特許 7492223 リン酸カルシウムに対するタンパク質集積方法およびタンパク質を集積したリン酸カルシウム

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-05-21

(45)【発行日】2024-05-29

(54)【発明の名称】リン酸カルシウムに対するタンパク質集積方法およびタンパク質を集積したリン酸カルシウム

(51)【国際特許分類】

   A61L 27/12 20060101AFI20240522BHJP

   A61L 27/02 20060101ALI20240522BHJP

   A61L 27/22 20060101ALI20240522BHJP

   A61L 27/34 20060101ALI20240522BHJP

【ＦＩ】

A61L27/12

A61L27/02

A61L27/22

A61L27/34

【請求項の数】 1

(21)【出願番号】P 2019135675

(22)【出願日】2019-07-23

(65)【公開番号】P2021016724

(43)【公開日】2021-02-15

【審査請求日】2022-05-12

(31)【優先権主張番号】P 2019133760

(32)【優先日】2019-07-19

(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】504157024

【氏名又は名称】国立大学法人東北大学

(73)【特許権者】

【識別番号】501415752

【氏名又は名称】日本ファインセラミックス株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100165179

【弁理士】

【氏名又は名称】田▲崎▼ 聡

(74)【代理人】

【識別番号】100188558

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 雅人

(74)【代理人】

【識別番号】100175824

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 淳一

(74)【代理人】

【識別番号】100152272

【弁理士】

【氏名又は名称】川越 雄一郎

(74)【代理人】

【識別番号】100181722

【弁理士】

【氏名又は名称】春田 洋孝

(72)【発明者】

【氏名】鈴木 治

(72)【発明者】

【氏名】濱井 瞭

(72)【発明者】

【氏名】土屋 香織

(72)【発明者】

【氏名】林 智洋

【審査官】高橋 樹理

(56)【参考文献】

【文献】特開２００４－１７３７９５（ＪＰ，Ａ）

【文献】Cells and Materials，1995年，Vol5, No.1，p.45-54

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ａ６１Ｋ

Ａ６１Ｌ ２７／００－２７／６０

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

リン酸カルシウムにタンパク質を集積させる方法であって、
１～５ｍＭのカルシウムイオンおよび０．５～３ｍＭの無機リン酸イオンを含有し、２５～４５℃でｐＨ６～８に調整された緩衝液を調製する緩衝液調製工程と、
前記緩衝液のカルシウムイオン含有量が１～２ｍＭの場合には０．０１～０．５ｍｇ・ｍＬ ^-1 の範囲で、カルシウムイオン含有量が２～５ｍＭの場合には０．０１～１．５ｍｇ・ｍＬ ^-1 の範囲で、タンパク質を前記緩衝液に溶解し、タンパク質含有緩衝液を調製するタンパク質含有緩衝液調製工程と、
前記タンパク質含有緩衝液にリン酸カルシウムを接触させるリン酸カルシウム接触工程と、を含んでいることを特徴とする方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、リン酸カルシウムに対するタンパク質集積方法およびタンパク質を集積したリン酸カルシウムに関する。

【背景技術】

【0002】

リン酸八カルシウム（ＯＣＰ、Ｃａ₈Ｈ₂（ＰＯ₄）₆・５Ｈ₂Ｏ）が、骨アパタイト結晶の前駆体であるといわれている。これは、ハイドロキシアパタイト（ＨＡ）との構造的な類似性（、溶液化学および理論的な溶解度分析に基づいている（例えば、非特許文献１参照）。合成ＯＣＰは、特定の合成条件で合成された場合、非焼結ＨＡなどの他のリン酸カルシウム材と比較してより高い骨伝導性を持つことが認識されている（例えば、非特許文献２参照）。

【0003】

ＯＣＰの骨伝導性は、骨芽細胞の機能を活性化する能力だけでなく破骨細胞の形成促進によっても説明され、その刺激能力は、ＯＣＰが破骨細胞の分化だけでなく、ＯＣＰ材料との直接的または間接的な接触による前駆細胞からの破骨細胞の形成をも増強することが証明されている（例えば、非特許文献１０～１２参照）。生理的骨リモデリングプロセスにおける破骨細胞吸収後の転化的骨形成は、アパタイト結晶核形成およびＨＡに関して周囲組織液の過飽和条件下での骨基質タンパク質上でのＨＡの成長を含むことが知られている（例えば、非特許文献１３参照）。ＯＣＰ上への新たな骨形成が結晶成長に関するそのような石灰化プロセス（例えば、非特許文献１参照）も含むと仮定することは合理的である。

【0004】

ＯＣＰは準安定相と考えられているため、ＨＡに関して過飽和条件下で最も熱力学的に安定なＨＡに変換することができる（例えば、非特許文献１参照）。実際、ＯＣＰは様々な骨組織に埋入された場合、時間とともに徐々にアパタイト相に変換されることが示された（例えば、非特許文献２、３参照）。ミネラル結晶－マトリックスタンパク質の相互作用の観点から、骨石灰化プロセスは、通常、ミネラル結晶および組織特異的細胞、骨芽細胞および循環血清による分泌マトリックスタンパク質などのタンパク質との間の相互作用を伴って進行することが認められている（例えば、非特許文献７参照）。その結果、骨組織中に組織化されたミネラル／タンパク質複合体が形成される。

【0005】

以前のレクチン組織化学およびプロテオーム解析により、マウス頭蓋冠骨への移植時またはインビトロでのラット血清への浸漬により、非コラーゲン性血清タンパク質がＯＣＰ結晶の周囲に集積あるいは吸着することが示された（例えば、非特許文献８参照）。超微細構造レベルでの脱灰組織標本を用いた観察により、マウス頭蓋冠へのＯＣＰ移植における新しい骨形成がＯＣＰ－非コラーゲンタンパク質複合体からなる構造物上から開始されたことが確認された（例えば、非特許文献２参照）。さらに、超微細構造レベルでの非脱灰組織標本を用いた観察により、マウス頭蓋冠への移植後の個々のＯＣＰ結晶への新規ナノ結晶析出が実証された（例えば、非特許文献１参照）。その結果により、新しい骨形成がＯＣＰ上で起こっているかまたはＯＣＰが溶解されている環境が、血清タンパク質の存在にかかわらず、実際に新しいリン酸カルシウム結晶形成を開始することができるある飽和レベルを有することが示唆されている。しかしながら、イオン濃度、主にカルシウムおよび無機リン酸イオンによって決定される飽和レベルが、血清タンパク質－ＯＣＰ相互作用を強化または弱める可能性があるかどうかについては不十分であり、それはＯＣＰ材料の骨伝導性に影響し得ると考えられる。

【0006】

血清の組成は、ＨＡに関して過飽和であり、ＯＣＰに対してほぼ飽和していると報告されている（例えば、非特許文献９参照）。これは、ラット頭蓋冠骨欠損に埋入されたＯＣＰがアパタイト相に変換される傾向があるという以前の観察と矛盾しない（例えば、非特許文献３参照）。上記の破骨細胞様細胞吸収がＯＣＰ周辺の飽和レベルに影響を与える可能性に加えて、ＯＣＰと間葉系幹細胞由来細胞（ＡＴＤＣ５）の存在は培地中のカルシウムイオン濃度を増加させＯＣＰが溶解したことが示されている（例えば、非特許文献１０参照）。骨欠損に埋入されたＯＣＰは骨形成中に、間葉由来細胞や炎症性免疫細胞などの他の細胞にも遭遇し、それによって細胞の溶解および再沈殿を調節されると考えられる。
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の吸着は、ＯＣＰ相に関して飽和条件下でラングミュア型単層吸着モデルによって十分に説明することができる（例えば、非特許文献１１参照）。同様のモデルを用いて、ＨＡへの唾液タンパク質およびアミノ酸の吸着が説明された（例えば、非特許文献１２、１３参照）。

【0007】

しかしながら、リン酸カルシウム相の安定性は過飽和度によって決定されると考えられ（例えば、非特許文献１参照）、タンパク質を含む他の成分は結晶相や結晶成長を調節すると考えられている（例えば、非特許文献１４参照）。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0008】

【文献】Ｓｕｚｕｋｉ， Ｏ． Ａｃｔａ Ｂｉｏｍａｔｅｒ． ２０１０， ６：３３７９－３３８７． ｄｏｉ ： １０．１０１６／ｊ．ａｃｔｂｉｏ．２０１０．０４．００２．

【文献】Ｓｕｚｕｋｉ， Ｏ．； Ｎａｋａｍｕｒａ， Ｍ．； Ｍｉｙａｓａｋａ， Ｙ．； Ｋａｇａｙａｍａ， Ｍ．； Ｓａｋｕｒａｉ， Ｍ． Ｂｏｎｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｎ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ ｏｆ ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ． Ｔｏｈｏｋｕ Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １９９１， １６４， ３７－５０， ｄｏｉ： １０．１６２０／ｔｊｅｍ．１６４．３７

【文献】Ｓｕｚｕｋｉ， Ｏ．； Ｋａｍａｋｕｒａ， Ｓ．； Ｋａｔａｇｉｒｉ， Ｔ．； Ｎａｋａｍｕｒａ， Ｍ．； Ｚｈａｏ， Ｂ．Ｈ．； Ｈｏｎｄａ， Ｙ．； Ｋａｍｉｊｏ， Ｒ． Ｂｏｎｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｂｙ ｉｍｐｌａｎｔｅｄ ｏｃｔａｃａｌｃｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｉｎｔｏ Ｃａ－ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ． Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ２００６， ２７， ２６７１－２６８１， ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｂｏｉｍａｔｅｒｉａｌｓ．２００５．１２．００４．

【文献】Ａｎａｄａ， Ｔ．； Ａｒａｓｅｋｉ， Ａ．； Ｍａｔｓｕｋａｗａ， Ｓ．； Ｙａｍａｓａｋｉ， Ｔ．； Ｋａｍａｋｕｒａ， Ｓ．； Ｓｕｚｕｋｉ， Ｏ． Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｏｃｔａｃａｌｃｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｉｏｎｉｃ ｄｉｓｓｏｌｕｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｏｎ ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔｉｃ ｃｅｌｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ． ２００８； ｐｐ． ３１－３４．

【文献】Ｔａｋａｍｉ， Ｍ．； Ｍｏｃｈｉｚｕｋｉ， Ａ．； Ｙａｍａｄａ， Ａ．； Ｔａｃｈｉ， Ｋ．； Ｚｈａｏ， Ｂ．； Ｍｉｙａｍｏｔｏ， Ｙ．； Ａｎａｄａ， Ｔ．； Ｈｏｎｄａ， Ｙ．； Ｉｎｏｕｅ， Ｔ．； Ｎａｋａｍｕｒａ， Ｍ．， ｅｔ ａｌ． Ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｏｃｔａｃａｌｃｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｔｈｒｏｕｇｈ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ ＮＦ－κ Ｂ ｌｉｇａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔｓ． Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｐａｒｔ Ａ ２００９， １５， ３９９１－４０００， ｄｏｉ：１０．１０８９／ｔｅｎ．ｔｅａ．２００９．００６５．

【文献】Ｌｏｔｓａｒｉ， Ａ．； Ｒａｊａｓｅｋｈａｒａｎ， Ａ．Ｋ．； Ｈａｌｖａｒｓｓｏｎ， Ｍ．； Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ， Ｍ． Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ａｍｏｒｐｈｏｕｓ ｃａｌｃｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｔｏ ｂｏｎｅ－ｌｉｋｅ ａｐａｔｉｔｅ． Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ２０１８， ９， １１， ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１４６７－０１８－０６５７０－ｘ．

【文献】Ａｏｂａ， Ｔ．； Ｓｈｉｍａｚｕ， Ｙ．； Ｔａｙａ， Ｙ．； Ｓｏｅｎｏ， Ｙ．； Ｓａｔｏ， Ｋ．； Ｍｉａｋｅ， Ｙ． Ｆｌｕｏｒｉｄｅ ａｎｄ ａｐａｔｉｔｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ ｖｉｖｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ． Ｊ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃ （Ｔｏｋｙｏ） ２００３， ５２， ６１５－６２５， ｄｏｉ：１０．１０９３／ｊｍｉｃｒｏ／５２．６．６１５．

【文献】Ｋａｎｅｋｏ， Ｈ．； Ｋａｍｉｉｅ， Ｊ．； Ｋａｗａｋａｍｉ， Ｈ．； Ａｎａｄａ， Ｔ．； Ｈｏｎｄａ， Ｙ．； Ｓｈｉｒａｉｓｈｉ， Ｎ．； Ｋａｍａｋｕｒａ， Ｓ．； Ｔｅｒａｓａｋｉ， Ｔ．； Ｓｈｉｍａｕｃｈｉ， Ｈ．； Ｓｕｚｕｋｉ， Ｏ． Ｐｒｏｔｅｏｍｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｒａｔ ｓｅｒｕｍ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｄｓｏｒｂｅｄ ｏｎｔｏ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｏｃｔａｃａｌｃｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｃｒｙｓｔａｌｓ． Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０１１， ４１８， ２７６－２８５， ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ａｂ．２０１１．０７．０２２．

【文献】Ｅｉｄｅｌｍａｎ， Ｎ．； Ｃｈｏｗ， Ｌ．Ｃ．； Ｂｒｏｗｎ， Ｗ．Ｅ． Ｃａｌｃｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ ｌｅｖｅｌｓ ｉｎ ｕｌｔｒａｆｉｌｔｅｒｅｄ ｓｅｒｕｍ． Ｃａｌｃｉｆｉｅｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ １９８７， ４０， ７１－７８， ｄｏｉ：１０．１００７／ｂｆ０２５５５７０８．

【文献】Ｓｈｉｂｕｙａ， Ｉ．； Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ， Ｋ．； Ｍｉｙａｍｏｔｏ， Ｙ．； Ｙａｍａｄａ， Ａ．； Ｔａｋａｍｉ， Ｍ．； Ｓｕｚａｗａ， Ｔ．； Ｓｕｚｕｋｉ， Ｄ．； Ｉｋｕｍｉ， Ｎ．； Ｈｉｕｒａ， Ｆ．； Ａｎａｄａ， Ｔ．， ｅｔ ａｌ． Ｏｃｔａｃａｌｃｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ ｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｉｃ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ＡＴＤＣ５ ｃｅｌｌｓ． Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０１３， ３５２， ４０１－４１２， ｄｏｉ：１０．１００７／ｓ００４４１－０１２－１５４８－８．

【文献】Ｓｕｚｕｋｉ， Ｏ．； Ｙａｇｉｓｈｉｔａ， Ｈ．； Ｙａｍａｚａｋｉ， Ｍ．； Ａｏｂａ， Ｔ． Ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ ｏｆ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ ｏｎｔｏ ｏｃｔａｃａｌｃｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ａｎｄ ｉｔｓ ｈｙｄｒｏｌｙｚａｔｅｓ． Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ １９９５， ５， ４５－５４．

【文献】Ａｏｂａ， Ｔ．； Ｍｏｒｅｎｏ， Ｅ．Ｃ．； Ｓｈｉｍｏｄａ， Ｓ． Ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｇｎｅｓｉｕｍ ａｎｄ ｃａｌｃｉｕｍ－ｉｏｎｓ ｏｎｔｏ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｐａｔｉｔｅｓ． Ｃａｌｃｉｆｉｅｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ １９９２， ５１， １４３－１５０， ｄｏｉ：１０．１００７／ｂｆ００２９８５０３．

【文献】Ｍｏｒｅｎｏ， Ｅ．Ｃ．； Ｋｒｅｓａｋ， Ｍ．； Ｈａｙ， Ｄ．Ｉ． Ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ ｏｎｔｏ ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ． Ｃａｌｃｉｆｉｅｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ １９８４， ３６， ４８－５９， ｄｏｉ：１０．１００７／ｂｆ０２４０５２９３．

【文献】Ｍｏｒｅｎｏ， Ｅ．Ｃ．； Ｖａｒｕｇｈｅｓｅ， Ｋ．； Ｈａｙ， Ｄ．Ｉ． Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｓａｌｉｖａｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｎ ｔｈｅ ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ ｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ｃａｌｃｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ． Ｃａｌｃｉｆｉｅｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ １９７９， ２８， ７－１６， ｄｏｉ：１０．１００７／ｂｆ０２４４１２１２．

【文献】Ｓｕｚｕｋｉ， Ｏ．； Ｎａｋａｍｕｒａ， Ｍ．； Ｍｉｙａｓａｋａ， Ｙ．； Ｋａｇａｙａｍａ， Ｍ．； Ｓａｋｕｒａｉ， Ｍ． Ｍａｃｌｕｒａ ｐｏｍｉｆｅｒａ ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｏｎ ｃｏｎｖｅｒｔｅｄ ａｐａｔｉｔｅ ｆｒｏｍ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｏｃｔａｃａｌｃｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｉｍｐｌａｎｔｅｄ ｉｎｔｏ ｓｕｂｐｅｒｉｏｓｔｅａｌ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｍｏｕｓｅ ｃａｌｖａｒｉａ． Ｂｏｎｅ ａｎｄ Ｍｉｎｅｒａｌ １９９３， ２０， １５１－１６６， ｄｏｉ：１０．１０１６／ｓ０１６９－６００９（０８）８００２４－４．

【文献】Ｍｏｒｅｎｏ， Ｅ．Ｃ．； Ｍａｒｇｏｌｉｓ， Ｈ．Ｃ． Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐｌａｑｕｅ ｆｌｕｉｄ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｅｎｔａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １９８８， ６７， １１８１－１１８９， ｄｏｉ：１０．１１７７／００２２０３４５８８０６７００９０７０１．

【文献】Ａｏｂａ， Ｔ．； Ｍｏｒｅｎｏ， Ｅ．Ｃ． Ｔｈｅ ｅｎａｍｅｌ ｆｌｕｉｄ ｉｎ ｔｈｅ ｅａｒｌｙ ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ ｓｔａｇｅ ｏｆ ｐｏｒｃｉｎｅ ａｍｅｌｏｇｅｎｅｓｉｓ： Ｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ａｎｄ ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｒｅｓｐｅｃｔ ｔｏ ｅｎａｍｅｌ ｍｉｎｅｒａｌ． Ｃａｌｃｉｆｉｅｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ １９８７， ４１， ８６－９４， ｄｏｉ：１０．１００７／ｂｆ０２５５５２５０．

【文献】Ｃｈｅｎ， Ｍ．Ｃ．； Ｌｏｒｄ， Ｒ．Ｃ． ｌａｓｅｒ－ｅｘｃｉｔｅｄ ｒａｍａｎ－ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ ｏｆ ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ． ＶＩＩＩ． ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ－ａｌｂｕｍｉｎ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ １９７６， ９８， ９９０－９９２， ｄｏｉ：１０．１０２１／ｊａ００４２０ａ０２１．

【文献】Ｋｏｂａｙａｓｈｉ， Ｋ．； Ａｎａｄａ， Ｔ．； Ｈａｎｄａ， Ｔ．； Ｋａｎｄａ， Ｎ．； Ｙｏｓｈｉｎａｒｉ， Ｍ．； Ｔａｋａｈａｓｈｉ， Ｔ．； Ｓｕｚｕｋｉ， Ｏ． Ｏｓｔｅｏｃｏｎｄｕｃｔｉｖｅ ｐｒｏｐｅｒｔｙ ｏｆ ａ ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ ｍｉｘｔｕｒｅ ｏｆ ｏｃｔａｃａｌｃｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ａｎｄ ａｍｏｒｐｈｏｕｓ ｃａｌｃｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ． Ａｃｓ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ ＆ Ｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ ２０１４， ６， ２２６０２－２２６１１， ｄｏｉ：１０．１０２１／ａｍ５０６７１３９．

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0009】

リン酸カルシウム、特にＯＣＰは、骨芽細胞および破骨細胞様細胞の活性とそれに付随するＨＡ形成およびその表面上の血清タンパク質吸着、ＯＣＰ自身の生体吸収と相まって新生骨の形成を促進することが示されている。これらに対し、任意のタンパク質を事前に必要量集積させることが出来れば、より生体材料としての有用性が向上すると考えられる。また必要量を集積させるにあたっては、従来の方法よりもより多量のタンパク質を効率よく集積させることができる方法が求められると考えられる。

【0010】

これに対し、本発明者らはＯＣＰを含むリン酸カルシウム結晶上に同結晶相（ＯＣＰ）が特異的に成長・析出する過飽和条件下でタンパク質の吸着が促進しうる原理を見出した。

【0011】

すなわち、過飽和度およびタンパク質の濃度を適切な範囲に制御することにより、結晶表面上に新たなタンパク質吸着サイトを有する結晶が生じること、析出に伴い結晶中にタンパク質を取り込むことでラングミュア式を超える量のタンパク質を高効率でリン酸カルシウムに集積させることができる。

【0012】

本発明は、リン酸カルシウムに対するタンパク質の集積量を向上・制御しうる方法およびタンパク質を集積したリン酸カルシウムを提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0013】

本発明のリン酸カルシウムにタンパク質を集積させる方法は、１～５ｍＭのカルシウムイオンおよび０．５～３ｍＭの無機リン酸イオンを含有し、２５～４５℃でｐＨ６～８に調整された緩衝液を調整する緩衝液調製工程と、前記緩衝液のカルシウムイオン含有量が１～５ｍＭの場合には０．０１～１０ｍｇ・ｍＬ^-1の範囲でタンパク質を前記緩衝液に溶解することによりタンパク質含有緩衝液を調製するタンパク質含有緩衝液調製工程と、前記タンパク質含有緩衝液にリン酸カルシウムを接触させるリン酸カルシウム接触工程とを含んでいることを特徴とする。

【0014】

前記タンパク質含有緩衝液調製工程において、前記タンパク質含有緩衝液調製工程において、０．０５～５ｍｇ・ｍＬ^-1の範囲でタンパク質を前記緩衝液に溶解することによりタンパク質含有緩衝液を調製することが好ましい。

【0015】

本発明のリン酸カルシウムは、吸着等温線の理論値を超えるタンパク質が集積されていることを特徴とする。

【0016】

ＯＣＰ等のリン酸カルシウム結晶相に関する過飽和度（ＤＳ）が、カルシウムイオン濃度を変えることによって、２５～４５℃、ｐＨ６～８の緩衝液におけるリン酸カルシウムへのＢＳＡ等のタンパク質の集積が影響されるという知見に基づいて本発明に到った。当該ＤＳ値が増加するにつれて、リン酸カルシウムへのＢＳＡの吸着量は増加した。さらに、新たに形成されたリン酸カルシウムは、ＤＳ値を増加させるだけでなく、タンパク質のより低い平衡濃度範囲でも促進された。タンパク質の集積容量の増加は吸着材としてのリン酸カルシウム上のリン酸カルシウムの形成に関連していると推定される。ＤＳ値だけでなく集積されるタンパク質の濃度にも依存するリン酸カルシウム結晶の形成が、インビボ条件に置かれた場合、リン酸カルシウム表面上のタンパク質の吸着量を制御することを示唆している。

【図面の簡単な説明】

【0017】

【図1】Ｃａ１．５Ｐ１．０またはＣａ３．０Ｐ１．０溶液におけるＢＳＡの平衡濃度に対するＯＣＰの単位面積当たりの吸着量の測定結果に関する説明図。

【図2A】Ｃａ１．５Ｐ１．０のＢＳＡ溶液中でのインキュベーション前後のＯＣＰのＸＲＤパターンの測定結果に関する説明図。

【図2B】Ｃａ３．０Ｐ１．０のＢＳＡ溶液中でのインキュベーション前後のＯＣＰのＸＲＤパターンの測定結果に関する説明図。

【図3A】Ｃａ１．５Ｐ１．０でのインキュベーション後のＯＣＰの１５００～１８００ｃｍ^－１の範囲の拡大ラマンスペクトルの測定結果に関する説明図。

【図3B】Ｃａ３．０Ｐ１．０でのインキュベーション後のＯＣＰの１５００～１８００ｃｍ^－１の範囲の拡大ラマンスペクトルの測定結果に関する説明図。

【図4A】インキュベーション前のＯＣＰの明視野像。

【図4B】０．５０ｍｇ・ｍＬ^-1のＢＳＡを含有するＣａ３．０Ｐ１．０溶液中でのインキュベーション後の試料の明視野像。

【発明を実施するための形態】

【0018】

本発明の一実施形態としてのリン酸カルシウムに細胞活性化タンパク質を集積させる方法は、（１）緩衝液調整工程と、（２）細胞活性化タンパク質含有緩衝液調整工程と、（３）リン酸カルシウム接触工程と、を含んでいる。

【0019】

（１）緩衝液調製工程において、１～５ｍＭのカルシウムイオンおよび０．５～３ｍＭの無機リン酸イオンを含有し、２５～４５℃でｐＨ６～８に調整された緩衝液が調製される。（２）タンパク質含有緩衝液調製工程において、緩衝液のカルシウムイオン含有量が１～５ｍＭの場合には０．０１～１０ｍｇ・ｍＬ^-1の範囲でタンパク質を前記緩衝液に溶解することによりタンパク質含有緩衝液が調製される。（３）リン酸カルシウム接触工程において、タンパク質含有緩衝液にリン酸カルシウムを接触させる。

【0020】

タンパク質含有緩衝液調製工程において、０．０５～５ｍｇ・ｍＬ^-1の範囲でタンパク質を前記緩衝液に溶解することによりタンパク質含有緩衝液を調製することが好ましい。

【0021】

本発明の一実施形態としてのリン酸カルシウムは、吸着等温線の理論値を超えるタンパク質が吸着されている。

【0022】

「リン酸カルシウム」には、リン酸二水素カルシウム（Ｃａ（Ｈ₂ＰＯ₄）₂）（ＭＣＰＡ）、リン酸二水素カルシウム一水和物（Ｃａ（Ｈ₂ＰＯ₄）₂・Ｈ₂Ｏ）（ＭＣＰＭ）、リン酸一水素カルシウム（ＣａＨＰＯ₄）（ＤＣＰＡ）、リン酸一水素カルシウム二水和物（ＣａＨＰＯ₄・２Ｈ₂Ｏ）（ＤＣＰＤ）、リン酸三カルシウム（Ｃａ₃（ＰＯ₄）₂）（ＴＣＰ）、リン酸八カルシウム（Ｃａ₈Ｈ₂（ＰＯ₄）₆・５Ｈ₂Ｏ）（ＯＣＰ）、水酸アパタイト（Ｃａ₁₀（ＰＯ₄）₆（ＯＨ）₂）（ＨＡＰ、ＨＡ（ハイドロキシアパタイト）、フッ素アパタイト（Ｃａ₁₀（ＰＯ₄）₆Ｆ₂）（ＦＡＰ，フルオロアパタイト）、塩素アパタイト（Ｃａ₁₀（ＰＯ₄）₆Ｃｌ₂）（クロロアパタイト）、炭酸アパタイト（炭酸含有水酸アパタイト）、アモルファスリン酸カルシウム（非晶質リン酸カルシウム、ＡＣＰ）、リン酸四カルシウム（Ｃａ₄Ｐ₂Ｏ₉）（ＴＴＣＰ）およびピロリン酸カルシウム（Ｃａ₂Ｐ₂Ｏ₇）などが含まれている。

【0023】

「タンパク質」には、ＢＭＰ－２ やＢＭＰ－７など一連のＢＭＰ、ＴＦＧ－β、ｂＦＧＦ、ＦＧＦ－２、ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、ＮＧＦ、ＢＤＮＦ、Ｇ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＥＰＯ、ＨＧＦ、ＩＧＦ、ＳＤＦ－１、ＶＥＧＦ、ホルモン、サイトカインおよびケモカインなどの各種成長因子が含まれている。また、アルブミンを含む血清由来タンパク質もリン酸カルシウム等の生体材料の生体親和性向上に寄与すると考えられている。（例えば非特許文献８、１５参照）

【0024】

（実施例）
本発明を以下の実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。

【0025】

（１．材料と方法）
（１．１ ＯＣＰの調製）
ＯＣＰは、湿式合成法（非特許文献２参照）にしたがって、酢酸カルシウムとリン酸水素ナトリウムの水溶液とを混合することによって合成された。溶液から回収した沈殿物を、脱イオン水を用いて洗浄した。沈殿物が１０５℃で乾燥した後、沈殿物を粉砕し試験用篩（２７０メッシュ）を通過させ、直径５３μｍ未満および比表面積１６ｍ²・ｇ^-1のＯＣＰの顆粒を得た（非特許文献７参照）。

【0026】

（１．２ 吸着実験）
ＨＡおよびＯＣＰに関して異なる過飽和度（ＤＳ）を有する溶液を得るため、ＣａＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏ、Ｋ₂ＨＰＯ₄、およびトリスヒドロキシメチルアミノメタン（Ｔｒｉｓ）（富士フィルム和光純薬社製）超純水に添加し、１．５ｍＭ（Ｍ＝ｍｏｌ・Ｌ^-1）のカルシウムイオン（Ｃａ²⁺）および１．０ｍＭの無機リン酸（Ｐｉ）イオンまたは３．０ｍＭのＣａ²⁺および１．０ｍＭのＰｉイオンを含有する１５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液を調製した。緩衝液のｐＨはＨＣｌ溶液を用いてｐＨ７．４（３７℃）に調整した。続いて各緩衝液に、０、０．２０、０．２５、０．５０、０．７５、１．０、 １．５ｍｇ・ｍＬ^-1のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、分子量：６６ｋＤａ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製））を添加した（調製用液）。

【0027】

過飽和条件下でのＯＣＰに対するＢＳＡの吸着挙動を分析するため、１５ｍｇのＯＣＰの顆粒を、３ｍＬ、３７℃の各調製溶液中に浸漬し転倒撹拌で１時間インキュベートした。混合物を３９００ｒｐｍで３分間遠心分離し、上清中のＢＳＡ濃度をＣＢＢプロテインアッセイ溶液（ナカライテスク社製）を用いて測定した（ブラッドフォード法）。試料はＣａ_xＰ_yＢＳＡ_zと表わされる。ここで、ｘ、ｙおよびｚのそれぞれは、吸着実験で用いた溶液中のＣａ²⁺（Ｃａ）、Ｐｉイオン（Ｐ）およびＢＳＡのそれぞれの濃度を示している。

【0028】

（１．３ Ｃａ²⁺およびＰｉイオン濃度の測定とＤＳの計算）
カルシウムＥテストワコーおよびホスファＣテストワコー（富士フイルム和光純薬社）のそれぞれを用いて、ＯＣＰの存在下および非存在下でのインキュベーション前後の、調製溶液中のＣａ²⁺およびＰｉイオンそれぞれの濃度を測定した。

【0029】

上清中のＣａ²⁺およびＰｉイオンの分析値を用いてインキュベーション前後の調製溶液中のＨＡ、ＯＣＰおよびリン酸水素カルシウム二水和物（ＤＣＰＤ）に関するＤＳ値を計算し、それぞれのリン酸カルシウム相について熱力学的安定性を推定した。ＤＳ値は、３７℃、ｐＨ７．４におけるＣａ²⁺、Ｍｇ²⁺およびＰｉイオンの３つのマスバランスを考慮して計算した（非特許文献１６、１７参照）。この計算では、溶液中にＨＣＯ^3-が存在すると仮定し、イオン対（ＣａＨ₂ＰＯ₄ ⁺、ＣａＨＰＯ₄ ⁰、ＭｇＨＰＯ₄ ⁰、ＣａＨＣＯ₃ ⁺およびＭｇＨＣＯ₃ ⁺）の存在を考慮した。ただし、計算に際してＢＳＡの存在は勘案されず、Ｍｇ²⁺の濃度はほぼゼロに設定している。さらに、１５０ｍＭのトリス濃度の代わりに１５０ｍＭのＮａ⁺のバックグラウンド電解質を計算に用いた。ＤＳ値は、関係式（１）にしたがって、ＨＡ、ＯＣＰおよびＤＣＰＤに関するイオン活動積（ＩＰ）および溶解度積（Ｋｓｐ）により計算した。

【0030】

ＤＳ＝（ＩＰ／Ｋｓｐ）^1/ν ‥（１）。

【0031】

ここで、νはリン酸カルシウム中のイオンの数である（ＨＡのνは「９」、ＯＣＰのνは「８」、ＤＣＰＤのνは「２」である。）。ＨＡ、ＯＣＰおよびＤＣＰＤのそれぞれの溶解度積は７．３６×１０^-60（ｍｏｌ・Ｌ^-1）⁹、２．５１×１０^-49（ｍｏｌ・Ｌ^-1）⁸、および２．７７×１０^-7（ｍｏｌ・Ｌ^-1）²（非特許文献１９参照）のそれぞれである。ＤＳ値が「１．０」、「１．０未満」および「１．０超」の場合、それぞれ「飽和」、「不飽和」および「過飽和」であることを示す。

【0032】

（１．４ 過飽和溶液に浸漬する前後のＯＣＰのキャラクタリゼーション）
調製溶液中でインキュベートしたＯＣＰの顆粒を超純水で数回洗浄した後、凍結乾燥した。

【0033】

調製溶液に浸漬する前のＯＣＰ、および浸漬後のＯＣＰを、粉末Ｘ線回折装置（ＸＲＤ， ＭｉｎｉＦｌｅｘ ６００（株式会社リガク製））を用いて分析した。測定は、単色ＣｕＫα線、４０ｋＶ、１５ｍＡで、走査速度１．０°・ｍｉｎ^-1、走査範囲は２θ＝３°から６０°までステップ幅０．０２°で行った。

【0034】

また、インキュベーション前後のＯＣＰを、光学顕微鏡を備えたラマン分光計（Ｍｏｄｅｌ Ａｐａｒａｍａｎ（ＬＩＣＩＲ社製））を用いて分析し、ＢＳＡ由来のスペクトルの有無を確認した。

【0035】

インキュベーション前後のＯＣＰ結晶を透過型電子顕微鏡（ＦＥ－ＴＥＭ；ＪＥＭ－２１００Ｆ（日本電子株式会社製））で観察しＴＥＭの明視野像を得た。

【0036】

（２．結果）
（２．１ 異なるＤＳを有する溶液中のＯＣＰへのＢＳＡ集積容量の測定）
図１には、各調製溶液における、ＢＳＡの平衡濃度に対するＯＣＰの単位面積当たりの吸着量が示されている。値は独立した３回の実験から得られた平均値を用いグラフのエラーバーは標準偏差値（ＳＤ）を示している。図１に示されている破線は、本発明者らによって報告された、３７℃、ｐＨ７．４におけるＯＣＰについての飽和状態でのＯＣＰへのＢＳＡの吸着等温線を表わしており、ラングミュア式（関係式（２）参照）に基づいて得られた吸着定数から算出した結果のプロットである。（非特許文献１１参照）。

【0037】

Ｑ＝ＫＱ₀Ｃ／（１＋ＫＣ） ‥（関係式（２））。

【0038】

ここで、Ｑは吸着材への吸着質の吸着量、Ｃは吸着質の平衡濃度、Ｋは平衡定数、Ｑ₀は吸着質の飽和容量である。ＫおよびＱ₀の定数は、それぞれ１５２０ｍＬ・μｍｏｌ^-1と０．０５４μｍｏｌ・ｍ^-2であり、これらは以前の吸着等温線から得られた（非特許文献１１参照）。

【0039】

図１からわかるように、Ｃａ１．５Ｐ１．０およびＣａ３．０Ｐ１．０の吸着等温線はいずれもラングミュア式に従わず、特にＢＳＡの平衡濃度の比較的低い範囲において理論値を大きく上回る値を示した。

【0040】

（２．２ 緩衝液中のＣａ²⁺およびＰｉイオン濃度の測定とＤＳ値の計算）

【0041】

表１には、ＯＣＰ顆粒へのＢＳＡ集積の間における溶液中のＣａ²⁺およびＰｉイオン濃度の変化の測定結果が示されている。Ｃａ１．５Ｐ１．０およびＣａ３．０Ｐ１．０溶液中のこれらのイオン濃度は、ＯＣＰ顆粒の浸漬後に減少した。これらの溶液中の計算されたＤＳ値は、初期のＤＳおよびＢＳＡ濃度にかかわらず、ＯＣＰとのインキュベーション後に減少した。

【0042】

【表1】

【0043】

これらのＤＳ値のオーダーは、ＨＡ、ＯＣＰおよびＤＣＰＤのそれぞれに関して１０⁸～１０¹²、１０⁰～１０¹および１０^-1のそれぞれであり、これはインキュベーション後のこれらの溶液がそれぞれＨＡおよびＯＣＰに関して過飽和およびわずかに過飽和であることを示している。ＨＡおよびＯＣＰに関するＤＳ値は、Ｃａ１．５Ｐ１．０と比較して、Ｃａ３．０Ｐ１．０の方が高い傾向があった。

【0044】

（２．３ ＢＳＡを含む緩衝液に浸す前後のＯＣＰのキャラクタリゼーション）
（２．３．１ ＸＲＤ分析）
図２Ａに、Ｃａ１．５Ｐ１．０の調製溶液中でのインキュベーション前後のＯＣＰのＸＲＤパターンを示す。また、図２Ｂは、Ｃａ３．０ Ｐ１．０の調製溶液中でのインキュベーション前後のＯＣＰのＸＲＤパターンである。ＯＣＰ結晶構造の（１００）、（０１０）および（００２）面に対応するピークは、それぞれ２θ＝４．７°、９．８°および２６°に検出される。ＯＣＰの（１００）に対応するピークの強度はわずかに減少したが、これらの特徴的なＯＣＰのピークは、調製溶液のＤＳ値およびＢＳＡ濃度にかかわらず、インキュベーション後にも検出された。また、インキュベーション後のパターンでは、ＨＡなどの他のリン酸カルシウムの結晶相に起因するピークは認められなかった。

【0045】

（２．３．２ ラマン分光法）
図３Ａ、３Ｂにはそれぞれ、Ｃａ１．５Ｐ１．０およびＣａ３．０Ｐ１．０でのインキュベーション前後のＯＣＰの１５００～１８００ｃｍ^-1の範囲のラマンスペクトルを示した。インキュベーション後のスペクトルは代表としてＢＳＡ０およびＢＳＡ０．５０のものを示した。図３Ａおよび図３Ｂからわかるように、ＢＳＡを含む調製溶液に浸漬したＯＣＰのスペクトルでは、ＢＳＡのアミドＩＩＩ、トリプシンおよびフェニルアラニンのアミノ酸、ならびにアミドＩに起因するピークが、１５４８ｃｍ^-1、１６０４ｃｍ^-1および１６５３ｃｍ^-1のそれぞれにおいて認められた（非特許文献１８参照）。

【0046】

（２．３．３ ＴＥＭ観察）
図４Ａ、図４Ｂのそれぞれには、インキュベーション前のＯＣＰおよび０．５０ｍｇ・ｍＬ^-1のＢＳＡを含有するＣａ３．０Ｐ１．０でのインキュベーション後のＯＣＰの明視野像が示されている。図４Ａの弱拡大像に示されているように、ＯＣＰ結晶の典型的な形態である板状構造を有する粒子が観察された。図４Ｂの弱拡大像に示されているように、この板状構造はインキュベーション後でも維持されていた。図４Ａの強拡大像に示されているように、インキュベーション前のＯＣＰは平滑な表面を有していた。これに対し、図４Ｂの強拡大像に示されているように、調製溶液中でインキュベーションされたＯＣＰの表面に多数の凹凸が観察された。

【0047】

（２．３．４ キャラクタリゼージョン）
上記のインキュベーション後の調製溶液中のカルシウムイオンおよび無機リン酸イオン濃度の減少、ＸＲＤパターン、ＴＥＭ像の結果から、ＴＥＭ像で見られる表面の多数の凹凸は微細なＯＣＰ結晶であることが示唆される。
この結晶は核形成を経て、元の結晶あるいは新たに析出した結晶のいずれかが成長したものであると考えられる。

【0048】

（２．３．５ タンパク質の吸着）
本発明がラングミュア式で示される吸着等温線を超え効率よくタンパク質を集積させることができるのは、上記によって新たにタンパク質の吸着サイトが出現し、あるいは析出の際にタンパク質を取り込むことによるためであると考えられる。

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図3A】

【図3B】

【図4A】

【図4B】