(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-05-23
(45)【発行日】2024-05-31
(54)【発明の名称】ナチュラルキラー細胞の増殖方法
(51)【国際特許分類】
C12N 5/0783 20100101AFI20240524BHJP
C12N 15/12 20060101ALN20240524BHJP
【ＦＩ】
C12N5/0783
C12N15/12
【請求項の数】
16
(21)【出願番号】P 2022552879
(86)(22)【出願日】2021-03-02
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2023-04-19
(86)【国際出願番号】 US2021020430
(87)【国際公開番号】W WO2021178383
(87)【国際公開日】2021-09-10
【審査請求日】2022-11-01
(31)【優先権主張番号】62/984,060
(32)【優先日】2020-03-02
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(73)【特許権者】
【識別番号】505008028
【氏名又は名称】中央研究院
【氏名又は名称原語表記】ＡＣＡＤＥＭＩＡ ＳＩＮＩＣＡ
【住所又は居所原語表記】１２８ Ａｃａｄｅｍｉａ Ｒｏａｄ，Ｓｅｃｔｉｏｎ ２，Ｎａｎｋａｎｇ Ｔａｉｐｅｉ，Ｔａｉｗａｎ
(74)【代理人】
【識別番号】100094569
【弁理士】
【氏名又は名称】田中 伸一郎
(74)【代理人】
【識別番号】100103610
【弁理士】
【氏名又は名称】▲吉▼田 和彦
(74)【代理人】
【識別番号】100109070
【弁理士】
【氏名又は名称】須田 洋之
(74)【代理人】
【識別番号】100119013
【弁理士】
【氏名又は名称】山崎 一夫
(74)【代理人】
【識別番号】100123777
【弁理士】
【氏名又は名称】市川 さつき
(74)【代理人】
【識別番号】100111796
【弁理士】
【氏名又は名称】服部 博信
(74)【代理人】
【識別番号】100123766
【弁理士】
【氏名又は名称】松田 七重
(74)【代理人】
【識別番号】100202603
【弁理士】
【氏名又は名称】宮崎 智史
(72)【発明者】
【氏名】フ チェ－ミン ジャック
(72)【発明者】
【氏名】チェン シー－ユ
(72)【発明者】
【氏名】ワン イ－フ
(72)【発明者】
【氏名】シェ ワン－チェン
(72)【発明者】
【氏名】ツェン イ－シウアン
(72)【発明者】
【氏名】ル ヤ－ティン
(72)【発明者】
【氏名】リン ジュン－チェン
(72)【発明者】
【氏名】シュ チュン－ヤオ
【審査官】北村 悠美子
(56)【参考文献】
【文献】Methods in Molecular Biology，Vol.1441, pp.167-174，<DOI 10.1007/978-1-4939-3684-7_14>
【文献】NATURE COMMUNICATIONS，2019年，Vol.10, 1057，<https://doi.org/10.1038/s41467-019-09049-5>
【文献】Biol Blood Marrow Transplant，2015年，Vol.21, pp.632-639，<http://dx.doi.org/10.1016/j.bbmt.2014.12.037>
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ ５／００－５／２８
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ナチュラルキラー細胞を増殖する方法であって、それぞれがゲル化された内部、および個々にまたは集合的にナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の増殖を刺激することができる１種または複数の膜結合タンパク質を含有する流体細胞膜を含む内部ゲル化細胞の集団を準備する工程、ならびに
ＮＫ細胞の増殖を可能にする条件下で、１種または複数の膜結合タンパク質に応答することができるＮＫ細胞を含有する細胞の集団を、前記内部ゲル化細胞の集団と共に培養する工程を含み、
前記内部ゲル化細胞の集団が、
前記１種または複数の膜結合タンパク質を発現する抗原提示細胞の集団を準備する工程、
プロテアーゼ阻害剤カクテルを含有し、フェノールレッドを含まないＤＭＥＭに前記抗原提示細胞の集団を懸濁して第１の細胞懸濁液を生成する工程、
ゲル化溶液を前記第１の細胞懸濁液に添加して、第２の細胞懸濁液を生成する工程であり、前記ゲル化溶液が前記抗原提示細胞の膜透過性を増加させることができ、光反応性架橋剤および任意に光開始剤を含有する工程、
前記光反応性架橋剤および任意に前記光開始剤が前記抗原提示細胞に入るのを可能にするのに十分な時間、室温で前記第２の細胞懸濁液をインキュベートする工程、
前記第２の細胞懸濁液を遠心分離して細胞ペレットを生成する工程、
前記細胞ペレットをフェノールレッドを含まないＤＭＥＭに再懸濁して、第３の細胞懸濁液を生成する工程、
前記光反応性架橋剤の架橋結合を可能にするのに十分な時間、前記第３の細胞懸濁液に光を当て、それによって前記内部ゲル化細胞の集団を生成する工程、ならびに
前記内部ゲル化細胞の集団を収集し、洗浄する工程を含む手順によって生成される、
方法。
【請求項2】
前記細胞集団が、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、濃縮ＮＫ細胞、ｉＰＳＣ由来ＮＫ細胞、胚性幹細胞由来ＮＫ細胞、組織常在性ＮＫ細胞、脾細胞、臍帯血細胞、および造血幹細胞由来ＮＫ細胞からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記１種または複数の膜結合タンパク質が、４１ＢＢＬ、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、Ｂ７－Ｈ６、ＢＡＴ３、ＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｃ２、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｇ、ＨＬＡ－Ｆ、ＨＬＡ－Ｃ、ＭＩＣＡ／ＭＩＣＢ、ＵＬＢＰ－１、ＵＬＢＰ－２、ＵＬＢＰ－３、ＵＬＢＰ－４、ＵＬＢＰ－５、ＵＬＢＰ－６、ＡＩＣＬ、ＣＤ４８、ＮＴＢ－Ａ、２Ｂ４、ＣＤ２、ＣＤ５８、ＣＤ１１ａ、ＩＣＡＭ１、ＣＲＡＣＣ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ１３７Ｌ、ネクチン－１、ネクチン－２、ネクチン－３、ネクチン－４、ｎｅｃｌ－１、ｎｅｃｌ－２、ｎｅｃｌ－３、ｎｅｃｌ－４、ｎｅｃｌ－５、ＰＣＮＡ、ＡＩＣＬ、ＩｇＧ、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ７２、ＣＥＡＣＡＭ－１、ＣＥＡＣＡＭ－５、ＯＣＩＬ、Ｎ－カドヘリン、Ｅ－カドヘリン、Ｒ－カドヘリン、シアル酸、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－９、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、ＩＬ－２７、ＩＬ－３３、ＩＬ－６、ＩＬ－１１、ＣＮＴＦ、ＬＩＦ、ＯＳＭ、ＣＴ－１、ＣＬＣ、ＩＦＮ－ａ、ＩＮＦ－ｂ、ＣＣＬ－５、およびＴＬＲ－１のアゴニスト、ＴＬＲ－２のアゴニスト、ＴＬＲ－３のアゴニスト、ＴＬＲ－５のアゴニスト、ＴＬＲ－６のアゴニスト、ＴＬＲ－９のアゴニスト、ＮＯＤ－１のアゴニスト、ＮＯＤ－２のアゴニスト、ＮＯＤ－３のアゴニスト、またはＮＬＲＰ３アゴニストからなる群から選択される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項4】
前記１種または複数の膜結合タンパク質が４１ＢＢＬおよびＩＬ－１５を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項5】
前記培養工程が、ＩＬ－２１またはＩＬ－２の存在下で実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項6】
前記培養工程におけるＮＫ細胞数の内部ゲル化細胞数に対する比が１：０．５～２０である、請求項１に記載の方法。
【請求項7】
前記ゲル化溶液が、前記第２の細胞懸濁液が３２０ｍＯｓｍｏｌ～２９０ｍＯｓｍｏｌ、３２０ｍＯｓｍｏｌを超える、または２９０ｍＯｓｍｏｌ未満の浸透圧濃度を有するように調製される、請求項１に記載の方法。
【請求項8】
前記第２の細胞懸濁液が０．１～５質量％のＤＭＳＯを含有する、請求項１に記載の方法。
【請求項9】
前記第２の細胞懸濁液中の前記光反応性架橋剤の濃度が、５質量％～５０質量％である、請求項１に記載の方法。
【請求項10】
前記光反応性架橋剤がポリ（エチレングリコール）ジアクリレート（ＰＥＧ－ＤＡ）であり、前記光開始剤が２－ヒドロキシ－４’－（２－ヒドロキシエトキシ）－２－メチルプロピオフェノンであり、前記光が３６５ｎｍの青色光である、請求項１に記載の方法。
【請求項11】
前記２－ヒドロキシ－４’－２（－ヒドロキシエトキシ）－２－メチルプロピオフェノンが０．０１～１質量％の範囲であり、前記ＰＥＧ－ＤＡが前記ゲル化溶液中２～８０質量％の範囲で、２００Ｄａ～５０００Ｄａの平均分子量を有する、請求項１０に記載の方法。
【請求項12】
前記ゲル化溶液が、２－ヒドロキシ－４’－（２－ヒドロキシエトキシ）－２－メチルプロピオフェノンをジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解して溶液を作製し、前記溶液を平均分子量７００ＤａのＰＥＧ－ＤＡと混合することによって調製される、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
前記第２の細胞懸濁液中のＰＥＧ－ＤＡの濃度が、１０質量％～４０質量％である、請求項１０に記載の方法。
【請求項14】
前記抗原提示細胞の集団が人工抗原提示細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項15】
前記人工抗原提示細胞が、Ｋ５６２細胞、ＰＢＭＣ、ＥＢＶ形質転換ＬＣＬ、７２１．２２１細胞、８８６６細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞、Ｊｕｒｋａｔ／ＫＬ－１細胞、Ｕ９３７細胞、ＢＪＡＢ細胞、ＮＢ４細胞、２９３Ｔ細胞、ＭＣＦ７細胞、Ｊｅｇ３細胞、Ｈｅｌａ細胞、Ａ５４９細胞、１１０６ｍｅｌ細胞、もしくはＣＥＭ細胞であるか、またはそれらから操作される、請求項１４に記載の方法。
【請求項16】
がん、感染症、自己免疫疾患またはＮＫ細胞欠損状態を治療する医薬組成物を製造するための、請求項１～１５のいずれか１項に記載の方法によって増殖されたＮＫ細胞の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
相互参照
本出願は、２０２０年３月２日に出願された米国特許仮出願第６２／９８４，０６０号の優先権を主張し、その内容全体を参照によって本明細書に組み入れる。
本出願は、２０２０年３月２日に出願された米国特許仮出願第６２／９８４，０６０号の優先権を主張し、その内容全体を参照によって本明細書に組み入れる。
【背景技術】
【0002】
末梢血リンパ球の１０～１５％を構成するナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、事前に感作しなくてもがんやウイルス感染細胞を殺傷する生来の能力を有するので、免疫監視において重要な役割を果たしている。Abel et al., Front. Immunol. 9, 1869 (2018); Cerwenka and Lanier, Nat. Rev. Immunol. 16, 112-123 (2016)；Adams et al. J. Immunol. 197, 2963-2970 (2016)；およびChiossone et al., Nat. Rev. Immunol. 18, 671-688 (2018)を参照のこと。ＮＫ細胞は、ＣＤ５６の表面発現およびＴ細胞マーカーＣＤ３の欠如によって特定される。ＮＫ細胞のサブセットは、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を補助することによってＮＫ細胞の細胞傷害機能を強化するＦｃγＲＩＩＩタンパク質であるＣＤ１６を発現する。Cerwenka and Lanier, Nat. Rev. Immunol. 16, 112-123 (2016)；Adams et al. J. Immunol. 197, 2963-2970 (2016)；およびFreud et al., Immunity 47, 820-833 (2017)を参照のこと。
【0003】
ＮＫ細胞の機能は、細胞表面活性化および抑制性受容体のファミリーによって主に制御されている。活性化シグナルは、ストレス誘導性タンパク質ＭＩＣＡを含むリガンドを認識するＮＫＧ２Ｄなどの受容体を活性化することによって伝達される。抑制性受容体は、正常細胞では普遍的に発現し、がん細胞ではしばしば下方制御されるＭＨＣクラスＩなどの分子を認識する。活性化受容体と抑制性受容体とのバランスをモニターすることによって、ＮＫ細胞は、感染細胞またはがん細胞などのストレスを受けた細胞を認識して殺傷することができる。Cerwenka and Lanier, Nat. Rev. Immunol. 16, 112-123 (2016)；Chiossone et al., Nat. Rev. Immunol. 18, 671-688 (2018)；およびFujisaki et al., Cancer Res. 69, 4010-4017 (2009)を参照のこと。
ＮＫ細胞は、多数のマウスモデルおよびヒトの研究に基づいた腫瘍免疫監視に関与している。それらの強力な抗腫瘍活性を考慮すると、ＮＫ細胞を使用した養子細胞療法は、がんに対する魅力的な治療方法である。Cerwenka and Lanier, Nat. Rev. Immunol. 16, 112-123 (2016)；Fujisaki et al., Cancer Res. 69, 4010-4017 (2009)；Cheung et al., Nat. Rev. Cancer 13, 397-411 (2013)；およびBrodeur et al., Nat. Rev. Cancer 3, 203-216 (2003)を参照のこと。
したがって、臨床用途のために非常に強力なＮＫ細胞を多数取得する増殖系を確立する必要がある。
ＮＫ細胞は、多数のマウスモデルおよびヒトの研究に基づいた腫瘍免疫監視に関与している。それらの強力な抗腫瘍活性を考慮すると、ＮＫ細胞を使用した養子細胞療法は、がんに対する魅力的な治療方法である。Cerwenka and Lanier, Nat. Rev. Immunol. 16, 112-123 (2016)；Fujisaki et al., Cancer Res. 69, 4010-4017 (2009)；Cheung et al., Nat. Rev. Cancer 13, 397-411 (2013)；およびBrodeur et al., Nat. Rev. Cancer 3, 203-216 (2003)を参照のこと。
したがって、臨床用途のために非常に強力なＮＫ細胞を多数取得する増殖系を確立する必要がある。
【発明の概要】
【0004】
１つまたは複数の実施形態の詳細は、添付の図面および以下の説明に記載されている。実施形態の他の特徴、目的、および利点は、説明および図面、ならびに特許請求の範囲から明らかになるであろう。
一態様では、ナチュラルキラー細胞の増殖方法が本明細書で記載されている。この方法は、それぞれがゲル化された内部、および個々にまたは集合的にナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の増殖を刺激することができる１種または複数の膜結合タンパク質を含有する流体細胞膜を含む内部ゲル化細胞の集団を準備する工程、ならびにＮＫ細胞の増殖を可能にする条件下で、１種または複数の膜結合タンパク質に応答することができるＮＫ細胞を含有する細胞の集団を、内部ゲル化細胞の集団と共に培養する工程を含む。
一部の実施形態では、細胞集団は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、濃縮ＮＫ細胞、ｉＰＳＣ由来ＮＫ細胞、胚性幹細胞由来ＮＫ細胞、組織常在性ＮＫ細胞、脾細胞、臍帯血細胞、および造血幹細胞由来ＮＫ細胞からなる群から選択される。
一態様では、ナチュラルキラー細胞の増殖方法が本明細書で記載されている。この方法は、それぞれがゲル化された内部、および個々にまたは集合的にナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の増殖を刺激することができる１種または複数の膜結合タンパク質を含有する流体細胞膜を含む内部ゲル化細胞の集団を準備する工程、ならびにＮＫ細胞の増殖を可能にする条件下で、１種または複数の膜結合タンパク質に応答することができるＮＫ細胞を含有する細胞の集団を、内部ゲル化細胞の集団と共に培養する工程を含む。
一部の実施形態では、細胞集団は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、濃縮ＮＫ細胞、ｉＰＳＣ由来ＮＫ細胞、胚性幹細胞由来ＮＫ細胞、組織常在性ＮＫ細胞、脾細胞、臍帯血細胞、および造血幹細胞由来ＮＫ細胞からなる群から選択される。
【0005】
一部の実施形態では、１種または複数の膜結合タンパク質は、４１ＢＢＬ、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、Ｂ７－Ｈ６、ＢＡＴ３、ＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｃ２、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｇ、ＨＬＡ－Ｆ、ＨＬＡ－Ｃ、ＭＩＣＡ／ＭＩＣＢ、ＵＬＢＰ－１、ＵＬＢＰ－２、ＵＬＢＰ－３、ＵＬＢＰ－４、ＵＬＢＰ－５、ＵＬＢＰ－６、ＡＩＣＬ、ＣＤ４８、ＮＴＢ－Ａ、２Ｂ４、ＣＤ２、ＣＤ５８、ＣＤ１１ａ、ＩＣＡＭ１、ＣＲＡＣＣ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ１３７Ｌ、ネクチン－１、ネクチン－２、ネクチン－３、ネクチン－４、ｎｅｃｌ－１、ｎｅｃｌ－２、ｎｅｃｌ－３、ｎｅｃｌ－４、ｎｅｃｌ－５、ＰＣＮＡ、ＡＩＣＬ、ＩｇＧ、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ７２、ＣＥＡＣＡＭ－１、ＣＥＡＣＡＭ－５、ＯＣＩＬ、Ｎ－カドヘリン、Ｅ－カドヘリン、Ｒ－カドヘリン、シアル酸、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－９、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、ＩＬ－２７、ＩＬ－３３、ＩＬ－６、ＩＬ－１１、ＣＮＴＦ、ＬＩＦ、ＯＳＭ、ＣＴ－１、ＣＬＣ、ＩＦＮ－ａ、ＩＮＦ－ｂ、ＣＣＬ－５、およびＴＬＲ－１のアゴニスト、ＴＬＲ－２のアゴニスト、ＴＬＲ－３のアゴニスト、ＴＬＲ－５のアゴニスト、ＴＬＲ－６のアゴニスト、ＴＬＲ－９のアゴニスト、ＮＯＤ－１のアゴニスト、ＮＯＤ－２のアゴニスト、ＮＯＤ－３のアゴニスト、またはＮＬＲＰ３アゴニストからなる群から選択される。例えば、１種または複数の膜結合タンパク質は、４１ＢＢＬおよびＩＬ－１５を含むことができる。
【0006】
一部の実施形態では、培養工程は、ＩＬ－２１またはＩＬ－２の存在下で実施される。
一部の実施形態ではＮＫ細胞数のゲル化細胞数に対する比は、１：０．５～２０（例えば、１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、１：１２、１：１５、または１：２０）である。
一部の実施形態では、内部ゲル化細胞の集団は、１種または複数の膜結合タンパク質を発現する抗原提示細胞の集団を準備する工程、プロテアーゼ阻害剤カクテルを含有し、フェノールレッドを含まないＤＭＥＭに抗原提示細胞の集団を懸濁して第１の細胞懸濁液を生成する工程、ゲル化溶液を第１の細胞懸濁液に添加して、第２の細胞懸濁液を生成する工程であり、ゲル化溶液が抗原提示細胞の膜透過性を増加させることができ、光反応性架橋剤および任意に光開始剤を含有する工程、光反応性架橋剤および任意に光開始剤が抗原提示細胞に入るのを可能にするのに十分な時間、室温で第２の細胞懸濁液をインキュベートする工程、第２の細胞懸濁液を遠心分離して細胞ペレットを生成する工程、細胞ペレットをフェノールレッドを含まないＤＭＥＭに再懸濁して、第３の細胞懸濁液を生成する工程、光反応性架橋剤の架橋結合を可能にするのに十分な時間、第３の細胞懸濁液に光を当て、それによって内部ゲル化細胞の集団を生成する工程、ならびに内部ゲル化細胞の集団を収集し、洗浄する工程を含む手順によって生成される。
一部の実施形態ではＮＫ細胞数のゲル化細胞数に対する比は、１：０．５～２０（例えば、１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、１：１２、１：１５、または１：２０）である。
一部の実施形態では、内部ゲル化細胞の集団は、１種または複数の膜結合タンパク質を発現する抗原提示細胞の集団を準備する工程、プロテアーゼ阻害剤カクテルを含有し、フェノールレッドを含まないＤＭＥＭに抗原提示細胞の集団を懸濁して第１の細胞懸濁液を生成する工程、ゲル化溶液を第１の細胞懸濁液に添加して、第２の細胞懸濁液を生成する工程であり、ゲル化溶液が抗原提示細胞の膜透過性を増加させることができ、光反応性架橋剤および任意に光開始剤を含有する工程、光反応性架橋剤および任意に光開始剤が抗原提示細胞に入るのを可能にするのに十分な時間、室温で第２の細胞懸濁液をインキュベートする工程、第２の細胞懸濁液を遠心分離して細胞ペレットを生成する工程、細胞ペレットをフェノールレッドを含まないＤＭＥＭに再懸濁して、第３の細胞懸濁液を生成する工程、光反応性架橋剤の架橋結合を可能にするのに十分な時間、第３の細胞懸濁液に光を当て、それによって内部ゲル化細胞の集団を生成する工程、ならびに内部ゲル化細胞の集団を収集し、洗浄する工程を含む手順によって生成される。
【0007】
一部の実施形態では、ゲル化溶液は、第２の細胞懸濁液が３２０ｍＯｓｍｏｌ～２９０ｍＯｓｍｏｌ、３２０ｍＯｓｍｏｌを超える、または２９０ｍＯｓｍｏｌ未満の浸透圧濃度を有するように調製される。
一部の実施形態では、ゲル化溶液は、第２の細胞懸濁液が０．１～５質量％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含有するように、ＤＭＳＯを含有する。
一部の実施形態では、第２の細胞懸濁液中の光反応性架橋剤の濃度は、５質量％～５０質量％である。
一部の実施形態では、ゲル化溶液は、第２の細胞懸濁液が０．１～５質量％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含有するように、ＤＭＳＯを含有する。
一部の実施形態では、第２の細胞懸濁液中の光反応性架橋剤の濃度は、５質量％～５０質量％である。
【0008】
一部の実施形態では、光反応性架橋剤はポリ（エチレングリコール）ジアクリレート（ＰＥＧ－ＤＡ）であり、光開始剤は２－ヒドロキシ－４’－（２－ヒドロキシエトキシ）－２－メチルプロピオフェノンであり、光は３６５ｎｍの青色光である。例えば、２－ヒドロキシ－４’－２（－ヒドロキシエトキシ）－２－メチルプロピオフェノンはゲル化溶液中０．０１～１質量％の範囲であってもよく、ＰＥＧ－ＤＡはゲル化溶液中２～８０質量％の範囲で、２００Ｄａ～５０００Ｄａの平均分子量を有する。
一部の実施形態では、ゲル化溶液は、２－ヒドロキシ－４’－（２－ヒドロキシエトキシ）－２－メチルプロピオフェノンをＤＭＳＯに溶解して溶液を作製し、その溶液を平均分子量７００ＤａのＰＥＧ－ＤＡと混合することによって調製される。
一部の実施形態では、第２の細胞懸濁液中のＰＥＧ－ＤＡの濃度は、１０質量％～４０質量％である。
一部の実施形態では、抗原提示細胞の集団は人工抗原提示細胞である。例えば、人工抗原提示細胞は、Ｋ５６２細胞、ＰＢＭＣ、ＥＢＶ形質転換ＬＣＬ、７２１．２２１細胞、８８６６細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞、Ｊｕｒｋａｔ／ＫＬ－１細胞、Ｕ９３７細胞、ＢＪＡＢ細胞、ＮＢ４細胞、２９３Ｔ細胞、ＭＣＦ７細胞、Ｊｅｇ３細胞、Ｈｅｌａ細胞、Ａ５４９細胞、１１０６ｍｅｌ細胞、もしくはＣＥＭ細胞であり得るか、またはそれらから操作され得る。
一部の実施形態では、ゲル化溶液は、２－ヒドロキシ－４’－（２－ヒドロキシエトキシ）－２－メチルプロピオフェノンをＤＭＳＯに溶解して溶液を作製し、その溶液を平均分子量７００ＤａのＰＥＧ－ＤＡと混合することによって調製される。
一部の実施形態では、第２の細胞懸濁液中のＰＥＧ－ＤＡの濃度は、１０質量％～４０質量％である。
一部の実施形態では、抗原提示細胞の集団は人工抗原提示細胞である。例えば、人工抗原提示細胞は、Ｋ５６２細胞、ＰＢＭＣ、ＥＢＶ形質転換ＬＣＬ、７２１．２２１細胞、８８６６細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞、Ｊｕｒｋａｔ／ＫＬ－１細胞、Ｕ９３７細胞、ＢＪＡＢ細胞、ＮＢ４細胞、２９３Ｔ細胞、ＭＣＦ７細胞、Ｊｅｇ３細胞、Ｈｅｌａ細胞、Ａ５４９細胞、１１０６ｍｅｌ細胞、もしくはＣＥＭ細胞であり得るか、またはそれらから操作され得る。
【0009】
一部の実施形態では、この方法は、増殖したＮＫ細胞を、それを必要とする対象、例えば、がん、感染症、自己免疫疾患、ＮＫ細胞欠損状態、または望ましくない細胞を有する対象に投与することをさらに含む。
一態様では、本明細書では、本明細書で記載したゲル化細胞によって生成した増殖したＮＫ細胞を、それを必要とする対象に投与することを含む、疾患を治療する方法を記載する。一部の実施形態では、疾患は、がん、感染症、自己免疫障害、または古典的ＮＫ欠損症および機能的ＮＫ欠損症などのＮＫ細胞欠損状態、または望ましくない細胞を有する状態である。
一態様では、本明細書では、本明細書で記載したゲル化細胞によって生成した増殖したＮＫ細胞を、それを必要とする対象に投与することを含む、疾患を治療する方法を記載する。一部の実施形態では、疾患は、がん、感染症、自己免疫障害、または古典的ＮＫ欠損症および機能的ＮＫ欠損症などのＮＫ細胞欠損状態、または望ましくない細胞を有する状態である。
【0010】
別の態様では、本明細書では、内部ゲル化細胞の集団を生成する方法を記載する。この方法は、１種または複数の膜結合タンパク質を発現する前駆体細胞の集団を準備する工程、プロテアーゼ阻害剤カクテルを含有し、フェノールレッドを含まないＤＭＥＭに前駆体細胞の集団を懸濁して第１の細胞懸濁液を生成する工程、ゲル化溶液を第１の細胞懸濁液に添加して、第２の細胞懸濁液を生成する工程であり、ゲル化溶液が前駆体細胞の膜透過性を増加させることができ、光反応性架橋剤および任意に光開始剤を含有する工程、光反応性架橋剤および任意に光開始剤が前駆体細胞に入るのを可能にするのに十分な時間、室温で第２の細胞懸濁液をインキュベートする工程、第２の細胞懸濁液を遠心分離して細胞ペレットを生成する工程、細胞ペレットをフェノールレッドを含まないＤＭＥＭに再懸濁して、第３の細胞懸濁液を生成する工程、光反応性架橋剤の架橋結合を可能にするのに十分な時間、第３の細胞懸濁液に光を当て、それによって内部ゲル化細胞の集団を生成する工程、ならびに内部ゲル化細胞の集団を収集し、洗浄する工程を含み、内部ゲル化細胞それぞれがゲル化された内部および１種または複数の膜結合タンパク質を含有する流体細胞膜を含む。
【0011】
一部の実施形態では、ゲル化溶液は、第２の細胞懸濁液が３２０ｍＯｓｍｏｌ～２９０ｍＯｓｍｏｌ、３２０ｍＯｓｍｏｌを超える、または２９０ｍＯｓｍｏｌ未満の浸透圧濃度を有するように調製される。
一部の実施形態では、ゲル化溶液は、第２の細胞懸濁液が０．１～５質量％のＤＭＳＯを含有するように、ＤＭＳＯを含有する。
一部の実施形態では、第２の細胞懸濁液中の光反応性架橋剤の濃度は、５質量％～５０質量％である。
一部の実施形態では、ゲル化溶液は、第２の細胞懸濁液が０．１～５質量％のＤＭＳＯを含有するように、ＤＭＳＯを含有する。
一部の実施形態では、第２の細胞懸濁液中の光反応性架橋剤の濃度は、５質量％～５０質量％である。
【0012】
一部の実施形態では、光反応性架橋剤はポリ（エチレングリコール）ジアクリレート（ＰＥＧ－ＤＡ）であり、光開始剤は２－ヒドロキシ－４’－（２－ヒドロキシエトキシ）－２メチルプロピオフェノンであり、光は３６５ｎｍの青色光である。例えば、２－ヒドロキシ－４’－２（－ヒドロキシエトキシ）－２－メチルプロピオフェノンはゲル化溶液中０．０１～１質量％の範囲であってもよく、ＰＥＧ－ＤＡはゲル化溶液中２～８０質量％の範囲で、２００Ｄａ～５０００Ｄａの平均分子量を有してもよい。
【0013】
一部の実施形態では、ゲル化溶液は、２－ヒドロキシ－４’－（２－ヒドロキシエトキシ）－２－メチルプロピオフェノンをＤＭＳＯに溶解して溶液を作製し、その溶液を平均分子量７００ＤａのＰＥＧ－ＤＡと混合することによって調製される。
一部の実施形態では、第２の細胞懸濁液中のＰＥＧ－ＤＡの濃度は、１０質量％～４０質量％である。
一部の実施形態では、前駆体細胞の集団は人工抗原提示細胞である。例えば、人工抗原提示細胞は、Ｋ５６２細胞、ＰＢＭＣ、ＥＢＶ形質転換ＬＣＬ、７２１．２２１細胞、８８６６細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞、Ｊｕｒｋａｔ／ＫＬ－１細胞、Ｕ９３７細胞、ＢＪＡＢ細胞、ＮＢ４細胞、２９３Ｔ細胞、ＭＣＦ７細胞、Ｊｅｇ３細胞、Ｈｅｌａ細胞、Ａ５４９細胞、１１０６ｍｅｌ細胞、もしくはＣＥＭ細胞であり得るか、またはそれらから操作され得る。
一部の実施形態では、第２の細胞懸濁液中のＰＥＧ－ＤＡの濃度は、１０質量％～４０質量％である。
一部の実施形態では、前駆体細胞の集団は人工抗原提示細胞である。例えば、人工抗原提示細胞は、Ｋ５６２細胞、ＰＢＭＣ、ＥＢＶ形質転換ＬＣＬ、７２１．２２１細胞、８８６６細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞、Ｊｕｒｋａｔ／ＫＬ－１細胞、Ｕ９３７細胞、ＢＪＡＢ細胞、ＮＢ４細胞、２９３Ｔ細胞、ＭＣＦ７細胞、Ｊｅｇ３細胞、Ｈｅｌａ細胞、Ａ５４９細胞、１１０６ｍｅｌ細胞、もしくはＣＥＭ細胞であり得るか、またはそれらから操作され得る。
【0014】
一部の実施形態では、１種または複数の膜結合タンパク質は、個々にまたは集合的にナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の増殖を刺激することができる。
一部の実施形態では、１種または複数の膜結合タンパク質は、４１ＢＢＬ、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、Ｂ７－Ｈ６、ＢＡＴ３、ＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｃ２、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｇ、ＨＬＡ－Ｆ、ＨＬＡ－Ｃ、ＭＩＣＡ／ＭＩＣＢ、ＵＬＢＰ－１、ＵＬＢＰ－２、ＵＬＢＰ－３、ＵＬＢＰ－４、ＵＬＢＰ－５、ＵＬＢＰ－６、ＡＩＣＬ、ＣＤ４８、ＮＴＢ－Ａ、２Ｂ４、ＣＤ２、ＣＤ５８、ＣＤ１１ａ、ＩＣＡＭ１、ＣＲＡＣＣ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ１３７Ｌ、ネクチン－１、ネクチン－２、ネクチン－３、ネクチン－４、ｎｅｃｌ－１、ｎｅｃｌ－２、ｎｅｃｌ－３、ｎｅｃｌ－４、ｎｅｃｌ－５、ＰＣＮＡ、ＡＩＣＬ、ＩｇＧ、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ７２、ＣＥＡＣＡＭ－１、ＣＥＡＣＡＭ－５、ＯＣＩＬ、Ｎ－カドヘリン、Ｅ－カドヘリン、Ｒ－カドヘリン、シアル酸、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－９、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、ＩＬ－２７、ＩＬ－３３、ＩＬ－６、ＩＬ－１１、ＣＮＴＦ、ＬＩＦ、ＯＳＭ、ＣＴ－１、ＣＬＣ、ＩＦＮ－ａ、ＩＮＦ－ｂ、ＣＣＬ－５、およびＴＬＲ－１のアゴニスト、ＴＬＲ－２のアゴニスト、ＴＬＲ－３のアゴニスト、ＴＬＲ－５のアゴニスト、ＴＬＲ－６のアゴニスト、ＴＬＲ－９のアゴニスト、ＮＯＤ－１のアゴニスト、ＮＯＤ－２のアゴニスト、ＮＯＤ－３のアゴニスト、またはＮＬＲＰ３アゴニストからなる群から選択される。
一部の実施形態では、１種または複数の膜結合タンパク質は、４１ＢＢＬ、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、Ｂ７－Ｈ６、ＢＡＴ３、ＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｃ２、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｇ、ＨＬＡ－Ｆ、ＨＬＡ－Ｃ、ＭＩＣＡ／ＭＩＣＢ、ＵＬＢＰ－１、ＵＬＢＰ－２、ＵＬＢＰ－３、ＵＬＢＰ－４、ＵＬＢＰ－５、ＵＬＢＰ－６、ＡＩＣＬ、ＣＤ４８、ＮＴＢ－Ａ、２Ｂ４、ＣＤ２、ＣＤ５８、ＣＤ１１ａ、ＩＣＡＭ１、ＣＲＡＣＣ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ１３７Ｌ、ネクチン－１、ネクチン－２、ネクチン－３、ネクチン－４、ｎｅｃｌ－１、ｎｅｃｌ－２、ｎｅｃｌ－３、ｎｅｃｌ－４、ｎｅｃｌ－５、ＰＣＮＡ、ＡＩＣＬ、ＩｇＧ、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ７２、ＣＥＡＣＡＭ－１、ＣＥＡＣＡＭ－５、ＯＣＩＬ、Ｎ－カドヘリン、Ｅ－カドヘリン、Ｒ－カドヘリン、シアル酸、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－９、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、ＩＬ－２７、ＩＬ－３３、ＩＬ－６、ＩＬ－１１、ＣＮＴＦ、ＬＩＦ、ＯＳＭ、ＣＴ－１、ＣＬＣ、ＩＦＮ－ａ、ＩＮＦ－ｂ、ＣＣＬ－５、およびＴＬＲ－１のアゴニスト、ＴＬＲ－２のアゴニスト、ＴＬＲ－３のアゴニスト、ＴＬＲ－５のアゴニスト、ＴＬＲ－６のアゴニスト、ＴＬＲ－９のアゴニスト、ＮＯＤ－１のアゴニスト、ＮＯＤ－２のアゴニスト、ＮＯＤ－３のアゴニスト、またはＮＬＲＰ３アゴニストからなる群から選択される。
【0015】
さらに別の態様では、本明細書では、各細胞が、ゲル化された内部および１種または複数の膜結合タンパク質を含有する流体細胞膜を含む、本明細書で記載した方法によって生成された内部ゲル化細胞の集団を記載する。
一態様では、本明細書では、内部ゲル化細胞の集団を含む組成物を記載する。
別の態様では、本明細書では、対象において免疫応答を誘導する方法であって、組成物を対象に投与することを含む、方法を提供する。
一態様では、本明細書では、内部ゲル化細胞の集団を含む組成物を記載する。
別の態様では、本明細書では、対象において免疫応答を誘導する方法であって、組成物を対象に投与することを含む、方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【0016】
【図1】ゲル化細胞を調製する例示的な方法の概略図である。
【図2】生きているＫ５６２細胞およびゲル化されたＫ５６２細胞を示す一連の画像である。生きているＫ５６２細胞（左）およびゲル化されたＫ５６２細胞（右）は、さらに実験を行う前に、同様の細胞形態を有することが視覚的に確認された。
【図3】新規フィーダー細胞系によるＮＫ細胞増殖を示す一連の図である。ＰＢＭＣを、ＩＬ－２１（１００ｎｇ／ｍｌ）を含む場合もしくは含まない場合とで、照射したＫ５２６－４１ＢＢＬ－ｍｂ１５細胞（ＧＭ）およびＫ５２６－４１ＢＢＬ－ｍｂ１５細胞から調製されたゲル化細胞（ＧＣ）と共培養した。細胞集団（Ａ）、ＮＫ細胞数（Ｂ）、および増殖倍数（Ｃ）を、０、７、および１４日目に決定した（ｎ＝３）。エラーバーは平均±ＳＤを表す。
【図4】ＮＫ細胞がＧＣによる増殖後に細胞傷害性の増加を示したことを示す一連の図である。ＰＢＭＣを、ＩＬ－２１を含む場合もしくは含まない場合で、また抗ＣＤ１３７抗体を含む場合（Ｂ）もしくは含まない場合（Ａ）で、ＧＭまたはＧＣと共培養した。増殖したＮＫ細胞の細胞傷害性を、殺傷アッセイによって評価した。Ｅ：Ｔ比は１：１、０．５：１、および０．２５：１（ｎ＝２）であった。エラーバーは平均±ＳＤを表す。
【図5】ＧＣがＮＫ細胞の細胞溶解活性を増加させたことを示す一連の図である。（Ａ）総細胞数（左）、ＮＫ集団（中央）、およびＮＫ細胞数（右）を、ＧＭおよびＧＣ増殖系について決定した。（Ｂ）ＧＭで増殖させたＮＫ細胞およびＧＣで増殖させたＮＫ細胞の増殖倍数を、７日間増殖した後に決定した。（Ｃ）ＮＫ細胞の細胞溶解活性を、７日間増殖した後に決定した。（Ｄ）ＮＫ増殖中の系内のＧＭおよびＧＣ集団を決定した。
【図6】ＧＣ増殖系の条件の最適化を示す一連の図である。（Ａ）ＮＫ細胞は様々な剛性を有する様々なＧＣで増殖させた。総ＮＫ細胞数を、７日間増殖した後に決定した。（Ｂ）ＧＣから増殖したＮＫ細胞の細胞溶解活性を、７日間増殖した後に決定した。
【図7-1】ＰＢＭＣからＮＫ細胞を濃縮する増殖条件の最適化を示す一連の図である。ＰＢＭＣから濃縮したＮＫ細胞は、様々な細胞比（ＮＫ：フィーダー＝１：１０、１：５、１：２、および１：０．５）をＩＬ－１２ １０ＩＵ／ｍＬ（Ａ～Ｃ）またはＩＬ－２ １００ＩＵ／ｍＬ（Ｄ～Ｆ）と共に使用して増殖させた。（Ａ）（Ｄ）様々な細胞比下で増殖させたＮＫ細胞の総細胞数（左）、ＮＫ集団（中央）、およびＮＫ細胞数（右）を、０日目および７日目に評価した。（Ｂ）（Ｅ）様々な細胞比下での増殖倍数を、７日間増殖した後に決定した。（Ｃ）（Ｆ）様々な細胞比下で増殖させたＮＫ細胞の細胞溶解活性を、７日間増殖した後に決定した。
【図7-2】ＰＢＭＣからＮＫ細胞を濃縮する増殖条件の最適化を示す一連の図である。ＰＢＭＣから濃縮したＮＫ細胞は、様々な細胞比（ＮＫ：フィーダー＝１：１０、１：５、１：２、および１：０．５）をＩＬ－１２ １０ＩＵ／ｍＬ（Ａ～Ｃ）またはＩＬ－２ １００ＩＵ／ｍＬ（Ｄ～Ｆ）と共に使用して増殖させた。（Ａ）（Ｄ）様々な細胞比下で増殖させたＮＫ細胞の総細胞数（左）、ＮＫ集団（中央）、およびＮＫ細胞数（右）を、０日目および７日目に評価した。（Ｂ）（Ｅ）様々な細胞比下での増殖倍数を、７日間増殖した後に決定した。（Ｃ）（Ｆ）様々な細胞比下で増殖させたＮＫ細胞の細胞溶解活性を、７日間増殖した後に決定した。
【発明を実施するための形態】
【0017】
細胞内ヒドロゲル化技術は、並外れた安定性を獲得しながら細胞原形質膜の完全性を維持することができることが実証された。Lin et al., Nat. Commun. 10, 1057 (2019)を参照のこと。この技術を使用して人工抗原提示細胞（ＡＰＣ）をＮＫ細胞のフィーダー細胞として調製することによって、この増殖系は標準的なフィーダー細胞系と比較して同等のＮＫ細胞増殖レベルを誘導できることが観察された。驚くべきことに、この増殖系はＮＫ活性化受容体の発現レベルを増加させただけでなく、ＮＫ細胞の腫瘍に対する細胞傷害性も増強した。
【0018】
したがって、本明細書では、ＮＫ細胞を増殖する方法を記載する。この方法は、それぞれがゲル化された内部、および個々にまたは集合的にＮＫ細胞の増殖を刺激することができる１種または複数の膜結合タンパク質を含有する流体細胞膜を含む、内部ゲル化細胞の集団を準備する工程、ならびにＮＫ細胞の増殖を可能にする条件下で、１種または複数の膜結合タンパク質に応答することができるＮＫ細胞を含有する細胞の集団を、内部ゲル化細胞の集団と共に培養する工程を含む。言い換えると、内部ゲル化細胞はフィーダー細胞として使用される。
【0019】
ＮＫ細胞の集団は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、ＰＢＭＣまたはその他の細胞源から濃縮したＮＫ細胞、ｉＰＳＣ由来ＮＫ細胞、胚性幹細胞由来ＮＫ細胞、組織常在性ＮＫ細胞、脾細胞、臍帯血細胞、および造血幹細胞由来ＮＫ細胞からなる群から選択され得る。
【0020】
１種または複数の膜結合タンパク質は、４１ＢＢＬ、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、Ｂ７－Ｈ６、ＢＡＴ３、ＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｃ２、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｇ、ＨＬＡ－Ｆ、ＨＬＡ－Ｃ、ＭＩＣＡ／ＭＩＣＢ、ＵＬＢＰ－１、ＵＬＢＰ－２、ＵＬＢＰ－３、ＵＬＢＰ－４、ＵＬＢＰ－５、ＵＬＢＰ－６、ＡＩＣＬ、ＣＤ４８、ＮＴＢ－Ａ、２Ｂ４、ＣＤ２、ＣＤ５８、ＣＤ１１ａ、ＩＣＡＭ１、ＣＲＡＣＣ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ１３７Ｌ、ネクチン－１、ネクチン－２、ネクチン－３、ネクチン－４、ｎｅｃｌ－１、ｎｅｃｌ－２、ｎｅｃｌ－３、ｎｅｃｌ－４、ｎｅｃｌ－５、ＰＣＮＡ、ＡＩＣＬ、ＩｇＧ、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ７２、ＣＥＡＣＡＭ－１、ＣＥＡＣＡＭ－５、ＯＣＩＬ、Ｎ－カドヘリン、Ｅ－カドヘリン、Ｒ－カドヘリン、シアル酸、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－９、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、ＩＬ－２７、ＩＬ－３３、ＩＬ－６、ＩＬ－１１、ＣＮＴＦ、ＬＩＦ、ＯＳＭ、ＣＴ－１、ＣＬＣ、ＩＦＮ－ａ、ＩＮＦ－ｂ、ＣＣＬ－５、およびＴＬＲ－１のアゴニスト、ＴＬＲ－２のアゴニスト、ＴＬＲ－３のアゴニスト、ＴＬＲ－５のアゴニスト、ＴＬＲ－６のアゴニスト、ＴＬＲ－９のアゴニスト、ＮＯＤ－１のアゴニスト、ＮＯＤ－２のアゴニスト、ＮＯＤ－３のアゴニスト、またはＮＬＲＰ３アゴニストからなる群から選択され得る。例えば、１種または複数の膜結合タンパク質は、４１ＢＢＬおよびＩＬ－１５を含むことができる。
【0021】
培養工程は、ＩＬ－２１（例えば、５０～２００ｎｇ／ｍｌ）またはＩＬ－２（例えば、５～２００ＩＵ／ｍｌ）の存在下で、ＮＫ細胞の培養および増殖に適した培地で実施され得る。
一部の実施形態では、ＮＫ細胞および内部ゲル化細胞は、ＩＬ－２１またはＩＬ－２の存在下で、ＮＫ細胞：ゲル化細胞の比１：０．５～２０（例えば、１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：１０、または１：１５）で共培養することができる。
内部ゲル化細胞の集団は、不活性ではあるが活性化可能な架橋剤を細胞に導入するために、前駆細胞集団の脂質膜を一時的に透過処理する工程を含む手順によって生成されてもよい。架橋剤が透過処理された細胞に入るとその後、細胞は非透過状態に戻ることが可能で、こうして架橋剤を細胞内に密閉する。次いで、例えば細胞を洗浄することによって、あらゆる残存する小胞外架橋剤を除去する。その後、内部架橋剤が活性化され、膜を乱すことなく細胞の内部ゲル化を達成する。透過処理工程は、架橋剤の存在下で実施されてもよい。国際公開第２０１８／０２６６４４号も参照のこと。
一部の実施形態では、ＮＫ細胞および内部ゲル化細胞は、ＩＬ－２１またはＩＬ－２の存在下で、ＮＫ細胞：ゲル化細胞の比１：０．５～２０（例えば、１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：１０、または１：１５）で共培養することができる。
内部ゲル化細胞の集団は、不活性ではあるが活性化可能な架橋剤を細胞に導入するために、前駆細胞集団の脂質膜を一時的に透過処理する工程を含む手順によって生成されてもよい。架橋剤が透過処理された細胞に入るとその後、細胞は非透過状態に戻ることが可能で、こうして架橋剤を細胞内に密閉する。次いで、例えば細胞を洗浄することによって、あらゆる残存する小胞外架橋剤を除去する。その後、内部架橋剤が活性化され、膜を乱すことなく細胞の内部ゲル化を達成する。透過処理工程は、架橋剤の存在下で実施されてもよい。国際公開第２０１８／０２６６４４号も参照のこと。
【0022】
得られた内部ゲル化細胞は天然の外観を保持しており、環境ストレスの影響を受けない。膜脂質およびタンパク質は、内部ゲル化に際し移動性を保持する。この方法によって生産された内部ゲル化細胞は、それらの前駆細胞の脂質膜と実質的に同一である脂質膜によって囲まれた、固定されたまたはゲル化された内部を有する。ゲル化細胞では、界面活性剤に対する感受性、膜流動性、膜タンパク質の移動性、膜透過性、膜含有量、表面電荷、膜の生物学的機能などの前駆細胞の特性を維持することができる。
当技術分野で公知の様々な技術を応用して、前駆細胞において一過性の膜穿孔または透過性を誘導することができる。この技術には、凍結解凍処理、浸透圧ショック、音響穿孔、電気穿孔、レーザー誘導膜穿孔、剪断誘導膜穿孔、および機械的手段に基づくその他の技術が含まれるが、これらに限定されない。例えば、空洞化現象が脂質膜のすぐ近くで生じると、音響穿孔が生じる。マイクロバブルと膜との間の相互作用は、アコースティックマイクロストリーミング、気泡振動、衝撃波、および脂質膜に穴をあけるマイクロジェット形成によって一時的な孔を生成する。当業者であれば、膜を永久に破壊することなく、膜に一時的な孔を生成するために技術の適用方法を決定することができるであろう。通常、一時的膜穿孔技術の適用を停止すると、生成された孔は自然に閉じる。
当技術分野で公知の様々な技術を応用して、前駆細胞において一過性の膜穿孔または透過性を誘導することができる。この技術には、凍結解凍処理、浸透圧ショック、音響穿孔、電気穿孔、レーザー誘導膜穿孔、剪断誘導膜穿孔、および機械的手段に基づくその他の技術が含まれるが、これらに限定されない。例えば、空洞化現象が脂質膜のすぐ近くで生じると、音響穿孔が生じる。マイクロバブルと膜との間の相互作用は、アコースティックマイクロストリーミング、気泡振動、衝撃波、および脂質膜に穴をあけるマイクロジェット形成によって一時的な孔を生成する。当業者であれば、膜を永久に破壊することなく、膜に一時的な孔を生成するために技術の適用方法を決定することができるであろう。通常、一時的膜穿孔技術の適用を停止すると、生成された孔は自然に閉じる。
【0023】
透過処理された脂質膜に侵入し、細胞内で活性化されてゲル化された内部を作製することができるあらゆる架橋剤を利用して、内部ゲル化細胞を作製することができる。一部の実施形態では、架橋剤は、活性化して架橋してゲルを形成することができるモノマーまたはポリマーである。熱応答性ヒドロゲル架橋、光応答性ヒドロゲル架橋、ｐＨ感受性ヒドロゲル架橋、化学物質応答性ヒドロゲル架橋、およびゾルゲルシリカ架橋は、活性化可能な架橋技術の例である。
光重合または光反応性架橋を使用することができる。光重合とは、光、多くの場合、紫外または可視領域の電磁スペクトルに曝露すると、その特性が変化して材料の硬化および強化を引き起こすポリマーの架橋である。この方法は、光開始剤の存在下または非存在下で行われ得る。光開始剤の例には、カチオン光開始剤（例：オニウム塩、有機金属塩、およびピリジニウム塩）およびフリーラジカル光開始剤（例：ベンゾフェノン、キサントン、キノン、ベンゾインエーテル、アセトフェノン、ベンゾイルオキシム、およびアシルホスフィン）が含まれるが、これらに限定されない。光反応性架橋剤の例には、エポキシド、ウレタン、ポリエーテル、および任意の分子量のポリエステルが含まれるが、これらに限定されない。光反応性架橋剤は通常、架橋のためにアクリレートで官能化されている。例えば、分子量７００のポリエチレングリコールジアクリレート（ＰＥＧＤＡ）は、光開始剤として（２－ヒドロキシ－４’－（２－ヒドロキシエトキシ）－２－メチルプロピオフェノン（Ｉ－２９５９）と共に使用される場合もある。
光重合または光反応性架橋を使用することができる。光重合とは、光、多くの場合、紫外または可視領域の電磁スペクトルに曝露すると、その特性が変化して材料の硬化および強化を引き起こすポリマーの架橋である。この方法は、光開始剤の存在下または非存在下で行われ得る。光開始剤の例には、カチオン光開始剤（例：オニウム塩、有機金属塩、およびピリジニウム塩）およびフリーラジカル光開始剤（例：ベンゾフェノン、キサントン、キノン、ベンゾインエーテル、アセトフェノン、ベンゾイルオキシム、およびアシルホスフィン）が含まれるが、これらに限定されない。光反応性架橋剤の例には、エポキシド、ウレタン、ポリエーテル、および任意の分子量のポリエステルが含まれるが、これらに限定されない。光反応性架橋剤は通常、架橋のためにアクリレートで官能化されている。例えば、分子量７００のポリエチレングリコールジアクリレート（ＰＥＧＤＡ）は、光開始剤として（２－ヒドロキシ－４’－（２－ヒドロキシエトキシ）－２－メチルプロピオフェノン（Ｉ－２９５９）と共に使用される場合もある。
【0024】
熱応答性ポリマーは通常、疎水基または臨界温度で鎖が凝集しやすい基を含有している。熱応答性ポリマーは、特定の温度（すなわち、非反応温度）で透過処理された細胞に導入され、その後温度を臨界温度に変更することによって架橋され得る。本明細書で記載した内部ゲル化法に適用可能な温度感受性ポリマーの例には、疎水性ペンダント基を含有するポリアクリルアミド誘導体、ＰＥＧ－ＰＬＧＡ－ＰＥＧトリブロック共重合体、ヒドロキシエチルメタクリレート－メチルメタクリレート（ＨＥＭＡ－ＭＭＡ）、ポリアクリロニトリル－ポリ塩化ビニル（ＰＡＮ－ＰＶＣ）、ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）（ポリＮＩＰＡＭ）、ポリ（Ｎ－ビニルカプロラクタム）、セルロース誘導体、エチレンオキシド－プロピレン、およびマトリゲルが含まれるが、これらに限定されない。
【0025】
本明細書で記載した方法のいずれかでは、内部ゲル化細胞は、１種または複数の膜結合タンパク質を発現する前駆細胞の集団を準備することによって生成され得る。次に、前駆細胞の集団を、プロテアーゼ阻害剤カクテルを含有し、フェノールレッドを含まないＤＭＥＭに懸濁して、第１の細胞懸濁液を生成する。ゲル化溶液を第１の細胞懸濁液に添加して第２の細胞懸濁液を生成する。光反応性架橋剤および任意に光開始剤を含有するゲル化溶液は、前駆細胞の膜透過性を増加させることができる。第２の細胞懸濁液を、光反応性架橋剤および任意に光開始剤が前駆細胞に入るのを可能にするのに十分な時間、室温でインキュベートする。次に、第２の細胞懸濁液を遠心分離して細胞ペレットを生成し、これをフェノールレッドを含まないＤＭＥＭに再懸濁して第３の細胞懸濁液を生成する。光反応性架橋剤の架橋を可能にするのに十分な時間、第３の細胞懸濁液に光を当て、それによって内部ゲル化細胞の集団を生成する。内部ゲル化細胞を収集し、洗浄する。このようにして生成された内部ゲル化細胞それぞれは、ゲル化された内部および前駆細胞によって発現した１種または複数の膜結合タンパク質を含有する流体細胞膜を含む。
【0026】
ゲル化溶液は、光開始剤（例えば、Ｉ－２９５９）をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解して溶液を作製し、その溶液を光反応性架橋剤（例えば、ＰＥＧ－ＤＡ）と混合することによって調製され得る。一部の実施形態では、ゲル化溶液では、Ｉ－２９５９は０．０１～１質量％の範囲であってもよく、ＰＥＧ－ＤＡは、２～８０質量％の範囲で、２００Ｄａ～５０００Ｄａの平均分子量を有してもよい。例えば、ゲル化溶液は、最初に７５０ｍｇ／ｍＬのＩ－２９５９ ２０μＬをＤＭＳＯに溶解し、次に得られた溶液をＰＥＧ－ＤＡ２００μＬと混合することによって、調製されてもよい。
【0027】
場合によっては、ゲル化溶液は、第２の細胞懸濁液が２９０ｍＯｓｍｏｌ～３２０ｍＯｓｍｏｌ、３２０ｍＯｓｍｏｌを超える、または２９０ｍＯｓｍｏｌ未満の浸透圧濃度を有するように調製され、第１の細胞懸濁液に添加される。
ゲル化溶液は、第２の細胞懸濁液が０．１～５質量％のＤＭＳＯを含有するように調製され、第１の細胞懸濁液に添加されてもよい。
ゲル化細胞の剛性は、第２の細胞懸濁液中の架橋剤の濃度を調整することによって変えられてもよい。例えば、ゲル化溶液は、第２の細胞懸濁液中の光反応性架橋剤の濃度が５質量％～５０質量％（例えば、５質量％、１０質量％、１５質量％、２０質量％、２５質量％、３０質量％、３５質量％、および４０質量％）であるように、第１の細胞懸濁液に添加され得る。
ゲル化溶液は、第２の細胞懸濁液が０．１～５質量％のＤＭＳＯを含有するように調製され、第１の細胞懸濁液に添加されてもよい。
ゲル化細胞の剛性は、第２の細胞懸濁液中の架橋剤の濃度を調整することによって変えられてもよい。例えば、ゲル化溶液は、第２の細胞懸濁液中の光反応性架橋剤の濃度が５質量％～５０質量％（例えば、５質量％、１０質量％、１５質量％、２０質量％、２５質量％、３０質量％、３５質量％、および４０質量％）であるように、第１の細胞懸濁液に添加され得る。
【0028】
本明細書で記載された方法によって生産された増殖したＮＫ細胞は、それを必要とする対象に投与することができる。増殖したＮＫ細胞は、対象または別のドナー対象から得られた細胞集団（例えば、ＰＢＭＣ）から得られる場合もある。増殖したＮＫ細胞は、がん、感染症、自己免疫疾患、もしくは古典的ＮＫ欠損症および機能的ＮＫ欠損症などのＮＫ細胞欠損状態の治療、または所望しない細胞の除去に使用され得る。
本明細書で記載した内部ゲル化細胞は、抗原提示細胞の抗原提示能力を保持しているが、増殖活性が欠如している。したがって、ゲル化細胞は、腫瘍形成のリスクなしに免疫応答を調節する能力を保持している。したがって、ゲル化細胞は、状態を治療するため、または免疫応答を誘導するために、それを必要とする対象に投与することができる。場合によっては、ゲル化細胞はワクチンとして使用される。
本明細書で記載した内部ゲル化細胞は、抗原提示細胞の抗原提示能力を保持しているが、増殖活性が欠如している。したがって、ゲル化細胞は、腫瘍形成のリスクなしに免疫応答を調節する能力を保持している。したがって、ゲル化細胞は、状態を治療するため、または免疫応答を誘導するために、それを必要とする対象に投与することができる。場合によっては、ゲル化細胞はワクチンとして使用される。
【0029】
ゲル化細胞は、様々な投与経路、例えば、静脈内、関節内、結膜、頭蓋内、腹腔内、胸腔内、筋肉内、髄腔内、または皮下投与経路に適した医薬組成物として処方することができる。薬学的に許容できる担体、例えば緩衝剤または賦形剤、またはアジュバントを含有することができる。
以下の特定の実施例は、単なる例示として解釈されるべきであり、決して本開示の残りの部分を限定するものではない。
さらに細かく説明しなくても、当業者は、本明細書の説明に基づいて、本開示を最大限に利用することができると考えられる。本明細書で引用される刊行物は全て、参照によってその全体が本明細書に組み入れられる。
以下の特定の実施例は、単なる例示として解釈されるべきであり、決して本開示の残りの部分を限定するものではない。
さらに細かく説明しなくても、当業者は、本明細書の説明に基づいて、本開示を最大限に利用することができると考えられる。本明細書で引用される刊行物は全て、参照によってその全体が本明細書に組み入れられる。
【0030】
（実施例１）
ゲル化された人工抗原提示細胞は、ｅｘ ｖｉｖｏにおいてＮＫ細胞の増殖を支持する。
ＮＫ増殖のために、十分に確立された遺伝子改変人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）の細胞内ヒドロゲル化を実施した。Ｋ５６２細胞をレンチウイルスで形質導入して、４１ＢＢＬおよび膜結合ＩＬ１５を発現させた（Ｋ５６２－４１ＢＢＬ－ｍｂ１５フィーダー細胞）。Fujisaki et al., Cancer Res. 69, 4010-4017 (2009)を参照のこと。
健康なドナーの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、照射したＫ５６２－４１ＢＢＬ－ｍｂ１５フィーダー細胞（ＧＭ）またはゲル化されたＫ５６２－４１ＢＢＬ－ｍｂ１５フィーダー細胞（ＧＣ）と共培養して、ＮＫ細胞の増殖を選択的に支持した。ＮＫ細胞の成熟および増殖におけるＩＬ－２１の重要な役割を考慮して、ＩＬ－２１を含む場合または含まない場合で、ＧＣおよびＧＭによる繰り返し刺激に応答したＮＫ細胞の増殖を比較した。図３（Ａ）に示したように、全条件において、ａＡＰＣと１４日間共培養した後に、ＣＤ３-ＣＤ５６+ＮＫ細胞の高濃縮（ＧＭ、ＩＬ－２１＋ＧＭでは８３．５％±１０．１０％、８９．２％±２．３５％、ＧＣ、ＩＬ－２１＋ＧＣでは６９．０％±２２．７６％、９３．０％±４．５５％）が観察された。７日目までに、ＮＫ細胞の増殖は、ＧＭと共培養した場合の平均５．４倍と比較して、ＧＣと共培養した場合は平均１３．１倍であることが観察された。驚くべきことに、ＧＣと共培養した場合はＮＫ細胞の数が少ないにも関わらず、ＧＣ共培養にＩＬ－２１を添加すると、増殖の大幅な増加が示された（ＩＬ－２１＋ＧＣでは１２．６倍）。１４日目までに、ａＡＰＣによるＮＫ増殖に同様の傾向が観察され（ＧＭ、ＩＬ－２１＋ＧＭでは６６．７±１３．０、７５．８±３３．５倍、ＧＣ、ＩＬ－２１＋ＧＣでは３９．７±９．５、７５．３±６．７倍）、ゲル化されたａＡＰＣは、ｅｘ ｖｉｖｏにおいてＮＫ細胞の増殖を支持する能力を維持しており、増殖したＮＫ細胞の選択的濃縮を促進することが示唆された。図３（Ｃ）を参照のこと。
ゲル化された人工抗原提示細胞は、ｅｘ ｖｉｖｏにおいてＮＫ細胞の増殖を支持する。
ＮＫ増殖のために、十分に確立された遺伝子改変人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）の細胞内ヒドロゲル化を実施した。Ｋ５６２細胞をレンチウイルスで形質導入して、４１ＢＢＬおよび膜結合ＩＬ１５を発現させた（Ｋ５６２－４１ＢＢＬ－ｍｂ１５フィーダー細胞）。Fujisaki et al., Cancer Res. 69, 4010-4017 (2009)を参照のこと。
健康なドナーの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、照射したＫ５６２－４１ＢＢＬ－ｍｂ１５フィーダー細胞（ＧＭ）またはゲル化されたＫ５６２－４１ＢＢＬ－ｍｂ１５フィーダー細胞（ＧＣ）と共培養して、ＮＫ細胞の増殖を選択的に支持した。ＮＫ細胞の成熟および増殖におけるＩＬ－２１の重要な役割を考慮して、ＩＬ－２１を含む場合または含まない場合で、ＧＣおよびＧＭによる繰り返し刺激に応答したＮＫ細胞の増殖を比較した。図３（Ａ）に示したように、全条件において、ａＡＰＣと１４日間共培養した後に、ＣＤ３-ＣＤ５６+ＮＫ細胞の高濃縮（ＧＭ、ＩＬ－２１＋ＧＭでは８３．５％±１０．１０％、８９．２％±２．３５％、ＧＣ、ＩＬ－２１＋ＧＣでは６９．０％±２２．７６％、９３．０％±４．５５％）が観察された。７日目までに、ＮＫ細胞の増殖は、ＧＭと共培養した場合の平均５．４倍と比較して、ＧＣと共培養した場合は平均１３．１倍であることが観察された。驚くべきことに、ＧＣと共培養した場合はＮＫ細胞の数が少ないにも関わらず、ＧＣ共培養にＩＬ－２１を添加すると、増殖の大幅な増加が示された（ＩＬ－２１＋ＧＣでは１２．６倍）。１４日目までに、ａＡＰＣによるＮＫ増殖に同様の傾向が観察され（ＧＭ、ＩＬ－２１＋ＧＭでは６６．７±１３．０、７５．８±３３．５倍、ＧＣ、ＩＬ－２１＋ＧＣでは３９．７±９．５、７５．３±６．７倍）、ゲル化されたａＡＰＣは、ｅｘ ｖｉｖｏにおいてＮＫ細胞の増殖を支持する能力を維持しており、増殖したＮＫ細胞の選択的濃縮を促進することが示唆された。図３（Ｃ）を参照のこと。
【0031】
（実施例２）
ゲル化ａＡＰＣによって支持されたＮＫ細胞の増殖は、ＮＫ細胞受容体の様々な発現パターンを引き起こした。
ＧＣおよびＧＭは同じ遺伝子改変されたａＡＰＣから得られたため、ＧＣまたはＧＭで増殖したＮＫ細胞は同じシグナル伝達経路を介して活性化され、同様の免疫表現型を生じると予測された。この問題を明確にするために、ＣＤ３-ＣＤ５６+ＮＫ細胞を固定して、ＣｙＴＯＦによって増殖前後の主要なＮＫ細胞受容体の表面発現を評価した。予期せぬことに、教師なしの階層的クラスタリング分析で示したように、増殖していない、ＧＣで増殖した、およびＧＭで増殖した群という３つの異なる群は一緒にクラスター化した（データは示していない）。特に、両群は増殖していないＮＫ細胞よりも高レベルの活性化受容体を発現したが、ＧＣで増殖したＮＫ細胞は、ＧＭで増殖したＮＫ細胞と比較して、ＮＫｐ３０、ＣＤ１３７、ＣＲＡＣＣ、およびＮＫＧ２Ｄを含む活性化受容体ならびにパーフォリンの発現の増加を示した（データは示していない）。これらの結果は、ＧＣとの共培養がＮＫ細胞に持続的な活性化シグナルをもたらし、より高発現レベルの活性化受容体およびパーフォリンを引き起こす可能性があることを示唆した。
ゲル化ａＡＰＣによって支持されたＮＫ細胞の増殖は、ＮＫ細胞受容体の様々な発現パターンを引き起こした。
ＧＣおよびＧＭは同じ遺伝子改変されたａＡＰＣから得られたため、ＧＣまたはＧＭで増殖したＮＫ細胞は同じシグナル伝達経路を介して活性化され、同様の免疫表現型を生じると予測された。この問題を明確にするために、ＣＤ３-ＣＤ５６+ＮＫ細胞を固定して、ＣｙＴＯＦによって増殖前後の主要なＮＫ細胞受容体の表面発現を評価した。予期せぬことに、教師なしの階層的クラスタリング分析で示したように、増殖していない、ＧＣで増殖した、およびＧＭで増殖した群という３つの異なる群は一緒にクラスター化した（データは示していない）。特に、両群は増殖していないＮＫ細胞よりも高レベルの活性化受容体を発現したが、ＧＣで増殖したＮＫ細胞は、ＧＭで増殖したＮＫ細胞と比較して、ＮＫｐ３０、ＣＤ１３７、ＣＲＡＣＣ、およびＮＫＧ２Ｄを含む活性化受容体ならびにパーフォリンの発現の増加を示した（データは示していない）。これらの結果は、ＧＣとの共培養がＮＫ細胞に持続的な活性化シグナルをもたらし、より高発現レベルの活性化受容体およびパーフォリンを引き起こす可能性があることを示唆した。
【0032】
（実施例３）
ゲル化ａＡＰＣで増殖したＮＫ細胞は、腫瘍細胞株に対して増強された細胞傷害性を示した。
活性化受容体およびパーフォリンの発現が高いため、ＧＣで増殖したＮＫ細胞は、腫瘍標的に対してより細胞傷害性である可能性がある。この問題を解決するため、増殖したＮＫ細胞の細胞傷害性を殺傷アッセイによって評価した。実際に、ＩＬ－２１を含む場合または含まない場合で、標的腫瘍細胞株であるＫ５６２に対するＧＣで増殖したＮＫ細胞の特異的な殺傷は、ＧＭで増殖したＮＫ細胞よりもはるかに大きいことがわかった。図４（Ａ）を参照すること。さらに、ＧＣで増殖したＮＫ細胞ではＣＤ１３７の発現が高いため、抗ＣＤ１３７アゴニスト抗体を利用することによってＧＣで増殖したＮＫ細胞をさらに活性化することができた。図４（Ｂ）で示したように、抗ＣＤ１３７アゴニスト抗体の存在下で、Ｋ５６２標的細胞に対するＧＣで増殖したＮＫ細胞の細胞傷害性はＧＭ群と比較してさらに増強され、治療戦略として抗ＣＤ１３７アゴニストとＧＣで増殖したＮＫ細胞とを組み合わせる可能性が示唆された。
ゲル化ａＡＰＣで増殖したＮＫ細胞は、腫瘍細胞株に対して増強された細胞傷害性を示した。
活性化受容体およびパーフォリンの発現が高いため、ＧＣで増殖したＮＫ細胞は、腫瘍標的に対してより細胞傷害性である可能性がある。この問題を解決するため、増殖したＮＫ細胞の細胞傷害性を殺傷アッセイによって評価した。実際に、ＩＬ－２１を含む場合または含まない場合で、標的腫瘍細胞株であるＫ５６２に対するＧＣで増殖したＮＫ細胞の特異的な殺傷は、ＧＭで増殖したＮＫ細胞よりもはるかに大きいことがわかった。図４（Ａ）を参照すること。さらに、ＧＣで増殖したＮＫ細胞ではＣＤ１３７の発現が高いため、抗ＣＤ１３７アゴニスト抗体を利用することによってＧＣで増殖したＮＫ細胞をさらに活性化することができた。図４（Ｂ）で示したように、抗ＣＤ１３７アゴニスト抗体の存在下で、Ｋ５６２標的細胞に対するＧＣで増殖したＮＫ細胞の細胞傷害性はＧＭ群と比較してさらに増強され、治療戦略として抗ＣＤ１３７アゴニストとＧＣで増殖したＮＫ細胞とを組み合わせる可能性が示唆された。
【0033】
（実施例４）
ゲル化ａＡＰＣはより高い持続性を有し、より高い細胞溶解活性を持つ増殖したＮＫ細胞を生産した。
ゲル化フィーダー細胞によって増殖したＮＫ細胞をさらに評価するために、ゲル化細胞をＫ５６２－４１ＢＢＬ－ｍｂ１５細胞から生成した。ＰＢＭＣをＧＭまたはＧＣと共培養した。総細胞数、ＮＫ集団、およびＮＫ細胞数を、０、４、および７日目に測定した。図５（Ａ）を参照のこと。７日間増殖した後、ＮＫ細胞を濃縮して細胞溶解活性を分析した。図５（Ｃ）を参照のこと。両群のＮＫ集団は７日目では類似していたが、ＧＭはＧＣ群よりも多くのＮＫ細胞を増殖させることができた。図５（Ａ）および（Ｂ）を参照のこと。一方、ＧＣで増殖したＮＫ細胞は、ＧＭで増殖した細胞よりも高い細胞溶解活性を示し、ＧＣがＧＭよりもＮＫ活性を促進する能力が高いことを示唆した。図５（Ｃ）を参照のこと。ＧＣはＧＭよりも持続性が高いことも観察された。図５（Ｄ）を参照のこと。したがって、ＧＣはＮＫ細胞をより長い期間刺激し、ＮＫ細胞においてより高い細胞溶解活性を誘導できるかもしれない。
ゲル化ａＡＰＣはより高い持続性を有し、より高い細胞溶解活性を持つ増殖したＮＫ細胞を生産した。
ゲル化フィーダー細胞によって増殖したＮＫ細胞をさらに評価するために、ゲル化細胞をＫ５６２－４１ＢＢＬ－ｍｂ１５細胞から生成した。ＰＢＭＣをＧＭまたはＧＣと共培養した。総細胞数、ＮＫ集団、およびＮＫ細胞数を、０、４、および７日目に測定した。図５（Ａ）を参照のこと。７日間増殖した後、ＮＫ細胞を濃縮して細胞溶解活性を分析した。図５（Ｃ）を参照のこと。両群のＮＫ集団は７日目では類似していたが、ＧＭはＧＣ群よりも多くのＮＫ細胞を増殖させることができた。図５（Ａ）および（Ｂ）を参照のこと。一方、ＧＣで増殖したＮＫ細胞は、ＧＭで増殖した細胞よりも高い細胞溶解活性を示し、ＧＣがＧＭよりもＮＫ活性を促進する能力が高いことを示唆した。図５（Ｃ）を参照のこと。ＧＣはＧＭよりも持続性が高いことも観察された。図５（Ｄ）を参照のこと。したがって、ＧＣはＮＫ細胞をより長い期間刺激し、ＮＫ細胞においてより高い細胞溶解活性を誘導できるかもしれない。
【0034】
（実施例５）
改変したゲル化細胞および培養条件がＮＫ細胞の増殖および細胞溶解活性を改善した。
ＮＫ細胞を増殖させるＧＣの能力を向上させるために、効率を最適化するようにＧＣの特性を改変した。
以前の研究では、刺激面の剛性がＮＫ細胞の活性化を調節できることが示唆された。Mordechay et al., Mechanical Regulation of the Cytotoxic Activity of Natural Killer Cells (2020), biorxiv.org, doi:10.1101/2020.03.02.972984を参照のこと。ＧＣの剛性を、ＮＫ細胞の活性化に対する影響を評価するために調整した。４％、１０％、２０％、４０％などの様々なレベルの剛性のＧＣを試験した。図６（Ａ）および（Ｂ）を参照のこと。データは、ＧＣの剛性とＮＫ増殖効率の相関関係が釣鐘型の曲線であることを示しており、これは以前の研究と一致した。１０％の剛性が最大の増殖効率を示した。図６（Ａ）を参照のこと。一方、ＧＣの様々な群の間には細胞溶解活性の有意差はなかった。図６（Ｂ）を参照のこと。
改変したゲル化細胞および培養条件がＮＫ細胞の増殖および細胞溶解活性を改善した。
ＮＫ細胞を増殖させるＧＣの能力を向上させるために、効率を最適化するようにＧＣの特性を改変した。
以前の研究では、刺激面の剛性がＮＫ細胞の活性化を調節できることが示唆された。Mordechay et al., Mechanical Regulation of the Cytotoxic Activity of Natural Killer Cells (2020), biorxiv.org, doi:10.1101/2020.03.02.972984を参照のこと。ＧＣの剛性を、ＮＫ細胞の活性化に対する影響を評価するために調整した。４％、１０％、２０％、４０％などの様々なレベルの剛性のＧＣを試験した。図６（Ａ）および（Ｂ）を参照のこと。データは、ＧＣの剛性とＮＫ増殖効率の相関関係が釣鐘型の曲線であることを示しており、これは以前の研究と一致した。１０％の剛性が最大の増殖効率を示した。図６（Ａ）を参照のこと。一方、ＧＣの様々な群の間には細胞溶解活性の有意差はなかった。図６（Ｂ）を参照のこと。
【0035】
ＮＫとＴ細胞などの他の免疫細胞との相互作用は、ＮＫの活性化および増殖を促進することができた。Malhotra and Shanker, NK cells: immune cross-talk and therapeutic implications. 37 (2012)；およびLee et al., Sci Rep 7, 11075 (2017)を参照のこと。しかし、これらの相互作用は、様々な増殖バッチのＮＫ細胞の品質に影響を与える可能性があった。この変動を排除するために、ＮＫ細胞は増殖前にＰＢＭＣから濃縮した。濃縮したＮＫ細胞は、ヒトＩＬ－２ １０ＩＵ／ｍＬまたは１００ＩＵ／ｍＬの存在化で、ＮＫ細胞のフィーダー細胞に対する様々な比（１：１０、１：５、１：２、および１：０．５）で共培養した。図７を参照のこと。データは、ＩＬ－２ １００ＩＵ／ｍＬを用いて増殖させたＮＫ細胞は、ＩＬ－２ １０ＩＵ／ｍＬを用いて増殖させた細胞よりも増殖効率が高いことを示した。図７（Ａ）、（Ｂ）、（Ｄ）、および（Ｅ）を参照のこと。さらに、ＩＬ－２ １００ＩＵ／ｍＬの存在下で増殖させたＮＫ細胞は、より高い細胞溶解活性を示した。図７（Ｃ）および（Ｆ）を参照のこと。これらのデータによると、剛性１０％のＧＣで増殖させたＮＫ細胞は、ＮＫ細胞のフィーダー細胞に対する比１：５で、ＩＬ－２ １００ＩＵ／ｍＬの存在下で、良好な増殖効率および細胞溶解活性の両方を示した。図７を参照のこと。さらに、ＩＬ－２ １００ＩＵ／ｍＬを用いて、１：１０の比でＧＭで増殖させた細胞とＧＣで増殖させた細胞の間には、増殖効率およびＮＫ細胞溶解活性の両方に関して劇的な違いがあった。図７（Ｄ）～（Ｆ）を参照のこと。
【0036】
（実施例６）
材料および方法
細胞株
Ｋ５６２－４１ＢＢＬ－ｍｂ１５細胞は、ＮＴＵＨのＣｈａｎｇ博士から恵与された。細胞は全て、ウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）を補給したＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ）で培養した。
材料および方法
細胞株
Ｋ５６２－４１ＢＢＬ－ｍｂ１５細胞は、ＮＴＵＨのＣｈａｎｇ博士から恵与された。細胞は全て、ウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）を補給したＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ）で培養した。
【0037】
ゲル化細胞
ゲル化緩衝液は、まずジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に７５０ｍｇ／ｍＬで溶解した２－ヒドロキシ－４'－（２－ヒドロキシエトキシ）－２－メチルプロピオフェノン（ＩｒｇａｃｕｒｅＤ－２９５９；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）２０μＬを、ポリ（エチレングリコール）－ジアクリレート（ＰＥＧ－ＤＡ；Ｍｎ＝７００Ｄａ；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）２００μＬと混合して調製した。５×１０6個のＫ５６２細胞または遺伝子改変Ｋ５６２細胞を収集し、１Ｘプロテアーゼ阻害剤を含有し、フェノールレッドを含まないＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）（ＣＡ２１０６３－０２９；ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）１ｍＬに懸濁した。この細胞懸濁液にゲル化緩衝液を１：１０の体積比で添加して、細胞懸濁液中のＰＥＧ－ＤＡ濃度を１０質量％にした。室温で５分間インキュベーションした後、細胞をペレットにし、ゲル化緩衝液を含まず、フェノレッドを含まないＤＭＥＭ５００μｌに再懸濁し、ＵＶオーブンで５分間３６５ｎｍの青色光照射を行った。得られたゲル化細胞（ＧＣ）をＰＢＳで１回洗浄し、さらなる実験の前に視覚的に評価した。図２を参照のこと。
ゲル化緩衝液は、まずジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に７５０ｍｇ／ｍＬで溶解した２－ヒドロキシ－４'－（２－ヒドロキシエトキシ）－２－メチルプロピオフェノン（ＩｒｇａｃｕｒｅＤ－２９５９；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）２０μＬを、ポリ（エチレングリコール）－ジアクリレート（ＰＥＧ－ＤＡ；Ｍｎ＝７００Ｄａ；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）２００μＬと混合して調製した。５×１０6個のＫ５６２細胞または遺伝子改変Ｋ５６２細胞を収集し、１Ｘプロテアーゼ阻害剤を含有し、フェノールレッドを含まないＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）（ＣＡ２１０６３－０２９；ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）１ｍＬに懸濁した。この細胞懸濁液にゲル化緩衝液を１：１０の体積比で添加して、細胞懸濁液中のＰＥＧ－ＤＡ濃度を１０質量％にした。室温で５分間インキュベーションした後、細胞をペレットにし、ゲル化緩衝液を含まず、フェノレッドを含まないＤＭＥＭ５００μｌに再懸濁し、ＵＶオーブンで５分間３６５ｎｍの青色光照射を行った。得られたゲル化細胞（ＧＣ）をＰＢＳで１回洗浄し、さらなる実験の前に視覚的に評価した。図２を参照のこと。
【0038】
ＰＢＭＣからのＮＫ細胞の増殖
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、ＩＬ－２１（１００ｎｇ／ｍｌ）を含む場合もしくは含まない場合で、またはＩＬ－２（１０ＩＵ／ｍｌもしくは１００ＩＵ）を含む場合もしくは含まない場合で、５％ヒト血清（Ｇｅｍｉｎｉ Ｂｉｏ）を補給したＸ－ＶＩＶＯ培地（Ｌｏｎｚａ）中で、照射されたＫ５６２－４１ＢＢＬ－ｍｂ１５細胞（ＧＭ）またはＧＣと共培養した。増殖効率を評価するために、７日間増殖した後にＮＫ集団および細胞数を評価した。さらに、増殖したＮＫ細胞をパラホルムアルデヒドで固定し、ＮＫ活性化および阻害マーカーをＣｙＴＯＦによって決定した。ＮＫ活性は、細胞傷害性アッセイによって評価した。
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、ＩＬ－２１（１００ｎｇ／ｍｌ）を含む場合もしくは含まない場合で、またはＩＬ－２（１０ＩＵ／ｍｌもしくは１００ＩＵ）を含む場合もしくは含まない場合で、５％ヒト血清（Ｇｅｍｉｎｉ Ｂｉｏ）を補給したＸ－ＶＩＶＯ培地（Ｌｏｎｚａ）中で、照射されたＫ５６２－４１ＢＢＬ－ｍｂ１５細胞（ＧＭ）またはＧＣと共培養した。増殖効率を評価するために、７日間増殖した後にＮＫ集団および細胞数を評価した。さらに、増殖したＮＫ細胞をパラホルムアルデヒドで固定し、ＮＫ活性化および阻害マーカーをＣｙＴＯＦによって決定した。ＮＫ活性は、細胞傷害性アッセイによって評価した。
【0039】
ＮＫ集団および細胞数の測定
ＰＢＭＣまたは増殖細胞をＡＰＣ－抗ＣＤ３（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）およびＰＥ－抗ＣＤ５６（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で染色し、ＮＫ集団（ＣＤ３-ＣＤ５６+）比をフローサイトメトリーによって検証した。さらに、総細胞数を血球計によって測定した。ＮＫ細胞数は次のように計算した：総細胞数×ＮＫ集団比。
細胞傷害性アッセイ
ＮＫ細胞の細胞傷害機能は、輝度を測定することによって評価した。標的細胞Ｋ５６２－ｌｕｃ+－ＧＦＰ+は、ルシフェラーゼマーカーを安定して発現した。ＮＫ細胞は、指定した比で標的細胞と４時間、３連で共培養した。細胞を溶解し、ルシフェラーゼアッセイシステム（ｐｒｏｍｅｇａ）によって９６ウェル白色プレートで輝度を測定した。細胞溶解パーセントは次のように計算した：（標的細胞単独の輝度－ＮＫ標的共培養の輝度）／（標的細胞単独の輝度－ブランク）×１００％
ＰＢＭＣまたは増殖細胞をＡＰＣ－抗ＣＤ３（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）およびＰＥ－抗ＣＤ５６（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で染色し、ＮＫ集団（ＣＤ３-ＣＤ５６+）比をフローサイトメトリーによって検証した。さらに、総細胞数を血球計によって測定した。ＮＫ細胞数は次のように計算した：総細胞数×ＮＫ集団比。
細胞傷害性アッセイ
ＮＫ細胞の細胞傷害機能は、輝度を測定することによって評価した。標的細胞Ｋ５６２－ｌｕｃ+－ＧＦＰ+は、ルシフェラーゼマーカーを安定して発現した。ＮＫ細胞は、指定した比で標的細胞と４時間、３連で共培養した。細胞を溶解し、ルシフェラーゼアッセイシステム（ｐｒｏｍｅｇａ）によって９６ウェル白色プレートで輝度を測定した。細胞溶解パーセントは次のように計算した：（標的細胞単独の輝度－ＮＫ標的共培養の輝度）／（標的細胞単独の輝度－ブランク）×１００％
【0040】
単一細胞マスサイトメトリー（ＣｙＴＯＦ）
試料を１．５％パラホルムアルデヒドで室温で１０分間固定し、続いて０．５％ＢＳＡを含有するＰＢＳで２回洗浄した。ホルムアルデヒド固定細胞試料を、表面マーカーに対する金属結合抗体で１時間インキュベートし、０．５％ＢＳＡを含有するＰＢＳで１回洗浄し、氷上でメタノールで１０分間透過処理し、０．５％ＢＳＡを含有するＰＢＳで２回洗浄し、次いで細胞内分子に対する金属結合抗体で１時間インキュベートした。細胞内染色後、細胞を０．５％ＢＳＡを含有するＰＢＳで１回洗浄し、次いで１．５％パラホルムアルデヒドを含有するＰＢＳ中でイリジウム含有ＤＮＡインタ－カレーター（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ）と共に室温で１０分間インキュベートした。インターカレーション／固定後、細胞試料を０．５％ＢＳＡを含有するＰＢＳで１回、水で２回洗浄した後、ＣｙＴＯＦマスサイトメーター（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ）で測定した。検出器感度の正規化は、前述のように実施した。測定して正規化した後、細胞長、ＤＮＡ含有量、およびシスプラチン染色に基づいて、ダブレット、デブリ、および死細胞を最初にゲートアウトすることによって、個々のファイルを分析した。ヒートマップ、ヒストグラム、およびＶｉＳＮＥマップは、ｃｙｔｏｂａｎｋ．ｏｒｇで入手可能なソフトウェアツールを使用して作成した。
試料を１．５％パラホルムアルデヒドで室温で１０分間固定し、続いて０．５％ＢＳＡを含有するＰＢＳで２回洗浄した。ホルムアルデヒド固定細胞試料を、表面マーカーに対する金属結合抗体で１時間インキュベートし、０．５％ＢＳＡを含有するＰＢＳで１回洗浄し、氷上でメタノールで１０分間透過処理し、０．５％ＢＳＡを含有するＰＢＳで２回洗浄し、次いで細胞内分子に対する金属結合抗体で１時間インキュベートした。細胞内染色後、細胞を０．５％ＢＳＡを含有するＰＢＳで１回洗浄し、次いで１．５％パラホルムアルデヒドを含有するＰＢＳ中でイリジウム含有ＤＮＡインタ－カレーター（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ）と共に室温で１０分間インキュベートした。インターカレーション／固定後、細胞試料を０．５％ＢＳＡを含有するＰＢＳで１回、水で２回洗浄した後、ＣｙＴＯＦマスサイトメーター（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ）で測定した。検出器感度の正規化は、前述のように実施した。測定して正規化した後、細胞長、ＤＮＡ含有量、およびシスプラチン染色に基づいて、ダブレット、デブリ、および死細胞を最初にゲートアウトすることによって、個々のファイルを分析した。ヒートマップ、ヒストグラム、およびＶｉＳＮＥマップは、ｃｙｔｏｂａｎｋ．ｏｒｇで入手可能なソフトウェアツールを使用して作成した。
【0041】
ＧＣの持続試験
ＮＫ増殖系におけるＧＭおよびＧＣの持続性をモニターするために、ハイコンテントイメージングシステムを使用してＧＭおよびＧＣ数の変化をモニターした。より詳細には、ＰＢＭＣおよびフィーダー細胞（ＧＭおよびＧＣ）を、ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ Ｆａｒ Ｒｅｄ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）およびＣＦＳＥ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でそれぞれ標識した。ＰＢＭＣおよびフィーダー細胞を、５％ヒト血清（Ｇｅｍｉｎｉ Ｂｉｏ）を補給したＸ－ＶＩＶＯ培地（Ｌｏｎｚａ）中でヒトＩＬ－２ １０ＩＵ／ｍｌと３日間共培養した。ＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）によって、２０倍の対物レンズ、ＦＩＴＣおよびＣｙ７フィルターのセットアップ、ならびに各ウェルについて９個のフィールドを使用して３時間毎に画像を取得した。画像データをＩｍａｇｅＪによって分析し、細胞数を評価した。
ＮＫ増殖系におけるＧＭおよびＧＣの持続性をモニターするために、ハイコンテントイメージングシステムを使用してＧＭおよびＧＣ数の変化をモニターした。より詳細には、ＰＢＭＣおよびフィーダー細胞（ＧＭおよびＧＣ）を、ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ Ｆａｒ Ｒｅｄ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）およびＣＦＳＥ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でそれぞれ標識した。ＰＢＭＣおよびフィーダー細胞を、５％ヒト血清（Ｇｅｍｉｎｉ Ｂｉｏ）を補給したＸ－ＶＩＶＯ培地（Ｌｏｎｚａ）中でヒトＩＬ－２ １０ＩＵ／ｍｌと３日間共培養した。ＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）によって、２０倍の対物レンズ、ＦＩＴＣおよびＣｙ７フィルターのセットアップ、ならびに各ウェルについて９個のフィールドを使用して３時間毎に画像を取得した。画像データをＩｍａｇｅＪによって分析し、細胞数を評価した。
【0042】
ＧＣの剛性
４％、１０％、２０％、および４０％などの様々な剛性のＧＣは、ゲル化緩衝液を含有する細胞懸濁液中においてＰＥＧ－ＤＡの濃度を調整することによって（すなわち、４質量％、１０質量％、２０質量％、および４０質量％）生成した。ＰＢＭＣを、５％ヒト血清（Ｇｅｍｉｎｉ Ｂｉｏ）を補給したＸ－ＶＩＶＯ培地（Ｌｏｎｚａ）中でヒトＩＬ－２ １０ＩＵ／ｍｌと共にＧＣと共培養した。培地は３日目および５日目に更新した。７日目に総細胞数およびＮＫ細胞溶解機能を評価した。
４％、１０％、２０％、および４０％などの様々な剛性のＧＣは、ゲル化緩衝液を含有する細胞懸濁液中においてＰＥＧ－ＤＡの濃度を調整することによって（すなわち、４質量％、１０質量％、２０質量％、および４０質量％）生成した。ＰＢＭＣを、５％ヒト血清（Ｇｅｍｉｎｉ Ｂｉｏ）を補給したＸ－ＶＩＶＯ培地（Ｌｏｎｚａ）中でヒトＩＬ－２ １０ＩＵ／ｍｌと共にＧＣと共培養した。培地は３日目および５日目に更新した。７日目に総細胞数およびＮＫ細胞溶解機能を評価した。
【0043】
濃縮したＮＫの増殖試験
ＮＫ細胞は、ＮＫ単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）によってＰＢＭＣから濃縮した。次に、ＮＫ細胞を、５％ヒト血清（Ｇｅｍｉｎｉ Ｂｉｏ）を補給したＸ－ＶＩＶＯ培地（Ｌｏｎｚａ）中でヒトＩＬ－２ １０または１００ＩＵ／ｍｌと共に、ＮＫ細胞のフィーダー細胞（ＧＭまたはＧＣ）に対する様々な比で共培養した。培地は３日目および５日目に更新した。７日目にＮＫ細胞数、集団、および細胞溶解機能を評価した。
ＮＫ細胞は、ＮＫ単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）によってＰＢＭＣから濃縮した。次に、ＮＫ細胞を、５％ヒト血清（Ｇｅｍｉｎｉ Ｂｉｏ）を補給したＸ－ＶＩＶＯ培地（Ｌｏｎｚａ）中でヒトＩＬ－２ １０または１００ＩＵ／ｍｌと共に、ＮＫ細胞のフィーダー細胞（ＧＭまたはＧＣ）に対する様々な比で共培養した。培地は３日目および５日目に更新した。７日目にＮＫ細胞数、集団、および細胞溶解機能を評価した。
【0044】
その他の実施形態
本明細書で開示した特徴は全て、任意の組合せで組み合わせることができる。本明細書で開示した各特徴は、同じ、同等、または同様の目的を果たす代替の特徴によって置き換えることができる。したがって、別段の明示的な記載がない限り、開示した各機能は、一連の一般的な同等または類似の特徴の例にすぎない。
本明細書で開示した特徴は全て、任意の組合せで組み合わせることができる。本明細書で開示した各特徴は、同じ、同等、または同様の目的を果たす代替の特徴によって置き換えることができる。したがって、別段の明示的な記載がない限り、開示した各機能は、一連の一般的な同等または類似の特徴の例にすぎない。
【0045】
上記の説明から、当業者は、記載した実施形態の本質的な特徴を容易に確認することができ、それらの趣旨および範囲から逸脱することなく、実施形態の様々な変更および改変を行って、様々な用途および条件に適合させることができる。したがって、その他の実施形態も特許請求の範囲内である。
本開示は以下の実施形態を含む。
（実施形態１）
ナチュラルキラー細胞を増殖する方法であって、
それぞれがゲル化された内部、および個々にまたは集合的にナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の増殖を刺激することができる１種または複数の膜結合タンパク質を含有する流体細胞膜を含む内部ゲル化細胞の集団を準備する工程、ならびに
ＮＫ細胞の増殖を可能にする条件下で、１種または複数の膜結合タンパク質に応答することができるＮＫ細胞を含有する細胞の集団を、前記内部ゲル化細胞の集団と共に培養する工程を含む、方法。
（実施形態２）
前記細胞集団が、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、濃縮ＮＫ細胞、ｉＰＳＣ由来ＮＫ細胞、胚性幹細胞由来ＮＫ細胞、組織常在性ＮＫ細胞、脾細胞、臍帯血細胞、および造血幹細胞由来ＮＫ細胞からなる群から選択される、実施形態１に記載の方法。
（実施形態３）
前記１種または複数の膜結合タンパク質が、４１ＢＢＬ、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、Ｂ７－Ｈ６、ＢＡＴ３、ＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｃ２、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｇ、ＨＬＡ－Ｆ、ＨＬＡ－Ｃ、ＭＩＣＡ／ＭＩＣＢ、ＵＬＢＰ－１、ＵＬＢＰ－２、ＵＬＢＰ－３、ＵＬＢＰ－４、ＵＬＢＰ－５、ＵＬＢＰ－６、ＡＩＣＬ、ＣＤ４８、ＮＴＢ－Ａ、２Ｂ４、ＣＤ２、ＣＤ５８、ＣＤ１１ａ、ＩＣＡＭ１、ＣＲＡＣＣ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ１３７Ｌ、ネクチン－１、ネクチン－２、ネクチン－３、ネクチン－４、ｎｅｃｌ－１、ｎｅｃｌ－２、ｎｅｃｌ－３、ｎｅｃｌ－４、ｎｅｃｌ－５、ＰＣＮＡ、ＡＩＣＬ、ＩｇＧ、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ７２、ＣＥＡＣＡＭ－１、ＣＥＡＣＡＭ－５、ＯＣＩＬ、Ｎ－カドヘリン、Ｅ－カドヘリン、Ｒ－カドヘリン、シアル酸、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－９、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、ＩＬ－２７、ＩＬ－３３、ＩＬ－６、ＩＬ－１１、ＣＮＴＦ、ＬＩＦ、ＯＳＭ、ＣＴ－１、ＣＬＣ、ＩＦＮ－ａ、ＩＮＦ－ｂ、ＣＣＬ－５、およびＴＬＲ－１のアゴニスト、ＴＬＲ－２のアゴニスト、ＴＬＲ－３のアゴニスト、ＴＬＲ－５のアゴニスト、ＴＬＲ－６のアゴニスト、ＴＬＲ－９のアゴニスト、ＮＯＤ－１のアゴニスト、ＮＯＤ－２のアゴニスト、ＮＯＤ－３のアゴニスト、またはＮＬＲＰ３アゴニストからなる群から選択される、実施形態１または２に記載の方法。
（実施形態４）
前記１種または複数の膜結合タンパク質が４１ＢＢＬおよびＩＬ－１５を含む、実施形態２に記載の方法。
（実施形態５）
前記培養工程が、ＩＬ－２１またはＩＬ－２の存在下で実施される、実施形態１に記載の方法。
（実施形態６）
前記培養工程におけるＮＫ細胞数の内部ゲル化細胞数に対する比が１：０．５～２０である、実施形態１に記載の方法。
（実施形態７）
前記内部ゲル化細胞の集団が、
前記１種または複数の膜結合タンパク質を発現する抗原提示細胞の集団を準備する工程、
プロテアーゼ阻害剤カクテルを含有し、フェノールレッドを含まないＤＭＥＭに前記抗原提示細胞の集団を懸濁して第１の細胞懸濁液を生成する工程、
ゲル化溶液を前記第１の細胞懸濁液に添加して、第２の細胞懸濁液を生成する工程であり、前記ゲル化溶液が前記抗原提示細胞の膜透過性を増加させることができ、光反応性架橋剤および任意に光開始剤を含有する工程、
前記光反応性架橋剤および任意に前記光開始剤が前記抗原提示細胞に入るのを可能にするのに十分な時間、室温で前記第２の細胞懸濁液をインキュベートする工程、
前記第２の細胞懸濁液を遠心分離して細胞ペレットを生成する工程、
前記細胞ペレットをフェノールレッドを含まないＤＭＥＭに再懸濁して、第３の細胞懸濁液を生成する工程、
前記光反応性架橋剤の架橋結合を可能にするのに十分な時間、前記第３の細胞懸濁液に光を当て、それによって前記内部ゲル化細胞の集団を生成する工程、ならびに
前記内部ゲル化細胞の集団を収集し、洗浄する工程を含む手順によって生成される、実施形態１～５のいずれか１項に記載の方法。
（実施形態８）
前記ゲル化溶液が、前記第２の細胞懸濁液が３２０ｍＯｓｍｏｌ～２９０ｍＯｓｍｏｌ、３２０ｍＯｓｍｏｌを超える、または２９０ｍＯｓｍｏｌ未満の浸透圧濃度を有するように調製される、実施形態７に記載の方法。
（実施形態９）
前記第２の細胞懸濁液が０．１～５質量％のＤＭＳＯを含有する、実施形態７に記載の方法。
（実施形態１０）
前記第２の細胞懸濁液中の前記光反応性架橋剤の濃度が、５質量％～５０質量％である、実施形態７に記載の方法。
（実施形態１１）
前記光反応性架橋剤がポリ（エチレングリコール）ジアクリレート（ＰＥＧ－ＤＡ）であり、前記光開始剤が２－ヒドロキシ－４’－（２－ヒドロキシエトキシ）－２－メチルプロピオフェノンであり、前記光が３６５ｎｍの青色光である、実施形態７に記載の方法。
（実施形態１２）
前記２－ヒドロキシ－４’－２（－ヒドロキシエトキシ）－２－メチルプロピオフェノンが０．０１～１質量％の範囲であり、前記ＰＥＧ－ＤＡが前記ゲル化溶液中２～８０質量％の範囲で、２００Ｄａ～５０００Ｄａの平均分子量を有する、実施形態１１に記載の方法。
（実施形態１３）
前記ゲル化溶液が、２－ヒドロキシ－４’－（２－ヒドロキシエトキシ）－２－メチルプロピオフェノンをジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解して溶液を作製し、前記溶液を平均分子量７００ＤａのＰＥＧ－ＤＡと混合することによって調製される、実施形態１２に記載の方法。
（実施形態１４）
前記第２の細胞懸濁液中のＰＥＧ－ＤＡの濃度が、１０質量％～４０質量％である、実施形態１１に記載の方法。
（実施形態１５）
前記抗原提示細胞の集団が人工抗原提示細胞である、実施形態７に記載の方法。
（実施形態１６）
前記人工抗原提示細胞が、Ｋ５６２細胞、ＰＢＭＣ、ＥＢＶ形質転換ＬＣＬ、７２１．２２１細胞、８８６６細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞、Ｊｕｒｋａｔ／ＫＬ－１細胞、Ｕ９３７細胞、ＢＪＡＢ細胞、ＮＢ４細胞、２９３Ｔ細胞、ＭＣＦ７細胞、Ｊｅｇ３細胞、Ｈｅｌａ細胞、Ａ５４９細胞、１１０６ｍｅｌ細胞、もしくはＣＥＭ細胞であるか、またはそれらから操作される、実施形態１５に記載の方法。
（実施形態１７）
前記増殖したＮＫ細胞を単離する工程、および前記単離されたＮＫ細胞をそれを必要とする対象に投与する工程をさらに含む、実施形態１～１６のいずれか１項に記載の方法。
（実施形態１８）
内部ゲル化細胞の集団を生成する方法であって、
１種または複数の膜結合タンパク質を発現する前駆体細胞の集団を準備する工程、
プロテアーゼ阻害剤カクテルを含有し、フェノールレッドを含まないＤＭＥＭに前記前駆体細胞の集団を懸濁して第１の細胞懸濁液を生成する工程、
ゲル化溶液を前記第１の細胞懸濁液に添加して、第２の細胞懸濁液を生成する工程であり、前記ゲル化溶液が前記前駆体細胞の膜透過性を増加させることができ、光反応性架橋剤および光開始剤を含有する工程、
前記光反応性架橋剤および光開始剤が前記前駆体細胞に入るのを可能にするのに十分な時間、室温で前記第２の細胞懸濁液をインキュベートする工程、
前記第２の細胞懸濁液を遠心分離して細胞ペレットを生成する工程、
前記細胞ペレットをフェノールレッドを含まないＤＭＥＭに再懸濁して、第３の細胞懸濁液を生成する工程、
前記光反応性架橋剤の架橋結合を可能にするのに十分な時間、前記第３の細胞懸濁液に光を当て、それによって前記内部ゲル化細胞の集団を生成する工程、ならびに
前記内部ゲル化細胞の集団を収集し、洗浄する工程を含み、
前記内部ゲル化細胞それぞれがゲル化された内部および前記１種または複数の膜結合タンパク質を含有する流体細胞膜を含む、方法。
（実施形態１９）
前記ゲル化溶液が、前記第２の細胞懸濁液が３２０ｍＯｓｍｏｌ～２９０ｍＯｓｍｏｌ、３２０ｍＯｓｍｏｌを超える、または２９０ｍＯｓｍｏｌ未満の浸透圧濃度を有するように調製される、実施形態１８に記載の方法。
（実施形態２０）
前記第２の細胞懸濁液が０．１～５質量％のＤＭＳＯを含有する、実施形態１８に記載の方法。
（実施形態２１）
前記第２の細胞懸濁液中の前記光反応性架橋剤の濃度が、５質量％～５０質量％である、実施形態１８に記載の方法。
（実施形態２２）
前記光反応性架橋剤がポリ（エチレングリコール）ジアクリレート（ＰＥＧ－ＤＡ）であり、前記光開始剤が２－ヒドロキシ－４’－（２－ヒドロキシエトキシ）－２－メチルプロピオフェノンであり、前記光が３６５ｎｍの青色光である、実施形態１８に記載の方法。
（実施形態２３）
前記２－ヒドロキシ－４’－２（－ヒドロキシエトキシ）－２－メチルプロピオフェノンが０．０１～１質量％の範囲であり、前記ＰＥＧ－ＤＡが前記ゲル化溶液中２～８０質量％の範囲で、２００Ｄａ～５０００Ｄａの平均分子量を有する、実施形態２２に記載の方法。
（実施形態２４）
前記ゲル化溶液が、２－ヒドロキシ－４’－（２－ヒドロキシエトキシ）－２－メチルプロピオフェノンをジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解して溶液を作製し、前記溶液を平均分子量７００ＤａのＰＥＧ－ＤＡと混合することによって調製される、実施形態２３に記載の方法。
（実施形態２５）
前記第２の細胞懸濁液中のＰＥＧ－ＤＡの濃度が、１０質量％～４０質量％である、実施形態２２に記載の方法。
（実施形態２６）
前記前駆体細胞の集団が人工抗原提示細胞である、実施形態１８に記載の方法。
（実施形態２７）
前記人工抗原提示細胞が、Ｋ５６２細胞、ＰＢＭＣ、ＥＢＶ形質転換ＬＣＬ、７２１．２２１細胞、８８６６細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞、Ｊｕｒｋａｔ／ＫＬ－１細胞、Ｕ９３７細胞、ＢＪＡＢ細胞、ＮＢ４細胞、２９３Ｔ細胞、ＭＣＦ７細胞、Ｊｅｇ３細胞、Ｈｅｌａ細胞、Ａ５４９細胞、１１０６ｍｅｌ細胞、もしくはＣＥＭ細胞であるか、またはそれらから操作される、実施形態２６に記載の方法。
（実施形態２８）
前記１種は複数の膜結合タンパク質が、個々にまたは集合的にナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の増殖を刺激することができる、実施形態２６に記載の方法。
（実施形態２９）
前記１種または複数の膜結合タンパク質が、４１ＢＢＬ、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、Ｂ７－Ｈ６、ＢＡＴ３、ＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｃ２、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｇ、ＨＬＡ－Ｆ、ＨＬＡ－Ｃ、ＭＩＣＡ／ＭＩＣＢ、ＵＬＢＰ－１、ＵＬＢＰ－２、ＵＬＢＰ－３、ＵＬＢＰ－４、ＵＬＢＰ－５、ＵＬＢＰ－６、ＡＩＣＬ、ＣＤ４８、ＮＴＢ－Ａ、２Ｂ４、ＣＤ２、ＣＤ５８、ＣＤ１１ａ、ＩＣＡＭ１、ＣＲＡＣＣ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ１３７Ｌ、ネクチン－１、ネクチン－２、ネクチン－３、ネクチン－４、ｎｅｃｌ－１、ｎｅｃｌ－２、ｎｅｃｌ－３、ｎｅｃｌ－４、ｎｅｃｌ－５、ＰＣＮＡ、ＡＩＣＬ、ＩｇＧ、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ７２、ＣＥＡＣＡＭ－１、ＣＥＡＣＡＭ－５、ＯＣＩＬ、Ｎ－カドヘリン、Ｅ－カドヘリン、Ｒ－カドヘリン、シアル酸、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－９、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、ＩＬ－２７、ＩＬ－３３、ＩＬ－６、ＩＬ－１１、ＣＮＴＦ、ＬＩＦ、ＯＳＭ、ＣＴ－１、ＣＬＣ、ＩＦＮ－ａ、ＩＮＦ－ｂ、ＣＣＬ－５、およびＴＬＲ－１のアゴニスト、ＴＬＲ－２のアゴニスト、ＴＬＲ－３のアゴニスト、ＴＬＲ－５のアゴニスト、ＴＬＲ－６のアゴニスト、ＴＬＲ－９のアゴニスト、ＮＯＤ－１のアゴニスト、ＮＯＤ－２のアゴニスト、ＮＯＤ－３のアゴニスト、またはＮＬＲＰ３アゴニストからなる群から選択される、実施形態２８に記載の方法。
（実施形態３０）
各細胞が、ゲル化された内部および前記１種または複数の膜結合タンパク質を含有する流体細胞膜を含む、実施形態１８～２９のいずれか１項の方法によって生成された内部ゲル化細胞の集団。
（実施形態３１）
実施形態３０の内部ゲル化細胞の集団を含む組成物。
（実施形態３２）
対象において免疫応答を誘導する方法であって、実施形態３１の組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
本開示は以下の実施形態を含む。
（実施形態１）
ナチュラルキラー細胞を増殖する方法であって、
それぞれがゲル化された内部、および個々にまたは集合的にナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の増殖を刺激することができる１種または複数の膜結合タンパク質を含有する流体細胞膜を含む内部ゲル化細胞の集団を準備する工程、ならびに
ＮＫ細胞の増殖を可能にする条件下で、１種または複数の膜結合タンパク質に応答することができるＮＫ細胞を含有する細胞の集団を、前記内部ゲル化細胞の集団と共に培養する工程を含む、方法。
（実施形態２）
前記細胞集団が、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、濃縮ＮＫ細胞、ｉＰＳＣ由来ＮＫ細胞、胚性幹細胞由来ＮＫ細胞、組織常在性ＮＫ細胞、脾細胞、臍帯血細胞、および造血幹細胞由来ＮＫ細胞からなる群から選択される、実施形態１に記載の方法。
（実施形態３）
前記１種または複数の膜結合タンパク質が、４１ＢＢＬ、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、Ｂ７－Ｈ６、ＢＡＴ３、ＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｃ２、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｇ、ＨＬＡ－Ｆ、ＨＬＡ－Ｃ、ＭＩＣＡ／ＭＩＣＢ、ＵＬＢＰ－１、ＵＬＢＰ－２、ＵＬＢＰ－３、ＵＬＢＰ－４、ＵＬＢＰ－５、ＵＬＢＰ－６、ＡＩＣＬ、ＣＤ４８、ＮＴＢ－Ａ、２Ｂ４、ＣＤ２、ＣＤ５８、ＣＤ１１ａ、ＩＣＡＭ１、ＣＲＡＣＣ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ１３７Ｌ、ネクチン－１、ネクチン－２、ネクチン－３、ネクチン－４、ｎｅｃｌ－１、ｎｅｃｌ－２、ｎｅｃｌ－３、ｎｅｃｌ－４、ｎｅｃｌ－５、ＰＣＮＡ、ＡＩＣＬ、ＩｇＧ、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ７２、ＣＥＡＣＡＭ－１、ＣＥＡＣＡＭ－５、ＯＣＩＬ、Ｎ－カドヘリン、Ｅ－カドヘリン、Ｒ－カドヘリン、シアル酸、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－９、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、ＩＬ－２７、ＩＬ－３３、ＩＬ－６、ＩＬ－１１、ＣＮＴＦ、ＬＩＦ、ＯＳＭ、ＣＴ－１、ＣＬＣ、ＩＦＮ－ａ、ＩＮＦ－ｂ、ＣＣＬ－５、およびＴＬＲ－１のアゴニスト、ＴＬＲ－２のアゴニスト、ＴＬＲ－３のアゴニスト、ＴＬＲ－５のアゴニスト、ＴＬＲ－６のアゴニスト、ＴＬＲ－９のアゴニスト、ＮＯＤ－１のアゴニスト、ＮＯＤ－２のアゴニスト、ＮＯＤ－３のアゴニスト、またはＮＬＲＰ３アゴニストからなる群から選択される、実施形態１または２に記載の方法。
（実施形態４）
前記１種または複数の膜結合タンパク質が４１ＢＢＬおよびＩＬ－１５を含む、実施形態２に記載の方法。
（実施形態５）
前記培養工程が、ＩＬ－２１またはＩＬ－２の存在下で実施される、実施形態１に記載の方法。
（実施形態６）
前記培養工程におけるＮＫ細胞数の内部ゲル化細胞数に対する比が１：０．５～２０である、実施形態１に記載の方法。
（実施形態７）
前記内部ゲル化細胞の集団が、
前記１種または複数の膜結合タンパク質を発現する抗原提示細胞の集団を準備する工程、
プロテアーゼ阻害剤カクテルを含有し、フェノールレッドを含まないＤＭＥＭに前記抗原提示細胞の集団を懸濁して第１の細胞懸濁液を生成する工程、
ゲル化溶液を前記第１の細胞懸濁液に添加して、第２の細胞懸濁液を生成する工程であり、前記ゲル化溶液が前記抗原提示細胞の膜透過性を増加させることができ、光反応性架橋剤および任意に光開始剤を含有する工程、
前記光反応性架橋剤および任意に前記光開始剤が前記抗原提示細胞に入るのを可能にするのに十分な時間、室温で前記第２の細胞懸濁液をインキュベートする工程、
前記第２の細胞懸濁液を遠心分離して細胞ペレットを生成する工程、
前記細胞ペレットをフェノールレッドを含まないＤＭＥＭに再懸濁して、第３の細胞懸濁液を生成する工程、
前記光反応性架橋剤の架橋結合を可能にするのに十分な時間、前記第３の細胞懸濁液に光を当て、それによって前記内部ゲル化細胞の集団を生成する工程、ならびに
前記内部ゲル化細胞の集団を収集し、洗浄する工程を含む手順によって生成される、実施形態１～５のいずれか１項に記載の方法。
（実施形態８）
前記ゲル化溶液が、前記第２の細胞懸濁液が３２０ｍＯｓｍｏｌ～２９０ｍＯｓｍｏｌ、３２０ｍＯｓｍｏｌを超える、または２９０ｍＯｓｍｏｌ未満の浸透圧濃度を有するように調製される、実施形態７に記載の方法。
（実施形態９）
前記第２の細胞懸濁液が０．１～５質量％のＤＭＳＯを含有する、実施形態７に記載の方法。
（実施形態１０）
前記第２の細胞懸濁液中の前記光反応性架橋剤の濃度が、５質量％～５０質量％である、実施形態７に記載の方法。
（実施形態１１）
前記光反応性架橋剤がポリ（エチレングリコール）ジアクリレート（ＰＥＧ－ＤＡ）であり、前記光開始剤が２－ヒドロキシ－４’－（２－ヒドロキシエトキシ）－２－メチルプロピオフェノンであり、前記光が３６５ｎｍの青色光である、実施形態７に記載の方法。
（実施形態１２）
前記２－ヒドロキシ－４’－２（－ヒドロキシエトキシ）－２－メチルプロピオフェノンが０．０１～１質量％の範囲であり、前記ＰＥＧ－ＤＡが前記ゲル化溶液中２～８０質量％の範囲で、２００Ｄａ～５０００Ｄａの平均分子量を有する、実施形態１１に記載の方法。
（実施形態１３）
前記ゲル化溶液が、２－ヒドロキシ－４’－（２－ヒドロキシエトキシ）－２－メチルプロピオフェノンをジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解して溶液を作製し、前記溶液を平均分子量７００ＤａのＰＥＧ－ＤＡと混合することによって調製される、実施形態１２に記載の方法。
（実施形態１４）
前記第２の細胞懸濁液中のＰＥＧ－ＤＡの濃度が、１０質量％～４０質量％である、実施形態１１に記載の方法。
（実施形態１５）
前記抗原提示細胞の集団が人工抗原提示細胞である、実施形態７に記載の方法。
（実施形態１６）
前記人工抗原提示細胞が、Ｋ５６２細胞、ＰＢＭＣ、ＥＢＶ形質転換ＬＣＬ、７２１．２２１細胞、８８６６細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞、Ｊｕｒｋａｔ／ＫＬ－１細胞、Ｕ９３７細胞、ＢＪＡＢ細胞、ＮＢ４細胞、２９３Ｔ細胞、ＭＣＦ７細胞、Ｊｅｇ３細胞、Ｈｅｌａ細胞、Ａ５４９細胞、１１０６ｍｅｌ細胞、もしくはＣＥＭ細胞であるか、またはそれらから操作される、実施形態１５に記載の方法。
（実施形態１７）
前記増殖したＮＫ細胞を単離する工程、および前記単離されたＮＫ細胞をそれを必要とする対象に投与する工程をさらに含む、実施形態１～１６のいずれか１項に記載の方法。
（実施形態１８）
内部ゲル化細胞の集団を生成する方法であって、
１種または複数の膜結合タンパク質を発現する前駆体細胞の集団を準備する工程、
プロテアーゼ阻害剤カクテルを含有し、フェノールレッドを含まないＤＭＥＭに前記前駆体細胞の集団を懸濁して第１の細胞懸濁液を生成する工程、
ゲル化溶液を前記第１の細胞懸濁液に添加して、第２の細胞懸濁液を生成する工程であり、前記ゲル化溶液が前記前駆体細胞の膜透過性を増加させることができ、光反応性架橋剤および光開始剤を含有する工程、
前記光反応性架橋剤および光開始剤が前記前駆体細胞に入るのを可能にするのに十分な時間、室温で前記第２の細胞懸濁液をインキュベートする工程、
前記第２の細胞懸濁液を遠心分離して細胞ペレットを生成する工程、
前記細胞ペレットをフェノールレッドを含まないＤＭＥＭに再懸濁して、第３の細胞懸濁液を生成する工程、
前記光反応性架橋剤の架橋結合を可能にするのに十分な時間、前記第３の細胞懸濁液に光を当て、それによって前記内部ゲル化細胞の集団を生成する工程、ならびに
前記内部ゲル化細胞の集団を収集し、洗浄する工程を含み、
前記内部ゲル化細胞それぞれがゲル化された内部および前記１種または複数の膜結合タンパク質を含有する流体細胞膜を含む、方法。
（実施形態１９）
前記ゲル化溶液が、前記第２の細胞懸濁液が３２０ｍＯｓｍｏｌ～２９０ｍＯｓｍｏｌ、３２０ｍＯｓｍｏｌを超える、または２９０ｍＯｓｍｏｌ未満の浸透圧濃度を有するように調製される、実施形態１８に記載の方法。
（実施形態２０）
前記第２の細胞懸濁液が０．１～５質量％のＤＭＳＯを含有する、実施形態１８に記載の方法。
（実施形態２１）
前記第２の細胞懸濁液中の前記光反応性架橋剤の濃度が、５質量％～５０質量％である、実施形態１８に記載の方法。
（実施形態２２）
前記光反応性架橋剤がポリ（エチレングリコール）ジアクリレート（ＰＥＧ－ＤＡ）であり、前記光開始剤が２－ヒドロキシ－４’－（２－ヒドロキシエトキシ）－２－メチルプロピオフェノンであり、前記光が３６５ｎｍの青色光である、実施形態１８に記載の方法。
（実施形態２３）
前記２－ヒドロキシ－４’－２（－ヒドロキシエトキシ）－２－メチルプロピオフェノンが０．０１～１質量％の範囲であり、前記ＰＥＧ－ＤＡが前記ゲル化溶液中２～８０質量％の範囲で、２００Ｄａ～５０００Ｄａの平均分子量を有する、実施形態２２に記載の方法。
（実施形態２４）
前記ゲル化溶液が、２－ヒドロキシ－４’－（２－ヒドロキシエトキシ）－２－メチルプロピオフェノンをジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解して溶液を作製し、前記溶液を平均分子量７００ＤａのＰＥＧ－ＤＡと混合することによって調製される、実施形態２３に記載の方法。
（実施形態２５）
前記第２の細胞懸濁液中のＰＥＧ－ＤＡの濃度が、１０質量％～４０質量％である、実施形態２２に記載の方法。
（実施形態２６）
前記前駆体細胞の集団が人工抗原提示細胞である、実施形態１８に記載の方法。
（実施形態２７）
前記人工抗原提示細胞が、Ｋ５６２細胞、ＰＢＭＣ、ＥＢＶ形質転換ＬＣＬ、７２１．２２１細胞、８８６６細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞、Ｊｕｒｋａｔ／ＫＬ－１細胞、Ｕ９３７細胞、ＢＪＡＢ細胞、ＮＢ４細胞、２９３Ｔ細胞、ＭＣＦ７細胞、Ｊｅｇ３細胞、Ｈｅｌａ細胞、Ａ５４９細胞、１１０６ｍｅｌ細胞、もしくはＣＥＭ細胞であるか、またはそれらから操作される、実施形態２６に記載の方法。
（実施形態２８）
前記１種は複数の膜結合タンパク質が、個々にまたは集合的にナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の増殖を刺激することができる、実施形態２６に記載の方法。
（実施形態２９）
前記１種または複数の膜結合タンパク質が、４１ＢＢＬ、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、Ｂ７－Ｈ６、ＢＡＴ３、ＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｃ２、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｇ、ＨＬＡ－Ｆ、ＨＬＡ－Ｃ、ＭＩＣＡ／ＭＩＣＢ、ＵＬＢＰ－１、ＵＬＢＰ－２、ＵＬＢＰ－３、ＵＬＢＰ－４、ＵＬＢＰ－５、ＵＬＢＰ－６、ＡＩＣＬ、ＣＤ４８、ＮＴＢ－Ａ、２Ｂ４、ＣＤ２、ＣＤ５８、ＣＤ１１ａ、ＩＣＡＭ１、ＣＲＡＣＣ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ１３７Ｌ、ネクチン－１、ネクチン－２、ネクチン－３、ネクチン－４、ｎｅｃｌ－１、ｎｅｃｌ－２、ｎｅｃｌ－３、ｎｅｃｌ－４、ｎｅｃｌ－５、ＰＣＮＡ、ＡＩＣＬ、ＩｇＧ、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ７２、ＣＥＡＣＡＭ－１、ＣＥＡＣＡＭ－５、ＯＣＩＬ、Ｎ－カドヘリン、Ｅ－カドヘリン、Ｒ－カドヘリン、シアル酸、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－９、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、ＩＬ－２７、ＩＬ－３３、ＩＬ－６、ＩＬ－１１、ＣＮＴＦ、ＬＩＦ、ＯＳＭ、ＣＴ－１、ＣＬＣ、ＩＦＮ－ａ、ＩＮＦ－ｂ、ＣＣＬ－５、およびＴＬＲ－１のアゴニスト、ＴＬＲ－２のアゴニスト、ＴＬＲ－３のアゴニスト、ＴＬＲ－５のアゴニスト、ＴＬＲ－６のアゴニスト、ＴＬＲ－９のアゴニスト、ＮＯＤ－１のアゴニスト、ＮＯＤ－２のアゴニスト、ＮＯＤ－３のアゴニスト、またはＮＬＲＰ３アゴニストからなる群から選択される、実施形態２８に記載の方法。
（実施形態３０）
各細胞が、ゲル化された内部および前記１種または複数の膜結合タンパク質を含有する流体細胞膜を含む、実施形態１８～２９のいずれか１項の方法によって生成された内部ゲル化細胞の集団。
（実施形態３１）
実施形態３０の内部ゲル化細胞の集団を含む組成物。
（実施形態３２）
対象において免疫応答を誘導する方法であって、実施形態３１の組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7-1】
【図7-2】
