５μｇ／ｋｇ体重／日、３５０μｇ／ｋｇ体重／日である）、ＳＩＰＩ－Ｇ９ペプチド群（投与量は、１７５μｇ／ｋｇ体重／日、３５０μｇ／ｋｇ体重／日である）、デキサメタゾン群（投与量は、２ｍｇ／ｋｇ体重／日である）。
【0328】
２番目のバッチ：マウスをグループに分け、各グループに１０匹のマウス、即ち、空白対照群（生理食塩水）、モデル群（ＯＶＡ、用量は、２０ｕｇ／匹である）、ＳＰペプチド群（投与量は、それぞれ８７．５μｇ／ｋｇ体重／日、１７５μｇ／ｋｇ体重／日、３５０μｇ／ｋｇ体重／日である）、Ｇ９ペプチド群（投与量は、８７．５μｇ／ｋｇ体重／日、１７５μｇ／ｋｇ体重／日、３５０μｇ／ｋｇ体重／日である）、デキサメタゾン群（投与量は、２ｍｇ／ｋｇ体重／日である）。
【0329】
３．２．アレルギー性喘息型モデル動物の構築および投与
３．２．１．薬物の調製および投与経路
３．２．１．１．ＯＶＡの調製および投与方法
３．２．１．１．１．感作（Ｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎ）用ＯＶＡ：
感作用ＯＶＡを滅菌ＰＢＳ溶液に溶解し、最終濃度は、０．２ｍｇ／ｍｌであり、等量の水酸化アルミニウムアジュバントを加え、３０分間振とうした後、マウスにマウスあたり０．２ｍｌ（２０μｇのＯＶＡ／匹）を腹腔内注射する。
３．２．１．薬物の調製および投与経路
３．２．１．１．ＯＶＡの調製および投与方法
３．２．１．１．１．感作（Ｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎ）用ＯＶＡ：
感作用ＯＶＡを滅菌ＰＢＳ溶液に溶解し、最終濃度は、０．２ｍｇ／ｍｌであり、等量の水酸化アルミニウムアジュバントを加え、３０分間振とうした後、マウスにマウスあたり０．２ｍｌ（２０μｇのＯＶＡ／匹）を腹腔内注射する。
【0330】
３．２．１．１．２．チャレンジ（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）用ＯＶＡ：
滅菌ＰＢＳで２％ＯＶＡ溶液を調製する。２％ＯＶＡをネブライザーで噴霧し、マウスをネブライザー吸入ボックスに１日３０分間入れる。
滅菌ＰＢＳで２％ＯＶＡ溶液を調製する。２％ＯＶＡをネブライザーで噴霧し、マウスをネブライザー吸入ボックスに１日３０分間入れる。
【0331】
３．２．１．１．３．デキサメタゾン：
デキサメタゾンリン酸ナトリウム注射液を生理食塩水で希釈した後に腹腔内注射により投与し、投与量は、２ｍｇ／ｋｇである。
デキサメタゾンリン酸ナトリウム注射液を生理食塩水で希釈した後に腹腔内注射により投与し、投与量は、２ｍｇ／ｋｇである。
【0332】
３．２．１．１．４．免疫７ペプチドおよびその誘導体：
投与量に応じて、それぞれＳＰペプチド、ＳＩＰＩ－Ｇ５ペプチド、ＳＩＰＩ－Ｇ９を生理食塩水に溶解し、動物の体重に応じて背中に皮下投与する。
投与量に応じて、それぞれＳＰペプチド、ＳＩＰＩ－Ｇ５ペプチド、ＳＩＰＩ－Ｇ９を生理食塩水に溶解し、動物の体重に応じて背中に皮下投与する。
【0333】
３．２．２．アレルギー性喘息型モデル動物の構築および投与方法
モデル群、ＳＰペプチド群、ＳＩＰＩ－Ｇ５ペプチド群、ＳＩＰＩ－Ｇ９ペプチド群およびデキサメタゾン群のマウス于は、０、７、１４日目にＯＶＡの腹腔内注射によって感作（２０μｇＯＶＡ／ｍｉｃｅ）された後、２１～２５日目に、エアロゾル投与によりＯＶＡ（５日間連続で１日１回）にチャレンジし、喘息型モデル動物を構築する。モデル群のマウスには、２１～２８日目に生理食塩水を投与し、異なる用量のＳＰペプチド、ＳＩＰＩ－Ｇ５ペプチド、ＳＩＰＩ－Ｇ９ペプチド群のマウスに、それぞれ１９～２８日目に異なる用量のＳＰペプチド、ＳＩＰＩ－Ｇ５ペプチド、ＳＩＰＩ－Ｇ９ペプチドを皮下注射し、デキサメタゾン群のマウスに、２１～２８日目に２ｍｇ／ｋｇ／日のデキサメタゾンを腹腔内注射する。同時に、空白対照群の１０匹のマウスは、処置なしで０～２８日目まで通常とおりに飲食が投与され、空白対照として生理食塩水が投与される。
モデル群、ＳＰペプチド群、ＳＩＰＩ－Ｇ５ペプチド群、ＳＩＰＩ－Ｇ９ペプチド群およびデキサメタゾン群のマウス于は、０、７、１４日目にＯＶＡの腹腔内注射によって感作（２０μｇＯＶＡ／ｍｉｃｅ）された後、２１～２５日目に、エアロゾル投与によりＯＶＡ（５日間連続で１日１回）にチャレンジし、喘息型モデル動物を構築する。モデル群のマウスには、２１～２８日目に生理食塩水を投与し、異なる用量のＳＰペプチド、ＳＩＰＩ－Ｇ５ペプチド、ＳＩＰＩ－Ｇ９ペプチド群のマウスに、それぞれ１９～２８日目に異なる用量のＳＰペプチド、ＳＩＰＩ－Ｇ５ペプチド、ＳＩＰＩ－Ｇ９ペプチドを皮下注射し、デキサメタゾン群のマウスに、２１～２８日目に２ｍｇ／ｋｇ／日のデキサメタゾンを腹腔内注射する。同時に、空白対照群の１０匹のマウスは、処置なしで０～２８日目まで通常とおりに飲食が投与され、空白対照として生理食塩水が投与される。
【0334】
４．実験結果
４．１．血清中のＩｇＥレベルの測定
２８日目が終了後、マウスの眼内眦から採血し、血清を取り、ＥＬＩＳＡキットで血清中のＩｇＥレベルを測定し、結果は、表２６に示されたとおりである。
４．１．血清中のＩｇＥレベルの測定
２８日目が終了後、マウスの眼内眦から採血し、血清を取り、ＥＬＩＳＡキットで血清中のＩｇＥレベルを測定し、結果は、表２６に示されたとおりである。
【0335】
【表27】
【0336】
表２６からわかるように、アジュバント水酸化アルミニウム感作と併用したＯＶＡによって引き起こされるアレルギー性喘息マウスモデル群の血清中のＩｇＥレベルは、有意に増加し（ｐ＜０．０１）、モデル群およびＳＰペプチド群と比較して、ＳＩＰＩ－Ｇ９ペプチド治療投与の血清中のＩｇＥレベルは、有意に低下し、ＳＩＰＩ－Ｇ９ペプチドがアレルギー性喘息マウスモデル群の血清中のＩｇＥレベルを有意に低下させることができることを示す。
【0337】
４．２．肺機能の測定
２８日目に、マウスに麻酔した後に気管挿管および頸静脈挿管を行い、各動物群で吸気気道抵抗および肺コンプライアンスを測定する。各動物は、頸静脈を介して、０．０２５ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ等の倍数で増加したメタコリンが投与される。各用量を投与した後に肺コンプライアンス曲線を５分間継続して記録し、吸気気道抵抗および肺コンプライアンスを計算し、結果は、表２７および表２８に示されたとおりである。
２８日目に、マウスに麻酔した後に気管挿管および頸静脈挿管を行い、各動物群で吸気気道抵抗および肺コンプライアンスを測定する。各動物は、頸静脈を介して、０．０２５ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ等の倍数で増加したメタコリンが投与される。各用量を投与した後に肺コンプライアンス曲線を５分間継続して記録し、吸気気道抵抗および肺コンプライアンスを計算し、結果は、表２７および表２８に示されたとおりである。
【0338】
【表28】
【0339】
【表29】
【0340】
表２７および表２８からわかるように、モデル群のマウスの吸気相抵抗は、有意に増加し、肺コンプライアンスは、有意に低下する。モデル群と比較して、デキサメタゾン群のマウスの吸気相抵抗は、有意に低下し、肺コンプライアンスは、有意に増加し、モデル群と比較して、ＳＩＰＩ－Ｇ９高、中、低用量群のマウスの吸気相抵抗は、有意に低下し、肺コンプライアンスは、有意に増加し、ＳＩＰＩ－Ｇ９ペプチドがマウスの吸気相抵抗を有意に低下し、肺コンプライアンスを有に増加することができることを示す。
【0341】
４．３．肺の病理学的観察
２８日目が終了後、マウスの肺組織を取り出し、４％のホルムアルデヒドで固定し、パラフィンに包埋し、切片化し、Ｈ＆Ｅ染色後に病理学的観察を行い、結果は、図１１および図１２に示されたとおりである。
２８日目が終了後、マウスの肺組織を取り出し、４％のホルムアルデヒドで固定し、パラフィンに包埋し、切片化し、Ｈ＆Ｅ染色後に病理学的観察を行い、結果は、図１１および図１２に示されたとおりである。
【0342】
図１１および図１２からわかるように、空白対照群のマウスの肺には、炎症性細胞の浸潤がなく、肺胞腔は透明である。モデル群のマウスの肺には、多数の炎症性細胞が浸潤し、炎症性細胞は、主に好酸球および単核細胞であり、肺胞腔は、ひどく損傷し、気道上皮は、損傷して脱落し、気道壁が肥厚であり、粘膜が浮腫であり、気道滲出物が増加し、粘液が貯留し、気道平滑筋が肥厚であることが分かる。陽性対照群のマウスの肺には、少量の炎症性細胞が浸潤しているが、肺胞腔は、ひどく損傷された。
【0343】
ＳＰ低用量群および高用量群のマウス気道粘膜に一部の炎症性細胞浸潤が観察され、気道壁が肥厚であり、粘膜が浮腫であり、気道滲出物が増加し、粘液が貯留し、気道平滑筋が肥厚であることが分かる。
【0344】
ＳＩＰＩ－Ｇ５低用量群のマウスの気道粘膜に多数の炎症性細胞が浸潤し、高用量群のマウスの気道粘膜には、一部の炎症細胞が浸潤し、低用量群および高用量群のマウスの両方は、気道壁が肥厚であり、粘膜が浮腫であり、気道滲出物が増加し、粘液が貯留し、気道平滑筋が肥厚であることが分かる。
【0345】
ＳＩＰＩ－Ｇ５群と同じ用量下で、ＳＩＰＩ－Ｇ９群のマウスの肺には、炎症性細胞浸潤が比較的少なく、肺胞腔は透明であり、気道上皮は、比較的無傷であり、気道壁の厚さは正常で、粘膜の浮腫および滲出はなく、気道平滑筋は、正常である。
【0346】
【0347】
要約すると、ＳＩＰＩ－Ｇ９ペプチドは、炎症性因子を効果的に阻害し、ＩｇＥレベルを低下させ、吸気気道抵抗を低下させ、肺コンプライアンスを向上させ、肺の炎症性細胞の浸潤を阻害することにより、アレルギー性喘息に対して効果的な治療効果を有することが分かる。
【0348】
本発明で言及されたすべての文書は、あたかも各文書が個別に参照として引用されたかのように、本出願における参照として引用される。さらに、本発明の上記の教示内容を読んだ後、当業者は本発明に様々な変更または修正を加えることができ、これらの同等の形態も、本出願の添付の請求範囲によって定義される範囲に含まれる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【配列表】